WO2023158213A1 - 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 snp 마커 및 이를 이용한 관상동맥 질환 발병 저위험 예측 방법 - Google Patents

관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 snp 마커 및 이를 이용한 관상동맥 질환 발병 저위험 예측 방법 Download PDF

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WO2023158213A1
WO2023158213A1 PCT/KR2023/002207 KR2023002207W WO2023158213A1 WO 2023158213 A1 WO2023158213 A1 WO 2023158213A1 KR 2023002207 W KR2023002207 W KR 2023002207W WO 2023158213 A1 WO2023158213 A1 WO 2023158213A1
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WO
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snp
gene
coronary artery
allele
artery disease
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PCT/KR2023/002207
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Inventor
이상학
이찬주
원홍희
김범수
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연세대학교 산학협력단
사회복지법인 삼성생명공익재단
성균관대학교산학협력단
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • This technology relates to a biomarker that can predict the low risk of coronary artery disease, and is a marker identified using genetic variation and eQTL related to ultra-normal coronary arteries in a group with high cardiovascular risk but normal coronary arteries using GWAS. Through this, it is a technique that can predict the low risk of developing coronary artery disease.
  • Non-Patent Documents 1 to 4 In a general population study or family study, loss-of-function mutations were identified in ANGPTL3 by PCSK9 in persons with a relatively low risk of vascular disease. These studies were analyzed with respect to the presence of vascular disease using randomly enrolled persons. In addition, genes with variants associated with low-risk phenotypes generally belonged to lipid metabolism pathways. The genetic and medical insights gleaned from these studies could be the basis for the successful development of novel targeted therapies, such as ANGPTL3 or PSCK9 monoclonal antibodies, for atherosclerotic vascular disease.
  • novel targeted therapies such as ANGPTL3 or PSCK9 monoclonal antibodies
  • Non-Patent Document 5 A recent study reported that people with supernormal arterial stiffness had a better prognosis in terms of cardiovascular events. Individual factors influencing these phenotypes may differ, but have not been reported in detail. A recent study on this protective phenotype was also conducted in diabetic patients resistant to diabetic retinopathy (Non-Patent Document 5). However, no genetic study of ultranormal or protected blood vessels has been conducted in a population with a high cardiovascular risk score calculated by a combination of risk factors.
  • the present inventors completed the present invention by identifying genetic loci and candidate genes potentially associated with coronary arteries protected from ultranormal or atherosclerosis.
  • Non-Patent Document 0001 McPherson R, Tybjaerg-Hansen A. Genetics of coronary artery disease. Circ Res 2016;118:564-578
  • Non-Patent Document 0002 Song J, Kim YK. Discovery and functional prediction of long non-coding RNAs common to ischemic stroke and myocardial infarction. J Lipid Atheroscler 2020;9:449-459
  • Non-Patent Document 0003 Lee HT, Oh S, Ro DH, et al. The key role of DNA methylation and histone acetylation in epigenetics of atherosclerosis. J Lipid Atheroscler 2020;9:419-434
  • Non-Patent Document 0004 Khera AV and Kathiresan S: Genetics of coronary artery disease: discovery, biology and clinical translation. Nat Rev Genet, 2017; 18: 331-344
  • Non-Patent Document 0005 Yokomizo H, Maeda Y, Park K, et al. Retinol binding proteoin 3 is increased in the retina of patients with diabetes resistant to diabetic retinopathy. Sci Transl Med 2019;11:eaau6627
  • the present inventors have tried to use it as a marker for predicting low risk of coronary artery disease by finding a genetic locus associated with a group with high cardiovascular risk but no coronary artery-related disease, and as a result, GWAS (genome -wide association study) was used to find genetic variations related to ultranormal coronary artery, and the present invention was completed by identifying the gene using eQTL (expression quantitative trait loci).
  • eQTL expression quantitative trait loci
  • an object of the present invention is to detect rs6427989, which is a SNP of the PPFIA4 gene; rs9630089, which is a SNP of the SLIT1 or ARHGAP19 gene; rs10799925, which is a SNP of LOC100422212 or PBX1 gene; rs9710701, which is a SNP of LINC01849 or NPAS2 gene; rs1415914, a SNP in MIR4465 or NMBR gene; rs1538950, which is a SNP in the LINC02644 or ZNF438 gene; rs1847474, a SNP in the LINC01493 or LRRC4C gene; rs3002220, which is a SNP of PABPC3 or AMER2 gene; rs12587912, a SNP of the SLC25A21 gene; And to provide a SNP biomarker composition for predicting low risk of coronary
  • Another object of the present invention is to provide a composition for predicting low risk of coronary artery disease, including an agent capable of detecting or amplifying the SNP biomarker set.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for predicting low risk of coronary artery disease including the composition for predicting low risk of developing coronary artery disease.
  • Another object of the present invention is to provide a method for predicting low risk of coronary artery disease using the composition for predicting low risk of coronary artery disease.
  • Another object of the present invention is a method for providing information for predicting a low risk of coronary artery disease, comprising determining an allele of an SNP from a biological sample isolated from an individual, wherein the SNP is rs6427989, a SNP of the PPFIA4 gene.
  • rs9630089 which is a SNP of the SLIT1 or ARHGAP19 gene
  • rs10799925 which is a SNP of LOC100422212 or PBX1 gene
  • rs9710701 which is a SNP of LINC01849 or NPAS2 gene
  • rs1415914 a SNP in MIR4465 or NMBR gene
  • rs1538950 which is a SNP in the LINC02644 or ZNF438 gene
  • rs1847474 a SNP in the LINC01493 or LRRC4C gene
  • rs3002220 which is a SNP of PABPC3 or AMER2 gene
  • rs12587912 a SNP of the SLC25A21 gene
  • And to provide an information providing method for predicting a low risk of coronary artery disease including one or more SNPs selected from the group consisting of PRR25 or LMF1 gene SNP rs663580.
  • the present invention is a SNP of the PPFIA4 gene, rs6427989; rs9630089, which is a SNP of the SLIT1 or ARHGAP19 gene; rs10799925, which is a SNP of LOC100422212 or PBX1 gene; rs9710701, which is a SNP of LINC01849 or NPAS2 gene; rs1415914, a SNP in MIR4465 or NMBR gene; rs1538950, which is a SNP in the LINC02644 or ZNF438 gene; rs1847474, a SNP in the LINC01493 or LRRC4C gene; rs3002220, which is a SNP of PABPC3 or AMER2 gene; rs12587912, a SNP of the SLC25A21 gene; And it provides a SNP biomarker composition for predicting a low risk of coronary
  • the present invention also provides a composition for predicting a low risk of developing coronary artery disease, comprising an agent capable of detecting or amplifying the SNP biomarker set.
  • the agent capable of detecting or amplifying the SNP biomarker set may be a probe or primer set complementary to the SNP.
  • the present invention also provides a kit for predicting low risk of coronary artery disease including the composition for predicting low risk of developing coronary artery disease.
  • the present invention provides a method for predicting the low risk of coronary artery disease using the composition for predicting the low risk of coronary artery disease.
  • the method for predicting low risk of coronary artery disease is:
  • the SNP in the step (c) is rs6427989, which is a SNP of the PPFIA4 gene; rs9630089, which is a SNP of the SLIT1 or ARHGAP19 gene; rs10799925, which is a SNP of LOC100422212 or PBX1 gene; rs9710701, which is a SNP of LINC01849 or NPAS2 gene; rs1415914, a SNP in MIR4465 or NMBR gene; rs1538950, which is a SNP in the LINC02644 or ZNF438 gene; rs1847474, a SNP in the LINC01493 or LRRC4C gene; rs3002220, which is a SNP of PABPC3 or AMER2 gene; rs12587912, a SNP of the SLC25A21 gene; And it may be one or more selected from the group consisting of PRR25 or LMF
  • step (c) in step (c)
  • coronary artery disease does not occur, or may further include a step of predicting with a low risk of occurrence.
  • the cardiovascular risk of the subject in step (a) may be an individual whose Framingham risk score is ⁇ 14 and the 10-year risk is ⁇ 16%.
  • the sample in step (a), is muscle, skeleton, whole blood, tibial artery, pancreas, esophageal mucosa, tibial nerve, sigmoid colon, esophageal muscle, lung, aorta, spleen, ovary, stomach It can be obtained from at least one selected from the group consisting of esophageal junction, testis, coronary artery, left ventricle, abdominal subcutaneous fat, heart-atrial appendage, small intestine-intestinal end, skin not exposed to sunlight, cells, breast and adrenal gland.
  • the present invention is also a method for providing information for predicting a low risk of coronary artery disease, comprising determining an allele of an SNP from a biological sample isolated from an individual, wherein the SNP is rs6427989, which is a SNP of the PPFIA4 gene; rs9630089, which is a SNP of the SLIT1 or ARHGAP19 gene; rs10799925, which is a SNP of LOC100422212 or PBX1 gene; rs9710701, which is a SNP of LINC01849 or NPAS2 gene; rs1415914, a SNP in MIR4465 or NMBR gene; rs1538950, which is a SNP in the LINC02644 or ZNF438 gene; rs1847474, a SNP in the LINC01493 or LRRC4C gene; rs3002220, which is a SNP of PABPC3 or AMER2
  • the present invention also includes the following steps (a) to (c), i) rs6427989, which is a SNP of the PPFIA4 gene, ii) rs9630089, which is a SNP of the SLIT1 or ARHGAP19 gene, iii) rs10799925, which is a SNP of the LOC100422212 or PBX1 gene, iv) rs9710701, which is a SNP of LINC01849 or NPAS2 gene, v) rs1415914, which is SNP of MIR4465 or NMBR gene, vi) rs1538950, which is SNP of LINC02644 or ZNF438 gene, vii) rs1847474, which is SNP of LINC01493 or LRRC4C gene, viii) PA BPC3 or AMER2 gene Provided is a method for detecting one or more SNPs selected from the group consisting of rs
  • the step (c) may be to determine whether to detect the following alleles i) to x):
  • the allele of rs9630089 which is a SNP of the SLIT1 or ARHGAP19 gene, is G;
  • rs10799925 which is a SNP of LOC100422212 or PBX1 gene, is T;
  • rs9710701 which is a SNP of LINC01849 or NPAS2 gene, is C;
  • v) the allele of rs1415914, a SNP of the MIR4465 or NMBR gene, is T;
  • rs3002220 which is a SNP of PABPC3 or AMER2 gene, is C;
  • the allele of rs663580, a SNP in the PRR25 or LMF1 gene, is C.
  • the cardiovascular risk of the subject in step (a) may be a Framingham risk score of ⁇ 14 and a 10-year risk of ⁇ 16%.
  • the sample in step (a), is muscle, skeleton, whole blood, tibial artery, pancreas, esophageal mucosa, tibial nerve, sigmoid colon, esophageal muscle, lung, aorta, spleen, ovary, stomach It may be obtained from one or more selected from the group consisting of esophageal junction, testis, coronary artery, left ventricle, abdominal subcutaneous fat, heart-atrial appendage, small intestine-intestinal end, skin not exposed to sunlight, cells, breast and adrenal gland. .
  • the present invention can be used as a marker for predicting a low risk of coronary artery disease by finding a genetic locus associated with a normal group on coronary artery examination, although the risk is high because there are a number of cardiovascular risk factors. medicine can be provided.
  • Figure 1 shows a schematic diagram of the selection of study participants.
  • Figure 2 shows the genome-wide association study results (Genome-wide association study).
  • Figure 3 shows the characteristics of study participants.
  • PCA Principal Component Analysis
  • GRCh37 chromosome number and base pair position (GRCh37/hg19); A1, effective allele; A2, non-effective allele; OR, odds ratio of each SNP estimated by Firth's logistic regression; L95, the lower bound of the 95% confidence interval of the odds ratio; U95, upper limit of the 95% confidence interval of the odds ratio; P, P-value of odds ratio estimated by Firth's logistic regression; P permutation , P-value of odds ratio estimated by permutation test; EAF, effective allele frequency in this study sample.
  • FIG. 6 shows a quantile plot of the GWAS results of the supernormal group.
