WO2023224099A1 - 細胞培養基材および細胞培養方法 - Google Patents

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WO2023224099A1
WO2023224099A1 PCT/JP2023/018621 JP2023018621W WO2023224099A1 WO 2023224099 A1 WO2023224099 A1 WO 2023224099A1 JP 2023018621 W JP2023018621 W JP 2023018621W WO 2023224099 A1 WO2023224099 A1 WO 2023224099A1
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WO
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cell culture
space
insert
well
culture substrate
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PCT/JP2023/018621
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English (en)
French (fr)
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民秀 松永
岳洋 岩尾
陽子 堺
勇 小川
秀樹 山田
淳史 土井
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公立大学法人名古屋市立大学
伸晃化学株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture substrate equipped with a well for culturing cells, and a cell culture method using the cell culture substrate.
  • a cell culture test is performed using, for example, a resin base material called a well plate (or companion plate) provided with a plurality of wells.
  • a cell culture container called an insert is placed within the well, and cells are cultured within the insert. The cells grow by taking up nutrients from the medium contained within the wells and inserts.
  • a substrate provided with at least one well, such as a well plate is referred to as a "cell culture substrate.”
  • the medium in the well and the medium in the insert are drained from the well using a pipette, aspirator, etc., and replaced with fresh medium, as necessary. Draining the old medium in the well is usually done with the insert removed from the well. This is because when the insert is placed in the well, the gap between the inner surface of the well and the insert is narrow, making it difficult to insert the tip of a pipette or the like into the well without contacting the insert. However, it requires a great deal of effort to remove the inserts from each well each time the medium is changed.
  • Patent Document 1 discloses a cell culture device in which the medium can be discharged from the well without removing the insert from the well.
  • the cell culture device disclosed in Patent Document 1 is configured to supply and discharge a medium through an insertion tube inserted inside a well and outside an insert. According to the configuration of Patent Document 1, the medium can be exchanged with the insert placed in the well.
  • Patent Document 1 has room for improvement in terms of stably holding the insert in the well. If the insert is not held stable, it may wobble or tilt during the process of replacing the medium in the well. It is conceivable that this may affect the cells within the insert. Furthermore, if the insert is not stably held, it may be difficult to drain the medium inside the insert. In particular, it is considered difficult to automatically discharge the culture medium from within the insert (using a robot or the like).
  • An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems, and to provide a cell culture substrate that allows medium exchange while suppressing the influence on cultured cells.
  • the present invention is configured as follows.
  • a cell culture substrate comprising at least one well having a side surface and a bottom surface, the side surface comprising: a first side portion defining a first space; and a second side portion defining a second space communicating with the first space. including a side portion;
  • the upper end portion of the first side portion is formed in a C-shape with a central angle of 240 degrees or more,
  • the second space extends from the opening of the upper end in a first direction away from the first space,
  • the opposing surface of the second side portion that faces the opening portion in the first direction has a maximum distance in the first direction between the opening portion and the opposing surface that is larger than the diameter of the C-shape at the upper end portion. It is placed in a smaller position.
  • the present invention it is possible to provide a cell culture substrate that allows medium exchange while suppressing the influence on cultured cells.
  • FIG. 2 is a perspective view of a well in a cell culture substrate according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a plan view of the well of FIG. 1; 2 is a sectional view taken along the line A1-A1 in FIG. 1.
  • FIG. 2 is a sectional view taken along the line B1-B1 in FIG. 1.
  • FIG. 2 is a sectional view taken along the line B2-B2 in FIG. 1.
  • FIG. FIG. 3 is a plan view illustrating variations in the shape and arrangement of grooves.
  • FIG. 3 is a plan view illustrating variations in the shape and arrangement of grooves.
  • FIG. 3 is a plan view illustrating variations in the shape and arrangement of grooves.
  • FIG. 3 is a plan view illustrating variations in the shape and arrangement of grooves.
  • FIG. 3 is a plan view illustrating variations in the shape and arrangement of grooves.
  • FIG. 3 is a plan view illustrating variations in the shape and arrangement of grooves.
  • FIG. 3 is a
  • FIG. 2 is a perspective view illustrating an insert.
  • FIG. 2 is a perspective view for explaining a support structure provided in the well of FIG. 1.
  • FIG. FIG. 5 is a plan view showing the arrangement relationship between the anti-rotation rib of the well and the side wall of the insert shown in FIG. 4;
  • FIG. 7 is a plan view showing another insert supported within the well.
  • It is a process sectional view for demonstrating a cell culture method. It is a process sectional view for demonstrating a cell culture method. It is a process sectional view for demonstrating a cell culture method. It is a process sectional view for demonstrating a cell culture method. It is a process sectional view for demonstrating a cell culture method. It is a process sectional view for demonstrating a cell culture method. It is a process sectional view for demonstrating a cell culture method. It is a process sectional view for demonstrating a cell culture method. It is a process sectional view for demonstrating a cell culture method.
  • FIG. 3 is a diagram showing the measurement results of TEER values in cell culture experiment 1.
  • (a) to (e) are diagrams showing the results of mRNA expression analysis in cell culture experiment 1.
  • (a) to (d) are diagrams showing the measurement results of drug-metabolizing enzyme activity in cell culture experiment 1.
  • (a) to (c) are phase contrast microscopic images of the cell surface 6 days after seeding in Cell Culture Experiment 2.
  • (a) to (c) are phase contrast microscopic images of the cell surface 7 days after seeding in Cell Culture Experiment 2.
  • (a) to (c) are phase contrast microscopic images of the cell surface 8 days after seeding in Cell Culture Experiment 2.
  • (a) to (c) are phase contrast microscopic images of the cell surface 9 days after seeding in Cell Culture Experiment 2.
  • (a) to (c) are phase contrast microscopic images of the cell surface 10 days after seeding in Cell Culture Experiment 2. It is a figure which shows the measurement result of the TEER value in cell culture experiment 2.
  • (a) to (j) are diagrams showing the results of mRNA expression analysis in cell culture experiment 2.
  • the present inventors have made the following findings as a result of intensive study on the structure of a cell culture substrate that allows medium exchange while suppressing the influence on cultured cells.
  • a conventional well plate is provided with a hollow cylindrical well.
  • the insert is placed approximately at the center of the circular well in plan view. If a space for inserting a tube such as a pipette is provided inside a well having such a shape, it becomes difficult to stably hold the insert.
  • Patent Document 1 in order to secure a space for inserting a tube into a well, an insert having a cylindrical shape with a portion cut away is used. For this reason, the balance of the insert is poor, and when replacing the medium in the well, there is a possibility that the insert may wobble due to the flow of the medium.
  • the insert may shift from its predetermined position or may tilt and hit the inner surface of the well. This may cause damage to the cells within the insert, such as the cells coming off from the bottom of the insert. Furthermore, since the insert is unbalanced, it is difficult to replace the culture medium in the insert.
  • the present inventors provided a first space in which an insert can be placed and a second space that communicates with the first space in the well, thereby defining the first space in a plan view.
  • the insert can be stably held in the first space while the second space can be easily held by the pipette. It has been found that this space can be used as a space into which a discharge pipe such as the like can be inserted. Based on this new knowledge, the present inventors have arrived at the following invention.
  • a cell culture substrate is a cell culture substrate comprising at least one well having a side surface and a bottom surface, wherein the side surface includes a first side portion defining a first space and a first side portion defining a first space; a second side part defining a second space communicating with the first space; in plan view, the upper end part of the first side part is formed in a C-shape with a central angle of 240 degrees or more;
  • the second space extends from the opening at the upper end in a first direction away from the first space, and the opposing surface of the second side facing the opening and the first direction extends from the opening at the second side.
  • the portion is arranged at a position where the maximum distance in the first direction between the portion and the opposing surface is smaller than the diameter of the C-shape at the upper end.
  • the insert is stabilized in the first space using the first side portion having the upper end portion having a C-shape with a central angle of 240 degrees or more (that is, an arc shape with a central angle of 240 degrees) in plan view. and can be maintained.
  • a commercially available general cylindrical insert can be held approximately evenly over its circumferential direction.
  • the second space is a space extending from the opening at the C-shaped upper end of the first side, and even if a pipette or the like is inserted into the second space, the cells in the insert will not reach the second space. Hard to influence. Therefore, while the insert is held in the first space of the well, the medium can be discharged and supplied using the second space while suppressing damage to the cultured cells in the insert. Furthermore, since the insert is stably held, the culture medium inside the insert can be easily replaced.
  • the second space may be provided. It is possible to suppress the increase in well size due to Therefore, for example, it becomes possible to arrange a plurality of wells at the same pitch as in a conventional well plate.
  • the bottom surface of the well When draining the medium, the bottom surface of the well may be tilted from the horizontal direction by tilting the cell culture substrate. Thereby, the culture medium in the first space can be easily moved to the second space by gravity, so that the culture medium can be efficiently discharged from the second space.
  • the insert since the insert is stably held in the first space, the position (relative position) of the insert with respect to the first side can be maintained even if the cell culture substrate is tilted. Therefore, it is possible to suppress the impact on the cells due to the insert contacting the first side surface. Furthermore, by partially narrowing the gap between the insert and the first side portion, it is possible to prevent a portion of the culture medium from remaining in that portion without being drained (liquid residue).
  • TEER measurement can be easily performed.
  • the electrodes can be easily inserted by inserting one of the pair of electrodes into the insert in the first space and the other into the second space. Furthermore, damage to cells caused by contact between the electrode and the insert can be suppressed.
  • the opposing surface of the second side portion may be smoothly curved so as to be convex in the first direction.
  • the second side part has the above configuration, it is possible to insert the opening of the discharge pipe (for example, the tip of a pipette) for discharging the culture medium, and it is possible to define the second space with a reduced volume. Therefore, it is possible to further suppress an increase in the size of the well due to the provision of the second space.
  • the bottom surface may include a first bottom portion that defines the first space and a second bottom portion that defines the second space, and the first bottom portion and the second bottom portion may be flush with each other.
  • the bottom surface may have at least one groove, and the at least one groove may include a first groove that is continuous from a first portion in contact with the first side portion to a second portion in contact with the second side portion. good.
  • the insert when the gap between the first side portion and the insert is small, the insert can be held more stably in the first space, but liquid remains easily in the gap due to capillary action.
  • the first groove in the bottom surface of the well, it is possible to keep the gap between the first side portion and the insert small and reduce the amount of culture medium remaining in this gap.
  • the width and depth of the first groove may be designed such that capillary forces in the first groove can draw liquid from the gap between the first side and the insert.
  • a stepped portion is provided on the first side portion so that the diameter of the upper end portion is larger than the diameter of the lower end portion in contact with the bottom surface, and in plan view, the stepped portion extends in the circumferential direction. may be present.
  • the liquid level in the gap becomes too high, the liquid level in the second space S2 will be lowered by the volume of the culture medium that has risen in the gap, and the liquid level in the insert will also fall due to the siphon phenomenon (i.e., the liquid level will drop). amount may decrease).
  • the first side portion may include a support structure for supporting the cell culture container (insert) at a distance from the bottom surface in the first space. Thereby, the insert can be held more stably in the first space.
  • the above cell culture substrate may include a plurality of wells.
  • the at least one well may include a plurality of wells arranged in a row direction and a column direction intersecting the row direction.
  • the first direction in each of the plurality of wells may be a direction that intersects both the row direction and the column direction.
  • the row direction and column direction may be orthogonal to each other.
  • the plurality of wells may be arranged such that the first direction of each well makes an angle of, for example, 45 degrees with the row direction and the column direction in plan view.
  • the cell culture substrate may further include an outer wall surrounding the plurality of wells in plan view.
  • the plurality of wells include a plurality of outer wells located at ends in the row direction or the column direction, and water is disposed between the side wall forming the side surface of the plurality of outer wells and the outer wall.
  • a pool portion for accommodating it may be formed. By filling the pool with water such as purified water, evaporation of the medium in the well can be suppressed.
  • the pool portion may be divided into the same number or more as the plurality of outer wells. With this configuration, even if the cell culture substrate is tilted, the water contained in the pool part is unlikely to spill.
  • a cell culture method uses the cell culture substrate described above and a cell culture container detachably housed in the first space of the at least one well and spaced apart from the bottom surface.
  • a cell culture method for culturing cells in the cell culture container comprising a discharge step of discharging part or all of the medium held in the at least one well, the discharge step comprising a culture medium moving step of tilting the cell culture substrate with the cell culture container accommodated in the space and moving the culture medium located in the first space to the second space via the opening portion; inserting a discharge tube into the second space, and discharging the medium located in the second space from the at least one well through the discharge tube.
  • the medium can be discharged while suppressing the influence on cultured cells.
  • This method can be applied both when manually discharging the medium from the wells and when discharging the medium automatically (for example, by a robot or the like).
  • the following was confirmed.
  • the above discharge step that is, the step of tilting the cell culture substrate to discharge the medium.
  • a pipette or the like can be inserted into the well while stably holding the insert, so the above-mentioned evacuation process can be automated. Furthermore, it becomes possible to automatically discharge not only the medium in the well but also the medium in the insert.
  • FIG. 1 is a perspective view of a cell culture substrate according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2A is a plan view of the cell culture substrate of FIG. 1.
  • 2B is a sectional view taken along line A1-A1 in FIG. 2A
  • FIG. 2C is a sectional view taken along line B1-B1 in FIG. 2A
  • FIG. 2D is a sectional view taken along line B2-B2 in FIG. 2A.
  • the cell culture substrate according to the present embodiment includes at least one well 100 having a side surface 10 and a bottom surface 20, a side wall 51 forming the side surface 10 of the well 100, A bottom wall 52 that constitutes the bottom surface 20 is provided.
  • the cell culture substrate is, for example, a resin molded body formed by injection molding.
  • the side surface 10 of the well 100 includes a first side portion 11 that defines a first space S1 and a second side portion 12 that defines a second space S2.
  • the second space S2 communicates with the first space S1.
  • the first space S1 is a space for culturing cells.
  • the first space S1 is configured such that an insert (not shown) can be removably placed therein.
  • the second space S2 is a space that can be used for supplying and discharging the culture medium.
  • the second space S2 is configured such that a tip end of a pipette, an aspirator, etc., an electrode for TEER measurement, etc. can be inserted without contacting the insert.
  • the first side portion 11 has an upper end portion 11a and a lower end portion 11b in contact with the bottom surface 20.
  • the upper end portion 11a of the first side portion 11 is formed in a C-shape (arc shape) with a central angle ⁇ of 240 degrees or more.
  • “Plane view” refers to a state viewed from above the well 100 in the thickness direction of the bottom wall 52. With this configuration, the insert can be stably held in the first space S1. For example, by providing a plurality of support structures on the upper surface of the first side portion 11 or the side wall 51 that constitutes the first side portion 11, the insert can be held at multiple locations.
  • the upper end or outer surface of the insert may be supported at three points equally divided into three in the circumferential direction.
  • the central angle ⁇ is, for example, 300 degrees. Note that if the central angle ⁇ becomes too large, the width of the opening portion 11p becomes small, which may make it difficult for the liquid in the first space S1 to move through the opening portion 11p to the second space S2.
  • the central angle ⁇ may be set such that the opening portion 11p has a width that allows liquid to easily pass therethrough.
  • the second space S2 extends from the opening portion 11p of the upper end portion 11a in the first direction E1 away from the first space S1.
