WO2023277122A1 - ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出又は分離方法 - Google Patents

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antibody
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ちひろ 佐藤
正弥 羽根
開都 早川
健 北島
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国立大学法人東海国立大学機構
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to methods for detecting and separating polysialic acid or polysialic acid-supporting materials.
  • Polysialic acid exists mainly as a modified sugar chain of NCAM, which is an intercellular adhesion molecule, and it is known that it is responsible for NCAM function regulation and has a unique function of polysialic acid. ing. Polysialic acid has been previously reported to present repulsive fields between cells and modulate intercellular spaces to control intracellular signal strength. However, in recent years, it has been reported that polysialic acid presents an attractive field and specifically binds to various molecular groups. In addition, polysialic acid is expressed in cancer cells, is abnormally expressed in patients with psychiatric disorders, is abnormally expressed in patients with neurodegenerative diseases, and is found on the surface of immune cells (NK cells, etc.). It is known to exist (Non-Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide a technique for detecting or separating polysialic acid or a polysialic acid-bearing material.
  • antibody A an anti-polysialic acid negative antibody in which the tyrosine residue on the C-terminal side in the light chain CDR1 is substituted with another amino acid
  • AX light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:33 or SEQ ID NO:34, light chain CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:5, and light chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:6 a light chain variable region and/or a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 36, a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9
  • antibody B an amino acid sequence BH2 whose heavy chain variable region has 95% or more identity to the amino acid sequence BH1 shown in SEQ ID NO: 16 (antibody C)
  • the antibody A is (Antibody A1) Corresponding to the 39th tyrosine residue from the N-terminus of the amino acid sequence A1L1 shown in SEQ ID NO: 2, or the tyrosine residue in the amino acid sequence A1L2 having 95% or more identity to the amino acid sequence A1L1 an anti-polysialic acid negative antibody, or (Antibody A2) the N-terminus of the amino acid sequence A2L1 represented by SEQ ID NO: 20, comprising a light chain variable region comprising an amino acid sequence in which the tyrosine residue is mutated to another amino acid residue 37th tyrosine residue from or the tyrosine residue corresponding to the tyrosine residue in the amino acid sequence A2L2 having 95% or more identity to the amino acid sequence A2L1 is mutated to another amino acid residue Item 2.
  • the kit according to Item 1 which is an anti-polysialic acid negative antibody, comprising a light chain variable region comprising an amino acid sequence.
  • Section 3. Item 1 or 2, wherein the antibody B is an anti-polysialic acid humanized antibody, the heavy chain variable region of which comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16.
  • Section 4 The kit according to any one of items 1 to 3, wherein said antibody C and/or said antibody D is an IgG antibody.
  • Item 5 Items 1 to 4, wherein the antibody E is an anti-polysialic acid antibody obtained by adding a streptavidin-binding protein and/or a multimerization domain to the antibody AX, the antibody B, the antibody C, or the antibody D.
  • Item 6 The kit according to any one of Items 1 to 5, which is for detecting or separating polysialic acid or a polysialic acid-bearing material.
  • Item 7 The kit according to any one of Items 1 to 6, which is for testing polysialic acid-related diseases or for isolating polysialic acid-expressing cells.
  • Antibody A an anti-polysialic acid negative antibody in which the C-terminal tyrosine residue in the light chain CDR1 is substituted with another amino acid
  • Antibody AX Light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:33 or SEQ ID NO:34, light chain CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:5, and light chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:6 and/or a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:35 or SEQ ID NO:36, a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:8, and the amino acid represented by SEQ ID NO:9 an anti-polysialic acid antibody comprising a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR3 comprising sequence;
  • Antibody B an anti-polysialic acid humanized antibody whose heavy chain variable region comprises an amino acid sequence BH2 having 95% or more identity
  • Item 10 The detection method according to Item 9, comprising visualizing a complex containing the antibody and polysialic acid or a polysialic acid-supporting material.
  • Item 11 The detection method according to Item 9 or 10, which is an ELISA method.
  • Item 12. The detection method according to Item 11, wherein the ELISA method is a sandwich ELISA method.
  • Antibody A an anti-polysialic acid negative antibody in which the C-terminal tyrosine residue in the light chain CDR1 is substituted with another amino acid
  • Antibody AX Light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:33 or SEQ ID NO:34, light chain CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:5, and light chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:6 and/or a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:35 or SEQ ID NO:36, a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:8, and the amino acid represented by SEQ ID NO:9 an anti-polysialic acid antibody comprising a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR3 comprising sequence;
  • Antibody B an anti-polysialic acid antibody comprising a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR3 comprising sequence
  • Antibody B an anti
  • a technique for detecting or separating polysialic acid or a polysialic acid-bearing material can be provided.
  • FIG. 1 shows the results of Western blotting using pig fetal brain and ELISA using mouse fetal brain (MEB) in Example 1.
  • FIG. 2 shows the results of Western blotting using pig fetal brain and ELISA using mouse fetal brain (MEB) in Example 2.
  • FIG. 2 shows the results of tissue staining in Example 2.
  • FIG. 3 shows the results of Western blotting using porcine fetal brain in Example 3.
  • FIG. 2 shows the results of sandwich ELISA using two types of anti-polysialic acid antibodies with different recognition abilities in Example 4.
  • FIG. 2 shows the results of Western blotting using pig fetal brain and ELISA using mouse fetal brain (MEB) in Example 5.
  • FIG. 6 shows the results of Western blotting using pig fetal brain and ELISA using mouse fetal brain (MEB) in Example 6.
  • FIG. 2 shows the results of ELISA using mouse fetal brain (MEB) in Example 7.
  • FIG. The amino acid sequences of the materials used or produced in Example 1 are shown.
  • the amino acid sequences of the materials used or produced in Example 5 are shown.
  • 2 shows the results of ELISA using mouse fetal brain (MEB) in Example 9.
  • FIG. 2 shows the results of ELISA using ganglioside GD3 in Example 10.
  • amino acids/amino acid residues are sometimes expressed in single letter notation.
  • Identity of amino acid sequences refers to the degree of matching of two or more comparable amino acid sequences to each other. Therefore, the higher the identity or similarity between two amino acid sequences, the higher the identity or similarity between those sequences.
  • the level of amino acid sequence identity is determined, for example, using the sequence analysis tool FASTA, using default parameters. or Algorithm BLAST by Karlin S, Altschul SF. "Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes" Proc Natl Acad Sci USA. "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences.” Proc Natl Acad Sci USA. 90:5873-7 (1993)).
  • BLASTX based on such a BLAST algorithm has been developed. Specific methods of these analysis methods are known, and the website of the National Center of Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) can be referred to. "Identity" of base sequences is also defined according to the above.
  • conservative substitution means that an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain.
  • substitutions between amino acid residues having basic side chains such as lysine, arginine, and histidine correspond to conservative substitutions.
  • amino acid residues having acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid
  • amino acid residues having uncharged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine and cysteine
  • alanine, valine, leucine, isoleucine amino acid residues with nonpolar side chains such as proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • amino acid residues with ⁇ -branched side chains such as threonine, valine, isoleucine
  • aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine. Substitutions between amino acid residues are also conservative substitutions.
  • CDR is an abbreviation for Complementarity Determining Region, and is also called complementarity determining region.
  • a CDR is a region present in the variable region of immunoglobulin, and is a region deeply involved in the specific binding of an antibody to an antigen.
  • Light chain CDR means a CDR present in the immunoglobulin light chain variable region
  • heavy chain CDR means a CDR present in the immunoglobulin heavy chain variable region.
  • variable region means a region containing the aforementioned CDR1 to CDR3 (hereinafter simply referred to as "CDRs1-3").
  • CDRs1-3 CDRs1-3
  • the arrangement order of these CDRs1-3 is not particularly limited, but preferably, from the N-terminal side to the C-terminal side, in the order of CDR1, CDR2, and CDR3, or in the reverse order, continuous or the frame described later It refers to regions interspersed with other amino acid sequences called work regions (FR).
  • the "heavy chain variable region” is the region in which the above-mentioned heavy chain CDRs1-3 are arranged, and the “light chain variable region” is the region in which the above-mentioned light chain CDRs1-3 are arranged.
  • FR1 is the region between the N-terminus of the variable region and the CDR1
  • FR2 is the region between CDR1 and CDR2
  • FR3 is the region between CDR2 and CDR3
  • FR3 is the region between CDR3 and the C-terminus of the variable region. defined respectively as FR4.
  • the FR also functions as a linker sequence connecting the particularly important CDRs1-3 as the antigen recognition sequence mentioned above, and is a region that contributes to the formation of the three-dimensional structure of the entire variable region.
  • antibody A, antibody AX, antibody B, antibody C, antibody D, and antibody E in the present specification, these may be collectively referred to as "the antibody of the present invention”). Regarding. These are described below.
  • Antibody A is an anti-polysialic acid negative antibody in which the C-terminal tyrosine residue in the light chain CDR1 is substituted with another amino acid.
  • the C-terminal tyrosine residue in the light chain CDR1 is a tyrosine residue in the light chain CDR1, a tyrosine residue present on the C-terminal side in the light chain CDR1, and is not particularly limited in this respect.
  • C-terminal side means, for example, 1 to 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, still more preferably 1) amino acid residues including the C-terminal amino acid residue of the light chain CDR1 indicates a region consisting of
  • the above tyrosine residue is preferably the most C-terminal tyrosine residue when there are multiple tyrosine residues on the C-terminal side in the light chain CDR1.
  • Antibody A is an anti-polysialic acid antibody into which the above tyrosine residue substitution has been introduced, and the tyrosine residue substitution greatly reduces the reactivity/binding to polysialic acid (see Example 2 below).
  • the reactivity/binding to polysialic acid measured by ELISA is, for example, 50% or less, preferably 40% or less, more preferably 30%, relative to 100% reactivity/binding before the introduction of tyrosine residue substitution. (more preferably 20% or less, still more preferably 10% or less, particularly preferably 5% or less), so it can be used as a polysialic acid negative antibody.
  • “Other amino acid residues” are not particularly limited as long as they are amino acid residues other than tyrosine residues.
  • Other amino acid residues include, for example, aliphatic amino acids such as G, A, V, I and L; sulfur-containing amino acids such as C and M; basic amino acids such as K, H and R; amides such as N and Q group-containing amino acids; hydroxy group-containing amino acids such as S and T; aromatic amino acids such as F and W; acidic amino acids such as D and E; Among these, preferably aliphatic amino acids such as G, A, V, I and L; basic amino acids such as K, H and R; hydroxy group-containing amino acids such as S and T; aromatic amino acids such as W; Examples include acidic amino acids such as D and E, and more preferably A, S, I, D, K, W, and the like.
  • Antibody A usually contains a light chain variable region and a heavy chain variable region.
  • Antibody A may be an anti-polysialic acid antibody into which mutations other than the above tyrosine residue substitutions have been introduced. Mutations include amino acid substitutions, deletions, insertions, and the like.
