WO2024014984A1 - Аммониевая соль пептида наее для лечения нейродегенеративных заболеваний - Google Patents

Аммониевая соль пептида наее для лечения нейродегенеративных заболеваний Download PDF

Info

Publication number
WO2024014984A1
WO2024014984A1 PCT/RU2023/000211 RU2023000211W WO2024014984A1 WO 2024014984 A1 WO2024014984 A1 WO 2024014984A1 RU 2023000211 W RU2023000211 W RU 2023000211W WO 2024014984 A1 WO2024014984 A1 WO 2024014984A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
haee
peptide
ammonium salt
pharmaceutical composition
ammonium
Prior art date
Application number
PCT/RU2023/000211
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Сергей Александрович КОЗИН
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "ЛАЙФМИССИЯ"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from RU2022119486A external-priority patent/RU2784249C1/ru
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "ЛАЙФМИССИЯ" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "ЛАЙФМИССИЯ"
Publication of WO2024014984A1 publication Critical patent/WO2024014984A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1024—Tetrapeptides with the first amino acid being heterocyclic

Definitions

  • the invention relates to monosubstituted or disubstituted ammonium salts of the HAEE peptide, where HAEE is a synthetic peptide, acetylated at the N-terminus and amidated at the C-terminus, with the amino acid sequence His-Ala-Glu-Glu.
  • the present invention also relates to a method for producing ammonium salts of the HAEE peptide (variants), to pharmaceutical compositions based on ammonium salts of the HAEE peptide and the use of ammonium salts of the HAEE peptide for the treatment of neurodegenerative diseases.
  • Neurodegenerative diseases have a number of common development factors and a number of other general mechanisms (Litvinenko I.V., Krasakov I.V., Bisaga G.N. et al. Modern conception of the pathogenesis of neurodegenerative diseases and therapeutic strategy. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2017;117(6 -2):3-10.
  • Inflammation is one of the typical pathological processes of the human body.
  • a typical pathological process is manifested by a certain set of characteristic signs. It is currently believed that the neurodegenerative process is secondary to the inflammatory process (Mostafa A., Jalilvand S., Shoja Z. Et al. Multiple sclerosis- associated retrovirus, Epstein-barr virus, and vitamin D status in patients with relapsing remitting multiple sclerosis. Journal of Medical Virology. 2017. doi: 10.1002/jmv.24774; Litvinenko I.V., Krasakov I.V., Bisaga G.N. et al. Modern conception of the pathogenesis of neurodegenerative diseases and therapeutic strategy. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2017; 117(6-2):3-10. (In Russ.), doi: 10.17116/jnevro2017117623-10).
  • Alzheimer's disease is one of the most common neurodegenerative diseases among older people and is characterized by neuritic plaques, the main component of which is the beta-amyloid peptide (AR).
  • the N-terminal 1-16 region of amyloid beta is the metal-binding domain where zinc (Zn) and copper (Cu) bind to the Ap peptide (Guilloreau L., Damian L., Coppel Y., et al. (2006). Structural and thermodynamic properties of Cull amyloid-pi6/28 complexes associated with Alzheimer's disease. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry, 11 (8), 1024-1038, doi: 10.1007/s00775-006-0154-1).
  • HAEE Ac-HAEE-NH 2
  • the letters mean: H - histidine, A - alanine, E - glutamic acid.
  • HAEE is capable of inhibiting the interaction of Ap peptides with Zn(II) ions, causing a decrease or prevention of Ap peptide aggregation in the presence of Zn(II) ions at physiological concentrations of Zn(II) ions of 100-400 ⁇ M.
  • 2709539 have developed a pharmaceutical composition for the delivery of HAEE across the BBB for the treatment of neurodegenerative diseases, including dementia of the Alzheimer's type (Alzheimer's disease), which can improve the pharmacokinetic characteristics and increase the bioavailability of HAEE.
  • This composition contains an effective amount of a substance in the form of a complex of HAEE with zinc and human serum albumin (HAEE-Zn-HSA) in the form of a solution for administration with a pharmaceutically acceptable carrier selected from a range of neutral carriers and diluents, for example, saline.
  • a pharmaceutically acceptable carrier selected from a range of neutral carriers and diluents, for example, saline.
  • the resulting pharmaceutical composition allows the bioavailability of the substance in the brain to be increased fivefold and the half-life from the body to be doubled; improve the cognitive functions of experimental animals by 20%.
  • RF patent No. 2709539 it is known that the pharmaceutical composition HAEE-Zn-HSA is stable in a suitable aqueous buffer system, in the pH range from 4 to 8, in the presence or absence of various salts.
  • albumin in a neutral environment is equal to -1, in an alkaline environment it is equal to -2, and in a weakly acidic environment it is equal to 0 (isoelectric state) and albumin precipitates (Biochemistry with exercises and tasks. Edited by A.I. Glukhov , E. S. Severina, GEOTAR-Media, Moscow, 2019, p. 19), therefore this complex should not exist in a slightly acidic environment at pH 4-5.5.
  • the prototype of the invention was the source WO 2012/056157, which describes a peptide with the amino acid sequence His-Ala-Glu-Glu, acetylated at the N-terminus and amidated at the C-terminus (HAEE).
  • Pharmaceutically acceptable salts for HAEE have not been previously prepared and characterized, and their properties in the solid phase are unknown.
  • the tasks to be solved by the invention are to obtain an effective remedy for the treatment of neurodegenerative diseases in the form of previously unknown ammonium salts of HAEE, including monosubstituted (HAEE-NH 4 ) and disubstituted ((HAEE-(NH 4 ) 2 ) ammonium salts HAEE, including in solid form, the development of pharmaceutical compositions based on such a drug and its use for the treatment of neurodegenerative diseases.
  • the present invention provides ammonium salts of the HAEE peptide.
  • HAEE ammonium salts of the HAEE peptide for the treatment of neurodegenerative diseases changes the mechanism of action of the HAEE peptide associated with the conformational structure of the HAEE peptide, which leads to an unexpectedly high therapeutic effect.
  • the 3D structure of HAEE in the form of ammonium salts remained unchanged under similar experimental conditions (that is, after extraction of the HAEE peptide from the initial aqueous solution of the ammonium salt and after extraction from the blood plasma of wild-type mice after a 2-minute exposure) and corresponded to the 3D structure -structure of the native HAEE peptide extracted from the original aqueous solution.
  • the chemical structure of the HAEE peptide in all experimental samples remained unchanged for both the native peptide and the peptide contained in the ammonium salt.
  • the change in the release time of the native HAEE peptide or the ammonium salt of the HAEE peptide from the chromatographic column is mainly due to differences in the hydrophobic interactions of the HAEE peptide with the column material, and these interactions, in turn, are determined by the prevailing 3D structure of the HAEE peptide in a particular sample.
  • the 3D structure of the HAEE peptide which corresponds to the “unfolded” conformation of the peptide and is prevalent for the native HAEE peptide in the original aqueous solution, corresponds to the 3D structure of the ammonium salt of the HAEE peptide in an aqueous solution and remains unchanged in the case of exposure of the ammonium salt of the HAEE peptide in the blood plasma, while the native HAEE peptide in the blood plasma loses its “unfolded” conformation.
  • the term 3O structure is used as a synonym for spatial structure or the relative arrangement of atoms in the HAEE molecule in three-dimensional space.
  • the HPLC method is based primarily on intermolecular interactions at the interface.
  • the change in the release time of HAEE from the chromatographic column reflects a change in intermolecular interactions HAEE with a sorbent, which is a consequence of differences in the spatial structure of HAEE molecules in the native state and in the form of an ammonium salt.
  • HAEE Pharmacokinetics and Molecular Modeling Indicate nAChRa4-Derived Peptide HAEE Goes through the Blood-Brain Barrier. Biomolecules 2021 Jun 18;11(6):909).
  • the imidazole group of the histidine amino acid residue can form stable polar bonds with the carboxyl groups of the side chains of glutamic acid amino acid residues, which does not contribute to maintaining the biologically significant “unfolded” conformation of this peptide and, as a result, reduces the beneficial therapeutic effects of HAEE.
  • one of the advantages of this invention is to increase the therapeutic effectiveness of the HAEE peptide in the form of the ammonium salt HAEE due to the preservation of the 3O structure of this salt in the “unfolded” conformation.
  • the invention also relates to the use of the ammonium salt of the HAEE peptide for the treatment of neurodegenerative diseases, as well as pathologies accompanied by neuroinflammatory processes.
  • the ammonium salt of the HAEE peptide can effectively influence neurodegenerative diseases, in particular those caused by inflammatory causes, restoring impaired cognitive functions.
  • ammonium salt of HAEE peptide can be used in either solid or liquid form and remains stable for at least 2 years.
  • the technical result of the invention is:
  • HAEE - stability of the “unfolded” conformation of the 3D HAEE molecule after dissolution of the ammonium salt of HAEE in blood plasma compared to HAEE.
  • the monosubstituted ammonium salt of the HAEE peptide claimed in the present invention in accordance with the production method used, can be obtained in an amorphous form, as confirmed by x-ray phase analysis (Fig. 1).
  • the disubstituted ammonium salt of the HAEE peptide is a weakly crystallized phase ( Figure 2).
  • Ammonium salts of the HAEE peptide are characterized by a differential scanning calorimetry (DSC) thermograviometry (TG) curve (DSC-TGA).
  • DSC differential scanning calorimetry
  • TG thermograviometry
  • the HAEE molecule on the DSC curve is characterized by a broad peak with an onset at 62°C and a maximum at 89°C; a double melting peak at temperatures of 203 and 227.5°C with a start at 188°C (Fig. 3).
  • the error for multiple measurements is estimated at ⁇ 3 °C.
  • HAEE-NH 4 on the DSC curve is characterized by three endothermic maxima: the first broad endothermic peak starts at 60 °C and has a broad maximum at 90-100 °C; the second begins at 197°C with a maximum at 208°C, the third peak begins at 215°C with a maximum at 234°C. (Fig. 4).
  • HAEE-(NH 4 ) 2 on the DSC curve has a complex character and is characterized by four endothermic peaks. The first starts at 60°C with a maximum at 98°C, the second peak starts at 112°C with a maximum at 130°C, the third peak starts at 174°C with a maximum at 202°C and the fourth melting maximum is observed at 234°C (Figure 5).
  • DSC curves show that the thermal behavior of the ammonium salts of the HAEE peptide (Fig. 4,5) differs from the behavior of HAEE (Fig. 3), the melting point of the ammonium salts is higher compared to the melting point of HAEE, which provides higher stability, which is confirmed by the results accelerated storage test.
  • FTIR spectroscopy of the ammonium salts of the HAEE peptide is shown in FIG. 6.
  • the IR spectra of ammonium salts repeat all the main lines of the HAEE IR spectrum.
  • the method for obtaining ammonium salts of the HAEE peptide consists of mixing aqueous solutions of HAEE and an aqueous solution of an ammonium compound in stoichiometric ratios at room temperature, stirring for 5-30 minutes and drying the solution.
  • HAEE-NH 4 the stoichiometric ratio of the components HAEE:NH 4 must be 1:1 by moles.
  • HAEE-(NH 4 ) 2 the stoichiometric ratio of the components HAEE:NH 4 must be 1:2 by moles.
  • HAEE peptide drying is carried out using standard methods of organic chemistry, mainly under vacuum. The drying temperature should not exceed 50°C. Ammonium salts of the HAEE peptide can be obtained in the form of a lyophilisate using standard freeze-drying. For freeze drying, the solution is pre-frozen.
  • ammonium compounds are ammonium hydroxide, bicarbonate or ammonium carbonate.
  • a variant of the method for obtaining ammonium salts of the HAEE peptide consists of mixing at room temperature aqueous solutions of HAEE and an aqueous solution of ammonium sulfate in stoichiometric ratios, stirring for 5-10 minutes, adding stoichiometric amounts of an aqueous solution of barium hydroxide to precipitate the sulfate anion, stirring for 10 -30 min, remove barium sulfate precipitate and dry the solution.
  • HAEE-NH 4 the stoichiometric ratio of the components HAEE:NH 4 must be 1:1 by moles.
  • HAEE-(NH 4 ) 2 the stoichiometric ratio of the components HAEE:NH 4 must be 1:2 by moles.
  • the stoichiometric ratio of the components SO 4 2 : Ba 2+ must be 1 : 1 by moles.
  • Removal of barium sulfate precipitate is carried out by filtration or centrifugation and decantation of the supernatant containing a solution of the ammonium salt of the HAEE peptide.
  • Ammonium salts of the HAEE peptide can be obtained in the form of a lyophilisate using standard freeze-drying. For freeze drying, the solution is pre-frozen. When preparing ammonium salts of the HAEE peptide, depending on the drying method, a residual moisture content of up to 5% by weight may remain. At the same time, ammonium salts of the HAEE peptide do not absorb additional water during storage and are stable for a long time.
  • Another object of the invention is pharmaceutical compositions with an effective amount of ammonium salt of the HAEE peptide and the presence of excipients.
  • the monosubstituted or disubstituted ammonium salt of the HAEE peptide can be used without excipients in the form of a lyophilized substance.
  • the effective amount of ammonium salt of HAEE peptide depends on the type of neurodegenerative disease, body weight, route of administration, and therefore can vary widely from 0.1 to 100 mg, more preferably from 5 to 50 mg.
  • the pharmaceutical composition of the ammonium salt of the HAEE peptide may be in solid form or in the form of an aqueous solution.
  • Solid compositions of the ammonium salt of the HAEE peptide contain an effective amount thereof and optionally excipients.
  • a solid pharmaceutical composition can be prepared by drying a solution of the active substance and a set of auxiliary components or adding auxiliary substances to the ammonium salt powder of the HAEE peptide.
  • the dried or lyophilized ammonium salt of the HAEE peptide may be in an amorphous form, which corresponds to the diffraction pattern in FIG. 1.2.
  • Excipients are selected from pharmaceutically acceptable additives. Such substances may be mannitol, povidone K 17, trometamol, disodium edetate, sodium chloride, sucrose, histidine, poloxamer 407, and other pharmaceutically acceptable additives.
  • the pharmaceutical composition of the ammonium salt of the HAEE peptide in the form of an aqueous solution contains an effective amount of the ammonium salt of the HAEE peptide, water, as well as a set of pharmaceutically acceptable additives and salts.
  • Such substances may be mannitol, povidone K 17, trometamol, disodium edetate, sodium chloride, sucrose, histidine, poloxamer 407, and other pharmaceutically acceptable additives.
  • Another object of the invention is the use of the ammonium salt of the HAEE peptide for the treatment of neurodegenerative diseases, which consists of administering the ammonium salt of the HAEE peptide as part of the described pharmaceutical compositions to the patient in an effective amount.
  • the effective amount of ammonium salt of the HAEE peptide depends on the type of neurodegenerative disease, body weight, route of administration, and can therefore vary widely from 0.1 to 100 mg, preferably from 5 to 50 mg.
  • the administration of the ammonium salt of the HAEE peptide to the patient can be carried out using all possible types of external, enteral, inhalation and parenteral routes of administration (including intravenous, intraarterial, intraperitoneal, subcutaneous, cutaneous, transdermal, intramuscular, intrathecal, subarachnoid, oral, intranasal, sublingual, buccal, rectal administration).
  • routes of administration including intravenous, intraarterial, intraperitoneal, subcutaneous, cutaneous, transdermal, intramuscular, intrathecal, subarachnoid, oral, intranasal, sublingual, buccal, rectal administration.
  • the preferred route of administration is sublingual.
  • the preferred routes of administration are intravenous and intranasal.
  • ammonium salts of the HAEE peptide were administered six times intravenously at a dose of 0.05 mg/kg, after which a valid test for cognitive abilities “Marble Burying Test” was performed [Santana-Santana M., Bayascas J.R., Gimenez- Llort L. (2021). Sex-Dependent Signatures, Time Frames and Longitudinal Fine-Tuning of the Marble Burying Test in Normal and AD-Pathological Aging Mice. Biomedicines, 9(8), 994, doi: 10.3390/biomedicines9080994), quantifying more than 2/3 of the buried beads as a percentage of the total number of beads. The greater the number of buried balls (BPS), the higher the cognitive abilities of mice.
  • BPS number of buried balls
  • the CVS value was 50.6 ⁇ 13.3 (%). This value was taken as a reference value.
