WO2023171989A1 - 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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WO2023171989A1
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preventing
treating eye
eye disease
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기민효
최미화
박소현
이국화
백문정
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주식회사 메디치바이오
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    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating eye diseases, and more specifically, to a pharmaceutical composition for preventing or treating eye diseases using a fumaric acid derivative, and further to a method for preventing or treating eye diseases using the same.
  • Dimethyl fumarate is an orally administered drug that has been used to treat psoriasis, an autoimmune disease, since it was approved by the FDA in 2013 as a treatment for multiple sclerosis (MS) recurrence.
  • MS multiple sclerosis
  • Dimethyl fumarate is expected to be effective in various diseases such as metabolic diseases and neurodegenerative diseases, and treatment as an oral agent is being attempted.
  • dimethyl fumarate is not free from gastrointestinal side effects, and Vumerity, an improved new drug and diroximel fumarate preparation with improved safety issues, was approved in 2019.
  • dimethyl fumarate for various diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis, cutaneous T cell lymphoma, glioblastoma multiforme, and age-related macular degeneration. Evaluation of the efficacy and safety of dimethyl fumarate for age-related macular degeneration, obstructive sleep apnoea, and rheumatoid arthritis is being attempted through oral administration. However, these attempts have all been made through oral administration of solid dosage forms such as tablets and capsules, and no studies have been conducted on the efficacy of topical administration of fumaric acid derivatives.
  • eye diseases especially corneal dystrophy
  • corneal tissue Due to the nature of corneal tissue, it is difficult to distribute drugs through oral administration, so topical treatment through eye drops is effective.
  • dimethyl fumarate can be developed as a topical agent for the treatment of these corneal diseases, it is expected that it can be used as a new treatment that can effectively treat various eye diseases, including corneal dystrophy.
  • One aspect of the present invention is to identify the use of a new compound effective for eye diseases and to provide a pharmaceutical composition containing the same for preventing or treating eye diseases.
  • Another aspect of the present invention is to provide a method for preventing or treating eye disease using the same.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating eye diseases which contains a fumaric acid derivative represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • R 1 is selected from the group consisting of C 1 -C 2 alkyl
  • R 2 is selected from the group consisting of H and C 1 -C 3 alkyl.
  • a method for preventing or treating eye disease comprising administering the pharmaceutical composition for preventing or treating eye disease of the present invention to the eye.
  • the present invention identifies a new therapeutic use for ocular diseases of fumaric acid derivatives or pharmaceutically acceptable salts thereof, thereby treating ocular diseases including corneal dystrophy, glaucoma, cataract, keratitis, conjunctivitis, scleritis, etc.
  • a pharmaceutical composition that can effectively treat diseases can be provided.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating eye diseases of the present invention is expected to be effectively applied to the prevention or treatment of eye diseases because it can be stored stably for a long period of time.
  • Figure 1 shows the results of evaluating the intracellular ROS inhibition effect according to monomethyl fumaric acid (MMF) concentration.
  • Figure 2 shows the results of evaluating the cytoprotective effect on human corneal endothelial cells according to monomethyl fumaric acid (MMF) concentration.
  • MMF monomethyl fumaric acid
  • Figure 3(a) shows the results of confirming the protein expression of Nrf2 in human corneal endothelial cells according to monomethyl fumaric acid (MMF) concentration
  • Figure 3(b) shows the results of quantitative analysis of the protein expression of Nrf2.
  • Figure 4 shows the relative mRNA expression levels of antioxidant enzymes HO-1, Prdx1, Prdx6, and ATP binding box transporter (ABCB6).
  • Figure 5 shows the mRNA expression levels of TGF- ⁇ 1, collagen (Coll), fibronectin, N-cadherin (N-cad), ZEB1, Snail, NFkB, and Nox4.
  • the present invention provides a new use of fumaric acid derivatives, that is, application for topical treatment of eye diseases.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating eye diseases comprising a fumaric acid derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, and more specifically, a fumaric acid derivative represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating eye disease comprising a pharmaceutically acceptable salt as an active ingredient, is provided.
  • R 1 may be selected from the group consisting of C 1 -C 2 alkyl
  • R 2 may be selected from the group consisting of H and C 1 -C 3 alkyl.
  • the compound represented by the formula (1) may be a compound having at least one structure selected from the group consisting of the following formulas (2) to (4), but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating eye diseases containing the fumaric acid derivative compound of formula (1), which is the active ingredient of the present invention, and a pharmaceutically acceptable salt thereof has structural stability of the compound when prepared and stored as an eye drop, for example. can be maintained, and therefore, the reduction of the active ingredient due to the formation of ineffective fumaric acid due to hydrolysis of both ester bonds at both ends of the fumaric acid derivative can be prevented.
  • a specific compound when hydrolyzed to produce at least one of the formulas (2) to (4), they can act as medicinal substances, and therefore, when administered to the eye, a compound that produces such a structure, for example, Precursor compounds producing at least one of the above formulas (2) to (4) by hydrolysis are also included in the scope of the present invention.
  • the term “pharmaceutically acceptable salt” refers to a formulation of a compound that does not cause significant irritation to the organism to which the compound is administered and does not impair the biological activity and physical properties of the compound.
  • the pharmaceutically acceptable salts include salts containing pharmaceutically acceptable cations, which include inorganic ionic salts made of calcium, potassium, sodium, magnesium, etc.; Amino acid salts made from glycine, arginine, lysine, etc.; and amine salts prepared from trimethylamine, triethylamine, ammonia, pyridine, picoline, etc.
  • Salts containing pharmaceutically acceptable anions include inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid (bromic acid), hydroiodic acid (iodic acid), perchloric acid, tartaric acid, succinic acid, oxalic acid, tartaric acid, and manderic acid.
  • organic carboxylic acids such as propionic acid, citric acid, lactic acid, glycolic acid, gluconic acid, tartaric acid, formic acid, citric acid, acetic acid, trichloroacetic acid, trifluoroacetic acid, gluconic acid, benzoic acid, lactic acid, fumaric acid, maleic acid, salicic acid, etc.
  • Acid addition salts formed by sulfonic acids such as methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid, etc. are included.
  • preferred salts in the present invention may be selected from salts containing cations, but the present invention is not limited thereto.
  • the compound according to the present invention can be converted into its salt by conventional methods.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the active ingredient in an amount of 0.01% to 5% by weight based on the total weight of the pharmaceutical composition, and has a pH of 4.0 to 8.0.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain the active ingredient in an amount of 0.05% by weight to 3% by weight based on the total weight of the pharmaceutical composition. If the content of the active ingredient is less than 0.01% by weight, the expression of medicinal efficacy may be insufficient, and if the content is more than 5% by weight, the problem of increased irritation may occur.
  • the pH of the pharmaceutical composition of the present invention may be pH 4.0 to pH 8.0, for example, pH 4.0 to 6.5, or pH 4.5 to 6.5.
  • the pharmaceutical composition may, if necessary, additionally include at least one selected from the group consisting of antioxidants, solubilizing agents, complexation agents, and surfactants, and, if necessary, any of the ingredients commonly used in the production of pharmaceutical compositions. It may further include appropriate carriers, excipients, diluents, pH adjusters, etc.
  • the antioxidants include cysteine, N-acetylcysteine, ascorbic acid, sodium sulfite, sodium bisulfite, sodium metabisulfite, Sodium thiosulfate, tocopherol, TPGS (Tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate), BHA (butylated hydroxyanisole), BHT (butylated hydroxytoluene), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), tris-EDTA , erythorbic acid, citric acid, fumaric acid, malic acid, maleic acid, tartaric acid, methionine, monothioglycerol ( monothioglycerol, phosphoric acid, propionic acid, propyl gallate, thymol, trisodium nitrilotriacetate, sodium hexametaphosphate, acetylsalicylic acid ), ascorbic acid, and their respective derivatives, and preferably includes EDTA or a pharmaceutically
  • the antioxidant may be included in an amount of 0.01% to 5% by weight based on the total weight of the pharmaceutical composition, for example, 0.01% to 3% by weight. When the antioxidant is included, It helps maintain the stability of the invention formula (1) or has the effect of suppressing oxidative stress, which can help prevent and treat eye diseases for which the present invention is intended.
  • the solubilizers include ethanol, glycerin, propylene glycol, castor oil, medium chain fatty acids (capric and caprylic), and mono-diglyceride (mono and diglycerides of capric and caprylic). acid), and for example, ethanol, glycerin, and propylene glycol can be used.
  • the inclusion agent includes cyclodextrin, cyclodextrin substituted with a hydroxyalkyl group, cyclodextrin substituted with an alkyl ether, and 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin). It may be one or more types selected from betadex) and sulfobutyl ether- ⁇ -cyclodextrin, for example, cyclodextrin may be used.
  • the surfactant may include at least one selected from the group consisting of nonionic surfactants, ionic surfactants, and mixtures thereof.
  • nonionic surfactants include polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters (polysorbate), polyoxyethylene fatty esters (Myrj), sorbitan esters (Span), and glycerol.
