JP2021003011A - 生体試料評価デバイスおよび生体試料評価方法 - Google Patents

Abstract

【課題】正確、迅速かつ詳細に生体試料を評価できる、生体試料評価デバイスおよび生体試料評価方法を実現する。【解決手段】本発明の生体試料評価デバイスは、生体試料を表面の上に配置するメッシュシート（４）と、メッシュシート（４）の表面に向かって試料溶液を供給する供給流路（２１）と、メッシュシート（４）の表面から当該表面に背向する裏面に向かってメッシュシート（４）内を通過した試料溶液を排出する排出流路（２２）と、を備えている。【選択図】図１

Description

本発明は、生体試料評価デバイスおよび生体試料評価方法に関する。

１型糖尿病患者の数は、現在、日本では約１０万人〜１４万人（非特許文献１参照）であり、世界全体では約２０００万人〜４０００万人（非特許文献２参照）であると報告されている。世界全体では、毎年、約１３万人の小児および若年者（０〜１９歳）が、新たに１型糖尿病と診断されており、１型糖尿病の罹患率は年々増加している（非特許文献３参照）。

１型糖尿病に対する治療法としては、インスリン投与療法が挙げられる。しかしながら、インスリン投与療法は、１型糖尿病の患者の全てに対して有効であるわけではなく、インスリン投与療法による血糖値コントロールが難しい患者も存在する。このような患者に対する治療法として、例えば、膵臓移植および膵島移植が用いられている。

膵島移植は、膵臓移植と比較して、手術が容易であり、かつ、低侵襲である。その一方で、膵島移植は、（ｉ）膵島の単離効率が低い、（ｉｉ）膵島の生着率が低い、および、（ｉｉｉ）膵島のドナーを必要とする、などの問題点も有している。膵島移植の問題点を解決するために、現在、幹細胞由来の膵島細胞を用いる技術、および、ヒトｉＰＳ細胞に由来する膵島細胞を用いる技術の開発が進められている。

膵臓移植および膵島移植に代表される移植医療では、移植される生体試料の機能（換言すれば、状態）を評価し、十分な機能を保持した生体試料を選別し、当該生体試料を患者へ移植することが、移植の成否を決める上で重要である。それ故に、現在、生体試料の機能を評価するための技術の開発が進められている。

例えば、膵島の機能を評価する技術として、１２〜９６ウェルプレートを用いた糖負荷試験が挙げられる。当該糖負荷試験では、各ウェル内に複数個の膵島を入れ、当該膵島を、低濃度グルコース含有緩衝液と高濃度グルコース含有緩衝液とで交互に３０分〜１時間程処理し、処理後の低濃度グルコース含有緩衝液および高濃度グルコース含有緩衝液の各々を、手動にて回収する。その後、回収した低濃度グルコース含有緩衝液に含まれるインスリン量と、回収した高濃度グルコース含有緩衝液に含まれるインスリン量とをＥＬＩＳＡ等によって定量し、グルコースに対する膵島の応答が正常であるか否か確認する。グルコースに対する応答が正常であると確認された膵島を患者に移植することが望ましいが、この方法は時間がかかるため、実際には主に移植後にこの確認作業が行われている。

膵島の機能を評価する別の技術として、膵島培養用チップを用いた糖負荷試験が挙げられる。当該糖負荷試験では、膵島培養用チップ内に複数個の膵島を入れ、膵島培養チップ内に低濃度グルコース含有緩衝液および高濃度グルコース含有緩衝液を交互に灌流させる。当該技術では、フラクションコレクターを使用して、一定時間毎の低濃度グルコース含有緩衝液および高濃度グルコース含有緩衝液を分取する（非特許文献４参照）。

田嶼 尚子、１型糖尿病の実態調査、客観的診断基準、日常生活・社会生活に着目した重症度評価の作成に関する研究 平成２８〜２９年度 総合研究報告書、厚生労働科学研究費補助金 循環器疾患・糖尿病等生活習慣病対策総合研究事業、２０１８年５月 Ｙｏｕ ＷＰ，Ｈｅｎｎｅｂｅｒｇ Ｍ． "Ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｇｌｏｂａｌｌｙ ａｎｄ ｒｅｇｉｏｎａｌｌｙ：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｉｆｅ ｅｘｐｅｃｔａｎｃｙ ａｔ ｂｉｒｔｈ" ＢＭＪ Ｏｐｅｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓ Ｃａｒｅ，２０１６ Ｍａｒ ２；４（１） ＩＤＦ ＤＩＡＢＥＴＥＳ ＡＴＬＡＳ Ｅｉｇｈｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１７ Ｌｅｎｇｕｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ． ２０１７ Ｆｅｂ ２８；１７（５）：７７２−７８１

しかしながら、上述のような従来の技術は、生体試料を正確、迅速かつ詳細に評価できないという問題点を有する。

例えば、１２〜９６ウェルプレートを用いる技術は、（ｉ）所定の時間内に分泌されるインスリンの合計量を測定することはできるが、分泌されるインスリンの量を経時的に連続して測定することができない、（ｉｉ）低濃度グルコース含有緩衝液および高濃度グルコース含有緩衝液を手動にて回収する時などに、膵島に対して物理的刺激が加えられ、インスリンの量を正確に測定することができない、（ｉｉｉ）２時間近くの時間がかかる、などの問題点を有する。

一方、膵島培養用チップを用いる技術は、（ｉｖ）膵島培養用チップの底面上に配置された膵島が、緩衝液を灌流する際に移動し、その結果、膵島培養用チップ内の膵島の数が変化する場合がある、または、膵島培養用チップ内の膵島の観察を困難にする、という問題点を有する。

本発明の一態様は、生体試料を正確、迅速かつ詳細に評価できる、生体試料評価デバイスおよび生体試料評価方法を実現することを目的とする。

上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る生体試料評価デバイスは、採取された生体試料を、表面の上に配置するためのメッシュシートと、上記メッシュシートの表面に向かって試料溶液を供給するための供給流路と、上記メッシュシートの表面から当該表面に背向する裏面に向かって上記メッシュシート内を通過した上記試料溶液を排出するための排出流路と、を備えていることを特徴としている。

上記構成では、試料溶液の流通経路上にメッシュシートが配置されている。当該メッシュシートは、生体試料を通過させることなく、その表面の上に生体試料を配置する。一方、当該メッシュシートは、試料溶液を通過させる。メッシュシートを通過した試料溶液は、生体試料の評価に用いられ得る。

上記構成によれば、メッシュシートは試料溶液を通過させるので、生体試料に水圧などのストレスをかけることなく、生体試料を正確に評価することができる。また、上記構成によれば、メッシュシートは生体試料を通過させないので、生体試料の量を変化させることなく、同じ条件下にて、連続的に、迅速に、かつ、詳細に生体試料を評価することができる。

本発明の一態様に係る生体試料評価デバイスでは、上記供給流路は、（ｉ）上記メッシュシートの表面に向かって上記試料溶液を供給するための主流路と、（ｉｉ）上記主流路と接続されている複数の副流路であって、上記主流路に向かって複数種類の上記試料溶液を別々に供給するための複数の副流路と、を備えていることが好ましい。

上記構成では、複数の副流路（例えば、副流路Ａ、および副流路Ｂ）を用いて、複数種類の試料溶液（例えば、試料溶液Ａ、および試料溶液Ｂ）を、別々にメッシュシートの表面に配置されている生体試料に供給することができる。例えば、副流路Ａおよび共通の主流路を用いて、試料溶液Ａを、メッシュシートの表面に配置されている生体試料に供給することができる。一方、副流路Ｂおよび共通の主流路を用いて、試料溶液Ｂを、メッシュシートの表面に配置されている生体試料に供給することができる。上記構成によれば、生体試料の周りの環境を変えながら、生体試料を評価することができる。

