RU2784319C1 - Цинковый комплекс пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний - Google Patents
Цинковый комплекс пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний Download PDFInfo
- Publication number
- RU2784319C1 RU2784319C1 RU2022119474A RU2022119474A RU2784319C1 RU 2784319 C1 RU2784319 C1 RU 2784319C1 RU 2022119474 A RU2022119474 A RU 2022119474A RU 2022119474 A RU2022119474 A RU 2022119474A RU 2784319 C1 RU2784319 C1 RU 2784319C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- haee
- zinc complex
- zinc
- complex
- pharmaceutical composition
- Prior art date
Links
- 239000011701 zinc Substances 0.000 title claims abstract description 236
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 169
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 168
- 206010053643 Neurodegenerative disease Diseases 0.000 title claims abstract description 36
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims abstract description 63
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 29
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 25
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 claims abstract description 15
- 206010001897 Alzheimer's disease Diseases 0.000 claims description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 19
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 19
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 17
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 claims description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 12
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 9
- FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N D-Mannitol Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N 0.000 claims description 8
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 238000001938 differential scanning calorimetry curve Methods 0.000 claims description 8
- 230000002757 inflammatory Effects 0.000 claims description 8
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 8
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 229920003079 Povidone K 17 Polymers 0.000 claims description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 7
- 229960002668 sodium chloride Drugs 0.000 claims description 7
- 229960002885 Histidine Drugs 0.000 claims description 6
- FEWJPZIEWOKRBE-XIXRPRMCSA-N Mesotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-XIXRPRMCSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 6
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M salicylate Chemical compound OC1=CC=CC=C1C([O-])=O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 229960001860 salicylate Drugs 0.000 claims description 6
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 claims description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 2qpq Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 5
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-M benzoate Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- 229940044476 Poloxamer 407 Drugs 0.000 claims description 4
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960004793 Sucrose Drugs 0.000 claims description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L disodium;2-[2-[carboxylatomethyl(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 230000001771 impaired Effects 0.000 claims description 4
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 claims description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 4
- 229960000281 trometamol Drugs 0.000 claims description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 3
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 claims description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims description 3
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 claims description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 3
- 229940086735 succinate Drugs 0.000 claims description 3
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 claims 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 4
- 238000010175 APPswe/PSEN1dE9 Methods 0.000 description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 28
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 26
- 238000010178 5xFAD (B6SJL) Methods 0.000 description 24
- 238000010179 5xFAD (C57BL6) Methods 0.000 description 24
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 17
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 17
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 16
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- 108091006822 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 13
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 10
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 210000001320 Hippocampus Anatomy 0.000 description 8
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 8
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 230000003542 behavioural Effects 0.000 description 7
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 7
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 7
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 6
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 6
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 6
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 5
- 210000001218 Blood-Brain Barrier Anatomy 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N formic acid Chemical compound OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001744 histochemical Effects 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N Zinc nitrate Chemical compound [Zn+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 4
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 4
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 4
- WSVLPVUVIUVCRA-RJMJUYIDSA-N (2R,3R,4S,5R,6S)-2-(hydroxymethyl)-6-[(2R,3S,4R,5R)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane-3,4,5-triol;hydrate Chemical compound O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O WSVLPVUVIUVCRA-RJMJUYIDSA-N 0.000 description 3
- 102100001249 ALB Human genes 0.000 description 3
- 101710027066 ALB Proteins 0.000 description 3
- 210000001736 Capillaries Anatomy 0.000 description 3
- 229940001468 Citrate Drugs 0.000 description 3
- 210000001947 Dentate Gyrus Anatomy 0.000 description 3
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 description 3
- 229960001021 Lactose Monohydrate Drugs 0.000 description 3
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 3
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L Zinc chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000002490 cerebral Effects 0.000 description 3
- 230000001149 cognitive Effects 0.000 description 3
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 3
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000002149 energy-dispersive X-ray emission spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 3
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 3
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 3
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 3
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229940050390 Benzoate Drugs 0.000 description 2
- 230000036912 Bioavailability Effects 0.000 description 2
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 2
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L Congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 2
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N Imidazole Chemical compound C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102100008812 PSEN1 Human genes 0.000 description 2
- 206010061536 Parkinson's disease Diseases 0.000 description 2
- 229940049954 Penicillin Drugs 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 2
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L Zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- -1 Zn(II) ions Chemical class 0.000 description 2
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015296 acetylcholine-gated cation-selective channel activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040006409 acetylcholine-gated cation-selective channel activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 125000004429 atoms Chemical group 0.000 description 2
- 229960000626 benzylpenicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000035514 bioavailability Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 2
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000011068 load Methods 0.000 description 2
- 239000004579 marble Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 230000000626 neurodegenerative Effects 0.000 description 2
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000000275 pharmacokinetic Effects 0.000 description 2
- 230000036231 pharmacokinetics Effects 0.000 description 2
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035489 relative bioavailability Effects 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 2
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 2
- SXFBQAMLJMDXOD-UHFFFAOYSA-N (+)-Hydrogentartrate bitartrate salt Chemical compound OC(=O)C(O)C(O)C(O)=O.OC(=O)C(O)C(O)C(O)=O SXFBQAMLJMDXOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- VHBSECWYEFJRNV-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O.OC(=O)C1=CC=CC=C1O VHBSECWYEFJRNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KOYYEPZTIWTHDY-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;zinc;dihydrate Chemical compound O.O.[Zn].[Zn].[Zn].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KOYYEPZTIWTHDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FZIPCQLKPTZZIM-UHFFFAOYSA-N 2-oxidanylpropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O FZIPCQLKPTZZIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010177 3xTg Methods 0.000 description 1
- 108060000460 APP Proteins 0.000 description 1
- 102100017796 APP Human genes 0.000 description 1
- 229940022663 Acetate Drugs 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010002022 Amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 206010002023 Amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 210000002459 Blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 206010057668 Cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 229910002476 CuII Inorganic materials 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 230000036947 Dissociation constant Effects 0.000 description 1
- 210000001161 Embryo, Mammalian Anatomy 0.000 description 1
- 206010048554 Endothelial dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 206010067410 Endotoxaemia Diseases 0.000 description 1
- 238000004252 FT/ICR mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 101710007376 H1-1 Proteins 0.000 description 1
- 230000036499 Half live Effects 0.000 description 1
- 101710017533 His1:CG33831 Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000896769 Multiple sclerosis associated retrovirus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 210000004897 N-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000012412 Presenilin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010036933 Presenilin-1 Proteins 0.000 description 1
- 229940076788 Pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 208000007400 Relapsing-Remitting Multiple Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000004001 Thalamic Nuclei Anatomy 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940068475 ZINC CITRATE Drugs 0.000 description 1
- DJWUNCQRNNEAKC-UHFFFAOYSA-L Zinc acetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O DJWUNCQRNNEAKC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- WJGAPUXHSQQWQF-UHFFFAOYSA-L acetate;chloride Chemical compound [Cl-].CC([O-])=O WJGAPUXHSQQWQF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 231100000494 adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 150000001449 anionic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000010405 anode material Substances 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-M benzenesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940077388 benzenesulfonate Drugs 0.000 description 1
- WXBLLCUINBKULX-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1.OC(=O)C1=CC=CC=C1 WXBLLCUINBKULX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000009933 burial Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N chloroform;ethanol Chemical compound CCO.ClC(Cl)Cl UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000003930 cognitive ability Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structures Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000036545 exercise Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N fumaric acid Chemical compound OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-L glutarate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCCC([O-])=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000971 hippocampal Effects 0.000 description 1
- 125000003372 histidine group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 229910001412 inorganic anion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000185 intracerebroventricular Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003902 lesions Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-L maleate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)\C=C/C([O-])=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-L 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 201000009457 movement disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000003959 neuroinflammation Effects 0.000 description 1
- 230000002314 neuroinflammatory Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neurons Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N o-xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N oxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 238000001050 pharmacotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 125000003616 serine group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 1
- 229960001367 tartaric acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002411 thermogravimetry Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-M toluene-4-sulfonate Chemical compound CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic Effects 0.000 description 1
- 201000004810 vascular dementia Diseases 0.000 description 1
- 235000020799 vitamin D status Nutrition 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 description 1
- 229940006486 zinc cation Drugs 0.000 description 1
- 239000011746 zinc citrate Substances 0.000 description 1
- 235000006076 zinc citrate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004572 zinc-binding Effects 0.000 description 1
- 108010088577 zinc-binding protein Proteins 0.000 description 1
- VRGNUPCISFMPEM-ZVGUSBNCSA-L zinc;(2R,3R)-2,3-dihydroxybutanedioate Chemical compound [Zn+2].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O VRGNUPCISFMPEM-ZVGUSBNCSA-L 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-BKBMJHBISA-N α-D-galacturonic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-BKBMJHBISA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к цинковому комплексу формулы [Zn(HAEE)]mXn, где Zn представляет собой двухзарядный катион цинка (II), m = 1 для однозарядных и двухзарядных анионов, m = 3 для трехзарядных анионов, HAEE представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по C-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu, Х – фармацевтически приемлемый анион, n = 1 для двухзарядных анионов, n = 2 для однозарядных и трехзарядных анионов. Также предложены фармацевтическая композиция, способ получения цинкового комплекса и его применение. Предложенный цинковый комплекс применяется для лечения нейродегенеративных заболеваний. 4 н. и 24 з.п. ф-лы, 8 ил., 5 табл., 4 пр.
Description
Изобретение относится к цинковому комплексу пептида HAEE для лечения нейродегенеративных заболеваний, который описывается формулой [Zn(НАЕЕ)]mXn, где Zn представляет собой двухзарядный катион цинка (II), m = 1 для однозарядных и двухзарядных анионов, m = 3 для трехзарядных анионов, HAEE представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по C-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu, Х – фармацевтически приемлемый анион, n = 1 для двухзарядных анионов, n = 2 для однозарядных и трехзарядных анионов. Настоящее изобретение также относится к способу получения цинкового комплекса пептида HAEE, к фармацевтическим композициям на его основе и применению цинкового комплекса пептида HAEE для лечения нейродегенеративных заболеваний.
Предшествующий уровень техники
Нейродегенеративные заболевания имеют ряд общих факторов развития и целый ряд других обобщающих механизмов (Litvinenko I.V., Krasakov I.V., Bisaga G.N. et al. Modern conception of the pathogenesis of neurodegenerative diseases and therapeutic strategy. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2017;117(6-2):3-10. (In Russ.). doi: 10.17116/jnevro2017117623-10), что может связывать болезнь Альцгеймера (БА), сосудистую деменцию, нейродегенерацию при рассеянном склерозе (РС), болезнь Паркинсона, а также болезнь Альцгеймера в условиях активации системного воспаления (Williams-Gray C.H., Wijeyekoon R., Yarnall A.J. et al. ICICLE-PD study group. Serum immune markers and disease progression in an incident Parkinson’s disease cohort (ICICLE-PD). Movement Disorders. 2016;31(7):995-1003. https://doi.org/10.1002/mds.26563). Воспаление относится к типовым патологическим процессам организма человека. Типовой патологический процесс проявляется определенным набором характерных признаков. В настоящее время считается, что нейродегенеративный процесс является вторичным по отношению к воспалительному (Mostafa A., Jalilvand S., Shoja Z. Et al. Multiple sclerosis-associated retrovirus, Epstein-barr virus, and vitamin D status in patients with relapsing remitting multiple sclerosis. Journal of Medical Virology. 2017. doi: 10.1002/jmv.24774; Litvinenko I.V., Krasakov I.V., Bisaga G.N. et al. Modern conception of the pathogenesis of neurodegenerative diseases and therapeutic strategy. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2017;117(6-2):3-10. (In Russ.). doi: 10.17116/jnevro2017117623-10).
