WO2023286474A1 - 抗老化剤、化粧品、医薬品、及び発毛促進剤 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to anti-aging agents, cosmetics, pharmaceuticals, and hair growth promoters.
- the three major aging reactions are oxidative reaction, glycation reaction, and chronic inflammatory reaction.
- cellular senescence is closely related to age-related pathologies. For example, removing senescent cells from the body of mice has been proven to extend lifespan.
- ROS reactive oxygen species
- Free radicals include ROS caused by oxidative stress, and oxidative stress is cited as one of the major causes of various geriatric diseases.
- Non-Patent Documents 1 and 2 The mechanism by which oxidative stress-induced ROS promotes cellular senescence has been investigated in detail, and the roles of various intracellular phenomena and molecules are being clarified.
- DNA is fragmented (e.g., Non-Patent Document 3), shortening of the telomere region is promoted (Non-Patent Document 4), and poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) is activated for DNA repair.
- PARP poly (ADP-ribose) polymerase
- NAD+ is consumed (Non-Patent Document 5)
- the activity of SIRT1 is decreased (Non-Patent Document 6), and other phenomena and roles have been clarified.
- Non-Patent Document 7 A mechanism by which cell senescence is induced by the cessation of cytotoxicity has been strongly suggested.
- Non-Patent Document 8 it has been shown that aquaporin-1 and aquaporin-3 (AQP-1, AQP-3) are involved in the activation of skin fibroblasts, and oxidative stress decreases AQP-1 and AQP-3. It has also become clear (Non-Patent Document 8). In addition, it was clarified that hydrogen peroxide is transported into cells by AQP-3 and that it regulates cell signaling as a second messenger, and that its dysregulation is essential for various pathologies in the skin ( Non-Patent Document 9).
- Glycation is also an important event related to cellular aging, but since humans use dietary carbohydrates as their main energy source, glycation of proteins by blood sugar cannot be avoided. Glycation is a non-enzymatic chemical reaction of amino acid residues in various proteins to produce advanced glycation end-products (AGEs). AGEs play an important role in aging throughout the organism and are involved in a wide variety of diseases.
- the concentration of AGEs in skin collagen increases with age and is higher in diabetic patients than in healthy people of the same age.
- the formation and accumulation of intracellular AGEs has been implicated in skin aging, Alzheimer's disease, hypertension, arteriosclerosis and osteoporosis.
- AGE receptors are involved in the decomposition and removal of AGEs, and it is necessary to promote this function.
- AGE receptors include FEEL-1, FEEL-2, AGE-R1, AGE-R3, CD36 and the like.
- Patent Document 1 describes that certain Placenta extracts activate nerve cells.
- Patent Document 2 describes an oral composition containing a Placenta extract and predetermined ingredients.
- H2O2 accelerates cellular senescence by accumulation of acetylated p53 via decrease in the function of SIRT1 by NAD+ depletion.
- Cell Physiol Biochem, 20:45-54 2007.
- An object of the present invention is to provide an anti-aging agent using a placenta-derived substance, as well as cosmetics, pharmaceuticals, and hair growth promoters containing this anti-aging agent.
- an anti-aging agent containing a Placenta extract as a non-decomposed placenta (2) the anti-aging agent according to (1), which has an antioxidative stress effect; (3) the anti-aging agent according to (2), which promotes the expression of at least one of AQP-7, AQP-3, SIRT1, SIRT6, UCP1, P53 and P21; (4) the anti-aging agent according to (1) having an anti-glycation effect; (5) The anti-aging agent according to (4), which promotes the expression of at least one of RAGE, FEEL-1, FEEL-2, CD36, AGE-R1, AGE-R2 and AGE-R3; (6) the anti-aging agent according to (1), which promotes the expression of at least one of Hsp104, gp96, Hsp90, Hsp70, Hsp60 and Hsp32; (7) Cosmetics containing the anti-aging agent according to any one of (1) to (6), (8) A drug compounded
- an anti-aging agent using a placenta-derived substance, and cosmetics, pharmaceuticals, and hair growth promoters containing this anti-aging agent are provided.
- FIG. 4 is a graph showing the cell viability of skin fibroblasts to which oxidative stress was applied in Examples.
- 1 is a graph showing mRNA levels of aquaporin-1 in skin fibroblasts to which oxidative stress was applied in Examples.
- 1 is a graph showing mRNA levels of aquaporin-3 in skin fibroblasts to which oxidative stress was applied in Examples.
- 1 is a graph showing the amount of hyaluronic acid in skin fibroblasts to which oxidative stress was applied in Examples.
- 1 is a graph showing the mRNA level of a molecule involved in intracellular signal transduction (SIRT1) in skin fibroblasts to which oxidative stress was applied in Examples.
- SIRT1 intracellular signal transduction
- 4 is a graph showing the mRNA level of a molecule (P53) involved in intracellular signal transduction in skin fibroblasts to which oxidative stress was applied in Examples.
- 4 is a graph showing the mRNA level of a molecule (P21) involved in intracellular signal transduction in skin fibroblasts to which oxidative stress was applied in Examples.
- 4 is a graph showing the abundance of senescent cells in skin fibroblasts to which oxidative stress was applied in Examples.
- 1 is a graph showing the amount of reactive oxygen species produced in skin fibroblasts to which oxidative stress was applied in Examples.
- the anti-aging agent of the present invention contains Placenta extract as non-decomposed placenta.
- mesenchymal stem cell-derived exosomes may be used as antioxidant stress agents.
- the Placenta extract used in the present invention refers to an extract obtained from the placenta of mammals such as humans, bovines, horses, pigs, and sheep, fish, and other vertebrates.
- the Placenta extract used in the present invention is non-decomposed placenta.
- the non-decomposed placenta is a drug substance in which at least high-molecular-weight components are preserved without enzymatic treatment.
- it is preferable that the non-decomposed placenta is not sterilized at a high temperature.
- the method for obtaining the Placenta extract used in the present invention is not particularly limited as long as it is a method that does not involve enzymatic treatment. and then concentrate by centrifugation or the like, or thaw the frozen placenta, sterilize it at a low temperature, and dry it under low temperature conditions using far infrared rays or the like. Moreover, these treatments and operations are preferably carried out under conditions such as normal pressure and a temperature of 4 to 23°C.
- Placenta extract obtained by this method is not enzymatically treated, so high-molecular-weight components are not decomposed and are preserved.
- placenta extracts obtained by enzymatic treatment, high-temperature sterilization, high-temperature drying, or freeze-drying becomes.
- it is preferably obtained without such treatment. That is, the Placenta extract used in the present invention is preferably not subjected to enzymatic treatment, sterilization at high temperature, drying, and freeze-drying.
- the Placenta extract obtained in this way has an anti-aging effect. More specifically, it has anti-oxidative stress action and anti-glycation action. That is, it can be used as an anti-oxidative stress agent or an anti-glycation agent.
- Mesenchymal stem cells are pluripotent stem cells that have the ability to differentiate into one or more types of cells belonging to the mesenchymal system, such as osteocytes, cardiomyocytes, adipocytes, muscle cells, and chondrocytes.
- mesenchymal stem cells can proliferate while retaining their differentiation potential.
- mesenchymal stem cells are thought to exist in all tissues having mesenchymal tissue, for example, adipose tissue, umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, placenta, dental pulp, amniotic membrane, skeletal muscle, periosteum, endometrium, etc.
- mesenchymal stem cells such as adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, placenta-derived mesenchymal stem cells, and dental pulp-derived mesenchymal stem cells are particularly limited. can be used without
- mesenchymal stem cells may be human-derived (autologous cells) or heterologous (allogeneic cells).
- heterologous mesenchymal stem cells include cattle, horses, pigs, dogs, cats, mice, rats, sheep, and the like.
- autologous mesenchymal cells may be used, or mesenchymal stem cells of others may be used.
- mesenchymal stem cells may be a cell population containing mesenchymal stem cells, and mesenchymal stem cells are preferably 20% or more, more preferably 50% or more, and still more preferably 80% in the cell population. above, particularly preferably 90% or more, most preferably 98% or more.
- mesenchymal stem cells may be cultured and used. It is preferable to culture in a serum-free medium without using any serum. Also, this serum-free medium preferably does not contain phenol red.
- mesenchymal stem cells when a medium containing serum is used, there is a possibility that the mesenchymal stem cells will be stimulated to induce differentiation, resulting in a change to tissue stem cells rather than pluripotent mesenchymal stem cells. be. Therefore, in the present invention, differentiation induction of mesenchymal stem cells during culture can be prevented by using a serum-free medium.
- Exosome extraction methods include ultracentrifugation, ultrafiltration, gel filtration, HPLC, methods using extraction reagents, and methods using filter paper treated to trap exosomes.
