RU2784326C1 - Натриевая соль пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний - Google Patents
Натриевая соль пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний Download PDFInfo
- Publication number
- RU2784326C1 RU2784326C1 RU2022119488A RU2022119488A RU2784326C1 RU 2784326 C1 RU2784326 C1 RU 2784326C1 RU 2022119488 A RU2022119488 A RU 2022119488A RU 2022119488 A RU2022119488 A RU 2022119488A RU 2784326 C1 RU2784326 C1 RU 2784326C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- haee
- peptide
- sodium salt
- sodium
- pharmaceutical composition
- Prior art date
Links
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 title claims abstract description 149
- 206010053643 Neurodegenerative disease Diseases 0.000 title claims abstract description 32
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 30
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 55
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 47
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 32
- 206010001897 Alzheimer's disease Diseases 0.000 claims description 20
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 19
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 17
- -1 monosubstituted sodium Chemical class 0.000 claims description 15
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 claims description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 claims description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 9
- FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N D-Mannitol Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N 0.000 claims description 8
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 8
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M NaHCO3 Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 8
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 8
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L sodium carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 229920003079 Povidone K 17 Polymers 0.000 claims description 7
- 238000001938 differential scanning calorimetry curve Methods 0.000 claims description 7
- 230000002757 inflammatory Effects 0.000 claims description 7
- 229960002668 sodium chloride Drugs 0.000 claims description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 7
- 229960002885 Histidine Drugs 0.000 claims description 6
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 6
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L na2so4 Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- 229940044476 Poloxamer 407 Drugs 0.000 claims description 4
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960004793 Sucrose Drugs 0.000 claims description 4
- RQPZNWPYLFFXCP-UHFFFAOYSA-L barium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ba+2] RQPZNWPYLFFXCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 229910001863 barium hydroxide Inorganic materials 0.000 claims description 4
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L disodium;2-[2-[carboxylatomethyl(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 claims description 4
- 239000001187 sodium carbonate Substances 0.000 claims description 4
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 150000003388 sodium compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 4
- 229960000281 trometamol Drugs 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 3
- 230000001771 impaired Effects 0.000 claims description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 claims description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims description 2
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 claims description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 2
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 81
- 238000010175 APPswe/PSEN1dE9 Methods 0.000 description 31
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 28
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 26
- 238000010178 5xFAD (B6SJL) Methods 0.000 description 25
- 238000010179 5xFAD (C57BL6) Methods 0.000 description 25
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 18
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 18
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 18
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 15
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 15
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 229940049954 Penicillin Drugs 0.000 description 9
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 9
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 9
- 229960000626 benzylpenicillin Drugs 0.000 description 9
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 9
- 210000001320 Hippocampus Anatomy 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 230000003542 behavioural Effects 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 7
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 6
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N sodium Chemical class [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- 210000001218 Blood-Brain Barrier Anatomy 0.000 description 5
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N formic acid Chemical compound OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001744 histochemical Effects 0.000 description 5
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 5
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N sodium cation Chemical compound [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 5
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 5
- TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L Barium sulfate Chemical compound [Ba+2].[O-]S([O-])(=O)=O TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 125000004429 atoms Chemical group 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 4
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 4
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 4
- 238000002149 energy-dispersive X-ray emission spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 4
- WSVLPVUVIUVCRA-RJMJUYIDSA-N (2R,3R,4S,5R,6S)-2-(hydroxymethyl)-6-[(2R,3S,4R,5R)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane-3,4,5-triol;hydrate Chemical compound O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O WSVLPVUVIUVCRA-RJMJUYIDSA-N 0.000 description 3
- 230000036912 Bioavailability Effects 0.000 description 3
- 210000001736 Capillaries Anatomy 0.000 description 3
- 210000001947 Dentate Gyrus Anatomy 0.000 description 3
- 229960001021 Lactose Monohydrate Drugs 0.000 description 3
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 3
- 230000035514 bioavailability Effects 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 230000002490 cerebral Effects 0.000 description 3
- 230000001149 cognitive Effects 0.000 description 3
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 3
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 3
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 3
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 3
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 3
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100001249 ALB Human genes 0.000 description 2
- 101710027066 ALB Proteins 0.000 description 2
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L Congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 2
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 2
- 238000004252 FT/ICR mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 description 2
- 101710007376 H1-1 Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710017533 His1:CG33831 Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 102100008812 PSEN1 Human genes 0.000 description 2
- 206010061536 Parkinson's disease Diseases 0.000 description 2
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015296 acetylcholine-gated cation-selective channel activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040006409 acetylcholine-gated cation-selective channel activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 2
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000011068 load Methods 0.000 description 2
- 239000004579 marble Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 230000000626 neurodegenerative Effects 0.000 description 2
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000036231 pharmacokinetics Effects 0.000 description 2
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 230000035489 relative bioavailability Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108060000460 APP Proteins 0.000 description 1
- 102100017796 APP Human genes 0.000 description 1
- 206010002022 Amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 206010002023 Amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010057668 Cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 229910002476 CuII Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 230000036947 Dissociation constant Effects 0.000 description 1
- 229940049906 Glutamate Drugs 0.000 description 1
- 230000036499 Half live Effects 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006822 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000896769 Multiple sclerosis associated retrovirus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 210000004897 N-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000012412 Presenilin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010036933 Presenilin-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 208000007400 Relapsing-Remitting Multiple Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000004001 Thalamic Nuclei Anatomy 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000010405 anode material Substances 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 238000011087 biopharmaceutical technology Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 238000009933 burial Methods 0.000 description 1
- 229910000099 calcium monohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N chloroform;ethanol Chemical compound CCO.ClC(Cl)Cl UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000003930 cognitive ability Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 230000036545 exercise Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000000971 hippocampal Effects 0.000 description 1
- 125000003372 histidine group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxyl anion Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesions Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 1
- 201000009457 movement disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000003959 neuroinflammation Effects 0.000 description 1
- 230000002314 neuroinflammatory Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neurons Anatomy 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N o-xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral Effects 0.000 description 1
- 230000000275 pharmacokinetic Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 125000003616 serine group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002411 thermogravimetry Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 230000001052 transient Effects 0.000 description 1
- 201000004810 vascular dementia Diseases 0.000 description 1
- 235000020799 vitamin D status Nutrition 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к однозамещенной или двузамещенной натриевой соли пептида HAEE, где HAEE представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по C-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu. Настоящее изобретение также относится к способу получения натриевых солей пептида HAEE (варианты), к фармацевтическим композициям на основе натриевых солей пептида HAEE и применению натриевых солей пептида HAEE для лечения нейродегенеративных заболеваний. 5 н. и 31 з.п. ф-лы, 11 ил., 4 табл., 7 пр.
Description
Изобретение относится к однозамещенной или двузамещенной натриевой соли пептида HAEE, где HAEE представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по C-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu. Настоящее изобретение также относится к способу получения натриевых солей пептида HAEE (варианты), к фармацевтическим композициям на основе натриевых солей пептида HAEE и применению натриевых солей пептида HAEE для лечения нейродегенеративных заболеваний.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Нейродегенеративные заболевания имеют ряд общих факторов развития и целый ряд других обобщающих механизмов (Litvinenko I.V., Krasakov I.V., Bisaga G.N. et al. Modern conception of the pathogenesis of neurodegenerative diseases and therapeutic strategy. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2017; 117(6-2):3-10. (In Russ.). doi: 10.17116/jnevro2017117623-10), что может связывать болезнь Альцгеймера (БА), сосудистую деменцию, нейродегенерацию при рассеянном склерозе (РС), болезнь Паркинсона, а также болезнь Альцгеймера в условиях активации системного воспаления (Williams-Gray C.H., Wijeyekoon R., Yarnall A.J. et al. ICICLE-PD study group.Serum immune markers and disease progression in an incident Parkinson’s disease cohort (ICICLE-PD). Movement Disorders. 2016;31(7):995-1003. https://doi.org/10.1002/mds.26563). Воспаление относится к типовым патологическим процессам организма человека. Типовой патологический процесс проявляется определенным набором характерных признаков. В настоящее время считается, что нейродегенеративный процесс является вторичным по отношению к воспалительному (Mostafa A., Jalilvand S., Shoja Z. Et al. Multiple sclerosis-associated retrovirus, Epstein-barr virus, and vitamin D status in patients with relapsing remitting multiple sclerosis. Journal of Medical Virology. 2017. doi: 10.1002/jmv.24774; Litvinenko I.V., Krasakov I.V., Bisaga G.N. et al. Modern conception of the pathogenesis of neurodegenerative diseases and therapeutic strategy. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2017;117(6-2):3-10. (In Russ.). doi: 10.17116/jnevro2017117623-10).
Болезнь Альцгеймера является одним из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний среди людей пожилого возраста и характеризуется нейритными бляшками, основным компонентом которых является пептид бета-амилоид (Аβ). N-концевая область 1-16 бета-амилоида является металл-связывающим доменом, где цинк (Zn) и медь (Cu) присоединяются к пептиду Аβ (Guilloreau L., Damian L., Coppel Y., et al. (2006). Structural and thermodynamical properties of CuII amyloid-β16/28 complexes associated with Alzheimer’s disease. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry, 11(8), 1024-1038, doi: 10.1007/s00775-006-0154-1). Снижение уровня ионов цинка в крови за счет связывания ионов цинка специфическими хелатирующими агентами и/или блокирование взаимодействий пептида Аβ с ионами цинка может предотвратить патологии, связанные с этими взаимодействиями (Ayton S., Lei P., Bush A. Biometals and Their Therapeutic Implications in Alzheimer’s Disease. Neurotherapeutics. 2015. 12(1): p.109-120). Высокие концентрации цинка вызывают преципитацию пептида Аβ и влияют на образование в специфических отделах мозга (гиппокамп, кортекс, таламические ядра) внеклеточных агрегатов Аβ (амилоидных бляшек), которые ассоциированы с развитием болезни Альцгеймера ((Frederickson C.J., Bush A.I. (2001). Synaptically released zinc: physiological functions and pathological effects. Biometals, 14(3), 353-366, doi: 10.1023/A:1012934207456). Поэтому применение цинка и других катионов в фармацевтических препаратах, которые могут взаимодействовать с таргетными мишенями в организме и лечить нейродегенеративные заболевания, в частности болезнь Альцгеймера, является нетривиальной решением.
На сегодняшний день нет действующих эффективных препаратов, которые бы излечивали нейродегенеративные заболевания. Из научной и патентной литературы известны ряд пептидов, которые могли бы применяться при лечении таких заболеваний.
