WO2024053648A1 - 脂質ナノ粒子 - Google Patents

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WO2024053648A1
WO2024053648A1 PCT/JP2023/032416 JP2023032416W WO2024053648A1 WO 2024053648 A1 WO2024053648 A1 WO 2024053648A1 JP 2023032416 W JP2023032416 W JP 2023032416W WO 2024053648 A1 WO2024053648 A1 WO 2024053648A1
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alkyl
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saturated
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剛 平井
直哉 松永
麻琴 寄立
茂弘 大戸
裕郷 近藤
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国立大学法人九州大学
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention generally belongs to the field of lipid nanoparticles that can be used in vaccines and the like.
  • the present invention relates to novel compounds capable of forming lipid nanoparticles, lipid nanoparticles containing them, and pharmaceutical compositions containing lipid nanoparticles, such as vaccines.
  • Nucleic acid medicines are one of the medicines with the greatest potential.
  • Nucleic acid medicines are one of the medicines with the greatest potential.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 antisense nucleic acids
  • siRNA Non-Patent Document 3
  • miRNA Non-Patent Document 4
  • lncRNA Non-Patent Document 5
  • the biological function and importance of untranslated RNA have been revealed, and it is attracting attention as a new drug target.
  • there are problems with their low biostability and poor physical properties due to their negatively charged polymer structure approximately 300 to 5000 kDa
  • LNPs lipid nanoparticles
  • COVID-19 novel coronavirus infection
  • LNPs lipid nanoparticles
  • They stabilize neutral (zwitterionic) lipids that assist particle formation, cholesterol, PEG lipids that play a role in particle formation and biostability improvement, and anionic nucleic acids. It consists of cationic lipids and the like (Non-Patent Document 7).
  • the structure of these components can be designed at the molecular level, and the physical properties of the particles change depending on the component ratio, so it is possible to impart extremely diverse properties.
  • Non-patent Document 8 cationic lipids that neutralize the negative charge of nucleic acids, contributing to selective accumulation in organs and stabilization of nucleic acids.
  • Non-patent Document 8 it has been suggested that PEG lipids may cause anaphylactic shock (Non-patent Document 8), and neutral lipids have long been known as 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- Since double-chain phospholipids such as phosphocholine (DSPC) are used, there is still room for further investigation.
  • DSPC double-chain phospholipids such as phosphocholine
  • Non-Patent Document 9 Non-Patent Document 9
  • glycolipids are components of cell membranes, and by recognizing specific molecules, the sugar chains protruding from the cell surface cause the molecules to be taken into the cell and various signal transmissions occur.
  • viruses such as influenza have their own sugar chain recognition proteins, and it is known that these proteins recognize and bind to sugar chains present on host cells, thereby infecting host cells.
  • Incorporating sugar chains that serve as ligands for specific sugar chain recognition proteins on the cell surface into LNPs has the potential to promote organ localization and intracellular uptake of LNPs.
  • Non-patent Literature 10 drug delivery technology
  • Non-patent Literature 11 the physical properties of LNP prepared by replacing neutral lipids with plant-derived natural glycolipids have been reported (Non-Patent Document 11), but the study has been limited to plant- and biological-derived glycolipids. No new helper lipids have been found that exhibit good transfection efficiency.
  • the organ localization tendency of LNPs changed when DSPC was replaced with another lipid, suggesting that consideration of helper lipids may be effective for organ- and cell-specific delivery of LNPs.
  • nanoparticles in which mannose is supported on the surface of hydroxyethyl starch via PEG are taken up in large quantities by dendritic cells (Non-Patent Document 12).
  • Paterson BM Roberts BE, Kuff EL. Structural gene identification and mapping by DNA-mRNA hybrid-arrested cell-free translation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977; 74(10): 4370-4374. https://doi .org/10.1073/pnas.74.10.4370 Zamecnik PC, Stephenson ML. Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligodeoxynucleotide. Proc Natl Acad Sci U S A. 1978; 75(1): 280-284.
  • COVID-19 mRNA vaccines can cause fever, inflammation, and anaphylactic shock, and the cause of these side effects is thought to be the components of LNPs that deliver mRNA. Therefore, not only is there room for improvement in the currently used LNP components, but there is no guarantee that these components will be as effective as LNP-mRNA vaccines against new infectious diseases that will emerge in the future. do not have. Therefore, the development of candidate molecules for various LNP constituents is essential.
  • the present inventors replaced the existing neutral lipids represented by DSPC with specific glycolipids in LNPs consisting of neutral lipids, cholesterol, PEG lipids, and cationic lipids, and investigated the intracellular uptake and stability of mRNA. , found that organ localization and cytokine induction ability were surprisingly greatly improved, and completed the present invention. We believe that the present invention shows that nanoparticles can be delivered to target cells if they are modified with sugar chains.
  • ⁇ C-glycoside monosaccharide lipid compound > [1]
  • R1 is hydrogen, halogen, or hydroxy
  • R2 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally interrupted by one or more ester, amide and/or ether bonds; good)
  • R3 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally interrupted by one or more ester, amide and/or ether bonds; good)
  • R4 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally interrupted by one or more ester, amide and/or ether bonds; good)
  • R5, R6 and R7 are each independently a hydrogen atom or a sugar chain connected by a glycosyl bond, Each wavy line independently indicates that when the bonded carbon is an asymmetric carbon atom, the stereochemistry of the bond is either the S or R configuration, and each dotted line independently indicates the presence of the bond
  • R1 is hydrogen, halogen, or hydroxy
  • R2 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where the alkyl is not interrupted by any bond
  • R3 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where the alkyl is not interrupted by any bond
  • R4 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where the alkyl is not interrupted by any bond
  • R5, R6 and R7 are each independently a hydrogen atom or a sugar chain connected by a glycosyl bond, Each wavy line independently indicates that when the bonded carbon is an asymmetric carbon atom, the stereochemistry of the bond is either the S or R configuration, and each dotted line independently indicates the presence of the bond.
  • the C-glycoside glycolipid compound according to [2] which indicates the presence of a bond or a double bond, which refers to either a single Z-form or
  • R1 is hydrogen, halogen, or hydroxy
  • R2 is a hydrogen atom, an optionally substituted hydroxy group, or a linear or branched, saturated or unsaturated, optionally substituted C11-C15 alkyl (herein, alkyl is one or more optionally interrupted by ester, amide and/or ether bonds)
  • R3 is a hydrogen atom, a linear or branched, saturated or unsaturated, optionally substituted C11-C15 alkyl (herein, alkyl represents one or more ester, amide and/or ether bonds);
  • R4 is straight-chain or branched, saturated or unsaturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally substituted by one or more ester, amide and/or ether bonds; ), amino which
  • R1 is hydrogen, halogen, or hydroxy
  • R2 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally interrupted by one or more ester, amide and/or ether bonds; good)
  • R3 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally interrupted by one or more ester, amide and/or ether bonds; good)
  • R4 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally interrupted by one or more ester, amide and/or ether bonds; good)
  • R5, R6 and R7 are each independently a hydrogen atom or a sugar chain connected by a glycosyl bond, Each wavy line independently indicates that when the bonded carbon is an asymmetric carbon atom, the stereochemistry of the bond is either the S or R configuration, and each dotted line independently indicates the presence of the
  • R1 is hydrogen, halogen, or hydroxy
  • R2 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where the alkyl is not interrupted by any bond
  • R3 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where the alkyl is not interrupted by any bond
  • R4 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where the alkyl is not interrupted by any bond
  • R5, R6 and R7 are each independently a hydrogen atom or a sugar chain connected by a glycosyl bond, Each wavy line independently indicates that when the bonded carbon is an asymmetric carbon atom, the stereochemistry of the bond is either the S or R configuration, and each dotted line independently indicates the presence of the bond.
  • the C-glycoside glycolipid compound according to [8] wherein the C-glycoside glycolipid compound according to [8], wherein the presence of a bond
  • ⁇ LNP> [13] The C-glycoside glycolipid compound according to any one of [1] to [6] and [7] to [12], and (a) a nucleic acid molecule, (b) a cationic lipid, and (c) an aggregation inhibitor (polyethylene (d) a sterol.
  • LNPs containing the C-glycoside glycolipid compound of the present invention dramatically increase the amount of mRNA delivered into cells and/or the ability to translate proteins encoded by the mRNA. This can significantly reduce the amount of other LNP components that may cause side effects or side effects such as fever, inflammation, and anaphylactic shock in COVID-19 mRNA vaccines, etc. It is thought that this leads to attenuation of these side effects and/or side reactions.
  • FIG. 1A is a graph showing the influence of cell number on LNP mRNA intracellular delivery using luciferase activity as an index.
  • FIG. 1B is a graph showing the effect of LNP dose on LNP mRNA intracellular delivery using luciferase activity as an index.
  • FIG. 2 is a graph showing the influence of various C-glycoside glycolipid-LNPs on mRNA intracellular delivery using luciferase activity as an index.
  • FIG. 3 is a graph showing the effects of various C-glycoside glycolipid-LNPs on living cells using ATP activity as an index.
  • FIG. 4 is a photograph of an agarose gel showing the stability of various C-glycoside glycolipids-LNPs at room temperature.
  • FIG. 5A is a graph showing the influence of various C-glycoside glycolipid-LNPs on the expression of the cytokine Ccl3 gene related to adjuvant activity.
  • FIG. 5B is a graph showing the influence of various C-glycoside glycolipid-LNPs on the expression of the cytokine Ccl22 gene related to adjuvant activity.
  • FIG. 6A is a graph showing the results of knockdown of the Mgl2 gene by transfecting cells with Mgl2 siRNA listed in Table 2.
  • FIG. 6B is a graph showing the amount of Moderna LNP, compound 15 ⁇ -LNP, and compound 14-Z ⁇ -LNP taken into cells in Mgl2 knockdown cells.
  • FIG. 7 is a photograph and a graph showing to which site LNP mRNA is delivered using luciferase activity as an indicator after Moderna LNP and Compound 14-Z ⁇ -LNP are intramuscularly injected into animals.
  • FIG. 8 is a photograph and a graph showing to which site LNP mRNA is delivered using luciferase activity as an indicator after Moderna LNP and Compound 30-LNP are intramuscularly injected into animals.
  • Figure 9 is a photograph and graph showing to which site LNP mRNA is delivered using luciferase activity as an indicator 24 hours and 72 hours after Moderna LNP and Compound 33-LNP were intramuscularly injected into animals. .
  • FIG. 8 is a photograph and a graph showing to which site LNP mRNA is delivered using luciferase activity as an indicator after Moderna LNP and Compound 30-LNP are intramuscularly injected into animals.
  • Figure 9 is a photograph and graph showing to which site LNP mRNA is delivered using
  • FIG. 10 is a photograph and a graph showing the influence of galactose-type C-type lectin 1 (macrophage galactose-type lectin 1: MGL1/CD301a) on the cellular uptake of compound 14-Z ⁇ -LNP.
  • FIG. 11 is a graph showing the influence of cell types on the intracellular uptake of Compound 14-Z ⁇ and Compound 30-LNP.
  • FIG. 12 is a graph showing intracellular mRNA uptake of compound 30-LNP targeting human leukemia cells THP1, which are human immune cells.
  • FIG. 13 is a graph showing luciferase mRNA intracellular delivery of Compound 14-Z ⁇ , Compound 30, and Compound 33-LNP.
  • FIG. 14 is a graph showing the intracellular delivery of mRNA of Compound 30-LNP using GFP protein as an indicator in comparison with Moderna-type LNP. In the figure, the P4 cell population indicates the part of the cell population with stronger fluorescence (only the shaded gray zone is shown).
  • FIG. 12 is a graph showing intracellular mRNA uptake of compound 30-LNP targeting human leukemia cells THP1, which are human immune cells.
  • FIG. 13 is a graph showing luciferase mRNA intracellular delivery of Compound 14-Z ⁇ , Compound 30, and
  • FIG. 15 is a graph showing the influence of various C-glycoside glycolipid-LNPs on 4°C PBS storage using GFP protein as an index.
  • FIG. 16 is a graph showing the influence of cryopreservation of Compound 30-LNP using GFP protein as an indicator. In the figure, the P4 cell population indicates the part of the cell population with stronger fluorescence (only the shaded gray zone is shown).
  • FIG. 17 is a graph showing antibody titers with Moderna and Compound 33-LNP using receptor-binding domain (RBD) as an index.
  • FIG. 18 is a graph of antibody titers with Moderna and Compound 33-LNP at 1 and 3 weeks post-administration, as measured by receptor-binding domain (RBD).
  • FIG. 19 is a graph showing the antibody titer of Moderna type and Compound 33-LNP using the full-length spike protein as an index.
  • the present invention provides, in one embodiment, the formula (I) Formula (I): [wherein R1 is hydrogen, halogen, or hydroxy, R2 is a hydrogen atom, an optionally substituted hydroxy group, or a linear or branched, saturated or unsaturated, optionally substituted C11-C15 alkyl (herein, alkyl is one or more optionally interrupted by ester, amide and/or ether bonds); R3 is a hydrogen atom, a straight-chain or branched, saturated or unsaturated, optionally substituted C11-C15 alkyl (wherein, alkyl represents one or more ester bonds, amide bonds and/or ether bonds); ), amino which may be secondary amidated, or hydroxy which may be alkylated or esterified; R4 is straight-chain or branched, saturated or unsaturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally substituted by one or more ester, amide and/or
  • the present invention provides formula (I') as a preferred embodiment: [wherein R1 is hydrogen, halogen, or hydroxy, R2 is a hydrogen atom, an optionally substituted hydroxy group, or a linear or branched, saturated or unsaturated, optionally substituted C11-C15 alkyl (herein, alkyl is one or more optionally interrupted by ester, amide and/or ether bonds); R3 is a hydrogen atom, a linear or branched, saturated or unsaturated, optionally substituted C11-C15 alkyl (herein, alkyl represents one or more ester, amide and/or ether bonds); ), amino which may be secondary amidated, or hydroxy which may be alkylated or esterified; R4 is straight-chain or branched, saturated or unsaturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally substituted by one or more ester, amide and/or ether bonds; ), amino which may be secondary amidated,
  • C-glycoside glycolipid compound is a glycolipid compound in which a double-chain alkyl group and a sugar moiety are directly connected via a C-glycosyl bond.
  • glycolipid compounds that have been reported to date for use in LNP were all O-glycoside glycolipid compounds of diacylglycerol, whereas the glycolipid compound of the present invention has two-chain alkyl and single-chain alkyl. It is a glycolipid compound with an extremely simple structure in which sugars are directly linked by ⁇ - or ⁇ -C-glycosyl bonds. In the C-glycosylation reaction of the present invention, the structure of the glycoside bonding site can be changed freely. Furthermore, the structures of sugar chains and lipids can be varied in a variety of ways, making it possible to conduct structure-activity relationship studies that have not been studied at all.
  • halogen means chloro, bromo, iodo or fluoro.
  • a preferred halogen is fluoro.
  • optionally substituted hydroxy group refers to a hydroxy group itself or a hydroxy group substituted with an alkyl, ester, or carbonate.
  • C11-C15 alkyl in “optionally substituted C11-C15 alkyl” means that the molecule consists of the indicated number of carbon atoms and hydrogen atoms, may contain unsaturation, means a straight or branched hydrocarbon chain group connected to the remainder of the term by a single bond. Examples include, but are not limited to, alkyl groups such as n-undecyl, n-dodecyl, n-tridecyl, n-tetradecyl, n-pentadecyl. When an alkyl group is substituted with one or more substituents, the substituents are as defined below.
  • Optionally substituted C11-C15 alkyl contains unsaturation, it can contain one or more double bonds.
  • “Optionally substituted C11-C15 alkyl” of the present invention is optionally interrupted by one or more ester bonds, one or more amide bonds and/or one or more ether bonds, as defined. Good too.
  • an amino that may be secondary amidated refers to a secondary amide obtained by condensing a carboxylic acid with a carbon number of C11 to C15 to an amino group, or an unsubstituted amino group and an ammonium salt.
  • hydroxy that may be alkylated or esterified refers to hydroxy substituted with a C11-C15 alkyl, ester condensed with a C11-C15 carboxylic acid, or substituted hydroxy. It is not a hydroxyl.
  • sugar chains linked by glycosyl bonds refers to monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, or glucosamine linked by ⁇ - or ⁇ -O-glycosidic bonds, or monosaccharides containing the above monosaccharides as constituent components. It is a disaccharide with
  • amino acid residue moieties have a conventional amino acid configuration, and each amino acid residue moiety can independently exist in the "L” or "D” stereoisomeric form. can.
  • a substituent can be substituted at any position (including carbon atoms and heteroatoms) by halogen (fluoro, chloro, bromo); alkoxy, preferably methoxy; Alkylcarbonyl, preferably methylcarbonyl; alkoxycarbonyl, preferably methoxycarbonyl and ethoxycarbonyl; hydroxycarbonyl; optionally substituted methyl, such as trifluoromethyl; cyano; nitro, methanesulfonyl; isobutyl; tert-butyl; ethanone; acetamide Methyl (-CH 2 -NH-CO-CH 3 ); oxazolyl or isoxazolyl optionally substituted by C1-C3 alkyl (e.g.
  • dialkylamine or dialkylcarboxamide, preferably dimethylamine and diethylamine), preferably dialkylcarboxamide; It means that it may be further substituted with one or more substituents selected from those forming a 5-, 6- or 7-membered ring; isopropyl; N-propionamide, haloacetyl, cyano, formyl and ketone.
  • the above substituents are fluoro, chloro, bromo, methoxy, methylcarbonyl, methoxycarbonyl, hydroxycarbonyl, ethoxycarbonyl, optionally substituted methyl such as trifluoromethyl, cyano, nitro, methanesulfonyl, pyridine, tertbutyl, acetamidomethyl (-CH 2 -NH-CO-CH 3 ), oxazolyl or isoxazolyl optionally substituted by C1-C3 alkyl (e.g.
  • pharmaceutically acceptable salt refers to a salt that, when administered to a subject, is capable of providing (directly or indirectly) a compound described herein. Preparation of salts can be performed by methods known in the art. Preferably, the "pharmaceutically acceptable salt” is one that is physiologically tolerated and typically does not cause allergic or similar untoward reactions (e.g., upset stomach, dizziness, etc.) when administered to humans. Give the molecular part that is not.
  • salts of the compounds provided herein are synthesized by conventional chemical methods from a parent compound containing a basic or acidic moiety.
  • such salts are prepared by combining the free acid or free base form of these compounds with stoichiometric amounts of the appropriate base or acid, for example, in water or an organic solvent, or in a mixture of the two. It is prepared by reacting.
  • non-aqueous media such as ether, ethyl acetate, ethanol, isopropanol or acetonitrile are preferred.
  • acid addition salts include mineral acid addition salts (e.g.
  • hydrochlorides, hydrobromides, hydroiodides, sulfates, nitrates, phosphates), organic acid addition salts such as acetates Mention may be made of maleate, fumarate, citrate, oxalate, succinate, tartrate, malate, mandelate, methanesulfonate and p-toluenesulfonate.
  • alkali addition salts include inorganic salts (e.g. sodium, potassium, calcium, ammonium, magnesium, aluminum, lithium salts), organic alkali salts (e.g. ethylenediamine, ethanolamine, N,N-dialkyleneethanolamine, (including salts of triethanolamine, glucamine, and basic amino acids).
  • Stereoisomers are compounds that differ only in their spatial arrangement.
  • Enantiomers are sets of stereoisomers whose mirror images are not superimposable, most commonly because they contain asymmetrically substituted carbon atoms that function as asymmetric centers.
  • “Enantiomer” means one of a set of molecules that are mirror images of each other and are not superimposable.
  • Diastereomers are stereoisomers that are not related as mirror images, most commonly because they contain two or more asymmetrically substituted carbon atoms.
  • "R” and “S” represent the configuration of substituents around one or more asymmetric carbon atoms.
  • R1 is hydrogen, halogen, or hydroxy
  • R2 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally interrupted by one or more ester, amide and/or ether bonds; good)
  • R3 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally interrupted by one or more ester, amide and/or ether bonds; good)
  • R4 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally interrupted by one or more ester, amide and/or ether bonds; good)
  • R5 is a hydrogen atom or a sugar chain linked by a glycosyl bond, The wavy line indicates the stereochemistry of the bond is either S or R configuration when the bonded carbon is an asymmetric carbon atom, and the dotted line indicates the presence or absence of the bond, and the
  • R1 is hydrogen, halogen, or hydroxy
  • R2 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where the alkyl is not interrupted by any bond
  • R3 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where the alkyl is not interrupted by any bond
  • R4 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where the alkyl is not interrupted by any bond
  • R5 is a hydrogen atom or a sugar chain linked by a glycosyl bond,
  • the wavy line indicates the stereochemistry of the bond is either S or R configuration when the bonded carbon is an asymmetric carbon atom, and the dotted line indicates the presence or absence of the bond, and the dotted line indicates the presence or absence of the bond, and the dotted line indicates the presence or absence of the bond. It relates to the C-glycoside glycolipid compound of the present
  • the present invention relates to a C-glycoside glycolipid compound represented by:
  • the present invention relates to a C-glycoside glycolipid compound represented by:
  • a C-glycoside glycolipid compound in which R1 is fluoro is preferred, and more preferably a C-glycoside glycolipid compound in which R1 is fluoro and the dotted line is a double bond in the Z form.
  • the method for preparing the C-glycoside monosaccharide lipid compound of the present invention will be generally described below.
  • the C-glycoside monosaccharide lipid compounds of the present invention are produced by the synthesis of donor and acceptor compounds according to the following reaction schemes I and II, followed by photoredox coupling according to reaction scheme III, deprotection, and optional hydrogenation. It can be prepared by addition reaction.
  • R2 is a hydrogen atom, an optionally substituted hydroxy group, or a linear or branched, saturated or unsaturated, optionally substituted C11-C15 alkyl (herein, alkyl is optionally interrupted by one or more ester, amide and/or ether bonds);
  • R3 is a hydrogen atom, a linear or branched, saturated or unsaturated, optionally substituted C11-C15 alkyl (herein, alkyl represents one or more ester, amide and/or ether bonds); ), amino which may be secondary amidated, or hydroxy which may be alkylated or esterified;
  • R4 is straight-chain or branched, saturated or unsaturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally substituted by one or more ester, amide and/or ether bonds; ), amino which may be secondary amidated, or hydroxy which may be alkylated or esterified.
  • R4 is straight-chain or branched, saturated or
  • a haloalkane compound represented by general formula (Xb) can be obtained by reacting a compound represented by general formula (Xa) with tribromofluoromethane and triphenylphosphine.
  • This reaction can be carried out in a suitable solvent at a suitable temperature.
  • the solvent may be any solvent that does not adversely affect the reaction, such as tetrahydrofuran, diethyl ether, tert-butyl methyl ether, or a mixed solvent thereof.
  • the activating reagent include diethylzinc. This reaction proceeds preferably at 25°C, especially at 10-40°C.
  • a halo compound represented by general formula (Yb) By subjecting the compound represented by general formula (Ya) to an elimination reaction, a halo compound represented by general formula (Yb) can be obtained.
  • This reaction can be carried out in a suitable solvent at a suitable temperature.
  • the solvent may be any solvent that does not adversely affect the reaction, such as dichloromethane, acetic acid, or a mixed solvent thereof.
  • the activating reagent include hydrogen bromide and iodine bromide. This reaction proceeds suitably at 25°C, especially at 25-60°C.
  • Photoredox coupling As a photoredox coupling reaction, a substrate and a reagent are combined in the coexistence of an organic photocatalyst or transition metal photocatalyst that catalytically causes both oxidation and reduction reactions through photoexcitation, and a transition metal catalyst that causes carbon-carbon bond formation. A chemical reaction is carried out by irradiating the mixed solution with a blue LED.
  • Organic photocatalysts or transition metal photocatalysts include 1,2,3,5-tetracarbazole-4,6-dicyanobenzene (4-CzIPN), [4,4'-bis(1,1-dimethyl)-2,2 '-Bipyridine-N1,N1']bis[3,5-difluoro-2-[5-(trifluoromethyl)-2-pyridinyl-N]phenyl-C]iridium(III) hexafluorophosphate, etc. can be used. .
  • Transition metal catalysts that cause carbon-carbon bond formation include nickel(II) chloride dimethoxyethane complex, nickel(II) bromide dimethoxyethane complex, and bis(2,2,6,6-tetramethyl-3,5-hebutanedione). (acid) nickel(II) etc. can be used.
  • a chemical reaction performed by irradiating a blue LED is, for example, a reaction solution prepared in a Pyrex (registered trademark) glass vial, which is air-cooled by applying a fan with a diameter of about 15 cm from the top. This can be done by irradiating.
  • Deprotection As a deprotection reaction, protective groups installed to render functional groups such as alcohols, amines, and carboxylic acids contained in sugar chains and lipids inactive are removed. For example, esters or carbonates can be removed with sodium methoxide, lithium hydroxide, sodium hydroxide, or sodium carbonate, and silyls can be removed with pyridine hydrogen fluoride or tetrabutylammonium fluoride.
  • Hydrogenation of double bonds in reaction substrates and hydrogenation of fluorine atoms is performed using a heterogeneous transition metal catalyst such as palladium, platinum, or rhodium and hydrogen gas.
  • a heterogeneous transition metal catalyst such as palladium, platinum, or rhodium and hydrogen gas.