  • the value of the CVS 12.6 ⁇ 4.2 (%), which indicates a strong deterioration in the behavioral reflexes of transgenic mice of the APP/PS1 line compared to wild-type animals and reflects the disabling effect of overexpression of human beta-amyloid, associated with neuroinflammation and the formation of amyloid plaques, on the processes of nervous activity.
  • ammonium salts of the HAEE peptide can be effectively used in the treatment of neurodegenerative diseases, in particular those caused by inflammatory complications, restoring cognitive functions to normal.
  • One of the mechanisms of action of ammonium salts of the HAEE peptide on the possibility of treating neurodegenerative diseases may be its binding to beta-amyloid.
  • This difference between the native HAEE peptide and the ammonium salts of the HAEE peptide may influence the pharmacological properties, which was confirmed by different tests of cognitive recovery - the effectiveness of HAEE was significantly lower than the effectiveness of the ammonium salts of the HAEE peptide.
  • This effect can be associated with the above-mentioned HPLC-MS data, which showed changes in the 3D structure of native HAEE after its introduction into the blood plasma, while the ammonium salt of the HAEE peptide before and after its introduction into the blood plasma had the same retention time on the HPLC chromatogram and, accordingly, a stable 3D structure.
  • ammonium ion plays a protective role in maintaining the “unfolded” conformation of the HAEE peptide in these salts, which may also prevent interaction with elements of the blood plasma, since it is known that the introduction of native HAEE into peripheral circulatory system of mice, rats and rabbits leads to the formation of stable HAEE complexes with transport and receptor proteins (Zolotarev YA, Mitkevich VA, Shram Sl et al. Pharmacokinetics and Molecular Modeling Indicate nAChRa4-Derived Peptide HAEE Goes through the Blood-Brain Barrier. Biomolecules 2021. 11(6): p.909, doi: 10.3390/biom11060909).
  • HAEE ammonium salts of the HAEE peptide have much greater therapeutic efficacy compared to HAEE and these substances are biononequivalent to each other, since after the introduction of the ammonium salt into the body, HAEE exists in the blood plasma solution in an “unfolded” conformation and has mechanism of action different from HAEE.
  • Fig. 1 X-ray diffraction pattern of HAEE-NH 4 .
  • Fig. 2 X-ray diffraction pattern of HAEE-(NH 4 ) 2 .
  • Fig. 6 IR spectra with Fourier transform HAEE (1), HAEE-(NH 4 ) 2 (2) and HAEE-NH 4 (3).
  • Fig. 7 IR spectrum with Fourier transform in the characteristic region 1800-700 cm' 1 .
  • Fig. 8 Arrangement of atoms in the HAEE molecule for 1 H-NMR analysis.
  • Powder X-ray phase analysis was performed on a Rigaku Ultima IV diffractometer (Japan), tube voltage - 40 kV, tube current - 30 mA, tube anode material - Cu.
  • Goniometer ⁇ / ⁇ vertical type, the sample is motionless.
  • the maxima in the diffraction pattern accumulated over 1 hour.
  • the angle 2 ⁇ ranged from 3 to 70 degrees.
  • Elemental analysis was performed by energy-dispersive X-ray spectroscopy with an EDXA attachment on a TESCAN MIRA3 microscope (Czech Republic).
  • the area of the measured area is 0.04 mm 2 , the number of measurements is 3.
  • Infrared radiation spectra IR spectra
  • beta-amyloid was recorded by a biosensor based on the effect of surface plasmon resonance (SPPR) in aqueous buffer systems at physiological pH values.
  • SPPR surface plasmon resonance
  • BPPR experiments were carried out on a BIAcore 3000 instrument (GE Healthcare, USA) using an CM4 optical chip in accordance with the manufacturer’s protocols.
  • the ligand (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAGGGGC) was immobilized on the surface of the optical chip through the disulfide bond of the thiol group of the C-terminal cysteine residue.
  • Ammonium salts HAEE or HAEE were used as analytes.
  • Drying of frozen samples was carried out in penicillin vials on a Heto FD 2.5 sublimator at a pressure of 0.1 -0.2 mbar.
  • the accelerated storage test was carried out in a Memmert HCP50 chamber at 40 °C and 75% humidity. Samples were taken once a month for 6 months and the content of the active substance was determined by HPLC.
  • Example 1 Preparation of monosubstituted ammonium salt of peptide HAEE (HAEE- NH4 ).
  • the first part was dried on a rotary evaporator under a vacuum of 7 mm. Hg Art. at a temperature of 40 °C. A white powder of the monosubstituted ammonium salt of the HAEE peptide was obtained; the product yield, taking into account losses, was 88%.
  • the second part of the solution with a volume of 55 ml was poured into penicillin vials with a volume of 5 ml and frozen in a refrigeration unit at -20 ° C and then freeze-dried in a standard mode at a pressure of 0.015 mbar for 24 hours.
  • the product yield, taking into account losses, was 97%.
  • the product was a white powder of the mono-ammonium salt of the HAEE peptide.
  • a study of samples of the monosubstituted ammonium salt of the HAEE peptide showed that, regardless of the drying method, they have identical characteristics (Fig. 1, 4, 6, 7, 10).
  • HAEE-NH 4 Another option for the method of producing HAEE-NH 4 is the use of ammonium bicarbonate.
  • the first part was dried on a rotary evaporator under a vacuum of 8 mm. Hg Art. at a temperature of 35 °C. A white powder of the monosubstituted ammonium salt of the HAEE peptide was obtained; the product yield, taking into account losses, was 86%.
  • the second part of the solution with a volume of 55 ml was poured into penicillin vials with a volume of 5 ml and frozen in a refrigeration unit at -20 ° C and then freeze-dried in a standard mode at a pressure of 0.02 mbar for 36 hours.
  • the product was a white powder of the mono-ammonium salt of the HAEE peptide.
  • HAEE-NH 4 Another option for the method of producing HAEE-NH 4 is the use of ammonium carbonate.
  • the first part was dried on a rotary evaporator under a vacuum of 6 mm. Hg Art. at room temperature. We obtained a white powder of the monosubstituted ammonium salt of the HAEE peptide; the product yield, taking into account losses, was 83%.
  • the second part of the solution with a volume of 55 ml was poured into penicillin vials with a volume of 5 ml and frozen in a refrigeration unit at -20 ° C and then freeze-dried in a standard mode at a pressure of 0.02 mbar for 30 hours.
  • the product was a white powder of the mono-ammonium salt of the HAEE peptide.
  • HAEE-NH 4 samples are characterized by an amorphous form in the diffraction pattern ( Figure 1).
  • HAEE-NH 4 is characterized by three endothermic maxima: the first broad endothermic peak starts at 60 °C and has a broad maximum at 90-100 °C; the second begins at 197 °C with a maximum at 208 °C, the third peak begins at 215 °C with a maximum at 234 °C. (Fig. 4).
  • ammonium salt of the HAEE peptide can contain a residual moisture content of up to 5 wt%.
  • HAEE-NH 4 the position of the chemical shifts of the protons in the HAEE molecule changed and is presented in Fig. 10, which indicates the influence of ammonium ion on HAEE molecules in solution and, therefore, the preservation of the steric structure of the HAEE molecule both in solid form in the form of an ammonium salt and in solution, which is important for pharmacological properties.
  • the signal shifts are presented in Table 1; signals differing by 0.02-0.03 ppm were considered significant.
  • the first part was dried on a rotary evaporator under a vacuum of 6 mm. Hg Art. at a temperature of 40°C. A white powder of the disubstituted ammonium salt of the HAEE peptide was obtained; the product yield, taking into account losses, was 87%.
  • the second part of the solution with a volume of 55 ml was poured into penicillin vials with a volume of 5 ml and frozen in a refrigeration unit at -20 ° C and then freeze-dried in a standard mode at a pressure of 0.02 mbar for 28 hours.
  • the product was a white powder of the disubstituted ammonium salt of the HAEE peptide.
  • HAEE-(NH 4 ) 2 Another option for the method of producing HAEE-(NH 4 ) 2 is the use of ammonium bicarbonate.
  • 10 ml of NH4HCO3 with a concentration of 0.02 M was added and stirred for 30 minutes at a temperature of 40°C until the emission of carbon dioxide bubbles stopped.
  • the resulting solution was divided into two equal parts of 55 ml.
  • the first part was dried on a rotary evaporator under a vacuum of 8 mm. Hg Art. at a temperature of 35 °C. A white powder of the disubstituted ammonium salt of the HAEE peptide was obtained; the product yield, taking into account losses, was 84%.
  • the second part of the solution with a volume of 55 ml was poured into penicillin vials with a volume of 5 ml and frozen in a refrigeration unit at -20 ° C and then freeze-dried in a standard mode at a pressure of 0.02 mbar for 34 hours.
  • the product was a white powder of the disubstituted ammonium salt of the HAEE peptide.
  • HAEE-(NH 4 ) 2 Another option for the method of producing HAEE-(NH 4 ) 2 is the use of ammonium carbonate.
  • the first part was dried on a rotary evaporator under a vacuum of 6 mm. Hg Art. at room temperature. A white powder of the disubstituted ammonium salt of the HAEE peptide was obtained; the product yield, taking into account losses, was 83%.
  • the second part of the solution with a volume of 55 ml was poured into penicillin vials with a volume of 5 ml and frozen in a refrigeration unit at -20 ° C and then freeze-dried in a standard mode at a pressure of 0.02 mbar for 30 hours.
  • the product was a white powder of the disubstituted ammonium salt of the HAEE peptide.
  • HAEE-(NH 4 ) 2 Another option for the method of producing HAEE-(NH 4 ) 2 is the use of ammonium sulfate.
  • HAEE-(NH 4 ) 2 is characterized by four endothermic peaks. The first begins at 60 °C with a maximum at 98 °C, the second peak begins at 112 °C with a maximum at 130 °C, the third peak begins at 174 °C with a maximum at 202 °C and the fourth melting maximum occurs at 234 °C ( Figure 5).
  • the disubstituted ammonium salt of the HAEE peptide can contain a residual moisture content of up to 5 wt%.
  • IR spectra with Fourier transform of HAEE-(NH 4 ) 2 in comparison with HAEE is characterized by a redistribution of the intensities of the maxima at 1250 and 1310 cm' 1 (CN) by 25%. New maxima are observed at 875 and 935 cm' 1 (imidazole ring) and 985 cm 1 (Fig. 6,7).
  • HAEE-(NH 4 ) 2 the position of the chemical shifts of the protons in the HAEE molecule changed and is presented in Fig. 10, which indicates the influence of ammonium ion on HAEE molecules in solution and, therefore, the preservation of the steric structure of the HAEE molecule both in solid form in the form of an ammonium salt and in solution, which is important for pharmacological properties.
  • the signal shifts are presented in Table 1; signals differing by 0.02-0.03 ppm were considered significant.
  • the displacement of proton signals from certain groups in the molecule shows their contribution to the electrostatic interaction with the ammonium ion during salt formation; the greater the interaction, the greater the shift observed in the 1 H-NMR spectrum of certain CH groups of the molecule.
  • the data obtained indicate that in human or mouse blood samples the conformation of the HAEE peptide differs sharply from the conformation observed under the same conditions for the ammonium salt. Only 8% of HAEE is in the “unfolded” conformation after its interaction with blood plasma elements. Thus, in blood samples, the ammonium salt of the HAEE peptide retains its conformation (presumably “unfolded”) unchanged, while HAEE acquires a different conformation, which is characterized by a much more compact structure, presumably "spiral". This means that the HAEE molecule in the form of an ammonium salt is resistant to changes in conformation in blood plasma.
  • the fundamental differences in the spatial structure of these molecules in the blood plasma indicate about the different molecular mechanism of action of the ammonium salt of the HAEE peptide and native HAEE, which excludes their bioequivalence.
  • Example 4 Stability of ammonium salts of the HAEE peptide.
  • the stability of ammonium salts of the HAEE peptide was determined in an accelerated storage test for 6 months, which corresponds to 2 years of storage under normal conditions (Table 2). Ammonium salts of the HAEE peptide retained their color and consistency, did not gain water (the weight of the sample did not increase within 1-2%) and did not lose the active substance. The HAEE sample gained water over time (up to 7% wt.) and, according to HPLC data, degraded to 67.4% of the active substance in 6 months. Thus, the stability of ammonium salts of the HAEE peptide turned out to be significantly higher compared to HAEE.
  • Example 5 Pharmaceutical compositions based on ammonium salts of the HAEE peptide.
  • compositions based on ammonium salts of the HAEE peptide may contain the active substance in an effective amount (Table 3). These compositions were prepared separately for each of the monosubstituted and disubstituted ammonium salts of the HAEE peptide.
  • the dosage composition is calculated individually and can vary from 0.1 mg to 100 mg per person per day, more preferably from 1 to 50 mg.
  • compositions of the pharmaceutical compositions are presented in Table 3.
  • the conversion was made to the dosage of the active substance.
  • Other ratios of the active substance in the pharmaceutical composition are possible in the range from 0.1 to 100 mg.
  • the weight of the tablets varies from 100 to 400 mg, the tablets can be coated.
  • Example 6 Effect of ammonium salts of the HAEE peptide on behavioral functions and severity of cerebral amyloidosis in experimental animals.
  • Alzheimer's disease To model a neurodegenerative disease, a model of Alzheimer's disease was chosen, which is the most common neurodegenerative disease in older people.
  • mice of the APPswe/PSEN1dE9 line were used for the experiments. Mice of this line are also known as APP/PS1.
  • APP/PS1 mice starting at 4-6 months of age, display characteristic cognitive signs of Alzheimer's disease-like pathology and have significant amounts of congophilic amyloid plaques in specific regions of the brain, including the hippocampus and cortex (Borchelt DR, Ratovitski G, Van Lare J., et al. (1997). Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin
  • control Wild-type mice injected intravenously with saline;
  • control APP/PS1 transgenic mice that were intravenously injected with saline;
  • HAEE preparations and ammonium salts of the HAEE peptide were injected into the retro-orbital venous plexus in accordance with a known procedure (Yardeni T., Eckhaus M., Morris H.D. et al. (2011). Retro-orbital injections in mice. Lab animal, 40(5), 155-160, doi: 10.1038/laban0511-155). Injections at a dose of 0.05 mg/kg were performed monthly, from the age of
  • APP/PS1 transgenic mice and wild-type mice were used as controls.
  • mice were placed in cages with fresh bedding containing eighteen beads arranged in a 3 x 6 matrix. The mice were left in the cage for 30 minutes, after which the percentage of more than two-thirds of beads buried was determined. of the total number of balls.
  • the burying behavior is a sign of obsessive-compulsive behavior. Due to the repetitive and perseverative nature of burying, this behavior may represent neuropsychiatric symptoms such as perseverative behavior and/or stereotypic behavior. Both are neuropsychiatric symptoms commonly present in patients with Alzheimer's disease and other types of dementia.
  • the value of the CVS 12.6 ⁇ 4.2 (%), which indicates a strong deterioration in the behavioral reflexes of APP/PS1 mice compared to wild-type animals and reflects the disabling effect of overproduction of human beta-amyloid on the processes nervous activity.
  • the CVS value was 20.6 ⁇ 7.3 (%).
  • the value of the NRS was 41.5 ⁇ 9.5 and 47.4 ⁇ 10.2 (%), respectively (Table 4).
  • the process of pouring the sample into paraffin was carried out as follows: poured 75% ethanol and left overnight, then changed to 96% ethanol and kept for 5 minutes, 96% ethanol - 10 minutes, 100% ethanol - 10 minutes (two changes), ethanol-chloroform (1:1) - 30 minutes, and left in pure chloroform overnight. Paraffin embedding was carried out at 60°C for 3 hours (three shifts). Embedding of tissues into paraffin blocks was carried out using a Leica EG1160 device. Serial brain sections (8 ⁇ m) were cut using a Leica RM2265 microtome and mounted on glass slides.
  • Example 7 Specific binding of ammonium salts of the HAEE peptide to human beta-amyloid (Ap42).
  • ammonium salts of the HAEE peptide to beta-amyloid was assessed as one of the mechanisms of action of this salt in neurodegenerative lesions associated with beta-amyloid.
  • Salt formation between the analyte in solution (ammonium salt of the HAEE peptide or native HAEE) and the immobilized 42-membered human beta-amyloid (ligand) was studied using BPPR. Based on the results of such experiments, the kinetic parameters of interactions and the value of the dissociation constant (K D ) of the interaction were calculated. If the K D 10" value is 4 M, then the interaction between the ammonium salt of the HAEE peptide and beta-amyloid is biologically significant.
  • NAEE vs. NAEE.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к однозамещенной или двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ, где НАЕЕ представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по С-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu. Настоящее изобретение также относится к способу получения аммониевых солей пептида НАЕЕ (варианты), к фармацевтическим композициям на основе аммониевых солей пептида НАЕЕ и применению аммониевых солей пептида НАЕЕ для лечения нейродегенеративных заболеваний.

