WO2024049111A1 - Ph-민감성 프랙탈 구조 폴리아닐린을 이용한 고감도 글루코즈 센서 및 이의 제조방법 - Google Patents

Ph-민감성 프랙탈 구조 폴리아닐린을 이용한 고감도 글루코즈 센서 및 이의 제조방법 Download PDF

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WO2024049111A1
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glucose
sensor
polyaniline
film
manufacturing
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허도성
신보경
프리양카쿨쉬레스타
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인제대학교 산학협력단
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    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/50—Detection characterised by immobilisation to a surface

Definitions

  • the present invention relates to a highly sensitive glucose sensor using pH-sensitive fractal structure polyaniline and a method of manufacturing the same. More specifically, the present invention relates to glucose concentration by changing the electrical conductivity according to pH of fractal-dendrite structure polyaniline coated on a porous polymer film. This is a technology related to a sensor that can selectively measure and its manufacturing method.
  • a sensor is a device that selectively captures physical or chemical quantities of a measurement object, converts them into useful signals, and outputs them.
  • Electrochemical biosensors are used as devices to detect various analysis targets in the environment, medicine, and food-related fields by using bioreceptors such as enzymes, microorganisms, and immune bodies. In particular, in the medical field, they are used to detect target substances such as glucose, cholesterol, and amino acids. It has the characteristic of being able to selectively, quickly and accurately measure target substances due to its high reaction specificity and fast response.
  • a blood sugar sensor is a type of electrochemical biosensor that measures the concentration of glucose in blood or urine.
  • Most existing commercialized blood sugar sensors use glucose oxidase (GOD), which oxidizes glucose. When glucose is oxidized, oxygen or the oxidized medium is changed to hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) or a reduced medium, and when it returns to its original oxidized form, electrons (e - ) are generated, and the current generated at this time is measured.
  • GOD glucose oxidase
  • An electro-chemical method is used to quantify glucose.
  • GOD an enzyme used in glucose sensors, is easy to supply and is more stable than other enzymes in terms of pH, ionic strength, and temperature.
  • the optimal conditions for GOD to oxidize glucose are consistent with the concentration of glucose in human blood, but it has a structure similar to glucose. Fructose, maltose, and xylose, as well as cysteine, uric acid, and vitamin C, can produce H 2 O 2 through similar oxidation-reduction reactions, causing errors by interfering with blood glucose measurement.
  • the purpose of the present invention is to provide a glucose sensor and a method of manufacturing the same that can increase sensitivity and selectivity to glucose while minimizing interference from fructose, which is similar to glucose.
  • the present invention is an electrochemical sensor comprising a porous polymer substrate having a plurality of holes, wherein the holes are modified with polyaniline grown in a fractal dendrite structure.
  • the holes may have an average diameter of 4 to 8 ⁇ m.
  • the polymers include polystyrene (PS), polycaprolactone (PCL), polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), and polyvinyl chloride (PVC). , poly N-vinyl pyrrolidone (PVP), and polymethyl methacrylate (PMMA).
  • PS polystyrene
  • PCL polycaprolactone
  • PGA polyglycolic acid
  • PLA polylactic acid
  • PVC polyvinyl chloride
  • PVP poly N-vinyl pyrrolidone
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • a sensor for detecting glucose comprising a porous polymer substrate having a plurality of holes, wherein the holes are modified with polyaniline containing glucose oxidase (GOD).
  • GOD glucose oxidase
  • the polyaniline can be grown into a fractal dendrite structure.
  • the holes may have an average diameter of 4 to 8 ⁇ m.
  • the porous polymer substrate may be in a form where the holes form a honeycomb pattern (honeycomb-patterned, HCP).
  • the polymers include polystyrene (PS), polycaprolactone (PCL), polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), and polyvinyl chloride (PVC). , poly N-vinyl pyrrolidone (PVP), and polymethyl methacrylate (PMMA).
  • PS polystyrene
  • PCL polycaprolactone
  • PGA polyglycolic acid
  • PLA polylactic acid
  • PVC polyvinyl chloride
  • PVP poly N-vinyl pyrrolidone
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • the sensor can selectively detect only glucose by reducing interference caused by pseudo-fructose.
  • the present invention includes the steps of manufacturing a porous polymer film having a plurality of holes; Modifying the holes into polyaniline by immersing the prepared film in an aniline aqueous solution; and fixing glucose oxidase (GOD) on the polyaniline.
  • the step of manufacturing a porous polymer film having a plurality of holes includes preparing a polymer solution by adding a hydrophobic polymer and an oxidizing agent into a volatile solvent; And pouring the prepared polymer solution into a glass container and drying it in a humidity chamber.
  • the oxidizing agent may be benzoyl peroxide (BPO).
  • the oxidizing agent may be included in an amount of 10 to 40 parts by weight based on 100 parts by weight of the total polymer solution.
  • the step of modifying the polyaniline may be performed by immersing the prepared film in an aniline aqueous solution for 0.5 to 5 hours to grow polyaniline with a fractal dendrite structure.
  • the step of fixing glucose oxidase (GOD) to the polyaniline may be performed by immersing the film in which the holes have been modified with polyaniline in a crosslinking agent, and then immersing the film in a glucose oxidase (GOD) solution.
  • GOD glucose oxidase
  • the crosslinking agent may be glutaraldehyde.
  • the hole may be modified into polyaniline polymerized through an interfacial polymerization reaction using the oxidizing agent.
  • the present invention provides a method of detecting glucose in blood using a sensor for detecting glucose manufactured according to the above manufacturing method.
  • fractal dendrite structures require external sources such as electrode-setup, plasma or gas flow systems, or expensive tools, but in the present invention, they cannot be easily made using simple chemical methods.
  • a method for easily producing polyaniline with a fractal dendrite structure through interfacial polymerization can be provided.
  • the glucose sensor according to the present invention can be modified with polyaniline having a fractal dendrite structure using the above method, thereby improving the sensing effect for glucose by increasing pH sensitivity.
  • the glucose sensor according to the present invention can measure the concentration of only glucose with high sensitivity while minimizing interference by pseudo-fructose, which is the biggest problem with conventional glucose kits.
  • HCP honeycomb-patterned
  • PS porous polystyrene
  • Flat flat film
  • SEM Scanning electron microscope
  • Figure 2 is an SEM image of the surface of a polyaniline HCP porous film and a flat film (Flat) with a fractal structure containing glucose oxidase (GOD) prepared according to an embodiment of the present invention, (a) shows BPO 10 wt%, (b) contains 15 wt%, (c) contains 20 wt%, and (d) contains 30 wt%.
  • Figure 3 schematically shows the manufacturing process of a film according to an embodiment of the present invention
  • (a) is the manufacturing process of the HCP porous PS film containing BPO
  • (b) is the manufacturing process of the HCP porous PS film using the PS film.
  • This is the manufacturing process of HCP porous film in which a polyaniline fractal structure is formed.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of the chemical reaction between glucose oxidase (GOD) enzyme and glutaraldehyde.
  • Figure 5 is an SEM image of a fractal structure growing according to immersion time according to an experimental example of the present invention, showing the change in fractal structure according to an immersion time of 0.5 to 3 hours at 30 wt% BPO and 1M aniline (ANI) concentration conditions. It represents.
  • Figure 6 shows SEM images of the phase diagram and fractal structure between various BPO weight percent and aniline (ANI) concentration ratios.
  • Figure 7 shows the change in contact angle between the HCP porous film and the flat film according to various weight percent of BPO according to another experimental example of the present invention.
  • Figure 8 is a graph of the results of measuring the conductivity of the film prepared according to the above example, (a) is a polyaniline planar (PANI-f) film, and (b) is a graph of the pH change of the polyaniline fractal (PF) film. This is the conductivity according to
  • Figure 9 schematically shows the process of analyzing changes after introducing a film containing a polyaniline (PANI)/glucose oxidase (GOD) complex into a glucose solution according to another experimental example of the present invention.
  • PANI polyaniline
  • GOD glucose oxidase
  • FIG. 10 schematically shows the glucose sensing mechanism by the PANI/GOD complex.