  • the present invention provides formula (II) as another embodiment: [wherein R1 is hydrogen, halogen, or hydroxy, R2 is a hydrogen atom, an optionally substituted hydroxy group, or a linear or branched, saturated or unsaturated, optionally substituted C11-C15 alkyl (herein, alkyl is one or more optionally interrupted by ester, amide and/or ether bonds); R3 is a hydrogen atom, a linear or branched, saturated or unsaturated, optionally substituted C11-C15 alkyl (herein, alkyl represents one or more ester, amide and/or ether bonds); ), amino which may be secondary amidated, or hydroxy which may be alkylated or esterified; R4 is straight-chain or branched, saturated or unsaturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally substituted by one or more ester, amide and/or ether bonds; ), amino which may be secondary amidated,
  • the present invention provides formula (II') as a preferred embodiment: [wherein R1 is hydrogen, halogen, or hydroxy, R2 is a hydrogen atom, an optionally substituted hydroxy group, or a linear or branched, saturated or unsaturated, optionally substituted C11-C15 alkyl (herein, alkyl is one or more optionally interrupted by ester, amide and/or ether bonds); R3 is a hydrogen atom, a linear or branched, saturated or unsaturated, optionally substituted C11-C15 alkyl (herein, alkyl represents one or more ester, amide and/or ether bonds); ), amino which may be secondary amidated, or hydroxy which may be alkylated or esterified; R4 is straight-chain or branched, saturated or unsaturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally substituted by one or more ester, amide and/or ether bonds; ), amino which may be secondary amidated
  • R1 is hydrogen, halogen, or hydroxy
  • R2 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally interrupted by one or more ester, amide and/or ether bonds; good
  • R3 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally interrupted by one or more ester, amide and/or ether bonds; good)
  • R4 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally interrupted by one or more ester, amide and/or ether bonds; good)
  • R5 is a hydrogen atom or a sugar chain linked by a glycosyl bond
  • R1 is hydrogen, halogen, or hydroxy
  • R2 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where the alkyl is not interrupted by any bond
  • R3 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where the alkyl is not interrupted by any bond
  • R4 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where the alkyl is not interrupted by any bond
  • R5 is a hydrogen atom or a sugar chain linked by a glycosyl bond
  • the wavy line indicates the stereochemistry of the bond is either S or R configuration when the bonded carbon is an asymmetric carbon atom
  • the dotted line indicates the presence or absence of the bond
  • the dotted line indicates the presence or absence of the bond
  • the dotted line indicates the presence or absence of the bond. It relates to the C-glycoside glycolipid compound of the
  • the present invention provides formula (II'') as a preferred embodiment: [Wherein, R1 is hydrogen, halogen, or hydroxy group, Each wavy line independently indicates that when the bonded carbon is an asymmetric carbon atom, the stereochemistry of the bond is either the S or R configuration, and the dotted line indicates the presence or absence of the bond. If a double bond is present and a bond is present, it refers to either a single Z-form or an E-form. ] 14.
  • the present invention encompasses C-glycoside disaccharide lipid compounds.
  • the C-glycoside disaccharide lipid compound of the present invention can be prepared according to the method for preparing the C-glycoside monoglycolipid compound described above.
  • the present invention provides the C-glycoside glycolipid compound of the present invention, as well as (a) a nucleic acid molecule, (b) a cationic lipid, and (c) an aggregation inhibitor (polyethylene glycol (PEG) lipid or PEG). modified lipids, etc.); and (d) sterols.
  • nucleic acid molecule is a molecule containing, preferably consisting of, a nucleic acid component.
  • Nucleic acid molecules preferably refer to DNA or RNA molecules.
  • the term is preferably used as a synonym for the term "polynucleotide".
  • the nucleic acid molecule is a polymer comprising or consisting of nucleotide monomers covalently linked to each other by phosphodiester bonds of a sugar/phosphate backbone.
  • nucleic acid molecule also encompasses modified nucleic acid molecules such as DNA or RNA molecules, such as base modifications, sugar modifications or backbone modifications.
  • RNA refers to naturally occurring or non-naturally occurring ribonucleic acid.
  • RNA may include modified and/or non-naturally occurring components such as one or more nucleobases, nucleosides, nucleotides, or linkers.
  • the RNA may include a cap structure, a chain-terminating nucleoside, a stem-loop, a polyA sequence, and/or a polyadenylation signal.
  • RNA can have a nucleotide sequence that encodes a polypeptide of interest.
  • the RNA can be messenger RNA (mRNA).
  • RNA includes, but is not limited to, small interfering RNA (siRNA), asymmetric interfering RNA (asRNA), microRNA (miRNA), Dicer substrate RNA (dsRNA), small hairpin RNA (shRNA), mRNA, and mixtures thereof. can be selected from the group.
  • siRNA small interfering RNA
  • asRNA asymmetric interfering RNA
  • miRNA microRNA
  • dsRNA Dicer substrate RNA
  • shRNA small hairpin RNA
  • mRNA small hairpin RNA
  • Cationic Lipids LNPs may include any cationic lipid suitable for forming lipid nanoparticles.
  • the cationic lipid has a net positive charge around physiological pH.
  • the cationic lipid may be an amino lipid.
  • aminolipid refers to one or two fatty acids or fatty alkyl chains and an amino head group (alkylamino or dialkyl) that can be protonated to form a cationic lipid at physiological pH. (including amino groups).
  • Cationic lipids include, for example, N,N-dioleyl-N,N-dimethylammonium chloride (DODAC), N,N-distearyl-N,N-dimethylammonium bromide (DDAB), 1,2-dioleoyl Trimethylammoniumpropane chloride (DOTAP) (N-(2,3-dioleoyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride and 1,2-dioleyloxy-3-trimethylaminopropane chloride ), N-(1-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA), N,N-dimethyl-2,3-dioleyl oxy)propylamine (DODMA), 1,2-dilinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane (DLinDMA), 1,2-dilinoleyloxy-N,N-d
  • Suitable cationic lipids include International Publication No. WO09/086558, WO09/127060, WO10/048536, WO10/054406, WO10/088537, WO10/129709, and WO2011/153493; US Patent Publication No. 2011/0256175, 2012 US Pat. No. 8,158,601; and Love et al, PNAS, 107(5), 1864-69, 2010.
  • aminolipids having other fatty acid groups and other dialkylamino groups include those having different alkyl substituents (eg, N-ethyl-N-methylamino- and N-propyl-N-ethylamino-).
  • aminolipids with fewer saturated acyl chains are more easily sized, especially when complex sizes need to be less than about 0.3 microns for filter sterilization purposes. can.
  • Aminolipids containing unsaturated fatty acids with carbon chain lengths ranging from C14 to C22 may also be used.
  • Other scaffolds may be used to separate the amino group and the fatty acid or fatty alkyl moiety in aminolipids.
  • the LNP comprises a cationic lipid of formula (III) as described in patent application PCT/EP2017/064066.
  • PCT/EP2017/064066 the disclosure of PCT/EP2017/064066 is also incorporated herein by reference.
  • LNPs may contain two or more cationic lipids.
  • Cationic lipids can be selected to contribute different useful properties.
  • cationic lipids with different properties such as amine pKa, chemical stability, half-life in circulation, half-life in tissues, net accumulation in tissues, or toxicity can be used in LNPs.
  • cationic lipids can be selected such that the properties of the mixed LNP are more desirable than the properties of a single LNP of the individual lipids.
  • the aggregation inhibitor may be a lipid capable of inhibiting aggregation.
  • lipids include, but are not limited to, polyethylene glycol (PEG) modified lipids, monosialoganglioside Gml, and polyamide oligomers (PAO) as described in U.S. Pat. No. 6,320,017. . US Pat. No. 6,320,017 is incorporated herein by reference in its entirety.
  • Aggregation inhibitors include, for example, PEG-diacylglycerol (DAG), PEG-dialkylglycerol, PEG-dialkyloxypropyl (DAA), PEG-phospholipid, PEG-ceramide (Cer), or mixtures thereof (PEG-Cerl4). or PEG-Cer20, etc.).
  • PEG-DAA conjugates include, for example, PEG-dilauryloxypropyl (C12), PEG-dimyristyloxypropyl (C14), PEG-dipalmityloxypropyl (C16), or PEG-distearyloxypropyl (C18). ) is included.
  • pegylated lipids include polyethylene glycol-didimyristoylglycerol (C14-PEG or PEG-C14 (PEG has an average molecular weight of 2000 Da) (PEG-DMG); (R)-2,3-bis( PEG-carbamoyl-1,2-dimyristyloxypropylamine (PEG has an average molecular weight of 2000 Da) (PEG- cDMA); N-acetylgalactosamine-((R)-2,3-bis(octadecyloxy)propyl-1-(methoxypoly(ethylene glycol) 2000) propyl carbamate)) (GalNAc-PEG-DSG); mPEG (mw2000) -diastearoylphosphatidyl-ethanolamine (PEG-DSPE); and polyethylene glycol-dipalmitoylglycerol (PEG-DPG).
  • C14-PEG or PEG-C14 PEG has
  • the aggregation inhibitor is PEG-DMG. In other embodiments, the aggregation inhibitor is PEG-c-DMA.
  • the LNP comprises a PEG lipid substitute, is PEG-free, and/or comprises a phosphatidylcholine (PC) substituted lipid (eg, oleic acid or an analog thereof).
  • PC phosphatidylcholine
  • the LNP comprises an aggregation inhibitor having formula (IV) as described in patent application PCT/EP2017/064066.
  • Sterol may preferably be cholesterol. Sterols may be present in a proportion of about 10 mol% to about 60 mol% or about 25 mol% to about 40 mol% of the LNP. In some embodiments, the sterol is present in a proportion of about 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, or about 60 mol% of the total lipids present in the LNP.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising the lipid nanoparticles of the present invention.
  • Lipid nanoparticles can be formulated in whole or in part as a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition may include one or more lipid nanoparticles.
  • a pharmaceutical composition can include one or more lipid nanoparticles containing one or more different therapeutic and/or prophylactic agents.
  • the pharmaceutical composition may further include one or more pharmaceutically acceptable excipients or auxiliary ingredients such as those described herein.
  • Conventional excipients and auxiliary ingredients can be used in any pharmaceutical composition, except insofar as any conventional excipients or auxiliary ingredients are incompatible with one or more components of the nanoparticle composition.
  • Excipients or auxiliary ingredients may be incompatible with the components of the lipid nanoparticles if their combination with the components of the lipid nanoparticles may result in some undesirable biological effect or other form of deleterious effect. .
  • one or more excipients or auxiliary ingredients may constitute more than 50% of the total weight or volume of the pharmaceutical composition comprising lipid nanoparticles.
  • one or more excipients or auxiliary ingredients may constitute 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or more of the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutically acceptable excipient is at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% pure.
  • the excipient is approved for human use and veterinary use.
  • lipid nanoparticles may vary depending on the attributes of the target being treated, the size, and/or depending on the condition and also on the route by which the composition is administered.
  • a pharmaceutical composition can include 0.1% to 100% (wt/wt) of one or more lipid nanoparticles.
  • Lipid nanoparticles and/or pharmaceutical compositions comprising one or more lipid nanoparticles can be used to target therapeutic agents and/or to one or more specific cells, tissues, organs, or systems or groups thereof (such as the renal system). It can be administered to any patient or subject, including those who could benefit from the therapeutic effects provided by the delivery of prophylactic agents.
  • lipid nanoparticles and pharmaceutical compositions including lipid nanoparticles, primarily relates to compositions suitable for administration to humans, such compositions generally can be used in any other mammalian population. It will be understood by those skilled in the art that it is suitable for administration to animals.
  • compositions suitable for administration to humans to make them suitable for administration to a variety of animals are well understood and the ordinary veterinary pharmacologist will be able to Experimentation can be used to design and/or implement such modifications.
  • Subjects to which the compositions are contemplated for administration include, but are not limited to, humans, other primates, and commercially valuable animals such as bovines, porcines, horses, sheep, cats, dogs, mice, and/or rats. Other mammals include certain mammals.
  • compositions containing one or more lipid nanoparticles may be prepared by any method known or hereafter developed in the pharmacological art. In general, such methods of preparation include the step of bringing into association the active ingredient with excipients and/or one or more other auxiliary ingredients and then, if desired or necessary, converting the product into the desired dividing, forming and/or packaging into single or multiple dosage units.
  • compositions according to the present disclosure can be prepared, packaged, and/or sold in bulk as a single unit dose and/or as multiple single unit doses.
  • a "unit dose” is a discrete amount of a pharmaceutical composition containing a predetermined amount of active ingredient (eg, lipid nanoparticles).
  • the amount of active ingredient will generally vary from the dosage of active ingredient that may be administered to a subject, and/or a convenient proportion of such dosage, such as one-half or one-third of such dosage. equal.
  • compositions may be prepared in a variety of forms suitable for various routes and methods of administration.
  • pharmaceutical compositions can be used in liquid dosage forms (e.g., emulsions, microemulsions, nanoemulsions, solutions, suspensions, syrups, and elixirs), injectable forms, solid dosage forms (e.g., capsules, tablets, pills). , powders, and granules), dosage forms for topical and/or transdermal administration (e.g. ointments, pastes, creams, lotions, gels, powders, solutions, sprays, inhalants, and patches), suspensions , powders, and other forms.
  • liquid dosage forms e.g., emulsions, microemulsions, nanoemulsions, solutions, suspensions, syrups, and elixirs
  • injectable forms e.g., solid dosage forms (e.g., capsules, tablets, pills).
  • powders, and granules) dosage forms for topical and
  • Liquid dosage forms for oral and parenteral administration include, but are not limited to, pharmaceutically acceptable emulsions, microemulsions, nanoemulsions, solutions, suspensions, syrups, and/or elixirs.
  • liquid dosage forms contain inert diluents commonly used in the art, such as water or other solvents, solubilizers and emulsifiers, such as ethyl alcohol, isopropyl alcohol, ethyl carbonate.
  • the oral compositions can contain further agents such as further therapeutic and/or prophylactic agents, wetting agents, emulsifying and suspending agents, sweetening, flavoring, and/or perfuming agents. .
  • the compositions include Cremophor®, alcohols, oils, denatured oils, glycols, polysorbates, cyclodextrins, polymers, and/or combinations thereof. Mixed with solubilizer.
  • Injectable preparations for example, sterile injectable aqueous or oleaginous suspensions, may be formulated according to known techniques using suitable dispersing agents, wetting agents, and/or suspending agents.
  • the sterile injectable preparation may be a sterile injectable solution, suspension, and/or suspension in a nontoxic parenterally acceptable diluent and/or solvent, for example, as a solution in 1,3-butanediol. It can be an emulsion.
  • the acceptable vehicles and solvents that may be employed are water, Ringer's solution, and isotonic sodium chloride solution.
  • Sterile, fixed oils are commonly employed as a solvent or suspending medium.
  • any bland fixed oil may be employed including synthetic mono- or diglycerides.
  • Fatty acids such as oleic acid can be used in the preparation of injectables.
  • Injectable formulations can be prepared, for example, by filtration through a bacteria-retaining filter and/or by incorporating a sterilizing agent in the form of a sterile solid composition that can be dissolved or dispersed in sterile water or other sterile injectable medium before use. Can be sterilized.
  • the pharmaceutical composition of the invention is useful for infectious diseases or neoplasms, such as cancer or tumor diseases, diseases of the blood and blood-forming organs, endocrine, nutritional and metabolic diseases, diseases of the nervous system, diseases of the circulatory system, respiratory Inherited or acquired diseases (inherited or It can be used to treat conditions (whether congenital or not).
  • infectious diseases or neoplasms such as cancer or tumor diseases, diseases of the blood and blood-forming organs, endocrine, nutritional and metabolic diseases, diseases of the nervous system, diseases of the circulatory system, respiratory Inherited or acquired diseases (inherited or It can be used to treat conditions (whether congenital or not).
  • a therapeutic (poly)peptide or protein encoded by a nucleic acid molecule includes any (poly)peptide or protein whose expression can prevent, ameliorate or cure a genetic or acquired disease. is included.
  • Such (poly)peptides or proteins may in principle exert their therapeutic function by exerting any suitable biological effect or function.
  • such (poly)peptides or proteins do not act, preferably by replacing missing, defective or mutated proteins, and/or by inducing an immune or allergic response. good.
  • (poly)peptides or proteins that are advantageous in treating inherited or acquired diseases such as infectious diseases or neoplasms are particularly advantageous in the treatment of acquired or inherited metabolic or endocrine disorders selected from: particularly preferred therapeutic proteins.
  • therapeutic (poly)peptides or proteins encoded by nucleic acid molecules include, for example, when the therapeutic target is a viral disease, peptides or proteins characteristic of viruses that cause infectious diseases, such as SARS-CoV-2 virus, influenza virus, and dengue virus. Mention may be made of proteins or peptides.
  • the term “treat”, unless otherwise specified, includes reversing, alleviating the disorder or condition to which such term applies, or one or more symptoms of such disorder or condition. , means to inhibit or prevent its progress.
  • the term “treatment” refers to the administration of a compound or composition of the invention to reduce or eliminate the symptoms of a viral infection and/or reduce the viral load in an individual. Treatment may be administered before the onset of the disease or condition as a prophylactic measure, or alternatively, treatment may be administered after the onset of the disease.
  • Preventing means any treatment of a disease or condition that prevents clinical symptoms of the disease or condition from occurring.
  • the term “prophylaxis” also includes the administration of a therapeutically effective amount prior to an individual's exposure to the virus to prevent the appearance of symptoms of the disease and/or to prevent the virus from reaching detectable levels in the blood. administration of compounds or compositions according to the invention (eg, pre-exposure prophylaxis).
  • the pharmaceutical composition usually means a drug for treating or preventing a disease, or for testing or diagnosing a disease.
  • a preferred embodiment is a vaccine.
  • Vaccines are associated with infectious diseases such as coronaviruses such as SARS, SARS-CoV-2, and MARS, influenza virus, measles virus, human papillomavirus (HPV), rabies, meningitis, pertussis, tetanus, hepatitis, and tuberculosis. It includes compounds and preparations capable of conferring immunity against one or more disease states and may include mRNA encoding antigens and/or epitopes derived from infectious diseases. Vaccines may also include compounds and preparations that direct an immune response against cancer cells and may include mRNA encoding antigens, epitopes, and/or neoepitopes derived from tumor cells.
  • the invention provides for the prevention of infections such as coronaviruses such as SARS, SARS-CoV-2, MARS, influenza virus, measles virus, human papillomavirus (HPV), rabies, meningitis, pertussis, tetanus, hepatitis and tuberculosis.
  • infections such as coronaviruses such as SARS, SARS-CoV-2, MARS, influenza virus, measles virus, human papillomavirus (HPV), rabies, meningitis, pertussis, tetanus, hepatitis and tuberculosis.
  • a method for treating or preventing various types of cancer including administering the lipid nanoparticles of the present invention, a pharmaceutical composition containing the same, and/or a vaccine to a subject in need of such treatment, etc.
  • the present invention further relates to coronaviruses such as SARS, SARS-CoV-2, MARS, influenza virus, measles virus, human papillomavirus (HPV), rabies, meningitis, pertussis, tetanus, hepatitis and tuberculosis.
  • coronaviruses such as SARS, SARS-CoV-2, MARS, influenza virus, measles virus, human papillomavirus (HPV), rabies, meningitis, pertussis, tetanus, hepatitis and tuberculosis.
  • the present invention relates to lipid nanoparticles, pharmaceutical compositions and/or vaccines containing the same, for treating or preventing infectious diseases or various cancers.
  • the present invention provides for the treatment of coronaviruses such as SARS, SARS-CoV-2, MARS, influenza virus, measles virus, human papillomavirus (HPV), rabies, meningitis, pertussis, tetanus, hepatitis and tuberculosis.
  • coronaviruses such as SARS, SARS-CoV-2, MARS, influenza virus, measles virus, human papillomavirus (HPV), rabies, meningitis, pertussis, tetanus, hepatitis and tuberculosis.
  • the present invention relates to the use of the lipid nanoparticles of the present invention, pharmaceutical compositions containing the same, and/or vaccines for producing medicaments for treating or preventing infectious diseases or various cancers.
  • Example 1 Compound 14-Z ⁇
  • Example 2 Compound 14E- ⁇
  • Example 3 Compound 14-E ⁇
  • Example 4-1 Compound 14-Z ⁇
  • acetic anhydride (5.4 mL) was added dropwise to a solution of Compound 3 (1.70 g, 5.70 mmol) in pyridine (30 mL) under ice cooling. After stirring at room temperature for 30 minutes, the reaction solution was diluted with ethyl acetate, and then poured into an ice-cooled saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution. It was extracted with ethyl acetate, washed with saturated brine, and dried over anhydrous sodium sulfate. The desiccant was filtered off, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • a 1,2-dichloroethane solution (56 mL) of compound 4 (2.67 g, 6.98 mmol) was prepared in a two-necked flask equipped with a stirrer bar, septum, and reflux tube under a nitrogen atmosphere.
  • Activated MS3A (2.67 g) and HBr in dichloromethane (1 M, 17.5 mL, 17.5 mmol) were added at room temperature, and the reaction solution was heated in a 90 °C oil bath. After heating under reflux for 19 hours, the reaction solution was cooled to room temperature and filtered through Celite, and the Celite was washed with dichloromethane.
  • acetic anhydride (5.4 mL) was added dropwise to a pyridine solution (30 mL) of compound 8 (1.70 g, 5.70 mmol) under ice cooling. After stirring at room temperature for 30 minutes, the reaction solution was diluted with ethyl acetate, and then poured into an ice-cooled saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution. It was extracted with ethyl acetate, washed with saturated brine, and dried over anhydrous sodium sulfate. The drying agent was filtered off, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • a 1,2-dichloroethane solution (100 mL) of compound 9 (2.92 g, 7.64 mmol) was prepared in a two-necked flask equipped with a stirrer bar, septum, and reflux tube under a nitrogen atmosphere.
  • Activated MS3A (3.0 g) and HBr in dichloromethane solution (1 M, 38.2 mL, 38.2 mmol) were added at room temperature, and the reaction solution was heated in an oil bath at 85 °C. After heating under reflux for 4 hours, the reaction solution was cooled to room temperature and filtered through Celite, and the Celite was washed with dichloromethane.
  • the aqueous layer of the filtrate was extracted with hexane and then dried over anhydrous sodium sulfate.
  • the desiccant was filtered off, the solvent was distilled off under reduced pressure, and the resulting residue was transferred to a 100 mL flask, the solvent was distilled off, and the residue was dried using a vacuum pump for 1 hour.
  • a 100 mL flask was equipped with a stirrer bar and a septum, and under a nitrogen atmosphere, THF (24 mL), tribromofluoromethane (1.2 mL, 4.6 mmol), and triphenylphosphine (1.22 g, 4.65 mmol) were added.
  • Nickel(II) chloride dimethoxyethane complex (4.1 mg, 19 ⁇ mol) and 2,10-di-tert-butylbipyridyl (dtbpy, 5.5 mg, 20 ⁇ mol) were added to a 3 mL screw-cap vial equipped with a stirrer bar under a nitrogen atmosphere. ) MeCN solution (2 mL) was prepared, sealed, and sonicated for 5 min.
  • compound 23 (9.9 mg, 90%) was obtained by reacting compound 21 (13.6 mg, 15.2 ⁇ mol) with sodium methoxide.
  • a mixed solvent solution of compound 24 (13.3 mg, 21.0 ⁇ mol) prepared in Example 16 in trifluoroacetic acid (150 ⁇ L) and distilled water (50 ⁇ L) was prepared in a 4 mL screw cap vial equipped with a stirrer bar. . After stirring at room temperature for 3 hours, TFA and water were distilled off under a nitrogen stream, and the residue was dissolved in methanol (100 ⁇ L). Methanol was distilled off under a nitrogen stream, the residue was dissolved in THF (300 ⁇ L), and myristic acid-N-hydroxysuccinimide ester (10.2 mg, 31.5 ⁇ mol) and saturated aqueous sodium bicarbonate (100 ⁇ L) were added.
  • Example 19 A THF (1.3 mL) solution of compound 21 (47.7 mg, 77.6 ⁇ mol) was prepared in a 30 mL flask equipped with a stirrer bar under an argon atmosphere, and triethylamine (260 ⁇ L), trityl chloride (65 mg, 230 ⁇ mol) and Dimethylaminopyridine (4.7 mg, 38 ⁇ mol) was added at room temperature.
  • the reaction vessel was heated to 60° C. in an oil bath and stirred for 24 hours, then cooled to room temperature, and saturated aqueous sodium bicarbonate (10 mL) was added. Extracted with dichloromethane and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • the drying agent was filtered off, the solvent was distilled off under reduced pressure and the mixture was dried under high vacuum.
  • a solution of the residue in pyridine (1.2 mL) was prepared in a 30 mL flask equipped with a stirrer bar under an argon atmosphere, and acetic anhydride (160 ⁇ L) was added at 0 °C. After stirring at room temperature for 14 hours, saturated aqueous sodium bicarbonate (10 mL) was added. Extracted with dichloromethane and dried over anhydrous sodium sulfate. The drying agent was filtered off, the solvent was distilled off under reduced pressure and the mixture was dried under high vacuum.
  • compound 28 was prepared by the method described in J. Med. Chem. 2005, 48, 645-652. Next, in a 10 mL flask equipped with a stirrer bar, under an argon atmosphere, compound 27 (15.0 mg, 20.2 ⁇ mol), compound 28 (12.0 mg, 24.3 ⁇ mol), and molecular sieve 4A (25 mg) were suspended in dichloromethane (670 ⁇ L). A suspension was prepared, and after cooling to -20°C, a 35 ⁇ M dichloromethane solution (170 ⁇ L, 6 ⁇ mol) of trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate was added at -20°C.
