WO2024080363A1 - デバイス、システム、方法、および薬剤評価方法 - Google Patents

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WO2024080363A1
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sample
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liquid
accumulation
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PCT/JP2023/037223
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康行 酒井
昌輝 西川
文弥 時任
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国立大学法人東京大学
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    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/02—Devices for withdrawing samples
    • G01N1/10—Devices for withdrawing samples in the liquid or fluent state
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility

Definitions

  • Embodiments of the present invention relate to a device, a system, a method, and a drug evaluation method.
  • This application claims priority to Japanese Patent Application No. 2022-164421, filed in Japan on October 13, 2022, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • bile components from hepatocytes contain hepatically metabolized compounds that are excreted from the liver. Recovering such bile and understanding the excretion pathways of hepatically metabolized compounds is extremely important in fields such as pharmaceutical development.
  • the problem that the present invention aims to solve is to provide a device, a system, a method, and a drug evaluation method that can improve the processing efficiency of a target substance.
  • a device comprising: a base for supporting a sample and having a flow path structure formed therein; and an accumulation section having an accumulation space that communicates with the flow path structure during use, wherein liquid from the sample passes through the flow path structure and is accumulated in the accumulation space.
  • a device described in [1] wherein one end of the flow path structure is blocked by the sample, and the other end of the flow path structure is connected to the accumulation space.
  • a method comprising the steps of: preparing a device having a base on which a flow path structure is formed and an accumulation portion having an accumulation space that communicates with the flow path structure when in use; placing a sample on the base; and accumulating liquid from the sample in the accumulation space through the flow path structure.
  • a drug evaluation method using a device described in any of [1] to [12], comprising the steps of contacting a drug with the sample or the accumulated liquid supported on the base, and measuring the response of the sample or the liquid to stimulation caused by contact with the drug, or the permeability or permeability of the drug into the sample.
  • the present invention provides a device, system, method, and drug evaluation method that can improve the processing efficiency of a target substance.
  • FIG. 1 is a perspective view of a collection system 1 according to a first embodiment.
  • FIG. 1 is a perspective view of a retrieval device 100 according to a first embodiment.
  • FIG. 2 is a top view of the retrieval device 100 according to the first embodiment.
  • 4 is a cross-sectional view of the retrieval device 100 according to the first embodiment taken along line IV-IV in FIG. 3.
  • 5A to 5C are cross-sectional views showing a method of using the retrieval device 100 according to the first embodiment.
  • FIG. 11 is a cross-sectional view of a retrieval device 200 according to a second embodiment.
  • FIG. 11 is a perspective view of a retrieval device 300 according to a third embodiment.
  • FIG. 8 is a cross-sectional view of the retrieval device 300 according to the third embodiment taken along line VIII-VIII in FIG. 7.
  • FIG. 13 is a perspective view of a retrieval device 400 according to a fourth embodiment. 10 is a cross-sectional view of the retrieval device 400 according to the fourth embodiment taken along line XX in FIG. 9. 13A to 13C are cross-sectional views showing a modification of the method of using the retrieval device 400 according to the fourth embodiment.
  • FIG. 13 is a perspective view of a retrieval device 500 according to a fifth embodiment. 13 is a cross-sectional view of the retrieval device 500 according to the fifth embodiment taken along line XIII-XIII in FIG. 12.
  • FIG. 11 is a cross-sectional view showing a modified example of a flow path structure.
  • FIG. 11 is a cross-sectional view showing a modified example of a flow path structure.
  • 1 shows a bright-field photograph of the sample surface taken in Experimental Example 1 (left), a fluorescent photograph of the cell layer (center), and a fluorescent photograph of the groove layer (right).
  • 1 shows a bright-field photograph of the sample surface taken in Experimental Example 2 (left), a fluorescent photograph of the cell layer (center), and a fluorescent photograph of the groove layer (right).
  • 13 is a fluorescent photograph of a recovery device taken in Experimental Example 5.
  • 13 is a bright-field photograph of liver cells on a sample surface taken in Experimental Example 6.
  • 13 is a bright field photograph of the cell layer (top) and a fluorescent photograph of the groove layer (bottom) in the outer portion of the base taken in Experimental Example 6.
  • 13 is a bright field photograph (top) of the cell layer near the boundary between the outer portion of the base and the peripheral wall of the reservoir, and a fluorescent photograph (bottom) of the groove layer taken in Experimental Example 6.
  • 11 shows the fluorescence intensity of the supernatant recovered from the culture space in Experimental Example 6.
  • 13 shows the fluorescence intensity of the supernatant recovered from the accumulation space in Experimental Example 6.
  • 13 shows the CLF concentrations in the supernatants recovered by the conventional technology and the fabricated recovery device in Experimental Example 7.
  • 13 shows the CLF amounts of the supernatants collected by the conventional technology and the prepared collection device in Experimental Example 7.
  • a device which supports a sample and comprises a base having a flow path structure formed therein, and an accumulation portion having an accumulation space which communicates with the flow path structure in use, wherein liquid from the sample passes through the flow path structure and accumulates in the accumulation space.
  • a method comprising the steps of: providing a device comprising a base having a flow path structure formed therein and an accumulation portion having an accumulation space that communicates with the flow path structure in use; disposing a sample on the base; and accumulating liquid from the sample in the accumulation space through the flow path structure.
  • flow path structure means a structure through which a fluid can pass.
  • flow path structures include, but are not limited to, holes, openings, grooves, meshes, tubes, etc.
  • FIG. 1 An example of a “system” and a collection device 100 (an example of a “device”) according to a first embodiment will be described with reference to FIGS. 1 to 5.
  • FIG. 1 An example of a “system”
  • FIG. 1 An example of a “device”
  • FIG. 1 is a perspective view of a collection system 1 according to the first embodiment.
  • the collection system 1 includes a well array 10 (an example of a “well device”) and one or more collection devices 100 .
  • the well array 10 has a main body 12 and a number of wells 14 arranged in a matrix on the main body 12.
  • the wells 14 are formed as recesses having a well bottom 16 and well sides 18 on the upper surface of the main body 12.
  • the wells 14 have a well bottom 16 without penetrating the main body 12, but the wells 14 may also penetrate the main body 12.
  • each well 14 can accommodate a collection device 100. Note that the shape, size, arrangement, etc. of the wells 14 are not limited to the above example.
  • the well bottom 16 is formed of an oxygen-permeable membrane, this is preferable in terms of the function and monolayer formation ability of the hepatocytes when using hepatocytes as a sample as described below, but the material of the well array 10 (including the well bottom 16) is not particularly limited.
  • FIG. 2 is a perspective view of the retrieval device 100 according to the first embodiment.
  • FIG. 3 is a top view of the retrieval device 100 according to the first embodiment.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view of the retrieval device 100 according to the first embodiment taken along line IV-IV in FIG.
  • the retrieval device 100 has a base 110 and an accumulation portion 120.
  • the base 110 is a disk-shaped member having an upper surface 110A and a lower surface 110B.
  • the accumulation portion 120 is a hollow tubular member having a peripheral wall 122.
  • the accumulation portion 120 has an upper opening and a lower opening.
  • the accumulation portion 120 is provided on the upper surface 110A in the center of the base 110.
  • the base 110 and the accumulation portion 120 may be joined by any method after being molded separately, or may be molded integrally.
  • the base 110 has an outer portion 110C and an inner portion 110D.
  • the outer portion 110C is the portion of the base 110 from the periphery to a position corresponding to the inner peripheral surface of the accumulation section 120.
  • the inner portion 110D is the portion of the base 110 that corresponds to the inside of the accumulation section 120.
  • a circular recess is formed in the upper surface 110A of the base 110. The diameter of the recess is approximately equal to the diameter of the internal space of the accumulation section 120.
  • a plurality of grooves 112 are formed radially on the upper surface 110A of the base 110.
  • Each of the plurality of grooves 112 is arranged so that one end faces the accumulation portion 120.
  • the grooves 112 extend linearly from the periphery of the base 110 toward the center of the base 110.
  • one end of the groove 112 forms an outlet 114 and communicates with a recess formed in the inner portion 110D. That is, as shown in FIG. 2, the outlets 114 from the plurality of grooves 112 are arranged to surround the recess of the inner portion 110D.
  • the other end of the groove 112 terminates just before the periphery of the base 110 in the example shown in FIGS. 2 and 3, but may extend completely to the periphery.
  • the groove 112 passes under the lower end 124 of the accumulation section 120 and communicates with a recess in the inner portion 110D of the base 110. Therefore, the space above the outer portion 110C of the base 110 and the space above the inner portion 110D (i.e., the internal space of the accumulation section 120) are connected via the groove 112. In this way, the groove 112 functions as a flow path structure between the external space and the internal space of the accumulation section 120.
  • the recovery device 100 is configured so that it can be inserted into a general well array 10. This allows the use of existing well arrays 10, making the recovery device 100 highly versatile.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view showing a method of using the retrieval device 100 according to the first embodiment. 5, in use, the retrieval device 100 is inserted into a well 14 of the well array 10. The lower surface 110B of the base 110 is supported by the bottom surface 16 of the well.
  • the entire upper surface 110A of the base 110 at the outer portion 110C is covered with cells C.
  • one end of the flow path structure formed by the groove 112 is blocked by cells C.
  • the other end of the flow path structure is connected to the recess of the inner portion 110D and the internal space of the accumulation portion 120.
  • An adhesive for adhering the cells to the upper surface 110A may be applied to the upper surface 110A.
  • the adhesive is preferably biocompatible, such as collagen.
  • Cell C can release liquid due to the action of a transporter, etc.
  • cell C has the function of performing polar transport. Since groove 112 is adjacent to cell C, liquid from cell C can be released into the internal space of groove 112. Note that the principle by which liquid is released from a sample is not limited to the above example, and the present invention can be applied to liquid released from any type of sample according to any principle.
  • the grooves 112 are large enough that the cells C cannot pass through. Since the size of the cells C varies, in this specification, "cannot pass through” means that at least 80% by volume of the added sample cannot pass through.
  • the width of the grooves 112 is 0.1 ⁇ m to 10 ⁇ m, 0.3 ⁇ m to 8 ⁇ m, 0.5 ⁇ m to 6 ⁇ m, or 1 ⁇ m to 5 ⁇ m. If the width of the grooves 112 is less than 0.1 ⁇ m, the pressure required to transport the liquid from the cells C increases, and pressure loss may increase. If the width of the grooves 112 exceeds 10 ⁇ m, the cells C may enter the inside of the grooves 112. For example, liver cells are about 10 ⁇ m to 20 ⁇ m, so they may enter the inside of a groove 112 having a width exceeding 10 ⁇ m.
  • the depth of the grooves 112 is not particularly limited, but may be, for example, 0.1 ⁇ m to 20 ⁇ m, 0.3 ⁇ m to 15 ⁇ m, 0.5 ⁇ m to 10 ⁇ m, or 1 ⁇ m to 5 ⁇ m.
  • the spacing (pitch) between adjacent grooves 112 is not particularly limited, but may be, for example, 0.1 ⁇ m to 100 ⁇ m, 0.5 ⁇ m to 70 ⁇ m, 1 ⁇ m to 50 ⁇ m, or 3 ⁇ m to 30 ⁇ m.
  • the cells C When cells C are placed on the upper surface 110A of the base 110, as shown in FIG. 5, the cells C covering the upper surface 110A, the peripheral wall 122 of the accumulation section 120, and the well bottom surface 16 define a donut-shaped culture space S1.
  • the culture space S1 is filled with culture fluid (culture medium) CL.
  • the cells C can be cultured.
  • the multiple grooves 112 whose upper parts are covered by the cells C define a recovery space S2.