  • the second side portion 12 includes an opening portion 11p of the upper end portion 11a and a facing surface 12f facing the first direction E1.
  • the opposing surface 12f of the second side portion 12 may be smoothly curved to be convex in the first direction E1. With this configuration, when the culture medium is discharged from the second space S2, it is difficult for liquid to remain. Further, since the second side portion 12 has the facing surface 12f as described above, the tip of a pipette for discharging the culture medium can be easily inserted, and the second space S2 with a reduced volume can be created. Can be defined.
  • the facing surface 12f may have, for example, an arc shape (here, a semicircular shape). As shown in FIG. 2B, the opposing surface 12f may be inclined such that the distance from the opening portion 11p increases as it goes upward.
  • the maximum distance L1 between the opening portion 11p and the facing surface 12f of the second side portion 12 in the first direction E1 (that is, the maximum length of the second space S2 in the first direction E1) L1 is the diameter of the C shape of the upper end portion 11a. smaller than Da. With this configuration, increase in the size of the well 100 can be suppressed. Further, it becomes possible to arrange the wells 100 at a pitch according to the standard.
  • the diameter Da of the arc of the upper end portion 11a is, for example, 16.0 mm
  • the maximum distance L1 is, for example, 10.5 mm.
  • the maximum width L2 of the second space S2 in the second direction E2 orthogonal to the first direction E1 may be, for example, less than or equal to the width of the opening portion 11p in the second direction E2.
  • the maximum width L2 of the second space S2 is, for example, 7.7 mm.
  • the first direction E1 may be the radial direction of the C-shaped upper end portion 11a.
  • the bottom surface 20 includes a first bottom portion 21 that defines a first space S1 and a second bottom portion 22 that defines a second space S2.
  • the first bottom portion 21 includes an observation surface 21a for performing microscopic observation and the like.
  • the observation surface 21a is, for example, circular with a diameter of 9.5 mm.
  • the observation surface 21a may be spaced apart from the periphery of the first bottom portion 21.
  • the observation surface 21a at least partially overlaps the bottom surface of the insert in plan view.
  • the first bottom portion 21 and the second bottom portion 22 may be flush with each other. With this configuration, the liquid located in the first space S1 can be easily moved to the second space S2, so that the culture medium can be discharged more efficiently.
  • the area of the bottom surface 20 in plan view is, for example, 187 mm 2 , which is the same as the bottom area of a well in a commercially available well plate.
  • the cell culture substrate When draining the medium, for example, the cell culture substrate may be tilted so that the first bottom 21 of the well 100 is relatively lower than the second bottom 22.
  • the cell culture substrate may be tilted, for example, in the first direction E1.
  • the direction in which the cell culture substrate is tilted (tilt direction) is not limited to the first direction E1, and may be any direction having a component in the first direction E1, that is, a direction less than ⁇ 90 degrees with respect to the first direction E1.
  • the direction of inclination is preferably a direction that makes an angle of ⁇ 45 degrees or less with the first direction E1. Thereby, the culture medium in the first space S1 can be easily moved to the second space S2 by gravity.
  • the tip of a pipette or the like may be placed near the lowest point of the second bottom portion 22 to discharge the culture medium.
  • points Q1 and Q2 of the second bottom portion 22 are the lowest points, respectively.
  • the first side portion 11 may be provided with a stepped portion so that the diameter Da of the upper end portion 11a of the first side portion 11 is larger than the diameter Db of the lower end portion 11b of the first side portion 11.
  • the diameter Da is, for example, 16.0 mm
  • the diameter Db is, for example, 12.5 mm.
  • the step portion includes an upward step surface 11c located between the upper end portion 11a and the lower end portion 11b. In plan view, the step portion extends in the circumferential direction. With this configuration, rise in the liquid level in the gap between the insert and the first side portion 11 can be suppressed. Therefore, it is possible to suppress the decrease in the amount of liquid (the amount of medium) in the insert due to the siphon phenomenon.
  • the stepped portion may extend across the first side portion 11. That is, the stepped portion may extend in the circumferential direction from one end of the C-shape to the other end in plan view.
  • the height (level) of the stepped surface 11c depends on the amount of medium supplied to the well 100, it may be set to be approximately the same as the height of the liquid level in the insert. As a result, the height of the liquid level in the gap between the insert and the first side part 11 can be made equal to the height of the liquid level in the insert and in the second space S2, so that the amount of culture medium in the insert can be reduced due to the siphon phenomenon. is less likely to occur.
  • the distance between the observation surface 21a and the stepped surface 11c in the thickness direction of the bottom wall 52 is, for example, 5.6 mm.
  • the width of the stepped surface 11c (the width in the radial direction of the upper end portion 11a) is set to a width that can suppress the rise in the liquid level in the gap by utilizing the Coanda effect.
  • the width of the stepped surface 11c may be set so as to suppress an increase in the liquid level while suppressing an increase in the diameter Da.
  • the width of the stepped surface 11c is, for example, 0.8 to 1.3 mm.
  • a step surface having the same height as the step surface 11c of the first side portion 11 may not be provided on at least a portion of the second side portion 12 that defines the second space S2. Thereby, fluctuations in the liquid level caused by the stepped surface 11c can be absorbed. In the illustrated example, such a stepped portion is not provided over the entire second side portion 12.
  • the bottom surface 20 may be provided with one or more grooves including the first groove 31.
  • the groove is arranged in a region of the bottom surface 20 other than the observation surface 21a.
  • the bottom of the groove is located below the observation surface 21a.
  • the first groove 31 only needs to be continuous from the first portion in contact with the first side portion 11 to the second portion in contact with the second side portion 12. With this configuration, the liquid located in the gap between the insert and the first side 11 and first bottom 21 of the well 100 can be easily moved to the second space S2 side by the first groove 31. Therefore, by arranging the tip of a pipette or the like close to the second portion of the first groove 31, the medium in the well 100 can be more efficiently discharged from the second space S2.
  • the first groove 31 may extend along the side surface 10 from the first portion to the second portion.
  • the first groove 31 is continuous from a first portion located between the first side portion 11 and the observation surface 21a to a second portion in contact with the opposing surface 12f of the second side portion 12.
  • the first groove 31 may extend along the entire periphery of the bottom surface 20.
  • the region of the bottom surface 20 in which the groove is not formed may be at the same height (level) as the observation surface 21a.
  • a region of the first bottom portion 21 in which no grooves are formed (including the observation surface 21a) and a region of the second bottom portion 22 in which no grooves are formed may be flush with each other.
  • the first groove 31 is provided only on the periphery of the bottom surface 20, and the portion of the bottom surface 20 located inside the first groove 31 is flush. With this configuration, it is possible to reduce the amount of liquid remaining due to the unevenness of the bottom surface 20.
  • the width r of the first groove 31 may be smaller than the width w of the gap between the insert and the first side portion 11 when the insert is supported at a predetermined position in the first space S1 (see FIG. 7A, etc.).
  • the width r of the first groove 31 may be equal to or greater than the minimum thickness of the side wall 51. Further, from the viewpoint of ensuring the strength of the mold for forming the cell culture substrate, the width r of the first groove 31 may be, for example, 0.6 mm or more. The width r of the first groove 31 is, for example, 0.9 mm.
  • the depth (maximum depth) d of the first groove 31 may be greater than or equal to the minimum thickness of the side wall 51, for example.
  • the depth d of the first groove 31 may be set such that the capillary force of the first groove 31 is higher than the capillary force generated in the gap between the insert and the first side part 11 and the first bottom part 21.
  • the depth d of the first groove 31 may be less than or equal to the maximum height H at which the liquid (here, the culture medium) rises through the gap between the insert and the first side portion 11.
  • the depth d of the first groove 31 is, for example, 0.5 mm.
  • the “maximum height H" is determined by the width w of the gap between the insert and the first side part 11, the surface tension ⁇ of the medium, the contact angle ⁇ (for example, 90 degrees) of the medium with respect to the resin material of the insert and well, and the height of the medium. It can be calculated from the density ⁇ and the gravitational acceleration g using the following formula (1).
  • other grooves may be provided on the bottom surface 20.
  • the other grooves may be connected to the first groove 31 or may be separated from the first groove 31.
  • the width and depth of the other grooves may be the same as or different from the first groove 31.
  • 3A to 3D are diagrams illustrating variations in the shape and arrangement of the grooves, and are plan views showing the bottom surface 20 of the well 100.
  • the periphery of the bottom surface 20 is defined by the lower ends of the first side 11 and the second side 12.
  • a groove is formed on the bottom surface 20 of the well 100, extending from the vicinity of the opening portion 11p of the first side portion 11 to the portion of the first groove 31 that is in contact with the opposing surface 12f of the second side portion 12.
  • Two grooves 32 may also be provided.
  • An end of the second groove 32 on the facing surface 12f side is connected to the first groove 31.
  • a third groove 33 may be further provided in the opening portion 11p of the first side portion 11 of the bottom surface 20 of the well 100.
  • the third groove 33 is arranged so as to connect both ends of the C-shaped portion of the first groove 31 along the first side portion 11.
  • the first groove 31 and the third groove 33 form an annular groove surrounding the bottom surface of the insert. Therefore, the liquid remaining in the gap between the insert and the first side portion 11 and the first bottom portion 21 can be efficiently drawn out into the annular groove, so that the time required for draining the culture medium can be shortened.
  • a plurality of second grooves 32 are further provided.
  • one end of each second groove 32 is connected to the third groove 33, and the other end is connected to a portion of the first groove 31 that is in contact with the opposing surface 12f of the second side portion 12. .
  • a plurality of convex portions 34 may be provided on the second bottom portion 22.
  • the plurality of convex portions 34 are arranged so as to define a groove between them that can serve as a flow path for the culture medium.
  • the region 35 of the second bottom portion 22 where the plurality of convex portions 34 are not formed may be flush with the bottom of the first groove 31.
  • the height (level) of the upper surface of each convex portion 34 may be the same as the height of the observation surface. The liquid remaining in the gap between the insert and the first side portion 11 and first bottom portion 21 can move through the third groove 33 and the region 35 to the opposing surface 12f, thereby reducing the time required for draining the culture medium.
  • the first side portion 11 may include a support structure 40 in the first space S1 for supporting the insert at a distance from the bottom surface 20. Thereby, the insert can be held more stably in the first space S1.
  • the insert is preferably arranged such that the center of the bottom surface of the insert substantially coincides with the center of the upper end portion 11a of the first side portion 11 in plan view. That is, it is preferable that the insert is not eccentrically arranged in the first space S1. Further, the insert is preferably arranged such that the central axis of the insert is parallel to the thickness direction of the bottom wall 52 of the well 100 when viewed in cross section. This can prevent the gap between the first side portion 11 and the insert from becoming partially narrow.
  • a part or all of the support structure 40 may be arranged on the stepped surface 11c or between the stepped surface 11c and the upper end portion 11a. Thereby, the support structure 40 can be formed using the space expanded in the radial direction by the stepped surface 11c. Furthermore, since the support structure 40 can be placed above the liquid level of the culture medium in the gap between the insert and the first side part 11, the influence of the support structure 40 on the culture medium replacement work (for example, it becomes difficult to drain the culture medium) can be avoided. It can be suppressed.
  • the support structure 40 may be configured to support one or more types of commercially available inserts.
  • the support structure 40 includes a portion that supports a portion of the insert from below. It is preferable that the support structure 40 is configured such that the insert can be attached or detached by simply moving the insert in the vertical direction (in the thickness direction of the bottom wall 52) with respect to the support structure 40. Further, it is preferable that the support structure 40 and the portion of the insert supported by the support structure 40 have a dimensional relationship that allows the insert to be easily attached to and removed from the well. This can suppress damage to cells due to attachment and detachment of the insert, such as peeling off of cells seeded on the bottom of the insert.
  • FIG. 4 is a perspective view showing an example of the insert.
  • the insert 60 has a cylindrical side wall and a bottom wall made of a porous membrane filter.
  • the outer surface 61 of the side wall of the insert 60 is provided with a plurality of (two in this case) protrusions 62 .
  • the insert 60 is, for example, an insert manufactured by Falcon.
  • the cell culture substrate includes, as the support structure 40, a plurality of ribs arranged between the upper end 11a and the lower end 11b of the first side 11.
  • the plurality of ribs include a plurality of support ribs 41 , a misinsertion prevention rib 42 arranged between two adjacent support ribs among the plurality of support ribs 41 , and a plurality of rotation prevention ribs 43 .
  • the lower surfaces of these ribs 41 to 43 are in contact with the stepped surface 11c. Since the upper surfaces of the ribs 41 to 43 are located below the upper end 11a of the first side 11, a support structure for supporting another type of insert is provided at the upper end 11a of the first side 11. can be provided separately. Ribs 41-43 may be positioned so as not to impede insertion of other types of inserts.
  • Each of the plurality of (two in this case) support ribs 41 has a recess 41a on its upper surface that receives one of the protrusions 62 in the insert 60. That is, the width of the recess 41a is larger than the width of each protrusion 62 of the insert 60.
  • the misinsertion prevention rib 42 is spaced apart from each of the two adjacent support ribs 41 by a distance t.
  • the spacing t is smaller than the width of each protrusion 62 of the insert 60.
  • the incorrect insertion prevention rib 42 may be divided into a plurality of parts. The plurality of divided portions may be arranged at intervals smaller than the width of each convex portion 62.
  • a plurality of (here, four) anti-rotation ribs 43 may be arranged at predetermined intervals in the circumferential direction of the first side portion 11.
  • each anti-rotation rib 43 extends inward from the first side portion 11 .
  • the width of each anti-rotation rib 43 may become smaller as the distance from the first side portion 11 increases.
  • each anti-rotation rib 43 has a triangular prism shape. As shown in FIG. 6A, the innermost portion of each anti-rotation rib 43 may be in contact with the outer surface of the insert 60 in plan view. Thereby, rotation of the insert 60 can be prevented.
  • the structure of the insert and the support structure 40 of the well 100 are not limited to the examples described above.
  • a plurality of (here, three) notches 44 may be formed in the upper surface 51a of the side wall 51 of the well 100.
  • the protrusions 63 of the insert 60a can be supported by the cutout portion 44.
  • the insert 60a is, for example, an insert made by FUJIFILM, MILLIPORE, VITRIGEL, or GREINER.
  • the three protrusions 63 of the insert 60a are arranged at positions that equally divide the upper end of the side wall of the insert 60a into three in the circumferential direction.
  • Each cutout 44 is configured to receive one of the protrusions 63.
  • the top surface 51a of the side wall 51 of the well 100 does not need to be provided with any unevenness other than the cutout portion 44.
  • the flange of the insert can be supported by a flat area other than the notch 44 on the upper surface 51a of the side wall 51. can do.
  • the support structure 40 is configured to support multiple types of inserts.
  • the support structure 40 should just be comprised so that any one type of insert can be supported.
  • FIGS. 7A to 12B are process cross-sectional views for explaining the cell culture method, respectively.
  • 7A to 12A show cross sections corresponding to the line A1-A1 shown in FIG. 2A
  • FIGS. 7B to 12B show cross sections corresponding to the line B1-B1 shown in FIG. 2A, respectively.
  • the insert 60 is placed in the first space S1 of the well 100 of the cell culture substrate, and cells 70 are seeded into the insert 60 by a known method.
  • a suspension containing the cells 70 and the medium 71 may be prepared, and a predetermined amount of the suspension may be supplied into the insert 60.
  • the insert 60 is not particularly limited, and any known insert can be used.
