WO2023219300A1 - 신규한 클로렐라 불가리스 균주 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 클로렐라 불가리스 균주 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023219300A1
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strain
skin
culture
extract
chlorella vulgaris
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권민정
이소영
진무현
황성환
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LG Household and Health Care Ltd
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    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Definitions

  • the present invention relates to a Chlorella vulgaris strain deposited with deposit number KCTC14768BP; and a cosmetic composition, quasi-drug composition, or food composition for skin improvement comprising any one or more of a strain, a culture of the strain, a fermentation product of the strain, a culture medium of the strain, an extract of the strain, and a lysate of the strain; A skin improvement method using the composition; It is for use in improving skin.
  • Microalgae are the oldest living organisms on Earth and the basis of the ecosystem that produces 50% of the Earth's oxygen. It contains more than 50% protein based on dry matter and is rich in various biologically active substances such as carotenoids, vitamins, and chlorophyll, so it has been loved as a health functional food for a long time. It has also been selected as a super food and future food, and continues to be researched and demanded by consumers. is expected to rise further.
  • land plants which are the main material for natural product research, require labor, time, and farmland for cultivation, microalgae have the characteristic of being able to be permanently preserved and utilized through isolation and culture.
  • Cosmetic ingredients are generally known to cause various skin problems such as inflammation, rashes, and swelling.
  • various substances used as raw materials for functional cosmetics also have problems of low stability or insignificant effect on the skin.
  • retinoids, adenosine, and animal placenta-derived proteins are known as cosmetics for improving skin wrinkles and elasticity.
  • Retinol the most widely known, has usage limits due to safety issues such as irritation when applied to the skin.
  • the present inventors conducted research on raw materials from natural resources that are safer and have excellent skin improvement effects, and completed the present invention by confirming that Chlorella vulgaris, a microalgae, has a significantly superior skin improvement effect.
  • the purpose of the present invention is to provide a Chlorella vulgaris strain deposited with deposit number KCTC14768BP.
  • Another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for skin improvement comprising any one or more of the strain, the culture of the strain, the fermentation product of the strain, the culture medium of the strain, the extract of the strain, and the lysate of the strain. will be.
  • Another object of the present invention is to provide a quasi-drug composition for skin improvement comprising any one or more of the strain, the culture of the strain, the fermentation product of the strain, the culture medium of the strain, the extract of the strain, and the lysate of the strain. It is done.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for skin improvement comprising any one or more of a strain, a culture of the strain, a fermented product of the strain, a culture fluid of the strain, an extract of the strain, and a lysate of the strain.
  • Another object of the present invention is any one of the Chlorella vulgaris strain deposited with the deposit number KCTC14768BP, the culture of the strain, the fermentation product of the strain, the culture medium of the strain, the extract of the strain, and the lysate of the strain.
  • a skin improvement method comprising the step of applying or administering a composition containing the above as an active ingredient to an object.
  • Another object of the present invention is any one of the Chlorella vulgaris strain deposited with the deposit number KCTC14768BP, the culture of the strain, the fermentation product of the strain, the culture medium of the strain, the extract of the strain, and the lysate of the strain.
  • the aim is to provide a use for skin prevention or improvement of a composition containing the above as active ingredients.
  • Chlorella vulgaris strain of the present invention and the culture, fermentation product, culture medium, extract or lysate of the strain have excellent skin improvement effects, and are therefore highly utilized as skin improvement cosmetic compositions, quasi-drug compositions, and food compositions. Accordingly, various industrial applications such as cosmetics, quasi-drugs, and food can be expected.
  • One aspect of the present invention provides a Chlorella vulgaris strain deposited with deposit number KCTC14768BP.
  • Chlorella vulgaris in the present invention refers to green microalgae belonging to the genus Chlorella, a green algae plant that has existed on Earth since the Precambrian period. Chlorella vulgaris is rich in nutrients such as chlorophyll as well as proteins, vitamins, and minerals, and is used as an additive, colorant, or food emulsion, but is not widely used as a food due to its unpleasant smell.
  • the present inventors isolated a new strain belonging to Chlorella vulgaris, named it Chlorella vulgaris LGHNH20483, and deposited it under deposit number KCTC14768BP. The strain may be isolated from Ulleungdo spring water, but is not limited thereto.
  • the strain not only has skin improvement effects such as antioxidant, whitening, anti-aging, skin elasticity improvement, microbiome improvement, skin moisturizing, skin soothing, inflammation improvement, and skin barrier strengthening, but also compared to other Chlorella vulgaris strains. It has excellent skin improvement effects. Based on the skin improvement effect of the strain deposited as KCTC14768BP, it can be used to develop cosmetics, quasi-drugs, food, etc.
  • Another aspect of the present invention is skin improvement comprising any one or more of the strain deposited as KCTC14768BP, the culture of the strain, the fermentation product of the strain, the culture medium of the strain, the extract of the strain, and the lysate of the strain.
  • strain refers to a collection of individuals derived from a single cell, proliferated through asexual reproduction, and having the same genetic characteristics. Within a species, genetic characteristics are not present. Several different genetic variants exist. In the present invention, the strain refers to Chlorella vulgaris, and may specifically be Chlorella vulgaris deposited under deposit number KCTC14768BP, but is not limited thereto.
  • the strain may include cells, dried cells, etc. of the Chlorella vulgaris strain.
  • the dried bacteria may be dried bacteria such as spray-dried bacteria, freeze-dried bacteria, vacuum-dried bacteria, or drum-dried bacteria.
  • the term “culture” refers to a product obtained by culturing the above strain in a medium.
  • the culture of the present invention may include components remaining in the culture medium of Chlorella vulgaris after harvesting the strain, or may include components of the culture medium containing the strain.
  • “Culture medium” of the present invention refers to the part of the culture excluding the strain.
  • the culture medium of the present invention may include a culture supernatant excluding the above-mentioned strain after centrifugation in a culture medium of Chlorella vulgaris, or a portion of the culture supernatant excluding the lysate.
  • the culture may be the Chlorella vulgaris strain, a total culture of the strain, a culture medium, or fractions thereof.
  • the culture medium may be a culture supernatant of the Chlorella vulgaris strain.
  • the culture supernatant can be obtained by centrifuging the culture of the strain, and the fraction can be obtained by subjecting the strain, the culture, culture supernatant, etc. to methods such as centrifugation and chromatography.
  • the medium and other culture conditions used for cultivating the strain of the present invention can be any medium used for cultivating ordinary Chlorella microorganisms without particular limitation, and specifically, the strain of the present invention can be cultured with an appropriate carbon source, nitrogen source, and personnel. , can be cultured under aerobic or anaerobic conditions in a conventional medium containing inorganic compounds, amino acids, and/or vitamins, while controlling temperature, pH, etc.
  • the carbon source includes carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, maltose, etc.; Sugar alcohols such as mannitol, sorbitol, etc., organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid, etc.; Amino acids such as glutamate, methionine, lysine, etc. may be included, but are not limited thereto.
  • natural organic nutrient sources such as starch hydrolyzate, molasses, blackstrap molasses, rice bran, cassava, bagasse and corn steep liquor can be used, as well as glucose and pre-sterilized molasses (i.e. molasses converted to reducing sugars).
  • Carbohydrates such as the like can be used, and various other carbon sources in appropriate amounts can be used without limitation. These carbon sources may be used individually or two or more types may be used in combination.
  • the nitrogen source includes inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate; Organic nitrogen sources such as amino acids, peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or its decomposition products, defatted soybean cake or its decomposition products, etc. can be used. These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more types, but are not limited thereto.
  • the agent may include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, or a corresponding sodium-containing salt.
  • Inorganic compounds include sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, and calcium carbonate.
  • the medium may contain amino acids, vitamins, and/or appropriate precursors.
  • L-amino acids, etc. may be added to the culture medium of the strain.
  • glycine, glutamate, and/or cysteine may be added, and if necessary, L-amino acids such as lysine may be added, but are not necessarily limited thereto. No.
  • the medium or precursor may be added to the culture or culture medium in a batch or continuous manner, but is not limited thereto.
  • the pH of the culture or culture medium can be adjusted by adding compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid, etc. to the culture or culture medium in an appropriate manner during cultivation of the strain. Additionally, during culturing, foam generation can be suppressed by using an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester.
  • an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester.
  • oxygen or oxygen-containing gas can be injected into the culture or culture medium, or nitrogen, hydrogen, or carbon dioxide gas can be injected without gas injection to maintain the anaerobic and microaerobic state. You can.
  • the term “fermented product” refers to a strain obtained by cultivating a microorganism in a medium for a certain period of time, a medium containing its metabolites, extra nutrients, etc., and a culture solution obtained by removing the strain from the medium, which is a dilution of the medium or culture solution. It may contain water, concentrate, or dried products thereof.
  • the term “fermentation” means that it is not a putrefaction reaction during the process in which microorganisms decompose organic matter using their own enzymes.
  • the method of obtaining the fermented product from the strain is not particularly limited, and can be obtained according to a method commonly used in the relevant technical field or similar fields.
  • the fermented product obtained from the strain is not only the fermented material itself, but also the culture medium of the strain in which the strain and the culture coexist, the fermented product obtained by filtering the strain from the culture medium, and the strain by centrifuging the culture medium.
  • Supernatant excluding, fermented product obtained by sterilizing the strain from the culture medium and filtering it, extract obtained by extracting the fermented product or the culture medium containing it, diluted solution of the fermented product or extract thereof, and drying the fermented product or extract thereof. It includes all types of materials including fermented products generated from the strain, such as dried material and lysate obtained by collecting and crushing the bacterial cells of the strain.
  • the concentration of the Chlorella vulgaris fermented product may be 0.01% to 100%, specifically 0.03% to 30%, and more specifically 0.05% to 10%, but is not limited thereto.
  • extract refers to a liquid component obtained by immersing the desired material in various solvents and then extracting it at room temperature, low temperature, or heated state for a certain period of time, and a solid content obtained by removing the solvent from the liquid component. means.
  • it can be comprehensively interpreted to include all dilutions of the results, concentrates thereof, crude preparations, purifications, etc. of the above results.
  • the Chlorella vulgaris extract provided by the present invention is an extract obtained by extraction treatment, a diluted or concentrated liquid of the extract, a dried product obtained by drying the extract, a crude product or purified product of the extract, or a mixture thereof, etc. It can be interpreted to include the extract itself and all types of extracts that can be formed using the extract.
  • the method for extracting Chlorella vulgaris of the present invention is not particularly limited, and can be extracted according to methods commonly used in the art.
  • Non-limiting examples of the extraction method include hot water extraction, ultrasonic extraction, filtration, and reflux extraction, which may be performed alone or by combining two or more methods.
  • the type of solvent used for the extraction is not particularly limited, and any solvent known in the art can be used.
  • Non-limiting examples of the extraction solvent include water, C1 to C4 lower alcohols, ether, ethyl acetate, glycerin, butylene glycol, propylene glycol, methyl acetate, ethyl acetate, chloroform, acetone, benzene, hexane, diethyl ether, and Dichloromethane or mixed solvents thereof may be used, and these may be used alone or in combination of two or more types, and specifically, water may be used.
  • alcohol is used as a solvent, alcohol having 1 to 4 carbon atoms can be specifically used.
  • the extract may be an extract of the culture, fermentation, culture medium, lysate, or strain (pellet). Specifically, it may be an extract obtained by centrifuging the culture, removing the supernatant, and concentrating the strain under reduced pressure. It is not limited to this.
  • the concentration of the Chlorella vulgaris extract may be 0.001% to 30%, specifically 0.001% to 15%, and more specifically 0.001% to 10%, but is not limited thereto.
  • a composition containing the Chlorella vulgaris strain deposited as KCTC14768BP of the present invention, a culture, fermentation product, broth, extract, lysate, or combination thereof of the strain may be used to treat other Chlorella vulgaris strains, its culture, fermentation product, culture broth, extract, or It has an excellent skin improvement effect compared to compositions containing crushed substances.
  • the term “shatter” refers to a substance obtained by physically or chemically treating the strain itself, high-pressure sterilization, or ultrasonic treatment, or by crushing a supernatant, fermentation product, or culture solution obtained by centrifuging a culture of the strain. may, but is not limited to this.
  • skin improvement may be any one or more selected from the group consisting of antioxidant, whitening, anti-aging, skin elasticity improvement, microbiome improvement, skin moisturization, skin soothing, inflammation improvement, and skin barrier strengthening, It is not limited to this.
  • the term “improvement” refers to any action that at least reduces the severity of symptoms, such as antioxidant, whitening, anti-aging, improving skin elasticity, improving microbiome, etc., parameters related to the alleviation or treatment of the condition. It may include one or more of skin moisturizing, skin soothing, inflammation improvement, and skin barrier strengthening.
  • the skin improvement includes increased radical scavenging, reduced melanin pigment content, increased tyrosinase activity, promotion of collagen synthesis, increased growth of beneficial bacteria, inhibition of growth of harmful bacteria, increased expression of aquaporin 3 (AQP3), inhibition of NO production, and involucrine ( This may be achieved through increased expression of IVL) and increased expression of loricrin (LOR), but is not limited to this.