  • the number of amino acid residues for the mutation is not particularly limited as long as the antibody structure is maintained, but is, for example, 0-20, 0-10, or 0-5, For example, it is 10% or less, 5% or less, 2% or less, or 1% or less relative to 100% of the total number of amino acid residues in the heavy chain/light chain constant region).
  • antibody A1 the 39th tyrosine residue from the N-terminus of the amino acid sequence A1L1 shown in SEQ ID NO: 2, or an amino acid having 95% or more identity to the amino acid sequence A1L1
  • It is preferably an anti-polysialic acid negative antibody comprising a light chain variable region comprising an amino acid sequence in which the tyrosine residue corresponding to the tyrosine residue in sequence A1L2 is mutated to another amino acid residue.
  • Antibody A1 is an anti-polysialic acid antibody containing the amino acid sequence A1L1 as a light chain variable region, into which the above tyrosine residue substitution has been introduced.
  • the identity of the amino acid sequence A1L2 to the amino acid sequence A1L1 is preferably 97% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and in any case less than 100%.
  • the number of amino acid residues mutated from the amino acid sequence A1L1 is, for example, 1-5, preferably 1-2, more preferably 1.
  • corresponding tyrosine residues indicate tyrosine residues at the same position on the aligned sequences when two sequences are compared by BLAST (default setting).
  • the tyrosine residue corresponding to the tyrosine residue in the amino acid sequence A1L2 is an alignment sequence obtained by comparing the amino acid sequence A1L1 and the amino acid sequence A1L2, in the amino acid sequence A1L2, The tyrosine residue at the same position as the 39th tyrosine residue from the N-terminus of the amino acid sequence A1L1 is shown.
  • Antibody A1 preferably comprises a heavy chain variable region comprising amino acid sequence A1H2 having 95% or more identity to amino acid sequence A1H1 shown in SEQ ID NO:3.
  • the identity of the amino acid sequence A1H2 to the amino acid sequence A1H1 is preferably 97% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and in any case 100% or less.
  • the number of amino acid residues mutated from the amino acid sequence A1H1 is, for example, 0-5, preferably 0-2, more preferably 0-1.
  • Antibody A2 is an anti-polysialic acid antibody containing the amino acid sequence A2L1 as a light chain variable region, into which the above tyrosine residue substitution has been introduced.
  • the identity of the amino acid sequence A2L2 to the amino acid sequence A2L1 is preferably 97% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and in any case less than 100%.
  • the number of amino acid residues mutated from the amino acid sequence A2L1 is, for example, 1-5, preferably 1-2, more preferably 1.
  • Antibody A2 preferably comprises a heavy chain variable region comprising amino acid sequence A2H2 having 95% or more identity to amino acid sequence A2H1 shown in SEQ ID NO:24.
  • the identity of the amino acid sequence A2H2 to the amino acid sequence A2H1 is preferably 97% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and in any case 100% or less.
  • the number of amino acid residues mutated from the amino acid sequence A2H1 is, for example, 0-5, preferably 0-2, more preferably 0-1.
  • Antibody A has low reactivity to polysialic acid and can be used as a negative control in the detection and separation of polysialic acid.
  • Antibody AX has a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:33 or SEQ ID NO:34 (preferably SEQ ID NO:33), a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5, and SEQ ID NO:6.
  • Antibody AX preferably contains an amino acid sequence AXL2 whose light chain variable region has 95% or more identity to the amino acid sequence AXL1 shown in SEQ ID NO:2.
  • the identity of the amino acid sequence AXL2 to the amino acid sequence AXL1 is preferably 97% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and in any case 100% or less.
  • the number of amino acid residues mutated from the amino acid sequence AXL1 is, for example, 0-5, preferably 0-2, more preferably 0-1.
  • Antibody AX preferably contains an amino acid sequence AXH2 whose heavy chain variable region has 95% or more identity to the amino acid sequence AXH1 shown in SEQ ID NO:3.
  • the identity of the amino acid sequence AXH2 to the amino acid sequence AXH1 is preferably 97% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and in any case 100% or less.
  • the number of amino acid residues mutated from the amino acid sequence AXH1 is, for example, 0-5, preferably 0-2, more preferably 0-1.
  • Antibody AX is preferably an IgG antibody.
  • Antibody AX can be used to detect/separate polysialic acid, and can be used for assays that require multiple types of anti-polysialic acid antibodies, such as sandwich ELISA.
  • Antibody B is an anti-polysialic acid humanized antibody whose heavy chain variable region comprises an amino acid sequence BH2 having 95% or more identity to the amino acid sequence BH1 shown in SEQ ID NO:16.
  • Antibody B is a humanized antibody with mouse-derived CDR sequences.
  • the identity of the amino acid sequence BH2 to the amino acid sequence BH1 is preferably 97% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and in any case 100% or less.
  • the number of amino acid residues mutated from the amino acid sequence BH1 is, for example, 0-5, preferably 0-2, more preferably 0-1.
  • Antibody B preferably contains a light chain variable region comprising an amino acid sequence BL2 having 95% or more identity to the amino acid sequence BL1 shown in SEQ ID NO:14.
  • the identity of the amino acid sequence BL2 to the amino acid sequence BL1 is preferably 97% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and in any case 100% or less.
  • the number of amino acid residues mutated from the amino acid sequence BL1 is, for example, 0-5, preferably 0-2, more preferably 0-1.
  • the mutation site and mutation content do not significantly impair the reactivity to polysialic acid, and the humanized sequence portion is not significantly mutated.
  • the site of mutation and the content of the mutation can be appropriately determined based on the antibody sequence information of each biological species, the information of Example 5 (FIG. 10, etc.), and the like.
  • antibody B has a light chain CDR1 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, a light chain CDR2 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, and an amino acid shown in SEQ ID NO: 6.
  • a light chain variable region comprising a light chain CDR3 comprising the sequence, and/or a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:7, a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:8, and a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:9
  • antibody B When antibody B has a constant region, its amino acid sequence is the amino acid sequence of the constant region of a human antibody.
  • Antibody B has a reactivity/binding to polysialic acid measured by ELISA in Example 5 described later, which is 100% of the reactivity/binding of the humanized antibody obtained in Example 5, for example, 50 % or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, and even more preferably 90% or more.
  • the upper limit of reactivity/binding is not particularly limited, and is, for example, 500%, 300%, 200%, 150%, or 120%.
  • Antibody B can be suitably used as a humanized antibody for in vivo diagnosis.
  • Antibody C comprises a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19.
  • a heavy chain CDR1 comprising a variable region and/or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21, a heavy chain CDR2 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, and a heavy chain CDR3 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23
  • An anti-polysialic acid antibody comprising a heavy chain variable region.
  • Antibody C has an amino acid sequence CL2 whose light chain variable region has 95% or more (preferably 100%) identity to the amino acid sequence CL1 represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 37 (preferably SEQ ID NO: 37). preferably included.
  • the identity of the amino acid sequence CL2 to the amino acid sequence CL1 is preferably 97% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and in any case 100% or less.
  • the number of amino acid residues mutated from the amino acid sequence CL1 is, for example, 0-5, preferably 0-2, more preferably 0-1.
  • Antibody C preferably contains an amino acid sequence CH2 whose heavy chain variable region has 95% or more identity to the amino acid sequence CH1 shown in SEQ ID NO:24.
  • the identity of the amino acid sequence CH2 to the amino acid sequence CH1 is preferably 97% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and in any case 100% or less.
  • the number of amino acid residues mutated from the amino acid sequence CH1 is, for example, 0-5, preferably 0-2, more preferably 0-1.
  • Antibody C is preferably an IgG antibody.
  • Antibody C can be used to detect/separate polysialic acid, and can be used in assays that require multiple types of anti-polysialic acid antibodies, such as sandwich ELISA.
  • Antibody D has a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 38, a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27. and/or a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29, a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30, and a heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31
  • Antibody D preferably contains an amino acid sequence DL2 whose light chain variable region has 95% or more identity to the amino acid sequence DL1 shown in SEQ ID NO:28.
  • the identity of the amino acid sequence DL2 to the amino acid sequence DL1 is preferably 97% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and in any case 100% or less.
  • the number of amino acid residues mutated from the amino acid sequence DL1 is, for example, 0-5, preferably 0-2, more preferably 0-1.
  • Antibody D preferably contains an amino acid sequence DH2 whose heavy chain variable region has 95% or more identity to the amino acid sequence DH1 shown in SEQ ID NO:32.
  • the identity of the amino acid sequence DH2 to the amino acid sequence DH1 is preferably 97% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and in any case 100% or less.
  • the number of amino acid residues mutated from the amino acid sequence DH1 is, for example, 0-5, preferably 0-2, more preferably 0-1.
  • Antibody D is preferably an IgG antibody.
  • Antibody D can be used to detect/separate polysialic acid, and can be used in assays that require multiple types of anti-polysialic acid antibodies, such as sandwich ELISA.
  • Antibody E is an antibody to which a streptavidin-binding protein and/or a multimerization domain has been added. Addition of streptavidin-binding proteins and/or multimerization domains can improve detection sensitivity.
  • the target of antibody E is not particularly limited, and examples include sugar chains such as polysialic acid, proteins, and peptides.
  • the streptavidin-binding protein is not particularly limited as long as it is a protein that has binding properties to streptavidin.
  • streptavidin-binding proteins for example, those derived from various organisms (animals, plants, and microorganisms) can be employed.
  • Specific examples of streptavidin-binding proteins include proteins consisting of an amino acid sequence E2 having 70% or more identity with the amino acid sequence E1 shown in SEQ ID NO:11.
  • the identity of the amino acid sequence E2 to the amino acid sequence E1 is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more, and in any case 100%. It is below.
  • the number of amino acid residues mutated from the amino acid sequence E1 is, for example, 0-30, preferably 0-15, more preferably 0-10, more preferably 0-5, still more preferably 0. ⁇ 2.
  • a multimerization domain is a domain that can bind to each other to form a multimer, and is not particularly limited as long as it is.
  • Multimerization domains include, for example, cartilage oligomeric matrix protein domains, leucine zipper domains, collagen-like domains, cholera toxin B subunit domains, tetrabrachion coiled core domains, reovirus ⁇ 1 protein domains, hepatitis delta antigen domains, and the like.
  • a specific example of the multimerization domain is a protein consisting of an amino acid sequence E4 having 70% or more identity with the amino acid sequence E3 shown in SEQ ID NO:10.
  • the identity of the amino acid sequence E4 to the amino acid sequence E3 is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more, and in any case 100%. It is below.
  • the number of amino acid residues mutated from the amino acid sequence E3 is, for example, 0-30, preferably 0-15, more preferably 0-10, more preferably 0-5, even more preferably 0. ⁇ 2.
  • the mode of addition of the streptavidin-binding protein and/or the multimerization domain is not particularly limited, and may be added in the form of a fusion protein with the antibody, or may be added with the antibody by chemical cross-linking.