- mesenchymal stem cell-derived exosomes it is preferable to add mesenchymal stem cell-derived exosomes to skin fibroblasts. It can be before or after. That is, in the present invention, mesenchymal stem cell-derived exosomes have a preventive effect against oxidative stress and a therapeutic/recovery effect after receiving oxidative stress. In other words, in the present invention, mesenchymal stem cell-derived exosomes have a preventive or therapeutic effect on the production of reactive oxygen species (ROS) derived from oxidative stress and the cell senescence-promoting mechanism. That is, in the present invention, exosomes derived from mesenchymal stem cells have antioxidative stress effects, moisturizing effects on skin cells, and anti-aging effects.
- ROS reactive oxygen species
- the Placenta extract or mesenchymal stem cell-derived exosome extracted in this way can be incorporated into cosmetics.
- cosmetics include lotions, milky lotions, facial cleansers, cleansers, serums, creams, foundations, eyebrows, mascara, eyeshadows, eyeliners, lipsticks, glosses, cheeks, face powders, and nail polishes.
- liquid, cream, solid, stick, powder and other forms can be adopted as the form of cosmetics.
- the anti-aging agent of the present invention has a moisturizing effect on skin cells and an anti-aging effect, it can be incorporated into pharmaceuticals intended for these purposes.
- a drug it can be used as both a prophylactic drug and a therapeutic drug.
- the anti-aging agent of the present invention may be used alone, or may be mixed with generally acceptable additives for formulation.
- dosage forms include oral dosage forms such as tablets, granules, capsules, pills, powders, liquids, suspensions, emulsions, syrups, elixirs, and extracts, injections, Examples include administration forms using parenteral agents such as liquids, suppositories, ointments, patches, poultices, lotions, etc., but there are no particular restrictions, and appropriate selection can be made according to the purpose of treatment or prevention. can be done.
- additives such as excipients, binders, disintegrants, and lubricants can be contained.
- Excipients include starch, carboxymethylcellulose, sucrose, dextrin, corn starch and the like.
- Binders include crystalline cellulose, crystalline cellulose/carmellose sodium, methylcellulose, hydroxypropylcellulose, low-substituted hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, hydroxypropylmethylcellulose acetate succinate, carmellose sodium, ethylcellulose, Carboxymethylethylcellulose, hydroxyethylcellulose, wheat starch, rice starch, corn starch, potato starch, dextrin, pregelatinized starch, partially pregelatinized starch, hydroxypropyl starch, pullulan, polyvinylpyrrolidone, aminoalkyl methacrylate copolymer E, aminoalkyl methacrylate copolymer RS , methacrylic acid copolymer L, methacrylic acid copolymer, polyvinyl acetal diethylaminoacetate, polyvinyl alcohol, gum arabic, gum arabic powder, agar, gelatin, white
- Disintegrants include crystalline cellulose, methyl cellulose, low-substituted hydroxypropyl cellulose, carmellose, carmellose calcium, carmellose sodium, croscarmellose sodium, wheat starch, rice starch, corn starch, potato starch, partially pregelatinized starch, hydroxy Propyl starch, sodium carboxymethyl starch, tragacanth.
- Lubricants include wheat starch, rice starch, corn starch, stearic acid, calcium stearate, magnesium stearate, hydrous silicon dioxide, light anhydrous silicic acid, synthetic aluminum silicate, dried aluminum hydroxide gel, talc, aluminum metasilicate.
- syrups, suspensions, emulsions, and elixirs in addition to commonly used inert diluents such as water and vegetable oils, coloring agents, flavoring agents, flavoring agents, etc. are added. It may be contained as an agent.
- additives such as suspensions, emulsions, and solubilizers before use can be contained.
- additives such as fats, fatty oils, lanolin, vaseline, paraffin, wax, resins, plastics, bases, glycols, higher alcohols, water, emulsifiers, suspending agents, etc. can be contained as In the case of poultices, glycerin, water, water-soluble polymer, water-absorbing polymer, etc. can be contained as additives.
- solvents, emulsifiers, suspending agents and the like can be added as additives.
- the anti-aging agent of the present invention may be blended into foods, beverages, and the like.
- Foods include breads, noodles, sweets, processed meat products, processed seafood products, frozen foods, jellies, ice creams, dairy products, and various seasonings. In addition to general foods, it can also be added to foods for specified health uses, quasi-drugs, health foods, and supplements.
- Beverages include soft drinks, milk drinks, alcoholic beverages, tea, black tea drinks, coffee, fruit juice drinks, carbonated drinks, mineral waters, fruit/vegetable drinks and the like.
- Foods and beverages containing the anti-aging agent of the present invention may also be in the same form as orally administered preparations such as tablets, capsules and syrups.
- sweeteners when producing foods and beverages containing the anti-aging agent of the present invention, sweeteners, coloring agents, preservatives, thickeners, stabilizers may be added as necessary to the extent that the effects of the present invention are not impaired.
- Additives such as agents, gelling agents, antioxidants, color formers, bleaching agents, emulsifiers, swelling agents, acidulants, brighteners, perfumes; solvents; oils may be added.
- One type of these additives may be used alone, or two or more types may be used in combination.
- the proportion of the anti-aging agent blended in the food or beverage can be appropriately adjusted according to the purpose of use. 0001 to 80% by weight, more preferably 0.003 to 50% by weight, still more preferably 0.005 to 30% by weight.
- Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells Human Mesenchymal Stem Cells from Adipose Tissue (hMSC-AT) (C-12977) and dedicated medium (C-28009), and normal human dermal fibroblasts (pediatric): Normal Human Dermal Fibroblasts (NHDF), juvenile foreskin (C-12300) and special medium (C-23020) were all purchased from Promo Cell.
- Each cell was cultured in an incubator under conditions of 37° C. and 5% CO 2 and used for experiments. Also, hereinafter, incubation was performed under these conditions unless otherwise specified.
- Biochemical reagents such as hydrogen peroxide were purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
- the miRCURY Exosome Isolation Kit (Product#: 300102; manufactured by EXIQON) was used to isolate exosomes contained in the culture medium.
- the amount of isolated exosome was measured using a CD9/CD63 ELISA kit (for human-derived exosome quantification).
- the isolated exosome was added to the culture medium at 1/100 volume (final concentration: 100 pg/ml) and incubated for 4 hours.
- the skin fibroblasts were incubated for 2 hours in a medium supplemented with 0.2 mM hydrogen peroxide, washed with phosphate-buffered saline (PBS), replaced with a normal medium, and incubated continuously. After 48 hours, the cells or culture medium were harvested and cell viability was measured. The results are shown as H2O2-NHDF in FIG.
- mesenchymal stem cell-derived exosomes or skin fibroblast-derived exosomes were added, incubated for 4 hours, and then incubated with PBS. The cells were washed away, replaced with a normal medium, and the culture was continued. After 48 hours, the cells or culture medium were harvested and cell viability was measured. The result using mesenchymal stem cell-derived exosome is shown as "H2O2 / MSC-Exo.” .” respectively.
- Fig. 1 shows the results of incubation for 48 hours in a medium without adding Exosome or hydrogen peroxide to skin fibroblasts (Nontreat-NHDF).
- MSC-Exo. The result of adding leaf stem cell-derived exosomes and incubating them in the medium for 48 hours.
- NHDF-Exo. The results of incubation for 48 hours are also shown.
- Hydrogen peroxide solution was added in advance, then exosome derived from skin fibroblasts (H2O2 / NHDF-Exo.), exosome derived from mesenchymal stem cells was added to skin fibroblasts, and then hydrogen peroxide was added. Water was added (MSC-Exo./H2O2), and skin fibroblast-derived exosome was added to skin fibroblasts, and then hydrogen peroxide was added (NHDF-Exo./H2O2). did In addition, measurements were also performed on skin fibroblasts to which neither Exosome nor hydrogen peroxide solution was added (Nontreat-NHDF). Quantitative PCR was used to measure AQP-1 and AQP-3.
- the specific procedure for the quantitative PCR method was as follows. Total RNA was extracted from the recovered specimen using a Trizol reagent and subjected to reverse transcription at 55°C for 10 minutes.
- the PCR reaction solution consists of Luna Universal One-Step Reaction Mix (2x) 10 ⁇ L, Luna WarmStart (registered trademark) RT Enzyme Mix 1 ⁇ L, Total RNA solution 2 ⁇ L, primer pair mix 1.6 ⁇ L (0.4 ⁇ M for each primer) and water 5.4 ⁇ L.
- the reaction was carried out under the conditions of 1 cycle at 95° C. for 1 minute, 45 cycles at 95° C. for 10 seconds, and 50 cycles at 60° C. for 30 seconds. Relative quantification was performed by the comparative Ct method ( ⁇ Ct method). If the difference in ⁇ Ct is greater than 2, it can be determined that there is a significant difference.
- Predetermined primers were used for each target and housekeeping gene (GAPDH).
- mesenchymal stem cell-derived exosomes MSC-Exo./H2O2 and H2O2/MSC-Exo.
- dermal fibroblast-derived exosomes NHDF-Exo./H2O2 and H2O2 / NHDF-Exo.
