WO2023282227A1 - 細胞操作用溶液、細胞凍結保存方法及び細胞融解方法 - Google Patents

細胞操作用溶液、細胞凍結保存方法及び細胞融解方法 Download PDF

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WO2023282227A1
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cell manipulation
cells
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正成 桑山
リオ 桑山
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株式会社先端生殖技術研究所
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a cell manipulation solution for cryopreserving cells, a cell cryopreservation method and a cell thawing method using this cell manipulation solution.
  • cryopreservation of eggs and embryos has attracted attention in human infertility treatment.
  • a cryopreservation method for mammalian ova, etc. eggs, embryos, etc. are covered with a vitrification liquid and attached to vials, straws, etc., and after sealing the cryopreservation container, they are brought into contact with liquid nitrogen.
  • a method for rapid cooling is known (for example, Patent Document 1).
  • Kuwayama et al. reported a vitrification preservation technique that can preserve fertilized eggs with little damage.
  • This preservation solution does not contain serum and contains at least one water-soluble cellulosic cryoprotectant selected from the group consisting of hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, and hydroxyethylmethylcellulose as a cryoprotectant.
  • the vitrification solution for cells (fertilized eggs) is required to have characteristics such as easy handling of cells during cryopreservation operations.
  • the cryopreservation operation is required to be easily performed in consideration of the load on the cells, shortening the working time.
  • an object of the present invention is to provide a cell manipulation solution that improves the operability of cells, a cell cryopreservation method and a cell thawing method using this cell manipulation solution.
  • the cell manipulation solution according to the present invention is used for vitrification-freezing of cells or thawing of vitrified-frozen cells, and contains a thickening agent, which is xanthan gum, carrageenan, gellan gum. , locust bean gum, guar gum, and diutan gum.
  • a thickening agent which is xanthan gum, carrageenan, gellan gum. , locust bean gum, guar gum, and diutan gum.
  • the cell manipulation solution according to the present invention is characterized by having a thickener concentration of 0.01% by mass to 0.50% by mass and a viscosity of 1.5 mPa ⁇ s to 100 mPa ⁇ s.
  • the cell manipulation solution according to the present invention contains at least one selected from cell membrane permeable cryoprotectants such as dimethylsulfoxide, ethylene glycol, glycerol, propylene glycol and butanediol, and includes trehalose, polyvinylpyrrolidone, sucrose and polyethylene. It is characterized by containing at least one selected from glycol cell membrane impermeable cryoprotective substances.
  • cell membrane permeable cryoprotectants such as dimethylsulfoxide, ethylene glycol, glycerol, propylene glycol and butanediol
  • trehalose polyvinylpyrrolidone
  • sucrose sucrose
  • polyethylene polyethylene
  • the cell cryopreservation method uses a plate having at least a first well and a second well filled with the above cell manipulation solution, and the first cell manipulation solution filled in the first well is A first step in which the viscosity of the thickener is lower than that of the second cell manipulation solution filled in the second well, and the cells are immersed in the first cell manipulation solution in the first well. After the first step, the cells are removed from the first cell manipulation solution in the first well and immersed in the second cell manipulation solution in the second well; and a third step of removing from the second cell manipulation solution in the two wells and freezing.
  • the cell lysis method according to the present invention is a cell lysis method in which cells are thawed using a plate having first, second, third, and fourth wells filled with the cell manipulation solution.
  • the viscosity of the thickener in the fourth cell manipulation solution filled in the fourth well is a first step of immersing the cells in the fourth cell manipulation solution in the fourth well and thawing the cells, which has a higher viscosity than the thickening agent in the solution and the third cell manipulation solution filled in the third well; , after the first step, the cells are removed from the fourth cell manipulation solution in the fourth well and immersed in the first cell manipulation solution in the first well; and a third step of removing from the first cell manipulation solution in the well and immersing in the second cell manipulation solution in the second well.
  • the cell manipulation solution of the present invention contains a thickening agent.
  • the thickening agent contains at least one of xanthan gum, carrageenan, gellan gum, locust bean gum, guar gum and diutan gum.
  • the above cell manipulation solution is used as the equilibrium liquid and the vitrification liquid, and the vitrification liquid has a low viscosity thickening agent as the equilibrium liquid.
  • the cells After immersing the cells in the equilibration solution, the cells are immersed in a vitrification solution and frozen.
  • This cell cryopreservation method improves the operability of cells and enables cells to be vitrified in a shorter time than conventional methods.
  • the cell manipulation solution is used as the thawing liquid, diluent and washing liquid, and the viscosity of the thickening agent in the thawing liquid is made higher than that of the diluent and washing liquid.
  • the cells are immersed in the lysing solution, they are immersed in the diluent and then in the washing solution.
  • FIG. 1 is a perspective view of a cell freezing instrument filled with a cell manipulation solution according to a first embodiment of the present invention
  • FIG. 1 is a cross-sectional view of a cell freezing instrument filled with a cell manipulation solution according to a first embodiment of the present invention
  • FIG. Fig. 2 is a perspective view of a cell lysis instrument filled with a cell manipulation solution according to a second embodiment of the present invention
  • FIG. 4 is a cross-sectional view of a cell lysis instrument filled with a cell manipulation solution according to a second embodiment of the present invention.
  • the cell manipulation solution according to this embodiment is used as a cell vitrification solution.
  • This cell vitrification solution is used, for example, when cryopreserving mammalian sperm, ova, and embryos.
  • This cell vitrification solution contains a thickener, for example, at least one of polysaccharide thickeners such as xanthan gum, carrageenan, gellan gum, locust bean gum, guar gum, and diutan gum. Hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose and hydroxyethylmethylcellulose are not contained.
  • the thickener is preferably contained at a concentration of 0.01% by mass to 0.50% by mass with respect to the cell vitrification solution. Moreover, it is most preferable that it is 0.03 mass % to 0.30 mass %. If the concentration of the thickening agent is lower than 0.01% by mass, the thickening effect is lost, and the cells may come into contact with each other in the cell vitrification solution and adhere to each other. Operability is sometimes reduced. On the other hand, when the concentration of the thickening agent is higher than 0.50% by mass, the viscosity of the cell vitrification solution increases, and the operability of cells in the cell vitrification solution decreases.
  • the viscosity of the cell vitrification solution is preferably from 1.5 mPa ⁇ s to 100 mPa ⁇ s. If the viscosity of the cell vitrification solution is less than 1.5 mPa s, the cells may come into contact with each other in the cell vitrification solution and adhere to each other, resulting in reduced operability when handling a single cell. do. On the other hand, if it is more than 100 mPa ⁇ s, it becomes difficult to take out the cells from the cell vitrification solution, and the operability of the cells decreases. The viscosity of each solution was measured using a tuning fork vibration viscometer (22° ⁇ 1.0°).