Description

АММОНИЕВАЯ СОЛЬ ПЕПТИДА НАЕЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Изобретение относится к однозамещенной или двузамещенной аммониевых солей пептида НАЕЕ, где НАЕЕ представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по С-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala- Glu-Glu. Настоящее изобретение также относится к способу получения аммониевых солей пептида НАЕЕ (варианты), к фармацевтическим композициям на основе аммониевых солей пептида НАЕЕ и применению аммониевых солей пептида НАЕЕ для лечения нейродегенеративных заболеваний.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Нейродегенеративные заболевания имеют ряд общих факторов развития и целый ряд других обобщающих механизмов (Litvinenko I.V., Krasakov I.V., Bisaga G.N. et al. Modern conception of the pathogenesis of neurodegenerative diseases and therapeutic strategy. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2017;117(6-2):3-10. (In Russ.), doi: 10.17116/jnevro2017117623-10), что может связывать болезнь Альцгеймера (БА), сосудистую деменцию, нейродегенерацию при рассеянном склерозе (PC), болезнь Паркинсона, а также болезнь Альцгеймера в условиях активации системного воспаления (Williams-Gray С.Н., Wijeyekoon R., Yarnall A.J. et al. ICICLE-PD study group. Serum immune markers and disease progression in an incident Parkinson’s disease cohort (ICICLE-PD). Movement Disorders. 2016;31(7):995-1003. https://doi.org/10.1002/mds.26563). Воспаление относится к типовым патологическим процессам организма человека. Типовой патологический процесс проявляется определенным набором характерных признаков. В настоящее время считается, что нейродегенеративный процесс является вторичным по отношению к воспалительному (Mostafa A., Jalilvand S., Shoja Z. Et al. Multiple sclerosis- associated retrovirus, Epstein-barr virus, and vitamin D status in patients with relapsing remitting multiple sclerosis. Journal of Medical Virology. 2017. doi: 10.1002/jmv.24774; Litvinenko I.V., Krasakov I.V., Bisaga G.N. et al. Modern conception of the pathogenesis of neurodegenerative diseases and therapeutic strategy. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2017;117(6-2):3-10. (In Russ.), doi: 10.17116/jnevro2017117623-10).
Болезнь Альцгеймера является одним из наиболее распространённых нейродегенеративных заболеваний среди людей пожилого возраста и характеризуется нейритными бляшками, основным компонентом которых является пептид бета-амилоид (АР). N-концевая область 1-16 бета-амилоида является металл-связывающим доменом, где цинк (Zn) и медь (Си) присоединяются к пептиду Ар (Guilloreau L., Damian L., Coppel Y., et al. (2006). Structural and thermodynamical properties of Cull amyloid-pi6/28 complexes associated with Alzheimer’s disease. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry, 11 (8), 1024-1038, doi: 10.1007/s00775-006-0154-1). Снижение уровня ионов цинка в крови за счет связывания ионов цинка специфическими хелатирующими агентами и/или блокирование взаимодействий пептида Ар с ионами цинка может предотвратить патологии, связанные с этими взаимодействиями (Ayton S., Lei Р., Bush A. Biometals and Their Therapeutic Implications in Alzheimer’s Disease. Neurotherapeutics. 2015. 12(1): p. 109-120). Высокие концентрации цинка вызывают преципитацию пептида Ар и влияют на образование в специфических отделах мозга (гиппокамп, кортекс, таламические ядра) внеклеточных агрегатов Ар (амилоидных бляшек), которые ассоциированы с развитием болезни Альцгеймера ((Frederickson C.J., Bush A.I. (2001). Synaptically released zinc: physiological functions and pathological effects. Biometals, 14(3), 353-366, doi: 10.1023/A: 1012934207456). Поэтому применение цинка и других катионов в фармацевтических препаратах, которые могут взаимодействовать с таргетными мишенями в организме и лечить нейродегенеративные заболевания, в частности болезнь Альцгеймера, является нетривиальной решением.
На сегодняшний день нет действующих эффективных препаратов, которые бы излечивали нейродегенеративные заболевания. Из научной и патентной литературы известны ряд пептидов, которые могли бы применяться при лечении таких заболеваний.
Из WO 2012/056157 и патента РФ № 2679080 известно соединение, представляющее собой Ac-HAEE-NH2 (далее - НАЕЕ). В аббревиатуре НАЕЕ буквы означают: Н -гистидин, А - аланин, Е - глутаминовая кислота. НАЕЕ способно ингибировать взаимодействие пептидов Ар с ионами Zn (II), вызывая уменьшение или предотвращение агрегации пептида Ар в присутствии ионов Zn (II) при физиологических концентрациях ионов Zn (II) 100-400 мкМ. Более высокие концентрации ионов Zn (II), порядка 1 ммоль (мМ), подавляют взаимодействия между НАЕЕ и 1-16 областью Ар. Было показано, что инкубация агрегатов Ар с НАЕЕ в течение минимум 1 часа при 20, 40, 80, 100 и 150 мкМ НАЕЕ приводит к дезагрегации таких агрегатов.
Из патента РФ № 2679059 известно, что несмотря на ингибирование образования амилоидных бляшек, влияние известных препаратов, в частности НАЕЕ, на улучшение когнитивных функций при болезни Альцгеймера в среднем является очень ограниченным и существует необходимость получения альтернативных эффективных средств для лечения болезни Альцгеймера, в том числе за счет снижения или предотвращения связывания ионов Zn(ll) с пептидом Ар. В качестве альтернативного средства для лечения болезни Альцгеймера было предложено использовать пептид с аминокислотной последовательностью (в стандартных однобуквенных кодах) H[isoD][pS]GYEVHH (где isoD обозначает изомеризованный остаток аспарагиновой кислоты, a pS относится к фосфорилированному остатку серина) с открытыми или защищенными концами основной полипептидной цепи. Из патента РФ № 2709539 известно, что короткие заряженные пептиды типа НАЕЕ имеют очень короткое время жизни в плазме крови (от нескольких секунд до нескольких минут) и с трудом проходят через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), что существенно ослабляет эффективность их терапевтического воздействия. С целью преодоления этих недостатков авторы патента РФ № 2709539 разработали фармацевтическую композицию для доставки НАЕЕ через ГЭБ для лечения нейродегенеративных заболеваний, включая деменцию Альцгеймеровского типа (болезнь Альцгеймера), которая позволяет улучшить фармакокинетические характеристики и увеличить биодоступность НАЕЕ.
Данная композиция содержит эффективное количество субстанции в виде комплекса НАЕЕ с цинком и человеческим сывороточным альбумином (HAEE-Zn-HSA) в форме раствора для введения с фармацевтически приемлемым носителем, выбранным из круга нейтральных носителей и разбавителей, например, в физиологическом растворе. Полученная фармацевтическая композиция позволяет увеличить в пять раз биодоступность субстанции в мозге, увеличить время полувыведения из организма в два раза; улучшить когнитивные функции экспериментальных животных на 20%. Из патента РФ № 2709539 известно, что фармацевтическая композиция HAEE-Zn-HSA является стабильной в подходящей водной буферной системе, в диапазоне значений pH от 4 до 8, в присутствии или в отсутствии различных солей.
Однако известно, что заряд альбумина в нейтральной среде равен -1 , в щелочной среде равен -2, а в слабокислой среде равен 0 (изоэлектрическое состояние) и альбумин выпадает в осадок (Биохимия с упражнениями и задачами. Под ред. А. И. Глухова, Е С. Северина. ГЭОТАР-Медиа, Москва. 2019. С.19), поэтому данный комплекс не должен существовать в слабокислой среде при pH 4-5,5.
Прототипом изобретения был выбран источник WO 2012/056157, в котором описывается пептид с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu, ацетилированный по N-концу и амидированный по С-концу (НАЕЕ). Фармацевтически приемлемые соли для НАЕЕ не были ранее получены и охарактеризованы, а их свойства в твердой фазе неизвестны.
Получение фармацевтически приемлемых солей лекарственных веществ способствует улучшению их растворимости, биодоступности, повышению стабильности и других полезных биофармацевтических характеристик.
Таким образом, задачи, на решение которых направлено изобретение, заключаются в получении эффективного средства для лечения нейродегенеративных заболеваний в виде неизвестных ранее аммониевых солей НАЕЕ, включая однозамещенную (HAEE-NH4) и двузамещенную ((HAEE-(NH4)2) аммониевые соли НАЕЕ, в том числе в твердой форме, разработке фармацевтических композиций на основе такого средства и его применении для лечения нейродегенеративных заболеваний. В соответствии с настоящим изобретением описываются аммониевые соли пептида НАЕЕ.
В настоящем изобретении было обнаружено, что для усиления терапевтического действия пептида НАЕЕ для лечения нейроденегеративных заболеваний полезно использовать аммониевые соли НАЕЕ. Использование аммониевых солей пептида НАЕЕ для лечения нейродегенеративных заболеваний изменяет механизм действия пептида НАЕЕ, связанный с конформационной структурой пептида НАЕЕ, что приводит к неожиданно высокому терапевтическому эффекту.
Это подтверждается экспериментальным введением нативного пептида НАЕЕ и аммониевых солей пептида НАЕЕ в организм экспериментальных животных. Было обнаружено, что ЗО-структура нативного пептида НАЕЕ, который в виде водного раствора был введён в плазму крови мышей дикого типа, отличается от 3D- структуры нативного НАЕЕ в исходном водном растворе, что подтверждается методом ВЭЖХ по изменению времени выхода с хроматографической колонки пробы НАЕЕ, экстрагированной из плазмы крови, относительно времени выхода пробы НАЕЕ, экстрагированной из исходного водного раствора. В то же время ЗО-структура НАЕЕ в форме аммониевых солей оставалась неизменной в аналогичных экспериментальных условиях (то есть после экстрагирования из исходного водного раствора аммониевой соли пептида НАЕЕ и после экстрагирования из плазмы крови мышей дикого типа после 2-х минутной экспозиции) и соответствовала ЗО-структуре нативного пептида НАЕЕ, экстрагированного из исходного водного раствора. По данным масс-спектрометрии химическая структура пептида НАЕЕ во всех экспериментальных пробах сохранялась неизменной как для нативного пептида, так и для пептида в составе аммониевой соли. Изменение времени выхода нативного пептида НАЕЕ или аммониевой соли пептида НАЕЕ с хроматографической колонки связано в основном с различиями в гидрофобных взаимодействиях пептида НАЕЕ с материалом колонки, а эти взаимодействия в свою очередь определяются превалирующей ЗО-струкгурой пептида НАЕЕ в конкретной пробе. Таким образом, из полученных экспериментальных данных следует, что ЗО-структура пептида НАЕЕ, которая соответствует «развёрнутой» конформации пептида и является превалирующей для нативного пептида НАЕЕ в исходном водном растворе, соответствует ЗО-структуре аммониевой соли пептида НАЕЕ в водном растворе и остаётся неизменной в случае экспозиции аммониевой соли пептида НАЕЕ в плазме крови, в то время как нативный пептид НАЕЕ в плазме крови утрачивает «развёрнутую» конформацию.
В данном случае термин ЗО-структура используется как синоним пространственной структуры или взаимного расположения атомов в молекуле НАЕЕ в трехмерном пространстве. Метод ВЭЖХ основан на преимущественно межмолекулярных взаимодействиях на границе раздела фаз. Изменение времени выхода НАЕЕ с хроматографической колонки отражает изменение межмолекулярных взаимодействий HAEE с сорбентом, что является следствием различий пространственной структуры молекул НАЕЕ в нативном состоянии и в виде аммониевой соли.
Известно, что нарушение ЗО-струкгуры олигопептидов может приводить к снижению их функций и уменьшению терапевтического действия (Sikora, К., Jaskiewicz, М., Neubauer, D., Migon, D., & Kamysz, W. (2020). The role of counter-ions in peptides — an overview. Pharmaceuticals, 13(12), 442.). Ранее было показано, что для оптимального взаимодействия с партнёрами белковой природы пептид НАЕЕ должен находиться в «развёрнутой» конформации (Barykin Е. Р., Garifulina A. I., Tolstova А. Р., Anashkina А. А., Adzhubei A. A., Mezentsev Y. V., Shelukhina I. V., Kozin S. A., Tsetlin V. I., Makarov A. A. Tetrapeptide Ac-HAEE-NH(2) Protects a4|32 nAChR from Inhibition by Ар П International journal of molecular sciences. - 2020. - T. 21 , № 17. - C. 6272; Zolotarev YA, Mitkevich VA, Shram SI, Adzhubei AA, Tolstova AP, Talibov OB, Dadayan AK, Myasoyedov NF, Makarov AA, Kozin SA. Pharmacokinetics and Molecular Modeling Indicate nAChRa4-Derived Peptide HAEE Goes through the Blood-Brain Barrier. Biomolecules. 2021 Jun 18;11(6):909). В нативном пептиде HAEE имидазольная группа аминокислотного остатка гистидина может образовывать стабильные полярные связи с карбоксильными группами боковых цепей аминокислотных остатков глутаминовой кислоты, что не способствует поддержанию биологически значимой «развёрнутой» конформации данного пептида и, как следствие, снижает полезные терапевтические эффекты НАЕЕ.
Таким образом, одним из преимуществ данного изобретения является повышение терапевтической эффективности пептида НАЕЕ в форме аммониевой соли НАЕЕ вследствие сохранения ЗО-структуры данной соли в «развернутой» конформации.
Изобретение также имеет отношение к применению аммониевой соли пептида НАЕЕ для лечения нейродегенеративных заболеваний, а также патологий, сопровождающихся нейровоспалительными процессами. Аммониевая соль пептида НАЕЕ может эффективно влиять на нейродегенеративные заболевания, в частности, вызванные воспалительными причинами, восстанавливая нарушенные когнитивные функции.
Аммониевая соль пептида НАЕЕ может быть использован как в твердой, так и в жидкой форме, сохраняя свою стабильность в течение по меньшей мере 2 лет.
Техническим результатом изобретения является:
- возможность использования аммониевой соли пептида НАЕЕ при лечении нейродегенеративных заболеваний, в частности вызванных опосредованно воспалительными причинами, которое приводит к эффективному восстановлению когнитивных функций;
- повышенная стабильность аммониевой соли пептида НАЕЕ по сравнению с
НАЕЕ; - устойчивость «развернутой» конформации 3D молекулы НАЕЕ после растворения аммониевой соли НАЕЕ в плазме крови по сравнению с НАЕЕ.
Заявляемая в настоящем изобретении однозамещенная аммониевая соль пептида НАЕЕ в соответствии с используемым способом получения может быть получена в аморфной форме, что подтверждается рентгенофазовым анализом (Фиг. 1). Двузамещенная аммониевая соль пептида НАЕЕ представляет собой слабо закристаллизованную фазу (Фиг. 2).
Аммониевые соли пептида НАЕЕ характеризуется кривой дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) с термогравиометрией (ТГ) (ДСК-ТГА). Молекула НАЕЕ на ДСК-кривой характеризуется широким пиком с началом при 62°С и максимумом при 89°С; двойным пиком плавления при температуре 203 и 227, 5°С с началом при 188°С (Фиг. 3). Погрешность при многократном измерении оценивается в ± 3 °C.
HAEE-NH4 на ДСК-кривой характеризуется тремя эндотермическими максимумами: первый широкий эндотермический пик начинается от 60 °C и имеет широкий максимум при 90-100°С; второй начинается при 197°С с максимумом при 208°С, третий пик начинается с 215 °C с максимумом при 234°С. (Фиг. 4).