本発明の一態様に係る生体試料評価デバイスは、上記排出流路から排出された上記試料溶液を複数のフラクションに分けて取得するための基材を備え、上記基材の内部には、（ｉ）上記複数のフラクションを別々に格納するための空間である複数の格納領域であって、互いが上下の位置関係にて配置されている複数の格納領域と、（ｉｉ）上記複数の格納領域の各々と接続されている分取流路であって、上記排出流路から排出された上記試料溶液を上記格納領域内に導入するための分取流路と、が設けられていることが好ましい。

上記構成では、複数の格納領域が互いに上下の位置関係にて配置されているので、排出流路から排出され、かつ、分取流路内へ導入された試料溶液は、重力によって、まず、一番下に配置されている格納領域内に導入され、当該格納領域が試料溶液にて満たされた後、次いで、下から二番目に配置されている格納領域内に導入される。つまり、上記構成では、下から順に、格納領域が試料溶液にて満たされることになる。

上記構成によれば、試料溶液を複数のフラクション（例えば、経時的な複数のフラクション）に分けた後、各フラクションを評価することができる。また、上記構成によれば、複数の構成（例えば、複数の容器、および、容器の駆動装置など）を備えていた従来の分取装置（フラクションコレクター）の機能を、一体化された構成によって実現することができる。

上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る生体試料評価方法は、本発明の一態様に係る生体試料評価デバイスを用いる生体試料評価方法であって、上記生体試料評価デバイスに試料溶液を供給する供給工程と、上記生体試料評価デバイスから上記試料溶液を排出する排出工程と、を有することを特徴としている。

上記構成では、試料溶液の流通経路上にメッシュシートが配置されている。当該メッシュシートは、生体試料を通過させることなく、その表面の上に生体試料を配置する。一方、当該メッシュシートは、試料溶液を通過させる。なお、メッシュシートを通過した試料溶液は、生体試料の評価に用いられ得る。

上記構成によれば、メッシュシートは試料溶液を通過させるので、生体試料に水圧などのストレスをかけることなく、生体試料を正確に評価することができる。また、上記構成によれば、メッシュシートは生体試料を通過させないので、生体試料の量を変化させることなく、同じ条件下にて、連続的に、迅速に、かつ、詳細に生体試料を評価することができる。

本発明の一態様によれば、生体試料に水圧などのストレスをかけることなく、生体試料を正確に評価することができる。

本発明の一態様によれば、生体試料の量を変化させることなく、同じ条件下にて、連続的に、迅速に、かつ、詳細に生体試料を評価することができる。

本発明の一実施形態に係る生体試料評価デバイスの構成を示す図である。 本発明の一実施形態に係る生体試料評価デバイスの構成を示す図である。 本発明の一実施形態に係る生体試料評価デバイスの供給流路の構成を示す図である。 本発明の一実施形態に係る生体試料評価デバイスのメッシュシートの構成を示す図である。 本発明の一実施形態に係る生体試料評価デバイスのフラクション分取用の基材の構成を示す図である。 本発明の一実施形態に係る生体試料評価デバイスのフラクション分取用の基材の構成を示す図である。 本発明の一実施形態に係る生体試料評価デバイスのフラクション分取用の基材から試料溶液を回収する方法を示す図である。 本発明の一実施形態に係る生体試料評価デバイスの構成を示す図である。

本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態及び実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態及び実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。本明細書中、数値範囲に関して「Ａ〜Ｂ」と記載した場合、当該記載は「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。

〔１．生体試料評価デバイス〕
本発明の一実施形態に係る生体試料評価デバイスは、生体試料評価用サンプルの製造装置、または、生体試料評価用サンプルの分取装置であり得る。

本発明の一実施形態に係る生体試料評価デバイスは、採取された生体試料を、表面の上に配置するためのメッシュシートと、上記メッシュシートの表面に向かって試料溶液を供給するための供給流路と、上記メッシュシートの表面から当該表面に背向する裏面に向かって上記メッシュシート内を通過した上記試料溶液を排出するための排出流路と、を備えている。このとき、供給流路は排出流路よりも上の位置に配置されており、試料溶液がメッシュシート内を通過するときに、当該試料溶液が、上から下に向かってメッシュシート内を通過してもよい。

上記構成では、試料溶液の流通経路上にメッシュシートが配置されている。当該メッシュシートは、生体試料を通過させることなく、その表面の上に生体試料を配置する。一方、当該メッシュシートは、試料溶液を通過させる。メッシュシートを通過した試料溶液は、生体試料の評価に用いられ得る。上記構成によれば、メッシュシートは試料溶液を通過させるので、生体試料に水圧などのストレスをかけることなく、生体試料を正確に評価することができる。上記構成によれば、メッシュシートは生体試料を通過させないので、生体試料の量を変化させることなく、同じ条件下にて、連続的に、かつ、詳細に生体試料を評価することができる。

上記採取された生体試料は、特に限定されず、例えば、（ｉ）生体から採取された、組織または臓器、（ｉｉ）生体から採取された細胞の集合体、または、株化された培養細胞の集合体、（ｉｉｉ）生体から採取された組織または臓器、および／または、生体から採取された細胞の集合体または株化された培養細胞の集合体などを用いて人工的に作製された生物試料、であってもよい。

より具体的に、採取された生体試料は、膵島、スフェロイド、オルガノイド、肝臓組織、腸管組織、皮膚組織、または、心臓組織であってもよい。当該構成によれば、様々な生体試料および細胞集合体の、様々な機能（例えば、膵島のインスリン分泌機能、肝臓組織の薬物代謝能、および、小腸組織のインクレチン分泌能）を評価することができる。

上記試料溶液としては、特に限定されず、評価対象である生体試料の種類、および／または、評価対象である生体試料の特性などに応じて、適宜、選択することができる。例えば、膵島のインスリン分泌機能を評価する場合には、低濃度グルコース含有緩衝液および高濃度グルコース含有緩衝液を用いればよい。

上記メッシュシートとしては、特に限定されず、表面の上に生体試料を配置することができ、かつ、メッシュシートの表面から当該表面に背向する裏面に向かって試料溶液が通過することができるものであればよい。

上記メッシュシートに形成されている孔の大きさとしては、特に限定されないが、好ましくは、（ｉ）当該孔の外接円の直径が１５μｍ以上である孔、（ｉｉ）採取された生体試料を内包する最小の球の直径の９５％以下の長さの直径を有する孔、または、（ｉｉｉ）メッシュシートの空隙率が１５％以上となる孔、である。当該構成では、メッシュシートに形成されている孔の大きさが、生体試料を通過させない大きさであって、かつ、大きく設定されている。それ故に、当該構成によれば、試料溶液がメッシュシートを通過し易くなるので、生体試料に水圧などのストレスがかかることを、より良く防ぐことができる。

上記メッシュシートのメッシュの線幅は、２０ミクロン以下であることが好ましい。当該構成によれば、メッシュが組み込まれた生体試料培養チップから試料溶液が漏出する可能性を著しく減少させることが可能になる。

上記メッシュシートに形成されている孔の形状としては、特に限定されず、多角形（例えば、三角形、正方形、または、長方形）であってもよく、円形であってもよい。当該多角形の一片の長さ、および、当該円形の直径の長さは、例えば、１５μｍ以上、２０μｍ以上、３０μｍ以上、４０μｍ以上、５０μ以上、１００μｍ以上、１５０μｍ以上、または、２００μｍ以上であってもよい。当該多角形の一片の長さ、および、当該円形の直径の長さの上限値は、例えば、１０ｍｍ以下、５ｍｍ以下、１ｍｍ以下、または、５００μｍ以下であってもよい。