  • the recess formed in the inner part 110D of the base 110 and the peripheral wall 122 of the accumulation section 120 define a storage space S3.
  • the recovery space S2 and the storage space S3 are filled with recovery fluid RL while communicating with each other.
  • the recovery fluid RL is, for example, the same type of culture medium as the culture fluid CL.
  • the recovery fluid RL is, for example, the same type of culture medium as the culture fluid CL.
  • the internal space of the groove 112 i.e., recovery space S2
  • the internal space of the accumulation unit 120 i.e., accumulation space S3
  • recovery liquid RL can be filled with recovery liquid RL.
  • the liquid from the cells C When the liquid from the cells C is discharged into the inside of the grooves 112, the liquid diffuses in the recovery liquid RL, passes through the grooves 112, and flows into the accumulation space S3 from the lower opening of the accumulation unit 120. In this way, the liquid from the cells C is transported through the recovery space S2 to the accumulation space S3. As a result, the recovery liquid RL containing the liquid is accumulated in the accumulation space S3. This allows the user to recover the recovery liquid RL containing the liquid from the upper opening of the accumulation unit 120. In this way, when the accumulation unit 120 has an upper opening, it becomes easier to recover the recovery liquid RL.
  • the cell C By covering the top of the groove 112, the cell C separates the culture space S1 from the recovery space S2 and the storage space S3 so that the culture space S1 does not communicate with the recovery space S2 and the storage space S3.
  • the cell C is positioned so as to block communication between the culture space S1 and the recovery space S2 and the storage space S3. This limits the range within which the liquid released from the cell C into the groove 112 can move. In other words, the liquid from the cell C cannot move into the culture space S1, so it is transported through the recovery space S2 to the storage space S3.
  • the liquid level of the culture fluid CL in the culture space S1 and the liquid level of the recovery liquid RL in the accumulation space S3 may be different.
  • the present invention is not bound by theory, if the liquid level in the accumulation space S3 is lower than the liquid level in the culture space S1, the water pressure may promote the release of liquid from the cells C.
  • cell C includes a hepatocyte, and is preferably a hepatocyte.
  • the liquid includes bile acids, and is preferably bile.
  • Hepatocytes excrete bile through the action of hepatic transporters.
  • cell C shown in FIG. 5 is a hepatocyte
  • bile excreted from the hepatocyte passes through groove 112 and is transported to accumulation space S3.
  • a user can collect the bile excreted from the hepatocyte from accumulation space S3.
  • the width of the groove is on the order of the bile canaliculus (several ⁇ m), an ecological environment can be reproduced well.
  • the liver is the central organ in the metabolic reactions of the body. Compounds metabolized in the liver are excreted into the blood or bile. Understanding the excretion pathways of compounds metabolized in the liver is extremely important in drug development.
  • conventional technology there were limited methods for recovering bile from hepatocytes. For example, in a sandwich culture method in which hepatocytes are sandwiched between extracellular matrices, in order to recover metabolic compounds in bile, there are two known methods: a method in which the bonds between hepatocytes are relaxed depending on the presence or absence of divalent ions in the buffer solution to recover bile components (B-CLEAR method), and a method in which bile components are physically aspirated from hepatocytes.
  • B-CLEAR method a method in which the bonds between hepatocytes are relaxed depending on the presence or absence of divalent ions in the buffer solution to recover bile components
  • the method of relaxing the bonds between hepatocytes is an indirect method in which the difference between the conditions with and without divalent ions is taken, and there are also transporters whose activity decreases in the absence of divalent ions, so it is difficult to say that it necessarily reflects the in vivo dynamics, and furthermore, it involves the destruction of hepatocytes.
  • the method of physically aspirating bile components from hepatocytes also involves the destruction of hepatocytes and requires intermittent and complicated operations.
  • the hepatocytes remain in an unbroken state on the upper surface 110A of the base 110. Bile components excreted from the hepatocytes are continuously accumulated in the accumulation space S3. Such bile collection and accumulation proceeds almost automatically, so no complicated operations are required. Furthermore, the method of loosening the bonds between hepatocytes in the conventional technology uses a relatively large amount of liquid for cell dissolution, so the concentration of the bile in the collected liquid is relatively low. In contrast, when the above-mentioned collection device 100 is used, a small amount of the collection liquid RL added initially is sufficient, so that a collection liquid RL containing a sufficient amount of bile can be obtained. In this way, the collection device 100 can efficiently collect liquid from the cells C.
  • a drug evaluation method is provided using the above-mentioned device, comprising the steps of contacting a drug with a sample or accumulated liquid supported on the base, and measuring the response of the sample or liquid to stimulation by contact with the drug, or the permeability or permeability of the drug into the sample.
  • drug in this specification includes not only drugs such as medicines, but also cosmetics and quasi-drugs.
  • the drug can be brought into contact with the cells C by applying the drug to the cells C or the upper surface 110A of the base 110, or by introducing the drug into the culture space S1, the recovery space S2, or the storage space S3.
  • the drug can also be brought into contact with the accumulated liquid by introducing the drug into the recovery space S2 or the storage space S3.
  • the response of the cells C or the liquid to the stimulation caused by contact with the drug, or the permeability or permeability of the drug to the cells C can be measured by evaluating the change in the cells C or the liquid from the cells C after the drug is added, the diffusion or penetration of the drug into the cells C, the diffusion of the drug through the cells C from the culture space S1 to the recovery space S2 and the storage space S3 (or from the recovery space S2 and the storage space S3 to the culture space S1), and the like, using any known method.
  • This drug evaluation method allows various drugs to be evaluated in a state where the environment in which the cell C releases a liquid substance is reproduced. In addition, various drugs can be evaluated on the liquid substance released from the cell C.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view of a retrieval device 200 according to the second embodiment.
  • the recovery device 200 has a base 210 and a storage section 220.
  • the base 210 has a bottom wall 212 and a side wall 218.
  • the bottom wall 212 has an upper surface 212A and a lower surface 212B, and a plurality of grooves 214 are formed on the upper surface 212A.
  • the grooves 214 form an outlet 216 that communicates with the internal space (accumulation space S3) of the storage section 220.
  • the side wall 218 plays the role of the well side surface 18 of the well 14 in the first embodiment.
  • the cells C when cells C are arranged to cover the upper surface 212A of the bottom wall 212, the cells C covering the upper surface 212A, the side wall 218 of the base 210, and the peripheral wall 222 of the storage section 220 define the culture space S1.
  • the grooves 214 define a recovery space S2 that communicates with the accumulation space S3.
  • the liquid from the cells C is released into the inside of the groove 214, the liquid is transported from the recovery space S2 to the accumulation space S3 through under the lower end 224 of the peripheral wall 222.
  • the user can recover the recovery liquid RL containing the liquid from the accumulation space S3.
  • the collection device 200 alone can collect liquid from the cells C without using the well array 10.
  • FIG. 7 is a perspective view of a retrieval device 300 according to the third embodiment.
  • FIG. 8 is a cross-sectional view of the retrieval device 300 according to the third embodiment taken along line VIII-VIII in FIG.
  • the retrieval device 300 has a base portion 310 and a reservoir portion 320 .
  • the base 310 has a bottom wall 312, a side wall 314, a partition 316, and an outlet 319.
  • the side wall 314 extends upward from the periphery of the bottom wall 312.
  • the partition 316 is provided at a position spaced apart from the bottom wall 312 in the height direction (Z direction).
  • the partition 316 may be molded integrally with the side wall 314, may be joined to the side wall 314, or may be supported by a support member (not shown) provided on the side wall 314.
  • the side wall 314 and the partition 316 define a culture space S1.
  • a recovery space S2 is formed between the bottom wall 312 and the partition 316.
  • the outlet 319 is provided in communication with the recovery space S2.
  • the partition 316 is a planar member in which a number of grooves 318 are formed.
  • the partition 316 may be a plate-like member, a membrane, a film, etc.
  • the grooves 318 are formed so as to penetrate the partition 316 in the height direction.
  • the number, size, shape, and arrangement of the grooves 318 are not limited to the example shown.
  • any flow path structure that does not allow the sample to pass but only allows liquid from the sample to pass may be used, such as a number of holes that penetrate the partition 316 in the height direction.
  • the accumulation section 320 is a container having a bottom wall and side walls.
  • the bottom wall and side walls form an accumulation space S3.
  • the accumulation section 320 has an inlet 322.
  • the outlet 319 and the inlet 322 are connected, so that the recovery space S2 and the accumulation space S3 are connected to each other.
  • cells C are seeded to cover the upper surface of the partition 316.
  • the culture space S1 is filled with a culture solution CL for culturing the cells C.
  • the recovery space S2 and the accumulation space S3 are filled with a recovery solution RL.
  • the liquid from the cells C is discharged into the recovery space S2 through the groove 318, and is diffused into the accumulation space S3 through the outlet 319 and the inlet 322.
  • the user can recover the recovery solution RL including the liquid portion from the accumulation space S3.
  • the base 310 and the accumulation section 320 can be removably connected to each other, which can improve the ease of handling of the retrieval device 300. Furthermore, if the partition section 316 that comes into contact with the sample is provided as a member independent of the main body of the base 310, the ease of handling of the retrieval device 300 can be further improved.
  • FIG. 9 is a perspective view of a retrieval device 400 according to the fourth embodiment.
  • FIG. 10 is a cross-sectional view of the retrieval device 400 according to the fourth embodiment taken along line XX in FIG.
  • the retrieval device 400 has a base 410 and a reservoir 420.
  • the base 410 is coupled to the reservoir 420 so as to be received in the reservoir 420.
  • the base 410 has a bottom wall 412, a side wall 414, and a flange 416.
  • the bottom wall 412 is attached to the lower end of the cylindrical side wall 414.
  • the bottom wall 412 may be provided integrally with the side wall 414, or may be provided as a plate-like member, membrane, film, or the like attached to the side wall 414.
  • the flange 416 is provided at the upper end of the side wall 414 and protrudes outward in the circumferential direction from the side wall 414.
  • a plurality of grooves 418 arranged radially are formed in the bottom wall 412. The grooves 418 are formed so as to penetrate the bottom wall 412 in the height direction (Z direction).
  • the number, size, shape, and arrangement of the grooves 418 are not limited to the example shown in the figure.
  • any flow path structure that does not pass the sample but passes only the liquid from the sample such as a number of holes that penetrate the bottom wall 412 in the height direction, may be adopted.
  • the accumulation portion 420 has a bottom wall 422, a side wall 424, and a support portion 426.
  • the side wall 424 extends upward from the peripheral edge of the bottom wall 422.
  • the support portion 426 is provided at the upper end of the cylindrical side wall 424 and protrudes circumferentially inward from the side wall 424. It is preferable that the inner diameter of the support portion 426 approximately matches the outer diameter of the side wall 414 of the base portion 410.
  • the base 410 is inserted into the storage unit 420 from above and attached to the storage unit 420.
  • the support 426 supports the flange 416 from below.
  • the support 426 can guide the horizontal (XY plane) alignment of the base 410 with respect to the storage unit 420.
  • a culture space S1 is formed as a space surrounded by the side wall 414 on the bottom wall 412.
  • the lower surface of the bottom wall 412 and the inner surface of the storage unit 420 form a recovery space S2 and a storage space S3.
  • the recovery space S2 and the storage space S3 are coincident.
  • an opening that communicates the spaces S2 and S3 with the external space may be formed in the storage unit 420 (and in the base 410, if necessary).
  • cells C are seeded to cover the upper surface of the bottom wall 412 of the base 410.
  • the culture space S1 is filled with a culture solution CL for culturing the cells C.
  • the recovery space S2 and the accumulation space S3 are filled with a recovery solution RL.
  • the liquid from the cells C passes through the groove 418 and is released into the spaces S2 and S3.