  • the cell vitrification solution contains multiple salts, multiple amino acids, multiple buffers, etc. Furthermore, this cell vitrification solution contains at least one selected from cell membrane permeable cryoprotectants such as dimethyl sulfoxide, ethylene glycol, glycerol, propylene glycol and butanediol, trehalose, polyvinylpyrrolidone, sucrose, At least one selected from cell membrane impermeable cryoprotective substances such as polyethylene glycol is included.
  • cell membrane permeable cryoprotectants such as dimethyl sulfoxide, ethylene glycol, glycerol, propylene glycol and butanediol, trehalose, polyvinylpyrrolidone, sucrose.
  • cell membrane impermeable cryoprotective substances such as polyethylene glycol is included.
  • FIG. 1 This cell freezing instrument 1 can be used when freezing various cells.
  • a case of use when freezing a fertilized egg (blastocyst) will be described as an example.
  • the cell freezing instrument 1 includes a plate body 2 and a lid 3 that covers the plate body 2 from above.
  • the longitudinal direction of the plate body 2 is referred to as the left-right direction X
  • the widthwise direction of the plate body 2 is referred to as the front-rear direction Y
  • the height direction of the plate body 2 is referred to as the up-down direction Z.
  • the plate body 2 has a horizontally long shape, and has a front wall 4, a rear wall 5 facing the front wall 4, and a left side wall 6 and a right side wall 7 formed by connecting the front wall 4 and the rear wall 5. .
  • the plate body 2 is made of a transparent material such as polypropylene, polystyrene, acrylic, or glass.
  • the size of the plate body 2 is designed so that the length L1 in the left-right direction X is 5.5 cm to 7.5 cm, and the length L2 in the front-rear direction Y is 2 cm to 3.5 cm.
  • the plate body 2 is formed with a first well 8, a second well 9 and a third well 10 each having a substantially semispherical shape in the horizontal direction X.
  • the first to third wells 8 to 10 are designed to have substantially the same diameter and depth.
  • a first well 8 is filled with an equilibration solution (ES), and a second well 9 and a third well 10 are filled with a vitrification solution (VS).
  • ES equilibration solution
  • VS vitrification solution
  • the cell vitrification solutions described above are used as equilibration solution ES and vitrification solution VS.
  • the vitrification fluid VS is a solution containing a cryoprotectant necessary for vitrifying cells, and the vitrification fluid VS contains basal medium (MEM), antibiotics, and the like.
  • the equilibrium solution ES is a solution containing a cryoprotectant at a lower concentration than the vitrification solution VS, and the equilibrium solution ES contains a basal medium (MEM) and antibiotics.
  • cell vitrification solutions with different thickener (thickening polysaccharide) concentrations and viscosities are used as the equilibrium solution ES and the vitrification solution VS.
  • concentration of the thickening agent in the equilibrium liquid ES is lower than the concentration of the thickening agent in the vitrification liquid VS.
  • the viscosity of the thickening agent in the equilibrium liquid ES is preferably lower than the viscosity of the thickening agent in the vitrification liquid VS.
  • the concentration of the thickening agent in the equilibrium liquid ES is set to 0.048% by mass
  • the concentration of the thickening agent in the vitrification liquid VS is set to 0.060% by mass.
  • the viscosity of the thickener in the equilibrium liquid ES is preferably 2.0 to 4.0 mPa ⁇ s
  • the viscosity of the thickener in the vitrification liquid VS is preferably 7.0 to 13 mPa ⁇ s.
  • Equilibrium solution ES (first cell manipulation solution) in first well 8
  • vitrification solution VS (second cell manipulation solution) in second well 9
  • vitrification solution VS (third cell manipulation solution) in third well 10 solution) is dispensed at 300 ⁇ L each.
  • a plurality of fertilized eggs are put into the first well 8 .
  • the equilibrium solution ES has a predetermined viscosity
  • the fertilized eggs that have been introduced slowly settle down to the bottom. By slowly settling down to the bottom, the whole surface of the fertilized egg is soaked with the equilibrium solution ES, and the inside of the fertilized egg is permeated with the cryoprotectant and equilibrated.
  • the equilibrium solution ES has a predetermined viscosity
  • the fertilized eggs are less likely to come into contact with each other in the equilibrium solution ES in the first well 8, making it easier to manipulate each cell.
  • the fertilized egg and the equilibrium solution ES are aspirated from the first well 8 with a capillary, and the sucked fertilized egg and the equilibrium solution ES are transferred to the second well 9 .
  • the vitrification fluid VS has a predetermined viscosity
  • the fertilized egg that has been introduced floats slowly to near the surface of the vitrification fluid VS.
  • the capillaries are co-washed with the vitrification fluid VS inside the second well 9 and the third well 10, and the floating fertilized eggs and the vitrification fluid VS in the second well 9 are aspirated.
  • the sucked fertilized egg and vitrification fluid VS are put into the third well 10 .
  • the vitrification liquid VS has a predetermined viscosity
  • the fertilized eggs that are put in slowly float in the vitrification liquid VS.
  • the capillary is co-washed with the vitrification fluid VS inside the third well 10 .
  • the fertilized egg aspirated by the capillary is dropped onto the tip of a rod-shaped cell freezing tool and frozen with liquid nitrogen.
  • the cell vitrification solution according to the present embodiment contains a thickener and has a predetermined viscosity, it is possible to adjust the sedimentation speed and floating speed of cells in the cell vitrification solution, It becomes easier to manipulate cells while ensuring safety. Therefore, the work load can be reduced, and the operation time can be shortened.
  • concentration of the thickener in the cell vitrification solution is from 0.01% by mass to 0.50% by mass, or when the viscosity of the cell vitrification solution is from 1.5 mPa ⁇ s to 100 mPa ⁇ s has good operability when handling a plurality of cells, and can be operated in a short time.
  • the fertilized egg slowly settles in the equilibrium solution ES.
  • the entire zygote (especially the lower part) is in contact with the cell vitrification solution for a longer period of time, making the zygote more stable than when the zygote settles in the solution immediately. It can be vitrified.
  • the fertilized egg gently touches the bottom of the container, thereby reducing the load on the fertilized egg.
  • the fertilized egg floats slowly in the vitrification fluid VS of the second well 9, it is possible to prevent the fertilized egg from being lost in the vitrification fluid VS.