HAEE-(NH4)2 на ДСК-кривой имеет сложный характер и характеризуется четырьмя эндотермическими пиками. Первый имеет начало при 60°С с максимумом при 98°С, второй пик начинается от 112°С с максимумом при 130°С, третий пик начинается от 174°С с максимумом при 202°С и четвертый максимум плавления наблюдается при 234°С (Фиг 5).
ДСК-кривые показывают, что термическое поведение аммониевых солей пептида НАЕЕ (Фиг. 4,5) отличается от поведения НАЕЕ (Фиг. 3), температура плавления аммониевых солей выше по сравнению с температурой плавления НАЕЕ, что обеспечивает более высокую стабильность, что подтверждается результатами теста ускоренного хранения.
ИК-спекгр с Фурье преобразованием аммониевых солей пептида НАЕЕ представлен на Фиг. 6. ИК-спектры аммониевых солей повторяет все основные линии ИК- спектра НАЕЕ.
В ИК-спекгре HAEE-NH4 максимум при 3075 см'1 сместился в 3050 см'1 (валентные колебания в -NH3 +). Исчез максимум при 2975 см'1 (соли аминов RNH3 +). Максимум при 1625 см'1 сместился в 1640 см'1 (плоские деформационные колебания -NH2). Произошли смещения и изменения в области длин волн 1235-1320 см'1 (C-N). Произошло изменение интенсивности максимумов при 1250 см'1 и 1310 см'1 (C-N) на 25% (Фиг. 6,7).
Отличие ИК-спекгра HAEE-(NH4)2 от НААЕ заключается в перераспределение интенсивностей максимумов при 1250 и 1310 см'1 (C-N) на 25%. Наблюдаются новые максимумы при 875 и 935 см'1 (кольцо имидазола) и 985 см'1 (Фиг. 6,7). Таким образом в ИК-спектре аммониевых солей пептида НАЕЕ произошли изменения колебаний связи в молекуле НАЕЕ, преимущественно аминогрупп, что связано с образованием солей аммония.
Способ получения аммониевых солей пептида НАЕЕ заключается в смешивании при комнатной температуре водных растворов НАЕЕ и водного раствора соединения аммония в стехиометрических соотношениях, перемешивании в течение 5-30 мин и высушивании раствора.
Для получения HAEE-NH4 стехиометрическое соотношение компонентов HAEE:NH4 должно быть 1 :1 по молям. Для получения HAEE-(NH4)2 стехиометрическое соотношение компонентов HAEE:NH4 должно быть 1 :2 по молям.
Во время перемешивания допускается нагревание до 50 °C.
Высушивание выполняется стандартными методами органический химии, преимущественно под вакуумом. Температура сушки не должна превышать 50°С. Аммониевые соли пептида НАЕЕ могут быть получены в виде лиофилизата методом стандартной сублимационной лиофильной сушки. Для лиофильного высушивания раствор предварительно замораживается.
В заявляемом способе получения соединениями аммония являются гидроксид, гидрокарбонат или карбонат аммония.
Вариант способа получения аммониевых солей пептида НАЕЕ заключается в смешивании при комнатной температуре водных растворов НАЕЕ и водного раствора сульфата аммония в стехиометрических соотношениях, перемешивании в течение 5-10 мин, добавлении стехиометрических количеств водного раствора гидроксида бария для осаждения сульфат-аниона, перемешивании в течение 10-30 мин, удаление осадка сульфата бария и высушивании раствора.
Для получения HAEE-NH4 стехиометрическое соотношение компонентов HAEE:NH4 должно быть 1 :1 по молям. Для получения HAEE-(NH4)2 стехиометрическое соотношение компонентов HAEE:NH4 должно быть 1 :2 по молям.
После добавления раствора гидроксида бария во время перемешивания допускается нагревание до 50°С. Для осаждения сульфат-аниона стехиометрическое соотношение компонентов SO4 2 :Ba2+ должно быть 1 :1 по молям.
Удаление осадка сульфата бария выполняется фильтрованием или центрифугированием и декантацией супернатанта, содержащего раствор аммониевой соли пептида НАЕЕ.
Высушивание выполняется стандартными методами органический химии, преимущественно под вакуумом. Температура сушки не должна превышать 50 °C. Аммониевые соли пептида НАЕЕ могут быть получены в виде лиофилизата методом стандартной сублимационной лиофильной сушки. Для лиофильного высушивания раствор предварительно замораживается. При получении аммониевых солей пептида НАЕЕ в зависимости от способа высушивания может оставаться остаточная влажность до 5% масс. При этом аммониевые соли пептида НАЕЕ не набирают дополнительную воду при хранении и стабильны в течение длительного времени.
Еще одним объектом изобретения является фармацевтические композиции с эффективным количеством аммониевой соли пептида НАЕЕ и наличием вспомогательных веществ. В качестве лекарственного средства однозамещенная или двузамещенная аммониевая соль пептида НАЕЕ может быть использована без вспомогательных веществ в виде лиофилизированной субстанции.
Эффективное количество аммониевой соли пептида НАЕЕ зависит от типа нейродегенеративного заболевания, веса тела, способа введения, поэтому может варьироваться в широких пределах от 0, 1 до 100 мг, более желательно от 5 до 50 мг.
Фармацевтическая композиция аммониевой соли пептида НАЕЕ может быть в твердом виде или в виде водного раствора. Твердые композиции аммониевой соли пептида НАЕЕ содержат его эффективное количество и необязательно вспомогательные вещества. Твердая фармацевтическая композиция может быть получена высушиванием раствора активного вещества и набором вспомогательных компонентов или добавлением вспомогательных веществ к порошку аммониевой соли пептида НАЕЕ.
Высушенная или лиофилизированная аммониевая соль пептида НАЕЕ может находиться в аморфной форме, которая соответствует дифрактограмме на Фиг. 1,2.
Вспомогательные вещества выбираются из фармацевтически приемлемых добавок. Такими веществами могут быть маннитол, повидон К 17, трометамол, динатрия эдетат, натрия хлорид, сахароза, гистидин, полоксамер 407, и другие фармацевтически приемлемые добавки.
Фармацевтическая композиция аммониевой соли пептида НАЕЕ в виде водного раствора содержит эффективное количество аммониевой соли пептида НАЕЕ, воду, а также набор фармацевтически приемлемых добавок и солей. Такими веществами могут быть маннитол, повидон К 17, трометамол, динатрия эдетат, натрия хлорид, сахароза, гистидин, полоксамер 407, и другие фармацевтически приемлемые добавки.
Еще одним объектом изобретения является применение аммониевой соли пептида НАЕЕ для лечения нейродегенеративных заболеваний, которое заключается во введении аммониевой соли пептида НАЕЕ в составе описанных фармацевтических композиций пациенту в эффективном количестве. Эффективное количество аммониевой соли пептида НАЕЕ зависит от типа нейродегенеративного заболевания, веса тела, способа введения, поэтому может варьироваться в широких пределах от 0,1 до 100 мг, предпочтительно от 5 до 50 мг.
Введение аммониевой соли пептида НАЕЕ пациенту может осуществляться с помощью всех возможных видов наружного, энтерального, ингаляционного и парентерального способов применения (включая внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, подкожное, накожное, трансдермальное, внутримышечное, интратекальное, субарахноидальное, пероральное, интраназальное, сублингвальное, буккальное, ректальное введение). При введении аммониевой соли пептида НАЕЕ в твердой форме предпочтительным способом введения является сублингвальный. При введении аммониевой соли пептида НАЕЕ в форме раствора предпочтительными способами введения являются внутривенный и интраназальный.
Возможность терапевтического лечения нейродегенеративных заболеваний была показана на примере болезни Альцгеймера, как одного из самых распространённых нейродегенеративных расстройств, смоделированной на трансгенных мышах линии APPswe/PSEN1dE9 (APP/PS1) (Jankowsky, J. L., Slant, H. H., Ratovitski, T„ Jenkins, N. A., Copeland, N. G., & Borchelt, D. R. (2001). Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomolecular engineering, 17(6), 157-165, doi: 10.1016/S1389- 0344(01)00067-3), которые проявляют характерные когнитивные признаки патологии. Данная модель может считаться моделью опосредованного воспалительного действия при нарушении когнитивных функций.
В настоящем изобретении аммониевые соли пептида НАЕЕ вводили шестикратно внутривенно в дозе 0,05 мг/кг, после чего проводили валидный тест на когнитивные способности «Закапывание шариков» (англ. Marble Burying Test) [Santana-Santana M., Bayascas J.R., Gimenez-Llort L. (2021). Sex-Dependent Signatures, Time Frames and Longitudinal Fine-Tuning of the Marble Burying Test in Normal and AD-Pathological Aging Mice. Biomedicines, 9(8), 994, doi: 10.3390/biomedicines9080994), определяя количество более чем на 2/3 закопанных шариков в процентах от общего количества шариков. Чем больше количество закопанных шариков (КЗШ), тем выше когнитивные способности у мышей.
По результатам тестирования у контрольной группы мышей дикого типа, которым вводили физиологический раствор, значение КЗШ равнялось 50,6 ±13,3 (%). Это значение принималось в качестве референсного. У контрольной группы трансгенных мышей линии APP/PS1 , которым вводили физиологический раствор, значение КЗШ = 12,6 ±4,2 (%), что указывает на сильное ухудшение поведенческих рефлексов трансгенных мышей линии APP/PS1 по сравнению с животными дикого типа и отражает инвалидизирующее влияние оверэкспрессии человеческого бета-амилоида, ассоциированное с нейроваоспалением и образования амилоидных бляшек, на процессы нервной деятельности. У группы трансгенных мышей линии APP/PS1 , получавшей НАЕЕ значение КЗШ составило 20,6±7,3 (%). Группа трансгенных мыши линии APP/PS1, получавшая однозамещенную и двузамещенную аммониевую соль пептида НАЕЕ показали значения КЗШ = 41 ,5±9,5 (%) и КЗШ = 47,4±10,2 (%), соответственно (Таблица 4). Эти данные свидетельствуют о том, что использование аммониевой соли пептида НАЕЕ существенно улучшает поведенческие рефлексы трансгенных мышей APP/PS1 , а эффект от этого использования значительно превышает таковой, наблюдаемый для НАЕЕ. HAEE-(NH4)2 на уровне тенденции имеет большую эффективность по сравнению с HAEE-NH4.
Таким образом, аммониевые соли пептида НАЕЕ могут эффективно применяться при лечении нейродегенеративных заболеваний, в частности вызванными воспалительными осложнениями, восстанавливая когнитивные функции до нормального состояния.
Гистохимический анализ области гиппокампа головного мозга экспериментальных мышей показал, что число бляшек (ЧБ) на один срез мозга у контрольной группы диких мышей равно нулю, у контрольной группы трансгенных мышей APP/PS1 значение ЧБ оказалось равным 31 ,7 ± 4,9, в группе мышей, получавших НАЕЕ, значение ЧБ составило 24,7±3,4. В группе мышей, получавших HAEE-NH4 и HAEE-(NH4)2, значение ЧБ составило 9,5±3,9 и 8,9±2,8, соответственно.
Таким образом, результаты гистохимического анализа показали, что введение аммониевых солей пептида НАЕЕ приводили к почти 4-кратному уменьшению амилоидной нагрузки в гиппокампе трансгенных мышей APP/PS1 , и по этому показателю эффективность аммониевых солей пептида НАЕЕ примерно в три раза выше таковой, выявленной для НАЕЕ.
В качестве одного из механизмов действия аммониевых солей пептида НАЕЕ на возможность лечения нейродегенеративных заболеваний может являться его связывание с бета-амилоидом. Были рассчитаны кинетические характеристики взаимодействия аммониевых солей пептида НАЕЕ и иммобилизованного человеческого бета-амилоида, которые оказались равны kon = (1 ,41±0,06) х 103
Figure imgf000012_0001
koff = (5,78±0,06) х Ю'3 s'1; KD = (4,1 ±0,3) х Ю'6 М для HAEE-NH4 И значения kon = (1 ,35±0,06) х Ю3 M'1s'1; koff = (5,65±0,06) х 10‘3 s'1; KD = (4,19±0,3) х Ю'6 для HAEE-(NH4)2. Поскольку значение KD s 10'4 М, то такое взаимодействие является биологически значимым. В отличие от аммониевых солей, нативный пептид НАЕЕ не связывался с бета-амилоидом в аналогичных экспериментальных условиях.
Это различие между нативным пептидом НАЕЕ и аммониевыми солями пептида НАЕЕ может влиять на фармакологические свойства, что подтвердили различающиеся тесты восстановления когнитивных функций - эффективность НАЕЕ была значительно ниже эффективности аммониевых солей пептида НАЕЕ. Этот эффект можно связать с вышеупомянутыми данными ВЭЖХ-МС, которые показали изменения в 3D структуре нативного НАЕЕ после его введения в плазму крови, тогда как аммониевая соль пептида НАЕЕ до и после его введения в плазму крови имеет одно и то же время удерживания на хроматограмме ВЭЖХ и, соответственно, устойчивую 3D структуру. Это означает, что ион аммония играет защитную роль для сохранения «развёрнутой» конформации пептида НАЕЕ в данных солях, что, возможно, также предотвращает взаимодействие с элементами плазмы крови, поскольку известно, что введение нативного НАЕЕ в периферическую кровеносную систему мышей, крыс и кроликов приводит к образованию стабильных комплексов НАЕЕ с транспортными и рецепторными белками (Zolotarev Y.A., Mitkevich V.A., Shram S.l. et al. Pharmacokinetics and Molecular Modeling Indicate nAChRa4- Derived Peptide HAEE Goes through the Blood-Brain Barrier. Biomolecules. 2021. 11(6): p. 909, doi: 10.3390/biom11060909).
В совокупности можно сделать вывод о том, что аммониевые соли пептида НАЕЕ имеет намного большую терапевтическую эффективность по сравнению с НАЕЕ и эти вещества между собой бионеэквивалентны, поскольку после введения аммониевой соли в организм, НАЕЕ существует в растворе плазмы крови в «развернутой» конформации и имеет отличный от НАЕЕ механизм действия.
ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фиг. 1 . Дифрактограмма HAEE-NH4.
Фиг. 2. Дифрактограмма HAEE-(NH4)2.
Фиг. 3. ДСК-ТГА кривая НАЕЕ. 1 - ДСК-кривая; 2 - ТГ-кривая.
Фиг. 4. ДСК-ТГА кривая HAEE-NH4.
Фиг. 5. ДСК-ТГА кривая HAEE-(NH4)2.
Фиг. 6. ИК-спекгр с Фурье преобразованием НАЕЕ (1), HAEE-(NH4)2 (2) и HAEE-NH4 (3).
Фиг. 7. ИК-спектр с Фурье преобразованием в характеристичной области 1800-700 см'1. НАЕЕ (1), HAEE-(NH4)2 (2) и HAEE-NH4 (3).
Фиг. 8. Расположение атомов в молекуле НАЕЕ для 1Н-ЯМР-анализа.
Фиг. 9. 1Н-ЯМР спектр НАЕЕ.
Фиг. 10. 1Н-ЯМР спектр HAEE-NH4.
Фиг. 11. 1Н-ЯМР спектр HAEE-(NH4)2.
Описание приборов.
Порошковый рентгенофазовый анализ (РФА) выполнялся на дифрактометре Rigaku Ultima IV (Япония), напряжение на трубке - 40 кВ, ток трубки - 30 мА, материал анода трубки - Си. Гониометр: ©/© вертикального типа, образец неподвижен. Радиус гониометра - 185 мм /285 мм. Максимумы на дифрактограмме накапливались в течение 1 ч. Угол 2© составил от 3 до 70 градусов.
Исследование температуры плавления, термического поведения и потери массы выполняли методом дифференциальной сканирующей калориметрии и термогравиметрии (ДСК-ТГА) на приборе NETZSCH STA 449 С (Германия) в инертной атмосфере при скорости нагрева 10 град/мин.
Элементный анализ выполнен методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии с приставкой EDXA на микроскопе TESCAN MIRA3 (Чехия). Площадь измеряемого участка 0,04 мм2, количество измерений - 3. и Спектры инфракрасного излучения (ИК-спектры) получали на ИК-Фурье спектрометре Spectrum Two (Perkin Elmer, США) с приставкой диффузного отражения в диапазоне 4000-600 см'1 с разрешением 2 см'1, количество сканов - 10.
1Н-спекгры ЯМР получали на ЯМР-спектрометре Bruker Avance IIIHD 500, рабочая частота 500,13 Mhz для ядер 1Н.
Взаимодействие с бета-амилоидом фиксировали биосенсором на эффекте поверхностного плазмонного резонанса (БППР) в водных буферных системах при физиологических значениях pH. БППР эксперименты были проведены на инструменте «BIAcore 3000» (GE Healthcare, США) с использованием оптического чипа СМ4 в соответствии с протоколами компании-производителя. Синтетический аналог 42-членного человеческого бета-амилоида (Ар42), на С-конце которого добавлен тетраглицилцистеиновый пептидный фрагмент (-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys), был использован в качестве лиганда.
