WO2024075937A1 - 후코이단 발효물 및 그의 피부 상태 개선 용도 - Google Patents

후코이단 발효물 및 그의 피부 상태 개선 용도 Download PDF

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WO2024075937A1
WO2024075937A1 PCT/KR2023/009388 KR2023009388W WO2024075937A1 WO 2024075937 A1 WO2024075937 A1 WO 2024075937A1 KR 2023009388 W KR2023009388 W KR 2023009388W WO 2024075937 A1 WO2024075937 A1 WO 2024075937A1
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fermented
fucoidan
lactobacillus reuteri
product
skin
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PCT/KR2023/009388
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이연선
김재현
최성준
안혜진
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에이치케이이노엔 주식회사
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    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K8/73—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin

Definitions

  • Fucoidan is a polysaccharide with a sulfate group attached and is effective in anti-cancer, anti-hypertension, anti-inflammatory, etc. and is known to exist in seaweed.
  • fucoidan in a polymer state has the disadvantage of not only being poorly absorbed into the skin, but also having poor solubility in solvents.
  • fucoidan in a polymer state due to the high viscosity of fucoidan in a polymer state, when used as a cosmetic ingredient, there is a problem that the viscosity of the product increases significantly even if only a small amount is added.
  • One aspect is to provide a fermented product of fucoidan extract.
  • Another aspect is to provide a cosmetic composition containing a fermented fucoidan extract.
  • Another aspect is to provide health functional food containing fermented fucoidan extract.
  • Another aspect is to provide a pharmaceutical composition for improving, preventing or treating skin conditions containing a fermented product of fucoidan extract.
  • Another aspect is to provide a method for improving, preventing, or treating skin conditions, comprising administering a fermented product of a fucoidan extract from a Lactobacillus reuteri strain to an individual in need thereof.
  • Another aspect provides the use of a fermented product of a Lactobacillus reuteri strain of fucoidan extract for use in the manufacture of cosmetic compositions.
  • Another aspect provides the use of a fermented product of Lactobacillus reuteri strain of fucoidan extract for use in the manufacture of a pharmaceutical composition for improving, preventing or treating skin conditions.
  • One aspect provides a fermented product of fucoidan extract.
  • the fucoidan may include polysaccharides and sulfuric acid or uronic acid, and may be extracted from natural products, for example, seaweed.
  • the polysaccharide may include fucose, glucose, xylose, fructose, mannose, galactose, or a combination thereof.
  • the fucoidan or fucoidan extract may include a natural extract (eg, seaweed) containing at least 60%, 70%, 80%, or 90% or more of fucoidan. Therefore, the fucoidan or fucoidan extract may refer to an extract containing fucoidan.
  • a natural extract eg, seaweed
  • the term “fermentation” may refer to the action of microorganisms such as bacteria decomposing organic compounds to produce useful organic substances, such as alcohol, organic acids, carbon dioxide, etc., and “fermentation” is It may mean denaturing or transforming raw materials by physical or chemical methods using lactic acid bacteria.
  • the fucoidan fermentation product may be a fermentation product produced by mixing fucoidan or fucoidan extract with a lactic acid bacteria culture medium, inoculating and fermenting lactic acid bacteria.
  • the lactic acid bacteria may be a Lactobacillus sp . strain.
  • the Lactobacillus genus strains include Lactobacillus reuteri , Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis , Lactobacillus casei , and Lactobacillus crispatus ( Lactobacillus. crispatus ), Lactobacillus delbruecki spp. Bulgaricus ( Lactobacillus. delbrueckii ssp. bulgaricus ), Lactobacillus delbrueckii spp. Delbruecki ( Lactobacillus. delbrueckii ssp. delbrueckii ), Lactobacillus delbrueckii spp. Lactobacillus. delbrueckii ssp.
  • Lactis Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus , Lactobacillus johnsonii ), Lactobacillus murinus, Lactobacillus paracasei , Lactobacillus paraplantarum , Lactobacillus pentosus , Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus. plantarum ), Lactobacillus rhamnosus ( Lactobacillus . sakei ), or Lactobacillus salivarius ( Lactobacillus. salivarius ).
  • the inoculation concentration (OD) of the lactic acid bacteria is 0.001 to 0.1 OD, for example, 0.01 to 0.1 OD, 0.02 to 0.1 OD, 0.03 to 0.1 OD, 0.04 to 0.1 OD, 0.05 to 0.1 OD, 0.01 to 0.08 OD, 0.02 to 0.08 OD, 0.03 to 0.08 OD, 0.04 to 0.08 OD, 0.01 to 0.06 OD, 0.02 to 0.06 OD, 0.03 to 0.06 OD, or 0.04 to 0.06 OD.
  • the fermentation temperature may be 25 to 40 °C, for example, 30 to 40 °C or 35 to 40 °C, and the fermentation time may be 10 to 60 hours, for example, 10 to 50 hours, 10 to 40 hours, 10 to 30 hours. hours, 15 to 40 hours, or 15 to 30 hours.
  • the fermented fucoidan product may be a fermented product obtained by fermenting fucoidan or a fucoidan extract with a Lactobacillus genus strain, for example, Lactobacillus reuteri.
  • the term “fermented product obtained by fermenting fucoidan or fucoidan extract with Lactobacillus reuteri” or “fermented product of fucoidan extract from Lactobacillus reuteri strain” may be used interchangeably with “fermented fucoidan product.”
  • the Lactobacillus reuteri can induce low molecular weight fucoidan, thereby increasing the skin absorption capacity of fucoidan.
  • the fermented fucoidan product is a fermented broth obtained by fermenting fucoidan or a fucoidan extract with Lactobacillus reuteri, a diluted liquid of the fermented broth, a concentrated liquid of the fermented broth, a dried product of the fermented broth, a purified product of the fermented broth, or a fermented broth of the fermented broth. It may include fractions.
  • the fucoidan extract may be obtained by extracting pulverized seaweed with water, C1 to C4 alcohol, acetone, or a mixture thereof and freeze-drying the resulting solution, or it may be a commercially available fucoidan extract.
  • the fucoidan extract may be fucoidan powder.
  • the alcohol used for the extraction may be ethanol or methanol.
  • Extraction temperature is 30°C to 100°C, 60°C to 100°C. It may be 30°C to 90°C, 30°C to 80°C, 60°C to 90°C, or 60°C to 80°C.
  • the extraction time may be 1 hour to 36 hours, 2 hours to 36 hours, 2 hours to 24 hours, 6 hours to 24 hours or 12 hours to 24 hours.
  • the extraction method for obtaining the extract can be prepared according to a commonly used known extraction method. Specifically, commonly used extraction methods such as cold immersion method, heat extraction method, ultrasonic extraction method, filtration method, pressure extraction method, reflux extraction method, supercritical extraction method, and electric extraction method can be used. Ordinary extraction equipment, ultrasonic grinding extractor or fractionator can be used. . Additionally, if necessary, after the extraction, filtration and/or concentration and/or freeze-drying methods known in the art may be additionally used.