Болезнь Альцгеймера является одним из наиболее распространённых нейродегенеративных заболеваний среди людей пожилого возраста и характеризуется нейритными бляшками, основным компонентом которых является пептид бета-амилоид (Аβ). N-концевая область 1-16 бета-амилоида является металл-связывающим доменом, где цинк (Zn) и медь (Cu) присоединяются к пептиду Аβ (Guilloreau L., Damian L., Coppel Y., et al. (2006). Structural and thermodynamical properties of CuII amyloid-β16/28 complexes associated with Alzheimer’s disease. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry, 11(8), 1024-1038, doi: 10.1007/s00775-006-0154-1). Снижение уровня ионов цинка в крови за счет связывания ионов цинка специфическими хелатирующими агентами и/или блокирование взаимодействий пептида Аβ с ионами цинка может предотвратить патологии, связанные с этими взаимодействиями (Ayton S., Lei P., Bush A. Biometals and Their Therapeutic Implications in Alzheimer’s Disease. Neurotherapeutics. 2015. 12(1): p. 109-120). Высокие концентрации цинка вызывают преципитацию пептида Аβ и влияют на образование в специфических отделах мозга (гиппокамп, кортекс, таламические ядра) внеклеточных агрегатов Аβ (амилоидных бляшек), которые ассоциированы с развитием болезни Альцгеймера ((Frederickson C.J., Bush A.I. (2001). Synaptically released zinc: physiological functions and pathological effects. Biometals, 14(3), 353-366, doi: 10.1023/A:1012934207456). Таким образом, применение ионов цинка в фармацевтических препаратах для лечения нейродегенеративных заболеваний, в частности болезнь Альцгеймера, является нетривиальной решением.
На сегодняшний день нет действующих эффективных препаратов, которые бы излечивали нейродегенеративные заболевания. Из научной и патентной литературы известны ряд пептидов, которые могли бы применяться при лечении таких заболеваний.
Из WO 2012/056157 и патента РФ № 2679080 известно соединение, представляющее собой Ac-HAEE-NH2 (далее – HAEE). В аббревиатуре НАЕЕ буквы означают: Н –гистидин, А – аланин, Е – глутаминовая кислота. НАЕЕ способно ингибировать взаимодействие пептидов Аβ с ионами Zn (II), вызывая уменьшение или предотвращение агрегации пептида Аβ в присутствии ионов Zn (II) при физиологических концентрациях ионов Zn (II) 100-400 мкМ. Более высокие концентрации ионов Zn (II), порядка 1 ммоль (мМ), подавляют взаимодействия между НАЕЕ и 1-16 областью Aβ. Было показано, что инкубация агрегатов Аβ с HAEE в течение минимум 1 часа при 20, 40, 80, 100 и 150 мкМ HAEE приводит к дезагрегации таких агрегатов.
Из патента РФ № 2679059 известно, что несмотря на ингибирование образования амилоидных бляшек, влияние известных препаратов, в частности НАЕЕ, на улучшение когнитивных функций при болезни Альцгеймера в среднем является очень ограниченным и существует необходимость получения альтернативных эффективных средств для лечения болезни Альцгеймера, в том числе за счет снижения или предотвращения связывания ионов Zn(II) с пептидом Аβ. В качестве альтернативного средства для лечения болезни Альцгеймера было предложено использовать пептид с аминокислотной последовательностью (в стандартных однобуквенных кодах) H[isoD][pS]GYEVHH (где isoD обозначает изомеризованный остаток аспарагиновой кислоты, а pS относится к фосфорилированному остатку серина) с открытыми или защищенными концами основной полипептидной цепи.
Из патента РФ № 2709539 известно, что короткие заряженные пептиды типа HAEE имеют очень короткое время жизни в плазме крови (от нескольких секунд до нескольких минут) и с трудом проходят через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), что существенно ослабляет эффективность их терапевтического воздействия. С целью преодоления этих недостатков авторы патента РФ № 2709539 разработали фармацевтическую композицию для доставки HAEE через ГЭБ для лечения нейродегенеративных заболеваний, включая деменцию Альцгеймеровского типа (болезнь Альцгеймера), которая позволяет улучшить фармакокинетические характеристики и увеличить биодоступность HAEE.
Данная композиция содержит эффективное количество субстанции в виде комплекса HAЕЕ с цинком и человеческим сывороточным альбумином (HAEE-Zn-HSA) в форме раствора для введения с фармацевтически приемлемым носителем, выбранным из круга нейтральных носителей и разбавителей, например, в физиологическом растворе. Полученная фармацевтическая композиция позволяет увеличить в пять раз биодоступность субстанции в мозге, увеличить время полувыведения из организма в два раза; улучшить когнитивные функции экспериментальных животных на 20%.
Изобретение по патенту РФ № 2709539 было выбрано в качестве ближайшего аналога, поскольку только оно представляет собой единственный известный для НАЕЕ комплекс. Из патента РФ № 2709539 известно, что с человеческим альбумином (HSA) пептид HAEE в присутствии ионов цинка образует специфический тройной комплекс (HAEE-Zn-HSA). При этом в отсутствии ионов цинка взаимодействий между HAEE и HSA не наблюдалось. Данный комплекс характеризуется тем, что с помощью иона цинка удалось получить межмолекулярное связывание между молекулами НАЕЕ и НSA. Катион цинка является координирующим катионом между этими двумя молекулами. В твердом виде данный комплекс получен не был.
Из патента РФ № 2709539 известно, что фармацевтическая композиция HAEE-Zn-HSA является стабильной в подходящей водной буферной системе, в диапазоне значений pH от 4 до 8, в присутствии или в отсутствии различных солей.
Известно, что заряд альбумина в нейтральной среде равен -1, в щелочной среде равен -2, а в слабокислой среде равен 0 (изоэлектрическое состояние) и альбумин выпадает в осадок (Биохимия с упражнениями и задачами. Под ред. А.И. Глухова, Е.С. Северина. ГЭОТАР-Медиа, Москва. 2019. С.19), поэтому данный комплекс не должен существовать в слабокислой среде при pH 4-5,5.
Из патента РФ № 2709539 известно, что для приготовления фармацевтической композиции HAEE-Zn-HSA, пригодной для проведения доклинических исследований, 5 мг HAEE, 600 мг человеческого альбумина и 0,5 мг хлорида цинка (ZnCl2) растворяли в 20 миллилитрах физиологического раствора. В качестве источника НАЕЕ использовался лиофилизированный препарат синтетического пептида HAEE (чистота более 98%). При известной молекулярной массе HAEE равной 525,52 г/моль соотношение компонентов в комплексе HAEE-Zn-HSA составляет примерно HAEE : Zn : HSA ~ 1 : 2,6 : 1 по молям.
Недостатком данного изобретения является высокое содержание человеческого альбумина, которое превышает в 120 раз по массе содержание активного вещества НАЕЕ, а также высокое содержание цинка, которое в 2,6 раза превышает по массе содержание активного вещества НАЕЕ и может привести к образованию комплекса с нестехиометрическим соотношением входящих в него компонентов.
Высокие концентрации человеческого альбумина могут оказывать различные негативные эффекты на организм как экспериментальных животных, так и человека (Gales B.J., Erstad B.L. (1993). Adverse reactions to human serum albumin. Annals of Pharmacotherapy, 27(1), 87-94, doi: 10.1177/106002809302700119; Kremer H., Baron-Menguy C., Tesse A. et al. (2011). Human serum albumin improves endothelial dysfunction and survival during experimental endotoxemia: concentration-dependent properties. Critical care medicine, 39(6), 1414-1422, doi: 10.1097/CCM.0b013e318211ff6e). Некоторые образцы HSA, в отличие от бычьего сывороточного альбумина (BSA), при культивировании мышиных эмбрионов не доводили их до стадии бластоцисты (Léveillé M.C., Carnegie J., Tanphaichitr N. (1992). Effects of human sera and human serum albumin on mouse embryo culture. Journal of assisted reproduction and genetics, 9(1), 45-52, doi: 10.1007/BF01204114). HSA может вызывать иммунный ответ у мышей после его введения (Favoretto B.C., Ricardi R., Silva, S.R. et al. (2011). Immunomodulatory effects of crotoxin isolated from Crotalus durissus terrificus venom in mice immunised with human serum albumin. Toxicon, 57(4), 600-607, doi: 10.1016/j.toxicon.2010.12.023).
Известно, что HSA может быть использован для улучшения когнитивных функций при лечении болезни Альцгеймера, однако только при интрацеребровентрикулярном (внутричерепном) введении. Введение HSA в плазму крови может снижать его эффективность (Ezra, A., Rabinovich-Nikitin, I., Rabinovich-Toidman, P., & Solomon, B. (2016). Multifunctional effect of human serum albumin reduces Alzheimer’s disease related pathologies in the 3xTg mouse model. Journal of Alzheimer's Disease, 50(1), 175-188, doi: 10.3233/JAD-150694).
Поэтому уменьшение количества человеческого альбумина или возможность полностью отказаться от него в лекарственном препарате, замена сложного и травмоопасного интрацеребровентрикулярного введения на внутривенное, при одновременном усилении терапевтического эффекта является важной медицинской задачей при лечении нейродегенеративных заболеваний.
Ранее НАЕЕ и комплекс HAEE-Zn-HSA не характеризовались в твердой фазе и их свойства в твердой фазе неизвестны.
Таким образом, задачи, на решение которых направлено изобретение, заключаются в получении нового эффективного цинкового комплекса пептида HAEE для лечения нейродегенеративных заболеваний, в том числе в твердой форме, разработке фармацевтических композиций на его основе и его применении для лечения нейродегенеративных заболеваний.
В соответствии с настоящим изобретением описывается цинковый комплекс пептида HAEE для лечения нейродегенеративных заболеваний, который описывается формулой [Zn(НАЕЕ)]mXn, где Zn представляет собой двухзарядный катион цинка (II), m = 1 для однозарядных и двухзарядных анионов, m = 2 для трехзарядных анионов, HAEE представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по C-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu, Х – фармацевтически приемлемый анион, n = 1 для двухзарядных анионов, n = 2 для однозарядных и трехзарядных анионов.