  • the user can recover the recovery solution RL including the liquid portion from the spaces S2 and S3.
  • FIG. 11 is a cross-sectional view showing a modification of the method of using the retrieval device 400 according to the fourth embodiment.
  • cells C are seeded so as to cover the underside of the bottom wall 412 of the base 410.
  • the following method can be used. First, the base 410 is turned upside down and cells C are seeded on the underside of the bottom wall 412. After culture medium CL is poured into the accumulation section 420, the base 410 with cells C seeded on the underside of the bottom wall 412 is turned upside down again and attached to the accumulation section 420. Next, recovery liquid RL is poured into the base 410.
  • a recovery space S2 and a storage space S3 are formed as spaces surrounded by side walls 414 on the bottom wall 412.
  • a culture space S1 is formed by the lower surface of the bottom wall 412 and the inner surface of the storage section 420.
  • the culture space S1 is filled with culture fluid CL for culturing cells C.
  • the recovery space S2 and the storage space S3 are filled with recovery fluid RL. Liquid from cells C passes through grooves 418 and is released into spaces S2 and S3.
  • a user can recover recovery fluid RL including the liquid portion from spaces S2 and S3.
  • the base 410 and the accumulation section 420 can be removably connected to each other, which can improve the ease of handling of the retrieval device 400. Furthermore, if the bottom wall 412 that comes into contact with the sample is provided as a member independent of the side wall 414 of the base 410, the ease of handling of the retrieval device 400 can be further improved. Furthermore, the positional relationship between the culture space S1 and the retrieval space S2 and accumulation space S3 can be reversed depending on the specific application.
  • FIG. 12 is a perspective view of a retrieval device 500 according to the fifth embodiment.
  • FIG. 13 is a cross-sectional view of the retrieval device 500 according to the fifth embodiment taken along line XIII-XIII in FIG.
  • the retrieval device 500 has a base 510 and a reservoir 520.
  • the base 510 may be formed integrally with the reservoir 520, or the base 510 may be formed separately and joined to the reservoir 520.
  • the base 510 has a bottom wall 512 and a side wall 514.
  • the storage unit 520 has a bottom wall 522, a side wall 524, and a power source 526.
  • the bottom wall 512 of the base 510 is provided at the lower end of the cylindrical side wall 514 and is disposed on the bottom wall 522 of the storage unit 520.
  • the bottom wall 512 may be provided integrally with the side wall 514 and/or the bottom wall 522, or may be provided as a plate-like member, membrane, film, etc. attached to the side wall 514 and/or the bottom wall 522.
  • the bottom wall 512 has a plurality of radially arranged grooves 516 formed therein.
  • the number, size, shape, and arrangement of the grooves 516 are not limited to the example shown in the figure.
  • the bottom wall 512 may be provided as a protrusion on the bottom wall 522 to define the grooves 516.
  • the side wall 524 of the storage unit 520 extends upward from the periphery of the bottom wall 522.
  • the power source 526 is coupled to the bottom surface of the side wall 524.
  • the power source 526 can rotate the entire collection device 500 by performing a rotational motion.
  • the power source 526 is a motor. Note that the power source 526 may be coupled only to the base 510 and not to the accumulation unit 520.
  • a culture space S1 is formed as a space surrounded by a side wall 514 on the bottom wall 512 of the base 510.
  • An accumulation space S3 is formed by the outer peripheral surface of the side wall 514 and the inner peripheral surface of the side wall 524 of the accumulation section 520.
  • the culture space S1 and the accumulation space S3 are connected via a groove 516.
  • the groove 516 forms a recovery space S2.
  • cells C are seeded to cover the upper surface of the bottom wall 512 of the base 510. As a result, the entire upper opening of the groove 516 is covered with the cells C.
  • the culture space S1 is filled with a culture solution CL for culturing the cells C.
  • the recovery space S2 and the accumulation space S3 are filled with a recovery solution RL.
  • the liquid from the cells C can be released into the groove 516.
  • the power source 526 rotates, the entire recovery device 500 rotates, and the liquid inside the groove 516 is transported to the accumulation space S3 by centrifugal force. The user can recover the recovery solution RL including the liquid portion from the accumulation space S3.
  • the liquid is forcibly transported from the recovery space S2 to the accumulation space S3 by the centrifugal force generated by the rotation about the center of the base 510. This improves the recovery efficiency of the liquid.
  • FIG. 14 is a cross-sectional view showing a modified example of the flow path structure.
  • a plurality of holes H are formed in the bottom wall B of the base as the flow path structure.
  • Each of the holes H has a size that does not allow the sample (cells C) to pass through, but allows liquid to pass through.
  • the flow path structure is not particularly limited as long as it is configured so that the sample does not pass through and liquid from the sample can pass through.
  • the flow channel structure may be in a direction perpendicular to the culture surface, or may be arranged three-dimensionally.
  • FIG. 15 is a cross-sectional view showing a modified example of the flow channel structure.
  • a complex flow channel FP which is a collection of many pores, is formed inside the bottom wall B of the base as the flow channel structure.
  • the pores constituting the flow channel FP may have an inner diameter of the submicron order.
  • the liquid from the cells C passes through the flow channel FP and is discharged from an outlet formed on a surface of the bottom wall B other than the surface on which the cells C are arranged.
  • the bottom wall B in which the submicron flow channel FP is formed inside may be a porous carrier such as a sponge.
  • a porous carrier can be formed from a curable resin such as PDMS.
  • a submicron flow channel structure can be formed inside the cured resin by dispersing nanofibers in a resin before curing, curing the resin, and then removing the nanofibers.
  • grooves are provided as the flow path structure
  • the shape and arrangement of the grooves are not limited to the above example.
  • non-linear grooves may be formed, and the width and depth of the grooves may vary.
  • Multiple grooves may be arranged parallel to each other, or may intersect each other.
  • multiple grooves may be arranged in a lattice pattern.
  • another flow path structure such as holes may be provided.
  • any sample may be the target, such as a non-biological sample such as an inorganic material or an artificial organic material, or a larger biological sample such as an organ or an organism itself.
  • the type of liquid is not limited to the above example.
  • the above collection device can be applied to any liquid, such as lymph, interstitial fluid, blood, urine, eluates, products of chemical reactions, and extracts.
  • the collection device can be used to collect lymph from various tissues or organs.
  • the size and configuration of the culture space S1, the accumulation space S3, the collection space S2 formed by the flow path structure, etc. may be changed as appropriate depending on the target sample or liquid.
  • the use of the device according to the embodiment is not limited to the above example.
  • the device can also be applied to cases where liquid is only observed or analyzed without being recovered.
  • Example 1 Experiment on accumulation of CDF in groove>
  • a PDMS substrate with grooves (groove width: 1.4 ⁇ m, depth: 1 ⁇ m, pitch between adjacent grooves: 20 ⁇ m) was prepared using a mold prepared by machining.
  • This PDMS substrate was attached to a well array, and collagen for cell adhesion was applied to the upper surface of the PDMS substrate (hereinafter, the surface coated with collagen is referred to as the "sample surface"). Hepatocytes were seeded on the entire sample surface, and a medium was poured on top of it.
  • a sample (-) without the addition of benzbromarone (hereinafter, also simply referred to as the "inhibitor”), an MRP2 inhibitor, and a sample (+) with the inhibitor added were prepared.
  • carboxydichlorofluorescein diacetate (CDFDA) was added to the medium.
  • CDFDA is taken up by hepatocytes and then released via the MRP2 transporter as carboxydichlorofluorescein (CDF), a fluorescent substance. Therefore, the sample surface of the PDMS substrate was observed by a bright-field microscope and a fluorescent microscope.
  • FIG. 16 shows a bright field photograph of the sample surface (left), a fluorescent photograph of the cell layer (center), and a fluorescent photograph of the groove layer (right).
  • the upper side of FIG. 16 shows the experimental results without an inhibitor (-), and the lower side of FIG. 16 shows the experimental results with an inhibitor (+).
  • the fluorescent substance CDF accumulates inside the grooves without the inhibitor (-), whereas CDF does not accumulate inside the grooves with the inhibitor (+). That is, when the inhibitor was not added, it was confirmed that CDFDA was taken up by the hepatocytes on the sample surface and CDF was released from the hepatocytes into the grooves. On the other hand, when the inhibitor was added, it was confirmed that the excretion of CDF was inhibited and only accumulated inside the hepatocytes, and was not released from the hepatocytes into the grooves.
  • FIG. 17 shows a bright field photograph of the sample surface (left), a fluorescent photograph of the cell layer (center), and a fluorescent photograph of the groove layer (right). The upper side of FIG. 17 shows the results without an inhibitor (-), and the lower side of FIG. 17 shows the results with an inhibitor (+).
  • the fluorescent substance CLF accumulates inside the grooves without the inhibitor (-), while CLF does not accumulate inside the grooves with the inhibitor (+). That is, it was confirmed that CLF was released from the hepatocytes into the grooves when the inhibitor was not added. On the other hand, it was confirmed that CLF was not released from the hepatocytes into the grooves when the inhibitor was added.
  • PDMS substrates with groove widths of 0.8 ⁇ m, 1.5 ⁇ m, 3 ⁇ m, and 5 ⁇ m were fabricated.
  • the grooves were formed on the PDMS substrates by photolithography.
  • the groove depth was set to 1 ⁇ m.
  • the groove depth was set to 5 ⁇ m.
  • the pitch between adjacent grooves was set to 3 ⁇ m.
  • PDMS substrates with groove widths of 0.8 ⁇ m, 1.5 ⁇ m, 3 ⁇ m, and 5 ⁇ m were fabricated with a pitch between adjacent grooves of 30 ⁇ m.
  • the groove depth was set to 1 ⁇ m.
  • the groove depth was set to 5 ⁇ m.
  • a recovery device having the configuration described as the first embodiment was fabricated. Specifically, a disk-shaped base having many radial grooves was fabricated by pouring PDMS into a mold having many convex structures fabricated by photolithography and baking it. The width of the groove was 3 ⁇ m and the depth of the groove was 5 ⁇ m. Next, a cylindrical storage part made of PDMS was bonded to the upper surface of the base by O2 plasma treatment. Next, collagen for adhesion was applied to the upper surface of the outer part of the base located outside the storage part (hereinafter, the surface applied with collagen is referred to as the "sample surface"). As a result, a recovery device as shown in FIG. 2 was obtained. The fabricated recovery device was attached to a well array as shown in FIG. 1.
  • Experimental Example 5 Evaluation of transportation performance of recovery device Using the prepared recovery device, it was examined whether CLF would be transported to the accumulation section through the groove when CLF was added only to the culture space outside the accumulation section. Specifically, 2000 ⁇ L of medium containing 10 ⁇ M CLF was added to the culture space without seeding hepatocytes on the sample surface of the base, and 10 ⁇ L of medium not containing CLF was added to the accumulation space inside the accumulation section. The recovery device was then left to stand, and the changes over time in the base and accumulation section in the groove layer of the recovery device were observed using a fluorescent microscope. Figure 18 shows fluorescent photographs of the recovery device at 0, 15, 60, 120, and 240 minutes after the addition of CLF.
  • the lower right of Figure 18 shows an enlarged view of the fluorescent photograph at 240 minutes after the addition of CLF. From this enlarged view, it was confirmed that the CLF was transported from the culture space to the storage space through the groove connecting the culture space and the storage space (i.e., the groove under the peripheral wall of the storage part).
  • the medium was aspirated and washed twice with medium, and then 500 ⁇ L of medium containing 10 ⁇ M troglitazone was added to the culture space formed on the upper side of the sample surface of the base (i.e., the outer space of the accumulation part) for the sample with inhibitor (+) and incubated at 37° C. under 5% CO 2 for 15 minutes. Troglitazone was not added to the sample without inhibitor ( ⁇ ).