  • commonly used extraction methods such as cold immersion method, heat extraction method, ultrasonic extraction method, filtration method, pressure extraction method, reflux extraction method, supercritical extraction method, and electric extraction method can be used. Ordinary extraction equipment, ultrasonic grinding extractor or fractionator can be used. . Additionally, if necessary, after the extraction, filtration and/or concentration and/or freeze-drying methods known in the art may be additionally used.
  • the fermented fucoidan product can be obtained through culturing fucoidan or fucoidan extract with Lactobacillus reuteri.
  • the Lactobacillus reuteri can be used in a sufficient amount to allow fermentation to occur, which can be appropriately selected by a person skilled in the art considering the amount of fermentation raw materials, etc.
  • the incubation temperature and time can be selected to be sufficient for fermentation to occur, and can be appropriately selected by a person skilled in the art considering the amount of fermentation raw materials, type of strain, etc.
  • the culture may be performed at 20 to 40° C., but is not particularly limited thereto. Additionally, the culturing may be performed for 1 to 200 hours, 1 to 180 hours, 1 to 120 hours, 12 to 120 hours, 12 to 60 hours, 12 to 24 hours, or 17 to 24 hours.
  • the fermentation can be performed in a medium capable of cultivating strains of the Lactobacillus genus.
  • the medium may be a known medium or a conventional medium capable of cultivating strains of the Lactobacillus genus.
  • the Lactobacillus genus strain may be Lactobacillus reuteri KMH202 ( Lactobacillus reuteri KMH202) strain deposited under the accession number KCTC 14878BP.
  • the Lactobacillus reuteri KMH202 may include the 16s rRNA gene of SEQ ID NO: 1.
  • Another aspect provides a cosmetic composition
  • a cosmetic composition comprising a fermented product of a fucoidan extract from a Lactobacillus reuteri strain.
  • the fucoidan extract, fermented product, and Lactobacillus reuteri strain are as described above.
  • the cosmetic composition may be used to improve skin condition.
  • the skin in this specification is not limited to a specific part, and may include the skin of our entire body, including the face, scalp, and body.
  • the skin condition improvement may be antioxidant, skin moisturizing improvement, skin barrier improvement, skin regeneration improvement, or skin whitening improvement.
  • the “skin barrier improvement” may refer to any action that improves the function of the skin barrier, which is located on the outermost layer of the skin and prevents moisture and nutrition loss.
  • the “skin whitening” can brighten skin tone by inhibiting the synthesis of melanin pigment, and can mean improving skin hyperpigmentation such as spots or freckles caused by ultraviolet rays, hormones, or genetics.
  • the fermented product is 0.0001 to 99.9999% by weight, 0.0001 to 90% by weight, 0.0001 to 50% by weight, 0.0001 to 10% by weight, 0.01 to 99.9999% by weight, 0.01 to 90% by weight, 0.01 to 50% by weight, based on the total weight of the cosmetic composition. %, 0.01 to 10% by weight, 0.1 to 99.9999% by weight, 0.1 to 90% by weight, 0.1 to 50% by weight, or 0.1 to 10% by weight, but is not particularly limited thereto.
  • the cosmetic composition may have, for example, an softening lotion, nourishing lotion, massage cream, nourishing cream, essence, pack, gel, ampoule, or skin-adhesive type cosmetic formulation.
  • the cosmetic composition may further include additional ingredients commonly used in cosmetics.
  • additional ingredients commonly used in cosmetics.
  • a person skilled in the art will be able to select any additional ingredients and/or their amounts such that the advantageous properties of the compositions according to the present disclosure are not or substantially not adversely affected by the envisaged additions.
  • the cosmetic composition may be used alone or in combination, or may be used in combination with other cosmetic compositions other than those of the present invention.
  • the cosmetic composition according to the present invention can be used according to conventional usage methods, and the number of times of use can be varied depending on the user's skin condition or preference.
  • Another aspect provides a health functional food containing a fermented product of Lactobacillus reuteri strain of fucoidan extract.
  • the fucoidan extract, fermented product, and Lactobacillus reuteri strain are as described above.
  • the health functional food may be used to improve skin condition.
  • the skin condition was as described above.
  • the health functional food can be used together with the composition or other food ingredients, and can be used appropriately according to conventional methods.
  • the mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health, or therapeutic treatment).
  • the composition of the present specification may be added in an amount of 15 parts by weight or less based on the raw materials.
  • beverage compositions may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients like ordinary beverages.
  • the natural carbohydrates may be monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • a sweetener natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract or synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame can be used.
  • the health food composition also contains nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, and carbonated beverages. It may contain the carbonating agent used, or a combination thereof.
  • the health functional food composition may also contain pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage, vegetable beverage, or a combination thereof.
  • the fermented product is 0.0001 to 99.9999% by weight, 0.0001 to 90% by weight, 0.0001 to 50% by weight, 0.0001 to 10% by weight, 0.01 to 99.9999% by weight, 0.01 to 90% by weight, 0.01 to 50% by weight, based on the total weight of the health functional food. It may be included in weight%, 0.01 to 10% by weight, 0.1 to 99.9999% by weight, 0.1 to 90% by weight, 0.1 to 50% by weight, or 0.1 to 10% by weight, but is not particularly limited thereto.
  • Another aspect provides a pharmaceutical composition for improving, preventing, or treating skin condition, comprising a fermented product of Lactobacillus reuteri strain of fucoidan extract as an active ingredient.
  • the fucoidan extract, fermented product, and Lactobacillus reuteri strain are as described above.
  • the skin condition may be a condition related to skin antioxidant, skin moisturizing, skin barrier, skin regeneration, or skin whitening.
  • the pharmaceutical composition may be used for skin regeneration.
  • the term "included as an active ingredient” may mean that the fermented product is added to an extent that can produce the effects mentioned above, and various ingredients are added as sub-ingredients for drug delivery and stabilization, etc. to form various forms. It may include being formulated.
  • the pharmaceutical composition may additionally include a pharmaceutically acceptable diluent or carrier.
  • the diluent may be lactose, corn starch, soybean oil, microcrystalline cellulose, or mannitol, and the lubricant may be magnesium stearate, talc, or a combination thereof.
  • the carrier may be an excipient, disintegrant, binder, lubricant, or a combination thereof.
  • the excipient may be microcrystalline cellulose, lactose, low-substituted hydroxycellulose, or a combination thereof.
  • the disintegrant may be calcium carboxymethylcellulose, sodium starch glycolate, calcium monohydrogen phosphate anhydride, or a combination thereof.
  • the binder may be polyvinylpyrrolidone, low-substituted hydroxypropylcellulose, hydroxypropylcellulose, or a combination thereof.
  • the lubricant may be magnesium stearate, silicon dioxide, talc, or a combination thereof.