  • thickening polysaccharides described above it is particularly useful as a cell vitrification solution containing only xanthan gum.
  • Cell vitrification solutions containing two or more of polysaccharide thickeners such as xanthan gum, carrageenan, gellan gum, locust bean gum, guar gum and diutan gum are also highly effective.
  • concentration of the thickening agent was 0.03% by mass to 0.30% by mass, the operability of the cells was remarkably good. again,
  • the cell cryopreservation method according to the present embodiment is performed using the above-described cell vitrification solution, changing the concentration and viscosity of the thickener in the equilibrium solution ES and the vitrification solution VS, Adjusting the speed improves cell manipulation. Therefore, the time required for the fertilized egg to reach the desired shape is shorter than in conventional cryopreservation methods. Therefore, with this cell cryopreservation method, cells can be frozen more safely, and the cell cryopreservation method according to this embodiment is highly useful.
  • the cell manipulation solution according to this embodiment can also be used as a cell thawing solution for vitrification-frozen cells.
  • This cell lysing solution is used for the purpose of improving the operability of the cell lysing operation.
  • a vitrification cryopreservation medium for example, a vitrification cryopreservation medium for animal cells described in Patent Document 2
  • a thawing liquid for thawing cells has been used as a thawing liquid for thawing cells.
  • this solution has a problem that the cellulosic substance precipitates when heated to about 37 degrees.
  • the cell lysing solution according to the present embodiment contains at least one of polysaccharide thickeners such as xanthan gum, carrageenan, gellan gum, locust bean gum, guar gum, and diutan gum. Does not contain ethyl methyl cellulose.
  • the thickener is preferably contained at a concentration of 0.01% by mass to 0.50% by mass with respect to the cell lysis solution. Moreover, it is most preferable that it is 0.03 mass % to 0.30 mass %. If the concentration of the thickening agent is lower than 0.01% by mass, the thickening property may be lost and the operability may deteriorate. On the other hand, when the concentration of the thickening agent is higher than 0.50% by mass, the viscosity of the cell lysis solution increases and the operability of cells in the cell vitrification solution decreases.
  • the viscosity of the cell lysing solution is preferably from 1.5 mPa ⁇ s to 100 mPa ⁇ s. If the viscosity of the cell lysing solution is less than 1.5 mPa ⁇ s, the thickening property may be lost and the operability may deteriorate. On the other hand, if it is more than 100 mPa ⁇ s, the viscosity of the cell lysis solution increases, and the operability of cells in the cell vitrification solution decreases.
  • FIG. 1A This cell thawing instrument 1A can be used when thawing various cells.
  • an example of use for melting a frozen fertilized egg (blastocyst) will be described.
  • the cell lysis instrument 1A has a horizontally long plate body 2A in the left-right direction X, as shown in FIG.
  • a sealing material may be provided on the upper surface of the plate body 2A in a detachable manner.
  • the plate body 2A has a front wall 4A, a rear wall 5A facing the front wall 4A, and a left side wall 6A and a right side wall 7A formed by connecting the front wall 4A and the rear wall 5A.
  • a transparent and light material such as polypropylene, polystyrene, polycarbonate, or acrylic is used for the plate body 2A.
  • a semispherical first well 8A, a semispherical second well 9A, a semispherical third well 10A, and a substantially trapezoidal fourth well 11 in plan view are provided in the left-right direction X.
  • the first well 8A, the second well 9A and the third well 10A are formed so as to protrude from the bottom wall of the groove of the plate body 2A.
  • the first well 8A is formed on the right side of the fourth well 11 in the horizontal direction X
  • the second well 9A is formed on the right side of the first well 8A
  • the third well 10A is formed on the right side of the second well 9A.
  • the fourth well 11 has a bottom wall 13 having a sloped portion 12 that slopes from left to right in the left-right direction X.
  • the fourth well 11 is filled with a melting solution TS (Thawing Solution).
  • the first well 8A is filled with a dilution solution DS (Dilution Solution)
  • the second well 9A is filled with a washing solution WS1 (Washing Solution 1)
  • the third well 10A is filled with a washing solution WS2 (Washing Solution 2).
  • the cell lysing solution according to this embodiment is used as a lysing solution TS, diluent DS, and washing solutions WS1 and WS2.
  • the lysate TS and the diluent DS contain basal medium (MEM), antibiotics, cell-impermeable dehydration-promoting substances (eg, trehalose), and the like.
  • Wash solutions WS1 and WS2 contain basal medium (MEM) and antibiotics, but do not contain cell-impermeable dehydration-promoting substances (eg, trehalose).
  • cell lysis solutions with different thickener concentrations and viscosities are used as the lysis solution TS, diluent solution DS, and washing solutions WS1 and WS2.
  • the concentration and viscosity of the thickener in the melt TS are preferably higher than the concentrations and viscosities of the thickener in the diluent DS and the cleaning liquids WS1 and WS2.
  • the concentration of the thickening agent in the melt TS is 0.06% by mass
  • the concentration of the thickening agent in the diluent DS is 0.06% by mass
  • the concentration of the thickening agent in the cleaning liquids WS1 and WS2 is 0.06% by mass.
  • the viscosity of the thickener in the melt TS is 7.0 to 15 mPa ⁇ s
  • the viscosity of the thickener in the diluent DS is 2.5 to 4.0 mPa ⁇ s
  • the viscosity of the thickener in the cleaning liquids WS1 and WS2 is The viscosity is preferably 1.5 to 2.0 mPa ⁇ s.
  • Thawing solution TS (fourth cell thawing solution) in fourth well 11, diluent DS (first cell thawing solution) in first well 8A, washing solution WS1 (second cell thawing solution) in second well 9A,
  • the third wells 10A are each filled with a washing solution WS2 (third cell lysing solution). Then, the fertilized egg frozen on the cell manipulation instrument is immersed in the thawing solution TS. Since the melting liquid TS has a predetermined viscosity, the melting liquid TS slowly permeates the frozen fertilized egg. Thereafter, the thawed fertilized egg is separated from the cell manipulation instrument and slowly floats in the lysing solution TS.
  • the floating fertilized eggs are put into the diluent DS in the first well 8A and diluted for 3 minutes.
  • the diluted fertilized egg is put into the washing solution WS1 of the second well 9A and washed for 5 minutes. At this time, it is confirmed that the fertilized egg has the desired shape. After confirming the form, it is put into the washing liquid WS2 of the third well 10A to complete the washing. After completion of washing, the fertilized egg is used for embryo transfer or the like.
  • the cell lysing solution according to the present embodiment contains a thickening agent, which allows the cell floating speed in the cell lysing solution to be adjusted, thereby facilitating the cell thawing operation while ensuring safety.