Лиганд (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAGGGGC) иммобилизовали на поверхности оптического чипа через дисульфидную связь тиоловой группы С-концевого остатка цистеина. В качестве аналитов использовали аммониевые соли НАЕЕ или НАЕЕ.
Высушивание замороженных образцов выполнялось в пенициллиновых пузырьках на сублиматоре Heto FD 2.5 при давлении 0,1 -0,2 мбар.
Тест ускоренного хранения проводили в камере Memmert НСР50 при 40 °C и 75% влажности. Образцы отбирали раз в месяц в течение 6 месяцев и определяли содержание действующего вещества методом ВЭЖХ.
ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, но не ограничивается ими.
Пример 1. Получение однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ (НАЕЕ- NH4).
К 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10'3 М добавляли 10 мл NH4OH с концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 15 мин при комнатной температуре. Полученный раствор разделили на две части по 55 мл.
Первую часть высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 7 мм. рт. ст. при температуре 40 °C. Получили белый порошок однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 88%.
Вторую часть раствора объемом 55 мл разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 5 мл и замораживали в холодильной установке при -20 °C и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,015 мбар в течение 24 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 97%. Продукт представлял собой белый порошок однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ. Исследование образцов однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ показало, что независимо от способа высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг. 1, 4, 6, 7, 10).
Еще одним вариантом способа получения HAEE-NH4 является использование гидрокарбоната аммония.
К 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10'3 М добавляли 10 мл NH4HCO3 с концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 30 мин при температуре 40°С вплоть до прекращения выделения пузырьков диоксида углерода. Полученный раствор разделили на две части по 55 мл.
Первую часть высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 8 мм. рт. ст. при температуре 35 °C. Получили белый порошок однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 86%.
Вторую часть раствора объемом 55 мл разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 5 мл и замораживали в холодильной установке при -20 °C и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,02 мбар в течение 36 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 99%. Продукт представлял собой белый порошок однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ показало, что независимо от способа высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг. 1, 4, 6, 7, 10).
Ещё одним вариантом способа получения HAEE-NH4 является использование карбоната аммония.
К 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10'3 М добавляли 5 мл (NH4)2CO3 С концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 25 мин при температуре 50°С вплоть до прекращения выделения пузырьков диоксида углерода. Полученный раствор разделили на две части по 50 и 55 мл.
Первую часть высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 6 мм. рт. ст. при комнатной температуре. Получили белый порошок однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учётом потерь составил 83%.
Вторую часть раствора объемом 55 мл разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 5 мл и замораживали в холодильной установке при -20 °C и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,02 мбар в течение 30 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 97%. Продукт представлял собой белый порошок однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ показало, что независимо от способа высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг. 1, 4, 6, 7, 10). Еще одним вариантом способа получения HAEE-NH4 является использование сульфата аммония.
К 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10'3 М добавляли 5 мл (NH4)2SO4 С концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре. После чего добавляли к получившемуся раствору добавляли 5 мл раствора Ва(ОН)2 с концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 20 мин при температуре 35°С. Полученный раствор с осадком центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 мин и декантировали надосадочную жидкость, которую высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 9 мм. рт. ст. при 30 °C. Получили белый порошок однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 82%.
В еще одном варианте осуществления изобретения к 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10'3 М добавляли 5 мл (NH4)2SO4 с концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре. После чего добавляли к получившемуся раствору добавляли 5 мл раствора Ва(ОН)2 с концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Полученный раствор с осадком фильтровали через бумажный фильтр под вакуумом. Профильтрованный раствора разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 2 мл и замораживали в холодильной установке при -20 °C и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,02 мбар в течение 32 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 91%. Продукт представлял собой белый порошок однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ, полученные из сульфата аммония показало, что независимо от способа фильтрования и высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг. 1, 4, 6, 7, 10).
Все полученные образцы HAEE-NH4 характеризуются аморфной формой на дифрактограмме (Фиг. 1). На ДСК кривой в отличие от НАЕЕ (Фиг. 3) HAEE-NH4 характеризуется тремя эндотермическими максимумами: первый широкий эндотермический пик начинается от 60 °C и имеет широкий максимум при 90-100 °C; второй начинается при 197 °C с максимумом при 208 °C, третий пик начинается с 215 °C с максимумом при 234 °C. (Фиг. 4).
Методом ДСК-ТГА было показано, что аммониевая соль пептида НАЕЕ может содержать остаточную влажность до 5% масс.
В ИК-спектре HAEE-NH4 в отличие от ИК-спектра НАЕЕ максимум при 3075 см'1 сместился в 3050 см'1 (валентные колебания в -NH3 +). Исчез максимум при 2975 см'1 (соли аминов RNH3 +). Максимум при 1625 см'1 сместился в 1640 см'1 (плоские деформационные колебания -NH2). Произошли смещения и изменения в области длин волн 1235-1320 см'1 (C-N). Произошло изменение интенсивности максимумов при 1250 см'1 и 1310 см'1 (C-N) на 25% (Фиг. 6,7).
Исходный образец НАЕЕ характеризовался ЯМР 1H[500.13Mhz; D2O; 298К; d, м.д.]: 1.27 (ЗН, d, j=7.13Hz, СН3(16)), 1.87 (5Н, m, СН3(3), 1/2СН2(21 ), 1/2СН2(33)), 1.99 (2Н, sx, j=7.45Hz 1/2СН2(21 ), 1/2СН2(33)), 2.28 (4Н, т, 2СН2(22,34 )), 3.13, 3,03 (2Н, т, СН2(8)), 4.19 (ЗН, т, ЗСН (15,20,29)), 4.56 (1Н, t, j=6.86Hz, СН(5)), 7.19 (1Н, s, СН(10)), 8.50 (1Н, S, СН(12)) (Фиг. 8,9).
В HAEE-NH4 положение химических сдвигов протонов в молекуле НАЕЕ изменялась и представлено на Фиг. 10, что свидетельствует о влиянии иона аммония на молекулы НАЕЕ в растворе и, следовательно, о сохранении стерической структуры молекулы НАЕЕ как в твердом виде в виде аммониевой соли, так и в растворе, что важно для фармакологических свойств. Смещение сигналов представлены в Таблица 1 , значимыми были приняты сигналы отличающиеся на 0,02-0,03 м.д.
Смещение протонных сигналов от определенных групп в молекуле показывает их вклад в электростатическое взаимодействие с ионом аммония при образовании соли; чем больше взаимодействие, тем большее смещение наблюдается в 1Н-ЯМР-спектре у определенных СН-групп молекулы. Поэтому наибольшее взаимодействие наблюдается у атомов 21 , 22, 33, 34 (Glu), что свидетельствует об образовании соли по карбоксильной группе глутамата.
Пример 2. Получение двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ (НАЕЕ- (NH4)2).
К 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10'3 М добавляли 10 мл NH4OH с концентрацией 0,02 М и перемешивали в течение 20 мин при комнатной температуре. Полученный раствор разделили на две равные части по 55 мл.
Первую часть высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 6 мм. рт. ст. при температуре 40°С. Получили белый порошок двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 87%.
Вторую часть раствора объемом 55 мл разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 5 мл и замораживали в холодильной установке при -20 °C и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,02 мбар в течение 28 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 97%. Продукт представлял собой белый порошок двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ показало, что независимо от способа высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг. 2, 5, 6, 7, 11).
Еще одним вариантом способа получения HAEE-(NH4)2 является использование гидрокарбоната аммония. К 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 103 М добавляли 10 мл NH4HCO3 с концентрацией 0,02 М и перемешивали в течение 30 мин при температуре 40°С вплоть до прекращения выделения пузырьков диоксида углерода. Полученный раствор разделили на две равные части по 55 мл.
Первую часть высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 8 мм. рт. ст. при температуре 35 °C. Получили белый порошок двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 84%.
Вторую часть раствора объемом 55 мл разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 5 мл и замораживали в холодильной установке при -20 °C и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,02 мбар в течение 34 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 98%. Продукт представлял собой белый порошок двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ показало, что независимо от способа высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг. 2, 5, 6, 7, 11).
Еще одним вариантом способа получения HAEE-(NH4)2 является использование карбоната аммония.
К 100 мл буферного раствора НАЕЕ с pH = 7 и с концентрацией 10'3 М добавляли 10 мл (NH4)2CO3 С концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 20 мин при температуре 50 °C вплоть до прекращения выделения пузырьков диоксида углерода. Полученный раствор разделили на две равные части.
Первую часть высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 6 мм. рт. ст. при комнатной температуре. Получили белый порошок двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 83%.
Вторую часть раствора объемом 55 мл разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 5 мл и замораживали в холодильной установке при -20 °C и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,02 мбар в течение 30 ч. Выход продукта с учётом потерь составил 97%. Продукт представлял собой белый порошок двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ показало, что независимо от способа высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг. 2, 5, 6, 7, 11).
Ещё одним вариантом способа получения HAEE-(NH4)2 является использование сульфата аммония.
К 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10'3 М добавляли 10 мл (NH4)2SO4 С концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре. После чего добавляли к получившемуся раствору добавляли 5 мл раствора Ва(ОН)2 с концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 20 мин при температуре 35°C. Полученный раствор с осадком центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 мин и декантировали надосадочную жидкость, которую высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 7 мм. рт. ст. при 30°С. Получили белый порошок двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 84%.
В еще одном варианте осуществления изобретения к 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10'3 М добавляли 10 мл (NH4)2SO4 с концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре. После чего добавляли к получившемуся раствору добавляли 5 мл раствора Ва(ОН)2 с концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Полученный раствор с осадком фильтровали через бумажный фильтр под вакуумом. Профильтрованный раствора разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 2 мл и замораживали в холодильной установке при -20 °C и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,02 мбар в течение 32 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 89%. Продукт представлял собой белый порошок двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ, полученные из сульфата аммония показало, что независимо от способа фильтрования и высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг. 2, 5, 6, 7, 11).
Все полученные образцы HAEE-(NH4)2 характеризуются слабо закристаллизованной формой на дифрактограмме (Фиг. 2).
На ДСК кривой в отличие от НАЕЕ (Фиг. 3) HAEE-(NH4)2 характеризуется характеризуется четырьмя эндотермическими пиками. Первый имеет начало при 60 °C с максимумом при 98 °C, второй пик начинается от 112 °C с максимумом при 130 °C, третий пик начинается от 174 °C с максимумом при 202 °C и четвертый максимум плавления наблюдается при 234 °C (Фиг 5).
Методом ДСК-ТГА было показано, что двузамещенная аммониевая соль пептида НАЕЕ может содержать остаточную влажность до 5% масс.
ИК-спекгр с Фурье преобразованием HAEE-(NH4)2 по сравнению с НАЕЕ характеризуется перераспределением интенсивностей максимумов при 1250 и 1310 см'1 (C-N) на 25%. Наблюдаются новые максимумы при 875 и 935 см'1 (кольцо имидазола) и 985 см 1 (Фиг. 6,7).
В HAEE-(NH4)2 положение химических сдвигов протонов в молекуле НАЕЕ изменялась и представлено на Фиг. 10, что свидетельствует о влиянии иона аммония на молекулы НАЕЕ в растворе и, следовательно, о сохранении стерической структуры молекулы НАЕЕ как в твердом виде в виде аммониевой соли, так и в растворе, что важно для фармакологических свойств. Смещение сигналов представлены в Таблице 1, значимыми были приняты сигналы отличающиеся на 0,02-0,03 м.д. Смещение протонных сигналов от определенных групп в молекуле показывает их вклад в электростатическое взаимодействие с ионом аммония при образовании соли; чем больше взаимодействие, тем большее смещение наблюдается в 1Н-ЯМР-спектре у определенных СН-групп молекулы. Поэтому взаимодействие наблюдается у атомов 21 , 22, 33, 34 (Glu), что свидетельствует об образовании соли по карбоксильной группе глутамина. В отличие от HAEE-NH4 в HAEE-(NH4)2 во взаимодействие включается имидазольная группа гистидинового фрагмента, что видно по смещению сигналов у протонов 8, 10, 12 (His1).
Пример 3. ВЭЖХ аммониевых солей пептида НАЕЕ.
