WO2024014527A1 - 魚類軟骨由来のコラーゲン含有組成物 - Google Patents

魚類軟骨由来のコラーゲン含有組成物 Download PDF

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WO2024014527A1
WO2024014527A1 PCT/JP2023/026006 JP2023026006W WO2024014527A1 WO 2024014527 A1 WO2024014527 A1 WO 2024014527A1 JP 2023026006 W JP2023026006 W JP 2023026006W WO 2024014527 A1 WO2024014527 A1 WO 2024014527A1
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collagen
type
cartilage
composition
range
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PCT/JP2023/026006
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英春 中野
正樹 鳴海
裕幸 佐々木
尚志 水田
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株式会社リナイス
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    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23LFOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17Amino acids, peptides or proteins
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56Materials from animals other than mammals
    • A61K35/60Fish, e.g. seahorses; Fish eggs
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/39Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
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    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61P19/02Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • AHUMAN NECESSITIES
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    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a technique for effectively utilizing a collagen-containing composition derived from fish cartilage.
  • Collagen is a protein that is widely distributed in animals such as mammals, birds, and fish, and functions as a major component of their extracellular matrices. It is said that it accounts for approximately 25-30% of the total protein in humans, and its molecular structure consists of three peptide chains with a molecular weight of about 100,000 gathered together to form a triple helix structure through hydrogen bonding. There is. In addition, the triple helical structural units are crosslinked at the telopeptide regions occupying the ends of the collagen molecules to form further higher-order structures such as fibrous structures and network structures. Currently, about 28 types of collagen have been confirmed in humans, and they are classified according to their functions.
  • type I collagen which is a major protein in bones, dermis, tendons, etc.
  • type II collagen has three ⁇ 1 chains forming a triple helical structure, and is localized in cartilage and the like, and has a function as a structural protein similar to type I collagen.
  • collagen types III and V coexist with type I in the skin
  • collagen type XI coexists with type II in cartilage, etc., and are thought to be auxiliary involved in the formation of collagen fibers suitable for each tissue.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 the main molecular species composition of type XI collagen is thought to be three types, ⁇ 1 chain, ⁇ 2 chain, and ⁇ 3 chain, forming a triple helical structure (Non-Patent Document 3).
  • Non-Patent Document 3 states that antibody titers against type II collagen increase in the blood of patients with rheumatoid arthritis. There is a report that preventive and therapeutic effects on rheumatoid arthritis can be expected by establishing immune tolerance through oral administration of undenatured type II collagen (Non-Patent Document 4).
  • methods for solubilizing and extracting collagen from animal tissues include heat denaturation treatment, solubilization treatment with acid/alkali, and solubilization with enzyme treatment. It degenerates randomly. Furthermore, in acid solubilization and alkali solubilization, only a small amount is eluted under normal non-denaturing conditions, resulting in poor productivity. On the other hand, it is thought that only the crosslinked structure can be partially decomposed using a digestive enzyme such as pepsin, and the triple helical structural unit can be efficiently extracted.
  • a digestive enzyme such as pepsin
  • Patent Document 1 discloses that bovine scapular cartilage is used as a raw material, impurities of the raw material are removed by a predetermined pretreatment using a high-pressure water stream, and then desorption is performed. It is described that type II collagen having antigen-antibody reactivity with the serum of rheumatoid arthritis patients was prepared by solubilizing ash and pepsin.
  • type II collagen which is the major type of cartilage-derived collagen
  • type XI which is only a minor type of cartilage collagen
  • An object of the present invention is to enable type XI collagen to be industrially produced as a material that can be effectively utilized in industry, and to provide a technology for utilizing this.
  • the present inventors used fish cartilage as an extraction raw material, solubilized collagen by acid protease treatment, and eluted it into the liquid part, and then sufficiently salted out the liquid part.
  • the present inventors have discovered that type II collagen and type XI collagen can be efficiently recovered by treatment, and have completed the present invention.
  • the present invention is a composition for cartilage protection containing a collagen-containing composition derived from fish cartilage as an active ingredient, the collagen-containing composition containing type II collagen and type XI collagen.
  • the present invention provides such a composition.
  • the present invention also provides a composition for protecting knee joints containing a collagen-containing composition derived from fish cartilage as an active ingredient, wherein the collagen-containing composition contains type II collagen and type XI collagen. , provides the composition.
  • the collagen-containing composition preferably has functionality that promotes the ability of chondrocytes to produce hyaluronic acid.
  • the collagen-containing composition has a mass ratio of type II collagen to type XI collagen of 10:1 to 1:10, and a collagen content per solid content of 30 It is preferable that the amount is adjusted to be at least % by mass.
  • the collagen-containing composition is preferably derived from salmon nasal cartilage.
  • FIG. 1 is a process chart showing one embodiment of a method for preparing a collagen-containing composition used in the present invention.
  • FIG. 3 is a process diagram showing another embodiment of the method for preparing a collagen-containing composition used in the present invention.
  • FIG. 3 is a process diagram showing another embodiment of a method for preparing a collagen-containing composition used in the present invention.
  • FIG. 2 is a manufacturing flow diagram performed in Manufacturing Example 1.
  • FIG. FIG. 5(a) is a chart showing the results of examining the solubilization rate when collagen was eluted from salmon nasal cartilage raw material by enzymatic treatment using lysopasopepsin in Test Example 1.
  • FIG. 5(b) shows the change over time in the solubilization rate. It is a chart, and FIG. 5(c) is a chart that summarizes the numerical values that are the basis of the graph.
  • 2 is a chart showing a photograph of a gel obtained when a part of the salting-out precipitate obtained in Production Example 1 was subjected to SDS-PAGE gel electrophoresis in Test Example 2.
  • 7(a) is a chart showing the results when a part of the salting-out precipitate obtained in Production Example 1 was subjected to ion chromatography analysis in Test Example 3, and FIG.
  • FIG. 7(b) is a diagram showing an enlarged photograph of fraction number 37 and fraction number 41 of the gel in the SDS-PAGE gel electrophoresis.
  • FIG. 7(c) is a diagram showing an analysis chart of an ion chromatograph.
  • 8(a) is a chart showing the results of analyzing the salting-out precipitate, 11% ammonium sulfate precipitate, and 20% ammonium sulfate precipitate obtained in Production Example 1 in Test Example 4, and FIG.
  • FIG. 8(b) shows the salting-out precipitate, 11% ammonium sulfate precipitate, and 20% ammonium sulfate precipitate.
  • 2 is a chart showing the results of determining the collagen content by measuring the hydroxyproline content of the sample using the dimethylbenzaldehyde colorimetric method and multiplying it by a conversion factor to the collagen content.
  • 3 is a chart showing the results of examining the amount of hyaluronic acid produced from rabbit chondrocytes in Test Example 5.
  • 12 is a chart showing the results of a hierarchical analysis of VAS scores excluding subjects who are 50 years old or older and have a score of 10 or less in Test Example 6.
  • 12 is a chart showing the results of a hierarchical analysis of a questionnaire on 10-time repeated motions, excluding subjects who were 50 years old or older and did not experience any discomfort during the motions in Test Example 6.
  • the collagen-containing composition used in the present invention can be prepared using fish cartilage as a collagen source.
  • fish cartilage there are no particular restrictions on the type of fish or the part of its cartilage tissue, and examples include salmon nasal cartilage (ice head), shark cartilage, ray cartilage, squid cartilage, and the like.
  • Salmon nasal cartilage (ice head) is particularly preferred because it has a high collagen content and can be obtained at low cost as it is a part that is normally discarded in the field of seafood processing. For example, when processing salmon roe or filleting, a large amount of the head of the landed salmon is discarded, so it is possible to obtain the head and extract the nasal cartilage from the head for use.
  • FIG. 1 shows one embodiment of the method for preparing the collagen-containing composition used in the present invention.
  • a collagen-containing composition containing type II collagen and type XI collagen which are cartilage-derived collagens, is obtained by using fish cartilage as an extraction raw material. That is, the method for preparing this collagen-containing composition includes a step of washing the raw material with an alkaline solvent (indicated by "S1" in FIG. 1, hereinafter also referred to as "alkaline washing step"), and a step of washing the raw material with an alkaline solvent.
  • S1 alkaline solvent
  • a step of enzymatically treating the washed product with acidic protease in a dilute acidic solvent indicated by "S2" in FIG.
  • a process of solid-liquid separation of a substance to recover a liquid part containing collagen (indicated by "S3" in FIG. 1, hereinafter also referred to as a “collagen-containing liquid part collection process"), and a step of recovering collagen by solid-liquid separation. (indicated by "S4" in FIG. 1; hereinafter also referred to as “collagen-containing liquid part neutralization step”), and neutralizing the pH of the liquid part containing collagen.
  • the neutralized product undergoes a step of salting out (indicated by "S5" in FIG. 1, hereinafter also referred to as “salting out step”).
  • the particle size of the cartilage raw material can be made uniform by subdividing it using a meat chopper using a plate with a predetermined hole size (for example, a hole size of about 1.8 to 10 mm), or using a homogenizer, Masco loader, etc. I can do it. By making the particle sizes uniform, alkaline washing and collagen elution can be performed more efficiently.
  • the particle size of the cartilage raw material may typically be, for example, in the range of 0.1 mm to 10 mm, may be in the range of 0.5 mm to 5 mm, or may be in the range of 1 mm to 3 mm.
  • the alkaline solvent used is not particularly limited, but may be an aqueous NaOH solution with a concentration range of 0.01M to 1M, an aqueous NaOH solution with a concentration range of 0.05M to 0.5M, and an aqueous NaOH solution with a concentration range of 0.1M to 0. It may also be an aqueous NaOH solution with a concentration range of .4M.
  • the above alkaline washing treatment is preferably carried out by stirring the fish cartilage raw material in an alkaline solvent for a predetermined period of time and then performing solid-liquid separation.
  • impurities such as carbohydrate-based extracellular matrix substances can be more effectively removed from the fish cartilage raw material.
  • the temperature conditions during stirring for such alkali cleaning it is preferable to control the temperature at a low temperature.
  • it may range from 0°C to 12°C, it may range from 2°C to 10°C, it may range from 4°C to 8°C.
  • the stirring time for alkali cleaning is not particularly limited, but may be, for example, in the range of 30 minutes to 48 hours, 1 hour to 36 hours, or 3 hours to 48 hours. It may be within a 24 hour range.