  • the medium was aspirated, and 2 mL of medium containing 10 ⁇ M troglitazone and 5 ⁇ M CLF was added to the culture space formed on the upper side of the sample surface of the base (i.e., the outer space of the accumulation part) for the sample with inhibitor (+), and 2 mL of medium containing 5 ⁇ M CLF without troglitazone was added to the culture space formed on the upper side of the sample surface of the base (i.e., the outer space of the accumulation part) for the sample without inhibitor ( ⁇ ). 10 ⁇ L of medium without CLF was added to the accumulation space (i.e., the inner space of the accumulation part). Then, incubated at 37° C. under 5% CO 2 for 120 minutes.
  • the cell layer and the groove layer were observed using a confocal microscope for both the samples without inhibitor (-) and with inhibitor (+).
  • the supernatant was collected from both the culture space and the storage space, and the fluorescence intensity of the collected supernatant was measured using an ultra-microspectrophotometer Nanodrop (Thermo Fisher). Note that in this procedure, a medium not containing fetal bovine serum was used.
  • Figure 20 shows a bright field photograph of the cell layer (top) and a fluorescent photograph of the sulcus layer (bottom) in the outer part of the base.
  • the left side of Figure 20 shows the results without inhibitors (-), and the right side of Figure 20 shows the results with inhibitors (+). It was confirmed that when no inhibitors were added, the fluorescent bile acid CLF accumulated in the sulcus, whereas when inhibitors were added, CLF did not accumulate in the sulcus. These results confirmed that bile acids were transported from the culture space into the sulcus by the bile acid transport function of hepatocytes.
  • Figure 21 shows a bright field photograph (top) of the cell layer near the boundary between the outer part of the base and the peripheral wall of the accumulation area, and a fluorescent photograph (bottom) of the groove layer.
  • the left side of Figure 21 shows the results without inhibitors (-), and the right side of Figure 21 shows the results with inhibitors (+). It was confirmed that without inhibitors (-), CLF flowed into the groove below the peripheral wall of the accumulation area, whereas with inhibitors (+), the amount of CLF flowing into the groove was less than without inhibitors (-).
  • Figure 22 shows the fluorescence intensity of the supernatant recovered from the culture space.
  • Figure 23 shows the fluorescence intensity of the supernatant recovered from the storage space.
  • Example 7 Comparative experiment with existing methods>
  • a CLF assay was performed using the prepared recovery device, and a B-CLEAR test (sandwich culture hepatocyte test), which is an existing bile acid recovery method, was performed to compare the two methods. Details of the CLF assay are omitted since they are the same as in Experimental Example 6.
  • B-clear test hepatocytes seeded at 2 ⁇ 10 5 cells/cm 2 were cultured for 3 days, washed twice with HBSS(+) or HBSS(-) containing 1 mM EGTA, and incubated for 10 minutes at 37° C.
  • hepatocytes were dissolved in 500 ⁇ L of PBS(-) solution containing 0.5% Triron X-100. Then, the mixture was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected.
  • the fluorescence intensity of the collected supernatant was measured using a Nanodrop ultra-microspectrophotometer (Thermo Fisher), and the difference in the average fluorescence intensity under each condition (HBSS(+)-HBSS(-)) was calculated.
  • the concentration of CLF was calculated by preparing a calibration curve.
  • Figure 24 shows the CLF concentration of the supernatant collected by the conventional technology (B-CLEAR test) and the prepared collection device (this device).
  • Figure 25 shows the CLF amount of the supernatant collected by the conventional technology (B-CLEAR test) and the prepared collection device (this device). It was confirmed that when this device was used, CLF could be collected at a CLF concentration approximately 70 times higher and in approximately twice the amount compared to when the conventional technology was used. Furthermore, while in the conventional technology, liver cells were destroyed by Triton X-100, when this device was used, liver cells remained undestroyed on the sample surface at the base.
  • Recovery system 10 ... Well array (well device) 14... Well 100, 200, 300, 400... Recovery device (device) 110, 210, 310, 410...base portion 112, 214, 318, 418...groove (channel structure) 120, 220, 320, 420...Storage section S1...Culture space S2...Recovery space S3...Storage space C...Cell CL...Culture fluid RL...Recovery fluid

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Abstract

本開示に係るデバイスは、試料を支持し、流路構造が形成された基部と、使用時に流路構造と連通する蓄積空間を有する蓄積部と、を備え、試料からの液状物が、流路構造を通って蓄積空間に蓄積される。

Description

デバイス、システム、方法、および薬剤評価方法
　本発明の実施形態は、デバイス、システム、方法、および薬剤評価方法に関する。本願は、２０２２年１０月１３日に日本国に出願された特願２０２２－１６４４２１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　細胞や組織などの試料から放出されるターゲット物質の回収および分析を行う手法が知られている（特許文献１など）。たとえば、肝細胞からの胆汁成分は、肝臓から排泄される肝代謝化合物を含む。このような胆汁を回収して、肝代謝化合物の排泄経路を理解することは、医薬品開発などの分野において非常に重要である。
日本国特表２０１１－５２０８３９号公報
　しかしながら、ターゲット物質に対する回収、分析などの処理効率が十分でない場合があった。
　本発明が解決しようとする課題は、ターゲット物質に対する処理効率を向上させることができるデバイス、システム、方法、および薬剤評価方法を提供することである。
　本発明は、以下の態様を含み得る。