  • the pharmaceutical composition may be formulated as an oral or parenteral dosage form.
  • Oral dosage forms may be granules, powders, solutions, tablets, capsules, dry syrup, or combinations thereof.
  • Parenteral dosage forms may be injectable.
  • the fermented product is 0.0001 to 99.9999% by weight, 0.0001 to 90% by weight, 0.0001 to 50% by weight, 0.0001 to 10% by weight, 0.01 to 99.9999% by weight, 0.01 to 90% by weight, 0.01 to 50% by weight, based on the total weight of the pharmaceutical composition. It may be included in weight%, 0.01 to 10% by weight, 0.1 to 99.9999% by weight, 0.1 to 90% by weight, 0.1 to 50% by weight, or 0.1 to 10% by weight, but is not particularly limited thereto.
  • Another aspect provides a method of preventing, ameliorating, or treating a condition of a subject comprising treating or administering an effective amount of the pharmaceutical composition described above to the subject in need thereof.
  • the condition of the subject may include conditions related to the skin, such as conditions related to antioxidant, skin moisturizing, skin barrier, skin regeneration, or skin whitening.
  • Administration can be done by methods known in the art. Administration may be administered directly to the subject by any means, such as, for example, intravenous, intramuscular, oral, transdermal, mucosal, intranasal, intratracheal or subcutaneous administration. You can. The administration may be administered systemically or locally.
  • the administration of the composition according to one embodiment is 0.00001 mg to 1,000 mg, for example, 0.00001 mg to 500 mg, 0.00001 mg to 100 mg, 0.00001 mg to 50 mg, 0.00001 mg to 25 mg, 1 mg to 1 mg per day.
  • 1,000 mg, 1 mg to 500 mg, 1 mg to 100 mg, 1 mg to 50 mg, 1 mg to 25 mg, 5 mg to 1,000 mg, 5 mg to 500 mg, 5 mg to 100 mg, 5 mg to 50 mg, 5 mg to 25 mg, 10 mg to 1,000 mg, 10 mg to 500 mg, 10 mg to 100 mg, 10 mg to 50 mg, or 10 mg to 25 mg may be administered.
  • the dosage may be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, gender, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity, and those skilled in the art will Taking these factors into consideration, the dosage can be adjusted appropriately.
  • the frequency of administration can be once a day or more than twice within the range of clinically acceptable side effects, and can be administered at one or two or more locations, daily or at intervals of 2 to 5 days.
  • the number of days of administration can be from 1 to 30 days per treatment. If necessary, the same treatment can be repeated after an appropriate period.
  • the dosage per kg is the same as for humans, or the above dosage is converted into, for example, the volume ratio (e.g., average value) of the organs (heart, etc.) between the target animal and human.
  • One dose can be administered.
  • the composition according to one aspect has the effect of inducing low molecules of fucoidan when fermenting fucoidan through the Lactobacillus strain, thereby improving the skin absorption ability of fucoidan and the solubility in solvents.
  • it has significantly improved skin improvement effects compared to fucoidan extract, for example, antioxidant, improved skin moisturizing, improved skin barrier, improved skin regeneration, or improved skin whitening effects.
  • Figure 1 is a graph showing the antioxidant effect of fucoidan fermented with Lactobacillus reuteri KMH202.
  • Figure 2 is a graph showing the melanin production inhibition effect of fucoidan fermented with Lactobacillus reuteri KMH202.
  • Figure 3 is a graph showing the expression level of filaggrin mRNA in fucoidan fermentation product fermented with Lactobacillus reuteri KMH202.
  • Figure 4 is a graph showing the expression level of HAS3 mRNA in fucoidan fermentation product fermented with Lactobacillus reuteri KMH202.
  • Figures 5 and 6 are graphs and images showing wound confluence according to treatment of fucoidan extract or fucoidan fermented product fermented with Lactobacillus reuteri KMH202:
  • Figure 5 is a graph showing wound confluence according to treatment of fucoidan extract or fermented fucoidan product fermented with Lactobacillus reuteri KMH202
  • Figure 6 is a graph showing wound healing effect according to treatment of fucoidan extract or fermented fucoidan product fermented with Lactobacillus reuteri KMH202. This is an image showing .
  • the base sequence of the 16S rRNA region determined among the selected bacterial colonies was compared and analyzed with other strains registered with the BLAST program provided on the US National Center for Biotechnology Information (NCBI) website.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • Lactobacillus reuteri KMH202 with 99% homology was isolated.
  • the selected Lactobacillus reuteri KMH202 strain was deposited at the Korea Center for Biological Resources on February 25, 2022 and given the deposit number KCTC 14878BP, and the Lactobacillus reuteri KMH202 strain has a 16s rRNA gene sequence of SEQ ID NO: 1 (complementary DNA). .
  • the fucoidan extract was cultured at 37° C. under anaerobic conditions for 17 hours to obtain a cultured fermentation broth, and then the fermentation broth was centrifuged at 4000 RPM for 10 to 20 minutes to obtain a supernatant. Afterwards, the supernatant was filtered through a 0.22 um filter to sterilize the residue, and a fermented fucoidan product was prepared.
  • DPPH assay was performed to confirm the antioxidant effect of fucoidan fermented with Lactobacillus reuteri KMH202.
  • Figure 1 is a graph showing the antioxidant effect of fucoidan fermented with Lactobacillus reuteri KMH202.
  • B16F1 cells were inoculated into a 6 - well plate at a density of 1 Afterwards, the cell culture medium was removed and washed with 1 mL of DPBS, and fucoidan fermentation product, fucoidan, and arbutin were each diluted with cell culture medium and added at 2 mL/well. Afterwards, the cells were cultured in an incubator at 37°C and 5% CO 2 for 72 hours. Then, the cells from which the culture medium was removed were reacted with trypsin-EDTA to obtain cells, and the obtained cells were washed once with 1 mL of DPBS.
  • Figure 2 is a graph showing the melanin production inhibition effect of fucoidan fermentation product fermented with Lactobacillus reuteri KMH202.
  • HaCaT cells were inoculated into a 6-well cell culture plate at a density of 3 x 10 5 cells/well and then cultured in an incubator at 37°C and 5% CO 2 for 24 hours. Afterwards, the fucoidan fermentation product and fucoidan were each diluted with a medium not containing FBS (FBS free medium), then added to the plate and cultured for 20 hours.
  • RNA was isolated using the RNeasy Mini Kit (QIAGEN), and the purity of the isolated RNA was confirmed using NanoDrop Onec (Thermo Scientific), then quantified, and cDNA was synthesized using SuperScript IV VILO Master Mix (Invitrogen).