- hydrogen peroxide solution was first added to skin fibroblasts, and then mesenchymal stem cell-derived exosome (H2O2 / MSC-Exo.) was added. Hydrogen peroxide solution was first added to the cells, then skin fibroblast-derived exosome (H2O2 / NHDF-Exo.) was added, mesenchymal stem cell-derived exosome was added to the skin fibroblasts, and then Hydrogen peroxide solution added (MSC-Exo. / H2O2) and skin fibroblasts added with skin fibroblast-derived exosome followed by hydrogen peroxide solution added (NHDF-Exo.
- H2O2-NHDF skin fibroblasts without Exosome and hydrogen peroxide solution added
- Nontreat-NHDF skin fibroblasts with neither Exosome nor hydrogen peroxide added
- mesenchymal stem cell-derived exosomes (MSC-Exo./H2O2 and H2O2/MSC-Exo.) were added, skin fibroblast-derived exosomes (NHDF-Exo./H2O2 and H2O2 / NHDF-Exo.).
- hydrogen peroxide solution was first added to skin fibroblasts, and then exosomes derived from mesenchymal stem cells were added (H2O2 / MSC-Exo.). Hydrogen peroxide solution was first added to skin fibroblasts, and then skin fibroblast-derived exosome (H2O2 / NHDF-Exo.) was added, and mesenchymal stem cell-derived exosome was added to skin fibroblasts. , then hydrogen peroxide solution added (MSC-Exo. / H2O2), and skin fibroblasts added with skin fibroblast-derived exosome, then hydrogen peroxide solution added (NHDF-Exo . / H2O2) was measured. In addition, measurements were also performed on dermal fibroblasts added with hydrogen peroxide (H2O2-NHDF) without adding Exosome.
- the quantitative PCR method was used to measure the amounts of SIRT1, P53 and P21. Quantitative PCR was carried out according to the procedure shown in the above "Examination of the effect of stimulating the secretion of aquaporins on the activation of skin fibroblasts". The amounts of SIRT1 and P53 were measured 4 hours after the stimulation with oxidative stress, but no change was observed in the amount of P21 after 4 hours. Therefore, the amount of P21 was measured 16 hours after stimulation with oxidative stress. This is probably because there is a delay between the accumulation of P53 and the transmission of the signal to P21 to act.
- oxidative stress H2O2-NHDF
- oxidative stress decreased the SIRT1 mRNA level.
- mesenchymal stem cell-derived exosomes MSC-Exo./H2O2 and H2O2/MSC-Exo.
- SIRT1 mRNA levels were restored.
- mesenchymal stem cell-derived exosomes MSC-Exo./H2O2 and H2O2/MSC-Exo.
- ROS intracellular reactive oxygen species
- ROS reactive oxygen species
- the frozen porcine placenta was thawed, sterilized at a low temperature, and dried with far infrared rays to obtain a Placenta extract. That is, a Placenta extract was obtained without enzymatic treatment and without drying at high temperature.
- human dermal fibroblasts to which Placenta extract was added in advance were incubated for 4 hours and then treated with 0.2 mM hydrogen peroxide solution for 2 hours. After that, it was washed away with PBS, further incubated, and after 48 hours, the cells or culture medium were collected, and the amounts of AQP-7, AQP-3, SIRT1, SIRT6, UCP1, P53 and P21 were measured, and no treatment was performed. compared to controls. Measurements were taken at 1/10 volume (final concentration; 1000 ng/ml), 1/100 volume (final concentration; 100 ng/ml), and 1/1000 volume (final concentration; 10 ng/ml) of the culture medium. It was measured. The results are shown in Table 1 as "samp-H2". AQP-7, AQP-3, SIRT1, SIRT6, UCP1, P53 and P21 were measured using quantitative RT-PCR.
- the PCR reaction solution consists of Luna Universal One-Step Reaction Mix (2x) 10 ⁇ L, Luna WarmStart (registered trademark) RT Enzyme Mix 1 ⁇ L, Total RNA solution 2 ⁇ L, primer pair mix 1.6 ⁇ L (0.4 ⁇ M for each primer) and water 5.4 ⁇ L.
- the reaction was carried out under the conditions of 1 cycle at 95° C. for 1 minute, 45 cycles at 95° C. for 10 seconds, and 50 cycles at 60° C. for 30 seconds. Results are expressed as folds of mRNA levels relative to untreated controls. Predetermined primers were used for each target and housekeeping gene (GAPDH).
- the Placenta extract was added before or after oxidative stress was applied to the cells, but regardless of the timing of addition before or after oxidative stress was applied, the amount of aquaporins and antioxidant mRNA increased. That is, when the cells were subjected to oxidative stress, the amounts of aquaporins and mRNAs acting as antioxidants increased even when Placenta extract was added afterwards.
- the antioxidant effect was strong, and all mRNA levels were strongly elevated. It was suggested that the anti-aging effect of the skin is strengthened by applying the Placenta extract to skin fibroblasts in advance.