  • the insert has a porous membrane filter on the bottom.
  • a porous membrane filter for example, is configured to allow small molecules (chemical substances, etc.) dissolved or suspended in a liquid to pass therethrough, but not cells.
  • the insert 60 shown in FIG. 4 is used as the insert 60.
  • the medium 72 is supplied into the well 100.
  • the medium 72 is injected into the second space S2 of the well 100 using, for example, a pipette 80.
  • the width w of the gap Sg between the insert 60 and the first side 11 of the well 100 is small, the liquid level of the culture medium 72 in the gap Sg may rise due to capillary action. Thereby, the liquid level of the culture medium 72 in the gap Sg becomes higher than the liquid level of the culture medium in the second space S2 by dh (>0).
  • the width w of the gap Sg refers to the distance in the radial direction of the insert 60 between the lower end of the outer surface of the insert 60 and the first side 11 of the well 100 in a plan view.
  • the width w of the gap Sg is, for example, about 1 to 2 mm.
  • the rise in the liquid level is suppressed due to the Coanda effect.
  • the height of the liquid level in the gap Sg is approximately the same as the height of the stepped surface 11c. This makes it possible to suppress an increase in the liquid level difference dh.
  • the step surface 11c it is possible to suppress the rise in the liquid level in the gap Sg, and therefore it is possible to suppress the decrease in the liquid amount in the insert 60 due to the siphon phenomenon.
  • by suppressing the rise in the liquid level in the gap Sg when the culture medium 72 is discharged, it becomes difficult for liquid to remain in the gap Sg between the insert 60 and the first side portion 11.
  • waves may be generated in the culture medium 72 due to the influence of the step surface 11c, and the liquid level may be shaken.
  • the second side portion 12 is not provided with a step surface having the same height as the step surface 11c, the fluctuation of the liquid level of the culture medium 72 due to waves can be absorbed in the second space S2. .
  • the height of the liquid level of the culture medium 72 in the second space S2 the height of the liquid level in the gap Sg regulated by the height of the step surface 11c, and the height of the liquid level of the culture medium 71 in the insert 60 are determined.
  • the amount of the medium supplied to the insert 60 and the well 100 may be adjusted so that the height of the liquid level is approximately the same.
  • cells are cultured by covering the well 100 and placing the cell culture substrate in a humidified CO 2 incubator at a predetermined temperature (for example, 37° C.).
  • a predetermined temperature for example, 37° C.
  • the medium exchange includes a draining step of draining at least a portion of the old medium with reduced nutrients from the well, and a feeding step of feeding the new medium to the well after draining the old medium.
  • FIGS. 10A and 10B In the ejection step, as shown in FIGS. 10A and 10B, first, the cell culture substrate is tilted with the insert accommodated in the first space S1, and the second bottom of the second space S2 is placed in the second bottom of the first space S1. 1. Make it relatively lower than the bottom. Thereby, a part of the culture medium 72 located in the first space S1 is moved to the second space S2 via the opening part of the first side part 11 (medium moving step).
  • FIGS. 10A and 10B show the cell culture substrate tilted in direction F2 shown in FIG. 2A. As illustrated, due to capillarity, the liquid level in the gap Sg between the insert 60 and the first side portion 11 is located above the liquid level in the second space S2.
  • the pipette 80 is inserted into the second space S2.
  • the tip of the pipette 80 may be placed near the lowest point Q2 (see FIG. 2A) of the second bottom portion 22.
  • the medium 72 located in the second space S2 is discharged from the well 100 via the pipette 80.
  • the portion of the culture medium 72 located in the gap Sg is influenced more strongly by capillary action than by gravity, and therefore tends to remain in the gap Sg.
  • the culture medium 72 remaining in the gap Sg is pulled by the capillary force of the first groove 31.
  • the pulled culture medium 72 moves within the first groove 31 to the second space S2 side, and can be discharged from the well 100 by the pipette 80. In this way, by utilizing the capillary force of the first groove 31, the amount of old culture medium 72 remaining in the gap Sg can be reduced.
  • a new medium is supplied into the well 100 (supply step).
  • the method of supplying fresh medium is similar to that described above with reference to FIGS. 8A-9B.
  • FIG. 13 is a perspective view showing an example of the cell culture substrate 200.
  • FIG. 14 is a plan view of the cell culture substrate 200.
  • the cell culture substrate 200 is a well plate having 24 wells 100 arranged in two dimensions.
  • the height direction of the cell culture substrate 200 is the Z direction.
  • the cell culture substrate 200 has, for example, a rectangular shape.
  • the directions in which two mutually orthogonal sides (here, the long side and the short side) of the rectangle extend are defined as the X direction and the Y direction, respectively.
  • the cell culture substrate 200 includes a plurality of wells 100 and an outer wall 53 surrounding the plurality of wells 100 in plan view.
  • the structure of each well 100 is similar to that described above with reference to FIGS. 1-6B.
  • the number of wells is 24, but is not limited to 24, and may be, for example, 6, 48, 96, etc.
  • the outer wall 53 extends in a rectangular shape in plan view.
  • the outer wall 53 has two first outer wall parts 53x extending in the X direction and two second outer wall parts 53y extending in the Y direction.
  • the length of the first outer wall portion 53x is, for example, 127.5 mm
  • the length of the second outer wall portion 53y is, for example, 185.5 mm.
  • the height of the outer wall 53 is, for example, 21.1 mm.
  • the wells 100 are arranged, for example, in a row direction and in a column direction that intersects (for example, perpendicularly crosses) the row direction.
  • Each well 100 is arranged such that its first direction E1 intersects both the row direction and the column direction, which are the directions in which the wells 100 are arranged. With this configuration, more wells 100 can be arranged in a limited area.
  • the row direction of the well 100 is the X direction
  • the column direction is the Y direction.
  • the first direction E1 of each well 100 makes, for example, an angle of 45 degrees with each of the X direction and the Y direction. That is, the second space S2 of each well 100 extends in the X direction and the Y direction of the first space S1. It is preferable that the plurality of wells 100 are arranged in the same direction (for example, so that the first direction E1 makes an angle of 45 degrees with the X direction and the Y direction). Thereby, when the cell culture substrate 200 is tilted, the culture medium in the first space S1 of the plurality of wells 100 can be simultaneously moved to the second space S2.
  • the arrangement pitch Px of the wells 100 in the X direction and the arrangement pitch Py of the wells 100 in the Y direction may be the same.
  • the arrangement pitches Px and Py are both 19 mm, which is the same as the arrangement pitch of commercially available well plates. Thereby, instruments such as observation microscopes and pipettes that are compatible with commercially available well plates can be applied to the cell culture substrate 200 as well.
  • the medium in each well 100 can be moved to the second space S2 by tilting the cell culture substrate 200 in the X direction, in the Y direction, or in both directions.
  • tilt in the X direction refers to tilting so that one of the two second outer wall portions 53y located on the second space S2 side of each well 100 is lower than the other.
  • tilt in the Y direction refers to tilting so that one of the two first outer wall portions 53x located on the second space S2 side of each well 100 is lower than the other.
  • a pipette or the like may be placed near the lowest point Q2 of the second bottom portion 22 of each well 100 to suck out the culture medium.
  • a pipette or the like When tilted in the Y direction, for example, a pipette or the like may be placed near the lowest point Q1 of the second bottom portion 22 of each well 100 to suck out the culture medium.
  • the direction of inclination of the cell culture substrate 200 may be any direction as long as it forms an angle of ⁇ 45 degrees or less with the first direction E1. Furthermore, the direction of inclination of the cell culture substrate 200 may be changed in stages when discharging the medium.
  • FIG. 15 is a perspective view illustrating a state in which the cell culture substrate 200 is tilted in the X direction.
  • the inclination angle ⁇ of the bottom surface of each well 100 (the surface including the observation surface of the well) with respect to the horizontal plane may be larger than 0°.
  • the angle of inclination ⁇ is preferably greater than 5°. Thereby, the moving speed of the culture medium to the second space S2 can be increased.
  • the inclination angle ⁇ may be smaller than 20°. Thereby, the influence on cells caused by tilting or returning the cell culture substrate 200 can be reduced.
  • the inclination angle ⁇ is, for example, about 10°.
  • the work of tilting the cell culture substrate 200 may be performed manually or automatically.
  • the cell culture substrate 200 may further include a pool portion 90 between the outer wall 53 and the plurality of wells 100. By filling the pool portion 90 with water such as purified water, evaporation of the culture medium within the well 100 can be suppressed.
  • the plurality of wells 100 include a plurality of outer wells 101 located at the ends in the row direction or column direction, and an inner well 102 located inside the outer wells 101.
  • the pool portion 90 is arranged between the side walls 51 of the plurality of outer wells 101 and the outer wall 53.
  • the pool portion 90 is divided into at least the same number of outer wells 101. By dividing the pool part 90 into the same number or more as the outer wells 101, the water contained in the pool part 90 is unlikely to spill even if the cell culture substrate 200 is tilted. In this example, the number of outer wells 101 is 16, and the pool section 90 is divided into 19.
  • FIG. 16 is a plan view showing a modification of the cell culture substrate of this embodiment.
  • the second space S2 has a region near the opposing surface 12f that is wider than the opening portion 11p of the C-shaped upper end of the first side portion.
  • the planar shape of each well 100 does not have to be axisymmetric.
  • the present inventor conducted a cell culture experiment using the well plate 200 and confirmed the operability of the well plate 200.
  • a similar experiment was conducted using a commercially available well plate, and a comparison was made with the case where the well plate 200 was used. The method and results of the cell culture experiment will be explained below.
  • Example 1 ⁇ Cell culture experiment 1> (Example 1)
  • a well plate 200 shown in FIGS. 13 and 4 was prepared. Falcon inserts were then placed in each of the 24 wells in the well plate 200.
  • intestinal stem cells differentiated from hiPS cells were seeded into each insert, and differentiation into intestinal epithelial cells was induced under feeder-less conditions.
  • the differentiation induction protocol followed the method described in JP-A No. 2022-019411.
  • the entire disclosure content of JP-A-2022-019411 is incorporated herein.
  • the culture medium was replaced by the following method, for example, once every 24 hours to every two days. The culture experiment was terminated 30 days after cell seeding. After completion, the differentiated cells were evaluated by mRNA expression analysis and drug metabolizing enzyme activity measurement.
  • the medium was discharged and supplied during medium exchange manually using the method described above with reference to FIGS. 7A to 12B. Specifically, the well plate was tilted with the insert held in the first space of each well, and the medium was discharged from the second space of each well with a pipette. After draining, the well plate was returned to the horizontal position and fresh medium was supplied to the second space of each well.
  • TEER transepithelial electrical resistance
  • ⁇ mRNA expression analysis For epithelial cells differentiated by the above method, the expression levels of the absorptive epithelial cell marker Villin1, drug transporters MDR1 and PEPT1, and drug metabolizing enzymes CYP3A4 and CYP2C9 are measured by RT-qPCR method. Then, the relative expression level to adult small intestine (ASI) was determined. KAPA SYBR Fast qPCR Kit was used for measurement.
  • CYP3A4/5, CYP2C9, CYP2C19, and CYP2D6 were investigated using midazolam, diclofenac, mephenytoin, and bufuralol as substrates for the epithelial cells differentiated by the above method.
  • CYP3A4/5, CYP2C9, CYP2C19, and CYP2D6 were investigated using midazolam, diclofenac, mephenytoin, and bufuralol as substrates for the epithelial cells differentiated by the above method.
  • CYP3A4/5, CYP2C9, CYP2C19, and CYP2D6 were investigated the activities of CYP3A4/5, CYP2C9, CYP2C19, and CYP2D6, and the production amounts of 1'-hydroxylation of midazolam, 4'-hydroxylation of diclofenac, 4'-hydroxylation of mephenytoin, and 1'
  • Example 2 Differentiation into intestinal epithelial cells was induced and epithelial cells were evaluated in the same manner as in Example 1, except that an insert manufactured by Greiner was used as the insert.
  • Comparative example 1 Differentiation into intestinal epithelial cells was performed in the same manner as in Example 1, except that a commercially available Falcon well plate with 24 wells and a Falcon insert were used, and the medium was exchanged as described below. Induction and epithelial cell evaluation were performed. - Medium exchange method In Comparative Example 1, the insert was removed from each well with tweezers, and the medium was discharged from the well using a pipette. Thereafter, the insert was placed back into the well and medium was supplied into the well. All these operations were performed manually.
  • Comparative example 2 Induction of differentiation into intestinal epithelial cells and evaluation of the epithelial cells were performed in the same manner as in Comparative Example 1, except that a commercially available Greiner well plate having 24 wells and a Greiner insert were used.
  • FIG. 17 is a diagram showing the measurement results of TEER values from the 18th day to the 30th day after sowing in Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 and 2. As shown in FIG. 17, the TEER values of the cells of Examples 1 and 2 are comparable to or higher than the TEER values of the cells of Comparative Examples 1 and 2, respectively, and even if the well plate 200 of this embodiment is used, It was confirmed that it was possible to culture cells with a barrier function comparable to or better than that achieved using a commercially available well plate.
  • the TEER values of the cells of Examples 1 and 2 are higher than those of the cells of Comparative Examples 1 and 2, respectively, and when the well plate 200 of this embodiment is used, , it was found that the barrier function of epithelial cells was improved. The reason for this is assumed to be as follows.
  • FIGS. 18(a) to (e) are diagrams showing the results of mRNA expression analysis in epithelial cells differentiated in Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 and 2. As shown in FIGS. 18(a) to (e), the mRNA expression level of Example 1 was comparable to Comparative Example 1, and the mRNA expression level of Example 2 was comparable to Comparative Example 2.
  • FIGS. 19(a) to 19(d) are diagrams showing the measurement results of drug-metabolizing enzyme activity in epithelial cells differentiated in Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 and 2. As shown in FIGS. 19(a) to (d), the metabolic activity of each marker in Example 1 was at the same level as in Comparative Example 1, and the metabolic activity of each marker in Example 2 was at the same level as in Comparative Example 2. there were.
  • Example 3 a cell culture substrate (well plate) 200 shown in FIGS. 13 and 14 was prepared. Greiner inserts were then placed in each of the 24 wells in the well plate 200.
  • three-dimensional intestinal organoids differentiated from hiPS cells were made into single cells and seeded onto each insert, and differentiation into two-dimensional intestinal organoids was induced under feeder-less conditions.
  • the differentiation induction protocol followed the method described in International Publication No. 2022/091020 by the present inventor. For reference, the entire disclosure content of International Publication No. 2022/091020 is incorporated herein.
  • the volume of the medium on the basal side was 800 ⁇ L. If necessary, the medium was replaced at a frequency of, for example, once every 24 hours to every 3 days.
  • TEER values were measured from the fourth day after seeding. Medium exchange and TEER value measurement were performed in the same manner as in Examples 1 and 2 described above.
  • the cell surface was observed using a phase contrast microscope to investigate changes in cell surface structure (villus-like structure) that accompany differentiation. The culture experiment was terminated 10 days after seeding. After completion, the differentiated cells were evaluated by mRNA expression analysis.
  • the intestinal organoids differentiated by the above method were analyzed by RT-qPCR to determine LGR5 (intestinal stem cell marker), Villin1 (absorptive epithelial cell marker), MUC2 (goblet cell marker), and Lysozyme (intestinal Paneth cell marker).