  • solid-liquid separation may be performed using, for example, a 60 to 100 mesh strainer, filter cloth, or centrifugation.
  • the alkaline cleaning treatment of the fish cartilage raw material with an alkaline solvent in the alkaline cleaning step is such that after stirring for a predetermined time, the alkaline solvent is removed by solid-liquid separation, and then a new alkaline solvent is added and the cleaning is repeated.
  • the process may be performed multiple times (for example, 2 to 4 times). According to this, impurities such as carbohydrate-based extracellular matrix substances can be removed even more effectively from the fish cartilage raw material.
  • a water cleaning treatment may be performed by adding water and performing solid-liquid separation after stirring for a predetermined period of time. This water washing process may also be repeated multiple times (for example, 2 to 4 times). Further, it is preferable to repeat the water washing treatment until the pH of the washing liquid becomes near neutral. According to this, it is possible to prevent the alkali used from affecting subsequent processing.
  • the washed product after the alkaline washing step is subjected to enzyme treatment with acidic protease in a dilute acidic solvent to solubilize collagen.
  • the acidic protease to be used is not particularly limited, but examples include pepsin.
  • it is non-animal pepsin derived from fungi, animal-derived materials that have the image of diseases such as mad cow disease and foot-and-mouth disease should be avoided. This is preferable because it does not need to be used.
  • non-animal pepsin derived from fungi include Rhizopus pepsin, which is an acid protease produced by Rhizopus niveus, a type of mold.
  • the dilute acidic solvent used is not particularly limited, but may be, for example, an acetic acid aqueous solution with a concentration range of 10 mM to 500 mM, an acetic acid aqueous solution with a concentration range of 250 mM to 500 mM, or an acetic acid aqueous solution with a concentration range of 400 mM to 500 mM.
  • An acetic acid aqueous solution may also be used.
  • it may be an aqueous citric acid solution with a concentration range of 10mM to 500mM, a citric acid aqueous solution with a concentration range of 250mM to 500mM, or a citric acid aqueous solution with a concentration range of 400mM to 500mM.
  • aqueous citric acid solution with a concentration range of 10mM to 500mM a citric acid aqueous solution with a concentration range of 250mM to 500mM
  • a citric acid aqueous solution with a concentration range of 400mM to 500mM it is necessary to adjust the pH to the acidic side.
  • the preferred pH conditions vary depending on the type of enzyme used and are not unconditional, but may range from pH 1 to 6, pH 2 to 5, and pH 2.5 to 5. It may be in the range of 3.5.
  • suitable conditions vary depending on the type of enzyme used and are not unconditional, but it is preferably within a range that does not denature collagen, and may be within a range of 0°C to 12°C, for example. , may be in the range of 2°C to 10°C, and may be in the range of 4°C to 8°C.
  • the treatment time for enzyme treatment is not particularly limited, but may be, for example, in the range of 30 minutes to 48 hours, 1 hour to 36 hours, or 3 hours to 24 hours. You can.
  • the amount of the enzyme added is 1/100 to 1/5 of the solid content (dry weight) of the input fish cartilage raw material, and in some cases, 1/5.
  • 50 to 1/10 of the amount, and in some cases, 1/25 to 1/15 of the Rhizopa pepsin preparation is added, and the concentration of the Rhizopa pepsin preparation contained in the dilute acidic solvent is Typically, the amount is 0.001 to 1% by weight, in some cases 0.005 to 0.1% by weight, and further in some cases 0.01 to 0.05% by weight.
  • the pH in the enzyme treatment step may be adjusted to the acidic side in advance by adding a dilute acidic solvent to the fish cartilage raw material and treating it for a predetermined time before adding the acidic protease.
  • a dilute acidic solvent is added in an amount of 1 to 50 times, in some cases 3 to 20 times, and further in some cases 5 to 10 times the amount of the cartilage raw material, and stirred for a predetermined period of time. By doing so, the pH can be adjusted to the acidic side.
  • the temperature conditions during such pH adjustment to the acidic side it is preferable to control the temperature at a low temperature.
  • it may range from 0°C to 12°C, it may range from 2°C to 10°C, it may range from 4°C to 8°C.
  • the stirring time when adjusting the pH to the acidic side is not particularly limited, but may be, for example, in the range of 30 minutes to 48 hours, 1 hour to 36 hours, 3 hours to It may be within a 24 hour range.
  • the enzyme-treated product after the enzyme treatment step is subjected to solid-liquid separation, and the liquid part containing the collagen eluted from the fish cartilage raw material is collected.
  • a centrifuge may be used for solid-liquid separation.
  • the collagen-containing liquid part neutralization step the pH of the recovered liquid part is neutralized and adjusted to near neutrality. This neutralization adjustment makes it easy to effectively recover not only type II collagen, which is the major cartilage-derived collagen, but also type XI collagen, which is a minor type, through the subsequent salting-out treatment.
  • Neutralization adjustment is not limited to this, but the recovered collagen-containing liquid part is treated with, for example, a 0.1M to 1M HCL aqueous solution or a 0.1M to 1M NaOH aqueous solution, and is treated with these acids and alkalis as appropriate. This can be done by, for example, adding while measuring the pH.
  • the pH is preferably adjusted to a range of 7.5 to 8.5, particularly preferably around pH 8.
  • the neutralized product after the collagen-containing liquid neutralization step is salted out, and type II collagen and type XI collagen are recovered as the salting-out precipitate.
  • Salting out can be carried out in a conventional manner, specifically by adding a salt such as sodium chloride in solid form or a form suitable for salting out, stirring for a predetermined period of time, and then performing solid-liquid separation. I can do it.
  • the final concentration of the salt may be, for example, in the range of 2M to 5M, 2.5M to 4.5M, or 3M to 4M. Particularly preferably, it is 4M or more, particularly around 4.4M.
  • the temperature conditions during such salting out there are no particular restrictions on the temperature conditions during such salting out, but it is preferable to control the temperature at a low temperature. For example, it may range from 0°C to 12°C, it may range from 2°C to 10°C, it may range from 4°C to 8°C.
  • the stirring time during salting out is not particularly limited, but may be, for example, in the range of 30 minutes to 48 hours, may be in the range of 1 hour to 36 hours, and may be in the range of 3 hours to 24 hours. It may be.
  • the salting-out precipitate may be collected by solid-liquid separation as described above, for example, by using a centrifuge.
  • Salts can be removed from the salting-out precipitate obtained as described above by ultrafiltration, dialysis, etc. Alternatively, this may be freeze-dried in vacuum to prepare a dried product.
  • ultrafiltration using hollow fiber modules, ceramic filters, flat membrane filters, etc.
  • desalting by filling it into a dialysis tube and immersing it in water. can be mentioned.
  • the collagen-containing composition containing type II collagen and type XI collagen obtained as above may have a collagen content of 30% by mass or more based on solid content, and may be 40% by mass or more, It may be 50% by mass or more, 60% by mass or more, 65% by mass or more, 70% by mass or more, 75% by mass or more, 80% by mass or more.
  • the content may be 85% by mass or more, may be 90% by mass or more, and may be 95% by mass or more.
  • the mass ratio of the content of type II collagen to type XI collagen may be in the range of 10:1 to 1:10, may be in the range of 8:2 to 2:8, and may be in the range of 7:3 to 2:8. It may be in the range of 3:7.
  • the collagen content can be determined by analyzing the amount of hydroxyproline by amino acid composition analysis, dimethylbenzaldehyde colorimetry, etc. after acid hydrolysis of collagen, and multiplying the result by a conversion factor to a predetermined amount of collagen.
  • hydroxyproline (Hyp) in 1000 amino acid residues is 54.3 residues
  • the content is 7.92%
  • the conversion factor from Hyp amount to collagen amount is 12.63. be.
  • FIG. 2 shows another embodiment of the method for preparing the collagen-containing composition used in the present invention.
  • a step of dissolving the above-described salted-out product containing type II collagen and type XI collagen in 0.5 M acetic acid (indicated by "S6" in FIG. 2), (indicated by "S7” in FIG. 2).
  • S6 0.5 M acetic acid
  • S7 0.5 M acetic acid
  • 0.5M acetic acid is exemplified in the figure, but for example, 0.4 to 0.6M acetic acid or 0.4 to 0.6M citric acid can be used to adjust the solution pH.
  • the concentration may be appropriately set so that the pH is in the range of 2.6 to 2.8.
  • the ammonium sulfate treatment can be carried out by a conventional method. Specifically, it can be carried out by adding ammonium sulfate in solid form or in a form suitable for salting out, followed by stirring for a predetermined period of time, and then separating it into solid and liquid. .
  • the final concentration of ammonium sulfate in the ammonium sulfate treatment (S7) is exemplified as 11 w/v% in the figure, but may be in the range of 10 w/v% to 13 w/v%, for example, 10.5 w/v% to The range may be 12.5 w/v%.
  • the temperature conditions for such ammonium sulfate treatment are not particularly limited, but may be, for example, in the range of 0°C to 12°C, may be in the range of 2°C to 10°C, and may be in the range of 4 to 8°C. It may be.
  • the stirring time during the ammonium sulfate treatment is not particularly limited, but may be, for example, in the range of 30 minutes to 48 hours, may be in the range of 1 hour to 36 hours, and may be in the range of 3 hours to 24 hours. It may be.
  • the ammonium sulfate precipitate may be collected by solid-liquid separation as described above, for example, by using a centrifuge.
  • Salts can be removed from the ammonium sulfate precipitate obtained as described above by dialysis using ultrafiltration or the like. Alternatively, this may be freeze-dried in vacuum to prepare a dried product. Salts can be removed from ammonium sulfate precipitates by physical desalination through ultrafiltration using hollow fiber modules, ceramic filters, flat membrane filters, etc., or by filling them into dialysis tubes and immersing them in water. Examples include a method to do so.
  • the collagen-containing composition enriched with type II collagen obtained as described above may have a collagen content of 30% by mass or more, 40% by mass or more, and 50% by mass based on the solid content. % or more, 60% by mass or more, 65% by mass or more, 70% by mass or more, 75% by mass or more, 80% by mass or more. It may be 85% by weight or more, it may be 90% by weight or more, it may be 95% by weight or more.