В описываемом комплексе мольное содержание катиона цинка (II) и пептида HAEE является эквимолярным (1:1). Таким образом, если X является однозарядным анионом, то заявляемый цинковый комплекс пептида HAEE описывается формулой [Zn(HAEE)]X2. Если X является двухзарядным анионом, то заявляемый цинковый комплекс пептида HAEE описывается формулой [Zn(HAEE)]X. Если X является трёхзарядным анионом, то заявляемый цинковый комплекс пептида HAEE описывается формулой [Zn(HAEE)]3X2.
Взаимодействие пептида HAEE с цинком наблюдалось и при других молярных соотношениях HAEE : Zn, а именно, в диапазоне от 1:0,1 до 1:10, что связано с наличием множества донорно-акцепторных центров (азот, кислород) в молекуле НАЕЕ и взаимодействие между НАЕЕ и Zn может быть нестехиометрическим. Использование более высокого содержания цинка (>1:10) приводили к получению в твердой форме смеси из цинкового комплекса пептида HAEE и соответствующей соли цинка, при использование малого количества цинка (<1:0,1) его взаимодействие с пептидом HAEE не фиксировали физико-химическими методами.
В настоящем изобретении было обнаружено, что для усиления терапевтического действия пептида НАЕЕ для лечения нейроденегеративных заболеваний, в частности опосредованно вызываемых воспалительными причинами, нет необходимости использования одновременно ионов цинка и человеческого альбумина. Для улучшения когнитивных функций, нарушенных вследствие нейродегенеративных заболеваний, достаточным является использование только пептида НАЕЕ и цинка в одном комплексе без необходимости использования высоких количеств человеческого альбумина. Также, если использование HAEE-Zn-HSA улучшает фармакокинетические параметры пептида НАЕЕ, то в настоящем изобретении использование цинкового комплекса пептида НАЕЕ для лечения нейродегенеративных заболеваний изменяет механизм действия пептида НАЕЕ, связанный с конформационной структурой пептида HAEE, что приводит к неожиданно высокому терапевтическому эффекту.
Это подтверждается экспериментальным введением нативного пептида НАЕЕ и полученного по данному изобретению цинкового комплекса пептида HAEE в организм экспериментальных животных. Было обнаружено, что 3D-структура нативного пептида НАЕЕ, который в виде водного раствора был помещён на 2 минуты в плазму крови мышей дикого типа, отличается от 3D-структуры нативного HAEE в исходном водном растворе, что подтверждается методом ВЭЖХ по изменению времени выходa с хроматографической колонки пробы HAEE, экстрагированной из плазмы крови, относительно времени выхода пробы HAEE, экстрагированной из исходного водного раствора. В то же время 3D-структура цинкового комплекса пептида HAEE оставалась неизменной в аналогичных экспериментальных условиях (то есть после экстрагирования из исходного водного раствора цинкового комплекса пептида HAEE и после экстрагирования из плазмы крови мышей дикого типа после 2-х минутной экспозиции) и соответствовала 3D-структуре нативного пептида HAEE, экстрагированного из исходного водного раствора. По данным масс-спектрометрии химическая структура пептида HAEE во всех экспериментальных пробах сохранялась неизменной как для нативного пептида, так и для пептида в составе цинкового комплекса. Изменение времени выхода нативного пептида HAEE или цинкового комплекса пептида HAEE с хроматографической колонки связано в основном с различиями в гидрофобных взаимодействиях пептида HAEE с материалом колонки, а эти взаимодействия в свою очередь определяются превалирующей 3D-структурой пептида HAEE в конкретной пробе. Таким образом, из полученных экспериментальных данных следует, что 3D-структура пептида HAEE, которая соответствует «развёрнутой» конформации пептида и является превалирующей для нативного пептида HAEE в исходном водном растворе, соответствует 3D-структуре цинкового комплекса пептида HAEE в водном растворе и остаётся неизменной в случае экспозиции цинкового комплекса пептида HAEE в плазме крови, в то время как нативный пептид HAEE в плазме крови утрачивает «развёрнутую» конформацию.
В данном случае термин 3D-структура используется как синоним пространственной структуры или взаимного расположения атомов в молекуле HAEE в трехмерном пространстве. Метод ВЭЖХ основан на преимущественно межмолекулярных взаимодействиях на границе раздела фаз. Изменение времени выхода НАЕЕ с хроматографической колонки отражает изменение межмолекулярных взаимодействий HAEE с сорбентом, что является следствием различий пространственной структуры молекул НАЕЕ в нативном состоянии и в виде цинкового комплекса.
Известно, что нарушение 3D-структуры олигопептидов может приводить к снижению их функций и уменьшению терапевтического действия (Sikora, K., Jaśkiewicz, M., Neubauer, D., Migoń, D., & Kamysz, W. (2020). The role of counter-ions in peptides—an overview. Pharmaceuticals, 13(12), 442.). Ранее было показано, что для оптимального взаимодействия с партнёрами белковой природы пептид HAEE должен находиться в «развёрнутой» конформации (Barykin E. P., Garifulina A. I., Tolstova A. P., Anashkina A. A., Adzhubei A. A., Mezentsev Y. V., Shelukhina I. V., Kozin S. A., Tsetlin V. I., Makarov A. A. Tetrapeptide Ac-HAEE-NH(2) Protects α4β2 nAChR from Inhibition by Aβ // International journal of molecular sciences. ‒ 2020. ‒ T. 21, № 17. ‒ C. 6272; Zolotarev YA, Mitkevich VA, Shram SI, Adzhubei AA, Tolstova AP, Talibov OB, Dadayan AK, Myasoyedov NF, Makarov AA, Kozin SA. Pharmacokinetics and Molecular Modeling Indicate nAChRα4-Derived Peptide HAEE Goes through the Blood-Brain Barrier. Biomolecules. 2021 Jun 18;11(6):909). В нативном пептиде HAEE имидазольная группа аминокислотного остатка гистидина может образовывать стабильные полярные связи с карбоксильными группами боковых цепей аминокислотных остатков глутаминовой кислоты, что не способствует поддержанию биологически значимой «развёрнутой» конформации данного пептида и, как следствие, снижает полезные терапевтические эффекты HAEE.
Таким образом, одним из преимуществ данного изобретения является повышение терапевтической эффективности цинкового комплекса пептида НАЕЕ вследствие сохранения 3D-структуры данного комплекса в «развернутой» конформации.
Также было обнаружено, что введение в плазму крови мышей комплекса НАЕЕ-Zn-HSA, полученного по описанному в патенте РФ № 2709539 способу, приводит к их стрессу, изменению внешнего вида и даже гибели, что может быть связано с высокой массовой концентрацией HSA в этом комплексе. Напротив, введение в плазму крови здоровых мышей цинкового комплекса пептида HAEE не приводило к каким-либо нарушениям в поведении и в физическом состоянии животных по сравнению с животными контрольной группы, которым вводился физиологический раствор, что указывает на отсутствие побочных эффектов цинкового комплекса пептида HAEE и является дополнительным преимуществом настоящего изобретения.
Таким образом, отличием настоящего изобретения от ближайшего аналога, патента РФ № 2709539, состоит в том, что заявляемый цинковый комплекс не содержит HSA, молярная концентрация ионов цинка в этом комплексе снижена по сравнению с комплексом HAEE-Zn-HSA с 2,6, как описано в примере патента РФ № 2709539, до 1 (эквимолярное количество), как описано в настоящем изобретении.
Изобретение также имеет отношение к применению цинкового комплекса для лечения нейродегенеративных заболеваний, а также патологий, сопровождающихся нейровоспалительными процессами. Заявляемый цинковый комплекс может эффективно влиять на нейродегенеративные заболевания, в частности, вызванные воспалительными причинами, восстанавливая нарушенные когнитивные функции.
Цинковый комплекс может быть использован как в твердой, так и в жидкой форме, сохраняя свою стабильность в течение по меньшей мере 2 лет.
Техническим результатом изобретения является:
- возможность использования заявляемого цинкового комплекса при лечении нейродегенеративных заболеваний, в частности вызванных опосредованно воспалительными причинами, которое приводит к эффективному восстановлению когнитивных функций;
- повышенная стабильность заявляемого цинкового комплекса по сравнению с НАЕЕ;
- устойчивость «развернутой» конформации 3D-структуры заявляемого цинкового комплекса в плазме крови по сравнению с НАЕЕ;
- отсутствие побочных эффектов у заявляемого цинкового комплекса по сравнению с НАЕЕ-Zn-HSA.
Заявляемый в настоящем изобретении цинковый комплекс в соответствии с используемым способом получения может быть получен в аморфной форме, что подтверждается рентгенофазовым анализом (Фиг. 1,2).
Сравнение данных рентгенофазового анализа комплекса НАЕЕ-Zn-HSA нецелесообразно, поскольку при соотношении масс HSA:HAEE ~ 120 на дифрактограмме будет представлен только HSA, а вещество НАЕЕ будет представлено в виде минорной примеси, не проявляющейся на дифрактограмме.
Цинковый комплекс характеризуется кривой дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) с термогравиометрией (ТГ) (ДСК-ТГА). Молекула НАЕЕ на ДСК-кривой характеризуется: широким пиком с началом при 62 оС и максимумом при 89 оС; двойным пиком плавления при температуре 203 и 227,5 оС с началом при 188 оС (Фиг. 3). Погрешность при многократном измерении оценивается в ± 3 оС. Заявляемый цинковый комплекс на ДСК-кривой характеризуется: широким пиком с началом при 62 оС и максимумом при 87 оС; широким пиком плавления с началом при 224 оС и максимумом при 255 оС (Фиг. 4).
ДСК-кривые показывают, что температура плавления цинкового комплекса выше по сравнению с температурой плавления НАЕЕ, что обеспечивает более высокую стабильность комплекса, что подтверждается результатами теста ускоренного хранения.
Сравнение данных ДСК-анализа комплекса НАЕЕ-Zn-HSA нецелесообразно, поскольку при соотношении масс HSA:HAEE > 120 на ДСК-кривой будет представлен только HSA, а вещество НАЕЕ представлено в виде минорной примеси, не проявляющейся на ДСК-кривой.
ИК-спектр с Фурье преобразованием заявляемого цинкового комплекса представлен на Фиг. 5. ИК-спектр комплекса повторяет все основные линии ИК-спектра НАЕЕ. Отличиями в полосах колебаний комплекса по сравнению с НАЕЕ и проявлением их в ИК-спектре являются смещение максимума при 1130 см-1 в область 1115 см-1 (C–N вал.) и новый максимум при 970 см-1. Таким образом цинковый комплекс, на примере ацетата, отличается от НАЕЕ наличием максимумов при 1115 см-1 и 970 см-1.
Сравнение ИК-спектра комплекса НАЕЕ-Zn-HSA нецелесообразно, поскольку при соотношении масс HSA:HAEE > 120 на ИК-спектре будет представлен только HSA, а вещество НАЕЕ представлено в виде минорной примеси, не проявляющейся на ИК-спектре.
Заявляемый цинковый комплекс может быть получен в виде лиофилизата методом стандартной сублимационной (лиофильной) сушки.