  • compound 31 was prepared by the method described in J. Med. Chem. 2005, 48, 645-652. Next, in a 10 mL flask equipped with a stirrer bar, under an argon atmosphere, compound 27 (13.8 mg, 18.6 ⁇ mol) prepared in Example 19, compound 31 (13.8 mg, 27.9 ⁇ mol), and molecular sieve 4A (27 mg) were added. A dichloromethane (600 ⁇ L) suspension was prepared, and after cooling to -20°C, a 35 ⁇ M dichloromethane solution (150 ⁇ L, 5.2 ⁇ mol) of trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate was added at -20°C.
  • LNP manufactured by Moderna is produced using a mixture of SM102 (50 mol%), GM-020 (1.5 mol%), cholesterol (38.5 mol%), and DSPC (10 mol%) and mRNA (0.695 ⁇ g). It was made using the device NanoSpark. Hereinafter, it will be referred to as Moderna-type LNP.
  • various C-glycoside glycolipids-LNPs are a mixture of SM102 (50 mol%), GM-020 (1.5 mol%), cholesterol (38.5 mol%), and various C-glycoside glycolipids (10 mol%). and mRNA (0.695 ⁇ g) using the LNP production device NanoSpark.
  • C-glycoside glycolipid-LNP means LNP containing the C-glycoside glycolipid compound of the present invention as a constituent component.
  • the sources of each lipid are as follows: ⁇ SM102: Medchemexpress (MCE), product number: HY-134541 ⁇ GM-020:SUNBRIGHT GM-020 (DMG-PEG2000) ⁇ Cholesterol: Nippon Fine Chemical ⁇ DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine): Sigma (Avanti) ⁇ RNA (GFP): Fuji Film (TriLink Bio Technologies, Inc.) ⁇ mRNA (luciferase): Fujifilm (TriLink Bio Technologies, Inc.)
  • ⁇ Cultured cells Cultured cells (mouse macrophage-like cells Raw264.7 (American Type Culture Collection)) were supplemented with 5% fetal bovine serum (FBS; Moregate Biotech, Bulimba, Australia) and 0.5% penicillin/streptomycin (Invitrogen, Grandisland, NY). The cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Sigma aldrich, St. Louis, MO) at 37°C under 5% CO 2 /95% atmospheric conditions.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • RNA extraction was performed using RNAiso (Takara Bio Co., Ltd., Shiga, Japan), and reverse transcription from total RNA to cDNA was performed using ReverTra Ace qPCR RT kit (Toyobo, Osaka, Japan).
  • Quantitative real-time PCR reactions were analyzed by the standard curve method using THUNDERBIRDTM SYBR qPCR Mix (Toyobo) and 7500 Real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA). 18S was used as the internal standard. Table 1 shows the primer sequences used to measure each target gene.
  • Mgl1,2 gene knockdown For knockdown of the Mgl1 gene, 10 ⁇ g of Invitrogen miRNA expression vector pcDNA6.2 containing the sequences shown in Table 2 below was added to the cells and introduced into the cells by electroporation using a gene transfer device NEPA21. After 24 hours, cells were exposed to G418 at 4000 ng/ml, and the DMEM medium was replaced at 72 hours to produce cells in which Mgl1 was stably knocked down. The expression level of MGL1 protein was confirmed by Western blotting using MGL1 antibody (R&D: AF4938).
  • Invitrogen siRNA was used to knock down the Mgl2 gene. 28.5 pmol of Mgl2 siRNA and control siRNA (Silencer TM Select Negative Control) were added to Raw264.7 cells (1 ⁇ 10 6 cells/100 ⁇ l) and introduced into the cells by electroporation using a gene transfer device NEPA21. The knockdown effect of Mgl2 was confirmed by measuring the Mgl2 mRNA expression level after collecting cells at 48 hours. The siRNA sequences for each target gene are shown in Table 2.
  • lectin protein-biotin compounds Con A, DBA, PNA, SBA, UEA-1, WGA (Vector Laboratories) were adjusted to 1 mg/ml in PBS and reacted with 20 ⁇ l of LNP at 4°C for 16 hours. Immunoprecipitation was performed using avidin magnetic beads (50 ⁇ l).
  • mRNA was recovered from the LNPs bound to avidin magnetic beads using ReliaPrep TM RNA Miniprep Systems (promega), and the mRNA was converted to cDNA using the ReverTra Ace® qPCR RT Kit (TOYOBO), followed by THUNDERBIRD (Registered Trademark) qPCR Mix and the following primers were used to detect the amount of luciferase mRNA by real-time PCR.
  • ⁇ Effects of storage at -80°C> Various LNPs were suspended in PBS or 20% sucrose PBS solution and stored at -80°C or 4°C. After freezing and thawing, the intracellular uptake activity of mRNA by LNPs was measured using GFPmRNA (TriLink CleanCap (registered trademark)). The fluorescence intensity of the GFP protein produced by mRNA was measured and verified using a flow cytometer CytoFLEX (BECKMANN).
  • Test example 1 Functional evaluation of LNP intracellular delivery of mRNA using luciferase activity as an indicator was performed.
  • Moderna LNP as a basic model LNP
  • the results obtained are shown in Figure 1A.
  • Figure 1A shows that mRNA intracellular delivery increases in a cell number-dependent manner, with 20,000 cells (50 ⁇ l) having the highest mRNA uptake.
  • Test example 2 Functional evaluation of mRNA intracellular delivery of various C-glycoside glycolipids-LNPs using luciferase activity as an index
  • Functional evaluation of mRNA intracellular delivery of various C-glycoside glycolipids-LNPs using luciferase activity as an index was performed. Using Moderna LNP as a basic model LNP, the amount of mRNA uptake of various LNPs was measured using luciferase activity as an index. Raw264.7 cells were seeded in a 96-well plate at various cell numbers (50 ⁇ l), 10 ⁇ l of each type of LNP was added, and luciferase activity was measured 16 hours later. The results obtained are shown in FIG. 2.
  • Figure 2 shows a comparison with Moderna-type LNPs when C-glycoside glycolipid-LNPs (compound 14-Z ⁇ , compound 14-Z ⁇ , compound 17-E ⁇ , compound 17-E ⁇ , compound 17-Z ⁇ , compound 17-Z ⁇ ) were added. It shows that the luciferase activity of the cells was significantly increased. Based on the above study results, C-glycoside glycolipid-LNPs (compound 14-Z ⁇ , compound 14-Z ⁇ , compound 17-E ⁇ , compound 17-E ⁇ , compound 17-Z ⁇ , compound 17-Z ⁇ ) were compared with Moderna-type LNPs. However, it was revealed that the amount of mRNA uptake into cells or translation ability increased.
  • Test example 3 Effects of various C-glycoside glycolipid-LNPs on living cells using ATP activity as an indicator.
  • the effects of various LNPs on living cells were evaluated using ATP activity as an indicator.
  • Moderna LNP as a basic model LNP, the effects of various C-glycoside glycolipid-LNPs were evaluated.
  • Raw264.7 cells were seeded in a 96-well plate at various cell numbers (50 ⁇ l), 10 ⁇ l of each type of LNP was added, and ATP activity was measured 24 hours later.
  • the results obtained are shown in FIG. Figure 3 shows that no significant differences were observed for all C-glycoside glycolipid-LNPs compared to Moderna-type LNPs.
  • the above study results revealed that, similar to Moderna-type LNPs, various C-glycoside glycolipid-LNPs have no effect on the number of viable cells.
  • Test example 4 Evaluation of the stability of various C-glycoside glycolipids-LNPs at room temperature Various C-glycoside glycolipids-LNPs were left at room temperature, and the stability of the LNPs was evaluated. Luc (luciferase mRNA) and GFP (green fluorescent protein mRNA) were simultaneously electrophoresed as degradation products. 5 ⁇ l of each C-glycoside glycolipid-LNP was injected into 2% agarose and electrophoresed. The obtained results are shown in FIG. Figure 4 shows that two RNAs, which are degradation products of LNP, are not observed for up to 7 days. The above results revealed that, like the Moderna type, various C-glycoside glycolipid-LNPs are stable at room temperature for 7 days.
  • Test example 5 Effects of various C-glycoside glycolipid-LNPs on the expression of genes related to adjuvant activity
  • the effects of various LNPs on the expression of genes related to adjuvant activity, which are important for antibody production, after LNP vaccine administration were evaluated.
  • the effects of various LNPs were measured using Moderna LNP as the basic model LNP.
  • Raw264.7 cells were seeded in a 96-well plate at various cell numbers (50 ⁇ l), 10 ⁇ l of various C-glycoside glycolipids-LNPs were added, and the cells were collected after 16 hours. After extracting RNA, various genes were extracted by real-time PCR. The expression level was measured.
  • Figure 5B shows that Ccl22 expression was significantly reduced in cells supplemented with C-glycoside glycolipid-LNP (compound 15 ⁇ , compound 18 ⁇ , compound 17-E ⁇ ) compared to Moderna-type LNP, and C-glycoside glycolipid-LNP ( Compound 21, Compound 17-Z ⁇ , Compound 17-Z ⁇ ) showed a significant increase in the cells.
  • Test example 6 Effect of galactose-type C-type lectin 2 (macrophage galactose-type lectin 2: MGL2/CD301b) on the intracellular uptake of various C-glycoside glycolipids-LNPs Compound 15 ⁇ and compound 14-Z ⁇ Excellent for mRNA delivery to Generally, APO protein binds to cholesterol, a component of LNP, and is taken into cells via the LDL receptor. This time, various C-glycoside glycolipids-LNPs were prepared by adding C-glycoside glycolipids instead of DSPC.
  • FIG. 6A is a graph showing the results of knockdown of the Mgl2 gene by transfecting cells with Mgl2 siRNA listed in Table 2.
  • Figure 6B shows that in Mgl2 knockdown cells, there was no significant difference in the uptake of Moderna LNPs, but the intracellular uptake of compound 15 ⁇ and compound 14-Z ⁇ was significantly reduced. ing.
  • Test example 7 Functional analysis of LNP using animals Previous studies have revealed that C-glycoside glycolipid-LNP can deliver genes to cultured cells more efficiently than Moderna-type LNP. Therefore, the compound 14-Z ⁇ -LNP was administered to animals and the gene expression level was measured.
  • FIG. Figure 7 shows that, compared to Moderna-type LNPs, compound 14-Z ⁇ -LNPs strongly express the gene in muscle, while Moderna-type LNPs deliver more LNPs not only to muscles but also to the liver. It shows.
  • compound 14-Z ⁇ delivers genes to cells at the site of intramuscular administration.
  • Test example 8 Functional analysis of Compound 30 using animals Previous studies have revealed that Compound 14-Z ⁇ -LNP can efficiently deliver and express genes in cultured cells and mouse tissues compared to Moderna-type LNPs. . However, no significant difference was observed between Moderna LNP and compound 14-Z ⁇ -LNP in gene expression in the animal's calf muscles. Therefore, 10 ⁇ l of LNP using Compound 30, which allows for more stable gene expression in cultured cells, was administered into the muscle, and the luciferase activity 24 hours later was analyzed using an in vivo imaging device. The results obtained are shown in FIG. Figure 8 shows that gene expression was significantly higher in the intramuscular administration group of KGK020-LNP compared to Moderna-type LNP, while gene expression was higher in the liver in Moderna-type LNP compared to compound 30-LNP. It shows that.
  • Test example 9 Functional analysis of Compound 33 using animals 10 ⁇ l of LNP using Compound 33, which has a disaccharide attached in the same way as Compound 30, was administered into the muscle, and luciferase activity was analyzed 24 and 72 hours later using an in vivo imaging device. did. The obtained results are shown in FIG. Figure 9 shows that the genes were significantly higher in the KGK020-LNP intramuscularly administered group when compared with Moderna LNPs at both 24 hours and 72 hours after administration.On the other hand, Moderna LNPs at 24 hours after administration Compared to Compound 33-LNP, gene expression was higher in the liver and no longer detected at 72 hours.
  • Test example 10 Influence of galactose-type C-type lectin 1 (macrophage galactose-type lectin 1: MGL1/CD301a) on the intracellular uptake of compound 14-Z ⁇ -LNP Compared with Moderna-type LNP, compound 15 ⁇ and compound 14-Z ⁇ have an effect on the intracellular uptake of MGL2 into cells. delivers mRNA into cells. However, since the effect was only partial, we also examined MGL1, a subtype of MGL. Therefore, we generated cells in which MGL1 was knocked down and evaluated the amount of LNP taken into the cells by luciferase activity. The obtained results are shown in FIG.
  • Figure 10 shows that the amount of compound 14-Z ⁇ -LNP taken into cells is significantly reduced in MGL1 knockdown cells.
  • MGL1 plays an important role in the cellular uptake mechanism of C-glycoside glycolipid-LNP compared to MGL2.
  • Test example 11 Effect of cell type on cellular uptake of Compound 14-Z ⁇ and Compound 30-LNP Compared to Moderna-type LNP, Compound 14-Z ⁇ -LNP and Compound 30-LNP are able to absorb MGL1, which is abundantly expressed on the surface of immune cell membranes, into cells. Deliver mRNA into cells via MGL2. Therefore, fibroblasts (NIH3T3) and immune cells (Raw264.7 cells) were seeded in 50 ⁇ l, 10 ⁇ l of each type of LNP was added, and luciferase activity was evaluated 16 hours later. The obtained results are shown in FIG. 11.
  • Figure 11 shows that in immune cells, Compound 14-Z ⁇ -LNP and Compound 30-LNP increased luciferase activity compared to Moderna type, while in fibroblasts, the rate of increase was lower than in immune cells. It shows that it is a value.
  • Test example 12 Intracellular mRNA uptake of compound 30-LNP targeting human immune cells
  • the C-glycoside glycolipid-LNP of the present invention efficiently delivers mRNA into cells compared to Moderna-type LNPs.
  • human immune cells human leukemia cells THP1.
  • FIG. 12 suggests that in THP1 as well, mRNA uptake into cells increases significantly over time in compound 30-LNP compared to Moderna-type LNP.
  • Test example 13 Functional evaluation of mRNA intracellular delivery of compound 14-Z ⁇ , compound 30, and compound 33-LNP
  • Functional evaluation of mRNA intracellular delivery of various LNPs was performed using luciferase activity as an index.
  • luciferase activity was measured using luciferase activity as an index.
  • Raw264.7 cells were seeded in a 96-well plate at various cell numbers (50 ⁇ l), 10 ⁇ l of each type of LNP was added, and luciferase activity was measured 8 hours later. The obtained results are shown in FIG. 13.
  • Figure 13 shows that compared to Moderna LNP, the luciferase activity of cells added with compound 14-Z ⁇ -LNP with monosaccharide, compound 30-LNP with disaccharide added, and compound 33-LNP significantly increased; Furthermore, the cells exposed to compound 33-LNP showed the highest gene expression.
  • Test example 14 Functional evaluation of mRNA intracellular delivery of Compound 30-LNP using GFP protein as an indicator Instead of luciferase, GFP mRNA was used to evaluate the amount of intracellular uptake.
  • Raw264.7 cells were seeded in a 24-well plate at various cell numbers (280 ⁇ l), 20 ⁇ l of Moderna LNP and compound 30-LNP were added, and GFP fluorescence activity was measured 16 hours later. The obtained results are shown in FIG. 14.
  • Figure 14 shows that the fluorescence intensity of compound 30-LNP-LNP-added cells is significantly increased compared to Moderna-type LNPs.
  • the C-glycoside glycolipid-LNP020 of the present invention increases the amount of mRNA uptake into cells or translation ability compared to the Moderna type, even for mRNA other than luciferase. Ta.
  • Test example 15 Effects of various C-glycoside glycolipids-LNPs on 4°C PBS storage using GFP protein as an indicator Evaluate the amount of intracellular uptake using GFP mRNA and evaluate the effects of various C-glycoside glycolipids-LNPs on 4°C PBS storage did. The obtained results are shown in FIG. 15. Figure 15 suggests that various C-glycoside glycolipid-LNPs can be stored for longer periods of 12 days or more compared to Moderna-type LNPs.
  • Test example 16 Effect of frozen storage of Compound 30-LNP using GFP protein as an indicator
  • Test Example 15 suggested that various C-glycoside glycolipid-LNPs could be stored for a long period of 12 days or more when stored in PBS at 4°C. Therefore, in order to verify a more long-term stable storage method, LNPs were suspended in 20% sucrose, frozen at -80°C, then thawed, and raw 264.7 cells were placed in a 24-well plate at various cell numbers ( 280 ⁇ l), 20 ⁇ l of Moderna LNP and compound 30-LNP were added, and GFP fluorescence activity was measured 16 hours later. The obtained results are shown in FIG. 16.
  • Figure 16 shows that the fluorescence activity of Compound 30-LNP-added cells is significantly increased compared to Moderna-type LNPs.
  • the above study results revealed that compound 30-LNP suspended in 20% sucrose can be stored at -80°C and its intracellular mRNA delivery ability is maintained.
  • Test example 17 Evaluation of antibody titer using Moderna type and Compound 33-LNP using receptor-binding domain (RBD) as an indicator
  • Covid19 spike protein mRNA was encapsulated in Compound 33-LNP and spike protein was detected after intramuscular administration (10 ⁇ l) in mice. The titer of antibodies against was measured 5 weeks after administration.
  • Covid19 spike protein mRNA (Omicron type; OZ Biosciences) was encapsulated in Compound 33-LNP, and 10 ⁇ l was administered to the thigh muscle. Blood was collected from the tail of the mouse, and serum was separated and used for measurements.
  • Spike protein Omicron stock
  • RBD receptor-binding domain
  • 30 ng/ ⁇ l was immobilized on a 96-well plate and reacted with mouse serum, followed by reaction with HRP-labeled mouse antibody. Finally, it was reacted with a chromogenic substrate, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid), and the absorbance was measured.
  • FIG. 17 shows that as a result of evaluating the antibody titer using RBD protein as an index, no significant difference was observed in the RBD target antibody titer due to Compound 33-LNP compared to Moderna type LNP.
  • Test example 18 Evaluation of antibody production ability using Moderna type and Compound 33-LNP According to the method in Test Example 17, Covid19 spike protein mRNA was encapsulated in Moderna type and Compound 33-LNP, and spikes were observed after intramuscular administration (10 ⁇ l) to mice. The amount of antibodies against the protein was measured 1 week and 3 weeks after administration.
  • FIG. 18 shows that the amount of antibody produced by Compound 33-LNP is slightly reduced in the third week compared to Moderna-type LNP.
  • Test example 19 Evaluation of antibody titer using Moderna type and Compound 33-LNP using full-length spike protein as an indicator.
  • Covid19 spike protein mRNA was encapsulated in Moderna type and Compound 33-LNP, and intramuscular administration ( The titer of antibodies against the spike protein was measured 5 weeks after administration (10 ⁇ l).
  • FIG. 19 shows that as a result of evaluating the antibody titer using the full-length spike protein as an index, no significant difference was observed in the antibody titer due to Compound 33-LNP compared to Moderna type LNP.
  • the present invention may include the following embodiments.
  • R1 is hydrogen, halogen, or hydroxy
  • R2 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally interrupted by one or more ester, amide and/or ether bonds; good)
  • R3 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally interrupted by one or more ester, amide and/or ether bonds; good)
  • R4 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally interrupted by one or more ester, amide and/or ether bonds; good)
  • R5, R6 and R7 are each independently a hydrogen atom or a sugar chain connected by a glycosyl bond, Each wavy line independently indicates that when the bonded carbon is an asymmetric carbon atom, the stereochemistry of the bond is either the S or R configuration, and each dotted line independently indicates the presence of the bond
  • R1 is hydrogen, halogen, or hydroxy
  • R2 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where the alkyl is not interrupted by any bond
  • R3 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where the alkyl is not interrupted by any bond
  • R4 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where the alkyl is not interrupted by any bond
  • R5, R6 and R7 are each independently a hydrogen atom or a sugar chain connected by a glycosyl bond, Each wavy line independently indicates that when the bonded carbon is an asymmetric carbon atom, the stereochemistry of the bond is either the S or R configuration, and each dotted line independently indicates the presence of the bond.
  • R1 is hydrogen, halogen, or hydroxy
  • R2 is a hydrogen atom, an optionally substituted hydroxy group, or a linear or branched, saturated or unsaturated, optionally substituted C11-C15 alkyl (herein, alkyl is one or more optionally interrupted by ester, amide and/or ether bonds)
  • R3 is a hydrogen atom, a linear or branched, saturated or unsaturated, optionally substituted C11-C15 alkyl (herein, alkyl represents one or more ester, amide and/or ether bonds);
  • R4 is straight-chain or branched, saturated or unsaturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally substituted by one or more ester, amide and/or ether bonds; ), amino which
  • R1 is hydrogen, halogen, or hydroxy
  • R2 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally interrupted by one or more ester, amide and/or ether bonds; good)
  • R3 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally interrupted by one or more ester, amide and/or ether bonds; good)
  • R4 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where alkyl is optionally interrupted by one or more ester, amide and/or ether bonds; good)
  • R5, R6 and R7 are each independently a hydrogen atom or a sugar chain connected by a glycosyl bond, Each wavy line independently indicates that when the bonded carbon is an asymmetric carbon atom, the stereochemistry of the bond is either the S or R configuration, and each dotted line independently indicates the presence of the
  • R1 is hydrogen, halogen, or hydroxy
  • R2 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where the alkyl is not interrupted by any bond
  • R3 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where the alkyl is not interrupted by any bond
  • R4 is straight-chain or branched, saturated, optionally substituted C11-C15 alkyl, where the alkyl is not interrupted by any bond
  • R5, R6 and R7 are each independently a hydrogen atom or a sugar chain connected by a glycosyl bond, Each wavy line independently indicates that when the bonded carbon is an asymmetric carbon atom, the stereochemistry of the bond is either the S or R configuration, and each dotted line independently indicates the presence of the bond.
  • ⁇ LNP> [13] The C-glycoside glycolipid compound according to any one of [1] to [6] and [7] to [12], and (a) a nucleic acid molecule, (b) a cationic lipid, and (c) an aggregation inhibitor (polyethylene (d) a sterol.