  • a thickening agent which allows the cell floating speed in the cell lysing solution to be adjusted, thereby facilitating the cell thawing operation while ensuring safety.
  • concentration of the thickening agent in the cell lysing solution is 0.01% by mass to 0.50% by mass, or when the viscosity of the cell lysing solution is 1.5 mPa ⁇ s to 100 mPa ⁇ s.
  • the thickening polysaccharides described above it is particularly useful as a cell lysing solution containing xanthan gum.
  • the cell lysis solution according to the present embodiment can safely lyse cells without depositing substances even when heated up to 37°C.
  • the lysing solution In conventional lysing solutions, the lysing solution easily permeates the fertilized eggs, so there is a risk that the fertilized eggs may be detached from the cell manipulation instrument immediately after being immersed in the lysing solution, and the fertilized eggs may be lost. Since the melting liquid TS of the present embodiment has a predetermined viscosity, the fertilized eggs immersed in the melting liquid TS are gradually permeated with the melting liquid TS. Since it floats slowly in the TS, it is possible to prevent the fertilized egg from being lost in the melt TS.
  • the cell thawing method according to the present embodiment is performed using the cell thawing solution described above, and by changing the concentrations and viscosities of the thickening agents in the lysing solution TS, the diluent DS, and the washing solutions WS1 and WS2, the lysing solution TS It improves the handling of the fertilized egg during isotination and reduces the time it takes for the fertilized egg to reach the desired morphology compared to conventional thawing methods.
  • the viscosity of the thickener in the melt TS higher than the viscosity of the thickener in the diluent DS and the washing liquids WS1 and WS2
  • the operability of the cells is enhanced. Therefore, cells can be manipulated more safely by this cell thawing method, and the cell thawing method according to this embodiment is highly useful.
  • Polysaccharides are not limited to xanthan gum, carrageenan, gellan gum, locust bean gum, guar gum, diutan gum, as long as they are highly safe and have a thickening effect.
  • hyaluronic acid, rhamsan gum, hexuronic acid, fucoidan , pectin and the like can also be used.
  • the cell manipulation solution can be used as long as it is a solution for manipulating cells other than freezing or thawing of cells.

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Abstract

細胞の操作性を向上させる細胞操作用溶液、この細胞操作用溶液を用いた細胞凍結保存方法及び細胞融解方法を提供する。この細胞操作用溶液は、細胞のガラス化凍結又はガラス化凍結された細胞の融解に使用するためのものであり、増粘剤が含有され、この増粘剤が、キサンタンガム、カラギーナン、ジェランガム、ローカストビーンガム、グァーガム、ダイユータンガムの中から選択される少なくとも一つを含む。この細胞操作用溶液を使用することで、細胞のガラス化凍結やガラス化凍結された細胞の融解における細胞の操作性が向上する。

Description

細胞操作用溶液、細胞凍結保存方法及び細胞融解方法
　本発明は、細胞を凍結保存するための細胞操作用溶液、この細胞操作用溶液を用いた細胞凍結保存方法及び細胞融解方法に関するものである。
　近年、ヒトの不妊治療において、卵子や胚の凍結保存が注目されている。