  • FIG. 3 shows another embodiment of the method for preparing the collagen-containing composition used in the present invention.
  • a step of dissolving the above-described salted-out product containing type II collagen and type XI collagen in 0.5 M acetic acid indicated by "S6” in FIG. 3
  • a step of ammonium sulfate treatment with ammonium sulfate at a predetermined second final concentration indicated by "S9" in FIG. 3).
  • a type XI collagen-containing composition enriched with type XI collagen as the ammonium sulfate precipitate is obtained.
  • the acid solvent in the dissolution treatment (S6) 0.5M acetic acid is exemplified in the figure, but for example, 0.4 to 0.6M acetic acid or 0.4 to 0.6M citric acid, etc.
  • the concentration may be appropriately set so that the pH of the solution is in the range of 2.6 to 2.8.
  • the ammonium sulfate treatment can be carried out by a conventional method.
  • the first final concentration of ammonium sulfate in the ammonium sulfate treatment (S7) may be, for example, in the range of 10 w/v% to 13 w/v%, and in the range of 10.5 w/v% to 12.5 w/v%. There may be. Particularly preferably, it is around 11 w/v%.
  • the second final concentration of ammonium sulfate in the ammonium sulfate treatment may be, for example, in the range of 18 w/v% to 22 w/v%, or may be in the range of 19 w/v% to 21 w/v%. Particularly preferably, it is around 20 w/v%.
  • the temperature conditions for such ammonium sulfate treatment are not particularly limited, but may range from 0°C to 20°C, for example from 2°C to 15°C, and from 4°C to 10°C. It may be a range.
  • the stirring time during the ammonium sulfate treatment is not particularly limited, but may be, for example, in the range of 30 minutes to 48 hours, may be in the range of 1 hour to 36 hours, and may be in the range of 3 hours to 24 hours. It may be.
  • the supernatant and precipitate after the ammonium sulfate treatment may be collected by solid-liquid separation as described above, for example, by using a centrifuge.
  • Salts can be removed from the ammonium sulfate precipitate obtained as described above by dialysis using ultrafiltration or the like. Alternatively, this may be freeze-dried in vacuum to prepare a dried product. Salts can be removed from ammonium sulfate precipitates by physical desalination through ultrafiltration using hollow fiber modules, ceramic filters, flat membrane filters, etc., or by filling them into dialysis tubes and immersing them in water. Examples include a method to do so.
  • the collagen-containing composition enriched with type XI collagen obtained as described above may have a collagen content of 30% by mass or more, 40% by mass or more, % or more, 60% by mass or more, 65% by mass or more, 70% by mass or more, 75% by mass or more, 80% by mass or more. It may be 85% by weight or more, it may be 90% by weight or more, it may be 95% by weight or more.
  • the product may be dried by means such as a vacuum dryer or a spray dryer commonly known to those skilled in the art, and the dried product may be further crushed, pulverized, etc. to be dried and powdered. If it is in the form of a dried product, like the above-mentioned dried product after freeze-drying, water is removed, so spoilage etc. are prevented and it has excellent storage stability. During drying, excipients such as texturin, crystalline cellulose, silica, etc. may be added in terms of formulation.
  • the particle size after powdering is preferably such that approximately 90% by mass or more of the total has a 30 mesh pass (opening: 500 ⁇ m), and approximately 90% by mass or more of the total has a 60 mesh pass (opening: 500 ⁇ m). :250 ⁇ m).
  • it is preferable to powder the powder so that about 90% by mass or more of the entire powder passes through a screen with a diameter of 0.3 mm or more and 0.75 mm or less.
  • the collagen-containing composition used in the present invention may be prepared by appropriately mixing the compositions with each other in a desired composition.
  • the collagen-containing composition derived from fish cartilage provided by the present invention has excellent effects in promoting the ability of chondrocytes to produce hyaluronic acid. In addition, it has excellent effects in protecting knee joints. Therefore, a functional composition containing this as an active ingredient can be made.
  • a functional composition for example, a composition for cartilage protection can be provided.
  • a composition for protecting knee joints can be provided.
  • the functionality provided by the present invention may be functionality as an agent for promoting articular chondrocyte regeneration, functionality as an agent for promoting chondrocyte proliferation, and functionality as an agent for promoting chondrocyte turnover. It may have functionality as an agent.
  • the subject may be a healthy person, and in particular, the composition may be made for a healthy person over 50 years old. Moreover, it may be made into a composition intended for animals such as pet animals.
  • the functional composition provided by the present invention which contains a collagen-containing composition derived from fish cartilage as an active ingredient, in addition to the type II collagen and/or type XI collagen, as long as the purpose is not impaired, There are no particular restrictions on the inclusion of other components.
  • Other ingredients include, for example, vitamin C, imidazole peptide, collagen peptide, salmon ovary integument peptide, and ⁇ -hydroxy- ⁇ -methylbutyric acid (HMB).
  • the functional composition provided by the present invention which contains a collagen-containing composition derived from fish cartilage as an active ingredient, can be used without any particular limitation, but it can be used by being ingested orally. preferable.
  • an oral composition as an example of its usage form, the above-mentioned type II collagen and/or type disintegrant), liquid (liquid), syrup (syrup), powder (granules, fine granules), capsule (capsule), soft capsule (soft capsule), solid, semi-liquid, cream, paste It may be formed into a shape such as a shape.
  • the intake amount may be set appropriately depending on the health condition, disease state, purpose, etc. of the human or animal to which it is applied.
  • the daily intake amount may be 5 mg or more and 100 mg or less, 5 mg or more and 40 mg or less, 5 mg or more and 20 mg or less, and 10 mg or more and 20 mg or less, in terms of collagen amount.
  • the amount may be 10 mg or more and 15 mg or less.
  • the period of ingestion it is preferable that the drug is ingested over a period of 12 weeks or more.
  • the intake period may be, for example, 2 weeks, 4 weeks, 6 weeks, 8 weeks, 10 weeks, 12 weeks, etc., and may be used so that it is ingested continuously or intermittently over these periods. .
  • the collagen-containing composition derived from fish cartilage provided by the present invention can be used for, for example, foods such as health foods and foods with functional claims, supplements, pharmaceuticals, medical materials, etc., and is particularly suitable for raw materials thereof. It can be suitably used as Further, as mentioned above, it can be used not only for humans but also for animals such as pet animals.
  • FIG. 4 shows a manufacturing flow diagram performed in this manufacturing example. Specifically, it was prepared as follows.
  • the amount of collagen contained in the salmon nasal cartilage used as the raw material for extraction was measured. Specifically, 30 mg of freeze-dried cartilage was decomposed by adding 5 mL of 6M-HCl (containing 0.04% mercaptoethanol), sealed in a tube after freezing, and then hydrolyzed at 110°C for 24 hours. The sample was transferred to an eggplant-shaped flask, and HCl was removed using an evaporator. 5 mL of ultrapure water was added to the sample remaining at the bottom of the eggplant-shaped flask to prepare a sample for analysis, and hydroxyproline (Hyp), which is unique to collagen, was quantified using an automatic amino acid analyzer.
  • 6M-HCl containing 0.04% mercaptoethanol
  • the supernatant after the enzyme treatment in Production Example 1 was collected over time to measure the amount of collagen. Specifically, 1 mL of the collected enzyme-treated supernatant was dispensed into test tubes, 1 mL of 12M-HCl was added, the tubes were sealed, and the tubes were hydrolyzed while being heated in a hot block bath at 130° C. for 3 hours. The sample was transferred to an eggplant-shaped flask, and hydrochloric acid was removed using an evaporator. After adding 5 mL of ultrapure water to the sample remaining at the bottom of the eggplant-shaped flask to prepare a sample for analysis, the colorimetric method using dimethylbenzaldehyde (J. F. Woesnner Jr., Archives of Biochemistry and Biophysics, 93, 440-447, 1961), the content of hydroxyproline (Hyp), which is unique to collagen, was measured.
  • dimethylbenzaldehyde J. F. Woesnner Jr., Archives of Biochemistry and Biophysics, 93
  • the content (g) of hydroxyproline (Hyp) was converted into collagen content (g) by multiplying by a coefficient of 12.63.
  • FIG. 6 shows a photograph of a gel obtained when a portion of the salting-out precipitate obtained in Production Example 1 was subjected to SDS-PAGE gel electrophoresis.
  • the salted-out precipitate derived from salmon cartilage contains ⁇ 1 (triple helical chain) of type II collagen, which is cartilage-derived collagen. ) was found to have a characteristic molecular weight band of around 116 kDa.
  • ⁇ 1 and ⁇ 2 characteristic of type XI lagen, which has a triple helical structure of ⁇ 1, ⁇ 2, and ⁇ 3, were observed in the vicinity of the molecular weight of 130 kDa to 160 kDa.
  • FIG. 7 shows the results when a part of the salting-out precipitate obtained in Production Example 1 was subjected to ion chromatography analysis.
  • the eluted protein was detected by continuously measuring the absorbance of the eluate from the column at a wavelength of 230 nm, and the eluate was collected as one fraction of 1 mL using a fraction collector.
  • the column temperature was maintained at 18°C.
  • the obtained peak fractions were subjected to SDS-PAGE gel electrophoresis.
  • FIG. 8 shows the results of analyzing the salting-out precipitate, 11% ammonium sulfate precipitate, and 20% ammonium sulfate precipitate obtained in Production Example 1.
  • the 20% ammonium sulfate precipitate obtained in Production Example 1 contained the fractions fractionated in the ion chromatography analysis in Test Example 3.
  • Collagen and type XI collagen that appeared in fraction number 41 were included.
  • the collagen content of the salting-out precipitate obtained in Production Example 1 was 67.8% by mass, and the collagen content of the ammonium sulfate precipitate was 11%.
  • the amount was 82.8% by weight, and the collagen content of the 20% ammonium sulfate precipitate was 95.2% by weight.
  • the salting-out precipitate obtained in Production Example 1 was subjected to SDS-PAGE gel electrophoresis, protein staining was performed, and the electrophoretic image was analyzed. It has a purity of approximately 95% based on the assumption that the remaining ⁇ 3 chain is included in the mass ratio of 1:1:1 and that the ⁇ 3 chain overlaps with the ⁇ 1 chain of type II collagen.
  • a hyaluronic acid production test was conducted using rabbit chondrocytes as follows.