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Abstract

本発明は、様々な脂質ナノ粒子の構成成分の候補分子を提供する。　本発明は、式（I）、または式（II）で示されるC-グリコシド糖脂質化合物、それを含有する脂質ナノ粒子、脂質ナノ粒子を含有する医薬組成物、特にワクチンに関する。

Description

脂質ナノ粒子
　本特許出願は、日本国特許出願２０２２－１４１４２１号（２０２２年９月６日出願）に基づくパリ条約上の優先権および利益を主張するものであり、ここに引用することによって、上記出願に記載された内容の全体が本明細書中に組み込まれるものとする。
　本発明は一般に、ワクチン等に利用可能な脂質ナノ粒子の分野に属する。詳細には、本発明は、脂質ナノ粒子を構成できる新規化合物、それを含有する脂質ナノ粒子、および脂質ナノ粒子を含有する医薬組成物、例えばワクチンに関する。
　核酸医薬品は最も潜在力を秘めた医薬品の一つである。例えば、古くから知られているアンチセンス核酸（非特許文献１および２）、siRNA（非特許文献３）などに加え、近年においてはmiRNA（非特許文献４）、lncRNA（非特許文献５）などの非翻訳RNAの生物学的機能および重要性が明らかとなり、新たな創薬標的として注目されている。しかし、核酸を標的細胞に届けるうえで、核酸は生体安定性が低いことや、負電荷を帯びた高分子構造（約300～5000 kDa）により物性が悪いことが問題である（非特許文献６）。
　以上の問題は、2019年からパンデミックを引き起こしている新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の蔓延により初めて実用化されたmRNAワクチンの輸送に使われた脂質ナノ粒子（LNP）によって解決することができる。LNPは、複数の脂質からなるベシクルであり、粒子形成を補助する中性（双性イオン型）脂質、コレステロール、粒子形成と生体安定性向上を担うPEG脂質、およびアニオン性の核酸を安定化するカチオン性脂質などから成る（非特許文献７）。これらの成分は分子レベルで構造を設計することが可能であり、その成分比によっても粒子の物性が変化することから、極めて多様な性質を付与することが可能である。これまでの研究の多くは、臓器への選択的集積や核酸の安定化に寄与する、核酸の負電荷を中和するカチオン性脂質の開発を中心に行われてきた（特許文献１および２）。一方、PEG脂質はアナフィラキシー・ショックの原因となっている可能性が示唆されていることや（非特許文献８）、中性脂質に関しては古くから1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）などの二本鎖リン脂質が用いられていることから、検討の余地を残している。これまでに承認された核酸医薬品のほとんどは、LNPなどの粒子に包まれていない核酸それ自体（nakedな状態）またはGalNAc修飾体として投与されており（非特許文献９）、より実用的なLNPの開発および機能向上は急務である。これまでの新規LNPの開発は、臓器への選択的集積や核酸の安定化に寄与するカチオン性脂質に焦点があてられてきた。
　他方、糖脂質は細胞膜の成分であり、細胞表面に突出した糖鎖は特定の分子を認識することで、分子の細胞内取り込みや様々なシグナル伝達を起こす。例えば、インフルエンザなどのウイルスは、それぞれ固有の糖鎖認識タンパク質を持ち、これが宿主の細胞上に存在する糖鎖を認識し結合することで感染することが知られている。細胞表層の特定の糖鎖認識タンパク質のリガンドとなる糖鎖をLNPに組み込むと、LNPの臓器局在性や細胞内取り込みを促進できる可能性が期待できる。しかし、糖脂質そのものの自己集合特性などは研究されているものの、それ単体ではベシクル構造を形成しにくいため、薬物送達技術（DDS）への応用には至っていないのが現状である(非特許文献１０）。ごく最近、中性脂質を植物由来の天然糖脂質に置き換えて調製したLNPの物性が報告されているが（非特許文献１１）、その検討は植物や生物由来の糖脂質に限られており、良好なトランスフェクション効率を示す新規ヘルパー脂質は見いだされていない。しかし、DSPCを他の脂質に変更したときにLNPの臓器局在傾向が変化したことから、ヘルパー脂質の検討はLNPの臓器・細胞特異的送達に有効である可能性が示唆された。また、ヒドロキシエチルデンプンの表面にPEGを介してマンノースを担持させたナノ粒子は、樹状細胞に多く取り込まれる事が報告されている（非特許文献１２）
特表2018-532721公報 特表2022-501360公報
Paterson BM, Roberts BE, Kuff EL. Structural gene identification and mapping by DNA-mRNA hybrid-arrested cell-free translation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977; 74(10): 4370-4374. https://doi.org/10.1073/pnas.74.10.4370 Zamecnik PC, Stephenson ML. Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligodeoxynucleotide. Proc Natl Acad Sci U S A. 1978; 75(1): 280-284. https://doi.org/10.1073/pnas.75.1.280 Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21±nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. n.d. O’Brien J, Hayder H, Zayed Y, Peng C. Overview of MicroRNA Biogenesis, Mechanisms of Actions, and Circulation. Front Endocrinol. 2018; 9: 402. https://doi.org/10.3389/fendo.2018.00402 Iyer MK, Niknafs YS, Malik R, et al. The landscape of long noncoding RNAs in the human transcriptome. Nat Genet. 2015; 47(3): 199-208. https://doi.org/10.1038/ng.3192 Kowalski PS, Rudra A, Miao L, Anderson DG. Delivering the Messenger: Advances in Technologies for Therapeutic mRNA Delivery. Mol Ther. 2019; 27(4): 710-728. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2019.02.012 Buschmann MD, Carrasco MJ, Alishetty S, Paige M, Alameh MG, Weissman D. Nanomaterial Delivery Systems for mRNA Vaccines. Vaccines (Basel). 2021; 9(1). https://doi.org/10.3390/vaccines9010065 Sellaturay P, Nasser S, Islam S, Gurugama P, Ewan PW. Polyethylene glycol (PEG) is a cause of anaphylaxis to the Pfizer/BioNTech mRNA COVID-19 vaccine. Clin Exp Allergy. 2021; 51(6):861-863. https://doi.org/10.1111/cea.13874 Yamada Y. Nucleic Acid Drugs-Current Status, Issues, and Expectations for Exosomes. Cancers. 2021; 13(19). https://doi.org/10.3390/cancers13195002 Hashim R, Zahid NI, Velayutham TS, Aripin NFK, Ogawa S, Sugimura A. Dry Thermotropic Glycolipid Self-Assembly: A Review. J Oleo Sci. 2018; 67(6): 651-668. https://doi.org/10.5650/jos.ess17261 Kim J, Jozic A, Sahay G. Naturally Derived Membrane Lipids Impact Nanoparticle-Based Messenger RNA Delivery. Cell Mol Bioeng. 2020; 13(5):463-474. https://doi.org/10.1007/s12195-020-00619-y Landfester K, Wurm FR, et al. Carbohydrate-Based Nanocarriers Exhibiting Specific Cell Targeting with Minimum Influence from the Protein Corona. Angew. Chem. Int. Ed. 2015; 54: 7436-7440. http://dx.doi.org/10.1002/anie.201502398
　COVID-19のmRNAワクチンは、発熱、炎症、アナフィラキシー・ショックを引き起こす可能性があり、これら副作用の原因は、mRNAを送達するLNPの構成成分にあると考えられる。よって、現在使用されているLNPの構成成分には改善の余地があるのみならず、これらの成分が、今後出現する新たな感染症に対してLNP-mRNAワクチンとして同様に効果的である保証はない。従って、様々なLNP構成成分の候補分子の開発が必要不可欠である。
　本発明者らは、中性脂質、コレステロール、PEG脂質およびカチオン性脂質から成るLNPにおいて、DSPCに代表される既存の中性脂質を特定の糖脂質で置き換え、そのmRNAの細胞内取り込み、安定性、臓器局在、サイトカイン誘導能が意外にも大きく向上することを見出し、本発明を完成させた。本発明は、ナノ粒子を糖鎖で修飾すれば、標的細胞に送達できることを示すものであると考えている。
　従って、本発明は、以下の態様を含む。
＜C-グリコシド単糖脂質化合物＞
［１］
　式（I）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［式中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　R2は、水素原子、置換されてもよいヒドロキシ基、または、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R3は、水素原子、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシであり、
　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシであり、
　R5、R6およびR7はそれぞれ独立して、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線はそれぞれ独立して、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す。］
で示されるC-グリコシド糖脂質化合物。
［２］
　式（I）中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　R2は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R3は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R5、R6およびR7はそれぞれ独立して、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線はそれぞれ独立して、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す、［１］記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
［３］
　式（I）中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　R2は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
　R3は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
　R5、R6およびR7はそれぞれ独立して、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線はそれぞれ独立して、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す、［２］記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
［４］
　式（I’’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［式中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシ基であり、
　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線は、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す。］
で示される、［３］記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
［５］
　R1がフルオロである、［４］記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
［６］
　点線がZ体の二重結合である、［５］記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
＜C-グリコシド二糖脂質化合物＞
［７］
　式（II）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［式中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　R2は、水素原子、置換されてもよいヒドロキシ基、または、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R3は、水素原子、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシであり、
　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシであり、
　R5、R6およびR7はそれぞれ独立して、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線はそれぞれ独立して、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す。］
で示されるC-グリコシド糖脂質化合物。
［８］
　式（II）中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　R2は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R3は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R5、R6およびR7はそれぞれ独立して、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線はそれぞれ独立して、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す、［７］記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
［９］
　式（II）中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　R2は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
　R3は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
　R5、R6およびR7はそれぞれ独立して、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線はそれぞれ独立して、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す、［８］記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
［１０］
　式（II’’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ［式中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシ基であり、
　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線は、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す。］
で示される、［９］記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
［１１］
　R1がフルオロである、［１０］記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
［１２］
　点線がZ体の二重結合である、［１１］記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
＜LNP＞
［１３］
　［１］から［６］、および［７］から［１２］のいずれか記載のC-グリコシド糖脂質化合物、ならびに（ａ）核酸分子、（ｂ）カチオン性脂質、（ｃ）凝集抑制剤（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質またはＰＥＧ修飾脂質など）、および（ｄ）ステロールを含む、脂質ナノ粒子。
＜医薬組成物＞
［１４］
　［１３］記載の脂質ナノ粒子を含む、医薬組成物。
［１５］
　ワクチンである、［１４］記載の医薬組成物。
　本発明のC-グリコシド糖脂質化合物を含むLNPは従来型のLNPと比較し、細胞内へのmRNAの送達量および／またはmRNAにコードされるタンパク質の翻訳能を飛躍的に増大させる。これにより、COVID-19のmRNAワクチン等において発熱、炎症、アナフィラキシー・ショックなどの副作用または副反応を引き起こす可能性がある他のLNP構成成分の量を大幅に減少させることができ、そのことは、これら副作用および／または副反応の減弱に繋がると考えられる。
図１Ａは、ルシフェラーゼ活性を指標としたLNPのmRNA細胞内送達に対する細胞数の影響を示すグラフである。図１Ｂは、ルシフェラーゼ活性を指標としたLNPのmRNA細胞内送達に対するLNP用量の影響を示すグラフである。 図２は、ルシフェラーゼ活性を指標としたmRNA細胞内送達に対する各種C-グリコシド糖脂質-LNPの影響を示すグラフである。 図３は、ATP活性を指標とした各種C-グリコシド糖脂質-LNPの生細胞に及ぼす影響を示すグラフである。 図４は、各種C-グリコシド糖脂質-LNPの室温における安定性を示すアガロースゲルの写真である。 図５Ａは、アジュバント活性に関連するサイトカインCcl3遺伝子の発現に及ぼす各種C-グリコシド糖脂質-LNPの影響を示すグラフである。 図５Ｂは、アジュバント活性に関連するサイトカインCcl22遺伝子の発現に及ぼす各種C-グリコシド糖脂質-LNPの影響を示すグラフである。 図６Ａは、細胞に、表2に記載されているMgl2 siRNAをトランスフェクションしてMgl2遺伝子をノックダウンした結果を示すグラフである。 図６Ｂは、Mgl2ノックダウン細胞におけるモデルナ型LNP、化合物15α-LNPおよび化合物14-Zα-LNPの細胞内取り込み量を示すグラフである。 図７は、モデルナ型LNPおよび化合物14-Zα-LNPを動物に筋注した後、どの部位にLNPのmRNAが送達されるかルシフェラーゼ活性を指標に示した写真およびグラフである。 図８は、モデルナ型LNPおよび化合物30-LNPを動物に筋注した後、どの部位にLNPのmRNAが送達されるかルシフェラーゼ活性を指標に示した写真およびグラフである。 図９は、モデルナ型LNPおよび化合物33-LNPを動物に筋注した24時間後および72時間後における、どの部位にLNPのmRNAが送達されるかルシフェラーゼ活性を指標に示した写真およびグラフである。 図１０は、化合物14-Zα-LNPの細胞内取り込みに及ぼすガラクトース型C型レクチン1(マクロファージ ガラクトース型レクチン1：MGL1/CD301a)の影響を示す写真およびグラフである。
図１１は、化合物14-Zα、化合物30-LNPの細胞内取り込みに及ぼす細胞種の影響を示すグラフである。 図１２は、ヒトの免疫細胞であるヒト白血病細胞THP1を対象とした化合物30-LNPの細胞内mRNA取り込みを示すグラフである。 図１３は、化合物14-Zα、化合物30、化合物33-LNPのルシフェラーゼmRNA細胞内送達を示すグラフである。 図１４は、GFPタンパク質を指標とした化合物30-LNPのmRNA細胞内送達を、モデルナ型LNPと比較して示すグラフである。図中、P4細胞集団とは、蛍光がより強い細胞集団の部分を示す（斜線グレーゾーンのみ表示）。 図１５は、GFPタンパク質を指標とした4℃ PBS保存に対する各種C-グリコシド糖脂質-LNPの影響を示すグラフである。 図１６は、GFPタンパク質を指標とした化合物30-LNP冷凍保存の影響を示すグラフである。図中、P4細胞集団とは、蛍光がより強い細胞集団の部分を示す（斜線グレーゾーンのみ表示）。 図１７は、受容体-結合ドメイン（RBD）を指標としたモデルナ型および化合物33-LNPによる抗体力価を示すグラフである。 図１８は、受容体-結合ドメイン（RBD）を指標としたモデルナ型および化合物33-LNPによる抗体力価の投与後1週目および3週目におけるグラフである。 図１９は、スパイクタンパク質の全長タンパク質を指標としたモデルナ型および化合物33-LNPによる抗体力価を示すグラフである。
＜化合物＞
　本発明は、一つの形態において、ある実施態様として、式（I）
　式（I)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 ［式中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　R2は、水素原子、置換されてもよいヒドロキシ基、または、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R3は、水素原子、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシであり、
　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシであり、
　R5、R6およびR7はそれぞれ独立して、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線はそれぞれ独立して、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す。］
で示されるC-グリコシド糖脂質化合物に関する。
　本発明は、本形態において、好ましい実施態様として、式（I’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 ［式中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　R2は、水素原子、置換されてもよいヒドロキシ基、または、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R3は、水素原子、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシであり、
　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシであり、
　R5は、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
　波線は、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線は、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す。］
で示されるC-グリコシド糖脂質化合物に関する。
　本明細書において、「C-グリコシド糖脂質化合物」とは、2本鎖アルキル基と糖部位がC-グリコシル結合で直接連結している糖脂質化合物である。
　これまでに報告されていた、LNP利用されていた糖脂質化合物は、いずれもジアシルグリセロールのO-グリコシド糖脂質化合物であったのに対し、本発明の糖脂質化合物は、2本鎖アルキルと単糖がα-またはβ-C-グリコシル結合で直接連結している、極めて単純な構造の糖脂質化合物である。本発明におけるC-グリコシル化反応では、グリコシド結合部位の構造を自在に変化させることができる。また、糖鎖および脂質の構造も多様に変更可能であり、これまでに全く研究されていない構造活性相関研究を実施可能である。
　本明細書において、「ハロゲン」の用語は、クロロ、ブロモ、ヨードまたはフルオロを意味する。好ましいハロゲンは、フルオロである。
　本明細書において、「置換されてもよいヒドロキシ基」の用語は、ヒドロキシ基そのもの、またはアルキル、エステル、カーボネートが置換したヒドロキシ基を指す。
　本明細書において、「置換されてもよいC11－C15アルキル」における「C11－C15アルキル」の用語は、指示されている数の炭素原子と水素原子からなり、不飽和を含むことができ、分子の残りの部分に単結合によって接続している直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖基を意味する。例としては、n-ウンデシル、n-ドデシル、n-トリデシル、n-テトラデシル、n-ペンタデシルのようなアルキル基が挙げられるが、これらに限定されない。アルキル基が、1個以上の置換基で置換されている場合、置換基は、以下に定義されるとおりである。「置換されてもよいC11－C15アルキル」が不飽和を含む場合、1つまたはそれ以上の二重結合を含ことができる。本発明の「置換されてもよいC11－C15アルキル」は、定義されている通り、１つ以上のエステル結合、１つ以上のアミド結合および／または１つ以上のエーテル結合によって任意に中断されてもよい。
　本明細書において、「二級アミド化されてもよいアミノ」とは、アミノ基に炭素数C11-C15のカルボン酸を縮合した二級アミド、または置換されていないアミノ基およびアンモニウム塩である。
　本明細書において、「アルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシ」とは、ヒドロキシに炭素数C11-C15のアルキルを置換したもの、炭素数C11-C15のカルボン酸を縮合したエステル、または置換されていないヒドロキシである。
　本明細書において、「グリコシル結合により連結した糖鎖」とは、α-またはβ-O-グリコシド結合により連結したグルコース、ガラクトース、マンノース、またはグルコサミンなどの単糖、または上記単糖を構成成分に持つ二糖である。
　本明細書において、アミノ酸残基部分は、通常のアミノ酸の立体配置を有し、それぞれのアミノ酸残基部分は独立して、「L」または「D」型の立体異性体形態で存在することができる。
　上記各定義における「置換されてもよい」とは、置換基が、置換可能な(炭素原子およびヘテロ原子を含む)任意の位置で、ハロゲン(フルオロ、クロロ、ブロモ)；アルコキシ、好ましくはメトキシ；アルキルカルボニル、好ましくはメチルカルボニル；アルコキシカルボニル、好ましくはメトキシカルボニルおよびエトキシカルボニル；ヒドロキシカルボニル；置換されてもよいメチル、例えばトリフルオロメチル；シアノ；ニトロ、メタンスルホニル；イソブチル；tert－ブチル；エタノン；アセトアミドメチル(－CH2－NH－CO－CH3)；C1～C3アルキル(例えばメチル)によって置換されてもよいオキサゾリルまたはイソオキサゾリル；ピリジル；ヒドロキシ；フェニル；アルキルアミド、好ましくはイソブチルアミド(－NH－CO－CH－(CH3)2)、O－アルキル－アミノ－アルキル、好ましくはO－(CH2)2－N－(CH2－CH3)2；N－アセトアミド；［1,2,3］チアジアゾリル；ジアルキルアミン、好ましくはジメチルアミン；エチル；アミン(例えば、ジアルキルアミン)によって置換されたエチル、またはジアルキルカルボキシアミド、好ましくはジメチルアミンおよびジエチルアミン)、好ましくは、ジアルキルカルボキシアミドのジアルキルアミンが4、5、6または7員環を形成するもの；イソプロピル；N－プロピオンアミド、ハロアセチル、シアノ、ホルミルおよびケトンから選択される1個以上の置換基でさらに置換されていてもよいことを意味する。
　好ましくは、上記の置換基は、フルオロ、クロロ、ブロモ、メトキシ、メチルカルボニル、メトキシカルボニル、ヒドロキシカルボニル、エトキシカルボニル、置換されてもよいメチル、例えばトリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、メタンスルホニル、ピリジン、tertブチル、アセトアミドメチル(－CH2－NH－CO－CH3)、C1～C3アルキル(例えばメチル)によって場合により置換されていてもよいオキサゾリルまたはイソオキサゾリル、フェニル、O－(CH2)2－N－(CH2－CH3)2、N－アセトアミド、ジメチルアミン、イソプロピル、N－プロピオンアミド、ハロアセチル、シアノ、ホルミルおよびケトンから選択される。
　「製薬的に許容できる塩」の用語は、被検者に投与すると、本明細書に記載の化合物を(直接的または間接的に)与えることができる塩を意味する。塩の調製は、当該技術分野で既知の方法によって行うことができる。好ましくは、「製薬的に許容できる塩」は、ヒトに投与したとき、生理学的に忍容され、典型的にはアレルギー反応または同様の不都合な反応(例えば、胃のむかつき、めまいなど)を起こさない分子部分を与える。
　例えば、本明細書にて提供される化合物の製薬的に許容できる塩は、塩基性部分または酸性部分を含む親化合物から従来の化学方法によって合成される。一般的に、このような塩は、例えば、水中または有機溶媒中、またはこの2つの混合物中、これらの化合物の遊離酸または遊離塩基の形態と、化学量論量の適切な塩基または酸とを反応させることによって調製される。一般的に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルのような非水系媒体が好ましい。酸付加塩の例としては、鉱物酸付加塩(例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩)、有機酸付加塩、例えば、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩およびｐ－トルエンスルホン酸塩が挙げられる。アルカリ付加塩の例としては、無機塩(例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシウム、アルミニウム、リチウムの塩)、有機アルカリ塩(例えば、エチレンジアミン、エタノールアミン、N,N－ジアルキレンエタノールアミン、トリエタノールアミン、グルカミン、塩基性アミノ酸の塩を含む)が挙げられる。
　本発明の化合物は、様々な立体異性体形態で存在してもよい。立体異性体はその空間配置のみで異なる化合物である。複数のエナンチオマーは、最も一般的にこれらが不斉中心として機能する非対称置換炭素原子を含むために、鏡像を重ねることができない複数組の立体異性体である。「エナンチオマー」は、互いに鏡像であり、重ねることができない一組の分子の1つを意味する。複数のジアステレオマーは、最も一般的にこれらが2つ以上の非対称置換炭素原子を含むために、鏡像として関連しない複数の立体異性体である。「R」および「S」は、1つ以上の不斉炭素原子の周辺の置換基の配置を表す。
　本発明は、好ましい実施形態では、式（I)中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　R2は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R3は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R5は、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
　波線は、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線は、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す、本発明のC-グリコシド糖脂質化合物に関する。
　本発明は、別の好ましい実施態様では、式（I)中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　R2は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
　R3は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
　R5は、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
　波線は、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線は、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す、本発明のC-グリコシド糖脂質化合物に関する。
　本発明は、さらなる別の好ましい実施態様では、式（I’’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 ［式中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線は、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す。］
で示される、本発明のC-グリコシド糖脂質化合物に関する。
　本発明は、さらなる別の好ましい実施態様では、式（I’’’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 ［式中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　点線は、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す。］
で示される、本発明のC-グリコシド糖脂質化合物に関する。
　上記好ましい実施態様において、R1がフルオロであるC-グリコシド糖脂質化合物が好ましく、さらに好ましくは、R1がフルオロであり、かつ点線がZ体の二重結合であるC-グリコシド糖脂質化合物である。
＜本発明C-グリコシド単糖脂質化合物の一般的な調製方法＞
　以下、本発明のC-グリコシド単糖脂質化合物の調製手法を一般的に説明する。
　本発明のC-グリコシド単糖脂質化合物は、次の反応スキームI、IIに従ったドナー化合物およびアクセプター化合物の合成、次いで反応スキームIIIに従った光酸化還元カップリング、脱保護、要すれば水素添加反応によって、調製できる。
ドナー化合物およびアクセプター化合物の合成
スキームI
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 ［式中、R2は、水素原子、置換されてもよいヒドロキシ基、または、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R3は、水素原子、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシであり、
　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシである。］
　一般式（Xa）で示される化合物をトリブロモフルオロメタンおよびトリフェニルホスフィンとの反応に付すことにより、一般式（Xb）で示されるハロアルカン化合物を得ることができる。
　本反応は、適当な溶媒中、適当な温度により実施することができる。溶媒としては、反応に悪影響を及ぼさない溶媒であればよく、例えば、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、tert-ブチルメチルエーテルまたはこれらの混合溶媒が挙げられる。
　活性化試薬としては、ジエチル亜鉛などが挙げられる。
　本反応は25 ℃、とりわけ10～40 ℃で好適に進行する。
スキームII
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 ［式中、P1は、保護基である場合、エステルまたはアセタールであり、糖鎖である場合、エステル、アセタール、カーボネート、シリルを保護基として有する糖鎖、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、またはグルコサミンなどの単糖、上記単糖を構成成分に持つ二糖であり、
　P2は保護基であり、エステル、アセタール、またはシリルであり、
　P3は保護基であり、エステルまたはカーボネートであり、そして
　LGは脱離基であり、スルフィドまたはアセトキシである。］
　一般式（Ya）で示される化合物を脱離反応に付すことにより、一般式（Yb）で示されるハロ化合物を得ることができる。
　本反応は、適当な溶媒中、適当な温度により実施することができる。溶媒としては、反応に悪影響を及ぼさない溶媒であればよく、例えば、ジクロロメタン、酢酸またはこれらの混合溶媒が挙げられる。
　活性化試薬としては、臭化水素、臭化ヨウ素などが挙げられる。
　本反応は25 ℃、とりわけ25～60 ℃で好適に進行する。
光酸化還元カップリング、脱保護、要すれば水素添加
スキームIII
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 ［式中、R2、R3、R4、P1、P2、P3、LGは、上記スキームにおける定義と同義である。］
光酸化還元カップリング
　光酸化還元カップリング反応として、光励起により酸化・還元の両反応を触媒的に起こす有機光触媒または遷移金属光触媒と、炭素-炭素結合形成を起こす遷移金属触媒共存下、基質と試薬の混合溶液に対して青色LEDを照射して行う化学反応を行う。
　有機光触媒または遷移金属光触媒としては、1,2,3,5-テトラカルバゾール-4,6-ジシアノベンゼン（4-CzIPN）、[4,4’-ビス（1,1-ジメチル）-2,2’-ビピリジン-N1,N1’]ビス[3,5-ジフロロ-2-[5-（トリフロロメチル）-2-ピリジニル-N]フェニル-C]イリジウム（III）ヘキサフルオロリン酸などが利用できる。
　炭素-炭素結合形成を起こす遷移金属触媒としては、塩化ニッケル(II)ジメトキシエタン錯体、臭化ニッケル(II)ジメトキシエタン錯体、ビス(2,2,6,6-テトラメチル-3,5-ヘブタンジオン酸)ニッケル(II)などが利用できる。
　青色LEDを照射して行う化学反応は、例えば、パイレックス(登録商標)ガラスバイアルに調製した反応溶液に、直径約15 cmのファンを上部からあて空冷しながら、465 nmのピーク波長を持つ青色LEDを照射して行うことができる。
脱保護
　脱保護反応として、糖鎖および脂質に含まれるアルコール、アミン、カルボン酸などの官能基を反応不活性にするために搭載した保護基を除去する。例えば、エステルまたはカーボネートはナトリウムメトキシド、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、または炭酸ナトリウムで除去可能であり、シリルはフッ化水素ピリジンまたはテトラブチルアンモニウムフルオリドで除去可能である。
