WO2023210899A1 - 다중 변이 코로나바이러스 치료용 약물 스크리닝 방법 - Google Patents

다중 변이 코로나바이러스 치료용 약물 스크리닝 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a drug screening method for treating multiple mutant coronaviruses.
  • the first is a drug that targets the spike protein of SARS-CoV-2. These drugs bind to the spike protein, preventing the virus from binding to the ACE-2 receptor on the surface of the host cell, thereby blocking the entry of the virus into the host cell.
  • SARS-CoV-2 a drug that targets the spike protein of SARS-CoV-2.
  • These drugs bind to the spike protein, preventing the virus from binding to the ACE-2 receptor on the surface of the host cell, thereby blocking the entry of the virus into the host cell.
  • the efficacy of neutralizing antibodies is reduced due to frequent mutations in the spike protein.
  • the highly infectious delta variant has 16 mutations within the spike protein, and the omicron variant has 32 mutations, making the action of neutralizing antibodies more difficult.
  • the second is a drug that targets viral RNA. They interfere with the SARS-CoV-2 RNA replication process and inhibit viral replication by causing fatal RNA mutations.
  • Remdesivir and Molnupiravir are representative drugs, but in addition to controversy over the efficacy of the drug, remdesivir has been reported to have side effects such as deterioration of liver and kidney function, and Molnupiravir is a mammalian RNA Fatal side effects have also been reported that can cause mutations and cause deformities or congenital genetic diseases due to genome damage.
  • the third is a drug that targets SARS-CoV-2-derived proteolytic enzymes.
  • This is a method of suppressing the proliferation of the virus by inhibiting the activity of M pro , the main protease of SARS-CoV-2. Specifically, it initiates replication by cutting the pp1a/ab protein of the virus that has entered the cell. It is a virus-derived proteolytic enzyme. Meanwhile, the viral replication mechanism by M pro is shared by various types of coronaviruses (SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-HKU1, etc.).
  • the drug has a low risk of side effects on the human body and is expected to have a high possibility of being used as a treatment for coronaviruses that may occur in the future.
  • the present invention provides a method for screening M pro inhibitors that inhibit the M pro activity of coronaviruses.
  • the existing M pro inhibitor screening method not only uses a high concentration of M pro despite the high unit price of M pro , but also requires more than two types of fluorescent substances and overcomes the limitations of several days of screening time.
  • the present invention seeks to provide a drug screening method targeting the M pro active site that does not change even with mutations in coronaviruses.
  • the present invention seeks to provide a composition for screening coronavirus treatments.
  • the present invention includes the steps of preparing an engineered amyloid peptide comprising the sequences represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; Step (b) of producing gold nanoparticles by mixing gold chloride (HAuCl 4 ) and sodium citrate; and step (c) of preparing an engineered amyloid nanocomposite by mixing the engineered amyloid peptide of step (a) with the gold nanoparticles of step (b). .
  • the engineered amyloid peptide of step (a) may be ⁇ -sheet, but is not limited thereto.
  • step (b) may be performed by mixing chloroauric acid and ultrapure water and heating, then adding sodium citrate and heating, but is not limited to this.
  • the engineered amyloid nanocomposite of step (c) may be prepared by mixing gold nanoparticles and engineered amyloid peptide in a volume ratio of 1:0.5 to 10, but is not limited thereto.
  • the engineered amyloid nanocomposite of step (c) may be red, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a composition for screening coronavirus therapeutics prepared by the above production method.
  • the present invention provides a screening method for a coronavirus treatment comprising treating the composition with a coronavirus treatment candidate drug.
  • the screening method may further include, but is not limited to, selecting the candidate drug as a coronavirus treatment when the color changes to blue after treatment with the candidate drug.
  • the present invention provides a method for screening coronavirus therapeutic agents in a short time using low concentrations of M pro .
  • Figure 1 is a diagram briefly showing the principles of amyloid peptide synthesis and screening of the present invention.
  • Figure 2 is a diagram showing the results of analyzing fibrillation of amyloid peptide in one embodiment of the present invention.
  • Figure 2(a) is the AFM (atomic force microscopy) image result of MCAP monomer
  • Figure 2(b) is a graph showing the height of the white dotted line in Figure 2(a)
  • Figure 2(c) is analysis through AFM graph.
  • Figure 2(d) is the AFM image result of the fibrillated amyloid peptide
  • Figure 2(e) is a graph showing the height of the white dotted line in Figure 2(d)
  • Figure 2(f) is the AFM
  • Figure 2(g) is a TEM (transmission electron microscope) image result of fibrillated amyloid peptide and an enlarged view thereof.
  • Figure 3 is a diagram confirming the ⁇ -sheet structure of fibrillated amyloid peptide in one embodiment of the present invention.
  • Figure 3(a) is the dynamic light scattering (DLS) analysis result
  • Figure 3(b) is the CD (Circular dichroism) analysis result
  • Figure 3(c) is the Thioflavin T fluorescence analysis result
  • Figure 3(d) is the FT-IR analysis result. This diagram shows the analysis results.
  • Figure 4 is a diagram confirming that the fibrillated amyloid peptide of the present invention is decomposed upon treatment with M pro .
  • Figure 5 is a diagram analyzing the structural stability of engineered amyloid nanocomposite (MCAP-AuNP) in one embodiment of the present invention.
  • Figure 5(a) is a diagram showing the absorbance peak according to the mixing amount of amyloid peptide solution.
  • Figure 5(b) shows the results of UV-vis spectrum analysis over time of a nanocomposite prepared with 50 ⁇ L amyloid peptide solution.
  • Figure 6 is a diagram analyzing the freeze-thaw performance of engineered amyloid nanocomposite (MCAP-AuNP) in one embodiment of the present invention.
  • Figure 6(a) is the UV-vis spectrum analysis result before freezing
  • Figure 6(b) is the UV-vis spectrum analysis result after freezing and thawing.
  • Figures 6(c) and 6(d) show gold nanoparticles (bare AuNPs, left: before freezing, right: after freezing and thawing) and engineered amyloid nanocomposites (MCAP-AuNPs, left: frozen) before and after freezing and thawing, respectively.
  • Figure 7 is a diagram analyzing the physical and chemical properties of gold nanoparticles (bare AuNP) and engineered amyloid nanocomposite (MCAP-AuNP) in one embodiment of the present invention.
  • Figure 7(a) is the result of measuring the hydrodynamic diameter
  • Figure 7(b) is the result of analyzing the zeta potential
  • Figure 7(c) is the result of the gold nano-engineered amyloid nanocomposite (MCAP-AuNP).
  • Figure 7(d) shows a TEM image of the engineered amyloid nanocomposite (MCAP-AuNP).
  • Figure 8(a) is a diagram analyzing the UV-vis spectrum of engineered amyloid nanocomposite (MCAP-AuNP) according to M pro concentration in one embodiment of the present invention
  • Figure 8(b) is a diagram showing the denatured M pro
  • Figure 8 ( c) which shows the results of the same analysis using Figure 8(d) is a diagram showing the TEM image results of MCAP-AuNPs depending on whether M pro was modified or not treated with MCAP-AuNPs.
  • FIG. 9 is a diagram showing the analysis of the UV-vis spectrum of engineered amyloid nanocomposite (MCAP-AuNP) by screening previously known M pro inhibitors in one embodiment of the present invention.
  • MCAP-AuNP engineered amyloid nanocomposite
  • Figure 10(a) is a diagram showing an image observed by TEM of the reaction of engineered amyloid nanocomposite (MCAP-AuNP) according to M pro treatment in one embodiment of the present invention.
