WO2023140302A1 - 細胞剥離方法、及び細胞剥離機構を搭載する装置 - Google Patents

細胞剥離方法、及び細胞剥離機構を搭載する装置 Download PDF

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WO2023140302A1
WO2023140302A1 PCT/JP2023/001409 JP2023001409W WO2023140302A1 WO 2023140302 A1 WO2023140302 A1 WO 2023140302A1 JP 2023001409 W JP2023001409 W JP 2023001409W WO 2023140302 A1 WO2023140302 A1 WO 2023140302A1
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cells
cell
culture vessel
ejection
liquid
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PCT/JP2023/001409
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English (en)
French (fr)
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直希 西下
智之 中石
明 小林
治久 井上
孝之 近藤
Original Assignee
株式会社カネカ
国立大学法人京都大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/26—Inoculator or sampler
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for detaching adherently cultured cells from a culture vessel, a method for producing differentiated cells from adherent stem cells, a device equipped with a cell detachment mechanism, and the like.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • iPS cells are adherent cells, and stem cells, progenitor cells, and/or differentiated cells obtained through differentiation induction are often adherent cells.
  • adherent cells each step of transferring the culture vessel involves the work of peeling and collecting the cells from the culture vessel in order to induce their proliferation, differentiation, and the like.
  • cell detachment can be performed by immersing the cells in a detachment solution containing trypsin or the like having strong detachment activity.
  • the cells gradually float in the detachment solution as a result of dissociation of cell-cell adhesion and cell-substrate adhesion.
  • a cell suspension can be prepared by shaking the culture vessel or adding a protease inactivating solution.
  • the work of detaching cells from the culture vessel using a cell scraper or the like can greatly affect the survival rate of the cells obtained, etc., depending on the experimenter's technique. It is difficult even for a skilled experimenter to collect cells efficiently and reproducibly, and the problem is that the burden is heavy.
  • Patent Literature 1 discloses an apparatus for exfoliating cells by rocking a culture vessel.
  • rocking when rocking is used to detach cells, high-speed rocking must be continued for a long period of time, and a detachment solution having strong detachment activity must be used, and damage to cells cannot be ignored.
  • a detachment solution having strong detachment activity For example, in addition to genome mutation, degradation of cell membranes, elution of intracellular proteases, etc., the effects of impairing the differentiation potential of stem cells cannot be avoided.
  • the purpose of the present invention is to provide a method for efficiently detaching adherent cells from culture vessels with minimal damage.
  • the present inventors have newly developed a device for detachment of adherent cultured cells.
  • This device is equipped with a discharge part for discharging a discharge liquid onto the surface of a culture vessel, and by discharging the discharge liquid against adherent cells, the cells can be detached.
  • the present inventors have found that the cells can be efficiently detached by ejecting the ejection liquid onto the adherent cells at a specific linear velocity.
  • the cell recovery rate and cell viability rate were successfully increased significantly.
  • the present invention is based on the above findings and provides the following.
  • a method for detaching adherently cultured cells from a culture container comprising a cell detachment solution treatment step of adding a cell detachment solution to the culture container and treating the cells with the cell detachment solution, and discharging a discharge solution to the cells after the cell detachment solution treatment, and detaching the cells from the culture container surface. and the ejection liquid is continuously ejected on a linear path with a center-to-center distance between adjacent spots of 4 mm to 33 mm, or an interval of 4 mm to 33 mm set on the surface of the culture vessel.
  • the cell detachment solution contains a protease and/or a chelating agent.
  • the cells are adherent stem cells, progenitor cells, differentiated cells, established cells, or immortalized cells.
  • the stem cells are selected from the group consisting of induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells, mesenchymal stem cells, and neural stem cells.
  • the stem cells are induced pluripotent stem cells.
  • a method for producing differentiated cells from adherent stem cells comprising: a first culturing step of adherently culturing the stem cells in a first culture container; a first cell detachment solution treatment step of adding a first cell detachment solution to the first culture container and treating the stem cells with the first cell detachment solution; adding a differentiation inducer to the stem cells collected in the first collection step, a differentiation induction step, a second culture step of culturing the progenitor cells and/or differentiated cells obtained in the differentiation induction step in a second culture container, adding a second cell detachment solution to the second culture container to treat the progenitor cells and/or the differentiated cells with the second cell detachment solution, a second cell detachment solution treatment step, and ejecting a second ejecting solution to the progenitor cells and/or the differentiated cells after the second cell detachment solution treatment.
  • a second peeling step of peeling the progenitor cells and / or the differentiated cells from the surface of the second culture vessel wherein the linear velocity of discharging the first ejection liquid in the first peeling step and / or the linear velocity of discharging the second ejection liquid in the second peeling step is 300 mm / sec to 1500 mm / sec, and the first peeling step and / or the second peeling step discharges the discharged liquid in the form of spots on the surface of the first culture vessel and / or the second culture vessel and adjacent to each other.
  • the distance between the centers of the spots is 4 mm to 33 mm, or the ejected liquid is continuously ejected on a linear path with an interval of 4 mm to 33 mm set on the surface of the first culture vessel and/or the second culture vessel.
  • a device equipped with a cell detachment mechanism for detaching adherent cultured cells comprising a cell detachment solution addition unit for adding a cell detachment solution to the culture vessel to which the cells are adhered, and an ejection unit for ejecting the ejection liquid onto the surface of the culture vessel, wherein the ejection section ejects the ejection liquid at a linear velocity of 300 mm / sec to 1500 mm / sec, and includes ejection position control means for controlling the position at which the ejection liquid is ejected on the surface of the culture vessel.
  • the apparatus according to (24) further comprising a cell recovery unit that recovers the cells detached from the culture vessel surface.
  • the ejection section includes ejection angle control means for adjusting the ejection angle of the ejection liquid with respect to the surface of the culture vessel.
  • the cell detachment solution adding section can rock the culture vessel.
  • the ejection section has an ejection port with a diameter of 0.1 mm to 2.0 mm.
  • the ejection position control means ejects the stripping liquid in spots, and the distance between adjacent spots is 4 mm to 33 mm.
  • adherent cells can be efficiently detached from culture vessels with minimal damage.
  • the cell detachment method of the present invention includes a cell detachment solution treatment step (S0101) of treating cells with a cell detachment solution and a detachment step (S0104) of detaching cells as essential steps, and includes a cell detachment solution removal step (S0103) and a collection step (S0106) of collecting detached cells as selection steps.
  • FIG. 2 is a diagram showing each step of one embodiment of the method for producing differentiated cells of the present invention.
  • the differentiated cell production method of the present invention includes a first culturing step (S0201), a first cell detachment solution treatment step (S0202), a first detachment step (S0203), a first collection step (S0204), a differentiation induction step (S0205), a second culture step (S0206), a second cell detachment solution treatment step (S0207), and a second detachment step (S0208) as essential steps, and a second collection step (S0208).
  • FIG. 4 is a diagram showing a process of treating adherently cultured cells with a cell detachment liquid and detaching them with a discharge liquid.
  • FIG. 4 is a diagram showing a process of treating adherently cultured cells with a cell detachment liquid and detaching them with a discharge liquid.
  • FIG. 3A shows high-density iPS cells with a confluency of 85% or more obtained by adherent culture.
  • FIG. 3B shows iPS cells after treatment with 2 ⁇ TrypLE Select as a cell detachment solution.
  • FIG. 3C shows how the ejection liquid is ejected onto the surface of the culture vessel.
  • FIG. 10 is a diagram showing the surface of the culture vessel after cells have been detached by a discharge liquid.
  • FIG. 4A shows the surface of the culture vessel after ejecting the ejection liquid onto a plurality of linear paths (arrows). Cells that have not been exfoliated remain in areas (white) where the ejection liquid has not been ejected.