  • Figure 11 shows the conductivity change and response time according to glucose concentration, along with a diabetes level and blood sugar level chart for glucose concentration within 60 seconds.
  • Figure 12 shows the conductivity change observed within 60 seconds.
  • Figure 13 shows the change in conductivity depending on the concentration of glucose and similar sugars.
  • Figure 14 shows the droplet profile along the film, (a) showing the droplet profile, contact angle and three interfacial tensions on a solid surface, and (b) showing the behavior of the droplet on the PANI surface with a water CA of 102.2°.
  • (c) is the profile of a droplet in the PANI fractal structure of bubble formation
  • (d) is a typical SEM image of the fractal expansion morphology.
  • the present inventors developed a method for the first time to easily produce polyaniline with a fractal dendrite structure, which cannot be easily produced by conventional simple chemical methods, by interfacial polymerization, and used polyaniline with improved pH sensitivity of the fractal dendrite structure produced in this way.
  • a modified electrochemical sensor was manufactured.
  • the present invention provides an electrochemical sensor comprising a porous polymer substrate having a plurality of holes, wherein the holes are modified with polyaniline grown in a fractal dendrite structure.
  • the average diameter of the hole may be 4 to 8 ⁇ m, preferably 5 to 7 ⁇ m, and more preferably 6 ⁇ m, but is not limited thereto.
  • the porous polymer substrate may be in a form where the holes form a honeycomb-patterned (HCP) pattern.
  • HCP honeycomb-patterned
  • the polymers include polystyrene (PS), polycaprolactone (PCL), polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), polyvinyl chloride (PVC), It may be one or more hydrophobic polymers selected from the group consisting of poly N-vinyl pyrrolidone (PVP) and polymethyl methacrylate (PMMA). Since hydrophilic polymer substrates may melt or deform during the modification process, it is preferable to use hydrophobic polymers as described above.
  • the polyaniline may be grown in a fractal dendrite structure.
  • the present inventors interfacially polymerized polyaniline with a fractal dendrite structure, which cannot be easily made using conventional simple chemical methods. was the first to develop an easy production method, and a glucose sensor was manufactured by introducing glucose oxidase into polyaniline, which has improved pH sensitivity of the fractal dendrite structure thus produced, and the sensor was manufactured using a chemical method different from the conventional electro-chemical method. By confirming that only glucose can be selectively measured, the present invention was completed.
  • the present invention provides a sensor for detecting glucose, comprising a porous polymer substrate having a plurality of holes, wherein the holes are modified with polyaniline containing glucose oxidase (GOD).
  • GOD glucose oxidase
  • the average diameter of the hole may be 4 to 8 ⁇ m, preferably 5 to 7 ⁇ m, and more preferably 6 ⁇ m, but is not limited thereto.
  • the porous polymer substrate may be in a form where the holes form a honeycomb-patterned (HCP) pattern.
  • HCP honeycomb-patterned
  • the polymers include polystyrene (PS), polycaprolactone (PCL), polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), polyvinyl chloride (PVC), It may be one or more hydrophobic polymers selected from the group consisting of poly N-vinyl pyrrolidone (PVP) and polymethyl methacrylate (PMMA). Since hydrophilic polymer substrates may melt or deform during the modification process, it is preferable to use hydrophobic polymers as described above.
  • the polyaniline may be grown in a fractal dendrite structure.
  • polyaniline with a fractal dendrite structure had higher pH sensitivity and improved conductivity accordingly compared to a simple polyaniline structure.
  • polyaniline with this structure By using polyaniline with this structure, the sensitivity of glucose detection can be further improved. there is.
  • the sensor uses the principle that the electrical conductivity of polyaniline increases by lowering the pH due to H + generated when glucose is oxidized to gluconic acid by glucose oxidase (GOD), a glucose decomposition enzyme, and fructose Since pseudo-fructose such as fructose cannot produce acid by GOD even if it generates hydrogen peroxide, only glucose can be selectively detected with high sensitivity while minimizing interference by pseudo-fructose, which is the biggest problem with conventional commercialized kits.
  • GOD glucose oxidase
  • the glucose sensing effect can be improved due to the porous polymer substrate in which multiple holes form a honeycomb pattern according to the present invention, and by modifying it with polyaniline of a fractal dendrite structure, a glucose sensor with higher sensitivity and higher selectivity can be produced. can be provided.
  • conductivity improved as the glucose concentration increased and it was confirmed that the conductivity change was more evident at the glucose concentration corresponding to diabetic patients, which is useful for checking and monitoring blood sugar changes in diabetic patients. It can be utilized effectively.
  • the present invention includes the steps of manufacturing a porous polymer film having a plurality of holes; Modifying the holes into polyaniline by immersing the prepared film in an aniline aqueous solution; and fixing glucose oxidase (GOD) on the polyaniline.
  • the step of manufacturing a porous polymer film having a plurality of holes includes preparing a polymer solution by adding a hydrophobic polymer and an oxidizing agent into a volatile solvent; And pouring the prepared polymer solution into a glass container and drying it in a humidity chamber.
  • the step of preparing the polymer solution may be performed by dissolving the hydrophobic polymer and the oxidizing agent in a volatile solvent.
  • the hydrophobic polymers include polystyrene (PS), polycaprolactone (PCL), polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), and polyvinyl chloride (PVC). , poly N-vinyl pyrrolidone (PVP), and polymethyl methacrylate (PMMA), but is not limited thereto.
  • the volatile solvent is chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, tetrahydrofuran (THF), 1,4-dioxane, 1,1-dichloro. It may be one or more selected from the group consisting of ethylene (1,1-dichloroethylene) and carbon tetrachloride, but is not limited thereto.
  • the oxidizing agent is capable of polymerizing aniline into polyaniline by dissolving in the volatile solvent, and is preferably benzoyl peroxide (BPO), but is not limited thereto.
  • the oxidizing agent may be included in an amount of 10 to 40 parts by weight, preferably 20 to 40 parts by weight, and more preferably 30 parts by weight, based on 100 parts by weight of the polymer solution, but is not limited thereto.
  • the hydrophobic polymer and the oxidizing agent may be included in a weight ratio of 1:(0.1 to 0.7), preferably 1:(0.3 to 0.5), but are not limited thereto.
  • the drying step may be performed by pouring the prepared polymer solution into a glass container and storing it in a humidity chamber to evaporate the solvent.
  • the humidity chamber may be maintained at a high humidity of 70 to 90%, but is not limited thereto.
  • the solvent evaporates in the high-humidity chamber, the temperature of the solution surface drops rapidly due to the heat taken away, causing the humidity to condense into water droplets, and the continued evaporation of the solvent causes self-organization in which the water droplets are packed. As this occurs, a porous film having micrometer-sized holes can be obtained, so the solvent is preferably a volatile solvent.
  • the step of modifying the holes with polyaniline involves immersing the prepared film in an aniline aqueous solution for 0.5 to 5 hours, preferably 0.5 to 3 hours to form fractal dendrites. ) can be performed by growing with polyaniline of the structure.
  • the aniline aqueous solution may specifically be an aniline hydrochloride aqueous solution.
  • the step of fixing glucose oxidase (GOD) to the polyaniline includes immersing the film in which the holes have been modified with polyaniline in a crosslinking agent, and then immersing the film in a glucose oxidase (GOD) solution. It can be performed by immersion.
  • the cross-linking agent may be glutaraldehyde,
  • the film immersed in the aniline aqueous solution may be immersed in an aqueous solution of glutaraldehyde, which acts as a covalent cross-linker of GOD, with continuous stirring for 1 to 2 hours, and then immersed in an aqueous solution of glutaraldehyde at pH 7 and 4°C.
  • Enzyme immobilization on the polyaniline backbone can be achieved by soaking in GOD phosphate buffer for 1 hour.
  • aniline can be polymerized into polyaniline, preferably polyaniline with a fractal-dendrite structure, through an interfacial polymerization reaction by an oxidizing agent on the surface or hole of the film,
  • a glucose sensor can be manufactured by attaching GOD to the polyaniline with the glutaraldehyde.
  • the present invention provides a method of detecting glucose in blood using a glucose detection sensor manufactured according to the method for manufacturing the glucose detection sensor.