水素添加
　パラジウム、白金、ロジウムなどの遷移金属不均一触媒と水素ガスによる、反応基質の二重結合の水素化、およびフッ素原子の水素化反応を行う。
　本発明は、かかる形態において、別の実施態様として、式（II）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 ［式中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　R2は、水素原子、置換されてもよいヒドロキシ基、または、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R3は、水素原子、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシであり、
　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシであり、
　R5、R6およびR7はそれぞれ独立して、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線はそれぞれ独立して、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す。］
で示されるC-グリコシド糖脂質化合物に関する。
　本発明は、本形態において、好ましい実施態様として、式（II’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 ［式中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　R2は、水素原子、置換されてもよいヒドロキシ基、または、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R3は、水素原子、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシであり、
　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシであり、
　R5は、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
　波線は、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線は、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す。］
で示されるC-グリコシド糖脂質化合物に関する。
　式（II）における置換基、塩、立体異性体等の説明は、式（I）における説明として妥当する。
　すなわち、かかる実施態様において、本発明は、好ましい実施形態では、式（II)中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　R2は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R3は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R5は、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
　波線は、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線は、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す、本発明のC-グリコシド糖脂質化合物に関する。
　本発明は、別の好ましい実施態様では、式（II)中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　R2は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
　R3は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
　R5は、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
　波線は、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線は、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す、本発明のC-グリコシド糖脂質化合物に関する。
　本発明は、本形態において、好ましい実施態様として、式（II’’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 ［式中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシ基であり、
　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線は、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す。］
で示される、請求項１３記載のC-グリコシド糖脂質化合物に関する。
＜本発明C-グリコシド二糖脂質化合物の一般的な調製方法＞
　本発明は、C-グリコシド二糖脂質化合物を包含する。本発明のC-グリコシド二糖脂質化合物の調製方法は、上記のC-グリコシド単糖脂質化合物の調製手法に準じて調製することができる。
＜LNP＞
　本発明は、別の一つの形態として、本発明のC-グリコシド糖脂質化合物、ならびに（ａ）核酸分子、（ｂ）カチオン性脂質、（ｃ）凝集抑制剤（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質またはＰＥＧ修飾脂質など）、および（ｄ）ステロールを含む、脂質ナノ粒子に関する。
（ａ）核酸分子
　本明細書において、核酸分子は、核酸成分を含む、好ましくは核酸成分からなる分子である。核酸分子とは、好ましくはDNAまたはRNA分子を指す。当該用語は、好ましくは、用語「ポリヌクレオチド」の同義語として使用される。好ましくは、核酸分子は、糖／リン酸バックボーンのホスホジエステル結合によって互いに共有結合しているヌクレオチドモノマーを含むか、または当該ヌクレオチドモノマーからなるポリマーである。用語「核酸分子」は、塩基修飾、糖修飾またはバックボーン修飾などのDNAまたはRNA分子などの修飾核酸分子も包含する。
　「RNA」は、天然に存在するかまたは天然に存在しないリボ核酸を指す。例えば、RNAは、１つ以上の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカーなどの修飾された及び／または天然に存在しない成分を含み得る。RNAは、キャップ構造、鎖終止ヌクレオシド、ステムループ、ポリＡ配列、および／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。RNAは、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有し得る。例えば、RNAは、メッセンジャーRNA（ｍRNA）であり得る。
　特定のポリペプチドをコードするｍRNAの翻訳、例えば哺乳動物細胞内のｍRNAのインビボ翻訳は、コードされたポリペプチドを生成し得る。RNAは、低分子干渉RNA（siRNA）、非対称干渉RNA（asRNA）、マイクロRNA（miRNA）、ダイサー基質RNA（dsRNA）、小ヘアピンRNA（shRNA）、mRNA、およびそれらの混合物からなる非限定的な群から選択され得る。
（ｂ）カチオン性脂質
　LNPは、脂質ナノ粒子を形成するのに好適な任意のカチオン性脂質を含み得る。好ましくは、カチオン性脂質は生理的pH程度の正味の陽電荷を帯びている。
　カチオン性脂質はアミノ脂質であってもよい。本明細書で用いられる「アミノ脂質」とは、１つまたは二つの脂肪酸または脂肪アルキル鎖と、プロトン化されて生理的pHでカチオン性脂質を形成することができるアミノ頭基（アルキルアミノまたはジアルキルアミノ基を含む）とを有する脂質を含む。
　カチオン性脂質は、例えば、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウム塩化物（DODAC）、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウム臭化物（DDAB）、1,2-ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン塩化物（DOTAP）（N-（2,3-ジオレオイルオキシ）プロピル）-N,N,N-トリメチルアンモニウム塩化物および1,2-ジオレイルオキシ-3-トリメチルアミノプロパン塩化物塩としても知られる）、N-（1-（2,3-ジオレイルオキシ）プロピル）-N,N,N-トリメチルアンモニウム塩化物（DOTＭA）、N,N-ジメチル-2,3-ジオレイルオキシ）プロピルアミン（DODＭA）、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLinDＭA）、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLｅｎDＭA）、1,2-ジ-ｙ-リノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（γ-DLｅｎDＭA）、1,2-ジリノレイルカルバモイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン（DLin-C-DAP）、1,2-ジリノレイオキシ-3-（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（DLin-DAC）、1,2-ジリノレイオキシ-3-モルホリノプロパン（DLin-ＭA）、1,2-ジリノレオイル-3-ジメチルアミノプロパン（DLinDAP）、1,2-ジリノレイルチオ-3-ジメチルアミノプロパン（DLin-Ｓ-DＭA）、1-リノレオイル-2-リノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン（DLin-2-DＭAP）、1,2-ジリノレイルオキシ-3-トリメチルアミノプロパン塩化物塩（DLin-TＭA．Cl）、1,2-ジリノレオイル-3-トリメチルアミノプロパン塩化物塩（DLin-TAP．Cl）、1,2-ジリノレイルオキシ-3-（N-メチルピペラジノ）プロパン（DLin-ＭPZ）、または3-（N,N-ジリノレイルアミノ）-l,2-プロパンジオール（DLinAP）、3-（N,N-ジオレイルアミノ）-1,2-プロパンジオ（DOAP）、1,2-ジリノレイルオキソ-3-（2-N,N-ジメチルアミノ）エトキシプロパン（DLin-EＧ-DＭA）、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-［1,3］-ジオキソラン（DLin-Ｋ-DＭA）またはそのアナログ、（3ａR,5ｓ,6ａＳ）-N,N-ジメチル-2,2-ジ（（9Z,12Z）-オクタデカ-9,12-ジエニル）テトラヒドロ-3ａＨ-シクロペンタ［ｄ］［1,3］ジオキソール-5-アミン、（6Z,9Z,28Z,31Z）-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル-4-ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭC3）、1,1'-（2-（4-（2-（（2-（ビス（2-ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（2-ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン-1-イル）エチルアザネジイル）ジドデカン-2-オール（C12-200）、2,2-ジリノレイル-4-（2-ジメチルアミノエチル）-［1,3］-ジオキソラン（DLin-Ｋ-C2-DＭA）、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-［1,3］-ジオキソラン（DLin-Ｋ-DＭA）、（6Z,9Z,28Z,31Z）-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル-4-（ジメチルアミノ）ブタノエート（DLin-Ｍ-C3-DＭA）、3-（（6Z,9Z,28Z,31Z）-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,3-1-テトラエン-19-イルオキシ）-N,N-ジメチルプロパン-1-アミン（ＭC3エーテル）、4-（（6Z,9Z,28Z,31Z）-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イルオキシ）-N,N-ジメチルブタン-1-アミン（ＭC4エーテル）、またはこれらのいずれかの組み合わせ、であり得る。
　他の好適なカチオン性脂質は、国際公開番号WO09/086558、WO09/127060、WO10/048536、WO10/054406、WO10/088537、WO10/129709、およびWO2011/153493； 米国特許公開番号2011/0256175、2012/0128760、およｂ2012/0027803；米国特許番号8,158,601；およびLove et al, PNAS, 107(5), 1864-69, 2010に開示されている。
　他の好適なアミノ脂質としては、別の脂肪酸基および他のジアルキルアミノ基を有するアミノ脂質が挙げられる。当該アミノ脂質としては、そのアルキル置換基が違っている（例えば、N-エチル-N-メチルアミノ-、およびN-プロピル-N-エチルアミノ-）ものが挙げられる。一般的に、飽和アシル鎖が少ないアミノ脂質は、特に、濾過滅菌する目的のために複合体の大きさを約0.3ミクロン未満にする必要がある場合に、より簡単に大きさを調整することができる。炭素鎖長がC14～C22の範囲である不飽和脂肪酸を含むアミノ脂質を使用してもよい。アミノ脂質において、アミノ基と脂肪酸または脂肪アルキル部分とを分離するために、他の骨格を使用してもよい。
　さらに好ましい実施形態では、LNPは、特許出願PCT/EP2017/064066に記載の式（ＩＩＩ）に示すカチオン性脂質を含む。これに関して、PCT/EP2017/064066の開示も参照により本願に援用される。
　LNPは、二つ以上のカチオン性脂質を含んでもよい。カチオン性脂質は、異なる有用な特性に寄与するように選択することができる。例えば、アミンpKa、化学的安定性、循環中の半減期、組織中の半減期、組織中の正味の蓄積、または毒性などの特性が異なるカチオン性脂質をLNPに使用することができる。特に、混合LNPの特性が個々の脂質の単一LNPの特性よりも望ましくなるように、カチオン性脂質を選択することができる。
　（ｃ）凝集抑制剤
　凝集抑制剤は、凝集を抑制することが可能な脂質であってもよい。そのような脂質の例には、ポリエチレングリコール（PEG）に修飾された脂質、モノシアロガングリオシドGml、および米国特許第6,320,017号に記載のようなポリアミドオリゴマー（PAO）が含まれるが、これらに限定されない。米国特許第6,320,017号は、参照によりその全部が本願に援用される。
　凝集抑制剤には、例えば、PEG-ジアシルグリセロール（DAG）、PEG-ジアルキルグリセロール、PEG-ジアルキルオキシプロピル（DAA）、PEG-リン脂質、PEG-セラミド（Cer）、またはそれらの混合物（PEG-Cerl4またはPEG-Cer20等）が含まれるがこれらに限定されないポリエチレングリコール（PEG）脂質から選択される。PEG-DAA結合物には、例えば、PEG-ジラウリルオキシプロピル（C12）、PEG-ジミリスチルオキシプロピル（C14）、PEG-ジパルミチルオキシプロピル（C16）、またはPEG-ジステアリルオキシプロピル（C18）が含まれる。他のペグ化された脂質には、ポリエチレングリコール-ジジミリストイルグリセロール（C14-PEGまたはPEG-C14（PEGは2000Daの平均分子量を有する）（PEG-DＭG）；（R）-2，3-ビス（オクタデシルオキシ）プロピル-1-（メトキシポリ（エチレングリコール）2０００）プロピルカルバメート）（PEG-DSG）；PEG-カルバモイル-1，2-ジミリスチルオキシプロピルアミン（PEGは2000Daの平均分子量を有する）（PEG-cDＭA）；Ｎ-アセチルガラクトサミン-（（R）-2，3-ビス（オクタデシルオキシ）プロピル-1-（メトキシポリ（エチレングリコール）2000）プロピルカルバメート））（GalNAc-PEG-DＳG）；mPEG（mw2000）-ジアステアロイルホスファチジル-エタノールアミン（PEG-DSPE）；およびポリエチレングリコール-ジパルミトイルグリセロール（PEG-DPG）が含まれるが、これらに限定されない。
　いくつかの実施形態においては、凝集抑制剤はPEG-DＭGである。他の実施形態では、凝集抑制剤はPEG-c-DＭAである。
　さらに好ましい実施形態において、LNPはPEG脂質代替物を含み、PEGを含まず、および／またはホスファチジルコリン（PC）置換脂質（例えば、オレイン酸またはそのアナログ）を含む。
　さらに好ましい実施形態において、LNPは、特許出願PCT/EP2017/064066に記載の式（IV）を有する凝集抑制剤を含む。
　（ｉｉｉ）ステロール
　ステロールは、好ましくはコレステロールであってもよい。ステロールは、LNPの約10mol％～約60mol％または約25mol％～約40mol％の比率で存在してもよい。いくつかの実施形態では、ステロールは、LNP中に存在する総脂質の約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、または約60mol％の比率で存在する。
＜医薬組成物＞
　本発明は、さらなる別の一つの形態として、本発明の脂質ナノ粒子を含む、医薬組成物に関する。
　脂質ナノ粒子は、医薬組成物として全体的にまたは部分的に製剤化され得る。医薬組成物は、１つ以上の脂質ナノ粒子を含み得る。例えば、医薬組成物は、１つ以上の異なる治療薬および／または予防薬を含む１つ以上の脂質ナノ粒子を含み得る。医薬組成物は、本明細書に記載されるものなどの１つ以上の薬学的に許容される賦形剤または補助成分をさらに含み得る。任意の従来の賦形剤または補助成分が、ナノ粒子組成物の１つ以上の成分と不適合である場合を除いて、従来の賦形剤および補助成分が、任意の医薬組成物において使用され得る。賦形剤または補助成分は、脂質ナノ粒子の成分とのその組み合わせが、何らかの望ましくない生物学的作用、または他の形の有害な作用をもたらし得る場合、脂質ナノ粒子の成分と不適合であり得る。
　いくつかの実施形態では、１つ以上の賦形剤または補助成分は、脂質ナノ粒子を含む医薬組成物の総質量または体積の５０％超を構成し得る。例えば、１つ以上の賦形剤または補助成分は、医薬品の慣例の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上を構成し得る。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋である。いくつかの実施形態では、賦形剤は、ヒトへの使用および獣医学用途のために承認されている。
　本開示に係る医薬組成物中の１つ以上の脂質ナノ粒子、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、および／または任意のさらなる成分の相対量は、治療対象の属性、サイズ、および／または状態に応じて、さらには、組成物が投与される経路に応じて変化する。例として、医薬組成物は、０．１％～１００％（ｗｔ／ｗｔ）の１つ以上の脂質ナノ粒子を含み得る。
　１つ以上の脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子および／または医薬組成物は、１つ以上の特定の細胞、組織、器官、またはそれらの系もしくは群（腎臓系など）への治療薬および／または予防薬の送達によって提供される治療効果から利益を受け得る患者または対象を含む任意の患者または対象に投与され得る。脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子および医薬組成物の本明細書において提供される説明は、主に、ヒトへの投与に好適な組成物に関するが、このような組成物は、一般に、任意の他の哺乳動物への投与に好適であることが当業者によって理解されよう。組成物を様々な動物への投与に好適にするための、ヒトへの投与に好適な組成物の修飾は、十分に理解されており、通常の獣医学薬理学者は、もしあれば単なる通常の実験を用いて、このような修飾を設計および／または実施することができる。組成物の投与が想定される対象としては、限定はされないが、ヒト、他の霊長類、およびウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／またはラットなどの商業的に価値のある哺乳動物を含む他の哺乳動物が挙げられる。
　１つ以上の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物は、薬理学分野において公知であるかまたは今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、このような調製方法は、活性成分を、賦形剤および／または１つ以上の他の補助成分と結合させる工程と、次に、望ましい場合または必要に応じて、生成物を、所望の単回または複数回投与単位に、分割、成形および／または包装する工程とを含む。
　本開示に係る医薬組成物は、単一単位用量、および／または複数の単一単位用量として、調製、包装、および／または大量販売され得る。本明細書で使用する場合、「単位用量」は、所定の量の活性成分（例えば、脂質ナノ粒子）を含む医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は、一般に、対象に投与され得る活性成分の投与量、および／またはこのような投与量の好都合な割合、例えば、このような投与量の２分の１もしくは３分の１に等しい。
　医薬組成物は、様々な投与経路および方法に好適な様々な形態で調製され得る。例えば、医薬組成物は、液体剤形（例えば、乳剤、マイクロエマルション、ナノ乳剤、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤）、注射用形態、固体剤形（例えば、カプセル、錠剤、丸剤、粉剤、および顆粒剤）、局所および／または経皮投与のための剤形（例えば、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉剤、溶液、スプレー、吸入剤、およびパッチ剤）、懸濁液、粉剤、および他の形態で調製され得る。
　経口および非経口投与のための液体剤形としては、限定はされないが、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルション、ナノ乳剤、溶液、懸濁液、シロップ、および／またはエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加えて、液体剤形は、当該技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、およびそれらの混合物を含み得る。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、さらなる治療薬および／または予防薬、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味料、香味料、および／または芳香剤などのさらなる薬剤を含み得る。非経口投与のための特定の実施形態では、組成物は、クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはそれらの組み合わせなどの可溶化剤と混合される。
　注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液が、好適な分散剤、湿潤剤、および／または懸濁化剤を用いて、公知の技術に従って製剤化され得る。滅菌注射用製剤は、例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液のような、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤および／または溶媒中の滅菌注射用溶液、懸濁液、および／または乳剤であり得る。用いられ得る許容可能なビヒクルおよび溶媒の中でも、水、リンゲル液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。滅菌固定油は、通常、溶媒または懸濁媒体として用いられる。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性固定油が用いられ得る。オレイン酸などの脂肪酸が、注射薬の調製に使用され得る。
　注射用製剤は、例えば、細菌捕捉フィルタを介した濾過によって、および／または使用前に滅菌水または他の滅菌注射用媒体に溶解または分散され得る滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって滅菌され得る。
　本発明の医薬組成物は、感染症、または新生物、例えば、癌または腫瘍疾患、血液および血液形成器官の疾患、内分泌、栄養摂取および代謝疾患、神経系の疾患、循環器系の疾患、呼吸器系の疾患、消化器系の疾患、皮膚および皮下組織の疾患、筋骨格系および結合組織の疾患、ならびに、泌尿生殖器系の疾患などの遺伝性または後天性疾患（遺伝性であるかまたは後天性であるかは問わない）を治療するために利用することができる。
　有利には、核酸分子にコードされる治療的（ポリ）ペプチドまたはタンパク質には、その発現によって、遺伝性または後天性疾患を予防、改善、または治癒することができる任意の（ポリ）ペプチドまたはタンパク質が含まれる。このような（ポリ）ペプチドまたはタンパク質は、原則として、任意の好適な生物学的作用または機能を発揮することによって、それらの治療的機能を発揮し得る。いくつかの実施形態では、このような（ポリ）ペプチドまたはタンパク質は、好ましくは欠如、欠損または変異タンパク質を置換することによって、および／または免疫またはアレルゲン性応答を誘導することによって作用しなくてもよい。例えば、感染症または新生物などの遺伝性または後天性疾患を治療するのに有利な（ポリ）ペプチドまたはタンパク質は、以下から選択される後天性または遺伝性の代謝または内分泌障害の治療において特に有利な特に好ましい治療的タンパク質を含み得る。
　核酸分子にコードされる治療的（ポリ）ペプチドまたはタンパク質の具体的として、例えば治療対象がウイルス疾患の場合、SARS-CoV-2ウイルス、インフルエンザウイルス、デングウイルスなどの感染症を引き起こすウイルスに特徴的なタンパク質またはペプチドを挙げることができる。
　本発明において、「処置する」の用語は、別段指定されない限り、このような用語が適用される障害もしくは状態、またはこのような障害もしくは状態の１つまたは複数の症状を、逆転する、軽減する、その進行を阻害する、または防止することを意味する。一つの実施形態では、「処置」の用語は、ウイルス感染症の症状を軽減もしくは排除する、および／または個体におけるウイルス負荷を低減するための、本発明の化合物または組成物の投与を意味する。処置は、予防的措置として疾患または状態の発症前に施してもよいし、あるいはまた、処置は、疾患の発症後に施してもよい。
　「予防する」は、疾患または状態の臨床症状を生じさせないようにする、疾患または状態の任意の処置を意味する。「予防」の用語はまた、疾患の症状の出現を防止する、および／またはウイルスが血中で検出可能なレベルに達するのを防止するための、ウイルスへの個体の曝露前の治療有効量の本発明による化合物または組成物の投与（例えば、曝露前予防）を包含する。
　本発明において医薬組成物とは、通常、疾患の処置もしくは予防、あるいは検査・診断のための薬剤を意味する。
　好ましい実施形態として、ワクチンを挙げることができる。ワクチンは、SARS、SARS-CoV-2、MARSなどのコロナウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ヒトパピローマウイルス（HPV）、狂犬病、髄膜炎、百日咳、破傷風、肝炎、および結核などの感染症に関連する１つまたはそれ以上の病態に対して免疫を与えることが可能な化合物および調製物を含み、感染症に由来する抗原および／またはエピトープをコードするmRNAを含み得る。ワクチンは、癌細胞に対して免疫応答を指令し、腫瘍細胞に由来する抗原、エピトープ、および／またはネオエピトープをコードするmRNAを含み得る化合物および調製物も含み得る。
　本発明は別の態様として、SARS、SARS-CoV-2、MARSなどのコロナウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ヒトパピローマウイルス（HPV）、狂犬病、髄膜炎、百日咳、破傷風、肝炎および結核などの感染症、または各種の癌を処置もしくは予防するための方法であって、本発明の脂質ナノ粒子、それを含有する医薬組成物および／またはワクチンを、そのような処置等を必要としている対象に投与することを含む方法に関する。
　さらに、本発明は別の態様として、SARS、SARS-CoV-2、MARSなどのコロナウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ヒトパピローマウイルス（HPV）、狂犬病、髄膜炎、百日咳、破傷風、肝炎および結核などの感染症、または各種の癌を処置もしくは予防するための本発明の脂質ナノ粒子、それを含有する医薬組成物および／またはワクチンに関する。
　本発明はさらなる別の態様として、SARS、SARS-CoV-2、MARSなどのコロナウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ヒトパピローマウイルス（HPV）、狂犬病、髄膜炎、百日咳、破傷風、肝炎および結核などの感染症、または各種の癌を処置もしくは予防するための医薬を製造するための、本発明の脂質ナノ粒子、それを含有する医薬組成物および／またはワクチンの使用に関する。
　以下、本発明を実施例により、詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでなく、単なる例示であることに留意すべきである。
実施例１：化合物14-Zα
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 実施例２：化合物14E-β
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
実施例３：化合物14-Eα
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 実施例４の１：化合物14-Zβ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
調製例１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　窒素雰囲気下、ジオール1（2.55 g, 6.53 μmol）、ピリジン（3.2 mL, 39 mmol）、N,N-ジメチルアミノピリジンのCH2Cl2溶液（30 mL）を氷冷下、トリホスゲン（1.16 g, 3.92 mmol）のCH2Cl2溶液（50 mL）を滴下した。0 ℃で30分攪拌し、反応溶液を、氷冷した飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に流し込んだ。CH2Cl2で抽出し、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン/酢酸エチル = 1/2）で精製し、化合物2（2.14 g, 79%）を白色結晶として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7.73-7.69 (m, 2H), 7.44-7.40 (m, 1H), 7.38-7.33 (m, 2H), 7.23-7.19 (m, 2H), 6.88-6.84 (m, 2H), 5.48 (s, 1H), 4.94 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 4.60-4.58 (m, 1H), 4.52 (dd, J = 11.7, 9.3 Hz, 1H), 4.43 (dd, J = 12.7, 1.0 Hz, 1H), 4.34 (dd, J = 11.7, 2.4 Hz, 1H), 4.08 (dd, J = 12.7, 2.0 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.65-3.63 (m, 1H); HRMS (ESI) C21H20O7SNaとして: 理論値：439.0827、実測値：439.0838 (M + Na)+.
調製例２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　化合物2（4.82 g, 11.6 mmol）にTHF（5 mL）、酢酸（40 mL）、水（5 mL）の混合溶媒を室温で加え溶解させた。室温で12時間攪拌し、反応溶液を酢酸エチルで希釈した後、飽和重曹水を加えた。pHが10以上になったことを確認し、酢酸エチルで抽出した。飽和食塩水で有機層を洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン/酢酸エチル = 1/3）で精製し、化合物3（2.71 g, 79%）を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7.61-7.57 (m, 2H), 7.41-7.33 (m, 3H), 4.94 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 4.57-4.55 (m, 1H), 4.53 (dd, J = 11.2, 9.8 Hz, 1H), 4.29 (dd, J = 11.2, 2.4 Hz, 1H), 4.02-3.98 (m, 2H), 3.73-3.69 (m, 1H), 3.12 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 2.04 (t, J = 6.3 Hz, 1H); HRMS (ESI) C13H14O6SNaとして: 理論値：321.0409、実測値：321.0413 (M + Na)+.
調製例３
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　窒素雰囲気下、化合物3（1.70 g, 5.70 mmol）のピリジン溶液（30 mL）を氷冷下、無水酢酸（5.4 mL）を滴下した。室温で30分攪拌し、反応溶液を酢酸エチルで希釈した後、氷冷した飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に流し込んだ。酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン/酢酸エチル = 1/1）で精製し、化合物4（2.14 g, 98%）を無色油状物質として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7.60-7.58 (m, 2H), 7.41-7.34 (m, 3H), 5.64 (dd, J = 2.8, 1.2 Hz, 1H), 4.94 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.39 (dd, J = 11.3, 2.8 Hz, 1H), 4.32 (dd, J = 11.3, 9.5 Hz, 1H), 4.18 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 4.05 (dt, J = 6.4, 1.2 Hz, 1H), 2.10 (s, 3H), 2.06 (s, 3H); ESI-MS: m/z C17H18O8SNaとして: 理論値：405.0615;、実測値：405.0612 (M + Na)+.
調製例４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　スターラーバー、セプタム、還流管を装着した二口フラスコに、窒素雰囲気下、化合物4（2.67 g, 6.98 mmol）の1,2-ジクロロエタン溶液（56 mL）を調製した。活性化したMS3A（2.67 g）とHBrのジクロロメタン溶液（1 M, 17.5 mL, 17.5 mmol）を室温で加え、反応溶液を90 ℃のオイルバスで加熱した。19時間加熱還流した後、室温に冷却した反応溶液をセライトで濾過し、セライトをジクロロメタンで洗浄した。ろ液を1 Mチオ硫酸ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン/酢酸エチル = 1/1）で精製し、化合物5（1.85 g, 75%）を白色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3): 6.67 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 5.74-5.72 (m, 1H), 4.94 (dd, J = 11.2, 2.9 Hz, 1H), 4.67 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 1H), 4.33 (ddd, J = 6.8, 6.3, 1.5 Hz, 1H), 4.24 (dd, J = 11.7, 6.3 Hz, 1H), 4.13 (dd, J = 11.7, 6.8 Hz, 1H), 2.19 (s, 3H), 2.08 (s, 3H); ESI-MS: m/z C11H13BrO8Naとして: 理論値：374.9686;、実測値：374.9685 (M + Na)+.
調製例５
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　窒素雰囲気下、ジオール6（200 mg, 510 μmol）とEt3N（260 μL, 1.9 mmol）のCH2Cl2溶液（1.7 mL）を氷冷下、トリホスゲン（110 mg, 380 μmol）のCH2Cl2溶液（600 μL）を滴下した。0 ℃で30分攪拌し、反応溶液を氷冷した飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に流し込んだ。CH2Cl2で抽出し、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン/酢酸エチル = 1/2）で精製し、化合物7（210 mg, quant.）を白色結晶として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ7.59-7.57 (m, 2H), 7.43-7.36 (m, 5H), 6.88 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 5.52 (s, 1H), 4.96 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 4.48 (t, J = 10.4, 1H), 4.39 (dd, J = 4.9, 10.4 Hz, 1H), 3.95 (dd, 8.9, 9.5 Hz, 1H), 3.88 (td, J = 4.9, 10.1 Hz, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.61 (td, J = 4.6, 8.9 Hz, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 160.3, 152.4, 134.8 (2C), 129.5, 129.3 (2C), 128.6, 128.4. 127.4 (2C), 113.7 (2C), 101.3, 83.5, 80.9, 78.2, 77.2, 72.8, 68.1, 55.3; ESI-MS: m/z C21H20O7SNaとして: 理論値：439.0827、実測値：439.0809 (M + Na)+.