  • FIG. 4B shows an enlarged view of a region where cells have been exfoliated by ejecting liquid and a region where cells have not been exfoliated. It is a figure which shows the discharge method of a discharge liquid.
  • FIG. 5A shows a method of continuously ejecting the ejection liquid onto a plurality of linear paths at regular intervals ( ⁇ X) while holding the culture vessel at an inclination angle of 10 degrees with respect to the horizontal plane.
  • FIG. 5B shows a linear path for continuously ejecting ejection liquid. The linear paths are arranged at regular intervals ( ⁇ X) from each other.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating a method of ejecting ejection liquid in a spot shape; FIG.
  • FIG. 6A exemplifies ejection to eight locations (ejection positions A) by an eight-channel dispensing arm and ejection to a position (ejection position B) shifted by a certain distance ( ⁇ Y) from the ejection position A.
  • FIG. FIG. 6B exemplifies ejection positions by a method in which the ejection positions A and B shown in FIG. 6A are repeated at regular intervals ( ⁇ X) in the X-axis direction.
  • FIG. 10 is a diagram showing an example of an ejection method that combines spot-like ejection and ejection onto a linear path;
  • FIG. 7-1A shows an example of positions for spot discharge and linear path discharge.
  • FIG. 7-1B illustrates ejection positions across the bottom surface of the culture vessel.
  • FIG. 7-1C shows a region where the iPS cells are exfoliated by ejection. Arrowheads indicate areas peeled off by spot discharge, and arrows indicate areas peeled off by discharge onto linear paths.
  • FIG. 7-2D shows the culture vessel surface before and after detachment of the induced neurons by ejection onto the linear path. The photograph on the left shows the surface of the culture vessel before peeling, and the photograph on the right shows the surface of the culture vessel after peeling.
  • FIG. 7-2E shows the culture vessel surface before and after exfoliation of induced neurons by combining spot-like ejection and linear path ejection.
  • FIG. 4 shows a method of recovering detached cells from a culture vessel.
  • FIG. 8A shows the position in the liquid where the cell suspension is recovered by the recovery method A.
  • FIG. 8B shows two locations for harvesting the cell suspension by harvesting method A.
  • FIG. 8C shows the liquid surface positions (collection positions 1 and 2) and the position in the liquid (collection position 3) where the cell suspension is collected by the collection method B.
  • FIG. 8D illustrates the 24 locations where the cell suspension is harvested by harvest method B.
  • FIG. FIG. 10 is a diagram showing the result of exfoliating induced neurons.
  • FIG. 9A to 9C each show the surface of the culture vessel after detachment of induced neurons by ejection onto a linear path at a predetermined linear velocity.
  • FIG. 9A shows the results of condition 5-1.
  • FIG. 9B shows the results of condition 5-2.
  • FIG. 9C shows the results of condition 5-3. Dotted frames indicate entanglements between axons.
  • FIG. 9D shows how cells clumped together in the dispensing tip when collecting cells under condition 5-3.
  • FIG. 10 is a diagram showing the relationship between the cell viability in a seeded cell suspension and the CV value in a 384-well plate.
  • FIG. 10A shows the results of evaluating the relationship between cell viability and CV value.
  • FIG. 10B shows corrected absorbance measurement results (multiple 96 wells) under Condition 6-3 of Example 6.
  • FIG. 10 shows the results of MAP2 immunostaining for cells obtained under Condition 6-2 of Example 6 (cell viability 60%) and cells obtained under Condition 6-3 (cell viability 89%).
  • FIG. 11A shows the results of MAP2 immunostaining of cells obtained under Condition 6-2. Arrowheads indicate cells in which cell nuclei (DAPI) can be confirmed but MAP2 signals cannot be confirmed.
  • FIG. 11B shows the percentage of MAP2-positive cells in cells obtained under condition 6-2.
  • FIG. 11C shows the results of MAP2 immunostaining of cells obtained under condition 6-3.
  • FIG. 11D shows the percentage of MAP2-positive cells in the cells obtained under condition 6-3.
  • FIG. 10 shows the results of analysis of induced neurons cultured after exfoliation and collection in Example 8.
  • FIG. 12A shows a photographed image of neurons in each well. Arrowheads indicate neuronal cell bodies and arrows indicate neuronal axons.
  • FIG. 12B shows the axonal length of neurons in each well of a 96-well plate.
  • FIG. 10 shows the results of observing vascular endothelial cells differentiated from iPS cells in Example 9 with a fluorescence microscope after immunostaining.
  • a first aspect of the present invention is a method for detaching adherently cultured cells from a culture vessel (hereinafter also referred to as "cell detachment method").
  • the cell detachment method of this embodiment includes a cell detachment solution treatment step and a detachment step. According to the cell detachment method of this aspect, adherent cultured cells can be efficiently detached from the culture vessel.
  • attachment refers to physical separation of cells from the surface of the culture vessel. Cells may be detached in single cell units, or may be detached in cell clump units. Examples of stripping include physical stripping, enzymatic stripping, chemical stripping, and any combination thereof.
  • physical detachment refers to a method of exfoliating cells by giving a physical stimulus to the entire or surface of a culture vessel containing cells or to the culture solution.
  • a cell scraping means such as a cell scraper
  • a method of discharging the ejection liquid onto the surface of the culture vessel also called “splashing”
  • a method of shaking or vibrating the culture vessel and ultrasonic treatment.
  • enzyme detachment refers to a method of detaching cells using an enzyme having cell detachment activity.
  • enzymes used for enzymatic detachment include proteases such as trypsin, TrypLE Select, collagenase, accutase, pronase, papain, and dispase.
  • proteases such as trypsin, TrypLE Select, collagenase, accutase, pronase, papain, and dispase.
  • Proteases used for enzymatic detachment are not limited, but proteases with relatively low activity (eg, TrypLE Select, collagenase, accutase) are preferred when stem cells such as iPS cells are detached.
  • “Chemical exfoliation” as used herein refers to a method of exfoliating cells using a compound such as a chelating agent.
  • Compounds preferably can combine calcium ions and magnesium ions.
  • chirate agents ethylangeiamine 4 acetic acid (EDTA), glycol ether diamine saccetic acid (EGTA), N'- (2 -hydroxyethyl) ethylange min, n, n'--.
  • phosphates containing phosphate ions and carbonates containing carbonate ions which bind to calcium ions and magnesium ions, can also be used.
  • Detergents such as phosphate buffers can be used.
  • Physical peeling, enzymatic peeling, and chemical peeling can also be used in combination of two or more peeling methods.
  • a protease such as trypsin and a chelating agent such as EDTA
  • cell detachment agents include trypsin-EDTA solution (manufactured by Thermo Fisher Scientific), TrypLE Select (manufactured by Thermo Fisher Scientific), Accutase (manufactured by Stemcell Technologies), Accumax (manufactured by Stemcell Technolo gies) and the like can also be used.
  • cell detachment agents include trypsin-EDTA solution (manufactured by Thermo Fisher Scientific), TrypLE Select (manufactured by Thermo Fisher Scientific), Accutase (manufactured by Stemcell Technologies), Accumax (manufactured by Stemcell Technolo gies) and the like can also be used.
  • the "culture vessel” is a vessel that can culture cells, regardless of its material, shape, size, etc.
  • Specific materials for culture vessels include, for example, synthetic resins, natural resins, glass, plastics, and metals.
  • Specific shapes of the culture vessel include, for example, polygonal prisms such as triangular prisms, cubes, and rectangular parallelepipeds, hemispherical shapes, and cylinders (e.g., those with circular bottoms).
  • Examples of culture vessels include petri dishes (petri dishes), culture flasks, plates, trays, chips, and the like.
  • the plate may be a multiwell plate.