  • the streptavidin-binding protein and/or the multimerization domain may be directly attached to the antibody, or may be a linker (peptide linker (for example, a linker composed of G and S), a chain-like bivalent group (e.g., optionally substituted alkylene group, optionally substituted heteroalkylene group, etc.), peptide tag (e.g., purification tag such as His tag, etc.), etc.
  • the position where the streptavidin-binding protein and/or the multimerization domain are added is preferably the end opposite to the antibody variable region.
  • Antibody E is preferably an IgG antibody.
  • Antibody E also typically comprises a light chain variable region and a heavy chain variable region. These variable regions or CDR sequences in these variable regions are preferably variable regions or CDR antibodies derived from IgM antibodies.
  • the target binding of the obtained IgG antibody is can drop significantly. In this case, binding can be improved by adding a streptavidin-binding protein and/or a multimerization domain.
  • Antibody E is preferably an anti-polysialic acid antibody obtained by adding a streptavidin-binding protein and/or a multimerization domain to antibody AX, antibody B, antibody C, or antibody D.
  • the antibodies of the present invention are preferably monoclonal antibodies.
  • the molecular weight of the antibody of the present invention is not particularly limited, but the lower limit is, for example, 20,000, preferably 50,000, preferably 100,000, more preferably 120,000, and the upper limit is, for example, 1,000,000, preferably 500,000, more preferably 200,000. .
  • the structure of the antibody of the present invention is not particularly limited.
  • the antibodies of the present invention may or may not contain a constant region. When it contains a constant region, it may contain all of the heavy chain constant region (CH1, CH2, and CH3) and the light chain constant region (CL), or any one or more of these. may include a combination of
  • antibody structures of the invention include immunoglobulin, Fab, F(ab') 2 , minibody, scFv-Fc, Fv, scFv, diabody, triabody, A tetrabody and the like can be mentioned. Among these, immunoglobulins are preferred from the viewpoint of the effects of the present invention.
  • An immunoglobulin has a structure in which two structures are combined, one heavy chain having a heavy chain variable region and heavy chain constant region and one light chain having a light chain variable region and light chain constant region.
  • Fab includes a heavy chain fragment containing CH1 in the heavy chain variable region and the heavy chain constant region, and a light chain containing the light chain variable region and the light chain constant region (CL). It has a structure in which it associates with the chain variable region through the above-described non-covalent intermolecular interaction or binds through a disulfide bond.
  • CH1 and CL may form a disulfide bond between the thiol groups of the cysteine residues present in each.
  • F(ab') 2 has two pairs of the above Fab, and has a structure in which CH1s are disulfide-bonded between thiol groups of cysteine residues contained therein.
  • a minibody is a structure in which two fragments in which CH3 is bound to the heavy chain variable region that constitutes the scFv below are associated through non-covalent intermolecular interactions between CH3.
  • scFv-Fc means that two antibody fragments containing the following scFv, CH2, and CH3 are associated by non-covalent intermolecular interactions between CH3, similar to the above minibody, and the cysteine residue contained in each CH3 It is a structure in which the thiol groups of the groups are disulfide-bonded.
  • Fv is also called the minimum structural unit of an antibody, and is a structure in which heavy chain variable regions and light chain variable regions are associated through non-covalent intermolecular interactions.
  • the thiol groups of cysteine residues present in the heavy chain variable region and the light chain variable region may be disulfide bonded.
  • scFv is a structure in which the C-terminus of the heavy chain variable region and the N-terminus of the light chain variable region are connected by a linker, or the N-terminus of the heavy chain variable region and the C-terminus of the light chain variable region are connected by a linker.
  • structure also called a single-chain antibody.
  • Diabodies, triabodies, and tetrabodies are the above-described scFvs that form dimers, trimers, and tetramers, respectively, and have non-covalent intermolecular interactions between variable regions, etc., similar to Fv. It is a structure that associates in a structurally stable state.
  • the antibody of the present invention is an immunoglobulin
  • its class is not particularly limited.
  • the classes include, for example, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, and subclasses thereof.
  • Preferred classes include, for example, IgG.
  • Antibodies of the present invention can be, for example, human-derived antibodies, mouse-derived antibodies, rat-derived antibodies, rabbit-derived antibodies, monkey-derived antibodies, chimpanzee-derived antibodies, and the like. Further, the antibodies of the present invention include chimeric antibodies (for example, antibodies obtained by replacing the amino acid sequence of the constant region of an antibody derived from a non-human organism (such as a mouse) with the amino acid sequence of the constant region of a human-derived antibody), humanized antibodies, It may be a fully humanized antibody or the like.
  • the antibody of the present invention can be produced, for example, by culturing a host transformed with a polynucleotide encoding the antibody of the present invention and collecting fractions containing the antibody of the present invention.
  • a polynucleotide encoding the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it contains the antibody of the present invention in an expressible state, and may contain other sequences besides the coding sequence of the antibody of the present invention. Other sequences include secretory signal peptide coding sequences, promoter sequences, enhancer sequences, repressor sequences, insulator sequences, origins of replication, drug resistance gene coding sequences, etc., which are located adjacent to the antibody coding sequences of the invention. be done.
  • a polynucleotide encoding the antibody of the present invention may be a linear polynucleotide or a circular polynucleotide (vector etc.).
  • polynucleotides include (I) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding at least one selected from the group consisting of the heavy chain, heavy chain variable region, and heavy chain CDRs 1-3 of the antibody of the present invention; (II) a polynucleotide comprising a base sequence encoding at least one selected from the group consisting of the light chain, light chain variable region, and light chain CDRs 1-3 of the antibody of the present invention; A polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding at least one selected from the group consisting of a heavy chain, a heavy chain variable region, and heavy chain CDRs 1-3, and a light chain, a light chain variable region, and a light chain of the antibody of the present invention A polynucleotide containing a base sequence encoding at least one selected from the group consisting of chain CDRs 1-3 and the like.
  • the host is not particularly limited, and examples include insect cells, eukaryotic cells, mammalian cells, and the like. Among them, mammalian cells such as HEK cells, CHO cells, NS0 cells, SP2/O cells, and P3U1 cells are preferred from the viewpoint of more efficient antibody expression.
  • Methods for transformation, culture and collection are not particularly limited, and known methods for antibody production can be employed. After recovery, the antibody of the present invention may be purified as necessary. Purification can be performed by known methods for antibody production, such as chromatography, dialysis, and the like.
  • the present invention relates to reagents or kits containing the antibody of the present invention and/or a polynucleotide encoding the antibody of the present invention.
  • the reagent of the present invention may further contain other components as necessary.
  • other components include, but are not limited to, bases, carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, and thickeners. agents, moisturizing agents, coloring agents, fragrances, chelating agents, and the like.
  • the kit of the present invention may optionally contain other materials, reagents, instruments, etc. necessary for carrying out the method of the present invention, such as gene introduction reagents, cells, buffer solutions, etc., as necessary.
  • the reagents and kits of the present invention can be used for detecting or separating polysialic acid or polysialic acid-bearing substances. More specifically, it can be used for examination of polysialic acid-related diseases or separation of polysialic acid-expressing cells. Specific aspects of these applications are described in the next section (4. Detection and Separation Methods).
  • Polysialic acid-related diseases include cancer (eg, ovarian cancer, liver cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, urethral cancer, colon cancer, skin cancer, malignant melanoma, osteosarcoma, squamous epithelium of the head and neck).
  • cancer eg, ovarian cancer, liver cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, urethral cancer, colon cancer, skin cancer, malignant melanoma, osteosarcoma, squamous epithelium of the head and neck).
  • stomach cancer prostate cancer, breast cancer, lung cancer, colon cancer, lymphoma, liver cancer, mesothelioma, melanoma, astrocytoma, oligodendroglioma, meningioma, neurofibroma, nerve glioblastoma, ependymoma, schwannoma, neurofibrosarcoma, neuromedulloblastoma, fibrosarcoma, squamous cell carcinoma, neuroectodermal cell carcinoma, thyroid tumor, pituitary tumor, epidermoid carcinoma cancer, etc.), psychiatric disorders (schizophrenia, bipolar disorder, depression), neurodegenerative diseases (Huntington's disease, Alzheimer's disease, ischemia), and the like.
  • the polysialic acid retainer is not particularly limited as long as it retains polysialic acid (for example, proteins, cells, etc.). Specific examples include polysialic acid-expressing cells (immune cells such as NK cells, etc.). Polysialic acid-expressing cells are cells in which polysialic acid is retained on the cell surface.
  • the present invention relates to a method for detecting polysialic acid or a polysialic acid-bearing material (detection method of the present invention), comprising a step of contacting the antibody of the present invention with a sample (contacting step).
  • detection method of the present invention polysialic acid or a polysialic acid-supported polysialic acid or polysialic acid-supported material comprising a contacting step and a step of separating the antibody-bound fraction and the antibody-unbound fraction (separation step) Separation method (separation method of the present invention).
  • the sample is not particularly limited as long as it can contain polysialic acid or a polysialic acid support, and can be, for example, a biological sample.
  • the species from which the biological sample is derived is not particularly limited, and examples thereof include various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits, other deuterostomes such as sea urchins, and capsular polysaccharides of bacteria. and preferably humans.
  • the biological sample is not particularly limited, and includes tissue (e.g., brain tissue, tissue in which various cancers may exist, etc.), body fluid (e.g., whole blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, saliva, synovial fluid, urine, tissue fluid (bronchial (including alveolar lavage fluid), sweat, tears, sputum, nasal discharge, etc.), and samples derived therefrom (for example, obtained through various treatments such as enzyme treatment and purification treatment).
  • tissue e.g., brain tissue, tissue in which various cancers may exist, etc.
  • body fluid e.g., whole blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, saliva, synovial fluid, urine, tissue fluid (bronchial (including alveolar lavage fluid), sweat, tears, sputum, nasal discharge, etc.
  • samples derived therefrom for example, obtained through various treatments such as enzyme treatment and purification treatment.
  • the contacting step can be performed in vitro or in vivo.
  • the antibody of the present invention can be brought into contact with the sample by administering the antibody of the present invention to a living body.
  • detection of polysialic acid or a polysialic acid-supporting substance can be performed by detecting (for example, visualizing) a complex containing the antibody of the present invention and polysialic acid or a polysialic acid-supporting substance.
  • detecting for example, visualizing
  • Specific examples include various immunological assays, more specifically immunohistochemical staining, ELISA, sandwich ELISA, EIA, RIA, Western blotting, and the like.
  • a polysialic acid-related disease can be tested based on the amount or concentration of polysialic acid or polysialic acid-supporting material detected by the detection method of the present invention.
  • the amount or concentration of polysialic acid or a polysialic acid carrier can aid in the determination of polysialic acid-related diseases.
  • the separation step is not particularly limited.