調製例６
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　化合物7（4.82 g, 11.6 mmol）にTHF（5 mL）、酢酸（40 mL）、水（5 mL）の混合溶媒を室温で加え溶解させた。室温で12時間攪拌し、反応溶液を酢酸エチルで希釈した後、飽和重曹水を加えた。pHが10以上になったことを確認し、酢酸エチルで抽出した。飽和食塩水で有機層を洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン/酢酸エチル = 1/3）で精製し、化合物8（2.71 g, 79%）を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.62-7.58 (m, 2H), 7.38-7.34 (m, 3H), 5.16 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 4.44 (dd, J = 9.8, 11.3 Hz, 1H), 3.96 (dd, J = 9.8, 11.3 Hz, 1H), 3.91-3.86 (m, 2H), 3.75 (dd, J = 5.6, 12.2 Hz, 1H), 3.47 (ddd, J = 2.1, 5.2, 8.9 Hz, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 155.2, 134.3 (2C), 132.3, 130.1 (2C), 129.5, 86.4, 84.0, 83.8, 78.0, 68.6, 61.8; HRMS (ESI) C13H14O6SNaとして: 理論値：321.0409、実測値：321.0389 (M + Na)+.
調製例７
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　窒素雰囲気下、化合物8（1.70 g, 5.70 mmol）のピリジン溶液（30 mL）を氷冷下、無水酢酸（5.4 mL）を滴下した。室温で30分攪拌し、反応溶液を酢酸エチルで希釈した後、氷冷した飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に流し込んだ。酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン/酢酸エチル = 1/1）で精製し、化合物9（2.14 g, 98%）を無色油状物質として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.61-7.58 (m, 2H), 7.44-7.40 (m, 1H), 7.38-7.34 (m, 2H), 5.20 (dd, J = 9.2, 10.1 Hz, 1H), 4.88 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.34 (dd, J = 10.1, 11.0 Hz, 1H), 4.29 (dd, J = 2.1, 12.5 Hz, 1H), 4.20 (dd, J = 4.6, 12.5 Hz, 1H), 3.85 (dd, J = 9.5, 11.0, 1H), 3.78 (ddd, J = 2.1, 4.6, 9.2 Hz, 1H), 2.11 (s, 3H), 2.09 (s, 3H) ; 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 170.4, 168.9, 152.1, 135.3 (2C), 129.6, 129.1 (2C), 128.1, 82.4, 82.0, 77.2, 75.7, 67.1, 61.6, 20.7, 20.6; ESI-MS: m/z C17H18O8SNaとして: 理論値：405.0615;、実測値：405.0618 (M + Na)+.
調製例８
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　スターラーバー、セプタム、還流管を装着した二口フラスコに、窒素雰囲気下、化合物9（2.92 g, 7.64 mmol）の1,2-ジクロロエタン溶液（100 mL）を調製した。活性化したMS3A（3.0 g）とHBrのジクロロメタン溶液（1 M, 38.2 mL, 38.2 mmol）を室温で加え、反応溶液を85 ℃のオイルバスで加熱した。4時間加熱還流した後、室温に冷却した反応溶液をセライトで濾過し、セライトをジクロロメタンで洗浄した。ろ液を1 Mチオ硫酸ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン/酢酸エチル = 1/1）で精製し、化合物10（2.16 g, 80%）を白色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 6.61 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 5.46 (t, J = 9.8 Hz, 1H), 4.34 (t, J = 3.4 Hz, 1H), 4.31 (dd, J = 1.8, 4.0 Hz, 1H), 4.19 (dd, J = 12.8, 2.1 Hz, 1H), 4.8 (ddd, J = 1.8, 4.0, 9.5 Hz, 1H), 2.15 (s, 3H), 2.10 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 170.3, 168.8, 151.6, 80.5, 78.5, 76.6, 73.7, 66.6, 60.5, 20.6, 20.5; ESI-MS: m/z C11H13BrO8Naとして: 理論値：374.9686;、実測値：374.9683 (M + Na)+.
調製例９
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　スターラーバー、セプタムを装着した100 mLフラスコ中、窒素雰囲気下、化合物11a（1.02 g, 2.32 mmol）を1,2-ジクロロエタン（11 mL）、ジメチルスルホキシド（11 mL）に溶解し、2-ヨードキシ安息香酸（IBX, 847 mg, 3.02 mmol）を室温で加えた。3時間室温で撹拌した後、反応溶液にヘキサン（30 mL）と精製水（30 mL）を順に加え、生じた白色固体をセライトで濾過し、セライトをヘキサンで洗浄した。ろ液の水層をヘキサンで抽出後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒を減圧留去して得た残渣を、100 mLフラスコに移して溶媒を留去し真空ポンプで1時間乾燥させた。100 mLフラスコにスターラーバーとセプタムを装着し、窒素雰囲気下、THF（24 mL）、トリブロモフルオロメタン（1.2 mL, 4.6 mmol）、トリフェニルホスフィン（1.22 g, 4.65 mmol）を加えた。調整した溶液に、ジエチル亜鉛THF溶液（1 M, 4.6 mL, 4.6 mmol）を10分間かけて滴下した。反応溶液を室温で2時間撹拌した後、メタノール（10 mL）をゆっくり滴下した。気体の発生が終わった後、精製水（30 mL）を加え、ヘキサンで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、乾燥剤をろ別した。溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン）で精製し、化合物12a（1.05 g, 85%）を白色固体として得た。
化合物12a: 
1H NMR (500 MHz, CDCl3): 5.20 (dd, J = 14.0, 10.4 Hz, 1/2H, Z), 4.74 (dd, J = 31.4, 10.4 Hz, 1/2H, E), 2.44 (m, 1/2H, E), 2.10 (m, 1/2H, Z), 1.45-1.10 (m, 52H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 6H).
　上記と同様の手法により、化合物11b（500 mg, 907 μmol）を化合物12b（444 mg, 76%）に、化合物11c（770 mg, 2.36 mmol）を化合物12c（779 mg, 79%）に、そして化合物11d（2.84 g, 6.21 mmol）を化合物12d（1.78 g, 52%）に変換した。
化合物12b: 
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 5.20 (dd, J = 14.0, 10.1 Hz, 1/2H, Z), 4.74 (dd, J = 31.4, 10.4 Hz, 1/2H, E), 2.48-2.39 (m, 1/2H, E), 2.15-2.05 (m, 1/2H, Z), 1.45-1.08 (m, 68H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H).
化合物12c: 
1H NMR (500 MHz, CDCl3): 5.21 (dd, J = 13.9, 10.0 Hz, 1/2H, Z), 4.75 (dd, J = 31.7, 10.2 Hz, 1/2H, E), 2.44 (m, 1/2H, E), 2.11 (m, 1/2H, E), 1.40-1.17 (m, 36H), 0.88 (t, J = 7.1 Hz, 6H).
化合物12d: 
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 5.70 (t, J = 10.2 Hz, 1/2H), 5.22 (dd, J = 31.0, 7.8 Hz, 1/2H), 4.87 (s, 1H), 4.51 (s, 1/2H), 4.28 (s, 1/2H), 4.19-4.07 (m, 2H), 
1.64-1.49 (m, 4H), 1.46 (s, 3H), 1.44 (s, 3H), 1.34-1.20 (m, 22), 1.32 (br, 9H), 0.86 (t, J = 7.0 Hz, 3H); 19F NMR (471 MHz, CDCl3): -66.87 (d, J = 10.2 Hz, Z-isomer), -68.26 (d, J = 31.2 Hz, E-isomer); ESI-MS (m/z) C27H49BrFNNaO4として理論値：572.2727; 実測値：572.2738 (M + Na)+.
実施例１から実施例４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　スターラーバーを装着した20 mLスクリューキャップバイアルに、窒素雰囲気下、塩化ニッケル（II）ジメトキシエタン錯体（6.2 mg, 28.2 μmol）と2,10-ジ-tert-ブチルビピリジル（dtbpy, 8.3 mg, 31.0μmol）のMeCN溶液（3 mL）を調製して密封し、5分間超音波をかけた。窒素気流下MeCNを留去し、化合物5（299 mg, 846 μmol）、化合物12a（E/Z = 1:1.1, 150 mg, 282 μmol）、(Ir[dF(CF3)ppy]2(dtbpy))PF6 (15.8 mg, 14.1 μmol)を加え、続いて酢酸エチル（2.8 mL）、2,4,6-コリジン（110 μL, 850 μmol）、トリストリメチルシリルシラノール（260 μL, 850 μmol）を順に加え、密栓をした。青色LED（Kessil Tuna Blue (465 nm)）照射下、24時間撹拌した後、光照射を止め、反応溶液をセライトで濾過し、セライトを酢酸エチル/ヘキサン = 1/3の混合溶媒で洗浄したで洗浄した。溶媒を減圧留去して得た残渣を循環式ゲルろ過精製装置（HP-GPC）（溶離液：クロロホルム）で精製し、カップリング生成物13を異性体混合物として得た。混合物をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン/酢酸エチル = 90/10 → 65/35）で精製し、化合物13-Eα (31.4 mg, 32%)、化合物13-Eβと化合物13-Zαの混合物 (99.9 mg, Eβ:Zα = 22:78, Eβ (23%), Zα (73%))、化合物13-Zβ (7.5 mg, 7.0%)をそれぞれ得た。
　撹拌子を装着した20 mLフラスコ中、窒素雰囲気下、化合物13-Eα (31.4 mg, 43.3 μmol)のメタノール（4 mL）溶液を調製し、ナトリウムメトキシド（2.8 mg, 52 μmol）を加えた。16時間撹拌した後、反応溶液にAmberlite IRC-120を加え1分間撹拌し、固体をろ別した。ろ液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン/酢酸エチル/メタノール = 10/20/1）で精製し、化合物14-Eα（21.9 mg, 82%）を白色固体として得た。
　同様に、化合物13-Eβと化合物13-Zαの混合物 (99.9 mg, 140 μmol, Eβ:Zα = 22:78）をナトリウムメトキシドで加溶媒分解し、HPLC（溶離液：ヘキサン/酢酸エチル/メタノール = 10/40/1）で精製することで、化合物14-Eβ（16.6 mg, 90%）と化合物14-Zα（59.4 mg, 88%）をそれぞれ得た。また、化合物13-Eβ (7.5 mg, 10 μmol)をナトリウムメトキシドで加溶媒分解し、シリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム/メタノール = 80:20）で精製することで、化合物14-Zβ（6.1 mg, 100%）を得た。
実施例３：化合物14-Eα
1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD = 9/1): 5.07 (dd, J = 25.0, 11.0 Hz, 1H), 4.78 (dd, J = 36.0, 6.7 Hz, 1H), 4.03－3.97 (m, 2H), 3.94－3.89 (m, 1H), 3.83－3.78 (m, 1H), 3.74 (dd, J = 11.6, 4.9 Hz, 1H), 3.69 (dd, J = 11.6, 5.8 Hz, 1H), 2.11－2.00 (m, 1H), 1.40－1.10 (m, 52H), 0.83 (t, J = 7.0 Hz, 6H); ESI-MS: m/z C37H71FNaO5として: 理論値：637.5183;、実測値：637.5151 (M + Na)+.
実施例２：化合物14-Eβ
1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD = 9/1): 5.10 (dd, J = 22.3, 10.7 Hz, 1H), 3.99-3.96 (m, 1H), 3.94-3.86 (m, 2H), 3.80 (dd, J = 11.9, 5.8 Hz, 1H), 3.73 (dd, J = 11.9, 5.2 Hz, 1H), 3.51-3.46 (m, 2H), 2.12-2.02 (m, 1H), 1.40－1.10 (m, 52H), 0.84 (t, J = 7.0 Hz, 6H); ESI-MS: m/z C37H71FNaO5として: 理論値：637.5183;、実測値：637.5150 (M + Na)+.
実施例１：化合物14-Zα
1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD = 9/1): 4.74 (dd, J = 38.5, 10.4 Hz, 1H), 4.46 (dd, J = 24.4, 6.1 Hz, 1H), 4.01-3.97 (m, 2H), 3.87 (ddd, J = 1.2, 3.4, 13.1 Hz, 1H), 3.84-3.80 (m, 1H), 3.76 (dd, J = 11.6, 5.5 Hz, 1H), 3.69 (dd, J = 11.3, 5.5 Hz, 1H), 2.49-2.39 (m, 1H), 1.38-1.08 (m, 52H), 0.83 (t, J = 6.7 Hz, 6H); ESI-MS: m/z C37H71FNaO5として: 理論値：637.5183;、実測値：637.5149 (M + Na)+.
実施例４の１：化合物14-Zβ
1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD = 9/1): 4.66 (dd, J = 37.2, 10.1 Hz, 1H), 3.91-3.89 (m, 1H), 3.79-3.73 (m, 2H), 3.69 (dd, 11.6, 5.5 Hz, 1H), 3.57 (dd, J = 21.7, 9.8 Hz, 1H), 3.49-3.46 (m, 1H), 3.43 (dd, J = 9.5, 3.4 Hz, 1H), 2.49-2.40 (m, 1H), 1.40-1.10 (m, 52H), 0.83 (t, J = 7.2 Hz, 6H); ESI-MS: m/z C37H71FNaO5として: 理論値： 637.5183;、実測値：637.5151 (M + Na)+.
実施例４の２および実施例４の３
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　20 mLスクリューキャップバイアルに、窒素雰囲気下、塩化ニッケル（II）ジメトキシエタン錯体（5.2 mg, 24 μmol）と2,10-ジ-tert-ブチルビピリジル（dtbpy, 7.0 mg, 26 μmol）のMeCN溶液（3 mL）を調製して密封し、5分間超音波をかけた。窒素気流下、MeCNを留去し、スターラーバー、化合物5（130 mg, 360 μmol）、化合物12c（E/Z = 1:1, 50 mg, 120 μmol）、(Ir[dF(CF3)ppy]2(dtbpy))PF6 (6.7 mg, 6.0 μmol)を加え、続いて酢酸エチル（1.2 mL）、2,4,6-コリジン（47 μL, 360 μmol）、トリストリメチルシリルシラノール（110 μL, 360 μmol）を順に加え、密栓をした。青色LED（Kessil Tuna Blue (465 nm)）照射下、24時間撹拌した後、光照射を止め、反応溶液をセライトで濾過し、セライトを酢酸エチル/ヘキサン = 1/3の混合溶媒で洗浄したで洗浄した。溶媒を減圧留去して得た残渣を循環式ゲルろ過精製装置（HP-GPC）（溶離液：クロロホルム）で精製し、カップリング生成物の化合物13-C10を異性体混合物（171 mg）および不純物を含む化合物13-C10-Zβ（21.7 mg）として得た。
　撹拌子を装着した10 mLフラスコ中、窒素雰囲気下、化合物13-C10の異性体混合物（171 mg）のメタノール（8 mL）溶液を調製し、ナトリウムメトキシド（25.5 mg, 471 μmol）を加えた。16時間撹拌した後、反応溶液にAmberlite IRC-120を加え1分間撹拌し、固体をろ別した。ろ液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン/酢酸エチル/メタノール = 10/20/1）で精製し、化合物14-C10-Zα（80.5 mg, 64%）を白色固体として得た。
　同様に、不純物を含む化合物13-C10-Zβ（21.7 mg）をナトリウムメトキシド（3.2 mg、60 μmol）で加溶媒分解し、HPLC（溶離液：クロロホルム/メタノール = 90:10）で精製することで、化合物14-C10-Zβ（5.3 mg, 35%）を得た。
実施例４の２：化合物14-C10-Z α
1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD = 9/1): 5.07 (dd, J = 25.0, 11.0 Hz, 1H), 4.78 (dd, J = 36.0, 6.7 Hz, 1H), 4.03－3.97 (m, 2H), 3.94－3.89 (m, 1H), 3.83－3.78 (m, 1H), 3.74 (dd, J = 11.6, 4.9 Hz, 1H), 3.69 (dd, J = 11.6, 5.8 Hz, 1H), 2.11－2.00 (m, 1H), 1.40－1.10 (m, 52H), 0.83 (t, J = 7.0 Hz, 6H); ESI-MS: m/z C29H55FNaO5として: 理論値：525.3931;、実測値：525.3925 (M + Na)+.
実施例４の３：化合物14-C10-Z β
1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD = 9/1): 4.67 (dd, J = 37.4, 10.2 Hz, 1H), 3.95 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 3.84-3.77 (m, 2H), 3.74 (dd, J = 11.9, 4.9 Hz, 1H), 3.58 (dd, J = 21.7, 9.8 Hz, 1H), 3.51-3.45 (m, 2H), 2.50-2.41 (m, 1H), 1.34-1.13 (m, 36H), 0.84 (t, J = 6.9 Hz, 6H); ESI-MS: m/z C29H55FNaO5として: 理論値：525.3931;、実測値：525.3927 (M + Na)+.
実施例５：化合物15α
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　スターラーバー、セプタムを装着した二口フラスコに、化合物14-Zα（31.2 mg, 50.7 μmol）とトリエチルアミン（14 μL, 100 μmol）の酢酸エチル溶液（2.0 mL）を調製した。白金炭素（Pt 5 wt%, 62.4 mg）を室温で加え、セプタムを三方コックに付け替えた。反応容器を水素置換し、24時間撹拌した後、反応溶液をセライトで濾過し、セライトをクロロホルム/メタノール = 9/1で洗浄した。溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム/メタノール = 9/1）で精製し、化合物15α（25.4 mg, 84%）を白色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD = 20:1): 4.00-3.92 (m, 3H), 3.83 (dd, J = 11.6, 5.5 Hz, 1H), 3.75 (dd, J = 11.6, 4.9 Hz, 1H), 3.64 (dd, J = 8.9, 3.4 Hz, 1H), 3.61-3.57 (m, 1H), 1.58-1.14 (m, 57H), 0.85 (t, J = 6.7 Hz, 6H); ESI-MS: m/z C37H74NaO5として: 理論値：621.5428;、実測値：621.5402 (M + Na)+.
実施例６：化合物15β
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　スターラーバー、セプタムを装着した二口フラスコに、化合物14-Eβ（3.2 mg, 5.2 μmol）とトリエチルアミン（3.6 μL, 26 μmol）の酢酸エチル溶液（1.0 mL）を調製した。ロジウムアルミナ（Rh 5 wt%, 7.0 mg）を室温で加え、セプタムを三方コックに付け替えた。反応容器を水素置換し、17時間撹拌した後、反応溶液をセライトで濾過し、セライトをクロロホルム/メタノール = 9/1で洗浄した。溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム/メタノール = 9/1）で精製し、化合物15β（1.7 mg, 55%）を白色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD = 20:1): 3.92 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 3.78 (dd, J = 11.6, 5.8 Hz, 1H), 3.70 (dd, J = 11.6, 5.2 Hz, 1H), 3.42-3.37 (m, 2H), 3.08-3.01 (m, 1H), 1.84-1.76 (m, 1H), 1.60-1.50 (m, 2H), 1.48-1.35 (m, 2H), 1.29-1.15 (m, 52H), 1.05-0.93 (m, 1H), 0.83 (t, J = 7.0 Hz, 6H); ESI-MS: m/z C37H74NaO5として: 理論値：621.5428;、実測値：621.5406 (M + Na)+.
実施例７から１０
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　スターラーバーを装着した3 mLスクリューキャップバイアルに、窒素雰囲気下、塩化ニッケル（II）ジメトキシエタン錯体（4.1 mg, 19 μmol）と2,10-ジ-tert-ブチルビピリジル（dtbpy, 5.5 mg, 20 μmol）のMeCN溶液（2 mL）を調製して密封し、5分間超音波をかけた。窒素気流下、MeCNを留去し、化合物10（100 mg, 280 μmol）、化合物12a（E/Z = 1.1:1, 50.0 mg, 94 μmol）、(Ir[dF(CF3)ppy]2(dtbpy))PF6 (5.3 mg, 4.7 μmol)を加え、続いて酢酸エチル (1.9 mL)、トリエチルアミン (29 μL, 280 μmol)、トリストリメチルシリルシラノール（75 μL, 280 μmol）を順に加え、密栓をした。同様のバイアルを合計6つ調製し（合計で300 mgの12を使用）、青色LED（Kessil Tuna Blue (465 nm)）を照射した。24時間撹拌した後、光照射を止め、すべての反応溶液をまとめてセライトで濾過し、セライトを酢酸エチル/ヘキサン = 1/3の混合溶媒で洗浄したで洗浄した。溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン/酢酸エチル = 82/18 → 60/40）で精製し、不純物を含む化合物16-Eα、化合物16-Eβおよび化合物16-Zαの混合物 (218 mg)と不純物を含む化合物16-Zβ（33.5 mg）をそれぞれ得た。
　撹拌子を装着した20 mLフラスコ中、窒素雰囲気下、化合物16-Eα、化合物16-Eβ、化合物16-Zαの混合物のメタノール（15 mL）溶液を調製し、ナトリウムメトキシド（32.5 mg, 601 μmol）を加えた。16時間撹拌した後、反応溶液にAmberlite IRC-120を加え1分間撹拌し、固体をろ別した。ろ液を濃縮し、 HPLC（溶離液：ヘキサン/酢酸エチル/メタノール = 20/40/1）で精製し、化合物17-Eα（13.8 mg, 8%, 2 steps）、化合物17-Eβ（9.0 mg, 6%, 2 steps）、および化合物17-Zα（114 mg, 63%, 2 steps）を白色固体として得た。
　同様に、不純物を含む化合物16-Zβをナトリウムメトキシド（5.0 mg, 92 μmol）で加溶媒分解し、シリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム/メタノール = 9/1）で精製することで、化合物17-Zβ（10.9 mg, 6%, 2 steps）を得た。
実施例７：化合物17-Eα
1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD = 20:1): 5.08 (dd, J = 24.7, 10.7 Hz, 1H), 4.72 (dd, J = 35.1, 7.0 Hz, 1H), 3.85 (ddd, J = 9.5, 9.5, 3.4 Hz, 1H), 3.75-3.67 (m, 3H), 3.62-3.56 (m, 1H), 3.45-3.39 (m, 1H), 2.05 (brs, 1H), 1.40-1.08 (m, 52H), 0.83 (t, J = 7.0 Hz, 6H); ESI-MS: m/z C37H71FNaO5として: 理論値：637.5183;、実測値：637.5151 (M + Na)+.
実施例８：化合物17-Eβ
1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD = 20:1): 5.09 (dd, J = 22.3, 11.0 Hz, 1H), 3.96 (dd, J = 25.9, 9.8 Hz, 1H), 3.78 (dd, J = 12.2, 3.1 Hz, 1H), 3.72 (dd, J = 12.2, 4.0 Hz, 1H), 3.59 (dd, J = 8.5 Hz, 1H), 3.49-3.40 (m, 2H), 3.26 (ddd, J = 8.5, 4.0, 3.1 Hz, 1H), 2.06 (brs, 1H), 1.40-1.10 (m, 52H), 0.83 (t, J = 6.7 Hz, 6H); ESI-MS: m/z C37H71FNaO5として: 理論値：637.5183;、実測値：637.5141 (M + Na)+.
実施例９：化合物17-Zα
1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD = 20:1): 4.75 (dd, J = 38.2, 10.1 Hz, 1H), 4.41 (dd, J = 25.6, 6.7 Hz, 1H), 3.85-3.80 (m, 1H), 3.75-3.73 (m, 2H), 3.71 (dd, J = 9.2, 6.7 Hz, 1H), 3.64-3.58 (m, 1H), 3.42 (dd, J = 9.0, 9.0 Hz, 1H), 2.50-2.40 (m, 1H), 1.40-1.10 (m, 52H), 0.84 (t, J = 6.7 Hz, 6H); ESI-MS: m/z C37H71FNaO5として: 理論値：637.5183;、実測値：637.5140 (M + Na)+.
実施例１０：化合物17-Zβ
1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD = 20:1): 4.67 (dd, J = 37.5, 10.1 Hz, 1H), 3.83 (dd, J = 12.2, 3.1 Hz, 1H), 3.73 (dd, J = 12.2, 4.6 Hz, 1H), 3.66 (dd, J = 21.7, 9.8 Hz, 1H), 3.53 (dd, J = 8.9, 8.9 Hz, 1H), 3.48-3.41 (m, 2H), 3.32-3.27 (ddd, J = 8.9, 4.6, 3.1 Hz, 1H), 2.51-2.42 (m, 1H), 1.40-1.13 (m, 52H), 0.85 (t, J = 6.7 Hz, 6H); ESI-MS: m/z C37H71FNaO5として: 理論値：637.5183;、実測値：637.5139 (M + Na)+.
実施例１１：化合物18α
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　スターラーバー、セプタムを装着した二口フラスコに、化合物17-Zα（50.0 mg, 81.0 μmol）とトリエチルアミン（57 μL, 410 μmol）の酢酸エチル溶液（16 mL）を調製した。ロジウムアルミナ（Pt 5 wt%, 62.4 mg）を室温で加え、セプタムを三方コックに付け替えた。反応容器を水素置換し、24時間撹拌した後、反応溶液をセライトで濾過し、セライトをクロロホルム/メタノール = 9/1で洗浄した。溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム/メタノール = 9/1）で精製し、化合物18α（18.9 mg, 39%）を白色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD = 20:1): 3.90-3.83 (m, 1H), 3.73 (m, 2H), 3.62 (dd, J = 9.5, 5.8 Hz, 1H), 3.56 (dd, J = 9.5, 7.9 Hz, 1H), 3.41-3.35 (m, 2H), 1.62-1.48 (m, 2H), 1.40-1.30 (m, 2H), 1.30-1.15 (m, 53H), 0.84 (t, J = 6.4 Hz, 6H); ESI-MS: m/z C37H74NaO5として: 理論値：621.5428;、実測値：621.5420 (M + Na)+.