  • a sample with a cell concentration of 2 x 10 5 cells/mL was prepared using a differentiation medium supplemented with the test substance, seeded in a 1.5 mL microtube, and heated in a CO 2 incubator with 5% CO2. 2 and cultured at 37°C. Medium exchange was performed every 2 to 3 days. Culture was carried out for two and a half weeks (17 days), and the final medium was replaced (500 ⁇ L/tube) 3 days before the collection of the culture supernatant.
  • Hyaluronic acid in the culture supernatant was measured using a hyaluronic acid measurement kit (R&D Co., Cat. No. DY3614) according to the protocol attached to the kit.
  • a collagen-containing composition containing type II collagen and type XI collagen has the effect of promoting hyaluronic acid production from rabbit chondrocytes. Moreover, the effect of promoting hyaluronic acid production was more remarkable than when type I collagen or type II collagen was used.
  • ⁇ Placebo food Processed into tablets of 300 mg each using glucose, fine silicon dioxide, and calcium stearate as a base.
  • ⁇ Test food Placebo tablet contains type II/XI collagen [type II: 80% by mass, Type XI: 20% by mass] (derived from salmon nasal cartilage) (Rinais Co., Ltd.) containing 10mg
  • Evaluation item ⁇ The discomfort in the knee joint was evaluated before and after ingesting the test food. Specifically, the five main evaluation items for knee joint pain (during daily life, walking, going up and down stairs, standing up after crouching down, and standing up for long periods of time) were evaluated using the Visual Analogue Scale (VAS) method. A questionnaire was conducted using a visual analogue scale. In addition, as secondary endpoints, three biomarkers known as indicators of cartilage turnover in the knee joint (serum CPII; a marker for type II collagen synthesis, urinary CTX-II; a marker for type II collagen degradation, and serum C1 , 2C; markers of type I & type II collagen degradation) were measured.
  • serum CPII a marker for type II collagen synthesis
  • urinary CTX-II a marker for type II collagen degradation
  • serum C1 , 2C markers of type I & type II collagen degradation
  • Biomarker analysis was outsourced to LSI Rulece Co., Ltd. Furthermore, when subjects were asked to perform 10 consecutive movements of crouching and standing up, squatting, and going up and down stairs, they were asked to report the number of times they were able to perform the movements.
  • VAS score> In the evaluation of the VAS questionnaire, which was the primary endpoint, a decrease in scores was confirmed in multiple questions 16 weeks after intake, and significant differences were also shown in intra-group comparisons. A comparison between the groups showed a significant difference (P ⁇ 0.039) in the amount of change in the VAS questionnaire during walking. Regarding other evaluation items, a decrease in score was also observed in the test group after 16 weeks of intake, using the results of the VAS questionnaire at rest as a representative example, but since the placebo group also showed a decrease in score, there was no significant difference in the between-group comparison. No difference was shown.
  • FIG. 10 shows the hierarchical analysis results when subjects aged 50 years or older and subjects with a score of 10 or less were excluded.
  • a collagen-containing composition containing type II collagen and type XI collagen was considered to be effective in protecting the knee joint.

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Abstract

魚類軟骨由来のコラーゲン含有組成物を有効に利用する技術を提供する。 魚類軟骨由来のコラーゲン含有組成物を有効成分として含有する軟骨保護用の組成物又は膝関節保護用の組成物であって、前記コラーゲン含有組成物はII型コラーゲン及びXI型コラーゲンを含有するものである、該組成物である。前記コラーゲン含有組成物は、軟骨細胞のヒアルロン酸産生能を促進する機能を有するものであることが好ましい。また、前記コラーゲン含有組成物は、サケ鼻軟骨由来のものであることが好ましい。

Description

魚類軟骨由来のコラーゲン含有組成物
 本発明は、魚類軟骨由来のコラーゲン含有組成物を有効に利用する技術に関する。
 コラーゲンは、哺乳類、鳥類、魚類等の動物一般に広く分布し、その細胞外マトリックスの主要構成成分として機能しているタンパク質である。ヒトでは総タンパク質量のうちおよそ25~30%を占めているといわれており、その分子構造としては、分子量10万程度のペプチド鎖が3本集まって水素結合により3重らせん構造を形成している。また、その3重らせん構造単位のものが、コラーゲン分子の端部を占めるテロペプチド領域で架橋して、繊維状構造や網目状構造等のさらなる高次構造を形成している。コラーゲンの種類は、ヒトで現在28種類ほど確認されており、また、機能によって分類されている。例えば、骨、真皮、腱などの主要タンパク質であるI型コラーゲンは、α1鎖2本とα2鎖1本とが3重らせん構造を形成しており、線維状の構造が引っぱり強度にすぐれ、体や臓器の形態を維持させている構造タンパク質として機能している。また、II型コラーゲンは、α1鎖3本が3重らせん構造を形成しており、軟骨等に局在してI型と同様な構造タンパク質としての機能を有している。一方、III型、V型コラーゲンは皮膚等においてI型と共存し、XI型コラーゲンは軟骨等においてII型と共存し、それぞれの組織に適合したコラーゲン線維の形成に補助的に関与していると考えられている(非特許文献1、2参照)。また、XI型コラーゲンの主たる分子種構成としては、α1鎖、α2鎖、α3鎖の3種類で3重らせん構造を形成していると考えられている(非特許文献3)。
 コラーゲン素材の利用については、動物組織のコラーゲンの最も多くを占めるI型コラーゲンが化粧品や健康食品、医薬品等の原料として広く利用されている。また、近年には、軟骨に局在するII型コラーゲン素材の利用も高まりつつあり、例えば、非特許文献3には、リウマチ性関節炎の患者の血中にはII型コラーゲンに対する抗体価が上昇しており、非変性II型コラーゲンの経口投与による免疫寛容により、リウマチ性関節炎の予防・治療効果が期待できるという報告がある(非特許文献4)。
 一般に、コラーゲンを動物組織から可溶化して抽出する方法としては、加熱変性処理、酸・アルカリによる可溶化処理、酵素処理による可溶化などの方法があるが、加熱変性処理では3重鎖がほどけてランダム状に変性してしまう。また、酸可溶化やアルカリ可溶化では、通常の非変性条件では、ごく少量しか溶出しないので生産性が悪い。一方、消化酵素であるペプシン等により、架橋構造の部分のみを部分的に分解して、3重らせん構造単位のものを効率的に抽出することができるものと考えられている。
 II型コラーゲン素材の調製方法に関連して、例えば、特許文献1には、ウシ肩甲軟骨を原料にして、高圧水流を用いた所定の前処理により原料の不純物を除去して、その後の脱灰とペプシン可溶化の処理により、リウマチ患者の血清と抗原抗体反応性を有するII型コラーゲンを調製したことが記載されている。
服部俊治著、「動物由来線維分子コラーゲンの性質と応用」、繊維と工業、vоl.65、Nо.12(2009)pp453-461. 服部俊治著、「コラーゲン-分子集合とその応用-」、高分子、47巻、6月号(1998)pp394-397. 吉岡秀克著、「XI型コラーゲンα1鎖遺伝子:α1鎖の一次構造,その遺伝子発現及び調節機構」、Connective Tissue、29(1997)pp39-47. David E.Trenthamら著、「Effects of oral administration of type II collagen on rheumatoid arthritis.」、Science 261(1993)pp1727-1730.