  • the antibody of the present invention is immobilized on a support (carrier particles, substrate, etc.) during the contacting step, or the antibody of the present invention is immobilized on the support after the contacting step, and the antibody of the present invention is immobilized on the support during the separation step. It can be carried out by separating the supernatant (for example, by washing the support). After separation, the complex of the antibody of the present invention and polysialic acid or polysialic acid-supported material, or polysialic acid or polysialic acid-supported material, can be liberated, if necessary.
  • Example 1 Preparation of Mouse Anti-polySia-hIgG1 Chimeric Antibody
  • the sequences (SEQ ID NOs: 1-3) in the description below are shown in FIG.
  • the sequence numbers of the L chain CDR sequences and the H chain CDR sequences are as follows.
  • H chain CDR1 SEQ ID NO: SEQ ID NO: 7
  • H chain CDR2 SEQ ID NO: 8
  • H chain CDR3 SEQ ID NO: 9.
  • pAb-mouse anti-polySia LC variant region, sequence 2-1: SEQ ID NO: 2
  • pAb - A mouse anti-polySia HC (variable region, sequence 2-2: SEQ ID NO: 3) was constructed. These were co-transfected into Expi293F cells, and the culture supernatant was obtained as a mouse anti-polySia-hIgG1 chimeric antibody fraction.
  • Example 2 Preparation of mouse anti-polySia-hIgG1 chimeric (negative) antibody
  • the 39th tyrosine residue of the variable region light chain (SEQ ID NO: 2) was point-mutated to an alanine residue.
  • a negative control antibody was prepared.
  • the fetal porcine brain, in which polysialic acid is highly expressed was a negative antibody that could not be detected by Western blotting (Fig. 2).
  • Y39A and Y39S mutants were mutated not only to alanine but also to serine, isoleucine, aspartic acid, lysine, phenylalanine, and tryptophan, respectively.
  • Mutants, Y39I mutant, Y39D mutant, Y39K mutant, Y39F mutant and Y39W mutant were produced. These amino acids were prepared as representatives of different properties such as charge and hydrophobicity.
  • Example 3 Preparation of highly functionalized mouse anti -polySia-hIgG1 chimeric antibody
  • the mouse anti-polySia hIgG1 chimeric antibody prepared in Example 1 was multimerized and highly functionalized.
  • the pAb-mouse anti-polySiaHC constant region was fused with the AVEXIS sequence (SEQ ID NO: 10) having a pentamerization domain, 6xHisTag, and SBP (streptavidin-binding protein) Tag (SEQ ID NO: 11), resulting in mouse anti-polySia-hIgG1- x5-His-SBP (FL-x5-His-SBP) was generated.
  • mouse anti-polySia-hIgG1(Hinge)-x5-His-SBP Hinge-x5-His-SBP
  • mouse anti-polySia-hIgG1(Hinge)-x5-His Hinge- x5-His
  • SBP Tag mouse anti-polySia-hIgG1-SBP fused with SBP Tag. Western blotting was performed using fetal porcine brain to confirm the recognition ability of the antibodies. Antibody fused with SBP Tag became detectable with Streptavidin-POD (Fig. 4).
  • Example 4 Establishment of sandwich ELISA for highly sensitive detection of polysialic acid
  • a sandwich ELISA method using two types of anti-polysialic acid antibodies with different recognition abilities. Specifically, a mouse IgM anti-polysialic acid antibody (prepared in Example 6) is immobilized on a 96-well plate, a sample is added, polysialic acid chains are captured by the mouse IgM anti-polysialic acid antibody, and blocked using BSA.
  • mouse anti-polySia-hIgG1-SBP which recognizes the polysialic acid chain captured by mouse anti-polySia-hIgG1-SBP, which is one of the above-mentioned highly functional mouse anti-polySia-hIgG1 chimeric antibodies, and the SBP attached to the antibody is treated with Streptavidin-POD made me recognize it.
  • Streptavidin-POD made me recognize it.
  • TMB solution as a substrate, POD activity was used to develop color, and A450 was measured.
  • Example 6 Cloning of CDR sequences of mouse IgM anti-polysialic acid antibody and evaluation of its activity cDNA was prepared from a hybridoma producing mouse IgM anti-polysialic acid antibody, and the variable light chain and variable heavy chain regions were cloned by PCR.
  • pAb-LC and pAb-HC Expression Vectors having human IgG constant region sequences by the seamless ligation method, respectively, pAb-mIgMpolySiaLC and pAb-mIgMpolySiaHC, and multimerized mIgMpolySia-hIgG1-x5-His- SBP (FL-x5-His-SBP) was generated.
  • a negative control antibody was prepared by point-mutating the 37th tyrosine residue of the light chain in the CDR to an alanine residue in the same manner as the anti-polySia antibody.
  • Light chain CDR1 QSLLDSDGKTY (SEQ ID NO: 17)
  • Light chain CDR2 LVS (SEQ ID NO: 18)
  • Light chain CDR3 WQGTHFP (SEQ ID NO: 19)
  • Light Chain Variable Region DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 20)
  • Heavy chain CDR1 GYTFTSYWI (SEQ ID NO:21)
  • Heavy chain CDR2 IYPGSGST (SEQ ID NO:22)
  • Heavy chain CDR3 IRSGVRRPHFDY (SEQ ID NO:23) Heavy chain variable region: QVQLQQPGSELVRPGGSVKLSCRASGYTFTSYWIHWVKQRPGQGLEWIGNIYPGSGSTNYDEEFKR
  • Example 7 Cloning of CDR sequences of mouse IgM anti-oligosialic acid antibody and evaluation of its activity cDNA was prepared from a hybridoma producing mouse IgMoligoSia, and the variable light chain and variable heavy chain regions were cloned by PCR. Then, they were subcloned into pAb-LC and pAb-HC Expression Vectors having human IgG constant region sequences by the seamless ligation method, respectively, pAb-moligoSiaLC and pAb-moligoSiaHC, and moligoSia-hIgG1-x5-His- SBP (FL-x5-His-SBP) was generated. Using this moligoSia-hIgG1 chimeric antibody, ELISA using ganglioside GD3 was performed to confirm the recognition ability of the antibody (Fig. 8).
  • Light chain CDR1 KSVDNYGISF (SEQ ID NO:25)
  • Light chain CDR2 AAS (SEQ ID NO:26)
  • Light chain CDR3 QQSKEVPYT (SEQ ID NO:27)
  • Light chain variable region DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 28)
  • Heavy chain CDR1 GFNIKNTY (SEQ ID NO:29)
  • Heavy chain CDR2 IDPANGNTK (SEQ ID NO:30)
  • Heavy chain CDR3 ARRLRSSAGDYFDY (SEQ ID NO:31)
  • Heavy chain variable region QVQLKQSVAELVRPGASVKLSCTASGFNIKNTYIHWVNQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYAPKFQ
  • Example 8 Preparation of high-affinity mouse anti-polySia-hIgG1 chimeric antibody and evaluation of its activity Based on the mouse anti-polySia-hIgG1 chimeric antibody prepared in Example 1, the following five point mutants were prepared.
  • N35Q-mIgGpolySia, L chain CDR1 is SEQ ID NO: 33: RSSQSLVHSNGQTYLY) in which the 12th asparagine residue of L chain CDR1 (SEQ ID NO: 4: RSSQSLVHSNGNTYLY) is point-mutated to a glutamine residue
  • - Mutant antibody N35L-mIgGpolySia, L chain CDR1 is SEQ ID NO: 34: RSSQSLVHSNGLTYLY) in which the 12th asparagine residue of L chain CDR1 (SEQ ID NO: 4: RSSQSLVHSNGNTYLY) is point-mutated to a leucine residue
  • D158Q-mIgGpolySia, H chain CDR1 is SEQ ID NO: 35: GYTFTQY) in which the 6th aspartic acid residue of H chain CDR1 (SEQ ID NO: 7: GYTFTDY) is point-mutated to
  • mice anti-polySia-hIgG1 chimeric antibody (mIgGpolySia-WT) prepared in Example 1
  • the negative antibody (Y39I-mIgGpolySia) prepared in Example 2
  • biolayer interferometry (Octet) analyzed the affinity to polysialic acid. Table 1 shows the results. The introduction of point mutations improved the affinity to polysialic acid.
  • Example 9 Preparation of high-affinity mouse anti-polySia-hIgG1 chimeric antibody and evaluation of its activity Based on the mIgMpolySia-hIgG-x5-His-SBP antibody prepared in Example 6, the following point mutants were prepared.
  • Example 10 Preparation of low-affinity mouse IgM anti-oligosialic acid antibody and evaluation of its activity Based on the mIgMoligoSia-hIgG-x5-His-SBP antibody prepared in Example 7, the following point mutants were prepared.
  • - Mutant antibody N31A, light chain CDR1 is SEQ ID NO: 38: KSVDAYGISF
  • the fifth asparagine residue of light chain CDR1 SEQ ID NO: 25: KSVDNYGISF
  • the above mutant antibody or the mIgMoligoSia-hIgG-x5-His-SBP antibody prepared in Example 7 was subjected to ELISA using ganglioside GD3 to confirm the recognition ability of the antibody. The results are shown in FIG.

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Abstract

ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出又は分離技術を提供すること。 抗体A～抗体Eからなる群より選択される少なくとも1種の抗体。

Description

ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出又は分離方法
　本発明は、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出・分離方法等に関する。
　ポリシアル酸（シアル酸重合体）は、主に細胞間接着分子であるNCAMの修飾糖鎖として存在しており、NCAMの機能制御を担い、またポリシアル酸独自の機能を担っていることが知られている。ポリシアル酸は、従来、細胞間の反発性の場を提示し、細胞間隙を調節して細胞内シグナル強度を制御することが報告されてきた。しかし、近年、ポリシアル酸は、誘因性の場を提示し、各種分子群と特異的に結合することが報告されている。また、ポリシアル酸は、がん細胞に発現すること、精神疾患患者で発現異常が起こっていること、神経変性疾患患者で発現異常が起こっていること、免疫細胞（NK細胞等）の表面上に存在すること等が知られている（非特許文献１）。
Sato, C. and Kitajima, K., Polysialylation and disease. Molecular Aspects of Medicine, 2020 Aug 27;100892.