  • antioxidant in the present invention refers to the inhibition of oxidation, and is a concept that often appears when explaining the cellular aging process and preventive methods.
  • cellular aging means oxidation of cells
  • active oxygen which is excess oxygen that is harmful to the body, is generated. do.
  • Free radicals attack normal cells in the body, causing aging and various diseases. Therefore, removing these active oxygen radicals is a way to prevent oxidation (aging) of cells, which means suppressing oxidation of these cells.
  • antioxidant activity may be due to increased radical scavenging activity, but is not limited thereto.
  • the term “radical” refers to an atom or molecule with one unpaired electron. Active oxygen radicals have excellent chemical reactivity, and the free radicals induced by them affect various reactions in the living body and cause aging. Living organisms are always exposed to harmful substances caused by free radicals, and as cells age, harmful substances gradually accumulate, causing various diseases. Therefore, free radical inhibition plays an important role in the antioxidant effect.
  • the increase in radical scavenging activity may be due to the Chlorella vulgaris strain, the culture of the strain, the fermentation product of the strain, the culture medium of the strain, the extract of the strain, the lysate of the strain, or a mixture thereof, and the present invention
  • the composition may have an antioxidant effect due to the radical scavenging activity.
  • the radical scavenging activity effect of the Chlorella vulgaris extract according to the present invention is superior to the conventionally known Chlorella vulgaris comparative strain AG10002 extract, and through this, the Chlorella vulgaris extract of the present invention has significant antioxidant properties compared to the comparative strain extract. It was confirmed that it was effective (Table 1).
  • whitening refers to a method of increasing the brightness of skin whose brightness has been reduced due to excessive pigment such as melanin or maintaining the brightness of the skin at a certain level, skin with increased brightness formed by the above method, etc. It is meant to encompass, and may specifically mean skin whitening.
  • skin whitening can be understood as a result of inhibition of tyrosinase activity. Specifically, as tyrosinase activity is inhibited, melanin production is inhibited, causing symptoms resulting from an increase in melanin, such as spots and freckles. It can be understood as an improvement.
  • melanin in the present invention refers to melanin, which is one of the pigments commonly found in nature and has a dark brown or black color. Skin color is determined by the amount of melanin. The greater the amount of melanin, the darker the skin color. It is synthesized from tyrosine, one of the amino acids, and is made of a polyphenol polymer, forming a very stable structure. Because of these structural characteristics, it has resistance to heat and chemicals, antioxidant ability, and radiation such as ultraviolet rays.
  • tyrosinase is an oxidative enzyme that regulates the production of melanin. It can be found in melanosomes, which are synthesized in melanocytes in the skin.
  • the reduction in melanin pigment content and/or the increase in tyrosinase activity is achieved by Chlorella vulgaris strain, culture of the strain, fermentation product of the strain, culture medium of the strain, extract of the strain, lysate of the strain, or these. It may be a mixture, and the composition of the present invention may have a whitening effect by reducing the melanin pigment content and/or increasing tyrosinase activity.
  • the reduction in melanin pigment content and/or the increase in tyrosinase activity of the Chlorella vulgaris fermented product according to the present invention is superior to the fermented product of the previously known Chlorella vulgaris comparison strain AG10002, through which the Chlorella vulgaris fermented product of the present invention It was confirmed that the fermented product had a significant effect on whitening, etc. compared to the fermented product of the comparative strain (Table 2).
  • aging refers to the phenomenon of decline in biological structure and function over time
  • anti-aging refers to the prevention, inhibition, delay, etc. of aging, and the extent to which aging is improved. Not limited.
  • the anti-aging may include, but is not limited to, improving skin elasticity, skin regeneration, and wrinkle improvement.
  • skin elasticity refers to the force that holds the skin taut when pressed with a finger
  • elasticity improvement or “elasticity enhancement” refers to increasing the elasticity of the skin by strengthening the subcutaneous fat layer structure of the subject, This may mean increasing skin elasticity using the composition of the present invention.
  • anti-aging and elasticity improvement may be due to stimulation of collagen synthesis, but is not limited thereto.
  • Collagen is a fibrous protein found in abundance in most animals, especially mammals, it makes up most of all connective tissues in the body, such as skin and cartilage, and fibroblasts are the most common cells in the body. (fibroblasts) produce and secrete collagen.
  • Gelatin which is widely used in cooking, food, and the pharmaceutical industry, is made by irreversibly hydrolyzing collagen. A decrease in collagen is the main cause of wrinkles and reduced skin elasticity, so collagen synthesis is essential for improving wrinkles and improving elasticity.
  • the promotion of collagen synthesis may be caused by the Chlorella vulgaris strain, the culture of the strain, the fermentation product of the strain, the culture medium of the strain, the extract of the strain, the lysate of the strain, or a mixture thereof,
  • the composition may have the effect of improving skin elasticity by promoting collagen synthesis.
  • the effect of promoting collagen synthesis of the fermented product of Chlorella vulgaris according to the present invention was superior to that of the fermented product of the comparative strain AG10002.
  • the fermented product of Chlorella vulgaris according to the present invention was found to have anti-aging and skin properties compared to the fermented product of the comparative strain. It was confirmed that there was a significant effect in improving elasticity (Table 3).
  • microbiome refers to the entire genetic information of microorganisms inhabiting the human body or the microorganisms themselves. Microbiota and genome are microorganisms that inhabit and coexist in the human body. ) is a compound word of
  • microbiome improvement of the present invention can be used interchangeably with maintaining microbiome balance, and refers to maintaining the microbiome balance, improving the microbiome by promoting the growth of beneficial bacteria while suppressing the growth of harmful bacteria. Balance can be maintained, and if the microbiome balance is disrupted, the skin barrier becomes weak, making it easier for harmful microorganisms to proliferate. Specifically, microbiome improvement may be due to increased growth of beneficial bacteria and/or inhibition of growth of harmful bacteria, but is not limited thereto.
  • beneficial bacteria refers to strains that help maintain skin homeostasis by enhancing skin defense by enhancing the skin regeneration effect and promoting skin regeneration by destroying (killing) the cell membrane and inhibiting the growth of harmful bacteria. it means.
  • the beneficial bacteria may be, for example, Staphylococcus epidermidis, but are not limited thereto.
  • harmful bacteria refers to bacteria that cause inflammatory reactions or acne on the skin.
  • the harmful bacteria may be, for example, Staphylococcus aureus, but are not limited thereto.
  • increasing the growth rate of beneficial bacteria and/or inhibiting the growth rate of beneficial bacteria is a Chlorella vulgaris strain, a culture of the strain, a fermentation product of the strain, a culture solution of the strain, an extract of the strain, a lysate of the strain, or a mixture thereof. It may be a mixture, and the composition of the present invention may have a microbiome improvement effect by increasing the growth of beneficial bacteria and/or inhibiting the growth of harmful bacteria.
  • the Chlorella vulgaris fermented product according to the present invention increases the growth rate of beneficial bacteria compared to the comparative strain AG10002 fermented product, while suppressing the growth of harmful bacteria, so that the Chlorella vulgaris fermented product according to the present invention is compared to the comparative strain AG10002 fermented product. It was confirmed that it had a significant effect on improving the microbiome compared to the previous study (Table 4, Table 5).
  • skin moisturizing in the present invention refers to all actions that supply moisture to the skin or block evaporation of moisture to maintain the skin's flexibility and induce uniform exfoliation to maintain a smooth surface, and "dry” This refers to a condition in which skin moisturization is insufficient.
  • the skin moisturizing effect can help improve skin wrinkles and increase elasticity.
  • skin moisturization may be due to increased expression of aquaporin 3 (AQP3), but is not limited thereto.
  • Aquaporin 3 is an integral membrane protein that forms a channel in the cell membrane and induces passive transport of water molecules, it selectively allows water molecules to pass through while restricting the movement of other substances.
  • the increased expression of Aquaporin 3 may be due to the Chlorella vulgaris strain, the culture of the strain, the fermentation product of the strain, the culture medium of the strain, the extract of the strain, the lysate of the strain, or a mixture thereof,
  • the composition of the present invention may have a skin moisturizing effect by increasing the expression of Aquaporin 3.
  • skin soothing in the present invention means alleviating and soothing erythema or irritated skin areas, etc., and may be a concept that includes alleviating skin irritation. Examples include, but are not limited to, reducing moisture loss and/or reducing redness of the skin.
  • inflammation is a kind of in vivo response to damage or infection of a specific tissue, the main mediator is immune cells.
  • the purpose of this inflammation is to minimize tissue damage, eliminate infectious agents, and regenerate tissues.
  • skin soothing and anti-inflammation may be due to inhibition of NO production, but are not limited thereto.
  • NO nitric oxide, nitrous acid
  • iNOS inducible nitric oxide
  • Synthetic enzyme increases, producing a large amount of NO, and excessively produced NO causes tissue damage, genetic mutation, and nerve damage, and increases vascular permeability, promoting inflammatory reactions such as edema. While NO production increases in inflammation-induced cells, NO production is suppressed when the skin is calmed, so there is an essential correlation between these.
  • NO production inhibition may be caused by the Chlorella vulgaris strain, the culture of the strain, the fermentation product of the strain, the culture medium of the strain, the extract of the strain, the lysate of the strain, or a mixture thereof, of the present invention.
  • the composition may have a skin soothing and inflammation improving effect by suppressing NO production.
  • the NO production inhibition effect of the fermented Chlorella vulgaris product according to the present invention was superior to that of the fermented product of the comparative strain AG10002, through which the fermented Chlorella vulgaris product of the present invention soothed the skin and improved inflammation compared to the fermented product of the comparative strain. It was confirmed that the effect was excellent (Table 7).
  • skin barrier in the present invention refers to all functions of the skin, especially the stratum corneum of the epidermis, that serve as a barrier layer to the outside, such as preventing moisture outflow to the outside and controlling the entry and exit of substances from the outside.
  • skin barrier strengthening may be due to increased expression of involucrin (IVL) and loricrin (LOR), but is not limited thereto.
  • involucrin (IVL) and “loricrin (LOR)” are structural proteins of keratinocyte formation present in keratinocytes, and the protein outer membrane constituent protein is a lipid outside the keratinocytes. By forming a covalent bond with , it plays an important role in creating a brick structure in the skin barrier.
  • the increased expression of involucrin or loricrin is caused by the Chlorella vulgaris strain, the culture of the strain, the fermentation product of the strain, the culture medium of the strain, the extract of the strain, the lysate of the strain, or a mixture thereof.
  • the composition of the present invention may have a skin barrier strengthening effect by increasing the expression of involucrin or loricrin.
  • cosmetic composition refers to a solution, external ointment, cream, foam, nutritional lotion, softening lotion, perfume, pack, softening water, emulsion, makeup base, essence, soap, liquid cleanser, bath salt, sunscreen cream, It may be a formulation selected from the group consisting of sun oils, suspensions, emulsions, pastes, gels, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansers, oils, powder foundations, emulsion foundations, wax foundations, patches and sprays. , but is not limited to this.
  • the cosmetic composition of the present invention may further include one or more cosmetically acceptable carriers that are blended with general skin cosmetics, and common ingredients include, for example, oil, water, surfactant, moisturizer, lower alcohol, thickener, Chelating agents, pigments, preservatives, fragrances, etc. may be appropriately mixed, but are not limited thereto.
  • Cosmetically acceptable carriers included in the cosmetic composition of the present invention vary depending on the formulation of the cosmetic composition.
  • the carrier ingredients include animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, and oxidation.
  • Zinc, etc. may be used, but are not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more types.
  • a solvent, solubilizing agent, or emulsifying agent may be used as a carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, Propylene glycol, 1,3-butyl glycol oil, etc. can be used, especially cottonseed oil, peanut oil, corn germ oil, olive oil, castor oil and sesame oil, glycerol aliphatic esters, polyethylene glycol or fatty acid esters of sorbitan. may be used, but is not limited thereto. These may be used singly or two or more types may be used.
  • the carrier components include water, liquid diluents such as ethanol or propylene glycol, suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, and miso.
  • Crystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar, or tracant may be used, but are not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more types.
  • the formulation of the present invention is a soap
  • alkali metal salts of fatty acids fatty acid hemiester salts, fatty acid protein hydrolyzates, isethionates, lanolin derivatives, fatty alcohols, vegetable oils, glycerol, sugars, etc.
  • carrier ingredients alkali metal salts of fatty acids, fatty acid hemiester salts, fatty acid protein hydrolyzates, isethionates, lanolin derivatives, fatty alcohols, vegetable oils, glycerol, sugars, etc.
  • these may be used alone or in combination of two or more types.
  • lactose When the formulation of the present invention is a powder or spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silcate, polyamide powder, or mixtures thereof may be used as the carrier ingredient, and especially in the case of a spray, chloro May contain propellants such as fluorohydrocarbons, propane/butane or dimethyl ether.
  • propellants such as fluorohydrocarbons, propane/butane or dimethyl ether.
  • composition of the present invention may be included in the composition of the present invention within a range that does not exceed the maximum usage level specified in the Regulations on Cosmetic Safety Standards, etc. and the Chinese 'Cosmetic Safety and Technology Code'.