特開2001-112419号公報
 しかしながら、従来、軟骨由来のコラーゲンのうちメジャーに存在しているII型コラーゲンについては非変性に抽出する各種の調製方法が開発されてきたものの、軟骨コラーゲンのうちマイナーにしか存在していないXI型コラーゲンについては、実験や研究用に少量を調製して利用することがあるだけで、II型コラーゲンほどには有効に利用されていないのが現状であった。
 本発明の目的は、XI型コラーゲンについて、産業上、有効に活用し得る素材として工業的に生産できるようにし、これを利用する技術を提供することにある。
 本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、魚類軟骨を抽出原料にして酸性プロテアーゼ処理によりコラーゲンを可溶化して液部に溶出させたうえ、その液部を十分に塩析処理することで、II型コラーゲンとともにXI型コラーゲンが効率よく回収できることを見出し、本発明を完成するに至った。
 すなわち、本発明は、魚類軟骨由来のコラーゲン含有組成物を有効成分として含有する軟骨保護用の組成物であって、前記コラーゲン含有組成物はII型コラーゲン及びXI型コラーゲンを含有するものである、該組成物を提供するものである。
 また、本発明は、魚類軟骨由来のコラーゲン含有組成物を有効成分として含有する膝関節保護用の組成物であって、前記コラーゲン含有組成物はII型コラーゲン及びXI型コラーゲンを含有するものである、該組成物を提供するものである。
 上記組成物にあっては、前記コラーゲン含有組成物は、軟骨細胞のヒアルロン酸産生能を促進する機能性を備えるものであることが好ましい。
 上記組成物にあっては、前記コラーゲン含有組成物は、前記II型コラーゲンと前記XI型コラーゲンの含有量の質量比が10:1~1:10であり、固形分あたりのコラーゲン含有量が30質量%以上であるよう調製されてなるものであることが好ましい。
 上記組成物にあっては、前記コラーゲン含有組成物は、サケ鼻軟骨由来のものであることが好ましい。
 本発明によれば、魚類軟骨を抽出原料に利用して、食品、サプリメント、医薬品、医療用素材などに配合する素材として有用な、高機能なコラーゲン素材を提供することができる。
本発明に用いるコラーゲン含有組成物を調製する方法の一実施形態を示す工程図である。 本発明に用いるコラーゲン含有組成物を調製する方法の他の実施形態を示す工程図である。 本発明に用いるコラーゲン含有組成物を調製する方法の別の実施形態を示す工程図である。 製造例1において行った製造フロー図である。 試験例1においてリゾパソペプシンを用いた酵素処理により鮭鼻軟骨原料からコラーゲンを溶出させたときの可溶化率を調べた結果を示す図表であり、図5(a)は検体番号1~3の各試料について軟骨重量、コラーゲン含量、可溶化分量、可溶化率、可溶率の平均、及びその標準偏差の値をまとめた図表であり、図5(b)は可溶化率の経時変化を表す図表であり、図5(c)はそのグラフのもとになる数値をまとめた図表である。 試験例2において製造例1で得られた塩析沈殿物の一部をSDS-PAGEゲル電気泳動にかけたときのゲルの写真を示す図表である。 試験例3において製造例1で得られた塩析沈殿物の一部をイオンクロマトグラフィー分析にかけたときの結果を示す図表であり、図7(a)はイオンクロマトグラフィーによる分画フラクションごとにSDS-PAGEゲル電気泳動分析にかけたときのゲルの写真を示す図表であり、図7(b)はそのSDS-PAGEゲル電気泳動のゲルのフラクション番号37及びフラクション番号41の部分の拡大写真を示す図表であり、図7(c)はイオンクロマトグラフの分析チャートを示す図表である。 試験例4において製造例1で得られた塩析沈殿物、11%硫安沈殿物、及び20%硫安沈殿物を解析した結果を示す図表であり、図8(a)は20%硫安沈殿物及び塩析沈殿物の一部をSDS-PAGEゲル電気泳動にかけたときのゲルの写真を示す図表であり、図8(b)は塩析沈殿物、11%硫安沈殿物、及び20%硫安沈殿物のヒドロキシプロリン含量をジメチルベンズアルデヒド比色法により測定しコラーゲン含量への換算係数を乗じてコラーゲン含量を求めた結果を示す図表である。 試験例5においてウサギ軟骨細胞からのヒアルロン酸産生量を調べた結果を示す図表である。 試験例6において50歳以上の被験者であってスコア10以下の被験者を除外したVASスコアの階層解析結果を示す図表である。 試験例6において50歳以上の被験者であって動作時になんら違和感を生じなかった被験者を除外した10回繰り返し動作のアンケートの階層解析結果を示す図表である。
 本発明に用いるコラーゲン含有組成物は、魚類軟骨をコラーゲンの基原として調製し得る。魚類の種類やその軟骨組織の部位等に特に制限はなく、例えばサケの鼻軟骨(氷頭)、サメの軟骨、エイの軟骨、イカの軟骨等が挙げられる。特にサケの鼻軟骨(氷頭)は、コラーゲン含量が高いうえ、水産加工の分野で通常廃棄される部位として安価に入手可能であるのでより好ましい。例えば、サケのイクラ加工やフィレ加工では水揚げされたサケから頭部は大量に廃棄処分されるので、これを入手し、その頭部から鼻軟骨を摘出して用いることができる。
 図1には、本発明に用いるコラーゲン含有組成物を調製する方法の一実施形態が示される。この実施形態にあっては、魚類軟骨を抽出原料として、軟骨由来のコラーゲンであるII型コラーゲン及びXI型コラーゲンを含むコラーゲン含有組成物が得られる。すなわち、このコラーゲン含有組成物の調製方法においては、アルカリ性溶媒で原料の洗浄処理を行う工程と(図1中では「S1」で示される。以下「アルカリ洗浄工程」ともいう。)、アルカリ洗浄後の洗浄処理物に対して希薄酸性溶媒中で酸性プロテアーゼによる酵素処理を行う工程と(図1中では「S2」で示される。以下「酵素処理工程」ともいう。)、酵素処理後の酵素処理物を固液分離してコラーゲンを含む液部を回収する工程と(図1中では「S3」で示される。以下「コラーゲン含有液部回収工程」ともいう。)、固液分離により回収したコラーゲンを含む液部のpHを中和調整する工程と(図1中では「S4」で示される。以下「コラーゲン含有液部中和工程」ともいう。)、コラーゲンを含む液部のpHを中和調整した後の中和処理物を塩析する工程(図1中では「S5」で示される。以下「塩析処理工程」ともいう。)を経るようにしている。
 上記調製方法においては、特に限定されないが、抽出原料として、例えば魚類軟骨を破砕し、粒径を揃えたものを用いることが好ましい。軟骨原料の粒径の均一化は、所定孔径のプレート(例えば孔径1.8~10mm程度)を使用したミートチョッパーや、あるいはホモジナイザー、マスコローダー等を使用して細分化処理することなどにより行うことができる。粒径を揃えることにより、アルカリ洗浄やコラーゲンの溶出をより効率よく行うことができる。軟骨原料の粒径としては、典型的に例えば0.1mm~10mmの範囲であってよく、0.5mm~5mmの範囲であってよく、1mm~3mmの範囲であってもよい。
 上記調製方法においては、アルカリ洗浄工程において、抽出原料である魚類軟骨に対してアルカリ性溶媒で洗浄処理を行って、その抽出原料からプロテオグリカン、ヒアルロン酸等の糖質系細胞外マトリックス物質を除去するようにしている。使用するアルカリ性溶媒は、特に限定されないが、0.01M~1Mの濃度範囲のNaOH水溶液であってよく、0.05M~0.5Mの濃度範囲のNaOH水溶液であってよく、0.1M~0.4Mの濃度範囲のNaOH水溶液であってもよい。
 上記アルカリ洗浄処理は、魚類軟骨原料をアルカリ性溶媒中で所定時間攪拌した後に固液分離することにより行うことが好ましい。これによれば、魚類軟骨原料から糖質系細胞外マトリックス物質等の夾雑物をより効果的に除去することができる。このようなアルカリ洗浄のための攪拌の際の温度条件としては、特に制限はないが、低温で温度管理することが好ましい。例えば、0℃~12℃の範囲であってよく、2℃~10℃の範囲であってよく、4℃~8℃の範囲であってもよい。また、アルカリ洗浄のための攪拌の際の攪拌時間としては、特に制限はないが、例えば30分間~48時間の範囲であってよく、1時間~36時間の範囲であってよく、3時間~24時間の範囲であってもよい。なお、固液分離には、例えば、60~100メッシュ程度のザルや濾布、遠心分離を使用すればよい。
 ある態様においては、上記アルカリ洗浄工程におけるアルカリ性溶媒による魚類軟骨原料のアルカリ洗浄処理は、所定時間攪拌後のアルカリ性溶媒を固液分離して除いた後、あらたなアルカリ溶媒を加えて洗浄を繰り返すようにして、複数回(例えば2~4回)行ってもよい。これによれば、魚類軟骨原料から糖質系細胞外マトリックス物質等の夾雑物を更により効果的に除去することができる。また、アルカリ洗浄後には、水を加えて所定時間攪拌後に固液分離することにより、水洗浄処理を行ってもよい。この水洗浄処理についても、複数回(例えば2~4回)繰り返してもよい。また、その洗浄液のpHが中性付近になるまで水洗浄処理を繰り返すことが好ましい。これによれば、用いたアルカリが後の処理に影響を及ぼすことを防ぐことができる。
 上記調製方法においては、酵素処理工程において、アルカリ洗浄工程後の洗浄処理物に対して希薄酸性溶媒中で酸性プロテアーゼによる酵素処理を行ってコラーゲンを可溶化させるようにしている。使用する酸性プロテアーゼとしては、特に限定されないが、例えばペプシン等が挙げられる、また、特に真菌由来の非動物性ペプシンであれば、狂牛病や口蹄疫などの疾病のイメージのある動物由来の素材を使用する必要がないので好ましい。真菌由来の非動物性ペプシンとしては、例えば、カビの一種であるRhizopus niveusが産生する酸性プロテアーゼであるリゾパスペプシン等が挙げられる。また、使用する希薄酸性溶媒は、特に限定されないが、例えば10mM~500mMの濃度範囲の酢酸水溶液であってよく、250mM~500mMの濃度範囲の酢酸水溶液であってよく、400mM~500mMの濃度範囲の酢酸水溶液であってもよい。また、例えば10mM~500mMの濃度範囲のクエン酸水溶液であってよく、250mM~500mMの濃度範囲のクエン酸水溶液であってよく、400mM~500mMの濃度範囲のクエン酸水溶液であってもよい。たたし、酸性プロテアーゼの好適条件のためにはpHを酸性側に調製する必要がある。