Получение цинкового комплекса заключается в смешивании водных растворов HAEE и водорастворимой цинковой соли в эквимолярных соотношениях при комнатной температуре, перемешивании в течение 10-60 мин, замораживании раствора и лиофильном высушивании.
Водорастворимые цинковые соли представляют собой нитрат, сульфат, ацетат и хлорид цинка. Для получения цинкового комплекса с другим фармацевтически приемлемым анионом, после перемешивания раствора и перед замораживанием проводится анионно-обменная хроматография или диализ, для удаления первичного аниона. После чего в раствор добавляется другой соответствующий фармацевтически приемлемый анион, раствор замораживается и лиофильно высушивается.
Анионы могут быть одно-, дву- или трехзарядными и выбираться из группы сульфата, ацетата, бензоата, нитрата, салицилата, тартрата, цитрата. Необходимость удаления анионов из раствора обусловлена заменой одного аниона на другой анион. Наличие анионов разной природы в составе комплекса в жидкой или в твердой фазе не влияет на терапевтическую эффективность цинкового комплекса. Предполагается, что только внутренняя сфера цинкового комплекса проявляет терапевтическую эффективность независимо от природы аниона.
Также анионы для цинкового комплекса выбираются из группы глюконата, лактата, трифторацетата, пирувата, галактуроната, бромида, глутарата, сукцината, малеата, фумарата, бензолсульфоната, тозилата и других фармацевтически приемлемых анионов.
Использование каждого из вышеперечисленных анионов для получения цинкового комплекса в твердой фазе методом сублимационной сушки показало, что в таком комплексе может частично оставаться гидратированная или связанная вода, однако, данный комплекс не набирает дополнительную воду при хранении и стабилен в течение длительного времени.
Еще одним объектом изобретения является фармацевтические композиции с эффективным количеством цинкового комплекса и наличием вспомогательных веществ. В качестве лекарственного средства цинковый комплекс может быть использован без вспомогательных веществ в виде лиофилизированной субстанции.
Эффективное количество цинкового комплекса зависит от типа нейродегенеративного заболевания, веса тела, способа введения, поэтому может варьироваться в широких пределах от 0,1 до 100 мг, более желательно от 5 до 50 мг.
Фармацевтическая композиция цинкового комплекса может быть в твердом виде или в виде водного раствора. Твердые композиции цинкового комплекса содержат его эффективное количество и необязательно вспомогательные вещества. Твердая фармацевтическая композиция может быть получена лиофилизацией цинкового комплекса и набором вспомогательных компонентов или добавлением вспомогательных веществ к лиофилизированному цинковому комплексу.
Лиофилизированной цинковый комплекс может быть в аморфной форме, которая соответствует дифрактограмме на Фиг. 1,2.
Вспомогательные вещества выбираются из фармацевтически приемлемых добавок. Такими веществами могут быть маннитол, повидон К 17, трометамол, динатрия эдетат, натрия хлорид, сахароза, гистидин, полоксамер 407, и другие фармацевтически приемлемые добавки.
Фармацевтическая композиция цинкового комплекса в виде водного раствора содержат эффективное количество цинкового комплекса, воду, а также набор фармацевтически приемлемых добавок и солей. Такими веществами могут быть маннитол, повидон К 17, трометамол, динатрия эдетат, натрия хлорид, сахароза, гистидин, полоксамер 407, и другие фармацевтически приемлемые добавки.
Еще одним объектом изобретения является применение цинкового комплекса для лечения нейродегенеративных заболеваний, которое заключается во введении цинкового комплекса в составе описанных фармацевтических композиций пациенту в эффективном количестве. Эффективное количество цинкового комплекса зависит от типа нейродегенеративного заболевания, веса тела, способа введения, поэтому может варьироваться в широких пределах от 0,1 до 100 мг, предпочтительно от 5 до 50 мг.
Введение цинкового комплекса пациенту может осуществляться с помощью всех возможных видов наружного, энтерального, ингаляционного и парентерального способов применения (включая внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, подкожное, накожное, трансдермальное, внутримышечное, интратекальное, субарахноидальное, пероральное, интраназальное, сублингвальное, буккальное, ректальное введение). При введении цинкового комплекса в твердой форме предпочтительным способом введения является сублингвальный. При введении цинкового комплекса в форме раствора предпочтительными способами введения являются внутривенный и интраназальный.
Возможность терапевтического лечения нейродегенеративных заболеваний была показана на примере болезни Альцгеймера, смоделированной на трансгенных мышах линии APPswe/PSEN1dE9 (APP/PS1) (Jankowsky, J. L., Slunt, H. H., Ratovitski, T., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., & Borchelt, D. R. (2001). Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomolecular engineering, 17(6), 157-165, doi: 10.1016/S1389-0344(01)00067-3), которые проявляют характерные когнитивные признаки патологии. Данная модель может считаться моделью опосредованного воспалительного действия при нарушении когнитивных функций.
В настоящем изобретении цинковый комплекс [Zn(НАЕЕ)](Ac)2, вводили шестикратно внутривенно в дозе 0,05 мг/кг, после чего проводили валидный тест на когнитивные способности «Закапывание шариков» (англ. Marble Burying Test) [Santana-Santana M., Bayascas J.R., Giménez-Llort L. (2021). Sex-Dependent Signatures, Time Frames and Longitudinal Fine-Tuning of the Marble Burying Test in Normal and AD-Pathological Aging Mice. Biomedicines, 9(8), 994, doi: 10.3390/biomedicines9080994), определяя количество более чем на 2/3 закопанных шариков в процентах от общего количества шариков. Чем больше количество закопанных шариков (КЗШ), тем выше когнитивные способности у мышей.
По результатам тестирования у контрольной группы мышей дикого типа, которым вводили физиологический раствор, значение КЗШ равнялось 50,6 ±13,3 %. Это значение принималось в качестве референсного. У контрольной группы трансгенных мышей линии APP/PS1, которым вводили физиологический раствор, значение КЗШ = 12,6 ±4,2 %, что указывает на сильное ухудшение поведенческих рефлексов трансгенных мышей линии APP/PS1 по сравнению с животными дикого типа и отражает инвалидизирующее влияние оверэкспрессии человеческого бета-амилоида, ассоциированное с нейроваоспалением и образования амилоидных бляшек, на процессы нервной деятельности. Трансгенные мыши линии APP/PS1, инъецированные препаратами HAEE или цинкового комплекса, показали значения КЗШ = 20,6 ±7,3(%) или КЗШ = 45,6 ±11,9(%), соответственно. Эти данные свидетельствуют о том, что использование цинкового комплекса существенно улучшает поведенческие рефлексы трансгенных мышей APP/PS1, а эффект от этого использования значительно превышает таковой, наблюдаемый для HAEE.
Таким образом, заявляемый цинковый комплекс может эффективно применяться при лечении нейродегенеративных заболеваний, в частности вызванными воспалительными осложнениями, восстанавливая когнитивные функции до нормального состояния.
Гистохимический анализ области гиппокампа головного мозга экспериментальных мышей показал, что число бляшек (ЧБ) на один срез мозга у контрольной группы диких мышей равно нулю, у контрольной группы трансгенных мышей APP/PS1 значение ЧБ оказалось равным 31,7 ± 4,9, в группе получавших НАЕЕ значение ЧБ составило 24,7 ± 3,4, в группе получавших цинковый комплекс значение ЧБ составило 8,2 ±2,9.
Таким образом, результаты гистохимического анализа показали, что внутривенные инъекции цинкового комплекса приводили к почти 4-кратному уменьшению амилоидной нагрузки в гиппокампе трансгенных мышей APP/PS1, и по этому показателю эффективность цинкового комплекса примерно в три раза выше таковой, выявленной для HAEE. Для ближайшего аналога HAEE-Zn-BSA данный тест не проводился из-за гибели мышей в группе и нарушения их функционального состояния на ранних этапах исследования.
В качестве одного из механизмов действия цинкового комплекса на возможность лечения нейродегенеративных заболеваний может являться его связывание с бета-амилоидом. Были рассчитаны кинетические характеристики взаимодействия цинкового комплекса и иммобилизованного человеческого бета-амилоида, которые оказались равны kon = (1,37±0,06) × 103 M-1s-1; koff = (5,89±0,06) × 10-3 s-1; KD = (4,3±0,3) × 10-6 М. Поскольку значение KD ≤ 10-4 М, то такое взаимодействие является биологически значимым. В отличие от цинкового комплекса, пептид НАЕЕ не связывался с бета-амилоидом в аналогичных экспериментальных условиях.
Это различие между нативным НАЕЕ и цинковым комплексом может влиять на фармакологические свойства, что подтвердили различающиеся тесты восстановления когнитивных функций – эффективность НАЕЕ была значительно ниже эффективности заявляемого цинкового комплекса. Этот эффект можно связать с вышеупомянутыми данными ВЭЖХ-МС, которые показали изменения в 3D структуре нативного НАЕЕ после его введения в плазму крови, тогда как цинковый комплекс до и после его введения в плазму крови имеет одно и то же время удерживания на хроматограмме ВЭЖХ и, соответственно, устойчивую 3D структуру. Это означает, что ион цинка в цинковом комплексе играет защитную роль для сохранения «развёрнутой» конформации пептида HAEE в данном комплексе, что, возможно, также предотвращает взаимодействия цинкового комплекса с элементами плазмы крови, поскольку известно, что введение нативного HAEE в периферическую кровеносную систему мышей, крыс и кроликов приводит к образованию стабильных комплексов HAEE с транспортными и рецепторными белками (Zolotarev Y.A., Mitkevich V.A., Shram S.I. et al. Pharmacokinetics and Molecular Modeling Indicate nAChRα4-Derived Peptide HAEE Goes through the Blood–Brain Barrier. Biomolecules. 2021. 11(6): p. 909, doi: 10.3390/biom11060909).
В совокупности можно сделать вывод о том, что цинковый комплекс имеет намного большую терапевтическую эффективность по сравнению с НАЕЕ и эти вещества между собой бионеэквивалентны, поскольку цинковый комплекс существует в растворе плазмы крови в «развернутой» конформации и имеет отличный от НАЕЕ механизм действия.
Описание фигур.
Фиг. 1. Дифрактограмма цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)](Ac)2.
Фиг. 2. Дифрактограмма цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)]Cl2.
Фиг. 3. ДСК-ТГА кривая НАЕЕ. 1 – ДСК-кривая; 2 – ТГ-кривая.
Фиг. 4. ДСК-ТГА кривая цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)](Ac)2 ; 1 – ДСК-кривая; 2 – ТГ-кривая.
Фиг. 5. ИК-спектр c Фурье преобразованием НАЕЕ (1) и цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)](Ac)2 (2), ([Zn(НАЕЕ)]Cl2. (3).
Фиг. 6. Расположение атомов в молекуле НАЕЕ для 1Н-ЯМР-анализа.
Фиг. 7. 1Н-ЯМР спектр НАЕЕ.
Фиг. 8. 1Н-ЯМР спектр [Zn(НАЕЕ)](Ac)2.
Описание приборов.