Сравнительный анализ аммониевых солей пептида НАЕЕ и нативного пептида НАЕЕ методом ВЭЖХ-МС (2,5 нг/мл, 0,5% FA - муравьиная кислота, 50% МеОН (1 :1)) показал, что в водных растворах in vitro при физиологических значениях pH их хроматографическая подвижность практически идентична НАЕЕ в тех же хроматографических условиях. Время выхода хроматографического пика с колонки для HAEE-NH4 составляло 2,80 мин, для HAEE-(NH4)2 - 2,81 мин, для НАЕЕ - 2,85 мин. С учетом известных из литературы данных молекулярного моделирования (Barykin Е.Р., Garifulina A.I., Tolstova А.Р. et al. (2020). Tetrapeptide Ac-HAEE-NH2 Protects a4₽2 nAChR from Inhibition by Ap. International journal of molecular sciences, 21(17), 6272, doi: 10.3390/ijms21176272), вышеприведённые результаты указывают на то, что пространственные структуры основной пептидной цепи аммониевой соли пептида НАЕЕ и пептида НАЕЕ в условиях in vitro идентичны и характеризуется «развернутой» конформацией.
После введения аммониевых солей пептида НАЕЕ внутривенно в организм здоровых мышей (п = 5) с последующим забором крови у животных и экстракцией из забранных образцов крови фракции, содержащей НАЕЕ, было найдено, что время выхода НАЕЕ на хроматограммах проб, приготовленных из образцов крови животных, которым вводили HAEE-NH4 ИЛИ HAEE-(NH4)2 не изменялось и составляло 2,80 мин и 2,81 мин, соответственно. Однако, неожиданно было обнаружено, что время выхода основного пика НАЕЕ на хроматограмме пробы, приготовленной из образцов крови животных, которым вводили пептид НАЕЕ, стало 1 ,27 мин и только около 8% НАЕЕ выходило в хроматографическом пике на времени 2,85 мин.
Полученные данные свидетельствует о том, что в образцах крови человека или мыши конформация пептида НАЕЕ резко отличается от конформации, наблюдаемой при тех же условиях для аммониевой соли. Лишь 8% НАЕЕ находится в «развернутой» конформации после его взаимодействия с элементами плазмы крови. Таким образом, в образцах крови аммониевая соль пептида НАЕЕ сохраняет свою конформацию (предположительно, «развёрнутую») неизменной, в то время как НАЕЕ приобретает иную конформацию, которая характеризуется гораздо более компактной структурой, предположительно, «спиральной». Это означает, что молекула НАЕЕ в форме аммониевой соли устойчива к изменению конформации в плазме крови. Согласно настоящему изобретению, для достижения терапевтического эффекта от аммониевых солей пептида НАЕЕ, так и от НАЕЕ требуется их введение в организм и присутствие в плазме крови, поэтому принципиальные различия в пространственной структуре этих молекул в плазме крови, исходя из общих представлений биохимии и физиологии, свидетельствуют о различном молекулярном механизме действия аммониевой соли пептида НАЕЕ и нативного НАЕЕ, что исключает их биоэквивалентность.
Пример 4. Стабильность аммониевых солей пептида НАЕЕ.
Была определена стабильность аммониевых солей пептида НАЕЕ в тесте ускоренного хранения в течение 6 месяцев, что соответствует 2 годам хранения в обычных условиях (Таблица 2). Аммониевые соли пептида НАЕЕ сохранили свой цвет, консистенцию, не набирали воды (масса образца не увеличивалась в пределах 1-2%) и не теряли активное вещество. Образец НАЕЕ с течением времени набирал воду (до 7% масс.) и по данным ВЭЖХ деградировал до 67,4% активного вещества за 6 мес. Таким образом, стабильность аммониевых солей пептида НАЕЕ оказалась значительно выше по сравнению с НАЕЕ.
Пример 5. Фармацевтические композиции на основе аммониевых солей пептида НАЕЕ.
Фармацевтические композиции на основе аммониевых солей пептида НАЕЕ могут содержать активное вещество в эффективном количестве (Таблица 3). Указанные композиции получены отдельно для каждой из однозамещенной и двузамещенной аммониевых солей пептида НАЕЕ. Состав дозы рассчитывается индивидуально и может варьироваться от 0,1 мг до 100 мг на человека в сутки, более предпочтительно от 1 до 50 мг.
Составы фармацевтических композиций представлены в Таблице 3. Пересчет выполнен на дозировку активного вещества. Возможны и другие соотношения активного вещества в фармацевтической композиции в диапазоне от 0, 1 до 100 мг. Масса таблеток варьируется от 100 до 400 мг, таблетки могут быть покрыты оболочкой.
Пример 6. Влияние аммониевых солей пептида НАЕЕ на поведенческие функции и степень тяжести церебрального амилоидоза у экспериментальных животных.
Для моделирования нейродегенеративного заболевания была выбрана модель болезни Альцгеймера, являющейся основным по распространённости нейродегенеративным заболеванием у людей пожилого возраста.
Для проведения экспериментов были использованы самцы трансгенных мышей линии APPswe/PSEN1dE9. Мыши данной линии также известны под названием APP/PS1. У мышей APP/PS1 , начиная с 4-6-месячного возраста, проявляются характерные когнитивные признаки патологии, подобной болезни Альцгеймера, и имеется значительное количество конгофильных амилоидных бляшек в специфических отделах мозга, включая гиппокамп и кортекс (Borchelt D.R., Ratovitski Г, Van Lare J., et al. (1997). Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin
1 and amyloid precursor proteins. Neuron, 19(4), 939-945, doi: 10.1016/S0896-6273(00)80974- 5).
Для тестирования были использованы 8-месячные животные, сгруппированные в следующие экспериментальные группы (п = 12 в каждой группе).
1. контроль 1 . Мыши дикого типа, которым внутривенно вводили физиологический раствор;
2. контроль 2. Трансгенные мыши APP/PS1 , которым внутривенно вводили физиологический раствор;
3. трансгенные мыши APP/PS1 , которым внутривенно вводили НАЕЕ;
4. трансгенные мыши APP/PS1 , которым внутривенно вводили HAEE-NH4;
5. трансгенные мыши APP/PS1 , которым внутривенно вводили HAEE-(NH4)2.
Препараты НАЕЕ и аммониевые соли пептида НАЕЕ вводили в ретроорбитальное венозное сплетение в соответствии с известной процедурой (Yardeni Т., Eckhaus М., Morris H.D. et al. (2011). Retro-orbital injections in mice. Lab animal, 40(5), 155-160, doi: 10.1038/laban0511-155). Инъекции в дозе 0,05 мг/кг проводили ежемесячно, в возрасте от
2 до 7 месяцев (включительно), всего было сделано 6 инъекций препаратами НАЕЕ и аммониевых солей пептида НАЕЕ.
В возрасте 8 месяцев проводили тестирование поведенческих функций, затем животные подвергались эвтаназии с последующим забором мозга и гистохимическим анализом числа конгофильных бляшек в областях СА1 , СА2, САЗ и зубчатой извилине гиппокампа согласно известной процедуре (Kozin S.A., Barykin Е.Р., Telegin G.B., et al. Intravenously Injected Amyloid-p Peptide With Isomerized Asp7 and Phosphorylated Ser8 Residues Inhibits Cerebral p-Amyloidosis in APPP/PS1 Transgenic Mice Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in neuroscience, 2018, 12, 518-518, doi: 10.3389/fnins.2018.00518).
6.1. Анализ улучшения поведенческих функций у 8-месячных самцов трансгенных мышей APP/PS1 под действием НАЕЕ и аммониевых солей пептида НАЕЕ был проведён с помощью теста «Закапывание шариков». В качестве контроля использовались трансгенные мыши APP/PS1 и мыши дикого типа. Для проведения теста мышей помещали в клетки со свежим подстилом с размещенными на нем восемнадцатью шариками, расположенными в виде матрицы 3 x 6. Мышей оставляли в клетке на 30 минут, после чего определяли количество более чем на 2/3 закопанных шариков (КЗШ) в процентах от общего количества шариков. Поведение закапывания является признаком обсессивно-компульсивного поведения. Из-за повторяющегося и персеверативного характера закапывания такое поведение может представлять нейропсихиатрические симптомы, такие как персеверативное поведение и/или стереотипное поведение. Оба являются нейропсихиатрическими симптомами, обычно присутствующими у пациентов с болезнью Альцгеймера и другими видами деменции.
По результатам тестирования, уровень поведения контрольной группы мышей дикого типа характеризовался значением КЗШ = 50,6±13,3 (%). Это значение рассматривается в качестве референсного. У контрольной группы трансгенных мышей APP/PS1 значение КЗШ = 12,6±4,2 (%), что указывает на сильное ухудшение поведенческих рефлексов мышей APP/PS1 по сравнению с животными дикого типа и отражает инвалидизирующее влияние оверпродукции человеческого бета-амилоида на процессы нервной деятельности. В группе мышей, получавших НАЕЕ, значения КЗШ составило 20,6±7,3 (%). Для групп мышей, получавших HAEE-NH4 и HAEE-(NH4)2, значение КЗШ составило 41 ,5±9,5 и 47,4±10,2 (%), соответственно (Таблица 4).
Эти данные свидетельствуют о том, что использование аммониевых солей пептида НАЕЕ существенно улучшает поведенческие рефлексы трансгенных мышей APP/PS1, а эффект от этого использования значительно превышает таковой, наблюдаемый для НАЕЕ.
6.2. Гистохимический анализ конгофильных амилоидных бляшек в областях СА1 , СА2, САЗ и зубчатой извилине гиппокампа был проведен согласно ранее описанным процедурам (Kozin S.A., Barykin Е.Р., Telegin G.B., et al. Intravenously Injected Amyloid-0 Peptide With Isomerized Asp7 and Phosphorylated Ser8 Residues Inhibits Cerebral 0- Amyloidosis in A0PP/PS1 Transgenic Mice Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in neuroscience, 2018, 12, 518-518, doi: 10.3389/fnins.2018.00518). Мозг мышей извлекали и фиксировали в 10% формалине. Процесс заливки образца в парафин проводили следующим образом: заливали 75% этанолом и оставляли на ночь, далее сменяли на 96% этанол и выдерживали 5 мин, 96% этанол - 10 мин, 100% этанол - 10 мин (две замены), этанол-хлороформ (1 :1) - 30 мин, и оставляли в чистом хлороформе на ночь. Заливку парафином проводили при 60°С в течение 3 ч (три смены). Заливку тканей в парафиновые блоки осуществляли на приборе Leica EG1160. Серийные срезы головного мозга (8 мкм) вырезали с помощью микротома Leica RM2265 и помещали на предметные стекла. Для депарафинизации, гидратации и окрашивания срезов проводили следующие этапы: предметные стекла последовательно помещали в ксилол три смены (по 10 минут), 96% этанол - 5 мин, 90% этанол - 2 мин, 75% этанол - 2 мин, вода - 5 мин (три смены), раствор конго красного - 5 мин, далее добавлялся раствор гидроксида калия и вода. Для монтирования использовали среду ImMu-Mount (Thermo Scientific). Срезы, охватывающие область мозга от 0,48 до 1 ,92 мм относительно средней линии в латеральных стереотаксических координатах (Franklin К., Paxinos, G. (2008). The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. New York, NY: Academic Press), использовали для количественного определения конгофильных амилоидных бляшек в гиппокампе. Анализировали каждый 15-й срез, что давало 10 срезов на животное. Амилоидные бляшки идентифицировали окрашиванием конго красным и подсчитывали вручную. Для каждой группы мышей рассчитывали средние значения и стандартное отклонение количества бляшек на 1 срез. Для проверки нормальности распределения использовали критерий Шапиро-Уилка. Для попарного сравнения исследуемых групп использовали критерий Манна-Уитни. Применяемый уровень значимости составлял 99,9% (Р <0,001).
У контрольной группы мышей дикого типа (группа 1) никаких амилоидных бляшек обнаружено не было (Таблица 4). Конгофильные амилоидные бляшки, визуализированные в областях СА1 , СА2, САЗ и зубчатой извилине гиппокампа головного мозга трансгенных животных были сходны по локализации и распределению размеров в паренхиме головного мозга. Однако, количественная оценка амилоидных бляшек выявила существенные различия между группами. В контрольной группе 2 (трансгенные мыши APP/PS1) среднее число бляшек в областях на один срез мозга (ЧБ) составляло ЧБ = 31 ,7 ± 4,9. В группе 3, в которой трангсенным мышам APP/PS1 вводили НАЕЕ, значение ЧБ оказалось равным 24,7 + 3,4. В группе 4, в которой трансгенным мышам APP/PS1 вводили HAEE-NH4, значение ЧБ составило 9,5±3,9. В группе 5, в которой трансгенным мышам APP/PS1 вводили HAEE-(NH4)2, значение ЧБ оказалось равным 8,9±2,8. Таким образом, результаты гистохимического анализа показали, что внутривенные инъекции аммониевых солей пептида НАЕЕ приводили к почти 4-кратному уменьшению амилоидной нагрузки в гиппокампе трансгенных мышей APP/PS1 , и по этому показателю эффективность аммониевых солей пептида НАЕЕ примерно в три раза выше таковой, выявленной для НАЕЕ.
Пример 7. Специфическое связывание аммониевых солей пептида НАЕЕ с человеческим бета-амилоидом (Ар42).
Дополнительно была проведена оценка связывания аммониевых солей пептида НАЕЕ с бета-амилоидом как одного из механизмов действия данной соли при нейродегенеративных поражениях, связанных с бета-амилоидом. Образование соли между находящимся в растворе аналитом (аммониевая соль пептида НАЕЕ или нативный НАЕЕ) и иммобилизованным 42-членным человеческим бета-амилоидом (лигандом) было исследовано с помощью БППР. По результатам таких экспериментов рассчитывали кинетические параметры взаимодействий и значение константы диссоциации (KD) взаимодействия. Если значение KD 10"4 М, то взаимодействие между аммониевой солью пептида НАЕЕ и бета-амилоидом является биологически значимым.
Взаимодействий между НАЕЕ и лигандом обнаружено не было. Напротив, при введении аммониевых солей пептида НАЕЕ было обнаружено их взаимодействие с иммобилизованным А042 при его различных концентрациях 150, 300, 500, 1000, 1500 мкМ. На основании полученных данных были рассчитаны кинетические характеристики взаимодействия аммониевых солей пептида НАЕЕ и иммобилизованного человеческого бета-амилоида, которые оказались равны kon = (1 ,41±0,06) х ю3 M'1s'1; koff = (5,78±0,06) х 10'3 s'1; KD = (4,1 ±0,3) x Ю'6 M для HAEE-NH4 и значения kon = (1 ,35±0,06) x Ю3 M'1s'1; koff = (5,65±0,06) x Ю'3 s'1; KD = (4,19±0,3) x 10'6 для HAEE-(NH4)2-
Таким образом, на основании вышеприведенных результатов доказано образование стабильных межмолекулярных комплексов между 42-членным человеческим бета-амилоидом (А|342) и аммониевыми солями пептида НАЕЕ. В отличие от аммониевых солей пептида НАЕЕ, нативный пептид НАЕЕ в идентичных экспериментальных условиях не взаимодействует с А[342.
Полученные в данном Примере настоящего изобретения результаты указывают на отсутствие способности НАЕЕ связываться с А042. Напротив, аммониевые соли пептида НАЕЕ способны связываться с Ар42. Несмотря на то, что и НАЕЕ и аммониевые соли пептида НАЕЕ при введении в кровеносную систему трансгенных мышей APP/PS1 улучшают когнитивные функции и снижают количество амилоидных бляшек у экспериментальных животных (Примеры 6.1 и 6.2 настоящего изобретения), полученные результаты свидетельствует о различных молекулярных механизмах терапевтического воздействия НАЕЕ и аммониевых солей пептида НАЕЕ, что, в свою очередь, исключает биоэквивалентность НАЕЕ и аммониевых солей пептида НАЕЕ при их использовании для лечения нейродегенеративных заболеваний. Поэтому можно заключить, что НАЕЕ и аммониевые соли пептида НАЕЕ небиоэквивалентны между собой.
Таблица 1. Смещение сигналов протонов в 1Н-ЯМР-спектре аммониевых солей
НАЕЕ по сравнению с НАЕЕ.
Figure imgf000026_0001
Таблица 2. Данные по стабильности аммониевых солей пептида НАЕЕ в тесте ускоренного хранения (40 °C, 75% влажности) в течение 6 месяцев.
Figure imgf000026_0002
Figure imgf000027_0001
Таблица 3. Состав фармацевтических композиций с аммониевыми солями (НАЕЕ- NH4 И HAEE-(NH4)2) пептида НАЕЕ. В/м - внутримышечное введение, в/в - внутривенное введение. 100,0 92,1 71 ,9
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
Таблица 4. Влияние аммониевых солей пептида НАЕЕ на когнитивные функции у мышей в тесте «закапывание шариков» и на количество амилоидных бляшек. Применяемый уровень значимости составлял 99,9% (Р <0,001).
Figure imgf000030_0002