  • glycerol monostearate nonoxynol (octoxinol), polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer , Poloxamer), polyoxyethylene castor oil derivatives, polyoxyethylene hydrogenated castor oil derivatives (Cremophor), and may contain one or more types selected from the group consisting of ionic surfactants. It may include anionic, cationic and zwitterionic surfactants.
  • anionic surfactants include sulfates (alkyl sulfates, alkyl ether sulfates) such as sodium lauryl sulfate, sulfonates (docusates, alkyl benzene sulfonates), and carboxylates. It may contain one or more types selected from the group consisting of carboxylates (alkyl carboxylates-fatty acid salts, carboxylate fluoro surfactant) and phosphates (alkyl aryl ether phosphates, alkyl ether phosphates), and may be used as a cationic surfactant.
  • carboxylates alkyl carboxylates-fatty acid salts, carboxylate fluoro surfactant
  • phosphates alkyl aryl ether phosphates, alkyl ether phosphates
  • the zwitterionic surfactant may include one or more types selected from phospholipids, but is not limited thereto, and may include, for example, lecithin.
  • a carrier can be defined as a substance that facilitates the introduction of a compound into cells or tissues.
  • An excipient is a substance added to a drug for the purpose of giving it an appropriate form or increasing its amount to make it more convenient to use.
  • a diluent can be defined as a substance that dissolves and dilutes a compound as well as stabilizing the biologically active form of the compound.
  • Such carriers, excipients and diluents include, for example, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol and erythritol. , maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose. , hydroxyethylcellulose, hydroxypropyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, crospovidone, sodium croscarmellose.
  • saline water, saline, buffered saline, dimethyl sulfoxide (DMSO), methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc. , magnesium stearate and mineral oil, etc., but are not limited thereto.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • methyl hydroxybenzoate methyl hydroxybenzoate
  • propyl hydroxybenzoate propyl hydroxybenzoate
  • talc. magnesium stearate and mineral oil, etc., but are not limited thereto.
  • the pH adjuster may be, for example, a base such as an alkali metal or alkaline earth metal hydroxide (sodium hydroxide, potassium hydroxide, etc.), a basic salt (ammonium chloride, tromethamine, etc.), an amino acid (arginine, choline, etc.), or Acids include hydrochloric acid, acetic acid, tartaric acid, citric acid, lactic acid, succinic acid, adipic acid, methanesulfonic acid, octanoic acid, linolenic acid, and gluconolactone. It may be (gluconolactone) or an acidic amino acid (aspartic acid).
  • a base such as an alkali metal or alkaline earth metal hydroxide (sodium hydroxide, potassium hydroxide, etc.), a basic salt (ammonium chloride, tromethamine, etc.), an amino acid (arginine, choline, etc.), or Acids include hydroch
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be in the form of a dry powder or cake that is scheduled to be dissolved in a solvent before use.
  • drying may be, for example, freeze-drying, but is not limited thereto.
  • the storage period can be further extended, but it can be mixed with a solvent before use.
  • the solvent is not particularly limited as long as it can dissolve the pharmaceutical composition containing the compound of formula (1) of the present invention or a salt thereof, for example, water, saline solution, buffer solution, aqueous dextrose, glycerol, propylene glycol. It may be at least one selected from the group consisting of ethanol, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can form, for example, a solution or suspension.
  • non-toxic auxiliary substances such as wetting agents, emulsifiers, pH buffering agents, etc. may be additionally contained.
  • these auxiliaries are sodium acetate, sorbitan monolaurate, triethanolamine, sodium acetate, triethanolamine oleate, etc.
  • pH buffering agents can be prepared and used in the form of a weak acid and its conjugate base, or a buffer solution made by adding the conjugate acid to a weak base, and include citrate buffer, acetate buffer, and phosphate buffer ( It can be prepared and used in the form of phosphate buffer, borate buffer, tris buffer, etc., but is not limited thereto.
  • the citric acid buffer solution contains citric acid and/or a pharmaceutically acceptable salt thereof and acetic acid, sodium hydroxide, sodium phosphate dibasic, and monophosphate, which can be used as a conjugate base of citric acid. It can be used by mixing sodium hydrogen (dibasic sodium phosphate), ammonium salt, etc., and the acetate (ammonium acetate) buffer solution contains acetic acid and/or its pharmaceutically acceptable salts such as ammonium acetate and potassium acetate ( potassium acetate), etc., and the phosphate buffer solution can be prepared by mixing phosphoric acid and/or its pharmaceutically acceptable salt with sodium hydroxide, potassium hydroxide, etc., and the borate buffer solution can be prepared using boric acid and /Or it can be prepared by mixing a pharmaceutically acceptable salt thereof with sodium chloride, sodium hydroxide, potassium chloride, etc., and the Tris buffer solution is 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3- It can be manufactured by mixing propanediol (2
  • an acidifying agent or a basicizing agent may be used as the above-mentioned pH adjusting agent.
  • the acidifying agent is hydrochloric acid, citric acid, acetic acid, or boric acid. etc. may be used, and as alkalinizing agents, tromethamine, sodium hydroxide, sodium carbonate, potassium carbonate, etc. may be used, but are not limited thereto.
  • composition of the present invention may additionally contain one or more additives selected from the group consisting of thickeners and tonicity agents.
  • the type of the thickener is not particularly limited, and for example, methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropyl methylcellulose (hydroxypropyl methylcellulose) , noncrystalline cellulose, polysaccharides including starch derivatives, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, and mixtures thereof.
  • the isotonic agent may be added in an amount sufficient to maintain the osmotic pressure of the eye drop similar to that of tear fluid, and chlorides including sodium chloride and sugars including mannitol may be used, but are not limited thereto.
  • the compound of formula (1) of the present invention induces activation of Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2) and inhibition of NF- ⁇ B (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), thereby acting as an antioxidant, Derives anti-inflammatory and cytoprotective effects.
  • Nrf2 nuclear factor erythroid 2-related factor 2
  • NF- ⁇ B nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used as a preventive or therapeutic agent for at least one selected from the group consisting of corneal dystrophy, glaucoma, cataract, keratitis, conjunctivitis, and scleritis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is in the form of eye drops, it is effective in treating corneal dystrophy and glaucoma while avoiding side effects such as gastrointestinal disorders such as abdominal pain, diarrhea, and nausea, and flushing and itching that occur when dimethyl fumarate and its derivatives act systemically as an oral preparation. It can be used to prevent and treat glaucoma, cataract, keratitis, conjunctivitis, and scleritis.
  • the corneal dystrophy includes Fuchs corneal endothelial dystrophy (FECD), granulo corneal dystrophy 1 (GCD 1), Avellino corneal dystrophy (granulo corneal dystrophy 2: GCD 2), It may include lattice corneal dystrophy (LCD), posterior polymorphous corneal dystrophy (PPCD), congenital hereditary endothelial dystrophy (CHED), etc., for example, the present invention It can be used to prevent or treat Fuchs corneal endothelial dystrophy (FECD).
  • Fuchs corneal endothelial dystrophy FECD
  • GCD 1 granulo corneal dystrophy 1
  • Avellino corneal dystrophy granulo corneal dystrophy 2: GCD 2
  • LCD lattice corneal dystrophy
  • PPCD posterior polymorphous corneal dystrophy
  • CHED congenital hereditary endothelial dystrophy
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, preferably parenterally, more preferably topically, for example, by eye drops.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is determined by the type of disease, the severity of the disease, the type and content of other ingredients contained in the pharmaceutical composition, the type of dosage form, the patient's age, weight, general health, gender and diet, administration time, It may be adjusted depending on various factors, including route of administration, duration of treatment, and concurrent drugs.
  • a method for preventing or treating eye disease comprising the step of administering the pharmaceutical composition for preventing or treating eye disease of the present invention to the eye, for example, administering by eye drop. .
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating eye disease is in solid form, for example, a dry powder formulation
  • the step of dissolving the dry powder in a solvent is performed first and additionally.
  • the description of the pharmaceutical composition for preventing or treating eye diseases described above may be applied in the same manner.
  • DMF Dimethyl fumaric acid
  • MMF monomethyl fumaric acid
  • Example One 2 3 4 5 6 DMF One One One - - - MMF - - - One One One pH regulator Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Purified water Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount pH 4 5 7 4 5 7
  • the appropriate amount of pH adjuster refers to the amount of pH adjuster to reach the pH of the corresponding example
  • the appropriate amount of purified water refers to the amount including the remaining purified water so that the total composition becomes 100% by weight.
  • Example 7 to 11 were prepared in the same manner as Example 4 according to the amounts in Table 2 below. At this time, Example 8 has the same composition as Example 5 but a different manufacturing date.
  • compositions of Examples 12 to 16 were prepared using a pH adjuster in the same manner as Example 4, except that 2Na-EDTA as an antioxidant was dissolved before dissolving MMF in purified water.
  • the composition was prepared by adjusting the pH to 4.5 to 6.5 and filtering it through a 0.22 um sterilizing filter.