Из WO 2012/056157 и патента РФ №2679080 известно соединение, представляющее собой Ac-HAEE-NH2 (далее - HAEE). В аббревиатуре НАЕЕ буквы означают: Н - гистидин, А - аланин, Е - глутаминовая кислота. НАЕЕ способно ингибировать взаимодействие пептидов Аβ с ионами Zn (II), вызывая уменьшение или предотвращение агрегации пептида Аβ в присутствии ионов Zn (II) при физиологических концентрациях ионов Zn (II) 100-400 мкМ. Более высокие концентрации ионов Zn (II), порядка 1 ммоль (мМ), подавляют взаимодействия между НАЕЕ и 1-16 областью Aβ. Было показано, что инкубация агрегатов Аβ с HAEE в течение минимум 1 часа при 20, 40, 80, 100 и 150 мкМ HAEE приводит к дезагрегации таких агрегатов.
Из патента РФ №2679059 известно, что несмотря на ингибирование образования амилоидных бляшек, влияние известных препаратов, в частности НАЕЕ, на улучшение когнитивных функций при болезни Альцгеймера в среднем является очень ограниченным и существует необходимость получения альтернативных эффективных средств для лечения болезни Альцгеймера, в том числе за счет снижения или предотвращения связывания ионов Zn(II) с пептидом Аβ. В качестве альтернативного средства для лечения болезни Альцгеймера было предложено использовать пептид с аминокислотной последовательностью (в стандартных однобуквенных кодах) H[isoD][pS]GYEVHH (где isoD обозначает изомеризованный остаток аспарагиновой кислоты, а pS относится к фосфорилированному остатку серина) с открытыми или защищенными концами основной полипептидной цепи.
Из патента РФ №2709539 известно, что короткие заряженные пептиды типа HAEE имеют очень короткое время жизни в плазме крови (от нескольких секунд до нескольких минут) и с трудом проходят через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), что существенно ослабляет эффективность их терапевтического воздействия. С целью преодоления этих недостатков авторы патента РФ №2709539 разработали фармацевтическую композицию для доставки HAEE через ГЭБ для лечения нейродегенеративных заболеваний, включая деменцию Альцгеймеровского типа (болезнь Альцгеймера), которая позволяет улучшить фармакокинетические характеристики и увеличить биодоступность HAEE.
Данная композиция содержит эффективное количество субстанции в виде комплекса HAEE с цинком и человеческим сывороточным альбумином (HAEE-Zn-HSA) в форме раствора для введения с фармацевтически приемлемым носителем, выбранным из круга нейтральных носителей и разбавителей, например, в физиологическом растворе. Полученная фармацевтическая композиция позволяет увеличить в пять раз биодоступность субстанции в мозге, увеличить время полувыведения из организма в два раза; улучшить когнитивные функции экспериментальных животных на 20%. Из патента РФ №2709539 известно, что фармацевтическая композиция HAEE-Zn-HSA является стабильной в подходящей водной буферной системе, в диапазоне значений pH от 4 до 8, в присутствии или в отсутствии различных солей.
Однако известно, что заряд альбумина в нейтральной среде равен -1, в щелочной среде равен -2, а в слабокислой среде равен 0 (изоэлектрическое состояние) и альбумин выпадает в осадок (Биохимия с упражнениями и задачами. Под ред. А.И. Глухова, Е.С.Северина. ГЭОТАР-Медиа, Москва. 2019. С.19), поэтому данный комплекс не должен существовать в слабокислой среде при pH 4-5,5.
Прототипом изобретения был выбран источник WO 2012/056157, в котором описывается пептид с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu, ацетилированный по N-концу и амидированный по C-концу (НАЕЕ). Фармацевтически приемлемые соли для НАЕЕ не были ранее получены и охарактеризованы, а их свойства в твердой фазе неизвестны.
Получение фармацевтически приемлемых солей лекарственных веществ способствует улучшению их растворимости, биодоступности, повышению стабильности и других полезных биофармацевтических характеристик.
Таким образом, задачи, на решение которых направлено изобретение, заключаются в получении эффективного средства для лечения нейродегенеративных заболеваний в виде неизвестных ранее натриевых солей НАЕЕ, включая однозамещенную (НАЕЕ-Na) и двузамещенную (НАЕЕ-Na2) натриевые соли НАЕЕ, в том числе в твердой форме, разработке фармацевтических композиций на основе такого средства и его применении для лечения нейродегенеративных заболеваний.
В соответствии с настоящим изобретением описываются натриевые соли пептида HAEE.
В настоящем изобретении было обнаружено, что для усиления терапевтического действия пептида НАЕЕ для лечения нейроденегеративных заболеваний полезно использовать натриевые соли НАЕЕ. Использование натриевых солей пептида НАЕЕ для лечения нейродегенеративных заболеваний изменяет механизм действия пептида НАЕЕ, связанный с конформационной структурой пептида HAEE, что приводит к неожиданно высокому терапевтическому эффекту.
Это подтверждается экспериментальным введением нативного пептида НАЕЕ и натриевых солей пептида HAEE в организм экспериментальных животных. Было обнаружено, что 3D-структура нативного пептида НАЕЕ, который в виде водного раствора был введен в плазму крови мышей дикого типа, отличается от 3D-структуры нативного HAEE в исходном водном растворе, что подтверждается методом ВЭЖХ по изменению времени выхода с хроматографической колонки пробы HAEE, экстрагированной из плазмы крови, относительно времени выхода пробы HAEE, экстрагированной из исходного водного раствора. В то же время 3D-структура HAEE в форме натриевых солей оставалась неизменной в аналогичных экспериментальных условиях (то есть после экстрагирования из исходного водного раствора натриевой соли пептида HAEE и после экстрагирования из плазмы крови мышей дикого типа после 2-х минутной экспозиции) и соответствовала 3D-структуре нативного пептида HAEE, экстрагированного из исходного водного раствора. По данным масс-спектрометрии химическая структура пептида HAEE во всех экспериментальных пробах сохранялась неизменной как для нативного пептида, так и для пептида в составе натриевой соли. Изменение времени выхода нативного пептида HAEE или натриевой соли пептида HAEE с хроматографической колонки связано в основном с различиями в гидрофобных взаимодействиях пептида HAEE с материалом колонки, а эти взаимодействия в свою очередь определяются превалирующей 3D-структурой пептида HAEE в конкретной пробе. Таким образом, из полученных экспериментальных данных следует, что 3D-структура пептида HAEE, которая соответствует «развернутой» конформации пептида и является превалирующей для нативного пептида HAEE в исходном водном растворе, соответствует 3D-структуре натриевой соли пептида HAEE в водном растворе и остается неизменной в случае экспозиции натриевой соли пептида HAEE в плазме крови, в то время как нативный пептид HAEE в плазме крови утрачивает «развернутую» конформацию.
В данном случае термин 3D-структура используется как синоним пространственной структуры или взаимного расположения атомов в молекуле HAEE в трехмерном пространстве. Метод ВЭЖХ основан на преимущественно межмолекулярных взаимодействиях на границе раздела фаз. Изменение времени выхода НАЕЕ с хроматографической колонки отражает изменение межмолекулярных взаимодействий HAEE с сорбентом, что является следствием различий пространственной структуры молекул НАЕЕ в нативном состоянии и в виде натриевой соли.
Известно, что нарушение 3D-структуры олигопептидов может приводить к снижению их функций и уменьшению терапевтического действия (Sikora, K., Jaśkiewicz, M., Neubauer, D., Migoń, D., & Kamysz, W. (2020). The role of counter-ions in peptides-an overview. Pharmaceuticals, 13(12), 442.). Ранее было показано, что для оптимального взаимодействия с партнерами белковой природы пептид HAEE должен находиться в «развернутой» конформации (Barykin E. P., Garifulina A. I., Tolstova A. P., Anashkina A. A., Adzhubei A. A., Mezentsev Y. V., Shelukhina I. V., Kozin S. A., Tsetlin V. I., Makarov A. A. Tetrapeptide Ac-HAEE-NH(2) Protects α4β2 nAChR from Inhibition by Aβ // International journal of molecular sciences. - 2020. - T. 21, №17. - C. 6272; Zolotarev YA, Mitkevich VA, Shram SI, Adzhubei AA, Tolstova AP, Talibov OB, Dadayan AK, Myasoyedov NF, Makarov AA, Kozin SA. Pharmacokinetics and Molecular Modeling Indicate nAChRα4-Derived Peptide HAEE Goes through the Blood-Brain Barrier. Biomolecules. 2021 Jun 18;11(6):909). В нативном пептиде HAEE имидазольная группа аминокислотного остатка гистидина может образовывать стабильные полярные связи с карбоксильными группами боковых цепей аминокислотных остатков глутаминовой кислоты, что не способствует поддержанию биологически значимой «развернутой» конформации данного пептида и, как следствие, снижает полезные терапевтические эффекты HAEE.
Таким образом, одним из преимуществ данного изобретения является повышение терапевтической эффективности пептида НАЕЕ в форме натриевой соли НАЕЕ вследствие сохранения 3D-структуры данной соли в «развернутой» конформации.
Изобретение также имеет отношение к применению натриевой соли пептида HAEE для лечения нейродегенеративных заболеваний, а также патологий, сопровождающихся нейровоспалительными процессами. Натриевая соль пептида HAEE может эффективно влиять на нейродегенеративные заболевания, в частности, вызванные воспалительными причинами, восстанавливая нарушенные когнитивные функции.
Натриевая соль пептида HAEE может быть использован как в твердой, так и в жидкой форме, сохраняя свою стабильность в течение по меньшей мере 2 лет.
Техническим результатом изобретения является:
- возможность использования натриевой соли пептида HAEE при лечении нейродегенеративных заболеваний, в частности вызванных опосредованно воспалительными причинами, которое приводит к эффективному восстановлению когнитивных функций;
- повышенная стабильность натриевой соли пептида HAEE по сравнению с НАЕЕ;
- устойчивость «развернутой» конформации 3D молекулы НАЕЕ после растворения натриевой соли HAEE в плазме крови по сравнению с НАЕЕ.
Заявляемые в настоящем изобретении натриевые соли пептида НАЕЕ в соответствии с используемым способом получения могут быть получены в аморфной форме, что подтверждается рентгенофазовым анализом (Фиг.1, 2).