  • Figure 10(b) shows the reaction results according to leupeptin treatment
  • Figure 10(c) shows the reaction results according to lopinavir treatment
  • Figure 10(d) shows the reaction results according to hesperetin treatment.
  • Figure 11 is a diagram showing the difference between engineered amyloid peptide (MCAP) and MCRP, an engineered peptide that does not contain an amyloid sequence, in one embodiment of the present invention.
  • MCAP engineered amyloid peptide
  • MCRP engineered peptide that does not contain an amyloid sequence
  • FIG 12 is a diagram analyzing ThT signals of engineered amyloid peptide (MCAP) and MCRP in one embodiment of the present invention.
  • MCAP engineered amyloid peptide
  • Figure 13 is a diagram analyzing the enzyme activity of M pro according to treatment with an M pro inhibitor in one embodiment of the present invention.
  • the present invention relates to an engineered amyloid nanocomposite (MCAP-AuNP) in which an amyloid peptide containing an M pro cleavage sequence (LQS) is coated on gold nanoparticles, which inhibits M pro , a proteolytic enzyme derived from coronavirus. It relates to a method for screening M pro inhibitors.
  • M pro main protease
  • the present invention can inhibit the proliferation of the virus by inhibiting the protease derived from the virus.
  • the coronavirus refers to viruses belonging to the coronavirus family. Coronaviruses are known to cause respiratory or digestive infectious diseases depending on the characteristics of the virus and the host.
  • the viral replication mechanism by M pro is shared by various types of coronaviruses (SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-HKU1, etc.).
  • SARS-CoV coronaviruses
  • MERS-CoV MERS-CoV
  • HCoV-HKU1 coronaviruses
  • Lyophilized main protease (M pro ) of SARS-CoV-2 was purchased from Biosynth Carbosynth (UK). ebselen, hesperetin, leupeptin, lopinavir, hesperidin, chlorauric acid trihydrate (HAuCl 4 3H 2 O) and ginseng citrate. Sodium (trisodium citrate) was purchased from Sigma-Aldrich (USA). Distilled water (DW) and phosphate buffered saline (PBS) were purchased from Gibco (USA).
  • the main protease (M pro ) of SARS-CoV-2 cleaves the LQS, LQA, and LQG sequences.
  • the prion protein-derived amyloid sequence (GNNQQNY) and the M pro cleavage sequence (LQS) were fused to produce an engineered amyloid peptide (M pro cleavage site embedded amyloid peptide, MCAP, LQGNLQSNQQNY, Peptron, Korea) was used (Figure 1).
  • Engineered amyloid peptide (MCAP) containing prion protein-derived amyloid sequence (GNNQQNY) and M pro cleavage sequence (LQS) was dissolved in distilled water to prepare a 1 mg/mL MCAP solution.
  • 50 ⁇ L of the MCAP solution and 150 ⁇ L of distilled water at pH 2 were mixed and fibrillated by sufficiently reacting at 1,000 rpm for 5 days in a shaking incubator (Eppendorf, Germany) at 37°C. Fibrillated amyloid peptide was confirmed as follows.
  • AFM analysis was performed with NX10 (Park systems, South Korea) using a silicon tip (NCHR, Park Systems, South Korea) with a radius of less than 10 nm.
  • AFM measurements were performed in NCM mode at a scan rate of 0.4 Hz and an image size of 5 ⁇ m ⁇ 5 ⁇ m.
  • Image flattening and topological analysis were performed using Smart Scan (Park systems, South Korea) software. Images obtained through AFM analysis were used to measure the persistence length of fibrillated amyloid peptide using Easyworm software.
  • Figure 2(a) shows an AFM image analyzing the persistence length of MCAP monomer.
  • FIG. 2(b) is a diagram showing the height of the white dotted line in FIG. 2(a).
  • Figure 2(c) shows the approximate average size of MCAP monomer analyzed through AFM images, which is 330.19 ⁇ 73.9 pm.
  • Figure 2(d) shows an AFM image analyzing the persistence length of fibrillated amyloid peptide.
  • Figure 2(e) is a diagram showing the height of the white dotted line in Figure 2(d).
  • Figure 2(f) shows the approximate average size of fibrillated amyloid peptide analyzed through AFM images, which is 2.64 ⁇ 0.74 nm.
  • TEM analysis was performed by reacting a 0.25 mg/mL MCAP solution at 37°C at 1,000 rpm for 96 hours, centrifuging at 12,000 rpm for 1 hour, and removing the supernatant.
  • Figure 2g is a TEM analysis image and its enlarged shape. Through this, it was confirmed that fibrillation of MCAP had progressed.
  • the hydrodynamic diameter was measured using dynamic light scattering (DLS) while reacting a 0.25 mg/mL MCAP solution at 37°C and 1,000 rpm for 3 days. 1 mL of the reacted MCAP solution was placed in a disposable cuvette (10 mm light path, standard type, Kartell, Italy) and measured with Zetasizer Nano S90 (Malvern Panalytical, United Kingdom) for 4 cycles, 10 times per cycle, for a total of 40 times. As shown in Figure 3(a), fibrillation progresses from the monomeric form of MCAP depending on the reaction time, and the diameter and standard deviation increase (1h: 0.20 ⁇ 0.073 ⁇ m, 12h: 0.30 ⁇ 0.03 ⁇ m, 24h: 0.98 ⁇ 0.13). ⁇ m, 36h: 3.40 ⁇ 1.37 ⁇ m, 48h: 3.62 ⁇ 2.02 ⁇ m).
  • CD can confirm the secondary structure of a material, and in the form of a random coil, the y-axis value shows a negative value at a wavelength ⁇ 210 nm.
  • the 0.25 mg/mL MCAP solution was reacted at 37°C and 1,000 rpm for 12, 24, 36, 48, 60, and 96 h, respectively, and then placed in a quartz glass cuvette (1 mm path length, 10 mm inside wide, Aireka Cells, USA). Measurements were taken after injection. Circular dichroism spectra were measured with J-815 (Jasco, Japan), which has a spectral detection range of 190-300 nm and a scanning speed of 10 nm/min.
  • Spectra had a resolution of 8 nm and were processed with CDTool software.
  • fibrillated amyloid peptide was confirmed to have a negative value at a wavelength of 210 to 240 nm, and a peak showing a positive value at a wavelength ⁇ 210 nm.
  • the signal due to the ⁇ -sheet structure increased with reaction time, which means that MCAP is gradually fibrillated into a ⁇ -sheet structure.
  • Thioflavin T is a fluorescent substance that detects ⁇ -sheet structures.
  • a 0.25 mg/mL MCAP solution was reacted with a 20 ⁇ M ThT solution and a pH 2 solution at 37°C and 1,000 rpm for 3 days, and the ThT fluorescence signal was measured.
  • ThT fluorescence signals were measured at 30-minute intervals for 99 hours. The experimental results are shown in Figure 3(c). The ThT fluorescence signal value increased with reaction time, indicating the formation of fibrillated amyloid peptide in the form of a ⁇ -sheet.
  • Example 2 decomposition of fibrils was confirmed by reacting M pro with engineered amyloid peptide (MCAP). Fibrillated amyloid peptide was prepared by incubating 0.25 mg/mL MCAP solution at pH 2 and 37°C for 5 days. 0.01 mg/mL of M pro was reacted with the prepared fibrillated amyloid peptide for 12 hours.