１つの細胞の長さは、略１０μｍである。個々の細胞がメッシュシート上に接着して増殖すると、メッシュシート上に細胞の膜が形成され、当該膜が、メッシュシートの孔を塞ぐ傾向を示す。上述した孔の大きさ、および／または、孔の形状であれば、個々の細胞がメッシュシートを通過し易くなり、メッシュシート上に細胞の膜が形成されることを防止することができる。

上記メッシュシートの材質としては、特に限定されず、例えば、ポリエステル、ポリプロピレンポリエチレンなどのポリマー；コーティング剤（例えば、パリレン、ポリスチレン、または、シリコン樹脂）によってコーティングされた金属（例えば、ニッケル、アルミニウム、または、銀）；生分解性ポリマー；または、タンパク質であってもよい。上記構成であれば、メッシュシートが生体試料に対して悪影響（例えば、毒性）を与えることを防ぐことができる。

上記供給流路は、複数種類の試料溶液を別々にメッシュシートの表面に向かって供給するものであってもよい。例えば、複数種類の試料溶液（例えば、試料溶液Ａ、および試料溶液Ｂ）が、別々にメッシュシートの表面に配置されている生体試料に供給されてもよい。当該構成によれば、試料溶液Ａを生体試料に供給したときに排出流路から排出される試料溶液と、試料溶液Ｂを生体試料に供給したときに排出流路から排出される試料溶液とを比較することによって、生体試料の機能の変化などを評価することができる。

試料溶液の種類の数は、特に限定されず、２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類または９種類であってもよく、１０種類以上であってもよい。試料溶液の種類は、評価対象である生体試料の種類、および／または、評価対象である生体試料の特性などに応じて、適宜、選択することができる。

上記供給流路は、一本の流路からなる直線流路であってもよいし、分岐した流路からなる分枝流路（例えば、Ｙ字流路）であってもよい（例えば、図３の３０１および３０２を参照）。直線流路を用いれば、生体試料評価デバイスの構成を簡単なものにすることができる。一方、分枝流路を用いれば、複数種類の試料溶液同士が混ざり合うことをより良く防ぐことができ、かつ、生体試料に供給する試料溶液を容易に切り替えることができる。なお、図３の３０１には、各構成の長さが記載されているが、本発明は、当該長さに限定されない。

上記供給流路（特に、上述した分岐流路）は、（ｉ）メッシュシートの表面に向かって試料溶液を供給するための主流路（換言すれば、メッシュシートの表面と対向している主流路）と、（ｉｉ）主流路と接続されている複数の副流路であって、主流路に向かって複数種類の上記試料溶液を別々に供給するための複数の副流路と、を備えていてもよい。上記構成によれば、複数の副流路（例えば、副流路Ａ、および副流路Ｂ）を用いて、複数種類の試料溶液（例えば、試料溶液Ａ、および試料溶液Ｂ）を、別々にメッシュシートの表面に配置されている生体試料に供給することができる。例えば、副流路Ａおよび共通の主流路を用いて、試料溶液Ａを、メッシュシートの表面に配置されている生体試料に供給することができる。一方、副流路Ｂおよび共通の主流路を用いて、試料溶液Ｂを、メッシュシートの表面に配置されている生体試料に供給することができる。

副流路の数は、特に限定されず、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個であってもよく、１０個以上であってもよい。副流路の数は、評価対象である生体試料の種類、評価対象である生体試料の特性、および／または、試料溶液の種類の数などに応じて、適宜、選択することができる。

上記供給流路は、主流路と複数の副流路との接続状態を切り替えるためのバルブ（例えば、四方バルブなどの多方バルブ）を備えていてもよい。上記構成によれば、メッシュシートの表面に配置されている生体試料に供給される試料溶液の種類を、容易に変えることができる。

上記供給流路は、メッシュシートの表面に対して略垂直方向へ伸びる整流流路を備えていてもよい。より具体的に、上記供給流路は、メッシュシートが略水平方向に広がるように配置されるときに、当該メッシュシートの表面に対して略鉛直方向へ伸びる整流流路を備えていてもよい。上記構成では、整流流路を通過した試料溶液は、メッシュシートの表面に対して略垂直方向に向かって流れる。当該構成によれば、試料溶液がメッシュシートの孔を通過し易くなるので、生体試料に水圧などのストレスがかかることを、より良く低下させることができる。また、当該構成によれば、生体試料に対して、メッシュシートの表面に対して略垂直方向に向かう力が適度にかかるので、生体試料の位置が変化することを、より良く防止することができる。

上記供給流路は、メッシュシートが略水平方向に広がるように配置されるときに、当該メッシュシートの表面に向かって略鉛直方向へ伸びる流路を備えていてもよい。なお、当該流路は、上述した整流流路と同一の構成であってもよいし、上述した整流流路とは別の構成であってもよい。当該構成では、メッシュシートの上流側に、略鉛直方向へ伸びる流路が設けられ、当該流路では、上から下に向かって試料溶液が流れることになる。試料溶液中に気泡が含まれている場合、当該流路内で気泡が上に向かって浮かび上がり、当該気泡がメッシュシート（換言すれば、メッシュシートの表面の上に配置されている生体試料）と接触することがない。それ故に、当該構成によれば、生体試料にダメージを与えることなく、生体試料を評価することができる。

上述した略鉛直方向へ伸びる流路は、メッシュシートとは反対側（例えば、メッシュシートとは反対側の端部）に、（ｉ）開口、または、（ｉｉ）開口および当該開口を開閉する蓋、を備えていてもよい。上記構成は、（ａ）開口を介して上記流路内へ生体試料を投入することによって、メッシュシートの表面の上に生体試料を容易に配置することができる、（ｂ）開口を介して、試料溶液中に含まれる気泡を容易に除去することができる、および、（ｃ）メッシュシートの表面の上に配置された生体試料を容易に観察（例えば、顕微鏡観察）することができる、という利点を有する。

本発明の一実施形態に係る生体試料評価デバイスは、上記排出流路から排出された上記試料溶液を複数のフラクションに分けて取得するための基材を備え、上記基材の内部には、（ｉ）上記複数のフラクションを別々に格納するための空間である複数の格納領域であって、互いが上下の位置関係にて配置されている複数の格納領域（以下、カラムとも呼ぶ）と、（ｉｉ）上記複数の格納領域の各々と接続されている分取流路であって、上記排出流路から排出された上記試料溶液を上記格納領域内に導入するための分取流路と、が設けられていてもよい。

上記構成では、複数の格納領域が互いに上下の位置関係にて配置されているので、排出流路から排出され、かつ、分取流路内へ導入された試料溶液は、重力によって、まず、一番下に配置されている格納領域内に導入され、当該格納領域が試料溶液にて満たされた後、次いで、下から二番目に配置されている格納領域内に導入される。つまり、上記構成では、下から順に、格納領域が試料溶液にて満たされることになる。当該構成によれば、試料溶液を複数のフラクション（例えば、経時的な複数のフラクション）に分けた後、各フラクションを評価することができる。当該構成によれば、複数の構成（例えば、複数の容器、および、容器の駆動装置など）を備えていた従来の分取装置（フラクションコレクター）の機能を、一体化された構成によって、低コストにて実現することができる。

１本の分取流路に接続される格納領域の数は、特に限定されず、例えば、２個以上、５個以上、または、１０個以上であってもよい。１本の分取流路に接続される格納領域の数の上限値は、特に限定されず、例えば、１０００個以下、５００個以下、１００個以下、５０個以下、または、１０個以下であってもよい。基材の大きさを適宜選択することによって、所望の数の格納領域を実現することができる。