Порошковый рентгенофазовый анализ (РФА) выполнялся на дифрактометре Rigaku Ultima IV (Япония), напряжение на трубке – 40 кВ, ток трубки – 30 мА, материал анода трубки – Cu. Гониометр: Θ/Θ вертикального типа, образец неподвижен. Радиус гониометра – 185 мм /285 мм. Максимумы на дифрактограмме накапливались в течение 1 ч. Угол 2Θ составил от 3 до 70 градусов.
Исследование температуры плавления, термического поведения и потери массы выполняли методом дифференциальной сканирующей калориметрии и термогравиметрии (ДСК-ТГА) на приборе NETZSCH STA 449 С (Германия) в инертной атмосфере при скорости нагрева 10 град/мин.
Элементный анализ выполнен методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии с приставкой EDXA на микроскопе TESCAN MIRA3 (Чехия). Площадь измеряемого участка 0,04 мм2, количество измерений – 3.
Спектры инфракрасного излучения (ИК-спектры) получали на ИК-Фурье спектрометре Spectrum Two (Perkin Elmer, США) c приставкой диффузного отражения в диапазоне 4000-600 см-1 с разрешением 2 см-1, количество сканов – 10.
1Н-спектры ЯМР получали на ЯМР-спектрометре Bruker Avance IIIHD 500, рабочая частота 500,13 Mhz для ядер 1H.
Характеризация цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)](Ac)2 в водном растворе проводилась методом масс-спектрометрии высокого разрешения с использованием масс-спектрометра LTQ FT Ultra (Thermo Scientific, Германия), который сочетает в себе технологии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье и ионной ловушки. Ионизацию электрораспылением (ESI) проводили с использованием источника Ion Max (Thermo Scientific, Германия) с металлическим капилляром для распыления. Использовались следующие параметры источника IonMax: скорость потока составляла 3 мкл/мин; температура нагретого капилляра составляла 200°C; распыляемый газ был отключен; напряжение на капилляре электрораспыления составляло +3,8 кВ в положительной моде и -2,5кВ в отрицательно моде. Идентификация молекулярных ионов проводилась с помощью специализированного программного обеспечения Qual Browser (Thermo Corp., Germany). Возможность характеризации катионных комплексов пептидов с помощью метода масс-спектрометрии была ранее описана (Zirah S., Rebuffat S., Kozin, S.A. et al (2003). Zinc binding properties of the amyloid fragment Aβ(1–16) studied by electrospray-ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry, 228(2-3), 999-101.
Образование комплекса фиксировали биосенсором на эффекте поверхностного плазмонного резонанса (БППР) в водных буферных системах при физиологических значениях pH. БППР эксперименты были проведены на инструменте «BIAcore 3000» (GE Healthcare, США) с использованием оптического чипа CM4 в соответствии с протоколами компании-производителя. Синтетический аналог 42-членного человеческого бета-амилоида (Aβ42), на C-конце которого добавлен тетраглицилцистеиновый пептидный фрагмент (-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys), был использован в качестве лиганда. Лиганд (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAGGGGC) иммобилизовали на поверхности оптического чипа через дисульфидную связь тиоловой группы С-концевого остатка цистеина. В качестве аналитов использовали цинковый комплекс или HAEE.
Высушивание замороженных образцов выполнялось в пенициллиновых пузырьках на сублиматоре Heto FD 2.5 при давлении 0,1-0,2 мбар.
Тест ускоренного хранения проводили в камере Memmert HCP50 при 40 оС и 75% влажности. Образцы отбирали раз в месяц в течение 6 месяцев и определяли содержание действующего вещества методом ВЭЖХ.
Варианты осуществления изобретения
Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, но не ограничивается ими.
Пример 1. Получение цинкового комплекса пептида HAEE.
Для получения комплекса в качестве источника цинка использовались ацетат, хлорид, сульфат и нитрат цинка в разных соотношениях. В таблице 1 приведены различные соотношения солей цинка для получения комплекса.
Для получения комплекса готовили раствор НАЕЕ с концентрацией 10-5 М. В него добавляли раствор соли цинка с концентрацией 10-3 М (Таблица 1). Перемешивание осуществляли в течение 5-60 мин. Эквимолярные цинковые комплексы образовывались при молярном соотношении НАЕЕ и соли цинка равные 1:1. Раствор медленно замораживали в холодильной установке при -20 или -80 оС и затем осуществляли лиофильную сушку в стандартном режиме. Далее детально изучали свойства полученного лиофилизированного цинкового комплекса.
При молярном соотношении компонентов менее 0,1 комплекс в растворе не обнаруживался методом ЯМР (сигналы основного вещества не смещались). При увеличении концентрации соли цинка более 1:10 образовывались смесь из цинкового комплекса и соответствующей соли цинка.
При получении цинкового комплекса с анионом, который изначально мало или совсем не растворяется в воде (например, тартрат цинка, цитрат цинка и т.п.) использовали на первой стадии водорастворимую соль цинка (нитрат, ацетат, хлорид, сульфат), анион удаляли известным способом – анион-обменной хроматографией или диализом и добавляли в раствор другое соединение – винную кислоту, лимонную кислоту и т.п в эквимолярных количествах. После чего совершали аналогичные операции по замораживанию и лиофильному высушиванию цинкового комплекса.
Таким образом, получение цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)]mXn, где Х - бензоат, салицилат, тартрат, цитрат и т.п. осуществляли в три этапа. Сначала готовили раствор цинкового комплекса по описанным в Таблице 1 соотношениям, затем хроматографически отделяли неорганические анионы и добавляли для получения бензоата – бензойную кислоту, салицилата – салициловую кислоту, тартрата – винную кислоту, цитрата – лимонную кислоту в эквимолярных количествах.
Для получения цинкового комплекса в твердой форме полученные растворы замораживали в морозильной камере (-20 оС) в пенициллиновых пузырьках в течение 2 ч. Замороженные образцы помещали в сублиматор с предварительно охлажденными полками и высушивали в течение 16-30 ч. Все высушенные образцы имели белый цвет. Выход продукта 99%. Высокий выход продукта обусловлен отсутствием потерь при высушивании образцов.
Полученные твердые образцы комплекса характеризуются аморфной формой на дифрактограмме (Фиг. 1,2). На ДСК кривой в отличие от НАЕЕ (Фиг. 3) комплекс характеризуется широким пиком с началом при 62 оС и максимумом при 87 оС; широким пиком плавления с началом при 224 оС и максимумом при 255 оС (Фиг. 4). Методом ДСК-ТГА было показано, что цинковый комплекс в твердой форме может содержать гидратированную или остаточную воду, содержание которой для разных образцов не превышало 5% (потеря массы при нагревании до 100 оС).
Элементный анализ (EDXA) цинкового комплекса показал содержание цинка в образцах (при молекулярном соотношении НАЕЕ : Zn = 1:1), от 5±0,5 до 10±1 % масс. в зависимости от природы аниона.
ИК-спектр с Фурье преобразованием комплекса характеризуется наличием максимумов при 1115 см-1 и 970 см-1 (Фиг. 5), что отличает заявляемый цинковый комплекс от НАЕЕ.
Исходный образец НАЕЕ характеризовался ЯМР 1H[500.13Mhz; D2O; 298K; d, м.д.]: 1.27 (3H, d, j=7.13Hz, CH3(16)), 1.87 (5H, m, CH3(3), 1/2CH2(21),1/2CH2(33)), 1.92 (0.22H, s, CH3(Imp. - Ac)), 1.99 (2H, sx, j=7.45Hz 1/2CH2(21),1/2CH2(33)), 2.28 (4H, m, 2CH2(22,34 )), 3.13, 3,03 (2H, m, CH2(8)), 4.19 (3H, m, 3CH (15,20,29)), 4.56 (1H, t, j=6.86Hz, CH(5)), 7.19 (1H, s, CH(10)), 8.50 (1H, s, CH(12)) (Фиг. 6,7).
После образования цинкового комплекса положение химических сдвигов протонов в молекуле НАЕЕ изменялась и представлено на Фиг. 8, что свидетельствует о сохранении комплекса после его растворения в воде, что важно для фармакологических свойств полученного комплекса. Так, сигнал при СН(12) смещался с 8,5 до 8,42 м.д., при CH(10) с 7.19 до 7,14 м.д., при CH2(8) с 3,13 и 3,03 до 3,10 и 3,01, при 2CH2(22,34 ) с 2,28 до 2,21, при CH3(16) с 1,27 до 1,26 (Таблица 2). Смещение протонных сигналов от определенных групп в молекуле показывает их вклад в электростатическое взаимодействие с ионом цинка при образовании комплекса; чем больше взаимодействие, тем большее смещение наблюдается в 1Н-ЯМР-спектре у определенных СН-групп молекулы. Поэтому наибольшее взаимодействие наблюдается у СН(12) группы имидазола гистидинового фрагмента и α-групп (22, 34) глутаминовых фрагментов, что связано с координированием -СООН групп глутаминовой кислоты.
При наличии в твердой фазе ацетата, бензоата, салицилата, тартрата в 1Н-ЯМР-спектре цинкового комплекса помимо молекулы НАЕЕ фиксировались сигналы от этих анионов, например от ацетата (СН3 - 1,92 м.д.).
Характеризация цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)](Ac)2 в водном растворе проводилась методом масс-спектрометрии высокого разрешения с использованием технологии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье путем измерения точной массы характерных молекулярных ионов как при положительной, так и при отрицательной модах ионизации. Для проведения измерений образцы цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)](Ac)2 в водном растворе c концентрацией 20 мкМ вносили в смесь воды и ацетонитрила в соотношении 1:1 с добавлением муравьиной кислоты (для достижении финальной концентрации 0,1%). Масс-спектрометрический анализ водного раствора цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)](Ac)2, проведенный при положительной моде электроспрейного ионизационного источника, показал наличие молекулярного иона [HAEE+H]+1 с моноизотопной массой 526,2270 m/z и молекулярного иона [HAEE-H+Zn]+1 с моноизотопной массой 588,1449 m/z. При использовании отрицательной моды электроспрейного ионизационного источника для анализа цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)](Ac)2 в водном растворе были идентифицированы молекулярный ион [HAEE-H]-1 с моноизотопной массой 524,2189 m/z и молекулярный ион [HAEE-3H+Zn]-1 с моноизотопной массой 586,1345 m/z. Таким образом, полученные данные подтверждают специфическое связывание катиона цинка (II) с пептидом HAEE, которое характеризует внутреннюю координационную сферу цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)]2+ в водном растворе.
Сравнительный анализ цинкового комплекса методом ВЭЖХ-МС (2,5 нг/мл, 0,5% FA – муравьиная кислота, 50% МеОН (1:1)) показал, что в водных растворах in vitro при физиологических значениях pH его хроматографическая подвижность практически идентична HAЕЕ в тех же хроматографических условиях. Время выхода хроматографического пика с колонки составляло 2,77 и 2,85 мин, соответственно. С учетом известных из литературы данных молекулярного моделирования (Barykin E.P., Garifulina A.I., Tolstova A.P. et al. (2020). Tetrapeptide Ac-HAEE-NH2 Protects α4β2 nAChR from Inhibition by Aβ. International journal of molecular sciences, 21(17), 6272, doi: 10.3390/ijms21176272), вышеприведённые результаты указывают на то, что пространственные структуры основной пептидной цепи цинкового комплекса и пептида HAEE в условиях in vitro идентичны и характеризуется «развернутой» конформацией.