Натриевые соли пептида НАЕЕ характеризуется кривой дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) с термогравиометрией (ТГ) (ДСК-ТГА). Молекула НАЕЕ на ДСК-кривой характеризуется широким пиком с началом при 62°С и максимумом при 89°С; двойным пиком плавления при температуре 203 и 227,5°С с началом при 188 °С (Фиг.3). Погрешность при многократном измерении оценивается в ±3°С.
HAEE-Na на ДСК-кривой характеризуется тремя эндотермическими максимумами: первый широкий эндотермический пик начинается от 60°С и имеет максимум при 90°С; второй начинается при 174°С с максимумом при 196°С, третий пик начинается с 204°С с максимумом при 238°С.(Фиг.4).
HAEE-Na2 на ДСК-кривой характеризуется четырьмя эндотермическими пиками. Первый имеет начало при 60°С с максимумом при 97°С, второй слабовыраженный пик начинается от 155°C с максимумом при 164°C, третий пик начинается от 220°C с максимумом при 243°C и четвертый максимум плавления наблюдается при 251,5°C (Фиг.5).
ДСК-кривые показывают, что термическое поведение натриевых солей пептида НАЕЕ (Фиг.4, 5) отличается от поведения НАЕЕ (Фиг.3), температура плавления натриевых солей выше по сравнению с температурой плавления НАЕЕ, что обеспечивает более высокую стабильность, что подтверждается результатами теста ускоренного хранения.
ИК-спектр с Фурье преобразованием натриевых солей пептида НАЕЕ представлен на Фиг.6, 7. ИК-спектры натриевых солей повторяет все основные линии ИК-спектра НАЕЕ.
В ИК-спектре HAEE-Na наблюдается новый максимум при 2980 см-1 (соли аминов RNH3 +) (Фиг.5), произошло смещение и уширение пика 1530 в область 1550 см-1 (плоские деформационные колебания -NH2). Произошло изменение интенсивностей пиков при 1250 и 1310 см-1 (С-N). Появился новый максимум при 985 см-1 (Фиг.6, 7).
Отличие ИК-спектра HAEE-Na2 от HAAE заключается в смещении максимумов при 1645 см-1 в область 1625 см-1 (плоские деформационные колебания -NH2 или С=О или [δ(N-H)]), наблюдаются слабые изменения максимумов в области 1260-1330 см-1 (С-N), произошли изменения слабых максимумов при 750-885 см-1 (неплоские деформационные колебания -NH2), присутствует небольшое смещение максимума при 3045 см-1 в область 3075 см-1 (валентные колебания в -NH3 +) (Фиг.6, 7).
Таким образом в ИК-спектре натриевых солей пептида НАЕЕ произошли изменения колебаний связи в молекуле НАЕЕ, преимущественно аминогрупп, что связано с образованием солей натрия.
Способ получения натриевых солей пептида НАЕЕ заключается в смешивании при комнатной температуре водных растворов HAEE и водного раствора соединения натрия в стехиометрических соотношениях, перемешивании в течение 5-30 мин и высушивании раствора.
Для получения HAEE-Na стехиометрическое соотношение компонентов НАЕЕ:Na должно быть 1:1 по молям. Для получения HAEE-Na2 стехиометрическое соотношение компонентов НАЕЕ:Na должно быть 1:2 по молям.
Во время перемешивания допускается нагревание до 50°C.
Высушивание выполняется стандартными методами органический химии, преимущественно под вакуумом. Температура сушки не должна превышать 50°C. Натриевые соли пептида НАЕЕ могут быть получены в виде лиофилизата методом стандартной сублимационной лиофильной сушки. Для лиофильного высушивания раствор предварительно замораживается.
В заявляемом способе получения соединениями натрия являются гидроксид, гидрокарбонат или карбонат натрия.
Вариант способа получения натриевых солей пептида НАЕЕ заключается в смешивании при комнатной температуре водных растворов HAEE и водного раствора сульфата натрия в стехиометрических соотношениях, перемешивании в течение 5-10 мин, добавлении стехиометрических количеств водного раствора гидроксида бария для осаждения сульфат-аниона, перемешивании в течение 10-30 мин, удаление осадка сульфата бария и высушивании раствора.
Для получения HAEE-Na стехиометрическое соотношение компонентов НАЕЕ:Na должно быть 1:1 по молям. Для получения HAEE-Na2 стехиометрическое соотношение компонентов НАЕЕ:Na должно быть 1:2 по молям.
После добавления раствора гидроксида бария во время перемешивания допускается нагревание до 50°C.Для осаждения сульфат-аниона стехиометрическое соотношение компонентов SO4 2-:Ba2+ должно быть 1:1 по молям.
Удаление осадка сульфата бария выполняется фильтрованием или центрифугированием и декантацией супернатанта, содержащего раствор натриевой соли пептида НАЕЕ.
Высушивание выполняется стандартными методами органической химии, преимущественно под вакуумом. Температура сушки не должна превышать 50°C. Натриевые соли пептида НАЕЕ могут быть получены в виде лиофилизата методом стандартной сублимационной лиофильной сушки. Для лиофильного высушивания раствор предварительно замораживается.
При получении натриевых солей пептида НАЕЕ в зависимости от способа высушивания может оставаться остаточная влажность до 5 мас.%. При этом натриевые соли пептида НАЕЕ не набирают дополнительную воду при хранении и стабильны в течение длительного времени.
Еще одним объектом изобретения являются фармацевтические композиции с эффективным количеством натриевой соли пептида НАЕЕ и наличием вспомогательных веществ. В качестве лекарственного средства однозамещенная или двузамещенная натриевая соль пептида НАЕЕ может быть использована без вспомогательных веществ в виде лиофилизированной субстанции.
Эффективное количество натриевой соли пептида НАЕЕ зависит от типа нейродегенеративного заболевания, веса тела, способа введения, поэтому может варьироваться в широких пределах от 0,1 до 100 мг, более желательно от 5 до 50 мг.
Фармацевтическая композиция натриевой соли пептида НАЕЕ может быть в твердом виде или в виде водного раствора. Твердые композиции натриевой соли пептида НАЕЕ содержат его эффективное количество и необязательно вспомогательные вещества. Твердая фармацевтическая композиция может быть получена высушиванием раствора активного вещества и набором вспомогательных компонентов или добавлением вспомогательных веществ к порошку натриевой соли пептида НАЕЕ.
Высушенная или лиофилизированная натриевая соль пептида НАЕЕ может находиться в аморфной форме, которая соответствует дифрактограмме на Фиг.1,2.
Вспомогательные вещества выбираются из фармацевтически приемлемых добавок. Такими веществами могут быть маннитол, повидон К 17, трометамол, динатрия эдетат, натрия хлорид, сахароза, гистидин, полоксамер 407, и другие фармацевтически приемлемые добавки.
Фармацевтическая композиция натриевой соли пептида НАЕЕ в виде водного раствора содержит эффективное количество натриевой соли пептида НАЕЕ, воду, а также набор фармацевтически приемлемых добавок и солей. Такими веществами могут быть маннитол, повидон К 17, трометамол, динатрия эдетат, натрия хлорид, сахароза, гистидин, полоксамер 407, и другие фармацевтически приемлемые добавки.
Еще одним объектом изобретения является применение натриевой соли пептида НАЕЕ для лечения нейродегенеративных заболеваний, которое заключается во введении натриевой соли пептида НАЕЕ в составе описанных фармацевтических композиций пациенту в эффективном количестве. Эффективное количество натриевой соли пептида НАЕЕ зависит от типа нейродегенеративного заболевания, веса тела, способа введения, поэтому может варьироваться в широких пределах от 0,1 до 100 мг, предпочтительно от 5 до 50 мг.
Введение натриевой соли пептида НАЕЕ пациенту может осуществляться с помощью всех возможных видов наружного, энтерального, ингаляционного и парентерального способов применения (включая внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, подкожное, накожное, трансдермальное, внутримышечное, интратекальное, субарахноидальное, пероральное, интраназальное, сублингвальное, буккальное, ректальное введение). При введении натриевой соли пептида НАЕЕ в твердой форме предпочтительным способом введения является сублингвальный. При введении натриевой соли пептида HAEE в форме раствора предпочтительными способами введения являются внутривенный и интраназальный.
Возможность терапевтического лечения нейродегенеративных заболеваний была показана на примере болезни Альцгеймера, как одного из самых распространенных нейродегенеративных расстройств, смоделированной на трансгенных мышах линии APPswe/PSEN1dE9 (APP/PS1) (Jankowsky, J. L., Slunt, H. H., Ratovitski, T., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., & Borchelt, D. R. (2001). Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomolecular engineering, 17(6), 157-165, doi: 10.1016/S1389-0344(01)00067-3), которые проявляют характерные когнитивные признаки патологии. Данная модель может считаться моделью опосредованного воспалительного действия при нарушении когнитивных функций.
В настоящем изобретении натриевые соли пептида НАЕЕ вводили шестикратно внутривенно в дозе 0,05 мг/кг, после чего проводили валидный тест на когнитивные способности «Закапывание шариков» (англ. Marble Burying Test) [Santana-Santana M., Bayascas J.R., Giménez-Llort L. (2021). Sex-Dependent Signatures, Time Frames and Longitudinal Fine-Tuning of the Marble Burying Test in Normal and AD-Pathological Aging Mice. Biomedicines, 9(8), 994, doi: 10.3390/biomedicines9080994), определяя количество более чем на 2/3 закопанных шариков в процентах от общего количества шариков. Чем больше количество закопанных шариков (КЗШ), тем выше когнитивные способности у мышей.
По результатам тестирования у контрольной группы мышей дикого типа, которым вводили физиологический раствор, значение КЗШ равнялось 50,6±13,3 (%). Это значение принималось в качестве референсного. У контрольной группы трансгенных мышей линии APP/PS1, которым вводили физиологический раствор, значение КЗШ=12,6±4,2 (%), что указывает на сильное ухудшение поведенческих рефлексов трансгенных мышей линии APP/PS1 по сравнению с животными дикого типа и отражает инвалидизирующее влияние оверэкспрессии человеческого бета-амилоида, ассоциированное с нейроваоспалением и образования амилоидных бляшек, на процессы нервной деятельности. У группы трансгенных мышей линии APP/PS1, получавшей НАЕЕ, значение КЗШ составило 20,6±7,3 (%). Группа трансгенных мыши линии APP/PS1, получавшая однозамещенную и двузамещенную натриевую соль пептида HAEE показали значения КЗШ=48,4±9,9 (%) и КЗШ=55,1±10,9 (%), соответственно (Таблица 4). Эти данные свидетельствуют о том, что использование натриевой соли пептида HAEE существенно улучшает поведенческие рефлексы трансгенных мышей APP/PS1, а эффект от этого использования значительно превышает таковой, наблюдаемый для HAEE. НАЕЕ-Na2 на уровне тенденции имеет большую эффективность по сравнению с НАЕЕ-Na.