- Placenta extract alone was added to the cultured human skin fibroblasts, kept in an incubator at 42°C, and after 4 hours, 1/100 volume of the culture solution (final concentration: 100 ng/ml). We also measured the It is shown as "42deg.” in Table 2.
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Abstract
非分解プラセンタとしてのPlacenta抽出エキスを含む抗老化剤、該抗老化剤を配合させた化粧品、該抗老化剤を配合させた老化反応に対する予防効果および／または治療効果を有する医薬品、非分解プラセンタとしてのPlacenta抽出エキスを含む発毛促進剤を提供する。
Description
本発明は、抗老化剤、化粧品、医薬品、及び発毛促進剤に関するものである。
三大老化反応は、酸化反応、糖化反応、慢性炎症反応である。また細胞の老化は加齢に
伴う病態と密接に関係している。例えばマウスの体から老化細胞を取り除くと寿命が長くなることなどからも証明されてきている。
伴う病態と密接に関係している。例えばマウスの体から老化細胞を取り除くと寿命が長くなることなどからも証明されてきている。
化粧品領域においては、端的に肌細胞（線維芽細胞、角化細胞、メラノサイトなど）の老化を防ぐ、または遅らせることが肌の抗老化と捉えられ、三大老化反応の抑制によりシワ、シミ、くすみ、たるみなどに功奏すると考えられている。
ヒト等の酸素を用いてエネルギーを生成する生体においては、代謝の過程で活性酸素種（ROS）が産生する。生体は、ROSによる損傷に対して解毒・修復・防御等を行う生体が有する抗酸化機能を有しているが、この抗酸化機能による処理能力を上回るROSが産生すると、酸化ストレスが引き起こされる。
また、１９５６年には、生体内で生成するフリーラジカルによってDNA、タンパク質、脂質が損傷するというフリーラジカル説が、Harmanらによって最初に提唱されている。フリーラジカルとしては酸化ストレスによるROSが挙げられ、酸化ストレスが各種老年疾患の主要な原因の一つとして挙げられている。
酸化ストレスによるROSは、生体分子を損傷し、生体構造の変化、機能の低下を引き起こす老化の促進や老年疾患の発症、重篤化において重要な役割を果たしている（非特許文献１および２）。酸化ストレスによるROSが細胞老化を促進する機構については、詳細な検討がなされており、細胞内における様々な現象や各種分子の役割が明らかにされつつある。例えば、DNAが断片化されたり（例えば、非特許文献３）、テロメア領域の短縮が促進されたり（非特許文献４）、DNA修復のためにpoly(ADP-ribose)polymerase（PARP）が活性化され、NAD+が消費されたり（非特許文献５）、SIRT1の活性が低下する（非特許文献６）等の現象や役割が明らかになってきている。
さらにヒト胎児肺線維芽細胞に対する酸化ストレスとして過酸化水素を用いた実験では、SIRT1の活性低下によってアセチル化p53が経時的に増加し、p53の下流分子であるp21の発現が誘導され、細胞周期の停止によって細胞老化が引き起こされる機構が強く示唆された（非特許文献７）。
最近皮膚線維芽細胞の活性化にアクアポリン－１、アクアポリン－３(AQP-1、AQP-3)が関係していることが示されており、酸化ストレスによってAQP-1、AQP-3が減少することも明らかとなった（非特許文献８）。また過酸化水素がAQP-3によって細胞内へ輸送され、second messengerとしてcell signalingを制御していること、およびその調節不全が、皮膚におけるさまざまな病態に必須であることなどが明らかとなった（非特許文献９）。
再生医療が進歩する中、自己間葉系幹細胞(Mesenchymal stem cell; MSC)を体外で培養増殖させた後、体内へ注入することで損傷部位の再生を促すことが報告されている（非特許文献１０）。そして幹細胞に限らず、その分泌物であるExosomeが様々な疾患モデルにおいて治療成果をあげる報告も蓄積されてきているが（非特許文献１１）、標的細胞の増殖促進またはアポトーシスの抑制などの現象を捉えたものが多く、メカニズムの解明には至っていない。
また、糖化反応も細胞老化に関連した重要な事象ではあるが、ヒトは、食物性炭水化物を主要なエネルギー源として使っているため、血糖によるタンパク質の糖化を避けることはできない。糖化反応は、種々のタンパク質中のアミノ酸残基の非酵素的化学反応であり、高度な糖化最終産物(AGE)を生成する。AGEは、生物体全体の老化において重要な役割を果たし、広範な種々の疾患に関与する。
例えば、皮膚コラーゲン中のAGE濃度は加齢とともに増加し、同年齢の健常人よりも糖尿病患者で高い。さらに、細胞内のAGEの形成および蓄積は、皮膚老化、アルツハイマー病、高血圧、動脈硬化および骨粗鬆症に関与することが示されている。
AGEの受容体としては、AGEの分解・除去に関わるものがあり、この働きを促進することが求められる。このようなAGE受容体としては、FEEL-1、FEEL-2、AGE-R1、AGE-R3、CD36等が挙げられる。
また、美容、健康分野または医薬関連分野においては、Placenta抽出エキスを用いることが検討されており、例えば、特許文献１には、所定のPlacenta抽出エキスが神経細胞を活性化させることが記載されている。また、特許文献２には、Placenta抽出エキスと所定の成分を配合した経口用組成物が記載されている。
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本発明の目的は、プラセンタ由来の物質を用いた抗老化剤、また、この抗老化剤を配合させた化粧品、医薬品及び発毛促進剤を提供することである。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討の結果、所定のPlacenta抽出エキスを用いることにより上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明によれば、
（１） 非分解プラセンタとしてのPlacenta抽出エキスを含む抗老化剤、
（２） 抗酸化ストレス作用を有する（１）記載の抗老化剤、
（３） AQP-7、AQP-3、SIRT1、SIRT6、UCP1、P53及びP21のうちの少なくとも１種の発現を促進させる（２）記載の抗老化剤、
（４） 抗糖化作用を有する（１）記載の抗老化剤、
（５） RAGE、FEEL-1、FEEL-2、CD36、AGE-R1、AGE-R2、AGE-R3のうちの少なくとも１種の発現を促進させる（４）記載の抗老化剤、
（６） Hsp104、gp96、Hsp90、Hsp70、Hsp60およびHsp32のうちの少なくとも１種の発現を促進させる（１）記載の抗老化剤、
（７） （１）～（６）の何れかに記載の抗老化剤を配合させた化粧品、
（８） （１）～（６）の何れかに記載の抗老化剤を配合させた老化反応に対する予防効果および／または治療効果を有する医薬品、
（９） 非分解プラセンタとしてのPlacenta抽出エキスを含む発毛促進剤、
（１０） 17型コラーゲンまたはHsp47のうちの少なくとも１種の発現を促進させる（９）記載の発毛促進剤、
が提供される。
（１） 非分解プラセンタとしてのPlacenta抽出エキスを含む抗老化剤、
（２） 抗酸化ストレス作用を有する（１）記載の抗老化剤、
（３） AQP-7、AQP-3、SIRT1、SIRT6、UCP1、P53及びP21のうちの少なくとも１種の発現を促進させる（２）記載の抗老化剤、
（４） 抗糖化作用を有する（１）記載の抗老化剤、
（５） RAGE、FEEL-1、FEEL-2、CD36、AGE-R1、AGE-R2、AGE-R3のうちの少なくとも１種の発現を促進させる（４）記載の抗老化剤、
（６） Hsp104、gp96、Hsp90、Hsp70、Hsp60およびHsp32のうちの少なくとも１種の発現を促進させる（１）記載の抗老化剤、
（７） （１）～（６）の何れかに記載の抗老化剤を配合させた化粧品、
（８） （１）～（６）の何れかに記載の抗老化剤を配合させた老化反応に対する予防効果および／または治療効果を有する医薬品、
（９） 非分解プラセンタとしてのPlacenta抽出エキスを含む発毛促進剤、
（１０） 17型コラーゲンまたはHsp47のうちの少なくとも１種の発現を促進させる（９）記載の発毛促進剤、
が提供される。
本発明によれば、プラセンタ由来の物質を用いた抗老化剤、また、この抗老化剤を配合させた化粧品、医薬品及び発毛促進剤が提供される。
以下、本発明の抗老化剤について説明する。本発明の抗老化剤は、非分解プラセンタとしてのPlacenta抽出エキスを含む。また、本発明においては、抗酸化ストレス剤として、間葉系幹細胞由来のExosomeを用いてもよい。
（Placenta抽出エキス）
本発明において用いるPlacenta抽出エキスは、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等の哺乳類、魚類、その他の脊椎動物等の胎盤から得られる抽出エキスをいう。ここで、本発明において用いるPlacenta抽出エキスは、非分解プラセンタである。非分解プラセンタは、少なくとも酵素処理を行わず、高分子量成分が温存された製剤原料である。また、非分解プラセンタは、高温での殺菌を行わないものであることが好ましい。
本発明において用いるPlacenta抽出エキスは、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等の哺乳類、魚類、その他の脊椎動物等の胎盤から得られる抽出エキスをいう。ここで、本発明において用いるPlacenta抽出エキスは、非分解プラセンタである。非分解プラセンタは、少なくとも酵素処理を行わず、高分子量成分が温存された製剤原料である。また、非分解プラセンタは、高温での殺菌を行わないものであることが好ましい。