  • Step One Plus (applied biosystems) was used as the RT-PCR equipment, and PowerUp SYBR Green Master Mix (applied biosystems) was added together with the synthesized cDNA and primer (filaggrin or ⁇ primer) and polymerized at 95°C for 2 minutes. After activating the enzyme, the polymerization reaction was performed: a total of 40 cycles (15 s at 95°C, 15 s at 55°C, 1 min at 72°C per cycle). D-panthenol was used as a control, and the sequences of the primers used are shown in Table 1 below.
  • Figure 3 is a graph showing the expression level of filaggrin mRNA in fucoidan fermentation product fermented with Lactobacillus reuteri KMH202.
  • HAS3 Hyaluronan synthase 3
  • a hyaluronic acid synthase enzyme in HaCaT cell line was confirmed by real-time PCR, and the results are shown in Fig. It is shown in 4.
  • HaCaT cells were inoculated into a 6-well cell culture plate at a density of 3 x 10 5 cells/well and then cultured in an incubator at 37°C and 5% CO 2 for 24 hours. Afterwards, the fermented fucoidan product and fucoidan were each diluted with FBS free medium, then added to the plate and cultured for 20 hours. RNA was isolated using the RNeasy Mini Kit (QIAGEN), and the purity of the isolated RNA was confirmed using NanoDrop Onec (Thermo Scientific), then quantified, and cDNA was synthesized using SuperScript IV VILO Master Mix (Invitrogen).
  • Step One Plus (applied biosystems) was used as the RT-PCR equipment, and PowerUp SYBR Green Master Mix (applied biosystems) was added together with the synthesized cDNA and primer (filaggrin or ⁇ primer), followed by polymerase incubation at 95°C for 2 minutes. After activation, the polymerization reaction was performed: a total of 40 cycles (15 seconds at 95°C, 15 seconds at 55°C, 1 minute at 72°C per cycle). Retinoic acid was used as a control, and the sequences of the primers used are shown in Table 2 below.
  • Figure 4 is a graph showing the expression level of HAS3 mRNA in fucoidan fermentation product fermented with Lactobacillus reuteri KMH202.
  • HaCaT cells were inoculated into a 96 well cell culture plate at a density of 3 Then, a wound scratch was created using a 96-well wound maker (sartorius stedim biotech) and washed twice with PBS. After changing to FBS free medium, fermented fucoidan or fucoidan was added to a concentration of 1% (v/v), and then cultured for 12 hours at 37°C and 5% CO 2 conditions. Then, cell photos of cultured HaCaT cells were taken using IncuCyte (Satorius). As a control group, a cell line without any sample treatment was used.
  • Wound confluence (%) [(cell area at 12 hours - cell area at 0 hours)/(total area - cell area at 0 hours)] x 100.
  • Figures 5 and 6 are graphs and images showing wound confluence according to treatment of fucoidan extract or fucoidan fermented product fermented with Lactobacillus reuteri KMH202:
  • Figure 5 is a graph showing wound confluence according to treatment of fucoidan extract or fermented fucoidan product fermented with Lactobacillus reuteri KMH202
  • Figure 6 is a graph showing wound healing effect according to treatment of fucoidan extract or fermented fucoidan product fermented with Lactobacillus reuteri KMH202. This is an image showing .

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Abstract

후코이단 발효물을 포함하는 조성물 및 그의 피부 상태 개선 용도에 관한 것으로, 일 양상에 따른 조성물은 상기 락토바실러스 속 균주를 통해 후코이단을 발효하는 경우, 후코이단의 저분자를 유도할 수 있어, 후코이단의 피부 흡수력 및 용매에 대한 용해도를 개선할 수 있는 효과가 있다. 또한, 후코이단 추출물 대비 현저히 향상된 피부 개선 효과, 예를 들면, 항산화, 피부 보습 개선, 피부 장벽 개선, 피부 재생 개선, 또는 피부 미백 효과가 있다.

Description

후코이단 발효물 및 그의 피부 상태 개선 용도
후코이단 발효물 및 그의 피부 상태 개선 용도에 관한 것이다.
후코이단(fucoidan)은 황 산기가 부착된 다당류로써 항암, 항고혈압, 항염증 등에 효능이 있고, 해조류에 존재하는 것으로 알려져 있다.
그러나 고분자 상태의 후코이단은 피부에 제대로 흡수되지 못할 뿐만 아니라, 용매에 대한 용해도가 떨어지는 단점이 있다. 또한, 고분자 상태의 후코이단은 큰 점성으로 인해, 화장품 성분으로 활용 시 소량만 첨가하여도 제품의 점도가 크게 상승된다는 문제가 발생한다.
이에, 산이나 염기와 같은 화학적 방법을 통해 후코이단의 저분자화를 유도하는 종래 기술들이 개발되어 왔으나, 이러한 공정은 매우 복잡하고 까다로운 조건에서 진행되기 때문에 비효율적이며 비경제적이라는 단점이 있다.
일 양상은 후코이단(fucoidan) 추출물의 발효물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 후코이단 추출물의 발효물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 후코이단 추출물의 발효물을 포함하는 건강기능식품을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 후코이단 추출물의 발효물을 포함하는 피부상태 개선, 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 후코이단 추출물의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주 발효물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부상태를 개선, 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 화장료 조성물의 제조에 사용하기 위한 후코이단 추출물의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주 발효물의 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 피부상태 개선, 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한 후코이단 추출물의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주 발효물의 용도를 제공하는 것이다.
일 양상은 후코이단 추출물의 발효물을 제공한다.
상기 후코이단은 다당류, 및 황산 또는 우론산을 포함할 수 있으며, 천연물, 예를 들어, 해조류로부터 추출될 수 있다. 상기 다당류는 후코스, 글루코스, 자일로스, 프럭토스, 만노스, 갈락토스 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 후코이단 또는 후코이단 추출물은 후코이단을 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 이상 함유하는 천연 추출물(예를 들면, 해조류)을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 후코이단 또는 후코이단 추출물은 후코이단을 포함하는 추출물을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "발효(fermentation)"는 균 등의 미생물이 유기 화합물을 분해하여 유용한 유기물, 즉, 알코올류, 유기산류, 이산화탄소 등을 생기게 하는 작용을 의미할 수 있으며, "발효물"은 유산균을 이용하여 원재료를 물리적, 화학적인 방법으로 변성 또는 변형시키는 것을 의미할 수 있다.
구체적으로, 상기 후코이단 발효물은 후코이단 또는 후코이단 추출물을 유산균 배양배지에 혼합하고 유산균을 접종 및 발효시켜 생산된 발효산물일 수 있다. 상기 유산균은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 균주일 수 있다.