  • Another aspect of the present invention is a quasi-drug composition for skin improvement comprising any one or more of the strain, the culture of the strain, the fermentation product of the strain, the culture medium of the strain, the extract of the strain, and the lysate of the strain. to provide.
  • quasi-drug of the present invention refers to body cleanser, disinfectant cleaner, detergent, kitchen cleaner, cleaning agent, toothpaste, mouthwash, wet tissue, detergent, soap, hand wash, hair cleaner, hair softener, humidifier filler, mask, ointment, and It may be selected from the group consisting of filter fillers, but is not limited thereto.
  • the quasi-drug composition of the present invention may further include pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or diluents as needed.
  • the pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent is not limited as long as it does not impair the effect of the present invention, and includes, for example, fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, lubricants, sweeteners, fragrances, preservatives, etc. It can be included.
  • Representative examples of pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, maltitol, starch, gelatin, glycerin, gum acacia, alginate, calcium phosphate, calcium. Carbonate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methyl hydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil. , injectable esters, Wethepsol, Macrogol, Tween 61, Kakaoji, Lauridge, etc.
  • the culture, fermentation product, culture medium, extract or lysate of the strain may additionally contain one or more active ingredients showing the same or similar function.
  • it may include ingredients known to promote beneficial skin bacteria, inhibit harmful skin bacteria, soothe the skin, improve skin inflammation, whiten the skin, regenerate the skin, and heal wounds.
  • the composition of the present invention has antioxidant, whitening, anti-aging, improvement of skin elasticity, improvement of microbiome, skin moisturization, skin soothing, inflammation improvement, and skin The barrier strengthening effect could be further increased.
  • the quasi-drug composition of the present invention includes skin anti-aging ingredients known in the art, such as retinoic acid, TGF, protein derived from animal placenta, betulinic acid, and chlorella extract;
  • skin anti-aging ingredients known in the art include non-steroidal flufenamic acid, ibuprofen, benzydamine, indomethacin, prednisolone, dexamethasone, allantoin, Azn, hydrocortisone; and one or two or more ingredients selected from the group consisting of their derivatives and various plant extracts.
  • Additional ingredients may be included in an amount of 0.0001% to 10% by weight based on the total weight of the composition, and the content range is determined when formulating skin safety, the strain of the present invention, the culture of the strain, the fermentation product, the culture broth, the extract, or the lysate. It may be adjusted according to requirements such as ease of use.
  • the formulation method, dosage, usage method, components, etc. of the quasi-drug may be appropriately selected from common techniques known in the technical field.
  • Another aspect of the present invention is a food composition for skin improvement comprising any one or more of the strain, the culture of the strain, the fermentation product of the strain, the culture medium of the strain, the extract of the strain, and the lysate of the strain. to provide.
  • “food” refers to meat, sausages, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages, It includes all foods in the conventional sense such as vitamin complexes and health functional foods, and includes Chlorella vulgaris of the present invention, a culture of the strain, a fermentation product of the strain, a culture solution of the strain, an extract of the strain, and lysate of the strain. It is not limited thereto, as long as it can include.
  • the strain according to the present invention, the culture, fermentation product, culture medium, extract, and crushed material of the strain can be added to juice, tea, jelly, juice, etc. as main ingredients, and can be used in pills, powders, granules, and preparations. , may include forms such as tablets, capsules, or liquid.
  • the above-mentioned functional food is the same term as food for special health use (FoSHU), and is a medicine processed to efficiently exhibit bioregulatory functions in addition to nutritional supply, with high medical effects. It means food.
  • “function” means adjusting nutrients to the structure and function of the human body or obtaining useful effects for health purposes, such as physiological effects.
  • the food of the present invention can be manufactured by methods commonly used in the industry, and can be manufactured by adding raw materials and ingredients commonly added in the industry. Additionally, the food formulation can be manufactured without limitation as long as it is a formulation recognized as a food.
  • the food composition of the present invention can be manufactured in various forms, and unlike general drugs, it is made from food as a raw material and has the advantage of not having side effects that may occur when taking the drug for a long period of time. It is also excellent in portability, and the present invention Foods can be consumed as supplements to enhance immunity.
  • health food refers to food that has a more active effect of maintaining or promoting health compared to general food
  • health supplement food refers to food for the purpose of health supplementation.
  • health functional food, health food, and health supplement are used interchangeably.
  • the health functional food is any one or more of Chlorella vulgaris, the culture of the strain, the fermentation product of the strain, the culture fluid of the strain, the extract of the strain, and the lysate of the strain into beverages, teas, spices, gum, and confectionery. It is a food manufactured by adding it to food materials, such as encapsulation, powdering, suspension, etc., and when ingested, it has a specific health effect. However, unlike general drugs, it is made from food as a raw material and can be taken for a long period of time. It has the advantage of not causing any side effects.
  • composition may further include a physiologically acceptable carrier.
  • a physiologically acceptable carrier is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art can be used.
  • the composition may contain additional ingredients that are commonly used in food compositions to improve odor, taste, vision, etc.
  • additional ingredients may include vitamins A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, niacin, biotin, folate, pantothenic acid, etc.
  • minerals such as zinc (Zn), iron (Fe), calcium (Ca), chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn), copper (Cu), and chromium (Cr).
  • it may contain amino acids such as lysine, tryptophan, cysteine, and valine.
  • composition contains preservatives (potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, sodium dehydroacetate, etc.), disinfectants (bleaching powder, high bleaching powder, sodium hypochlorite, etc.), and antioxidants (butylhydroxyanisole (BHA), butylhydroxyanisole).
  • preservatives potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, sodium dehydroacetate, etc.
  • disinfectants bleaching powder, high bleaching powder, sodium hypochlorite, etc.
  • antioxidants butylhydroxyanisole (BHA), butylhydroxyanisole).
  • toluene BHT, etc.
  • coloring agents tar coloring, etc.
  • coloring agents coloring agents (sodium nitrite, sodium nitrite, etc.), bleaching agents (sodium sulfite), seasonings (MSG monosodium glutamate, etc.), sweeteners (dulcine, cyclemate, saccharin, Food additives such as sodium, etc.), flavorings (vanillin, lactones, etc.), leavening agents (alum, D-potassium hydrogen tartrate, etc.), strengtheners, emulsifiers, thickeners (grease), coating agents, gum base agents, foam suppressants, solvents, improvers, etc. (food additives) may be included.
  • the additives can be selected depending on the type of food and used in an appropriate amount.
  • any one or more of the Chlorella vulgaris, the culture of the strain, the fermentation product of the strain, the culture medium of the strain, the extract of the strain, and the lysate of the strain may be added as is or used together with other foods or food ingredients, and are commonly used It can be used appropriately according to the method.
  • the mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health, or therapeutic treatment).
  • the food composition of the present invention may be added in an amount of 50 parts by weight or less, specifically 20 parts by weight or less, relative to the food or beverage.
  • the content when consumed for a long time for health and hygiene purposes, the content may be below the above range. Since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in amounts above the above range.
  • the food composition of the present invention can be used as a health drink composition, and in this case, it can contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients, like regular drinks.
  • the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose and sucrose; polysaccharides such as dextrins and cyclodextrins; It may be a sugar alcohol such as xylitol, sorbitol, or erythritol.
  • Sweeteners include natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract; Synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame can be used.
  • the ratio of the natural carbohydrate is generally about 0.01 to 0.04 g, specifically about 0.02 to 0.03 g per 100 mL of the composition of the present invention.
  • the health drink composition includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid, salts of pectic acid, alginic acid, salts of alginic acid, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, It may contain alcohol or carbonating agent. Additionally, it may contain pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage, or vegetable beverage. These ingredients can be used independently or in combination. The ratio of these additives is not very important, but is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • it may contain 0.00001 to 100% by weight of any one or more of Chlorella vulgaris, the culture of the strain, the fermentation product of the strain, the culture fluid of the strain, the extract of the strain, and the lysate of the strain, based on the total weight of the food composition. there is.
  • Another aspect of the present invention is any of the Chlorella vulgaris strain deposited with the deposit number KCTC14768BP, the culture of the strain, the fermentation product of the strain, the culture solution of the strain, the extract of the strain, and the lysate of the strain.
  • a method for preventing or improving skin using a composition comprising one or more active ingredients is provided.
  • Another aspect of the present invention is any of the Chlorella vulgaris strain deposited with the deposit number KCTC14768BP, the culture of the strain, the fermentation product of the strain, the culture solution of the strain, the extract of the strain, and the lysate of the strain.
  • a method for improving skin comprising the step of applying or administering a composition containing one or more active ingredients to a subject.
  • the composition may be a cosmetic or food composition.
  • the term “individual” used in the present invention may mean any animal, including humans.
  • the animal may be not only a human, but also a mammal such as a cow, horse, sheep, pig, goat, camel, antelope, dog, or cat that requires treatment for similar symptoms, but is not limited thereto.
  • the prevention or improvement method of the present invention may specifically include administering the composition in a pharmaceutically effective amount to an individual with the potential for skin improvement.
  • the term "application” refers to any method of contacting the composition according to the present invention to the skin of an individual by any appropriate method, and the purpose is to allow the composition to be absorbed into the skin.
  • composition of the present invention When the composition of the present invention is applied to the skin of an individual, it may have antioxidant, whitening, anti-aging, skin elasticity improvement, microbiome improvement, skin moisturizing, skin soothing, inflammation improvement, or skin barrier strengthening effects, and may have the following effects on the individual. It may include applying or administering the composition in an amount effective to produce the above effect.
  • the term "administration" is a general term for providing a predetermined substance to an individual by any appropriate method, and the administration route can be administered through any general route as long as it can reach the target skin. there is.
  • Another aspect of the present invention is any of the Chlorella vulgaris strain deposited with the deposit number KCTC14768BP, the culture of the strain, the fermentation product of the strain, the culture solution of the strain, the extract of the strain, and the lysate of the strain.
  • a composition containing one or more active ingredients for use in preventing or improving skin is provided.
  • Example 1 Isolation of a new Chlorella vulgaris strain from Ulleungdo spring water
  • a plankton net (Daehan Chemlab, catalog number CL-NP2020) was installed on a rock over which spring water flows for one day to collect microalgae, and the collected microalgae were placed on BG-11 medium (Sigma-aldrich, catalog number C3061-500ML). After mixing, separation was performed. The separation process used the dilution method, and the experiment was performed until Chlorella vulgaris was secured as a single cell.
  • the new strain was named Chlorella vulgaris LGHNH20483, and was deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Biological Resources Center (KCTC), a depository under the Budapest Treaty, on November 11, 2021, and was given the deposit number KCTC14768BP.
  • KCTC Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Biological Resources Center
  • Example 2-1 Preparation of fermented product of Chlorella vulgaris strain LGHNH20483
  • BG-11 medium (Sigma-aldrich, catalog number C3061-500ML) was used for the pre-culture.
  • the components of the BG-11 medium are as follows. NaNO 3 1.5 g/L, K 2 HPO 4 0.04 g/L, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.075 g/L, CaCl 2 ⁇ 2H 2 O 0.036 g/L, Citric acid 0.006 g/L, Ferric ammonium citrate 0.006 g /L, Disodium magnesium salt 0.001 g/L, Na 2 CO 3 0.02 g/L, Trace metal mix A5 1 mL (H 3 BO 3 2.86 g, MnCl 2 ⁇ 4H 2 O 1.81 g, ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.222 g, Na 2 MoO 4 ⁇ 2H 2 O 0.39 g, CuSO 2 ⁇ 5H 2 O 0.079 g, Co(NO 3 ) 2 ⁇ 6H 2 O 0.0494 g/L).
  • LGHNH20483 a Chlorella vulgaris strain
  • the culture was centrifuged and the supernatant was taken.
  • the supernatant included the culture medium of the LGHNH20483 strain of the present invention and the lysate obtained by crushing the main culture, and the centrifuged supernatant contained the strain in which the strain decomposed organic compounds. Since it is manufactured as a result, it corresponds to the fermented product of Chlorella vulgaris LGHNH20483 strain.
  • Example 2-1 Only the strain (pellet) obtained after centrifuging the culture in Example 2-1 was secured. Afterwards, the strain (pellet) was washed at least three times with distilled water, and moisture was removed through freeze-drying. A methanol solution equivalent to 10 times the mass of the prepared Chlorella vulgaris powder was added, extracted at room temperature for 3 days, and then filtered under reduced pressure. The filtered extract was concentrated and dried using a rotary evaporator (Buchi, Switzerland) to prepare an extract.
  • a rotary evaporator Buchi, Switzerland
  • Example 2-2 The antioxidant effect was confirmed using the extract of Chlorella vulgaris strain LGHNH20483 prepared by this method, and the antioxidant effect was compared by measuring the radical scavenging activity of the extract of the positive control (ascorbic acid) and comparison strain (Chlorella vulgaris strain AG10002 extract). .
  • AG10002 the comparative strain, is a strain distributed from the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Biological Resources Center (KCTC), Example 2-2. The extract was prepared using this method.