  • Multi-well plate means a plate containing multiple wells (ie, two or more wells).
  • 6-well plates for example, without limitation, 6-well plates, 12-well plates, 24-well plates, 48-well plates, 96-well plates, 192-well plates, 384-well plates, and 1536-well plates can be used.
  • chips include organ-on-a-chips and biofunction chips.
  • the culture vessel can be coated on its surface to promote cell adhesion and cell proliferation.
  • a coating agent is used for coating the culture vessel.
  • coating agents include laminin, fibronectin, vitronectin, osteopontin, entactin, collagen (e.g., collagen I, collagen II, collagen III, collagen IV, collagen V, collagen VI), gelatin, poly-L-ornithine, poly-D-lysine, poly-L-lysine, or Matrigel®, Synthemax® II-S matrix, and the like.
  • adherent cells refer to cells that proliferate while adhering to a culture vessel, and are contrasted with floating cells that proliferate while floating in a medium.
  • Adherent cells can be adherent, eukaryotic cells such as insect cells, avian cells (such as chicken cells), and mammalian cells (such as mouse cells, chimpanzee cells, and human cells). Adherent mammalian cells are preferred. Examples of adherent cells include adherent, stem, progenitor, differentiated, established, or immortalized cells.
  • stem cells are cells that have self-renewal ability and pluripotency (the ability to differentiate into various cells).
  • adhesive stem cells include induced pluripotent stem cells (iPSCs; iPS cells), embryonic stem cells (ESCs; ES cells), mesenchymal stem cells (MS cells; MSCs), neural stem cells, and the like.
  • progenitor cells are cells that are positioned at an intermediate stage of differentiation between stem cells and differentiated cells.
  • progenitor cells include immature cells that are derived from stem cells and have not undergone terminal differentiation into differentiated cells.
  • Specific examples of progenitor cells include neural progenitor cells, cardiovascular progenitor cells, myocardial progenitor cells, common myeloid progenitor cells, T progenitor cells, satellite cells, pancreatic progenitor cells, osteoblasts, and the like.
  • differentiated cells are cells that do not further differentiate into different cell types under normal physiological conditions. In the present specification, the presence or absence of self-renewal ability of differentiated cells does not matter. Examples of differentiated cells include preneural cells, neurons, vascular endothelial cells, vessel wall cells, cardiomyocytes, epithelial cells, fibroblasts, astrocytes, glial cells, hepatocytes, pancreatic islet cells, mesenchymal cells, muscle cells, blood cells, etc., and any combination thereof. Differentiated cells may be differentiated cells induced from stem cells such as iPS cells.
  • induced nerve cells nerve cells induced from iPS cells are particularly referred to as "induced nerve cells” (for example, "iN” in Japanese Patent No. 6473077).
  • Differentiated cells may be of either a single cell type or multiple cell types.
  • established cell lines include CHO cells, COS cells, Vero cells, HEK293 cells, HeLa cells, NIH3T3 cells and the like.
  • immortalized cells include RPTEC/TERT1 (renal proximal tubular epithelial immortalized cells), TELOHAEC (aortic endothelial cells), and the like.
  • iPS cells are cells with totipotency similar to ES cells, which are obtained from somatic cells by induction treatment. iPS cells can be obtained from various types of cells by various methods. It is usually produced by introducing four reprogramming factors into somatic cells: OCT3/4, SOX2, KLF4, and C-MYC proteins. Since iPS cells are adhesive and have the property of proliferating while forming colonies, they have the property of being less likely to be detached compared to normal cells.
  • the cell detachment method of this embodiment includes a cell detachment solution treatment step and a detachment step as essential steps, and includes a cell detachment solution removal step and/or recovery step as a selection step. Moreover, the cell detachment method of this aspect can also include a repeating step of repeating the cell detachment solution treatment step to the collection step. Each step will be specifically described below.
  • the cell detachment solution treatment step is a step of adding the cell detachment solution to the culture vessel and treating the cells with the cell detachment solution.
  • the "cell detachment liquid” is a liquid containing at least one component having a cell detachment action (hereinafter referred to as "cell detachment component").
  • the cell detachment component contained in the cell detachment solution may be a component used for enzymatic detachment and/or chemical detachment.
  • trypsin trypLE Select
  • protease such as collagenase, accutase, pronase, papain, and dispase
  • nuclease such as DNase I.
  • a chelating agent e.g., EDTA or EGTA
  • a salt capable of binding calcium ions or magnesium ions e.g., phosphate or carbonate
  • PBS Phosphate buffered saline
  • CTK can be used as a detachment agent including trypsin and collagenase.
  • the concentration of cell detachment components in the cell detachment solution is not limited.
  • 2x TrypLE Select/PBS obtained by diluting 10x TrypLE Select 5-fold with PBS
  • a cell detachment solution containing 2 ⁇ TrypLE Select can be used.
  • a buffer solution containing 0.1 mM or more EDTA for example, 1 mM EDTA/PBS or 0.5 mM EDTA/PBS
  • a buffer solution containing 0.1 M EGTA can be used.
  • the cell detachment solution may contain a ROCK-specific inhibitor such as Y-27632 in addition to the above cell detachment components. Addition of a ROCK-specific inhibitor can prevent cell death of stem cells such as iPS cells.
  • the type and concentration of the components of the cell detachment solution can be appropriately selected according to the type of cells to be detached.
  • 2 ⁇ TrypLE Select/PBS containing 10 nM Y-27632, for example can be used.
  • nerve cells such as induced nerve cells
  • a detachment solution obtained by mixing 1 ⁇ TrypLE Select and Neurobasal plus Medium at a ratio of 8:7 can be used.
  • the time for treating the cells with the cell detachment solution in the cell detachment solution treatment step may be appropriately set according to the activity and concentration of the above cell detachment components. For example, 30 seconds or more, 1 minute or more, 2 minutes or more, 3 minutes or more, 5 minutes or more, 10 minutes or more, 15 minutes or more, 20 minutes or more, 30 minutes or more, 45 minutes or more, 1 hour or more, and/or 6 hours or less, 5 hours or less, 4 hours or less, 3 hours or less, for example, 1 minute to 2 hours, 1 minute to 1 hour, 1 minute to 30 minutes, 10 minutes to 20 minutes, or 15 minutes to 18 minutes.
  • the temperature at which the cells are treated with the cell detachment solution in the cell detachment solution treatment step is the temperature at which the cell detachment component has detachment activity, and may be any temperature that does not significantly affect the quality of the cells.
  • the culture vessel can be rocked in this step.
  • the rocking condition is not particularly limited as long as it can further promote cell detachment.
  • the amplitude of the oscillation is not limited, but may be, for example, 1 mm or more, 2 mm or more, 3 mm or more, 4 mm or more, 5 mm or more, 10 mm or more, or 20 mm or more, and/or 100 mm or less, 90 mm or less, 80 mm or less, 70 mm or less, 60 mm or less, 50 mm or less, 40 mm or less, or 30 mm or less, for example, 1 mm to 4 mm, 2 mm or 3 mm.
  • the oscillation frequency is not limited, but may be, for example, 0.5 Hz or more, 1 Hz or more, 2 Hz or more, 3 Hz or more, or 4 Hz or more, 40 Hz or less, 30 Hz or less, 20 Hz or less, 10 Hz or less, or 5 Hz or less, for example, 1 Hz to 10 Hz or 1 Hz to 8.5 Hz.
  • the confluency of the cells to be subjected to the cell detachment solution treatment step is not limited, but it is preferably within a range that allows a sufficient amount of cells to be recovered and allows the cells to maintain a good growth state. Specifically, for example, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 85% or more, or 90% or more, and/or less than 100%, less than 99%, less than 99%, less than 98%, less than 97%, less than 96%, less than 95%, less than 94%, less than 93%, or less than 92%.