１個の格納領域の容積は、特に限定されず、例えば、０．０１ｍＬ以上、０．１ｍＬ以上、１ｍＬ以上、または、１０ｍＬ以上であってもよい。１個の格納領域の容積の上限値は、特に限定されず、例えば、１０００ｍＬ以下、５００ｍＬ以下、１００ｍＬ以下、または、１０ｍＬ以下であってもよい。基材の大きさを適宜選択することによって、所望の容積の格納領域を実現することができる。

上記基材は、上記複数の格納領域と上記分取流路とからなるセットを複数セット備えていてもよい。当該構成によれば、１つの基材によって、より多くのフラクションを取得することができる。換言すれば、上記構成によれば、より多くのフラクションを取得することが可能な分取装置を、小さく構成することができる。

１つの基材に備えられるセットの数は、特に限定されず、例えば、２セット以上、５セット以上、または、１０セット以上であってもよい。上記セットの数の上限値は、特に限定されず、例えば、１０００セット以下、５００セット以下、１００セット以下、５０セット以下、または、１０セット以下であってもよい。上記基材は、複数の基板を貼り合わせることによって作製することができる。後述するように、貼り合わせる基板の数を適宜選択することによって、所望の数のセットを実現することができる。

上記分取流路は、排出流路から排出された試料溶液を格納領域内に導入する時に、鉛直方向（重力方向）に対して斜めの方向へ向かって伸びるように配置されるものであることが好ましい。

分取流路から格納領域内へ試料溶液を導入する時に、分取流路が鉛直方向（重力方向）へ向かって伸びるように配置されていると、格納領域内に導入される直前の試料溶液の移動速度が大きくなる。一方、分取流路から格納領域内へ試料溶液を導入する時に、分取流路が鉛直方向（重力方向）に対して斜めの方向へ向かって伸びるように配置されていると、格納領域内に導入される直前の試料溶液の移動速度が小さくなる。上記構成によれば、格納領域内に既に導入されている試料溶液が、当該格納領域内に新たに導入される試料溶液によって撹拌され、その結果、格納領域内に既に導入されている試料溶液が当該格納領域の外へ流出することを防ぐことができる。つまり、当該構成によれば、複数のフラクション同士が混ざり合うことを、より良く防ぐことができる。

分取流路が伸びる方向と、鉛直方向（重力方向）とがなす角度Ａは、特に限定されず、例えば、０°＜Ａ＜９０°、０°＜Ａ＜７０°、０°＜Ａ＜５０°、０°＜Ａ＜３０°、または、０°＜Ａ＜１０°であってもよい。

上記基材は、分取流路および／または格納領域と連通する通気孔であって、分取流路内および／または格納領域内の空気を基材の外へ排出するための通気孔を備えていてもよい。排出流路から排出された試料溶液を基材の内部に導入する前には、当該基材の内部に空気が存在する。当該空気は、排出流路から排出された試料溶液を基材の内部に導入するにしたがって、当該基材の外へ排出される必要がある。上記構成によれば、基材の内部の空気（換言すれば、分取流路内および／または格納領域内の空気）を効率良く基材の外へ排出することができ、同時に、排出流路から排出された試料溶液を効率良く基材の内部に導入することができる。

上記通気孔の数は限定されず、適宜設定することができる。例えば、複数の格納領域と分取流路とからなるセット１つに対して１つの通気孔を設けてもよいし、複数の当該セットに対して１つの通気孔を設けてもよい。

上記格納領域の壁面、および／または、上記分取流路の壁面は、試料溶液を構成する溶媒（例えば、水、有機溶媒、または、これらの混合物）との接触角が小さいものであることが好ましい。当該構成によれば、試料溶液が格納領域内および／または分取流路内を移動し易くなる。その結果、当該構成によれば、試料溶液を一番下の格納領域から順に導入することができる。

試料溶液を構成する溶媒（例えば、水、有機溶媒、または、これらの混合物）と、格納領域の壁面および分取流路の壁面との接触角は、小さいほど好ましく、好ましくは２０°以下、より好ましくは１５°以下、より好ましくは１０°以下、より好ましくは９°以下、より好ましくは８°以下、より好ましくは７°以下、より好ましくは６°以下、より好ましくは５°以下、より好ましくは４°以下、より好ましくは３°以下、より好ましくは２°以下、最も好ましくは１°以下である。

〔２．生体試料評価デバイスの製造方法、使用方法、および、構成〕
図面を参照しながら、本発明の一実施形態に係る生体試料評価デバイスを構成する生体試料培養チップ、試料溶液潅流システムおよび試料溶液分取チップ（基材）の一例について説明する。

〔２−１．生体試料培養チップ〕
生体試料培養チップは、主要な構成として、供給流路、排出流路、および、メッシュシートを備えている。生体試料培養チップは、更に、整流流路、および、蓋などの他の構成を備え得る。

図１の１０１は、溝が形成された複数の基板１（例えば、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）シート）を重ね合わせることにより作製された生体試料培養チップの断面図である。一方、図１の１０２は、当該生体試料培養チップの斜視図である。生体試料培養チップは、内部に流路を備えており、上述した溝が当該流路を形成している。当該生体試料培養チップは、具体的に、供給流路２１、整流流路２３、および、排出流路２２を備えている。

当該生体試料培養チップでは、整流流路２３と排出流路２２との間にメッシュシート４が備えられており、当該メッシュシート４の表面の上に生体試料５が配置される。当該メッシュシート４は、例えば、基板１同士を重ね合せるときに、これらの間に挟み込むことによって、設けられ得る。

整流流路２３は、メッシュシート４の表面に向かって略鉛直方向に伸びている。整流流路２３におけるメッシュシート４とは反対側の端部には開口が設けられており、当該開口は、蓋２（例えば、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）の蓋）によって開閉され得る。

供給流路２１および排出流路２２の各々には、接続流路３（例えば、シリコンチューブ）が接続され、当該接続流路３を介して、生体試料培養チップと別の構成とを接続することができる。

メッシュシート４の一例として、ニッケルから成るマイクロメッシュシート（オプトニクス精密社製）を用いることができる（図１の１０４、および、図４の「ニッケル／パリレンマイクロメッシュ」を参照）。図４の「ニッケル／パリレンマイクロメッシュ」では、生体試料へのニッケルの影響を無くすために、ラボコータ ＰＤＳ−２０１０（日本パリレン社製）を用いて、生体適合性に優れたパリレン（ＤＰＸＣ， ＣＡＳ Ｎｏ． ２８８０４−４６−８）（日本パリレン社製）をニッケルからなるマイクロメッシュシート上に蒸着している。

メッシュシート４の一例として、ポリエステルからなるマイクロメッシュシート（天池合繊）を用いることもできる（図４の「ポリエステルマイクロメッシュ」を参照）。

図１の１０４に示すメッシュシート４は、一辺の長さが３０μｍである三角形の孔を有している。図４の左上に示すメッシュシート４は、一辺の長さが１００μｍである三角形の孔を有し、図４の右上に示すメッシュシート４は、一辺の長さが５０μｍである三角形の孔を有している。図４の左下に示すメッシュシートは、約１１８μｍ×約１７４μｍの長方形の孔を有し、図４の右下に示すメッシュシートは、約６２μｍ×約１６５μｍの長方形の孔を有している。

図２の２０１〜２０４に、生体試料培養チップの構成の一例を示す。図２の２０１は生体試料培養チップの内部流路の斜視図であり、図２の２０２は当該生体試料培養チップの平面図であり、図２の２０３は当該生体試料培養チップのＣ’線における断面図であり、図２の２０４は当該生体試料培養チップのＤ’線における断面図である。なお、図２には各構成のサイズが記載されているが、当該サイズは一例であって、本発明は当該サイズに限定されない。