  • DPPH (Sigma-aldrich) was used dissolved in 95% ethanol to a concentration of 0.2mM. The DPPH solution and the diluted strain extract were mixed 1:1 and reacted in the dark at room temperature for 30 minutes, and then the absorbance at 517 nm was measured using an ELISA reader. DPPH radical scavenging activity was expressed as a percentage of the difference in absorbance between the sample solution addition and no addition groups as shown in the formula below. In the case of the standard, strain extract and 95% ethanol were mixed at a ratio of 1:1, respectively. did.
  • the DPPH radical scavenging activity of the extract of Chlorella vulgaris strain LGHNH20483 increased by more than 30% compared to the extract of AG10002, a comparative strain, and through this, the Chlorella vulgaris extract of the present invention It was confirmed that it has high radical scavenging activity.
  • Example 2-1 The whitening effect was confirmed using the fermented product of Chlorella vulgaris strain LGHNH20483, and the amount of melanin pigment in the cells and the amount of melanin pigment in the cells by the fermented product of the negative control, positive control (arbutin), and comparative strain (fermented product of Chlorella vulgaris strain AG10002) The whitening effect was compared by measuring the degree of tyrosinase activity.
  • AG10002 the comparative strain, is a strain distributed from the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Biological Resources Center (KCTC), Example 2-1. Fermented product was prepared using this method.
  • MNT-1 melanocytes (Melanocyte, ATCC, catalog number CRL-3450) were dispensed at a concentration of 1 to 2 x 10 5 cells/ml in DMEM medium containing 10% FBS and cultured for 24 hours.
  • the prepared fermented product or positive control sample was diluted to the concentration corresponding to Table 2, treated, and cultured for 72 hours, and then the cells were recovered.
  • 300 ⁇ l of 0.5% triton X-100 solution was added to the pellet to lyse the cells. This was centrifuged again at 13,000 rpm for 3 minutes, and the pellet and supernatant were recovered separately.
  • 100 ⁇ l of 0.5N NaOH was added to the cell pellet and cultured overnight to dissolve melanin, and then the absorbance at 450 nm was measured using an ELISA reader.
  • the melanin content of melanocytes treated with the fermented product of Chlorella vulgaris strain LGHNH20483 decreased by more than about 31% compared to the no-added control group, and the tyrosinase activity decreased by about 65% or more compared to the no-added control group. It was confirmed that the decrease in melanin content and tyrosinase activity decreased compared to the positive control group.
  • the fermented product of strain LGHNH20483 of the present invention had a more significant melanin biosynthesis inhibitory effect than the fermented product of AG10002, a comparative strain.
  • Example 2-1 The anti-aging and skin elasticity effects were confirmed using the fermented product of Chlorella vulgaris strain LGHNH20483, and the change in collagen concentration by the fermented product of the negative control, positive control (TGF- ⁇ ), and comparison strain (fermented product of Chlorella vulgaris strain AG10002) was confirmed. The anti-aging and skin elasticity effects of promoting type 1 collagen synthesis were compared.
  • DMEM with 10% FBS was used to distribute the cells at a concentration of 2 to 5 x 10 4 cells/ml in a 48-well plate, and the fibroblasts were cultured for 24 hours.
  • the existing culture medium was removed, and the prepared fermented product or positive control sample was diluted in serum-free medium to the concentration corresponding to Table 3 below and treated for 24 hours.
  • the cell culture medium was obtained and the effect of promoting type 1 collagen synthesis was measured using ELISA assay.
  • the synthesized collagen was quantified using Human Pro-Collagen I ⁇ 1/COLIA1 (R&D systems, catalog number DY6220-05), and the collagen synthesis rate of the sample was calculated by calculating the increase rate compared to the control group (serum-free medium).
  • the collagen concentration of fibroblasts treated with the fermented product of Chlorella vulgaris strain LGHNH20483 was confirmed to increase by about 24% or more compared to the no-added control group, and the effect of promoting collagen synthesis was more significant than that of the fermented product of the comparative strain AG10002. It was confirmed that it has.
  • Example 2-1 The microbiome improvement effect ( in vitro prebiotic ability) was confirmed using the fermented product of Chlorella vulgaris strain LGHNH20483, and the growth rate of beneficial and harmful bacteria by the fermented product of the control and comparison strain (fermented product of Chlorella vulgaris strain AG10002) The changes were measured and the effect of improving the microbiome was compared.
  • Staphylococcus epidermidis S. epidermidis
  • Staphylococcus aureus S. aureus
  • Example 6-1 Beneficial bacteria ( S. epidermidis ) growth rate evaluation
  • Sterile liquid medium was prepared using commercial TSB (Tryptic soy broth, Difco) medium, and S. epidermidis glycerol-preserved solution was inoculated into sterile liquid TSB medium and pre-cultured at 30-37°C for 6-18 hours. This pre-culture was performed 1-2 times. Afterwards, each fermentation product was added to sterile liquid TSB medium, the pre-culture solution was inoculated, and the culture was cultured at 30-37°C for 6-18 hours. After culturing, the absorbance (OD) immediately after inoculation and the absorbance during the stationary phase of growth were measured, and the ratio of the values (growth rate) was used as a statistical variable. By comparing the growth rate of the experimental group treated with the extract compared to the control group not treated with the extract, it was determined whether the sample had a significant effect on the growth of bacteria.
  • the growth rate of beneficial bacteria S. epidermidis
  • the fermented product of the vulgaris strain LGHNH20483 was confirmed to increase by about 7 times compared to the fermented product of the comparative strain AG10002.
  • Example 6-2 Harmful bacteria ( S. aureus ) growth rate evaluation
  • the growth rate of the harmful bacteria S. aureus was evaluated, and the evaluation conditions and methods were described in Example 6-1 above.
  • the conditions and methods for evaluating the growth rate of beneficial bacteria were the same.
  • Example 2-1 The skin moisturizing effect was confirmed using the fermented product of Chlorella vulgaris strain LGHNH20483, and the degree of increased expression of aquaporin 3 (AQP3) by the fermented product of the control and comparison strains (fermented product of Chlorella vulgaris strain AG10002) was measured. The skin moisturizing effect was compared.
  • AQP3 aquaporin 3
  • keratinocyte-SFM Thermo Fisher Scientific, catalog number 17005042
  • EGF epidermal growth factor
  • BPE bovine pituitary extract
  • polymerase chain reaction (real-time PCR, Bio-Rad, CFX Connect Real-Time PCR detection system) was performed using this as a template.
  • the base sequences of the AQP3 primer used in real-time PCR are 5'-ACCTTTGCCATGTGCTTCCT-3' (SEQ ID NO. 2), 5'-GCGTCTGTGCCAGGGTGTA-3' (SEQ ID NO. 3), and the housekeeping gene is (housekeeping gene) ⁇ -actin.
  • 5'-ATTGGCAATGAGCGGTTCC-3' SEQ ID NO: 4
  • 5'-GGTAGTTTCGTGGATGCCACA-3' (SEQ ID NO: 5) were used as standards.
  • the expression level of the AQP3 gene in the sample was quantified based on the mRNA expression level in the no-added control group.
  • the level of AQP3 gene expression in skin keratinocytes treated with the fermented product of Chlorella vulgaris strain LGHNH20483 was confirmed to increase by about 1.6 times or more compared to the fermented product of AG10002, a comparative strain. Accordingly, it was found that the fermented product of Chlorella vulgaris strain LGHNH20483 of the present invention exhibited an excellent effect on skin moisturizing.
  • Example 2-1 The effect of skin soothing and inflammation improvement was confirmed using the fermented product of Chlorella vulgaris strain LGHNH20483, and the NO production inhibition rate by the fermented product of the positive control (L-NMMA) and comparison strain (fermented product of Chlorella vulgaris strain AG10002) was measured. The effects of skin soothing and inflammation improvement were compared.
  • FBS 10% FBS was added to DMEM and used as a growth medium, and Raw264.7 cells (ATCC, catalog number CRL-2788), a mouse macrophage cell line, were dispensed at a concentration of 1 to 2 x 10 5 cells/ml and incubated in a 5% CO 2 incubator. It was cultured for one day. After removing the medium and starvating with serum-free medium for 12 hours, the prepared fermented product and positive control were treated and pretreated for 30 minutes. Afterwards, 500 ng/ml of LPS (Lipopolysaccharides, SIGMA, catalog number L43901) was treated and cultured for 18 hours.
  • LPS Lipopolysaccharides, SIGMA, catalog number L43901
  • the NO production inhibition rate of Raw264.7 cells treated with fermented product of Chlorella vulgaris strain LGHNH20483 was confirmed to increase by about 2 to about 3.6 times or more compared to the fermented product of AG10002, a comparative strain.
  • the fermented product of Chlorella vulgaris strain LGHNH20483 of the present invention showed excellent effects in soothing the skin and improving inflammation.
  • Example 2-1 The skin barrier strengthening effect was confirmed using the fermented product of Chlorella vulgaris strain LGHNH20483, and the fermented product of the control and comparison strain (fermented product of Chlorella vulgaris strain AG10002) produced involucrin (IVL), loricrin, The level of increased expression of LOR) was measured to compare the effect of strengthening the skin barrier.
  • Skin keratinocytes were cultured using keratinocyte-SFM (Thermo Fisher Scientific, catalog number 17005042) medium supplemented with epidermal growth factor (EGF) and bovine pituitary extract (BPE). Skin keratinocytes were distributed on a 60-mm culture plate (SPL, catalog number 20060) at a concentration of 2 to 5 x 10 5 cells/ml and cultured for 24 hours. The medium was removed and the prepared fermented product was diluted in a medium without EGF and BPE added and treated for 24 hours.
  • keratinocyte-SFM Thermo Fisher Scientific, catalog number 17005042
  • EGF epidermal growth factor
  • BPE bovine pituitary extract
  • RNA from cultured cells was processed with M-MLV reverse transcriptase (ELPIS-Biotech, catalog number EBT-1027). After performing cDNA synthesis, polymerase chain reaction (real-time PCR, Bio-Rad, CFX Connect Real-Time PCR detection system) was performed using this as a template.
  • the nucleotide sequence of the IVL primer used in real-time PCR is 5'-TGGTCTGGGTTTTCTGCTTT-3' (SEQ ID NO: 6), 5'-GATGTCCCAGCAACACACAC-3' (SEQ ID NO: 7), and the nucleotide sequence of the LOR primer is 5'-TAGAGACGCCTCCGTAGCTC-3. '(SEQ ID NO: 8), 5'-AGTGGACTGCGTGAAGACCT-3' (SEQ ID NO: 9).
  • the housekeeping genes were based on GAPDH (5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3' (SEQ ID NO: 10), 5'-GGCATGGACTGTGTCATGAG-3' (SEQ ID NO: 11).
  • the expression levels of involucrin and loricrin genes in the sample were compared to the mRNA of the no-added control group. Quantification was done based on the expression level.
  • the level of IVL gene expression in skin keratinocytes treated with fermented product of Chlorella vulgaris strain LGHNH20483 increased by approximately 1.4 times or more compared to the fermented product of AG10002, a comparative strain, and the level of LOR gene expression increased by 1.3 times. It was confirmed that there was an abnormal increase. Accordingly, it was found that the fermented product of Chlorella vulgaris strain LGHNH20483 of the present invention showed an excellent effect in strengthening the skin barrier.

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Abstract

본 발명은 기탁 번호 KCTC14768BP로 기탁된 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) 균주; 및 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물 중 어느 하나 이상을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물, 의약외품 조성물, 식품조성물; 상기 조성물의 피부 개선 방법; 피부 개선 용도에 관한 것으로, 클로렐라 불가리스 균주, 상기 균주의 배양물, 발효물, 배양액, 추출물 또는 파쇄물은 우수한 피부 개선 효과가 있으므로, 피부 개선용 화장료 조성물, 의약외품 조성물, 및 식품 조성물로서의 활용도가 높다. 이에, 화장품, 의약외품, 식품 등의 다양한 산업적 활용을 기대할 수 있다.

Description

신규한 클로렐라 불가리스 균주 및 이의 용도
본 발명은 기탁 번호 KCTC14768BP로 기탁된 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) 균주; 및 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물 중 어느 하나 이상을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물, 의약외품 조성물, 식품조성물; 상기 조성물의 피부 개선 방법; 피부 개선 용도에 관한 것이다.
미세조류는 지구에서 가장 오래된 생물체이자 지구 산소 50%를 생산하는 생태계의 근본이 되는 생물이다. 건조물 기준 50%가 넘는 단백질을 함유하고 있으며 카로티노이드, 비타민, 클로로필 등 다양한 생리 활성물질이 풍부하여 오랜 시간 동안 건강기능식품으로 사랑 받아 왔으며, 슈퍼 푸드, 미래 식량으로도 선정되어 계속적인 연구와 소비자 요구는 더욱 높아질 것으로 예상된다. 또한 천연물 연구의 주 소재인 육지 식물이 재배를 위해 노동력, 시간, 경작지 등이 필요한 것에 비해 미세조류는 분리와 배양을 통해 영구적인 보존과 활용이 가능하다는 특징이 있다.