  • Ki67 proliferative cell marker
  • CYP3A4 drug metabolizing enzyme
  • MDR1 drug transporter
  • ALB mature hepatocyte differentiation marker
  • OLFM4 small intestine stem cell marker
  • CDX2 involved in the proliferation and differentiation of intestinal epithelial cells.
  • the expression levels of transcription factors were measured.
  • KAPA SYBR Fast qPCR Kit was used for measurement.
  • Example 4 Differentiation into intestinal two-dimensional organoids and differentiated cells were evaluated in the same manner as in Example 3, except that the volume of the medium on the basal side was 1200 ⁇ L.
  • Comparative example 3 Differentiation into intestinal two-dimensional organoids and differentiated cells were induced in the same manner as in Example 3, except that a commercially available Greiner well plate with 24 wells and a Greiner insert were used, and the medium exchange method was used. was evaluated. In Comparative Example 3, the medium was replaced in the same manner as in Comparative Example 1.
  • FIGS. 20(a) to (c) are phase contrast microscopic images of the cell surfaces of Comparative Example 3, Example 3, and Example 4 on day 6 after seeding, respectively.
  • FIGS. 21(a) to 24(a) to 24(c) show the cell surfaces of Comparative Example 3, Example 3, and Example 4 on days 7 to 10 after seeding, respectively. This is a phase contrast microscope image.
  • the villus density of the cells of Examples 3 and 4 is higher (the villi are denser) than that of the cells of Comparative Example 3, and the villi density of the cells of Examples 3 and 4 is higher than that of the cells of Comparative Example 3. It can be seen that maturation progressed quickly. Further, for example, the villus density 10 days after seeding in Comparative Example 3 was comparable to the villus density 8 to 9 days after seeding in Examples 3 and 4. This shows that the cells in Examples 3 and 4 matured about 1 to 2 days earlier than in Comparative Example 3.
  • FIG. 25 is a diagram showing the measurement results of TEER values from the 4th day to the 10th day after seeding in Examples 3 and 4 and Comparative Example 3. As shown in FIG. 25, the TEER values of the cells of Examples 3 and 4 were comparable to the TEER value of the cells of Comparative Example 3.
  • the TEER values were slightly lower than in Comparative Example 3, but this does not mean that the barrier function was deteriorated.
  • intestinal two-dimensional organoids it has been proven that the TEER value decreases when a crypt villus-like structure is formed, and in living organisms, the TEER value is 100 ⁇ cm -2 or less. 4, it is thought that the intestinal two-dimensional organoid is in a state closer to that of the living body.
  • FIGS. 26(a) to (j) are diagrams showing the results of mRNA expression analysis of each marker for cells differentiated in Examples 3 and 4 and Comparative Example 3. Each figure also shows the expression level of ASI. As shown in FIGS. 26(a) to (j), the mRNA expression levels of Examples 3 and 4 were comparable to those of Comparative Example 3.
  • Examples 1 to 4 above medium exchange was performed manually, but the present inventor confirmed through another cell culture experiment that medium exchange could be performed automatically using an automated device, further improving operability. .
  • the main factors that made automation possible are that when the well plate 200 of this embodiment is used, the medium can be discharged from the wells without removing the inserts from the wells, and the inserts do not stay in the wells even if the well plate is tilted.
  • One example is that it is properly maintained.
  • the present inventors have also confirmed that even when the medium exchange is automated, the functionality of the cultured cells is at least as good as that of cells cultured using conventional cell culture substrates.
  • a cell culture substrate comprising at least one well having a side surface and a bottom surface, the cell culture substrate comprising:
  • the side surface includes a first side portion that defines a first space, and a second side portion that defines a second space that communicates with the first space,
  • the upper end portion of the first side portion is formed in a C-shape with a central angle of 240 degrees or more,
  • the second space extends from the opening of the upper end in a first direction away from the first space,
  • the opposing surface of the second side portion that faces the opening portion in the first direction has a maximum distance in the first direction between the opening portion and the opposing surface that is larger than the diameter of the C-shape at the upper end portion.
  • Cell culture substrate placed in a smaller position [Item 2] The cell culture substrate according to item 1, wherein the opposing surface of the second side portion is smoothly curved to be convex in the first direction when viewed in plan. [Item 3] Item 1 or 2, wherein the bottom surface includes a first bottom portion that defines a first space and a second bottom portion that defines the second space, and the first bottom portion and the second bottom portion are flush with each other. Cell culture substrate described in. [Item 4] the bottom surface has at least one groove; The cell culture according to any one of items 1 to 3, wherein the at least one groove includes a first groove that is continuous from a first portion in contact with the first side to a second portion in contact with the second side. Base material.
  • a stepped portion is provided on the first side portion so that the diameter of the upper end portion is larger than the diameter of the lower end portion in contact with the bottom surface, and in plan view, the stepped portion extends in the circumferential direction.
  • the cell culture substrate according to any one of items 1 to 4 which is present in the cell culture substrate according to any one of items 1 to 4.
  • the at least one well includes a plurality of wells arranged in a row direction and a column direction intersecting the row direction, 7.
  • the first direction in each of the plurality of wells is a direction that intersects both the row direction and the column direction.
  • [Item 8] further comprising an outer wall surrounding the plurality of wells in a plan view,
  • the plurality of wells include a plurality of outer wells located at ends in the row direction or the column direction, A pool portion that accommodates water is formed between a side wall forming the side surface of the plurality of outer wells and the outer wall, and the pool portion is divided into at least the same number as the plurality of outer wells.
  • the cell culture substrate according to any one of items 1 to 8, a cell culture container detachably housed in the first space of the at least one well and spaced apart from the bottom surface;
  • the present invention is not limited to the embodiments described above, and can be implemented in various other ways.
  • a cell culture substrate provided with a plurality of wells at least some of the wells may have the above-described structure.
  • the cell culture substrate of the present invention can be applied to both open and closed systems. Moreover, it can be used not only when operations such as medium exchange are performed manually, but also in automatic cell culture apparatuses that perform medium exchange automatically.