상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus. brevis), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus. casei), 락토바실러스 크리스파터스(Lactobacillus. crispatus), 락토바실러스 델브루에키 spp. 불가리쿠스(Lactobacillus. delbrueckii ssp. bulgaricus), 락토바실러스 델브루에키 spp. 델브루에키(Lactobacillus. delbrueckii ssp. delbrueckii), 락토바실러스 델브루에키 spp. 락티스(Lactobacillus. delbrueckii ssp. lactis), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus. fermentum), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus. gasseri), 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus. helveticus), 락토바실러스 존소니(Lactobacillus. johnsonii), 락토바실러스 뮤리너스(Lactobacillus. murinus), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus. paracasei), 락토바실러스 파라플란타룸(Lactobacillus. paraplantarum), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus. pentosus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus. plantarum), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus. rhamnosus), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus. sakei) 또는 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus. salivarius)일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 유산균의 접종 농도(OD)는 0.001 내지 0.1 OD, 예를 들면, 0.01 내지 0.1 OD, 0.02 내지 0.1 OD, 0.03 내지 0.1 OD, 0.04 내지 0.1 OD, 0.05 내지 0.1 OD, 0.01 내지 0.08 OD, 0.02 내지 0.08 OD, 0.03 내지 0.08 OD, 0.04 내지 0.08 OD, 0.01 내지 0.06 OD, 0.02 내지 0.06 OD, 0.03 내지 0.06 OD, 또는 0.04 내지 0.06 OD일 수 있다.
상기 발효 온도는 25 내지 40 ℃ 예를 들면, 30 내지 40 ℃ 또는 35 내지 40 ℃일 수 있으며, 발효 시간은 10 내지 60 시간, 예를 들면, 10 내지 50 시간, 10 내지 40 시간, 10 내지 30 시간, 15 내지 40 시간, 또는 15 내지 30 시간일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 후코이단 발효물은 후코이단 또는 후코이단 추출물을 락토바실러스 속 균주, 예를 들면, 락토바실러스 루테리에 의해 발효시켜 수득한 발효물일 수 있다. 상기 "후코이단 또는 후코이단 추출물을 락토바실러스 루테리에 의해 발효시켜 수득한 발효물" 또는 "후코이단 추출물의 락토바실러스 루테리 균주 발효물"은 "후코이단 발효물"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 락토바실러스 루테리는 후코이단의 저분자화를 유도하여, 후코이단의 피부 흡수력을 상승시킬 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 후코이단 발효물은 후코이단 또는 후코이단 추출물을 락토바실러스 루테리에 의해 발효시킨 발효액, 상기 발효액의 희석액, 상기 발효액의 농축액, 상기 발효액의 건조물, 상기 발효액의 정제물, 또는 상기 발효액의 분획물을 포함할 수 있다.
상기 후코이단 추출물은 분쇄한 해조류를 물, C1 내지 C4 알코올, 아세톤 또는 이들의 혼합물로 추출하여 수득한 용액을 동결건조하여 수득한 것, 또는 시판되고 있는 후코이단 추출물일 수 있다. 예를 들어, 상기 후코이단 추출물은 후코이단 파우더일 수 있다. 상기 추출에 사용되는 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것일 수 있다. 추출 온도는 30 ℃ 내지 100 ℃, 60 ℃ 내지 100 ℃. 30 ℃ 내지 90 ℃, 30 ℃ 내지 80 ℃, 60 ℃ 내지 90 ℃, 또는 60 ℃ 내지 80 ℃일 수 있다. 추출 시간은 1 시간 내지 36 시간, 2 시간 내지 36 시간, 2 시간 내지 24 시간, 6 시간 내지 24 시간 또는 12 시간 내지 24 시간일 수 있다. 상기 추출물을 얻기 위한 추출방법은 통상적으로 사용되는 공지된 추출방법에 따라 제조될 수 있다. 구체적으로 냉침법, 가열 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 가압추출법, 환류추출법, 초임계 추출법, 전기적 추출법 등 통상적으로 사용되는 추출법을 사용할 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 또한, 필요한 경우 상기 추출 후, 당업계에 공지된 여과 및/또는 농축 및/또는 동결건조 방법을 추가적으로 사용할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 후코이단 발효물은 후코이단 또는 후코이단 추출물을 락토바실러스 루테리와 배양하는 단계를 통해 수득할 수 있다. 이 때, 상기 락토바실러스 루테리는 발효가 일어날 수 있도록 충분한 양을 사용할 수 있으며, 이는 발효 원료의 양 등을 고려하여 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
상기 배양 온도 및 시간은 발효가 일어날 수 있도록 충분한 온도 및 시간을 선택할 수 있으며, 이는 발효 원료의 양, 균주의 종류 등을 고려하여 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 상기 배양 20 내지 40 ℃에서 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 배양은 1 내지 200 시간, 1 내지 180 시간, 1 내지 120 시간, 12 내지 120 시간, 12 내지 60 시간, 12 내지 24 시간, 또는 17 내지 24 시간 동안 수행될 수 있다.
상기 발효는 락토바실러스 속 균주를 배양할 수 있는 배지에서 수행될 수 있다. 상기 배지는 락토바실러스 속 균주를 배양할 수 있는 공지된 배지 또는 통상적인 배지를 사용할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 락토바실러스 속 균주는 기탁번호 KCTC 14878BP로 기탁된 락토바실러스 루테리 KMH202(Lactobacillus reuteri KMH202) 균주일 수 있다.
상기 락토바실러스 루테리 KMH202는 서열번호 1의 16s rRNA 유전자를 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은 후코이단 추출물의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주 발효물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
상기 후코이단 추출물, 발효물, 및 락토바실러스 루테리 균주는 상기한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부상태 개선용일 수 있다.
본 명세서 상에서의 피부는 특정 부분을 한정하는 것이 아니며, 얼굴, 두피, 몸 등을 포함하는 우리 몸 전체의 피부를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 피부상태 개선은 항산화, 피부 보습 개선, 피부 장벽 개선, 피부 재생 개선, 또는 피부 미백 개선일 수 있다.
상기 "피부 장벽 개선"은 피부 가장 바깥쪽에 위치하여 수분과 영양 손실을 막아주는 피부 장벽의 기능이 증진되는 모든 작용을 의미할 수 있다.
상기 "피부 미백"은 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써 피부 톤을 밝게 할 수 있으며, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착을 개선하는 것을 의미할 수 있다.
상기 발효물은 화장료 조성물 총 중량에 대해 0.0001 내지 99.9999 중량%, 0.0001 내지 90 중량%, 0.0001 내지 50 중량%, 0.0001 내지 10 중량%, 0.01 내지 99.9999 중량%, 0.01 내지 90 중량%, 0.01 내지 50 중량%, 0.01 내지 10 중량%, 0.1 내지 99.9999 중량%, 0.1 내지 90 중량%, 0.1 내지 50 중량%, 또는 0.1 내지 10 중량%로 포함될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 화장료 조성물은 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 에센스, 팩, 젤, 앰플 또는 피부 점착 타입의 화장료 제형을 갖는 것일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 화장품에 통상 사용되는 추가 성분을 더 포함할 수 있다. 당업자는 본 명세서에 따른 조성물의 유리한 특성이 예상된 첨가에 의해 악영향을 받지 않거나 실질적으로 받지 않도록, 임의의 추가 성분 및/또는 이의 양을 선택할 수 있다.