［１］試料を支持し、流路構造が形成された基部と、使用時に前記流路構造と連通する蓄積空間を有する蓄積部と、を備え、前記試料からの液状物が、前記流路構造を通って前記蓄積空間に蓄積される、デバイス。
［２］前記流路構造の一端が前記試料によって塞がれ、前記流路構造の他端が前記蓄積空間と連通している、［１］に記載のデバイス。
［３］前記流路構造は、前記基部に形成された溝を含む、［１］または［２］に記載のデバイス。
［４］前記溝の幅は、前記試料が通過できない大きさである、［３］に記載のデバイス。
［５］前記溝の幅は、０．１μｍ以上１０μｍ以下である、［３］または［４］に記載のデバイス。
［６］前記流路構造は、前記基部上に放射状に配置された複数の溝を含み、前記蓄積部は、前記基部の中央部に設けられる、［１］～［５］のいずれかに記載のデバイス。
［７］前記蓄積部は、上部開口および下部開口を有し、前記液状物は、前記下部開口から蓄積空間に流入する、［１］～［６］のいずれかに記載のデバイス。
［８］前記流路構造は、使用時に前記液状物を含む液体で満たされる、［１］～［７］のいずれかに記載のデバイス。
［９］前記試料は、細胞および／または組織である、［１］～［８］のいずれかに記載のデバイス。
［１０］前記試料は、肝細胞を含み、前記液状物は、胆汁酸を含む、［９］に記載のデバイス。
［１１］前記基部は、前記細胞および／または組織が培養される培養空間を少なくとも部分的に画定する、［９］または［１０］に記載のデバイス。
［１２］前記試料は、前記培養空間と前記蓄積空間との連通を遮断するように配置される、［１１］に記載のデバイス。
［１３］［１］～［１２］のいずれかに記載のデバイスと、前記デバイスを収容するウェルを有するウェルデバイスと、を備える、システム。
［１４］流路構造が形成された基部と、使用時に前記流路構造と連通する蓄積空間を有する蓄積部と、を備えるデバイスを用意するステップと、前記基部上に試料を配置するステップと、前記試料からの液状物を、前記流路構造を通して前記蓄積空間に蓄積するステップと、を含む、方法。
［１５］［１］～［１２］のいずれかに記載のデバイスを用いた薬剤評価方法であって、前記基部に支持された前記試料または前記蓄積された液状物に薬剤を接触させるステップと、前記薬剤の接触による刺激に対する前記試料もしくは前記液状物の応答、または前記試料に対する前記薬剤の浸透性もしくは透過性を測定するステップと、を含む、薬剤評価方法。
　本発明によれば、ターゲット物質に対する処理効率を向上させることができるデバイス、システム、方法、および薬剤評価方法を提供することができる。
第１実施形態に係る回収システム１の斜視図である。 第１実施形態に係る回収デバイス１００の斜視図である。 第１実施形態に係る回収デバイス１００の上面図である。 第１実施形態に係る回収デバイス１００を図３の線ＩＶ－ＩＶで切断した断面図である。 第１実施形態に係る回収デバイス１００の使用方法を示す断面図である。 第２実施形態に係る回収デバイス２００の断面図である。 第３実施形態に係る回収デバイス３００の斜視図である。 第３実施形態に係る回収デバイス３００を図７の線ＶＩＩＩ－ＶＩＩＩで切断した断面図である。 第４実施形態に係る回収デバイス４００の斜視図である。 第４実施形態に係る回収デバイス４００を図９の線Ｘ－Ｘで切断した断面図である。 第４実施形態に係る回収デバイス４００の使用方法の変形を示す断面図である。 第５実施形態に係る回収デバイス５００の斜視図である。 第５実施形態に係る回収デバイス５００を図１２の線ＸＩＩＩ－ＸＩＩＩで切断した断面図である。 流路構造の変形例を示す断面図である。 流路構造の変形例を示す断面図である。 実験例１で撮影された試料面の明視野写真（左）、細胞レイヤの蛍光写真（中央）、および溝レイヤの蛍光写真（右）である。 実験例２で撮影された試料面の明視野写真（左）、細胞レイヤの蛍光写真（中央）、および溝レイヤの蛍光写真（右）である。 実験例５で撮影された回収デバイスの蛍光写真である。 実験例６で撮影された試料面上の肝細胞の明視野写真である。 実験例６で撮影された、基部の外側部分における細胞レイヤの明視野写真（上）および溝レイヤの蛍光写真（下）である。 実験例６で撮影された、基部の外側部分と蓄積部の周壁との境界付近における細胞レイヤの明視野写真（上）および溝レイヤの蛍光写真（下）である。 実験例６において培養空間から回収した上澄み液の蛍光強度を示す。 実験例６において蓄積空間から回収した上澄み液の蛍光強度を示す。 実験例７における、従来技術および作製した回収デバイスによって回収された上澄み液のＣＬＦ濃度を示す。 実験例７における、従来技術および作製した回収デバイスによって回収された上澄み液のＣＬＦ量を示す。
　以下、実施形態のデバイス、システム、方法、および薬剤評価方法を、図面を参照して説明する。なお、図面は模式的または概念的なものであり、各部分の厚みと幅との関係、部分間の大きさの比率などは、必ずしも現実のものと同一とは限らない。また、同じ部分を表す場合であっても、図面により互いの寸法や比率が異なって表される場合もある。また、図面に示すＸＹＺ座標は、説明の便宜上定義されたものであり、発明を限定するものではない。
＜概要＞
　一実施形態によれば、試料を支持し、流路構造が形成された基部と、使用時に流路構造と連通する蓄積空間を有する蓄積部と、を備え、試料からの液状物が、流路構造を通って蓄積空間に蓄積される、デバイスが提供される。
　別の実施形態によれば、流路構造が形成された基部と、使用時に流路構造と連通する蓄積空間を有する蓄積部と、を備えるデバイスを用意するステップと、基部上に試料を配置するステップと、試料からの液状物を、流路構造を通して蓄積空間に蓄積するステップと、を含む方法が提供される。
　本明細書において、「流路構造」とは、流体が通過可能である構造を意味する。流路構造の例として、孔、開口、溝、メッシュ、管などが挙げられるが、これらに限定されない。
＜第１実施形態＞
　図１～図５を参照して、第１実施形態に係る回収システム１（「システム」の一例）および回収デバイス１００（「デバイス」の一例）について説明する。
［回収システム１の全体構成］
　図１は、第１実施形態に係る回収システム１の斜視図である。
　図１に示すように、回収システム１は、ウェルアレイ１０（「ウェルデバイス」の一例）および１以上の回収デバイス１００を備える。
　ウェルアレイ１０は、本体１２および本体１２上にマトリックス状に配列された多数のウェル１４を有する。ウェル１４は、本体１２の上面に、ウェル底面１６およびウェル側面１８を有する凹部として形成される。図１に示す例では、ウェル１４は、本体１２を貫通せずウェル底面１６を有しているが、ウェル１４が本体１２を貫通してもよい。図１に示すように、各ウェル１４は、回収デバイス１００を収容可能である。なお、ウェル１４の形状、大きさ、配置などは上記例に限定されない。なお、ウェル底面１６が酸素透過膜で形成されていると、後述のように試料として肝細胞を使用する場合に、肝細胞の機能や単層形成能の点で好ましいが、ウェルアレイ１０（ウェル底面１６を含む）の材質は特に限定されない。
（回収デバイス１００の構成）
　図２は、第１実施形態に係る回収デバイス１００の斜視図である。
　図３は、第１実施形態に係る回収デバイス１００の上面図である。
　図４は、第１実施形態に係る回収デバイス１００を図３の線ＩＶ－ＩＶで切断した断面図である。
　図２に示すように、回収デバイス１００は、基部１１０および蓄積部１２０を有する。基部１１０は、上面１１０Ａおよび下面１１０Ｂを有する円盤状の部材である。蓄積部１２０は、周壁１２２を有する中空の管状部材である。蓄積部１２０は、上部開口および下部開口を有する。蓄積部１２０は、基部１１０の中央部において、上面１１０Ａに設けられている。基部１１０および蓄積部１２０は、別々に成形された後で任意の方法で接合されてもよく、一体成形されてもよい。
　図２および図３に示すように、基部１１０は、外側部分１１０Ｃおよび内側部分１１０Ｄを有する。外側部分１１０Ｃは、基部１１０のうち、周縁から蓄積部１２０の内周面に対応する位置までの部分である。内側部分１１０Ｄは、基部１１０のうち、蓄積部１２０の内部に対応する部分である。図２に示すように、内側部分１１０Ｄでは、基部１１０の上面１１０Ａに円形の凹部が形成されている。凹部の直径は、蓄積部１２０の内部空間の直径と略等しい。
　図２および図３に示すように、外側部分１１０Ｃでは、基部１１０の上面１１０Ａに、放射状に配置された複数の溝１１２（「流路構造」の一例）が形成されている。複数の溝１１２の各々は、その一端を蓄積部１２０に向けるように配置される。具体的には、溝１１２は、基部１１０の周縁から基部１１０の中心部に向かって直線状に延在する。図３および図４に示すように、溝１１２の一端は、流出口１１４を形成し、内側部分１１０Ｄに形成された凹部と連通している。すなわち、図２に示すように、複数の溝１１２からの流出口１１４が、内側部分１１０Ｄの凹部を囲むように配置される。溝１１２の他端は、図２および図３に示す例では基部１１０の周縁の直前で終端しているが、完全に周縁まで延在してもよい。
　図４に示すように、溝１１２は、蓄積部１２０の下端１２４の下を通過して、基部１１０の内側部分１１０Ｄの凹部と連通する。このため、基部１１０の外側部分１１０Ｃの上の空間と、内側部分１１０Ｄの上の空間（すなわち、蓄積部１２０の内部空間）とは、溝１１２を介して連通している。このようにして、溝１１２は、蓄積部１２０の外部空間と内部空間との間の流路構造として機能する。
　図１に示すように、回収デバイス１００は、一般的なウェルアレイ１０に挿入できるように構成される。これにより、既存のウェルアレイ１０を使用することができるので、回収デバイス１００は、高い汎用性を有する。
［回収システム１の使用方法］
　図５は、第１実施形態に係る回収デバイス１００の使用方法を示す断面図である。
　図５に示すように、使用時には、回収デバイス１００がウェルアレイ１０のウェル１４内に挿入される。基部１１０の下面１１０Ｂは、ウェル底面１６に支持される。
　図５に示すように、基部１１０の外側部分１１０Ｃにわたって上面１１０Ａ上に細胞Ｃまたは組織（「試料」の一例）を播種することにより、外側部分１１０Ｃにおける基部１１０の上面１１０Ａの全体が、細胞Ｃによって覆われる。その結果、溝１１２によって形成される流路構造の一端は、細胞Ｃによって塞がれる。流路構造の他端は、内側部分１１０Ｄの凹部および蓄積部１２０の内部空間と連通している。このようにして、溝１１２を介して連通していた蓄積部１２０の外部空間および内部空間は、上面１１０Ａを覆う細胞Ｃによって空間的に分離される。なお、上面１１０Ａには、細胞を上面１１０Ａに接着させるための接着剤が塗布されてよい。接着剤は、生体適合性を有するものが好ましくは、たとえばコラーゲンなどが挙げられる。
　細胞Ｃは、トランスポーターの作用などにより、液状物を放出することができる。たとえば、細胞Ｃは、極性輸送を行う機能を有する。細胞Ｃに溝１１２が隣接しているので、細胞Ｃからの液状物が、溝１１２の内部空間に放出され得る。なお、試料から液状物が放出される原理は上記例に限定されず、本発明は、任意の種類の試料から任意の原理で放出される液状物に対して適用可能である。
　溝１１２は、細胞Ｃが通過できない大きさを有する。ここで、細胞Ｃの大きさにはばらつきがあるので、本明細書において「通過できない」とは、添加した試料の少なくとも８０体積％が通過しないことを意味する。たとえば、溝１１２の幅は、０．１μｍ以上１０μｍ以下、０．３μｍ以上８μｍ以下、０．５μｍ以上６μｍ以下、または１μｍ以上５μｍ以下である。溝１１２の幅が０．１μｍ未満である場合には、細胞Ｃからの液状物の輸送に必要な圧力が増加し、圧力損失が大きくなる可能性がある。溝１１２の幅が１０μｍを超える場合には、細胞Ｃが溝１１２の内部に入ってしまう可能性がある。たとえば、肝細胞は１０μｍ～２０μｍ程度であるので、１０μｍを超える幅を有する溝１１２の内部に入ってしまう可能性がある。