После введения цинкового комплекса HAEE внутривенно в организм здоровых мышей (n = 5) было показано, что время выхода хроматографического пика НАЕЕ, экстрагированного из образцов крови мыши, не изменялось и также составляло 2,77 мин. Однако, для HAEE, введенного в организм в нативной форме, экстрагированного из образцов крови, было неожиданно обнаружено, что время выхода хроматографического пика стало 1,27 мин. Только около 8% вещества продолжало выходить из колонки на времени 2,85 мин.
Полученные данные свидетельствует о том, что в образцах крови человека или мыши конформация пептида HAEE резко отличается от конформации, наблюдаемой при тех же условиях для цинкового комплекса. Лишь 8% НАЕЕ находится в «развернутой» конформации после его взаимодействия с элементами плазмы крови. Таким образом, в образцах крови цинковый комплекс сохраняет свою конформацию (предположительно, «развёрнутую») неизменной, в то время как HAEE приобретает иную конформацию, которая характеризуется гораздо более компактной структурой, предположительно, «спиральной». Это означает, что цинковый комплекс устойчив к изменению конформации в плазме крови. Согласно настоящему изобретению, для достижения терапевтического эффекта как от цинкового комплекса пептида HAEE, так и от HAEE требуется их введение в организм и присутствие в плазме крови, поэтому принципиальные различия в пространственной структуре этих молекул в плазме крови, исходя из общих представлений биохимии и физиологии, свидетельствуют о различном молекулярном механизме действия цинкового комплекса и HAEE, что исключает их биоэквивалентность.
Была определена стабильность цинкового комплекса в тесте ускоренного хранения в течение 6 месяцев, что соответствует 2 годам хранения в обычных условиях (Таблица 3). Цинковый комплекс, как очищенный от анионов, так и в смеси с указанными анионами за время хранения сохранил свой цвет, консистенцию, не набирал воды (масса образца не увеличивалась в пределах 1-2%) и не терял активное вещество. Образец НАЕЕ с течением времени набирал воду (до 7% масс.) и по данным ВЭЖХ деградировал до 67,4% активного вещества за 6 мес. Образец, полученный по патенту РФ № 2709539, представляющий собой комплекс НАЕЕ-Zn-HSA также набирал воду (до 16% масс.) и деградировал до содержания 71,9% от исходного количества. Таким образом, стабильность заявляемого цинкового комплекса оказалась значительно выше по сравнению с НАЕЕ и НАЕЕ-Zn-HSA.
Пример 2. Фармацевтические композиции на основе цинкового комплекса пептида HAEE.
Фармацевтические композиции на основе цинкового комплекса пептида HAEE могут содержать активное вещество в эффективном количестве (Таблица 4). Состав дозы рассчитывается индивидуально и может варьироваться от 0,1 мг до 100 мг на человека в сутки, более предпочтительно от 1 до 50 мг. Составы фармацевтических композиций представлены в Таблице 3. Пересчет выполнен на дозировку активного вещества. Возможны и другие соотношения активного вещества в фармацевтической композиции в диапазоне от 0,1 до 100 мг. Масса таблеток варьируется от 100 до 400 мг, таблетки могут быть покрыты оболочкой.
Пример 3. Влияние цинкового комплекса пептида HAEE на поведенческие функции и степень тяжести церебрального амилоидоза у экспериментальных животных.
Для моделирования нейродегенеративного заболевания была выбрана модель болезни Альцгеймера, являющейся основным по распространённости нейродегенеративным заболеванием у людей пожилого возраста.
Для проведения экспериментов были использованы самцы трансгенных мышей линии APPswe/PSEN1dE9. Мыши данной линии также известны под названием APP/PS1: у контрольной группы мышей APP/PS1, начиная с 4-6-месячного возраста, проявляются характерные когнитивные признаки патологии, подобной болезни Альцгеймера, и имеется значительное количество конгофильных амилоидных бляшек в специфических отделах мозга, включая гиппокамп и кортекс (Borchelt D.R., Ratovitski T., Van Lare J., et al. (1997). Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron, 19(4), 939-945, doi: 10.1016/S0896-6273(00)80974-5).
Для тестирования были использованы 8-месячные животные, сгруппированные в следующие экспериментальные группы (n = 12 в каждой группе):
1. контроль 1. Мыши дикого типа, которым внутривенно вводили физиологический раствор;
2. контроль 2. Трансгенные мыши APP/PS1, которым внутривенно вводили физиологический раствор;
3. трансгенные мыши APP/PS1, которым внутривенно вводили HAEE;
4. трансгенные мыши APP/PS1, которым внутривенно вводили HAEE-Zn-HSA (1:2,6);
5. трансгенные мыши APP/PS1, которым внутривенно вводили [Zn(НАЕЕ)](Ac)2.
Препараты HAEE, HAEE-Zn-HSA и заявляемый цинковый комплекс вводили в ретроорбитальное венозное сплетение в соответствии с известной процедурой (Yardeni T., Eckhaus M., Morris H.D. et al. (2011). Retro-orbital injections in mice. Lab animal, 40(5), 155-160, doi: 10.1038/laban0511-155). Инъекции в дозе 0,05 мг/кг проводили ежемесячно, в возрасте от 2 до 7 месяцев (включительно), всего было сделано 6 инъекций препаратами HAEE и цинкового комплекса, однако, препаратом HAEE-Zn-HSA было сделано только две инъекции, а далее эксперименты с этим препаратом были прекращены из-за появления признаков ухудшения внешнего вида экспериментальных животных после первой инъекции и гибели 5 трансгенных мышей непосредственно после второй инъекции. Скорее всего, это связано с влиянием высоких концентраций HSA, который отличается по структуре от эндогенного мышиного альбумина (MSA).
В возрасте 8 месяцев проводили тестирование поведенческих функций, затем животные подвергались эвтаназии с последующим забором мозга и гистохимическим анализом числа конгофильных бляшек в областях СА1, СА2, СА3 и зубчатой извилине гиппокампа согласно известной процедуре (Kozin S.A., Barykin E.P., Telegin G.B., et al. Intravenously Injected Amyloid-β Peptide With Isomerized Asp7 and Phosphorylated Ser8 Residues Inhibits Cerebral β-Amyloidosis in AβPP/PS1 Transgenic Mice Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in neuroscience, 2018, 12, 518-518, doi: 10.3389/fnins.2018.00518).
3.1 Анализ улучшения поведенческих функций у 8-месячных самцов трансгенных мышей APP/PS1 под действием HAEE и цинкового комплекса пептида HAEE был проведён с помощью теста «Закапывание шариков». В качестве контроля использовались трансгенные мыши APP/PS1 и мыши дикого типа. Для проведения теста мышей помещали в клетки со свежим подстилом с размещенными на нем восемнадцатью шариками, расположенными в виде матрицы 3 х 6. Мышей оставляли в клетке на 30 минут, после чего определяли количество более чем на 2/3 закопанных шариков (КЗШ) в процентах от общего количества шариков. Поведение закапывания является признаком обсессивно-компульсивного поведения. Из-за повторяющегося и персеверативного характера закапывания такое поведение может представлять нейропсихиатрические симптомы, такие как персеверативное поведение и/или стереотипное поведение. Оба являются нейропсихиатрическими симптомами, обычно присутствующими у пациентов с болезнью Альцгеймера и другими видами деменции.
По результатам тестирования, уровень поведения контрольной группы мышей дикого типа характеризовался значением КЗШ = 50,6 ±13,3 %. Это значение рассматривается в качестве референсного. У контрольной группы трансгенных мышей APP/PS1 значение КЗШ = 12,6 ±4,2 %, что указывает на сильное ухудшение поведенческих рефлексов мышей APP/PS1 по сравнению с животными дикого типа и отражает инвалидизирующее влияние оверпродукции человеческого бета-амилоида на процессы нервной деятельности. Мыши, инъецированные HAEE и цинковым комплексом пептида HAEE, показали значения КЗШ = 20,6 ±7,3 % и КЗШ = 45,6 ±11,9 %, соответственно (Таблица 5).
Эти данные свидетельствуют о том, что использование цинкового комплекса пептида HAEE существенно улучшает поведенческие рефлексы трансгенных мышей APP/PS1, а эффект от этого использования значительно превышает таковой, наблюдаемый для HAEE. Сравнительные эксперименты цинкового комплекса с другими анионами не выявили статистически значимых различий в биологическом эффекте. Введение ближайшего аналога HAEE-Zn-HSA приводило к нарушению физического состояния у мышей и к их гибели, что, по-видимому, связано с высокой дозировкой НSA.
3.2. Гистохимический анализ конгофильных амилоидных бляшек в областях СА1, СА2, СА3 и зубчатой извилине гиппокампа был проведен согласно ранее описанным процедурам (Kozin S.A., Barykin E.P., Telegin G.B., et al. Intravenously Injected Amyloid-β Peptide With Isomerized Asp7 and Phosphorylated Ser8 Residues Inhibits Cerebral β-Amyloidosis in AβPP/PS1 Transgenic Mice Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in neuroscience, 2018, 12, 518-518, doi: 10.3389/fnins.2018.00518). Мозг мышей извлекали и фиксировали в 10% формалине. Процесс заливки образца в парафин проводили следующим образом: заливали 75% этанолом и оставляли на ночь, далее сменяли на 96% этанол и выдерживали 5 мин, 96% этанол – 10 мин, 100% этанол – 10 мин (две замены), этанол-хлороформ (1:1) – 30 мин, и оставляли в чистом хлороформе на ночь. Заливку парафином проводили при 60°С в течение 3 ч (три смены). Заливку тканей в парафиновые блоки осуществляли на приборе Leica EG1160. Серийные срезы головного мозга (8 мкм) вырезали с помощью микротома Leica RM2265 и помещали на предметные стекла. Для депарафинизации, гидратации и окрашивания срезов проводили следующие этапы: предметные стекла последовательно помещали в ксилол три смены (по 10 минут), 96% этанол – 5 мин, 90% этанол – 2 мин, 75% этанол – 2 мин, вода – 5 мин (три смены), раствор конго красного – 5 мин, далее добавлялся раствор гидроксида калия и вода. Для монтирования использовали среду ImMu-Mount (Thermo Scientific). Срезы, охватывающие область мозга от 0,48 до 1,92 мм относительно средней линии в латеральных стереотаксических координатах (Franklin K., Paxinos, G. (2008). The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. New York, NY: Academic Press), использовали для количественного определения конгофильных амилоидных бляшек в гиппокампе. Анализировали каждый 15-й срез, что давало 10 срезов на животное. Амилоидные бляшки идентифицировали окрашиванием конго красным и подсчитывали вручную. Для каждой группы мышей рассчитывали средние значения и стандартное отклонение количества бляшек на 1 срез. Для проверки нормальности распределения использовали критерий Шапиро-Уилка. Для попарного сравнения исследуемых групп использовали критерий Манна-Уитни. Применяемый уровень значимости составлял 99,9% (P <0,001).