Таким образом, натриевые соли пептида НАЕ могут эффективно применяться при лечении нейродегенеративных заболеваний, в частности вызванными воспалительными осложнениями, восстанавливая когнитивные функции до нормального состояния.
Гистохимический анализ области гиппокампа головного мозга экспериментальных мышей показал, что число бляшек (ЧБ) на один срез мозга у контрольной группы диких мышей равно нулю, у контрольной группы трансгенных мышей APP/PS1 значение ЧБ оказалось равным 31,7±4,9, в группе мышей, получавших НАЕЕ, значение ЧБ составило 24,7±3,4. В группе мышей, получавших НАЕЕ-Na и НАЕЕ-Na2, значение ЧБ составило 7,9±2,7 и 7,0±2,5, соответственно.
Таким образом, результаты гистохимического анализа показали, что введение натриевых солей пептида НАЕЕ приводили к почти 4-кратному уменьшению амилоидной нагрузки в гиппокампе трансгенных мышей APP/PS1, и по этому показателю эффективность натриевых солей пептида НАЕЕ примерно в три раза выше таковой, выявленной для HAEE.
В качестве одного из механизмов действия натриевых солей пептида НАЕЕ на возможность лечения нейродегенеративных заболеваний может являться его связывание с бета-амилоидом. Были рассчитаны кинетические характеристики взаимодействия натриевых солей пептида НАЕЕ и иммобилизованного человеческого бета-амилоида, которые оказались равны kon=(1,31±0,06) × 103 M-1s-1; koff=(5,23±0,06) × 10-3 s-1; KD=(4,0±0,3) × 10-6 М для НАЕЕ-Na и значения kon=(1,25±0,06) × 103 M-1s-1; koff=(5,17±0,06) × 10-3 s-1; KD=(4,14±0,3) × 10-6 для НАЕЕ-Na2. Поскольку значение KD ≤ 10-4 М, то такое взаимодействие является биологически значимым. В отличие от натриевых солей, нативный пептид НАЕЕ не связывался с бета-амилоидом в аналогичных экспериментальных условиях.
Это различие между нативным пептидом НАЕЕ и натриевыми солями пептида НАЕЕ может влиять на фармакологические свойства, что подтвердили различающиеся тесты восстановления когнитивных функций - эффективность НАЕЕ была значительно ниже эффективности натриевых солей пептида НАЕЕ. Этот эффект можно связать с вышеупомянутыми данными ВЭЖХ-МС, которые показали изменения в 3D структуре нативного НАЕЕ после его введения в плазму крови, тогда как натриевая соль пептида HAEE до и после его введения в плазму крови имеет одно и то же время удерживания на хроматограмме ВЭЖХ и, соответственно, устойчивую 3D структуру. Это означает, что ион натрия играет защитную роль для сохранения «развернутой» конформации пептида HAEE в данных солях, что, возможно, также предотвращает взаимодействие с элементами плазмы крови, поскольку известно, что введение нативного HAEE в периферическую кровеносную систему мышей, крыс и кроликов приводит к образованию стабильных комплексов HAEE с транспортными и рецепторными белками (Zolotarev Y.A., Mitkevich V.A., Shram S.I. et al. Pharmacokinetics and Molecular Modeling Indicate nAChRα4-Derived Peptide HAEE Goes through the Blood-Brain Barrier. Biomolecules. 2021. 11(6): p.909, doi: 10.3390/biom11060909).
В совокупности можно сделать вывод о том, что натриевые соли пептида НАЕЕ имеет намного большую терапевтическую эффективность по сравнению с НАЕЕ и эти вещества между собой бионеэквивалентны, поскольку после введения натриевой соли в организм, НАЕЕ существует в растворе плазмы крови в «развернутой» конформации и имеет отличный от НАЕЕ механизм действия.
ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фиг.1. Дифрактограмма HAEE-Na.
Фиг.2. Дифрактограмма HAEE-Na2.
Фиг.3. ДСК-ТГА кривая НАЕЕ. 1 - ДСК-кривая; 2 - ТГ-кривая.
Фиг.4. ДСК-ТГА кривая HAEE-Na.
Фиг.5. ДСК-ТГА кривая HAEE-Na2.
Фиг.6. ИК-спектр c Фурье преобразованием НАЕЕ (1), НАЕЕ-Na2 (2) и НАЕЕ-Na (3).
Фиг.7. ИК-спектр c Фурье преобразованием в характеристичной области 1800-700 см-1. НАЕЕ (1), НАЕЕ-Na2 (2) и НАЕЕ-Na (3).
Фиг.8. Расположение атомов в молекуле НАЕЕ для 1Н-ЯМР-анализа.
Фиг.9. 1Н-ЯМР спектр НАЕЕ.
Фиг.10. 1Н-ЯМР спектр НАЕЕ-Na.
Фиг.11. 1Н-ЯМР спектр НАЕЕ-Na2.
Описание приборов
Порошковый рентгенофазовый анализ (РФА) выполнялся на дифрактометре Rigaku Ultima IV (Япония), напряжение на трубке - 40 кВ, ток трубки - 30 мА, материал анода трубки - Cu. Гониометр: Θ/Θ вертикального типа, образец неподвижен. Радиус гониометра - 185 мм /285 мм. Максимумы на дифрактограмме накапливались в течение 1 ч. Угол 2Θ составил от 3 до 70 градусов.
Исследование температуры плавления, термического поведения и потери массы выполняли методом дифференциальной сканирующей калориметрии и термогравиметрии (ДСК-ТГА) на приборе NETZSCH STA 449 С (Германия) в инертной атмосфере при скорости нагрева 10 град/мин.
Элементный анализ выполнен методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии с приставкой EDXA на микроскопе TESCAN MIRA3 (Чехия). Площадь измеряемого участка 0,04 мм2, количество измерений - 3.
Спектры инфракрасного излучения (ИК-спектры) получали на ИК-Фурье спектрометре Spectrum Two (Perkin Elmer, США) c приставкой диффузного отражения в диапазоне 4000-600 см-1 с разрешением 2 см-1, количество сканов - 10.
1Н-спектры ЯМР получали на ЯМР-спектрометре Bruker Avance IIIHD 500, рабочая частота 500,13 Mhz для ядер 1H.
Масс-спектрометрия высокого разрешения проводилась с использованием масс-спектрометра LTQ FT Ultra (Thermo Scientific, Германия), который сочетает в себе технологии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье и ионной ловушки. Ионизацию электрораспылением (ESI) выполняли с использованием источника Ion Max (Thermo Scientific, Германия) с металлическим капилляром для распыления. Использовались следующие параметры источника IonMax: скорость потока составляла 3 мкл/мин; температура нагретого капилляра составляла 200°C; распыляемый газ был отключен; напряжение на капилляре электрораспыления составляло+3,8 кВ в положительной моде и -2,5кВ в отрицательно моде. Идентификация молекулярных ионов проводилась с помощью специализированного программного обеспечения Qual Browser (Thermo Corp., Germany).
Взаимодействие с бета-амилоидом фиксировали биосенсором на эффекте поверхностного плазмонного резонанса (БППР) в водных буферных системах при физиологических значениях pH. БППР эксперименты были проведены на инструменте «BIAcore 3000» (GE Healthcare, США) с использованием оптического чипа CM4 в соответствии с протоколами компании-производителя. Синтетический аналог 42-членного человеческого бета-амилоида (Aβ42), на C-конце которого добавлен тетраглицилцистеиновый пептидный фрагмент (-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys), был использован в качестве лиганда.
Лиганд (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAGGGGC) иммобилизовали на поверхности оптического чипа через дисульфидную связь тиоловой группы С-концевого остатка цистеина. В качестве аналитов использовали натриевые соли НАЕЕ или HAEE.
Высушивание замороженных образцов выполнялось в пенициллиновых пузырьках на сублиматоре Heto FD 2.5 при давлении 0,1-0,2 мбар.
Тест ускоренного хранения проводили в камере Memmert HCP50 при 40°C и 75% влажности. Образцы отбирали раз в месяц в течение 6 месяцев и определяли содержание действующего вещества методом ВЭЖХ.
ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, но не ограничивается ими.
Пример 1. Получение однозамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ (HAEE-Na)
К 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10-3 М добавляли 10 мл NaOH c концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 15 мин при комнатной температуре. Полученный раствор разделили на две части по 55 мл.
Первую часть высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 7 мм рт.ст. при температуре 40°C.Получили белый порошок однозамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 87%.
Вторую часть раствора объемом 55 мл разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 5 мл и замораживали в холодильной установке при -20°C и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,015 мбар в течение 24 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 98%. Продукт представлял собой белый порошок однозамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов однозамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ показало, что независимо от способа высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг.1, 4, 6, 7, 10).
Еще одним вариантом способа получения HAEE-Na является использование гидрокарбоната натрия.
К 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10-3 М добавляли 10 мл NaHCO3 c концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 30 мин при температуре 40°C вплоть до прекращения выделения пузырьков диоксида углерода. Полученный раствор разделили на две части по 55 мл.
Первую часть высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 8 мм рт.ст. при температуре 35°C. Получили белый порошок однозамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 84%.
Вторую часть раствора объемом 55 мл разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 5 мл и замораживали в холодильной установке при -20°C и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,02 мбар в течение 36 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 97%. Продукт представлял собой белый порошок однозамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов однозамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ показало, что независимо от способа высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг.1, 4, 6, 7, 10).
Еще одним вариантом способа получения HAEE-Na является использование карбоната натрия.
К 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10-3 М добавляли 5 мл Na2CO3 c концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 25 мин при температуре 50°C вплоть до прекращения выделения пузырьков диоксида углерода. Полученный раствор разделили на две части по 50 и 55 мл.
Первую часть высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 6 мм рт.ст. при комнатной температуре. Получили белый порошок однозамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 83%.
Вторую часть раствора объемом 55 мл разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 5 мл и замораживали в холодильной установке при -20°C и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,02 мбар в течение 30 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 97%. Продукт представлял собой белый порошок однозамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов однозамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ показало, что независимо от способа высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг.1, 4, 6, 7, 10).
Еще одним вариантом способа получения HAEE-Na является использование сульфата натрия.