  • Example 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 MMF One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One One 2Na-EDTA - - - - - 3 3 3 3 3 pH regulator Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount pH 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
  • Examples 17 to 21 were prepared in the same manner as Example 12 according to the quantities in Table 3 below. However, in Examples 17 to 21, disodium EDTA (2Na-EDTA) was dissolved as an antioxidant, hydroxypropyl betadex was dissolved as an inclusion agent, MMF was dissolved, and a pH adjuster was used to adjust pH to 4.5 to 6.5. The composition was prepared by adjusting and filtering through a 0.22 um sterilizing filter.
  • Example 17 18 19 20 21 MMF One One One One One One 2Na-EDTA 3 3 3 3 3 Hydroxypropyl Betadex 50 50 50 50 pH regulator Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Purified water Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount pH 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
  • a mixed solution was prepared by adding mannitol or trehalose as an excipient, as shown in Table 4. Then, the pH was adjusted to 5.0 to 6.0 using a pH adjuster, sterilized through 0.22 um filtration, and then freeze-dried to remove purified water to obtain the dried product.
  • the prepared dried material can be dissolved in water, saline solution, buffer solution, or aqueous dextrose solution immediately before use.
  • Example 22 23 24 25 26 27 MMF One 2.5 One 2.5 One 2.5 One 2.5 2Na-EDTA 3 6 3 6 3 6 Hydroxypropyl Betadex - 50 - 50 - 50 mannitol 50 - 50 - 50 - Trehalose - 20 - 20 - 20 pH regulator Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Purified water Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount Appropriate amount pH 5.0 5.0 5.5 5.5 6.0 6.0
  • a mixed solution was prepared by adding a preservative and a thickener to increase the viscosity of the composition, as shown in Table 5. Then, the pH was adjusted to 5.0 to 6.0 using a pH adjuster and filtered through a 0.22 um sterilizing filter to prepare the composition.
  • Test Example 1 Comparison of stability according to pH of DMF and MMF
  • compositions prepared in Examples 1 to 6 were stored at room temperature (25°C) for 7 days. After manufacturing, the maximum related substances among the active ingredients and decomposition products were analyzed by HPLC under the analysis conditions described below, and the ratio (peak area, %) was calculated to evaluate stability.
  • Example Early 7 days Example Early 7 days DMF Decomposition products DMF Decomposition products MMF Decomposition products MMF Decomposition products One 99.91 0.09 98.98 1.02 4 99.90 0.10 99.79 0.21 2 99.76 0.24 90.92 9.08 5 99.89 0.12 99.83 0.17 3 90.63 9.37 38.96 61.04 6 99.87 0.13 99.12 0.88
  • the DMF and MMF compositions were confirmed to be stable at relatively low pH (Table 6). More specifically, the DMF composition without a stabilizer, such as the compositions of Examples 1 to 6, was observed to be stable at pH 4.0 or lower under production conditions, and the MMF composition was observed to be more stable at pH 5.0 or lower. On the other hand, considering that too low pH may cause eye irritation due to the nature of eye drops, it can be seen that MMF is more preferable as an eye drop composition.
  • compositions prepared in Examples 7 to 21 were stored under refrigerated (4°C) and room temperature (25°C) conditions, respectively. Initially and after 1 week, 2 weeks, and 4 weeks, the maximum amount of related substances produced among the active ingredient monomethyl fumaric acid and decomposition products was analyzed by HPLC under the same conditions as described in Test Example 1, and the ratio of maximum related substances (peak area) was analyzed by HPLC method. %) was calculated (Table 7 and Table 8).
  • Human corneal endothelial cells were cultured according to the culture method of the cell distribution company (Creative Biolabs, NY, USA) in PriNeu I medium, a serum-free medium, with 10% fetal bovine serum, human epidermal growth factor (EGF), FNC Coating Mix (Athena Environmental Sciences, MD, USA) and cultured at 37°C and 5% CO 2 conditions.
  • oxidative stress ROS
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • ROS was detected using the ROS-Glo H 2 O 2 assay (Promega, WI, USA) according to the manufacturer's instructions, and the level of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) in the cell culture medium as an indicator of reactive oxygen species was measured using a GloMax Discover microplate reader. The luminescence intensity was measured at excitation and emission wavelengths of 485 and 520-530 nm, respectively, using (Promega).
  • the intracellular ROS level increased more than two-fold in the group treated with menadione (10 ⁇ M), an oxidative stress, and TGF- ⁇ 1 (10 ng/ml), a fibrotic stress, and MMF It was confirmed that the treatment effectively removed ROS caused by oxidative fibrosis stress in human corneal endothelial cells in a concentration-dependent manner, reducing it to the normal level of the control group.
  • the Control group (Ctrl) refers to the cell group that was not treated with menadione and TGF- ⁇ 1.
  • the cell survival rate of human corneal endothelial cells was reduced by more than 40% in the group treated with corneal dystrophy-inducing substances, and treatment with MMF suppressed apoptosis caused by oxidative stress and fibrotic stress in a concentration-dependent manner. It was confirmed that the survival rate of human corneal endothelial cells was improved to the normal level of the control group.
  • the Control group (Ctrl) refers to the cell group that was not treated with menadione and TGF- ⁇ 1.
  • Nrf2 human corneal endothelial cells were cultured in a 6-well plate coated with FNC Coating Mix at 3 ⁇ 10 5 cells per well for 18-24 hours and then treated with TGF- ⁇ 1 for 24 hours. MMF was used to treat corneal dystrophy. Cell samples were prepared by treatment 4 hours before the inducer.
  • For Western blot analysis cells were washed with PBS and lysed in RIPA lysis buffer (GenDEPOT) containing protease inhibitor cocktail tablets (GenDEPOT, TX, USA). Next, the cell lysate was centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes at 4°C, and the supernatant was separated.
  • RIPA lysis buffer GenDEPOT
  • GenDEPOT protease inhibitor cocktail tablets
  • the membrane was washed three times with TBST, reacted with secondary antibody (Cell Signaling Technology), treated with ECL reagent (Thermo Fisher Scientific), developed color, and analyzed using a chemiluminescence imaging analysis system (Uvitec, NL, Cananda). Detected. Protein quantitative analysis was performed using ImageJ software (version 1.53t).
  • Nrf2 is a transcription factor that collectively produces a group of antioxidant proteins within cells, and that Nrf2 is depleted in the corneal cells of patients with corneal oxidative stress disease, it can not only eliminate oxidative fibrotic stress but also strengthen the endogenous defense mechanism.
  • the y-axis shows the relative Nrf2 protein expression level as a ratio (Nrf2/ ⁇ -actin) based on the ⁇ -actin expression level.
  • Test Example 6 Modulating effects of antioxidant, fibrosis, and cytopathic factors in human corneal endothelial cells
  • Nrf2 transcription factor Through regulation of the Nrf2 transcription factor by MMF in human corneal endothelial cells, the regulation pattern of mRNA expression of fibrosis, cytopathic and inflammatory factors downstream of the TGF- ⁇ signaling system, which are reported to be regulated by Nrf2, along with its downstream antioxidant factors, is real. It was observed through -time PCR.
  • Real-time PCR was performed using GoTaq mater mix (Promega) containing SYBR green solution, using the primers in Table 9 under the following conditions: 95°C for 2 minutes, 95°C for 15 seconds for a total of 35 cycles, and 60°C for 1 minute. It was carried out.
  • MMF reduces the antioxidant enzymes HO-1, Prdx1, and Prdx6 and the ATP-binding box transporter (ATP-binding box transporter) known to reduce oxidants. It increased the mRNA expression of ABCB6), and in particular, the expression of these factors is reported to be reduced in corneal dystrophies such as Fuchs endothelial corneal dystrophy (Redox Biology, 2020, doi.org/10.1016/j.redox.2020.101763).
  • the Control group (Ctrl) refers to the cell group that was not treated with menadione.
  • MMF decreased TGF- ⁇ 1 mRNA expression in human corneal endothelial cells in which TGF- ⁇ signaling system activity was increased by TGF- ⁇ 1 treatment, and also in the stage before fibrosis is established. It decreased the mRNA expression of N-cadherin (N-cad), ZEB1, and Snail, which are key factors in endothelial-to-mesenchymal transition (EnMT), and increased the mRNA expression of collagen (Coll) and fibronectin, which are key factors mediating fibrosis. decreased.
  • the Control group (Ctrl) refers to the cell group that was not treated with TGF- ⁇ 1.
  • MMF of the present invention has a therapeutic mechanism suitable for the purpose of antioxidant and antifibrotic treatment of eye diseases.

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Abstract

안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이를 이용한 안질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 하기 화학식 (1)로 표시되는 푸마르산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는, 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이를 안구에 투여하는 단계를 포함하는, 안질환의 예방 또는 치료 방법이 제공된다. 상기 화학식 (1)에 있어서, R1은 C1-C2 알킬로 이루어진 그룹에서 선택되고, R2는 H 및 C1-C3 알킬로 이루어진 그룹에서 선택된다.