У контрольной группы мышей дикого типа (группа 1) никаких амилоидных бляшек обнаружено не было (Таблица 4). Конгофильные амилоидные бляшки, визуализированные в областях СА1, СА2, СА3 и зубчатой извилине гиппокампа головного мозга трансгенных животных были сходны по локализации и распределению размеров в паренхиме головного мозга. Однако, количественная оценка амилоидных бляшек выявила существенные различия между группами. В контрольной группе 2 (трансгенные мыши APP/PS1) среднее число бляшек в областях на один срез мозга (ЧБ) составляло ЧБ = 31,7 ± 4,9. В группе 3, где трангсенным мышам APP/PS1 вводили HAEE, ЧБ = 24,7 ± 3,4. В группе 4, в которой трансгенным мышам APP/PS1 вводили заявляемый цинковый комплекс, ЧБ = 8,2 ±2,9. Таким образом, результаты гистохимического анализа показали, что внутривенные инъекции цинкового комплекса приводили к почти 4-кратному уменьшению амилоидной нагрузки в гиппокампе трансгенных мышей APP/PS1, и по этому показателю эффективность цинкового комплекса примерно в три раза выше таковой, выявленной для HAEE.
Пример 4. Специфическое связывание цинкового комплекса пептида HAEE с человеческим бета-амилоидом (Aβ42).
Дополнительно была проведена оценка связывания заявляемого цинкового комплекса с бета-амилоидом как одного из механизмов действия данного комплекса при нейродегенеративных поражениях, связанных с бета-амилоидом. Образование комплексов между находящимся в растворе аналитом (заявляемый цинковый комплекс или HAEE) и иммобилизованным 42-членным человеческим бета-амилоидом (лигандом) было исследовано с помощью БППР. По результатам таких экспериментов рассчитывали кинетические параметры взаимодействий и значение константы диссоциации (KD) взаимодействия цинкового и иммобилизованного лиганда. Если значение KD ≤ 10-4 М, то взаимодействие между цинковым комплексом и бета-амилоидом является биологически значимым.
Взаимодействий между HAEE и лигандом обнаружено не было. Напротив, при введении цинкового комплекса пептида HAEE было обнаружено его взаимодействие с иммобилизованным Aβ42 при его различных концентрациях 150, 300, 500, 1000, 1500 мкМ. На основании полученных данных были рассчитаны кинетические характеристики взаимодействия цинкового комплекса пептида HAEE с иммобилизованным бета-амилоидом Aβ42: kon = (1,37±0,06) × 103 M-1s-1; koff = (5,89±0,06) × 10-3 s-1; KD = (4,3±0,3) × 10-6 М. Кинетические характеристики оставались в этих же значениях пределах погрешности при исследовании цинкового комплекса с разным набором анионов – нитрат, ацетат, хлорид, сульфат, тартрат, цитрат, салицилат.
Таким образом, на основании вышеприведенных результатов доказано образование стабильных межмолекулярных комплексов между 42-членным человеческим бета-амилоидом (Aβ42) и цинковым комплексом пептида HAEE. В отличие от цинкового комплекса пептида HAEE, нативный пептид HAEE в идентичных экспериментальных условиях не взаимодействует с Aβ42.
Полученные в данном Примере настоящего изобретения результаты указывают на отсутствие способности HAEE связываться с Aβ42. Напротив, цинковый комплекс пептида HAEE связывается с Aβ42. Несмотря на то, что и HAEE и заявляемый цинковый комплекс при введении в кровеносную систему трансгенных мышей APP/PS1 улучшают когнитивные функции и снижают количество амилоидных бляшек у экспериментальных животных (Примеры 3.1 и 3.2 настоящего изобретения), полученные результаты свидетельствует о различных молекулярных механизмах терапевтического воздействия HAEE и заявляемого цинкового комплекса, что, в свою очередь, исключает биоэквивалентность HAEE и заявляемого цинкового комплекса при их использовании для лечения нейродегенеративных заболеваний.
Таблица 1. Объемы реагентов для приготовления цинковых комплексов HAEE с различными анионами.
Молярное соотношение веществ | Объём раствора НАЕЕ с концентрацией 10-5 М в мл | Объем раствора соли с коцентрацией 10-3 М в мкл |
HAEE + Zn(CH3COO)2 (1:1) | 0,5 | 5 |
HAEE + Zn(CH3COO)2 (1:10) | 0,4 | 40 |
HAEE + Zn(CH3COO)2 (1:0,1) | 0,5 | 0,5 |
HAEE + ZnCl2 (1:1) | 0,4 | 4 |
HAEE + ZnSO4 (1:1) | 0,5 | 5 |
HAEE + Zn(NO3)2 (1:1) | 0,4 | 4 |
1 стадия: HAEE + Zn(CH3COO)2 (1:1) 2 стадия: анион-обменная хроматография. 3 стадия: добавление лимонной кислоты |
0,5 | 5 мкл - Zn(CH3COO)2; 15 мкл - лимонная кислота (с = 10-3 М) |
Таблица 2. Смещение сигналов протонов в 1Н-ЯМР-спектре заявляемого цинкового комплекса по сравнению c HAEE.
Номер СН-группы в молекуле НАЕЕ (Фиг. 6)/принадлежность аминокислоте | Сигнал в молекуле НАЕЕ, м.д. (Фиг. 7) | Сигнал в цинковом комплексе, м.д. (Фиг. 8) | Разница сигнала, Δ |
His1 | |||
8 | 3.03/3.13 | 3.01/3.10 | 0.02/ 0.03 |
10 | 7.19 | 7.14 | 0.03 |
12 | 8.5 | 8.42 | 0.08 |
Glu3/Glu4 | |||
22, 34 | 2.28 | 2.21/2.23 | 0.07 |
Ala2 | |||
16 | 1.27 | 1.25 | |
CαH: 15(Ala) 20(Glu) 29(Glu) | 4.19 | 4.21 | 0.02 |
CβH2: 21(Glu), 33(Glu) | 1.99 | 1.96 | 0.03 |
3 (Ас) | 1.87 | 1.88 | 0,01 |
Таблица 3. Данные по стабильности цинкового комплекса пептида HAEE в тесте ускоренного хранения (40 оС, 75% влажности).
Образец | Срок хранения, мес | |||||
0 | 1 | 2 | 3 | 5 | 6 | |
Содержание действующего вещества в % (метод ВЭЖХ), погрешность 1% | ||||||
[Zn(HAEE)](Ac)2 | 100,0 | 100,1 | 99,4 | 99,8 | 100,5 | 99,4 |
[Zn(HAEE)]SO4 | 100,0 | 99,5 | 99,7 | 100,4 | 99,7 | 100,1 |
[Zn(HAEE)](NO3)2 | 100,0 | 100,1 | 100,2 | 99,4 | 99,8 | 100,0 |
[Zn(HAEE)]Cl2 | 100,0 | 100,3 | 100,1 | 100,0 | 99,4 | 99,9 |
[Zn(HAEE)](тартрат) | 100,0 | 99,8 | 100,0 | 100,3 | 100,1 | 99,8 |
[Zn(HAEE)](бензоат)2 | 100,0 | 99,7 | 100,4 | 99,7 | 100,1 | 100,2 |
[Zn(HAEE)](салицилат)2 | 100,0 | 99,8 | 99,7 | 100,4 | 99,7 | 99,8 |
[Zn(HAEE)](сукцинат) | 100,0 | 99,4 | 99,6 | 99,5 | 99,5 | 99,7 |
[Zn(HAEE)]3(цитрат)2 | 100,0 | 99,1 | 99,2 | 99,9 | 100,1 | 99,4 |
НАЕЕ | 100,0 | 94,6 | 85,2 | 77,1 | 72,7 | 67,4 |
НАЕЕ-Zn-HSA (1:2,6) | 100,0 | 92,1 | 83,5 | 77,3 | 72,1 | 71,9 |
Таблица 4. Состав фармацевтических композиций с цинковым комплексом пептида HAEE. В/м – внутримышечное введение, в/в – внутривенное введение.
№ | Кол-во комплекса (в пересчете на НАЕЕ), мг | Форма | Вспомогательные вещества |
0,1 | лиофилизат | – | |
0,5 | лиофилизат | – | |
1 | лиофилизат | – | |
5 | лиофилизат | – | |
10 | лиофилизат | – | |
25 | лиофилизат | – | |
50 | лиофилизат | – | |
100 | лиофилизат | – | |
0,1 | лиофилизат | маннитол – 0,1 мг повидон К 17 – 0,1 мг |
|
10 | лиофилизат | маннитол –1 мг повидон К 17 – 1 мг |
|
50 | лиофилизат | маннитол –10 мг повидон К 17 – 17 мг |
|
100 | лиофилизат | маннитол –100 мг повидон К 17 – 104 мг |
|
5 | таблетка | лактозы моногидрат - 71 мг, целлюлоза микрокристаллическая – 100 мг, магния стеарат – 0,5 мг | |
10 | таблетка | лактозы моногидрат - 95 мг, целлюлоза микрокристаллическая – 140 мг, магния стеарат – 0,5 мг | |
25 | таблетка | лактозы моногидрат - 105 мг, целлюлоза микрокристаллическая – 180 мг, магния стеарат – 0,5 мг | |
0,1 | жидкая, для в/в | набор солей для поддержания осмотического давления 290-310 мОсм/л, вода до 100% |
|
0,5 | жидкая, для в/в | 0,9% - хлорид натрия 0,1 М раствор натрия гидроксида - до pH 5,0 - 7,5 вода – до 100% |
|
1 | жидкая, р-р для в/м | 0,9% - хлорид натрия 0,1 М раствор хлористоводородной кислоты -до pH 5,0-7,5 вода – до 100% |
|
5 | жидкая, р-р для в/в | Аналогично примеру 17 | |
10 | жидкая, р-р для в/м | Аналогично примеру 18 | |
25 | жидкая, р-р для в/м | Аналогично примеру 17 | |
50 | жидкая, р-р для в/м | Аналогично примеру 18 | |
100 | жидкая, р-р для в/в | – Аналогично примеру 18 | |
1 | жидкая, ингаляционная | 0,9% - хлорид натрия, регулятор pH до 5,5-7 сахароза – до 5%, гистидин, полоксамер 407 – до 1% вода – до 100% |
|
5 | жидкая, интроназальная | Аналогично примеру 24 | |
10 | жидкая, р-р для в/в | Аналогично примеру 24 | |
25 | Жидкая, р-р для в/в | Аналогично примеру 24 | |
10 | жидкая ингаляционная | 0,9% - хлорид натрия, регулятор pH до 5,5-7,5 вода – до 100% |
|
100 | жидкая, интроназальная | Аналогично примеру 28 | |
1 | Жидкая, в/в или в/м | маннитол – 0,5 мг; трометамол – 12 мг; динатрия эдетат - 1 мг вода – до 100% |
Таблица 5. Влияние цинкового комплекса пептида HAEE на когнитивные функции у мышей в тесте «закапывание шариков» и на количество амилоидных бляшек. Применяемый уровень значимости составлял 99,9% (P <0,001).