К 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10-3 М добавляли 5 мл Na2SO4 c концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре. После чего добавляли к получившемуся раствору добавляли 5 мл раствора Ba(ОН)2 с концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 20 мин при температуре 35°C.Полученный раствор с осадком центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 мин и декантировали надосадочную жидкость, которую высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 9 мм рт.ст. при 30°C.Получили белый порошок однозамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 82%.
В еще одном варианте осуществления изобретения к 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10-3 М добавляли 5 мл Na2SO4 c концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре. После чего к получившемуся раствору добавляли 5 мл раствора Ba(ОН)2 с концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Полученный раствор с осадком фильтровали через бумажный фильтр под вакуумом. Профильтрованный раствора разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 2 мл и замораживали в холодильной установке при -20°C и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,02 мбар в течение 32 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 91%. Продукт представлял собой белый порошок однозамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов однозамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ, полученные из сульфата натрия показало, что независимо от способа фильтрования и высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг.1, 4, 6, 7, 10).
Все полученные образцы НАЕЕ-Na характеризуются аморфной формой на дифрактограмме (Фиг.1). На ДСК кривой в отличие от НАЕЕ (Фиг.3) HAEE-Na характеризуется тремя эндотермическими максимумами: первый широкий эндотермический пик начинается от 60°C и имеет максимум при 90°C; второй начинается при 174°C с максимумом при 196°C, третий пик начинается с 204°C с максимумом при 238°C.(Фиг.4).
Методом ДСК-ТГА было показано, что натриевая соль пептида НАЕЕ может содержать остаточную влажность до 5 мас.%.
Элементный анализ (EDXA) НАЕЕ-Na показал содержание натрия в образцах 4,2±0,5 мас.%.
ИК-спектр с Фурье преобразованием НАЕЕ-Na по сравнению с НАЕЕ характеризуется новым максимум при 2980 см-1 (соли аминов RNH3 +), произошло смещение и уширение пика 1530 в область 1550 см-1 (плоские деформационные колебания -NH2). Произошло изменение интенсивностей пиков при 1250 и 1310 см-1 (С-N). Появился новый максимум при 985 см-1 (Фиг.6, 7).
Исходный образец НАЕЕ характеризовался ЯМР 1H[500.13Mhz; D2O; 298K; d, м.д.]: 1.27 (3H, d, j=7.13Hz, CH3(16)), 1.87 (5H, m, CH3(3), 1/2CH2(21),1/2CH2(33)), 1.99 (2H, sx, j=7.45Hz 1/2CH2(21),1/2CH2(33)), 2.28 (4H, m, 2CH2(22,34)), 3.13, 3,03 (2H, m, CH2(8)), 4.19 (3H, m, 3CH (15,20,29)), 4.56 (1H, t, j=6.86Hz, CH(5)), 7.19 (1H, s, CH(10)), 8.50 (1H, s, CH(12)) (Фиг.8, 9).
В НАЕЕ-Na положение химических сдвигов протонов в молекуле НАЕЕ изменялась и представлено на Фиг.10, что свидетельствует о влиянии иона натрия на молекулы НАЕЕ в растворе и, следовательно, о сохранении стерической структуры молекулы НАЕЕ как в твердом виде в виде натриевой соли, так и в растворе, что важно для фармакологических свойств. Смещение сигналов представлены в Таблица 1, значимыми были приняты сигналы отличающиеся на 0,02-0,03 м.д.
Смещение протонных сигналов от определенных групп в молекуле показывает их вклад в электростатическое взаимодействие с ионом натрия при образовании соли; чем больше взаимодействие, тем большее смещение наблюдается в 1Н-ЯМР-спектре у определенных СН-групп молекулы. Поэтому наибольшее взаимодействие наблюдается у атомов 21, 22, 33, 34 (Glu), что свидетельствует об образовании соли по карбоксильной группе глутамата.
Пример 2. Получение двузамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ (HAEE-Na2)
К 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10-3 М добавляли 10 мл NaOH c концентрацией 0,02 М и перемешивали в течение 20 мин при комнатной температуре. Полученный раствор разделили на две равные части по 55 мл.
Первую часть высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 6 мм рт.ст. при температуре 40°C.Получили белый порошок двузамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 87%.
Вторую часть раствора объемом 55 мл разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 5 мл и замораживали в холодильной установке при -20°C и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,02 мбар в течение 28 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 97%. Продукт представлял собой белый порошок двузамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов двузамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ показало, что независимо от способа высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг.2, 5, 6, 7, 11).
Еще одним вариантом способа получения HAEE-Na2 является использование гидрокарбоната натрия.
К 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10-3 М добавляли 10 мл NaHCO3 c концентрацией 0,02 М и перемешивали в течение 30 мин при температуре 40°C вплоть до прекращения выделения пузырьков диоксида углерода. Полученный раствор разделили на две равные части по 55 мл.
Первую часть высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 8 мм рт.ст. при температуре 35°C. Получили белый порошок двузамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 84%.
Вторую часть раствора объемом 55 мл разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 5 мл и замораживали в холодильной установке при -20°C и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,02 мбар в течение 34 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 98%. Продукт представлял собой белый порошок двузамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов двузамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ показало, что независимо от способа высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг.2, 5, 6, 7, 11).
Еще одним вариантом способа получения HAEE-Na2 является использование карбоната натрия.
К 100 мл буферного раствора НАЕЕ с pH=7 и с концентрацией 10-3 М добавляли 10 мл Na2CO3 c концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 20 мин при температуре 50°C вплоть до прекращения выделения пузырьков диоксида углерода. Полученный раствор разделили на две равные части.
Первую часть высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 6 мм рт.ст. при комнатной температуре. Получили белый порошок двузамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 83%.
Вторую часть раствора объемом 55 мл разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 5 мл и замораживали в холодильной установке при -20°C и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,02 мбар в течение 30 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 97%. Продукт представлял собой белый порошок двузамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов двузамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ показало, что независимо от способа высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг.2, 5, 6, 7, 11).
Еще одним вариантом способа получения HAEE-Na2 является использование сульфата натрия.
К 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10-3 М добавляли 10 мл Na2SO4 c концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре. После чего добавляли к получившемуся раствору добавляли 5 мл раствора Ba(ОН)2 с концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 20 мин при температуре 35°C. Полученный раствор с осадком центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 мин и декантировали надосадочную жидкость, которую высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 7 мм рт.ст. при 30°C.Получили белый порошок двузамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 86%.
В еще одном варианте осуществления изобретения к 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10-3 М добавляли 10 мл Na2SO4 c концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре. После чего к получившемуся раствору добавляли 5 мл раствора Ba(ОН)2 с концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Полученный раствор с осадком фильтровали через бумажный фильтр под вакуумом. Профильтрованный раствора разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 2 мл и замораживали в холодильной установке при -20°C и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,02 мбар в течение 32 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 91%. Продукт представлял собой белый порошок двузамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов двузамещенной натриевой соли пептида НАЕЕ, полученные из сульфата натрия показало, что независимо от способа фильтрования и высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг.2, 5, 6, 7, 11).
Все полученные образцы НАЕЕ-Na2 характеризуются аморфной формой на дифрактограмме (Фиг.2). На ДСК кривой в отличие от НАЕЕ (Фиг.3) HAEE-Na2 характеризуется четырьмя эндотермическими пиками. Первый имеет начало при 60°C с максимумом при 97°C, второй слабовыраженный пик начинается от 155°C с максимумом при 164°C, третий пик начинается от 220°C с максимумом при 243°C и четвертый максимум плавления наблюдается при 251,5°C (Фиг.5).
Методом ДСК-ТГА было показано, что двузамещенная натриевая соль пептида НАЕЕ может содержать остаточную влажность до 5 мас.%.
Элементный анализ (EDXA) НАЕЕ-Na2 показал содержание натрия в образцах 8,1±0,5% масс.
ИК-спектр с Фурье преобразованием НАЕЕ-Na2 по сравнению с НАЕЕ характеризуется смещением максимумов при 1645 см-1 в область 1625 см-1, наблюдаются слабые изменения максимумов в области 1260-1330 см-1, произошли изменения слабых максимумов при 750-885 см-1, присутствует небольшое смещение максимума при 3045 см-1 в область 3075 см-1 (Фиг.6, 7).
В НАЕЕ-Na2 положение химических сдвигов протонов в молекуле НАЕЕ изменялась и представлено на Фиг.10, что свидетельствует о влиянии иона натрия на молекулы НАЕЕ в растворе и, следовательно, о сохранении стерической структуры молекулы НАЕЕ как в твердом виде в виде натриевой соли, так и в растворе, что важно для фармакологических свойств. Смещение сигналов представлены в Таблице 1, значимыми были приняты сигналы отличающиеся на 0,02-0,03 м.д.
Смещение протонных сигналов от определенных групп в молекуле показывает их вклад в электростатическое взаимодействие с ионом натрия при образовании соли; чем больше взаимодействие, тем большее смещение наблюдается в 1Н-ЯМР-спектре у определенных СН-групп молекулы. Поэтому взаимодействие наблюдается у атомов 21, 22, 33, 34 (Glu), что свидетельствует об образовании соли по карбоксильной группе глутамина. В отличие от НАЕЕ-Na в НАЕЕ-Na2 во взаимодействие включается имидазольная группа гистидинового фрагмента, что видно по смещению сигналов у протонов 8, 10, 12 (His1).
Пример 3. ВЭЖХ и масс-спектрометрия натриевых солей пептида НАЕЕ
Характеризация натриевых солей в водном растворе проводилась методом масс-спектрометрии высокого разрешения с использованием технологии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье путем измерения точной массы характерных молекулярных ионов как при положительной, так и при отрицательной модах ионизации. Для проведения измерений образцы натриевых солей пептида НАЕЕ в водном растворе c концентрацией 20 мкМ вносили в смесь воды и ацетонитрила в соотношении 1:1 с добавлением муравьиной кислоты (для достижения финальной концентрации 0,1%). Масс-спектрометрический анализ водного раствора натриевых солей, проведенный при положительной моде электроспрейного ионизационного источника, показал наличие молекулярного иона [HAEE+H] с моноизотопной массой 526,2327 m/z и молекулярного иона [HAEE+Na] с моноизотопной массой 548,2141 m/z. При использовании отрицательной моды электроспрейного ионизационного источника для анализа натриевых солей пептида НАЕЕ в водном растворе были идентифицированы молекулярный ион [HAEE-H] с моноизотопной массой 524,2195 m/z и молекулярный ион [HAEE+Na-2H] с моноизотопной массой 546,2016 m/z.