　本発明は、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出又は分離技術を提供することを課題とする。
　本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、（抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；（抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；（抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；（抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；（抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び（抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体からなる群より選択される少なくとも1種の抗体を用いることにより、上記課題を解決できることを見出した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　（抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；
（抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
（抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；
（抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
（抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び
（抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体
からなる群より選択される少なくとも1種の抗体、及び／又は前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、キット。
　項２．　前記抗体Aが、
（抗体A1）配列番号2で示されるアミノ酸配列A1L1のN末端から39番目のチロシン残基、若しくは前記アミノ酸配列A1L1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列A1L2における前記チロシン残基に対応するチロシン残基が、他のアミノ酸残基に変異してなるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体、又は
（抗体A2）配列番号20で示されるアミノ酸配列A2L1のN末端から37番目のチロシン残基、若しくは前記アミノ酸配列A2L1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列A2L2における前記チロシン残基に対応するチロシン残基が、他のアミノ酸残基に変異してなるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体
である、項１に記載のキット。
　項３．　前記抗体Bが、重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体である、項１又は２に記載のキット。
　項４．　前記抗体C及び／又は前記抗体DがIgG抗体である、項１～３のいずれかに記載のキット。
　項５．　前記抗体Eが、前記抗体AX、前記抗体B、前記抗体C、又は前記抗体Dにストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗ポリシアル酸抗体である、項１～４のいずれかに記載のキット。
　項６．　ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出又は分離用である、項１～５のいずれかに記載のキット。
　項７．　ポリシアル酸関連疾患の検査用、又はポリシアル酸発現細胞の分離用である、項１～６のいずれかに記載のキット。
　項８．　（抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；
（抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
（抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；
（抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
（抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び
（抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体
からなる群より選択される少なくとも1種の抗体、及び／又は前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、試薬。
　項９．　（抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；
（抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
（抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；
（抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
（抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び
（抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体
からなる群より選択される少なくとも1種の抗体を試料と接触させる工程を含む、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出方法。
　項１０．　前記抗体とポリシアル酸又はポリシアル酸保持体とを含む複合体を可視化することを含む、項９に記載の検出方法。
　項１１．　ELISA法である、項９又は１０に記載の検出方法。
　項１２．　前記ELISA法がサンドイッチELISA法である、項１１に記載の検出方法。
　項１３．　（抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；
（抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
（抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；
（抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
（抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び
（抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体
からなる群より選択される少なくとも1種の抗体を試料と接触させる工程、及び前記抗体への結合画分と前記抗体への非結合画分を分離する工程を含む、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の分離方法。
　項１４．　　下記抗体A～抗体Eのいずれかの抗体、及び／又は前記抗体をコードするポリヌクレオチド：
（抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；
（抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
（抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；
（抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
（抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び
（抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体。
　本発明によれば、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出又は分離技術を提供することができる。
実施例1における、ブタ胎児脳を用いたウエスタンブロッティングおよびマウス胎児脳(MEB)を用いたELISAの結果を示す。 実施例2における、ブタ胎児脳を用いたウエスタンブロッティングおよびマウス胎児脳(MEB)を用いたELISAの結果を示す。 実施例2における、組織染色の結果を示す。 実施例3における、ブタ胎児脳を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。 実施例4における、認識能の異なる2種類の抗ポリシアル酸抗体を用いたサンドイッチELISAの結果を示す。 実施例5における、ブタ胎児脳を用いたウエスタンブロッティングおよびマウス胎児脳(MEB)を用いたELISAの結果を示す。 実施例6における、ブタ胎児脳を用いたウエスタンブロッティングおよびマウス胎児脳(MEB)を用いたELISAの結果を示す。 実施例7における、マウス胎児脳(MEB)を用いたELISAの結果を示す。 実施例1で使用又は作製した材料のアミノ酸配列を示す。 実施例5で使用又は作製した材料のアミノ酸配列を示す。 実施例9における、マウス胎児脳(MEB)を用いたELISAの結果を示す。 実施例10における、ガングリオシドGD3用いたELISAの結果を示す。
　1．定義
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　本明細書においては、アミノ酸／アミノ酸残基を一文字表記で表すこともある。
　アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS，Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264－2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high－scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873－7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の『同一性』も上記に準じて定義される。
　本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
　本明細書中において、「CDR」とは、Complementarity Determining Regionの略であり、相補性決定領域とも称される。CDRとは、イムノグロブリンの可変領域に存在する領域であり、抗体が有する抗原への特異的な結合に深く関与する領域である。そして、「軽鎖CDR」とはイムノグロブリンの軽鎖の可変領域に存在するCDRであり、「重鎖CDR」とはイムノグロブリンの重鎖の可変領域に存在するCDRのことを意味する。
　本明細書中において、「可変領域」とは、上述したCDR1～CDR3（以下、単に「CDRs1-3」という）を含む領域のことを意味する。これらのCDRs1-3の配置順序は特に限定はされないが、好ましくは、N末端側からC末端側の方向に、CDR1、CDR2、及びCDR3の順か、若しくはこの逆の順に、連続又は後述するフレームワーク領域（FR）と称される他のアミノ酸配列を介して、配置された領域を意味する。そして「重鎖可変領域」とは、上述の重鎖CDRs1-3が配置された領域であり、「軽鎖可変領域」とは、上述の軽鎖CDRs1-3が配置された領域である。
　各可変領域の上記CDR1-3以外の領域は、上述するようにフレームワーク領域（FR）と称される。特に可変領域のN末端と上記CDR1との間の領域をFR1、CDR1とCDR2との間の領域をFR2、CDR2とCDR3との間の領域をFR3、CDR3と可変領域のC末端との間をFR4とそれぞれ定義される。
　FRは、上述した抗原認識配列として特に重要なCDRs1-3を繋ぐリンカー配列としての機能も兼ね備えており、可変領域全体の立体構造形成に寄与する領域である。
　2．抗体
　本発明は、一態様において、抗体A、抗体AX、抗体B、抗体C、抗体D、及び抗体E（本明細書において、これらをまとめて「本発明の抗体」と示すこともある。）に関する。以下に、これらについて説明する。
　2-1．抗体A
　抗体Aは、軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体、である。
　軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基は、軽鎖CDR1内のチロシン残基であって、軽鎖CDR1内のC末端側に存在するチロシン残基であり、この限りにおいて特に制限されない。「C末端側」とは、例えば軽鎖CDR1のC末端アミノ酸残基を含む1～5つ（好ましくは1～3つ、より好ましくは1～2つ、さらに好ましくは1つ）のアミノ酸残基からなる領域を示す。上記チロシン残基は、軽鎖CDR1内のC末端側に複数のチロシン残基が存在する場合は、最もC末端側のチロシン残基であることが好ましい。
　抗体Aは、抗ポリシアル酸抗体において、上記チロシン残基置換が導入された抗体であり、当該チロシン残基置換によりポリシアル酸に対する反応性/結合性が大きく低下している（後述の実施例2のELISAで測定される、ポリシアル酸に対する反応性/結合性が、チロシン残基置換導入前の反応性/結合性100％に対して、例えば50％以下、好ましくは40％以下、より好ましくは30％以下、さらに好ましくは20％以下、よりさらに好ましくは10％以下、とりわけ好ましくは5％以下である）ので、ポリシアル酸ネガティブ抗体として使用することができる。
　「他のアミノ酸残基」は、チロシン残基以外のアミノ酸残基である限り、特に制限されない。他のアミノ酸残基としては、例えばG、A、V、I、L等の脂肪族アミノ酸；　C、M等の含硫アミノ酸；　K、H、R等の塩基性アミノ酸；　N、Q等のアミド基含有アミノ酸；　S、T等のヒドロキシ基含有アミノ酸；　F、W等の芳香族アミノ酸；　D、E等の酸性アミノ酸；　P等のイミノ酸等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは、G、A、V、I、L等の脂肪族アミノ酸；　K、H、R等の塩基性アミノ酸；　S、T等のヒドロキシ基含有アミノ酸；　Wである芳香族アミノ酸；　D、E等の酸性アミノ酸等が挙げられ、より好ましくはA、S、I、D、K、W等が挙げられる。
　抗体Aは、通常、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む。
　抗体Aは、抗ポリシアル酸抗体に対して上記チロシン残基置換以外の変異が導入されたものであってもよい。変異としては、アミノ酸の置換、欠失、挿入等が挙げられる。当該変異のアミノ酸残基の数は、抗体構造が保たれる限り特に制限されないが、例えば0～20、0～10、又は0～5であり、或いは抗体（又は重鎖/軽鎖可変領域、重鎖/軽鎖定常領域）の全アミノ酸残基数100％に対して例えば10％以下、5％以下、2％以下、又は1％以下である。
　抗体Aは、その一態様において、（抗体A1）配列番号2で示されるアミノ酸配列A1L1のN末端から39番目のチロシン残基、若しくは前記アミノ酸配列A1L1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列A1L2における前記チロシン残基に対応するチロシン残基が、他のアミノ酸残基に変異してなるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体、であることが好ましい。
　抗体A1は、アミノ酸配列A1L1を軽鎖可変領域として含む抗ポリシアル酸抗体において、上記チロシン残基置換が導入された抗体である。
　アミノ酸配列A1L2のアミノ酸配列A1L1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％未満である。アミノ酸配列A1L2において、アミノ酸配列A1L1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば1～5、好ましくは1～2、より好ましくは1である。