  • the negative log of the observed (y-axis) and expected (x-axis) P values are shown for each SNP.
  • the genome inflation factor ( ⁇ GC ) is indicated in the upper left corner of the figure.
  • FIG. 7a to 7j show regional plots of important loci.
  • the regional plot with -log10(P) represents the supernormal group GWAS results.
  • the results of the association analysis are shown in the 2 megabase pair region surrounding the top variant (purple).
  • Each dot represents a variant and different colors represent the linkage disequilibrium (r 2 ) of each variant and its parent variant.
  • Figure 8 shows the eQTL (expression quantitative trait loci) results of the genotype-tissue expression project (GTEx, Genotype-Tissue Expression Project).
  • the present invention is a SNP of the PPFIA4 gene, rs6427989; rs9630089, which is a SNP of the SLIT1 or ARHGAP19 gene; rs10799925, which is a SNP of LOC100422212 or PBX1 gene; rs9710701, which is a SNP of LINC01849 or NPAS2 gene; rs1415914, a SNP in MIR4465 or NMBR gene; rs1538950, which is a SNP in the LINC02644 or ZNF438 gene; rs1847474, a SNP in the LINC01493 or LRRC4C gene; rs3002220, which is a SNP of PABPC3 or AMER2 gene; rs12587912, a SNP of the SLC25A21 gene; And it provides a SNP biomarker composition for predicting a low risk of coronary artery disease, including one or
  • prediction refers to whether a specific individual is likely to develop coronary artery disease, and if there is a possibility of developing coronary artery disease, whether the probability of developing coronary artery disease is relatively low compared to an unspecified number of people. means to determine
  • the term "low-risk predictive marker” means a polypeptide or nucleic acid showing a significant increase or decrease in gene expression level or protein expression level in an individual with a low risk of coronary artery disease compared to a normal control individual (e.g., : mRNA, etc.), lipids, glycolipids, glycoproteins, sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.), and organic biomolecules such as SNPs.
  • low risk refers to an individual with a high expected cardiovascular risk due to having a number of cardiovascular risk factors, but normal coronary artery examination was confirmed and coronary artery disease may not occur in the present invention. It refers to a condition that can be identified by the claimed SNP biomarker.
  • “super normal group”, “supernormal” and “protected from cardiovascular disease” may be used interchangeably.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the term “marker” refers to a biomarker and can detect changes in living organisms, thereby objectively measuring the normal or pathological state of living organisms, the degree of response to drugs, and the like.
  • SNP rs6427989 of the PPFIA4 gene As a result of whole genome linkage analysis, SNP rs6427989 of the PPFIA4 gene; rs9630089, which is a SNP of the SLIT1 or ARHGAP19 gene; rs10799925, which is a SNP of LOC100422212 or PBX1 gene; LINC01849, rs9710701, a SNP in the NPAS2 gene; MIR4465, rs1415914, a SNP of the NMBR gene; LINC02644, rs1538950, a SNP of the ZNF438 gene; LINC01493, rs1847474, a SNP in the LRRC4C gene; PABPC3, rs3002220, which is a SNP of the AMER2 gene; rs12587912, a SNP of the SLC25A21 gene; And it was confirmed that rs663580
  • allele refers to several types of a gene that occur at the same locus on a homologous chromosome. Alleles are also used to indicate polymorphism, for example, SNPs have two or more types, for example, two types of alleles.
  • GWAS Gene-wide association study
  • primer used throughout the present specification is a base sequence having a short free 3' terminal hydroxyl group, capable of forming a base pair with a complementary template, and copying the template strand.
  • a short sequence that serves as a starting point for A primer can initiate DNA synthesis in the presence of a reagent for polymerization (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different nucleoside triphosphates in an appropriate buffer and temperature.
  • a reagent for polymerization i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase
  • PCR conditions and lengths of sense and antisense primers may be modified based on those known in the art.
  • the probe used for detecting the SNP may refer to a hybridization probe, and refers to an oligonucleotide capable of sequence-specifically binding to a complementary strand of a nucleic acid.
  • Hybridization conditions must be sufficiently stringent to hybridize to only one of the alleles with significant differences in hybridization strength between alleles. It is preferable that the central region of the probe of the present invention aligns with the polymorphic region of the polymorphic sequence. This can lead to good hybridization differences between different allelic forms.
  • the probe may be used in a kit or prediction method such as a microarray for diagnosing cerebral aneurysms by detecting alleles.
  • the probe of interest may be labeled so as to be detectable, for example labeled with a radioactive isotope, fluorescent compound, bioluminescent compound, chemiluminescent compound, metal chelate or enzyme.
  • a radioactive isotope for example labeled with a radioactive isotope, fluorescent compound, bioluminescent compound, chemiluminescent compound, metal chelate or enzyme.
  • Properly labeling the probe as described above is a technique widely known in the art and can be performed through a conventional method.
  • the primer or probe may be chemically synthesized using a phosphoramidite solid support method or other well-known methods.
  • Such nucleic acid sequences can also be modified using a number of means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, capping, substitution of one or more homologues of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages (e.g., methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoro amidates, carbamates, etc.) or to charged linkages (eg phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.).
  • uncharged linkages e.g., methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoro amidates, carbamates, etc.
  • charged linkages eg phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.
  • the probe may further conjugate a reporter to its 5' end.
  • the reporter is FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red (texas red), fluorescein (fluorescein), fluorescein chlorotriazinyl (fluorescein chlorotriazinyl), HEX (2',4',5',7'-tetrachloro -6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), rhodamine green, rhodamine red, tetramethylrhodamine, fluorescein isothiocyanate (FITC), oregon green, Alexa Fluoro (alexa fluor), JOE (6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX (6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET (TetrachloroFluorescein), TRITC (tertramethylrodamine isothiocyanate ),
  • the probe may further conjugate a quencher to its 3' end.
  • the photon is TAMRA, BHQ (black hole quencher) 1, BHQ2, BHQ3, NFQ (nonfluorescent quencher), dabcyl, Eclipse, DDQ (deep dark quencher), Blackberry Quencher, Iowa black ), but may be any one or more selected from the group consisting of, in addition, any material known in the art that can be used as a quencher may be used.
  • CAD coronary artery disease
  • coronary artery disease refers to atherosclerotic disease caused by narrowing of the arteries (coronary arteries) supplying blood to the myocardium by atherosclerosis and, in some cases, by blockage by blood clots. means vascular disease.
  • CAD causes a decrease in blood flow to the myocardium, so that the myocardium does not receive a sufficient amount of oxygen, sometimes causing necrosis.
  • CAD includes, but is not limited to, acute coronary syndrome, myocardial infarction (heart attack), angina pectoris (stable and unstable), or thrombosis and atherosclerosis in the blood vessels supplying the heart.
  • the present invention also provides a composition for predicting a low risk of developing coronary artery disease, comprising an agent capable of detecting or amplifying the SNP biomarker set.
  • the agent capable of detecting or amplifying the SNP biomarker set may be a probe or primer set complementary to the SNP.
  • the present invention also provides a kit for predicting low risk of coronary artery disease including the composition for predicting low risk of developing coronary artery disease.
  • the kit may be of various types depending on the method of using the SNP marker.
  • the kit when the SNP marker is to be used as a primer for polynucleotide amplification, the kit may be a nucleic acid amplification kit.
  • the kit may include various reagents required for nucleic acid amplification, such as DNA polymerase, dNTP, buffer, detection label, and the like.
  • the kit may be a nucleic acid hybridization kit.
  • the kit may include various reagents required for nucleic acid hybridization, such as a hybridization buffer and a detection label.
  • the polynucleotide may be fixed and arranged on a substrate of a microarray device, but is not limited thereto.
  • the nucleotide sequence at the SNP position can be determined by directly determining the nucleotide sequence of the nucleic acid by the dideoxy method, or by hybridizing a probe containing the sequence at the SNP position to a target polynucleotide and analyzing the hybridization result.
  • the degree of hybridization can be confirmed, for example, by labeling a target nucleic acid with a detectable label and detecting the hybridized target nucleic acid, or by an electrical method or the like.
  • a single base primer extension (SBE) method and a molecular inversion method may be used.
  • the SNP is sequencing, exome sequencing, microarray hybridization, allele specific PCR, dynamic allele-specific hybridization hybridization), PCR extension analysis, and Taqman technique, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for predicting the low risk of coronary artery disease using the composition for predicting the low risk of coronary artery disease.
  • the method for predicting low risk of coronary artery disease is:
  • the SNP in the step (c) is rs6427989, which is a SNP of the PPFIA4 gene; rs9630089, which is a SNP of the SLIT1 or ARHGAP19 gene; rs10799925, which is a SNP of LOC100422212 or PBX1 gene; rs9710701, which is a SNP of LINC01849 or NPAS2 gene; rs1415914, a SNP in MIR4465 or NMBR gene; rs1538950, which is a SNP in the LINC02644 or ZNF438 gene; rs1847474, a SNP in the LINC01493 or LRRC4C gene; rs3002220, which is a SNP of PABPC3 or AMER2 gene; rs12587912, a SNP of the SLC25A21 gene; And it may be one or more selected from the group consisting of PRR25 or LMF
  • step (c) in step (c)
  • coronary artery disease does not occur, or may further include the step of predicting the risk of occurrence at a low level.
  • high cardiovascular risk group refers to a group with a Framingham risk score of ⁇ 14 and thus an expected 10-year risk of ⁇ 16%.
  • the Framingham coronary risk score a study that started about 50 years ago, introduced the concept of risk factors in cardiovascular diseases and provided a standard for risk factor estimation.
  • the Framingham coronary risk score presented here It is widely recommended for predicting the risk of developing cardiovascular disease.
  • the Framingham risk score study established the concept that thorough drug treatment and therapeutic lifestyle changes can prevent cardiovascular disease.
  • the term “supernormal group” used throughout the present specification refers to a normal blood vessel group in which there is little atherosclerosis in coronary arteries on examination despite a high cardiovascular risk. In the present specification, it may be named interchangeably with “supernormal”, “low risk group” and “low risk group”.
  • the group with low coronary artery risk means a group with a high cardiovascular risk estimated by the Framingham coronary risk score like the control group, but with normal coronary arteries unlike the control group.
  • control group refers to a group in which coronary artery disease occurred in a group with high cardiovascular risk estimated by the Framingham coronary risk score.
  • the cardiovascular risk of the subject in step (a) may be an individual whose Framingham risk score is ⁇ 14 and the 10-year risk is ⁇ 16%.
  • the sample in step (a), is muscle, skeleton, whole blood, tibial artery, pancreas, esophageal mucosa, tibial nerve, sigmoid colon, esophageal muscle, lung, aorta, spleen, ovary, stomach It can be obtained from at least one selected from the group consisting of esophageal junction, testis, coronary artery, left ventricle, abdominal subcutaneous fat, heart-atrial appendage, small intestine-intestinal end, skin not exposed to sunlight, cells, breast and adrenal gland, Not limited to this.
  • the present invention is also a method for providing information for predicting a low risk of coronary artery disease, comprising determining an allele of an SNP from a biological sample isolated from an individual, wherein the SNP is rs6427989, which is a SNP of the PPFIA4 gene; rs9630089, which is a SNP of the SLIT1 or ARHGAP19 gene; rs10799925, which is a SNP of LOC100422212 or PBX1 gene; rs9710701, which is a SNP of LINC01849 or NPAS2 gene; rs1415914, a SNP in MIR4465 or NMBR gene; rs1538950, which is a SNP in the LINC02644 or ZNF438 gene; rs1847474, a SNP in the LINC01493 or LRRC4C gene; rs3002220, which is a SNP of PABPC3 or AMER2
  • the present invention provides a method for detecting 10 SNPs according to the present invention in an individual.