〔２−２．試料溶液潅流システム〕
図１の１０３は、生体試料培養チップ９、および、その上流側に接続された溶液灌流システムの像である。一方、図１の１０５は、生体試料培養チップ９の像である。

本溶液灌流システムは、試料溶液を収容するための２本の試料溶液用チューブ６（各々、５０ｍＬの容積）、２台のポンプ８（ＲＰ−ＨＸ０１Ｓ−１Ａ−ＤＣ３ＶＳ， アクアテック）、ポンプ制御装置１１、四方バルブ７（本体ＯＭ１１１４，コネクターＯＭ１０８０， ハギテック）、廃液用チューブ１２、および、生体試料培養チップ９を備えている。四方バルブ７の上流側に溜まった、生体試料培養チップ９へ供給されなかった試料溶液は、ポンプ８によって排出され、当該試料溶液は、廃液用チューブ１２内に収容される。

上述した構成同士を繋ぐ各流路は、シリコンチューブにより作製され得る。本溶液灌流システムは、生体試料培養チップ９から排出された試料溶液を９６穴のプレート１０の各ウェルへ手動で分注できる構成になっている。

本溶液灌流システムは、四方バルブ７によって、２種類の試料溶液のうちの何れが生体試料培養チップ９に向かって流れるか選択できる構成になっている。例えば、試料溶液Ａが生体試料培養チップ９に向かって流れ、試料溶液Ｂが廃液用チューブ１２に向かって流れているときに、四方バルブ７を９０度回転させれば、試料溶液Ａが廃液用チューブ１２に向かって流れ、試料溶液Ｂが生体試料培養チップ９に向かって流れることになる。

〔２−３．試料溶液分取チップ（基材）（６カラム用）〕
試料溶液分取チップは、基本的に基材によって構成されている。当該基材は、主要な構成として、格納領域、および、分取流路を備えている。試料溶液分取チップは、更に、通気孔などの他の構成を備え得る。

試料溶液分取チップ（基材）（６カラム用）は、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）（商品名： ＳＩＬＰＯＴ １８４， 東レ・ダウコーニング）を用いて作製することができる。

図５の５０１は、６カラム用の試料溶液分取チップを構成するシートａの作製方法を示している。まず、主剤と硬化剤とを１０：１の比率で混合したＰＤＭＳ溶液を鋳型１３に流し込み、その後、当該ＰＤＭＳ溶液を加熱処理することにより、基板３０を作製する。鋳型１３は、３ＤプリンタＡＧＩＬＩＳＴＡ−３２００（キーエンス）等によって作製した造形物をディッシュ等に張り付けることにより作製することができる。鋳型１３から剥がした基板３０の流路部分をコーティング剤１４（例えば、パリレン）によって被覆する。基板３０の表面に対してプラズマ処理１５を行った後、当該基板３０を、シートａとして用いる。

図５の５０２は、６カラム用の試料溶液分取チップを構成するシートｂの作製方法を示している。まず、基板３１（例えば、厚さ１ ｍｍのＰＤＭＳシート）をコーティング剤１４（例えば、パリレン）によって被覆する。当該基板３１の表面に対して、プラズマクリーナー（ＨＡＲＲＩＣＫ ＰＬＡＳＭＡ）を用いてプラズマ処理１５を行うことによって、基板３１の表面の親水性度を上げる。基板３１の表面の親水性度をさらに上げるために、基板３１の表面を超親水化コート剤１６および１７（例えば、商品名：セルフェイスコートＷＧ−Ｒ１、および、下地処理剤ＮＺ−５５０（丸昌社製））を用いて被覆する。基板３１の表面に対してプラズマ処理１５を行った後、当該基板３１を、シートｂとして用いる。

図５の５０３に示すように、シートａとシートｂとを貼り合わせることによって、試料溶液分取チップを完成させる。なお、シートａとシートｂとを貼り合わせた「シートａ／ｂ」において、（ｉ）略水平方向に広がる６つの領域（６つのカラム）が、本発明における格納領域に相当し、（ｉｉ）格納領域の右側に当該格納領域と接続された状態で斜め方向に向かって伸び、端部に接続流路３が接続され、かつ、端部に空気を通す通気孔（穴）が設けられている流路が、本発明における分取流路に相当する。

一連の処理（コーティング剤（例えば、パリレン）による被覆、超親水化コート剤による被覆、および、プラズマ処理）によって、格納領域の壁面、および／または、分取流路の壁面を超親水性（例えば、接触角１０°以下）にすることができる。使用する超親水化コート剤は、セルフェイスコートＷＧ−Ｒ１に限らない。超親水化コート剤の代わりに液体ガラス等を用いることも可能である。

〔２−４．試料溶液分取チップ（基材）（１２カラム用）〕
試料溶液分取チップ（基材）（１２カラム用）は、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）（商品名： ＳＩＬＰＯＴ １８４， 東レ・ダウコーニング）を用いて作製することができる。

図６の６０１おおよび６０２に示すように、試料溶液分取チップ（１２カラム用）は、シートａ、シートｂ、および、シートｃを貼り合わせることによって作製することができる。

シートａおよびシートｂの作製方法は、試料溶液分取チップ（６カラム用）の場合と同じである。一方、シートは、基本的に、シートａの作製方法と、シートｂの作製方法とを組み合させて、作製され得る。

シートｃを作製する場合、まず、主剤と硬化剤とを１０：１の比率で混合したＰＤＭＳ溶液を鋳型１３と同様の構造をした鋳型に流し込み、その後、当該ＰＤＭＳ溶液を加熱処理することにより、基板３０と同様の構造をしたシートｃを作製する。鋳型は、３ＤプリンタＡＧＩＬＩＳＴＡ−３２００（キーエンス）等によって作製した造形物をディッシュ等に張り付けることにより作製することができる。なお、当該鋳型には、通気孔に相当する凸部を設け得る。例えば、流路に相当する凸部の上に、更に通気孔に相当する凸部を設けてもよい。鋳型から剥がしたシートｃの流路部分および上面をコーティング剤１４（例えば、パリレン）によって被覆する。シートｃの上面に対して、プラズマクリーナー（ＨＡＲＲＩＣＫ ＰＬＡＳＭＡ）を用いてプラズマ処理１５を行うことによって、シートｃの表面の親水性度を上げる。シートｃの表面の親水性度をさらに上げるために、シートｃの表面を超親水化コート剤１６・１７（商品名：セルフェイスコートＷＧ−Ｒ１、および、下地処理剤ＮＺ−５５０（丸昌社製））を用いて被覆する。シートｃの表面に対してプラズマ処理１５を行った。

図６の６０１および６０２に示すように、シートａとシートｃとシートｂとを貼り合わせることによって、試料溶液分取チップを完成させる。当該製造方法であれば、格納領域と分取流路とからなるセットを複数セット備えている試料溶液分取チップを製造することができる。

〔２−５．試料溶液分取チップからの試料溶液回収方法〕
図６の６０４に示すように、試料溶液分取チップ（基材）内の格納領域に試料溶液が満たされた後、試料溶液分取チップをハサミ１８等によって裁断し（例えば、分取流路に沿って、試料溶液分取チップをハサミ１８等によって裁断し）、各格納領域内に入っている試料溶液を、ピペット１９等を用いて回収することができる。