Description

안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명은 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 푸마르산 유도체를 이용한 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 나아가 이를 이용한 안질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
디메틸푸마레이트(dimethyl fumarate)는 2013년 FDA로부터 다발성경화증(multiple sclerosis, MS) 재발 치료제로 승인을 받은 이후 자가면역질환인 건선(psoriasis) 등의 치료 목적으로 사용되고 있는 경구 투여용 약물이다. 디메틸푸마레이트는 그 외에도 대사질환, 신경퇴행성질환 등의 다양한 질환에서 효과가 기대되어, 경구제로서 치료가 시도되고 있다.
하지만 이와 같은 디메틸푸마레이트는 위장관계 부작용 문제에서 자유롭지 못하여, 이의 개량 신약이자 안전성 문제가 개선된 디록시멜푸마레이트(diroximel fumarate) 제제인 Vumerity가 2019년 승인되었다.
현재 다양한 질병에 대한 디메틸푸마레이트의 활용 연구가 시도되고 있으며, 그 예로서 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 피부T세포림프종 (cutaneous T cell lymphoma), 교모세포종(glioblastoma multiforme), 노인성 황반변성(age-related macular degeneration), 폐쇄성 수면무호흡증(obstructive sleep apnoea) 및 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 등에 대한 디메틸푸마레이트의 효능 및 안전성 평가가 경구투여를 통하여 시도되고 있다. 그러나 이러한 시도는 모두 정제, 캡슐제 등과 같은 고형의 제형을 경구 투여하여 이루어지고 있으며, 푸마르산 유도체의 국소 투여에 의한 효능에 대한 연구는 이루어진 바 없다.
한편, 안질환 특히 각막이영양증(corneal dystrophy)은 적합한 치료제가 없어 수술에 의한 치료법 만이 존재하는 경우가 많고, 각막 조직의 특성상 경구투여를 통한 약물 분포가 어려워 점안을 통한 국소치료가 효과적인 질환이다.
이러한 각막 질환의 치료를 위하여 디메틸푸마레이트가 국소제제로 개발될 수 있다면, 각막이영양증을 포함한 다양한 안질환을 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 치료제로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 한 측면은 안질환에 효과적인 새로운 화합물의 용도를 확인하고 이를 포함하는 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 이를 이용한 안질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 하기 화학식 (1)로 표시되는 푸마르산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는, 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.
Figure PCTKR2023002950-appb-img-000001
화학식 (1)
(상기 화학식 (1)에 있어서, R1은 C1-C2 알킬로 이루어진 그룹에서 선택되고, R2는 H 및 C1-C3 알킬로 이루어진 그룹에서 선택된다.)
본 발명의 다른 견지에 의하면, 상기 본 발명의 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 안구에 투여하는 단계를 포함하는, 안질환의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
본 발명은 푸마르산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 안질환에 대한 새로운 치료 용도를 확인함으로써 각막이영양증(corneal dystrophy), 녹내장(glaucoma), 백내장(cataract), 각막염, 결막염, 공막염 등을 포함하는 안질환을 효과적으로 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공할 수 있다. 나아가, 본 발명의 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 장기간 안정하게 보관될 수 있으므로 안질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 모노메틸푸마르산(MMF) 농도에 따른 세포 내 ROS 저해 효력을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 모노메틸푸마르산(MMF) 농도에 따른 인간 각막내피세포에 대한 세포보호 효력을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 3(a)은 모노메틸푸마르산(MMF) 농도에 따른 인간 각막내피세포 내 Nrf2의 단백질 발현을 확인한 결과이고, 도 3(b)는 Nrf2의 단백질 발현을 정량적으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 항산화 효소들인 HO-1, Prdx1, Prdx6 및 ATP결합상자 수송체 (ABCB6)의 상대적인 mRNA 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 5는 TGF-β1, collagen(Coll), fibronectin, N-cadherin(N-cad), ZEB1, Snail, NFkB 및 Nox4의 mRNA 발현 수준을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
종래 푸마르산 유도체는 다발성경화증, 건선 등의 치료를 위한 경구제제로만 연구 및 개발된 것과 달리, 본 발명은 푸마르산 유도체의 새로운 용도로의 사용, 즉 안질환 국소 치료 용도로의 적용을 제공한다.
본 발명에 의하면, 푸마르산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는, 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공되며, 보다 상세하게는 하기 화학식 (1)로 표시되는 푸마르산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는, 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.
Figure PCTKR2023002950-appb-img-000002
화학식 (1)
이때, 상기 화학식 (1)에 있어서, R1은 C1-C2 알킬로 이루어진 그룹에서 선택되고, R2는 H 및 C1-C3 알킬로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다.
예를 들어, 상기 화학식 (1)로 표시되는 화합물은 하기 화학식 (2) 내지 화학식 (4)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 구조를 갖는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
Figure PCTKR2023002950-appb-img-000003
화학식 (2)
디메틸 푸마레이트(Dimethyl fumarate)
Figure PCTKR2023002950-appb-img-000004
화학식 (3)
모노메틸 푸마레이트(Monomethyl fumarate)
Figure PCTKR2023002950-appb-img-000005
화학식 (4)
모노에틸 푸마레이트(Monoethyl fumarate)
본 발명의 유효성분인 화학식 (1)의 푸마르산 유도체 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 예를 들어 점안제로 제조되어 보관되었을 때 화합물의 구조적인 안정성을 유지할 수 있으며, 따라서 푸마르산 유도체의 양쪽 끝의 에스터 결합이 모두 가수분해되어 효력이 없는 푸마르산 형성에 따른 유효성분의 감소를 예방할 수 있다. 또한, 예를 들어 특정 화합물이 가수분해되어 화학식 (2) 내지 화학식 (4) 중 적어도 하나가 생성되는 경우 이들이 약효 물질로 작용할 수 있으므로 이와 같은 구조를 생성하는 화합물, 즉 예를 들어 안구에 투여 시 가수분해에 의해 상기 화학식 (2) 내지 화학식 (4) 중 적어도 하나가 생성되는 전구체 화합물도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 명세서에 사용된 용어 "약학적으로 허용되는 염"이란 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는, 화합물의 제형을 의미한다.
상기 약학적으로 허용되는 염은, 약학적으로 허용되는 양이온을 함유하는 염으로서 칼슘, 칼륨, 나트륨 및 마그네슘 등으로 제조된 무기이온염; 글리신, 아르기닌, 라이신 등으로 제조된 아미노산염; 및 트리메틸아민, 트라이에틸아민, 암모니아, 피리딘, 피콜린 등으로 제조된 아민염에서 선택될 수 있다. 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 염으로서, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산(브롬산), 요오드화수소산(요오드산), 과염소산, 주석산 등과 같은 무기산, 숙신산, 옥살산, 타르타르산, 만데르산, 프로피온산, 구연산, 젖산, 글리콜산, 글루콘산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리신산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함된다. 한편, 본 발명에 있어서 바람직한 염은 양이온을 함유하는 염으로부터 선택될 수 있으나 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 화합물은 통상적인 방법에 의해 그것의 염으로 전환시킬 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학 조성물 전체 중량을 기준으로 상기 유효 성분을 0.01 중량% 내지 5 중량%의 함량으로 포함하며, pH가 4.0 내지 8.0인 것이다. 예를 들어 상기 본 발명의 약학 조성물은 약학 조성물 전체 중량을 기준으로 상기 유효 성분을 0.05 중량% 내지 3 중량%의 함량으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 유효 성분의 함량이 0.01 중량% 미만인 경우 약효의 발현이 불충분할 수 있으며, 5 중량% 초과의 함량으로 포함되는 경우 자극성이 증가하는 문제가 발생할 수 있다.
한편, 본 발명의 약학 조성물의 pH는 pH 4.0 내지 pH 8.0, 예를 들어 pH 4.0 내지 6.5이거나 pH 4.5 내지 6.5 일 수 있다.
상기 약학 조성물은 필요에 따라 항산화제, 용해보조제, 포접화제(complexation agent) 및 계면활성제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 필요에 따라 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제, 희석제, pH 조절제 등을 더 포함할 수 있다.
상기 항산화제는 시스테인(cysteine), N-아세틸시스테인(N-acetylcycsteine), 아스코르빈산(ascorbic acid), 아황산나트륨(sodium sulfite), 아황산수소나트륨(sodium bisulfite), 피로아황산나트륨(sodium metabisulfite), 치오황산나트륨(sodium thiosulfate), 토코페롤(Tocopherol), TPGS(Tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate), BHA(butylated hydroxyanisole), BHT (butylated hydroxytoluene), 이디티에이(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), 트리스이디티에이(tris-EDTA), 에리솔빈산(erythorbic acid), 구연산(citric acid), 푸마릭산(fumaric acid), 말산(malic acid), 말레산(maleic acid), 타르타르산(tartaric acid), 메치오닌(methionine), 모노치오글리세롤(monothioglycerol), 인산(phosphoric acid), 프로피온산(propionic acid), 프로필 몰식자산(propyl gallate), 치몰(thymol), 니트릴로트리아세트산나트륨(trisodium nitrilotriacetate), 헥사메타인산나트륨(sodium hexametaphosphate), 아세틸살리실산(acetylsalicylic acid), 아스코르브산(ascorbic acid) 및 이들 각각의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것일 수 있으며, 바람직하게는 이디티에이 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 예를 들어 EDTA의 디소듐염(disodium salt)을 포함하는 것이다.