  • the method for detecting the SNP is i) rs6427989, which is a SNP of the PPFIA4 gene, ii) rs9630089, which is a SNP of the SLIT1 or ARHGAP19 gene, iii) rs10799925, which is a SNP of the LOC100422212 or PBX1 gene, iv) LINC01849 or the SNP of the NPAS2 gene rs9710701, v) rs1415914, a SNP in the MIR4465 or NMBR gene, vi) rs1538950, a SNP in the LINC02644 or ZNF438 gene, vii) rs1847474, a SNP in the LINC01493 or LRRC4C gene, viii) rs300222, a SNP in the PABPC3 or AMER2 gene 0, ix) SLC25A21 gene
  • step (c) may be to determine whether to detect the following alleles i) to x):
  • the allele of rs9630089 which is a SNP of the SLIT1 or ARHGAP19 gene, is G;
  • rs10799925 which is a SNP of LOC100422212 or PBX1 gene, is T;
  • rs9710701 which is a SNP of LINC01849 or NPAS2 gene, is C;
  • v) the allele of rs1415914, a SNP of the MIR4465 or NMBR gene, is T;
  • rs3002220 which is a SNP of PABPC3 or AMER2 gene, is C;
  • the allele of rs663580, a SNP in the PRR25 or LMF1 gene, is C.
  • the cardiovascular risk of the subject in step (a) may be a Framingham risk score of ⁇ 14 and a 10-year risk of ⁇ 16%, but are limited thereto. It doesn't work.
  • the sample is muscle, skeleton, whole blood, tibial artery, pancreas, esophageal mucosa, tibial nerve, sigmoid colon, esophageal muscle, lung, aorta, spleen, Obtained from at least one selected from the group consisting of ovary, gastroesophageal junction, testis, coronary artery, left ventricle, abdominal subcutaneous fat, heart-atrial appendage, small intestine-intestinal end, skin not exposed to sunlight, cells, breast and adrenal gland. It may be, but is not limited thereto.
  • the term "subject” refers to any subject whose risk of developing coronary artery disease is to be determined, and in particular, includes subjects with a high cardiovascular risk such as Framingham risk score or 10-year risk score, but is not limited thereto.
  • CGC Cardiovascular Genome Center
  • CMERC-HI Center for Cardiovascular and Metabolic Disease Etiology-High Risk
  • Inclusion criteria for the CMERC-HI cohort were hypertensive patients with reduced estimated glomerular filtration rate, diabetic patients with albuminuria, and individuals with carotid plaque or increased carotid intima-media thickness. Individuals in both cohorts underwent coronary artery calcium scoring or coronary angiography as needed due to chest symptoms for health examination.
  • Cardiovascular risk was defined as those with a Framingham risk score ("NHLBI, 10-year risk estimate for CHD". Retrieved from National Heart, Lung, and Blood Institute. 2013-09-14) of 14 or greater, with a 10-year risk of 16. % or more were considered high risk and were ultimately enrolled.
  • a normal coronary artery was defined as a coronary artery that showed no plaque on coronary angiography or had a coronary artery calcium score of 0 on computed tomography.
  • Coronary artery disease was defined as 50% or greater luminal stenosis in one or more epicardial coronary arteries.
  • the median age of study participants was 67 years and 39% of participants had diabetes. More than half of the participants were hypertensive or current smokers. Median total cholesterol and HDL-C were 174 mg/dL and 38 mg/dL, respectively, and the median Framingham risk score was 15. The supernormal group had a higher frequency of hypertension and smokers and a higher Framingham risk score, and other characteristics were similar between the two groups.
  • DNA samples from study participants were genotyped in the Korea Biobank Array (Theragen, Seoul, Korea) optimized for the Korean population ⁇ PMID: 30718733 ⁇ .
  • Sample-level and variance-level quality control (QC) was performed on the genotype data.
  • Specimens with related relatives of secondary or close kinship were identified and excluded using KING 2.0 ⁇ PMID: 20926424 ⁇ .
  • Samples were excluded based on several criteria, including call rate ⁇ 95%, heterozygosity 5 standard deviations (sd) from the mean, and discrepancies between sex estimated based on heterozygosity on the X chromosome and reported sex.
  • variants with call rate ⁇ 98%, minority allele frequency (MAF) ⁇ 1%, or out of Hardy-Weinberg equilibrium (P ⁇ 1.0 ⁇ 10 -6 ) were excluded. There were no outlier samples in the Principal Component Analysis (PCA) performed on genetic mutations with high frequency (MAF ⁇ 5%). The first three principal components of all samples were within 5 standard deviations of the mean.
  • genotype data were phased using Eagle v2.3 ⁇ PMID: 27694958 ⁇ and variants were statistically estimated using Minimac v4 ⁇ PMID: 27571263 ⁇ and the Haplotype Reference Consortium (HRC r1.1 2016) reference panel. Genetic variants with low statistical variance estimation quality scores (R 2 ⁇ 0.8) or MAF ⁇ 1% were excluded to reduce false-positive statistical variance estimation results.
  • GWAS Genome-wide association analysis
  • the observed significance levels of the 10 lead SNPs at each locus were confirmed in a permutation test using the Monte Carlo method (P ⁇ 9.0 ⁇ 10 -6 ). Seven loci were intergenic, including SNPs near PBX1, and three loci were intronic, including SNPs in PPFIA4 and ARHGAP19-SLIT1. The genotypic patterns of the 10 lead variants of the study participants are shown in Figure 2b.
  • eQTL data from the Genotype-Tissue Expression Project (GTEx) ⁇ PMID: 32913098 ⁇ were used to identify variants associated with gene expression among GWAS lead variants or their proxies (LD r 2 > 0.8).
  • GTEx Genotype-Tissue Expression Project
  • a total of 265 genes were tested for cis-eQTL association in relevant tissues (coronary artery, whole blood, subcutaneous fat and visceral adipose tissue) for GWAS lead variants or their proxies.
  • cis-eQTL results that passed Bonferroni's correction were considered significant (cis-eQTL P-value ⁇ 0.05/265).
  • Table 2 shows the GTEx eQTL results.
  • 3 of the 10 GWAS lead mutations or their proxies were found in coronary artery, whole blood or adipose tissue of the Genotype-Tissue Expression project (GTEx) ⁇ PMID: 32913098 ⁇ . were related to gene expression levels.
  • the intronic lead mutation rs9630089 of ARHGAP19-SLIT1 was associated with SLIT1 expression in coronary artery, whole blood, and adipose tissue, and ARHGAP19 expression in adipose tissue.
  • the intronic lead mutation rs6427989 of PPFIA4 was associated with PPFIA4 expression in whole blood.

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Abstract

본 발명에서는 GWAS를 사용하여 관상동맥과 연관된 유전적 변이와 eQTL을 사용하여 해당하는 마커를 식별하고자 하였으며, 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 SNP 바이오마커 조성물, 키트 및 관상동맥 질환 발병 저위험 예측 방법을 제공한다. 구체적으로 심혈관 위험도가 높지만 관상동맥이 정상이거나, 관상동맥 질환이 있는 남성(대조군)을 대상으로 바이오마커를 식별한 결과, 10개의 독립적인 유전좌위를 확인하였다. 본 발명의 바이오마커는 관상동맥 질환 발병으로부터 보호되는 유전적 좌위를 시사하는 바, 개인별 맞춤 의약을 제공할 수 있다.

Description

관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 SNP 마커 및 이를 이용한 관상동맥 질환 발병 저위험 예측 방법
본 기술은 관상동맥 질환 발병 저위험을 예측할 수 있는 바이오마커에 관한 것으로, GWAS를 이용하여 심혈관 위험도가 높지만 관상동맥이 정상인 군에서 초정상 관상동맥과 관련된 유전적 변이와 eQTL을 사용하여 식별한 마커를 통해, 관상동맥 질환 발병 저위험을 예측할 수 있는 기술이다.
유전적 요인은 동맥경화성 심혈관 질환 발병에 상당한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 종래의 많은 연구자들은 이러한 위험에 기여하는 유전적 변이를 찾기 위해 적극적으로 조사하였으며, 그 중 많은 것이 전통적인 임상 요인과 관련이 있는 한편 많은 다른 연구는 비암호화 유전 영역 및 알려지지 않은 경로와 관련되어 있음을 발견하였다(비특허문헌 1 내지 4). 일반 인구집단 연구 혹은 가족 연구에서 혈관 질환 위험도가 상대적으로 낮은 사람은 PCSK9에 의해 ANGPTL3에서 기능 상실 변이가 확인되었다. 이러한 연구는 무작위로 등록된 사람들을 이용하여 혈관 질환 존재와 관련하여 분석되었다. 또한, 질환 저위험 표현형과 관련된 변이가 있는 유전자는 일반적으로 지질 대사 경로에 속했다. 이러한 연구에서 얻은 유전적 및 의학적 통찰력은 죽상경화성 혈관 질환에 대한 ANGPTL3 또는 PSCK9 단일클론 항체와 같은 새로운 표적 치료제의 성공적인 개발에 기초가 될 수 있었다.
최근 연구에서 동맥 경직도가 초정상인 사람들은 심혈관 사건 측면에서 예후가 더 좋은 것이 보고되었다. 이러한 표현형에 영향을 미치는 개인의 요인은 다를 수 있지만 자세히 보고되지는 않았다. 이러한 보호 표현형에 관한 최근 연구는 당뇨병성 망막병증에 저항성이 있는 당뇨병 환자에서 수행되기도 하였다 (비특허문헌 5). 그러나 초정상 혹은 보호되는 혈관에 대한 유전적 연구가 위험 요소의 조합에 의해 계산된 심혈관 위험 점수가 높은 집단을 대상으로 수행된 적은 없었다.