화장품 성분은 일반적으로 피부에 염증이나 뾰루지, 부종 등 각종 트러블을 발생시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 기능성 화장품의 원료로 사용되는 다양한 물질들도 피부에 대한 낮은 안정성 또는 미미한 효과를 나타내는 문제점이 있다. 일 예로, 피부 주름 개선 및 탄력 개선 화장료로 레티노이드, 아데노신 및 동물 태반유래 단백질 등이 알려져 있다. 가장 널리 알려진 레티놀은 피부 적용 시 자극 등의 안전성 문제로 사용량 제한이 있다.
미세조류 종류에 속하는 두날리엘라 살리나 추출물 (한국공개특허 KR 10-2016-0146370 A), 나노클로롭시스 오세아니카 추출물 (한국공개특허 KR 10-2018-0076791 A) 등을 이용하여 화장품 원재료로 사용하고자 하는 연구가 진행 중지만, 미세조류를 응용한 산업분야는 아직까지 풍부한 종에 비해 그 규모와 다양성 면에서 극히 제한적이므로, 적용 분야의 확대가 요구된다 할 것이다.
본 발명자들은 천연 자원물로부터 보다 안전하고 피부 개선 효과가 우수한 원료에 관한 연구를 수행하였으며, 미세조류인 클로렐라 불가리스가 피부 개선 효과가 현저히 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 기탁 번호 KCTC14768BP로 기탁된 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물 중 어느 하나 이상을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물 중 어느 하나 이상을 포함하는 피부 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물 중 어느 하나 이상을 포함하는 피부 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 기탁 번호 KCTC14768BP로 기탁된 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 도포 또는 투여하는 단계를 포함하는, 피부 개선 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 기탁 번호 KCTC14768BP로 기탁된 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부 예방 또는 개선 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 클로렐라 불가리스 균주, 상기 균주의 배양물, 발효물, 배양액, 추출물 또는 파쇄물은 우수한 피부 개선 효과가 있으므로, 피부 개선용 화장료 조성물, 의약외품 조성물, 및 식품 조성물로서의 활용도가 높다. 이에, 화장품, 의약외품, 식품 등의 다양한 산업적 활용을 기대할 수 있다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험 만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 하나의 양태는 기탁 번호 KCTC14768BP로 기탁된 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) 균주를 제공한다.
본 발명의 용어, "클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris)"는 선캄브리아기 시대부터 지구에 존재했던 녹조식물문 클로렐라 속에 속하는 녹색 미세조류이다. 클로렐라 불가리스는 엽록소는 물론, 단백질, 비타민, 미네랄 등 영양소가 풍부하여, 첨가제, 착색제 또는 식품 유제로 사용되기는 하지만, 역한 냄새 때문에 식품으로는 널리 사용되지 않는다. 본 발명자들은 클로렐라 불가리스에 속하는 신규한 균주를 분리하여 이를 클로렐라 불가리스 LGHNH20483으로 명명하였고, 이를 기탁 번호 KCTC14768BP로 기탁하였다. 상기 균주는 울릉도 용출수에서 분리한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 균주는 항산화, 미백, 항노화, 피부탄력 개선, 마이크로바이옴 개선, 피부 보습, 피부 진정, 염증 개선, 및 피부 장벽 강화 등의 피부개선 효과를 가질 뿐만 아니라, 다른 클로렐라 불가리스 균주와 비교해서도 우수한 피부개선 효과를 가진다. 이와 같은 KCTC14768BP로 기탁된 균주의 피부 개선 효과에 기초하여 이를 이용한 화장품, 의약외품, 식품 등의 개발에 이용할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 KCTC14768BP로 기탁된 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물 중 어느 하나 이상을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "균주 (strain)"는 한 개의 세포에서 유래한, 무성생식을 통해 증식하여 동질의 유전적 특징을 갖는 개체들의 집합을 의미하며, 하나의 종(species) 안에는 유전적 특징이 서로 다른 여러 개의 균주들(genetic variants)이 존재한다. 본 발명에서 균주는 클로렐라 불가리스를 의미하며, 구체적으로 기탁 번호 KCTC14768BP로 기탁된 클로렐라 불가리스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 균주는 클로렐라 불가리스 균주의 균체, 건조된 균체 등을 포함할 수 있다. 이 때, 상기 건조된 균체는 분무 건조균, 동결 건조균, 진공 건조균, 드럼 건조균 등의 건조균일 수 있다.
본 발명의 용어, "배양물"은 상기 균주를 배지에서 배양하여 수득한 산물을 의미한다. 그 예로 본 발명의 배양물은 클로렐라 불가리스의 배양 배지에서 상기 균주를 수확한 후 남은 배지에 잔존한 성분을 포함하거나, 균주를 포함하는 배양 배지의 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 "배양액"은 상기 배양물에서 균주를 제외한 부분을 의미한다. 그 예로 본 발명의 배양액은 클로렐라 불가리스의 배양 배지에서 원심분리 후 상기 균주를 제외한 배양상등액 또는 배양상등액에서 파쇄물을 제외한 부분을 포함할 수 있다.
상기 배양물은 상기 클로렐라 불가리스 균주, 상기 균주의 전체 배양물, 배양 배지, 이들의 분획물 등이 될 수 있다. 상기 배양액은 상기 클로렐라 불가리스 균주의 배양상등액 등이 될 수 있다. 이때, 상기 배양상등액은 상기 균주의 배양물을 원심분리하여 수득할 수 있고, 상기 분획물은 상기 균주, 상기 배양물, 배양상등액 등을 원심분리, 크로마토그래피 등의 방법에 적용하여 수득할 수 있다.
본 발명의 균주의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 클로렐라속 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용될 수 있으며, 구체적으로는 본 발명의 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 또는 혐기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 발명에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루타메이트, 메티오닌, 라이신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다.
그 외에 상기 배지에는 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 균주의 배양 배지에는 L-아미노산 등이 첨가될 수 있다. 구체적으로는 글리신(glycine), 글루타메이트(glutamate), 및/또는 시스테인(cysteine) 등이 첨가될 수 있고, 필요에 따라서는 라이신(lysine) 등의 L-아미노산 이 더 첨가될 수 있으나 반드시 이에 제한되지 않는다.
상기 배지 또는 전구체는 배양물 또는 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 균주의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배양물 또는 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물 또는 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물 또는 배양액의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 또는 배양액 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.
본 발명의 용어, "발효물"은 미생물을 배지에서 일정 기간 동안 배양하여 수득한 균주, 그의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 배지, 상기 배지로부터 균주를 제거한 배양액을 상기 배지 또는 배양액의 희석물 또는 농축물, 또는 이들의 건조물을 포함할 수 있다. 상기 "발효"는 미생물이 자신이 가지고 있는 효소를 이용하여 유기물을 분해시키는 과정 중 부패 반응이 아닌 것을 의미한다.
본 발명에서, 상기 균주로부터 발효물을 수득하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술분야 또는 유사 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수득할 수 있다.
본 발명에서, 상기 균주로부터 수득한 발효물은 발효된 물질 자체뿐만 아니라, 균주 및 배양물이 공존하는 균주의 배양 배지, 상기 배양 배지로부터 균주를 여과시킨 발효물, 상기 배양 배지를 원심분리하여 균주를 제외한 상등액, 상기 배양 배지로부터 균주을 멸균처리하고 이를 여과시킨 발효물, 상기 발효물 또는 이를 포함하는 배양 배지를 추출한 추출물, 상기 발효물 또는 이의 추출물을 희석시킨 희석액, 상기 발효물 또는 이의 추출물을 건조시킨 건조물, 상기 균주의 균체를 포집해서 파쇄시킨 용해물 등, 상기 균주로부터 발생한 발효물을 포함하는 모든 종류의 물질을 포함한다.
본 발명에서, 클로렐라 불가리스 발효물의 농도는 0.01% 내지 100%, 구체적으로 0.03% 내지 30%, 더욱 구체적으로 0.05% 내지 10%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "추출물" 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온, 저온 또는 가온 상태에서 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상 성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미한다. 뿐만 아니라, 상기 결과물에 더하여, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다. 이에 따라, 본 발명에서 제공하는 클로렐라 불가리스 추출물은 이를 추출 처리하여 얻어 지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 클로렐라 불가리스를 추출하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
상기 추출에 사용되는 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 에테르, 초산에틸, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 클로로포름, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르 및 디클로로메탄 또는 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있고, 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합하여 사용될 수 있으며, 구체적으로 물이 사용될 수 있다. 알코올을 용매로 사용하는 경우에는 구체적으로 탄소수 1 내지 4의 알코올을 사용할 수 있다.
본 발명에서 추출물은 상기 배양물, 발효물, 배양액, 파쇄물 또는 균주 (pellet)의 추출물일 수 있고, 구체적으로, 배양물을 원심분리한 후 상등액을 제거한 균주를 감압농축하여 추출한 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 클로렐라 불가리스 추출물의 농도는 0.001% 내지 30%, 구체적으로 0.001% 내지 15%, 더욱 구체적으로 0.001% 내지 10%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 KCTC14768BP로 기탁된 클로렐라 불가리스 균주, 상기 균주의 배양물, 발효물, 배양액, 추출물, 파쇄물 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물은 다른 클로렐라 불가리스 균주, 이의 배양물, 발효물, 배양액, 추출물 또는 파쇄물 등을 포함한 조성물에 비해 우수한 피부 개선효과를 갖는다.
본 발명의 용어, "파쇄물"은 균주 자체를 물리적·화학적으로 처리, 고압멸균 또는 초음파 처리하여 수득한 것이거나, 균주의 배양물을 원심분리하여 얻은 상등액, 발효물 또는 배양액을 파쇄하여 수득한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "피부 개선"은 항산화, 미백, 항노화, 피부탄력 개선, 마이크로바이옴 개선, 피부 보습, 피부 진정, 염증 개선, 및 피부 장벽 강화로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "개선"은 상태의 완화 또는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미하며, 항산화, 미백, 항노화, 피부탄력 개선, 마이크로바이옴 개선, 피부 보습, 피부 진정, 염증 개선, 및 피부 장벽 강화 중 어느 하나 이상을 모두 포함할 수 있다.
상기 피부 개선은 라디칼 소거 증가, 멜라닌 색소 함량감소, 타이로시네즈 활성 증가, 콜라겐 합성 촉진, 유익균 생장 증가, 유해균 생장 억제, 아쿠아포린3 (AQP3)의 발현 증가, NO생성 억제, 인볼루크린(IVL) 발현 증가 및 로리크린(LOR)의 발현 증가를 통해 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "항산화"는 산화의 억제를 의미하며, 세포의 노화 과정과 그에 대한 예방법을 설명할 때 많이 등장하는 개념이다. 즉, 세포의 노화가 세포의 산화를 의미하기 때문에 사람의 호흡을 통해 체내로 들어온 산소는 인체에 필요한 에너지를 만드는 등 이로운 작용도 하지만, 이 과정에서 몸에 좋지 않은 여분의 산소인 활성산소가 생성된다. 활성산소는 체내의 정상 세포를 공격하여 노화나 각종 질병의 원인으로 작용한다. 따라서 이 활성산소를 제거하는 것이 세포의 산화(노화)를 막는 방법이며, 이러한 세포의 산화를 억제하는 것을 의미한다. 구체적으로, 항산화는 라디칼 소거 활성 증가에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "라디칼(radical)" 은 1개의 쌍 안 지은 전자를 갖는 원자 혹은 분자를 의미한다. 활성산소들은 화학적인 반응성이 뛰어나며 이들에 의해 유도되는 자유 라디칼은 생체 내의 각종 반응에 영향을 미치고 노화 등을 야기한다. 생물체는 자유 라디칼들에 의해 일어나는 유해성에 항상 노출되어 있으며, 세포의 연령증가에 따라 유해성이 점진적으로 축적되어 다양한 질병들을 일으킨다. 따라서, 자유라디칼 저해는 항산화 효과에 중요한 역할을 한다.
본 발명에서 라디칼 소거 활성 증가는 클로렐라 불가리스 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물, 상기 균주의 파쇄물 또는 이들의 혼합물에 의한 것일 수 있으며, 본 발명의 조성물은 상기 라디칼 소거 활성에 의해 항산화 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 본 발명에 따른 클로렐라 불가리스 추출물의 라디칼 소거 활성 효과는 종래 알려진 클로렐라 불가리스 비교 균주 AG10002 추출물보다 우수함을 확인하였으며, 이를 통해 본 발명의 클로렐라 불가리스 추출물은 비교 균주 추출물 대비 항산화 등에 현저한 효과가 있음을 확인하였다 (표 1).
본 발명의 용어, "미백"은 멜라닌 등의 색소의 과다로 인하여 명도가 감소된 피부의 명도를 증가시키거나 또는 피부의 명도를 일정 수준으로 유지하는 방법, 상기 방법으로 형성된 명도가 증가된 피부 등을 포괄하여 의미하는 것으로서, 구체적으로는 피부 미백을 의미할 수 있다. 구체적으로, 피부 미백은 타이로시나제활성 저해에 따른 결과로서 이해될 수 있으며, 구체적으로 타이로시나제 활성이 저해됨에 따라 멜라닌의 생성이 저해되어 멜라닌의 증가에서 비롯되는 증상, 예컨대 기미, 주근깨 개선으로서 이해될 수 있다.