実施例１２から１５
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　10 mLスクリューキャップバイアルに、窒素雰囲気下、塩化ニッケル（II）ジメトキシエタン錯体（6.2 mg, 28.2 μmol）と2,10-ジ-tert-ブチルビピリジル（dtbpy, 8.3 mg, 31.0 μmol）のMeCN溶液（3 mL）を調製して密封し、5分間超音波をかけた。MeCNを減圧留去し、スターラーバー、化合物19（464 mg, 1.13 mmol）、化合物12a（E/Z = 1:1, 300 mg, 564 μmol）、(Ir[dF(CF3)ppy]2(dtbpy))PF6 (6.3 mg, 5.6 μmol)を加え、続いて脱気した酢酸エチル（5.6 mL）、2,4,6-コリジン（150 μL, 1.1 mmol）、トリストリメチルシリルシラノール（350 μL, 1.1 mmol）を順に加え、密栓をした。青色LED（Kessil Tuna Blue (465 nm)）照射下、24時間撹拌した後、光照射を止め、反応溶液をセライトで濾過し、セライトを酢酸エチル/ヘキサン = 1/3の混合溶媒で洗浄した。溶媒を減圧留去して得た残渣を循環式ゲルろ過精製装置（HP-GPC）（溶離液：クロロホルム）で精製した。得た混合物をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン/酢酸エチル = 90/10 → 65/35）で精製し、20 (192 mg, 87%)を得た。
　撹拌子を装着した20 mLフラスコ中、窒素雰囲気下、20 (155 mg, 198 μmol)のメタノール（5 mL）、ジクロロメタン（5 mL）混合溶媒の溶液を調製し、ナトリウムメトキシド（2.1 mg, 40 μmol）を加えた。12時間撹拌した後、反応溶液にAmberlite IRC-120を加え1分間撹拌し、固体をろ別した。ろ液を濃縮し、シリカゲル（イアトロビーズ（登録商標））クロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム/メタノール = 19/1）で精製し、22（115 mg, 94%）を白色固体として得た。
　同様に、化合物19（128 mg, 311 μmol）と化合物12b（E/Z = 1.1:1, 100 mg, 155 μmol）を反応させることで化合物21（53 mg, 72%）を得た。また、化合物21（13.6 mg, 15.2 μmol）をナトリウムメトキシドと反応させることで化合物23（9.9 mg, 90%）を得た。
実施例１２：化合物20: 
1H NMR (500 MHz, CDCl3): 5.52 (t, J = 3.2 Hz, 1H), 5.27 (dd, J = 8.6, 3.4 Hz, 1H), 5.23 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 4.81 (dd, J = 37.5, 10.4 Hz, 1H), 4.55 (dd, J = 11.0, 3.1 Hz, 1H), 4.40 (dd, J = 12.2, 6.4 Hz, 1H), 4.09 (dd, J = 12.2, 2.8 Hz, 1H), 3.97-3.93 (m, 1H), 2.59-2.49 (m, 1H), 2.14 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 1.45-1.18 (m, 54H), 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 6H); ESI-MS (m/z) C45H79FNaO9として: 理論値：805.5606; 実測値：805.5612 (M + Na)+.
実施例１３：化合物21: 
1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD = 9/1): 4.53 (dd, J = 37.7, 10.2 Hz, 2H), 4.06 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 3.76-3.69 (m, 3H), 3.64 (dd, J = 9.3, 3.2 Hz, 1H), 3.44 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 1.30-1.16 (m, 57H), 0.79 (t, J = 7.0 Hz, 6H); ESI-MS (m/z) C37H71FNaO5として: 理論値：637.5183; 実測値：637.5165 (M + Na)+.
実施例１４：化合物22: 
1H NMR (500 MHz, CDCl3): 5.51 (dd, J = 3.4, 3.4 Hz, 1H), 5.28-5.20, (m, 2H), 4.80 (dd, J = 37.5, 10.4 Hz, 1H), 4.55 (dd, J = 11.0, 3.4 Hz, 1H), 4.40 (dd, J = 12.2, 6.4 Hz, 1H), 4.08 (dd, J = 12.2, 3.1 Hz, 1H), 3.97-3.92 (m, 1H), 2.58-2.49 (m, 1H), 2.13 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 1.45-1.08 (m, 76H), 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 7H); ESI-MS (m/z) C53H95FNaO9として: 理論値：917.6858; 実測値：917.6825 (M + Na)+.
実施例１５：化合物23: 
1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD = 19/1): 4.56 (dd, J = 38.8, 10.4 Hz, 1H), 4.52 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 4.10-4.08 (m, 1H), 3.80-3.71 (m, 3H), 3.67 (dd, J = 9.2, 3.1 Hz, 1H), 3.47 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 2.44 (q, J = 4.5 Hz, 1H), 1.34-1.20 (m, 74H), 0.82 (t, J = 6.9 Hz, 6H); ESI-MS (m/z) C45H87FNaO5として: 理論値：749.6435; 実測値：749.6420 (M + Na)+.
実施例１６
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
　10 mLスクリューキャップバイアルに、窒素雰囲気下、塩化ニッケル（II）ジメトキシエタン錯体（12.0 mg, 54.5 μmol）と2,10-ジ-tert-ブチルビピリジル（dtbpy, 16.1 mg, 59.9 μmol）のMeCN溶液（5 mL）を調製して密封し、5分間超音波をかけた。MeCNを減圧留去し、スターラーバー、化合物5（481 mg, 1.36 mmol）、化合物12d（E/Z = 1:1, 300 mg, 545 μmol）、(Ir[dF(CF3)ppy]2(dtbpy))PF6 (30.6 mg, 27.2 μmol)を加え、続いて脱気した1,4-ジオキサン（5.5 mL）、2,4,6-コリジン（180 μL, 1.4 mmol）、トリストリメチルシリルシラノール（420 μL, 1.4 mmol）を順に加え、密栓をした。青色LED（Kessil Tuna Blue (465 nm)）照射下、24時間撹拌した後、光照射を止め、反応溶液をセライトで濾過し、セライトを酢酸エチル/ヘキサン = 1/3の混合溶媒で洗浄した。溶媒を減圧留去して得た残渣を循環式ゲルろ過精製装置（HP-GPC）（溶離液：クロロホルム）で精製した。得た混合物を20 mLフラスコ中、窒素雰囲気下、メタノール（5 mL）に溶解し、ナトリウムメトキシド（58.9 mg, 1.09 mmol）を加えた。12時間撹拌した後、反応溶液にAmberlite IRC-120を加え1分間撹拌し、固体をろ別した。ろ液を濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル/ヘキサン/メタノール = 4/1/0.1）で精製し、化合物24（91.3 mg, 54%）を白色固体として得た。
化合物24: 
1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD = 2/1): 5.14 (dd, J = 37.8, 9.5 Hz, 1H), 4.77 (dd, J = 9.5, 3.4 Hz, 1H), 4.51 (dd, J = 17.4, 4.9 Hz, 1H), 4.00 (dd, J = 3.4, 3.4 Hz, 1H), 3.98-3.95 (m, 1H), 3.94-3.89 (m, 1H), 3.89 (dd, J =8.2, 3.4 Hz, 1H), 3.85 (dd, J = 11.9, 7.0 Hz, 1H), 3.69 (dd, J = 11.9, 4.0 Hz, 1H), 3.44 (dd, J = 7.9, 3.4 Hz, 1H), 3.36 (ddd, J = 8.5, 7.9, 2.4 Hz, 1H), 1.74-1.66 (m, 1H), 1.55-1.47 (m, 1H), 1.42 (s, 9H), 1.37-1.19 (m, 24H), 1.30 (s, 6H), 0.85 (t, J = 6.9 Hz, 3H); ESI-MS (m/z) C33H60FNNaO9として: 理論値：656.4150; 実測値：656.4148 (M + Na)+.
実施例１７および１８
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　スターラーバーを装着した4 mLスクリューキャップバイアルに、実施例１６にて調製した化合物24（13.3 mg, 21.0 μmol）のトリフルオロ酢酸（150 μL）、蒸留水（50 μL）の混合溶媒溶液を調製した。室温で3時間撹拌した後、窒素気流下TFA、水を留去し、残渣をメタノール（100 μL）に溶解した。窒素気流下メタノールを留去し、残渣をTHF（300 μL）に溶解し、ミリスチン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（10.2 mg, 31.5 μmol）および飽和重曹水（100 μL）を加えた。室温で12時間撹拌し、反応溶液にシリカゲル100 mgを加え、THFを減圧留去した。残渣を、シリカゲル（1 cc）を充填したカラムで濾過し、シリカゲルをクロロホルム/メタノール = 9/1で洗浄した。溶媒を減圧留去して得た残渣をピリジン（300 μL）に溶解し、0 ℃で無水酢酸（100 μL）を加えた。室温で12時間撹拌し、反応溶液を酢酸エチルで希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に流し込んだ。酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグフィー（溶離液：ヘキサン/酢酸エチル = 3/1）で精製し、化合物25（7.1 mg, 35%）を白色固体として得た。
　スターラーバーを装着した4 mLスクリューキャップバイアルに、化合物25（4.1 mg, 4.3 μmol）のメタノール（300 μL）溶液を調製し、ナトリウムメトキシド（1.2 mg, 21 μmol）を加えた。室温で12時間撹拌した後、反応溶液にAmberlite IRC-120を加え1分間撹拌し、固体をろ別した。ろ液を濃縮し、シリカゲル（イアトロビーズ(登録商標)）クロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム/メタノール/蒸留水 = 19/1/0.05）で精製し、26（3.0 mg, 100%）を白色固体として得た。
実施例１７：化合物25: 
1H NMR (500 MHz, CDCl3): 5.91 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 5.48 (dd, J = 3.7, 1.5 Hz, 1H), 5.42 (dd, J = 10.1, 3.7 Hz, 1H), 5.21 (dd, J = 10.1, 6.4 Hz, 1H), 5.12-5.04 (m, 2H), 4.94-4.89 (m, 1H), 4.87 (dd, J = 31.7, 8.9 Hz, 1H), 4.78 (dd, J = 27.8, 6.4 Hz, 1H), 4.27 (m, 1H), 4.11-4.08 (m, 2H), 2.18-2.10 (m, 2H), 2.13 (s, 3H), 2.12 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.044 (s, 3H), 2.040 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.67-1.50 (m, 4H), 1.32-1.23 (m, 44H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 6H); ESI-MS (m/z) C51H86FNNaO14として: 理論値：978.5930; 実測値：978.5897 (M + Na)+.
実施例１８：化合物26: 
1H NMR (500 MHz, CDCl3): 8.77 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.92-6.81 (m, 2H), 6.78 (brd, J = 4.3 Hz, 1H), 6.53 (brd, J = 2.4 Hz, 1H), 6.45 (brs, 1H), 6.35 (dd, J = 39.2, 9.9 Hz, 1H), 6.24 (td, J = 8.9, 2.5 Hz, 1H), 6.12 (s, 1H), 5.21 (dd, J = 12.8, 4.3 Hz, 1H), 4.81-4.75 (m, 2H), 4.68-4.59 (m, 3H), 4.54-4.48 (m, 1H), 4.39-4.34 (m, 1H), 4.28-4.21 (m, 1H), 2.40 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.32-2.23 (m, 1H), 1.96-1.84 (m, 2H), 1.80 (quin, J = 7.6 Hz, 2H), 1.65-1.61 (m, 1H), 1.46-1.17 (m, 47H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 6H); ESI-MS (m/z) C39H74FNNaO8として: 理論値：726.5296; 実測値：726.5282 (M + Na)+.
実施例１９
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 　スターラーバーを装着した30 mLフラスコに、アルゴン雰囲気下、化合物21（47.7 mg, 77.6 μmol）のTHF（1.3 mL）溶液を調製し、トリエチルアミン（260 μL）、トリチルクロリド（65 mg, 230 μmol）およびジメチルアミノピリジン（4.7 mg, 38 μmol）を室温で加えた。反応容器をオイルバスで60 ℃に加熱し、24時間撹拌した後、室温に冷却し、飽和重曹水（10 mL）を加えた。ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒を減圧留去して、高真空下で乾燥させた。スターラーバーを装着した30 mLフラスコに、アルゴン雰囲気下、残渣のピリジン（1.2 mL）溶液を調製し、0 ℃で無水酢酸（160 μL）を加えた。室温で14時間撹拌した後、飽和重曹水（10 mL）を加えた。ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒を減圧留去して、高真空下で乾燥させた。スターラーバーを装着した30 mLフラスコに、アルゴン雰囲気下、残渣のジクロロメタン（1.2 mL）溶液を調整し、0 ℃で臭化水素酸の5 M酢酸溶液（70 μL, 390 μmol）を加えた。0 ℃で30秒撹拌した後、ジクロロメタン（10 mL）および蒸留水（10 mL）で希釈し、飽和重曹水（20 mL）に流し込んだ。ジクロロメタンで抽出し、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグフィー（溶離液：ヘキサン/酢酸エチル = 70/30）で精製し、化合物27（37.7 mg, 66%）を無色油状物質として得た。
化合物27: 
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 5.56 (dd, J = 2.4, 2.1 Hz, 1H), 5.28 (dd, J = 9.8, 2.8 Hz, 1H), 5.26 (dd, J = 9.8, 9.8 Hz, 1H), 4.83 (dd, J = 37.8, 10.4 Hz, 1H), 4.58 (dd, J = 8.5, 2.1 Hz, 1H), 3.74-3.67 (m, 2H), 3.62 (ddd, J = 12.8, 5.2, 4.9 Hz, 1H), 2.60-2.50 (m, 1H), 2.35 (dd, J = 8.5, 5.2 Hz, 1H), 2.15 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.43-1.24 (m, 52H), 0.87 (t, J = 7.0 Hz, 6H); ESI-MS (m/z): C43H77FNNaO8として: 理論値：763.5500, 実測値：763.5523 (M + Na)+. 
実施例２０および２１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
　まず、化合物28を、J. Med. Chem. 2005, 48, 645-652に記載の方法により調製した。
　次いで、スターラーバーを装着した10 mLフラスコに、アルゴン雰囲気下、化合物27（15.0 mg, 20.2 μmol）と化合物28（12.0 mg, 24.3 μmol）、モレキュラーシーブ4A（25 mg）のジクロロメタン（670 μL）懸濁液を調製し、-20 ℃に冷却後、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートの35 μMジクロロメタン溶液（170 μL, 6 μmol）を-20 ℃で加えた。-20 ℃で13時間撹拌した後、トリエチルアミン（0.2 mL）および飽和重曹水（10 mL）を加えた。ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグフィー（溶離液：ヘキサン/酢酸エチル = 70/30）で精製し、化合物29（15.4 mg, 71%）を無色油状物質として得た。
　スターラーバーを装着した4 mLスクリューキャップバイアルに、化合物29（8.0 mg, 7.5 μmol）のメタノール（150 μL）溶液を調製し、室温でナトリウムメトキシド（1.5 mg, 28 μmol）を加えた。室温で1時間撹拌した後、反応溶液にAmberlite IRC-120を加え1分間撹拌し、固体をろ別した。ろ液を濃縮し、シリカゲル（イアトロビーズ（登録商標））クロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム/メタノール = 4/1）で精製し、30（3.4 mg, 59%）を白色固体として得た。
実施例２０：化合物29: 
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 5.53 (dd, J = 2.6, 2.6 Hz, 1H), 5.39 (dd, J = 3.4, 1.1 Hz, 1H), 5.25 (dd, J = 10.4, 7.9 Hz, 1H), 5.21 (dd, J = 9.2, 2.6 Hz, 1H), 5.18 (dd, J = 9.2, 9.2 Hz, 1H), 5.02 (dd, J = 10.4, 3.4 Hz, 1H), 4.81 (dd, J = 38.1, 9.5 Hz, 1H), 4.57 (dd, J = 6.7, 2.6 Hz, 1H), 4.54 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.19 (dd, J = 11.3, 6.4 Hz, 1H), 4.11 (dd, J = 11.3, 7.2 Hz, 1H), 3.98 (dd, J = 11.3, 2.4 Hz, 1H), 3.91-3.88 (m, 2H), 3.57 (dd, J = 11.3, 6.3 Hz, 1H), 2.58-2.48 (m, 1H), 2.17 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.049 (s, 3H), 2.047 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.97 (s, 3H), 1.48-1.18 (m, 60H), 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 6H); ESI-MS (m/z): C57H95FNaO17として: 理論値：1093.6451, 実測値：1093.6373 (M + Na)+. 
実施例２１：化合物30: 
1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD = 4/1): δ 4.60 (dd, J = 38.5, 10.1 Hz, 1H), 4.50 (brd, J = 9.5 Hz, 1H), 4.23 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.11-4.03 (m, 2H), 3.87-3.81 (m, 3H), 3.79 (dd, J = 11.6, 6.7 Hz, 1H), 3.70 (dd, J = 11.6, 5.0 Hz, 1H), 3.66 (dd, J = 9.5, 3.4 Hz, 1H), 3.60-3.55 (m, 1H), 3.55 (dd, J = 9.8, 7.9 Hz, 1H), 3.49-3.44 (m, 2H), 2.50-2.41 (m, 1H), 1.38-1.08 (m, 52H), 0.83 (t, J = 7.0 Hz, 6H); ESI-MS (m/z): C43H81FNaO10として: 理論値：799.5711, 実測値：799.5677 (M + Na)+.
実施例２２および２３
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
　まず、化合物31を、J. Med. Chem. 2005, 48, 645-652.に記載の方法により調製した。
　次いで、スターラーバーを装着した10 mLフラスコに、アルゴン雰囲気下、実施例１９にて調製した化合物27（13.8 mg, 18.6 μmol）と化合物31（13.8 mg, 27.9 μmol）、モレキュラーシーブ4A（27 mg）のジクロロメタン（600 μL）懸濁液を調製し、-20 ℃に冷却後、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートの35 μMジクロロメタン溶液（150 μL, 5.2 μmol）を-20 ℃で加えた。-20 ℃で13時間撹拌した後、トリエチルアミン（0.2 mL）および飽和重曹水（10 mL）を加えた。ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒を減圧留去して得た残渣を循環式ゲルろ過精製装置（HP-GPC）（溶離液：クロロホルム）で精製し、続いて得た混合物をシリカゲルクロマトグフィー（溶離液：ヘキサン/酢酸エチル = 60/40）で精製し、化合物32（10.8 mg, 54%）を無色油状物質として得た。
　スターラーバーを装着した4 mLスクリューキャップバイアルに、化合物32（10.8 mg, 10.1 μmol）のジクロロメタン（600 μL）、メタノール（600 μL）の混合溶媒溶液を調製し、室温でナトリウムメトキシド（2.2 mg, 40 μmol）を加えた。室温で4時間撹拌した後、反応溶液にAmberlite IRC-120を加え1分間撹拌し、固体をろ別した。ろ液を濃縮し、シリカゲル（イアトロビーズ（登録商標））クロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム/メタノール = 4/1）で精製し、33（7.2 mg, 92%）を白色固体として得た。
実施例２２：化合物32: 
1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD = 4/1): δ 5.52 (t, J = 2.7 Hz, 1H), 5.21 (dd, J = 9.8, 9.5 Hz, 1H), 5.22-5.18 (m, 1H), 5.18 (dd, J = 9.2, 9.2 Hz, 1H), 5.07 (dd, J = 10.1, 9.5 Hz, 1H), 5.04 (dd, J = 9.8, 7.9 Hz, 1H), 4.81 (dd, J = 37.8, 9.8 Hz, 1H), 4.57 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.56 (brdd, J = 7.0, 2.7 Hz, 1H), 4.28 (dd, J = 12.5, 4.6 Hz, 1H), 4.13 (dd, J = 12.5, 2.4 Hz, 1H), 3.97 (dd, J = 11.3, 2.4 Hz, 1H), 3.90-3.85 (m, 1H), 3.69 (ddd, J = 10.1, 4.6, 2.4 Hz, 1H), 3.58 (dd, J = 11.3, 6.1 Hz, 1H), 2.57-2.48 (m, 1H), 2.16 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.43-1.25 (m, 52H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); ESI-MS (m/z): C57H95FNaO17として: 理論値：1093.6451, 実測値：1093.6382 (M + Na)+. 
実施例２３：化合物33: 
1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD = 4/1): δ 4.61 (dd, J = 38.5, 10.4 Hz, 1H), 4.51 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.28 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 4.10 (dd, J = 2.4, 2.4 Hz, 1H), 4.06 (dd, J = 11.1, 2.4 Hz, 1H), 3.84-3.80 (m, 3H), 3.71-3.65 (m, 2H), 3.62-3.57 (m, 1H), 3.39 (dd, J = 8.9, 8.5 Hz, 1H), 3.34 (dd, J = 9.2, 8.9 Hz, 1H), 3.27 (dd, J = 8.5, 8.2 Hz, 1H), 3.28-3.23 (m, 1H), 2.51-2.42 (m, 1H), 1.40-1.08 (m, 52H), 0.84 (t, J = 6.9 Hz, 6H); ESI-MS (m/z): C43H81FNaO10として: 理論値：799.5711, 実測値：799.5693 (M + Na)+.
方法：
＜LNPの作製＞
　モデルナ製のLNPは、SM102 (50 mol％)、GM-020 (1.5 mol％)、コレステロール (38.5 mol％)、およびDSPC (10 mol％)の混合液とmRNA (0.695 μg) を用い、LNP作製装置ナノスパークにより作製した。以下、モデルナ型LNPと称する。また、各種C-グリコシド糖脂質-LNPは、SM102 (50 mol％)、GM-020 (1.5 mol％)、コレステロール (38.5 mol％)、および各種C-グリコシド糖脂質(10 mol％)の混合液とmRNA (0.695 μg) を用いて、LNP作製装置ナノスパークにより作製した。C-グリコシド糖脂質-LNPとは、本発明のC-グリコシド糖脂質化合物を構成成分とするLNPを意味する。
　各脂質の入手先は次の通りである：
・SM102：Medchemexpress（MCE）、商品番号：HY-134541
・GM-020：SUNBRIGHT GM-020 (DMG-PEG2000)
・コレステロール：日本精化
・DSPC（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン）：シグマ(Avanti)
・RNA (GFP) ：富士フィルム(TriLink Bio Technologies,Inc.)
・mRNA (ルシフェラーゼ)：富士フィルム(TriLink Bio Technologies,Inc.)