  • the conductivity change appears more clearly at the glucose concentration corresponding to the diabetic patient, and this can be usefully used to check and monitor blood sugar changes in the diabetic patient.
  • polystyrene (PS) containing 10, 15, 20, and 30 wt% of benzoyl peroxide (BPO) was first dissolved in chloroform.
  • the polymer solution containing BPO was poured into a glass Petri dish and dried naturally. After evaporating the solvent, i.e. chloroform, a translucent flat PS/BPO film was obtained. Afterwards, this film was immersed in a 1M aniline hydrochloride solution, and the BPO present in the PS film initiated interfacial polymerization and appeared at the interface (surface) of the PS film. This chemical oxidation reaction proceeded for 1 hour.
  • the HCP porous polystyrene (PS) film was produced by the breath figure (BF) method described in Example 1-1, using the same concentration of benzoyl peroxide (BPO) as the PANI-Flat film in Example 1-2.
  • the prepared polymer solution was cast at 70-80% relative humidity and completely dried to obtain an opaque HCP porous PS film, which was then functionalized by performing similar interfacial polymerization of the PANI-Flat film. After functionalization was completed, the film was taken out, washed, and air-dried. During polymerization, the color of the film changed from white to dark green. Green is the characteristic color of emeraldine salt (ES), which is the conductive form of PANI.
  • the produced film was labeled HCP-PANI ( Figure 2).
  • Covalent immobilization of GOD using the cross-linker glutaraldehyde can be performed under appropriate conditions so that the enzyme activity is not significantly denatured, and thus, the formation of a complete PANI/GOD complex on the surface of the HCP porous film can be confirmed ( Figures 3 and 3 4).
  • the growth path of the fractal structure formed only by interfacial polymerization without using an electrochemical method varies depending on two factors: time and concentration.
  • Figure 5 shows the complete time-dependent growth of PANI fractals on HCP porous films, showing the growth of polyaniline branching-fractals (PBF) with various immersion times, followed by stochasting release. Polymerization steps such as nucleation, nucleation, and growth may follow.
  • PPF polyaniline branching-fractals
  • PANI's growth process satisfies the self-similarity and iterative generation principals of fractal theory. These processes have the same consistency for time-dependent polymerization. Specifically, spherical particles were formed at the initial stage of the reaction (0.5 h), and after 1 h of polymerization, they aggregated into larger particles with elongated stems, generating PANI of different dimensions. Then, as the reaction time progressed to 2 hours, the formation of small fractals, abbreviated as polyaniline small fractals (PSF), was observed. PSF is associated with nano-structured PANI with irregular surfaces. A structure of more extended dimensions was formed and continued to grow uniformly along the edge with secondary branches.
  • PSF polyaniline small fractals
  • Contact angle shows the difference between the surface of the HCP porous film and the surface of the flat film.
  • the HCP porous film has a higher virtual water repellency than the flat film and has an excellent ability to catch water droplets. showed characteristics. This is expected to be due to the capillary force of the pores formed at the location where the water droplets contact the film. In other words, it has unique, seemingly contradictory characteristics, such as repelling water droplets while also grabbing them.
  • This characteristic plays a major role in capturing glucose droplets in the pores of the film surface in glucose sensing applications using HCP porous films, and can also provide high sensitivity.
  • the conductivity measurement results showed that the conductivity of the HCP porous film (PF) coated with PANI, which is sensitive to pH changes due to the structure of PANI, increased compared to the flat film (PANI-f).
  • the conductivity value of the PANI-f film is 1.68 ⁇ 10 -5 to 3.1 ⁇ 10 -2
  • the conductivity value of the PF film is 2.2 ⁇ 10 -5
  • This difference in conductivity may be due to the structure of the HCP porous film, which contains fractal features that increase the surface area.
  • PANI is well known to show excellent conductivity in acidic media. Doping PANI with strong acids and bases in the polymer backbone can change the microenvironment of nitrogen atoms and shift the local pH. In other words, the conductivity can be improved by topographical modification as well as surface modification of the fractal-assisted HCP porous film. Therefore, these features can be applied to glucose sensing applications.
  • the film containing the PANI/GOD complex prepared according to Examples 1-3 was introduced into a glucose solution.
  • the film on which the PANI/GOD complex was formed was cut into 1.5 cm ⁇ 1.5 cm pieces, immersed in a phosphate buffer solution of pH 7, and an aqueous glucose solution was added dropwise.
  • the film was immediately taken out, immersed in a liquid nitrogen bottle for 5 minutes, and then freeze-dried in a freeze dryer for 6 hours to completely remove moisture trapped inside the film. After complete drying, the pore surface morphology, wettability, and conductivity of the film surface were compared ( Figure 9).
  • the pH-sensitive PANI/GOD complex containing a fractal structure responds very sensitively to the addition of glucose.
  • gluconic acid is produced after the addition of glucose.
  • Gluconic acid can only be produced through films containing GOD enzymes. This enzyme is very selective for glucose molecules, and other molecules do not produce any type of acid.
  • the addition of glucose individual fractal structures containing gluconic acid leads to expansion due to the gluconic acid hydrogen ion concentration. Different concentrations of glucose can change its conductivity from 5.2 ⁇ 10 -5 to 4.3 ⁇ 10 -1 S ⁇ cm -1 .
  • This pH response starts at a very low concentration of 0.5 mm/dm 3 to 25 mm/dm 3 and is also related to the blood sugar concentration of diabetic patients, as shown in FIG. 11.
  • Figures 12 and 13 show the selectivity and specificity of the glucose sensor.
  • the glucose sensor according to the present invention is very sensitive, with a conductivity response reaching within 60 seconds. there is.
  • it can be judged to be useful as a glucose sensor as it shows a high conductivity response by achieving a concentration of 15 to 25 mmol in the range of 10 -2 to 10 -1 S ⁇ cm -1 within 60 seconds.
  • the glucose sensor according to the present invention generates H + generated when glucose is oxidized to gluconic acid by glucose oxidase (GOD), a glucose decomposition enzyme contained in polyaniline. It uses the principle that the electrical conductivity of polyaniline increases by lowering the pH. Since pseudo-fructose such as fructose does not produce acid by GOD, it minimizes interference by pseudo-fructose, which is the biggest problem with conventional commercialized kits. It can be confirmed that the concentration of glucose alone can be measured with high sensitivity.
  • GOD glucose oxidase

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Abstract

본 발명은 pH-민감성 프랙탈 구조 폴리아닐린을 이용한 고감도 글루코즈 센서 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 다수의 홀을 가지는 다공성 고분자 기재를 포함하며, 상기 홀은 글루코즈옥시데이즈(glucose oxidase, GOD)를 포함하는 폴리아닐린으로 개질된 것을 특징으로 하는, 글루코즈 검출용 센서 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따른 글루코즈 센서는 프랙탈 덴드라이트 구조의 폴리아닐린으로 개질함으로써, pH 민감도를 높여 글루코즈에 대한 센싱 효과를 향상시킬 수 있고, 유사 과당에 의한 간섭을 최소화하면서 글루코즈만의 농도를 고감도로 측정할 수 있다.

Description

PH-민감성 프랙탈 구조 폴리아닐린을 이용한 고감도 글루코즈 센서 및 이의 제조방법
본 발명은 pH-민감성 프랙탈 구조 폴리아닐린을 이용한 고감도 글루코즈 센서 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 다공성 고분자 필름에 코팅된 프랙탈-덴드라이트 구조의 폴리아닐린의 pH에 따른 전기전도도 변화에 의해 글루코즈 농도를 선택적으로 측정할 수 있는 센서 및 이의 제조방법에 관한 기술이다.
센서(sensor)는 측정 대상의 물리량이나 화학량을 선택적으로 포착하여 유용한 신호로 변환 및 출력하는 장치이다. 전기화학적 바이오센서는 효소, 미생물, 면역체 등의 바이오 리셉터를 이용하여 환경, 의학, 식품 관련 분야에서 다양한 분석 대상을 검출하는 장치로써 사용되고 있으며, 특히 의학 분야에서는 글루코즈, 콜레스테롤, 아미노산 등과 같은 대상 물질에 대한 높은 반응 특이성과 빠른 응답성으로 인해 대상 물질을 선택적이고도 신속·정확하게 측정할 수 있는 특징이 있다.