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Аммониевая соль пептида НАЕЕ, где НАЕЕ представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по С-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu.
2. Соль по п. 1 , которая представляет собой однозамещенную аммониевую соль пептида НАЕЕ.
3. Соль по п. 1 , которая представляет собой двузамещенную аммониевую соль пептида НАЕЕ.
4. Соль по п. 2, которая представляет собой в твердом виде аморфную фазу.
5. Соль по п. 3, которая представляет собой в твердом виде слабо закристаллизованную фазу.
6. Соль по п. 1 , которая характеризуется дифрактограммой, представленной на Фиг. 1 ,2.
7. Соль по п. 1 , которая характеризуется кривой дифференциальной сканирующей калориметрии, представленной на Фиг. 4,5.
8. Соль по п. 1 , которая характеризуется ИК-спектром, представленным на Фиг. 6.
9. Фармацевтическая композиция для лечения нейродегенеративных заболеваний, содержащая в качестве активного вещества аммониевую соль пептида НАЕЕ, где НАЕЕ представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по С-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu. в эффективном количестве и фармацевтически приемлемые добавки.
10. Фармацевтическая композиция по п. 9, в которой в качестве активного вещества используется однозамещенная аммониевая соль пептида НАЕЕ.
11. Фармацевтическая композиция по п. 9, в которой в качестве активного вещества используется двузамещенная аммониевая соль пептида НАЕЕ.
12. Фармацевтическая композиция по п. 9, которая представлена твердой или жидкой формой.
13. Фармацевтическая композиция по п. 9, в которой аммониевая соль пептида НАЕЕ находится в виде аморфной формы.
14. Фармацевтическая композиция по п. 13, в которой аморфная форма аммониевой соли пептида НАЕЕ характеризуется дифрактограммой, представленной на Фиг. 1 ,2.
15. Фармацевтическая композиция по п. 9. в которой эффективное количество аммониевой соли пептида НАЕЕ составляет от 0,1 до 100 мг.
16. Фармацевтическая композиция по п. 9, в которой эффективное количество аммониевой соли пептида НАЕЕ составляет от 5 до 50 мг.
17. Фармацевтическая композиция по п. 8 для лечения болезни Альцгеймера.
29
18. Фармацевтическая композиция по п. 9, предназначенная для восстановления когнитивных функций, нарушенных вследствие нейродегенеративных заболеваний.
19. Фармацевтическая композиция по п. 18, применяющаяся при воспалительных причинах заболеваний.
20. Фармацевтическая композиция по п. 9, в которой вспомогательные фармацевтически приемлемые добавки представляют собой маннитол, повидон К 17, трометамол, динатрия эдетат, натрия хлорид, сахароза, гистидин, полоксамер 407.
21. Фармацевтическая композиция по п. 9, которая представляет собой лиофилизат.
22. Фармацевтическая композиция по п. 9, предназначенная для введения внутривенным, внутриартериальным, внутрибрюшинным, подкожным, накожным, трансдермальным, внутримышечным, интратекальным, субарахноидальным, пероральным, интраназальным, сублингвальным, буккальным, ректальным способом.
23. Способ получения аммониевой соли пептида НАЕЕ, где НАЕЕ представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по С-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu, заключающийся в том, что водный или буферный раствор пептида НАЕЕ смешивают с водным раствором соединения аммония в стехиометрических соотношениях при комнатной температуре, перемешивают и высушивают.
24. Способ получения по п. 23, в котором соединение аммония представляет собой гидроксид аммония, гидрокарбонат аммония, карбонат аммония.
25. Способ получения по п. 23, в котором перемешивание проводят в течение 5-30 мин.
26. Способ получения по п. 23, в котором при перемешивании раствор подогревают до 50 оС.
27. Способ получения по п. 23, в котором высушивание проводят под вакуумом при температуре не более 50 оС.
28. Способ получения аммониевой соли пептида НАЕЕ, где НАЕЕ представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по С-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu, заключающийся в том, что водный или буферный раствор пептида НАЕЕ смешивают с водным раствором сульфата аммония в стехиометрических соотношениях при комнатной температуре, перемешивают, добавляют стехиометрическое количество гидроксида бария, отделяют осадок и высушивают.
29. Способ получения по п. 28, в котором после добавления гидроксида бария раствор подогревают до 50 оС.
30. Применение аммониевой соли пептида НАЕЕ, где НАЕЕ представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по С-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu, для лечения нейродегенеративных заболеваний.
30
31. Применение по п. 30, в котором в качестве активного вещества используется однозамещенная аммониевая соль пептида НАЕЕ.
32. Применение по п. 30, в котором в качестве активного вещества используется двузамещенная аммониевая соль пептида НАЕЕ.
33. Применение по п. 30, для лечения болезни Альцгеймера.
34. Применение по п. 30, для восстановления когнитивных функций, нарушенных вслудствие дегенеративных заболеваний.
35. Применение по п. 30, для восстановления когнитивных функций при воспалительных причинах заболеваний.
36. Применение по п. 30 при его введении внутривенным, внутриартериальным, внутрибрюшинным, подкожным, накожным, трансдермальным, внутримышечным, интратекальным, субарахноидальным, пероральным, интраназальным, сублингвальным, буккальным, ректальным способом.
37. Применение по п. 30, которое терапевтически бионеэквивалентно применению НАЕЕ в нативной форме.
PCT/RU2023/000211 2022-07-15 2023-07-12 Аммониевая соль пептида наее для лечения нейродегенеративных заболеваний WO2024014984A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2022119486A RU2784249C1 (ru) 2022-07-15 Аммониевая соль пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний
RU2022119486 2022-07-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024014984A1 true WO2024014984A1 (ru) 2024-01-18