상기 항산화제는 약학 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 5 중량%의 함량으로 포함되는 것일 수 있으며, 예를 들어 0.01 중량% 내지 3 중량%의 함량으로 포함되는 것으로, 항산화제가 포함되는 경우 본 발명 화학식 (1)의 안정성을 유지하는 데 도움을 주거나 그 자체가 산화스트레스를 억제하는 효과가 있어 본 발명이 목적하는 안질환 예방 및 치료에 도움을 줄 수 있다.
상기 용해보조제는 에탄올(ethanol), 글리세린(glycerin), 프로필렌글리콜(propylene glycol), 피마자유(castor oil), 중쇄지방산(카프릭 및 카프릴릭) 모노-디글리세린(mono and diglycerides of capric and caprylic acid)에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예를 들어 에탄올, 글리세린, 프로필렌글리콜을 사용할 수 있다.
상기 포접화제로는 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 하이드록시알킬기로 치환된 사이클로덱스트린, 알킬 에테르로 치환된 사이클로덱스트린, 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린(2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin, 히드록시프로필베타덱스), 설포부틸에테르-β-사이클로덱스트린(sulfobutyl ether-β-cyclocextrin)에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예를 들어 사이클로덱스트린을 사용할 수 있다.
상기 계면활성제는 비이온성　계면활성제, 이온성　계면활성제 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있다. 예를 들어, 비이온성　계면활성제로 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, polysorbate), 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르(polyoxyethylene fatty esters, Myrj), 소르비탄 에스테르(sorbitan esters, Span), 글리세롤 모노스테아레이트(glycerol monostearate), 노녹시놀(nonoxynol, 옥토시놀(octoxinol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 (polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer, Poloxamer), 폴리옥시에틸렌 피마자유(polyoxyethylene castor oil derivatives), 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유 (polyoxyethylene hydrogenated castor oil derivatives, Cremophor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함 할 수 있으며, 이온성　계면활성제로 음이온성, 양이온성 및 양쪽성 이온　계면활성제를 포함할 수 있다.
예를 들어, 음이온성　계면활성제로는 라우릴황산나트륨(sodium lauryl sulfate) 등과 같은 술페이트류(sulfates; alkyl sulfates, alkyl ether sulfates), 술포네이트류(sulfonates; docusates, alkyl benzene sulfonates), 카르복실레이트류 (carboxylates; alkyl carboxylates-fatty acid salts, carboxylate fluoro surfactant) 및 포스페이트류(phosphates; alkyl aryl ether phosphates, alkyl ether phosphates)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으며, 양이온성　계면활성제로 4급 암모늄류 및 피리디늄류(quaternary ammonium and pyridinium cationic surfactants)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 일례로 벤잘코늄염산염(benzalkonium chloride)을 포함할 수 있다. 양쪽성 이온　계면활성제로는 인지질류 (phospholipids)에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 레시틴을 포함할 수 있다.
담체(carrier)는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 투입을 용이하게 하는 물질로 정의될 수 있다. 부형제(excipient)는 약제에 적당한 형태를 주거나 혹은 양을 증가해 사용에 편리하게 하는 목적으로 더해지는 물질을 말한다. 희석제(diluent)는 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해 및 희석시키는 물질로 정의될 수 있다.
이와 같은 담체, 부형제 및 희석제로는 예를 들어 락토오즈(lactose), 덱스트로즈(dextrose), 수크로스(sucrose), 솔비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol), 자일리톨(xylitol), 에리스리톨(erythritol), 말티톨(maltitol), 전분(starch), 아카시아 고무(acacia gum), 알지네이트, 젤라틴(gelatin), 칼슘 포스페이트(calcium phosphate), 칼슘 실리케이트(calcium silicate), 셀룰로즈(cellulose), 메틸 셀룰로즈(methyl cellulose), 히드록시에틸셀룰로즈(hydroxyethylcellulose), 히드록시프로필셀룰로즈(hydroxypropyl cellulose), 미정질 셀룰로스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 크로스포비돈(crospovidone), 크로스카멜로오스 소디움(sodium croscarmellose), 물, 생리식염수(saline), 버퍼 식염수(buffered saline), 디메틸술폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 메틸히드록시벤조에이트(methyl hydroxybenzoate), 프로필히드록시벤조에이트(propyl hydroxybenzoate), 탈크(talc), 마그네슘 스테아린산(magnesium stearate) 및 광물유(mineral oil) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 pH 조절제는 예를 들면, 염기로서 알칼리금속 또는 알칼리 토금속의 수산화물(sodium hydroxide, potassium hydroxide 등), 염기성염(염화암모늄, 트로메타아민 등), 아미노산(아르기닌, 콜린 등)일 수 있고, 또는 산으로서 염산, 아세트산, 타르타르산, 시트르산, 락트산, 숙신산(succinic acid), 아디프산(adipic acid), 메탄설폰산(methanesulfonic acid), 옥탄산(octanoic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 글루코노락톤(gluconolactone) 또는 산성 아미노산(아스파르트산) 등일 수 있다.
한편, 본 발명의 상기 약학 조성물은, 사용 전 용매에 용해가 예정된, 건조 분말 또는 케이크 형태인 것일 수 있으며, 이때 건조는 예를 들어 동결건조일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이와 같이 본 발명의 약학 조성물이 고체 상태로 제공되는 경우 보존 기간을 더욱 연장시킬 수 있으며, 다만 사용 전 용매와 혼합될 수 있다.
이때 상기 용매는 본 발명의 화학식 (1) 화합물 또는 이의 염을 포함하는 약학 조성물을 용해시킬 수 있는 것이라면 특히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 물, 식염수, 완충액, 수성 덱스트로즈, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 에탄올 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 예를 들어 액제 또는 현탁제를 형성할 수 있다. 이 경우 필요에 따라, 습윤제, 유화제, pH 완충제 등과 같은 무독성 보조 물질들을 추가로 함유할 수 있다. 이러한 보조제들의 전형적인 예들은 아세트산나트륨(sodium acetate), 소르비탄 모노라우레이트(sorbitan monolaurate), 트리에탄올아민(triethanolamine), 아세트산나트륨(sodium acetate), 트리에탄올아민 올레에이트(triethanolamine oleate) 등이다.　
상기 pH 완충제의 종류는 본 발명의 유효성분을 안정화시킬 수 있는 범위의 pH를 유지시킬 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않으며, 당 기술 분야 통상의 기술자라면 공지된 완충제 중 본 발명에 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, pH 완충제는 약산과 그 산의 짝염기 또는 약염기에 그 짝산을 넣어 만든 완충용액의 형태로 제조되어 사용될 수 있으며 시트르산염완충액(citrate buffer), 아세테이트산염완충액(acetate buffer), 인산염완충액(phosphate buffer), 붕산염완충액(borate buffer), 트리스염완충액(tris buffer) 등의 형태로 조제하여 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 시트르산완충용액은 시트르산 및/또는 이의 약학적으로 허용되는 염과 시트르산의 짝염기로 사용할 수 있는 아세트산(acetic acid), 수산화나트륨(sodium hydroxide), 인산수소이나트륨(sodium phosphate dibascic), 인산일수소나트륨(dibasic sodium phosphate), 암모늄염(ammonium salt) 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 아세트산염(아세트산암모늄)완충액은 아세트산 및/또는 이의 약학적으로 허용되는 염인 아세트산암모늄(ammonium acetate), 아세트산칼륨(potassium acetate) 등을 사용하여 제조할 수 있고, 인산염완충액은 인산 및/또는 이의 약학적으로 허용되는 염과 수산화나트륨, 수산화칼륨(potassium hydroxide) 등을 혼합하여 제조할 수 있고, 붕산염완충액은 붕산 및/또는 이의 약학적으로 허용되는 염과 염화나트륨(sodium chloride), 수산화나트륨, 염화칼륨(potassium chloride) 등을 혼합하여 제조할 수 있으며, 트리스완충액은 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올(2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) 및/또는 염화나트륨을 포함한 염산염, 아세트산염 등을 혼합하여 제조할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 pH 완충제와 함께 조성물의 pH를 조절하기 위하여 상술한 pH 조절제로 산성화제 또는 염기성화제가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 산성화제로서 염산, 구연산, 초산(acetic acid), 붕산(boric acid) 등이 사용될 수 있고 염기성화제로서 트로메타아민, 수산화나트륨, 탄산나트륨, 탄산칼륨 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 추가적으로 점증제 및 등장화제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 첨가제를 포함할 수 있다.