본 발명의 용어, "멜라닌"은 멜라닌은 자연계에서 흔히 발견되는 색소 중 하나로서 흑갈색 또는 검은색을 띠며, 멜라닌의 양에 따라 피부색이 결정되는데, 멜라닌의 양이 많을수록 검은 피부색을 띤다. 아미노산 중 하나인 타이로신(tyrosine)으로부터 합성되며 폴리페놀(polyphenol) 중합체를 이루어 매우 안정적인 구조를 이루고 있다. 이러한 구조적 특징 때문에 열과 화학물질에 대한 내성, 항산화 능력과 더불어 자외선과 같은 방사선에 대해 저항성을 가지고 있다.
본 발명의 용어, "타이로시네즈"는 멜라닌의 생성을 조절하는 산화 효소이다. 이것은 피부의 멜라닌세포에서 합성되는 멜라닌소체에서 발견 될 수 있다.
본 발명에서 멜라닌 색소 함량 감소 및/또는 타이로시네즈 활성 증가는 클로렐라 불가리스 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물, 상기 균주의 파쇄물 또는 이들의 혼합물에 의한 것일 수 있으며, 본 발명의 조성물은 상기 멜라닌 색소 함량 감소 및/또는 타이로시네즈 활성 증가에 의해 미백 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현에서는 본 발명에 따른 클로렐라 불가리스 발효물의 멜라닌 색소 함량 감소 및/또는 타이로시네즈 활성 증가가 종래 알려진 클로렐라 불가리스 비교 균주 AG10002 발효물 보다 우수함을 확인하였으며, 이를 통해 본 발명의 클로렐라 불가리스 발효물은 비교 균주 발효물 대비 미백 등에 현저한 효과가 있음을 확인하였다 (표 2).
본 발명의 용어, "노화"는 시간의 흐름에 따라 생체 구조와 기능이 쇠퇴하는 현상을 의미하며, 본 발명의 "항노화"는 노화를 예방, 억제, 지연 시키는 등 노화가 개선된다면 그 정도 등에 제한되지 않는다. 상기 항노화는 피부 탄력 개선, 피부 재생, 주름 개선 등을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "피부 탄력"은 피부를 손가락으로 눌렀을 때 팽팽하게 버티는 힘으로, "탄력 개선" 또는 "탄력 증진"은, 개체의 피하 지방층 구조를 강화시켜 피부의 탄력을 높이는 것을 의미로서, 본 발명의 조성물을 이용하여 피부의 탄력을 높이는 것을 의미할 수 있다. 구체적으로, 항노화 및 탄력 개선은 콜라겐 합성 촉진에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "콜라겐(Collagen)"은 대부분의 동물, 특히 포유 동물에서 많이 발견되는 섬유 단백질로, 피부와 연골 등 체내의 모든 결합 조직의 대부분을 차지하며, 체내에서 가장 흔한 세포인 섬유아세포 (fibroblasts)가 콜라겐을 생성 분비한다. 요리, 혹은 식품과 의약산업에서 널리 이용되는 젤라틴은 콜라겐을 비가역적으로 가수분해 한 것이다. 콜라겐의 감소는 주름을 유발하고, 피부의 탄력을 감소시키는 주된 원인이므로, 콜라겐의 합성은 주름 개선 및 탄력 증진을 위해 필수적이다.
본 발명에서 콜라겐 합성 촉진은 클로렐라 불가리스 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물, 상기 균주의 파쇄물 또는 이들의 혼합물에 의한 것일 수 있으며, 본 발명의 조성물은 상기 콜라겐 합성 촉진에 의해 피부탄력 개선 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에서는 본 발명에 따른 클로렐라 불가리스 발효물의 콜라겐 합성 촉진 효과가 비교 균주 AG10002 발효물 보다 우수함을 확인하였으며, 이를 통해 본 발명의 클로렐라 불가리스 발효물은 비교 균주 발효물 대비 항노화 및 피부탄력 개선 등에 현저한 효과가 있음을 확인하였다 (표 3).
본 발명의 용어, "마이크로바이옴 (Microbiome)" 인체에 서식하는 미생물의 유전정보 전체나 미생물 자체를 일컫는 용어로서, 인간의 몸에 서식하며 공생하는 미생물인 마이크로바이오타 (Microbiota)와 게놈 (Genome) 의 합성어이다.
본 발명의 용어, "마이크로바이옴 개선"은 마이크로바이옴 밸런스 유지로 혼용될 수 있고, 상기 마이크로바이옴 균형 유지를 의미하는 것으로서, 유익균 성장을 촉진하면서 유해균 성장을 억제하는 방식으로 마이크로바이옴의 균형을 유지할 수 있으며, 마이크로바이옴 밸런스가 무너질 경우 피부 장벽이 약해짐으로써 유해 미생물의 증식이 쉬워지게 된다. 구체적으로, 마이크로바이옴 개선은 유익균 생장 증가 및/또는 유해균 생장 억제에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "유익균"은 피부 재생 효과를 증진시킴으로써 피부 방어력을 증진시키고, 유해균의 세포막 파괴(사멸) 및 생장 억제를 통해 피부 재생을 증진시킴으로써, 피부 항상성을 유지하는 데 도움을 주는 균주를 의미한다. 상기 유익균을 예를 들어, 표피포도구균 (Staphylococcus epidermidis)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "유해균"은 피부에 염증 반응 또는 여드름 등을 일으키는 균을 의미한다. 상기 유해균은 예를 들어, 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 유익균의 생장 속도 증가 및/또는 유익균의 생장 속도 억제는 클로렐라 불가리스 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물, 상기 균주의 파쇄물 또는 이들의 혼합물에 의한 것일 수 있으며, 본 발명의 조성물은 상기 유익균 생장 증가 및/또는 유해균 생장 억제에 의해 마이크로바이옴 개선 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 본 발명에 따른 클로렐라 불가리스 발효물은 유익균의 생장 속도는 비교 균주 AG10002 발효물 보다 증가시키는 반면, 유해균의 생장은 억제시킴으로써, 본 발명의 클로렐라 불가리스 발효물은 비교 균주 발효물 대비 마이크로바이옴 개선에 현저한 효과를 갖는 것을 확인하였다 (표 4, 표 5).
본 발명의 용어, "피부 보습"은 피부에 수분을 공급하거나 수분의 증발을 차단하여 피부의 유연성을 유지하고 균일한 각질 탈락을 유도하여 매끈한 표면을 유지하게 하는 모든 작용을 의미하며, "건조"란 이러한 피부 보습이 충분하지 않은 상태를 의미한다. 피부 보습 효과는 피부의 주름개선, 탄력도 증가에 도움을 줄 수 있다. 구체적으로, 피부 보습은 아쿠아포린3 (AQP3) 발현 증가에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "아쿠아포린3 (Aquaporin 3, AQP3)"은 세포막에서 채널을 형성하여 물 분자들의 수동 수송을 유도하는 내재 막 단백질로서, 다른 물질들의 이동은 제한하면서 물 분자만을 선택적으로 통과시킨다.
본 발명에서 아쿠아포린3의 발현 증가는 클로렐라 불가리스 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물, 상기 균주의 파쇄물 또는 이들의 혼합물에 의한 것일 수 있으며, 본 발명의 조성물은 상기 아쿠아포린3 발현 증가에 의해 피부 보습 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 본 발명에 따른 클로렐라 불가리스 발효물의 아쿠아포린3 발현 증가 효과는 무첨가 대조군 및 비교 균주 AG10002 발효물 보다 우수함을 확인하였으며, 이를 통해 클로렐라 불가리스 발효물은 비교 균주 발효물 대비 항노화, 피부 보습 등에 현저한 효과가 있음을 확인하였다 (표 6).
본 발명의 용어, "피부 진정"은 홍반 또는 자극 받은 피부 부위 등을 완화시키고 가라앉히는 것을 의미하며, 피부 자극 완화를 포함하는 개념일 수 있다. 예를 들어, 피부의 수분 손실 감소 및/또는 붉은기 감소를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "염증"은 특정 조직의 손상 또는 감염에 대한 일종의 생체 내 반응이며, 주요 매개체는 면역세포이다. 이러한 염증의 목적은 조직의 손상을 최대한 억제하고, 감염체를 제거하며 조직 재생을 목적으로 하고 있다. 구체적으로, 피부 진정 및 항염증은 NO 생성 억제 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "NO(nitric oxide, 아질산)"는 세균과 종양을 제거하고 혈압을 조절하거나 신경 전달을 매개하는 등 다양한 역할을 하지만, 염증 반응이 일어나게 되면 관련 세포들에서 iNOS(유도성 일산화질소 합성효소)의 발현이 증가하여 많은 양의 NO가 생성되고, 과도하게 생성된 NO는 조직의 손상, 유전자 변이, 신경 손상 등을 유발하며, 혈관 투과성을 증가시켜 부종 등의 염증 반응을 촉진시킨다. 염증이 유발된 세포들에서 NO 생성이 증가하는 반면, 피부 진정이 되면 NO 생성이 억제되는바, 이들은 필수적 상관관계가 존재한다.
본 발명에서 NO 생성 억제는 클로렐라 불가리스 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물, 상기 균주의 파쇄물 또는 이들의 혼합물에 의한 것일 수 있으며, 본 발명의 조성물은 상기 NO 생성 억제에 의해 피부 진정 및 염증 개선 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현에서는 본 발명에 따른 클로렐라 불가리스 발효물의 NO 생성 억제 효과는 비교 균주 AG10002 발효물 보다 우수함을 확인하였으며, 이를 통해 본 발명의 클로렐라 불가리스 발효물은 비교 균주 발효물 대비 피부 진정 및 염증 개선 효과가 우수함을 확인하였다 (표 7).
본 발명의 용어, "피부 장벽"은 피부, 특히 표피의 각질층이 외부로의 수분 유출을 방지하고, 외부로부터의 물질 출입을 통제하는 등 외부와의 차단층 역할을 수행하는 모든 기능을 의미한다. 구체적으로, 피부 장벽 강화는 인볼루크린(IVL), 로리크린(LOR) 발현 증가에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "인볼루크린 (involucrin, IVL)","로리크린 (loricrin, LOR)"은 각질세포 내 존재하는 각질세포형성의 구조단백질로서, 상기 단백질외막 구성 단백질이 각질세포 외부의 지질과 공유결합하여 형성함으로써, 피부장벽에서 벽돌구조를 만드는데 중요한 역할을 담당한다.
본 발명에서 인볼루크린 또는 로리크린의 발현 증가는 클로렐라 불가리스 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물, 상기 균주의 파쇄물 또는 이들의 혼합물에 의한 것일 수 있으며, 본 발명의 조성물은 상기 인볼루크린 또는 로리크린 발현 증가에 의해 피부 장벽 강화 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 본 발명에 따른 클로렐라 불가리스 발효물의 인볼루크린 또는 로리크린 발현 증가 효과는 무첨가 대조군 및 비교 균주 AG10002 발효물 보다 우수함을 확인하였으며, 이를 통해 클로렐라 불가리스 발효물은 비교 균주 발효물 대비 피부 장벽 강화 등에 현저한 효과가 있음을 확인하였다 (표 8, 9).
본 발명의 용어, "화장료 조성물"은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 향수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성되는 군에서 선택되는 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 상기 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 화장료 제형이 연고, 페이스트, 크림, 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨데 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.
한편, 본 발명에 기재된 모든 성분이 바람직하게는 화장품 안전기준 등에 관한 규정 및 중국 '화장품 안전·기술 규범'에서 규정한 최대 사용치를 초과하지 않는 범위 내에서 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물 중 어느 하나 이상을 포함하는 피부 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
상기 "클로렐라 불가리스", "균주", "배양물", "배양액", "파쇄물", "발효물", "추출물", "피부 개선"및 "개선"은 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "의약외품"은 바디 클렌저, 소독 청결제, 세정제, 주방용 세정제, 청소용 세정제, 치약, 가글제, 물티슈, 세제, 비누, 핸드워시, 헤어 세정제, 헤어 유연제, 가습기 충전제, 마스크, 연고제, 및 필터 충진제로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 성분 외에 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제의 대표적인 예로는, 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 글리세린, 아카시아 고무, 알지네이트, 칼슘포스페이트, 칼슘카보네이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식물성 오일, 주사 가능한 에스테르, 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우리지 등을 들 수 있다.
본 발명의 균주, 상기 균주의 배양물, 발효물, 배양액, 추출물 또는 파쇄물을 의약외품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 예컨대, 공지의 피부 유익균 증진, 피부 유해균 억제, 피부 진정, 피부 염증 개선, 피부 미백, 피부 재생, 상처 치유성분을 포함할 수 있을 것이다. 추가적인 주름 개선, 피부 미백, 피부 트러블 개선, 피부 보습 성분을 포함하게 되면 본 발명의 조성물의 항산화, 미백, 항노화, 피부탄력 개선, 마이크로바이옴 개선, 피부 보습, 피부 진정, 염증 개선, 및 피부 장벽 강화 효과는 더욱 증가될 수 있을 것이다. 상기 성분 추가 시에는 복합 사용에 따른 피부 안전성, 제형화의 용이성, 유효성분들의 안정성을 고려할 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 당업계에 공지된 당업계에 공지된 피부 노화 방지 성분으로서, 레티노산, TGF, 동물 태반 유래의 단백질, 베툴린산 및 클로렐라 추출물; 당업계에 공지된 항염증 성분으로서, 비스테로이드계로 플루페남산, 이부프로펜, 벤지다민, 인도메타신, 프레드니솔론, 덱사메타손, 알란토인, 아즈엔, 하이드로코티손; 및 이들의 유도체와 각종 식물 추출물로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 추가 성분은 전체 조성물 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로 포함될 수 있을 것이며, 상기 함량 범위는 피부 안전성, 본 발명의 균주, 균주의 배양물, 발효물, 배양액, 추출물 또는 파쇄물의 제형화 시의 용이성 등의 요건에 따라 조절될 수 있을 것이다.