  • the confluency is 80% or more and less than 100%, and may be, for example, 80% to 98%, 85% to 95%, or 90% to 92%.
  • Specific cell density ranges corresponding to confluency in the above range include 1 ⁇ 10 4 cells/cm 2 to 100 ⁇ 10 4 cells/cm 2 , 5 ⁇ 10 4 cells/cm 2 to 80 ⁇ 10 4 cells/cm 2 , 10 ⁇ 10 4 cells /cm 2 to 60 ⁇ 10 4 cells/cm 2 , or 20 ⁇ 10 4 cells / cm 2 to 40 ⁇ 10 4 cells/cm 2 . 2 is mentioned.
  • An example of a preferred cell density range is 21 ⁇ 10 4 cells/cm 2 to 35 ⁇ 10 4 cells/cm 2 .
  • the cells are stem cells (eg, induced pluripotent stem cells) and may have a cell density range of 21 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or higher.
  • this step can be performed by an experimenter.
  • this step can be performed using a device (for example, a device equipped with a cell detachment mechanism described in the third aspect below).
  • a device for example, a device equipped with a cell detachment mechanism described in the third aspect below.
  • the adhesive force between the cells and the culture vessel surface decreases due to the cell detachment solution treatment process, it is preferable that some or all of the cells are not completely detached from the culture vessel surface.
  • the cell detachment solution removing step is an optional step of removing the cell detachment solution between the cell detachment solution treatment step and the detachment step described below for the purpose of removing or inactivating the cell detachment components.
  • the method of this aspect includes this step, it is preferable because the cell detachment component can be prevented from acting in the subsequent steps and damage to the cells can be prevented.
  • the method of removing the cell detachment solution is not particularly limited, as long as the cells are not removed together.
  • it may be removed by aspiration or decantation.
  • the method for inactivating the cell detachment component can be appropriately selected from known methods according to the type of cell detachment component.
  • the cell detachment component is a protease
  • a protease inhibitor for example, trypsin inhibitor
  • a protease inactivating solution such as a serum-containing medium
  • this step can be performed by an experimenter.
  • this step can be performed using a device (for example, a device equipped with a cell detachment mechanism described in the third aspect below).
  • a device for example, a device equipped with a cell detachment mechanism described in the third aspect below.
  • the detachment step is a step of detaching the cells from the surface of the culture vessel by ejecting a discharge liquid onto the cells after the cell detachment liquid treatment step.
  • the term "ejection liquid” refers to a liquid that is ejected onto cells whose adhesive strength has weakened in the above-described cell detachment solution treatment process (in this specification, this may be referred to as "residual adherent cells").
  • the type of liquid to be discharged is not particularly limited. Although the same cell detachment liquid as described above can be used, it is preferably a liquid that does not contain degrading enzymes such as proteases. For example, buffers such as PBS and arbitrary media can also be used.
  • the medium is not particularly limited, and commercially available medium may be used.
  • DMEM medium Ham's F12 medium, DMEM/F12 medium, McCoy's 5A medium, Eagle's MEM medium, ⁇ MEM medium, MEM medium, RPMI1640 medium, Iscove's modified Dulbecco's medium, MCDB131 medium, William's medium E, IPL41 medium, Fischer's medium, etc.
  • a discharge liquid having the same composition as the cell detachment liquid described above is used.
  • the linear velocity for ejecting the ejection liquid is 300 mm/second to 1500 mm/second.
  • linear velocity refers to the speed at which the ejection liquid passes through the ejection port.
  • the linear velocity of the ejection liquid can be calculated by dividing the amount of the ejection liquid passing through the ejection port per unit time by the cross-sectional area of the ejection port.
  • the linear velocity for ejecting the ejection liquid in the peeling step may be 300 mm / sec to 1500 mm / sec, for example, 300 mm / sec to 1400 mm / sec, 350 mm / sec to 1300 mm / sec, 400 mm / sec to 1200 mm / sec, or 500 mm / sec to 1100 mm / sec, preferably 550 mm / sec to 1050 mm / sec.
  • Examples of further linear velocities are 400 mm/s to 700 mm/s or 500 mm/s to 600 mm/s, 700 mm/s to 1000 mm/s or 800 mm/s to 900 mm/s, 700 mm/s to 1100 mm/s or 800 mm/s to 1000 mm/s, or 800 mm/s to 1200 mm/s or 900 mm/s to 1100 mm/s.
  • mm/sec is exemplified.
  • the cells are stem cells (for example, induced pluripotent stem cells), and the linear velocity at which the liquid is ejected in the exfoliation step is 300 mm/second to 1500 mm/second, preferably 400 mm/second to 1200 mm/second, 500 mm/second to 1100 mm/second, or 550 mm/second to 1050 mm/second. Examples are 0 mm/sec to 600 mm/sec, 700 mm/sec to 1000 mm/sec or 800 mm/sec to 900 mm/sec, or 800 mm/sec to 1200 mm/sec or 900 mm/sec to 1100 mm/sec.
  • stem cells for example, induced pluripotent stem cells
  • the linear velocity at which the liquid is ejected in the exfoliation step is 300 mm/second to 1500 mm/second, preferably 400 mm/second to 1200 mm/second, 500 mm/second to 1100 mm/second, or 550 mm/second to 1050 mm/second. Examples are
  • the cells are nerve cells (for example, nerve cells induced to differentiate from induced pluripotent stem cells), and the linear velocity at which the ejection liquid is ejected in the exfoliation step may be 500 mm/second to 1100 mm/second, or 550 mm/second to 1050 mm/second, or may be 300 mm/second to 850 mm/second, 400 mm/second to 800 mm/second, or 400 mm/second to 700 mm/second.
  • nerve cells for example, nerve cells induced to differentiate from induced pluripotent stem cells
  • the linear velocity at which the ejection liquid is ejected in the exfoliation step may be 500 mm/second to 1100 mm/second, or 550 mm/second to 1050 mm/second, or may be 300 mm/second to 850 mm/second, 400 mm/second to 800 mm/second, or 400 mm/second to 700 mm/second.
  • linear velocity examples are 400 mm/sec to 700 mm/sec or 500 mm/sec to 600 mm/sec, 700 mm/sec to 1000 mm/sec or 800 mm/sec to 900 mm/sec, 700 mm/sec to 1100 mm/sec or 800 mm/sec to 1000 mm/sec, or 800 mm/sec to 1200 mm/sec or 900 mm/sec to 1100 mm/sec. is exemplified.
  • the ejection liquid can be ejected in spots on the surface of the culture vessel.
  • “Ejecting the ejection liquid in a spot shape” refers to an ejection method in which the ejection position is not changed and the same position is ejected for a certain period of time, or an ejection method in which the ejection position is repeatedly ejected for a certain period of time after ejection at the same position for a certain period of time.
  • spot-like ejection cells contained within a range of a certain distance from the position where the ejection liquid is ejected are exfoliated.
  • the distance between the centers of adjacent spots is 4 mm to 33 mm.
  • the “center-to-center distance between adjacent spots” (hereinafter also simply referred to as “center-to-center distance”) means the distance between a plurality of positions from which liquid is discharged.
  • the center-to-center distance can be appropriately set within a range of 4 mm to 33 mm.
  • the center-to-center distance is 4 mm or more, 4.5 mm or more, 5 mm or more, 6 mm or more, 7 mm or more, 8 mm or more, 9 mm or more, 10 mm or more, 11 mm or more, 12 mm or more, 13 mm or more, 14 mm or more, 15 mm or more, 16 mm or more, 20 mm or more, 25 mm or more, or 28 mm or more, and/or 33 mm or less, 28 mm or less, 25 mm or less, 20 mm or less, 16 mm or less, 15 mm.