　なお、本明細書において、「対応するチロシン残基」とは、2つの配列をBLAST（設定はデフォルト）で比較した場合に、アライメント配列上同一の位置のチロシン残基であることを示す。例えば、上記の場合であれば、「アミノ酸配列A1L2における前記チロシン残基に対応するチロシン残基とは、アミノ酸配列A1L1とアミノ酸配列A1L2と配列比較して得られるアライメント配列において、アミノ酸配列A1L2における、アミノ酸配列A1L1のN末端から39番目のチロシン残基と同一の位置のチロシン残基を示す。
　抗体A1は、配列番号3で示されるアミノ酸配列A1H1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列A1H2を含む重鎖可変領域を含むことが好ましい。
　アミノ酸配列A1H2のアミノ酸配列A1H1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列A1H2において、アミノ酸配列A1H1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～5、好ましくは0～2、より好ましくは0～1である。
　抗体Aは、その一態様において、（抗体A2）配列番号20で示されるアミノ酸配列A2L1のN末端から37番目のチロシン残基、若しくは前記アミノ酸配列A2L1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列A2L2における前記チロシン残基に対応するチロシン残基が、他のアミノ酸残基に変異してなるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体、であることが好ましい。
　抗体A2は、アミノ酸配列A2L1を軽鎖可変領域として含む抗ポリシアル酸抗体において、上記チロシン残基置換が導入された抗体である。
　アミノ酸配列A2L2のアミノ酸配列A2L1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％未満である。アミノ酸配列A2L2において、アミノ酸配列A2L1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば1～5、好ましくは1～2、より好ましくは1である。
　抗体A2は、配列番号24で示されるアミノ酸配列A2H1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列A2H2を含む重鎖可変領域を含むことが好ましい。
　アミノ酸配列A2H2のアミノ酸配列A2H1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列A2H2において、アミノ酸配列A2H1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～5、好ましくは0～2、より好ましくは0～1である。
　抗体Aは、ポリシアル酸に対する反応性が低く、ポリシアル酸検出・分離におけるネガティブコントロールとして使用することができる。
　2-1X．抗体AX
　抗体AXは、配列番号33又は配列番号34（好ましくは配列番号33）で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36（好ましくは配列番号36）で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体、である。
　抗体AXは、軽鎖可変領域が配列番号2で示されるアミノ酸配列AXL1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列AXL2を含むことが好ましい。
　アミノ酸配列AXL2のアミノ酸配列AXL1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列AXL2において、アミノ酸配列AXL1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～5、好ましくは0～2、より好ましくは0～1である。
　抗体AXは、重鎖可変領域が配列番号3で示されるアミノ酸配列AXH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列AXH2を含むことが好ましい。
　アミノ酸配列AXH2のアミノ酸配列AXH1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列AXH2において、アミノ酸配列AXH1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～5、好ましくは0～2、より好ましくは0～1である。
　抗体AXは、IgG抗体であることが好ましい。
　抗体AXは、ポリシアル酸の検出/分離に用いることができ、例えばサンドイッチELISA等の複数種の抗ポリシアル酸抗体が必要なアッセイに利用することができる。
　2-2．抗体B
　抗体Bは、重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体、である。
　抗体Bは、マウス由来のCDR配列を有する抗体のヒト化抗体である。
　アミノ酸配列BH2のアミノ酸配列BH1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列BH2において、アミノ酸配列BH1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～5、好ましくは0～2、より好ましくは0～1である。
　抗体Bは、配列番号14で示されるアミノ酸配列BL1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BL2を含む軽鎖可変領域を含むことが好ましい。
　アミノ酸配列BL2のアミノ酸配列BL1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列BL2において、アミノ酸配列BL1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～5、好ましくは0～2、より好ましくは0～1である。
　上記において、アミノ酸配列BH1又はアミノ酸配列BL1に対して変異した配列である場合、その変異箇所及び変異内容は、ポリシアル酸への反応性が著しく損なわれず、且つヒト化配列部分が著しく変異していない限りにおいて、特に制限されない。当該変異箇所及び変異内容は、各生物種の抗体配列情報、実施例5の内容（図10等）の情報等に基づいて、適宜決定することができる。
　ポリシアル酸への反応性の観点から、抗体Bは、配列番号4で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号7で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含むことが好ましい。
　抗体Bが定常領域を有する場合、そのアミノ酸配列は、ヒト抗体の定常領域のアミノ酸配列である。
　抗体Bは、後述の実施例5のELISAで測定される、ポリシアル酸に対する反応性/結合性が、実施例5で得られたヒト化抗体の反応性/結合性100％に対して、例えば50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、よりさらに好ましくは90％以上である。当該反応性/結合性の上限は特に制限されず、例えば500％、300％、200％、150％、又は120％である。
　抗体Bは、ヒト化抗体として、体内診断等において好適に利用することができる。
　2-3．抗体C
　抗体Cは、配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体、である。
　抗体Cは、軽鎖可変領域が配列番号20又は配列番号37（好ましくは配列番号37）で示されるアミノ酸配列CL1に対して95％以上（好ましくは100％）の同一性を有するアミノ酸配列CL2を含むことが好ましい。
　アミノ酸配列CL2のアミノ酸配列CL1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列CL2において、アミノ酸配列CL1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～5、好ましくは0～2、より好ましくは0～1である。
　抗体Cは、重鎖可変領域が配列番号24で示されるアミノ酸配列CH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列CH2を含むことが好ましい。
　アミノ酸配列CH2のアミノ酸配列CH1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列CH2において、アミノ酸配列CH1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～5、好ましくは0～2、より好ましくは0～1である。
　抗体Cは、IgG抗体であることが好ましい。
　抗体Cは、ポリシアル酸の検出/分離に用いることができ、例えばサンドイッチELISA等の複数種の抗ポリシアル酸抗体が必要なアッセイに利用することができる。
　2-4．抗体D
　抗体Dは、配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体、である。
　抗体Dは、軽鎖可変領域が配列番号28で示されるアミノ酸配列DL1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列DL2を含むことが好ましい。
　アミノ酸配列DL2のアミノ酸配列DL1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列DL2において、アミノ酸配列DL1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～5、好ましくは0～2、より好ましくは0～1である。
　抗体Dは、重鎖可変領域が配列番号32で示されるアミノ酸配列DH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列DH2を含むことが好ましい。
　アミノ酸配列DH2のアミノ酸配列DH1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列DH2において、アミノ酸配列DH1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～5、好ましくは0～2、より好ましくは0～1である。
　抗体Dは、IgG抗体であることが好ましい。
　抗体Dは、ポリシアル酸の検出/分離に用いることができ、例えばサンドイッチELISA等の複数種の抗ポリシアル酸抗体が必要なアッセイに利用することができる。
　2-5．抗体E
　抗体Eは、ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体、である。ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインの付加により検出感度を向上させることが可能である。
　抗体Eの標的としては、特に制限されず、例えばポリシアル酸等の糖鎖、タンパク質、ペプチド等が挙げられる。
　ストレプトアビジン結合タンパク質は、ストレプトアビジンに対して結合性を有するタンパク質である限り特に制限されない。ストレプトアビジン結合タンパク質としては、例えば各種生物（動物、植物、微生物）由来のものを採用することができる。ストレプトアビジン結合タンパク質の具体例としては、配列番号11で示されるアミノ酸配列E1に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列E2からなるタンパク質が挙げられる。アミノ酸配列E2のアミノ酸配列E1に対する同一性は、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上であり、よりさらに好ましくは98％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列E2において、アミノ酸配列E1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～30、好ましくは0～15、より好ましくは0～10、さらに好ましくは0～5、よりさらに好ましくは0～2である。
　多量体化ドメインは、互いに結合して多量体を形成可能なドメインであり、その限りにおいて特に制限されない。多量体化ドメインとしては、例えば軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質ドメイン、ロイシンジッパードメイン、コラーゲン様ドメイン、コレラトキシンBサブユニットドメイン、テトラブラキオンコイルドコアドメイン、レオウイルスσ1タンパク質ドメイン、ヘパチチスデルタ抗原ドメイン等が挙げられる。多量体化ドメインの具体例としては、配列番号10で示されるアミノ酸配列E3に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列E4からなるタンパク質が挙げられる。アミノ酸配列E4のアミノ酸配列E3に対する同一性は、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上であり、よりさらに好ましくは98％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列E4において、アミノ酸配列E3から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～30、好ましくは0～15、より好ましくは0～10、さらに好ましくは0～5、よりさらに好ましくは0～2である。
　ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインの付加の態様は特に制限されず、抗体との融合タンパク質の状態で付加されていてもよいし、抗体と化学架橋により付加されていてもよい。また、ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインは、抗体に直接付加されていてもよいし、リンカー（ペプチドリンカー（例えばGとSから構成されるリンカー等）、鎖状構造の二価の基（例えば置換されていてもよいアルキレン基、置換されていてもよいヘテロアルキレン基等））、ペプチドタグ（例えばHisタグ等の精製タグ等）等の他の構造を介して抗体に付加されていてもよい。抗体の結合性への影響を抑えるために、ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインを付加させる位置は、抗体可変領域とは反対側の末端であることが好ましい。
　抗体Eは、IgG抗体であることが好ましい。また、抗体Eは、通常、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む。これらの可変領域又はこれらの可変領域中のCDR配列は、IgM抗体由来の可変領域又はCDR抗体であることが好ましい。IgM抗体の可変領域を用いてIgG抗体を得る（例えば、IgM抗体の可変領域とIgG抗体の定常領域とを融合させてなるキメラ抗体を得る）場合、得られたIgG抗体の標的に対する結合性が大きく低下し得る。この場合、ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインを付加することにより、結合性を向上させることが可能である。
　抗体Eは、抗体AX、抗体B、抗体C、又は抗体Dにストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗ポリシアル酸抗体であることが好ましい。
　2-6．共通事項
　本発明の各抗体について、上記で説明した構成以外の構成については以下のとおりである。
　本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。
　本発明の抗体の分子量は、特に制限されないが、下限は、例えば20,000、好ましくは50,000、好ましくは100,000、より好ましくは120,000であり、上限は、例えば1,000,000、好ましくは500,000、より好ましくは200,000である。