또한, 상기 화장료 조성물은 단독 또는 중복으로 도포하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복 도포하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.
또 다른 양상은 후코이단 추출물의 락토바실러스 루테리 균주 발효물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다.
상기 후코이단 추출물, 발효물, 및 락토바실러스 루테리 균주는 상기한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상기 건강기능식품은 피부상태 개선용일 수 있다.
피부상태는 상기한 바와 같다.
상기 건강기능식품은 상기 조성물 또는 다른 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강기능식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 건강식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.
상기 발효물은 건강기능식품 총 중량에 대해 0.0001 내지 99.9999 중량%, 0.0001 내지 90 중량%, 0.0001 내지 50 중량%, 0.0001 내지 10 중량%, 0.01 내지 99.9999 중량%, 0.01 내지 90 중량%, 0.01 내지 50 중량%, 0.01 내지 10 중량%, 0.1 내지 99.9999 중량%, 0.1 내지 90 중량%, 0.1 내지 50 중량%, 또는 0.1 내지 10 중량%로 포함될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양상은 후코이단 추출물의 락토바실러스 루테리 균주 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선, 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 후코이단 추출물, 발효물, 및 락토바실러스 루테리 균주는 상기한 바와 같다.
상기 피부상태는 피부 항산화, 피부 보습, 피부 장벽, 피부 재생, 또는 피부 미백과 관련된 상태일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 피부 재생용일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "유효성분으로 포함"은 상기에서 언급한 효과를 나타낼 수 있는 정도로 상기 발효물이 첨가되는 것을 의미할 수 있으며, 약물전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 포뮬레이션 (formulation)되는 것을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제일 수 있다.
상기 발효물은 약학적 조성물 총 중량에 대해 0.0001 내지 99.9999 중량%, 0.0001 내지 90 중량%, 0.0001 내지 50 중량%, 0.0001 내지 10 중량%, 0.01 내지 99.9999 중량%, 0.01 내지 90 중량%, 0.01 내지 50 중량%, 0.01 내지 10 중량%, 0.1 내지 99.9999 중량%, 0.1 내지 90 중량%, 0.1 내지 50 중량%, 또는 0.1 내지 10 중량%로 포함될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
또한, 다른 양상은 유효한 양의 상기한 약학적 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 처리 또는 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 예방, 개선, 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체의 상태는 피부와 관련된 상태, 예를 들면, 항산화, 피부 보습, 피부 장벽, 피부 재생, 또는 피부 미백과 관련된 상태를 포함할 수 있다.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
상기 투여는 일 구체예에 따른 조성물을 개체당 일당 0.00001 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.00001 mg 내지 500 mg, 0.00001 mg 내지 100 mg, 0.00001 mg 내지 50 mg, 0.00001 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인 가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.
일 양상에 따른 조성물은 상기 락토바실러스 속 균주를 통해 후코이단을 발효하는 경우, 후코이단의 저분자를 유도할 수 있어, 후코이단의 피부 흡수력 및 용매에 대한 용해도를 개선할 수 있는 효과가 있다. 또한, 후코이단 추출물 대비 현저히 향상된 피부 개선 효과, 예를 들면, 항산화, 피부 보습 개선, 피부 장벽 개선, 피부 재생 개선, 또는 피부 미백 개선 효과가 있다.
도 1은 락토바실러스 루테리 KMH202로 발효한 후코이단 발효물의 항산화 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 락토바실러스 루테리 KMH202로 발효한 후코이단 발효물의 멜라닌 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 락토바실러스 루테리 KMH202로 발효한 후코이단 발효물의 필라그린 mRNA의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 락토바실러스 루테리 KMH202로 발효한 후코이단 발효물의 HAS3 mRNA의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 5 및 6은 후코이단 추출물 또는 락토바실러스 루테리 KMH202로 발효한 후코이단 발효물의 처리에 따른 상처 컨플루언스를 나타낸 그래프 및 이미지이다:
도 5는 후코이단 추출물 또는 락토바실러스 루테리 KMH202로 발효한 후코이단 발효물의 처리에 따른 상처 컨플루언스를 나타낸 그래프이고, 도 6은 후코이단 추출물 또는 락토바실러스 루테리 KMH202로 발효한 후코이단 발효물의 처리에 따른 상처 치유 효과를 나타낸 이미지이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 락토바실러스 루테리 KMH202의 분리 및 동정
석류로부터 락토바실러스 루테리 KMH202 균주를 분리 및 동정하기 위해 다음과 같이 수행하였다.
먼저, 껍질 채 파쇄한 석류 1 g과 MRS media 20 ml을 혼합 후 vortexing하여 시료를 현탁하였다. 그 후, 현탁된 시료를 멸균증류수를 이용하여 연속희석 하였고, MRS agar plate에 10-4 내지 10-6으로 pour plating하였다. 이 후, 37 ℃에서 1 일 이상 배양하여 균을 선별하였다.
선별한 균체 집락 중 결정된 16S rRNA부위의 염기서열을 미국 국립생물정보센터(NCBI, National Center for Biotechnology Information) 홈페이지에서 제공되는 BLAST 프로그램으로 등록된 다른 균주들과 비교 분석하였다. 비교 분석 결과 상동성 99%의 락토바실러스 루테리 KMH202를 분리하였다. 선별된 락토바실러스 루테리 KMH202 균주를 2022년 02월 25일자로 한국생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 14878BP를 부여받았고, 락토바실러스 루테리 KMH202 균주는 서열번호 1(complementary DNA)의 16s rRNA 유전자 서열을 갖는다.
실시예 2. 후코이단 발효물 제조
락토바실러스 루테리 KMH202로 발효한 후코이단 발효물을 제조하기 위해, 4 % 농도의 후코이단 추출물 파우더(Biocorp)를 정제수에 용해하고, 0.22 μm 필터로 여과하여 여과액을 수득하였다. 그 후, 상기 여과액을 200% 농도의 영양 배지(Glucose, yeast, 염 등을 포함)에 1 : 1 비율로 희석함으로써 2% 농도의 후코이단 추출물 용액을 수득하였다. 상기 후코이단 추출물 용액에 0.04 OD 농도의 락토바실러스 루테리 KMH202를 접종하였다.
그리고 상기 후코이단 추출물을 37 ℃, 혐기 조건 유지 하에서 17시간동안 배양하여 배양된 발효액을 수득한 후, 상기 발효액을 10 내지 20 분 동안 4000 RPM 조건으로 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 그 후, 상기 상등액을 0.22 um 필터로 여과하여 잔여물을 제균하고, 후코이단 발효물을 제조하였다.
실험예 1. 후코이단 발효물의 항산화 효과 확인
락토바실러스 루테리 KMH202로 발효한 후코이단 발효물의 항산화 효과를 확인하기 위해 DPPH assay를 진행하였다.