　従来、哺乳動物の卵子等の凍結保存方法として、バイアルやストロー等に、卵や胚等をガラス化液で包被して貼り付け、凍結保存用容器を密封した後、液体窒素に接触させて急速に冷却する方法が知られている（例えば、特許文献１）。
　また、損傷をほとんど与えずに受精卵を保存できるガラス化保存技術が桑山らによって報告されている。
　受精卵をガラス化し、保存する際に使用される保存液が報告されている（例えば、特許文献２）。この保存液は、血清を含まず、凍結保護物質としてヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロースからなる群より選択された少なくとも一種の水溶性セルロース系凍結保護物質を含有している。
特開２０００－１８９１５５号公報 特開２０１１－１１１４０６号公報
　細胞（受精卵）のガラス化の保存液には、安全性に加え、凍結保存操作の際に細胞が取り扱いしやすい等の特性が求められている。そして、凍結保存操作には、細胞への負荷を考慮し、作業時間を短縮し、容易にできることが求められている。
　そこで、本発明は、細胞の操作性を向上させる細胞操作用溶液、この細胞操作用溶液を用いた細胞凍結保存方法及び細胞融解方法を提供することを目的とする。
　本発明に係る細胞操作用溶液は、細胞のガラス化凍結又はガラス化凍結された細胞の融解に使用するものであって、増粘剤が含有され、この増粘剤が、キサンタンガム、カラギーナン、ジェランガム、ローカストビーンガム、グァーガム、ダイユータンガムの中から選択される少なくとも一つであることを特徴とする。
　本発明に係る細胞操作用溶液は、増粘剤の濃度が０．０１質量％から０．５０質量％であり、粘度が１．５ｍＰａ・ｓから１００ｍＰａ・ｓであることを特徴とする。
　本発明に係る細胞操作用溶液は、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール、ブタンジオールの細胞膜透過性凍結保護物質の中から選択される少なくとも一つが含まれ、トレハロース、ポリビニルピロリドン、スクロース、ポリエチレングリコールの細胞膜非透過性凍結保護物質の中から選択される少なくとも一つが含まれていることを特徴とする。
　本発明に係る細胞凍結保存方法は、上記の細胞操作用溶液が充填される、少なくとも第一ウェル及び第二ウェルを備えるプレートを用い、第一ウェルに充填される第一細胞操作用溶液中の増粘剤の粘度が、第二ウェルに充填される第二細胞操作用溶液中の増粘剤の粘度よりも低く、細胞を第一ウェル中の第一細胞操作用溶液に浸漬させる第一工程と、第一工程後、細胞を第一ウェル中の第一細胞操作用溶液から取り出し、第二ウェル中の第二細胞操作用溶液に浸漬させる第二工程と、第二工程後、細胞を第二ウェル中の第二細胞操作用溶液から取り出し、凍結させる第三工程と、を含むことを特徴とする。
　本発明に係る細胞融解方法は、上記の細胞操作用溶液が充填される、第一ウェル、第二ウェル、第三ウェル、第四ウェルを備えるプレートを用いて、細胞を融解する細胞融解方法であって、第四ウェルに充填される第四細胞操作用溶液中の増粘剤の粘度が、第一ウェルに充填される第一細胞操作用溶液、第二ウェルに充填される第二細胞操作用溶液及び第三ウェルに充填される第三細胞操作用溶液中の増粘剤の粘度よりも高く、細胞を第四ウェル中の第四細胞操作用溶液に浸漬させ、融解する第一工程と、第一工程後、細胞を第四ウェル中の第四細胞操作用溶液から取り出し、第一ウェル中の第一細胞操作用溶液に浸漬させる第二工程と、第二工程後、細胞を第一ウェル中の第一細胞操作用溶液から取り出し、第二ウェル中の第二細胞操作用溶液に浸漬させる第三工程と、を含むことを特徴とする。
　本発明の細胞操作用溶液には、増粘剤が含まれている。この増粘剤には、キサンタンガム、カラギーナン、ジェランガム、ローカストビーンガム、グァーガム、ダイユータンガムの中から少なくとも一つが含有されている。これらの増粘剤を含むことで、例えば、細胞をガラス化する際に細胞操作用溶液内でゆっくり沈降及び浮遊させることができるため、操作性が向上し、作業負担を軽減でき、操作時間を短縮することができる。
　本発明の細胞凍結保存方法は、上述の細胞操作用溶液を平衡液及びガラス化液として使用し、平衡液にはガラス化液中の増粘剤の粘度が低いものを使用する。そして細胞を平衡液に浸漬させた後、細胞をガラス化液に浸漬させ、凍結させる。この細胞凍結保存方法により、細胞の操作性が向上し、従来よりも短時間で細胞をガラス化できる。
　本発明の細胞融解方法は、細胞操作用溶液を融解液、希釈液及び洗浄液として使用し、融解液中の増粘剤の粘度を希釈液や洗浄液の粘度より高くする。そして、細胞を融解液に浸漬させた後、希釈液に浸漬させ、さらに洗浄液に浸漬させる。この細胞融解方法により、細胞の操作性が向上し、従来よりも短時間で細胞を融解し、利用することができる。
本発明の第一実施形態に係る細胞操作用溶液が充填された細胞凍結用器具の斜視図である。 本発明の第一実施形態に係る細胞操作用溶液が充填された細胞凍結用器具の断面図である。 本発明の第二実施形態に係る細胞操作用溶液が充填された細胞融解用器具の斜視図である。 本発明の第二実施形態に係る細胞操作用溶液が充填された細胞融解用器具の断面図である。
［第一実施形態］
　本実施形態に係る細胞操作用溶液は、細胞ガラス化用溶液として使用される。
　この細胞ガラス化用溶液は、例えば、哺乳類の精子、卵子、胚を凍結保存する際に使用される。この細胞ガラス化用溶液には増粘剤が含まれ、例えば、増粘多糖類であるキサンタンガム、カラギーナン、ジェランガム、ローカストビーンガム、グァーガム、ダイユータンガムの中から少なくとも一つが含有されている。
　なお、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースやヒドロキシエチルメチルセルロースは含有されていない。
　増粘剤は、細胞ガラス化用溶液に対し、０．０１質量％から０．５０質量％の濃度で含有されていることが好ましい。また、０．０３質量％から０．３０質量％であることが最も好ましい。増粘剤の濃度が０．０１質量％よりも低い場合、増粘性の効果が失われ、細胞ガラス化用溶液中で細胞同士が接触し、接着してしまうおそれがあり、一つの細胞を取り扱うときに操作性が低下する。一方、増粘剤の濃度が０．５０質量％よりも高い場合、細胞ガラス化用溶液の粘度が大きくなり、細胞ガラス化用溶液中における細胞の操作性が低下する。
　また、細胞ガラス化用溶液の粘度が１．５ｍＰａ・ｓから１００ｍＰａ・ｓであることが好ましい。細胞ガラス化用溶液の粘度が１．５ｍＰａ・ｓよりも小さい場合、細胞ガラス化用溶液中で細胞同士が接触し、接着してしまうおそれがあり、一つの細胞を取り扱うときに操作性が低下する。一方、１００ｍＰａ・ｓよりも大きい場合、細胞ガラス化用溶液中細胞を取り出しにくくなり、細胞の操作性が低下する。