  • the center-to-center distance may be 4 mm to 30 mm, 4 mm to 28 mm, 4 mm to 25 mm, 4 mm to 22 mm, 4 mm to 21 mm, 4 mm to 20 mm, 5 mm to 19 mm, 6 mm to 18 mm, 7 mm to 17 mm, 8 mm to 16 mm, 9 mm to 15 mm, 10 mm to 14 mm, or 11 mm to 13 mm.
  • the center-to-center distance may be 4 mm to 15 mm, 4 mm to 12 mm, 4 mm to 10 mm, 4 mm to 9 mm, 4 mm to 8 mm, 4 mm to 7 mm, 4 mm to 6 mm, or 4.5 mm to 5.5 mm.
  • a suitable center-to-center distance can be appropriately selected depending on the type of cells to be detached, the type and concentration of the cell detachment components contained in the detachment used, the linear discharge velocity, and the like.
  • the center-to-center distance is 10-19 mm at a linear velocity of 400-600 mm/second, or the center-to-center distance is 4-18 mm at a linear velocity of 600-1200 mm/second.
  • the amount of liquid to be ejected in one spot ejection may be 1000 ⁇ L or less, 750 ⁇ L or less, or 500 ⁇ L or less, and/or 20 ⁇ L or more, 50 ⁇ L or more, or 100 ⁇ L, for example, 500 ⁇ L, 250 ⁇ L, or 100 ⁇ L.
  • the ejection time for one spot-like ejection may be 10 seconds or less, 5 seconds or less, or 1 second or less, and/or 0.01 seconds or more, 0.1 seconds or more, or 0.5 seconds or more, for example, 1.0 seconds, 1.5 seconds, or 2.0 seconds.
  • the ejection liquid can be continuously ejected onto the linear path set on the surface of the culture vessel (hereinafter also referred to as "ejection onto the linear path").
  • the term “linear path” refers to a discharge position that exhibits a linear form.
  • the term “linear form” as used herein refers to a single rail-like form.
  • the liquid to be ejected is continuously ejected onto the linear paths set on the surface of the culture vessel at intervals of 4 mm to 33 mm.
  • linear path with an interval of 4 mm to 33 mm means that different portions in one linear path are set at intervals of 4 mm to 33 mm, and/or a plurality of linear paths are set at intervals of 4 mm to 33 mm.
  • the linear path is 4 mm or greater, 4.5 mm or greater, 5 mm or greater, 6 mm or greater, 7 mm or greater, 8 mm or greater, 9 mm or greater, 10 mm or greater, 11 mm or greater, 12 mm or greater, 13 mm or greater, 14 mm or greater, 15 mm or greater, 16 mm or greater, 20 mm or greater, 25 mm or greater, or 28 mm or greater, and/or 33 mm or less, 28 mm or less, 25 mm or less, 20 mm or less, 16 mm or less, or 15 mm.
  • the linear paths may be 4 mm to 33 mm apart, such as 4 mm to 30 mm, 4 mm to 28 mm, 4 mm to 25 mm, 4 mm to 22 mm, 4 mm to 21 mm, 4 mm to 20 mm, 5 mm to 19 mm, 6 mm to 18 mm, 7 mm to 17 mm, 8 mm to 16 mm, 9 mm to 15 mm, 10 mm to 14 mm, or 11 mm to 13 mm. .
  • the linear paths are spaced from 6 mm to 33 mm, with further exemplary ranges being 6 mm to 20 mm, 10 mm to 33 mm, 9 mm to 30 mm, 6 mm to 16 mm, 8 mm to 14 mm, 10 mm to 12 mm, 10 mm to 20 mm, 12 mm to 18 mm, 14 mm to 16 mm, 23 mm to 33 mm, 25 mm to 31 mm, or 27 mm to 29 mm. mentioned.
  • a suitable interval between the linear paths can be appropriately selected according to the discharge linear velocity.
  • the spacing can be 10 mm to 19 mm, and if the linear velocity is 850 mm/sec to 1500 mm/sec, the spacing can be 4 mm to 10 mm.
  • enzymatic detachment and/or chemical detachment based on cell detachment components can proceed simultaneously with physical detachment based on ejection of the ejection liquid.
  • the effect of physical detachment can be improved as the linear velocity is increased
  • the effect of enzymatic detachment and/or chemical detachment can be advantageous as the linear velocity is decreased because the cell detachment solution stays longer at the ejection position.
  • the discharge is performed while moving the position of the discharge port with respect to the culture container.
  • the movement speed of the ejection port is not limited, but may be, for example, 0.1 mm/second or more, 0.5 mm/second or more, 1 mm/second or more, 2 mm/second or more, 5 mm/second or more, or 10 mm/second or more, and/or 50 mm/second or less, 40 mm/second or less, or 30 mm/second or less, and may be, for example, 20 mm/second, 22.7 mm/second, or 25 mm/second.
  • the amount of liquid to be discharged once onto the linear path may be, for example, 0.1 mL to 20 mL, 0.5 mL to 10 mL, or 1 mL to 4.5 mL.
  • the ejection time for one ejection onto the linear path may be, for example, 0.1 seconds to 10 seconds, 0.5 seconds to 5 seconds, or 0.5 seconds to 3 seconds.
  • the ejection liquid can be ejected by combining the above-described spot-like ejection and ejection onto a linear path.
  • cells can be efficiently exfoliated by alternately performing spot-like ejection and linear path ejection on the culture vessel surface.
  • the cells are stem cells (e.g., induced pluripotent stem cells), the center-to-center distance between adjacent spots is 4 mm to 20 mm, and/or the distance between linear tracks is 4 mm to 20 mm, preferably the center-to-center distance between adjacent spots is 4 mm to 15 mm, and/or the distance between linear tracks is 4 mm to 15 mm.
  • stem cells e.g., induced pluripotent stem cells
  • the cells are stem cells (e.g., induced pluripotent stem cells), and the linear velocity at which the liquid is ejected, the center-to-center distance between adjacent spots, and the spacing between linear paths can be selected from any combination of the ranges described above.
  • the line speed may be 500 mm/sec to 1100 mm/sec
  • the center-to-center distance may be 4 mm to 8 mm, 4 mm to 7 mm, 4 mm to 6 mm, or 4.5 mm to 5.5 mm
  • the spacing between linear paths may be 6 mm to 33 mm, 9 mm to 30 mm, or 9 mm to 17 mm.
  • the cells are nerve cells (e.g., nerve cells induced to differentiate from induced pluripotent stem cells), and the center-to-center distance between adjacent spots is 23 mm to 33 mm, and/or the distance between linear tracts is 23 mm to 33 mm, preferably the center-to-center distance between adjacent spots is 25 mm to 30 mm, and/or the distance between linear tracts is 25 mm to 30 mm.
  • nerve cells e.g., nerve cells induced to differentiate from induced pluripotent stem cells
  • the cells are nerve cells (for example, nerve cells induced to differentiate from induced pluripotent stem cells), and the linear velocity at which the ejection liquid is ejected, the center-to-center distance between adjacent spots, and the interval between linear paths can be selected from any combination of the ranges described above.
  • Examples of combinations include, but are not limited to, line speeds of 500 mm/s to 1100 mm/s, 500 mm/s to 1000 mm/s, or 500 mm/s to 600 mm/s, center-to-center distances of 4 mm to 8 mm, 4 mm to 7 mm, 4 mm to 6 mm, or 4.5 mm to 5.5 mm, and spacings between linear paths of 6 mm to 33 mm, 6 mm to 16 mm, or 2 It may be from 3 mm to 33 mm.
  • the total amount of liquid to be discharged in this process is not limited. For example, 1 mL to 100 mL, 2 mL to 50 mL, 3 mL to 30 mL, 5 mL to 20 mL, or 7 mL to 15 mL.