보다 구체적으로, 96 well plate에 10 % 후코이단 발효물, 또는 10 % 후코이단을 각각 100 uL씩 넣어준 후, 0.5 mM DPPH 100 uL 또는 100 % 에탄올(100 uL)을 첨가하여, 25 ℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후, 540 nm에서의 흡광도를 측정하고 그 결과를 도 1에 나타내었다. 양성대조군으로 10 ug/ml의 L-아스코르브산(ascorbic acid, 100 uL)을 사용하였다.
도 1은 락토바실러스 루테리 KMH202로 발효한 후코이단 발효물의 항산화 효과를 나타낸 그래프이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 후코이단 발효물에서 후코이단 추출물 대비 약 7 배 이상 증가한 항산화능 효과를 나타냄을 확인하였다.
실험예 2. 후코이단 발효물의 미백 효과 확인
락토바실러스 루테리 KMH202로 발효한 후코이단 발효물의 미백 효과를 확인하기 위해 멜라닌 세포에서 멜라닌 합성 저해 효과를 측정하였다.
보다 구체적으로, 6 well plate에 B16F1 세포를 1 X 105 cell/well의 밀도로 접종한 후, 37 ℃, 5 % CO2 조건으로 배양기에서 24 시간동안 배양하였다. 이후, 세포 배양액을 제거한 뒤 DPBS 1 mL로 세척하고, 후코이단 발효물, 후코이단, 및 알부틴(arbutin)을 각각 세포 배양 배지로 희석하여 각 2 mL/well씩 첨가하였다. 이후 37 ℃, 5 % CO2 조건의 배양기에서 72 시간동안 배양하였다. 그리고 배양액을 제거한 세포를 trypsin-EDTA로 반응시켜 세포를 수득하고, 상기 수득한 세포를 DPBS 1 mL로 1 회 세척하였다. 이후, 25 ℃, 10,000 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 상층액을 제거한후, pellet을 70 ℃의 건조 오븐(drying oven)에서 1 시간동안 건조시켰다. 완전히 건조된 pellet에 NaOH 용액(0.4 mL)을 첨가하여 70 ℃에서 10 분동안 pellet을 녹인 후, 1,800 rpm으로 5 분간 교반하고 96 well plate에 100 uL씩 분주하여 490 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그리고 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 락토바실러스 루테리 KMH202로 발효한 후코이단 발효물의 멜라닌 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 후코이단 추출물은 약 13 %의 멜라닌 생성 억제 효과를 보인 반면, 후코이단 발효물은 약 28.3 %의 멜라닌 생성 억제 효과를 보임을 확인하였다. 이는 후코이단 발효물에서 후코이단 추출물 대비 약 20 % 이상 증가한 미백 효과를 가짐을 의미한다.
실험예 3. 후코이단 발효물의 피부 장벽 강화 효과 확인
락토바실러스 루테리 KMH202로 발효한 후코이단 발효물의 피부장벽 강화 효과를 확인하기 위해, 인간 각질형성세포(human keratinocyte) 인 HaCaT 세포주에서 필라그린(filaggrin) 유전자의 mRNA 발현량을 real-time PCR로 확인하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
보다 구체적으로, HaCaT 세포를 6 well 세포배양 플레이트에 3 x 105 cells/well의 밀도로 접종한 후, 37 ℃, 5 % CO2 조건의 배양기에서 24 시간동안 배양하였다. 그 후, 후코이단 발효물, 및 후코이단을 각각 FBS를 포함하지 않는 배지(FBS free 배지)로 희석한 후, 상기 플레이트에 첨가하여 20 시간동안 배양하였다. RNA는 RNeasy Mini Kit(QIAGEN)를 사용하여 분리하였으며, 분리한 RNA는 NanoDrop Onec(Thermo Scientific)를 이용해 순도(purity)를 확인한 후 정량하여 SuperScript IV VILO Master Mix(Invitrogen)로 cDNA를 합성하였다. RT-PCR 장비로는 Step One Plus(applied biosystems)를 사용하였으며, PowerUp SYBR Green Master Mix(applied biosystems)를 합성한 cDNA 및 프라이머(filaggrin 또는 β의 프라이머)와 함께 첨가하여, 95 ℃에서 2 분간 중합효소를 활성화시킨 후, 중합반응을 진행하였다: 총 40 사이클(1 사이클당 95 ℃에서 15초, 55 ℃에서 15초, 72 ℃에서 1 분). 대조군으로 D-판테놀(D-panthenol)을 사용하였고, 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 1과 같다.
유전자 프라이머 방향 프라이머 서열 서열번호
Filaggrin Forward 5'-GAGCTGAAGGAACTTCTGGAAA-3' 서열번호 2
Reverse 5'-TGCTTTCTGTGCTTGTGTCC-3' 서열번호 3
β-actin Forward 5'-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3' 서열번호 4
Reverse 5'-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3' 서열번호 5
도 3은 락토바실러스 루테리 KMH202로 발효한 후코이단 발효물의 필라그린 mRNA의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 후코이단 발효물에서 필라그린 발현 정도가 후코이단 추출물 대비 약 1.5 배 이상 증가함을 확인하였다. 이는 후코이단 추출물보다 후코이단 발효물에서 현저한 피부 장벽 강화 효과가 나타남을 의미한다.
실험예 4. 후코이단 발효물의 피부 보습 효과 확인
락토바실러스 루테리 KMH202로 발효한 후코이단 발효물의 피부 보습 효과를 확인하기 위해, HaCaT 세포주에서 히알루론산 합성 효소인 HAS3(Hyaluronan synthase 3) 유전자의 mRNA 발현량을 real-time PCR로 확인하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
보다 구체적으로, HaCaT 세포를 6 well 세포배양 플레이트에 3 x 105 cells/well의 밀도로 접종한 후, 37 ℃, 5 % CO2 조건의 배양기에서 24 시간동안 배양하였다. 그 후, 후코이단 발효물 및 후코이단을 각각 FBS free 배지로 희석한 후, 상기 플레이트에 첨가하여 20 시간동안 배양하였다. RNA는 RNeasy Mini Kit(QIAGEN)를 사용하여 분리하였으며, 분리한 RNA는 NanoDrop Onec(Thermo Scientific)를 이용해 순도를 확인한 후 정량하여 SuperScript IV VILO Master Mix(Invitrogen)로 cDNA를 합성하였다. RT-PCR 장비로는 Step One Plus(applied biosystems)를 사용하였으며, PowerUp SYBR Green Master Mix(applied biosystems)를 합성한 cDNA 및 프라이머(filaggrin 또는 β의 프라이머)함께 첨가하여, 95 ℃에서 2 분간 중합효소를 활성화시킨 후, 중합반응을 진행하였다: 총 40 사이클(1 사이클당 95 ℃에서 15초, 55 ℃에서 15초, 72 ℃에서 1 분). 대조군으로 레티노산(retinoic acid)을 사용하였고, 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 2와 같다.