 上記酵素処理において、pH条件は、使用する酵素の種類によっても好適条件は異なり一概ではないが、例えばpH1~6の範囲であってよく、pH2~5の範囲であってよく、pH2.5~3.5の範囲であってもよい。酵素処理の際の温度条件としては、使用する酵素の種類によっても好適条件は異なり一概ではないが、コラーゲンが変性しない範囲内とすることが好ましく、例えば0℃~12℃の範囲であってよく、2℃~10℃の範囲であってよく、4℃~8℃の範囲であってもよい。酵素処理の際の処理時間としては、特に制限はないが、例えば30分間~48時間の範囲であってよく、1時間~36時間の範囲であってよく、3時間~24時間の範囲であってもよい。なお、酸性プロテアーゼとして上記リゾパスペプシンを用いる場合、その酵素の添加量としては、投入した魚類軟骨原料の固形分(乾燥重量)に対して1/100~1/5量、場合によっては1/50~1/10量、更に場合によっては1/25~1/15量のリゾパスペプシン製剤を添加することなどが典型的であり、稀薄酸性溶媒中に含有せしめるリゾパスペプシン製剤の濃度としては0.001~1質量%、場合によっては0.005~0.1質量%、更に場合によっては0.01~0.05質量%になるようにすることなどが典型的である。
 ある態様においては、上記酵素処理工程におけるpHは、酸性プロテアーゼを添加する前に、魚類軟骨原料に希薄酸性溶媒を添加して所定時間処理することにより予め酸性側に調整してもよい。これによれば、酸性プロテアーゼによる処理の際、pHがアルカリ側にシフトして、コラーゲン可溶化の効率が悪くなるのを防ぐことができる。これに限定されないが、例えば、軟骨原料に対して1~50倍量、場合によっては3~20倍量、更に場合によっては5~10倍量の希薄酸性溶媒を添加し、所定時間攪拌処理することにより、そのpHを酸性側に調整することができる。このような酸性側へのpH調整の際の温度条件としては、特に制限はないが、低温で温度管理することが好ましい。例えば、0℃~12℃の範囲であってよく、2℃~10℃の範囲であってよく、4℃~8℃の範囲であってもよい。また、酸性側へのpH調整の際の攪拌時間としては、特に制限はないが、例えば30分間~48時間の範囲であってよく、1時間~36時間の範囲であってよく、3時間~24時間の範囲であってもよい。
 上記調製方法においては、コラーゲン含有液部回収工程において、酵素処理工程後の酵素処理物を固液分離して、魚類軟骨原料から溶出させたコラーゲンを含む液部を回収するようにしている。固液分離には、例えば、遠心分離機を使用すればよい。そして、上記コラーゲン含有液部中和工程において、回収した液部のpHを中性付近に中和調整するようにしている。この中和調整により、つづく塩析処理によって、軟骨由来のコラーゲンとしてメジャーに存在するII型コラーゲンだけでなく、マイナー型であるXI型コラーゲンを有効に回収やすくなる。中和調整は、これに限定されないが、回収したコラーゲン含有液部に対して、例えば0.1M~1MのHCL水溶液や0.1M~1MのNaOH水溶液を用いて、適宜、これらの酸・アルカリを、pH測定を行いながら添加することになどにより行うことができる。pHは例えば、pH7.5~8.5の範囲に調整することが好ましく、特に好ましくはpH8付近である。
 上記調製方法においては、塩析処理工程において、コラーゲン含有液部中和工程後の中和処理物を塩析して、その塩析沈殿物としてII型コラーゲン及びXI型コラーゲンを回収するようにしている。塩析は、通常の方法で行えばよく、具体的には、固形状ないし塩析に適した形状の塩化ナトリウム等の塩を添加し、その後所定時間攪拌後、固液分離することにより行うことができる。塩の終濃度としては、例えば2M~5Mの範囲であってよく、2.5M~4.5Mの範囲であってよく、3M~4Mの範囲であってもよい。特に好ましくは4M以上であり、特には4.4M付近である。このような塩析の際の温度条件としては、特に制限はないが、低温で温度管理することが好ましい。例えば、0℃~12℃の範囲であってよく、2℃~10℃の範囲であってよく、4℃~8℃の範囲であってもよい。また、塩析の際の攪拌時間としては、特に制限はないが、例えば30分間~48時間の範囲であってよく、1時間~36時間の範囲であってよく、3時間~24時間の範囲であってもよい。塩析沈殿物の回収は、上記と同じく固液分離によればよく、例えば、遠心分離機を使用すればよい。
 以上のようにして得られた塩析沈殿物は、限外濾過、透析等により塩を除去することができる。また、これを真空凍結乾燥して乾燥物に調製してもよい。塩析沈殿物からの塩の除去には、中空糸モジュール、セラミックフィルター、平膜型フィルター等を用いた限外濾過による方法や、透析チューブに充填して水中に浸漬して脱塩する方法等が挙げられる。
 以上のようにして得られたII型コラーゲン及びXI型コラーゲンを含有するコラーゲン含有組成物は、そのコラーゲン含有量が固形分あたり30質量%以上であってよく、40質量%以上であってよく、50質量%以上であってよく、60質量%以上であってよく、65質量%以上であってよく、70質量%以上であってよく、75質量%以上であってよく、80質量%以上であってよく、85質量%以上であってよく、90質量%以上であってよく、95質量%以上であってよい。また、II型コラーゲンとXI型コラーゲンの含有量の質量比としては、10:1~1:10の範囲であってよく、8:2~2:8の範囲であってよく、7:3~3:7の範囲であってもよい。なお、コラーゲン含量は、コラーゲンの酸加水分解処理後、ヒドロキシプロリン量をアミノ酸組成分析やジメチルベンズアルデヒド比色法等により分析し、所定のコラーゲン量への換算係数を乗じることなどにより求めることができる。例えば、サケコラーゲンの場合、アミノ酸1000残基中のヒドロキシプロリン(Hyp)は54.3残基で、含有率は7.92%であり、Hyp量からコラーゲン量への換算係数は12.63である。
 図2には、本発明に用いるコラーゲン含有組成物を調製する方法の他の実施形態が示される。この実施形態にあっては、上記に説明したII型コラーゲン及びXI型コラーゲンを含有する塩析処理物を0.5M酢酸に溶解する工程と(図2中では「S6」で示す。)、所定の終濃度の硫安で硫安処理する工程と(図2中では「S7」で示す。)を経るようにしている。これにより、その硫安沈殿物としてII型コラーゲンが富化されたII型コラーゲン含有組成物が得られる。溶解処理(S6)における酸溶媒としては、図中では0.5M酢酸が例示されるが、例えば0.4~0.6M酢酸又は0.4~0.6Mクエン酸などにより、溶液pHとしてはpH2.6~2.8の範囲になるよう、濃度を適切に設定すればよい。また、硫安処理は、通常の方法で行えばよく、具体的には、固形状ないし塩析に適した形状の硫酸アンモニウムを添加し、その後所定時間攪拌後、固液分離することにより行うことができる。硫安処理(S7)における硫安の終濃度としては、図中では11w/v%が例示されるが、例えば10w/v%~13w/v%の範囲であってよく、10.5w/v%~12.5w/v%の範囲であってもよい。特に好ましくは11w/v%付近である。このような硫安処理の際の温度条件としては、特に制限はないが、例えば0℃~12℃の範囲であってよく、2℃~10℃の範囲であってよく、4~8℃の範囲であってもよい。また、硫安処理の際の攪拌時間としては、特に制限はないが、例えば30分間~48時間の範囲であってよく、1時間~36時間の範囲であってよく、3時間~24時間の範囲であってもよい。硫安沈殿物の回収は、上記と同じく固液分離によればよく、例えば、遠心分離機を使用すればよい。
 以上のようにして得られた硫安沈殿物は、限外濾過による透析等により塩を除去することができる。また、これを真空凍結乾燥して乾燥物に調製してもよい。硫安沈殿物からの塩の除去には、中空糸モジュール、セラミックフィルター、平膜型フィルター等を用いた限外濾過による物理的な脱塩や、透析チューブに充填して水中に浸漬して脱塩する方法等が挙げられる。
 以上のようにして得られたII型コラーゲンを富化してなるコラーゲン含有組成物は、そのコラーゲン含有量が固形分あたり30質量%以上であってよく、40質量%以上であってよく、50質量%以上であってよく、60質量%以上であってよく、65質量%以上であってよく、70質量%以上であってよく、75質量%以上であってよく、80質量%以上であってよく、85質量%以上であってよく、90質量%以上であってよく、95質量%以上であってよい。
 図3には、本発明に用いるコラーゲン含有組成物を調製する方法の別の実施形態が示される。この実施形態にあっては、上記に説明したII型コラーゲン及びXI型コラーゲンを含有する塩析処理物を0.5M酢酸に溶解する工程と(図3中では「S6」で示す。)、所定の第1の終濃度の硫安で硫安処理する工程と(図3中では「S7」で示す。)、その硫安処理後の上清を回収する工程と(図3中では「S8」で示す。)、所定の第2の終濃度の硫安で硫安処理する工程と(図3中では「S9」で示す。)を経るようにしている。これにより、その硫安沈殿物としてXI型コラーゲンが富化されたXI型コラーゲン含有組成物が得られる。上述したように、溶解処理(S6)における酸溶媒としては、図中では0.5M酢酸が例示されるが、例えば0.4~0.6M酢酸又は0.4~0.6Mクエン酸などにより、溶液pHとしてはpH2.6~2.8の範囲になるよう、濃度を適切に設定すればよい。また、硫安処理は、通常の方法で行えばよく、具体的には、固形状ないし塩析に適した形状の硫酸アンモニウムを添加し、その後所定時間攪拌後、固液分離することにより行うことができる。硫安処理(S7)における硫安の上記第1の終濃度としては、例えば10w/v%~13w/v%の範囲であってよく、10.5w/v%~12.5w/v%の範囲であってもよい。特に好ましくは11w/v%付近である。また、硫安処理の硫安の上記第2の終濃度としては、例えば18w/v%~22w/v%の範囲であってよく、19w/v%~21w/v%の範囲であってもよい。特に好ましくは20w/v%付近である。このような硫安処理の際の温度条件としては、特に制限はないが、例えば0℃~20℃の範囲であってよく、2℃~15℃の範囲であってよく、4℃~10℃の範囲であってもよい。また、硫安処理の際の攪拌時間としては、特に制限はないが、例えば30分間~48時間の範囲であってよく、1時間~36時間の範囲であってよく、3時間~24時間の範囲であってもよい。なお、硫安処理後の上清や沈殿物の回収は、上記と同じく固液分離によればよく、例えば、遠心分離機を使用すればよい。
 以上のようにして得られた硫安沈殿物は、限外濾過による透析等により塩を除去することができる。また、これを真空凍結乾燥して乾燥物に調製してもよい。硫安沈殿物からの塩の除去には、中空糸モジュール、セラミックフィルター、平膜型フィルター等を用いた限外濾過による物理的な脱塩や、透析チューブに充填して水中に浸漬して脱塩する方法等が挙げられる。
 以上のようにして得られたXI型コラーゲンを富化してなるコラーゲン含有組成物は、そのコラーゲン含有量が固形分あたり30質量%以上であってよく、40質量%以上であってよく、50質量%以上であってよく、60質量%以上であってよく、65質量%以上であってよく、70質量%以上であってよく、75質量%以上であってよく、80質量%以上であってよく、85質量%以上であってよく、90質量%以上であってよく、95質量%以上であってよい。