  • MCAP engineered amyloid peptide
  • Gold nanoparticles were synthesized using citrate reduction. 2.5 mL of 38.8 mM chloroauric acid (HAuCl 4 ) solution and 45 mL Millipore water were mixed in a round beaker and heated while stirring at 1,200 rpm. After boiling the mixture, 1 mL of 80 mM sodium citrate solution was added and heated for 1 hour while stirring at 1,200 rpm to prepare gold nanoparticles stabilized with citric acid. Gold nanoparticles were manufactured with a size of 20 nm. The final gold nanoparticle solution was cooled to room temperature and stored at 4°C.
  • a 0.1 mg/mL MCAP solution was prepared by adding a mixture of distilled water and PBS in a 10:1 volume ratio to MCAP.
  • the 20 nm gold nanoparticle solution was centrifuged at 13,000 rpm for 20 minutes and the supernatant was removed.
  • 40 ⁇ L of the gold nanoparticle solution was mixed with 25, 50, 100, 200, 300, and 400 ⁇ L of Example 2 (0.09 mg/mL), respectively, and reacted at 37°C and 1,000 rpm to synthesize an engineered amyloid nanocomposite.
  • a salt resistance test was performed for 24 hours by adding 600 ⁇ L of 1 ⁇ PBS, and the UV-vis spectrum was measured.
  • the UV-vis spectrum was measured with a spectrophotometer (scan range 400 ⁇ 800 nm, scan rate 600 nm/min, Perkin Elmer, USA). In the UV-vis spectrum of dispersed gold nanoparticles of 20 nm or less, a peak was detected around 525 nm (A 525 ). If the fibrillated amyloid peptide does not coat the surface of the gold nanoparticle well, the gold nanoparticles are aggregated by PBS, causing a color change in the solution, and the peak moves to near 650 nm (A 650 ). Therefore, the degree of aggregation of gold nanoparticles can be quantified by relative absorbance (A 650 /A 525 ).
  • Example 5 the freeze-thaw performance of the gold nanoparticle solution (bare AuNP) prepared in Example 5 and the engineered amyloid nanocomposite (MCAP-AuNP) prepared with 50 ⁇ L MCAP solution was analyzed.
  • Figure 6(a) shows the UV-vis spectrum measurement results before freezing
  • Figure 6(b) shows the UV-vis spectrum measurement results after freezing and thawing.
  • the peak change before and after freezing and in Figure 6(c) after freezing and thawing, aggregation of gold nanoparticles occurred and a color change was observed, whereas the engineered amyloid nanocomposite (MCAP-AuNP) had constant peaks before and after freezing.
  • MCAP-AuNP engineered amyloid nanocomposite
  • Example 3 the results of measuring the hydrodynamic diameters of bare AuNPs and MCAP-AuNPs using dynamic light scattering (DLS) are shown in FIG. 7(a). Bare AuNP was 19.01 ⁇ 0.53 nm, MCAP-AuNP was 21.96 ⁇ 0.67 nm, and MCAP-AuNP coated with engineered amyloid peptide was confirmed to be about 3 nm thicker than the gold nanoparticle before coating.
  • DLS dynamic light scattering
  • Figure 7(b) shows the zeta potential value of MCAP-AuNP.
  • a 0.4 mg/mL MCAP-AuNP solution was placed in the Zetasizer Cuvette, and the accumulation time for each point was measured 15 times.
  • the zeta potential of MCAP-AuNP was -19 ⁇ 3.1 mV, confirming that MCAP-AuNP had excellent structural stability.
  • XPS X-ray photoelectron spectroscopy
  • the range from 0 to 800 eV was scanned using a 40 eV pass energy with a 0.1 eV step size.
  • the nitrogen (N) 1s peak was measured by the protein, and from this, it was confirmed that the surface of the gold nanoparticle of the engineered amyloid nanocomposite (MCAP-AuNP) was coated with MCAP solution, that is, amyloid peptide. I was able to confirm.
  • FIG. 7(d) is a TEM image result of engineered amyloid nanocomposite (MCAP-AuNP). These results also indicate that engineered amyloid peptides are coated on the surface of the gold nanoparticles of the engineered amyloid nanocomposite (MCAP-AuNP).
  • M pro was dissolved in PBS at various concentrations (0.925-18.5 nM) for 20 minutes to prepare each volume at 0.8 mL.
  • the M pro solution of each concentration was mixed with the gold nanoparticle solution (bare AuNP) prepared in Example 5 and the engineered amyloid nanocomposite (MCAP-AuNP) prepared with 50 ⁇ L amyloid peptide solution, so that the total volume was 1 mL. It was made to be.
  • the UV-vis spectrum was measured with a spectrophotometer.
  • FIG. 8(a) As shown in Figure 8(a), as the M pro concentration increased, the UV peak shifted to the right. Meanwhile, as a result of denaturing M pro at 90°C for 4 hours and reacting in the same manner as above, it was confirmed that there was no change in the UV spectrum, as shown in Figure 8(b).
  • a sigmoidal dose-response curve quantifying the degree of aggregation (A 650 /A 525 ) of MCAP-AuNPs depending on M pro denaturation is shown in Figure 8(c).
  • Figure 8(d) is a TEM image result of MCAP-AuNP depending on whether or not M pro is modified.
  • M pro 50 ng of M pro (1.4 nM) was added to M pro inhibitors (ebselen, hesperidin, hesperetin, lopinavir, leupeptin) dissolved in various concentrations in PBS (1.5% DSMO) to prepare a total solution volume of 800 ⁇ L.
  • M pro inhibitors ebselen, hesperidin, hesperetin, lopinavir, leupeptin
  • PBS 1.5% DSMO
  • 600 ⁇ L of the final solution was added to 200 ⁇ L engineered amyloid nanocomposite (MCAP-AuNP) solution and reacted at 37°C for 1 hour. After reaction, the UV-vis spectrum was measured with a spectrophotometer. The degree of particle aggregation was analyzed by relative absorbance (A 650 /A 525 ).
  • the IC 50 values of each drug were confirmed to be 0.39 ⁇ M for ebselen, 43.14 ⁇ M for hesperetin, 28.57 ⁇ M for leupeptin, 10.7 ⁇ M for lopinavir, and 369.4 ⁇ M for hesperidin.
  • M pro inhibitors (leupeptin, lopinavir, hesperetin) dissolved at various concentrations in PBS (10% DSMO) to increase the total volume of the solution. Prepared in 500 ⁇ L. The mixture was reacted at room temperature for 20 minutes and then filtered through a 200 ⁇ m PVDF syringe filter (Biopil, China) to remove unreacted substances. Afterwards, 70 ⁇ L of the mixture was added to MCAP solutions of 1.88, 3.7, 5.66, 7.55, 9.43, and 11.32 ⁇ M to prepare a final volume of 220 ⁇ L.
  • the relative absorbance (A 650 /A 525 ) by the M pro inhibitor according to the concentration of the engineered amyloid nanocomposite (MCAP-AuNP) solution was analyzed using a microplate reader (Molecular Device, USA). As shown in Figure 13, enzyme activity according to inhibitor treatment was analyzed using the Michaelis-Menten equation.
  • Figure 10 shows an image observed by TEM of the reaction of the engineered amyloid nanocomposite (MCAP-AuNP) according to M pro treatment.
  • Figure 10(a) shows the engineered amyloid nanocomposite (MCAP-AuNP) reacted with M pro
  • Figure 10(b) shows the reaction results according to leupeptin treatment
  • Figure 10(c) shows the reaction results according to lopinavir treatment
  • Figure 10(d) shows an image observed by TEM of the reaction results according to hesperetin treatment.