  • the cell culture substrate according to the present invention is useful for applications such as the pharmaceutical industry, beauty product industry, and food industry, since it is possible to exchange and drain the medium while suppressing the influence on cultured cells. .

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Abstract

本発明に係る細胞培養基材は、側面および底面を有する少なくとも１つのウェルを備える細胞培養基材であって、側面は、第１空間を画定する第１側部と、第１空間と連通する第２空間を画定する第２側部と、を含み、平面視において、第１側部の上端部は、中心角が２４０度以上のＣ字状に形成され、第２空間は、上端部の開口部分から、第１空間から離れる第１方向に延在し、第２側部のうち開口部分と第１方向に対向する対向面は、開口部分と対向面との第１方向における最大距離が、上端部のＣ字の直径よりも小さくなる位置に配置されている。

Description

細胞培養基材および細胞培養方法
　本発明は、細胞を培養するためのウェルを備えた細胞培養基材、および、細胞培養基材を用いた細胞培養方法に関する。
　細胞培養試験は、例えば、複数のウェルが設けられたウェルプレート（またはコンパニオンプレート）と呼ばれる樹脂製の基材を用いて行われる。ウェル内には、インサートと呼ばれる細胞培養容器が配置され、インサート内で細胞の培養が行われる。細胞は、ウェル内およびインサート内に収容された培地から養分を摂取して成長する。本明細書では、ウェルプレートのように、少なくとも１つのウェルが設けられた基材を「細胞培養基材」と呼ぶ。
　ウェル内の培地およびインサート内の培地は、必要に応じて、ピペット、アスピレータ等によってウェルから排出され、新しい培地に交換される。ウェル内の古い培地の排出は、通常、インサートをウェルから取り外した状態で行われる。ウェル内にインサートを配置した状態では、ウェルの内側面とインサートとの隙間が狭く、インサートに接触させずにピペット等の先端部分をウェル内に挿入することが難しいからである。しかし、培地交換のたびに、各ウェルからインサートを取り外すには多大な労力が必要である。
　例えば特許文献１は、インサートをウェルから取り外さずに、培地をウェルから排出することの可能な細胞培養装置を開示している。
国際公開第２０１８／１０５０７８号
　特許文献１に開示された細胞培養装置は、ウェルの内部かつインサートの外部に挿入された挿入管を介して、培地の供給および排出を行うように構成されている。特許文献１の構成によると、ウェル内にインサートを配置した状態で培地の交換を行うことができる。
　しかしながら、特許文献１の構成では、インサートをウェルにより安定して保持するという観点で改善の余地がある。インサートが安定して保持されていないと、ウェル内の培地の交換作業中にインサートがぐらついたり、傾いたりする可能性がある。これによってインサート内の細胞が影響を受ける可能性が考えられる。また、インサートが安定して保持されていないと、インサート内の培地を排出しにくい可能性がある。特に自動で（ロボット等を用いて）インサート内から培地を排出することは難しいと考えられる。
　本発明の目的は、前記問題を解決することにあって、培養細胞への影響を抑えつつ、培地の交換を行うことの可能な細胞培養基材を提供することにある。
　前記目的を達成するために、本発明は以下のように構成する。
　本発明の一態様に係る細胞培養基材によれば、
　側面および底面を有する少なくとも１つのウェルを備える細胞培養基材であって、前記側面は、第１空間を画定する第１側部と、前記第１空間と連通する第２空間を画定する第２側部と、を含み、
　平面視において、
　　前記第１側部の上端部は、中心角が２４０度以上のＣ字状に形成され、
　　前記第２空間は、前記上端部の開口部分から、前記第１空間から離れる第１方向に延在し、
　　前記第２側部のうち前記開口部分と前記第１方向に対向する対向面は、前記開口部分と前記対向面との前記第１方向における最大距離が、前記上端部のＣ字の直径よりも小さくなる位置に配置されている。
　本発明によれば、培養細胞への影響を抑えつつ、培地の交換を行うことの可能な細胞培養基材を提供することができる。
本発明の実施形態に係る細胞培養基材におけるウェルの斜視図である。 図１のウェルの平面図である。 図１のＡ１－Ａ１線断面図である。 図１のＢ１－Ｂ１線断面図である。 図１のＢ２－Ｂ２線断面図である。 溝の形状および配置のバリエーションを例示する平面図である。 溝の形状および配置のバリエーションを例示する平面図である。 溝の形状および配置のバリエーションを例示する平面図である。 溝の形状および配置のバリエーションを例示する平面図である。 インサートを例示する斜視図である。 図１のウェルに設けられた支持構造を説明するための斜視図である。 ウェルの回転防止リブと、図４に示すインサートの側壁との配置関係を示す平面図である。 ウェル内に他のインサートが支持された状態を示す平面図である。 細胞培養方法を説明するための工程断面図である。 細胞培養方法を説明するための工程断面図である。 細胞培養方法を説明するための工程断面図である。 細胞培養方法を説明するための工程断面図である。 細胞培養方法を説明するための工程断面図である。 細胞培養方法を説明するための工程断面図である。 細胞培養方法を説明するための工程断面図である。 細胞培養方法を説明するための工程断面図である。 細胞培養方法を説明するための工程断面図である。 細胞培養方法を説明するための工程断面図である。 細胞培養方法を説明するための工程断面図である。 細胞培養方法を説明するための工程断面図である。 細胞培養基材の一例を示す斜視図である。 図１３に示す細胞培養基材の平面図である。 細胞培養基材をＸ方向に傾けた状態を例示する斜視図である。 図１３の細胞培養基材の変形例を示す平面図である。 細胞培養実験１におけるＴＥＥＲ値の測定結果を示す図である。 （ａ）～（ｅ）は、細胞培養実験１におけるｍＲＮＡ発現解析結果を示す図である。 （ａ）～（ｄ）は、細胞培養実験１における薬物代謝酵素活性の測定結果を示す図である。 （ａ）～（ｃ）は、細胞培養実験２における播種後６日目の細胞表面の位相差顕微鏡像である。 （ａ）～（ｃ）は、細胞培養実験２における播種後７日目の細胞表面の位相差顕微鏡像である。 （ａ）～（ｃ）は、細胞培養実験２における播種後８日目の細胞表面の位相差顕微鏡像である。 （ａ）～（ｃ）は、細胞培養実験２における播種後９日目の細胞表面の位相差顕微鏡像である。 （ａ）～（ｃ）は、細胞培養実験２における播種後１０日目の細胞表面の位相差顕微鏡像である。 細胞培養実験２におけるＴＥＥＲ値の測定結果を示す図である。 （ａ）～（ｊ）は、細胞培養実験２におけるｍＲＮＡ発現解析結果を示す図である。
　（本発明の基礎となった知見）
　本発明者らは、培養細胞への影響を抑えつつ、培地の交換を行うことの可能な細胞培養基材の構成を鋭意検討した結果、以下の知見を得た。
　インサートをウェルから取り外さずに培地交換作業を行うためには、ウェル内に、インサートを配置する空間とは別に、ピペット等の管を挿入するための空間を確保することが考えられる。
　従来のウェルプレートには、中空円筒形状のウェルが設けられている。インサートは、例えば、平面視において円形のウェルの略中央に配置される。このような形状のウェルの内部にピペット等の管を挿入する空間を設けると、インサートを安定して保持することが難しくなる。例えば特許文献１では、ウェル内に管を挿入する空間を確保するために、円筒形の一部を切り欠いた形状のインサートが用いられている。このため、インサートのバランスが悪く、ウェル内の培地を交換する際に、培地の流れ等によってインサートがぐらつく可能性がある。さらに、培地を効率よく排出するためにウェルを傾けると、インサートが所定の位置からずれたり、インサートが傾いてウェルの内側面に当たったりする可能性がある。そうすると、細胞がインサート底面から剥がれてしまう等、インサート内の細胞にダメージが生じ得る。また、インサートのバランスが悪いので、インサート内の培地の交換作業も困難である。
　そこで、本発明者らは、検討を重ねた結果、インサートを配置可能な第１空間と、第１空間と連通する第２空間とをウェル内に設け、平面視において、第１空間を画定する側面の上端部がＣ字状に形成され、第２空間がＣ字の開口部分から延在する構成を有することにより、第１空間にインサートを安定して保持しつつ、第２空間を、ピペット等の排出管を挿入し得る空間として利用できることを見出した。この新規な知見に基づき、本発明者らは、以下の発明に至った。
　本発明の一態様に係る細胞培養基材は、側面および底面を有する少なくとも１つのウェルを備える細胞培養基材であって、前記側面は、第１空間を画定する第１側部と、前記第１空間と連通する第２空間を画定する第２側部と、を含み、平面視において、前記第１側部の上端部は、中心角が２４０度以上のＣ字状に形成され、前記第２空間は、前記上端部の開口部分から、前記第１空間から離れる第１方向に延在し、前記第２側部のうち前記開口部分と前記第１方向に対向する対向面は、前記開口部分と前記対向面との前記第１方向における最大距離が、前記上端部のＣ字の直径よりも小さくなる位置に配置されている。
　この構成によると、平面視において中心角が２４０度以上のＣ字状（すなわち、中心角が２４０度の円弧状）の上端部を有する第１側部を用いて、第１空間にインサートを安定して保持できる。例えば、市販されている一般的な円筒形状のインサートを、その周方向に亘って概ね均等に保持することができる。また、第２空間は、平面視において、第１側部のＣ字状の上端部の開口部分から延在した空間であり、第２空間にピペット等を挿入しても、インサート内の細胞に影響を与えにくい。このため、インサートをウェルの第１空間に保持した状態で、インサート内の培養細胞へのダメージを抑えつつ、第２空間を利用して培地の排出および供給等を行うことができる。さらに、インサートが安定して保持されているので、インダート内の培地の交換を容易に行うことができる。
　また、第１側部の上端部の開口部分と第２側部の対向面との第１方向における最大距離が、第１側部の上端部の直径よりも小さいので、第２空間を設けることによるウェルのサイズの増大を抑制できる。このため、例えば従来のウェルプレートと同様のピッチで複数のウェルを配列することが可能になる。
　培地を排出する際には、細胞培養基材を傾けることにより、ウェルの底面を水平方向から傾斜させてもよい。これにより、第１空間内の培地を、重力により第２空間に容易に移動させることができるので、第２空間から培地を効率よく排出できる。なお、インサートは第１空間に安定的に保持されているので、細胞培養基材を傾けても、第１側部に対するインサートの位置（相対的な位置）が保持され得る。このため、インサートが第１側面に接触することによる細胞への衝撃を抑制できる。また、インサートと第１側部との隙間が部分的に狭くなることによって、その部分に培地の一部が排出されずに残ってしまうこと（液残り）を抑制できる。
　さらに、上記細胞培養基材を用いると、ＴＥＥＲ測定を容易に行うことができる。ＴＥＥＲ測定の際には、一対の電極の一方を第１空間のインサート内に挿入し、他方を第２空間に挿入することで、電極の挿入が容易である。また、電極とインサートとの接触に起因する細胞のダメージを抑えることができる。
　平面視において、前記第２側部の対向面は、前記第１方向に凸になるように滑らかに湾曲していてもよい。この構成により、第２空間から培地を排出するときに、液残りが生じ難い。また、第２側部が上記構成を有することで、培地を排出するための排出管の開口（例えばピペットの先端部）を挿入可能であり、かつ、体積を抑えた第２空間を画定できる。従って、第２空間を設けることによるウェルのサイズの増大をさらに抑制できる。
　前記底面は、前記第１空間を画定する第１底部と、前記第２空間を画定する第２底部と、を含み、前記第１底部と前記第２底部とは面一であってもよい。この構成により、培地の排出時に、第１空間から第２空間へ培地をスムーズに移動させることができる。従って、より効率的に培地を排出できる。また、培地を排出する際に細胞培養基材を傾ける場合、傾斜角度を小さく抑えることができるので、細胞培養基材を傾けることによる培養細胞への影響を低減できる。
　前記底面は、少なくとも１つの溝を有し、前記少なくとも１つの溝は、前記第１側部に接する第１部分から、前記第２側部に接する第２部分まで連続する第１溝を含んでもよい。この構成により、インサートとウェルの第１側部との隙間に位置する液体を、溝によって第２空間側へ移動させやすくなる。従って、ウェル内の培地を、より効率的に第２空間から排出することができる。
　なお、第１側部とインサートとの隙間が小さいと、第１空間にインサートをより安定して保持できる一方で、毛細管現象によって上記隙間に液残りが発生しやすくなる。これに対し、ウェルの底面に第１溝を設けることによって、第１側部とインサートとの隙間を小さく抑えつつ、この隙間に残ってしまう培地の量を減少させることができる。第１溝の幅および深さは、第１溝の毛細管力によって、第１側部とインサートとの隙間から液体を引っ張ることができるように設計されていてもよい。
　前記第１側部には、前記上端部の前記直径を、前記底面に接する下端部の直径よりも拡大させるように段差部が設けられており、平面視において、前記段差部は周方向に延在していてもよい。この構成により、インサートとウェルの第１側部との隙間において、液面（培地の上面）の上昇を段差部によって抑制できる。従って、ウェルから培地を排出するときに、古い培地が上記隙間に残り難くなる。また、上記隙間における液面が高くなりすぎると、隙間内で上昇した培地の体積分だけ第２空間Ｓ２内の液面が低くなり、サイフォン現象によって、インサート内の液面も下降する（すなわち液量が減少する）場合がある。段差部によって上記隙間の液面の上昇を抑えることで、サイフォン現象によるインサート内の液量（培地の量）の減少を抑制できる。
　前記第１側部は、前記第１空間に、細胞培養容器（インサート）を前記底面から距離を空けて支持するための支持構造を備えてもよい。これにより、インサートを第１空間により安定して保持できる。
　上記細胞培養基材は複数のウェルを備えてもよい。例えば、平面視において、前記少なくとも１つのウェルは、行方向および前記行方向に交差する列方向に配列された複数のウェルを含んでもよい。前記複数のウェルのそれぞれにおける前記第１方向は、前記行方向および前記列方向のいずれとも交差する方向であってもよい。この構成により、限られた面積により多くのウェルを配列できる。行方向と列方向とは互いに直交していてもよい。この場合、複数のウェルは、平面視において各ウェルの第１方向が行方向および列方向と例えば４５度の角度をなすように配列されていてもよい。
　上記細胞培養基材は、平面視において前記複数のウェルを包囲する外壁をさらに備えてもよい。前記複数のウェルは、前記行方向または前記列方向の端部に位置する複数の外側ウェルを含み、前記複数の外側ウェルの前記側面を形成する側壁と、前記外壁との間には、水を収容するプール部が形成されていてもよい。プール部に精製水等の水を充填することにより、ウェル内の培地の蒸発を抑制できる。前記プール部は、例えば、前記複数の外側ウェルと同数以上に分割されていてもよい。この構成により、細胞培養基材を傾けてもプール部に収容された水がこぼれにくい。
　本発明の一態様の細胞培養方法は、上記細胞培養基材と、前記少なくとも１つのウェルの前記第１空間に、前記底面から離隔して着脱可能に収容された細胞培養容器と、を用いて、前記細胞培養容器内で細胞を培養する細胞培養方法であって、前記少なくとも１つのウェル内に保持された培地の一部または全部を排出する排出工程を含み、前記排出工程は、前記第１空間に前記細胞培養容器を収容した状態で前記細胞培養基材を傾けて、前記第１空間に位置する培地を、前記開口部分を介して前記第２空間に移動させる培地移動工程と、前記第２空間に排出管を挿入し、前記第２空間に位置する培地を、前記排出管を介して、前記少なくとも１つのウェルから排出する工程と、を含む。この方法によると、培養細胞への影響を抑えつつ、培地の排出を行うことができる。この方法は、ウェルから手動で培地を排出する場合にも、自動で（例えばロボット等により）培地を排出する場合にも適用され得る。本発明者が検証したところ、以下のことが確認された。従来の細胞培養基材を用いると、上記排出工程（すなわち、細胞培養基材を傾けて培地を排出する工程）を自動で行うことは困難であった。これに対し、本発明の細胞培養基材を用いると、インサートを安定して保持しつつウェル内にピペット等を挿入できるので、上記排出工程の自動化が可能になる。また、ウェル内の培地のみでなく、インサート内の培地の排出も自動で行うことが可能になる。
　以下、本発明の実施形態について、図面を参照しながら説明する。なお、この実施形態によって本発明が限定されるものではない。また、図面において実質的に同一の部材については同一の符号を付している。
　また、以下では、説明の便宜上、通常使用時の状態を想定して「上」、「下」、「側」等の方向を示す用語を用いるが、本発明に係る細胞培養基材の使用状態等を限定することを意味するものではない。