　本発明の抗体の構造は、特に制限されない。本発明の抗体は、定常領域を含むものであってもよいし、定常領域を含まないものであってもよい。定常領域を含む場合、重鎖の定常領域（CH1、CH2、及びCH3）並びに軽鎖の定常領域（CL）の全てを含んでいてもよいし、これらの内の任意の1種又は2種以上の組み合わせを含んでいてもよい。
　本発明の抗体の構造の具体例としては、イムノグロブリン、Fab、F(ab’)2、ミニボディ（minibody）、scFv‐Fc、Fv、scFv、ディアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）などが挙げられる。これらの中でも、本発明の効果の観点から、好ましくはイムノグロブリンが挙げられる。
　イムノグロブリンは、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を有する1本の重鎖と軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を有する1本の軽鎖から成る構造が2つ組み合わされた構造を有する。
　Fabとは、重鎖可変領域及び重鎖定常領域中のCH1を含む重鎖の断片と、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域（CL）を含む軽鎖とを含み、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが上述する非共有結合性の分子間相互作用によって会合するか、またはジスルフィド結合によって結合してなる構造を有する。Fabにおいて、CH1とCLとは、それぞれに存在するシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合していてもよい。
　F(ab’)2とは、2対の上記Fabを有し、CH1同士がこれらに含まれるシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合してなる構造である。
　ミニボディとは、下記scFvを構成する重鎖可変領域にCH3が結合した断片2つが、CH3同士で非共有結合性の分子間相互作用によって会合した構造である。
　scFv‐Fcとは、下記scFv、CH2、およびCH3を含む抗体断片2つが、上記ミニボディと同様にCH3同士で非共有結合性の分子間相互作用によって会合し、それぞれのCH3に含まれるシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合した構造である。
　Fvとは、抗体の最小構造単位ともいわれ、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが非共有結合性の分子間相互作用によって会合した構造である。Fvにおいて、重鎖可変領域および軽鎖可変領域内に存在するシステイン残基のチオール基同士がジスルフィド結合していてもよい。
　scFvとは、重鎖可変領域のC末端と軽鎖可変領域のN末端がリンカーで繋がれた構造、又は重鎖可変領域のN末端と軽鎖可変領域のC末端とがリンカーで繋がれた構造であり、単鎖抗体とも呼ばれる。
　ディアボディ、トリアボディ、およびテトラボディとは、それぞれ上記scFvが2量体、3量体および4量体を形成し、Fvなどと同様に可変領域同士の非共有結合性の分子間相互作用等により、構造的に安定な状態で会合した構造である。
　本発明の抗体がイムノグロブリンである場合、そのクラスは特に制限されない。該クラスとしては、例えばIgA、IgD、IgE、IgG、IgMなど、さらにはこれらのサブクラスが挙げられる。好ましいクラスとしては、例えばIgGが挙げられる。
　本発明の抗体の由来は特に制限されない。本発明の抗体は、例えばヒト由来抗体、マウス由来抗体、ラット由来抗体、ウサギ由来抗体、サル由来抗体、チンパンジー由来抗体などであり得る。また、本発明の抗体は、キメラ抗体（例えばヒト以外の生物（マウスなど）由来抗体の定常領域のアミノ酸配列をヒト由来抗体の定常領域のアミノ酸配列に置き換えられてなる抗体）、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体などであってもよい。
　本発明の抗体は、例えば、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドにより形質転換させた宿主を培養し、本発明の抗体を含む画分を回収する工程を含む方法によって製造することができる。
　本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは、本発明の抗体を発現可能な状態で含む限りにおいて特に制限されず、本発明の抗体のコード配列以外に、他の配列を含んでいてもよい。他の配列としては、本発明の抗体コード配列に隣接して配置される分泌シグナルペプチドコード配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、リプレッサー配列、インスレーター配列、複製基点、薬剤耐性遺伝子コード配列などが挙げられる。また、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは、直鎖状のポリヌクレオチドであってもよいし、環状のポリヌクレオチド（ベクターなど）であってもよい。
　ポリヌクレオチドの具体例としては、（I）本発明の抗体の重鎖、重鎖可変領域、及び重鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、（II）本発明の抗体の軽鎖、軽鎖可変領域、及び軽鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、（III）本発明の抗体の重鎖、重鎖可変領域、及び重鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに本発明の抗体の軽鎖、軽鎖可変領域、及び軽鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。
　宿主は、特に制限されず、例えば昆虫細胞、真核細胞、哺乳類細胞等が挙げられる。中でも、抗体をより効率的に発現させる観点から、哺乳類細胞であるHEK細胞、CHO細胞、NS0細胞、SP2/O細胞、P3U1細胞などが好ましい。形質転換、培養、及び回収の方法は、特に制限されず、抗体製造における公知の方法を採用することができる。回収後は、必要に応じて本発明の抗体を精製してもよい。精製は、抗体製造における公知の方法、例えばクロマトグラフィー、透析などにより行うことができる。
　3．試薬、キット
　本発明は、その一態様において、本発明の抗体、及び／又は本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、試薬或いはキット、に関する。
　本発明の試薬は、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
　本発明のキットは、必要に応じて、遺伝子導入試薬、細胞、緩衝液等、本発明の方法の実施等に必要な他の材料、試薬、器具等を適宜含んでいてもよい。
　本発明の試薬、キットは、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出又は分離に用いることができる。より具体的には、ポリシアル酸関連疾患の検査用、又はポリシアル酸発現細胞の分離に用いることができる。これらの用途の具体的態様については、次項（4．検出、分離方法）で説明する。
　ポリシアル酸関連疾患としては、がん（例えば卵巣がん、肝臓がん、膵臓がん、膀胱がん、尿道がん、大腸がん、皮膚がん、悪性メラノーマ、骨肉腫、頭頚部の扁平上皮がん、胃がん、前立腺がん、乳がん、肺がん、結腸がん、リンパ腫、肝がん、中皮腫、黒色腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経線維腫、神経膠芽細胞腫、上衣細胞腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、神経髄芽細胞腫、線維肉腫、扁平上皮細胞がん、神経外胚葉細胞がん、甲状腺腫瘍、下垂体腫瘍、類表皮がん腫等）、精神疾患（統合失調症、双極性障害、うつ病）、神経変性疾患（ハンチントン病、アルツハイマー病、虚血）等が挙げられる。
　ポリシアル酸保持体は、ポリシアル酸を保持するもの（例えばタンパク質、細胞等）である限り、特に制限されない。具体例として、ポリシアル酸発現細胞（NK細胞等の免疫細胞等）が挙げられる。ポリシアル酸発現細胞は、ポリシアル酸が細胞表面上に保持されている細胞である。
　4．検出、分離方法
　本発明は、その一態様において、本発明の抗体を試料と接触させる工程（接触工程）を含む、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出方法（本発明の検出方法）、に関する。また、本発明は、その一態様において、接触工程、及び前記抗体への結合画分と前記抗体への非結合画分を分離する工程（分離工程）を含む、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の分離方法（本発明の分離方法）、に関する。以下、これらについて説明する。
　試料は、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体を含み得るものであれば特に制限されず、例えば生体試料であることができる。生体試料の由来生物種としては、特に制限されず、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物、ウニなどのその他後口動物、バクテリアの莢膜多糖が挙げられ、好ましくはヒトが挙げられる。
　生体試料としては、特に制限されず、組織（例えば脳組織、各種がんが存在し得る組織等）、体液（例えば全血、血清、血漿、髄液、唾液、関節液、尿、組織液（気管支肺胞洗浄液を含む）、汗、涙、喀痰、鼻汁等）等、さらにはこれらに由来する（例えば、酵素処理、精製処理等の各種処理を経て得られる）試料等が挙げられる。
　接触工程は、in vitro又はin vivoで行うことができる。接触をin vivoで行う場合、本発明の抗体を生体に投与することにより、本発明の抗体と試料とを接触させることができる。
　本発明の検出方法において、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出は、本発明の抗体とポリシアル酸又はポリシアル酸保持体とを含む複合体を検出（例えば、可視化）することにより行うことができる。具体的には、例えば各種免疫学的測定法、より具体的には免疫組織化学染色法、ELISA法、サンドイッチELISA法、EIA法、RIA法、ウェスタンブロッティング法等が挙げられる。
　本発明の検出方法により検出されたポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の量又は濃度に基づいて、ポリシアル酸関連疾患を検査することができる。例えば、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の量又は濃度に基づいて、ポリシアル酸関連疾患の判定を補助することができる。
　分離工程の具体的態様は、特に制限されない。例えば、接触工程の際に本発明の抗体を支持体（担体粒子、基材等）に固定させておき、或いは接触工程の後に本発明の抗体を支持体に固定させ、分離工程において支持体と上清とを分離すること（例えば支持体を洗浄すること）により行うことができる。分離後は、必要に応じて、本発明の抗体とポリシアル酸又はポリシアル酸保持体との複合体を、或いはポリシアル酸又はポリシアル酸保持体を、遊離させることができる。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　実施例1．マウス抗polySia-hIgG1キメラ抗体の作製
　下記説明中の配列（配列番号1～3）を図9に示す。図9中、L鎖CDR配列及びH鎖CDR配列の配列番号は次のとおりである。L鎖CDR1：配列番号4、L鎖CDR2：配列番号5、L鎖CDR3：配列番号6、H鎖CDR1：配列番号7、H鎖CDR2：配列番号8、H鎖CDR3：配列番号9。
　マウス抗polySia（＝polysialic acid）抗体 scFvの発現ベクター（pCold-マウス抗polySia scFv (配列1：配列番号1)）よりマウス抗polySia可変部軽鎖およびマウス抗polySia可変部重鎖領域をPCR法により増幅し、ヒトIgG定常領域の配列を持つpAb-LCおよびpAb-HC Expression Vectorにそれぞれseamless ligation法によってサブクローニングし、pAb-マウス抗polySia LC (可変部、配列2-1：配列番号2)およびpAb-マウス抗polySia HC (可変部、配列2-2：配列番号3)を構築した。これらをExpi293F細胞に共に遺伝子導入し、培養上清をマウス抗polySia -hIgG1キメラ抗体画分として得た。このマウス抗polySia -hIgG1キメラ抗体画分を用いてポリシアル酸が高く発現しているブタ胎児脳を用いたウエスタンブロッティングおよびマウス胎児脳(MEB)を用いたELISAを行い、その抗体の認識能を確認した（図1）。
　実施例2．マウス抗polySia -hIgG1キメラ（ネガティブ）抗体の作製
　実施例1で作製したマウス抗polySia -hIgG1キメラ抗体において可変部軽鎖（配列番号2）の39番目のチロシン残基をアラニン残基に点変異させたネガティブコントロール抗体の作製を行なった。その結果、ポリシアル酸が高く発現しているブタ胎児脳はウエスタンブロッティングで検出できないネガティブ抗体であった（図2）。さらに、39番目のチロシン残基への点変異導入の影響の普遍性を確かめるために、アラニンだけではなく、セリン、イソロイシン、アスパラギン酸、リジン、フェニルアラニン、トリプトファンにそれぞれ変異させたY39A変異体、Y39S変異体、Y39I変異体、Y39D変異体、Y39K変異体、Y39F変異体、Y39W変異体を作製した。これらのアミノ酸は電荷や疎水性などの性質の異なるものの代表として作製した。CBB染色により分泌された抗体を確認したところ、タンパク質としての発現量や安定性に大きな影響は見られなかった（図2）。そして、ブタ胎児脳を用いたウエスタンブロッティングでは、その活性は、チロシン同様に芳香族アミノ酸であるフェニルアラニンに変異したY39F変異体には半分程度の活性が残るものの同じく芳香族であるトリプトファンを含め、その他変異体は検出限界以下のネガティブ抗体であった（図2）。さらに、MEBを用いてELISAを行った結果、Y39I変異体が全く反応性を持たない完全ネガティブ抗体であった（図2）。また、マウス抗polySia -hIgG1キメラ抗体およびネガティブコントロール抗体の有用性を組織染色により示した（図3）。
　実施例3．高機能化マウス抗polySia -hIgG1キメラ抗体の作製
　実施例1で作製したマウス抗polySia hIgG1キメラ抗体を多量体化し、その高機能化を行なった。pAb-マウス抗polySiaHCの定常部に5量体化ドメインを持つAVEXIS配列（配列番号10）および、6xHisTag、SBP（ストレプトアビジン結合タンパク質） Tag（配列番号11）を融合し、マウス抗polySia-hIgG1-x5-His-SBP（FL-x5-His-SBP）を作製した。また、hIgG1定常部をヒンジ領域までにしたマウス抗polySia-hIgG1(Hinge)-x5-His-SBP（Hinge-x5-His-SBP）、マウス抗polySia-hIgG1(Hinge)-x5-His（Hinge-x5-His）を作製した。さらに、単量体ではあるがSBP Tagを融合したマウス抗polySia-hIgG1-SBPを作製した。それぞれ、ブタ胎児脳を用いたウエスタンブロッティングを行い、その抗体の認識能を確認した。SBP Tagを融合した抗体はStreptavidin-PODによる検出が可能となった（図4）。
　実施例4．ポリシアル酸を高感度に検出するサンドイッチELISAの確立
　微量なポリシアル酸を検出するため、認識能の異なる2種類の抗ポリシアル酸抗体を用いたサンドイッチELISA法を開発した。具体的には、マウスIgM抗ポリシアル酸抗体（実施例6で作製）を96well plateに固層化し、サンプルを添加しマウスIgM抗ポリシアル酸抗体によりポリシアル酸鎖をキャプチャーし、そしてBSAを用いてブロッキングを行ない、上述した高機能化マウス抗polySia-hIgG1キメラ抗体の一つであるマウス抗polySia-hIgG1-SBPによりキャプチャーされているポリシアル酸鎖を認識し、抗体に付加されているSBPをStreptavidin-PODで認識させた。そしてTMB溶液を基質としPODの活性を用いて呈色させ、A450を測定した。その結果、MEBは1 ng、ポリシアル酸転移酵素を遺伝子導入し、ポリシアル酸を発現させたメラノーマB16細胞の溶解液は125 ng、バクテリア莢膜由来のポリシアル酸（colominic acid）は5 ng、精製したpolySia-NCAM-Fcは0.2 ngまでの定量が可能であった（図5）。