　なお、各溶液の粘度は、音叉振動式粘度計（２２度±１．０度）を用いて測定した。
　細胞ガラス化用溶液には、複数の塩、複数のアミノ酸、複数の緩衝剤等が含まれている。さらに、この細胞ガラス化用溶液には、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール、ブタンジオールの細胞膜透過性凍結保護物質の中から選択される少なくとも一つが含まれ、トレハロース、ポリビニルピロリドン、スクロース、ポリエチレングリコールの細胞膜非透過性凍結保護物質の中から選択される少なくとも一つが含まれている。
　次に、細胞ガラス化用溶液が充填される細胞凍結用器具１を、図１及び図２を参照し説明する。この細胞凍結用器具１は、種々の細胞を凍結する際に使用することができる。本実施形態では、受精卵（胚盤胞）を凍結する際に使用する場合を例に挙げ、説明する。
　本実施形態に係る細胞凍結用器具１は、図１に示すように、プレート本体２と、このプレート本体２を上側から覆う蓋体３とを備えている。以下、図１を基準として、プレート本体２の長手方向を左右方向Ｘ、プレート本体２の短手方向を前後方向Ｙ、プレート本体２の高さ方向を上下方向Ｚと記す。
　プレート本体２は、横長の形状であり、前壁４、前壁４と対向する後壁５、前壁４と後壁５と連なって形成される左側壁６及び右側壁７を有している。このプレート本体２は、透明な素材で構成され、例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル、ガラスで構成される。プレート本体２のサイズは、左右方向Ｘの長さＬ１が５．５ｃｍから７．５ｃｍ、前後方向Ｙの長さＬ２が２ｃｍから３．５ｃｍに設計されている。
　プレート本体２は、図２に示すように、左右方向Ｘに向けて、略半円球状の第一ウェル８、第二ウェル９及び第三ウェル１０が形成されている。これらの第一ウェル８から第三ウェル１０の直径及び深さは、ほぼ同じに設計されている。第一ウェル８には、平衡液ＥＳ（Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が注入され、第二ウェル９及び第三ウェル１０には、ガラス化液ＶＳ（ＶＳ：Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）がそれぞれ充填される。上記で説明した細胞ガラス化用溶液は、平衡液ＥＳ及びガラス化液ＶＳとして使用される。
　本実施形態において、ガラス化液ＶＳとは、細胞をガラス化するために必要な凍結保護物質を含む溶液であり、このガラス化液ＶＳには、基礎培地（ＭＥＭ）、抗生物質等が含まれている。一方、平衡液ＥＳとは、ガラス化液ＶＳよりも低濃度の凍結保護物質を含む溶液であり、この平衡液ＥＳには、基礎培地（ＭＥＭ）、抗生物質が含まれている。
　次に、細胞ガラス化用溶液を使用した細胞凍結保存方法（細胞ガラス化凍結法）について、説明する。
　本実施形態に係る細胞凍結保存方法では、増粘剤（増粘多糖類）の濃度や粘度の異なる細胞ガラス化用溶液を平衡液ＥＳ及びガラス化液ＶＳとして使用する。平衡液ＥＳ中の増粘剤の濃度は、ガラス化液ＶＳ中の増粘剤の濃度よりも低いことが好ましい。さらに、平衡液ＥＳ中の増粘剤の粘度は、ガラス化液ＶＳ中の増粘剤の粘度よりも低いことが好ましい。本実施形態では、平衡液ＥＳにおける増粘剤の濃度を０.０４８質量％、ガラス化液ＶＳにおける増粘剤の濃度を０．０６０質量％とする。また、平衡液ＥＳにおける増粘剤の粘度は２．０から４．０ｍＰａ・ｓ、ガラス化液ＶＳにおける増粘剤の粘度は７．０から１３ｍＰａ・ｓが好ましい。
　第一ウェル８に平衡液ＥＳ（第一細胞操作用溶液）、第二ウェル９にガラス化液ＶＳ（第二細胞操作用溶液）及び第三ウェル１０にガラス化液ＶＳ（第三細胞操作用溶液）をそれぞれ３００μＬ分注する。平衡液ＥＳ及びガラス化液ＶＳを分注した後、複数の受精卵を第一ウェル８に投入する。平衡液ＥＳは、所定の粘度を有するため、投入された受精卵は、ゆっくり底部まで沈降する。底部までゆっくり沈降させることで、受精卵の表面全体に平衡液ＥＳが浸され、受精卵の内部に凍結保護物質が浸透され、平衡化される。また、平衡液ＥＳは所定の粘度を有するため、第一ウェル８の平衡液ＥＳ中では、受精卵同士は接触しづらくなり、各細胞を操作し易くなる。
　次に、受精卵が所望の形態に変化していることを確認し、第一ウェル８内から受精卵と平衡液ＥＳをキャピラリーで吸引し、吸引した受精卵と平衡液ＥＳを第二ウェル９の底部に投入する。ガラス化液ＶＳが所定の粘度を有するため、投入された受精卵は、ガラス化液ＶＳの表面付近までゆっくり浮遊する。キャピラリーを第二ウェル９及び第三ウェル１０の内部のガラス化液ＶＳで共洗いし、浮遊した受精卵と第二ウェル９中のガラス化液ＶＳを吸引する。吸引した受精卵とガラス化液ＶＳは、第三ウェル１０に投入される。
　ガラス化液ＶＳが所定の粘度を有するため、投入された受精卵は、ガラス化液ＶＳ中をゆっくり浮遊する。第三ウェル１０内のガラス化液ＶＳを、キャピラリーで攪拌し、浮遊した受精卵の状態を確認した後、キャピラリーを第三ウェル１０の内部のガラス化液ＶＳで共洗いする。そして、キャピラリーで吸引した受精卵を、棒状の細胞凍結具の先端にドロップさせ、液体窒素で凍結させる。
　以上の操作を、第一ウェル８に沈降させた各受精卵について行い、複数の受精卵を凍結する。
　次に、本実施形態に係る細胞ガラス化用溶液及び細胞凍結保存方法の作用効果について、説明する。
　本実施形態に係る細胞ガラス化用溶液は、増粘剤が含まれ、所定の粘度を有しているため、細胞ガラス化用溶液中における細胞の沈降速度や浮遊速度を調整することができ、安全性を確保しつつ細胞を操作しやすくなる。そのため、作業負担を軽減でき、操作時間を短縮することができる。特に、細胞ガラス化用溶液中の増粘剤の濃度が０．０１質量％から０．５０質量％の場合や、細胞ガラス化用溶液の粘度が１．５ｍＰａ・ｓから１００ｍＰａ・ｓである場合は、複数の細胞を取り扱うときに操作性がよく、短時間で操作をすることができる。
　受精卵は、平衡液ＥＳ中では、ゆっくり沈降する。受精卵が溶液中をすぐに沈降してしまう場合と比較して、受精卵全体（特に、下側部分）が細胞ガラス化用溶液に接している時間が長くなり、受精卵をより安定してガラス化することができる。そして、平衡液ＥＳ中において、受精卵は容器の底に緩やかに接するため、受精卵への負荷が低減される。また、受精卵は、第二ウェル９のガラス化液ＶＳ中では、ゆっくり浮遊するため、ガラス化液ＶＳ中で受精卵を見失うことを防止できる。