 以上に説明した調製方法により得られる、上記II型コラーゲン及びXI型コラーゲンを含有する塩析沈殿物、上記II型コラーゲンを含有する11%硫安沈殿物、上記XI型コラーゲンを含有する20%硫安沈殿物は、通常当業者に周知の減圧乾燥機、噴霧乾燥機等の手段により乾燥してもよく、その乾燥物を更に解砕、粉砕等して乾燥ともに粉末化してもよい。乾燥物の形態であれば、上記した凍結乾燥後の乾燥物と同様に、水分が除かれているので、腐敗等が防がれて、保存安定性に優れている。乾燥に際しては、製剤的にテキストリン等の賦形剤や結晶セルロース、シリカ等を添加してもよい。
 粉末化のためには、通常当業者に周知の粉砕機、ミル、マスコローダー等の手段を利用することができる。粉末化後の粒度としては、全体のおよそ90質量%以上が30メッシュパス(目開き:500μm)となる程度に粉末化することが好ましく、全体のおよそ90質量%以上が60メッシュパス(目開き:250μm)となる程度に粉末化することがより好ましい。あるいは、全体のおよそ90質量%以上が0.3mm経以上0.75mm径以下のスクリーンをパスするように粉末化することが好ましい。
 以上に説明した調製方法により得られる、上記II型コラーゲン及びXI型コラーゲンを含有する塩析沈殿物、上記II型コラーゲンを含有する11%硫安沈殿物、上記XI型コラーゲンを含有する20%硫安沈殿物は、適宜、所望の配合でお互いの組成物どうしを混合して、本発明に用いるコラーゲン含有組成物と成してもよい。
 後述する実施例で示されるように、本発明により提供される魚類軟骨由来のコラーゲン含有組成物によれば、軟骨細胞のヒアルロン酸産生能を促進する作用効果に優れている。また、膝関節保護の作用効果に優れている。よって、これを有効成分として含有する機能性組成物と成すことができる。機能性組成物として、例えば、軟骨保護用の組成物を提供することができる。また、例えば、膝関節保護用の組成物を提供することができる。また、ある態様において、本発明によって提供される機能性は、関節軟骨細胞再生促進剤としての機能性であってよく、軟骨細胞増殖促進剤としての機能性であってよく、軟骨細胞ターンオーバー促進剤としての機能性であってよい。また、対象は健常者であってもよく、特には50歳以上の健常者のための組成物と成してもよい。また、ペット動物等の動物を対象にした組成物と成してもよい。
 本発明により提供される、魚類軟骨由来のコラーゲン含有組成物を有効成分として含有してなる機能性組成物においては、その目的を損なわない限り、上記II型コラーゲン及び/又はXI型コラーゲンに加え、他の成分を含有することについて、特に制限はない。他の成分としては、例えば、ビタミンC、イミダゾールペプチド、コラーゲンペプチド、鮭卵巣外皮ペプチド、β-ヒドロキシ-β-メチル酪酸(HMB)などが挙げられる。
 本発明により提供される、魚類軟骨由来のコラーゲン含有組成物を有効成分として含有してなる機能性組成物の利用形態は、特に制限されないが、経口的に摂取されるようにして用いられることが好ましい。経口用組成物である場合、その利用形態の例としては、上記II型コラーゲン及び/又はXI型コラーゲンをそのまま用いてもよく、必要に応じて、錠剤状(錠剤、タブレット、チュアブル錠、口腔内崩壊剤)、液状(液剤)、シロップ状(シロップ剤)、粉末状(顆粒、細粒)、カプセル状(カプセル剤)、ソフトカプセル状(ソフトカプセル剤)、固形状、半液体状、クリーム状、ペースト状等の形態と成してもよい。
 摂取量に関し、適用するヒト又は動物の健康状態や疾患の状態、目的等に応じて適宜設定すればよく、特に制限はない。例えば、1日あたりの摂取量としては、例えば、コラーゲン量換算で、5mg以上100mg以下であってよく、5mg以上40mg以下であってよく、5mg以上20mg以下であってよく、10mg以上20mg以下であってよく、10mg以上15mg以下であってよい。摂取期間としては、12週間以上にわたって摂取されるように用いられることが好ましい。摂取期間としては、例えば、2週間、4週間、6週間、8週間、10週間、12週間などであってよく、これらの期間にわたって連続的又は断続的に摂取されるように用いられてもよい。
 本発明により提供される魚類軟骨由来のコラーゲン含有組成物は、例えば、健康食品、機能性表示食品等の食品やサプリメント、医薬品、医療用素材等に向けた利用が可能であり、特にその原料素材として好適に利用され得る。また、上述したようにヒトだけでなくペット動物等の動物に向けた利用も可能である。
 以下、製造例及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの製造例及び試験例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。
 [製造例1] 
 水産加工工場から排出されるサケの頭部を入手し、その頭部から鼻軟骨を摘出して、200gの生軟骨を採取した(サケ8匹相当)。採取した生軟骨は2.8mm孔径のプレートを取り付けたミートチョッパーを使用し細分化処理を行い抽出用出発原料とした。
 上記に調製した抽出原料からコラーゲンを抽出した。
 図4には、本製造例において行った製造フロー図を示す。具体的には、以下のようにして調製した。
 ・抽出原料200gに対して0.1MNaOH水溶液を2400mL添加し、4℃下で24時間攪拌した後、遠心分離装置により10,000g×20分間の処理を行って固液分離し、その固部を回収した。
 ・水2400mLを添加し、4℃下で攪拌した後、遠心分離装置により10,000g×20分間の処理を行って固液分離し、その固部を回収し、更に同様の操作をもう一度繰り返した。2回目の上清のpHを測定したところpH11.92であった。更に同様の水洗を繰り返し、最終水洗時のpHは9.47であった。
 ・10mMクエン酸水溶液を2000mL添加し、4℃下で24時間攪拌し、上清のpHを測定したところpH3.0であった。
 ・リゾパスペプシン(商品名「ニューラーゼF3G」、天野エンザイム株式会社社製)を添加し、4℃下で48時間攪拌した。その処理後のpHを測定したところpH3.0であった。
 ・遠心分離装置により10,000g×20分間の処理を行って固液分離し、その液部を回収した。
 ・リン酸水素二ナトリウムを終濃度20mMとなる量で添加し、4℃下で1時間攪拌した。
 ・6MHCl水溶液または6MNaOH水溶液の滴下による微調整によりpH8.0に調整した。
 ・粉体NaClを終濃度4.4Mとなる量で添加し、4℃下で24時間攪拌した。
 ・遠心分離装置により10,000g×20分間の処理を行って固液分離し、その固部を塩析沈殿物として回収した。
 ・0.5M酢酸水溶液1200mLを添加し、塩析沈殿物を溶解させた。
 ・粉体硫酸アンモニウムを終濃度11W/V%となる量で添加し、4℃下で24時間攪拌した。
 ・遠心分離装置により10,000g×20分間の処理を行って固液分離し、その固部を11%硫安沈殿物として回収した。また、その液部を上清として回収した。
 ・上記上清に粉体硫酸アンモニウムを終濃度20W/V%となる量で添加し、4℃下で24時間攪拌した。
 ・遠心分離装置により10,000g×20分間の処理を行って固液分離し、その固部を20%硫安沈殿物として回収した。
 ・透析による脱塩した。具体的には、分画分子量12,000~16,000の透析チューブ(エーディア株式会社のセルロースチューブ 36/32)に充填して水中に浸漬して脱塩した。
 ・真空凍結乾燥機により乾燥した。
 <試験例1> 
 製造例1の製造フローにおいて、リゾパスペプシンによる酵素処理によるコラーゲンの可溶化率について検討した。
 まず、抽出原料に用いたサケ鼻軟骨に含まれるコラーゲン量を測定した。具体的には、30mgの凍結乾燥軟骨に6M-HCl(0.04%メルカプトエタノール含有)を5mL添加して分解処理し、凍結処理後に封管後、110℃で24時間、加水分解処理した後に試料をナス型フラスコに移し、エバポレーターでHClを除去した。ナス型フラスコ底部に残った試料に5mLの超純水を加え分析用試料とし、アミノ酸自動分析装置でコラーゲンに特有のヒドロキシプロリン(Hyp)を定量した。
 また、製造例1の酵素処理した後の上清について、これを経時的に採取してコラーゲン量を測定した。具体的には、採取した酵素処理上清の1mLを試験管に分注し、12M-HClを1mL加えて密封し、130℃のホットブロックバスで3時間加熱しながら加水分解した。試料をナス型フラスコに移し、エバポレーターで塩酸を除去した。ナス型フラスコ底部に残った試料に5mLの超純水を加え分析用試料とした後、常法に従い、ジメチルベンズアルデヒドを用いた比色定量法(J. F. Woesnner Jr, Archives of Biochemistry and Biophysics, 93, 440-447, 1961)により、コラーゲンに特有のヒドロキシプロリン(Hyp)の含有量を測定した。
 ヒドロキシプロリン(Hyp)の含有量(g)は、係数12.63を乗じることにより、コラーゲン含量(g)に換算した。
 その結果、図5(a)に示されるように、3回測定したところ、いずれの算定値も90%以上の高い可溶化率で安定していた。また。図5(b)(c)に示されるように、可溶化率を経時的にみたところ、酵素処理開始から24時間後には、90%以上の可溶化率に達していた。
 <試験例2> 
 図6には、製造例1で得られた塩析沈殿物の一部をSDS-PAGEゲル電気泳動にかけたときのゲルの写真を示す。
 図6に示されるように、サケ皮膚由来のコラーゲンサンプルの電気泳動像にくらべて、サケ軟骨由来の塩析沈殿物中には、軟骨由来のコラーゲンであるII型コラーゲンのα1(3重らせん鎖)に特徴的な分子量116kDa付近のバンドがみられた。加えて、分子量130kDa~160kDa付近にはα1、α2、α3の3重らせん構造を持つXI型ラーゲンに特徴的なα1、α2の2種と考えられるバンドがみられた。
 <試験例3> 
 図7には、製造例1で得られた塩析沈殿物の一部をイオンクロマトグラフィー分析にかけたときの結果を示す。
 具体的には、製造例1で得られた塩析沈殿物の一部を、2M尿素を含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.8)に溶解させ、陽イオン交換クロマトグラフィーに供した。カラムには、カルボキシメチル基をリガンドとして有する充填剤を詰めたイオン交換カラム(昭和電工株式会社、CM-825)を用い、流速1.0ml/minで、40分間にわたる0~0.4MまでのNaClグラジエント(濃度勾配)によって吸着タンパク質を溶出させた。カラムからの溶出液について波長230nmにおける吸光度を連続的に測定することにより溶出タンパク質を検出し、1画分1mLとしてフラクションコレクターを用いて溶出液を回収した。カラムの温度は18℃に保持した。得られたピーク画分についてSDS-PAGEゲル電気泳動にかけたた。