本発明に用いるPlacenta抽出エキスを得る方法としては、酵素処理を実施しない方法であれば特に制限はないが、例えば、凍結した胎盤を解凍し、水、生理食塩水、緩衝液等の水溶性溶媒を用いて撹拌し、その後、遠心分離等により濃縮する方法や、凍結した胎盤を解凍し、低温にて殺菌を行い、遠赤外線等を用いて低温条件にて乾燥させる方法などが挙げられる。また、これらの処理・操作は、たとえば、常圧下にて、温度４～２３℃等の条件にて行うことが好ましい。
このような方法にて得られるPlacenta抽出エキスは、酵素処理を行わないため、高分子量の成分が分解されず、温存された状態となる。
なお、酵素処理や高温での殺菌、高温での乾燥、または凍結乾燥を行って得られるプラセンタエキスも存在するが、このような工程を経ると、高分子量の成分が分解され、低分子量の成分となる。本発明においては、このような処理を行わずに得られるものであることが好ましい。すなわち、本発明において用いるPlacenta抽出エキスは、酵素処理を実施せず、また、高温における殺菌や乾燥を行わないことが好ましく、また、凍結乾燥も行わないことが好ましい。
このようにして得られるPlacenta抽出エキスは、抗老化作用を有する。より具体的には、抗酸化ストレス作用および抗糖化作用を有する。すなわち、抗酸化ストレス剤または抗糖化剤として用いることができる。
（間葉系幹細胞）
間葉系幹細胞は、骨細胞、心筋細胞、脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞など、間葉系に属する一種以上の細胞への分化能を有する多能性幹細胞である。また、間葉系幹細胞は、この分化能を保持したまま増殖することができる。また、間葉系幹細胞は、間葉系組織を有する全ての組織に存在すると考えられ、例えば、脂肪組織、臍帯、臍帯血、骨髄、胎盤、歯髄、羊膜、骨格筋、骨膜、子宮内膜等に間葉系幹細胞は存在する。本発明においては、間葉系幹細胞として、脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞等、特に限定することなく用いることができる。
間葉系幹細胞は、骨細胞、心筋細胞、脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞など、間葉系に属する一種以上の細胞への分化能を有する多能性幹細胞である。また、間葉系幹細胞は、この分化能を保持したまま増殖することができる。また、間葉系幹細胞は、間葉系組織を有する全ての組織に存在すると考えられ、例えば、脂肪組織、臍帯、臍帯血、骨髄、胎盤、歯髄、羊膜、骨格筋、骨膜、子宮内膜等に間葉系幹細胞は存在する。本発明においては、間葉系幹細胞として、脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞等、特に限定することなく用いることができる。
なお、本発明において、間葉系幹細胞は、ヒト由来（自家細胞）であってもよいし、異種由来（他家細胞）であってもよい。異種由来の間葉系幹細胞の種として、牛、馬、豚、犬、猫、マウス、ラット、羊等が挙げられる。
また、自家細胞を用いる場合、自己間葉系細胞を用いてもよいし、他人の間葉系幹細胞を用いてもよい。
また、自家細胞を用いる場合、自己間葉系細胞を用いてもよいし、他人の間葉系幹細胞を用いてもよい。
本発明において間葉系幹細胞とは、間葉系幹細胞を含む細胞集団であってもよく、細胞集団において間葉系幹細胞が好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９８％以上含まれる。
なお、本発明において、間葉系幹細胞を培養して用いてもよいが、間葉系幹細胞の培養方法としては、間葉系幹細胞の多能性を維持する観点から、牛やヒト、馬等の血清を用いない無血清培地により培養することが好ましい。また、この無血清培地は、フェノールレッドをも含まないことが好ましい。
ここで、血清を含む培地を用いると、間葉系幹細胞に対して刺激が付与されることにより分化誘導がおこり多能性を有する間葉系幹細胞ではなく、組織幹細胞の状態へ変化する虞がある。そのため、本発明においては、無血清培地を用いることにより、培養時における間葉系幹細胞の分化誘導を防ぐことができる。
（Exosomeの抽出）
Exosomeの抽出方法としては、超遠心分離法、限外濾過法、ゲル濾過法、ＨＰＬＣ、抽出用試薬を用いる方法、Exosomeをトラップできるように処理されたろ紙を用いる方法等が挙げられる。
Exosomeの抽出方法としては、超遠心分離法、限外濾過法、ゲル濾過法、ＨＰＬＣ、抽出用試薬を用いる方法、Exosomeをトラップできるように処理されたろ紙を用いる方法等が挙げられる。
本発明においては、例えば、皮膚線維芽細胞に対して間葉系幹細胞由来Exosomeを添加することが好ましいが、皮膚繊維芽細胞に間葉系幹細胞由来のExosomeを添加するタイミングは、酸化ストレスを加える前であっても後であってもよい。即ち、本発明において、間葉系幹細胞由来のExosomeは、酸化ストレスに対する予防効果及び酸化ストレスを受けた後の治療・回復効果を有する。換言すると、本発明において、間葉系幹細胞由来のExosomeは、酸化ストレスに由来する活性酸素種（ROS）の産生及び細胞老化促進機構に対する予防または治療効果を有する。
即ち、本発明において、間葉系幹細胞由来のExosomeは、抗酸化ストレス作用を有し、肌細胞の保湿効果や抗加齢作用効果を有する。
即ち、本発明において、間葉系幹細胞由来のExosomeは、抗酸化ストレス作用を有し、肌細胞の保湿効果や抗加齢作用効果を有する。
このように抽出されたPlacenta抽出エキスまたは間葉系幹細胞由来のExosomeを化粧品に配合することができる。化粧品としては、化粧水、乳液、洗顔料、クレンジング、美容液、クリーム、ファンデーション、アイブロー、マスカラ、アイシャドウ、アイライン、口紅、グロス、チーク、白粉、マニキュア等が挙げられる。また、化粧品の形態としては、液体、クリーム、固体、スティック、粉末等の形態を採用することができる。
また、本発明の抗老化剤は、肌細胞の保湿効果や抗加齢作用効果を有するため、これらを目的とした医薬品に配合させることもできる。医薬品としては、予防薬、治療薬のいずれにも用いることができる。
医薬品に配合させる場合には、本発明の抗老化剤を単独で用いてもよいし、又は一般に製剤上許容される添加剤と共に混和し、製剤化してもよい。また、投与形態としては、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、エキス剤等の経口剤を用いた投与形態または、注射剤、液剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤、パップ剤、ローション剤等の非経口剤を用いた投与形態等が挙げられるが、特に制限はなく、治療や予防の目的等に応じて適宜選択することができる。
また、錠剤、顆粒剤、丸剤、カプセル剤、散剤の場合には、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等の添加剤を含有させることができる。賦形剤としては、デンプン、カルボキシメチルセルロース、白糖、デキストリン、コーンスターチ等を挙げることができる。
結合剤としては、結晶セルロース、結晶セルロース・カルメロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルメロースナトリウム、エチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、デキストリン、アルファー化デンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、プルラン、ポリビニルピロリドン、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥ、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＲＳ、メタクリル酸コポリマーＬ、メタクリル酸コポリマー、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、アラビアゴム末、寒天、ゼラチン、白色セラック、トラガント、精製白糖、マクロゴールが挙げられる。
崩壊剤としては、結晶セルロース、メチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、トラガントが挙げられる。
滑沢剤としては、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、含水二酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、乾燥水酸化アルミニウムゲル、タルク、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム、無水リン酸水素カルシウム、ショ糖脂肪酸エステル、ロウ類、水素添加植物油、ポリエチレングリコールが挙げられる。
また、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤の場合には、水や植物油等の一般的に用いられる不活性な希釈剤の他、着色剤、矯味剤、着香剤等を添加剤として含有させてもよい。
また、注射剤の場合には、懸濁液、乳濁液、用時溶解剤等の添加剤を含有させることができる。また、軟膏剤、坐剤の場合には、脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、パラフィン、ろう、樹脂、プラスチック、基剤、グリコール類、高級アルコール、水、乳化剤、懸濁化剤等を添加剤として含有させることができる。また、パップ剤の場合にはグリセリン、水、水溶性高分子、吸水性高分子等を添加物として含有させることができる。また、ローション剤の場合には、溶剤、乳化剤、懸濁化剤等を添加剤として含有させることができる。
また、本発明の抗老化剤を、食品や飲料等に配合させてもよい。食品としては、パン類、麺類、菓子類、食肉加工品、魚介加工品、冷凍食品、ゼリー類、アイスクリーム類、乳製品、各種調味料等が挙げられる。また、一般食品の他、特定保健用食品、医薬部外品、健康食品、サプリメントにも配合させることができる。飲料としては、清涼飲料水、乳飲料、酒類、茶、紅茶飲料、コーヒー、果汁飲料、炭酸飲料、ミネラルウォーター類、果実・野菜飲料等が挙げられる。
また、本発明の抗老化剤を配合させた食品や飲料を、錠剤、カプセル剤、シロップ等の経口投与製剤と同様の形態としてもよい。
また、本発明の抗老化剤を配合させた食品や飲料を、錠剤、カプセル剤、シロップ等の経口投与製剤と同様の形態としてもよい。