　従来のセルロース系物質が含まれたガラス化凍結保存液と本実施形態に係る細胞ガラス化用溶液における、所望の形態に変化する受精卵の様子を観察し、受精卵に対する細胞透過性凍結保護物質の浸透性について調べた。その結果、本実施形態の細胞ガラス化用溶液を使用した場合の方が、細胞透過性凍結保護物質が、受精卵に浸透しやすいことが判った。したがって、従来の溶液を使用するよりも、受精卵をすばやくガラス化凍結処理でき、受精卵に対する負荷を軽減することができる。
　上述した増粘多糖類の中でも、特にキサンタンガムのみを含む細胞ガラス化用溶液として有用である。また、増粘多糖類であるキサンタンガム、カラギーナン、ジェランガム、ローカストビーンガム、グァーガム、ダイユータンガムの中から２つ以上含まれている細胞ガラス化用溶液も有効性が高い。さらに、増粘剤の濃度が０．０３質量％から０．３０質量％の場合、細胞の操作性が著しく良いことが判った。また、
　本実施形態に係る細胞凍結保存方法は、上述した細胞ガラス化用溶液を用いて行い、平衡液ＥＳとガラス化液ＶＳ中の増粘剤の濃度や粘度を変え、受精卵の沈降速度や浮遊速度を調整することで、細胞操作性が向上する。そのため、受精卵が所望の形態となる時間が従来の凍結保存方法よりも短縮される。したがって、この細胞凍結保存方法により、細胞をより安全に凍結することができ、本実施形態に係る細胞凍結保存方法は有用性が高い。
［第二実施形態］
　本実施形態に係る細胞操作用溶液は、ガラス化凍結された細胞の細胞融解用溶液としても使用することができる。この細胞融解用溶液は、細胞融解操作の操作性を向上させる目的で使用される。
　従来、ガラス化凍結保存液（例えば、特許文献２に記載の動物細胞のガラス化凍結保存液）を、細胞を融解させるための融解液として使用することがあった。しかし、この溶液は、約３７度まで加温するとセルロース系物質が析出してしまうという課題があった。
　本実施形態に係る細胞融解用溶液は、増粘多糖類であるキサンタンガム、カラギーナン、ジェランガム、ローカストビーンガム、グァーガム、ダイユータンガムの中から少なくとも一つが含有され、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースやヒドロキシエチルメチルセルロースは含有されていない。
　増粘剤は、細胞融解用溶液に対し、０．０１質量％から０．５０質量％の濃度で含有されていることが好ましい。また、０．０３質量％から０．３０質量％であることが最も好ましい。増粘剤の濃度が０．０１質量％よりも低い場合、増粘性が失われ操作性が低下するおそれがある。一方、増粘剤の濃度が０．５０質量％よりも高い場合、細胞融解用溶液の粘度が大きくなり、細胞ガラス化用溶液中における細胞の操作性が低下する。
　また、細胞融解用溶液の粘度が１．５ｍＰａ・ｓから１００ｍＰａ・ｓであることが好ましい。細胞融解用溶液の粘度が１．５ｍＰａ・ｓよりも小さい場合、増粘性が失われ操作性が低下するおそれがある。一方、１００ｍＰａ・ｓよりも大きい場合、細胞融解用溶液の粘度が大きくなり、細胞ガラス化用溶液中における細胞の操作性が低下する。
　次に、細胞融解用溶液が充填される細胞融解用器具１Ａを、図３及び図４を参照し説明する。この細胞融解用器具１Ａは、種々の細胞を融解する際に使用することができる。本実施形態では、凍結された受精卵（胚盤胞）を融解する際に使用する場合を例に挙げ、説明する。
　細胞融解用器具１Ａは、図３に示すように、左右方向Ｘに横長のプレート本体２Ａを備えている。なお、プレート本体２Ａの上面に剥離可能な状態で貼り付けられたシール材を設けてもよい。プレート本体２Ａは、前壁４Ａ、前壁４Ａと対向する後壁５Ａ、前壁４Ａと後壁５Ａと連なって形成される左側壁６Ａ及び右側壁７Ａを有している。このプレート本体２Ａには、透明で軽い素材、例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、アクリルが使用される。
　プレート本体２Ａには、半円球状の第一ウェル８Ａと、半円球状の第二ウェル９Ａと、半円球状の第三ウェル１０Ａ及び平面視したときに略台形状の第四ウェル１１が、左右方向Ｘに向けて形成されている。第一ウェル８Ａ、第二ウェル９Ａ及び第三ウェル１０Ａは、プレート本体２Ａの溝部の底壁から突出して形成されている。第一ウェル８Ａは第四ウェル１１の左右方向Ｘの右側に、第二ウェル９Ａは第一ウェル８Ａの右側に、第三ウェル１０Ａは第二ウェル９Ａの右側に、それぞれ形成されている。
　第四ウェル１１は、図４に示すように、左右方向Ｘにおいて左方から右方にかけて傾斜する傾斜部１２を有する底壁１３を備えている。
　第四ウェル１１には、融解液ＴＳ（Ｔｈａｗｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が充填される。一方、第一ウェル８Ａには希釈液ＤＳ（Ｄｉｌｕｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、第二ウェル９Ａには洗浄液ＷＳ１（Ｗａｓｈｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　１）及び第三ウェル１０Ａには洗浄液ＷＳ２（Ｗａｓｈｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　２）がそれぞれ充填される。
　本実施形態に係る細胞融解用溶液は、融解液ＴＳ、希釈液ＤＳ、洗浄液ＷＳ１、ＷＳ２として使用される。
　本実施形態において、融解液ＴＳ及び希釈液ＤＳには、基礎培地（ＭＥＭ）、抗生物質、細胞非透過性脱水促進物質（例えば、トレハロース）等が含まれている。洗浄液ＷＳ１、ＷＳ２には、基礎培地（ＭＥＭ）、抗生物質が含まれ、細胞非透過性脱水促進物質（例えば、トレハロース）は含まれていない。
　次に、細胞融解用溶液を使用した細胞融解方法について、説明する。
　本実施形態に係る細胞融解方法では、増粘剤の濃度や粘度の異なる細胞融解用溶液を融解液ＴＳ、希釈液ＤＳ及び洗浄液ＷＳ１、ＷＳ２として使用する。融解液ＴＳ中の増粘剤の濃度や粘度は、希釈液ＤＳ及び洗浄液ＷＳ１、ＷＳ２中の増粘剤の濃度や粘度よりも高いことが好ましい。本実施形態では、融解液ＴＳ中の増粘剤の濃度を０．０６質量％、希釈液ＤＳ中の増粘剤の濃度を０．０６質量％、洗浄液ＷＳ１、ＷＳ２中の増粘剤の濃度を０．０３質量％とする。融解液ＴＳ中の増粘剤の粘度は７．０から１５ｍＰａ・ｓ、希釈液ＤＳ中の増粘剤の粘度は２．５から４．０ｍＰａ・ｓ、洗浄液ＷＳ１、ＷＳ２中の増粘剤の粘度は１．５から２．０ｍＰａ・ｓが好ましい。
　次に、上述した細胞融解用溶液を使用した細胞融解方法について説明する。
　第四ウェル１１に融解液ＴＳ（第四細胞融解用溶液）、第一ウェル８Ａに希釈液ＤＳ（第一細胞融解用溶液）、第二ウェル９Ａに洗浄液ＷＳ１（第二細胞融解用溶液）、第三ウェル１０Ａに洗浄液ＷＳ２（第三細胞融解用溶液）がそれぞれ充填される。そして、細胞操作用器具上で凍結されている受精卵を融解液ＴＳに浸漬させる。融解液ＴＳは、所定の粘度を有しているため、凍結している受精卵には、融解液ＴＳがゆっくり浸透する。その後、融解した受精卵は、細胞操作用器具から剥がれ、融解液ＴＳ中をゆっくり浮遊する。