　溝１１２の深さは、特に限定されないが、たとえば、０．１μｍ以上２０μｍ以下、０．３μｍ以上１５μｍ以下、０．５μｍ以上１０μｍ以下、または１μｍ以上５μｍ以下である。隣接する溝１１２の間の間隔（ピッチ）は、特に限定されないが、たとえば、０．１μｍ以上１００μｍ以下、０．５μｍ以上７０μｍ以下、１μｍ以上５０μｍ以下、または３μｍ以上３０μｍ以下である。
　基部１１０の上面１１０Ａに細胞Ｃを配置する場合には、図５に示すように、上面１１０Ａを覆う細胞Ｃ、蓄積部１２０の周壁１２２、およびウェル底面１６が、ドーナツ型の培養空間Ｓ１を画定する。培養空間Ｓ１は、培養液（培地）ＣＬで満たされる。培養空間Ｓ１では、細胞Ｃの培養を行うことができる。一方、上部が細胞Ｃによって覆われた複数の溝１１２は、回収空間Ｓ２を画定する。基部１１０の内側部分１１０Ｄに形成された凹部および蓄積部１２０の周壁１２２は、蓄積空間Ｓ３を画定する。回収空間Ｓ２および蓄積空間Ｓ３は、互いに連通した状態で、回収液ＲＬで満たされる。回収液ＲＬは、たとえば、培養液ＣＬと同じ種類の培地である。たとえば、蓄積部１２０の上部開口から回収液ＲＬを添加することにより、溝１１２の内部空間（すなわち、回収空間Ｓ２）および蓄積部１２０の内部空間（すなわち、蓄積空間Ｓ３）を回収液ＲＬで満たすことができる。このように、使用時に溝１１２の内部を回収液ＲＬで満たすことにより、細胞Ｃが乾燥するのを防止することができる。
　細胞Ｃからの液状物が溝１１２の内部へ排出されると、液状物は、回収液ＲＬ中を拡散し、溝１１２を通過して、蓄積部１２０の下部開口から蓄積空間Ｓ３へ流入する。このようにして、細胞Ｃからの液状物が、回収空間Ｓ２を通過して蓄積空間Ｓ３に輸送される。その結果、液状物を含む回収液ＲＬが蓄積空間Ｓ３に蓄積される。これにより、ユーザは、蓄積部１２０の上部開口から液状物を含む回収液ＲＬを回収することができる。このように、蓄積部１２０が上部開口を有すると、回収液ＲＬの回収が容易になる。
　細胞Ｃは、溝１１２の上部を覆うことによって、培養空間Ｓ１と回収空間Ｓ２および蓄積空間Ｓ３とが連通しないように、培養空間Ｓ１と回収空間Ｓ２および蓄積空間Ｓ３とを仕切る。すなわち、細胞Ｃは、培養空間Ｓ１と回収空間Ｓ２および蓄積空間Ｓ３との連通を遮断するように配置される。これにより、細胞Ｃから溝１１２に放出された液状物が移動できる範囲が限定される。すなわち、細胞Ｃからの液状物は、培養空間Ｓ１に移動できないので、回収空間Ｓ２を通って蓄積空間Ｓ３に輸送されることになる。
　なお、図５に示すように、培養空間Ｓ１における培養液ＣＬの液面高さと、蓄積空間Ｓ３における回収液ＲＬの液面高さとは異なってよい。理論によって本発明を拘束するものではないが、培養空間Ｓ１における液面高さよりも蓄積空間Ｓ３における液面高さが小さい場合には、水圧によって細胞Ｃからの液状物の放出が促進される可能性がある。
　たとえば、細胞Ｃは、肝細胞を含み、好ましくは肝細胞である。この場合、液状物は、胆汁酸を含み、好ましくは胆汁である。肝細胞は、肝トランスポーターの作用によって胆汁を排泄する。図５に示す細胞Ｃが肝細胞である場合、肝細胞から排泄された胆汁は、溝１１２を通過して蓄積空間Ｓ３に輸送される。ユーザは、肝細胞から排泄された胆汁を蓄積空間Ｓ３から回収することができる。この場合、溝の幅が毛細胆管程度（数μｍ）であれば、生態環境を良好に再現することができる。
　肝臓は、生体代謝反応の中心を担う臓器である。肝臓で生成した肝代謝化合物は、血液中または胆汁中に排泄される。このような肝代謝化合物の排泄経路を理解することは、医薬品開発において極めて重要である。しかしながら、従来技術において、肝細胞から胆汁を回収する方法は限定的であった。たとえば、肝細胞を細胞外マトリックスでサンドイッチするサンドイッチ培養法を使用する手法では、胆汁中の代謝化合物を回収するためには、緩衝液中の二価イオンの有無によって肝細胞間の結合を弛緩させて胆汁成分を回収する方法か（Ｂ－ＣＬＥＡＲ法）、肝細胞から胆汁成分を物理的に吸引する方法が知られている。しかしながら、肝細胞間の結合を弛緩させる方法は、二価イオンの有無における条件間の差分をとるといった間接的な手法であり、また二価イオンが存在しないことで活性が下がるトランスポーターも存在し、必ずしも体内動態を反映しているとは言い難く、更には肝細胞の破壊を伴う。肝細胞から胆汁成分を物理的に吸引する方法も、肝細胞の破壊を伴い、断続的かつ煩雑な操作が必要となる。
　これに対し、回収デバイス１００を使用して肝細胞から胆汁を回収する場合、肝細胞は、基部１１０の上面１１０Ａに非破壊状態で残存する。肝細胞から排泄された胆汁成分は、連続的に蓄積空間Ｓ３に蓄積される。このような胆汁の回収および蓄積は、ほぼ自動的に進行するので、煩雑な操作を必要としない。さらに、従来技術における肝細胞間の結合を弛緩させる方法は、細胞溶解のための液体を比較的大量に使用するので、胆汁の回収液の濃度が比較的小さくなる。これに対し、上記の回収デバイス１００を使用する場合には、最初に加える回収液ＲＬの量は少量で十分であるので、十分な量の胆汁を含む回収液ＲＬを得ることができる。このように、回収デバイス１００は、細胞Ｃからの液状物を効率的に回収することができる。
［薬剤評価方法］
　一実施形態によれば、上記のデバイスを用いた薬剤評価方法であって、基部に支持された試料または蓄積された液状物に薬剤を接触させるステップと、薬剤の接触による刺激に対する試料もしくは液状物の応答、または試料に対する薬剤の浸透性もしくは透過性を測定するステップと、を含む、薬剤評価方法が提供される。
　本明細書における「薬剤」は、医薬品などの薬物のほか、化粧品や医薬部外品なども含む。たとえば、薬剤を細胞Ｃまたは基部１１０の上面１１０Ａに塗布したり、培養空間Ｓ１、回収空間Ｓ２、または蓄積空間Ｓ３に薬剤を導入したりすることにより、薬剤を細胞Ｃに接触させることができる。また、回収空間Ｓ２または蓄積空間Ｓ３に薬剤を導入することにより、蓄積された液状物に薬剤を接触させることができる。薬剤を添加した後の細胞Ｃまたは細胞Ｃからの液状物の変化、薬剤の細胞Ｃへの拡散や透過の様子、薬剤が細胞Ｃを通過して培養空間Ｓ１から回収空間Ｓ２および蓄積空間Ｓ３へ（または、回収空間Ｓ２および蓄積空間Ｓ３から培養空間Ｓ１へ）拡散する様子などを既知の任意の手法で評価することにより、薬剤の接触による刺激に対する細胞Ｃもしくは液状物の応答、または細胞Ｃに対する薬剤の浸透性もしくは透過性を測定することができる。
　このような薬剤評価方法によれば、細胞Ｃが液状物を放出している環境を再現した状態で、各種薬剤の評価を行うことができる。また、細胞Ｃから放出された液状物に対して、各種薬剤の評価を行うこともできる。
＜第２実施形態＞
　図６を参照して、第２実施形態に係る回収デバイス２００について説明する。第２実施形態は、ウェルアレイ１０を使用しなくても回収デバイス２００だけで培養空間Ｓ１が形成される点で第１実施形態と相違する。以下では、主に上記実施形態との相違点について説明し、上記実施形態と共通する点についての説明は繰り返さない。
　図６は、第２実施形態に係る回収デバイス２００の断面図である。
［回収デバイス２００の構成］
　図６に示すように、回収デバイス２００は、基部２１０および蓄積部２２０を有する。基部２１０は、底壁２１２および側壁２１８を有する。底壁２１２は、上面２１２Ａおよび下面２１２Ｂを有し、上面２１２Ａには複数の溝２１４が形成される。溝２１４は、蓄積部２２０の内部空間（蓄積空間Ｓ３）と連通する流出口２１６を形成する。側壁２１８は、第１実施形態におけるウェル１４のウェル側面１８の役割を果たす。したがって、底壁２１２の上面２１２Ａを覆うように細胞Ｃが配置された場合、上面２１２Ａを覆う細胞Ｃと、基部２１０の側壁２１８と、蓄積部２２０の周壁２２２とが、培養空間Ｓ１を画定する。溝２１４は、蓄積空間Ｓ３と連通する回収空間Ｓ２を画定する。細胞Ｃからの液状物が溝２１４の内部に放出されると、液状物は、回収空間Ｓ２から周壁２２２の下端２２４の下を通って蓄積空間Ｓ３に輸送される。ユーザは、液状物を含む回収液ＲＬを蓄積空間Ｓ３から回収することができる。
　以上のような回収デバイス２００によれば、ウェルアレイ１０を使用せずとも、回収デバイス２００単独で細胞Ｃからの液状物を回収することができる。
＜第３実施形態＞
　図７および図８を参照して、第３実施形態に係る回収デバイス３００について説明する。以下では、主に上記実施形態との相違点について説明し、上記実施形態と共通する点についての説明は繰り返さない。
　図７は、第３実施形態に係る回収デバイス３００の斜視図である。
　図８は、第３実施形態に係る回収デバイス３００を図７の線ＶＩＩＩ－ＶＩＩＩで切断した断面図である。
［回収デバイス３００の構成］
　図７および図８に示すように、回収デバイス３００は、基部３１０および蓄積部３２０を有する。
　基部３１０は、底壁３１２、側壁３１４、仕切り部３１６、および流出口３１９を有する。側壁３１４は、底壁３１２の周縁部から上方に延在する。仕切り部３１６は、底壁３１２から高さ方向（Ｚ方向）に離間した位置に設けられる。仕切り部３１６は、側壁３１４と一体に成形されてもよく、側壁３１４に結合されてもよく、側壁３１４に設けられた支持部材（図示せず）によって支持されてもよい。仕切り部３１６の上方では、側壁３１４および仕切り部３１６が培養空間Ｓ１を画定する。底壁３１２と仕切り部３１６との間には、回収空間Ｓ２が形成される。流出口３１９は、回収空間Ｓ２と連通して設けられる。
　図７に示すように、仕切り部３１６は、複数の溝３１８が形成された平面状の部材である。たとえば、仕切り部３１６は、板状部材、膜、フィルムなどであってよい。溝３１８は、仕切り部３１６を高さ方向に貫通するように形成される。溝３１８の数、大きさ、形状、および配置は、図示される例に限定されない。あるいは、溝３１８の代わりに、仕切り部３１６を高さ方向に貫通する多数の孔など、試料を通さず試料からの液状物のみを通過させる任意の流路構造が採用されてよい。
　図７および図８に示すように、蓄積部３２０は、底壁および側壁を有する容器である。底壁および側壁によって蓄積空間Ｓ３が形成される。蓄積部３２０は、流入口３２２を有する。図８に示すように、流出口３１９と流入口３２２とが接続されることにより、回収空間Ｓ２と蓄積空間Ｓ３とが連通する。
［回収デバイス３００の使用方法］
　図８に示すように、細胞Ｃが、仕切り部３１６の上面を覆うように播種される。上記の実施形態と同様に、培養空間Ｓ１は、細胞Ｃを培養するための培養液ＣＬで満たされる。回収空間Ｓ２および蓄積空間Ｓ３は、回収液ＲＬで満たされる。細胞Ｃからの液状物は、溝３１８を通過して回収空間Ｓ２に放出され、流出口３１９および流入口３２２を通過して蓄積空間Ｓ３に拡散される。ユーザは、蓄積空間Ｓ３から、液状部を含む回収液ＲＬを回収することができる。
　以上のような回収デバイス３００によれば、基部３１０と蓄積部３２０とを互いに取り外し可能に連結できるので、回収デバイス３００の取り扱い性が向上し得る。また、試料に接触する仕切り部３１６を基部３１０の本体部分から独立した部材として設ければ、回収デバイス３００の取り扱い性がさらに向上し得る。
＜第４実施形態＞
　図９～図１１を参照して、第４実施形態に係る回収デバイス４００について説明する。以下では、主に上記実施形態との相違点について説明し、上記実施形態と共通する点についての説明は繰り返さない。
　図９は、第４実施形態に係る回収デバイス４００の斜視図である。
　図１０は、第４実施形態に係る回収デバイス４００を図９の線Ｘ－Ｘで切断した断面図である。
［回収デバイス４００の構成］
　図９および図１０に示すように、回収デバイス４００は、基部４１０および蓄積部４２０を有する。基部４１０は、蓄積部４２０に収容されるように蓄積部４２０と結合される。
　基部４１０は、底壁４１２、側壁４１４、およびフランジ４１６を有する。底壁４１２は、円筒状の側壁４１４の下端に取り付けられている。底壁４１２は、側壁４１４と一体に設けられてもよく、側壁４１４に取り付けられた板状部材、膜、フィルムなどとして設けられてもよい。フランジ４１６は、側壁４１４の上端に設けられ、側壁４１４から周方向外側に突出している。底壁４１２には、放射状に配置された複数の溝４１８が形成されている。溝４１８は、底壁４１２を高さ方向（Ｚ方向）に貫通するように形成される。溝４１８の数、大きさ、形状、および配置は、図示される例に限定されない。あるいは、溝４１８の代わりに、底壁４１２を高さ方向に貫通する多数の孔など、試料を通さず試料からの液状物のみを通過させる任意の流路構造が採用されてよい。