이에, 본 발명자들은 초정상 혹은 죽상동맥경화증으로부터 보호되는 관상동맥과 잠재적인 연관성이 있는 유전적 좌위와 후보 유전자를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
[선행기술문헌]
[비특허문헌]
(비특허문헌 0001) McPherson R, Tybjaerg-Hansen A. Genetics of coronary artery disease. Circ Res 2016;118:564-578
(비특허문헌 0002) Song J, Kim YK. Discovery and functional prediction of long non-coding RNAs common to ischemic stroke and myocardial infarction. J Lipid Atheroscler 2020;9:449-459
(비특허문헌 0003) Lee HT, Oh S, Ro DH, et al. The key role of DNA methylation and histone acetylation in epigenetics of atherosclerosis. J Lipid Atheroscler 2020;9:419-434
(비특허문헌 0004) Khera AV and Kathiresan S: Genetics of coronary artery disease: discovery, biology and clinical translation. Nat Rev Genet, 2017; 18: 331-344
(비특허문헌 0005) Yokomizo H, Maeda Y, Park K, et al. Retinol binding proteoin 3 is increased in the retina of patients with diabetes resistant to diabetic retinopathy. Sci Transl Med 2019;11:eaau6627
이에, 본 발명자들은 심혈관 위험도가 높으나, 관상동맥 관련 질환이 발생하지 않은 군과 연관성이 있는 유전적 좌위를 찾음으로써, 관상동맥 질환 발병 저위험 예측을 위한 마커로서 이용하기 위해 노력한 결과, GWAS(genome-wide association study)를 사용하여 초정상 관상동맥과 관련된 유전적 변이를 찾고, eQTL(expression quantitative trait loci)을 사용하여 해당 유전자를 식별하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 PPFIA4 유전자의 SNP인 rs6427989; SLIT1 또는 ARHGAP19 유전자의 SNP인 rs9630089; LOC100422212 또는 PBX1 유전자의 SNP인 rs10799925; LINC01849 또는 NPAS2 유전자의 SNP인 rs9710701; MIR4465 또는 NMBR 유전자의 SNP인 rs1415914; LINC02644 또는 ZNF438 유전자의 SNP인 rs1538950; LINC01493 또는 LRRC4C 유전자의 SNP인 rs1847474; PABPC3 또는 AMER2 유전자의 SNP인 rs3002220; SLC25A21 유전자의 SNP인 rs12587912; 및 PRR25 또는 LMF1 유전자의 SNP인 rs663580로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 포함하는, 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 SNP 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 SNP 바이오마커 세트를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 조성물을 포함하는 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 조성물을 이용한 관상동맥 질환 발병 저위험 예측 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터, SNP의 대립형질을 결정하는 단계를 포함하는, 관상동맥 질환 발병 저위험 예측을 위한 정보 제공 방법으로, 상기 SNP는 PPFIA4 유전자의 SNP인 rs6427989; SLIT1 또는 ARHGAP19 유전자의 SNP인 rs9630089; LOC100422212 또는 PBX1 유전자의 SNP인 rs10799925; LINC01849 또는 NPAS2 유전자의 SNP인 rs9710701; MIR4465 또는 NMBR 유전자의 SNP인 rs1415914; LINC02644 또는 ZNF438 유전자의 SNP인 rs1538950; LINC01493 또는 LRRC4C 유전자의 SNP인 rs1847474; PABPC3 또는 AMER2 유전자의 SNP인 rs3002220; SLC25A21 유전자의 SNP인 rs12587912; 및 PRR25 또는 LMF1 유전자의 SNP인 rs663580로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 포함하는, 관상동맥 질환 발병 저위험 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안 된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속 하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 PPFIA4 유전자의 SNP인 rs6427989; SLIT1 또는 ARHGAP19 유전자의 SNP인 rs9630089; LOC100422212 또는 PBX1 유전자의 SNP인 rs10799925; LINC01849 또는 NPAS2 유전자의 SNP인 rs9710701; MIR4465 또는 NMBR 유전자의 SNP인 rs1415914; LINC02644 또는 ZNF438 유전자의 SNP인 rs1538950; LINC01493 또는 LRRC4C 유전자의 SNP인 rs1847474; PABPC3 또는 AMER2 유전자의 SNP인 rs3002220; SLC25A21 유전자의 SNP인 rs12587912; 및 PRR25 또는 LMF1 유전자의 SNP인 rs663580로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 포함하는, 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 SNP 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 SNP 바이오마커 세트를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SNP 바이오마커 세트를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는 SNP에 상보적인 프로브 또는 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 조성물을 포함하는 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 조성물을 이용한 관상동맥 질환 발병 저위험 예측 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 관상동맥 질환 발병 저위험 예측 방법은:
(a) 상기 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 조성물을 개체로부터 분리한 검체 게놈 DNA 시료에 처리하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계;
(b) 상기 수행된 PCR 결과물을 시퀀싱(sequencing)하는 단계; 및
(c) 상기 시퀀싱 결과로부터 검체에 SNP가 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함하고,
상기 (c) 단계의 SNP는 PPFIA4 유전자의 SNP인 rs6427989; SLIT1 또는 ARHGAP19 유전자의 SNP인 rs9630089; LOC100422212 또는 PBX1 유전자의 SNP인 rs10799925; LINC01849 또는 NPAS2 유전자의 SNP인 rs9710701; MIR4465 또는 NMBR 유전자의 SNP인 rs1415914; LINC02644 또는 ZNF438 유전자의 SNP인 rs1538950; LINC01493 또는 LRRC4C 유전자의 SNP인 rs1847474; PABPC3 또는 AMER2 유전자의 SNP인 rs3002220; SLC25A21 유전자의 SNP인 rs12587912; 및 PRR25 또는 LMF1 유전자의 SNP인 rs663580로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (c) 단계에서
PPFIA4 유전자의 SNP인 rs6427989의 대립형질(allele)이 A인 경우;
SLIT1 또는 ARHGAP19 유전자의 SNP인 rs9630089의 대립형질이 G인 경우;
LOC100422212 또는 PBX1 유전자의 SNP인 rs10799925의 대립형질이 T인 경우;
LINC01849 또는 NPAS2 유전자의 SNP인 rs9710701의 대립형질이 C인 경우;
MIR4465 또는 NMBR 유전자의 SNP인 rs1415914의 대립형질이 T인 경우;
LINC02644 또는 ZNF438 유전자의 SNP인 rs1538950의 대립형질이 T인 경우;
LINC01493 또는 LRRC4C 유전자의 SNP인 rs1847474의 대립형질이 C인 경우;
PABPC3 또는 AMER2 유전자의 SNP인 rs3002220의 대립형질이 C인 경우;
SLC25A21 유전자의 SNP인 rs12587912의 대립형질이 A인 경우; 및
PRR25 또는 LMF1 유전자의 SNP인 rs663580의 대립형질이 C인 경우
로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 경우, 관상동맥 질환이 발병하지 않거나, 낮은 발병 위험도로 예측하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 개체의 심혈관 위험도는 Framingham 위험 점수가 ≥14 이고, 10년 위험도가 ≥16%인 개체일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 시료는 근육, 골격, 전혈, 경골동맥, 췌장, 식도 점막, 경골신경, S자 결장, 식도 근육, 폐, 대동맥, 비장, 난소, 위식도접합부, 정소, 관상동맥, 좌심실, 복부피하지방, 심장 - 심방 부속물, 소장-장말단, 햇빛에 노출되지 않은 피부, 세포, 유방 및 부신으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에서 얻을 수 있다.
본 발명은 또한, 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터, SNP의 대립형질을 결정하는 단계를 포함하는, 관상동맥 질환 발병 저위험 예측을 위한 정보 제공 방법으로, 상기 SNP는 PPFIA4 유전자의 SNP인 rs6427989; SLIT1 또는 ARHGAP19 유전자의 SNP인 rs9630089; LOC100422212 또는 PBX1 유전자의 SNP인 rs10799925; LINC01849 또는 NPAS2 유전자의 SNP인 rs9710701; MIR4465 또는 NMBR 유전자의 SNP인 rs1415914; LINC02644 또는 ZNF438 유전자의 SNP인 rs1538950; LINC01493 또는 LRRC4C 유전자의 SNP인 rs1847474; PABPC3 또는 AMER2 유전자의 SNP인 rs3002220; SLC25A21 유전자의 SNP인 rs12587912; 및 PRR25 또는 LMF1 유전자의 SNP인 rs663580로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 포함하는, 관상동맥 질환 발병 저위험 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음의 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는, i) PPFIA4 유전자의 SNP인 rs6427989, ii) SLIT1 또는 ARHGAP19 유전자의 SNP인 rs9630089, iii) LOC100422212 또는 PBX1 유전자의 SNP인 rs10799925, iv) LINC01849 또는 NPAS2 유전자의 SNP인 rs9710701, v) MIR4465 또는 NMBR 유전자의 SNP인 rs1415914, vi) LINC02644 또는 ZNF438 유전자의 SNP인 rs1538950, vii) LINC01493 또는 LRRC4C 유전자의 SNP인 rs1847474, viii) PABPC3 또는 AMER2 유전자의 SNP인 rs3002220, ix) SLC25A21 유전자의 SNP인 rs12587912, 및 x) PRR25 또는 LMF1 유전자의 SNP인 rs663580로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 개체에서 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 제2항 또는 제3항의 조성물을 개체로부터 분리된 검체 게놈 DNA 시료에 처리하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계;
(b) 상기 수행된 PCR 결과물을 시퀀싱(sequencing)하는 단계; 및
(c) 상기 시퀀싱 결과로부터 검체에 상기 i) 내지 x)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 SNP가 있는지 여부를 결정하는 단계.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (c) 단계는 다음의 i) 내지 x)의 대립형질의 검출 여부를 결정하는 것일 수 있다:
i) PPFIA4 유전자의 SNP인 rs6427989의 대립형질(allele)이 A;
ii) SLIT1 또는 ARHGAP19 유전자의 SNP인 rs9630089의 대립형질이 G;
iii) LOC100422212 또는 PBX1 유전자의 SNP인 rs10799925의 대립형질이 T;
iv) LINC01849 또는 NPAS2 유전자의 SNP인 rs9710701의 대립형질이 C;
v) MIR4465 또는 NMBR 유전자의 SNP인 rs1415914의 대립형질이 T;
vi) LINC02644 또는 ZNF438 유전자의 SNP인 rs1538950의 대립형질이 T;
vii) LINC01493 또는 LRRC4C 유전자의 SNP인 rs1847474의 대립형질이 C;
viii) PABPC3 또는 AMER2 유전자의 SNP인 rs3002220의 대립형질이 C;
ix) SLC25A21 유전자의 SNP인 rs12587912의 대립형질이 A; 및
x) PRR25 또는 LMF1 유전자의 SNP인 rs663580의 대립형질이 C.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 개체의 심혈관 위험도는 프래밍험 위험 점수 (Framingham risk score)가 ≥14 이고, 10년 위험도가 ≥16%일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 시료는 근육, 골격, 전혈, 경골동맥, 췌장, 식도 점막, 경골신경, S자 결장, 식도 근육, 폐, 대동맥, 비장, 난소, 위식도접합부, 정소, 관상동맥, 좌심실, 복부피하지방, 심장 - 심방 부속물, 소장-장말단, 햇빛에 노출되지 않은 피부, 세포, 유방 및 부신으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에서 얻은 것일 수 있다.
본 발명은 다수의 심혈관 위험요인이 있어서 그 위험도가 높으나, 관상동맥 검사상 정상인 군과 연관성이 있는 유전적 좌위를 찾음으로써, 관상동맥 질환 발병 저위험 예측을 위한 마커로서 이용할 수 있는 바, 개인별 맞춤 의학을 제공할 수 있다.
도 1은 연구 참가자의 선정 개략도를 나타낸다.
도 2는 게놈 전반에 걸친 전장유전체 연관성 연구결과(Genome-wide association study)를 나타낸다.
도 3은 연구 참가자의 특성을 나타낸다.
도 4는 유전적 변이를 이용한 주성분 분석(Principal Component Analysis, PCA)을 나타낸다. 유전적 인종의 처음 세 가지 주성분(PC)에 대해 평균 ± 3 표준편차(파란색 점선), 평균 ± 5 표준편차(빨간색 선)가 표시되며, 각 점은 이 연구의 참가자를 나타낸다. 파란색 원은 초정상군, 빨간색 X 점은 대조군을 나타낸다.
도 5는 GWAS에서 확인된 초정상 관상동맥과 관련된 리드(lead) 변이(P < 5 × 10-5)를 나타낸다. 약어: GRCh37, 염색체 번호 및 염기쌍 위치(GRCh37/hg19); A1, 유효 대립유전자(effective allele); A2, 비효과적 대립유전자(non-effective allele); OR, Firth의 로지스틱 회귀에 의해 추정된 각 SNP의 오즈비(odds ratio); L95, 오즈비의 95% 신뢰 구간의 하한; U95, 오즈비의 95% 신뢰 구간의 상한; P, Firth의 로지스틱 회귀에 의해 추정된 오즈비의 P-value; Ppermutation, 순열 검정에 의해 추정된 오즈비의 P-value; EAF, 이 연구 샘플에서 유효 대립유전자 빈도(effective allele frequency).
도 6은 초정상군의 GWAS 결과의 분위수 플롯을 나타낸다. 관찰된(y 축) 및 예상된(x 축) P 값의 음의 로그(log)가 각 SNP에 대해 표시된다. 빨간색 선은 실제 연관성이 없다는 귀무 가설(y = x)을 나타내고 회색 영역은 빨간색 선의 95% 신뢰 구간을 나타낸다. 게놈 인플레이션(inflation) 인자(λGC)는 그림의 왼쪽 상단에 표시된다.
도 7a 내지 7j는 중요한 loci의 regional plot을 나타낸다. -log10(P)가 있는 regional plot은 초정상군 GWAS 결과를 나타낸다. 연관 분석의 결과는 상위 변이(보라색)를 둘러싼 2메가 염기 쌍 영역에 표시된다. 각 점은 변이를 나타내고 다른 색상은 각 변이와 상위 변이의 연관 불균형(linkage disequilibrium, r2)을 나타낸다.
도 8은 유전자형-조직 발현 프로젝트(GTEx, Genotype-Tissue Expression Project)의 eQTL(expression Quantitative Trait Loci) 결과를 나타낸다.