혈당 센서는 이러한 전기화학적 바이오센서의 일종으로서 혈액 또는 소변 내의 글루코즈의 농도를 측정하는 것으로, 기존의 상용화된 혈당 센서는 대부분 글루코즈를 산화시키는 글루코즈옥시데이즈(glucose oxidase, GOD)를 이용한다. 글루코즈가 산화될 때 산소 또는 산화된 매개체가 과산화수소(H2O2) 또는 환원된 매개체로 바뀌고, 다시 원래의 산화된 형태로 되돌아올 때 전자(e-)가 발생하는데, 이때 발생하는 전류를 측정하여 글루코스를 정량화하는 전기-화학적 방법을 이용한다. 글루코즈 센서에 사용되는 효소인 GOD는 공급이 용이하고 다른 효소보다 pH, 이온강도, 온도에 대해 안정하며 GOD가 글루코즈를 산화시키는 최적 조건이 사람 혈액 속의 글루코즈 농도와 일치하나, 글루코즈와 유사한 구조를 하고 있는 프룩토즈, 말토즈, 자일로즈는 물론 시스테인, 요산, 비타민 C 등도 유사한 산화-환원 반응에 의해 H2O2를 생성할 수 있어 혈당 클루코즈 측정을 간섭함으로써 오차를 초래하는 문제가 있다.
이에 글루코즈만 선택적으로 측정할 수 있는 방법에 관한 연구가 국내외에서 많이 진행되고 있다. 대표적으로는 글루코즈 센서를 적혈구 세포막과 같이 글루코즈만 통과시킬 수 있는 물질로 코팅하여 유사한 과당의 센서 접근을 방지함으로써 오차를 줄이는 방법 등이 연구되고 있으나, 상용화된 키트에 의한 방법으로는 혈중에 존재하는 많은 유사 물질에서 만들어질 수 있는 H2O2를 배제하기가 쉽지 않고, 연구 결과로 얻어지는 방법들은 시스템이 복잡하여 당장 상용화가 어려운 한계점이 있다.
이에, 글루코즈와 유사한 과당의 간섭을 최소화하면서 글루코즈에 대한 민감성 및 선택성을 높일 수 있는 새로운 형태의 글루코즈 센서가 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 글루코즈와 유사한 과당의 간섭을 최소화하면서 글루코즈에 대한 민감성 및 선택성을 높일 수 있는 글루코즈 센서 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다수의 홀을 가지는 다공성 고분자 기재를 포함하며, 상기 홀은 프랙탈-덴드라이트(fractal dendrite) 구조로 성장된 폴리아닐린으로 개질된 것을 특징으로 하는, 전기화학센서를 제공한다.
상기 홀은, 평균 직경이 4 내지 8 μm일 수 있다.
상기 고분자는, 폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리글라이콜산(polyglycolic acid, PGA), 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리비닐클로라이드(poly vinyl chloride, PVC), 폴리 N-비닐 피롤리돈(poly N-vinyl pyrrolidone, PVP), 및 폴리메틸메타크릴레이트(polymethyl methacrylate, PMMA)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 소수성 고분자일 수 있다.
또한, 다수의 홀을 가지는 다공성 고분자 기재를 포함하며, 상기 홀은 글루코즈옥시데이즈(glucose oxidase, GOD)를 포함하는 폴리아닐린으로 개질된 것을 특징으로 하는, 글루코즈 검출용 센서를 제공한다.
상기 폴리아닐린은, 프랙탈-덴드라이트(fractal dendrite) 구조로 성장될 수 있다.
상기 홀은, 평균 직경이 4 내지 8 μm 일 수 있다.
상기 다공성 고분자 기재는, 상기 홀이 벌집 패턴(honeycomb-patterned, HCP)을 이루는 형태일 수 있다.
상기 고분자는, 폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리글라이콜산(polyglycolic acid, PGA), 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리비닐클로라이드(poly vinyl chloride, PVC), 폴리 N-비닐 피롤리돈(poly N-vinyl pyrrolidone, PVP), 및 폴리메틸메타크릴레이트(polymethyl methacrylate, PMMA)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 소수성 고분자일 수 있다.
상기 센서는, 유사 과당에 의한 간섭을 감소시켜 글루코즈만을 선택적으로 검출할 수 있다.
또한, 본 발명은 다수의 홀을 가지는 다공성 고분자 필름을 제조하는 단계; 상기 제조된 필름을 아닐린 수용액에 침지시켜 상기 홀을 폴리아닐린으로 개질시키는 단계; 및 상기 폴리아닐린에 글루코즈옥시데이즈(glucose oxidase, GOD)를 고정시키는 단계;를 포함하는, 글루코즈 검출용 센서의 제조방법을 제공한다.
상기 다수의 홀을 가지는 다공성 고분자 필름을 제조하는 단계는, 소수성 고분자 및 산화제를 휘발성 용매에 넣어 고분자 용액을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 고분자 용액을 유리 용기에 붓고 습도 챔버에서 건조시키는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 산화제는, 벤조일 퍼옥사이드(benzoyl peroxide, BPO) 일 수 있다.
상기 산화제는, 상기 고분자 용액 전체 100 중량부에 대하여, 10 내지 40 중량부로 포함될 수 있다.
상기 폴리아닐린으로 개질시키는 단계는, 상기 제조된 필름을 아닐린 수용액에 0.5 내지 5시간 동안 침지시켜 프랙탈-덴드라이트(fractal dendrite) 구조의 폴리아닐린으로 성장시켜 수행될 수 있다.
상기 폴리아닐린에 글루코즈옥시데이즈(GOD)를 고정시키는 단계는, 상기 홀이 폴리아닐린으로 개질된 필름을 가교제에 침지시킨 후, 상기 필름을 글루코즈옥시데이즈(GOD) 용액에 침지시켜 수행될 수 있다.
상기 가교제는, 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 일 수 있다.
상기 홀은, 상기 산화제에 의한 계면 중합(interfacial polymerization) 반응으로 중합된 폴리아닐린으로 개질될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 제조방법에 따라 제조된 글루코즈 검출용 센서를 사용하여 혈액 내 글루코즈를 검출하는 방법을 제공한다.
일반적으로 프랙탈 덴드라이트 구조는 전극 설정(electrode-setup), 플라즈마 또는 가스 흐름 시스템(gas flow system)과 같은 외부 소스 또는 고가의 도구가 필요하나, 본 발명에서는 단순 화학적인 방법으로는 쉽게 만들 수 없는 프랙탈 덴드라이트 구조의 폴리아닐린을 계면 중합에 의해 쉽게 생성하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 글루코즈 센서는 상기의 방법을 이용하여 프랙탈 덴드라이트 구조의 폴리아닐린으로 개질함으로써, pH 민감도를 높여 글루코즈에 대한 센싱 효과를 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 글루코즈 센서는 종래의 글루코즈 키트의 가장 큰 문제점인 유사 과당에 의한 간섭을 최소화하면서 글루코즈만의 농도를 고감도로 측정할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 다양한 중량부의 벤조일 퍼옥사이드(benzoyl peroxide, BPO)를 포함하여 제조된 벌집 패턴(honeycomb-patterned, HCP) 다공성 폴리스티렌(polystyrene, PS) 필름 및 평면 필름(Flat) 표면의 주사전자현미경(SEM) 이미지로, (a)는 BPO가 10 wt%, (b)는 15 wt%, (c)는 20 wt%, 및 (d)는 30 wt% 포함된 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 글루코즈옥시데이즈(glucose oxidase, GOD)가 포함된 프랙탈 구조의 폴리아닐린 HCP 다공성 필름 및 평면 필름(Flat) 표면의 SEM 이미지로, (a)는 BPO가 10 wt%, (b)는 15 wt%, (c)는 20 wt%, 및 (d)는 30 wt% 포함된 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 필름의 제조과정을 개략적으로 나타낸 것으로, (a)는 BPO를 포함하는 HCP 다공성 PS 필름의 제조과정, (b)는 상기 PS 필름을 이용하여 GOD가 포함된 폴리아닐린 프렉탈 구조가 형성된 HCP 다공성 필름의 제조과정이다.