의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물 중 어느 하나 이상을 포함하는 피부 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 "클로렐라 불가리스", "균주", "배양물", "배양액", "파쇄물", "발효물", "추출물", "피부 개선"및 "개선"은 전술한 바와 같다.
발명의 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료, 비타민 복합체, 건강기능식품 등의 통상적인 의미의 식품을 모두 포함하며, 본 발명의 클로렐라 불가리스, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물을 포함할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다. 또한 본 발명에 따른 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 발효물, 배양액, 추출물 및 파쇄물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있으며, 환제, 분말, 과립, 제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있다.
상기 건강기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료 효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 " 기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조 시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 식품은 면역 증진 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강 식품(health food)은 일반 식품에 비해 적극적인 건강 유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)는 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용된다.
구체적으로 상기 건강 기능 식품은 클로렐라 불가리스, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물 중 어느 하나 이상을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
상기 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
상기 클로렐라 불가리스, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물 중 어느 하나 이상을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합 양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강 음료 조성물으로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 구체적으로는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
구체적으로 클로렐라 불가리스, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물 중 어느 하나 이상을 식품 조성물의 총중량 대비 0.00001 내지 100 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 기탁 번호 KCTC14768BP로 기탁된 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부 예방 또는 개선 방법을 제공한다.
상기 "클로렐라 불가리스", "균주", "배양물", "배양액", "파쇄물", "발효물", "추출물", "피부 개선"및 "개선"은 전술한 바와 같다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 기탁 번호 KCTC14768BP로 기탁된 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 도포 또는 투여하는 단계를 포함하는, 피부 개선 방법을 제공한다.
상기 "클로렐라 불가리스", "균주", "배양물", "배양액", "파쇄물", "발효물", "추출물", "피부 개선"및 "개선"은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 상기 조성물은 화장료 또는 식품 조성물일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란, 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 상기 예방 또는 개선 방법은 구체적으로, 피부 개선 가능성이 있는 개체에 상기 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "도포"는 어떠한 적절한 방법으로 개체의 피부에 본 발명에 따른 조성물을 접촉시키는 모든 방법을 의미하며, 이를 통해 해당 조성물을 피부 내부로 흡수시키는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 조성물을 개체의 피부에 도포하는 경우, 항산화, 미백, 항노화, 피부탄력 개선, 마이크로바이옴 개선, 피부 보습, 피부 진정, 염증 개선 또는 피부 장벽 강화 효과를 가질 수 있으며, 개체에 상기 조성물을 상기 효과를 나타내기에 유효한 양으로 도포 또는 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 제공하는 것을 총칭하는 의미로서, 상기 투여 경로는 목적이 되는 피부에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 기탁 번호 KCTC14768BP로 기탁된 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부 예방 또는 개선 용도를 제공한다.
상기 "클로렐라 불가리스", "균주", "배양물", "배양액", "파쇄물", "발효물", "추출물", "피부 개선"및 "개선"은 전술한 바와 같다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 울릉도 용출수로부터 신규 클로렐라 불가리스 균주의 분리
울릉도의 용출수에서 항산화, 항염, 피부 미백 등의 효과를 갖는 신규한 클로렐라 불가리스 균주를 다음과 같은 과정으로 분리하였다.
먼저, 용출수가 흐르는 바위에 플랑크톤 네트 (대한켐랩, 카탈로그 넘버 CL-NP2020)을 하루 동안 설치하여 미세조류를 모았고, 상기 모은 미세조류는 BG-11 배지 (Sigma-aldrich, 카탈로그 넘버 C3061-500ML)에 섞은 후, 분리 작업 해주었다. 분리 작업은 희석법 (dilution method)를 이용하였으며 클로렐라 불가리스가 하나의 세포로 확보 될 때까지 실험을 수행하였다.
상기 분리된 균주의 ITS 서열 (서열번호 1)을 NCBI blast 분석한 결과, 기존 균주들과의 일치도가 98.67%의 동일성을 가지므로, 상기 분리된 균주는 기존 균주들과 상이한 신규한 균주임을 확인하였다.
상기 신규 균주는 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) LGHNH20483으로 명명하였으며, 부다페스트조약 하의 기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC)에 2021년 11월 11일자로 기탁하여 기탁 번호 KCTC14768BP 를 부여 받았다.
실시예 2. 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483의 발효물 및 추출물 제조
실시예 2-1. 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483의 발효물 제조
클로렐라 불가리스 신규 균주인 LGHNH20483 균의 전배양 및 본배양을 각각 14일 내지 28일 동안 실시하였다.
구체적으로, 상기 전배양은 BG-11배지 (Sigma-aldrich, 카탈로그 넘버 C3061-500ML)를 사용하였다. 상기 BG-11 배지의 구성 성분은 다음과 같다. NaNO3 1.5 g/L, K2HPO4 0.04 g/L, MgSO4·7H2O 0.075 g/L, CaCl2·2H2O 0.036 g/L, Citric acid 0.006 g/L, Ferric ammonium citrate 0.006 g/L, Disodium magnesium salt 0.001 g/L, Na2CO3 0.02 g/L, Trace metal mix A5 1 mL(H3BO3 2.86 g, MnCl2·4H2O 1.81 g, ZnSO4·7H2O 0.222 g, Na2MoO4·2H2O 0.39 g, CuSO2·5H2O 0.079 g, Co(NO3)2·6H2O 0.0494 g/L).
전배양 및 본배양 각각에서 클로렐라 불가리스 균주인 LGHNH20483를 배지에 접종하고, 25℃에서 광원의 세기는 200~2000 lux 수준으로 16시간: 8시간의 명암 주기로 배양하였다.
이후, 상기 배양물을 원심분리하여 상등액을 취하였으며, 취한 상등액은 본 발명 LGHNH20483 균주의 배양액 및 본배양물을 파쇄하여 수득한 파쇄물을 포함하고, 상기 원심분리한 상등액은 균주가 유기화합물을 분해한 결과 제조되는 것이므로 클로렐라 불가리스 LGHNH20483 균주 발효물에 해당한다.
실시예 2-2. 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483의 추출물 제조
실시예 2-1.에서 배양물을 원심분리한 후 수득한 균주 (pellet)만을 확보하였다. 이후, 상기 균주 (pellet)를 증류수로 3회 이상 세척하였으며, 동결건조를 통해 수분을 제거하였다. 준비된 클로렐라 불가리스 가루 질량의 10배에 해당하는 메탄올 용액을 가하여 상온에서 3일간 추출한 후 감압 여과하였다. 여과한 추출물을 회전 증발기 (rotary evaporator, Buchi, Switzerland)로 농축, 건조하여 추출물을 제조하였다.
실시예 3. 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483의 항산화 효과 확인
실시예 2-2. 방법으로 제조한 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483의 추출물을 이용하여 항산화 효과를 확인하였으며, 양성 대조군 (아스코르브산) 및 비교 균주의 추출물 (클로렐라 불가리스 균주 AG10002 추출물)에 의한 라디칼 소거 활성을 측정하여 항산화 효과를 비교하였다. 상기 비교 균주인 AG10002는 한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC)에서 분양 받은 균주로, 실시예 2-2. 방법으로 추출물을 제조하였다.
DPPH (Sigma-aldrich)는 0.2 mM이 되도록 95% 에탄올에 녹여 사용하였다. DPPH 용액과 희석된 균주 추출물을 각각 1:1로 혼합하여 30분간 실온의 암실에서 반응시킨 후, ELISA reader를 이용해 517 nm 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성 (Radical scavenging activity)은 하기 식과 같이 시료 용액의 첨가군과 무첨가군 사이의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었으며, standard의 경우에는 균주 추출물과 95% 에탄올을 각각 1:1로 혼합하여 사용하였다.
Figure PCTKR2023005428-appb-img-000001
DPPH 라디칼 소거 활성 (%) 농도(%)
0.2% 0.1%
LGHNH20483 추출물 82.1% 63.1%
AG10002 추출물 52.1% 32.0%
Ascorbic acid 0.0016% 86.8%
- 양성 대조군: ascorbic acid 0.0016%
상기 표 1의 결과에서 나타나듯이, 실험 농도 0.2%, 0.1%에서 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483 추출물은 비교 균주인 AG10002의 추출물보다 DPPH 라디칼 소거 활성이 30%이상 증가하였는바, 이를 통해 본 발명의 클로렐라 불가리스 추출물은 높은 라디칼 소거 활성을 갖는다는 것을 확인하였다.
그에 따라, 본 발명의 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483 추출물은 항산화에 우수한 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 4. 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483의 미백 효과 확인
실시예 2-1. 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483의 발효물을 이용하여 미백 효과를 확인하였으며, 음성 대조군, 양성 대조군 (알부틴) 및 비교 균주의 발효물 (클로렐라 불가리스 균주 AG10002 발효물)에 의한 세포 내의 멜라닌 (Melanin) 색소의 양 및 타이로시네이즈 활성 (Tyrosinase activity) 정도를 측정하여 미백 효과를 비교하였다. 상기 비교 균주인 AG10002는 한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC)에서 분양 받은 균주로, 실시예 2-1. 방법으로 발효물을 제조하였다.
MNT-1 멜라닌 세포 (Melanocyte, ATCC, 카탈로그 넘버 CRL-3450)를 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에 1~2 x 105 cells/㎖의 농도로 분주하고 24시간 배양하였다. 제조한 발효물 또는 양성 대조군 시료를 표 2에 해당하는 농도로 희석하여 처리하고 72시간 배양한 후, 세포를 회수하였다. 13,000 rpm으로 1분간 원심 분리하고 상층액을 제거한 후, 펠렛에 0.5% triton X-100 용액 300 μl를 첨가하여 세포를 용해하였다. 이를 다시 13,000 rpm으로 3분간 원심 분리하고 펠렛과 상층액을 따로 회수하였다. 세포 펠렛은 0.5N NaOH를 100 μl 첨가하고 밤새 배양하여 멜라닌을 녹여낸 후, ELISA reader를 이용하여 450 nm 흡광도를 측정하였다.
타이로시네이즈 활성을 측정하기 위해 상기 회수한 세포 용해 상층액 100 μl를 취하고, 여기에 1 mM L-DOPA (Sigma-aldrich) 용액을 첨가한 후 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응액은 ELISA reader를 이용하여 450 nm 흡광도를 측정하였다
무첨가 대조군 Arbutin
200 μg/mL		 LGHNH20483 발효물 2.0% AG10002 발효물 2.0%
멜라닌 함량(%) 100 82.9 68.6 90.5
타이로시네이즈 활성(%) 100 51.0 34.2 81.1
- 양성 대조군: 알부틴(Arbutin) 200 μg/mL
상기 표 2의 결과에서 나타나듯이, 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483 발효물이 처리된 멜라닌 세포의 멜라닌 함량은 무첨가 대조군 대비 약 31%이상 감소하였고, 타이로시네이즈 활성은 무첨가 대조군 대비 약 65%이상 감소하였으며, 멜라닌 함량 감소 및 타이로시네즈 활성 감소는 양성 대조군보다도 감소하였음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 균주 LGHNH20483의 발효물은 비교 균주인 AG10002 발효물 보다도 현저한 멜라닌 생합성 저해 효과를 갖는 것을 확인하였다.
그에 따라, 본 발명의 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483 발효물은 미백에 우수한 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 5. 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483의 항노화 및 피부탄력 효과 확인
실시예 2-1. 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483의 발효물을 이용하여 항노화 및 피부탄력 효과를 확인하였으며, 음성 대조군, 양성 대조군 (TGF-β) 및 비교 균주의 발효물 (클로렐라 불가리스 균주 AG10002 발효물)에 의한 콜라겐 농도 변화를 측정하여 제 1 형 콜라겐 합성 촉진에 따른 항노화 및 피부탄력 효과를 비교하였다.
구체적으로, 상용 DMEM 에 10% FBS 를 첨가한 배지를 이용하여 48-well plate에 2~5 x 104 cells/㎖의 농도로 분주하고 24시간 동안 섬유아세포 (fibroblasts)를 배양하였다. 기존 배양액을 제거하고, 제조한 발효물 또는 양성 대조군 시료를 무혈청 배지에 아래 표 3에 해당하는 농도로 희석하여 24 시간 동안 처리하였다. 이후, 세포 배양액을 수득하여 ELISA assay 를 사용하여 제 1 형 콜라겐 합성 촉진 효과를 측정하였다. 합성된 콜라겐은 Human Pro-Collagen Iα1/COLIA1 (R&D systems, 카탈로그넘버 DY6220-05)을 이용하여 수치화하였으며, 시료의 콜라겐 합성률은 대조군 (무혈청 배지)에 대비하여 증가한 비율을 계산하여 산출하였다.