裁断時の試料溶液の滴りを防ぎたい場合には、図７に示す方法にしたがえばよい。すなわち、最下段の格納領域の付近に穴を開け、当該穴からパスツールピペット２０等を用いて分取流路内の試料溶液を除去した後、試料溶液分取チップをハサミ１８等によって裁断する（例えば、分取流路に沿って、試料溶液分取チップをハサミ１８等によって裁断する）。その後、各格納領域内に入っている試料溶液を、ピペット１９等を用いて回収することができる。なお、上記穴は、試料溶液分取チップの使用前（換言すれば、試料溶液の分取開始前）に開けておき、テープ（例えば、カプトンテープ）等で塞いでおけばよい。

〔３．生体試料評価方法〕
本発明の一実施形態に係る生体試料評価方法は、本発明の一実施形態に係る生体試料評価デバイスを用いる生体試料評価方法であって、上記生体試料評価デバイスに試料溶液を供給する供給工程と、上記生体試料評価デバイスから上記試料溶液を排出する排出工程と、を有する。

上記構成では、試料溶液の流通経路上にメッシュシートが配置されている。当該メッシュシートは、生体試料を通過させることなく、その表面の上に生体試料を配置する。一方、当該メッシュシートは、試料溶液を通過させる。メッシュシートを通過した試料溶液は、生体試料の評価に用いられ得る。上記構成によれば、メッシュシートは試料溶液を通過させるので、生体試料に水圧などのストレスをかけることなく、生体試料を正確に評価することができる。上記構成によれば、メッシュシートは生体試料を通過させないので、生体試料の量を変化させることなく、同じ条件下にて、連続的に、迅速に、かつ、詳細に生体試料を評価することができる。

上記供給工程は、より具体的に、採取された生体試料が表面の上に配置されたメッシュシートの表面に向かって試料溶液を供給する工程であってもよい。上記排出工程は、より具体的に、メッシュシートの表面から当該表面に背向する裏面に向かってメッシュシートを通過した試料溶液を排出する工程であってもよい。

本発明の一実施形態に係る生体試料評価方法は、排出工程の後に、排出された試料溶液を複数のフラクションに分けて取得するための分取工程を有してもよい。当該構成によれば、試料溶液を複数のフラクション（例えば、経時的な複数のフラクション）に分けた後、各フラクションを評価することができる。

〔１．生体試料評価デバイス〕および〔２．生体試料評価デバイスの製造方法〕の欄にて既に説明した構成については、ここでは、その説明を省略する。

〔実施例１〕
生体試料評価デバイスに２種類の試料溶液を交互に潅流させ、試料溶液を複数のフラクションに分けて分取可能か否か確認した。

試料溶液としては、ＰＢＳ（−）溶液と、０．０１Ｗ／Ｖ％ トリパンブルー溶液とを用いた。０．０１Ｗ／Ｖ％ トリパンブルー溶液は、０．４％Ｗ／Ｖ％ トリパンブルー溶液をＰＢＳ（−）にて希釈することによって調製した。

生体試料評価デバイスとしては、図１の１０３に示す構成を用いた。なお、本生体試料評価デバイスは、２本の試料溶液用チューブ６（各々、５０ｍＬの容積）、２台のポンプ８（ＲＰ−ＨＸ０１Ｓ−１Ａ−ＤＣ３ＶＳ， アクアテック）、ポンプ制御装置１１、四方バルブ７（本体ＯＭ１１１４，コネクターＯＭ１０８０， ハギテック）、廃液用チューブ１２、および、生体試料培養チップ９を備えている。

まず、ＰＢＳ（−）溶液を生体試料培養チップ９へ灌流し（５０μＬ／ｍｉｎ）、生体試料培養チップ９を通過した後に排出された試料溶液を、２分毎に９６穴プレートのウェルに回収した（１００μＬ／ｗｅｌｌ）。

灌流開始から８分後に四方バルブ７をひねり、生体試料培養チップ９へ潅流させる試料溶液を、ＰＢＳ（−）溶液から０．０１Ｗ／Ｖ％ トリパンブルー溶液に切り替えた。生体試料培養チップ９へ潅流させる試料溶液を切り替えた後、生体試料培養チップ９を通過した後に排出された試料溶液を、２分毎に９６穴プレートのウェルに回収した（１００μＬ／ｗｅｌｌ）。

その後、潅流開始から２０分後、３２分後、および、４４分後に四方バルブをひねり、生体試料培養チップ９へ潅流させる試料溶液を切り替えた。そして、潅流開始から６０分後に、分取を終了した。

９６穴プレートの各ウェル内に分取した試料溶液から８０μＬずつを新しい９６ウェルプレートの各ウェル内へ移し６２０μｍの波長における吸光度を、プレートリーダー（ＭｕｌｔｉＳｋａｎ ＦＣ Ｂａｓｉｃ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。検量線を用いて、各ウェル内に分取した各試料溶液のトリパンブルー濃度を算出し、当該トリパンブルー濃度をグラフ化した。

試験結果を図１の１０６に示す。四方バルブをひねった時間を、矢印で示す。潅流開始から１０分後（四方バルブをひねってから２分後）では、分取された試料溶液内にトリパンブルーがほとんど含まれていなかった。一方、潅流開始から１４分後（四方バルブをひねってから６分後）では、分取された試料溶液内に、原液（０．０１ｗ／ｖ％）に近い濃度のトリパンブルーが含まれていた。

本実施例の生体試料評価デバイスであれば、生体試料培養チップ９内へ複数種類の試料溶液を交互に灌流できるとともに、試料溶液を複数のフラクションに分けて分取可能であることが明らかになった。

〔実施例２〕
Ｙ字型の供給流路を備えている生体試料評価デバイスに２種類の試料溶液を交互に潅流させ、試料溶液を複数のフラクションに分けて分取可能か否か確認した。なお、本生体試料評価デバイスでは、供給流路として、図３の３０１の右側に示すＹ字流路を用いた。

試料溶液としては、ＰＢＳ（−）溶液と、０．０１Ｗ／Ｖ％ トリパンブルー溶液とを用いた。０．０１Ｗ／Ｖ％ トリパンブルー溶液は、０．４％Ｗ／Ｖ％ トリパンブルー溶液をＰＢＳ（−）にて希釈することによって調製した。

本実施例では、シリンジポンプ（ｋｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）２台を用いて、生体試料培養チップ９へ試料溶液を送った。１台のシリンジポンプを用いて、生体試料培養チップ９へＰＢＳ（−）溶液を灌流し、もう一台のシリンジポンプを用いて、生体試料培養チップ９へトリパンブルー溶液を灌流した。シリンジポンプと生体試料培養チップ９とは、シリコンチューブによって連結した。２台のシリンジポンプの内、一方をＯＮにしている時は、もう一方をＯＦＦにした。この方法により、ＰＢＳ（−）溶液と、０．０１Ｗ／Ｖ％ トリパンブルー溶液とを、交互に生体試料培養チップ９へ灌流した。

まず、ＰＢＳ（−）溶液用のシリンジポンプを起動して、ＰＢＳ（−）溶液を生体試料培養チップ９へ潅流し（５０μＬ／ｍｉｎ）、生体試料培養チップ９を通過した後に排出された試料溶液を、２分毎に９６穴プレートのウェルに回収した（１００μＬ／ｗｅｌｌ）。

灌流開始から８分後に、ＰＢＳ（−）溶液用のシリンジポンプを止め、０．０１Ｗ／Ｖ％ トリパンブルー溶液用のシリンジポンプを作動させた。これによって、生体試料培養チップ９へ潅流させる試料溶液を、ＰＢＳ（−）溶液から０．０１Ｗ／Ｖ％ トリパンブルー溶液に切り替えた。生体試料培養チップ９へ潅流させる試料溶液を切り替えた後、生体試料培養チップ９を通過した後に排出された試料溶液を、２分毎に９６穴プレートのウェルに回収した（１００μＬ／ｗｅｌｌ）。