　《実施形態》
　図１および図２Ａ～図２Ｄを用いて、本発明の実施形態に係る細胞培養基材の全体構成について説明する。図１は、本発明の実施形態に係る細胞培養基材の斜視図である。図２Ａは、図１の細胞培養基材の平面図である。図２Ｂは、図２ＡのＡ１－Ａ１線断面図、図２Ｃは、図２ＡのＢ１－Ｂ１線断面図、図２Ｄは、図２ＡのＢ２－Ｂ２線断面図である。
　図１および図２Ａ～図２Ｄに示すように、本実施形態に係る細胞培養基材は、側面１０および底面２０を有する少なくとも１つのウェル１００と、ウェル１００の側面１０を構成する側壁５１と、底面２０を構成する底壁５２とを備える。細胞培養基材は、例えば射出成形によって形成された樹脂成形体である。
　ウェル１００の側面１０は、第１空間Ｓ１を画定する第１側部１１と、第２空間Ｓ２を画定する第２側部１２とを含む。第２空間Ｓ２は、第１空間Ｓ１と連通している。第１空間Ｓ１は、細胞を培養する空間である。第１空間Ｓ１は、インサート（不図示）を着脱可能に配置することができるように構成されている。第２空間Ｓ２は、培地の供給や排出等に使用され得る空間である。第２空間Ｓ２は、ピペット、アスピレータ等の先端部、ＴＥＥＲ測定用の電極等を、インサートに接触させずに挿入することができるように構成されている。
　第１側部１１は、上端部１１ａと、底面２０に接する下端部１１ｂとを有する。平面視において、第１側部１１の上端部１１ａは、中心角αが２４０度以上のＣ字状（円弧状）に形成されている。「平面視」は、ウェル１００の上方から、底壁５２の厚さ方向に見た状態をいう。この構成により、第１空間Ｓ１にインサートを安定して保持できる。例えば、第１側部１１または第１側部１１を構成する側壁５１の上面に複数の支持構造を設けることで、複数個所でインサートを保持できる。一般的な円筒形状のインサートであれば、インサートの上端部または外側面を、その周方向に３等分する３か所で支持してもよい。中心角αが大きいほど、インサートを安定して保持しやすい。中心角αは例えば３００度である。なお、中心角αが大きくなりすぎると、開口部分１１ｐの幅が小さくなり、第１空間Ｓ１内の液体が開口部分１１ｐを通って第２空間Ｓ２まで移動しにくくなる可能性がある。中心角αは、開口部分１１ｐが液体を容易に通過させることのできる幅を有するように設定されてもよい。
　平面視において、第２空間Ｓ２は、上端部１１ａの開口部分１１ｐから、第１空間Ｓ１から離れる第１方向Ｅ１に延在している。平面視において、第２側部１２は、上端部１１ａの開口部分１１ｐと第１方向Ｅ１に対向する対向面１２ｆを含む。平面視において、第２側部１２の対向面１２ｆは、第１方向Ｅ１に凸になるように滑らかに湾曲していてもよい。この構成により、第２空間Ｓ２から培地を排出するときに、液残りが生じ難い。また、第２側部１２が上記のような対向面１２ｆを有することで、培地を排出するためのピペットの先端部等を容易に挿入可能であり、かつ、体積を抑えた第２空間Ｓ２を画定できる。平面視において、対向面１２ｆは、例えば円弧状（ここでは半円状）であってもよい。図２Ｂに示すように、対向面１２ｆは、上方に向かうにつれて、開口部分１１ｐからの距離が長くなるように傾斜していてもよい。
　開口部分１１ｐと第２側部１２の対向面１２ｆとの第１方向Ｅ１における最大距離（すなわち、第２空間Ｓ２の第１方向Ｅ１における最大長さ）Ｌ１は、上端部１１ａのＣ字の直径Ｄａよりも小さい。この構成により、ウェル１００のサイズの増大を抑制できる。また、ウェル１００を規格に応じたピッチで配列することが可能になる。上端部１１ａの円弧の直径Ｄａは、例えば１６．０ｍｍであり、最大距離Ｌ１は、例えば１０．５ｍｍである。平面視において、第１方向Ｅ１に直交する第２方向Ｅ２における第２空間Ｓ２の最大幅Ｌ２は、例えば開口部分１１ｐの第２方向Ｅ２における幅以下であってもよい。第２空間Ｓ２の最大幅Ｌ２は、例えば７．７ｍｍである。
　第１方向Ｅ１は、Ｃ字状の上端部１１ａの径方向であってもよい。この構成により、細胞培養容器を傾けて培地を排出する際に、第１空間Ｓ１に位置する液体を第２空間Ｓ２に移動させやすくなり、第１空間Ｓ１に残ってしまう培地の量を減少させることができる。また、ＴＥＥＲ測定では、一対の電極を、それぞれ、第１空間Ｓ１に配置されたインサートの中央付近と、第２空間Ｓ２とに容易に挿入できる。各ウェル１００の平面形状は、上端部１１ａの中心および開口部分１１ｐの中心を結ぶ線を軸とする線対称であってもよい。
　底面２０は、第１空間Ｓ１を画定する第１底部２１と、第２空間Ｓ２を画定する第２底部２２とを含む。第１底部２１は、顕微鏡観察等を行うための観察面２１ａを含む。観察面２１ａは、例えば、直径が９．５ｍｍの円形である。観察面２１ａは、第１底部２１の周縁から間隔を空けて配置されていてもよい。インサートを配置した場合、平面視において、観察面２１ａはインサートの底面と少なくとも部分的に重なる。第１底部２１と第２底部２２とは面一であってもよい。この構成により、第１空間Ｓ１に位置する液体を第２空間Ｓ２に移動させやすくなるので、より効率的に培地を排出できる。平面視における底面２０の面積は、例えば１８７ｍｍ２であり、市販されているウェルプレートにおけるウェルの底面積と同じである。
　培地の排出を行う際には、例えば、ウェル１００の第１底部２１が第２底部２２よりも相対的に低くなるように細胞培養基材を傾けてもよい。細胞培養基材は、例えば第１方向Ｅ１に傾けてもよい。細胞培養基材を傾ける方向（傾斜方向）は、第１方向Ｅ１に限定されず、第１方向Ｅ１に成分を有する方向、すなわち第１方向Ｅ１に対して±９０度未満の方向であればよい。傾斜方向は、第１方向Ｅ１と±４５度以下の角度をなす方向であることが好ましい。これにより、重力によって第１空間Ｓ１内の培地を第２空間Ｓ２に容易に移動させることができる。この状態で、第２底部２２のうち最も低くなる最下点の近傍にピペット等の先端部を配置し、培地の排出を行ってもよい。第１方向Ｅ１と±４５度の角度をなす方向Ｆ１、Ｆ２に細胞培養基材を傾けた場合、第２底部２２のうちの点Ｑ１、Ｑ２がそれぞれ最下点となる。
＜段差部＞
　第１側部１１には、第１側部１１の上端部１１ａの直径Ｄａを、第１側部１１の下端部１１ｂの直径Ｄｂよりも拡大させるように段差部が設けられていてもよい。直径Ｄａは、例えば１６．０ｍｍであり、直径Ｄｂは、例えば１２．５ｍｍである。段差部は、上端部１１ａと下端部１１ｂとの間に位置する上向きの段差面１１ｃを含む。平面視において、段差部は周方向に延在している。この構成により、インサートと第１側部１１との隙間における液面の上昇を抑制できる。従って、サイフォン現象によるインサート内の液量（培地の量）の減少を抑制できる。また、ウェル１００から培地を排出するときに、古い培地が上記隙間に残り難くなるので、液残りを抑制できる。段差部は、第１側部１１に亘って延在していてもよい。つまり、段差部は、平面視において、Ｃ字状の一方の端部から他方の端部まで周方向に延在していてもよい。
　段差面１１ｃの高さ（レベル）は、ウェル１００に供給される培地量にもよるが、インサート内の液面の高さと同程度になるように設定されていてもよい。これにより、インサートと第１側部１１との隙間における液面の高さと、インサート内および第２空間Ｓ２における液面の高さとを揃えることができるので、サイフォン現象によるインサート内の培地量の減少が生じにくい。観察面２１ａと段差面１１ｃとの、底壁５２の厚さ方向における距離は、例えば５．６ｍｍである。
　段差面１１ｃの幅（上端部１１ａの径方向における幅）は、コアンダ効果を利用して、上記隙間における液面の上昇を抑えることの可能な幅に設定される。一方、段差面１１ｃの幅が大きくなりすぎると、インサートの直径に対して直径Ｄａが増大し、インサートを安定して保持することが難しくなることがある。このため、段差面１１ｃの幅は、直径Ｄａの増大を抑えつつ、液面の上昇を抑えることができるように設定されてもよい。段差面１１ｃの幅は、例えば０．８～１．３ｍｍである。
　第２空間Ｓ２を画定する第２側部１２の少なくとも一部には、第１側部１１の段差面１１ｃと同じ高さの段差面が設けられていなくてもよい。これにより、段差面１１ｃに起因して生じた液面の揺れを吸収することができる。図示する例では、第２側部１２全体に亘ってそのような段差部が設けられていない。
＜溝＞
　底面２０には、第１溝３１を含む１つまたは複数の溝が設けられていてもよい。溝は、底面２０のうち観察面２１ａ以外の領域に配置される。溝の底部は、観察面２１ａよりも下方に位置する。
　第１溝３１は、第１側部１１に接する第１部分から、第２側部１２に接する第２部分まで連続していればよい。この構成により、インサートとウェル１００の第１側部１１および第１底部２１との隙間に位置する液体を、第１溝３１によって第２空間Ｓ２側へ容易に移動させることができる。従って、第１溝３１の第２部分に近接してピペット等の先端部を配置することにより、ウェル１００内の培地を、より効率的に第２空間Ｓ２から排出することができる。
　第１溝３１は、第１部分から第２部分まで側面１０に沿って延びていてもよい。図示する例では、第１溝３１は、第１側部１１と観察面２１ａとの間に位置する第１部分から、第２側部１２の対向面１２ｆに接する第２部分まで連続している。平面視において、第１溝３１は、底面２０の周縁全体に延在していてもよい。
　底面２０のうち溝が形成されていない領域は、観察面２１ａと同じ高さ（レベル）であってもよい。例えば、第１底部２１のうち溝が形成されていない領域（観察面２１ａを含む）と、第２底部２２のうち溝が形成されていない領域とは面一であってもよい。図示する例では、底面２０の周縁のみに第１溝３１が設けられ、底面２０のうち第１溝３１の内側に位置する部分は面一である。この構成により、底面２０の凹凸に起因する液残りを低減できる。
　第１溝３１の幅ｒは、第１空間Ｓ１の所定の位置にインサートを支持したときのインサートと第１側部１１との隙間の幅ｗ（図７Ａ等参照）よりも小さくてもよい。第１溝３１の幅ｒを小さくすることで、培地の排出時に、インサートと第１側部１１および第１底部２１との隙間に残る培地を、毛細管現象によって第１溝３１に引っ張り、第１溝３１内を第２空間Ｓ２側まで移動させることができるので、液残りをさらに低減できる。一方、第１溝３１の幅が小さすぎると、毛細管力が低下する可能性がある。このため、第１溝３１の幅ｒは、側壁５１の最小厚さ以上であってもよい。また、細胞培養基材を形成するための金型の強度を確保する観点から、第１溝３１の幅ｒは、例えば０．６ｍｍ以上であってもよい。第１溝３１の幅ｒは、例えば０．９ｍｍである。
　第１溝３１の深さ（最大深さ）ｄは、例えば、側壁５１の最小厚さ以上であってもよい。第１溝３１の深さｄは、第１溝３１の毛細管力が、インサートと第１側部１１および第１底部２１との隙間に生じる毛細管力よりも高くなるように設定されていてもよい。一方、第１溝３１の深さｄは、インサートと第１側部１１との隙間を液体（ここでは培地）が上昇する最大高さＨ以下であってもよい。第１溝３１の深さｄは、例えば０．５ｍｍである。なお、「最大高さＨ」は、インサートと第１側部１１との隙間の幅ｗ、培地の表面張力σ、インサートおよびウェルの樹脂材料に対する培地の接触角θ（例えば９０度）、培地の密度ρ、重力加速度ｇから、下記式（１）を用いて算出することができる。
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　底面２０には、第１溝３１に加えて、他の溝が設けられていてもよい。他の溝は、第１溝３１に繋がっていてもよいし、第１溝３１と分離されていてもよい。他の溝の幅および深さは、第１溝３１と同じであってもよいし、異なっていてもよい。
　図３Ａ～図３Ｄは、それぞれ、溝の形状および配置のバリエーションを例示する図であり、ウェル１００の底面２０を示す平面図である。底面２０の周縁は、第１側部１１および第２側部１２の下端部によって画定されている。
　図３Ａに示すように、ウェル１００の底面２０に、第１側部１１の開口部分１１ｐの近傍から、第１溝３１のうち第２側部１２の対向面１２ｆに接する部分まで延在する第２溝３２がさらに設けられてもよい。第２溝３２の対向面１２ｆ側の端部は、第１溝３１に繋がっている。これにより、インサートと第１側部１１および第１底部２１との隙間に残る液体を、第２溝３２を介してより効率的に対向面１２ｆ側に導くことができる。従って、培地の排出に要する時間を短縮できる。
　図３Ｂに示すように、ウェル１００の底面２０のうち第１側部１１の開口部分１１ｐに第３溝３３がさらに設けられていてもよい。平面視において、第３溝３３は、第１溝３１のうち第１側部１１に沿ってＣ字状に形成されている部分の両端部を繋ぐように配置されている。これにより、第１溝３１および第３溝３３によって、インサートの底面を包囲する環状の溝が構成される。従って、インサートと第１側部１１および第１底部２１との隙間に残る液体を、効率よく環状の溝に引っ張り出すことができるので、培地の排出に要する時間を短縮できる。
　なお、第１溝３１のみを設ける場合、あるいは、図３Ａおよび図３Ｂに示す例では、ウェル１００の底面の大部分は、平坦（観察面と面一）である。このため、ウェル１００の底面の凹凸（溝を設けることによって生じた凹凸）に起因する液残りを少なくできる。
　図３Ｃに示す例では、図３Ｂに示す第１溝３１および第３溝３３に加えて、複数の第２溝３２がさらに設けられている。平面視において、各第２溝３２の一方の端部は第３溝３３に繋がり、他方の端部は、第１溝３１のうち第２側部１２の対向面１２ｆに接する部分に繋がっている。第２溝３２を複数本設けることで、図３Ａおよび図３Ｂに示す例よりも、培地の排出に要する時間を短縮できる。
　図３Ｄに示すように、第２底部２２に、複数の凸部３４が設けられてもよい。複数の凸部３４は、これらの間に培地の流路となり得る溝を画定するように配列されている。第２底部２２のうち複数の凸部３４が形成されていない領域３５は、第１溝３１の底部と面一であってもよい。各凸部３４の上面の高さ（レベル）は、観察面の高さと同じであってもよい。インサートと第１側部１１および第１底部２１との隙間に残る液体は、第３溝３３および領域３５を対向面１２ｆ側まで移動することができるので、培地の排出に要する時間を短縮できる。
　＜支持構造＞
　再び図１および図２Ａ～図２Ｄを参照する。第１側部１１は、第１空間Ｓ１に、インサートを底面２０から距離を空けて支持するための支持構造４０を備えてもよい。これにより、インサートを第１空間Ｓ１により安定して保持できる。インサートは、平面視において、インサートの底面の中心が、第１側部１１の上端部１１ａの中心と略一致するように配置されることが好ましい。つまり、インサートは第１空間Ｓ１に偏心して配置されていないことが好ましい。また、インサートは、断面視において、インサートの中心軸が、ウェル１００の底壁５２の厚さ方向に平行になるように配置されていることが好ましい。これにより、第１側部１１とインサートとの隙間が部分的に狭くなってしまうことを抑制できる。
　支持構造４０の一部または全部は、段差面１１ｃ上、または、段差面１１ｃと上端部１１ａとの間に配置されてもよい。これにより、段差面１１ｃによって径方向に拡大されたスペースを利用して支持構造４０を形成できる。また、インサートと第１側部１１との隙間における培地の液面よりも上方に支持構造４０を配置できるので、支持構造４０による培地交換作業への影響（例えば培地を排出しにくくなる等）を抑制できる。
　支持構造４０は、１つまたは複数種類の市販のインサートを支持できるように構成されていてもよい。支持構造４０は、インサートの一部を下方から支持する部分を含む。支持構造４０は、支持構造４０に対してインサートを上下方向に（底壁５２の厚さ方向に）移動させるだけで、インサートを着脱できるように構成されていることが好ましい。また、支持構造４０と、インサートにおける支持構造４０によって支持される部分とは、インサートをウェルに対して容易に着脱できるような寸法関係を有することが好ましい。これによって、インサートの着脱による細胞へのダメージ、例えばインサート底面に播種した細胞が剥がれてしまうこと等を抑制できる。
　図４はインサートの一例を示す斜視図である。インサート６０は、円筒形状の側壁と、多孔質メンブレンフィルターからなる底壁とを有する。インサート６０の側壁の外側面６１には、複数の（ここでは２つの）凸部６２が設けられている。インサート６０は、例えばＦａｌｃｏｎ製のインサートである。
　図５に示す斜視図を参照しながら、インサート６０を支持するための支持構造４０の一例を説明する。
　細胞培養基材は、支持構造４０として、第１側部１１の上端部１１ａと下端部１１ｂとの間に配置された複数のリブを備える。複数のリブは、複数の支持リブ４１と、複数の支持リブ４１のうちの隣接する２つの支持リブの間に配置された誤挿入防止リブ４２と、複数の回転防止リブ４３とを含む。これらのリブ４１～４３の下面は段差面１１ｃに接している。リブ４１～４３の上面は、第１側部１１の上端部１１ａよりも下方に位置しているので、第１側部１１の上端部１１ａに、他の種類のインサートを支持するための支持構造を別途設けることが可能になる。リブ４１～４３は、他の種類のインサートの挿入を妨げないように位置付けられてもよい。
　複数（ここでは２つ）の支持リブ４１のそれぞれは、インサート６０における凸部６２の１つを受け入れる凹部４１ａを上面に有している。つまり、凹部４１ａの幅は、インサート６０の各凸部６２の幅よりも大きい。