도 4는 글루코즈옥시데이즈(GOD) 효소와 글루타르알데히드(glutaraldehyde)의 화학 반응의 개략도이다.
도 5는 본 발명의 일 실험예에 따른 침지 시간에 따라 성장하는 프랙탈 구조의 SEM 이미지로, 30 wt% BPO 및 1M 아닐린(ANI) 농도 조건에서 0.5 내지 3 시간의 침지 시간에 따라 프랙탈 구조의 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 다양한 BPO 중량% 및 아닐린(ANI) 농도 비 사이의 상평형도(phase diagram) 및 프랙탈 구조의 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 다른 실험예에 따라 다양한 BPO 중량%에 따른 HCP 다공성 필름 및 평면 필름 사이의 접촉각 변화를 나타낸 것이다.
도 8은 상기 실시예에 따라 제조된 필름의 전도도(conductivity)를 측정한 결과 그래프로, (a)는 폴리아닐린 평면(PANI-f) 필름, (b)는 폴리아닐린 프랙탈 (PF) 필름의 pH 변화에 따른 전도도이다.
도 9는 본 발명의 또 다른 실험예에 따라 폴리아닐린(PANI)/글루코즈옥시데이즈(GOD) 복합체가 형성된 필름을 글루코즈 용액에 도입한 후 변화를 분석하는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 10은 PANI/GOD 복합체에 의한 글루코즈 센싱 메커니즘을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 11은 글루코즈 농도에 따른 전도도 변화 및 반응 시간을 나타낸 것으로, 60초 이내 글루코즈 농도에 대한 당뇨병 수준 및 혈당 수치 차트와 함께 나타내었다.
도 12는 60초 이내 관찰된 전도도 변화를 나타낸 것이다.
도 13은 글루코즈 및 이와 유사한 당들의 농도에 따른 전도도 변화를 나타낸 것이다.
도 14는 필름에 따른 액적 프로파일을 나타낸 것으로, (a)는 고체 표면의 액적 프로파일, 접촉각 및 3가지 계면 장력을 표시하였고, (b)는 102.2°의 물 CA를 가진 PANI 표면에서 액적의 거동을, (c)는 기포 형성의 PANI 프랙탈 구조에서 액적의 프로파일, (d)는 프랙탈 팽창 형태의 전형적인 SEM 이미지이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명자들은 종래의 단순 화학적인 방법으로는 쉽게 만들 수 없는 프랙탈 덴드라이트 구조의 폴리아닐린을 계면 중합에 의해 쉽게 생성하는 방법을 최초로 개발하였고, 이렇게 생성된 프랙탈 덴드라이트 구조의 pH 민감도가 향상된 폴리아닐린을 이용하여 개질된 전기화학센서를 제조하였다.
본 발명은 다수의 홀(hole)을 가지는 다공성 고분자 기재를 포함하며, 상기 홀은 프랙탈-덴드라이트(fractal dendrite) 구조로 성장된 폴리아닐린으로 개질된 것을 특징으로 하는, 전기화학센서를 제공한다.
상기 전기화학센서에 있어서, 상기 홀은 평균 직경이 4 내지 8 μm, 바람직하게는 5 내지 7 μm, 보다 바람직하게는 6 μm 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 다공성 고분자 기재는 상기 홀이 벌집 패턴(honeycomb-patterned, HCP)을 이루는 형태일 수 있다.
상기 고분자는 폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리글라이콜산(polyglycolic acid, PGA), 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리비닐클로라이드(poly vinyl chloride, PVC), 폴리 N-비닐 피롤리돈(poly N-vinyl pyrrolidone, PVP), 및 폴리메틸메타크릴레이트(polymethyl methacrylate, PMMA)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 소수성 고분자일 수 있다. 친수성 고분자 기재는 개질 과정에서 녹거나 변형될 수 있는 바, 상기와 같은 소수성 고분자를 이용하는 것이 바람직하다.
상기 폴리아닐린은 프랙탈 덴드라이트(fractal dendrite) 구조로 성장된 것일 수 있다.
본 발명자들은 혈액의 글루코즈 검출에 있어서 방해 물질들의 영향을 받지 않는 고선택성 및 고감도를 가지는 안정한 글루코즈 센서를 개발하고자, 종래의 단순 화학적인 방법으로는 쉽게 만들 수 없는 프랙탈 덴드라이트 구조의 폴리아닐린을 계면 중합에 의해 쉽게 생성하는 방법을 최초로 개발하였고, 이렇게 생성된 프랙탈 덴드라이트 구조의 pH 민감도가 향상된 폴리아닐린에 글루코즈옥시데이즈를 도입하여 글루코즈 센서를 제조하였으며, 상기 센서가 종래의 전기-화학적 방법과 다른 화학적 방법으로 글루코즈만을 선택적으로 측정할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 다수의 홀(hole)을 가지는 다공성 고분자 기재를 포함하며, 상기 홀은 글루코즈옥시데이즈(glucose oxidase, GOD)를 포함하는 폴리아닐린으로 개질된 것을 특징으로 하는, 글루코즈 검출용 센서를 제공한다.
상기 홀은 평균 직경이 4 내지 8 μm, 바람직하게는 5 내지 7 μm, 보다 바람직하게는 6 μm 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 다공성 고분자 기재는 상기 홀이 벌집 패턴(honeycomb-patterned, HCP)을 이루는 형태일 수 있다.
상기 고분자는 폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리글라이콜산(polyglycolic acid, PGA), 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리비닐클로라이드(poly vinyl chloride, PVC), 폴리 N-비닐 피롤리돈(poly N-vinyl pyrrolidone, PVP), 및 폴리메틸메타크릴레이트(polymethyl methacrylate, PMMA)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 소수성 고분자일 수 있다. 친수성 고분자 기재는 개질 과정에서 녹거나 변형될 수 있는 바, 상기와 같은 소수성 고분자를 이용하는 것이 바람직하다.
상기 폴리아닐린은 프랙탈 덴드라이트(fractal dendrite) 구조로 성장된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실험예에 따르면, 단순 폴리아닐린 구조에 비해 프랙탈 덴드라이트 구조의 폴리아닐린에서 pH 민감도가 높고 그에 따른 전도도가 향상된 것으로 나타난 바, 이러한 구조의 폴리아닐린을 이용함으로써 글루코즈 검출의 민감도를 보다 향상시킬 수 있다.
상기 센서는 글루코즈 분해효소인 글루코즈옥시데이즈(GOD)에 의해 글루코즈가 글루콘산(gluconic acid)으로 산화되면서 발생하는 H+ 에 의해 pH가 낮아짐으로써 폴리아닐린의 전기전도도가 증가하는 원리를 이용한 것으로, 프룩토즈(fructose)와 같은 유사 과당은 과산화수소를 생성하더라도 GOD에 의해 산을 생성하지 못하므로 종래 상용화 키트의 가장 큰 문제점인 유사 과당에 의한 간섭을 최소화하면서 글루코즈만을 선택적으로 고감도로 검출할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 다수의 홀이 벌집 패턴을 이루는 다공성의 고분자 기재로 인해 글루코즈 센싱 효과를 향상시킬 수 있으며, 이를 프랙탈 덴드라이트 구조의 폴리아닐린으로 개질함으로써, 보다 더 고감도, 고선택성의 글루코즈 센서를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 글루코즈 농도가 증가할수록 전도도가 향상되었고, 당뇨 환자에 해당하는 글루코즈 농도에서 전도도 변화가 더 뚜렷하게 나타남을 확인한 바, 이를 당뇨 환자의 혈당 변화 체크 및 모니터링 등을 위해 유용하게 활용할 수 있다.
본 발명은 다수의 홀을 가지는 다공성 고분자 필름을 제조하는 단계; 상기 제조된 필름을 아닐린 수용액에 침지시켜 상기 홀을 폴리아닐린으로 개질시키는 단계; 및 상기 폴리아닐린에 글루코즈옥시데이즈(glucose oxidase, GOD)를 고정시키는 단계;를 포함하는, 글루코즈 검출용 센서의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 다수의 홀을 가지는 다공성 고분자 필름을 제조하는 단계는 소수성 고분자 및 산화제를 휘발성 용매에 넣어 고분자 용액을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 고분자 용액을 유리 용기에 붓고 습도 챔버에서 건조시키는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 고분자 용액을 제조하는 단계는, 상기 소수성 고분자 및 산화제를 휘발성 용매에 녹임으로써 수행될 수 있다.