상술한 바와 같이, 보호 혈관 표현형에 대한 종래의 유전적 연구는 위험 요소의 조합에 따라 심혈관 위험 점수가 높은 개인을 대상으로 설계되지 않아, 관상동맥 질환 발병 저위험 예측을 위한 바이오마커에 대한 필요성이 대두되었다. 이에, 본 발명자들은 관상동맥 질환과 잠재적인 연관성이 있는 유전적 좌위와 후보 유전자를 확인하기 위하여 GWAS(genome-wide association study)를 사용하여 초정상 관상동맥과 관련된 유전적 변이를 찾고, eQTL(expression quantitative trait loci)을 사용하여 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 PPFIA4 유전자의 SNP인 rs6427989; SLIT1 또는 ARHGAP19 유전자의 SNP인 rs9630089; LOC100422212 또는 PBX1 유전자의 SNP인 rs10799925; LINC01849 또는 NPAS2 유전자의 SNP인 rs9710701; MIR4465 또는 NMBR 유전자의 SNP인 rs1415914; LINC02644 또는 ZNF438 유전자의 SNP인 rs1538950; LINC01493 또는 LRRC4C 유전자의 SNP인 rs1847474; PABPC3 또는 AMER2 유전자의 SNP인 rs3002220; SLC25A21 유전자의 SNP인 rs12587912; 및 PRR25 또는 LMF1 유전자의 SNP인 rs663580로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 포함하는, 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 SNP 바이오마커 조성물을 제공한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "예측"은, 특정 개인에 대하여 관상동맥 질환이 발병할 가능성이 있는지, 발병할 가능성이 있다면 관상동맥 관련 질환이 발병할 가능성이 불특정 다수인에 비하여 상대적으로 낮은지 여부를 판별하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "발병 저위험 예측용 마커"란 정상 대조군 개체에 비하여 관상동맥 질환 발병 위험도가 낮은 개체에서 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준의 유의적인 증가 또는 감소 양상을 보이는 폴리펩티드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 및 SNP 등을 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "저위험"이란, 심혈관 위험요인을 다수 보유하여 예상되는 심혈관 위험도가 높은 개체이지만, 관상동맥 검사상 정상이 확인되었고, 관상동맥 질환이 발생하지 않을 수 있음을 본발명에서 청구하는 SNP 바이오마커에 의해 확인할 수 있는 상태를 의미한다. 본 발명의 명세서에 있어서, "초정상군", "supernormal" 및 "심혈관 질환으로부터 보호되는"과 혼용되어 명명될 수 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "SNP(single nucleotide polymorphism)"는 단일염기다형성을 의미하며, 염색체의 단일부위에서 여러 가지 DNA 염기들 중의 하나에 나타나는 일반적인 돌연변이로 SNP는 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개인의 유전적 다양성이 발생한다. 본원에서, 상기 "SNP 마커"는 "SNP"와 혼용되어 명명될 수 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "마커(marker)"는 바이오마커를 의미하며 생명체의 변화를 탐지할 수 있어 생명체의 정상 또는 병리적인 상태, 약물에 대한 반응 정도 등을 객관적으로 측정할 수 있다.
본원의 일 실시예에 따르면, 전장유전체 연관 분석 결과 PPFIA4 유전자의 SNP인 rs6427989; SLIT1 또는 ARHGAP19 유전자의 SNP인 rs9630089; LOC100422212 또는 PBX1 유전자의 SNP인 rs10799925; LINC01849, NPAS2 유전자의 SNP인 rs9710701; MIR4465, NMBR 유전자의 SNP인 rs1415914; LINC02644, ZNF438 유전자의 SNP인 rs1538950; LINC01493, LRRC4C 유전자의 SNP인 rs1847474; PABPC3, AMER2 유전자의 SNP인 rs3002220; SLC25A21 유전자의 SNP인 rs12587912; 및 PRR25, LMF1 유전자의 SNP인 rs663580가 관상동맥 질환 발병 저위험 예측에 있어서 높은 통계적 유의성을 갖는 것을 확인하였는 바(도 5), 상기 SNP를 이용하면 효율적으로 관상동맥 질환의 발병 저위험을 예측할 수 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "대립형질" 또는 "대립유전자"는 상동염색체의 동일한 유전자 좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 유형을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류 이상, 예를 들어 두 종류의 대립형질을 갖는다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "전장유전체 연관분석(Genome-wide association study; GWAS)"은 약 50만-200만개 단일염기다형성의 유전자형을 탐색하여 질병과의 연관성을 통계적으로 분석하는 방법을 일컫는 것으로서, 일본 이화학연구소의 Ozaki(2002) 그룹에서 최초로 시도된 연구 방법이다. 구체적으로, GWAS 연구는 환자와 건강한 사람의 DNA 또는 SNP를 비교 분석하는 방식으로 진행되며, 만약 질병을 갖고 있는 사람에게서 유전적 변이가 더 많이 발견된다면, 연구자들은 이 변이가 해당 질병과 '연관이 있다'고 본다. 현재, HapMap 프로젝트의 완성 및 마이크로어레이 기술의 급속한 발전으로, 유전자 다형성에 관한 전장유전체 스캔이 일상적인 작업이 되었고, 수백의 전장유전체 연관 분석이 성공적으로 수행되어, 심혈관 질환, 당뇨 등의 통상적인 질병과 관련된 다수의 공지되거나 신규한 유전자 변이의 발견을 이끌고 있다. 또한, 이러한 기술은 다양한 질환의 진단과 관련된 유전자 다형성 식별에 대한 강력한 수단을 제공하고 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "프라이머"는, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위 한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 이때, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
상기 SNP 검출에 사용되는 프로브는 혼성화 프로브를 의미하는 것일 수 있으며, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 혼성화 조건은 대립형질 간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여 대립형질 중 하나에만 혼성화되도록 충분히 엄격해야 한다. 이러한 본 발명의 프로브는 중앙 부위가 다형성 서열의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 이에 따라 서로 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 상기 프로브는 대립형질을 검출하여 뇌동맥류를 진단하기 위한 마이크로어레이 등의 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다. 중요한 프로브는 검출할 수 있도록 표지될 수 있으며, 예를 들면 방사선 동위원소, 형광 화합물, 바이오 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소로 표지 될 수 있다. 상기와 같은 프로브를 적당하게 표지하는 것은 당해 분야에서 널리 알려진 기술이며, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수 단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터(reporter)가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6- carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐 (fluorescein chlorotriazinyl), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6- Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(TetrachloroFluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl)ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanin e)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 리포터로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. [0905] 상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자(quencher)가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 소광자는 TAMRA, BHQ(black hole quencher) 1, BHQ2, BHQ3, NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(deep dark quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사 용할 수 있다.
본 명세서의 용어 "관상동맥질환(coronary artery disease, CAD)"은 심근에 혈액을 공급하는 동맥(관상동맥)이 죽상경화(atherosclerosis)에 의해 좁아지고, 경우에 따라 혈전에 의해 막혀서 발생되는 동맥경화성 혈관질환을 의미한다. CAD는 심근으로의 혈류량 감소를 초래하며 이에 따라 심근이 충분한 양의 산소를 공급받지 못하고, 때에 따라 괴사(necrosis)를 야기한다. CAD는 급성 관상동맥증후군, 심근경색(심장마비), 협심증(안정 및 불안정) 또는 심장으로 혈액을 공급하는 혈관에서 발생하는 혈전증 및 죽상경화증을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 상기 SNP 바이오마커 세트를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SNP 바이오마커 세트를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는 SNP에 상보적인 프로브 또는 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 조성물을 포함하는 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 키트를 제공한다.
상기 키트는 SNP 마커를 사용하는 방법에 따라 다양한 형태의 키트일 수 있다. 예를 들면, 상기 SNP 마커의 폴리뉴클레오티드 증폭을 위한 프라이머로 사용하고자 하는 경우, 상기 키트는 핵산 증폭 키트일 수 있다. 이 경우, 상기 키트에는 핵산 증폭에 필요한 다양한 시약, 예를 들면, DNA 폴리머라제, dNTP, 버퍼, 검출표지 등이 포함될 수 있다. 상기 SNP 마커를 핵산 혼성화를 위한 프로브로 사용하고자 하는 경우, 상기 키트는 핵산 혼성화 키트일 수 있다. 이 경우, 상기 키트에는 핵산 혼성화에 필요한 다양한 시약, 예를 들면, 혼성화 버퍼, 검출표지 등이 포함될 수 있다. 상기 키트에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 마이크로어레이 장치의 기판에 고정되어 배열되어 있는 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
SNP 위치의 뉴클레오티드를 결정하는 것은 알려져 있다. 예를 들면, 디데옥시법에 의하여 직접적으로 핵산의 뉴클레오티드 서열을 결정하거나, SNP 위치의 서열을 포함하는 프로브를 대상 폴리뉴클레오티드와 혼성화시키고, 혼성화 결과를 분석함으로써, SNP 위치의 뉴클레오티드를 결정할 수 있다. 혼성화 정도는 예를 들면, 검출가능한 표지를 대상 핵산에 표지하고, 혼성화된 대상 핵산을 검출함으로써 확인되거나, 전기적 방법 등에 의하여 확인될 수 있다. 또한, 단일염기 연장(single base primer extension: SBE)법 및 분자 반전(molecular inversion)법이 사용될 수 있다.
바람직하게는, 상기 SNP는 시퀀싱(sequencing), 엑솜 시퀀싱(exome sequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화(microarray hybridization), 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 동적 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization), PCR 연장 분석 및 Taqman 기법으로 이루어진 군으로부터 선택 되는 하나 이상의 방법에 의해 확인될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 조성물을 이용한 관상동맥 질환 발병 저위험 예측 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 관상동맥 질환 발병 저위험 예측 방법은:
(a) 상기 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 조성물을 개체로부터 분리한 검체 게놈 DNA 시료에 처리하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계;
(b) 상기 수행된 PCR 결과물을 시퀀싱(sequencing)하는 단계; 및
(c) 상기 시퀀싱 결과로부터 검체에 SNP가 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함하고,
상기 (c) 단계의 SNP는 PPFIA4 유전자의 SNP인 rs6427989; SLIT1 또는 ARHGAP19 유전자의 SNP인 rs9630089; LOC100422212 또는 PBX1 유전자의 SNP인 rs10799925; LINC01849 또는 NPAS2 유전자의 SNP인 rs9710701; MIR4465 또는 NMBR 유전자의 SNP인 rs1415914; LINC02644 또는 ZNF438 유전자의 SNP인 rs1538950; LINC01493 또는 LRRC4C 유전자의 SNP인 rs1847474; PABPC3 또는 AMER2 유전자의 SNP인 rs3002220; SLC25A21 유전자의 SNP인 rs12587912; 및 PRR25 또는 LMF1 유전자의 SNP인 rs663580로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (c) 단계에서
PPFIA4 유전자의 SNP인 rs6427989의 대립형질이 A인 경우;
SLIT1 또는 ARHGAP19 유전자의 SNP인 rs9630089의 대립형질이 G인 경우;
LOC100422212 또는 PBX1 유전자의 SNP인 rs10799925의 대립형질이 T인 경우;
LINC01849 또는 NPAS2 유전자의 SNP인 rs9710701의 대립형질이 C인 경우;
MIR4465 또는 NMBR 유전자의 SNP인 rs1415914의 대립형질이 T인 경우;
LINC02644 또는 ZNF438 유전자의 SNP인 rs1538950의 대립형질이 T인 경우;
LINC01493 또는 LRRC4C 유전자의 SNP인 rs1847474의 대립형질이 C인 경우;
PABPC3 또는 AMER2 유전자의 SNP인 rs3002220의 대립형질이 C인 경우;
SLC25A21 유전자의 SNP인 rs12587912의 대립형질이 A인 경우; 및
PRR25 또는 LMF1 유전자의 SNP인 rs663580의 대립형질이 C인 경우
로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 경우, 관상동맥 질환이 발병하지 않거나, 발병 위험을 낮은 수준으로 예측하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "심혈관 위험도가 높은 군"은 Framingham 위험 점수가 ≥14이며 이에 따라 예상되는 10년 위험도 ≥16%인 군을 의미한다. Framingham 관상동맥 위험 점수(Framingham coronary risk score)는 약 50년 전부터 시작된 연구로서 심혈관계 질환에서 위험인자의 개념을 소개하였으며, 위험인자 추정을 위한 표준을 제공하였고, 여기서 발표된 Framingham 관상동맥 위험 점수는 심혈관계 질환의 발생 위험도를 폭넓게 예측하는데 널리 추천되고 있다. 또한 Framingham 위험 점수 연구는 철저한 약물 치료와 치료적 의미의 생활 습관 개선 등이 심혈관계 질환을 예방할 수 있다는 개념을 확립하게 하였다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "초정상군"은 심혈관 위험도가 높은 데도 불구하고 검사상 관상동맥에 죽상동맥경화가 거의 없는 정상 혈관인 군을 의미한다. 본원 명세서에 있어서, "supernormal", "발병 위험이 낮은 군" 및 "저위험군"과 혼용되어 명명될 수 있다. 관상동맥 발병 위험이 낮은 군은 대조군과 같이 Framingham 관상동맥 위험 점수로 추정한 심혈관 위험도가 높으나, 대조군과 달리 관상동맥이 정상인 군을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "대조군"은 Framingham 관상동맥 위험 점수로 추정한 심혈관 위험도가 높은 군에서, 관상동맥 질환이 발생한 군을 의미한다.