  • a peptide with the LQSLQALQGLQSS sequence (M pro cleavage-site-embedded repeated peptide, MCRP) was prepared by linking LQS, LQA, and LQG, which are sequences cleaved by M pro .
  • Figures 11(a) and 11(b) show the differences from the engineered amyloid peptide (M pro cleavage site embedded amyloid peptide, MCAP, LQGNLQSNQQNY) of the present invention.
  • a nanocomposite was prepared by mixing 50 ⁇ L MCRP solution and 40 ⁇ L gold nanoparticle solution, and 600 ⁇ L of 1 ⁇ PBS was added to perform a salt resistance test for 24 hours to measure the UV-vis spectrum.
  • the results are shown in Figure 11(c).
  • MCRP was unable to coat the surface of the gold nanoparticles, and the absorbance shifted to the right as the gold nanoparticles aggregated.
  • MCRP did not have the amyloid properties of ⁇ -sheet, so it could not coat the surface of gold nanoparticles.

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Abstract

본 발명은 다중 변이 코로나바이러스 치료용 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 낮은 농도의 Mpro를 이용하여 단시간에 코로나바이러스 치료제를 스크리닝할 수 있는 방법을 제공한다.

Description

다중 변이 코로나바이러스 치료용 약물 스크리닝 방법
본 발명은 다중 변이 코로나바이러스 치료용 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.
근 COVID-19 펜데믹 극복을 위해 백신과 치료제 관련 연구가 다수 수행되고 있으나, SARS-CoV-2의 스파이크 단백질(spiked protein)은 변이가 계속되고 있다. 특히 백신 접종 후 항체량이 감소한다는 연구 보고에 따라 백신 효과에 대한 의문이 제기되고 있으며, 치료제에 대한 임상시험은 꾸준히 증가하고 있어, COVID-19 치료제 개발에 대한 연구 개발이 절실히 필요한 실정이다.
COVID-19 치료를 위한 약물은 크게 3가지 메커니즘이 존재하는데, 첫째로 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질을 타겟으로 하는 약물이다. 이러한 약물은 스파이크 단백질과 결합하여, 바이러스가 숙주세포 표면의 ACE-2 수용체와 결합하는 것을 방지함에 따라 바이러스의 숙주세포로의 유입을 차단한다. 그러나 스파이크 단백질의 잦은 변이에 의해 중화항체의 효능이 감소한다는 한계점이 존재한다. 특히, 감염력이 강한 델타변이의 경우 스파이크 단백질 내부에 16개의 돌연변이를 보유하며, 오미크론 변이는 32개의 돌연변이를 보유하고 있어, 중화항체의 작용이 더욱 어려운 실정이다.
두 번째는, 바이러스 RNA를 타겟으로 하는 약물이다. 이들은 SARS-CoV-2 RNA 복제 과정에 간섭하여 치명적인 RNA 돌연변이를 유발함에 따라 바이러스의 복제를 억제한다. 렘데시비르(remdesivir)와 몰누피라버(Molnupiravir)가 대표적이나, 렘데시비르는 약물의 효능에 대한 논란과 더불어, 간과 신장의 기능을 저하한다는 부작용이 보고되고 있으며, 몰누피라버는 포유동물의 RNA에서도 돌연변이를 일으켜 유전체 손상으로 인한 기형아나 선천적 유전병을 일으킬 수 있다는 치명적인 부작용이 보고되었다.
세 번째는, SARS-CoV-2 유래 단백질 분해효소를 타겟으로 하는 약물이다. SARS-CoV-2 주요 단백질 분해효소(main protease)인 Mpro의 활성을 억제하여 바이러스의 증식을 억제하는 방법으로, 구체적으로는 세포 내부로 들어온 바이러스의 pp1a/ab 단백질을 절단함으로써 복제를 개시하는 바이러스 유래 단백질 분해효소이다. 한편, Mpro에 의한 바이러스 복제 기작은 다양한 종류의 코로나바이러스(SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-HKU1 등)들이 그 메커니즘을 공유하고 있다. 2003년에 유행한 SARS-CoV-1의 Mpro 활성 부위 서열과 2021년 SARS-CoV-2의 Mpro 활성 부위 서열을 비교했을 때 변이가 관찰되지 않았으며, 이에 따라 Mpro 활성 부위를 타겟으로 하는 약물은 인체에 대한 부작용 우려가 낮고, 향후 발생할 수 있는 코로나바이러스 치료제로도 사용 가능성이 매우 높을 것으로 예상된다.
이에, 본 발명은 코로나바이러스의 Mpro의 활성을 억제하는 Mpro 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하고 한다. 특히, 기존의 Mpro 억제제 스크리닝 방법은 Mpro의 높은 단가에도 불구하고 고농도의 Mpro를 이용하였을 뿐만 아니라 두 가지 이상의 형광물질이 필요하며, 스크리닝에 필요한 시간이 수 일 소요되었던 한계를 극복하여, 낮은 농도의 Mpro를 이용하여 단시간에 코로나바이러스 치료제를 스크리닝할 수 있는 방법을 개발하여 제공한다.
본 발명은 코로나바이러스의 변이에도 변하지 않는 Mpro 활성 부위를 타겟으로 하는 약물 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 코로나바이러스 치료제 스크리닝용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 서열을 포함하는 엔지니어드 아밀로이드 펩타이드를 제조하는 단계 (a); 염화금산(HAuCl4)과 시트르산 나트륨을 혼합하여 금나노입자를 제조하는 단계 (b); 및 상기 단계 (a)의 엔지니어드 아밀로이드 펩타이드와 상기 단계 (b)의 금나노입자를 혼합하여 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체를 제조하는 단계 (c);를 포함하는 코로나바이러스 치료제 스크리닝용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (a)의 엔지니어드 아밀로이드 펩타이드는 β-sheet인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (b)는, 염화금산과 초순수를 혼합하여 가열한 뒤, 시트르산 나트륨을 첨가하여 가열하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (c)의 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체는, 금나노입자와 엔지니어드 아밀로이드 펩타이드를 부피비 1 : 0.5~10으로 혼합하여 제조된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (c)의 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체는 붉은색인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 코로나바이러스 치료제 스크리닝용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물에 코로나바이러스 치료제 후보 약물을 처리하는 단계;를 포함하는 코로나바이러스 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 스크리닝 방법은, 후보 약물 처리 후 푸른색으로 색이 변하는 경우 상기 후보 약물을 코로나바이러스 치료제로 선정하는 단계;를 더욱 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 낮은 농도의 Mpro를 이용하여 단시간에 코로나바이러스 치료제를 스크리닝할 수 있는 방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 아밀로이드 펩타이드 합성 원리와 스크리닝 원리를 간략하게 도시한 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 아밀로이드 펩타이드의 피브릴화를 분석한 결과를 나타낸 도이다. 도 2(a)는 MCAP monomer의 AFM(atomic force microscopy) 이미지 결과이고, 도 2(b)는 도 2(a)의 흰색 점선의 높이를 나타낸 그래프, 도 2(c)는 AFM 그래프를 통해 분석한 MCAP monomer의 평균 크기, 도 2(d)는 피브릴화 아밀로이드 펩타이드의 AFM 이미지 결과, 도 2(e)는 도 2(d)의 흰색 점선의 높이를 나타낸 그래프, 도 2(f)는 AFM 그래프를 통해 분석한 피브릴화 아밀로이드 펩타이드의 평균 크기, 도 2(g)는 피브릴화 아밀로이드 펩타이드의 TEM(transmission electron microscope) 이미지 결과와 이를 확대한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 피브릴화 아밀로이드 펩타이드의 β-sheet 구조를 확인한 도이다. 도 3(a)는 DLS(dynamic light scattering) 분석 결과, 도 3(b)는 CD(Circular dichroism) 분석 결과, 도 3(c)는 Thioflavin T 형광 분석 결과, 도 3(d)는 FT-IR 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 피브릴화 아밀로이드 펩타이드가 Mpro 처리에 따라 분해되는 것을 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)의 구조적 안정성을 분석한 도이다. 도 5(a)는 아밀로이드 펩타이드 용액의 혼합 양에 따른 흡광도 피크를 나타낸 도이다. 도 5(b)는 50 μL 아밀로이드 펩타이드 용액으로 제조한 나노복합체의 시간별 UV-vis 스펙트럼 분석 결과이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)의 동결-해동 성능을 분석한 도이다. 도 6(a)는 동결 전, 도 6(b)는 동결 및 해동 후의 UV-vis 스펙트럼 분석 결과이다. 도 6(c) 및 도 6(d)는 각각 동결 및 해동 전과 후의 금나노입자(bare AuNP, 왼쪽: 동결 전, 오른쪽: 동결 및 해동 후)와 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP, 왼쪽: 동결 전, 오른쪽: 동결 및 해동 후)의 색변화를 관찰한 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 금나노입자(bare AuNP)와 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)의 물리·화학적 특성을 분석한 도이다. 도 7(a)는 유체역학적 직경을 측정한 결과이고, 도 7(b)는 제타 전위(zeta potential)를 분석한 결과, 도 7(c)는 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)의 금나노입자 표면에 아밀로이드 펩타이드가 코팅되어 있음을 X선 광전자 분광법으로 확인한 결과, 도 7(d)는 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)의 TEM 이미지를 나타낸 도이다.