점안제가 점증제를 포함하는 경우, 점증제의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어, 메틸셀룰로스, 히드록시메틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스(hydroxypropyl methylcellulose), 비결정형 셀룰로스(noncrystalline cellulose), 전분 유도체를 포함하는 다당류, 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol) 및 폴리비닐피롤리돈 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
등장화제는 점안액의 삼투압이 누액과 유사한 삼투압을 유지할 수 있을 정도의 분량으로 첨가될 수 있으며 염화나트륨을 포함한 염화물, 만니톨을 포함한 당류가 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 화학식(1)의 화합물은 Nrf2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2)의 활성화 및 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)의 억제를 유도함으로써 항산화, 항염증 및 세포보호 효과(cytoprotective effect)를 도출한다.
따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 각막이영양증, 녹내장(glaucoma), 백내장(cataract), 각막염, 결막염, 공막염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나에 대한 예방 및 치료제로 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 약제학적 조성물은 점안제 형태이므로 디메틸푸마레이트 및 그 유도체가 경구투여 제제로 전신작용할 경우 나타나는 복통, 설사, 구역과 같은 위장관 장애나 홍조, 가려움증 등의 부작용을 회피하면서 효과적인 각막이영양증, 녹내장(glaucoma), 백내장(cataract), 각막염, 결막염, 공막염을 예방 및 치료제로 사용될 수 있다.
상기 각막이영양증은 푹스각막내피이영양증(Fuchs corneal endothelial dystrophy: FECD), 과립형각막이영양증 1(granulo corneal dystrophy 1: GCD 1), 아벨리노각막이영양증(Avellino corneal dystrophy, granulo corneal dystrophy 2: GCD 2), 격자형각막이영양증(lattice corneal dystrophy: LCD), 후부다형각막이영양증(Posterior polymorphous corneal dystrophy: PPCD), 선천유전내피이영양증(Congenital hereditary endothelial dystrophy: CHED) 등을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어 본 발명은 푹스각막내피이영양증(fuchs corneal endothelial dystrophy: FECD)의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여하여 수행될 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 더욱 바람직하게는 국소 투여될 수 있으며, 예를 들어 점안에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 약학 조성물에 함유된 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 상기 본 발명의 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 안구에 투여하는 단계, 예를 들어 점안에 의해 투여하는 단계를 포함하는, 안질환의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
한편, 상기 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물이 고체 형태, 예를 들어 건조 분말 제형인 경우, 상기 건조 분말을 용매에 용해시키는 단계가 선행하여 추가로 수행되는 것이다.
본 발명에 따른 안질환의 예방 또는 치료 방법에 대해서는, 전술한　안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대한 설명이 동일하게 적용될 수 있다.
이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
실시예
실시예 1 내지 6
하기 표 1의 분량에 따라 적량의 정제수에 디메틸푸마르산(DMF) 또는 모노메틸푸마르산(MMF)을 각각 용해시킨 후 pH조절제를 사용하여 pH 4 내지 7로 조절한 후 0.22 um 멸균 필터로 여과하여 조성물을 제조하였다.
실시예 1 2 3 4 5 6
DMF 1 1 1 - - -
MMF - - - 1 1 1
pH조절제 적량 적량 적량 적량 적량 적량
정제수 적량 적량 적량 적량 적량 적량
pH 4 5 7 4 5 7
* 단위(분량): mg/mL
상기 표 1 및 이하 표에서 pH조절제의 적량은 해당 실시예의 pH에 도달하기 위한 pH조절제의 양을 의미하며, 정제수의 적량은 전체 조성물이 100 중량%가 되도록 잔부의 정제수를 포함하는 양을 의미하는 것이다.
실시예 7 내지 16
하기 표 2의 분량에 따라 실시예 4와 동일한 방법으로 실시예 7 내지 11의 조성물을 제조하였다. 이때 실시예 8은 실시예 5와 조성은 동일하고 제조일이 상이한 조성물이다.
한편, 실시예 12 내지 16의 조성물은 MMF를 정제수에 용해시키기 전 항산화제로 이나트륨이디티에이(2Na-EDTA)를 용해시킨 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 방법에 의해, pH조절제를 사용하여 pH 4.5 내지 6.5로 조절하고 0.22 um 멸균필터로 여과하여 조성물을 제조하였다.
실시예 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
MMF 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2Na-EDTA - - - - - 3 3 3 3 3
pH조절제 적량 적량 적량 적량 적량 적량 적량 적량 적량 적량
정제수 적량 적량 적량 적량 적량 적량 적량 적량 적량 적량
pH 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
* 단위(분량): mg/mL
실시예 17 내지 21
하기 표 3의 분량에 따라 실시예 12와 동일한 방법으로 실시예 17 내지 21을 제조하였다. 단, 실시예 17 내지 21에는 항산화제로 이나트륨이디티에이(2Na-EDTA)를 용해시키고, 포접화제로 히드록시프로필베타덱스를 용해시킨 후 MMF를 용해하고, pH조절제를 사용하여 pH 4.5 내지 6.5로 조절하고 0.22 um 멸균필터로 여과하여 조성물을 제조하였다.
실시예 17 18 19 20 21
MMF 1 1 1 1 1
2Na-EDTA 3 3 3 3 3
히드록시프로필베타덱스 50 50 50 50 50
pH조절제 적량 적량 적량 적량 적량
정제수 적량 적량 적량 적량 적량
pH 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
* 단위(분량): mg/mL
실시예 22 내지 27
MMF을 활성성분으로 하는 점안 조성물로서 사용 직전에 액상으로 제조 가능한 제형으로 개발하기 위하여 표 4와 같이 부형제로 만니톨 또는 트레할로즈를 추가하여 혼합액을 제조하였다. 그리고 pH조절제를 사용하여 pH 5.0 내지 6.0로 조절하고 0.22 um 멸균여과 후 정제수를 제거하기 위한 목적으로 동결건조를 수행하여 건조물을 획득하였다. 제조된 건조물은 사용 직전에 물, 식염수, 완충액, 수성 덱스트로즈 용액으로 용해되어 사용될 수 있다.
실시예 22 23 24 25 26 27
MMF 1 2.5 1 2.5 1 2.5
2Na-EDTA 3 6 3 6 3 6
히드록시프로필베타덱스 - 50 - 50 - 50
만니톨 50 - 50 - 50 -
트레할로즈 - 20 - 20 - 20
pH조절제 적량 적량 적량 적량 적량 적량
정제수 적량 적량 적량 적량 적량 적량
pH 5.0 5.0 5.5 5.5 6.0 6.0
* 단위(분량): mg/mL
실시예 28 내지 33
MMF을 활성성분으로 하는 점안 조성물로서 표 5와 같이 보존제와 조성물의 점도를 높이기 위한 점증제를 추가하여 혼합액을 제조하였다. 그리고 pH조절제를 사용하여 pH 5.0 내지 6.0로 조절하고 0.22 um 멸균필터로 여과하여 조성물을 제조하였다.
실시예 28 29 30 31 32 33
MMF 1 5 1 5 1 5
2Na-EDTA 3 6 3 6 3 6
히드록시프로필베타덱스 - 50 - 50 - 50
포비돈 K30 5 5 5 5 5 5
벤잘코늄염화물 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
pH조절제 적량 적량 적량 적량 적량 적량
정제수 적량 적량 적량 적량 적량 적량
pH 5.0 5.0 5.5 5.5 6.0 6.0
* 단위(분량): mg/mL
시험예 1 : DMF 및 MMF의 pH에 따른 안정성 비교
상기 실시예 1 내지 6과 같이 제조한 조성물을 상온(25℃) 조건에서 7일 동안 보관하였다. 제조 후 활성성분과 분해산물 중 최대 유연물질을 하기에 기재된 분석 조건의 HPLC법으로 분석한 후 그 비율(peak area, %)을 산출하여 안정성을 평가하였다.
[분석 조건]
- 컬럼 : Kromasil C18(4.6 X 150 mm, 5 um)
- 이동상 : 정제수(pH 2.6)/메탄올 = 50/50(V/V)
- UV 파장 : 210 nm
- 유속 : 1 mL/min
실시예 초기 7 일 실시예 초기 7 일
DMF 분해산물 DMF 분해산물 MMF 분해산물 MMF 분해산물
1 99.91 0.09 98.98 1.02 4 99.90 0.10 99.79 0.21
2 99.76 0.24 90.92 9.08 5 99.89 0.12 99.83 0.17
3 90.63 9.37 38.96 61.04 6 99.87 0.13 99.12 0.88
* 단위: % (Peak Area)
안정성 평가 결과 DMF 및 MMF 조성물은 상대적으로 낮은 pH에서 안정한 것으로 확인되었다(표 6). 보다 상세하게, 실시예 1 내지 6의 조성과 같이 안정화제가 없는 DMF 조성은 제조 조건 중에서 pH 4.0 이하에서 안정한 것으로 관찰되었고 MMF 조성은 pH 5.0 이하에서 더욱 안정한 것으로 관찰되었다. 한편, 점안제의 특성상 너무 낮은 pH는 눈에 자극성을 유발할 수 있는 점을 고려할 때, MMF가 점안 조성물로 더욱 바람직한 것을 알 수 있다.