따라서, 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 개체의 심혈관 위험도는 Framingham 위험 점수가 ≥14 이고, 10년 위험도가 ≥16%인 개체일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 시료는 근육, 골격, 전혈, 경골동맥, 췌장, 식도 점막, 경골신경, S자 결장, 식도 근육, 폐, 대동맥, 비장, 난소, 위식도접합부, 정소, 관상동맥, 좌심실, 복부피하지방, 심장 - 심방 부속물, 소장-장말단, 햇빛에 노출되지 않은 피부, 세포, 유방 및 부신으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에서 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터, SNP의 대립형질을 결정하는 단계를 포함하는, 관상동맥 질환 발병 저위험 예측을 위한 정보 제공 방법으로, 상기 SNP는 PPFIA4 유전자의 SNP인 rs6427989; SLIT1 또는 ARHGAP19 유전자의 SNP인 rs9630089; LOC100422212 또는 PBX1 유전자의 SNP인 rs10799925; LINC01849 또는 NPAS2 유전자의 SNP인 rs9710701; MIR4465 또는 NMBR 유전자의 SNP인 rs1415914; LINC02644 또는 ZNF438 유전자의 SNP인 rs1538950; LINC01493 또는 LRRC4C 유전자의 SNP인 rs1847474; PABPC3 또는 AMER2 유전자의 SNP인 rs3002220; SLC25A21 유전자의 SNP인 rs12587912; 및 PRR25 또는 LMF1 유전자의 SNP인 rs663580로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 포함하는, 관상동맥 질환 발병 저위험 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명은 개체에서 본 발명에 따른 10종의 SNP를 검출하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 SNP를 검출하는 방법은 i) PPFIA4 유전자의 SNP인 rs6427989, ii) SLIT1 또는 ARHGAP19 유전자의 SNP인 rs9630089, iii) LOC100422212 또는 PBX1 유전자의 SNP인 rs10799925, iv) LINC01849 또는 NPAS2 유전자의 SNP인 rs9710701, v) MIR4465 또는 NMBR 유전자의 SNP인 rs1415914, vi) LINC02644 또는 ZNF438 유전자의 SNP인 rs1538950, vii) LINC01493 또는 LRRC4C 유전자의 SNP인 rs1847474, viii) PABPC3 또는 AMER2 유전자의 SNP인 rs3002220, ix) SLC25A21 유전자의 SNP인 rs12587912, 및 x) PRR25 또는 LMF1 유전자의 SNP인 rs663580로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 개체에서 검출하는 방법으로서, 다음의 (a) 내지 (c) 단계를 포함하여 수행될 수 있다:
(a) 상기 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 조성물을 개체로부터 분리된 검체 게놈 DNA 시료에 처리하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계;
(b) 상기 수행된 PCR 결과물을 시퀀싱(sequencing)하는 단계; 및
(c) 상기 시퀀싱 결과로부터 검체에 상기 i) 내지 x)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 SNP가 있는지 여부를 결정하는 단계.
본 발명에 따른 SNP를 검출하는 방법에 있어서, 상기 (c) 단계는 다음의 i) 내지 x)의 대립형질의 검출 여부를 결정하는 것일 수 있다:
i) PPFIA4 유전자의 SNP인 rs6427989의 대립형질(allele)이 A;
ii) SLIT1 또는 ARHGAP19 유전자의 SNP인 rs9630089의 대립형질이 G;
iii) LOC100422212 또는 PBX1 유전자의 SNP인 rs10799925의 대립형질이 T;
iv) LINC01849 또는 NPAS2 유전자의 SNP인 rs9710701의 대립형질이 C;
v) MIR4465 또는 NMBR 유전자의 SNP인 rs1415914의 대립형질이 T;
vi) LINC02644 또는 ZNF438 유전자의 SNP인 rs1538950의 대립형질이 T;
vii) LINC01493 또는 LRRC4C 유전자의 SNP인 rs1847474의 대립형질이 C;
viii) PABPC3 또는 AMER2 유전자의 SNP인 rs3002220의 대립형질이 C;
ix) SLC25A21 유전자의 SNP인 rs12587912의 대립형질이 A; 및
x) PRR25 또는 LMF1 유전자의 SNP인 rs663580의 대립형질이 C.
본 발명에 따른 SNP를 검출하는 방법에 있어서, 상기 (a) 단계에서 개체의 심혈관 위험도는 프래밍험 위험 점수 (Framingham risk score)가 ≥14 이고, 10년 위험도가 ≥16%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 SNP를 검출하는 방법에 있어서, 상기 (a) 단계에서 시료는 근육, 골격, 전혈, 경골동맥, 췌장, 식도 점막, 경골신경, S자 결장, 식도 근육, 폐, 대동맥, 비장, 난소, 위식도접합부, 정소, 관상동맥, 좌심실, 복부피하지방, 심장 - 심방 부속물, 소장-장말단, 햇빛에 노출되지 않은 피부, 세포, 유방 및 부신으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에서 얻은 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 용어 “개체”는 관상동맥 질환 발병 위험도를 확인하고자 하는 모든 대상을 의미하며, 특히, Framingham 위험 점수 또는 10년 위험도와 같은 심혈관 위험도가 높은 대상을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
연구 참가자
이 연구는 헬싱키 선언을 준수하며 적절한 윤리적 감독을 받았다. 서울 세브란스병원 기관심의위원회는 연구계획서를 승인했다(4-2016-0979). 본 발명에서 연세대학교 의과대학의 심혈관 게놈 센터(CGC) 코호트와 심혈관 및 대사성 질환 병인 연구 센터-고위험(CMERC-HI) 코호트의 두 코호트에서 남성 참가자를 선택했다. 계산된 심혈관 위험이 높은 연구 참가자의 대부분이 남성이었기 때문에 여성은 제외하였으며, 모든 참가자로부터 서면 동의를 얻었다. 2001년 1월부터 2009년 8월까지 건강검진 또는 흉부증상으로 세브란스병원 심장내과에 내원한 모든 환자를 CGC 코호트에 포함시켰다. CMERC-HI 코호트의 포함 기준은 추정 사구체 여과율이 감소된 고혈압 환자, 알부민뇨가 있는 당뇨병 환자, 경동맥 플라크 또는 경동맥 내중막 두께가 증가한 개인이었다. 두 코호트에서 개인은 건강 검진을 위해 관상동맥 칼슘 스코어링 또는 흉부 증상으로 인해 필요시 관상동맥 조영술을 받았다.
본 발명의 연구 참가자의 포함 기준은 심혈관 위험이 높지만 관상동맥이 정상인 남성(초정상 그룹) 또는 관상동맥 질환이 있는 남성(대조군)이다. 초정상 그룹의 참가자는 2개의 코호트에서 선택되었고 대조군은 CGC 코호트에서 1:1.3 비율로 연령 매칭에 의해 선택되었다. 심혈관 위험은 Framingham 위험 점수("NHLBI, CHD에 대한 10년 위험 추정치". National Heart, Lung, and Blood Institute. 2013-09-14에 검색됨)가 14점 이상인 사람들로, 10-year risk가 16% 이상인 사람들이 위험이 높은 것으로 간주되어 최종적으로 등록되었다. 관상동맥 조영술에서 플라크가 보이지 않거나 컴퓨터 단층촬영에서 관상동맥 칼슘 점수가 0인 관상동맥을 정상 관상동맥으로 정의하였다. 관상동맥 질환은 하나 이상의 심장 외막 관상동맥에서 50% 이상의 관강 협착(luminal stenosis)으로 정의되었다.
CMERC-HI 코호트의 3,470명 중 1,569명의 남성이 관상동맥 칼슘 점수를 평가받았고 65명이 연구에 포함되었다(도 1).
도 2에 나타난 바와 같이, 연구 참가자의 중앙 연령은 67세였으며 참가자의 39%는 당뇨병을 가지고 있었다. 참가자의 절반 이상이 고혈압 또는 현재 흡연자였다. 총 콜레스테롤과 HDL-C의 중앙값은 각각 174mg/dL 및 38mg/dL이었고 Framingham 위험 점수 중앙값은 15였다. 초정상 그룹은 고혈압과 흡연자의 빈도가 높았고 Framingham 위험 점수는 더 높으며, 다른 특성은 두 그룹 간에 유사했다.
[실시예 2]
지노타이핑(genotyping), 품질 관리(quality control) 및 통계적 변이 추정(imputation)
연구 참가자의 DNA 샘플은 한국 인구에 최적화된 Korea Biobank Array(Theragen, Seoul, Korea)에서 유전자형을 분석했다{PMID: 30718733}. 유전자형 데이터에 대해 유전자형 데이터에 대한 샘플 수준 및 변이 수준 품질 관리(QC)를 수행했다. 2차 또는 가까운 혈연관계에 있는 관련자가 있는 표본은 KING 2.0{PMID: 20926424}를 사용하여 식별하고 제외했다. 샘플은 call rate < 95%, 평균에서 5 표준편차(sd) 떨어진 이형접합률, X 염색체의 이형접합률을 기반으로 추정된 성별과 보고된 성별 간의 불일치를 포함한 여러 기준에 따라 제외하였다. 저품질 샘플 제외 후, call rate < 98%, 소수 대립유전자 빈도(MAF) < 1% 또는 Hardy-Weinberg 평형에서 벗어난 변이(P < 1.0 × 10-6)는 제외하였다. 빈도가 높은(MAF ≥ 5%) 유전자 변이를 대상으로 실시한 주성분 분석(Principal Component Analysis, PCA)에서는 이상치 샘플이 없었다. 모든 샘플의 처음 세 가지 주성분은 평균으로부터 5 표준편차 이내에 있었다. QC 후 유전자형 데이터는 Eagle v2.3{PMID: 27694958}을 사용하여 phasing되었으며 Minimac v4{PMID: 27571263}과 Haplotype Reference Consortium(HRC r1.1 2016) 참조 패널을 사용하여 변이를 통계적으로 추정하였다. 낮은 통계적 변이 추정 결과의 품질 점수(R2 < 0.8) 또는 MAF < 1%를 갖는 유전적 변이는 위양성 통계적 변이 추정 결과를 줄이기 위해 제외하였다.
[실시예 3]
전장유전체 연관성 분석(Genome-wide association analysis, GWAS)
유전자 변이와 초정상 형질의 연관성은 Firth의 로지스틱 회귀를 사용하고 분석하여 대립유전자 수가 적은 빈도가 낮은 변이의 위양성 연관성을 줄였다. 연령과 유전적 인종의 처음 4개의 주성분(PC)은 회귀 모델에서 공변량으로 보정되었다. 독립적인 변이를 식별하기 위해 GWAS의 결과로 LD clumping 과정(r2 < 0.1)을 수행했다. 표본 크기가 작은 경우 위음성 결과를 고려하여 연관 P-value < 5.0 × 10-5에 도달한 변이가 유의한 것으로 간주되었다. 각 유전좌위의 상위 변이에 대해 Monte Carlo 방법을 사용하여 Firth 회귀 계수에 대한 순열 검정을 수행하여 GWAS의 결과를 확인했다. 가장 가까운 유전자와 상위 변이의 기능적 효과는 ANNOVAR{PMID: 20601685}를 사용하여 추정하였다.