상기 소수성 고분자는 폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리글라이콜산(polyglycolic acid, PGA), 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리비닐클로라이드(poly vinyl chloride, PVC), 폴리 N-비닐 피롤리돈(poly N-vinyl pyrrolidone, PVP), 및 폴리메틸메타크릴레이트(polymethyl methacrylate, PMMA)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 휘발성 용매는 클로로포름(chloroform), 디클로로메탄(dichloromethane), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF), 1,4-디옥산(1,4-dioxane), 1,1-디클로로에틸렌(1,1-dichloroethylene), 및 카본 테트라클로라이드(carbon tetrachloride)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 산화제는 상기 휘발성 용매에 용해되어 아닐린을 폴리아닐린으로 고분자화할 수 있는 것으로, 바람직하게는 벤조일 퍼옥사이드(benzoyl peroxide, BPO) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 산화제는 상기 고분자 용액 전체 100 중량부에 대하여, 10 내지 40 중량부 포함될 수 있고, 바람직하게는 20 내지 40 중량부, 보다 바람직하게는 30 중량부 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또는, 상기 소수성 고분자 및 상기 산화제는 1 : (0.1 내지 0.7)의 중량비로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1 : (0.3 내지 0.5)의 중량비로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 건조시키는 단계는, 상기 제조된 고분자 용액을 유리 용기에 붓고 습도 챔버에 보관하여 용매를 증발시킴으로써 수행될 수 있다.
상기 습도 챔버는 70 내지 90%의 고습도로 유지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 고습도의 챔버에서 용매가 증발하면서 빼앗는 열에 의해 용액 표면의 온도가 급격하게 떨어져 습도가 물방울로 응축이 되고, 계속된 용매의 증발에 의해 물방울이 패킹(packing)되는 자기 조직화(self-organization)가 일어남에 따라 마이크로미터 크기의 홀을 가지는 다공성 필름을 수득할 수 있기에, 상기 용매는 휘발성 용매인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 홀을 폴리아닐린으로 개질시키는 단계는, 상기 제조된 필름을 아닐린 수용액에 0.5 내지 5 시간 동안, 바람직하게는 0.5 내지 3시간 동안 침지시켜 프랙탈-덴드라이트(fractal dendrite) 구조의 폴리아닐린으로 성장시킴으로써 수행될 수 있다.
상기 아닐린 수용액은, 구체적으로 아닐린 하이드로클로라이드(aniline hydrochloride) 수용액일 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 폴리아닐린에 글루코즈옥시데이즈(GOD)를 고정시키는 단계는, 상기 홀이 폴리아닐린으로 개질된 필름을 가교제에 침지시킨 후, 상기 필름을 글루코즈옥시데이즈(GOD) 용액에 침지시켜 수행될 수 있다.
상기 가교제는 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 일 수 있다,
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 아닐린 수용액에 침지된 필름은 GOD의 공유 가교제 역할을 하는 글루타르알데히드 수용액에 1 내지 2 시간 동안 계속 교반하면서 침지시킬 수 있고, 이후 pH 7, 4℃에서 24시간 동안 GOD 인산 완충액에서 침지시켜 폴리아닐린 백본에서 효소 고정화를 달성할 수 있다.
즉, 상기 제조된 필름은 아닐린 수용액에 침지되어 상기 필름 표면 또는 홀에서의 산화제에 의한 계면 중합(interfacial polymerization) 반응으로 아닐린을 폴리아닐린, 바람직하게는 프랙탈-덴드라이트 구조의 폴리아닐린으로 중합될 수 있고, 상기 글루타르알데히드로 GOD를 상기 폴리아닐린에 부착하여 글루코즈 센서로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 글루코즈 검출용 센서의 제조방법에 따라 제조된 글루코즈 검출용 센서를 사용하여 혈액 내 글루코즈를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 당뇨 환자에 해당하는 글루코즈 농도에서 전도도 변화가 더 뚜렷하게 나타남을 확인한 바, 이를 당뇨 환자의 혈당 변화 체크 및 모니터링 등을 위해 유용하게 활용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 필름의 제조
1-1. 폴리스티렌(PS) 평면 필름 및 다공성 필름의 제조
일반적인 절차에 따라, 다양한 농도의 벤조일 퍼옥사이드(benzoyl peroxide, BPO)와 함께 폴리스티렌(PS) 250 mg를 5 ml 클로로포름(chloroform)에 용해시키고, 이 용액을 직경 5 cm의 유리 패트리 디쉬에 부었다. 용액 혼합물이 있는 패트리 디쉬를 0.5 L min-1 기류 속도에 의해 약 90%의 상대 습도로 유지되는 breath figure (BF) 챔버 내부에 보관하였다. BPO를 포함하는 고분자 용액을 실온에서 BF 내 완전히 건조될 때까지 증발시켜 벌집 패턴(honeycomb-patterned, HCP)의 다공성 PS 필름을 형성하였다. 고분자 용액에서 BPO의 다양한 양은 각각 10, 15, 20, 및 30 wt% 였다. 평면 PS 필름도 BF 챔버를 제공하는 것 외에는 동일한 절차를 따랐고, 필름을 개방 공기 조건에서 건조시켜 제조하였다 (도 1).
1-2. 폴리아닐린 평면(PANI-Flat, PANI-f) 필름의 제조
폴리아닐린(PANI) 평면 필름을 제조하기 위해, 먼저 10, 15, 20, 및 30 wt%의 벤조일 퍼옥사이드(BPO)가 포함된 폴리스티렌(PS)을 클로로포름에 용해시켰다. BPO가 포함된 고분자 용액을 유리 페트리 디쉬에 붓고 자연 건조시켰다. 용매, 즉 클로로포름을 증발시킨 후, 반투명의 평면 PS/BPO 필름을 수득하였다. 이후, 이 필름을 1M 아닐린 하이드로클로라이드(aniline hydrochloride) 용액에 담그었고 PS 필름에 존재하는 BPO는 계면 중합(interfacial polymerization)을 개시하여 PS 필름의 계면(표면)에 나타났다. 이 화학적 산화 반응은 1시간 동안 진행되었다. 기능화 완료 후, 필름을 꺼내 증류수로 세척하여 PANI에 느슨하게 결합된 모노머를 제거하고, 자연 건조시켰다. 중합 후, 녹색 착색된 필름이 수득되었으며, 이를 PANI-Flat 또는 PANI-f로 표시하였다 (도 2).
1-3. 글루코즈옥시데이즈(glucose oxidase, GOD)를 포함하는 폴리아닐린 프랙탈 구조의 다공성 필름의 제조
HCP 다공성 폴리스티렌(PS) 필름은 상기 실시예 1-1에서 설명한 breath figure (BF) 방법으로 제작하였고, 상기 실시예 1-2의 PANI-Flat 필름과 동일한 농도의 벤조일 퍼옥사이드(BPO)를 사용하여 제조된 고분자 용액을 70-80% 상대 습도에서 캐스팅하고 이를 완전히 건조시켜 불투명한 HCP 다공성 PS 필름을 수득한 다음, PANI-Flat 필름의 계면 중합과 유사하게 수행하여 기능화하였다. 기능화가 완료된 후 필름을 꺼내 세척하고 자연 건조시켰다. 중합하는 동안, 필름의 색이 흰색에서 짙은 녹색으로 변하였다. 녹색은 에메랄딘염(emeraldine salt, ES)의 특징적인 색으로, PANI의 전도 형태이다. 제작된 필름은 HCP-PANI로 표시하였다 (도 2).
더불어, 상기 HCP-PANI 필름에 글루코즈옥시데이즈(GOD)를 포함하는 복합체(PANI/GOD)를 고정하였다.