도 8(a)는 본 발명의 일 실시예에 있어서, Mpro 농도별 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)의 UV-vis 스펙트럼을 분석한 도이고, 도 8(b)는 변성된 Mpro를 이용하여 동일하게 분석한 결과를 나타낸 도, 도 8(c)는 Mpro 변성 여부에 따라 MCAP-AuNP의 응집 정도를 정량화(A650/A525)한 S자형 용량-반응 곡선을 도시한 그래프, 도 8(d)는 MCAP-AuNP에 처리한 Mpro 변성 여부에 따른 MCAP-AuNP의 TEM 이미지 결과를 나타낸 도이다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 기존에 알려진 Mpro 억제제를 스크리닝하여 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)의 UV-vis 스펙트럼을 분석한 도이다.
도 10(a)는 본 발명의 일 실시예에 있어서, Mpro 처리에 따른 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)의 반응을 TEM으로 관찰한 이미지를 나타낸 도이다. 도 10(b)는 leupeptin 처리에 따른 반응 결과를, 도 10(c)는 lopinavir 처리에 따른 반응 결과를, 도 10(d)는 hesperetin 처리에 따른 반응 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 엔지니어드 아밀로이드 펩타이드(MCAP)와 아밀로이드 서열을 포함하지 않는 엔지니어드 펩타이드인 MCRP의 차이를 나타낸 도이다.
도 12은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 엔지니어드 아밀로이드 펩타이드(MCAP)와 MCRP의 ThT 신호를 분석한 도이다.
도 13는 본 발명의 일 실시예에 있어서, Mpro 억제제 처리에 따른 Mpro의 효소 활성도를 분석한 도이다.
본 발명은 Mpro 절단 서열(L-Q-S)을 포함하는 아밀로이드 펩타이드가 금나노입자에 코팅된 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)에 관한 것으로, 코로나바이러스(Coronavirus) 유래 단백질 분해 효소인 Mpro를 억제하는 Mpro 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. Mpro(main protease)는 코로나바이러스(Coronavirus) 유래 단백질 분해 효소이며, 본 발명은 바이러스 유래 단백질 분해효소를 억제함에 따라 바이러스의 증식을 억제할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 코로나바이러스는, 코로나바이러스 과에 속하는 바이러스들을 말한다. 코로나바이러스는 바이러스의 특성과 숙주에 따라 호흡기 또는 소화기 감염병을 유발하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체에 Mpro 및 특정 약물을 처리할 경우, 특정 약물에 Mpro 억제효과가 포함되었다면 용액의 색 변화가 관찰되지 않으며, 특정 약물에 Mpro 억제효과가 포함되지 않았다면 용액의 색 변화가 관찰된다. 상기 용액은 금나노입자의 응집 등 구조적 안정성 붕괴에 따라 색 변화가 발생하는데, Mpro에 의해 Mpro 절단 서열(L-Q-S)이 절단되어 아밀로이드 펩타이드가 분해되고, 금나노입자의 응집이 유도되어 용액의 색 변화가 발생한다. 반면 Mpro 억제제에 의해 활성이 감소한 Mpro는 아밀로이드 펩타이드를 분해하지 못하며, 금나노입자의 응집을 유도하지 못해 용액의 색 변화가 관찰되지 않는다(도 1 참조).
한편, Mpro에 의한 바이러스 복제 기작은 다양한 종류의 코로나바이러스(SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-HKU1 등)들이 그 메커니즘을 공유하고 있다. 2003년에 유행한 SARS-CoV-1의 Mpro 활성 부위 서열과 2021년 SARS-CoV-2의 Mpro 활성 부위 서열을 비교했을 때 변이가 관찰되지 않았으며, 이에 따라 Mpro 활성 부위를 타겟으로 하는 약물은 인체에 대한 부작용 우려가 낮고, 향후 발생할 수 있는 코로나바이러스 치료제로도 사용 가능성이 매우 높을 것으로 예상된다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 자세히 설명한다. 다만, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
<준비예 1>
동결건조된 SARS-CoV-2의 주요 프로테아제(main protease, Mpro)는 Biosynth Carbosynth(UK)에서 구입하였다. 엡셀렌(ebselen), 헤스페레틴(hesperetin), 류펩틴(leupeptin), 로피나비르(lopinavir), 헤스페리딘(hesperidin), 염화금산삼수화물(chloroauric acid trihydrate(HAuCl4·3H2O)) 및 시트르산삼나트륨(trisodium citrate)은 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하였다. 증류수(distilled water, DW) 및 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)는 Gibco(USA)에서 구입하였다.
<실시예 1> 아밀로이드 펩타이드의 제조
SARS-CoV-2의 주요 프로테아제(main protease, Mpro)는 L-Q-S, L-Q-A, L-Q-G 서열을 절단한다. 본 실험에서는 프리온 단백질 유래 아밀로이드 서열(G-N-N-Q-Q-N-Y)과 Mpro 절단 서열(L-Q-S)을 융합하여 Solid Phase Peptide Synthesis 방법을 이용하여 C-terminal부터 엔지니어드 아밀로이드 펩타이드(Mpro cleavage site embedded amyloid peptide, MCAP, L-Q-G-N-L-Q-S-N-Q-Q-N-Y, Peptron, Korea)를 사용하였다(도 1).