  • the surface of the culture vessel when ejecting the ejection liquid in this step may be held horizontally, or may be held at a constant angle of inclination with respect to the horizontal direction.
  • the range of inclination angle of the culture vessel surface with respect to the horizontal direction is not limited, but may be, for example, 0 to 45 degrees, 1 to 30 degrees, or 1 to 20 degrees, preferably 10 degrees.
  • the ejection angle is not limited.
  • discharge angle means the angle at which the liquid is discharged with respect to the surface of the culture vessel to which the cells adhere, and is expressed in the range of 0 to 90 degrees. Therefore, for example, 95 degrees to 105 degrees is synonymous with 75 degrees to 85 degrees.
  • a specific ejection angle may be 90 degrees (in the vertical direction) or an angle inclined from the vertical direction. More specifically, the ejection angle may be, for example, 45 degrees to 90 degrees, 50 degrees to 90 degrees, 55 degrees to 90 degrees, 60 degrees to 90 degrees, 65 degrees to 90 degrees, 70 degrees to 90 degrees, or 75 degrees to 85 degrees, preferably 79.5 degrees to 80.5 degrees or 80 degrees.
  • the diameter of the ejection port that ejects the ejection liquid is not limited as long as adjacent spots or linear paths do not overlap each other.
  • it may be 0.05 mm or more, 0.1 mm or more, or 0.3 mm or more, and/or 5.0 mm or less, 4.5 mm or less, 4.0 mm or less, 3.5 mm or less, 3.0 mm or less, 2.5 mm or less, 2.0 mm or less, preferably 0.05 mm to 5 mm, 0.05 mm to 4 mm, 0.05 mm to 3 mm, 0.1 mm to 2.0 mm or 0.3 mm to 1.5 mm.
  • this step can be performed by an experimenter.
  • this step can be performed using a device (for example, a device equipped with a cell detachment mechanism described in the third aspect below).
  • a device for example, a device equipped with a cell detachment mechanism described in the third aspect below.
  • the recovering step is an optional step of recovering the cells after the detachment step from the culture vessel.
  • the method of collecting cells from the culture vessel is not limited.
  • a cell suspension containing cells may be collected by aspiration or decantation.
  • the cell suspension collected in a specific direction can also be aspirated by tilting the culture vessel.
  • the position where cells are collected from the cell suspension is not limited.
  • the cells may be collected from the liquid surface of the cell suspension containing the exfoliated cells, collected from the liquid, or collected from a plurality of positions including the liquid surface and the liquid.
  • the number of cells collected in this step is not limited, but is, for example, 1 ⁇ 10 5 or more, 1 ⁇ 10 6 or more, or 10 ⁇ 10 6 or more, preferably 15 ⁇ 10 6 or more.
  • the viability of the cells collected in this step is not limited, but is preferably 70% or more, 80% or more, or 90% or more, for example, 92% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • this step can be performed by an experimenter.
  • this step can be performed using a device (for example, a device equipped with a cell detachment mechanism described in the third aspect below).
  • a device for example, a device equipped with a cell detachment mechanism described in the third aspect below.
  • the repeating step is a selective step that repeats the cell detachment solution treatment step to the recovery step.
  • the cell species detached and collected in the cell detachment solution treatment step, the collection step, and the repeated step may be the same or different.
  • the stem cells may be detached and collected in the cell detachment solution treatment step and the collection step, and the progenitor cells and differentiated cells obtained by inducing differentiation of the stem cells may be detached and collected in the repeated steps.
  • the number of repetitions of this step is not limited.
  • this step can be performed by an experimenter.
  • this step can be performed using a device (for example, a device equipped with a cell detachment mechanism described in the third aspect below).
  • a device for example, a device equipped with a cell detachment mechanism described in the third aspect below.
  • cells can be detached and collected from the culture vessel with high recovery and survival rates.
  • iPS cells, progenitor cells, and/or differentiated cells obtained by reprogramming cells collected from a patient can be exfoliated and collected with high recovery and viability after adherent culture.
  • adherent cells with high cell density are difficult to detach from culture vessels. According to the cell detachment method of this embodiment, even highly confluent adherent cells can be efficiently collected from the culture vessel.
  • stem cells such as iPS cells collected by the cell detachment method of this embodiment have reduced cell damage, high uniformity, and maintain differentiation potential.
  • cells can be efficiently and reproducibly detached and collected without the need for skilled experimenters.
  • a second aspect of the present invention is a method for producing differentiated cells from adherent stem cells (hereinafter also referred to as "differentiated cell production method").
  • the differentiated cell production method of this aspect includes detaching the cultured adherent stem cells by the cell detachment method of the first aspect, culturing progenitor cells and/or differentiated cells obtained by inducing differentiation, and detaching them by the cell detachment method of the first aspect. According to the production method of this embodiment, differentiated cells can be efficiently produced from adherent stem cells.
  • the method for producing differentiated cells of this aspect includes a first culturing step, a first cell detachment solution treatment step, a first detachment step, a first collection step, a differentiation induction step, a second culture step, a second cell detachment solution treatment step, and a second detachment step as essential steps, and includes a second collection step and/or seeding step as a selection step.
  • a first culturing step a first cell detachment solution treatment step, a first detachment step, a first collection step, a differentiation induction step, a second culture step, a second cell detachment solution treatment step, and a second detachment step as essential steps, and includes a second collection step and/or seeding step as a selection step.
  • the first culturing step is a first culturing step of adherently culturing adherent stem cells in a first culture container.
  • the stem cells cultured in this process are not limited as long as they are adhesive stem cells.
  • iPS cells ES cells, MS cells, or neural stem cells may be used.
  • iPS cells are derived from a human patient.
  • familial AD patient-derived iPS cells, sporadic AD patient-derived iPS cells, or healthy elderly person-derived iPS cells may be used.
  • culture conditions such as temperature, CO2 concentration, culture period, and medium exchange frequency in this step are not limited.
  • the cells may be cultured statically at 37° C. and 5% CO 2 , replaced by half every 2 days, and cultured for 1 to 100 days, 1 to 40 days, for example, 2 to 30 days, 3 to 20 days, 4 to 10 days, or 5 to 8 days, depending on the state of cell growth.
  • a known medium can be appropriately selected and used as the medium used for culture.
  • it can be prepared by using any liquid medium for animal cell culture as a basal medium and, if necessary, by appropriately adding other components (serum, serum replacement reagent, growth factor, etc.).
  • Basic media include BME medium, BGJb medium, CMRL1066 medium, Glasgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, Ham's F10 medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, NBp Media such as media and mixed media thereof (eg, DMEM/F12 medium, NeurobasalTM Medium (Thermo Fisher Scientific), or NBpDY medium) can be used, but are not particularly limited. Examples of other components added to the basal medium include ROCK-specific inhibitors such as Y-27632 and doxycycline.
  • a commercially available serum-free medium may be used as the medium used for the above culture.
  • examples include STK1 and STK2 (DS Pharma Biomedical), EXPREP MSC Medium (Biomimetics Sympathies), Corning stemgro human mesenchymal stem cell medium (Corning), but are not particularly limited.
  • Other components added to the basal medium include, for example, albumin, serum, serum replacement reagents, growth factors, and the like.
  • the stem cells to be cultured are iPS cells or ES cells
  • a commercially available primate ES cell medium or primate ES/iPS cell medium may be used.
  • These media contain known additives suitable for culturing pluripotent stem cells such as ES cells or iPS cells, such as N2 supplements, B27 (R) supplements, insulin, bFGF, activin A, heparin, ROCK (Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho binding kinase) inhibitors, and/or additives such as GSK-3 inhibitors. may be added.