　蓄積部４２０は、底壁４２２、側壁４２４、および支持部４２６を有する。側壁４２４は、底壁４２２の周縁部から上方に延在する。支持部４２６は、円筒状の側壁４２４の上端に設けられ、側壁４２４から周方向内側に突出している。支持部４２６の内径は、基部４１０の側壁４１４の外径と略一致することが好ましい。
　図１０に示すように、基部４１０は、蓄積部４２０に上から挿入されて蓄積部４２０に装着される。支持部４２６は、フランジ４１６を下から支持する。支持部４２６は、蓄積部４２０に対する基部４１０の水平方向（ＸＹ面内方向）の位置合わせをガイドすることができる。底壁４１２の上で側壁４１４に囲まれた空間として、培養空間Ｓ１が形成される。底壁４１２の下面および蓄積部４２０の内面によって、回収空間Ｓ２および蓄積空間Ｓ３が形成される。本実施形態では、回収空間Ｓ２および蓄積空間Ｓ３は一致する。なお、基部４１０が蓄積部４２０に装着された状態で空間Ｓ２、Ｓ３に回収液ＲＬを添加したり、空間Ｓ２、Ｓ３内の回収液ＲＬを回収したりするために、空間Ｓ２、Ｓ３と外部空間とを連通させる開口部が蓄積部４２０に（必要であれば基部４１０にも）形成されてもよい。
［回収デバイス４００の使用方法］
　図１０に示すように、細胞Ｃが、基部４１０の底壁４１２の上面を覆うように播種される。上記の実施形態と同様に、培養空間Ｓ１は、細胞Ｃを培養するための培養液ＣＬで満たされる。回収空間Ｓ２および蓄積空間Ｓ３は、回収液ＲＬで満たされる。細胞Ｃからの液状物は、溝４１８を通過して空間Ｓ２、Ｓ３に放出される。ユーザは、空間Ｓ２、Ｓ３から、液状部を含む回収液ＲＬを回収することができる。
［回収デバイス４００の使用方法の変形例］
　別の使用方法として、図１１に示す態様も実施可能である。
　図１１は、第４実施形態に係る回収デバイス４００の使用方法の変形を示す断面図である。
　図１１に示す例では、細胞Ｃが、基部４１０の底壁４１２の下面を覆うように播種される。底壁４１２の下面に細胞Ｃを播種するためには、たとえば、次のような方法が使用可能である。まず、基部４１０を上下引っくり返して、底壁４１２の下面に細胞Ｃを播種する。蓄積部４２０に培養液ＣＬを投入した後、底壁４１２の下面に細胞Ｃが播種された状態の基部４１０を再び上下引っくり返して、蓄積部４２０に装着する。次いで、基部４１０に回収液ＲＬを投入する。
　図１１に示す例では、上記の例とは逆に、底壁４１２の上で側壁４１４に囲まれた空間として、回収空間Ｓ２および蓄積空間Ｓ３が形成される。底壁４１２の下面および蓄積部４２０の内面によって、培養空間Ｓ１が形成される。培養空間Ｓ１は、細胞Ｃを培養するための培養液ＣＬで満たされる。回収空間Ｓ２および蓄積空間Ｓ３は、回収液ＲＬで満たされる。細胞Ｃからの液状物は、溝４１８を通過して空間Ｓ２、Ｓ３に放出される。ユーザは、空間Ｓ２、Ｓ３から、液状部を含む回収液ＲＬを回収することができる。
　以上のような回収デバイス４００によれば、基部４１０と蓄積部４２０とを互いに取り外し可能に連結できるので、回収デバイス４００の取り扱い性が向上し得る。また、試料に接触する底壁４１２を基部４１０の側壁４１４から独立した部材として設ければ、回収デバイス４００の取り扱い性がさらに向上し得る。さらに、具体的な用途に応じて、培養空間Ｓ１と回収空間Ｓ２および蓄積空間Ｓ３との配置関係を逆転させることができる。
＜第５実施形態＞
　図１２および図１３を参照して、第５実施形態に係る回収デバイス５００について説明する。以下では、主に上記実施形態との相違点について説明し、上記実施形態と共通する点についての説明は繰り返さない。
　図１２は、第５実施形態に係る回収デバイス５００の斜視図である。
　図１３は、第５実施形態に係る回収デバイス５００を図１２の線ＸＩＩＩ－ＸＩＩＩで切断した断面図である。
［回収デバイス５００の構成］
　図１２および図１３に示すように、回収デバイス５００は、基部５１０および蓄積部５２０を有する。基部５１０は、蓄積部５２０と一体に形成されてもよく、別体として形成されて互いに接合されてもよい。
　基部５１０は、底壁５１２および側壁５１４を有する。蓄積部５２０は、底壁５２２、側壁５２４、および動力源５２６を有する。基部５１０の底壁５１２は、円筒状の側壁５１４の下端に設けられるとともに、蓄積部５２０の底壁５２２上に配置されている。底壁５１２は、側壁５１４および／または底壁５２２と一体に設けられてもよく、側壁５１４および／または底壁５２２に取り付けられた板状部材、膜、フィルムなどとして設けられてもよい。底壁５１２には、放射状に配置された複数の溝５１６が形成されている。溝５１６の数、大きさ、形状、および配置は、図示される例に限定されない。底壁５１２は、溝５１６を画定するように、底壁５２２上の突出部として設けられてもよい。蓄積部５２０の側壁５２４は、底壁５２２の周縁部から上方に延在する。動力源５２６は、側壁５２４の底面に結合されている。動力源５２６は、回転運動をすることによって回収デバイス５００全体を回転させることができる。たとえば、動力源５２６は、モータである。なお、動力源５２６は、基部５１０のみに結合され、蓄積部５２０には結合されなくてもよい。
　図１３に示すように、基部５１０の底壁５１２の上で側壁５１４に囲まれた空間として、培養空間Ｓ１が形成される。側壁５１４の外周面および蓄積部５２０の側壁５２４の内周面によって、蓄積空間Ｓ３が形成される。培養空間Ｓ１および蓄積空間Ｓ３は、溝５１６を介して連通している。溝５１６は、回収空間Ｓ２を形成する。
［回収デバイス５００の使用方法］
　図１３に示すように、細胞Ｃが、基部５１０の底壁５１２の上面を覆うように播種される。これにより、溝５１６の上側開口の全体が細胞Ｃによって覆われる。上記の実施形態と同様に、培養空間Ｓ１は、細胞Ｃを培養するための培養液ＣＬで満たされる。回収空間Ｓ２および蓄積空間Ｓ３は、回収液ＲＬで満たされる。細胞Ｃからの液状物は、溝５１６内に放出され得る。動力源５２６が回転すると、回収デバイス５００全体が回転し、溝５１６内部の液状物が、遠心力によって蓄積空間Ｓ３に輸送される。ユーザは、蓄積空間Ｓ３から、液状部を含む回収液ＲＬを回収することができる。
　以上のような回収デバイス５００によれば、基部５１０の中心を基準とする回転によって生じる遠心力により、液状物が回収空間Ｓ２から蓄積空間Ｓ３へ強制的に輸送される。これにより、液状物の回収効率を向上させることができる。
＜変形例＞
　上記実施形態では、流路構造の一例として溝が形成される例を説明したが、流路構造の構成は上記例に限定されない。たとえば、第３実施形態および第４実施形態のような構成では、複数の孔が流路構造として設けられてもよい。図１４は、流路構造の変形例を示す断面図である。図１４に示す例では、流路構造として、基部の底壁Ｂに複数の孔Ｈが形成されている。孔Ｈの各々は、試料（細胞Ｃ）が通過できない大きさを有する一方、液状物を通過させることができる。その他、流路構造は、試料が通過せず、試料からの液状物が通過できる構成であれば、特に限定されない。
　たとえば、流路構造が培養面に対して垂直な方向にあってもよく、三次元的に配備されたものであってもよい。図１５は、流路構造の変形例を示す断面図である。図１５に示す例では、流路構造として、基部の底壁Ｂの内部に、多数の細孔の集合である複雑な流路ＦＰが形成されている。底壁Ｂが１０μｍ～１ｍｍ程度である場合、流路ＦＰを構成する細孔は、サブミクロンオーダーの内径を有し得る。細胞Ｃからの液状物は、流路ＦＰを通過し、底壁Ｂの細胞Ｃが配置された面とは別の面に形成された出口から放出される。たとえば、サブミクロン流路ＦＰが内部に形成された底壁Ｂは、スポンジのような多孔質担体であってもよい。一例として、このような多孔質担体は、ＰＤＭＳなどの硬化性樹脂によって形成することができる。具体的には、ナノファイバーを硬化前の樹脂中に分散させた後、樹脂を硬化させ、その後ナノファイバーを除去することにより、硬化後の樹脂内部にサブミクロン流路構造を形成することができる。
　流路構造として溝が設けられる場合において、溝の形状および配置は、上記例に限定されない。たとえば、非直線状の溝が形成されてもよく、溝の幅および深さが変化してもよい。複数の溝が、互いに平行に配置されてもよく、互いに交差してもよい。たとえば、複数の溝が格子状に配置されてもよい。溝に加えて、孔などの別の流路構造が設けられてもよい。
　上記実施形態では、細胞や組織などの生体試料を対象とする例を説明したが、試料の種類は上記例に限定されない。たとえば、無機材料や人工有機材料などの非生体試料、臓器や生物自体といったより大きな生体試料など、任意の試料を対象としてよい。同様に、液状物の種類も上記例に限定されない。たとえば、上記の回収デバイスは、リンパ、細胞間質液、血液、尿、溶出物、化学反応の生成物、抽出物など、任意の液状物に対して適用可能である。たとえば、回収デバイスは、様々な組織または臓器からリンパを回収する用途で使用可能である。培養空間Ｓ１、蓄積空間Ｓ３、流路構造によって形成される回収空間Ｓ２などの大きさおよび構成は、対象の試料または液状物に応じて、適宜変更されてよい。
　上記実施形態では、試料からの液状物を回収する例を説明したが、実施形態に係るデバイスの用途は上記例に限定されない。たとえば、上記デバイスは、液状物を回収せずに、液状物の観察または分析のみを行う場合などにも適用可能である。
　以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
＜実験例１：ＣＤＦの溝内蓄積実験＞
　機械加工によって作製した鋳型を使用して、溝（溝幅：１．４μｍ、深さ：１μｍ、隣接する溝の間のピッチ：２０μｍ）が形成されたＰＤＭＳ基板を作製した。このＰＤＭＳ基板をウェルアレイに装着し、ＰＤＭＳ基板の上面に細胞接着用のコラーゲンを塗布した（以下、同様にコラーゲンを塗布した面を「試料面」という。）。試料面全体に肝細胞を播種し、その上に培地を投入した。ここで、ＭＲＰ２阻害剤であるベンズブロマロン（以下、単に「阻害剤」ともいう。）を添加していない試料（－）と、阻害剤を添加した試料（＋）とを用意した。次いで、培地中にカルボキシジクロロフルオレセイン二酢酸塩（ＣＤＦＤＡ）を添加した。一般に、ＣＤＦＤＡは、肝細胞によって取り込まれた後、蛍光性物質であるカルボキシジクロロフルオレセイン（ＣＤＦ）としてＭＲＰ２トランスポーター経由で放出される。そこで、ＰＤＭＳ基板の試料面を明視野顕微鏡および蛍光顕微鏡により観察した。蛍光顕微鏡による観察は、（１）溝の高さ位置より上側の肝細胞が位置する高さ位置（以下、「細胞レイヤ」ともいう。）、および（２）溝の高さ位置（以下、「溝レイヤ」ともいう。）の各々を焦点位置に設定して行った。図１６は、試料面の明視野写真（左）、細胞レイヤの蛍光写真（中央）、および溝レイヤの蛍光写真（右）である。図１６の上側は、阻害剤なし（－）の実験結果を示し、図１６の下側は、阻害剤あり（＋）の実験結果を示す。溝レイヤの蛍光写真を参照すると、阻害剤なし（－）では溝の内部に蛍光性物質ＣＤＦが蓄積している一方、阻害内あり（＋）では溝の内部にＣＤＦが蓄積していないことが確認できる。すなわち、阻害剤を添加しなかった場合には、ＣＤＦＤＡが試料面上の肝細胞に取り込まれてＣＤＦが肝細胞から溝の内部に放出されたことが確認された。一方、阻害剤を添加した場合には、ＣＤＦの排泄が阻害され肝細胞内部に蓄積するのみで、肝細胞から溝の内部に放出されなかったことが確認された。
＜実験例２：ＣＬＦの溝内蓄積実験＞