その後、潅流開始から２０分後、３２分後、および、４４分後に作動させるシリンジポンプを切り替え、これによって、生体試料培養チップ９へ潅流させる試料溶液を切り替えた。そして、潅流開始から６０分後に、分取を終了した。

９６穴プレートの各ウェル内に分取した試料溶液から９０μＬずつを新しい９６ウェルプレートの各ウェル内へ移し６２０μｍの波長における吸光度を、プレートリーダー（ＭｕｌｔｉＳｋａｎ ＦＣ Ｂａｓｉｃ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。検量線を用いて、各ウェル内に分取した各試料溶液のトリパンブルー濃度を算出し、当該トリパンブルー濃度をグラフ化した。

試験結果を図３の３０３に示す。２台のシリンジポンプのＯＮ／ＯＦＦを切替えた時間を、矢印で示す。潅流開始から１０分後（２台のシリンジポンプのＯＮ／ＯＦＦを切替えてから２分後）では、分取された試料溶液内に略０．００５ｗ／ｖ％のトリパンブルーが含まれていた。一方、潅流開始から１２分後（２台のシリンジポンプのＯＮ／ＯＦＦを切替えてから４分後）では、分取された試料溶液内に、原液（０．０１ｗ／ｖ％）に近い濃度のトリパンブルーが含まれていた。

本実施例の生体試料評価デバイスであれば、生体試料培養チップ９内へ複数種類の試料溶液を交互に灌流できるとともに、試料溶液を複数のフラクションに分けて分取可能であることが明らかになった。

〔実施例３〕
６カラム用の試料溶液分取チップを備えている生体試料評価デバイスに２種類の試料溶液を交互に潅流させ、試料溶液を複数のフラクションに分けて分取可能か否か確認した。

試料溶液としては、黄色溶液（２ｍｇ／ｍＬ黄色食紅水）と、青色溶液（２ｍｇ／ｍＬ青色食紅水）とを用いた。

生体試料評価デバイスとしては、実施例１に用いた生体試料評価デバイスから９６穴プレートを除き、当該９６穴プレートの代わりに図５の５０１〜５０３に示す試料溶液分取チップ（６カラム用）を備えたものを用いた。なお、試料溶液分取チップ（６カラム用）内に設けられている格納領域は、下から上に向かって、順に１番目〜６番目の格納領域と呼ぶこととする。

まず、試料溶液分取チップ（６カラム用）内に黄色溶液を導入し、１番目の格納領域、次いで２番目の格納領域が黄色溶液によって満たされたときに、四方バルブ７をひねり、生体試料培養チップ９へ潅流させる試料溶液を、黄色溶液から青色溶液に切り替えた。６番目の格納領域が青色溶液によって満たされたときに、分取を終了した。

試験結果を図５の５０４に示す。本実施例の生体試料評価デバイスであれば、生体試料培養チップ９内へ複数種類の試料溶液を交互に灌流できるとともに、試料溶液を６個のフラクションに分けて分取可能であることが明らかになった。更に、本実施例の生体試料評価デバイスであれば、格納領域間での試料溶液の混合が生じることなく、経時的に所定の量の試料溶液を分取可能であることが明らかになった。更に、本実施例の生体試料評価デバイスでは、試料溶液分取チップ内における試料溶液の移動がスムーズであり、格納領域の壁面、および／または、分取流路の壁面が超親水性になっていることが明らかになった。

〔実施例４〕
１２カラム用の試料溶液分取チップを備えている生体試料評価デバイスに２種類の試料溶液を交互に潅流させ、試料溶液を複数のフラクションに分けて分取可能か否か確認した。

試料溶液としては、ＰＢＳ（−）溶液と、０．０１Ｗ／Ｖ％ トリパンブルー溶液とを用いた。０．０１Ｗ／Ｖ％ トリパンブルー溶液は、０．４％Ｗ／Ｖ％ トリパンブルー溶液をＰＢＳ（−）にて希釈することによって調製した。

生体試料評価デバイスとしては、実施例１に用いた生体試料評価デバイスから９６穴プレートを除き、当該９６穴プレートの代わりに図６の６０１〜６０２に示す試料溶液分取チップ（１２カラム用）を備えたものを用いた。なお、試料溶液分取チップ（１２カラム用）内に設けられている格納領域は、図６の６０１〜６０２の紙面手前に存在する格納領域を、下から上に向かって、順に１番目〜６番目の格納領域と呼び、図６の６０１〜６０２の紙面奥に存在する格納領域を、下から上に向かって、順に７番目〜１２番目の格納領域と呼ぶこととする。

まず、試料溶液分取チップ（１２カラム用）内にＰＢＳ（−）溶液を導入し、１番目の格納領域、次いで２番目の格納領域がＰＢＳ（−）溶液によって満たされたときに、四方バルブ７をひねり、生体試料培養チップ９へ潅流させる試料溶液を、ＰＢＳ（−）溶液から０．０１Ｗ／Ｖ％ トリパンブルー溶液に切り替えた。７番目の格納領域が溶液によって満たされたときに、再び四方バルブ７をひねり、生体試料培養チップ９へ潅流させる試料溶液を、０．０１Ｗ／Ｖ％ トリパンブルー溶液からＰＢＳ（−）溶液に切り替えた。１２番目の格納領域が溶液によって満たされたときに、分取を終了した。

図６の６０４に示す方法にしたがって、ハサミにて試料溶液分取チップを裁断し、各格納領域内に分取された試料溶液を、９６穴プレートの各ウェル内へ移した。

９６穴プレートの各ウェル内へ移した試料溶液から６０μＬずつを新しい９６ウェルプレートの各ウェル内へ移し６２０μｍの波長における吸光度を、プレートリーダー（ＭｕｌｔｉＳｋａｎ ＦＣ Ｂａｓｉｃ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。検量線を用いて、各ウェル内に分取した各試料溶液のトリパンブルー濃度を算出し、当該トリパンブルー濃度をグラフ化した。

試験結果を図６の６０３および６０５に示す。四方バルブをひねった時間を、矢印で示す。四方バルブを１回目にひねった後に注目すると、３番目の格納領域内の試料溶液にはトリパンブルーはほとんど含まれておらず、５番目の格納領域内の試料溶液には原液（０．０１ｗ／ｖ％）に近い濃度のトリパンブルーが含まれていた。７番目の格納領域が溶液によって満たされたときに再び四方バルブ７をひねったが、８番目の格納領域内の試料溶液は、７番目の格納領域内の試料溶液と同様の組成であり、９番目の格納領域内の試料溶液ではトリパンブルーの濃度が低かった。

本実施例の生体試料評価デバイスであれば、生体試料培養チップ９内へ複数種類の試料溶液を交互に灌流できるとともに、試料溶液を１２個のフラクションに分けて分取可能（約１．６ｍＬ／約３２分）であることが明らかになった。

〔実施例５〕
本発明の生体試料評価デバイスを用いて、マウス膵島に対する糖負荷試験を行った。

ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢、オス）から膵島を単離し、当該膵島を、１０％ 牛胎児血清（ＦＢＳ）、１００ ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００ μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を含有したＲＰＭＩ１６４０培地が入った１５ｍＬチューブへ移した。氷冷下にて、約３時間かけて膵島単離場所から膵島評価場所に膵島を運んだ。その後、膵島と培地とを、アガロースコーティングされた培養皿内へ移し、３７℃、５％二酸化炭素（ＣＯ２）条件下のインキュベータ内で約３時間静置した。