また、本発明の抗老化剤を配合させた食品や飲料を製造する際に、本発明の効果を妨げない範囲で必要に応じて、甘味料、着色料、保存料、増粘剤、安定化剤、ゲル化剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、乳化剤、膨張剤、酸味料、光沢剤、香料等の添加剤；溶剤；油を添加してもよい。これらの添加剤は一種類を単独で用いてもよいし、二種類以上を組み合わせて用いてもよい。
上記食品や飲料中に配合される抗老化剤の割合は、使用目的に応じて適宜調整することができるが、上記食品や飲料中に配合される抗酸化ストレス剤の割合は、好ましくは０．０００１～８０重量％、より好ましくは０．００３～５０重量％、さらに好ましくは０．００５～３０重量％である。
以下に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本実施例における部および％は、特記しない限り重量基準である。また、実施例の結果を示すグラフ（図１～９）において、標準偏差の表示も行い、統計的な有意性の判断は分散分析（ANOVA）により行い、P値が0.05未満である場合を統計的に有意とみなした。
（間葉系幹細胞の培養）
ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞：Human Mesenchymal Stem Cells from Adipose Tissue (hMSC-AT)（C-12977）と専用培地(C-28009)及び、正常ヒト皮膚線維芽細胞（小児）：Normal Human Dermal Fibroblasts (NHDF), juvenile foreskin(C-12300)と専用培地(C-23020)、はすべてPromo Cell社から購入して使用した。
ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞：Human Mesenchymal Stem Cells from Adipose Tissue (hMSC-AT)（C-12977）と専用培地(C-28009)及び、正常ヒト皮膚線維芽細胞（小児）：Normal Human Dermal Fibroblasts (NHDF), juvenile foreskin(C-12300)と専用培地(C-23020)、はすべてPromo Cell社から購入して使用した。
各細胞は３７℃、５％ＣＯ２の条件下のインキュベーター内で培養して、実験に用いた。また、以下において、特に断りのない限り、インキュベーションはこの条件にて行った。
（生化学試薬）
過酸化水素水など生化学試薬は和光純薬工業株式会社より購入した。
過酸化水素水など生化学試薬は和光純薬工業株式会社より購入した。
（Exosomeの抽出、定量及び細胞への添加）
間葉系幹細胞、線維芽細胞はそれぞれCulture Flaskを用いて、７日間培養し、８０％程度コンフルエントになった状態の培養上清を回収し、遠心（12,000rpm、15分）によって細胞のデブリスを除去した上澄みをExosomeの単離まで４℃で保存した。
間葉系幹細胞、線維芽細胞はそれぞれCulture Flaskを用いて、７日間培養し、８０％程度コンフルエントになった状態の培養上清を回収し、遠心（12,000rpm、15分）によって細胞のデブリスを除去した上澄みをExosomeの単離まで４℃で保存した。
また、培養液中に含まれるExosomeの単離にはmiRCURY Exosome Isolation Kit (Product#: 300102; EXIQON製)を用いた。単離されたExosome量はCD9 / CD63 ELISA キット(ヒト由来Exosome定量用)を用いて測定した。
単離したExosomeは１/１００量で(最終濃度；100pg/ml)培養液に添加して、４時間インキュベーションした。
単離したExosomeは１/１００量で(最終濃度；100pg/ml)培養液に添加して、４時間インキュベーションした。
（細胞への酸化ストレス処理及びExosome処理）
0.2 mM過酸化水素水を添加した培地で、皮膚線維芽細胞を２時間インキュベーションしたのち、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄除去し、通常の培地に入れ替えてインキュベーションを継続した。その後、48時間経過後に細胞または培養液を回収し、細胞生存率の測定を行った。結果を図１のH2O2-NHDFとして示した。
0.2 mM過酸化水素水を添加した培地で、皮膚線維芽細胞を２時間インキュベーションしたのち、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄除去し、通常の培地に入れ替えてインキュベーションを継続した。その後、48時間経過後に細胞または培養液を回収し、細胞生存率の測定を行った。結果を図１のH2O2-NHDFとして示した。
また、0.2mM過酸化水素水を添加した培地で、皮膚線維芽細胞を２時間インキュベーションしたのち、間葉系幹細胞由来Exosomeまたは皮膚線維芽細胞由来Exosomeをそれぞれ添加し、４時間インキュベーションし、PBSで洗浄除去し、通常の培地に入れ替えて培養を継続した。その後、48時間経過後に細胞または培養液を回収し、細胞生存率の測定を行った。結果を間葉系幹細胞由来Exosomeを用いたものについては、図１の「H2O2 / MSC-Exo.」として、皮膚線維芽細胞由来Exosomeを用いたものについては、図１の「H2O2 / NHDF-Exo.」としてそれぞれ示した。
また、あらかじめ間葉系幹細胞由来Exosomeまたは皮膚線維芽細胞由来Exosomeをそれぞれ添加した皮膚線維芽細胞を４時間インキュベーションしたのち、0.2mM過酸化水素水で２時間処理した。その後、PBSで洗浄除去し、さらにインキュベーションを行い、48時間経過後に細胞または培養液を回収し、細胞生存率の測定を行った。結果を間葉系幹細胞由来Exosomeを用いたものについては、図１の「MSC-Exo. / H2O2」として、皮膚線維芽細胞由来Exosomeを用いたものについては、図１の「NHDF-Exo. / H2O2」としてそれぞれ示した。
なお、図１には皮膚線維芽細胞にExosomeも過酸化水素水も加えずに、培地にて48時間インキュベーションした結果（Nontreat-NHDF）、皮膚線維芽細胞に過酸化水素水を加えずに間葉系幹細胞由来Exosomeを添加し、培地にて48時間インキュベーションした結果（MSC-Exo.）及び皮膚線維芽細胞に過酸化水素水を加えずに皮膚線維芽細胞由来Exosomeを添加し、培地にて48時間インキュベーションした結果（NHDF-Exo.）についても示した。
図１に示すように、皮膚線維芽細胞にExosomeを加えた場合（MSC-Exo.およびNHDF-Exo.）には、生存率への影響は特にみられなかったが、過酸化水素水のみを加えた場合（H2O2-NHDF）では、細胞生存率は８８％となった。同様の酸化ストレスを与えた後にExosomeを治療的に添加した場合（H2O2 / MSC-Exo.およびH2O2 / NHDF-Exo.）には、過酸化水素水のみを加えた場合（H2O2-NHDF）と比較して細胞生存率に大きな変動は見られなかった。
一方、予め間葉系幹細胞由来Exosomeを添加し、その後上記と同様の酸化ストレスを与えた場合（MSC-Exo. / H2O2）の細胞生存率は、有意な上昇を示し、その上昇幅は予め皮膚繊維芽細胞由来Exosomeを添加し、その後上記と同様の酸化ストレスを与えた場合（NHDF-Exo. / H2O2）と比較しても有意な差であった。
一方、予め間葉系幹細胞由来Exosomeを添加し、その後上記と同様の酸化ストレスを与えた場合（MSC-Exo. / H2O2）の細胞生存率は、有意な上昇を示し、その上昇幅は予め皮膚繊維芽細胞由来Exosomeを添加し、その後上記と同様の酸化ストレスを与えた場合（NHDF-Exo. / H2O2）と比較しても有意な差であった。
（皮膚線維芽細胞の活性化に関わるアクアポリンの分泌刺激効果の検討）
上記「細胞への酸化ストレス処理及びExosome処理」における処理と同様の処理を行い、アクアポリン－１（AQP-1）およびアクアポリン－３（AQP-3）の量を測定し、結果をそれぞれ図２および図３に示した。アクアポリンの分泌刺激効果の検討については、皮膚繊維芽細胞に過酸化水素水を予め加えて、その後、間葉系幹細胞由来Exosomeを添加したもの（H2O2 / MSC-Exo.）、皮膚繊維芽細胞に過酸化水素水を予め加えて、その後、皮膚線維芽細胞由来Exosomeを加えたもの（H2O2 / NHDF-Exo.）、皮膚線維芽細胞に間葉系幹細胞由来Exosomeを添加し、その後、過酸化水素水を加えたもの（MSC-Exo. / H2O2）及び、皮膚線維芽細胞に皮膚線維芽細胞由来Exosomeを添加し、その後、過酸化水素水を加えたもの（NHDF-Exo. / H2O2）について測定を行った。また、皮膚線維芽細胞にExosomeも過酸化水素水も添加しないもの（Nontreat-NHDF）についても測定を行った。
なお、AQP-1および、AQP-3の測定としては、定量ＰＣＲ法を用いた。
上記「細胞への酸化ストレス処理及びExosome処理」における処理と同様の処理を行い、アクアポリン－１（AQP-1）およびアクアポリン－３（AQP-3）の量を測定し、結果をそれぞれ図２および図３に示した。アクアポリンの分泌刺激効果の検討については、皮膚繊維芽細胞に過酸化水素水を予め加えて、その後、間葉系幹細胞由来Exosomeを添加したもの（H2O2 / MSC-Exo.）、皮膚繊維芽細胞に過酸化水素水を予め加えて、その後、皮膚線維芽細胞由来Exosomeを加えたもの（H2O2 / NHDF-Exo.）、皮膚線維芽細胞に間葉系幹細胞由来Exosomeを添加し、その後、過酸化水素水を加えたもの（MSC-Exo. / H2O2）及び、皮膚線維芽細胞に皮膚線維芽細胞由来Exosomeを添加し、その後、過酸化水素水を加えたもの（NHDF-Exo. / H2O2）について測定を行った。また、皮膚線維芽細胞にExosomeも過酸化水素水も添加しないもの（Nontreat-NHDF）についても測定を行った。
なお、AQP-1および、AQP-3の測定としては、定量ＰＣＲ法を用いた。