  • the first cell detachment solution treatment step is a step of adding the first cell detachment solution to the first culture vessel and treating the stem cells with the first cell detachment solution. This step can be performed according to the cell detachment solution removal step described in the first aspect. Therefore, detailed description here is omitted.
  • the first detachment step is a step of detaching the stem cells from the surface of the first culture vessel by ejecting the first ejection liquid onto the stem cells after the first cell detachment liquid treatment step.
  • This step can be performed according to the peeling step described in the first aspect. Therefore, detailed description here is omitted.
  • the first collecting step is a step of collecting stem cells after the first peeling step. This step can be performed according to the recovery step described in the first aspect. Therefore, detailed description here is omitted.
  • the differentiation-inducing step is a step of adding a differentiation-inducing agent to the stem cells collected in the first collection step.
  • differentiation induction refers to advancing differentiation of cells with differentiation potential, and includes differentiation to a state in the process of differentiation such as progenitor cells, and differentiation from progenitor cells to differentiated cells that have further differentiated. This step refers to differentiating stem cells into progenitor cells and/or differentiated cells.
  • the term “differentiation-inducing agent” refers to an agent that has the activity of inducing the differentiation of stem cells into progenitor cells and/or differentiated cells. In this step, an agent having an activity of inducing differentiation of stem cells into progenitor cells and/or differentiated cells is applicable.
  • the differentiation inducer may be either a low-molecular-weight compound or a macromolecule such as protein.
  • the differentiation inducer is a nerve inducer.
  • nerve inducers include Shh protein, NGF protein, Noggin protein, Neurturin protein, NT-3 protein, NT-4 protein, HGF protein, GSK-3 inhibitor (eg CHIR99021), ⁇ -secretase inhibitor (eg DAPT), and 17- ⁇ -Estradiol.
  • stem cells are statically cultured in a medium supplemented with a differentiation inducer at 37° C. under 5% CO 2 conditions, and on days 2 to 3, half or all of the medium is replaced, and the cells are cultured for 1 to 40 days, for example, 2 to 30 days, 3 to 20 days, 4 to 10 days, or 5 to 8 days to induce differentiation into progenitor cells and/or differentiated cells.
  • this step can also be referred to as a "first differentiation-inducing step.”
  • the second culturing step is a step of culturing the progenitor cells and/or differentiated cells obtained in the differentiation-inducing step in a second culture vessel. This step can be performed according to the first culture step described above. Therefore, detailed description here is omitted.
  • the second cell detachment solution treatment step is a step of adding the second cell detachment solution to the second culture vessel and treating the progenitor cells and/or differentiated cells with the second cell detachment solution. This step can be performed according to the cell detachment solution treatment step described in the first aspect. Therefore, detailed description here is omitted.
  • the second detachment step is a step of detaching the progenitor cells and/or differentiated cells from the surface of the second culture vessel by ejecting the second ejection liquid onto the progenitor cells and/or differentiated cells after the treatment with the second cell detachment liquid.
  • This step can be performed according to the peeling step described in the first aspect. Therefore, detailed description here is omitted.
  • the second recovery step is a selective step of recovering progenitor cells and/or differentiated cells after the second exfoliation step. This step can be performed according to the recovery step described in the first aspect. Therefore, detailed description here is omitted.
  • the cells or cell clusters collected in this step can be suspended as necessary before seeding. For example, by repeating pipetting at 450 ⁇ L/sec or more twice or more (for example, 10 times or more) to disperse the cells into single cells, a uniform cell suspension can be prepared, which is preferable.
  • the seeding step is a selective step of seeding the progenitor cells and/or differentiated cells collected in the second collecting step into a culture vessel such as a multiwell plate.
  • the seeding method is not limited in this process.
  • a portion of the solution containing cell clusters may be collected using a pipette or the like and seeded in a culture vessel such as a multi-well plate containing new medium, as in a method commonly used in the field of cell culture.
  • a culture vessel such as a multi-well plate containing new medium
  • the seeding amount is not limited. It may be appropriately determined in consideration of the volume of fresh medium, the desired cell concentration at the start of culture, the type of target cells to be cultured, and the like.
  • the number of cells per well of a multiwell plate can be 10,000 to 100,000 cells/well, 20,000 to 90,000 cells/well, or 30,000 to 80,000 cells/well, or 40,000 to 60,000 cells/well.
  • a more specific seeding amount may be 40,000 to 100,000 cells/well for a 96-well plate and 10,000 to 25,000 cells/well for a 384-well plate.
  • the total number of cells can be calculated by the following (formula I), and the total liquid volume of the cell suspension can be calculated by the following formula (II).
  • Total cell count A x B x C + D (Formula I) (Wherein, "A” is the number of multiwell plates to be produced, and “B” is the number of seeded cells per well. “C” is a numerical value determined according to the number of wells contained in one multiwell plate. For example, a predetermined value such as “100” for a 96-well plate and “400” for a 384-well plate can be used.
  • Total liquid volume A x E x C + F (Formula II) (In the formula, “A” is the number of multiwell plates to be prepared, and “E” is the amount of seeding liquid per well. “C” is a numerical value determined according to the number of wells contained in one multiwell plate. For example, a predetermined value such as “100” for a 96-well plate and “400” for a 384-well plate can be used.
  • the progenitor cells and/or differentiated cells seeded in this step can be cultured in the same manner as in the first culture step.
  • the cells seeded by this step can exhibit uniformity of quality such as cell viability with a CV value of 20% or less or 15% or less, preferably 10% or less.
  • the progenitor cells seeded in this step can become differentiated cells. For example, overculture can result in differentiated cells.
  • a second differentiation-inducing step in which a differentiation-inducing agent is added may be performed to promote differentiation induction.
  • the coating agent may be removed from the culture vessel and washed with PBS or the like, if necessary.
  • differentiated cells such as nerve cells can be efficiently produced from adhesive stem cells such as iPS cells, ES cells, or MS cells.
  • the burden on the experimenter is reduced, and differentiated cells can be produced efficiently and reproducibly.
  • a multiwell plate containing highly uniform cells with a CV value of 10% or less can be produced.
  • cell assays with high measurement accuracy and high reproducibility are possible.
  • a first aspect of the present invention is a device equipped with a cell detachment mechanism (hereinafter, also referred to as a “device equipped with a cell detachment mechanism”).
  • the cell detachment mechanism-equipped device of this aspect includes a cell detachment solution addition section and a discharge section. According to the device equipped with a cell detachment mechanism of this aspect, adherent cultured cells can be efficiently detached from the culture vessel.
  • the device equipped with a cell detachment mechanism of this aspect can also be called a cell detachment device that detaches adherent cultured cells.
  • the device equipped with a cell detachment mechanism of this aspect includes a cell detachment solution addition section and a discharge section as essential components, and includes a cell recovery section as an optional configuration.
  • the cell detachment mechanism-equipped device of this aspect can include a differentiation induction section, a cell seeding section, a cell observation section, and/or a transfer section as further selective configurations. Each part will be specifically described below.
  • the cell detachment solution adding section can add the cell detachment solution to the culture vessel to which the cells are adhered.
  • the cell detachment solution addition part may be equipped with a pipette (pipette tip) for adding the cell detachment solution.
  • a pipette tip for adding the cell detachment solution.
  • the cell detachment solution addition section can hold the culture vessel at a temperature at which the cell detachment components have detachment activity.
  • the temperature can be maintained at 15°C to 45°C, 20°C to 42°C, 25°C to 40°C, 30°C to 39°C, 35°C to 38°C, or 36°C to 37°C.
  • the cell detachment solution adding section can control the temperature of the cell detachment solution added to the culture vessel.
  • the cell detachment solution adding section can shake the culture vessel so as to further promote cell detachment.