Сравнительный анализ натриевых солей пептида НАЕЕ и нативного пептида НАЕЕ методом ВЭЖХ-МС (2,5 нг/мл, 0,5% FA - муравьиная кислота, 50% МеОН (1:1)) показал, что в водных растворах in vitro при физиологических значениях pH хроматографическая подвижность НАЕЕ-Na и НАЕЕ-Na2 практически идентична таковой для HAEE в тех же хроматографических условиях. Время выхода хроматографического пика с колонки для НАЕЕ-Na составляло 2,83 мин, для НАЕЕ-Na2 - 2,84 мин, для НАЕЕ - 2,85 мин. С учетом известных из литературы данных молекулярного моделирования (Barykin E.P., Garifulina A.I., Tolstova A.P. et al. (2020). Tetrapeptide Ac-HAEE-NH2 Protects α4β2 nAChR from Inhibition by Aβ. International journal of molecular sciences, 21(17), 6272, doi: 10.3390/ijms21176272), вышеприведенные результаты указывают на то, что пространственные структуры основной пептидной цепи натриевой соли пептида HAEE и пептида HAEE в условиях in vitro идентичны и характеризуется «развернутой» конформацией.
После введения натриевых солей пептида НАЕЕ внутривенно в организм здоровых мышей (n=5) с последующим забором крови у животных и экстракцией из забранных образцов крови фракции, содержащей HAEE, было найдено, что время выхода HAEE на хроматограммах проб, приготовленных из образцов крови животных, которым вводили НАЕЕ-Na или НАЕЕ-Na2, не изменялось и составляло 2,83 мин и 2,84 мин, соответственно. Однако, неожиданно было обнаружено, что время выхода основного пика HAEE на хроматограмме пробы, приготовленной из образцов крови животных, которым вводили пептид HAEE, стало 1,27 мин и только около 8% HAEE выходило в хроматографическом пике на времени 2,85 мин.
Полученные данные свидетельствует о том, что в образцах крови конформация пептида HAEE резко отличается от конформации, наблюдаемой при тех же условиях для натриевой соли. Лишь 8% НАЕЕ находится в «развернутой» конформации после его взаимодействия с элементами плазмы крови. Таким образом, в образцах крови натриевая соль пептида HAEE сохраняет свою конформацию (предположительно, «развернутую») неизменной, в то время как HAEE приобретает иную конформацию, которая характеризуется гораздо более компактной структурой, предположительно, «спиральной». Это означает, что молекула НАЕЕ в форме натриевой соли устойчива к изменению конформации в плазме крови. Согласно настоящему изобретению, для достижения терапевтического эффекта от натриевых солей пептида HAEE, так и от HAEE требуется их введение в организм и присутствие в плазме крови, поэтому принципиальные различия в пространственной структуре этих молекул в плазме крови, исходя из общих представлений биохимии и физиологии, свидетельствуют о различном молекулярном механизме действия натриевой соли пептида НАЕЕ и нативного HAEE, что исключает их биоэквивалентность.
Пример 4. Стабильность натриевых солей пептида НАЕЕ
Была определена стабильность натриевых солей пептида НАЕЕ в тесте ускоренного хранения в течение 6 месяцев, что соответствует 2 годам хранения в обычных условиях (Таблица 2). Натриевые соли пептида НАЕЕ сохранили свой цвет, консистенцию, не набирали воды (масса образца не увеличивалась в пределах 1-2%) и не теряли активное вещество. Образец НАЕЕ с течением времени набирал воду (до 7 мас.%) и по данным ВЭЖХ деградировал до 67,4% активного вещества за 6 мес. Таким образом, стабильность натриевых солей пептида НАЕЕ оказалась значительно выше по сравнению с НАЕЕ.
Пример 5. Фармацевтические композиции на основе натриевых солей пептида НАЕЕ
Фармацевтические композиции на основе натриевых солей пептида HAEE могут содержать активное вещество в эффективном количестве (Таблица 3). Указанные композиции получены отдельно для каждой из однозамещенной и двузамещенной натриевых солей пептида НАЕЕ. Состав дозы рассчитывается индивидуально и может варьироваться от 0,1 мг до 100 мг на человека в сутки, более предпочтительно от 1 до 50 мг.
Составы фармацевтических композиций представлены в Таблице 3. Пересчет выполнен на дозировку активного вещества. Возможны и другие соотношения активного вещества в фармацевтической композиции в диапазоне от 0,1 до 100 мг. Масса таблеток варьируется от 100 до 400 мг, таблетки могут быть покрыты оболочкой.
Пример 6. Влияние натриевых солей пептида HAEE на поведенческие функции и степень тяжести церебрального амилоидоза у экспериментальных животных
Для моделирования нейродегенеративного заболевания была выбрана модель болезни Альцгеймера, являющейся основным по распространенности нейродегенеративным заболеванием у людей пожилого возраста.
Для проведения экспериментов были использованы самцы трансгенных мышей линии APPswe/PSEN1dE9. Мыши данной линии также известны под названием APP/PS1. У мышей APP/PS1, начиная с 4-6-месячного возраста, проявляются характерные когнитивные признаки патологии, подобной болезни Альцгеймера, и имеется значительное количество конгофильных амилоидных бляшек в специфических отделах мозга, включая гиппокамп и кортекс (Borchelt D.R., Ratovitski T., Van Lare J., et al. (1997). Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron, 19(4), 939-945, doi: 10.1016/S0896-6273(00)80974-5).
Для тестирования были использованы 8-месячные животные, сгруппированные в следующие экспериментальные группы (n=12 в каждой группе):
1. контроль 1. Мыши дикого типа, которым внутривенно вводили физиологический раствор;
2. контроль 2. Трансгенные мыши APP/PS1, которым внутривенно вводили физиологический раствор;
3. трансгенные мыши APP/PS1, которым внутривенно вводили HAEE;
4. трансгенные мыши APP/PS1, которым внутривенно вводили HAEE-Na;
5. трансгенные мыши APP/PS1, которым внутривенно вводили HAEE-Na2.
Препараты HAEE и натриевые соли пептида НАЕЕ вводили в ретроорбитальное венозное сплетение в соответствии с известной процедурой (Yardeni T., Eckhaus M., Morris H.D. et al. (2011). Retro-orbital injections in mice. Lab animal, 40(5), 155-160, doi: 10.1038/laban0511-155). Инъекции в дозе 0,05 мг/кг проводили ежемесячно, в возрасте от 2 до 7 месяцев (включительно), всего было сделано 6 инъекций препаратами HAEE и натриевых солей пептида НАЕЕ.
В возрасте 8 месяцев проводили тестирование поведенческих функций, затем животные подвергались эвтаназии с последующим забором мозга и гистохимическим анализом числа конгофильных бляшек в областях СА1, СА2, СА3 и зубчатой извилине гиппокампа согласно известной процедуре (Kozin S.A., Barykin E.P., Telegin G.B., et al. Intravenously Injected Amyloid-β Peptide With Isomerized Asp7 and Phosphorylated Ser8 Residues Inhibits Cerebral β-Amyloidosis in AβPP/PS1 Transgenic Mice Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in neuroscience, 2018, 12, 518-518, doi: 10.3389/fnins.2018.00518).
6.1. Анализ улучшения поведенческих функций у 8-месячных самцов трансгенных мышей APP/PS1 под действием HAEE и натриевых солей пептида НАЕЕ был проведен с помощью теста «Закапывание шариков». В качестве контроля использовались трансгенные мыши APP/PS1 и мыши дикого типа. Для проведения теста мышей помещали в клетки со свежим подстилом с размещенными на нем восемнадцатью шариками, расположенными в виде матрицы 3 × 6. Мышей оставляли в клетке на 30 минут, после чего определяли количество более чем на 2/3 закопанных шариков (КЗШ) в процентах от общего количества шариков. Поведение закапывания является признаком обсессивно-компульсивного поведения. Из-за повторяющегося и персеверативного характера закапывания такое поведение может представлять нейропсихиатрические симптомы, такие как персеверативное поведение и/или стереотипное поведение. Оба являются нейропсихиатрическими симптомами, обычно присутствующими у пациентов с болезнью Альцгеймера и другими видами деменции.
По результатам тестирования, уровень поведения контрольной группы мышей дикого типа характеризовался значением КЗШ=50,6±13,3 (%). Это значение рассматривается в качестве референсного. У контрольной группы трансгенных мышей APP/PS1 значение КЗШ=12,6±4,2 (%), что указывает на сильное ухудшение поведенческих рефлексов мышей APP/PS1 по сравнению с животными дикого типа и отражает инвалидизирующее влияние оверпродукции человеческого бета-амилоида на процессы нервной деятельности. В группе мышей, получавших HAEE, значения КЗШ составило 20,6±7,3 (%). Для групп мышей, получавших НАЕЕ-Na и НАЕЕ-Na2, значение КЗШ составило 48,4±9,9 (%) и 55,1±10,9 (%), соответственно (Таблица 4).
Эти данные свидетельствуют о том, что использование натриевых солей пептида HAEE существенно улучшает поведенческие рефлексы трансгенных мышей APP/PS1, а эффект от этого использования значительно превышает таковой, наблюдаемый для HAEE.
6.2. истохимический анализ конгофильных амилоидных бляшек в областях СА1, СА2, СА3 и зубчатой извилине гиппокампа был проведен согласно ранее описанным процедурам (Kozin S.A., Barykin E.P., Telegin G.B., et al. Intravenously Injected Amyloid-β Peptide With Isomerized Asp7 and Phosphorylated Ser8 Residues Inhibits Cerebral β-Amyloidosis in AβPP/PS1 Transgenic Mice Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in neuroscience, 2018, 12, 518-518, doi: 10.3389/fnins.2018.00518). Мозг мышей извлекали и фиксировали в 10% формалине. Процесс заливки образца в парафин проводили следующим образом: заливали 75% этанолом и оставляли на ночь, далее сменяли на 96% этанол и выдерживали 5 мин, 96% этанол - 10 мин, 100% этанол - 10 мин (две замены), этанол-хлороформ (1:1) - 30 мин, и оставляли в чистом хлороформе на ночь. Заливку парафином проводили при 60°С в течение 3 ч (три смены). Заливку тканей в парафиновые блоки осуществляли на приборе Leica EG1160. Серийные срезы головного мозга (8 мкм) вырезали с помощью микротома Leica RM2265 и помещали на предметные стекла. Для депарафинизации, гидратации и окрашивания срезов проводили следующие этапы: предметные стекла последовательно помещали в ксилол три смены (по 10 минут), 96% этанол - 5 мин, 90% этанол - 2 мин, 75% этанол - 2 мин, вода - 5 мин (три смены), раствор конго красного - 5 мин, далее добавлялся раствор гидроксида калия и вода. Для монтирования использовали среду ImMu-Mount (Thermo Scientific). Срезы, охватывающие область мозга от 0,48 до 1,92 мм относительно средней линии в латеральных стереотаксических координатах (Franklin K., Paxinos, G. (2008). The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. New York, NY: Academic Press), использовали для количественного определения конгофильных амилоидных бляшек в гиппокампе. Анализировали каждый 15-й срез, что давало 10 срезов на животное. Амилоидные бляшки идентифицировали окрашиванием конго красным и подсчитывали вручную. Для каждой группы мышей рассчитывали средние значения и стандартное отклонение количества бляшек на 1 срез. Для проверки нормальности распределения использовали критерий Шапиро-Уилка. Для попарного сравнения исследуемых групп использовали критерий Манна-Уитни. Применяемый уровень значимости составлял 99,9% (P<0,001).