유전자 프라이머 방향 프라이머 서열 서열번호
HAS3 Forward 5'-GTCATGTACACGGCCTTCAA-3' 서열번호 6
Reverse 5'-CTGCTCAGGAAGGAAATCCA-3' 서열번호 7
β-actin Forward 5'-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3' 서열번호 8
Reverse 5'-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3' 서열번호 9
도 4는 락토바실러스 루테리 KMH202로 발효한 후코이단 발효물의 HAS3 mRNA의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 후코이단 발효물에서 발효물의 농도에 비례하여 HAS3 mRNA의 발현 정도가 증가함을 확인하였다. 특히, 5 % 후코이단 발효물에서 HAS3 mRNA 발현 정도가 후코이단 처리군 대비 약 5 배 이상 증가함을 확인하였다. 반면, 후코이단 추출물에서는 농도에 따른 유의한 변화가 나타나지 않음을 확인하였다.
이러한 결과는 후코이단 추출물보다 후코이단 발효물에서 현저한 피부 보습 효과가 나타남을 의미한다.
실험예 5. 후코이단 발효물의 피부 재생 효과 확인
락토바실러스 루테리 KMH202로 발효한 후코이단 발효물의 피부 재생 효과를 확인하기 위해, HaCaT 세포주를 사용하여 상처 치유 분석(wound healing assay)을 수행하고 도 5 및 6에 나타내었다.
보다 구체적으로, HaCaT 세포를 96 well 세포배양 플레이트에 3 x 104 cells/well의 밀도로 접종한 후, 37 ℃, 5 % CO2 조건의 배양기에서 24 시간동안 배양하였다. 그리고 96-well wound maker(sartorius stedim biotech)를 이용하여 상처(wound scratch)를 생성한 뒤, PBS로 2번 세척하였다. 이후 FBS free 배지로 교체한 뒤, 후코이단 발효물 또는 후코이단을 1 %(v/v) 농도가 되도록 첨가한 후, 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 12 시간동안 배양하였다. 그리고, IncuCyte(Satorius)를 사용하여 배양한 HaCaT 세포의 세포 사진을 촬영하였다. 대조군으로는 시료를 처리하지 않은 세포주를 사용하였다.
상처 컨플루언스(wound confluence)는 Incucyte Software(Scratch Wound Cell Migration and Invastion Analysis Metrics)를 사용하여 계산하였으며, 계산식은 하기 식 1과 같다:
[식 1]
상처 컨플루언스(%) = [(12시간 세포면적 - 0시간 세포면적)/(전체면적 - 0시간 세포면적)] x 100.
도 5 및 6은 후코이단 추출물 또는 락토바실러스 루테리 KMH202로 발효한 후코이단 발효물의 처리에 따른 상처 컨플루언스를 나타낸 그래프 및 이미지이다:
도 5는 후코이단 추출물 또는 락토바실러스 루테리 KMH202로 발효한 후코이단 발효물의 처리에 따른 상처 컨플루언스를 나타낸 그래프이고, 도 6은 후코이단 추출물 또는 락토바실러스 루테리 KMH202로 발효한 후코이단 발효물의 처리에 따른 상처 치유 효과를 나타낸 이미지이다.
도 5 및 6에 나타낸 바와 같이, 상처 컨플루언스에서 후코이단 추출물을 처리한 경우 대조군 대비 유의한 차이가 나타나지 않음을 확인하였다. 반면, 후코이단 발효물을 처리한 경우, 대조군 대비 약 1.2 배 증가, 및 후코이단 추출물 대비 약 1.4 배 증가한 상처 컨플루언스를 보임을 확인하였다. 이는, 후코이단 추출물보다 후코이단 발효물에서 현저한 피부 재생 효과가 나타남을 의미한다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)
수탁번호 : KCTC14878BP
수탁일자 : 20220225
Figure PCTKR2023009388-appb-img-000001

Claims (18)

  1. 후코이단 추출물의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주 발효물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 락토바실러스 루테리는 기탁번호 KCTC 14878BP로 기탁된 락토바실러스 루테리 KMH202(Lactobacillus reuteri KMH202)인 것인, 발효물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 발효물은 후코이단 추출물에 락토바실러스 루테리 균주를 접종하여 제조된 것인, 발효물.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 균주의 접종 농도는 0.001 내지 0.1 OD인 것인, 발효물.
  5. 후코이단 추출물의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주 발효물을 포함하는 화장료 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 락토바실러스 루테리는 기탁번호 KCTC 14878BP로 기탁된 락토바실러스 루테리 KMH202(Lactobacillus reuteri KMH202)인 것인, 화장료 조성물.
  7. 청구항 5에 있어서,
    상기 조성물은 피부상태 개선용인 것인, 화장료 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 피부상태 개선은 항산화, 피부 보습 개선, 피부 장벽 개선, 피부 재생 개선, 또는 피부 미백 개선인 것인, 화장료 조성물.
  9. 청구항 5에 있어서,
    상기 발효물은 후코이단 추출물을 락토바실러스 루테리에 의해 발효시킨 발효액, 상기 발효액의 희석액, 상기 발효액의 농축액, 상기 발효액의 건조물, 상기 발효액의 정제물, 또는 상기 발효액의 분획물을 포함하는 것인, 화장료 조성물.
  10. 후코이단 추출물의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주 발효물을 포함하는 건강기능식품.
  11. 청구항 10 있어서,
    상기 락토바실러스 루테리는 기탁번호 KCTC 14878BP로 기탁된 락토바실러스 루테리 KMH202(Lactobacillus reuteri KMH202) 균주인 것인, 건강기능식품.
  12. 청구항 10에 있어서,
    상기 발효물은 후코이단 추출물을 락토바실러스 루테리에 의해 발효시킨 발효액, 상기 발효액의 희석액, 상기 발효액의 농축액, 상기 발효액의 건조물, 상기 발효액의 정제물, 또는 상기 발효액의 분획물을 포함하는 것인, 건강기능식품.
  13. 후코이단 추출물의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선, 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 락토바실러스 루테리는 기탁번호 KCTC 14878BP로 기탁된 락토바실러스 루테리 KMH202(Lactobacillus reuteri KMH202) 균주인 것인, 약학적 조성물.
  15. 청구항 13에 있어서,
    상기 발효물은 후코이단 추출물을 락토바실러스 루테리에 의해 발효시킨 발효액, 상기 발효액의 희석액, 상기 발효액의 농축액, 상기 발효액의 건조물, 상기 발효액의 정제물, 또는 상기 발효액의 분획물을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  16. 후코이단 추출물의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주 발효물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부상태를 개선, 예방 또는 치료하는 방법.
  17. 화장료 조성물의 제조에 사용하기 위한 후코이단 추출물의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주 발효물의 용도.
  18. 피부상태 개선, 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한 후코이단 추출물의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주 발효물의 용도.
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