＜培養細胞＞
　培養細胞（マウスのマクロファージ様細胞 Raw264.7（American Type Culture Collection））は、5% ウシ胎仔血清 (FBS; Moregate Biotech, Bulimba, Australia)、および0.5% ペニシリン／ストレプトマイシン (Invitrogen, Grandisland, NY) を含むダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM; Sigma aldrich, St. Louis, MO) にて37℃、5% CO2 / 95%大気条件下で培養した。
＜定量的リアルタイムRT-PCR法＞
　培養細胞からDMEM培地 (Sigma Aldrich) を除去した後にPBSで洗浄し、総 RNAを抽出した。RNA抽出には、RNAiso (Takara Bio Co., Ltd., Shiga, Japan) を用い、総RNAからcDNAへの逆転写はReverTra Ace qPCR RT kit (Toyobo, Osaka, Japan) を用いて行った。定量的リアルタイムPCR反応は、THUNDERBIRDTM SYBR qPCR Mix (Toyobo) および7500 Real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA) を用い、検量線法により解析した。内部標準は18Sを用いた。各標的遺伝子の測定に用いたプライマー配列を表１ に示す。
表１
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
Fw：フォワードプライマー
Re：リバースプライマー
＜細胞増殖活性の測定＞
　Raw264.7細胞は96 well black plate (Cat No.655086, Greiner) に播種し、細胞接着後24時間目に各種LNPを10 μL で添加し、24時間後にATP活性を測定した。ATP アッセイにはCell Titer-GloTM Luminescent Cell Viability Assay (Promega) を用い、EnSpire Multimode plate Reader (Perkin Elmer) で化学発光強度の測定を行った。
＜LNPによるmRNA細胞内取り込み量の測定＞
　Raw264.7細胞は96 well black plate (Cat No.655086, Greiner) に播種し、細胞接着後24時間目に各種LNPを10 μL で添加し、8-24時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。LNP暴露後の細胞は、培地を除去後、Passive Lysis Buffer（Promega）を40 μl添加して10分間振盪し溶解後に、ルシフェリンを10μl添加し、1分間振盪後にEnSpire Multimode plate Reader (Perkin Elmer) で化学発光強度の測定を行った。
＜動物を対象としたLNPの組織内取り込み量の測定＞
　ICRマウスの脹脛に各種LNPを10 μl投与した。投与後24時間目に、ルシフェリン 100mg/kgを皮下投与後5分後に、イソフルラン麻酔下でin vivoイメージング装置（FUSION FX7.EDGE）を用いて、化学発光強度の測定を行った。発光量の定量は、FUSIONのアプリケーションソフトで行った。
＜LNPの分解評価＞
　2%アガロース（WAKO）を作製し、各時点（0、3、7 日）で各LNP 5μlを電気泳動し確認した。
＜Mgl1,2遺伝子ノックダウン＞
　Mgl1遺伝子のノックダウンは、インビトロジェンmiRNA発現ベクターpcDNA6.2に以下の表２に示す配列を導入したベクターを細胞に10 μgを添加し遺伝子導入装置 NEPA21 エレクトロポレーションにより細胞内へ導入した。24時間後に、G418を4000ng/mlで暴露後、72時間目にDMEM培地を交換して、安定にMgl1がノックダウンした細胞を作製した。MGL1タンパク質の発現量は、MGL1抗体（R＆D : AF4938）を用いたウエスタンブロット法にて確認した。
　Mgl2遺伝子のノックダウンには、インビトロジェン siRNAを使用した。Mgl2 siRNAおよび対照siRNA (SilencerTM Select Negative Control) 28.5 pmol をRaw264.7細胞（1X106個/100 μl）に添加し遺伝子導入装置 NEPA21 エレクトロポレーションにより細胞内へ導入した。Mgl2のノックダウン効果は、48時間目に細胞を回収した後に、Mgl2 mRNA発現量を測定して確認した。各標的遺伝子のsiRNA配列を表２に示す。
表２
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
＜レクチンタンパク質とLNPの相互作用＞
　各種レクチンタンパク質-ビオチン化合物（Con A、DBA、PNA、SBA、UEA-1、WGA（ベクターラボラトリーズ））は、PBSにて1mg/mlに合わせ、LNP 20μlと4℃で16時間反応させた後に、アビジンマグネットビーズ（50 μl）にて免疫沈降した。その後、アビジンマグネットビーズに結合したLNPからmRNAをReliaPrepTM RNA Miniprep Systems (promega)を用いて回収し、mRNAはReverTra Ace(登録商標) qPCR RT Kit を用いて (TOYOBO) cDNAに変換し、その後THUNDERBIRD(登録商標) qPCR Mixおよび下記のプライマーを用いてリアルタイム-PCR法により、ルシフェラーゼmRNA量を検出した。
表３
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
＜-80℃における保存の影響＞
　各種LNPを、PBS若しくは、20%スクロースPBS溶液中で懸濁し、-80℃または、4℃で保存し、凍結融解後におけるLNPによるmRNAの細胞内取り込み活性をGFPmRNA(TriLink社　CleanCap(登録商標) mRNA)により生成されたGFPタンパク質の蛍光強度をフローサイトメーターCytoFLEX（BECKMANN）で測定し検証した。
＜統計解析＞
　独立他群間の比較には一元配置分散分析法 (One-way ANOVA) およびTukey-Kramer post-hoc testを用いた。また、独立二群間の比較には、独立t検定 (Unpaired t-test) を用いた。有意水準5%以下を有意な差とした。
試験例１
ルシフェラーゼ活性を指標としたLNPのmRNA細胞内送達の機能評価
　ルシフェラーゼ活性を指標としたLNPのmRNA細胞内送達の機能評価を行った。
　モデルナ型LNPを基本モデルLNPとして、mRNA細胞内送達に及ぼすLNP添加量と細胞数の影響を測定した。96ウエルプレートにRaw264.7細胞を各細胞数 (50 μl) で播種してモデルナ型LNP 10μlを添加し16時間後のルシフェラーゼ活性を測定して、LNPのmRNA取り込みに及ぼす細胞数の影響を検討した。得られた結果を図１Aに示す。図１Aは、細胞数依存的にmRNA細胞内送達が増加し、20,000個 (50μl) が最もmRNA取り込みが最大となることを示している。
　また、96ウエルプレートに、Raw264.7細胞を20,000個 (50μl) で播種し、LNPを用量依存的に細胞に添加して、16時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。得られた結果を図１Bに示す。図１Bは、用量依存的にmRNAが取り込まれ、10 μlが最も取り込み量が最大となることを示している。
　以上の検討結果より、以降の検討は、96ウエルプレートに、Raw264.7細胞を20,000個 (50μl) 播種し、LNPの暴露量は10μl添加して16時間後のルシフェラーゼ活性を測定することにした。
試験例２
ルシフェラーゼ活性を指標とした各種C-グリコシド糖脂質-LNPのmRNA細胞内送達の機能評価
　ルシフェラーゼ活性を指標とした各種C-グリコシド糖脂質-LNPのmRNA細胞内送達の機能評価を行った。
　モデルナ型LNPを基本モデルLNPとして、各種LNPのmRNA取り込み量についてルシフェラーゼ活性を指標に測定した。96ウエルプレートにRaw264.7細胞を各細胞数（50 μl）で播種して各種LNP 10μlを添加し16時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。得られた結果を図２に示す。図２は、モデルナ型LNPと比較し、C-グリコシド糖脂質-LNP (化合物14-Zα、化合物14-Zβ、化合物17-Eα、化合物17-Eβ、化合物17-Zα、化合物17-Zβ) 添加細胞のルシフェラーゼ活性が有意に増加したことを示している。
　以上の検討結果より、C-グリコシド糖脂質-LNP (化合物14-Zα、化合物14-Zβ、化合物17-Eα、化合物17-Eβ、化合物17-Zα、化合物17-Zβ) はモデルナ型LNPと比較し、細胞内へのmRNA取り込み量、もしくは翻訳能が増加することが明らかになった。
試験例３
ATP活性を指標とした各種C-グリコシド糖脂質-LNPの生細胞に及ぼす影響
　ATP活性を指標に、生細胞に及ぼす各種LNPの影響を評価した。モデルナ型LNPを基本モデルLNPとして、各種C-グリコシド糖脂質-LNPの影響を側定した。96ウエルプレートにRaw264.7細胞を各細胞数 (50 μl）で播種して各種LNP 10μlを添加し24時間後のATP活性を測定した。得られた結果を図３に示す。図３は、モデルナ型LNPと比較し、すべてのC-グリコシド糖脂質-LNPついて有意な差異は認められないことを示している。
　以上の検討結果より、モデルナ型LNPと同様に各種C-グリコシド糖脂質-LNPは生細胞数に影響がないことが明らかになった。
試験例４
各種C-グリコシド糖脂質-LNPの室温における安定性の評価
　各種C-グリコシド糖脂質-LNPを室温に放置し、LNPの安定性を評価した。分解物としてLuc (ルシフェラーゼmRNA) およびGFP (緑色蛍光タンパク質mRNA) を同時に電気泳動した。2%アガロースに各種C-グリコシド糖脂質-LNPを5 μl注入し電気泳動した。得られた結果を図４に示す。図４は、LNPの分解物である、2つのRNAは7日間まで認められないことを示している。
　以上の結果より、モデルナ型と同様に各種C-グリコシド糖脂質-LNPは室温で7日間は安定であることが明らかになった。
試験例５
アジュバント活性に関連する遺伝子発現に及ぼす各種C-グリコシド糖脂質-LNPの影響
　LNPワクチン投与後の、抗体産生に重要なアジュバント活性に関連した遺伝子の発現に及ぼす、各種LNPの影響を評価した。
　モデルナ型LNPを基本モデルLNPとして、各種LNPの影響を測定した。96ウエルプレートにRaw264.7細胞を各細胞数（50 μl）で播種して各種C-グリコシド糖脂質-LNP 10μlを添加し16時間後に細胞を回収し、RNAを抽出後、リアルタイムPCRで各種遺伝子発現量を測定した。
　まず初めにアジュバント活性に関連して抗原提示細胞の遊走を促すサイトカインCcl3の発現量を測定した。得られた結果を図５Aに示す。図５Aは、モデルナ型LNPと比較し、C-グリコシド糖脂質-LNP (化合物14-Zα、化合物14-Zβ、化合物21、15β) 添加した細胞でCcl3発現が有意に増加することを示している。また、アジュバント活性を抑制するサイトカインCcl22の発現量を測定した。得られた結果を図５Bに示す。図５Bは、モデルナ型LNPと比較し、C-グリコシド糖脂質-LNP (化合物15α、化合物18α、化合物17-Eα) 添加した細胞でCcl22発現が有意に低下し、C-グリコシド糖脂質-LNP (化合物21、化合物17-Zα、化合物17-Zβ)添加した細胞で有意に増加することを示している。
　以上の結果から、各種C-グリコシド糖脂質-LNPは、アジュバント活性を有するLNPであること、また細胞内へのmRNA取り込みとアジュバント活性の関連から14-Zαと17-Eαが有用であることが示唆された。
試験例６
各種C-グリコシド糖脂質-LNPの細胞内取り込みに及ぼすガラクトース型C型レクチン2(マクロファージ ガラクトース型レクチン2：MGL2/CD301b)の影響
　モデルナ型LNPと比較し、化合物15αや化合物14-Zαは細胞内へのmRNA送達に優れている。一般的に、LNPは構成成分のコレステロールにAPOタンパク質が結合し、LDLレセプターを介し細胞内へ取り込まれる。今回、各種C-グリコシド糖脂質-LNPは、DSPCの代わりにC-グリコシド糖脂質を加えLNPを作製した。さらにC-グリコシド糖脂質の構造にはガラクトースが結合していることから、細胞内へはガラクトースを取り込むレクチン受容体が重要でないかと仮説を立て、各種C-グリコシド糖脂質-LNPの細胞内取り込み機構を検証した。
　まずRaw264.7細胞がマクロファージ様細胞であることに着目し調査した結果、ガラクトース型C型レクチン2(マクロファージ ガラクトース型レクチン2：MGL2/CD301b)が発現していることが明らかとなった(American Society for Microbiology Journal of VirologyVolume 88, Issue 3, 1 February 2014, Pages 1659-1672: https://doi.org/10.1128/JVI.02014-13)。そこで、Mgl2をノックダウンした細胞を作製し、各種LNPの細胞内取り込み量をルシフェラーゼ活性で評価した。
　得られた結果を図6に示す。図６Ａは、細胞に、表2に記載されているMgl2 siRNAをトランスフェクションしてMgl2遺伝子をノックダウンした結果を示すグラフである。図6Bは、Mgl2ノックダウン細胞は、モデルナ型LNPの取り込み量には有意な差異は、認められないが、化合物15αおよび 化合物14-Zαの細胞内取り込み量が有意に低下していることを示している。以上の結果から、Mgl2がC-グリコシド糖脂質-LNPの細胞内取り込み機構に重要な役割を果たしていることが示唆された。
試験例７
動物を用いたLNPの機能解析
　これまでの検討で、モデルナ型LNPと比較しC-グリコシド糖脂質-LNPは、培養細胞に遺伝子を効率よく送達出来ることが明らかとなった。そこで、化合物14-Zα-LNPを動物に投与して遺伝子発現量を測定した。
　動物の脹脛の筋肉に10 μl投与し、24時間後のルシフェラーゼ活性をin vivoイメージング装置で解析した。得られた結果を図７に示す。図７は、モデルナ型LNPと比較し、化合物14-Zα-LNPは筋肉で強く遺伝子を発現し、一方で、モデルナ型LNPは、筋肉のみならず肝臓にも、LNPが多く送達されていることを示している。
　以上の結果より、化合物14-Zαは筋肉内投与部位にて細胞に遺伝子を送達することが明らかとなった。
試験例８
動物を用いた化合物30の機能解析
　これまでの検討で、モデルナ型LNPと比較し化合物14-Zα-LNPは、培養細胞およびマウス組織においてに遺伝子を効率よく送達、発現出来ることが明らかとなった。しかし、動物の脹脛の筋肉における遺伝子発現は、モデルナ型LNPと化合物14-Zα-LNPには有意な差異は認められなかった。そこで、より培養細胞にて安定に遺伝子発現可能な、化合物30を用いたLNPを筋肉に10 μl投与し、24時間後のルシフェラーゼ活性をin vivoイメージング装置で解析した。
　得られた結果を図８に示す。図８は、モデルナ型LNPと比較し、KGK020-LNPの筋肉内投与群で有意に遺伝子が高値であり、一方で、モデルナ型LNPは、化合物30-LNPと比較し、肝臓において遺伝子発現が高値であることを示している。
試験例９
動物を用いた化合物33の機能解析
　化合物30と同様に二糖が結合した化合物33を用いたLNPを筋肉に10 μl投与し、24時間後および72時間後のルシフェラーゼ活性をin vivoイメージング装置で解析した。得られた結果を図９に示す。図９は、24時間後および72時間後共にモデルナ型LNPと比較し、KGK020-LNPの筋肉内投与群で有意に遺伝子が高値であり、一方で、投与後24時間後におけるモデルナ型LNPは、化合物33-LNPと比較し、肝臓において遺伝子発現が高値を示し、72時間目には、検出が認められなくなることを示している。
試験例１０
化合物14-Zα-LNPの細胞内取り込みに及ぼすガラクトース型C型レクチン1(マクロファージ ガラクトース型レクチン1：MGL1/CD301a)の影響
　モデルナ型LNPと比較し、化合物15αや化合物14-Zαは細胞内へMGL2により細胞内へmRNAを送達する。しかしその影響は、部分的であることからMGLのサブタイプであるMGL1についても検証した。そこで、MGL1をノックダウンした細胞を作製し、各種LNPの細胞内取り込み量をルシフェラーゼ活性で評価した。
　得られた結果を図１０に示す。図１０は、MGL1ノックダウン細胞では、化合物14-Zα-LNPの細胞内取り込み量が有意に低下することを示している。
　以上の結果から、MGL２と比較しMGL1がC-グリコシド糖脂質-LNPの細胞内取り込み機構に重要な役割を果たしていることが示唆された。
試験例１１
化合物14-Zα、化合物30-LNPの細胞内取り込みに及ぼす細胞種の影響
　モデルナ型LNPと比較し、化合物14-Zα-LNP、化合物30-LNPは細胞内へ免疫細胞膜表面に多く発現するMGL1、MGL2を介して細胞内へmRNAを送達する。そこで、線維芽細胞（NIH3T3）と免疫細胞（Raw264.7細胞）を50 μlで播種して各種LNP 10μlを添加し16時間後のルシフェラーゼ活性を評価した。
　得られた結果を図１１に示す。図１１は、免疫細胞において、化合物14-Zα-LNPおよび化合物30-LNPがモデルナ型と比較しルシフェラーゼ活性が増加し、その一方で、線維芽細胞では、その増加率は免疫細胞と比較し低値であることを示している。
試験例１２
ヒトの免疫細胞を対象とした化合物30-LNPの細胞内mRNA取り込み
　マウス免疫細胞では、モデルナ型LNPと比較し、本発明のC-グリコシド糖脂質-LNPは細胞内へmRNAを効率的に送達する。そこで、ヒトの免疫細胞（ヒト白血病細胞THP1）を対象に、化合物30-LNPによるmRNA細胞内取り込み量を評価した。
　得られた結果を図１２に示す。図１２は、THP1においても、モデルナ型LNPと比較し、化合物30-LNPにおいて、経時的に細胞内へmRNA取り込みが有意に増加することが示唆された。
試験例１３
化合物14-Zα、化合物30、化合物33-LNPのmRNA細胞内送達の機能評価
　ルシフェラーゼ活性を指標とした各種LNPのmRNA細胞内送達の機能評価を行った。モデルナ型LNPを基本モデルLNPとして、各種LNPのmRNA取り込み量についてルシフェラーゼ活性を指標に測定した。96ウエルプレートにRaw264.7細胞を各細胞数（50 μl）で播種して各種LNP 10μlを添加し、8時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。
　得られた結果を図１３に示す。図１３は、モデルナ型LNPと比較し、一糖が付加した化合物14-Zα-LNPと同様に二糖が付加した化合物30-LNP、化合物33-LNP添加細胞のルシフェラーゼ活性が有意に増加し、さらに化合物33-LNP暴露細胞が最も遺伝子発現が高値であることを示している。
試験例１４
GFPタンパク質を指標とした化合物30-LNPのmRNA細胞内送達の機能評価
　ルシフェラーゼに代え、GFPmRNAを用いて細胞内取り込み量を評価した。24ウエルプレートにRaw264.7細胞を各細胞数（280 μl）で播種して、モデルナ型LNPおよび化合物30-LNP 20μlを添加し、16時間後のGFP蛍光活性を測定した。
　得られた結果を図１４に示す。図１４は、モデルナ型LNPと比較し、化合物30-LNP-LNP添加細胞の蛍光強度が有意に増加することを示している。
　以上の検討結果より、ルシフェラーゼ以外のmRNAにおいても、本発明のC-グリコシド糖脂質-LNP020は、モデルナ型と比較し、細胞内へのmRNA取り込み量、もしくは翻訳能が増加することが明らかになった。
試験例１５
GFPタンパク質を指標とした4℃ PBS保存に対する各種C-グリコシド糖脂質-LNPの影響
　GFPmRNAを用いて細胞内取り込み量を評価し、4℃ PBS保存に対する各種C-グリコシド糖脂質-LNPの影響を評価した。得られた結果を図１５に示す。図１５は、各種C-グリコシド糖脂質-LNPはモデルナ型LNPと比較して、12日以上の長期的保存が可能であることを示唆している。
試験例１６
GFPタンパク質を指標とした化合物30-LNP冷凍保存の影響
　試験例１５では、各種C-グリコシド糖脂質-LNPが4℃ PBS保存では12日以上の長期的保存が可能であることが示唆された。そこで、より長期的安定的な保存方法を検証するために、20%スクロースでLNPを懸濁し、-80℃で凍結その後融解をしたLNPを、24ウエルプレートにRaw264.7細胞を各細胞数（280 μl）で播種して、モデルナ型LNPおよび化合物30-LNP 20μlを添加し、16時間後のGFP蛍光活性を測定した。
　得られた結果を図１６に示す。図１６は、モデルナ型LNPと比較し、化合物30-LNP添加細胞の蛍光活性が有意に増加することを示している。
　以上の検討結果より、20%スクロースに懸濁した化合物30-LNPは、-80℃で保存可能であり、その細胞内mRNA送達能は、保持されることが明らかになった。
試験例１７
受容体-結合ドメイン（RBD）を指標としたモデルナ型および化合物33-LNPによる抗体力価の評価
　化合物33-LNPにCovid19スパイクタンパク質mRNAを封入し、マウス筋肉内投与（10 μl）後におけるスパイクタンパク質に対する抗体の力価を投与後5週目に測定した。
　詳細には、化合物33-LNPにCovid19スパイクタンパク質mRNA（オミクロン型；OZ Biosciences社）を封入し、10 μlを大腿部の筋肉に投与した。マウスの尾部から採血をして、血清を分離し測定に用いた。スパイクタンパク質（オミクロン株）または受容体-結合ドメイン (RBD；ミクロン株) 30 ng/μlを96 ウエルプレートに固定化しマウスの血清を反応した後に、HRP標識のマウス抗体を反応させた。最後に発色基質である2,2'-アジノ-ビス（3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸）と反応させ吸光度を測定した。
　得られた結果を図１７に示す。図１７は、RBDタンパク質を指標に抗体の力価を評価した結果、モデルナ型LNPと比較して、化合物33-LNPによるRBD標的抗体力価に有意な差異は認められなかった。
試験例１８
モデルナ型および化合物33-LNPを用いた抗体産生量能の評価
　試験例１７に方法に従い、モデルナ型および化合物33-LNPにCovid19スパイクタンパク質mRNAを封入し、マウス筋肉内投与（10 μl）後におけるスパイクタンパク質に対する抗体量を、投与後1週目および3週目に測定した。
　得られた結果を図１８に示す。図１８は、モデルナ型LNPと比較して、化合物33-LNPによる抗体産生量は、3週目において若干低下することを示している。
試験例１９
スパイクタンパク質の全長タンパク質を指標としたモデルナ型および化合物33-LNPによる抗体力価の評価
　試験例１７に方法に従い、モデルナ型および化合物33-LNPにCovid19スパイクタンパク質mRNAを封入し、マウス筋肉内投与（10 μl）後におけるスパイクタンパク質に対する抗体の力価を投与後5週目に測定した。
　得られた結果を図１９に示す。図１９は、スパイクタンパク質の全長タンパク質を指標に抗体の力価を評価した結果、モデルナ型LNPと比較して、化合物33-LNPによる抗体力価に有意な差異は認められなかった。
　本発明は、以下の実施態様を包含することができる。
＜C-グリコシド単糖脂質化合物＞
［１］
　式（I）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
 ［式中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　R2は、水素原子、置換されてもよいヒドロキシ基、または、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R3は、水素原子、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシであり、
　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシであり、
　R5、R6およびR7はそれぞれ独立して、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線はそれぞれ独立して、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す。］
で示されるC-グリコシド糖脂質化合物。
［２］
　式（I）中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　R2は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R3は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R5、R6およびR7はそれぞれ独立して、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線はそれぞれ独立して、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す、［１］記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
［３］
　式（I）中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　R2は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
　R3は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
　R5、R6およびR7はそれぞれ独立して、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線はそれぞれ独立して、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す、［１］または［２］記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
［４］
　　式（I’’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
 ［式中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシ基であり、
　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線は、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す。］
で示される、［１］から［３］のいずれか記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
［５］
　R1がフルオロである、［１］から［４］のいずれか記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
［６］
　点線がZ体の二重結合である、［１］から［５］のいずれか記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
＜C-グリコシド二糖脂質化合物＞
［７］
　式（II）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
 ［式中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　R2は、水素原子、置換されてもよいヒドロキシ基、または、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R3は、水素原子、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシであり、
　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシであり、
　R5、R6およびR7はそれぞれ独立して、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線はそれぞれ独立して、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す。］
で示されるC-グリコシド糖脂質化合物。
［８］
　式（II）中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　R2は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R3は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
　R5、R6およびR7はそれぞれ独立して、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線はそれぞれ独立して、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す、［７］記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
［９］
　式（II）中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
　R2は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
　R3は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
　R5、R6およびR7はそれぞれ独立して、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線はそれぞれ独立して、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す、［７］または［８］記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
［１０］
　式（II’’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 ［式中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシ基であり、
　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
　点線は、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す。］
で示される、［７］から［９］のいずれか記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
［１１］
　R1がフルオロである、［７］から［１０］のいずれか記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
［１２］
　点線がZ体の二重結合である、［７］から［１１］記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
＜LNP＞
［１３］
　［１］から［６］、および［７］から［１２］のいずれか記載のC-グリコシド糖脂質化合物、ならびに（ａ）核酸分子、（ｂ）カチオン性脂質、（ｃ）凝集抑制剤（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質またはＰＥＧ修飾脂質など）、および（ｄ）ステロールを含む、脂質ナノ粒子。
＜医薬組成物＞
［１４］
　［１３］記載の脂質ナノ粒子を含む、医薬組成物。
［１５］
　ワクチンである、［１４］記載の医薬組成物。

Claims (15)

  1. 　式（I）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
    　R2は、水素原子、置換されてもよいヒドロキシ基、または、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
    　R3は、水素原子、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシであり、
    　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシであり、
    　R5、R6およびR7はそれぞれ独立して、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
    　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
    　点線はそれぞれ独立して、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す。］
    で示されるC-グリコシド糖脂質化合物。
  2. 　式（I）中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
    　R2は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
    　R3は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
    　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
    　R5、R6およびR7はそれぞれ独立して、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
    　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
    　点線はそれぞれ独立して、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す、請求項１記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
  3. 　式（I）中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
    　R2は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
    　R3は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
    　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
    　R5、R6およびR7はそれぞれ独立して、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
    　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
    　点線はそれぞれ独立して、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す、請求項２記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
  4. 　式（I’’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシ基であり、
    　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
    　点線は、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す。］
    で示される、請求項３記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
  5. 　R1がフルオロである、請求項４記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
  6. 　点線がZ体の二重結合である、請求項５記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
  7. 　式（II）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
    　R2は、水素原子、置換されてもよいヒドロキシ基、または、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
    　R3は、水素原子、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシであり、
    　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）、二級アミド化されてもよいアミノ、またはアルキル化もしくはエステル化されてもよいヒドロキシであり、
    　R5、R6およびR7はそれぞれ独立して、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
    　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
    　点線はそれぞれ独立して、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す。］
    で示されるC-グリコシド糖脂質化合物。
  8. 　式（II）中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
    　R2は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
    　R3は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
    　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、１つ以上のエステル結合、アミド結合および／またはエーテル結合によって任意に中断されてよい）であり、
    　R5、R6およびR7はそれぞれ独立して、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
    　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
    　点線はそれぞれ独立して、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す、請求項７記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
  9. 　式（II）中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシであり、
    　R2は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
    　R3は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
    　R4は、直鎖または分枝鎖の、飽和の、置換されてもよいC11－C15アルキル（ここに、アルキルは、いずれの結合にも中断されていない）であり、
    　R5、R6およびR7はそれぞれ独立して、水素原子、またはグリコシル結合により連結した糖鎖であり、
    　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
    　点線はそれぞれ独立して、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す、請求項８記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
  10. 　式（II’’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     ［式中、R1は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシ基であり、
    　波線はそれぞれ独立して、結合する炭素が不斉炭素原子である場合、結合の立体化学がS配置およびR配置のいずれか単一のものを指し、そして
    　点線は、結合の存在または不存在を示し、結合が存在し、二重結合を示す場合、Z体およびE体のいずれか単一のものを指す。］
    で示される、請求項９記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
  11. 　R1がフルオロである、請求項１０記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
  12. 　点線がZ体の二重結合である、請求項１１記載のC-グリコシド糖脂質化合物。
  13. 　請求項１から６、および請求項７から１２のいずれか記載のC-グリコシド糖脂質化合物、ならびに（ａ）核酸分子、（ｂ）カチオン性脂質、（ｃ）凝集抑制剤（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質またはＰＥＧ修飾脂質など）、および（ｄ）ステロールを含む、脂質ナノ粒子。
  14. 　請求項１３記載の脂質ナノ粒子を含む、医薬組成物。
  15. 　ワクチンである、請求項１４記載の医薬組成物。
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