定量ＰＣＲ法の具体的な手順としては以下のように行った。回収した検体から、Trizol試薬を用いてTotal RNAを抽出し、５５℃で１０分間逆転写を行った。ＰＣＲ反応液はLuna Universal One-Step Reaction Mix （2x）10μＬ、 Luna WarmStart（登録商標）RT Enzyme Mix 1μＬ、Total RNA溶液2μＬ、primer pair mix 1.6μＬ(各プライマーにつき0.4μＭ)及び水5.4μＬからなる20μＬを用い、反応は９５℃にて１分を１サイクル、さらに９５℃にて１０秒のサイクルを４５サイクルおよび６０℃にて３０秒のサイクルを５０サイクルの条件にて行った。比較Ct法（ΔΔCt法）より相対定量を行った。ΔΔCtの差が２より大きい場合に有意差があると判断することができる。なお、各種ターゲット及びハウスキーピング遺伝子（GAPDH）について、所定のプライマーをそれぞれ用いた。
図２および図３に示すように、皮膚線維芽細胞に酸化ストレスを与える前または後に間葉系幹細胞由来Exosomeを与えた場合（MSC-Exo. / H2O2およびH2O2 / MSC-Exo.）には、AQP-1およびAQP-3のmRNAレベルが修復することが示された。この現象は、酸化ストレスを与える前に間葉系幹細胞由来Exosomeを添加した場合および酸化ストレスを与えた後に間葉系幹細胞由来Exosomeを添加した場合のどちらにも認められた。さらに、間葉系幹細胞由来Exosomeを添加した場合（MSC-Exo. / H2O2およびH2O2 / MSC-Exo.）の方が、皮膚線維芽細胞由来Exosomeを添加した場合（NHDF-Exo. / H2O2およびH2O2 / NHDF-Exo.）よりも強い修復効果が認められた。
（皮膚線維芽細胞の活性化に関わるヒアルロン酸の分泌刺激効果の検討）
上記「細胞への酸化ストレス処理及びExosome処理」における処理と同様の処理を行い、ヒアルロン酸の量を測定し、結果を図４に示した。なお、測定は、細胞培養上清中のヒアルロン酸をELISA Kit , Hyaluronan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay kit (R&D systems.、 Inc. Mineapolis, MN 55413 USA)を用いて測定した。
上記「細胞への酸化ストレス処理及びExosome処理」における処理と同様の処理を行い、ヒアルロン酸の量を測定し、結果を図４に示した。なお、測定は、細胞培養上清中のヒアルロン酸をELISA Kit , Hyaluronan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay kit (R&D systems.、 Inc. Mineapolis, MN 55413 USA)を用いて測定した。
ヒアルロン酸の分泌刺激効果の検討については、皮膚繊維芽細胞に過酸化水素水を先に加えて、その後、間葉系幹細胞由来Exosomeを添加したもの（H2O2 / MSC-Exo.）、皮膚繊維芽細胞に過酸化水素水を先に加えて、その後、皮膚線維芽細胞由来Exosomeを加えたもの（H2O2 / NHDF-Exo.）、皮膚線維芽細胞に間葉系幹細胞由来Exosomeを添加し、その後、過酸化水素水を加えたもの（MSC-Exo. / H2O2）及び、皮膚線維芽細胞に皮膚線維芽細胞由来Exosomeを添加し、その後、過酸化水素水を加えたもの（NHDF-Exo. / H2O2）について測定を行った。また、皮膚線維芽細胞にExosomeを添加せず、過酸化水素水を加えたもの（H2O2-NHDF）及び皮膚線維芽細胞にExosomeも過酸化水素も加えないもの（Nontreat-NHDF）についても測定を行った。
図４に示すように、皮膚線維芽細胞に酸化ストレスのみを与えた場合（H2O2-NHDF）には、線維芽細胞から分泌されるヒアルロン酸量が減少することが示された。その酸化ストレスを与える前または後に間葉系幹細胞由来Exosomeを与えた場合（MSC-Exo. / H2O2およびH2O2 / MSC-Exo.）には、ヒアルロン酸量が回復する傾向にあることが示された。また、間葉系幹細胞由来Exosomeを添加した場合（MSC-Exo. / H2O2およびH2O2 / MSC-Exo.）の方が、皮膚線維芽細胞由来Exosomeを添加した場合（NHDF-Exo. / H2O2およびH2O2 / NHDF-Exo.）よりも強い回復効果が認められた。
（酸化ストレスによる細胞老化の誘導に対する効果の検討）
上記「細胞への酸化ストレス処理及びExosome処理」における処理と同様の処理を行い、細胞内シグナル伝達にかかわる分子（SIRT1、P53及びP21）のmRNAレベルを測定し、結果をそれぞれ図５～７に示した。また、老化細胞が染色される状態を顕微鏡下に観察し、蛍光量を数値化して、図８に示した。
上記「細胞への酸化ストレス処理及びExosome処理」における処理と同様の処理を行い、細胞内シグナル伝達にかかわる分子（SIRT1、P53及びP21）のmRNAレベルを測定し、結果をそれぞれ図５～７に示した。また、老化細胞が染色される状態を顕微鏡下に観察し、蛍光量を数値化して、図８に示した。
酸化ストレスによる細胞老化の誘導に対する効果の検討については、皮膚繊維芽細胞に過酸化水素水を先に加えて、その後、間葉系幹細胞由来Exosomeを添加したもの（H2O2 / MSC-Exo.）、皮膚繊維芽細胞に過酸化水素水を先に加えて、その後、皮膚線維芽細胞由来Exosomeを加えたもの（H2O2 / NHDF-Exo.）、皮膚線維芽細胞に間葉系幹細胞由来Exosomeを添加し、その後、過酸化水素水を加えたもの（MSC-Exo. / H2O2）及び、皮膚線維芽細胞に皮膚線維芽細胞由来Exosomeを添加し、その後、過酸化水素水を加えたもの（NHDF-Exo. / H2O2）について測定を行った。また、皮膚線維芽細胞にExosomeを添加せず、過酸化水素水を加えたもの（H2O2-NHDF）についても測定を行った。
また、蛍光量の数値化（図８）については、皮膚線維芽細胞にExosomeも過酸化水素も加えないもの（Nontreat-NHDF）についても測定を行った。
ここで、SIRT1、P53及びP21の量の測定については、定量PCR法を用いた。定量PCR法については、上記「皮膚線維芽細胞の活性化に関わるアクアポリンの分泌刺激効果の検討」において示した手順により行った。なお、SIRT1およびP53の量は、酸化ストレスによる刺激を与えてから４時間後の測定結果を示すが、P21の量については４時間後の測定結果に変動はみられなかった。そのため、P21の量は、酸化ストレスによる刺激を与えてから１６時間後の測定結果を示した。これはP53が蓄積されてから、P21へシグナルが伝達され作動するまでに、遅れが発生するためと考えられる。
また、蛍光量の測定については、酸化ストレスを与えた皮膚線維芽細胞に各種Exosomeを継続的に添加し、培養、継代を繰り返しながら、細胞老化を測定するためにCellular Senescence detection Kit -SPiDER-β Gal Kit（SG03; DOJINDO :Kumamoto, JAPAN）により老化細胞が染色される状態を顕微鏡下に観察した。取得した画像から老化細胞の存在量を蛍光量として数値化して評価した。
図５～７に示すように、皮膚線維芽細胞に酸化ストレスのみを与えた場合（H2O2-NHDF）には、酸化ストレスによってSIRT1のmRNAレベルが減少することが示された。一方、その酸化ストレスを与える前または後に間葉系幹細胞由来Exosomeを与えた場合（MSC-Exo. / H2O2およびH2O2 / MSC-Exo.）には、SIRT1のmRNAレベルが回復する効果が認められた。
また、間葉系幹細胞由来Exosomeを添加した場合（MSC-Exo. / H2O2およびH2O2 / MSC-Exo.）の方が、皮膚線維芽細胞由来Exosomeを添加した場合（NHDF-Exo. / H2O2およびH2O2 / NHDF-Exo.）よりも強い回復効果が認められた。
また、間葉系幹細胞由来Exosomeを添加した場合（MSC-Exo. / H2O2およびH2O2 / MSC-Exo.）の方が、皮膚線維芽細胞由来Exosomeを添加した場合（NHDF-Exo. / H2O2およびH2O2 / NHDF-Exo.）よりも強い回復効果が認められた。
SIRT1の活性低下によってP53が増加し、P53の下流分子であるP21の発現は４時間では変化は認めなかったが（図示せず）、１６時間後には誘導された。この場合のExosome添加の効果に関して、酸化ストレスを与えた後に間葉系幹細胞由来Exosomeを添加した場合（H2O2 / MSC-Exo.）には、酸化ストレスの抑制についての強い効果はみられなかったが、予め間葉系幹細胞由来Exosomeを添加し、その後上記と同様の酸化ストレスを与えた場合（MSC-Exo. / H2O2）には、酸化ストレスに対して抵抗を示す働きが認められた。
また、図８に示すように、皮膚線維芽細胞に酸化ストレスのみを与えた場合（H2O2-NHDF）には、酸化ストレスによって老化細胞が増加し、蛍光プローブ量は正常細胞（Nontreat-NHDF）の613に比較して4730に上昇した。その酸化ストレスを与える前または後にそれぞれ皮膚線維芽細胞由来のExosomeを添加した場合（NHDF-Exo. / H2O2およびH2O2 / NHDF-Exo.）には、有意の酸化ストレスの抑制効果はみられなかったが（前処理；4381、後処理；4567）、間葉系幹細胞由来Exosomeを添加した場合（MSC-Exo. / H2O2およびH2O2 / MSC-Exo.）ではExosomeを添加するタイミングが酸化ストレスを与える前であっても、後であっても、有意の酸化ストレス抑制効果が認められた（前処理；3403、後処理；3730）。
（細胞内の活性酸素種（ROS）産生の測定）
上記「細胞への酸化ストレス処理及びExosome処理」における処理と同様の処理を行い、その後、それぞれの検体について、PBSで洗浄したのち、１Ｍ蛍光プローブ（CM-H2DCFDA (Molecular Probes Inc., Eugene, OR)を加え、３７℃で６０分インキュベーションした。そして、細胞内の活性酸素種（ROS）の産生量をfluorescence intensity using the micro plate reader (SYNERGY/HT, BioTek, Japan)を用いて測定し、蛍光量を数値化した。結果を図９に示した。