№ | Группа животных | Количество закопанных шариков более чем на 2/3 (КЗШ), % | Количество амилоидных бляшек на 1 срез мозга, гистологический анализ |
1. | Группа 1. Контроль 1. Мыши дикого типа, физиологический раствор | 50,6 ±13,3 | отсутствуют |
2. | Группа 2. Контроль 2. Трансгенные мыши APP/PS1, физиологический раствор | 12,6 ±4,2 | 31,7 ± 4,9 |
3. | Группа 3. Трансгенные мыши APP/PS1, в/в HAEE 0,05 мг/кг | 20,6 ±7,3 | 24,7 ± 3,4 |
4. | Группа 4. трансгенные мыши APP/PS1, в/в [Zn(НАЕЕ)](Ac)2, 0,05 мг/кг | 45,6 ±11,9 | 8,2 ±2,9 |
5. | Группа 5. Трансгенные мыши APP/PS1, в/в HAEE-Zn-HSA (1:2,6), 0,05 мг/кг | - (побочные действия, гибель животных) |
– |
Claims (29)
1. Цинковый комплекс формулы [Zn(HAEE)]mXn, где Zn представляет собой двухзарядный катион цинка (II), m = 1 для однозарядных и двухзарядных анионов, m = 3 для трехзарядных анионов, HAEE представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по C-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu, Х – фармацевтически приемлемый анион, n = 1 для двухзарядных анионов, n = 2 для однозарядных и трехзарядных анионов.
2. Цинковый комплекс по п. 1, в котором фармацевтически приемлемый анион выбирается из группы ацетата (C2H3O2), сульфата (SO4), хлорида (Cl), нитрата (NO3), бензоата (C7H5O2), салицилата (C7H5O3), тартрата (C4H4O6), цитрата (C6H5O7), сукцината (C4H4O4).
3. Цинковый комплекс по п. 1, который представляет собой [Zn(HAEE)](C2H3O2)2, [Zn(HAEE)](SO4), [Zn(HAEE)](Cl)2, [Zn(HAEE)](NO3)2, [Zn(HAEE)](C7H5O2)2, [Zn(HAEE)](C7H5O3)2, [Zn(HAEE)](C4H4O6), [Zn(HAEE)]2(C6H5O7)3, [Zn(HAEE)](C4H4O4).
4. Цинковый комплекс по п. 1, который представляет собой в твердом виде аморфную фазу.
5. Цинковый комплекс по п. 1, который характеризуется дифрактограммой, представленной на Фиг. 1, 2.
6. Цинковый комплекс по п. 1, который характеризуется кривой дифференциальной сканирующей калориметрии, представленной на Фиг. 4.
7. Фармацевтическая композиция для лечения нейродегенеративных заболеваний, содержащая в качестве активного вещества цинковый комплекс формулы [Zn(HAEE)]mXn, где Zn представляет собой двухзарядный катион цинка (II), m = 1 для однозарядных и двухзарядных анионов, m = 3 для трехзарядных анионов, HAEE представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по C-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu, Х – фармацевтически приемлемый анион, n = 1 для двухзарядных анионов, n = 2 для однозарядных и трехзарядных анионов, в эффективном количестве и фармацевтически приемлемые добавки.
8 .Фармацевтическая композиция по п. 7, которая представлена твердой или жидкой формой.
9. Фармацевтическая композиция по п. 7, в которой цинковый комплекс находится в виде аморфной формы.
10. Фармацевтическая композиция по п. 9, в которой аморфная форма цинкового комплекса характеризуется дифрактограммой на Фиг. 1, 2.
11. Фармацевтическая композиция по п. 7, в которой эффективное количество цинкового комплекса составляет от 0,1 до 100 мг.
12. Фармацевтическая композиция по п. 7, в которой эффективное количество цинкового комплекса составляет от 5 до 50 мг.
13. Фармацевтическая композиция по п. 7 для лечения болезни Альцгеймера.
14. Фармацевтическая композиция по п. 7, предназначенная для восстановления когнитивных функций, нарушенных вследствие нейродегенеративных заболеваний.
15. Фармацевтическая композиция по п. 14, применяющаяся при воспалительных причинах нейродегенеративных заболеваний.
16. Фармацевтическая композиция по п. 7, в которой вспомогательные фармацевтически приемлемые добавки представляют собой маннитол, повидон К 17, трометамол, динатрия эдетат, натрия хлорид, сахароза, гистидин, полоксамер 407.
17. Фармацевтическая композиция по п. 7, которая представляет собой лиофилизат.
18. Фармацевтическая композиция по п. 7, предназначенная для введения внутривенным, внутриартериальным, внутрибрюшинным, подкожным, накожным, трансдермальным, внутримышечным, интратекальным, субарахноидальным, пероральным, интраназальным, сублингвальным, буккальным, ректальным способом.
19. Способ получения цинкового комплекса формулы [Zn(HAEE)]mXn, где Zn представляет собой двухзарядный катион цинка (II), m = 1 для однозарядных и двухзарядных анионов, m = 3 для трехзарядных анионов, HAEE представляет собой синтетический тетрапептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по C-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu, Х – фармацевтически приемлемый анион, n = 1 для двухзарядных анионов, n = 2 для однозарядных и трехзарядных анионов,
заключающийся в том, что пептид HAEE смешивают с солью цинка в эквимолярном соотношении в водном растворе или буферном растворе при комнатной температуре, замораживают и высушивают.
20. Способ получения по п. 19, в котором соль цинка представляет собой ацетат, сульфат, хлорид, нитрат.
21. Способ получения по п. 19, в котором при необходимости замещают анион другим фармацевтически приемлемым анионом.
22. Способ получения по п. 21, в котором фармацевтически приемлемый анион представляет собой одно-, дву- или три- зарядные органические соединения, содержащие -СООН группу.
23. Применение цинкового комплекса [Zn(HAEE)]mXn, где Zn представляет собой двухзарядный катион цинка (II), m = 1 для однозарядных и двухзарядных анионов, m = 3 для трехзарядных анионов, HAEE представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по C-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu, Х – фармацевтически приемлемый анион, n = 1 для двухзарядных анионов, n = 2 для однозарядных и трехзарядных анионов, для лечения нейродегенеративных заболеваний.
24. Применение соединения по п. 23 для лечения болезни Альцгеймера.
25. Применение соединения по п. 23 для восстановления когнитивных функций, нарушенных вследствие нейродегенеративных заболеваний.
26. Применение соединения по п. 23 для восстановления когнитивных функций при воспалительных причинах нейродегенеративных заболеваний.
27. Применение соединения по п. 23 при его введении внутривенным, внутриартериальным, внутрибрюшинным, подкожным, накожным, трансдермальным, внутримышечным, интратекальным, субарахноидальным, пероральным, интраназальным, сублингвальным, буккальным, ректальным способом.
28. Применение соединения по п. 23, которое терапевтически бионеэквивалентно применению HAEE в нативной форме.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/RU2023/000210 WO2024014983A1 (ru) | 2022-07-15 | 2023-07-12 | Цинковый комплес пептида наее для лечения нейродегенеративных заболеваний |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2784319C1 true RU2784319C1 (ru) | 2022-11-23 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012056157A1 (fr) * | 2010-10-27 | 2012-05-03 | Kimonella Ventures Ltd | Compose peptidique utile pour l'inhibition de la formation de plaques amyloïdes |
RU2679080C1 (ru) * | 2018-04-17 | 2019-02-05 | Александр Олегович Морозов | Пептид и способ лечения болезни альцгеймера |
RU2709539C1 (ru) * | 2019-08-15 | 2019-12-18 | Акционерное общество "Опытно-Экспериментальный завод "ВладМиВа" | Фармацевтическая композиция на основе пептида HAEE для лечения нейродегенеративных заболеваний |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012056157A1 (fr) * | 2010-10-27 | 2012-05-03 | Kimonella Ventures Ltd | Compose peptidique utile pour l'inhibition de la formation de plaques amyloïdes |
RU2679080C1 (ru) * | 2018-04-17 | 2019-02-05 | Александр Олегович Морозов | Пептид и способ лечения болезни альцгеймера |
RU2709539C1 (ru) * | 2019-08-15 | 2019-12-18 | Акционерное общество "Опытно-Экспериментальный завод "ВладМиВа" | Фармацевтическая композиция на основе пептида HAEE для лечения нейродегенеративных заболеваний |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
TSVETKOV P. O. et al. Peripherally Applied Synthetic Tetrapeptides HAEE and RADD Slow Down the Development of Cerebral β-Amyloidosis in AβPP/PS1 Transgenic Mice, Journal of Alzheimer's Disease, 2015, v. 46, no. 4, p. 849-853. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9790262B2 (en) | Compositions comprising glucagon analogs and methods of making and using the same | |
EP1623719B1 (en) | Treatment of alzheimer's disease and cerebral amyloid angiopathy | |
US7498308B2 (en) | Method of treating a subject suffering stroke comprising administering Glucagon-like peptide-1 analogs | |
US8946158B2 (en) | Treatments of gastrointestinal disorders | |
JP5893614B2 (ja) | アルツハイマー病および家族性認知症の治療のための化合物および方法 | |
US9675679B2 (en) | Vaccines and methods for controlling adiposity | |
JP4079775B2 (ja) | β−アミロイドペプチドの可溶性環状類似体 | |
RU2784319C1 (ru) | Цинковый комплекс пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
JP2023552824A (ja) | アルツハイマー病および関連状態を処置するためのペプチド治療薬 | |
RU2784732C1 (ru) | Медный комплекс пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
RU2785354C1 (ru) | Кальциевый комплекс пептида для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
RU2784746C1 (ru) | Магниевый комплекс пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
JP5801206B2 (ja) | アルツハイマー病の治療のための化合物および方法 | |
RU2784326C1 (ru) | Натриевая соль пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
RU2784425C1 (ru) | Калиевая соль пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
RU2784249C1 (ru) | Аммониевая соль пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
WO2024014985A1 (ru) | Кальциевый комплекс пептида наее для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
WO2024014983A1 (ru) | Цинковый комплес пептида наее для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
WO2024014982A1 (ru) | Медный комплекс пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
WO2024014986A1 (ru) | Магниевый комплекс пептида наее для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
EP1481007B1 (en) | Spheron components useful in determining compounds capable of treating symptoms of alzheimer's disease, treatments and animal models produced therefrom | |
WO2024014981A1 (ru) | Натриевая соль пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
WO2024014980A1 (ru) | Калиевая соль пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
WO2024014984A1 (ru) | Аммониевая соль пептида наее для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
KR20230121823A (ko) | Glp-1/glp-2 이중 효능제의 약학적 조성물 |