서열번호 1 GNNQQNY
서열번호 2 LQS
<실시예 2> 엔지니어드 아밀로이드 펩타이드(MCAP)의 피브릴(fibril)화
2-1. MCAP의 피브릴화
프리온 단백질 유래 아밀로이드 서열(G-N-N-Q-Q-N-Y)과 Mpro 절단 서열(L-Q-S)을 포함하는 엔지니어드 아밀로이드 펩타이드(MCAP)를 증류수에 용해하여 1 mg/mL의 MCAP 용액을 제조하였다. 50 μL의 MCAP 용액과 pH 2의 증류수 150 μL를 혼합하여 37℃의 shaking incubator(Eppendorf, Germany)에서 1,000 rpm으로 5일간 충분히 반응시켜 피브릴화 하였다. 피브릴화 아밀로이드 펩타이드를 하기와 같이 확인하였다.
2-2. AFM(atomic force microscope) 및 TEM(transmission electron microscope)분석
실리콘 웨이퍼를 piranha 용액(H2SO4:H2O2=1:1)으로 세척하였다. 50 μL의 피브릴화 아밀로이드 펩타이드 용액을 실온에서 20분간 실리콘 웨이퍼에 증착시키고, 증류수로 세척한 뒤, fume hood에서 12시간 건조시켰다.
AFM 분석은 반경이 10 nm 미만인 실리콘 팁(NCHR, Park Systems, South Korea)을 사용하여 NX10(Park systems, South Korea)으로 측정하였다. AFM 측정은 0.4 Hz의 스캔 속도와 5 μm × 5 μm의 이미지 크기에서 NCM모드로 수행하였다. 이미지 평탄화(image flattening) 및 토폴로지 분석(topological analysis)은 Smart Scan(Park systems, South Korea) 소프트웨어로 수행하였다. AFM 분석을 통해 얻은 이미지를 Easyworm 소프트웨어를 사용하여 피브릴화 아밀로이드 펩타이드의 지속 길이(persistence length)를 측정하였다.
도 2(a)에 MCAP monomer의 지속 길이를 분석한 AFM 이미지를 나타내었다. 도 2(b)는 도 2(a)의 흰색 점선의 높이를 나타낸 도이다. 도 2(c)는 AFM 이미지를 통해 분석한 MCAP monomer의 대략적인 평균 크기이며, 이는 330.19 ± 73.9 pm 이다. 도 2(d)에 피브릴화 아밀로이드 펩타이드의 지속 길이를 분석한 AFM 이미지를 나타내었다. 도 2(e)는 도 2(d)의 흰색 점선의 높이를 나타낸 도이다. 도 2(f)는 AFM 이미지를 통해 분석한 피브릴화 아밀로이드 펩타이드의 대략적인 평균 크기이며, 이는 2.64 ± 0.74 nm 이다.
TEM 분석은 0.25 mg/mL의 MCAP 용액을 37℃에서 1,000 rpm으로 96시간 반응시킨뒤 12,000 rpm에서 1시간 원심분리하고 상층액을 제거한 후 수행하였다. 도 2g는 TEM 분석 이미지와 이를 확대한 형상이다. 이를 통해 MCAP의 피브릴화가 진행된 것을 확인하였다.
<실시예 3> 피브릴화 아밀로이드 펩타이드의 β-sheet 구조 확인
3-1. DLS(dynamic light scattering) 분석
0.25 mg/mL의 MCAP 용액을 37℃에서 1,000 rpm으로 3일간 반응시키면서 DLS(dynamic light scattering)를 이용하여 유체역학적 직경(hydrodynamic diameter)을 측정하였다. 반응시킨 MCAP 용액 1 mL를 일회용 큐벳 (10 mm light path, standard type, Kartell, Italy)에 넣어 Zetasizer Nano S90 (Malvern Panalytical, United Kingdom)으로 1 cycle당 10번씩 4 cycle, 총 40회 측정하였다. 도 3(a)에서 보듯이, 반응 시간에 따라 단량체 형태의 MCAP로부터 피브릴화가 진행되며, 직경과 표준편차가 증가(1h : 0.20 ± 0.073 μm, 12h : 0.30 ± 0.03 μm, 24h : 0.98 ± 0.13 μm, 36h : 3.40 ± 1.37 μm, 48h : 3.62 ± 2.02 μm)하는 것으로 나타났다.
3-2. CD(Circular dichroism) 분석
CD는 물질의 2차 구조를 확인할 수 있으며, 랜덤 코일(random coil) 형태는 210 nm ≥ wavelength에서 y축 값이 음의 값을 보인다. 0.25 mg/mL의 MCAP 용액을 37℃에서 1,000 rpm으로 각각 12, 24, 36, 48, 60, 96h 반응시킨 후, 석영 유리 큐벳(1 mm path length, 10 mm inside wide, Aireka Cells, USA)에 주입 후 측정하였다. 스펙트럼의 검출 범위가 190~300 nm이고, 스캐닝 속도가 10 nm/min인 J-815 (Jasco, Japan)으로 원형 이색성 스펙트럼(Circular dichroism spectra)을 측정하였다. 스펙트럼은 8 nm 분해능을 가지며, CDTool 소프트웨어로 처리되었다. 도 3(b)에서 보듯이, 피브릴화 아밀로이드 펩타이드는 210~240 nm의 wavelength에서 음의 값을, 210 nm ≥ wavelength에서는 양의 값을 보이는 피크를 확인하였다. 즉, 반응 시간에 따라 β-sheet 구조에 의한 신호가 증가하였으며, MCAP는 점차 β-sheet 구조로 피브릴화 되는 것을 의미한다.
3-3. Thioflavin T 형광 분석
ThT(Thioflavin T)는 β-sheet 구조를 탐지하는 형광물질이다. 0.25 mg/mL의 MCAP 용액을 20 μM의 ThT 용액과 pH 2 용액 상에서 37℃, 1,000 rpm으로 3일간 반응시키며 ThT 형광신호를 측정하였다. ThT 형광신호는 30분 간격으로 99 시간 동안 측정하였다. 실험 결과를 도 3(c)에 나타내었다. 반응 시간에 따라 ThT 형광 신호 값이 증가하였으며, 이는 β-sheet 형태의 피브릴화 아밀로이드 펩타이드가 형성되는 것을 의미한다.
3-4. FT-IR(Fourier transform infrared) 분석
FT-IR는 β-sheet 구조를 측정할 경우 1,620/cm 부근에서 피크가 확인된다. 48시간 반응시킨 피브릴화 아밀로이드 펩타이드 용액을 12,000 rpm에서 1시간 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 이를 실리콘 웨이퍼에 증착시킨 뒤, fume hood에서 12시간 건조시켰다. FT-IR 스펙트럼은 Cary 630 FTIR Spectrometer(scanning range 1,600~1,700/cm, Agilent Technologies, USA)로 측정하였다. 스펙트럼은 4 nm의 분해능을 가지며, Agilent MicroLab 소프트웨어로 처리하였다. 도 3(d)에서 보듯이, 1,620/cm 부근에서 피크가 측정되어 피브릴화 아밀로이드 펩타이드가 β-sheet의 구조임을 확인하였다.
<실시예 4> 피브릴화 아밀로이드 펩타이드의 M pro 에 의한 분해 확인
1-1. AFM(atomic force microscope) 분석
상기 실시예 2에서 엔지니어드 아밀로이드 펩타이드(MCAP)에 Mpro를 반응시켜 피브릴의 분해를 확인하였다. 0.25 mg/mL 의 MCAP 용액을 pH 2, 37℃ 조건에서 5일 인큐베이션하여 피브릴화 아밀로이드 펩타이드를 제작하였다. 만들어진 피브릴화 아밀로이드 펩타이드에 0.01 mg/mL 의 Mpro를 12시간 동안 반응시켰다.