上記「細胞への酸化ストレス処理及びExosome処理」における処理と同様の処理を行い、その後、それぞれの検体について、PBSで洗浄したのち、１Ｍ蛍光プローブ（CM-H2DCFDA (Molecular Probes Inc., Eugene, OR)を加え、３７℃で６０分インキュベーションした。そして、細胞内の活性酸素種（ROS）の産生量をfluorescence intensity using the micro plate reader (SYNERGY/HT, BioTek, Japan)を用いて測定し、蛍光量を数値化した。結果を図９に示した。
細胞内の活性酸素種（ROS）産生の測定については、皮膚繊維芽細胞に過酸化水素水を予め加えて、その後、間葉系幹細胞由来Exosomeを添加したもの（H2O2 / MSC-Exo.）、皮膚繊維芽細胞に過酸化水素水を予め加えて、その後、皮膚線維芽細胞由来Exosomeを加えたもの（H2O2 / NHDF-Exo.）、皮膚線維芽細胞に間葉系幹細胞由来Exosomeを添加し、その後、過酸化水素水を加えたもの（MSC-Exo. / H2O2）及び、皮膚線維芽細胞に皮膚線維芽細胞由来Exosomeを添加し、その後、過酸化水素水を加えたもの（NHDF-Exo. / H2O2）について測定を行った。また、皮膚線維芽細胞にExosomeを添加せず、過酸化水素水を加えたもの（H2O2-NHDF）及び皮膚線維芽細胞にExosomeも過酸化水素も加えないもの（nontreat-NHDF）についても測定を行った。
図９に示すように、皮膚線維芽細胞に酸化ストレスのみを与えた場合（H2O2-NHDF）には、酸化ストレスによって細胞内の蛍光プローブ量は正常細胞（nontreat-NHDF）の2310に比較して16300に上昇した。その酸化ストレスを与える前または後にそれぞれ皮膚線維芽細胞由来のExosomeを添加した場合（NHDF-Exo. / H2O2およびH2O2 / NHDF-Exo.）には、有意の酸化ストレスの抑制効果はみられなかったが（前処理；13960、後処理；14670）、間葉系幹細胞由来Exosomeを添加した場合（MSC-Exo. / H2O2およびH2O2 / MSC-Exo.）ではExsomeを添加するタイミングが酸化ストレスを与える前であっても、後であっても、有意の酸化ストレス抑制効果が認められた（前処理；11230、後処理；12600）。
（Placenta抽出エキスの抗酸化作用）
凍結されたブタ由来プラセンタを解凍し、低温にて殺菌を行い、さらに遠赤外線にて乾燥させることによりPlacenta抽出エキスを得た。すなわち、酵素による処理、高温での乾燥は行わずにPlacenta抽出エキスを得た。
凍結されたブタ由来プラセンタを解凍し、低温にて殺菌を行い、さらに遠赤外線にて乾燥させることによりPlacenta抽出エキスを得た。すなわち、酵素による処理、高温での乾燥は行わずにPlacenta抽出エキスを得た。
また、0.2mM過酸化水素水を添加した培地で、ヒト皮膚線維芽細胞を２時間インキュベーションしたのち、Placenta抽出エキスを添加し、４時間インキュベーションし、PBSで洗浄除去し、通常の培地に入れ替えて培養を継続した。その後、48時間経過後に細胞または培養液を回収し、アクアポリン－７（AQP-7）、アクアポリン－３（AQP-3）、細胞内シグナル伝達にかかわる分子（SIRT1、SIRT6、UCP1、P53及びP21）量を測定し、無処置コントロールと比較した。結果を表１の「H2-samp」として示した。
また、あらかじめPlacenta抽出エキスを添加したヒト皮膚線維芽細胞を４時間インキュベーションしたのち、0.2mM過酸化水素水で２時間処理した。その後、PBSで洗浄除去し、さらにインキュベーションを行い、48時間経過後に細胞または培養液を回収し、AQP-7、AQP-3、SIRT1、SIRT6、UCP1、P53及びP21の量を測定し、無処置コントロールと比較した。
測定は、培養液で1/10量(最終濃度；1000ng/ml)、1/100量(最終濃度；100 ng/ml)、1/1000量(最終濃度；10 ng/ml)としたものについて測定した。結果を表１の「samp-H2」として示した。
なお、AQP-7および、AQP-3 、SIRT1、SIRT6、UCP1、P53及びP21の測定には、定量ＲＴ－ＰＣＲ法を用いた。
測定は、培養液で1/10量(最終濃度；1000ng/ml)、1/100量(最終濃度；100 ng/ml)、1/1000量(最終濃度；10 ng/ml)としたものについて測定した。結果を表１の「samp-H2」として示した。
なお、AQP-7および、AQP-3 、SIRT1、SIRT6、UCP1、P53及びP21の測定には、定量ＲＴ－ＰＣＲ法を用いた。
定量ＰＣＲ法の具体的な手順としては以下のように行った。回収した細胞または培養液から、Trizol試薬を用いてTotal RNAを抽出し、５５℃で１０分間逆転写を行った。ＰＣＲ反応液はLuna Universal One-Step Reaction Mix （2x）10μＬ、 Luna WarmStart（登録商標）RT Enzyme Mix 1μＬ、Total RNA溶液2μＬ、primer pair mix 1.6μＬ(各プライマーにつき0.4μＭ)及び水5.4μＬからなる20μＬを用い、反応は９５℃にて１分を１サイクル、さらに９５℃にて１０秒のサイクルを４５サイクルおよび６０℃にて３０秒のサイクルを５０サイクルの条件にて行った。結果は、無処置コントロールに対するmRNA量の倍数にて示した。なお、各種ターゲット及びハウスキーピング遺伝子（GAPDH）について、所定のプライマーをそれぞれ用いた。
表１に示すように、細胞に酸化ストレスをかける前または後にPlacenta抽出エキス添加したが、添加するタイミングが酸化ストレスをかける前後に関係なく、アクアポリンや抗酸化に働くmRNAの量は上昇した。すなわち、細胞に酸化ストレスをかけた際、後からPlacenta抽出エキスを添加してもアクアポリンや抗酸化に働くmRNAの量は上昇した。
また、酸化ストレスをかける前にPlacenta抽出エキスを添加した場合、抗酸化効果は強く、いずれのmRNAレベルも強く上昇した。皮膚繊維芽細胞にあらかじめPlacenta抽出エキスをなじませておくことにより、皮膚の抗老化作用が強まることが示唆された。
（Placenta抽出エキスの抗糖化作用）
凍結されたブタ由来プラセンタを解凍し、低温にて殺菌を行い、さらに遠赤外線にて乾燥させることによりPlacenta抽出エキスを得た。
凍結されたブタ由来プラセンタを解凍し、低温にて殺菌を行い、さらに遠赤外線にて乾燥させることによりPlacenta抽出エキスを得た。
培養したヒト皮膚線維芽細胞に対して、（１）Placenta抽出エキスを単独で添加した場合（AGE(-)）、および（２）Placenta抽出エキスとＡＧＥをともに添加した場合（AGE(+)）の各種（抗糖化反応関連；RAGE, FEEL-1 -2, CD36, AGER-1,-2,-3, 発毛関連；17型コラーゲン(17-Collagene)、Hsp47、ストレス応答ヒートショックプロテイン；Hsp104, gp96, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp32）のmRNAレベルを定量RT-PCR法により測定し、無処置コントロールと比較した。３７℃のインキュベーター内で保持し、４時間経過時に測定を行った。また、測定は、培養液で1/10量(最終濃度；1000 ng/ml)、1/100量(最終濃度；100 ng/ml)、1/1000量(最終濃度；10 ng/ml)としたものについて測定した。結果を表２に示した。
また、培養したヒト皮膚線維芽細胞に対して、Placenta抽出エキスを単独で添加し、４２℃のインキュベーター内で保持し、４時間経過時に培養液1/100量(最終濃度；100 ng/ml)としたものについても測定を行った。表２において「42deg.」として示した。
定量RT-PCR法の具体的な手順としては以下のように行った。検体を添加したヒト皮膚線維芽細胞からTrizol試薬(ambion)を用いてTotal RNAの抽出を行った。抽出したRNAからPrimeScript RT Master Mix (Takara)の方法に準じてcDNAに逆転写し、SYBR Premix EX Taq II (Takara)により増幅を行った。なお、PCR反応液としては、50μＬ（25μＬ SYBR Green Mix (2x), 1μＬ cDNA, 2μＬ primer pair mix (５pmol／μＬ each primer), 22μＬ Ｈ２Ｏ）のＰＣＲ反応液を用い、反応は９５℃にて３０秒を１サイクル、さらに９５℃にて５秒および６０℃にて３０秒のサイクルを５０サイクルの条件にて行った。
表２に示すように、細胞にAGEを添加して刺激を与えると、各種mRNAレベルを増強する傾向にあった。より糖化ストレスに強い抵抗を示す結果と考えられる。
Claims (10)
- 非分解プラセンタとしてのPlacenta抽出エキスを含む抗老化剤。
- 抗酸化ストレス作用を有する請求項１記載の抗老化剤。
- AQP-7、AQP-3、SIRT1、SIRT6、UCP1、P53及びP21のうちの少なくとも１種の発現を促進させる請求項２記載の抗老化剤。
- 抗糖化作用を有する請求項１記載の抗老化剤。
- RAGE、FEEL-1、FEEL-2、CD36、AGE-R1、AGE-R2、AGE-R3のうちの少なくとも１種の発現を促進させる請求項４記載の抗老化剤。
- Hsp104、gp96、Hsp90、Hsp70、Hsp60およびHsp32のうちの少なくとも１種の発現を促進させる請求項１記載の抗老化剤。
- 請求項１～６の何れかに記載の抗老化剤を配合させた化粧品。
- 請求項１～６の何れかに記載の抗老化剤を配合させた老化反応に対する予防効果および／または治療効果を有する医薬品。
- 非分解プラセンタとしてのPlacenta抽出エキスを含む発毛促進剤。
- 17型コラーゲンまたはHsp47のうちの少なくとも１種の発現を促進させる請求項９記載の発毛促進剤。
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| Title |
|---|
| YASUI, HIROYUKI : " Evaluation of novel-type placental extract as anti-aging material", FRAGRANCE JOURNAL, vol. 44, no. 4, 1 January 2016 (2016-01-01), JP , pages 36 - 45, XP009542527, ISSN: 0288-9803 * |
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