　そして、浮遊した受精卵を第一ウェル８Ａの希釈液ＤＳに投入し、３分間希釈化する。次に、希釈化された受精卵を第二ウェル９Ａの洗浄液ＷＳ１に投入し、５分間洗浄する。この際、受精卵の所望の形態となっていることを確認する。形態を確認後、第三ウェル１０Ａの洗浄液ＷＳ２に投入し、洗浄を完了する。洗浄完了後、受精卵は、胚移植などに使用される。
　次に、本実施形態に係る細胞融解用溶液及び細胞融解方法の作用効果について、説明する。
　本実施形態に係る細胞融解用溶液は、増粘剤が含まれ、細胞融解用溶液中における細胞の浮遊速度を調整することができ、安全性を確保しつつ細胞融解操作をしやすくなる。特に、細胞融解用溶液中の増粘剤の濃度が０．０１質量％から０．５０質量％の場合や、細胞融解用溶液の粘度が１．５ｍＰａ・ｓから１００ｍＰａ・ｓである場合は、複数の細胞を取り扱うときに操作性がよく、短時間で操作をすることができる。上述した増粘多糖類の中でも、特にキサンタンガムを含む細胞融解用溶液として有用である。
　また、本実施形態に係る細胞融解用溶液は、３７度まで加温した場合でも、物質が析出せず、細胞を安全に融解することができる。
　従来の融解液中では、受精卵に融解液が浸透しやすいため、融解液に浸漬させた後、すぐに細胞操作用器具から受精卵が剥がれ、受精卵を見失うおそれがあった。
　本実施形態の融解液ＴＳは、所定の粘度を有するため、融解液ＴＳ中に浸漬された受精卵には、徐々に融解液ＴＳが浸透し、細胞操作用器具から剥がれた後、ゆっくり融解液ＴＳ中をゆっくり浮遊するため、融解液ＴＳ中で受精卵を見失うおそれを防止できる。
　本実施形態に係る細胞融解方法は、上述した細胞融解用溶液を用いて行い、融解液ＴＳと希釈液ＤＳ、洗浄液ＷＳ１、ＷＳ２中の増粘剤の濃度や粘度を変えることで、融解液ＴＳ等中の受精卵の操作性を向上させ、受精卵が所望の形態となる時間が従来の融解方法よりも短縮される。特に、融解液ＴＳ中の増粘剤の粘度を希釈液ＤＳ及び洗浄液ＷＳ１、ＷＳ２中の増粘剤の粘度よりも高くすることで、細胞の操作性が高くなる。したがって、この細胞融解方法により、細胞をより安全に操作することができ、本実施形態に係る細胞融解方法は有用性が高い。
　以上、本実施形態について説明したが、これ以外にも、本発明の主旨を逸脱しない限り、上記実施の形態で挙げた構成を取捨選択したり、他の構成に適宜変更することが可能である。
　多糖類は、安全性が高く、増粘効果があるものであれば、キサンタンガム、カラギーナン、ジェランガム、ローカストビーンガム、グァーガム、ダイユータンガムに限定されず、例えば、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン等も使用することができる。
　また、細胞操作用溶液は、細胞の凍結や融解以外でも、細胞を操作するための溶液であれば使用することができる。
１　　　細胞凍結用器具
１Ａ　　細胞融解用器具
２，２Ａ　プレート本体（本体部）
３　　　蓋体
４，４Ａ　前壁
５，５Ａ　後壁
６，６Ａ　左側壁
７，７Ａ　右側壁
８，８Ａ　第一ウェル
９，９Ａ　第二ウェル
１０，１０Ａ　　第三ウェル
１１　　第四ウェル
１２　　傾斜部
１３　　底壁
ＥＳ　　平衡液（第一細胞操作用溶液）
ＶＳ　　ガラス化液（第二細胞操作用溶液，第三細胞操作用溶液）
ＴＳ　　融解液（第四細胞操作用溶液）
ＤＳ　　希釈液（第一細胞操作用溶液）
ＷＳ１，ＷＳ２　洗浄液（第二細胞操作用溶液、第三細胞操作用溶液）
Ｘ　　　左右方向
Ｙ　　　前後方向
Ｚ　　　上下方向

 

Claims (5)

  1. 　細胞のガラス化凍結又はガラス化凍結された細胞の融解に使用する細胞操作用溶液であって、
    　増粘剤が含有され、前記増粘剤が、キサンタンガム、カラギーナン、ジェランガム、ローカストビーンガム、グァーガム、ダイユータンガムの中から選択される少なくとも一つである、
    ことを特徴とする細胞操作用溶液。
  2. 　前記増粘剤の濃度が、０．０１質量％から０．５０質量％であり、
    　粘度が１．５ｍＰａ・ｓから１００ｍＰａ・ｓである、
    ことを特徴とする請求項１に記載の細胞操作用溶液。
  3. 　ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール、ブタンジオールの細胞膜透過性凍結保護物質の中から選択される少なくとも一つが含まれ、
    　トレハロース、ポリビニルピロリドン、スクロース、ポリエチレングリコールの細胞膜非透過性凍結保護物質の中から選択される少なくとも一つが含まれている、
    ことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の細胞操作用溶液。
  4. 　請求項１に記載の細胞操作用溶液が充填される、少なくとも第一ウェル及び第二ウェルを備えるプレートを用いて、細胞を凍結する細胞凍結保存方法であって、
    　前記第一ウェルに充填される第一細胞操作用溶液中の増粘剤の粘度が、前記第二ウェルに充填される第二細胞操作用溶液中の増粘剤の粘度よりも低く、
    　前記細胞を、前記第一ウェル中の第一細胞操作用溶液に浸漬させる第一工程と、
    　前記第一工程後、前記細胞を前記第一ウェル中の第一細胞操作用溶液から取り出し、前記第二ウェル中の第二細胞操作用溶液に浸漬させる第二工程と、
    　前記第二工程後、前記細胞を前記第二ウェル中の第二細胞操作用溶液から取り出し、凍結させる第三工程と、を含む、
    ことを特徴とする細胞凍結保存方法。
  5. 　請求項１に記載の細胞操作用溶液が充填される、第一ウェル、第二ウェル、第三ウェル、第四ウェルを備えるプレートを用いて、細胞を融解する細胞融解方法であって、
    　前記第四ウェルに充填される第四細胞操作用溶液中の増粘剤の粘度が、前記第一ウェルに充填される第一細胞操作用溶液、前記第二ウェルに充填される第二細胞操作用溶液及び前記第三ウェルに充填される第三細胞操作用溶液中の増粘剤の粘度よりも高く、
    　前記細胞を、前記第四ウェル中の第四細胞操作用溶液に浸漬させ、融解する第一工程と、
    　前記第一工程後、前記細胞を前記第四ウェル中の第四細胞操作用溶液から取り出し、前記第一ウェル中の第一細胞操作用溶液に浸漬させる第二工程と、
    　前記第二工程後、前記細胞を前記第一ウェル中の第一細胞操作用溶液から取り出し、前記第二ウェル中の第二細胞操作用溶液に浸漬させる第三工程と、を含む、
    ことを特徴とする細胞融解方法。

     
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