도 4(a)에서 보듯이, 피브릴화 아밀로이드 펩타이드를 제작된 것을 확인하였다. 도 4(b)에서 보듯이, 상기 피브릴화 아밀로이드 펩타이드에 0.01 mg/mL 의 Mpro를 12시간 동안 반응시켜 피브릴이 분해되어 잘게 쪼개지며, 작은 덩어리 형태로 바뀌는 것을 확인하였다. 이미지의 흰색 점선의 높이를 그래프화 하여 각각 하기에 도시하였다.
<실시예 5> 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)의 합성
5-1. 금나노입자(AuNP)의 제조
Citrate reduction을 사용하여 금나노입자를 합성하였다. 2.5 mL의 38.8 mM 염화금산(HAuCl4) 용액과 45 mL Millipore water를 둥근 비커에서 혼합하고, 1,200 rpm으로 교반하면서 가열하였다. 혼합물을 끓인 후, 80 mM 시트르산 나트륨(sodium citrate) 용액 1 mL를 첨가하고 1,200 rpm으로 교반하면서 1시간 가열하여 시트르산으로 안정화된 금나노입자를 제조하였다. 금나노입자는 20 nm 크기로 제조되었다. 최종 금나노입자 용액을 실온으로 냉각하고 4℃에서 보관하였다.
5-2. 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)의 최적화
증류수와 PBS를 10:1 부피비로 혼합한 혼합물을 MCAP에 첨가하여 0.1 mg/mL의 MCAP 용액을 제조하였다. 20 nm 금나노입자 용액을 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 40 μL 금나노입자 용액을 상기 실시예 2의 (0.09 mg/mL) 25, 50, 100, 200, 300 및 400 μL와 각각 혼합하여 37℃, 1,000 rpm으로 반응하여 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체를 합성하였다. 1×PBS 600 μL를 첨가하여 salt resistance test를 24시간 수행하고, UV-vis 스펙트럼을 측정하였다. UV-vis 스펙트럼은 분광광도계(scan range 400~800 nm, scan rate 600 nm/min, Perkin Elmer, USA)로 측정하였다. 분산된 상태의 20 nm 이하 금나노입자의 UV-vis 스펙트럼은 525 nm(A525) 부근에서 피크가 검출되었다. 피브릴화 아밀로이드 펩타이드가 금나노입자 표면을 잘 코팅하지 못한 경우, PBS에 의해 금나노입자가 응집되어 용액의 색 변화를 일으키고, 피크가 650 nm(A650) 근처로 이동한다. 따라서, 금나노입자의 응집 정도는 상대 흡광도(A650/A525)로 정량화할 수 있다.
도 5(a)에서 보듯이, 25~100 μL MCAP 용액을 이용한 경우 피크가 525 nm(A525) 부근에서 관찰되어 가장 안정한 구조로 확인되었다.
한편, 50 μL MCAP 용액으로 제조한 나노복합체의 구조적 안정성을 추가로 확인하기 위해, 나노복합체에 증류수를 추가하여 총 부피를 0.8 mL로 제조하고, 시간에 따른 UV-vis 스펙트럼을 측정한 결과, 도 5(b)에서 보듯이, 24시간 구조적 안정성이 유지되는 것을 확인하였다.
<실시예 6> 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)의 특성 분석
6-1. 동결-해동 성능(freeze-thaw performance) 분석
본 실험에서는 상기 실시예 5에서 제조한 금나노입자용액(bare AuNP)과 50 μL MCAP 용액으로 제조한 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)의 동결-해동 성능(freeze-thaw performance)을 분석하였다.
각각 1 mL의 bare AuNP와 MCAP-AuNP를 -80℃에서 2시간 동결시킨 후, 실온에서 2시간 해동하였다. 동결 및 해동 전후의 유체역학적 직경(hydrodynamic diameter)을 Zetasizer로 측정하였다. 또한 동결 및 해동 전후의 각 용액의 UV-vis 스펙트럼을 측정하였다. 도 6에 실험 결과를 나타내었다.
도 6(a)는 동결 전, 도 6(b)는 동결 및 해동 후의 UV-vis 스펙트럼 측정 결과를 나타낸 도이다. 동결 전후 피크 변화와 도 6(c)에서 보듯이, 동결 및 해동 후의 경우 금나노입자의 응집이 일어나 색 변화가 관찰된 반면, 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)는 동결 전후 피크가 일정하며, 도 6(d)에서 보듯이, 동결 및 해동 후에도 색 변화가 관찰되지 않아 구조적 안정성이 매우 우수한 것으로 확인되었다.
6-2. 물리·화학적 특성 분석
본 실험에서는 상기 실시예 5에서 제조한 금나노입자용액(bare AuNP)과 50 μL MCAP 용액으로 제조한 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)의 물리·화학적 특성을 분석하였다.
상기 실시예 3과 같이, DLS(dynamic light scattering)를 이용하여 bare AuNP와 MCAP-AuNP의 유체역학적 직경(hydrodynamic diameter)을 측정한 결과를 도 7(a)에 나타내었다. Bare AuNP가 19.01 ± 0.53 nm, MCAP-AuNP가 21.96 ± 0.67 nm였으며, 엔지니어드 아밀로이드 펩타이드에 의해 코팅된 MCAP-AuNP가 코팅 전 금나노입자에 비해 약 3 nm 두꺼워지는 점을 확인하였다.
도 7(b)에 MCAP-AuNP의 zeta potential 값을 나타내었다. 0.4 mg/mL의 MCAP-AuNP 용액을 Zetasizer Cuvette에 넣고 각 지점별 accumlation time을 15회 지정하여 측정하였다. 그 결과, MCAP-AuNP의 zeta potential은 -19 ± 3.1 mV로, MCAP-AuNP의 구조적 안정성이 우수한 것으로 확인되었다.
X선 광전자 분광법(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)을 이용하여 금(Au) 원소와 질소(N) 원소의 피크를 확인하였다. MCAP-AuNP 용액을 6,720×g로 20분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 각 용액(< 40 μL)의 펠릿(pellet)을 실리콘 웨이퍼에 증착시키고, fume hood에서 24시간 건조하였다. K-alpha instrument(Thermo VG, UK)를 이용하여 XPS를 측정하였다. 이 장비는 4.8 × 10-9 mb에서 단색 X선 소스(Al Kα line: 1486.6 eV)를 제어할 수 있다. 0.1 eV 스텝 사이즈의 40 eV 패스에너지를 이용하여 0~800 eV 범위를 스캔하였다. 도 7(c)에서 보듯이, 단백질에 의해 질소(N) 1s 피크가 측정되었으며, 이로부터 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)의 금나노입자 표면에는 MCAP 용액, 즉 아밀로이드 펩타이드가 코팅되어 있음을 확인할 수 있었다.
Filter paper를 적당한 크기로 잘라 petri dish 바닥에 깔고 그 위에 TEM grid를 올렸다. MCAP-AuNP 용액을 TEM grid 위에 떨어뜨린 후 petri dish에서 건조 시킨 후 TEM 이미지를 촬영하였다. 도 7(d)는 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)의 TEM 이미지 결과이다. 이러한 결과 역시 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)의 금나노입자 표면에 엔지니어드 아밀로이드 펩타이드가 코팅되어 있음을 나타낸다.