콜라겐 농도(%) 무첨가 대조군 TGF-β
5 ng/mL		 LGHNH20483 발효물 0.05% AG10002 발효물 0.05%
100 156.5 124.6 116.78
- 양성 대조군: TGF-β 5 ng/mL
상기 표 3의 결과에서 나타나듯이, 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483 발효물이 처리된 섬유아세포의 콜라겐 농도는 무첨가 대조군 대비 약 24% 이상 증가하는 것을 확인하였으며, 비교 균주인 AG10002 발효물 보다 현저한 콜라겐 합성 촉진 효과를 갖는 것을 확인하였다.
그에 따라, 본 발명의 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483 발효물은 항노화 및 피부탄력 에 우수한 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 6. 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483의 마이크로바이옴 개선 효과 확인
실시예 2-1. 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483의 발효물을 이용하여 마이크로바이옴 개선 효과 (In vitro 프리바이오틱 능력)를 확인하였으며, 대조군 및 비교 균주의 발효물 (클로렐라 불가리스 균주 AG10002 발효물)에 의한 유익균 및 유해균의 생장 속도 변화를 측정하여 마이크로바이옴 개선 효과를 비교하였다.
피부상재균 중 대표적인 유익균으로 표피포도구균 (Staphylococcus epidermidis, S. epidermidis)를 선정하였으며, 대표적인 유해균은 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus, S. aureus)를 선정하였다.
실시예 6-1. 유익균 ( S. epidermidis )의 생장 속도 평가
상용 TSB (Tryptic soy broth, Difco) 배지를 이용하여 멸균 액상 배지를 제조하였으며, S. epidermidis 글리세롤 보존액을 멸균 액상 TSB 배지에 접종하여, 30-37℃에서 6-18 시간 동안 전배양하였다. 이러한 전배양은 1-2회 실시하였다. 이후, 멸균 액상 TSB 배지에 각각의 발효물을 첨가하고, 상기 전배양 용액을 접종하여, 30-37℃에서 6-18 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 접종 직후의 흡광도 (OD)와 생장정체기 (stationary phase) 때의 흡광도를 측정하여, 그 값의 비율 (생장률)을 통계의 변수로 사용하였다. 상기 추출물을 처리 하지 않은 대조군 대비, 처리한 실험군의 생장률을 비교하여, 시료가 균의 생장에 유의미한 효과를 주는지 판단하였다.
S. epidermidis
생장률 (%)		 무첨가 대조군 LGHNH20483 발효물
1.0%		 AG10002 발효물 1.0%
0 6.43 0.97
상기 표 4의 결과에서 나타나듯이, 불가리스 균주 LGHNH20483 발효물이 처리된 유익균 (S. epidermidis)의 생장률은 비교 균주인 AG10002 발효물 대비 약 7배 이상 증가함을 확인하였다.
실시예 6-2. 유해균 ( S. aureus )의 생장 속도 평가
유해균인 S. aureus의 생장 속도를 평가하였으며, 평가 조건 및 방법은 상기 실시예 6-1. 유익균의 생장 속도 평가 조건 및 방법과 동일하게 진행하였다.
S. aureus
생장률 (%)		 무첨가 대조군 LGHNH20483 발효물
1.0%		 AG10002 발효물 1.0%
0 -8.28 -0.92
상기 표 5의 결과에서 나타나듯이, 불가리스 균주 LGHNH20483 발효물이 처리된 유해균 (S. aureus)의 생장률은 비교 균주인 AG10002 발효물 대비 약 9배 이상 억제됨을 확인하였다. 그에 따라, 본 발명의 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483 발효물은 마이크로바이옴 개선에 우수한 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 7. 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483의 피부 보습 효과 확인
실시예 2-1. 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483의 발효물을 이용하여 피부 보습 효과를 확인하였으며, 대조군 및 비교 균주의 발효물 (클로렐라 불가리스 균주 AG10002의 발효물)에 의한 아쿠아포린3 (aquaporin3, AQP3)의 발현 증가 정도를 측정하여 피부 보습 효과를 비교하였다.
피부각질형성세포 (keratinocyte)는 표피성장인자 (epidermal growth factor, EGF)와 bovine pituitary extract (BPE)가 첨가된 keratinocyte-SFM (Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 넘버 17005042)배지를 이용하였으며, 상기 피부각질형성 세포를 2~5 x 105 cells/㎖ 농도로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 제조한 발효물을 EGF와 BPE가 첨가되지 않은 배지에 희석한 후 24시간 동안 처리하였다. 배양된 세포로부터 RNA를 분리하기 위해 Easy BlueTM Total RNA Extraction Kit (iNtRON, 카탈로그 넘버 17061)를 이용하였으며, 분리한 RNA는 M-MLV 역전사 효소 (Reverse Transcriptase, ELPIS-Biotech, 카탈로그 넘버 EBT-1027)로 cDNA 합성을 수행한 후, 이를 주형으로 중합 효소 연쇄 반응 (real-time PCR, Bio-Rad, CFX Connect Real-Time PCR detection system)을 수행하였다. Real-time PCR에 이용한 AQP3 프라이머의 염기 서열은 5'-ACCTTTGCCATGTGCTTCCT-3'(서열번호 2), 5'-GCGTCTGTGCCAGGGTGTA-3'(서열번호 3)이고, 하우스키핑 유전자는 (housekeeping gene) β-actin 5'-ATTGGCAATGAGCGGTTCC-3'(서열번호 4), 5'-GGTAGTTTCGTGGATGCCACA-3'(서열번호 5)를 기준으로 하였다. 시료의 AQP3 유전자의 발현 정도는 무첨가 대조군의 mRNA 발현량을 기준으로 수치화하였다.
무첨가 대조군 LGHNH20483 발효물
2.0%		 AG10002 발효물 2.0%
AQP3 mRNA 농도 증가(배수) 1.0 2.29 1.45
상기 표 6의 결과에서 나타나듯이, 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483 발효물이 처리된 피부각질형성세포의 AQP3 유전자 발현 정도는 비교 균주인 AG10002 발효물 대비 약 1.6배 이상 증가함을 확인하였다. 그에 따라, 본 발명의 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483 발효물은 피부 보습에 우수한 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 8. 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483의 피부 진정 및 염증 개선 효과 확인
실시예 2-1. 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483의 발효물을 이용하여 피부 진정 및 염증 개선 효과를 확인하였으며, 양성 대조군 (L-NMMA) 및 비교 균주의 발효물 (클로렐라 불가리스 균주 AG10002의 발효물)에 의한 NO생성 억제율을 측정하여 피부 진정 및 염증 개선 효과를 비교하였다.
DMEM에 10% FBS 를 첨가하여 성장 배지로 이용하였으며 마우스 대식세포주 인 Raw264.7 세포 (ATCC, 카탈로그 넘버 CRL-2788)를 1~2 x 105 cells/㎖ 농도로 분주하고 5% CO2 인큐베이터에서 하루 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 무혈청배지로 12시간 starvation 시킨 후, 제조한 발효물 및 양성 대조군을 처리하여 30분 동안 전처리 하였다. 이후, 500 ng/ml의 LPS (Lipopolysaccharides, SIGMA, 카탈로그 넘버 L43901)를 처리하고 18시간 동안 배양하였다. 배양 후 상층액을 취해 96-well 조직 배양 플레이트에 옮기고, GREISS 시약 (SIGMA, 카탈로그 넘버 G4410)를 가해 상온에서 15분간 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이후, NO 정량 키트를 이용하여 NO 생성 억제능을 하기 식과 같이 평가하였다.
Figure PCTKR2023005428-appb-img-000002
NO생성 억제율(%) 농도
0.1% 0.5% 1.0% 2.0%
LGHNH20483 발효물 10.6 21.1 35.1 66.5
AG10002 발효물 5.21 8.93 12.27 18.43
L-NMMA 100 μM 60.5%
- 양성 대조군: L-NMMA 100 mM
상기 표 7의 결과에서 나타나듯이, 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483 발효물이 처리된 Raw264.7 세포의 NO 생성 억제율은 비교 균주인 AG10002 발효물 대비 약 2배 내지 약 3.6배 이상 증가함을 확인하였다.
그에 따라, 본 발명의 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483 발효물은 피부 진정 및 염증 개선에 우수한 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 9. 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483의 피부 장벽 강화 효과 확인
실시예 2-1. 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483의 발효물을 이용하여 피부 장벽 강화 효과를 확인하였으며, 대조군 및 비교 균주의 발효물 (클로렐라 불가리스 균주 AG10002의 발효물)에 의한 인볼루크린 (involucrin, IVL), 로리크린 (loricrin, LOR)의 발현 증가 정도를 측정하여 피부 장벽 강화 효과를 비교하였다.
피부각질형성세포(keratinocyte)는 표피성장인자 (epidermal growth factor, EGF)와 bovine pituitary extract (BPE)가 첨가된 keratinocyte-SFM (Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 넘버 17005042)배지를 이용하여 배양하였다. 60-mm 배양 플레이트 (SPL, 카탈로그 넘버 카탈로그 넘버 20060)에 피부각질형성 세포를 2~5 x 105 cells/㎖ 농도로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 제조한 발효물을 EGF와 BPE가 첨가되지 않은 배지에 희석한 후 24시간 동안 처리하였다. 배양된 세포로부터 RNA를 분리하기 위해 Easy BlueTM Total RNA Extraction Kit (iNtRON, 카탈로그 넘버 17061)를 이용하였으며, 분리한 RNA는 M-MLV 역전사 효소 (Reverse Transcriptase, ELPIS-Biotech, 카탈로그 넘버 EBT-1027)로 cDNA 합성을 수행한 후, 이를 주형으로 중합 효소 연쇄 반응 (real-time PCR, Bio-Rad, CFX Connect Real-Time PCR detection system)을 수행하였다. Real-time PCR에 이용한 IVL 프라이머의 염기 서열은 5'-TGGTCTGGGTTTTCTGCTTT-3'(서열번호 6), 5'-GATGTCCCAGCAACACACAC-3'(서열번호 7)이며 LOR 프라이머의 염기 서열은 5'-TAGAGACGCCTCCGTAGCTC-3'(서열번호 8), 5'-AGTGGACTGCGTGAAGACCT-3'(서열번호 9)이다. 하우스키핑 유전자는 GAPDH(5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'(서열번호 10), 5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'(서열번호 11)를 기준으로 하였다. 시료의 involucrin 및 loricrin 유전자의 발현 정도는 무첨가 대조군의 mRNA 발현량을 기준으로하여 수치화하였다.
무첨가 대조군 LGHNH20483 발효물
1.0%		 AG10002 발효물 1.0%
IVL mRNA 농도 증가(배수) 1.0 1.77 1.26
무첨가 대조군 LGHNH20483 발효물
0.5%		 AG10002 발효물 0.5%
LOR mRNA 농도 증가(배수) 1.0 2.36 1.81
상기 표 8, 9의 결과에서 나타나듯이, 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483 발효물이 처리된 피부각질형성세포의 IVL 유전자 발현 정도는 비교 균주인 AG10002 발효물 대비 약 1.4배 이상 증가, LOR 유전자 발현 정도는 1.3배 이상 증가함을 확인하였다. 그에 따라, 본 발명의 클로렐라 불가리스 균주 LGHNH20483 발효물은 피부 장벽 강화에 우수한 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2023005428-appb-img-000003

Claims (11)

  1. 기탁 번호 KCTC14768BP로 기탁된 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) 균주.
  2. 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물 중 어느 하나 이상을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 피부 개선은 항산화, 미백, 항노화, 피부탄력 개선, 마이크로바이옴 개선, 피부 보습, 피부 진정, 염증 개선, 및 피부 장벽 강화로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 화장료 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 라디칼 소거 증가, 멜라닌 색소 함량감소, 타이로시네즈 활성 증가, 콜라겐 합성 촉진, 유익균 생장 증가, 유해균 생장 억제, 아쿠아포린3 (AQP3)의 발현 증가, NO생성 억제, 인볼루크린 (IVL) 및 로리크린 (LOR)의 발현 증가로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 효과를 갖는 것인, 화장료 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 및 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출하여 제조한 것인, 화장료 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 추출물은 상기 배양물, 발효물, 배양액 또는 파쇄물을 추출한 것인, 화장료 조성물.
  7. 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물 중 어느 하나 이상을 포함하는 피부 개선용 의약외품 조성물.
  8. 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물 중 어느 하나 이상을 포함하는 피부 개선용 식품 조성물.
  9. 기탁 번호 KCTC14768BP로 기탁된 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 도포 또는 투여하는 단계를 포함하는, 피부 개선 방법.
  10. 제9항항에 있어서, 상기 조성물은 화장료 또는 식품 조성물인 것인, 방법.
  11. 기탁 번호 KCTC14768BP로 기탁된 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주의 파쇄물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부 예방 또는 개선 용도.
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