GWAS(도 3a)에서 Haplotype Reference Consortium 참조 패널을 사용하여 유전자형 데이터를 통계적으로 추정한 후, 연령과 유전 인종의 처음 4개 주성분(PC)을 공변량으로 보정하여, 5,197,138개의 상염색체 변이를 테스트했다. PCA는 본 샘플에서 인구 계층화에 대한 증거를 보여주지 않았다(도 4). 0.892의 게놈 인플레이션 인자(λGC)에 의한 통계적 검정력이 부족함에도 불구하고, 본 발명에서는 초정상 그룹과 암시적 연관성(P < 5.0 × 10-5)을 가진 10개의 독립적인 유전자좌를 식별했다(도 5 내지 도 7a-7j). [표 1]은 P-values < 5e-5 기준으로 선별한 초정상 관상동맥과 연관된 모든 SNP에 대한 결과이다.
rsID GRCh37 A1 A2 Nerarest
Genes		 Function N OR LOG(OR)_SE L95 U95 P frq.A1
rs663580 16:890470 G C PRR25;LMF1 intergenic 166 0.295 0.276 0.172 0.507 9.97E-06 0.4217
rs6427989 1:203019737 G A PPFIA4 intronic 166 0.248 0.316 0.134 0.461 1.02E-05 0.2922
rs9921151 16:889560 T C PRR25;LMF1 intergenic 166 0.307 0.271 0.180 0.522 1.31E-05 0.3855
rs4984938 16:892018 A C PRR25;LMF1 intergenic 166 0.326 0.264 0.194 0.547 2.18E-05 0.3705
rs4984694 16:891534 T C PRR25;LMF1 Intergenic 166 0.326 0.264 0.194 0.547 2.18E-05 0.3705
rs2994896 13:25688898 G T PABPC3;AMER2 intergenic 166 0.329 0.262 0.197 0.550 2.19E-05 0.3946
rs3002220 13:25685942 T C PABPC3;AMER2 intergenic 166 0.329 0.262 0.197 0.550 2.19E-05 0.3946
rs2994888 13:25686069 C T PABPC3;AMER2 intergenic 166 0.329 0.262 0.197 0.550 2.19E-05 0.3946
rs2994891 13:25687231 C T PABPC3;AMER2 intergenic 166 0.329 0.262 0.197 0.550 2.19E-05 0.3946
rs2994905 13:25691248 C T PABPC3;AMER2 intergenic 166 0.329 0.262 0.197 0.550 2.19E-05 0.3946
rs3002221 13:25688642 T C PABPC3;AMER2 intergenic 166 0.329 0.262 0.197 0.550 2.19E-05 0.3946
rs2994903 13:25690632 A G PABPC3;AMER2 intergenic 166 0.329 0.262 0.197 0.550 2.19E-05 0.3946
rs2994901 13:25690337 G C PABPC3;AMER2 intergenic 166 0.329 0.262 0.197 0.550 2.19E-05 0.3946
rs2994900 13:25690006 C A PABPC3;AMER2 intergenic 166 0.329 0.262 0.197 0.550 2.19E-05 0.3946
rs2994893 13:25687738 A G PABPC3;AMER2 intergenic 166 0.329 0.262 0.197 0.550 2.19E-05 0.3946
rs2994895 13:25688106 C A PABPC3;AMER2 intergenic 166 0.329 0.262 0.197 0.550 2.19E-05 0.3946
rs2487596 13:25689163 A C PABPC3;AMER2 intergenic 166 0.329 0.262 0.197 0.550 2.19E-05 0.3946
rs2994899 13:25689121 T A PABPC3;AMER2 intergenic 166 0.329 0.262 0.197 0.550 2.19E-05 0.3946
rs3002222 13:25690681 T C PABPC3;AMER2 intergenic 166 0.329 0.262 0.197 0.550 2.19E-05 0.3946
rs9511642 13:25690775 C T PABPC3;AMER2 intergenic 166 0.329 0.262 0.197 0.550 2.19E-05 0.3946
rs2994898 13:25688985 C T PABPC3;AMER2 intergenic 166 0.329 0.262 0.197 0.550 2.19E-05 0.3946
rs10799925 1:163480019 G T LOC100422212;PBX1 intergenic 166 0.314 0.273 0.184 0.536 2.22E-05 0.4578
rs731493 16:889509 A G PRR25;LMF1 intergenic 166 0.325 0.265 0.193 0.547 2.31E-05 0.3886
rs12587912 14:37186791 A G SLC25A21 intronic 166 3.070 0.268 1.817 5.189 2.79E-05 0.2771
rs6427740 1:163478748 C G LOC100422212;PBX1 intergenic 166 0.327 0.267 0.194 0.552 2.84E-05 0.4639
rs4657294 1:163478287 A G LOC100422212;PBX1 intergenic 166 0.327 0.267 0.194 0.552 2.84E-05 0.4639
rs6427737 1:163477733 G A LOC100422212;PBX1 intergenic 166 0.327 0.267 0.194 0.552 2.84E-05 0.4639
rs7535284 1:163477356 C T LOC100422212;PBX1 Intergenic 166 0.327 0.267 0.194 0.552 2.84E-05 0.4639
rs1847474 11:38796040 C T LINC01493;LRRC4C intergenic 166 3.179 0.277 1.846 5.473 3.02E-05 0.2801
rs77988724 2:101352758 G C LINC01849;NPAS2 intergenic 166 0.222 0.361 0.109 0.451 3.14E-05 0.1958
rs9710701 2:101344222 T C LINC01849;NPAS2 intergenic 166 0.222 0.361 0.109 0.451 3.14E-05 0.1958
rs6571759 14:37185166 A C SLC25A21 intronic 166 3.072 0.271 1.807 5.221 3.38E-05 0.2741
rs2994892 13:25687237 G C PABPC3;AMER2 intergenic 165 0.337 0.263 0.201 0.565 3.58E-05 0.3879
rs4984695 16:894583 T C PRR25;LMF1 intergenic 165 0.335 0.265 0.199 0.563 3.69E-05 0.3697
rs1538950 10:31042464 T C LINC02644;ZNF438 intergenic 166 2.927 0.262 1.752 4.887 4.06E-05 0.3494
rs1415914 6:141908348 T A MIR4465;NMBR intergenic 166 2.843 0.255 1.726 4.686 4.12E-05 0.4428
rs1933284 6:141911476 C T MIR4465;NMBR intergenic 166 2.843 0.255 1.726 4.686 4.12E-05 0.4428
rs1415907 6:141929466 C T MIR4465;NMBR intergenic 166 2.835 0.255 1.721 4.669 4.27E-05 0.4428
rs9496098 6:141928791 C T MIR4465;NMBR intergenic 166 2.835 0.255 1.721 4.669 4.27E-05 0.4428
rs9484536 6:141930580 T G MIR4465;NMBR Intergenic 166 2.835 0.255 1.721 4.669 4.27E-05 0.4428
rs61949678 13:25698133 A G PABPC3;AMER2 intergenic 166 0.342 0.262 0.204 0.572 4.35E-05 0.3946
rs56090620 2:101354489 G A LINC01849;NPAS2 intergenic 166 0.244 0.345 0.124 0.480 4.36E-05 0.2048
rs72814920 2:101348400 A G LINC01849;NPAS2 intergenic 166 0.244 0.345 0.124 0.480 4.36E-05 0.2048
rs12477035 2:101352040 G A LINC01849;NPAS2 intergenic 166 0.244 0.345 0.124 0.480 4.36E-05 0.2048
rs61181153 2:101352393 A G LINC01849;NPAS2 intergenic 166 0.244 0.345 0.124 0.480 4.36E-05 0.2048
rs61106364 2:101352469 T C LINC01849;NPAS2 intergenic 166 0.244 0.345 0.124 0.480 4.36E-05 0.2048
rs9630089 10:98968967 G A ARHGAP19-SLIT1 ncRNA_intronic 166 3.158 0.282 1.817 5.489 4.55E-05 0.3584
rs9484541 6:141989348 G T MIR4465;NMBR intergenic 166 2.764 0.250 1.694 4.508 4.66E-05 0.4548
rs7759161 6:141986865 T C MIR4465;NMBR intergenic 166 2.764 0.250 1.694 4.508 4.66E-05 0.4548
rs7755765 6:141990258 C A MIR4465;NMBR intergenic 166 2.764 0.250 1.694 4.508 4.66E-05 0.4548
rs12208890 6:141984984 T C MIR4465;NMBR intergenic 166 2.764 0.250 1.694 4.508 4.66E-05 0.4548
rs73777235 6:141989914 C T MIR4465;NMBR intergenic 166 2.764 0.250 1.694 4.508 4.66E-05 0.4548
rs1338103 6:141988466 T C MIR4465;NMBR intergenic 166 2.764 0.250 1.694 4.508 4.66E-05 0.4548
rs9484542 6:141991227 G A MIR4465;NMBR intergenic 166 2.764 0.250 1.694 4.508 4.66E-05 0.4548
rs7756112 6:141990441 C T MIR4465;NMBR intergenic 166 2.764 0.250 1.694 4.508 4.66E-05 0.4548
rs7740047 6:141987400 G A MIR4465;NMBR intergenic 166 2.764 0.250 1.694 4.508 4.66E-05 0.4548
rs7756402 6:141990439 G A MIR4465;NMBR intergenic 166 2.764 0.250 1.694 4.508 4.66E-05 0.4548
각 유전자좌에서 10개의 리드 SNP의 관찰된 유의 수준은 Monte Carlo 방법을 사용하는 순열 테스트에서 확인하였다(P < 9.0 × 10-6). 7개의 유전자좌는 PBX1 근처의 SNP를 포함하여 intergenic이었고, 3개는 PPFIA4 및 ARHGAP19-SLIT1의 SNP를 포함하여 intronic이었다. 연구 참가자의 10가지 리드 변이의 유전형 패턴은 도 2b에 나타냈다.
[실시예 4]
유전자형-조직 발현 프로젝트 데이터를 이용한 eQTL 분석
Genotype-Tissue Expression Project(GTEx){PMID: 32913098}의 eQTL 데이터는 GWAS 리드 변이 또는 그 프록시(LD r2 > 0.8) 중 유전자 발현과 관련된 변이를 식별하는 데 사용되었다. GWAS 리드 변이 또는 그 프록시의 경우 관련 조직(관상동맥, 전혈, 피하 지방 및 내장 지방 조직)에서 cis-eQTL 연관에 대해 총 265개의 유전자가 테스트되었다. Bonferroni의 보정을 통과한 cis-eQTL 결과는 유의미한 것으로 간주되었다(cis-eQTL P-값 < 0.05/265).