試料溶液としては、以下の高濃度グルコース含有緩衝液と、低濃度グルコース含有緩衝液とを用いた：
高濃度グルコース含有緩衝液： Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ＨＥＰＥＳ （ＫＲＢＨ） ｂｕｆｆｅｒ（１１６ ｍＭ ＮａＣｌ， ４．７ ｍＭ ＫＣｌ， ２．５ ｍＭ ＣａＣｌ_２， １．２ ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４， １．２ ｍＭ ＭｇＳＯ_４， ２４ ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ２５ ｍＭ ＮａＨＣＯ_３，ａｎｄ ０．１％ ＢＳＡ； ｐＨ ７．４） ｗｉｔｈ ２２．５ ｍＭ （４０５３ ｍｇ／Ｌ） Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ０．０２８ ｍＭ （１ ｍｇ／Ｌ） ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ、
低濃度グルコース含有緩衝液： Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ＨＥＰＥＳ （ＫＲＢＨ） ｂｕｆｆｅｒ ｗｉｔｈ ２．５ ｍＭ （４５０ ｍｇ／Ｌ） Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ４００９ ｍｇ／Ｌ Ｆｉｃｏｌｌ ＰＭ４００ （ＧＥヘルスケア）、なお、Ｆｉｃｏｌｌは比重を調整するために添加した。

生体試料評価デバイスとしては、図８の８０１に示すものを用いた。

５３個の膵島を生体試料培養チップ内へ入れた。膵島の画像を取得した（図８の８０３を参照）。当該画像に基づいて、取得した膵島を、直径１５０ μｍの膵島を基準とした単位Ｉｓｌｅｔ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ （ＩＥＱ）に換算すると、４６．６ ＩＥＱであった。画像解析にはＩｍａｇｅＪバージョン１．５２ａ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）を用いた。

膵島を冷やさないために生体試料培養チップを３７℃のヒーターの上に乗せた。当該生体試料培養チップを、低濃度グルコース含有緩衝液を用いて、予め３０分間灌流した。その後、１２カラム用の試料溶液分取チップを備えた生体試料評価デバイスを用いて、以下に記述する試験を行った。

まず、低濃度グルコース含有緩衝液を生体試料培養チップへ灌流した。試料溶液分取チップの２番目の格納領域が試料溶液にて満たされたときに、四方バルブをひねり、生体試料培養チップへ灌流させる試料溶液を、低濃度グルコース含有緩衝液から高濃度グルコース含有緩衝液に切り替えた。７番目の格納領域が試料溶液によって満たされたときに、再び四方バルブをひねり、生体試料培養チップへ潅流させる試料溶液を、高濃度グルコース含有緩衝液から低濃度グルコース含有緩衝液に切り替えた。１２番目の格納領域が試料溶液によって満たされたときに、分取を終了した。なお、灌流の流速は、全て５０ μＬ／ｍｉｎで行い、アッセイ時間は、合計約３０分であった。

図６の６０４に示す方法にしたがって、ハサミにて試料溶液分取チップを裁断し、各格納領域内に分取された試料溶液を１．５ｍＬチューブ内へ移し、当該チューブを−８０℃にて保存した。

１．５ｍＬチューブ内へ移した各試料溶液に含まれているインスリンの量を、Ｍｏｕｓｅ ｉｎｓｕｌｉｎ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ）を用いて定量した。１．５ｍＬチューブ内へ移した各試料溶液に含まれているグルコースの量を、グルコカード プラスケア（アークレイ）とＧｓｅｎｓｏｒ（アークレイ）を用いて定量した。低濃度グルコース含有緩衝液、高濃度グルコース含有緩衝液、および、これらの混合溶液を用いて作成した検量線を用いて、グルコース量の測定値を補正した。

試験結果を図８の８０３〜８０６に示す。

本実施例に用いた生体試料培養チップは、メッシュシートに向かって鉛直方向に伸びる流路を備えており、当該流路は、メッシュシートとは反対側の端部に、開口を備えていた。それ故に、本実施例では、生体試料培養チップ内への膵島の投入が容易であり、かつ、糖負荷試験の前後におけるメッシュシートの表面の上に配置された膵島の顕微鏡観察が容易であった。

図８の８０３、８０５および８０６に示すように、糖負荷試験の後におけるメッシュシートの表面の上の膵島は、試料溶液の水圧および試料溶液に含まれる気泡によって破壊されることなく、大きな塊として残っていた。このことから、本発明の生体試料培養チップであれば、膵島へ与えるダメージを軽減できることが明らかになった。

図８の８０４に示すように、１〜５番目の格納領域内の試料溶液では、グルコース濃度の上昇に伴ってインスリン濃度が上昇した。６〜９番目の格納領域内の試料溶液では、グルコース濃度は高く維持されたが、インスリン濃度は経時的に減少した。１０〜１２番目の格納領域内の試料溶液では、グルコース濃度は低く維持されたため、インスリン濃度も低く維持された。

これらのグルコース濃度とインスリン濃度との相関関係は、他の研究者によるフラクションコレクターを用いた実験結果と一致していた。本試験では、従来のフラクションコレクターを使用することなく、本発明の試料溶液分取チップによって、グルコース濃度とインスリン濃度との相関関係に関する有用な情報を得ることができた。

本発明は、生体試料（例えば、膵島、スフェロイド、オルガノイド、肝臓組織、腸管組織、皮膚組織、または、心臓組織）の評価に利用することができる。例えば、肝臓組織の機能として薬物代謝能を評価する場合は、薬剤を含んだ溶液を灌流した時の代謝産物の生成速度を評価することができる。また、腸管組織（例えば、小腸組織）から分泌されるインクレチン（ＧＬＰ−１やＧＩＰ）やセクレチンなどを分取して定量することによって、腸管組織（例えば、小腸組織）の機能を評価することができる。

１ 基板
２ 蓋
３ 接続流路
４ メッシュシート
５ 生体試料
６ 試料溶液用チューブ
７ 四方バルブ
８ ポンプ
９ 生体試料培養チップ
１１ ポンプ制御装置
１２ 廃液用チューブ
１３ 鋳型
１４ コーティング剤
１５ プラズマ処理
１６・１７ 超親水化コート剤
１８ ハサミ
１９ ピペット
２０ パスツールピペット
２１ 供給流路
２２ 排出流路
２３ 整流流路
３０・３１ 基板

Claims (4)

1. 採取された生体試料を、表面の上に配置するためのメッシュシートと、
   上記メッシュシートの表面に向かって試料溶液を供給するための供給流路と、
   上記メッシュシートの表面から当該表面に背向する裏面に向かって上記メッシュシート内を通過した上記試料溶液を排出するための排出流路と、を備えていることを特徴とする、生体試料評価デバイス。
2. 上記供給流路は、（ｉ）上記メッシュシートの表面に向かって上記試料溶液を供給するための主流路と、（ｉｉ）上記主流路と接続されている複数の副流路であって、上記主流路に向かって複数種類の上記試料溶液を別々に供給するための複数の副流路と、を備えていることを特徴とする、請求項１に記載の生体試料評価デバイス。
3. 上記排出流路から排出された上記試料溶液を複数のフラクションに分けて取得するための基材を備え、
   上記基材の内部には、（ｉ）上記複数のフラクションを別々に格納するための空間である複数の格納領域であって、互いが上下の位置関係にて配置されている複数の格納領域と、（ｉｉ）上記複数の格納領域の各々と接続されている分取流路であって、上記排出流路から排出された上記試料溶液を上記格納領域内に導入するための分取流路と、が設けられていることを特徴とする、請求項１または２に記載の生体試料評価デバイス。
4. 請求項１〜３の何れか１項に記載の生体試料評価デバイスを用いる生体試料評価方法であって、
   上記生体試料評価デバイスに試料溶液を供給する供給工程と、
   上記生体試料評価デバイスから上記試料溶液を排出する排出工程と、を有することを特徴とする、生体試料評価方法。