<실시예 7> M pro 의 농도별 운동 분석(kinetic analysis)
Mpro를 농도별(0.925~18.5 nM)로 PBS에 20분간 용해하여 각 부피를 0.8 mL로 제조하였다. 상기 실시예 5에서 제조한 금나노입자용액(bare AuNP)과 50 μL 아밀로이드 펩타이드 용액으로 제조한 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)에 농도별 Mpro 용액을 혼합하여 총 부피가 총 부피가 1 mL가 되도록 하였다. MCAP-AuNP 및 Mpro 혼합물을 37℃에서 1시간 반응시킨 후, UV-vis 스펙트럼을 분광광도계로 측정하였다.
도 8(a)에서 보듯이, Mpro 농도가 증가할수록 UV 피크가 오른쪽으로 이동하였다. 한편, Mpro를 90℃에서 4시간 변성시켜 상기와 동일하게 반응시킨 결과, 도 8(b)에서 보듯이, UV 스펙트럼에 변화가 없음을 확인하였다. Mpro 변성 여부에 따라 MCAP-AuNP의 응집 정도를 정량화(A650/A525)한 S자형 용량-반응 곡선을 도 8(c)에 도시하였다. 도 8(d)는 Mpro 변성 여부에 따른 MCAP-AuNP의 TEM 이미지 결과이다.
<실시예 8> M pro 억제제 스크리닝
PBS(1.5% DSMO)에 다양한 농도로 용해된 Mpro 억제제(ebselen, hesperidin, hesperetin, lopinavir, leupeptin)에 50 ng의 Mpro를 첨가(1.4 nM)하여 용액의 총 부피를 800 μL로 제조하였다. 혼합물을 실온에서 20분간 반응시킨 후 200 μm 크기의 PVDF syringe filter(Biopil, China)에 여과하여 미반응 물질을 제거하였다. 600 μL의 최종 용액을 200 μL 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP) 용액에 첨가하고 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 UV-vis 스펙트럼을 분광광도계로 측정하였다. 입자의 응집 정도는 상대 흡광도(A650/A525)로 분석하였다.
도 9에서 보듯이, 각 약물의 IC50 값은 ebselen 0.39 μM, hesperetin 43.14 μM, leupeptin 28.57 μM, lopinavir 10.7 μM, hesperidin 369.4 μM로 확인되었다.
Mpro 억제제의 작용을 검증하기 위해, PBS(10% DSMO)에 다양한 농도로 용해된 Mpro 억제제(leupeptin, lopinavir, hesperetin)에 12 μg의 Mpro를 첨가(1.4 nM)하여 용액의 총 부피를 500 μL로 제조하였다. 혼합물을 실온에서 20분간 반응시킨 후 200 μm 크기의 PVDF syringe filter(Biopil, China)에 여과하여 미반응 물질을 제거하였다. 이후, 1.88, 3.7, 5.66, 7.55, 9.43, 11.32 μM의 MCAP 용액에 70 μL의 혼합물을 첨가하여 최종 부피를 220 μL로 제조하였다. Microplate reader (Molecular Device, USA)를 이용하여 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP) 용액의 농도에 따른 Mpro 억제제에 의한 상대 흡광도(A650/A525)를 분석하였다. 도 13와 같이 억제제 처리에 따른 효소 활성도는 Michaelis-Menten 방정식을 이용하여 분석하였다.
도 10에 Mpro 처리에 따른 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)의 반응을 TEM으로 관찰한 이미지를 나타내었다. 도 10(a)는 Mpro와 반응시킨 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)이고, 도 10(b)에 leupeptin 처리에 따른 반응 결과를, 도 10(c)에 lopinavir 처리에 따른 반응 결과를, 도 10(d)에 hesperetin 처리에 따른 반응 결과를 TEM으로 관찰한 이미지를 나타내었다. 도 10에서 보듯이, 상기 Mpro 억제제 처리에 따라 Mpro의 활성이 억제되어, 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체(MCAP-AuNP)에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
<실시예 9> M pro 에 의한 절단되는 서열에 따른 엔지니어드 아밀로이드 펩타이드의 특성 확인
본 실험에서는 Mpro에 의해 절단되는 서열인 L-Q-S, L-Q-A, L-Q-G를 연결하여 L-Q-S-L-Q-A-L-Q-G-L-Q-S-S 서열을 가진 펩타이드(Mpro cleavage-site-embedded repeated peptide, MCRP)를 제조하였다. 도 11(a) 및 도 11(b)에 본 발명의 엔지니어드 아밀로이드 펩타이드(Mpro cleavage site embedded amyloid peptide, MCAP, L-Q-G-N-L-Q-S-N-Q-Q-N-Y)와의 차이를 나타내었다.
상기 실시예 5와 동일하게, 50 μL MCRP 용액과 40 μL 금나노입자 용액을 혼합하여 나노복합체를 제조하고, 1×PBS 600 μL를 첨가하여 salt resistance test를 24시간 수행하여 UV-vis 스펙트럼을 측정한 결과를 도 11(c)에 나타내었다. 실험 결과, 본 발명의 MCAP에 비해 나노복합체의 구조적 안정성이 불안정한 것을 확인하였으며, 특히 MCRP가 금나노입자의 표면을 코팅하지 못하여 금나노입자가 응집됨에 따라 흡광도가 오른쪽으로 이동한 것을 확인하였다. 즉, MCRP는 β-sheet의 아밀로이드 성질이 없어, 금나노입자 표면을 코팅하지 못하였다.
또한, 상기 실시예 3과 같이 ThT 분석을 수행한 결과, 도 12에서 보듯이, 본 발명의 MCAP에 비해 ThT 신호가 확인되지 않았으며, 이는 β-sheet의 피브릴화 아밀로이드 펩타이드를 형성하지 못하기 때문으로 확인되었다.

Claims (8)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 서열을 포함하는 엔지니어드 아밀로이드 펩타이드를 제조하는 단계 (a);
    염화금산(HAuCl4)과 시트르산 나트륨을 혼합하여 금나노입자를 제조하는 단계 (b); 및
    상기 단계 (a)의 아밀로이드 펩타이드와 상기 단계 (b)의 금나노입자를 혼합하여 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체를 제조하는 단계 (c);를 포함하는 코로나바이러스 치료제 스크리닝용 조성물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 엔지니어드 아밀로이드 펩타이드는 β-sheet인 것인, 코로나바이러스 치료제 스크리닝용 조성물의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)는, 염화금산과 초순수를 혼합하여 가열한 뒤, 시트르산 나트륨을 첨가하여 가열하는 것인, 코로나바이러스 치료제 스크리닝용 조성물의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (c)의 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체는,
    금나노입자와 엔지니어드 아밀로이드 펩타이드를 부피비 1 : 0.5~10으로 혼합하여 제조된 것인, 코로나바이러스 치료제 스크리닝용 조성물의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (c)의 엔지니어드 아밀로이드 나노복합체는 붉은색인, 코로나바이러스 치료제 스크리닝용 조성물의 제조방법.
  6. 제1항의 제조방법에 의해 제조된 코로나바이러스 치료제 스크리닝용 조성물.
  7. 제6항의 조성물에 코로나바이러스 치료제 후보 약물을 처리하는 단계;를 포함하는 코로나바이러스 치료제 스크리닝 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    후보 약물 처리 후 푸른색으로 색이 변하는 경우 상기 후보 약물을 코로나바이러스 치료제로 선정하는 단계;를 더욱 포함하는 것인, 코로나바이러스 치료제 스크리닝 방법.
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