[표 2]는 GTEx eQTL 결과를 나타낸다.
rsID GRCh37 A1 A2 Gencode Gene NES P Tissue
rs6427989 1:203019737 G A ENSG00000122180.4 MYOG -0.15 6.2E-07 근육-골격
rs6427989 1:203019737 G A ENSG00000143847.15 PPFIA4 0.2 2.3E-06 전혈
rs6427989 1:203019737 G A ENSG00000143847.15 PPFIA4 0.11 2.3E-05 경골 동맥
rs9710701 2:101344222 T C ENSG00000170485.16 NPAS2 -0.42 4.1E-05 췌장
rs9710701 2:101344222 T C ENSG00000170485.16 NPAS2 -0.14 1.5E-04 식도 점막
rs9710701 2:101344222 T C ENSG00000223947.1 AC016738.4 -0.2 2.0E-04 식도 점막
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.32 7.3E-21 경골 신경
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.31 1.8E-20 전혈
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.3 2.1E-16 S자 결장
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.35 6.4E-15 식도 근육
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.35 9.3E-15 경골 동맥
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.35 3.8E-14 폐
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.43 1.5E-13 대동맥
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.53 5.1E-12 비장
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.68 3.4E-11 난소
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.37 6.2E-11 위식도접합부
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000181274.6 FRAT2 -0.22 6.7E-11 정소
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.46 3.3E-10 관상동맥
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.33 4.1E-10 식도 점막
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.35 2.1E-09 좌심실
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.27 7.1E-09 복부 피하지방
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.34 1.7E-08 심장 - 심방 부속물
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.36 2.2E-08 소장-장말단
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.3 3.3E-08 피부(햇빛에 노출되지 않음)
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000213390.10 ARHGAP19 -0.16 3.9E-08 피부(햇빛에 노출됨)
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.27 4.1E-08 피부(햇빛에 노출됨)
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000165879.8 FRAT1 -0.14 1.8E-07 세포-배양된 섬유아세포
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.29 2.2E-07 유방
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000213390.10 ARHGAP19 -0.17 3.0E-07 피부(햇빛에 노출되지 않음)
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.15 3.5E-06 대장
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.23 6.8E-06 내장지방
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000213390.10 ARHGAP19 -0.14 7.9E-06 복부 피하지방
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.16 1.1E-05 근육-골격
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000187122.16 SLIT1 0.32 1.8E-05 부신
rs9630089 10:98968967 G A ENSG00000171314.8 PGAM1 -0.09 1.5E-04 경골 동맥
rs4984694 16:891534 T C ENSG00000130731.15 METTL26 0.067 8.5E-05 전혈
그 결과, 도 8의 결과와 같이 10개의 GWAS 리드 변이 또는 그 프록시(LD r2 > 0.8) 중 3개는 Genotype-Tissue Expression project(GTEx){PMID: 32913098}의 관상동맥, 전혈 또는 지방 조직의 유전자 발현 수준과 관련이 있었다. ARHGAP19-SLIT1의 인트론 리드 변이인 rs9630089는 관상동맥, 전혈, 지방 조직에서의 SLIT1 발현 및 지방 조직에서의 ARHGAP19 발현과 관련이 있었다. PPFIA4의 인트론 리드 변이인 rs6427989는 전혈에서 PPFIA4 발현과 관련이 있었다. PRR25와 LMF1 사이의 리드 변이(rs663580)의 intergenic 프록시인 rs4984694는 전혈에서 METTL26 발현과 관련이 있었다. intergenic 리드 변이인 rs10799925와 RGS4 발현은 명목상 유의한 eQTL 연관만을 나타내었지만(정규화된 효과 크기 = -0.150, P = 0.032) RGS4는 GTEx의 관상동맥 조직에서 유의하게 발현되었다(백만 당 전사체의 중앙값 = 18.23).
본 발명을 지원한 국가연구개발사업은 하기와 같다.
(1) [이 발명을 지원한 국가연구개발사업]
[과제고유번호] 1711148180
[과제번호] 2019R1F1A1057952
[부처명] 과학기술정보통신부
[과제관리(전문)기관명] 한국연구재단
[연구사업명] 이공분야기초연구사업
[연구과제명] 유전자 적중 마우스를 통한 환자발굴 CDKAL1의 지단백 대사
조절 분자기전 규명
[기여율] 50/100
[과제수행기관명] 연세대학교
[연구기간] 2021.03.01 ~ 2022.02.28
(2) [이 발명을 지원한 국가연구개발사업]
[과제고유번호] 1711148711
[과제번호] NRF2019R1A2C407049613
[부처명] 과학기술정보통신부
[과제관리(전문)기관명] 한국연구재단
[연구사업명] 개인기초 - 중견연구자지원사업
[연구과제명] 대규모 역학 및 유전체 분석을 통한 중성지방 약물 표적 발
굴 및 효과 평가
[기여율] 50/100
[과제수행기관명] 성균관대학교
[연구기간] 2019.06.01 ~ 2022.02.28

Claims (14)

  1. PPFIA4 유전자의 SNP인 rs6427989; SLIT1 또는 ARHGAP19 유전자의 SNP인 rs9630089; LOC100422212 또는 PBX1 유전자의 SNP인 rs10799925; LINC01849 또는 NPAS2 유전자의 SNP인 rs9710701; MIR4465 또는 NMBR 유전자의 SNP인 rs1415914; LINC02644 또는 ZNF438 유전자의 SNP인 rs1538950; LINC01493 또는 LRRC4C 유전자의 SNP인 rs1847474; PABPC3 또는 AMER2 유전자의 SNP인 rs3002220; SLC25A21 유전자의 SNP인 rs12587912; 및 PRR25 또는 LMF1 유전자의 SNP인 rs663580로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 포함하는, 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 SNP 바이오마커 조성물.
  2. 제1항의 SNP 바이오마커 세트를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 SNP 바이오마커 세트를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는 SNP에 상보적인 프로브 또는 프라이머 세트인, 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항의 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 조성물을 포함하는 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 키트.
  5. 제2항 또는 제3항의 관상동맥 질환 발병 저위험 예측용 조성물을 이용한 관상동맥 질환 발병 저위험 예측 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 관상동맥 질환 발병 저위험 예측 방법은:
    (a) 제2항 또는 제3항의 조성물을 개체로부터 분리된 검체 게놈 DNA 시료에 처리하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계;
    (b) 상기 수행된 PCR 결과물을 시퀀싱(sequencing)하는 단계; 및
    (c) 상기 시퀀싱 결과로부터 검체에 SNP가 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함하고,
    상기 (c) 단계의 SNP는 PPFIA4 유전자의 SNP인 rs6427989; SLIT1 또는 ARHGAP19 유전자의 SNP인 rs9630089; LOC100422212 또는 PBX1 유전자의 SNP인 rs10799925; LINC01849 또는 NPAS2 유전자의 SNP인 rs9710701; MIR4465 또는 NMBR 유전자의 SNP인 rs1415914; LINC02644 또는 ZNF438 유전자의 SNP인 rs1538950; LINC01493 또는 LRRC4C 유전자의 SNP인 rs1847474; PABPC3 또는 AMER2 유전자의 SNP인 rs3002220; SLC25A21 유전자의 SNP인 rs12587912; 및 PRR25 또는 LMF1 유전자의 SNP인 rs663580로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 관상동맥 질환 발병 저위험 예측 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 (c) 단계에서
    PPFIA4 유전자의 SNP인 rs6427989의 대립형질(allele)이 A인 경우;
    SLIT1 또는 ARHGAP19 유전자의 SNP인 rs9630089의 대립형질이 G인 경우;
    LOC100422212 또는 PBX1 유전자의 SNP인 rs10799925의 대립형질이 T인 경우;
    LINC01849 또는 NPAS2 유전자의 SNP인 rs9710701의 대립형질이 C인 경우;
    MIR4465 또는 NMBR 유전자의 SNP인 rs1415914의 대립형질이 T인 경우;
    LINC02644 또는 ZNF438 유전자의 SNP인 rs1538950의 대립형질이 T인 경우;
    LINC01493 또는 LRRC4C 유전자의 SNP인 rs1847474의 대립형질이 C인 경우;
    PABPC3 또는 AMER2 유전자의 SNP인 rs3002220의 대립형질이 C인 경우;
    SLC25A21 유전자의 SNP인 rs12587912의 대립형질이 A인 경우; 및
    PRR25 또는 LMF1 유전자의 SNP인 rs663580의 대립형질이 C인 경우
    로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 경우, 관상동맥 질환이 발병하지 않거나, 낮은 발병 위험도로 예측하는 단계를 추가로 포함하는, 관상동맥 질환 발병 저위험 예측 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 개체의 심혈관 위험도는 프래밍험 위험 점수 (Framingham risk score)가 ≥14 이고, 10년 위험도가 ≥16%인, 관상동맥 질환 발병 저위험 예측 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 시료는 근육, 골격, 전혈, 경골동맥, 췌장, 식도 점막, 경골신경, S자 결장, 식도 근육, 폐, 대동맥, 비장, 난소, 위식도접합부, 정소, 관상동맥, 좌심실, 복부피하지방, 심장 - 심방 부속물, 소장-장말단, 햇빛에 노출되지 않은 피부, 세포, 유방 및 부신으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에서 얻은 것인, 관상동맥 질환 발병 저위험 예측 방법.
  10. 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터, SNP의 대립형질을 결정하는 단계를 포함하는, 관상동맥 질환 발병 저위험 예측을 위한 정보 제공 방법으로,
    상기 SNP는 PPFIA4 유전자의 SNP인 rs6427989; SLIT1 또는 ARHGAP19 유전자의 SNP인 rs9630089; LOC100422212 또는 PBX1 유전자의 SNP인 rs10799925; LINC01849 또는 NPAS2 유전자의 SNP인 rs9710701; MIR4465 또는 NMBR 유전자의 SNP인 rs1415914; LINC02644 또는 ZNF438 유전자의 SNP인 rs1538950; LINC01493 또는 LRRC4C 유전자의 SNP인 rs1847474; PABPC3 또는 AMER2 유전자의 SNP인 rs3002220; SLC25A21 유전자의 SNP인 rs12587912; 및 PRR25 또는 LMF1 유전자의 SNP인 rs663580로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 포함하는, 관상동맥 질환 발병 저위험 예측을 위한 정보 제공 방법.
  11. 개체에서, i) PPFIA4 유전자의 SNP인 rs6427989, ii) SLIT1 또는 ARHGAP19 유전자의 SNP인 rs9630089, iii) LOC100422212 또는 PBX1 유전자의 SNP인 rs10799925, iv) LINC01849 또는 NPAS2 유전자의 SNP인 rs9710701, v) MIR4465 또는 NMBR 유전자의 SNP인 rs1415914, vi) LINC02644 또는 ZNF438 유전자의 SNP인 rs1538950, vii) LINC01493 또는 LRRC4C 유전자의 SNP인 rs1847474, viii) PABPC3 또는 AMER2 유전자의 SNP인 rs3002220, ix) SLC25A21 유전자의 SNP인 rs12587912, 및 x) PRR25 또는 LMF1 유전자의 SNP인 rs663580로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 검출하는 방법:
    (a) 제2항 또는 제3항의 조성물을 개체로부터 분리된 검체 게놈 DNA 시료에 처리하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계;
    (b) 상기 수행된 PCR 결과물을 시퀀싱(sequencing)하는 단계; 및
    (c) 상기 시퀀싱 결과로부터 검체에 상기 i) 내지 x)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 SNP가 있는지 여부를 결정하는 단계.
  12. 제11항에 있어서, 상기 (c) 단계는 다음의 i) 내지 x)의 대립형질의 검출 여부를 결정하는 것인, 방법:
    i) PPFIA4 유전자의 SNP인 rs6427989의 대립형질(allele)이 A;
    ii) SLIT1 또는 ARHGAP19 유전자의 SNP인 rs9630089의 대립형질이 G;
    iii) LOC100422212 또는 PBX1 유전자의 SNP인 rs10799925의 대립형질이 T;
    iv) LINC01849 또는 NPAS2 유전자의 SNP인 rs9710701의 대립형질이 C;
    v) MIR4465 또는 NMBR 유전자의 SNP인 rs1415914의 대립형질이 T;
    vi) LINC02644 또는 ZNF438 유전자의 SNP인 rs1538950의 대립형질이 T;
    vii) LINC01493 또는 LRRC4C 유전자의 SNP인 rs1847474의 대립형질이 C;
    viii) PABPC3 또는 AMER2 유전자의 SNP인 rs3002220의 대립형질이 C;
    ix) SLC25A21 유전자의 SNP인 rs12587912의 대립형질이 A; 및
    x) PRR25 또는 LMF1 유전자의 SNP인 rs663580의 대립형질이 C.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 개체의 심혈관 위험도는 프래밍험 위험 점수 (Framingham risk score)가 ≥14 이고, 10년 위험도가 ≥16%인, 방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 시료는 근육, 골격, 전혈, 경골동맥, 췌장, 식도 점막, 경골신경, S자 결장, 식도 근육, 폐, 대동맥, 비장, 난소, 위식도접합부, 정소, 관상동맥, 좌심실, 복부피하지방, 심장 - 심방 부속물, 소장-장말단, 햇빛에 노출되지 않은 피부, 세포, 유방 및 부신으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에서 얻은 것인, 방법.
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