У контрольной группы мышей дикого типа (группа 1) никаких амилоидных бляшек обнаружено не было (Таблица 4). Конгофильные амилоидные бляшки, визуализированные в областях СА1, СА2, СА3 и зубчатой извилине гиппокампа головного мозга трансгенных животных были сходны по локализации и распределению размеров в паренхиме головного мозга. Однако, количественная оценка амилоидных бляшек выявила существенные различия между группами. В контрольной группе 2 (трансгенные мыши APP/PS1) среднее число бляшек в областях на один срез мозга (ЧБ) составляло ЧБ=31,7±4,9. В группе 3, в которой трангсенным мышам APP/PS1 вводили HAEE, значение ЧБ оказалось равным 24,7±3,4. В группе 4, в которой трансгенным мышам APP/PS1 вводили HAEE-Na, значение ЧБ составило 7,9±2,7. В группе 5, в которой трансгенным мышам APP/PS1 вводили HAEE-Na2, значение ЧБ оказалось равным 7,0±2,5. Таким образом, результаты гистохимического анализа показали, что внутривенные инъекции натриевых солей пептида НАЕЕ приводили к почти 4-кратному уменьшению амилоидной нагрузки в гиппокампе трансгенных мышей APP/PS1, и по этому показателю эффективность натриевых солей пептида НАЕЕ примерно в три раза выше таковой, выявленной для HAEE.
Пример 7. Специфическое связывание натриевых солей пептида HAEE с человеческим бета-амилоидом (Aβ42)
Дополнительно была проведена оценка связывания натриевых солей пептида HAEE с бета-амилоидом как одного из механизмов действия данной соли при нейродегенеративных поражениях, связанных с бета-амилоидом. Образование соли между находящимся в растворе аналитом (натриевая соль пептида HAEE или нативный HAEE) и иммобилизованным 42-членным человеческим бета-амилоидом (лигандом) было исследовано с помощью БППР. По результатам таких экспериментов рассчитывали кинетические параметры взаимодействий и значение константы диссоциации (KD) взаимодействия. Если значение KD ≤ 10-4 М, то взаимодействие между натриевой солью пептида HAEE и бета-амилоидом является биологически значимым.
Взаимодействий между HAEE и лигандом обнаружено не было. Напротив, при введении натриевых солей пептида HAEE было обнаружено их взаимодействие с иммобилизованным Aβ42 при его различных концентрациях 150, 300, 500, 1000, 1500 мкМ. На основании полученных данных были рассчитаны кинетические характеристики взаимодействия натриевых солей пептида НАЕЕ и иммобилизованного человеческого бета-амилоида, которые оказались равны kon=(1,31±0,06) × 103 M-1s-1; koff=(5,23±0,06) × 10-3 s-1; KD=(4,0±0,3) × 10-6 М для НАЕЕ-Na и значения kon=(1,25±0,06) × 103 M-1s-1; koff=(5,17±0,06) × 10-3 s-1; KD=(4,14±0,3) × 10-6 для НАЕЕ-Na2.
Таким образом, на основании вышеприведенных результатов доказано образование стабильных межмолекулярных комплексов между 42-членным человеческим бета-амилоидом (Aβ42) и натриевыми солями пептида HAEE. В отличие от натриевых солей пептида HAEE, нативный пептид HAEE в идентичных экспериментальных условиях не взаимодействует с Aβ42.
Полученные в данном Примере настоящего изобретения результаты указывают на отсутствие способности HAEE связываться с Aβ42. Напротив, натриевые соли пептида HAEE способны связываться с Aβ42. Несмотря на то, что и HAEE и натриевые соли пептида HAEE при введении в кровеносную систему трансгенных мышей APP/PS1 улучшают когнитивные функции и снижают количество амилоидных бляшек у экспериментальных животных (Примеры 6.1 и 6.2 настоящего изобретения), полученные результаты свидетельствует о различных молекулярных механизмах терапевтического воздействия HAEE и натриевых солей пептида HAEE, что, в свою очередь, исключает биоэквивалентность HAEE и натриевых солей пептида HAEE при их использовании для лечения нейродегенеративных заболеваний. Поэтому можно заключить, что НАЕЕ и натриевые соли пептида HAEE небиоэквивалентны между собой.
Таблица 1. | ||||
Смещение сигналов протонов в 1Н-ЯМР-спектре натриевых солей НАЕЕ по сравнению c HAEE. | ||||
Номер СН-группы в молекуле НАЕЕ (Фиг.8) и принадлежность аминокислоте | Сигнал в молекуле НАЕЕ, м.д. (Фиг.9) | Сигнал в НАЕЕ-Na, м.д. (Фиг.10) и разница сигнала Δ, м.д. | Сигнал в НАЕЕ-Na2, м.д. (Фиг.11) и разница сигнала Δ, м.д. | |
His1 | ||||
8 | 3.03/3.13 | 3.03/3.12 Δ=0.00/0.01 |
2.91/2.97 Δ=0.12/0.16 |
|
10 | 7.19 | 7.17 Δ=0.02 |
6.89 Δ=0.30 |
|
12 | 8.50 | 8.47 Δ=0.03 |
7.70 Δ=0.80 |
|
Glu3/Glu4 | ||||
22, 34 | 2.28 | 2.19 Δ=0.09 |
2.16 Δ=0.12 |
|
Ala2 | ||||
16 | 1.27 | 1.27 Δ=0.00 |
1.23 Δ=0.04 |
|
CαH: 15(Ala) 20(Glu) 29(Glu) | 4.19 | 4.19 Δ=0.00 |
4.18 Δ=0.01 |
|
CβH2: 21(Glu), 33(Glu) | 1.99 | 1.95 Δ=0.04 |
1.94 Δ=0.05 |
|
3 (Ас) | 1.87 | 1.87 Δ=0.00 |
1.86 Δ=0.01 |
Таблица 2. | ||||||
Данные по стабильности натриевых солей пептида HAEE в тесте ускоренного хранения (40°C, 75% влажности) в течение 6 месяцев. | ||||||
Образец | Срок хранения, мес | |||||
0 | 1 | 2 | 3 | 5 | 6 | |
Содержание действующего вещества в % (метод ВЭЖХ), погрешность 1% | ||||||
НАЕЕ-Na | 100,0 | 99,1 | 99,4 | 99,7 | 100,1 | 99,3 |
НАЕЕ-Na2 | 100,0 | 99,9 | 99,2 | 99,2 | 99,3 | 99,2 |
НАЕЕ | 100,0 | 97,6 | 94,2 | 89,1 | 81,7 | 67,4 |
Таблица 3. | |||
Состав фармацевтических композиций с натриевыми солями (НАЕЕ-Na и HAEE-Na2) пептида HAEE. В/м - внутримышечное введение, в/в - внутривенное введение. 100,0 92,1 71,9 | |||
№ | Кол-во натриевой соли НАЕЕ (в пересчете на НАЕЕ), мг | Форма | Вспомогательные вещества |
0,1 | лиофилизат | - | |
0,5 | лиофилизат | - | |
1 | лиофилизат | - | |
5 | лиофилизат | - | |
10 | лиофилизат | - | |
25 | лиофилизат | - | |
50 | лиофилизат | - | |
100 | лиофилизат | - | |
0,1 | лиофилизат | маннитол - 0,1 мг повидон К 17 - 0,1 мг |
|
10 | лиофилизат | маннитол - 1 мг повидон К 17 - 1 мг |
|
50 | лиофилизат | маннитол - 10 мг повидон К 17 - 17 мг |
|
100 | лиофилизат | маннитол - 100 мг повидон К 17 - 104 мг |
|
5 | таблетка | лактозы моногидрат - 71 мг, целлюлоза микрокристаллическая - 100 мг, магния стеарат - 0,5 мг | |
10 | таблетка | лактозы моногидрат - 95 мг, целлюлоза микрокристаллическая - 140 мг, магния стеарат - 0,5 мг | |
25 | таблетка | лактозы моногидрат - 105 мг, целлюлоза микрокристаллическая - 180 мг, магния стеарат - 0,5 мг | |
0,1 | жидкая, для в/в | набор солей для поддержания осмотического давления 290-310 мОсм/л, вода до 100% |
|
0,5 | жидкая, для в/в | 0,9% - хлорид натрия 0,1 М раствор натрия гидроксида - до pH 5,0 - 7,5 вода - до 100% |
|
1 | жидкая, р-р для в/м | 0,9% - хлорид натрия 0,1 М раствор хлористоводородной кислоты -до pH 5,0-7,5 вода - до 100% |
|
5 | жидкая, р-р для в/в | Аналогично примеру 17 | |
10 | жидкая, р-р для в/м | Аналогично примеру 18 | |
25 | жидкая, р-р для в/м | Аналогично примеру 17 | |
50 | жидкая, р-р для в/м | Аналогично примеру 18 | |
100 | жидкая, р-р для в/в | Аналогично примеру 18 | |
1 | жидкая, ингаляционная | 0,9% - хлорид натрия, регулятор pH до 5,5-7 сахароза - до 5%, гистидин, полоксамер 407 - до 1% вода - до 100% |
|
5 | жидкая, интроназальная | Аналогично примеру 24 | |
10 | жидкая, р-р для в/в | Аналогично примеру 24 | |
25 | Жидкая, р-р для в/в | Аналогично примеру 24 | |
10 | жидкая ингаляционная | 0,9% - хлорид натрия, регулятор pH до 5,5-7,5 вода - до 100% |
|
100 | жидкая, интроназальная | Аналогично примеру 28 | |
1 | Жидкая, в/в или в/м | маннитол - 0,5 мг; трометамол - 12 мг; динатрия эдетат - 1 мг вода - до 100% |
Таблица 4. | |||
Влияние натриевых солей пептида HAEE на когнитивные функции у мышей в тесте «закапывание шариков» и на количество амилоидных бляшек. Применяемый уровень значимости составлял 99,9% (P<0,001). | |||
№ | Группа животных | Количество закопанных шариков более чем на 2/3 (КЗШ), % | Количество амилоидных бляшек на 1 срез мозга, гистологический анализ |
1. | Группа 1. Контроль 1. Мыши дикого типа, физиологический раствор | 50,6±13,3 | отсутствуют |
2. | Группа 2. Контроль 2. Трансгенные мыши APP/PS1, физиологический раствор | 12,6±4,2 | 31,7±4,9 |
3. | Группа 3. Трансгенные мыши APP/PS1, в/в HAEE 0,05 мг/кг | 20,6±7,3 | 24,7±3,4 |
4. | Группа 4. трансгенные мыши APP/PS1, в/в НАЕЕ-Na, 0,05 мг/кг | 48,4±9,9 | 7,9±2,7 |
5. | Группа 5. трансгенные мыши APP/PS1, в/в НАЕЕ-Na2, 0,05 мг/кг | 55,1±10,9 | 7,0±2,5 |
Claims (38)
1. Натриевая соль пептида НАЕЕ, где HAEE представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по C-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu.