　胆汁酸取込・排泄阻害剤としてトログリタゾンを利用した点、及びＣＤＦＤＡに代えて蛍光性胆汁酸コリル－リシル－フルオレセイン（ＣＬＦ）を添加した点を除き、実験例１と同様にして、ＰＤＭＳ基板の溝への蓄積を検証した。図１７は、試料面の明視野写真（左）、細胞レイヤの蛍光写真（中央）、および溝レイヤの蛍光写真（右）である。図１７の上側は、阻害剤なし（－）の結果を示し、図１７の下側は、阻害剤あり（＋）の結果を示す。溝レイヤの蛍光写真を参照すると、阻害剤なし（－）では溝の内部に蛍光性物質ＣＬＦが蓄積している一方、阻害内あり（＋）では溝の内部にＣＬＦが蓄積していないことが確認できる。すなわち、阻害剤を添加しなかった場合には、ＣＬＦが肝細胞から溝の内部に放出されたことが確認された。一方、阻害剤を添加した場合には、ＣＬＦが肝細胞から溝の内部に放出されなかったことが確認された。
＜実験例３：溝の幅、深さ、およびピッチの検討＞
　上記のＰＤＭＳ基板の他に、溝の幅が０．８μｍ、１．５μｍ、３μｍ、および５μｍのＰＤＭＳ基板を作製した。溝は、フォトリソグラフィによってＰＤＭＳ基板上に形成した。溝の幅が０．８μｍおよび１．５μｍのＰＤＭＳ基板では、溝の深さを１μｍとした。溝の幅が３μｍ、５μｍのＰＤＭＳ基板では、溝の深さを５μｍとした。隣接する溝の間のピッチはいずれも３μｍとした。また、隣接する溝の間のピッチを３０μｍとして、溝の幅が０．８μｍ、１．５μｍ、３μｍ、および５μｍのＰＤＭＳ基板を作製した。溝の幅が０．８μｍおよび１．５μｍのＰＤＭＳ基板では、溝の深さを１μｍとした。溝の幅が３μｍおよび５μｍのＰＤＭＳ基板では、溝の深さを５μｍとした。
　これらのＰＤＭＳ基板について、上記と同様に蛍光性物質の蓄積実験を行った。その結果、いずれのＰＤＭＳ基板を用いても、蛍光性物質が溝に蓄積されたことが確認された。
＜実験例４：回収デバイスの作製＞
　第１実施形態として説明した構成の回収デバイスを作製した。具体的には、フォトリソグラフィで作製した多数の凸構造を有する鋳型へＰＤＭＳを流し込み焼成することで、放射状の溝を多数有する円盤状の基部を作製した。溝の幅は３μｍ、溝の深さは５μｍとした。次いで、Ｏ２プラズマ処理によってＰＤＭＳ製の円筒状蓄積部を基部の上面に結合させた。次いで、蓄積部の外側に位置する基部の外側部分の上面に、接着用のコラーゲンを塗布した（以下、コラーゲンを塗布した面を「試料面」という。）。これにより、図２に示すような回収デバイスを得た。作製した回収デバイスを、図１に示すようにウェルアレイに装着した。
＜実験例５：回収デバイスの輸送性能の評価＞
　作製した回収デバイスを使用して、蓄積部の外側の培養空間のみにＣＬＦを添加した場合に、ＣＬＦが溝を通って蓄積部に輸送されるかどうかを検討した。具体的には、基部の試料面への肝細胞の播種を行わずに、培養空間に１０μＭのＣＬＦを含む培地２０００μＬを添加するとともに、蓄積部の内側の蓄積空間にはＣＬＦを含まない培地１０μＬを添加した。その後、回収デバイスを静置して、蛍光顕微鏡を用いて、回収デバイスの溝レイヤにおける基部および蓄積部の経時的な変化を観察した。図１８は、ＣＬＦ添加後０分、１５分、６０分、１２０分、および２４０分が経過した時点での回収デバイスの蛍光写真である。時間が経つにつれて、蓄積部の内部の蓄積空間に蛍光性物質が蓄積されることが確認された。図１８の右下には、ＣＬＦ添加後２４０分が経過した時点での蛍光写真の拡大図を示す。この拡大図から、ＣＬＦが、培養空間と蓄積空間とを繋ぐ溝（すなわち、蓄積部の周壁の下の溝）を通過して培養空間から蓄積空間へ輸送されていることが確認された。
＜実験例６：胆汁酸の輸送実験＞
　作製した回収デバイスを使用して、肝細胞存在下で胆汁酸が蓄積空間に輸送されるかを検討した。本実験例では、実験例２と同様に、胆汁酸取込・排泄阻害剤トログリタゾンを添加した場合（＋）と添加しなかった場合（－）とを比較した。具体的には、まず、回収デバイスの基部の試料面に２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の肝細胞を播種した。試料面に播種した肝細胞の形態の経時的な変化を明視野顕微鏡で観察した。図１９は、播種から４時間後、１日後、２日後、および３日後の試料面上の肝細胞の明視野写真である。播種から１日程度で肝細胞が試料面に接着し、試料面全体を覆っていることが確認された。
　肝細胞の播種から３日後、培地を吸引し、培地で２回洗浄した後、阻害剤あり（＋）の試料には、１０μＭのトログリタゾンを含む培地５００μＬを、基部の試料面の上側に形成された培養空間（すなわち、蓄積部の外側空間）へ添加し、５％ＣＯ２下、３７℃で１５分間インキュベートした。阻害剤なし（－）の試料にはトログリタゾンを添加しなかった。次いで、培地を吸引し、阻害剤あり（＋）の試料には１０μＭのトログリタゾンおよび５μＭのＣＬＦを含む培地２ｍＬを、阻害剤なし（－）の試料にはトログリタゾンを含まない５μＭのＣＬＦを含む培地２ｍＬを、基部の試料面の上側に形成された培養空間（すなわち、蓄積部の外側空間）に添加した。ＣＬＦを含まない１０μＬの培地を蓄積空間（すなわち、蓄積部の内側空間）に添加した。次いで、５％ＣＯ２下、３７℃で１２０分間インキュベートした。その後、阻害剤なし（－）および阻害剤あり（＋）の両試料について、共焦点顕微鏡を用いて細胞レイヤ及び溝レイヤを観察した。また、培養空間および蓄積空間の両方から上澄み液を回収し、回収した上澄み液の蛍光強度を、超微量分光光度計Ｎａｎｏｄｒｏｐ（サーモフィッシャー）を使用して測定した。なお本操作においては、ウシ胎児血清を含まない培地を使用した。
　図２０は、基部の外側部分における細胞レイヤの明視野写真（上）および溝レイヤの蛍光写真（下）である。図２０の左側は、阻害剤なし（－）の結果を示し、図２０の右側は、阻害剤あり（＋）の結果を示す。阻害剤を添加しなかった場合には、蛍光性胆汁酸ＣＬＦが溝内に蓄積しているのに対し、阻害剤を添加した場合には、ＣＬＦが溝内に蓄積していないことが確認された。この結果から、肝細胞の胆汁酸輸送機能によって胆汁酸が培養空間から溝内に輸送されることが確認された。
　図２１は、基部の外側部分と蓄積部の周壁との境界付近における細胞レイヤの明視野写真（上）および溝レイヤの蛍光写真（下）である。図２１の左側は、阻害剤なし（－）の結果を示し、図２１の右側は、阻害剤あり（＋）の結果を示す。阻害剤なし（－）の場合には、ＣＬＦが蓄積部の周壁の下の溝内に流入しているのに対し、阻害剤あり（＋）の場合には、阻害剤なし（－）の場合と比べて溝内に流入しているＣＬＦの量が少ないことが確認された。
　図２２は、培養空間から回収した上澄み液の蛍光強度を示す。図２３は、蓄積空間から回収した上澄み液の蛍光強度を示す。図中の縦軸は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）のｎ＝４の平均値を表し、エラーバーは標準偏差を表す。培養空間の上澄み液の蛍光強度は、阻害剤の有無にかかわらず同程度であることが確認された。一方、蓄積空間の上澄み液の蛍光強度は、阻害剤なし（－）の場合の方が、阻害剤あり（＋）の場合よりも大きかった。
＜実験例７：既往手法との比較実験＞
　実験例６と同様にして、作製した回収デバイスを用いたＣＬＦアッセイを行うとともに、既存の胆汁酸回収方法であるＢ－ＣＬＥＡＲ試験（サンドイッチ培養肝細胞試験）を行い、両手法を比較した。ＣＬＦアッセイの詳細は実験例６と同様なので割愛する。Ｂ－ｃｌｅａｒ試験では、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種した肝細胞を３日間培養後、ＨＢＳＳ（＋）または１ｍＭのＥＧＴＡを含むＨＢＳＳ（－）で２回洗浄し、ＨＢＳＳ（＋）または１ｍＭのＥＧＴＡを含むＨＢＳＳ（－）で５％ＣＯ２下、３７℃の下１０分間インキュベートを行った。次いで、５μＭのＣＬＦを添加し、５％ＣＯ２下、３７℃で３０分間インキュベートを行った。次いで、氷冷したＨＢＳＳ（＋）で３回洗浄した。次いで、０．５％Ｔｒｉｒｏｎ　Ｘ－１００を含むＰＢＳ（－）溶液５００μＬにより、肝細胞を溶解させた。次いで、１０分間１２０００ｒｐｍで遠心分離を行い、上澄み液を回収した。回収した上澄み液の蛍光強度を、超微量分光光度計Ｎａｎｏｄｒｏｐ（サーモフィッシャー）を使用して測定し、各条件の蛍光強度の平均値の差（ＨＢＳＳ（＋）－　ＨＢＳＳ（－））を計算した。また検量線を作製することでＣＬＦの濃度を算出した。
　図２４は、従来技術（Ｂ－ＣＬＥＡＲ試験）および作製した回収デバイス（本デバイス）によって回収された上澄み液のＣＬＦ濃度を示す。図２５は、従来技術（Ｂ－ＣＬＥＡＲ試験）および作製した回収デバイス（本デバイス）によって回収された上澄み液のＣＬＦ量を示す。本デバイスを使用した場合には、従来技術を使用した場合と比べて約７０倍のＣＬＦ濃度および約２倍のＣＬＦ量でＣＬＦが回収できることが確認された。また、従来技術では、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００によって肝細胞が破壊されたのに対し、本デバイスを使用すると、肝細胞は、破壊されずに基部の試料面に残存した。
　１…回収システム
　１０…ウェルアレイ（ウェルデバイス）
　１４…ウェル
　１００、２００、３００、４００…回収デバイス（デバイス）
　１１０、２１０、３１０、４１０…基部
　１１２、２１４、３１８、４１８…溝（流路構造）
　１２０、２２０、３２０、４２０…蓄積部
　Ｓ１…培養空間
　Ｓ２…回収空間
　Ｓ３…蓄積空間
　Ｃ…細胞
　ＣＬ…培養液
　ＲＬ…回収液

Claims (15)

  1. 　試料を支持し、流路構造が形成された基部と、
    　使用時に前記流路構造と連通する蓄積空間を有する蓄積部と、
    を備え、
    　前記試料からの液状物が、前記流路構造を通って前記蓄積空間に蓄積される、
    　デバイス。
  2. 　前記流路構造の一端が前記試料によって塞がれ、
    　前記流路構造の他端が前記蓄積空間と連通している、
    　請求項１に記載のデバイス。
  3. 　前記流路構造は、前記基部に形成された溝を含む、
    　請求項１または２に記載のデバイス。
  4. 　前記溝の幅は、前記試料が通過できない大きさである、
    　請求項３に記載のデバイス。
  5. 　前記溝の幅は、０．１μｍ以上１０μｍ以下である、
    　請求項３に記載のデバイス。
  6. 　前記流路構造は、前記基部上に放射状に配置された複数の溝を含み、
    　前記蓄積部は、前記基部の中央部に設けられる、
    　請求項１または２に記載のデバイス。
  7. 　前記蓄積部は、上部開口および下部開口を有し、
    　前記液状物は、前記下部開口から蓄積空間に流入する、
    　請求項１または２に記載のデバイス。
  8. 　前記流路構造は、使用時に前記液状物を含む液体で満たされる、
    　請求項１または２に記載のデバイス。
  9. 　前記試料は、細胞および／または組織である、
    　請求項１または２に記載のデバイス。
  10. 　前記試料は、肝細胞を含み、
    　前記液状物は、胆汁酸を含む、
    　請求項９に記載のデバイス。
  11. 　前記基部は、前記細胞および／または組織が培養される培養空間を少なくとも部分的に画定する、
    　請求項９に記載のデバイス。
  12. 　前記試料は、前記培養空間と前記蓄積空間との連通を遮断するように配置される、
    　請求項１１に記載のデバイス。
  13. 　請求項１または２に記載のデバイスと、
    　前記デバイスを収容するウェルを有するウェルデバイスと、
    を備える、システム。
  14. 　流路構造が形成された基部と、使用時に前記流路構造と連通する蓄積空間を有する蓄積部と、を備えるデバイスを用意するステップと、
    　前記基部上に試料を配置するステップと、
    　前記試料からの液状物を、前記流路構造を通して前記蓄積空間に蓄積するステップと、
    を含む、方法。
  15. 　請求項１または２に記載のデバイスを用いた薬剤評価方法であって、
    　前記基部に支持された前記試料または前記蓄積された液状物に薬剤を接触させるステップと、
    　前記薬剤の接触による刺激に対する前記試料もしくは前記液状物の応答、または前記試料に対する前記薬剤の浸透性もしくは透過性を測定するステップと、
    を含む、薬剤評価方法。　
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