먼저 PANI 백본에서 효소 고정화를 달성하기 위하여, 상기 HCP-PANI 필름을 일정한 교반과 함께 가교제 글루타르알데히드(glutaraldehyde, 1.2 % (w/w), fluka)에 1시간 동안 침지한 다음, GOD (0.01 M, pH = 7) 인산 완충 용액에 4℃에서 24시간 동안 침지시켰다. 가교 결합제 글루타르알데히드를 이용한 GOD의 공유 고정화는 효소 활성이 현저히 변성되지 않도록 적당한 조건에서 수행될 수 있고 이에 따라, HCP 다공성 필름 표면에 완전한 PANI/GOD 복합체의 형성을 확인할 수 있다 (도 3 및 도 4).
<실험예 1> 프랙탈 구조의 성장 확인
상기 실시예와 같이, 전기화학적 방법을 사용하지 않고 계면 중합만으로 형성된 프랙탈 구조의 성장 경로는 시간 및 농도 두 가지 요인에 따라 달라진다.
1-1. 다공성 필름의 시간 의존적 프랙탈 성장
도 5는 HCP 다공성 필름상 PANI 프랙탈의 완전한 시간-의존적 성장을 나타낸 것으로, 다양한 침지 시간에 따른 폴리아닐린 분지-프랙탈(polyaniline branching-fractal, PBF)의 성장을 확인할 수 있고, 이후 스토캐스팅(stochasting) 방출, 결정핵 생성(nucleation), 및 성장과 같은 중합 단계가 뒤따를 수 있다.
PANI의 성장 과정은 프랙탈 이론의 자기 유사성(self-similarity) 및 반복 생성 원리(iternative generation principal)를 충족한다. 이러한 과정들은 시간-의존적 중합에 대해 동일한 일관성을 가진다. 구체적으로, 반응의 초기 단계 (0.5시간)에서 구형 입자가 형성되었고, 중합 1시간 후에는 길어진 줄기를 가진 더 큰 입자로 응집되어 다른 차원의 PANI를 발생시켰다. 그 후 반응 시간이 2시간으로 진행됨에 따라, 폴리아닐린 작은 프랙탈(polyaniline small fractals, PSF)로 약칭되는 작은 프랙탈의 형성이 관찰되었다. PSF는 불규칙한 표면의 나노-구조의 PANI와 연관이 있다. 더 연장된 차원의 구조가 형성되었고 2차 가지와 함께 모서리를 따라 균일하게 계속 성장하였다. 안정된 조건에서 중합 시간이 증가함에 따라, PANI의 상대적으로 빈 코어는 외부 성장 가지와 같이 폴리아닐린 침착물에 의해 덮인 것으로 관찰되며, 흡착률(surface coverage)은 결정질 범위 성장에 따라 증가한다. 중합의 완전한 성장 (3시간) 에 의해, 프랙탈 분지가 발달하여 폴리아닐린 분지 프랙탈(PBF)을 형성하였다.
1-2. 농도에 따른 프랙탈 구조
중합 시간에 따른 다양한 벤조일 퍼옥사이드(BPO) 중량% 및 아닐린(ANI) 농도 비율 사이의 관계를 나타낸 도 6을 참조하면, 다양한 중량%의 BPO를 갖는 0.5 M 농도의 ANI에서는 폴리아닐린(PANI)의 2차원 성장인 작은 프랙탈만이 생성됨을 확인할 수 있다. 폴리아닐린 작은 프랙탈(PSF)은 결정질 정도는 아니지만, 다양한 중량%의 BPO를 갖는 1 M 농도의 ANI에서는 3시간 이내 결정질 치수를 갖는 덴드라이트(dendrite)가 나타났다.
즉, PSF에서 완전한 PBF로의 성장에 대한 전체적인 분석에서 30 중량%의 BPO 및 1 M 농도의 ANI이 가장 적합함을 확인할 수 있다.
<실험예 2> 접촉각 확인
접촉각(Contact angle)은 HCP 다공성 필름의 표면 및 평면 필름의 표면 사이의 차이점을 보여주는 것으로, 도 7에 나타난 바와 같이, HCP 다공성 필름은 평면 필름보다 높은 가상 발수성(water repellency)과 함께 물방울을 잡는 우수한 특성을 보였다. 이는 물방울이 필름과 접촉하는 위치에 형성된 기공의 모세관력에 의한 것으로 예상된다. 즉, 물방울을 튕겨 내면서도 움켜쥐는 것과 같이 겉보기에 상반되는 독특한 특성을 가진다.
이러한 특성은 HCP 다공성 필름을 이용한 글루코즈 센싱 어플리케이션에서 상기 필름 표면의 기공에서 글루코즈 방울을 잡는 데 큰 역할을 하며, 더불어 높은 감도를 제공할 수 있다.
<실험예 3> 필름의 pH-의존성 전도도 확인
pH 변화에 따른 전도도를 확인하였다. 간단한 폴리아닐린(PANI) 프랙탈 구조의 필름을 낮은 pH 및 높은 pH의 media에 도입하고 전도도 측정을 위해 즉시 액체 질소에 담금으로써, PANI의 화학적 백본(backbone)에 의해 pH 변화에 민감한 PANI로 코팅된 HCP 다공성 필름은 수소이온으로 충전되었다.
도 8을 참조하면, 전도도 측정 결과, PANI의 구조로 인해 pH 변화에 민감한 PANI이 코팅된 HCP 다공성 필름 (PF)의 전도도가 평면 필름 (PANI-f) 보다 증가한 것으로 나타났다.
보다 상세하게는 도 8의 (a) 및 (b)를 참조하면, PANI-f 필름의 전도도 값은 1.68×10-5 에서 3.1×10-2, PF 필름의 전도도 값은 2.2×10-5 에서 8.0×10-1로 각각 측정되었다. 이러한 전도도의 차이는 표면적을 증가시키는 프랙탈의 특징을 포함하는 HCP 다공성 필름의 구조 때문일 수 있다.
PANI의 산화환원 과정에 양성자가 참여하기 때문에, PANI는 산성 매질에서 우수한 전도도를 보여주는 것으로 잘 알려져 있다. 고분자 백본에서 강산 및 강염기로의 PANI 도핑은 질소 원자의 미세 환경을 변화시키고 국부 pH를 이동시킬 수 있다. 즉, 프랙탈이 보조된 HCP 다공성 필름의 표면 개질뿐만 아니라 지형적 개질에 의해 전도도가 향상될 수 있다. 따라서, 이러한 특징을 글루코즈 센싱 어플리케이션에 적용할 수 있다.
<실험예 4> PANI/GOD 복합체의 글루코즈 센싱 확인
상기 실시예 1-3에 따라 제조된 PANI/GOD 복합체가 형성된 필름을 글루코즈 용액에 도입하였다.
먼저, PANI/GOD 복합체가 형성된 필름을 1.5 cm × 1.5 cm 크기로 잘라 pH 7의 인산 완충액에 담그고 글루코즈 수용액을 적가하였다. 상기 필름을 즉시 꺼내어 액체 질소 병에 5분 동안 담그고, 동결 건조기로 6시간 동안 동결 건조하여 필름 내부에 갇힌 수분을 완전히 제거하였다. 완전 건조 후, 필름의 기공 표면 형태, 습윤성 및 필름 표면의 전도도를 비교하였다 (도 9).
도 10을 참조하면, 프랙탈 구조를 포함하는 pH-민감성 PANI/GOD 복합체는 글루코즈 첨가에 매우 민감하게 반응한다. 화학적 메커니즘에 의해 글루코즈 첨가 후 글루콘산(gluconic acid)이 생성된다. 글루콘산은 GOD 효소를 포함한 필름을 통해서만 생성될 수 있다. 이 효소는 글루코즈 분자에 매우 선택적이며, 다른 분자는 어떤 종류의 산도 생성하지 않는다. 그러나, 글루콘산을 포함하는 글루코즈 개별 프랙탈 구조의 추가는 글루콘산 수소 이온 농도로 인해 팽창하게 된다. 글루코즈의 다른 농도로 5.2 × 10-5 에서 4.3 × 10-1 S·cm-1로 이의 전도도를 변경시킬 수 있다. 이 pH 반응은 0.5 mm/dm3 에서 25 mm/dm3 의 매우 낮은 농도에서 시작되어 도 11에 나타난 바와 같이, 당뇨병 환자의 혈당 농도와도 관련된다.