시험예 2
실시예 7 내지 21에서 제조한 조성물을 냉장(4℃), 및 상온(25℃) 조건에서 각각 보관하였다. 초기 및 1주, 2주 및 4주 후 활성 성분인 모노메틸푸마르산과 분해산물 중 최대 유연물질의 생성량을 시험예 1에 기재된 것과 동일한 조건의 HPLC법으로 분석한 후 최대 유연물질의 비율(peak area %)을 산출하였다(표 7 및 표 8).
4℃ 보관 시 실시예 7 내지 21의 안정성 결과(최대 유연물질, %)
실시예 초기 1 주 2 주 4 주
7 (4.5) 0.12 0.10 0.12 0.12
8 (5.0) 0.11 0.10 0.13 0.12
9 (5.5) 0.11 0.12 0.15 0.17
10 (6.0) 0.11 0.15 0.21 0.30
11 (6.5) 0.13 0.23 0.36 0.59
12 (4.5) 0.06 0.06 0.06 0.08
13 (5.0) 0.04 0.06 0.07 0.07
14 (5.5) 0.05 0.07 0.09 0.10
15 (6.0) 0.04 0.07 0.10 0.12
16 (6.5) 0.03 0.11 0.15 0.19
17 (4.5) 0.02 0.05 0.07 0.07
18 (5.0) 0.03 0.05 0.07 0.07
19 (5.5) 0.02 0.05 0.07 0.08
20 (6.0) 0.03 0.06 0.09 0.11
21 (6.5) 0.04 0.10 0.13 0.22
25℃ 보관 시 실시예 7 내지 21의 안정성 결과(최대 유연물질, %)
실시예 초기 1 주 2 주 4 주
7 (4.5) 0.12 0.15 0.19 0.30
8 (5.0) 0.11 0.15 0.19 0.32
9 (5.5) 0.12 0.18 0.26 0.5
10 (6.0) 0.12 0.30 0.50 1.56
11 (6.5) 0.13 0.85 1.50 3.67
12 (4.5) 0.02 0.09 0.13 0.25
13 (5.0) 0.05 0.09 0.13 0.25
14 (5.5) 0.02 0.13 0.21 0.36
15 (6.0) 0.07 0.27 0.53 0.77
16 (6.5) 0.06 0.79 1.63 1.49
17 (4.5) 0.02 0.07 0.11 0.20
18 (5.0) 0.03 0.07 0.12 0.20
19 (5.5) 0.02 0.10 0.17 0.34
20 (6.0) 0.03 0.18 0.37 0.79
21 (6.5) 0.04 0.45 0.94 1.64
표 7 및 표 8에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명에 의해 제조된 조성물의 pH가 낮을수록 냉장 및 상온에서 안정하였으며, pH가 동일할 경우 냉장 및 상온 보관 시 안정화제로 이나트륨이디티에이가 포함된 조성물(실시예 12 내지 21)이 안정화제가 포함되지 않은 조성물(실시예 7 내지 11) 보다 양호한 안정성 결과를 나타내었다.
시험예 3: 인간 각막내피세포에서 산화 스트레스 저해 효력
인간 각막내피세포 배양은 세포 분양 회사 (Creative Biolabs, NY, USA)의 배양 방법에 따라 serum-free 배지인 PriNeu I 배지에 10% 소 태아 혈청 (fetal bovine serum), 인간 상피성장인자 (EGF), 인간 혈관내피 성장인자 (VEGF), 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 나트륨 셀레나이트, 히드로코르티손, 헤파린, 베타 에스트라디올, L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신 및 G418을 첨가하여, FNC Coating Mix (Athena Environmental Sciences, MD, USA)로 미리 코팅된 세포 배양 접시에 부착하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
각막 이영양증의 세포 내 유사 환경 모사 방법으로는 각막 이영양증 유발에 밀접하게 관여하는 산화 스트레스 (ROS) 및 transforming growth factor-β (TGF-β) 신호기전의 활성을 유도하였고, 이를 위해 산화물질인 메나디온(Menadione, MP Biomedicals, CA, USA) 10μM 농도 및/또는 재조합 인간 TGF-β1 단백질 (Bon Opus, NJ, USA) 10ng/ml 농도를 각막 이영양증 유도 물질로써 처리하였다. 이하 메나디온 또는 재조합 인간 TGF-β1 단백질을 각막 이영양증 유도 물질이라고 지칭한다.
MMF에 의한 세포 내 ROS 저해 효력 평가 방법으로는 인간 각막내피세포를 FNC Coating Mix로 코팅 된 96웰 플레이트에 웰 당 1.5 × 104 세포 수로 18-24시간 배양 후 메나디온 (10μM) 및 TGF-β1(10ng/ml)을 24시간 동안 처리하였고, MMF는 각막 이영양증 유도 물질 4시간 전 처리하여 ROS 저해 효력을 평가하였다. ROS는 ROS-Glo H2O2 assay (Promega, WI, USA)를 사용하여 제조사의 지침서에 따라 검출하였고, 활성산소 지표로 세포 배양액의 과산화수소 (H2O2)의 수준을 GloMax Discover 마이크로 플레이트 리더 (Promega)를 이용하여 각각 485 및 520-530 nm의 여기 및 방출 파장에서 발광 강도로 측정하였다.
그 결과 도 1에 나타나는 바와 같이, 정상 인간 각막내피세포 대비 산화스트레스인 메나디온(10μM)과 섬유화 스트레스인 TGF-β1 (10ng/ml)처리 군에서 세포 내 ROS 수준이 2배 이상 증가하였고, MMF의 처리에 의해 농도의존적으로 인간 각막내피세포의 산화 섬유화 스트레스에 의한 ROS를 효과적으로 제거하여 Control군의 정상 수준까지 감소됨을 확인하였다. 도 1에서 Control군(Ctrl)은 메나디온과 TGF-β1을 처리하지 않은 세포군을 의미한다.
시험예 4: 인간 각막내피세포에서 세포보호 효력
MMF의 인간 각막내피세포에 대한 세포보호 효력을 평가하기 위해, 각막 이영양증 발생 요인인 산화 스트레스 및 TGF-β 신호전달기전의 활성이 증가된 인간 각막내피세포에서 유도되는 세포사멸에 대한 저해 효력을 관찰하였다. 시험예 3의 ROS 시험법과 동일한 방법으로 세포를 배양하고 준비 후, 메나디온 (10μM)과 재조합 인간 TGF-β1 (10ng/ml)을 24시간 처리하여 인간 각막내피세포의 세포사멸을 유도하였고, MMF는 3가지 농도로 각막 이영양증 유도 물질 4시간 전 처리하였다. 세포 생존율 측정은 CellTiter-Glo 2.0 cell viability assay (Promega)를 사용하여 생존하고 있는 세포 수를 세포 내 유지되고 있는 ATP 수준으로 반영하여 측정하였고, 발광 값은 시험예 3의 마이크로 플레이트 리더기를 이용하여 검출하였다.
그 결과 도 2에 나타나는 바와 같이, 각막 이영양증 유도 물질 처리 군에서 인간 각막내피세포의 세포 생존율이 40% 이상 감소되었고, MMF의 처리에 의해 농도의존적으로 산화 스트레스와 섬유화 스트레스에 의한 세포사멸을 억제하여 인간 각막내피세포의 생존율을 Control군의 정상 수준까지 향상시키는 것을 확인하였다. 도 2에서 Control군(Ctrl)은 메나디온과 TGF-β1을 처리하지 않은 세포군을 의미한다.
시험예 5: 인간 각막내피세포에서의 Nrf2의 발현 증가 효과
시험예 3을 통해 MMF의 인간 각막내피세포의 산화 스트레스에 대한 저해 효력을 확인하였고, 항산화 기전을 확인하기 위해 주요 항산화 전사인자인 nuclear factor erythroid-2-related factor 2 (Nrf2)의 발현 조절 양상을 관찰하였다.
Nrf2의 단백질 분석을 위해, 인간 각막내피세포를 FNC Coating Mix로 코팅 된 6웰 플레이트에 웰 당 3 × 105 세포 수로 18-24시간 배양 후 TGF-β1을 24시간 동안 처리하였고, MMF는 각막 이영양증 유도 물질 4시간 전 처리하여 세포 샘플을 준비하였다. 웨스턴블랏 분석은 세포를 PBS로 세척하고, 프로테아제 저해제 칵테일 정제 (GenDEPOT, TX, USA)를 포함한 RIPA 용해 완충액 (GenDEPOT)에 용해시켰다. 그 다음, 세포 용해액을 4 ℃에서 13,000rpm으로 10분 동안 원심분리 후, 상등액을 분리하였다. 단백질 농도를 측정하기 위해 BCA kit (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)을 이용하였고, 동량의 단백질을 로딩하여 전기영동 (SDS-PAGE)으로 분리하고, 니트로 셀룰로오스 막(GenDEPOT)에 전이시킨 후, 5% 탈지유로 상온에서 1시간 동안 비특이적 항체 결합을 차단하였다. 이 후 각 anti-Nrf2 항체 (Cell Signaling Technology, MA, USA)와 anti-β-actin 항체 (Cell Signaling Technology)를 넣고 4℃에서 반응시켰다. 18시간 후 막을 TBST로 3회 세척 후, 2차 항체 (Cell Signaling Technology)와 반응시켰고, ECL 시약 (Thermo Fisher Scientific)을 처리하여 발색 후 화학발광 이미징 분석 시스템 (Uvitec, NL, Cananda)를 이용하여 검출하였다. 단백질 정량 분석은 ImageJ 소프트웨어 (version 1.53t)를 이용하여 실시하였다.