Family

ID=89537174

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2023/000211 WO2024014984A1 (ru) 2022-07-15 2023-07-12 Аммониевая соль пептида наее для лечения нейродегенеративных заболеваний

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2024014984A1 (ru)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012056157A1 (fr) * 2010-10-27 2012-05-03 Kimonella Ventures Ltd Compose peptidique utile pour l'inhibition de la formation de plaques amyloïdes
RU2709539C1 (ru) * 2019-08-15 2019-12-18 Акционерное общество "Опытно-Экспериментальный завод "ВладМиВа" Фармацевтическая композиция на основе пептида HAEE для лечения нейродегенеративных заболеваний
RU2767030C1 (ru) * 2021-05-20 2022-03-16 Акционерное общество "Опытно-Экспериментальный завод "ВладМиВа" Способ получения пептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH2

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012056157A1 (fr) * 2010-10-27 2012-05-03 Kimonella Ventures Ltd Compose peptidique utile pour l'inhibition de la formation de plaques amyloïdes
RU2709539C1 (ru) * 2019-08-15 2019-12-18 Акционерное общество "Опытно-Экспериментальный завод "ВладМиВа" Фармацевтическая композиция на основе пептида HAEE для лечения нейродегенеративных заболеваний
RU2767030C1 (ru) * 2021-05-20 2022-03-16 Акционерное общество "Опытно-Экспериментальный завод "ВладМиВа" Способ получения пептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH2

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EVGENY P. BARYKIN ET AL.: "Tetrapeptide Ac-HAEE-NH2 Protects alpha4beta2 nAChR from Inhibition by Abeta", INT J MOL SCI, vol. 21, no. 17, September 2020 (2020-09-01), pages 6272, XP093130280, DOI: 10.3390/ijms21176272 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2709539C1 (ru) Фармацевтическая композиция на основе пептида HAEE для лечения нейродегенеративных заболеваний
MX2010013648A (es) Compuestos para tratar enfermedades.
HUE035744T2 (en) Crystallization process and bioavailability
JP2003519620A (ja) Ａ−ベータペプチド組成物およびその製造法
MX2010013657A (es) Compuestos para tratar la amiloidosis.
US20080026995A1 (en) Therapeutic vaccine targeted against p-glycoprotein 170 for inhibiting multidrug resistance in the treatment of cancers
WO2024014984A1 (ru) Аммониевая соль пептида наее для лечения нейродегенеративных заболеваний
RU2784249C1 (ru) Аммониевая соль пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний
WO2024014981A1 (ru) Натриевая соль пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний
WO2024014980A1 (ru) Калиевая соль пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний
RU2784425C1 (ru) Калиевая соль пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний
RU2784326C1 (ru) Натриевая соль пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний
RU2785354C1 (ru) Кальциевый комплекс пептида для лечения нейродегенеративных заболеваний
RU2784732C1 (ru) Медный комплекс пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний
WO2024014982A1 (ru) Медный комплекс пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний
RU2784319C1 (ru) Цинковый комплекс пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний
WO2024014983A1 (ru) Цинковый комплес пептида наее для лечения нейродегенеративных заболеваний
RU2784746C1 (ru) Магниевый комплекс пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний
WO2024014985A1 (ru) Кальциевый комплекс пептида наее для лечения нейродегенеративных заболеваний
WO2024014986A1 (ru) Магниевый комплекс пептида наее для лечения нейродегенеративных заболеваний
TWI587868B (zh) 雙鏈分子（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）及其於治療異常蛋白聚集之用途
EP1481007B1 (en) Spheron components useful in determining compounds capable of treating symptoms of alzheimer&#39;s disease, treatments and animal models produced therefrom
CZ9904142A3 (cs) Nové BPC peptidové sole s organo-protektivní aktivitou, proces jejich přípravy a jejich pouľití v léčbě
KR102716959B1 (ko) 신경변성 장애의 치료 방법
US20080139456A1 (en) Macrocyclic Sh2 Domain Binding Inhibitors

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23840047

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1