　誤挿入防止リブ４２は、隣接する２つの支持リブ４１のそれぞれとは間隔ｔを空けて配置されている。間隔ｔは、インサート６０の各凸部６２の幅よりも小さい。誤挿入防止リブ４２は、複数に分割されていてもよい。分割された複数の部分は、各凸部６２の幅よりも小さい間隔を空けて配列されてもよい。誤挿入防止リブ４２を設けることで、インサート６０が所定の高さよりも下方まで誤挿入されることを防ぐことができる。従って、誤挿入によって、インサート６０内の液面の高さが、ウェル１００内に充填した液体（培地）の液面の高さよりも低くなることに起因するサイフォン現象を抑制できる。
　複数の（ここでは４つ）回転防止リブ４３は、第１側部１１の周方向に所定の間隔を空けて配置されてもよい。平面視において、各回転防止リブ４３は、第１側部１１から内側に延在している。各回転防止リブ４３の幅は、第１側部１１から離れるにつれて小さくなっていてもよい。図示する例では、各回転防止リブ４３は三角柱状である。図６Ａに示すように、平面視において、各回転防止リブ４３の最も内側に位置する部分は、インサート６０の外側面に接していてもよい。これにより、インサート６０の回転を防止することができる。
　インサートの構造およびウェル１００の支持構造４０は、上述した例に限定されない。ウェル１００の側壁５１の上面５１ａには、複数（ここでは３つ）の切り欠き部４４が形成されていてもよい。これにより、図６Ｂに示すように、円筒形の一方の端部から鍔状に延在する複数（ここでは３つ）の突出部６３を備えるインサート６０ａを用いる場合に、インサート６０ａの突出部６３を切り欠き部４４で支持することができる。インサート６０ａは、例えば、ＦＵＪＩＦＩＬＭ製、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製、ＶＩＴＲＩＧＥＬ製またはＧＲＥＩＮＥＲ製のインサートである。インサート６０ａの３つの突出部６３は、インサート６０ａの側壁の上端部を周方向に３等分する位置にそれぞれ配置されている。各切り欠き部４４は、突出部６３の１つを受け入れるように構成されている。
　また、ウェル１００の側壁５１の上面５１ａには、切り欠き部４４以外の凹凸が設けられていなくてもよい。これにより、例えば、円筒形の一方の端部にフランジを有するインサート（例えばＣＯＲＮＩＮＧ製）を用いる場合に、インサートのフランジを、側壁５１の上面５１ａのうち切り欠き部４４以外の平坦な領域で支持することができる。
　図５に示す例では、支持構造４０は、複数種類のインサートを支持できるように構成されている。なお、支持構造４０は、いずれか１種類のインサートを支持可能に構成されていればよい。
　（細胞培養方法）
　本実施形態の細胞培養基材を用いて、細胞を培養する方法の一例を説明する。図７Ａ～図１２Ｂは、それぞれ、細胞培養方法を説明するための工程断面図である。図７Ａ～図１２Ａは、図２Ａに示したＡ１－Ａ１線に対応する断面を示し、図７Ｂ～図１２Ｂは、それぞれ、図２Ａに示したＢ１－Ｂ１線に対応する断面を示す。
　図７Ａおよび図７Ｂに示すように、細胞培養基材のウェル１００の第１空間Ｓ１にインサート６０を配置し、公知の方法でインサート６０に細胞７０を播種する。例えば、細胞７０および培地７１を含む懸濁液を調整し、所定量の懸濁液をインサート６０内に供給してもよい。インサート６０としては、特に限定されず、公知のものを使用可能である。インサートは底面に多孔質メンブレンフィルターを有する。多孔質メンブレンフィルターは、例えば、液体に溶解または縣濁した小分子（化学物質等）を透過させるが、細胞を透過させないように構成されている。ここでは、インサート６０として、図４に示したインサート６０を用いる。
　次いで、図８Ａおよび図８Ｂに示すように、ウェル１００内に培地７２を供給する。ここでは、例えばピペット８０を用いて、ウェル１００の第２空間Ｓ２に培地７２を注入する。このとき、インサート６０とウェル１００の第１側部１１との隙間Ｓｇの幅ｗが小さいと、毛細管現象により、隙間Ｓｇにおける培地７２の液面が上昇することがある。これにより、隙間Ｓｇにおける培地７２の液面は、第２空間Ｓ２における培地の液面よりもｄｈ（＞０）だけ高くなる。本明細書では、隙間Ｓｇの幅ｗは、平面視において、インサート６０の外側面の下端部とウェル１００の第１側部１１との、インサート６０の径方向における距離を指す。隙間Ｓｇの幅ｗは、例えば１～２ｍｍ程度である。
　図９Ａおよび図９Ｂに示すように、ウェル１００内に培地７２をさらに注入し、隙間Ｓｇにおける培地７２の液面が段差面１１ｃの高さに達すると、コアンダ効果により、液面の上昇が抑えられる。例えば、隙間Ｓｇにおける液面の高さは、段差面１１ｃの高さと略同じになる。これにより、液面の高さの差ｄｈの増大を抑えることができる。このように、段差面１１ｃを設けることにより、隙間Ｓｇにおける液面の上昇を抑えることができるので、サイフォン現象に起因するインサート６０内の液量の減少を抑制できる。また、隙間Ｓｇにおける液面の上昇を抑えることで、培地７２を排出する際にインサート６０と第１側部１１との隙間Ｓｇに液残りが生じにくくなる。
　なお、段差面１１ｃの影響で培地７２に波が生じ、液面が揺れてしまう可能性がある。本実施形態では、第２側部１２に、段差面１１ｃと同じ高さの段差面が設けられていないので、波による培地７２の液面の揺れを、第２空間Ｓ２で吸収することができる。
　培地７２の供給を完了した時点で、第２空間Ｓ２における培地７２の液面の高さと、段差面１１ｃの高さによって規制された隙間Ｓｇにおける液面の高さと、インサート６０内の培地７１の液面の高さとが略同じになるように、インサート６０およびウェル１００に供給する培地の量が調整されていてもよい。
　この後、ウェル１００に蓋をして、所定の温度（例えば３７℃）で加湿したＣＯ２インキュベータに細胞培養基材を静置することにより、細胞を培養する。細胞は、培地７２から必要な栄養分を摂取して成長する。
　細胞の増加に伴い、必要に応じて培地交換を行う。培地交換は、栄養分の減少した古い培地の少なくとも一部をウェルから排出する排出工程と、古い培地を排出した後、ウェルに新しい培地を供給する供給工程とを含む。
　排出工程では、図１０Ａおよび図１０Ｂに示すように、まず、第１空間Ｓ１にインサートを収容した状態で細胞培養基材を傾けて、第２空間Ｓ２の第２底部を第１空間Ｓ１の第１底部よりも相対的に低くする。これにより、第１空間Ｓ１に位置する培地７２の一部を、第１側部１１の開口部分を介して第２空間Ｓ２に移動させる（培地移動工程）。図１０Ａおよび図１０Ｂは、図２Ａに示す方向Ｆ２に、細胞培養基材を傾けた状態を示す。図示するように、毛細管現象により、インサート６０と第１側部１１との隙間Ｓｇにおける液面は、第２空間Ｓ２における液面よりも上方に位置する。
　次いで、ピペット８０を第２空間Ｓ２に挿入する。ピペット８０の先端部は、第２底部２２のうち最も低くなる点Ｑ２（図２Ａ参照）の近傍に配置されてもよい。
　続いて、図１１Ａおよび図１１Ｂに示すように、第２空間Ｓ２に位置する培地７２を、ピペット８０を介してウェル１００から排出する。培地７２のうち隙間Ｓｇに位置する部分は、重力の影響よりも毛細管現象の影響を強く受けるので、隙間Ｓｇ内に残ろうとする。
　図１２Ａおよび図１２Ｂに示すように、第２空間Ｓ２内の培地７２の大部分が排出されると、隙間Ｓｇに残った培地７２は、第１溝３１の毛細管力に引っ張られる。引っ張られた培地７２は、第１溝３１内を第２空間Ｓ２側まで移動し、ピペット８０によってウェル１００から排出され得る。このように、第１溝３１の毛細管力を利用することで、隙間Ｓｇに残る古い培地７２の量を減らすことができる。
　古い培地を排出した後、ウェル１００内に新しい培地を供給する（供給工程）。新しい培地を供給する方法は、図８Ａ～図９Ｂを参照しながら前述した方法と同様である。
　上記では、段差部および第１溝３１を有するウェル１００を用いた細胞培養方法を説明したが、ウェル１００が段差部、第１溝３１またはその両方を有していない場合でも、上記と同様の方法で細胞の培養を行うことができる。段差部および第１溝３１を有していない場合でも、培地の排出速度を小さくしたり、複数回に分けて培地の排出作業を行ったりすることにより、液残りを減少させることができる。
　（細胞培養基材の他の例）
　図１３は、細胞培養基材２００の一例を示す斜視図である。図１４は、細胞培養基材２００の平面図である。細胞培養基材２００は、２次元に配列された２４個のウェル１００を有するウェルプレートである。図１３および図１４では、細胞培養基材２００の高さ方向をＺ方向する。Ｚ方向から見た平面視において、細胞培養基材２００は例えば矩形状である。矩形における互いに直交する２辺（ここでは長辺および短辺）の延在する方向を、それぞれ、Ｘ方向およびＹ方向とする。
　細胞培養基材２００は、複数のウェル１００と、平面視において複数のウェル１００を包囲する外壁５３とを備える。各ウェル１００の構造は、図１～図６Ｂを参照して前述した構造と同様である。この例では、ウェルの個数は２４であるが、２４に限定されず、例えば６、４８、９６等であってもよい。
　外壁５３は、平面視において矩形状に延在している。平面視において、外壁５３は、Ｘ方向に延在する２つの第１外壁部５３ｘと、Ｙ方向に延在する２つの第２外壁部５３ｙとを有する。第１外壁部５３ｘの長さは例えば１２７．５ｍｍ、第２外壁部５３ｙの長さは例えば１８５．５ｍｍである。外壁５３の高さは、例えば２１．１ｍｍである。
　平面視において、ウェル１００は、例えば行方向および行方向に交差（例えば直交）する列方向に配列されている。各ウェル１００は、その第１方向Ｅ１が、ウェル１００の配列方向である行方向および列方向のいずれとも交差するように配置されている。この構成により、限られた面積により多くのウェル１００を配置できる。
　図１４に示す例では、ウェル１００の行方向はＸ方向であり、列方向はＹ方向である。各ウェル１００の第１方向Ｅ１は、例えば、Ｘ方向およびＹ方向のそれぞれと４５度の角度をなす。つまり、各ウェル１００の第２空間Ｓ２は、第１空間Ｓ１のＸ方向かつＹ方向に延在している。複数のウェル１００は同じ向きになるように（例えば、第１方向Ｅ１がＸ方向およびＹ方向と４５°の角度をなすように）配列されていることが好ましい。これにより、細胞培養基材２００を傾けたときに、複数のウェル１００の第１空間Ｓ１内の培地を、同時に第２空間Ｓ２に移動させることができる。
　Ｘ方向におけるウェル１００の配列ピッチＰｘと、Ｙ方向におけるウェル１００の配列ピッチＰｙとは同じであってもよい。この例では、配列ピッチＰｘ、Ｐｙはいずれも１９ｍｍであり、市販されているウェルプレートの配列ピッチと同じである。これにより、市販のウェルプレートに対応した観察用の顕微鏡やピペット等の器具を、細胞培養基材２００にも適用可能である。
　図１４に示す例では、細胞培養基材２００をＸ方向に傾けるか、Ｙ方向に傾けるか、またはその両方に傾けることによって、各ウェル１００内の培地を第２空間Ｓ２に移動させることができる。「Ｘ方向に傾ける」とは、２つの第２外壁部５３ｙのうちの、各ウェル１００の第２空間Ｓ２側に位置する方が他方よりも下になるように傾けることをいう。「Ｙ方向に傾ける」とは、２つの第１外壁部５３ｘのうちの、各ウェル１００の第２空間Ｓ２側に位置する方が他方よりも下になるように傾けることをいう。Ｘ方向に傾けたときには、例えば、各ウェル１００の第２底部２２のうち最も低くなる点Ｑ２の近傍にピペット等を配置して培地の吸い取りを行ってもよい。Ｙ方向に傾けたときには、例えば、各ウェル１００の第２底部２２のうち最も低くなる点Ｑ１の近傍にピペット等を配置して培地の吸い取りを行ってもよい。なお、細胞培養基材２００の傾斜方向は、第１方向Ｅ１と±４５度以下の角度をなす方向であればよい。また、培地の排出時に段階的に、細胞培養基材２００の傾斜方向を変化させてもよい。
　図１５は、細胞培養基材２００をＸ方向に傾けた状態を例示する斜視図である。水平面に対する各ウェル１００の底面（ウェルの観察面を含む面）の傾斜角度βは、０°よりも大きければよい。傾斜角度βは、好ましくは５°よりも大きい。これにより、培地の第２空間Ｓ２への移動速度を高めることができる。一方、傾斜角度βは、２０°よりも小さくてもよい。これにより、細胞培養基材２００を傾斜させたり、戻したりすることによる細胞への影響を小さくできる。傾斜角度βは、例えば１０°程度である。細胞培養基材２００を傾斜させる作業は手動で行ってもよいし、自動で行ってもよい。
　再び図１３および図１４を参照する。細胞培養基材２００は、外壁５３と複数のウェル１００との間に、プール部９０をさらに備えてもよい。プール部９０に精製水等の水を充填することで、ウェル１００内の培地の蒸発を抑制できる。
　複数のウェル１００は、行方向または列方向の端部に位置する複数の外側ウェル１０１と、外側ウェル１０１の内側に位置する内側ウェル１０２とを含む。プール部９０は、複数の外側ウェル１０１の側壁５１と、外壁５３との間に配置されている。プール部９０は、外側ウェル１０１と同数以上に分割されている。プール部９０を外側ウェル１０１と同数以上に分割することで、細胞培養基材２００を傾けてもプール部９０に収容された水がこぼれにくい。この例では、外側ウェル１０１の数は１６個であり、プール部９０は１９個に分割されている。
　図１６は、本実施形態の細胞培養基材の変形例を示す平面図である。変形例の細胞培養基材２００ａでは、第２空間Ｓ２は、対向面１２ｆの近傍に、第１側部のＣ字状の上端部の開口部分１１ｐよりも幅の大きい領域を有している。各ウェル１００の平面形状は線対称でなくてもよい。
　本発明者は、図１３および図１４に示す細胞培養基材（ウェルプレート）２００の有用性を調べるために、ウェルプレート２００を用いて細胞培養実験を行い、ウェルプレート２００の操作性を確認するとともに培養された細胞の機能を評価した。また、市販のウェルプレートを用いて同様の実験を行い、ウェルプレート２００を用いた場合との比較を行った。以下、細胞培養実験の方法および結果を説明する。
　＜細胞培養実験１＞
　（実施例１）
　実施例１では、図１３および図４に示すウェルプレート２００を準備した。次いで、ウェルプレート２００における２４個のウェルのそれぞれにＦａｌｃｏｎ製インサートを配置した。
　続いて、ｈｉＰＳ細胞から分化させた腸管幹細胞を各インサートに播種し、フィーダーレス条件で腸管上皮細胞への分化誘導を行った。分化誘導のプロトコルは、特開２０２２－０１９４１１号公報に記載の方法に従った。参考のため、特開２０２２－０１９４１１号公報号の開示内容の全てを本明細書に援用する。必要に応じて、例えば２４時間～２日に１回の頻度で、下記方法で培地交換を行った。細胞播種後３０日目で培養実験を終了した。終了後、ｍＲＮＡ発現解析および薬物代謝酵素活性測定により、分化させた細胞の評価を行った。
　・培地交換方法
　培地交換の際の培地の排出および供給は、図７Ａ～図１２Ｂを参照して前述した方法を用いて、手動で行った。具体的には、各ウェルの第１空間にインサートを保持した状態でウェルプレートを傾斜させて、各ウェルの第２空間からピペットで培地を排出した。排出後、ウェルプレートを水平に戻して、各ウェルの第２空間に新しい培地を供給した。
　・ＴＥＥＲ値の測定
　細胞播種後１８日目から、細胞の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）値の測定を行い、ＴＥＥＲ値の経時的な変化を調べた。測定には、Millicell ERS-2を用いた。
　・ｍＲＮＡ発現解析
　上記方法で分化させた上皮細胞について、ＲＴ－ｑＰＣＲ法により、吸収上皮細胞マーカーであるVillin1、薬物トランスポーターであるMDR1、PEPT1、薬物代謝酵素であるCYP3A4、CYP2C9の発現量を測定し、adult small intestine（ＡＳＩ）に対する相対的発現量を求めた。測定には、KAPA SYBR Fast qPCR Kitを用いた。
　・薬物代謝酵素活性の測定
　上記方法で分化させた上皮細胞について、基質としてmidazolam、diclofenac、mephenytoin、bufuralolを用いて、CYP3A4/5、CYP2C9、CYP2C19、およびCYP2D6の代謝活性を調べた。ここでは、CYP3A4/5、CYP2C9、CYP2C19、およびCYP2D6の活性を、1’-hydroxylation of midazolam、4’-hydroxylation of diclofenac、4’-hydroxylation of mephenytoin、および、1’-hydroxylation of bufuralolの生成量を測定することによって算出した。
　（実施例２）
　インサートとして、Ｇｒｅｉｎｅｒ製のインサートを用いた点以外は、実施例１と同様の方法で腸管上皮細胞への分化誘導および上皮細胞の評価を行った。
　（比較例１）
　２４個のウェルを有する市販のＦａｌｃｏｎ製ウェルプレートおよびＦａｌｃｏｎ製インサートを用いた点、および、下記方法で培地交換を行った点以外は、実施例１と同様の方法で、腸管上皮細胞への分化誘導および上皮細胞の評価を行った。
　・培地交換方法
　比較例１では、各ウェルからピンセットでインサートを取り外して、ピペットを用いてウェルから培地を排出した。その後、インサートをウェル内に戻してウェル内に培地を供給した。これらの操作を全て手動で行った。