도 11을 참조하면, 글루코즈 농도가 증가할수록 전도도가 향상되는 것을 확인할 수 있고, 당뇨병 환자의 일반적인 글루코즈 농도와 비교하였을 때, 정상적인 사람과 당뇨병 환자의 글루코즈 농도를 전도도로 확연하게 식별할 수 있음을 확인할 수 있다.
더불어, 도 12 및 도 13은 글루코즈 센서의 선택성 및 특이성을 나타낸 것으로, 먼저 도 12를 참조하면, 본 발명에 따른 글루코즈 센서는 전도성 응답(conductivity response)이 60초 이내에 도달하여 매우 민감함을 확인할 수 있다. 특히, 60초 이내 10-2 에서 10-1 S·cm-1 범위에서 15 에서 25 mmol 농도를 달성하여 높은 전도성 응답을 보여주어 글루코즈 센서로서 활용성이 있을 것으로 판단할 수 있다.
또한, 글루코즈에 대한 선택성 센싱을 확인하기 위해, 유사 당인 프룩토즈(fructose), 수크로즈(sucrose), 갈락토즈(galactose), 락토즈(lactose)의 농도에 따른 전도도 변화를 확인한 결과, 도 13을 참조하면, 글루코즈 및 이의 농도 변화에 대해서만 전도도의 변화가 현저히 증가함을 확인할 수 있다. 그 외, 프룩토즈에 대해서는 경미한 변화가 확인되었고, 그 외 유사 과당에 대해서는 전도도 변화를 확인할 수 없었다.
종래의 전기-화학적 방법과 달리, 본 발명에 따른 글루코즈 센서는 폴리아닐린에 포함된 글루코즈 분해효소인 글루코즈옥시데이즈(glucose oxidase, GOD)에 의해 글루코즈가 글루콘산(gluconic acid)으로 산화되면서 발생하는 H+ 에 의해 pH가 낮아짐으로써 폴리아닐린의 전기전도도가 증가하는 원리를 이용한 것으로, 프룩토즈와 같은 유사 과당은 GOD에 의해 산을 생성하지 못하므로 종래 상용화 키트의 가장 큰 문제점인 유사 과당에 의한 간섭을 최소화하면서 글루코즈만의 농도를 고감도로 측정할 수 있음을 확인할 수 있다.
<실험예 5> 액체 약물 시료 분석을 위한 기능성 인터페이스로의 적용
폴리아닐린(PANI) 프랙탈의 팽창 형태에 따르면, 낮은 pH 환경에서 처리한 후 마이크로 및 나노미터 크기의 프랙탈 튜브 유사 형태의 공존은 개별 프랙탈 사이의 빈 공간에 공기를 가두기에 충분히 거친 표면을 생성한다고 판단된다. 이는 물과 필름 사이의 접촉면을 최소화하여 매우 거친 표면을 초래한다. 그러므로, 물방울에 대한 초접착성을 초래하는 것은 공기 부분 영역 내 개별 프랙탈 내부 사이에 갇힌 공기의 큰 범위로 추론할 수 있다.
접촉각 분석은 3상 (고-액-기) 접촉 라인에 의해 결정된다. PANI 프랙탈은 약물 전달 영역 또는 손실 없이 소량의 액체 약물 샘플 분석에 성공적으로 적용될 수 있다 (도 14).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (18)

  1. 다수의 홀을 가지는 다공성 고분자 기재를 포함하며,
    상기 홀은 프랙탈-덴드라이트(fractal dendrite) 구조로 성장된 폴리아닐린으로 개질된 것을 특징으로 하는, 전기화학센서.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 홀은,
    평균 직경이 4 내지 8 μm 인 것을 특징으로 하는, 전기화학센서.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 고분자는,
    폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리글라이콜산(polyglycolic acid, PGA), 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리비닐클로라이드(poly vinyl chloride, PVC), 폴리 N-비닐 피롤리돈(poly N-vinyl pyrrolidone, PVP), 및 폴리메틸메타크릴레이트(polymethyl methacrylate, PMMA)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 소수성 고분자인 것을 특징으로 하는, 전기화학센서.
  4. 다수의 홀을 가지는 다공성 고분자 기재를 포함하며,
    상기 홀은 글루코즈옥시데이즈(glucose oxidase, GOD)를 포함하는 폴리아닐린으로 개질된 것을 특징으로 하는, 글루코즈 검출용 센서.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 폴리아닐린은,
    프랙탈-덴드라이트(fractal dendrite) 구조로 성장된 것을 특징으로 하는, 글루코즈 검출용 센서.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 홀은,
    평균 직경이 4 내지 8 μm 인 것을 특징으로 하는, 글루코즈 검출용 센서.
  7. 제 4 항에 있어서,
    상기 다공성 고분자 기재는,
    상기 홀이 벌집 패턴(honeycomb-patterned, HCP)을 이루는 형태인 것을 특징으로 하는, 글루코즈 검출용 센서.
  8. 제 4 항에 있어서,
    상기 고분자는,
    폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리글라이콜산(polyglycolic acid, PGA), 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리비닐클로라이드(poly vinyl chloride, PVC), 폴리 N-비닐 피롤리돈(poly N-vinyl pyrrolidone, PVP), 및 폴리메틸메타크릴레이트(polymethyl methacrylate, PMMA)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 소수성 고분자인 것을 특징으로 하는, 글루코즈 검출용 센서.
  9. 제 4 항에 있어서,
    상기 센서는,
    유사 과당에 의한 간섭을 감소시켜 글루코즈만을 선택적으로 검출하는 것을 특징으로 하는, 글루코즈 검출용 센서.
  10. 다수의 홀을 가지는 다공성 고분자 필름을 제조하는 단계;
    상기 제조된 필름을 아닐린 수용액에 침지시켜 상기 홀을 폴리아닐린으로 개질시키는 단계; 및
    상기 폴리아닐린에 글루코즈옥시데이즈(glucose oxidase, GOD)를 고정시키는 단계;를 포함하는, 글루코즈 검출용 센서의 제조방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 다수의 홀을 가지는 다공성 고분자 필름을 제조하는 단계는,
    소수성 고분자 및 산화제를 휘발성 용매에 넣어 고분자 용액을 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 고분자 용액을 유리 용기에 붓고 습도 챔버에서 건조시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 글루코즈 검출용 센서의 제조방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 산화제는,
    벤조일 퍼옥사이드(benzoyl peroxide, BPO)인 것을 특징으로 하는, 글루코즈 검출용 센서의 제조방법.
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 산화제는,
    상기 고분자 용액 전체 100 중량부에 대하여, 10 내지 40 중량부 포함되는 것을 특징으로 하는, 글루코즈 검출용 센서의 제조방법.
  14. 제 10 항에 있어서,
    상기 폴리아닐린으로 개질시키는 단계는,
    상기 제조된 필름을 아닐린 수용액에 0.5 내지 5시간 동안 침지시켜 프랙탈-덴드라이트(fractal dendrite) 구조의 폴리아닐린으로 성장시켜 수행되는 것을 특징으로 하는, 글루코즈 검출용 센서의 제조방법.
  15. 제 10 항에 있어서,
    상기 폴리아닐린에 글루코즈옥시데이즈(GOD)를 고정시키는 단계는,
    상기 홀이 폴리아닐린으로 개질된 필름을 가교제에 침지시킨 후, 상기 필름을 글루코즈옥시데이즈(GOD) 용액에 침지시켜 수행되는 것을 특징으로 하는, 글루코즈 검출용 센서의 제조방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 가교제는,
    글루타르알데히드(glutaraldehyde)인 것을 특징으로 하는, 글루코즈 검출용 센서의 제조방법.
  17. 제 10 항에 있어서,
    상기 홀은,
    상기 산화제에 의한 계면 중합(interfacial polymerization) 반응으로 중합된 폴리아닐린으로 개질되는 것을 특징으로 하는, 글루코즈 검출용 센서의 제조방법.
  18. 제 10 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따라 제조된 글루코즈 검출용 센서를 사용하여 혈액 내 글루코즈를 검출하는 방법.
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