2. Соль по п. 1, которая представляет собой однозамещенную натриевую соль пептида НАЕЕ.
3. Соль по п. 1, которая представляет собой двузамещенную натриевую соль пептида НАЕЕ.
4. Соль по п. 1, которая представляет собой в твердом виде аморфную фазу.
5. Соль по п. 1, которая характеризуется дифрактограммой, представленной на Фиг. 1, 2.
6. Соль по п. 1, которая характеризуется кривой дифференциальной сканирующей калориметрии, представленной на Фиг. 4, 5.
7. Соль по п. 1, которая характеризуется ИК-спектром, представленным на Фиг. 6.
8. Фармацевтическая композиция для лечения нейродегенеративных заболеваний, содержащая в качестве активного вещества натриевую соль пептида НАЕЕ, где HAEE представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по C-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu, в эффективном количестве и фармацевтически приемлемые добавки.
9. Фармацевтическая композиция по п. 8, в которой в качестве активного вещества используется однозамещенная натриевая соль пептида НАЕЕ.
10. Фармацевтическая композиция по п. 8, в которой в качестве активного вещества используется двузамещенная натриевая соль пептида НАЕЕ.
11. Фармацевтическая композиция по п. 8, которая представлена твердой или жидкой формой.
12. Фармацевтическая композиция по п. 8, в которой натриевая соль пептида НАЕЕ находится в виде аморфной формы.
13. Фармацевтическая композиция по п. 12, в которой аморфная форма натриевой соли пептида НАЕЕ характеризуется дифрактограммой, представленной на Фиг. 1, 2.
14. Фармацевтическая композиция по п. 8, в которой эффективное количество натриевой соли пептида НАЕЕ составляет от 0,1 до 100 мг.
15. Фармацевтическая композиция по п. 8, в которой эффективное количество натриевой соли пептида НАЕЕ составляет от 5 до 50 мг.
16. Фармацевтическая композиция по п. 8 для лечения болезни Альцгеймера.
17. Фармацевтическая композиция по п. 8, предназначенная для восстановления когнитивных функций, нарушенных вследствие нейродегенеративных заболеваний.
18. Фармацевтическая композиция по п. 17, применяющаяся при воспалительных причинах заболеваний.
19. Фармацевтическая композиция по п. 8, в которой вспомогательные фармацевтически приемлемые добавки представляют собой маннитол, повидон К 17, трометамол, динатрия эдетат, натрия хлорид, сахароза, гистидин, полоксамер 407.
20. Фармацевтическая композиция по п. 8, которая представляет собой лиофилизат.
21. Фармацевтическая композиция по п. 8, предназначенная для введения внутривенным, внутриартериальным, внутрибрюшинным, подкожным, накожным, трансдермальным, внутримышечным, интратекальным, субарахноидальным, пероральным, интраназальным, сублингвальным, буккальным, ректальным способом.
22. Способ получения натриевой соли пептида НАЕЕ, где HAEE представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по C-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu,
заключающийся в том, что водный или буферный раствор пептида HAEE смешивают с водным раствором соединения натрия в стехиометрических соотношениях при комнатной температуре, перемешивают и высушивают.
23. Способ получения по п. 22, в котором соединение натрия представляет собой гидроксид натрия, гидрокарбонат натрия, карбонат натрия.
24. Способ получения по п. 22, в котором перемешивание проводят в течение 5-30 мин.
25. Способ получения по п. 22, в котором при перемешивании раствор подогревают до 50°С.
26. Способ получения по п. 22, в котором высушивание проводят под вакуумом при температуре не более 50°С.
27. Способ получения натриевой соли пептида НАЕЕ, где HAEE представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по C-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu,
заключающийся в том, что водный или буферный раствор пептида HAEE смешивают с водным раствором сульфата натрия в стехиометрических соотношениях при комнатной температуре, перемешивают, добавляют стехиометрическое количество гидроксида бария, отделяют осадок и высушивают.
28. Способ получения по п. 27, в котором после добавления гидроксида бария раствор подогревают до 50°С.
29. Применение натриевой соли пептида НАЕЕ, где HAEE представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по C-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu, для лечения нейродегенеративных заболеваний.
30. Применение по п. 29, в котором в качестве активного вещества используется однозамещенная натриевая соль пептида НАЕЕ.
31. Применение по п. 29, в котором в качестве активного вещества используется двузамещенная натриевая соль пептида НАЕЕ.
32. Применение по п. 29, для лечения болезни Альцгеймера.
33. Применение по п. 29, для восстановления когнитивных функций, нарушенных вследствие нейродегенеративных заболеваний.
34. Применение по п. 29, для восстановления когнитивных функций при воспалительных причинах заболеваний.
35. Применение по п. 29 при его введении внутривенным, внутриартериальным, внутрибрюшинным, подкожным, накожным, трансдермальным, внутримышечным, интратекальным, субарахноидальным, пероральным, интраназальным, сублингвальным, буккальным, ректальным способом.
36. Применение по п. 29, которое терапевтически бионеэквивалентно применению HAEE в нативной форме.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/RU2023/000208 WO2024014981A1 (ru) | 2022-07-15 | 2023-07-12 | Натриевая соль пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2784326C1 true RU2784326C1 (ru) | 2022-11-23 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012056157A1 (fr) * | 2010-10-27 | 2012-05-03 | Kimonella Ventures Ltd | Compose peptidique utile pour l'inhibition de la formation de plaques amyloïdes |
RU2709539C1 (ru) * | 2019-08-15 | 2019-12-18 | Акционерное общество "Опытно-Экспериментальный завод "ВладМиВа" | Фармацевтическая композиция на основе пептида HAEE для лечения нейродегенеративных заболеваний |
RU2767030C1 (ru) * | 2021-05-20 | 2022-03-16 | Акционерное общество "Опытно-Экспериментальный завод "ВладМиВа" | Способ получения пептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH2 |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012056157A1 (fr) * | 2010-10-27 | 2012-05-03 | Kimonella Ventures Ltd | Compose peptidique utile pour l'inhibition de la formation de plaques amyloïdes |
RU2709539C1 (ru) * | 2019-08-15 | 2019-12-18 | Акционерное общество "Опытно-Экспериментальный завод "ВладМиВа" | Фармацевтическая композиция на основе пептида HAEE для лечения нейродегенеративных заболеваний |
RU2767030C1 (ru) * | 2021-05-20 | 2022-03-16 | Акционерное общество "Опытно-Экспериментальный завод "ВладМиВа" | Способ получения пептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH2 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Evgeny P. Barykin et al "Tetrapeptide Ac-HAEE-NH2 Protects α4β2 nAChR from Inhibition by Aβ", Int J Mol Sci. 2020 Sep; 21(17): 6272. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1623719B1 (en) | Treatment of alzheimer's disease and cerebral amyloid angiopathy | |
US20140296164A1 (en) | Compositions and methods of use for cell targeted inhibitors of the Cystic Fibrosis transmembrane regulator associated ligand | |
JP4079775B2 (ja) | β−アミロイドペプチドの可溶性環状類似体 | |
RU2784326C1 (ru) | Натриевая соль пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
RU2784425C1 (ru) | Калиевая соль пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
RU2784249C1 (ru) | Аммониевая соль пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
JP2023552824A (ja) | アルツハイマー病および関連状態を処置するためのペプチド治療薬 | |
JP5801206B2 (ja) | アルツハイマー病の治療のための化合物および方法 | |
RU2784732C1 (ru) | Медный комплекс пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
RU2784319C1 (ru) | Цинковый комплекс пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
RU2784746C1 (ru) | Магниевый комплекс пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
RU2785354C1 (ru) | Кальциевый комплекс пептида для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
WO2024014980A1 (ru) | Калиевая соль пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
WO2024014981A1 (ru) | Натриевая соль пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
US20080139456A1 (en) | Macrocyclic Sh2 Domain Binding Inhibitors | |
WO2024014985A1 (ru) | Кальциевый комплекс пептида наее для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
WO2024014982A1 (ru) | Медный комплекс пептида haee для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
WO2024014983A1 (ru) | Цинковый комплес пептида наее для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
WO2024014984A1 (ru) | Аммониевая соль пептида наее для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
EP1481007B1 (en) | Spheron components useful in determining compounds capable of treating symptoms of alzheimer's disease, treatments and animal models produced therefrom | |
WO2024014986A1 (ru) | Магниевый комплекс пептида наее для лечения нейродегенеративных заболеваний | |
JP2008509915A (ja) | Aβの効果を低減する方法およびそのための組成物 | |
JP5179198B2 (ja) | アミロイドベータ−ペプチドの凝集を低減する化合物 | |
US11771772B2 (en) | Glycemic control using intrinsic factor bound to a vitamin B12 conjugate of a glucagon-like peptide-1 receptor agonist | |
US20230364204A1 (en) | Bioactive Peptides, Compositions, Production Process, and Use of Bioactive Peptides as Anti-Tumoral Agents |