　（比較例２）
　２４個のウェルを有する市販のＧｒｅｉｎｅｒ製ウェルプレートおよびＧｒｅｉｎｅｒ製インサートを用いた点以外は、比較例１と同様の方法で腸管上皮細胞への分化誘導および上皮細胞の評価を行った。
　（ＴＥＥＲ値測定結果）
　図１７は、実施例１、２および比較例１、２における播種後１８日目～３０日目までのＴＥＥＲ値の測定結果を示す図である。図１７に示すように、実施例１、２の細胞のＴＥＥＲ値は、それぞれ、比較例１、２の細胞のＴＥＥＲ値と同程度以上であり、本実施形態のウェルプレート２００を用いても、市販品のウェルプレートを用いた場合と同程度以上のバリア機能を有する細胞を培養できることが確認された。
　また、特に２４日目以降では、実施例１、２の細胞のＴＥＥＲ値は、それぞれ、比較例１、２の細胞のＴＥＥＲ値よりも高くなっており、本実施形態のウェルプレート２００を用いると、上皮細胞のバリア機能が向上することが分かった。この理由について、以下のように推察される。
　比較例１、２では、培地の排出のたびにインサートをウェルからピンセットで持ち上げたために、インサートの振動やピンセットによる操作に起因してインサート内の細胞が刺激を受け、この刺激が繰り返された結果、バリア機能が低下した可能性があると考えられる。これに対し、実施例１、２では、インサートを取り外さずにウェル内の培地を排出したので、培地交換による細胞への影響が抑えられ、バリア機能の低下が抑制されたと推察される。また、各ウェル内にインサートが適切かつ安定的に保持されていたため、培地の排出時にウェルプレートを傾斜させても、ウェルプレートの傾斜によってインサート内の細胞はほとんど影響を受けなかった（受けたとしても、ピンセットによる操作と比べて極めて小さかった）と考えられる。さらに、実施例１、２では、培地交換操作がスムーズで交換に要する時間が短縮されたこと、ウェルの第２空間を利用して培地の供給およびＴＥＥＲ値測定を行ったことで、これらの操作による細胞への影響が比較例１、２よりも抑えられたと推察される。
　（評価結果）
　図１８（ａ）～（ｅ）は、実施例１、２および比較例１、２で分化させた上皮細胞におけるｍＲＮＡ発現解析結果を示す図である。図１８（ａ）～（ｅ）に示すように、実施例１のｍＲＮＡ発現量は比較例１と同程度であり、実施例２のｍＲＮＡ発現量は比較例２と同程度であった。
　図１９（ａ）～図１９（ｄ）は、実施例１、２および比較例１、２で分化させた上皮細胞における薬物代謝酵素活性の測定結果を示す図である。図１９（ａ）～（ｄ）に示すように、実施例１の各マーカーの代謝活性は比較例１の同程度であり、実施例２の各マーカーの代謝活性は比較例２と同程度であった。
　これらの評価結果から、本実施形態のウェルプレート２００を用いると、操作性を大幅に向上させつつ、市販のウェルプレートを用いる場合と同程度またはそれ以上の機能の細胞を培養可能であることが確認された。
　＜細胞培養実験２＞
　（実施例３）
　実施例３では、図１３および図１４に示す細胞培養基材(ウェルプレート）２００を準備した。次いで、ウェルプレート２００における２４個のウェルのそれぞれにＧｒｅｉｎｅｒ製インサートを配置した。
　続いて、ｈｉＰＳ細胞から分化させた三次元の腸管オルガノイドをシングルセル化して各インサートに播種し、フィーダーレス条件で腸管二次元オルガノイドへの分化誘導を行った。分化誘導のプロトコルは、本発明者による国際公開第２０２２／０９１０２０号に記載の方法に従った。参考のため、国際公開第２０２２／０９１０２０号の開示内容の全てを本明細書に援用する。basal側の培地量を８００μLとした。必要に応じて、例えば２４時間～３日に１回の頻度で培地交換を行った。また、播種後４日目からＴＥＥＲ値の測定を行った。培地交換およびＴＥＥＲ値測定は、上述した実施例１、２と同様の方法で行った。さらに、位相差顕微鏡による細胞表面の観察を行い、分化に伴う細胞表面の構造（絨毛様構造）の変化を調べた。播種後１０日目に培養実験を終了した。終了後、ｍＲＮＡ発現解析により、分化させた細胞の評価を行った。
　・ｍＲＮＡ発現解析
　上記方法で分化させた腸管オルガノイドについて、ＲＴ－ｑＰＣＲ法により、LGR5（腸管幹細胞のマーカー）、Villin１（吸収上皮細胞マーカー）、MUC2（杯細胞マーカー）、Lysozyme（腸管パネート細胞マーカー）、Ki67（増殖細胞マーカー）、CYP3A4（薬物代謝酵素）、MDR1（薬物トランスポーター）、ALB（成熟肝細胞分化マーカー）、OLFM4（小腸幹細胞マーカー）、CDX2（腸管上皮細胞の増殖・分化に関与している転写因子）の発現量を測定した。測定には、KAPA SYBR Fast qPCR Kitを用いた。
　（実施例４）
　basal側の培地量を１２００μLとした点以外は、実施例３と同様の方法で腸管二次元オルガノイドへの分化誘導および分化させた細胞の評価を行った。
　（比較例３）
　２４個のウェルを有する市販のＧｒｅｉｎｅｒ製ウェルプレートおよびＧｒｅｉｎｅｒ製インサートを用いた点、および培地交換方法以外は、実施例３と同様の方法で、腸管二次元オルガノイドへの分化誘導および分化させた細胞の評価を行った。比較例３では、比較例１と同様の方法で培地交換を行った。
　（細胞観察結果）
　図２０（ａ）～（ｃ）は、それぞれ、比較例３、実施例３および実施例４の播種後６日目の細胞表面の位相差顕微鏡像である。同様に、図２１（ａ）～（ｃ）～図２４（ａ）～（ｃ）は、それぞれ、播種後７日目～１０日目の比較例３、実施例３および実施例４の細胞表面の位相差顕微鏡像である。
　細胞表面の絨毛様構造における絨毛密度から、細胞の成熟度を判断することが可能である。同じ日の結果を比較すると、実施例３、４の細胞の絨毛密度が比較例３の細胞の絨毛密度よりも高く（絨毛が密に）なっており、実施例３、４の方が細胞の成熟が早く進んだことが分かる。また、例えば、比較例３の播種後１０日目の絨毛密度は、実施例３、４の播種後８～９日目の絨毛密度と同程度であった。このことから、実施例３、４の方が、比較例３よりも細胞が１～２日ほど早く成熟したことが分かる。
　したがって、本実施形態のウェルプレートを用いると、市販品のウェルプレートを用いた場合よりも細胞の成熟が促進されることが確認された。成熟が促進された理由は、以下のように推察される。
　比較例３では、培地の排出のたびにインサートをウェルからピンセットで持ち上げたために、インサートの振動やピンセットによる操作に起因して、インサート内の細胞が刺激を受け、細胞の成熟が遅れた可能性があると考えられる。これに対し、実施例３、４では、インサートを取り外さずにウェル内の培地を排出させたこと、培地交換がスムーズで交換に要する時間が短縮されたこと、ウェルの第２空間を利用して培地の供給およびＴＥＥＲ値測定を行ったことにより、細胞試験の各操作による細胞の成熟速度への影響が抑制されたからと推察される。また、各ウェル内にインサートが適切かつ安定的に保持されており、ウェルプレートを傾斜させることによる細胞の成熟速度への影響はほとんど見られなかったと考えられる。
　（ＴＥＥＲ値測定結果）
　図２５は、実施例３、４および比較例３の播種後４日目～１０日目までのＴＥＥＲ値の測定結果を示す図である。図２５に示すように、実施例３、４の細胞のＴＥＥＲ値は、比較例３の細胞のＴＥＥＲ値と同程度であった。
　なお、詳細には、実施例３、４では、比較例３よりもＴＥＥＲ値が若干低くなったが、これはバリア機能の低下を意味するものではない。腸管二次元オルガノイドにおいては、陰窩絨毛様構造が形成されると、ＴＥＥＲ値が低くなることが証明されており、生体ではＴＥＥＲ値が１００Ω・ｃｍ－２以下になることから、実施例３、４では、むしろ腸管二次元オルガノイドが生体により近い状態になっていると考えられる。
　（評価結果）
　図２６（ａ）～（ｊ）は、実施例３、４および比較例３で分化させた細胞について、各マーカーのｍＲＮＡ発現解析結果を示す図である。各図には、ＡＳＩの発現量を併せて示す。図２６（ａ）～（ｊ）に示すように、実施例３、４のｍＲＮＡ発現量は、比較例３と同程度であった。
　細胞培養実験２の評価結果から、本実施形態のウェルプレート２００を用いると、操作性を大幅に向上させつつ、市販のウェルプレートを用いる同程度またはそれ以上の速度で細胞を成熟させることが可能になることが確認された。
　上記実施例１～４では、培地交換を手動で行ったが、本発明者は別の細胞培養実験により、自動化装置を用いて自動で培地交換を実施し、操作性をさらに向上できることを確認した。自動化が可能になった主な要因として、本実施形態のウェルプレート２００を用いると、インサートをウェルから取り外さずに培地をウェルから排出可能であること、ウェルプレートを傾けてもインサートがウェル内に適切に保持されていることが挙げられる。さらに、本発明者は、培地交換を自動化しても培養された細胞の機能が、従来の細胞培養基材を用いて培養された細胞と同程度以上であることも確認した。
　本開示の細胞培養基材および細胞培養方法は、例えば以下のように表現することもできる。
［項目１］
　側面および底面を有する少なくとも１つのウェルを備える細胞培養基材であって、
　前記側面は、第１空間を画定する第１側部と、前記第１空間と連通する第２空間を画定する第２側部と、を含み、
　平面視において、
　　前記第１側部の上端部は、中心角が２４０度以上のＣ字状に形成され、
　　前記第２空間は、前記上端部の開口部分から、前記第１空間から離れる第１方向に延在し、
　　前記第２側部のうち前記開口部分と前記第１方向に対向する対向面は、前記開口部分と前記対向面との前記第１方向における最大距離が、前記上端部のＣ字の直径よりも小さくなる位置に配置されている、細胞培養基材。
［項目２］
　平面視において、前記第２側部の前記対向面は、前記第１方向に凸になるように滑らかに湾曲している、項目１に記載の細胞培養基材。
［項目３］
　前記底面は、第１空間を画定する第１底部と、前記第２空間を画定する第２底部と、を含み、前記第１底部と前記第２底部とは面一である、項目１または２に記載の細胞培養基材。
［項目４］
　前記底面は、少なくとも１つの溝を有し、
　前記少なくとも１つの溝は、前記第１側部に接する第１部分から、前記第２側部に接する第２部分まで連続する第１溝を含む、項目１から３のいずれかに記載の細胞培養基材。
［項目５］
　前記第１側部には、前記上端部の前記直径を、前記底面に接する下端部の直径よりも拡大させるように段差部が設けられており、平面視において、前記段差部は周方向に延在している、項目１から４のいずれかに記載の細胞培養基材。
［項目６］
　前記第１側部は、前記第１空間に、細胞培養容器を前記底面から距離を空けて支持するための支持構造を備える、項目１から５のいずれかに記載の細胞培養基材。
［項目７］
　平面視において、
　　前記少なくとも１つのウェルは、行方向および前記行方向に交差する列方向に配列された複数のウェルを含み、
　　前記複数のウェルのそれぞれにおける前記第１方向は、前記行方向および前記列方向のいずれとも交差する方向である、項目１から６のいずれかに記載の細胞培養基材。
［項目８］
　平面視において前記複数のウェルを包囲する外壁をさらに備え、
　前記複数のウェルは、前記行方向または前記列方向の端に位置する複数の外側ウェルを含み、
　前記複数の外側ウェルの前記側面を形成する側壁と、前記外壁との間には、水を収容するプール部が形成されており、前記プール部は、前記複数の外側ウェルと同数以上に分割されている、項目７に記載の細胞培養基材。
［項目９］
　項目１から８のいずれかに記載の細胞培養基材と、
　前記少なくとも１つのウェルの前記第１空間に、前記底面から離隔して着脱可能に収容された細胞培養容器と、
を用いて、前記細胞培養容器内で細胞を培養する細胞培養方法であって、
　前記少なくとも１つのウェル内に保持された培地の一部または全部を排出する排出工程を含み、前記排出工程は、
　　　前記第１空間に前記細胞培養容器を収容した状態で前記細胞培養基材を傾けて、前記第１空間に位置する培地を、前記開口部分を介して前記第２空間に移動させる培地移動工程と、
　　　前記第２空間に排出管を挿入し、前記第２空間に位置する培地を、前記排出管を介して、前記少なくとも１つのウェルから排出する工程と、
を含む、細胞培養方法。
　なお、本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、その他種々の態様で実施できる。複数のウェルを備えた細胞培養基材においては、少なくとも一部のウェルが上述したような構造を有していればよい。本発明の細胞培養基材は、開放系および閉鎖系のいずれの形態にも適用され得る。また、培地交換等の作業を手動で行う場合だけでなく、培地交換を自動で行う自動細胞培養装置にも使用され得る。
　本発明に係る細胞培養基材は、培養細胞への影響を抑えつつ、培地の交換や排出を行うことができるので、例えば、医薬品産業、美容品産業、および食品産業等の用途に有用である。
　　１０　側面
　　１１　第１側部
　　１１ａ　第１側部の上端部
　　１１ｂ　第１側部の下端部
　　１１ｃ　段差面
　　１１ｐ　上端部の開口部分
　　１２　第２側部
　　１２ｆ　対向面
　　２０　底面
　　２１　第１底部
　　２１ａ　観察面
　　２２　第２底部
　　３１、３２、３３　溝
　　４０　支持構造
　　４１　支持リブ
　　４２　誤挿入防止リブ
　　４３　回転防止リブ
　　４４　切り欠き部
　　５１　側壁
　　５２　底壁
　　５３　外壁
　　６０、６０ａ　インサート
　　７０　細胞
　　７１、７２　培地
　　８０　ピペット
　　９０　プール部
　　１００　ウェル
　　１０１　外側ウェル
　　２００、２００ａ　細胞培養基材
　　Ｄａ　第１側部の上端部の直径
　　Ｅ１　第１方向
　　Ｅ２　第２方向
　　Ｓｇ　インサートと第１側部との隙間
　　Ｓ１　第１空間
　　Ｓ２　第２空間

Claims (9)

  1. 　側面および底面を有する少なくとも１つのウェルを備える細胞培養基材であって、
    　前記側面は、第１空間を画定する第１側部と、前記第１空間と連通する第２空間を画定する第２側部と、を含み、
    　平面視において、
    　　前記第１側部の上端部は、中心角が２４０度以上のＣ字状に形成され、
    　　前記第２空間は、前記上端部の開口部分から、前記第１空間から離れる第１方向に延在し、
    　　前記第２側部のうち前記開口部分と前記第１方向に対向する対向面は、前記開口部分と前記対向面との前記第１方向における最大距離が、前記上端部のＣ字の直径よりも小さくなる位置に配置されている、細胞培養基材。
  2. 　平面視において、前記第２側部の前記対向面は、前記第１方向に凸になるように滑らかに湾曲している、請求項１に記載の細胞培養基材。
  3. 　前記底面は、前記第１空間を画定する第１底部と、前記第２空間を画定する第２底部と、を含み、前記第１底部と前記第２底部とは面一である、請求項１または２に記載の細胞培養基材。
  4. 　前記底面は、少なくとも１つの溝を有し、
    　前記少なくとも１つの溝は、前記第１側部に接する第１部分から、前記第２側部に接する第２部分まで連続する第１溝を含む、請求項１または２に記載の細胞培養基材。
  5. 　前記第１側部には、前記上端部の前記直径を、前記底面に接する下端部の直径よりも拡大させるように段差部が設けられており、平面視において、前記段差部は周方向に延在している、請求項１または２に記載の細胞培養基材。
  6. 　前記第１側部は、前記第１空間に、細胞培養容器を前記底面から距離を空けて支持するための支持構造を備える、請求項１または２に記載の細胞培養基材。
  7. 　平面視において、
    　　前記少なくとも１つのウェルは、行方向および前記行方向に交差する列方向に配列された複数のウェルを含み、
    　　前記複数のウェルのそれぞれにおける前記第１方向は、前記行方向および前記列方向のいずれとも交差する方向である、請求項１または２に記載の細胞培養基材。
  8. 　平面視において前記複数のウェルを包囲する外壁をさらに備え、
    　前記複数のウェルは、前記行方向または前記列方向の端に位置する複数の外側ウェルを含み、
    　前記複数の外側ウェルの前記側面を形成する側壁と、前記外壁との間には、水を収容するプール部が形成されており、前記プール部は、前記複数の外側ウェルと同数以上に分割されている、請求項７に記載の細胞培養基材。
  9. 　請求項１または２に記載の細胞培養基材と、
    　前記少なくとも１つのウェルの前記第１空間に、前記底面から離隔して着脱可能に収容された細胞培養容器と、
    を用いて、前記細胞培養容器内で細胞を培養する細胞培養方法であって、
    　前記少なくとも１つのウェル内に保持された培地の一部または全部を排出する排出工程を含み、前記排出工程は、
    　　　前記第１空間に前記細胞培養容器を収容した状態で前記細胞培養基材を傾けて、前記第１空間に位置する培地を、前記開口部分を介して前記第２空間に移動させる培地移動工程と、
    　　　前記第２空間に排出管を挿入し、前記第２空間に位置する培地を、前記排出管を介して、前記少なくとも１つのウェルから排出する工程と、
    を含む、細胞培養方法。
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