그 결과 도 3(a)와 (b)에 나타낸 바와 같이, MMF는 인간 각막내피세포 내 Nrf2의 단백질 발현을 농도 의존적으로 증가시키는 것을 확인하였다. Nrf2가 세포 내의 항산화 단백질군을 총체적으로 생성시키는 전사인자이고 각막의 산화스트레스 질환 환자의 각막세포에서 Nrf2가 고갈되어 있음을 고려할 때 단순히 산화 섬유화스트레스를 제거할 뿐 아니라 내인적인 방어기전도 강화시킬 수 있음을 확인하였다. 도 3(b)에서 y축은 β-actin 발현량을 기준으로 하여 상대적인 Nrf2 단백질 발현량을 비율(Nrf2/β-actin)로 나타낸 것이다.
시험예 6: 인간 각막내피세포에서 항산화, 섬유화, 및 세포변성 인자들의 조절 효과
인간 각막내피세포에서 MMF에 의한 Nrf2 전사인자 조절을 통해, 이의 하위 항산화 인자들과 더불어 Nrf2에 의해 조절된다고 보고된 TGF-β 신호전달계의 하위 섬유화, 세포변성 및 염증인자들의 mRNA 발현 조절 양상을 real-time PCR을 통해 관찰하였다.
시험예 5와 같이 6웰 플레이트에 세포를 배양하였고, 각 메나디온 (10μM)과 재조합 인간 TGF-β1(10ng/ml)을 24시간 동안 처리하였으며, MMF는 50μM 농도로 각막 이영양증 유도 물질 4시간 전 처리하였다. 세포로부터 RNA 추출 키트 (Bioneer, 대전)를 이용하여 RNA 분리 후, 1μg의 RNA로부터 RT PreMix (Bioneer)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. Real-time PCR 진행은 SYBR 그린 용액을 포함한 GoTaq mater mix (Promega)를 사용하여 2분 동안 95℃, 총 35 사이클의 15초 동안 95 ℃, 1분 동안 60 ℃ 조건 하에서 다음 표 9의 프라이머들을 이용하여 수행하였다.
서열번호 프라이머 서열
1 GAPDH 특이적 프라이머 정방향 5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'
2 역방향 5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'
3 HO-1 특이적 프라이머 정방향 5'-AAGACTGCGTTCCTGCTCAAC-3'
4 역방향 5'-AAAGCCCTACAGCAACTGTCG-3'
5 Prdx1특이적 프라이머 정방향 5'-CACTGACAAACATGGGGAAG-3'
6 역방향 5'-TTTGCTCTTTTGGACATCAGG-3'
7 Prdx6 특이적 프라이머 정방향 5'-GCATCCGTTTCCACGACT-3'
8 역방향 5'-TGCACACTGGGGTAAAGTCC-3'
9 ABCB6 특이적 프라이머 정방향 5'-GCCTCATTGTGTTCCTGTGC-3'
10 역방향 5'-CACTTCGTAACTCTCGGCGT-3'
11 TGF-β1 특이적 프라이머 정방향 5'-TCCTGGCGATACCTCAGCAA-3'
12 역방향 5'-CTCAATTTCCCCTCCACGGC-3'
13 Collagen I 특이적 프라이머 정방향 5'-TCGGCGAGAGCATGACCGATGGAT-3'
14 역방향 5'-GACGCTGTAGGTGAAGCGGCTGTT-3'
15 Fibronectin 특이적 프라이머 정방향 5'-GCGAGAGTGCCCCTACTACA-3'
16 역방향 5'-GTTGGTGAATCGCAGGTCA-3'
17 N-cadherin 특이적 프라이머 정방향 5'-CCTGCTCTGCATCATCATCCTGC-3'
18 역방향 5'-CTGCAGCTGGCTCAAGTCATAGTC-3'
19 ZEB1 특이적 프라이머 정방향 5'-GGCATACACCTACTCAACTACGG-3'
20 역방향 5'-TGGGCGGTGTAGAATCAGAGTC-3'
21 Snail 특이적 프라이머 정방향 5'-CCTTCTCTAGGCCCTGGCTGCTAC-3'
22 역방향 5'-GACATCTGAGTGGGTCTGGAGGTGG-3'
23 NFκB 특이적 프라이머 정방향 5'-TGCAGCAGACCAAGGAGATG-3'
24 역방향 5'-TGCATTGGGGGCTTTACTGT-3'
25 Nox4 특이적 프라이머 정방향 5'-GCAGGAGAACCAGGAGATTG-3'
26 역방향 5'-CACTGAGAAGTTGAGGGCATT-3'
그 결과 도 4에서 나타내는 것과 같이, 메나디온 처리에 의해 산화 스트레스가 증가되어 있는 인간 각막내피세포에서 MMF는 항산화 효소들인 HO-1, Prdx1, Prdx6과 산화물질을 감소시킨다고 알려진 ATP결합상자 수송체 (ABCB6)의 mRNA 발현을 증가시켰고, 특히 이런 인자들은 푹스 내피 각막 이영양증과 같은 각막 이영양증에서 발현이 감소되어 있는 것으로 보고되어 있다 (Redox Biology, 2020, doi.org/10.1016/j.redox.2020.101763). 도 4에서 Control군(Ctrl)은 메나디온을 처리하지 않은 세포군을 의미한다.
또한, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 TGF-β1 처리에 의해 TGF-β 신호전달계 활성이 증가되어 있는 인간 각막내피세포에서 MMF는 TGF-β1 mRNA 발현을 감소시켰으며, 또한 섬유화가 고착되기 전 단계인 endothelial-to-mesenchymal transition (EnMT)의 주요 인자들인 N-cadherin(N-cad), ZEB1 및 Snail의 mRNA 발현을 감소시켰고, 섬유화를 매개하는 주된 인자들인 collagen(Coll)과 fibronectin의 mRNA 발현을 감소시켰다. 도 5에서 Control군(Ctrl)은 TGF-β1을 처리하지 않은 세포군을 의미한다.
더 나아가 산화 스트레스 및 섬유화와 모두 밀접한 관련성을 보이는 NFkB와 Nox4의 mRNA 발현을 감소시키는 것으로 나타내었다.
상기 결과들을 토대로, 본 발명의 MMF는 안 질환의 항산화 및 항섬유화 치료 목적에 적합한 치료기전을 가짐을 확인하였다.

Claims (14)

  1. 하기 화학식 (1)로 표시되는 푸마르산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는, 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    Figure PCTKR2023002950-appb-img-000006
    화학식 (1)
    (상기 화학식 (1)에 있어서,
    R1은 C1-C2 알킬로 이루어진 그룹에서 선택되고,
    R2는 H 및 C1-C3 알킬로 이루어진 그룹에서 선택된다.)
  2. 제1항에 있어서, R1은 C1-C2 알킬로 이루어진 그룹에서 선택되고, R2는 H 인, 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 pH가 4.0 내지 8.0인 액상 조성물인, 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 pH가 4.0 내지 6.5인 액상 조성물인, 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 안정화제, 용해보조제, 포접화제 및 계면활성제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 추가로 포함하는, 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 안정화제는 이디티에이(EDTA) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인, 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은, 사용 전 용매에 용해가 예정된, 건조 분말 형태인, 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 용매는 물, 식염수, 완충액, 수성 덱스트로즈, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 에탄올로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 점안 조성물인, 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 안질환은 각막이영양증, 녹내장, 백내장, 각막염, 결막염, 및 공막염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 각막이영양증은 푹스각막내피이영양증(Fuchs corneal endothelial dystrophy: FECD), 과립형각막이영양증 1(granulo corneal dystrophy 1: GCD 1), 아벨리노각막이영양증(Avellino corneal dystrophy, granulo corneal dystrophy 2: GCD 2), 격자형각막이영양증(lattice corneal dystrophy: LCD), 후부다형각막이영양증(Posterior polymorphous corneal dystrophy: PPCD), 및 선천유전내피이영양증(Congenital hereditary endothelial dystrophy: CHED)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 안질환은 푹스각막내피이영양증인, 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 안구에 투여하는 단계를 포함하는, 안질환의 예방 또는 치료 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물이 고체 제형인 경우, 상기 고체 제형을 용매에 용해시키는 단계가 선행하여 추가로 수행되는, 안질환의 예방 또는 치료 방법.
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