　実施例5．完全ヒト化抗polySia抗体の作製
　下記説明中の配列（配列番号12～16）を図10に示す。
　マウス抗polySia抗体のCDR領域をヒトIgG抗体に移植し、完全ヒト化抗polySia抗体の作製を目指した。移植するヒトIgG抗体として、トラスツズマブの配列(可変部、配列3：配列番号12及び13)を用いた(可変部、配列4：配列番号14及び15)。しかし、その活性は検出限界以下であった。そこで、他のマウスIgGおよびヒトIgGの配列を比較し、重鎖の配列のCDR以外の部分の調整を行った(可変部、配列5：配列番号16)。その結果、その活性はマウス抗polySia-hIgG1キメラ抗体には劣るものの完全ヒト化を達成した（図6）。
　実施例6．マウスIgM抗ポリシアル酸抗体のCDR配列のクローニングおよびその活性の評価
　マウスIgM抗ポリシアル酸抗体を生産するハイブリドーマよりcDNAを調製し、可変部軽鎖および可変部重鎖領域をPCR法によりクローニングした。そして、ヒトIgG定常領域の配列を持つpAb-LCおよびpAb-HC Expression Vectorにそれぞれseamless ligation法によってサブクローニングし、pAb-mIgMpolySiaLC およびpAb-mIgMpolySiaHCおよび、多量化体となるmIgMpolySia-hIgG1-x5-His-SBP（FL-x5-His-SBP）を作製した。また、抗polySia抗体同様にCDR中にある軽鎖の37番目のチロシン残基をアラニン残基に点変異させたネガティブコントロール抗体の作製を行なった。このmIgMpolySia-hIgG1キメラ抗体を用いてポリシアル酸が高く発現しているブタ胎児脳を用いたウエスタンブロッティングおよびマウス胎児脳(MEB)を用いたELISAを行い、その抗体の認識能を確認した（図7）。
　得られた抗体の配列は以下のとおりである：
　軽鎖CDR1：QSLLDSDGKTY（配列番号17）
　軽鎖CDR2：LVS（配列番号18）
　軽鎖CDR3：WQGTHFP（配列番号19）
　軽鎖可変領域：DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPFTFGSGTKLEIK（配列番号20）
　重鎖CDR1：GYTFTSYWI（配列番号21）
　重鎖CDR2：IYPGSGST（配列番号22）
　重鎖CDR3：IRSGVRRPHFDY（配列番号23）
　重鎖可変領域：QVQLQQPGSELVRPGGSVKLSCRASGYTFTSYWIHWVKQRPGQGLEWIGNIYPGSGSTNYDEEFKRQATLTVDTSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCIRSGVRRPHFDYWGQGTTLTVSS（配列番号24）。
　実施例7．マウスIgM抗オリゴシアル酸抗体のCDR配列のクローニングおよびその活性の評価
　マウスIgMoligoSiaを生産するハイブリドーマよりcDNAを調製し、可変部軽鎖および可変部重鎖領域をPCR法によりクローニングした。そして、ヒトIgG定常領域の配列を持つpAb-LCおよびpAb-HC Expression Vectorにそれぞれseamless ligation法によってサブクローニングし、pAb-moligoSiaLC およびpAb-moligoSiaHCおよび、多量化体となるmoligoSia-hIgG1-x5-His-SBP（FL-x5-His-SBP）を作製した。このmoligoSia-hIgG1キメラ抗体を用いてガングリオシドGD3用いたELISAを行い、その抗体の認識能を確認した（図8）。
　得られた抗体の配列は以下のとおりである：
　軽鎖CDR1：KSVDNYGISF（配列番号25）
　軽鎖CDR2：AAS（配列番号26）
　軽鎖CDR3：QQSKEVPYT（配列番号27）
　軽鎖可変領域：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPYTFGGGTKLEIK（配列番号28）
　重鎖CDR1：GFNIKNTY（配列番号29）
　重鎖CDR2：IDPANGNTK（配列番号30）
　重鎖CDR3：ARRLRSSAGDYFDY（配列番号31）
　重鎖可変領域：QVQLKQSVAELVRPGASVKLSCTASGFNIKNTYIHWVNQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYAPKFQGKATISAATSSNTAYLQLSSLTSEDTAMYYCARRLRSSAGDYFDYWGLGTTLTVSS（配列番号32）。
　実施例8．高親和性マウス抗polySia -hIgG1キメラ抗体の作製とその活性の評価
　実施例1で作製したマウス抗polySia -hIgG1キメラ抗体に基づいて以下の5つの点変異体を作製した。
・L鎖CDR1（配列番号4：RSSQSLVHSNGNTYLY）の12番目のアスパラギン残基をグルタミン残基に点変異させた変異抗体（N35Q-mIgGpolySia、L鎖CDR1は配列番号33：RSSQSLVHSNGQTYLY）、
・L鎖CDR1（配列番号4：RSSQSLVHSNGNTYLY）の12番目のアスパラギン残基をロイシン残基に点変異させた変異抗体（N35L-mIgGpolySia、L鎖CDR1は配列番号34：RSSQSLVHSNGLTYLY）、
・H鎖CDR1（配列番号7：GYTFTDY）の6番目のアスパラギン酸残基をグルタミン残基に点変異させた変異抗体（D158Q-mIgGpolySia、H鎖CDR1は配列番号35：GYTFTQY）、
・H鎖CDR1（配列番号7：GYTFTDY）の6番目のアスパラギン酸残基をグルタミン酸残基に点変異させた変異抗体（D158E-mIgGpolySia、H鎖CDR1は配列番号36：GYTFTEY）、及び
・L鎖CDR1（配列番号4：RSSQSLVHSNGNTYLY）の12番目のアスパラギン残基をグルタミン残基に点変異させ、且つH鎖CDR1（配列番号7：GYTFTDY）の6番目のアスパラギン酸残基をグルタミン残基に点変異させた変異抗体（N35Q/D158Q-mIgGpolySia、L鎖CDR1は配列番号33：RSSQSLVHSNGQTYLY、H鎖CDR1は配列番号35：GYTFTQY）。
　これら5つの変異抗体、実施例1で作製したマウス抗polySia -hIgG1キメラ抗体（mIgGpolySia-WT）、及び実施例2で作製したネガティブ抗体（Y39I-mIgGpolySia）のそれぞれについて、バイオレイヤー干渉法（Octet）においてポリシアル酸への親和性を解析した。結果を表１に示す。点変異導入により、ポリシアル酸への親和性が向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実施例9．高親和性マウス抗polySia -hIgG1キメラ抗体の作製とその活性の評価
　実施例6で作成したmIgMpolySia-hIgG-x5-His-SBP抗体に基づいて以下の点変異体を作製した。
・軽鎖可変領域（配列番号20：DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPFTFGSGTKLEIK）の60番目のアスパラギン酸残基ををグルタミン残基に点変異させた変異抗体（D60Q、軽鎖可変領域は配列番号37：DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLQSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPFTFGSGTKLEIK）。
　上記変異抗体又は実施例6で作成したmIgMpolySia-hIgG-x5-His-SBP抗体を用いて、マウス胎児脳(MEB)を用いたELISAを行い、その抗体の認識能を確認した。結果を図１１に示す。点変異導入によりポリシアル酸への親和性が向上した。また、上記以外の点変異体をいくつか作製したが、全て、親和性が大きく低下した。
　実施例10．低親和性マウスIgM抗オリゴシアル酸抗体の作製およびその活性の評価
　実施例7で作成したmIgMoligoSia-hIgG-x5-His-SBP抗体に基づいて以下の点変異体を作製した。
・軽鎖CDR1（配列番号25：KSVDNYGISF）の5番目のアスパラギン残基をアラニン残基に点変異させた変異抗体（N31A、軽鎖CDR1は配列番号38：KSVDAYGISF）。
　上記変異抗体又は実施例7で作成したmIgMoligoSia-hIgG-x5-His-SBP抗体について、ガングリオシドGD3用いたELISAを行い、その抗体の認識能を確認した。結果を図１２に示す。

Claims (14)

  1. （抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；
    （抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
    （抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；
    （抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
    （抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び
    （抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体
    からなる群より選択される少なくとも1種の抗体、及び／又は前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、キット。
  2. 前記抗体Aが、
    （抗体A1）配列番号2で示されるアミノ酸配列A1L1のN末端から39番目のチロシン残基、若しくは前記アミノ酸配列A1L1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列A1L2における前記チロシン残基に対応するチロシン残基が、他のアミノ酸残基に変異してなるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体、又は
    （抗体A2）配列番号20で示されるアミノ酸配列A2L1のN末端から37番目のチロシン残基、若しくは前記アミノ酸配列A2L1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列A2L2における前記チロシン残基に対応するチロシン残基が、他のアミノ酸残基に変異してなるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体
    である、請求項１に記載のキット。
  3. 前記抗体Bが、重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体である、請求項１又は２に記載のキット。
  4. 前記抗体C及び／又は前記抗体DがIgG抗体である、請求項１～３のいずれかに記載のキット。
  5. 前記抗体Eが、前記抗体AX、前記抗体B、前記抗体C、又は前記抗体Dにストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗ポリシアル酸抗体である、請求項１～４のいずれかに記載のキット。
  6. ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出又は分離用である、請求項１～５のいずれかに記載のキット。
  7. ポリシアル酸関連疾患の検査用、又はポリシアル酸発現細胞の分離用である、請求項１～６のいずれかに記載のキット。
  8. （抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；
    （抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
    （抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；
    （抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
    （抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び
    （抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体
    からなる群より選択される少なくとも1種の抗体、及び／又は前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、試薬。
  9. （抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；
    （抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
    （抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；
    （抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
    （抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び
    （抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体
    からなる群より選択される少なくとも1種の抗体を試料と接触させる工程を含む、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出方法。
  10. 前記抗体とポリシアル酸又はポリシアル酸保持体とを含む複合体を可視化することを含む、請求項９に記載の検出方法。
  11. ELISA法である、請求項９又は１０に記載の検出方法。
  12. 前記ELISA法がサンドイッチELISA法である、請求項１１に記載の検出方法。
  13. （抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；
    （抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
    （抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；
    （抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
    （抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び
    （抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体
    からなる群より選択される少なくとも1種の抗体を試料と接触させる工程、及び前記抗体への結合画分と前記抗体への非結合画分を分離する工程を含む、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の分離方法。
  14. 　下記抗体A～抗体Eのいずれかの抗体、及び／又は前記抗体をコードするポリヌクレオチド：
    （抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；
    （抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
    （抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；
    （抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
    （抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び
    （抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体。
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