 図7(a)に示されるように、図7(c)のイオンクロマトグラフィーによる分画フラクションごとの230nm波長の吸光度による出現ピークのうち、フラクション番号31~フラクション番号42にかけてタンパク質染色剤であるクマジーブリリアントブルーR-250に染まる成分が出現し、いずれも分子量116~160kDa付近にバンドがみられた。また、図7(b)に示されるように、そのイオンクロマトグラフィーによるフラクション番号37には、II型コラーゲンに相当するα1の3重鎖によると考えられるバンドが出現し、一方でフラクション番号41にはXI型コラーゲンに相当するα1~α3の3重鎖によると考えられるバンドが出現した。
 <試験例4> 
 図8には、製造例1で得られた塩析沈殿物、11%硫安沈殿物、及び20%硫安沈殿物を、解析した結果を示す。
 図8(a)のSDS-PAGEゲル電気泳動の結果に示されるように、製造例1で得られた20%硫安沈殿物中には、試験例3のイオンクロマトグラフィー分析で分画されたフラクション番号41に出現したXI型コラーゲンが含まれており、製造例1で得られた塩析沈殿物中には、試験例3のイオンクロマトグラフィー分析で分画されたフラクション番号37に出現したII型コラーゲン及びフラクション番号41に出現したXI型コラーゲンが含まれていた。
 図8(b)のコラーゲン量の測定の結果に示されるように、製造例1で得られた塩析沈殿物のコラーゲン含有量は67.8質量%であり、11%硫安沈殿物のコラーゲン含有量は82.8質量%であり、20%硫安沈殿物のコラーゲン含有量は95.2質量%であった。
 また、別途、製造例1で得られた塩析沈殿物をSDS-PAGEゲル電気泳動にかけて、タンパク質染色してその電気泳動像を解析し、XI型コラーゲンの分子量が大きいほうからα1鎖及びα2鎖として帰属させるとともに残りのα3鎖がともに1:1:1の質量部で含まれ、そのα3鎖がII型コラーゲンのα1鎖と重なっているとの仮定のもとに、およそ95%純度を有するXI型コラーゲンのα1鎖及びα2鎖に相当するバンドの染色強度を指標にして、そのバンドの染色強度をコラーゲン量に換算するための換算係数を求めたうえ、これを他のバンドについても量論的にあてはめておよその定量測定を行ったところ、製造例1で得られた塩析沈殿物中に含まれるコラーゲンのうち、II型が60質量%であり、XI型が40質量%を占めると推定された。
 <試験例5> 
 II型コラーゲンとともにXI型コラーゲンを含有してなるコラーゲン含有組成物について、その有用性を評価した。
 具体的には、ウサギ軟骨細胞を用いてヒアルロン酸産生試験を以下のとおり実施した。
 〔1.被験物質〕
・I型コラーゲン(ウシ表皮由来)(MP Biomedicals, Inc)
・II型コラーゲン(サケ鼻軟骨由来)(株式会社リナイス)
・II型/XI型コラーゲン[II型:80質量%、XI型:20質量%](サケ鼻軟骨由来)(株式会社リナイス)
 〔2.細胞・培地〕
・ウサギ軟骨細胞、日本白色種ウサギ・メス関節軟骨(「軟骨細胞培養キット」、コスモ・バイオ株式会社)
・軟骨細胞培養用培地(「軟骨細胞培養キット」、コスモ・バイオ株式会社)
・軟骨細胞分化用培地(「軟骨細胞培養キット」、コスモ・バイオ株式会社)
 〔3.培養〕
 培養状態で入手した細胞は、軟骨細胞培養キットに付属している培養用培地を使用して、COインキュベーター(5%CO、37℃)内で培養し、翌日、細胞を剥離し凍結保存した。
 別途、被験物質としてI型コラーゲン、II型コラーゲン、II型/XI型コラーゲンは、それぞれ10mg/mLとなるように軟骨細胞分化用培地にて調製し、フィルター滅菌した。なお、各被験物質は培地への添加の直前に調製した。
 凍結融解した細胞を培養用培地で起眠し、T-75フラスコ内で培養した。細胞を剥離後、被験物質を添加した分化用培地を用いて2×10cells/mLの細胞濃度の試料を調製し、これを1.5mLマイクロチューブに播種し、COインキュベーターで5%CO、且つ、37℃の条件下に培養した。培地交換は2~3日間ごとに行った。培養は2週間半(17日間)行い、培養上清の回収日の3日前に最終の培地交換(500μL/チューブ)を行った。
 〔4.ヒアルロン酸の測定〕
 培養上清中のヒアルロン酸の測定は、ヒアルロン酸測定キット(R&D社、Cat. No. DY3614)を使用して、キットに添付のプロトコールに従って行なった。
 〔5.統計解析〕
 有意差検定はStudent T-testを行い、P<0.05(帰無仮説が5%未満)のものを有意差ありと判断した。
 〔6.結果〕
 表1及び図9に結果をまとめて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 その結果、II型コラーゲンとともにXI型コラーゲンを含有してなるコラーゲン含有組成物には、ウサギ軟骨細胞からのヒアルロン酸産生を促進する作用効果があることが明らかとなった。まら、そのヒアルロン酸産生促進の作用効果は、I型コラーゲンやII型コラーゲンを用いた場合に比べて、より顕著であった。
 <試験例6> 
 II型コラーゲンとともにXI型コラーゲンを含有してなるコラーゲン含有組成物について、その有用性を評価した。
 具体的には、健常人を対象にしたヒト試験を以下のとおり実施した。
 〔1.被験食品〕
・プラセボ食品:ブドウ糖と微粒二酸化ケイ素、ステアリン酸カルシウムを基材として、1粒300mgの錠剤に加工したもの
・試験食品:プラセボとした錠剤中にII型/XI型コラーゲン[II型:80質量%、XI型:20質量%](サケ鼻軟骨由来)(株式会社リナイス)を10mg配合したもの
 〔2.被験者〕
 ボランティアを募り、所定基準を満たす50名についてランダムに各試験群に割り付けた。表2には、試験群ごとに被験者のベースライン特性を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 〔3.試験スケジュール〕
 被験者には、被験食品を、決まった摂取タイミングを設定せずに、1日1粒を水またはぬるま湯で摂取してもらった。摂取期間は16週間とした。
 〔4.評価項目〕
 膝関節の違和感について、被験食品の摂取前後で評価を行った。具体的には、主要評価項目として5項目(日常時、歩行時、階段の上り下り時、しゃがみこんで立ち上がる時、長時間の起立時)の膝関節の痛みについては、VAS法(Visual Analogue Scale;視覚アナログ尺度)によるアンケートを実施した。また、副次評価項目として、膝関節の軟骨ターンオーバーの指標として知られる3種のバイオマーカー(血清CPII;II型コラーゲン合成のマーカー、尿中CTX-II;II型コラーゲン分解のマーカー、血清C1,2C;I型&II型コラーゲン分解のマーカー)を測定した。バイオマーカーの分析は、株式会社LSIメディエンスに委託した。また、しゃがみこんで立ち上がる動作、スクワットの動作、階段上り降りの動作を、各々10回の連続動作を要請したとき、被験者に動作可能な回数につき申告してもらった。
 〔5.統計解析〕
 群内比較の解析はWilcoxonの符号付き順位検定が選択された。群間比較の解析はMann-WhitneyのU検定が選択された。有意水準は両側5%とした。
 〔6.結果〕
 表3に結果をまとめて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 その結果、以下のことが明らかとなった。
(1)<VASスコア>
 主要評価項目のVASアンケートの評価は、摂取16週後において複数の設問でスコアの減少が確認され、群内比較での有意差も示された。群間比較においては、歩行時のVASアンケートの変化量において有意差(P<0.039)が示された。その他の評価項目においては、安静時のVASアンケートの結果を代表例として、試験群で摂取16週後にスコアの減少も認められたが、プラセボ群でもスコア減少を示したため、群間比較での有意差は示されなかった。
 図10には、50歳以上の被験者であってスコア10以下の被験者を除外したときの階層解析結果を示す。これによれば、歩行時及び階段の上り下り時のVASスコアについて、摂取16週後に群間で有意差(P=0.013)が認められた。なお、スコア10以下の被験者は、50歳未満の被験者では数多く存在していたが、50歳以上の被験者では、数名程度であった。
(2)<関節軟骨バイオマーカー>
 副次評価項目の関節軟骨バイオマーカーの検査結果において、II型コラーゲンの合成バイオマーカーである血清CPIIは、摂取前と摂取後とで大きな変化は確認されなかった。また、II型コラーゲンの分解バイオマーカーである尿中CTX-IIは、試験群で値が大きく低下して群内での顕著な有意差(P<0.003)が示されたものの、プラセボ群でも減少傾向が示され、両群における群間の有意差は認められなかった。I型&II型コラーゲン分解のマーカーである血清C1,2Cも、摂取前後で試験群に変化がみられず、両群における群間の有意差は認められなかった。CTX-II/CPII比については、CTX-IIの結果と同様、試験群で値が大きく減少を示して、群内での有意差(P=0.037)が示された。また、両群における群間の有意差も認められた。
(3)<10回繰り返し動作のアンケート>
 副次評価項目の10回繰り返し動作のアンケート結果では、いずれの評価項目でも両群で大きな変化が認められず、両群における群間の有意差は認められなかった。
 図11には、50歳以上の被験者であって動作時になんら違和感を生じなかった被験者を除外したときの階層解析結果を示す。これによれば、プラセボ群のスクワット回数は減少を示したのに対し、試験群のスクワット回数はわずかに増加し、摂取16週後に群間での有意差(P=0.040)が示された。
 以上の結果によれば、II型コラーゲンとともにXI型コラーゲンを含有してなるコラーゲン含有組成物は、膝関節の保護に有効であると考えられた。
 

Claims (5)

  1.  魚類軟骨由来のコラーゲン含有組成物を有効成分として含有する軟骨保護用の組成物であって、前記コラーゲン含有組成物はII型コラーゲン及びXI型コラーゲンを含有するものである、該組成物。
  2.  魚類軟骨由来のコラーゲン含有組成物を有効成分として含有する膝関節保護用の組成物であって、前記コラーゲン含有組成物はII型コラーゲン及びXI型コラーゲンを含有するものである、該組成物。
  3.  前記コラーゲン含有組成物は、軟骨細胞のヒアルロン酸産生能を促進する機能性を備えるものである、請求項1又は2記載の組成物。
  4.  前記コラーゲン含有組成物は、前記II型コラーゲンと前記XI型コラーゲンの含有量の質量比が10:1~1:10であり、固形分あたりのコラーゲン含有量が30質量%以上であるよう調製されてなるものである、請求項1又は2記載の組成物。
  5.  前記コラーゲン含有組成物は、サケ鼻軟骨由来のものである、請求項1又は2記載の組成物。
     
     
     
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