  • the amplitude of the oscillation is not limited, but may be, for example, 1 mm or more, 2 mm or more, 3 mm or more, 4 mm or more, 5 mm or more, 10 mm or more, or 20 mm or more, and/or 100 mm or less, 90 mm or less, 80 mm or less, 70 mm or less, 60 mm or less, 50 mm or less, 40 mm or less, or 30 mm or less, for example, 1 mm to 4 mm, 2 mm or 3 mm.
  • the oscillation frequency is not limited, but may be, for example, 0.5 Hz or more, 1 Hz or more, 2 Hz or more, 3 Hz or more, or 4 Hz or more, 40 Hz or less, 30 Hz or less, 20 Hz or less, 10 Hz or less, or 5 Hz or less, for example, 1 Hz to 10 Hz or 1 Hz to 8.5 Hz.
  • the cell detachment solution adding section includes rocking speed control means for controlling the rocking speed of the culture vessel.
  • the rocking speed range can be selected, for example, from the range of frequencies described above.
  • the ejection part can eject the ejection liquid onto the surface of the culture vessel.
  • the ejection part can eject the ejection liquid at a linear velocity of 300 mm/second to 1500 mm/second.
  • the linear velocity at which the ejection part ejects the ejection liquid may be, for example, 300 mm/second to 1400 mm/second, 350 mm/second to 1300 mm/second, 400 mm/second to 1200 mm/second, or 500 mm/second to 1100 mm/second, preferably 550 mm/second to 1050 mm/second.
  • the ejection part can have an ejection port for ejecting the ejection liquid to the culture vessel.
  • the diameter of the ejection port is not limited, but may be, for example, 0.05 mm to 5 mm, 0.05 mm to 4 mm, 0.05 mm to 3 mm, 0.1 mm to 2.0 mm, or 0.3 mm to 1.5 mm.
  • the cross-sectional area of the outlet may be, for example, 0.002 mm 2 to 20 mm 2 , 0.002 mm 2 to 13 mm 2 , 0.002 mm 2 to 7 mm 2 , 0.01 mm 2 to 4 mm 2 , or 0.1 mm 2 to 1.8 mm 2 .
  • the ejection port may be, for example, the tip of a pipette (pipette tip).
  • a discharge port of a pipette or the like can suck and/or discharge a discharge liquid by connecting it to a pump such as a syringe pump.
  • the ejection section includes ejection position control means.
  • the ejection position control means is means for controlling the ejection position and/or the ejection angle of the ejection liquid onto the surface of the culture vessel.
  • the ejection position control means can eject the stripping liquid in spots.
  • the distance between adjacent spots is 4 mm or more, 4.5 mm or more, 5 mm or more, 6 mm or more, 7 mm or more, 8 mm or more, 9 mm or more, 10 mm or more, 11 mm or more, 12 mm or more, 13 mm or more, 14 mm or more, 15 mm or more, 16 mm or more, 20 mm or more, 25 mm or more, or 28 mm or more, and/or 33 mm or less, 28 mm or less, 25 mm or less, 20 mm or less, 16 mm or less, 15 mm or less, It may be 14 mm or less, 13 mm or less, 12 mm or less, 11 mm or less, 10 mm or less, 9 mm or less, 8 mm or less, 7 mm or less, 6 mm or less, or 5.5 mm or less.
  • the spacing between adjacent spots may be 4 mm to 33 mm, 4 mm to 30 mm, 4 mm to 28 mm, 4 mm to 25 mm, 4 mm to 22 mm, 4 mm to 21 mm, 4 mm to 20 mm, 5 mm to 19 mm, 6 mm to 18 mm, 7 mm to 17 mm, 8 mm to 16 mm, 9 mm to 15 mm, 10 mm to 14 mm, or 11 mm to 13 mm.
  • the spacing between adjacent spots may be 4 mm to 15 mm, 4 mm to 12 mm, 4 mm to 10 mm, 4 mm to 9 mm, 4 mm to 8 mm, 4 mm to 7 mm, 4 mm to 6 mm, or 4.5 mm to 5.5 mm.
  • the ejection position control means can continuously eject the stripping solution along a linear path set on the surface of the culture vessel.
  • the distance between the linear paths is, for example, 4 mm or more, 4.5 mm or more, 5 mm or more, 6 mm or more, 7 mm or more, 8 mm or more, 9 mm or more, 10 mm or more, 11 mm or more, 12 mm or more, 13 mm or more, 14 mm or more, 15 mm or more, 16 mm or more, 20 mm or more, 25 mm or more, or 28 mm or more, and/or 33 mm or less, 28 mm or less, 25 mm or less, 20 mm or less, 16 mm or less, 15 mm or less.
  • the spacing between linear paths may be 4 mm to 33 mm, 4 mm to 30 mm, 4 mm to 28 mm, 4 mm to 25 mm, 4 mm to 22 mm, 4 mm to 21 mm, 4 mm to 20 mm, 5 mm to 19 mm, 6 mm to 18 mm, 7 mm to 17 mm, 8 mm to 16 mm, 9 mm to 15 mm, 10 mm to 14 mm, or 11 mm to 13 mm.
  • the spacing between linear paths is a spacing of 6 mm to 33 mm, with further exemplary ranges including spacings of 6 mm to 20 mm, 10 mm to 33 mm, 6 mm to 16 mm, 8 mm to 14 mm, 10 mm to 12 mm, 10 mm to 20 mm, 12 mm to 18 mm, 14 mm to 16 mm, 23 mm to 33 mm, 25 mm to 31 mm, or 27 mm to 29 mm.
  • the ejection angle may be 0 to 45 degrees, 1 to 30 degrees, or 1 to 20 degrees with respect to the vertical direction.
  • the ejection unit may include means for controlling the temperature of the ejection liquid to be ejected.
  • the cell collection unit can collect the cells detached from the culture vessel surface.
  • the cell collection part may use a pipette (pipette tip) connected to a pump such as a syringe pump.
  • a cell suspension can be aspirated by using a device having the same configuration as the ejection section described above.
  • the cell collection unit can include collection position control means.
  • the collection position control means is means for controlling the position at which cells are collected in the cell suspension containing detached cells.
  • the collection position control means may collect cells from a plurality of positions including the liquid surface and the liquid of the cell suspension.
  • the cell collection unit may have means for separating the collected cells from the collection liquid.
  • a centrifugal separator is exemplified as a means for separating cells from the collected liquid.
  • the cell collection part can add a new medium to the separated cells and pipette until the cells are monodispersed, if necessary.
  • the differentiation induction section can add a differentiation induction agent to cells such as stem cells collected by the cell collection section.
  • the cell seeding unit can calculate the total number of cells and the total liquid volume of cells such as progenitor cells and/or differentiated cells collected by the cell collecting unit using the above formula I and the above formula II, and prepare a cell suspension for seeding into a culture vessel such as a multiwell plate.
  • the cell seeding section can remove the coating agent from the culture vessel before seeding the cell suspension in the culture vessel.
  • the transport section can transport a culture vessel such as a multiwell plate between each section.
  • the transport section can comprise a transport arm as transport means. The transport arm can grip the culture vessel and transport the culture vessel to a predetermined section.
  • the transport section can include transport speed control means.
  • the transport speed control means can control the transport speed to an appropriate speed according to the type of culture vessel to be transported (e.g., 1-well plate or multi-well plate such as 6, 24, 48, 96, 384, or 1536 well plate) so that the content liquid in the culture vessel does not spill during transportation.
  • the cell observation section can observe cells in the culture vessel.
  • the cell observation unit can photograph cells under a microscope or the like.
  • the cell observation unit can also calculate confluency, measure the number of cells, and/or calculate cell viability based on images obtained by photographing cells.
  • differentiated cells can be produced efficiently and reproducibly without the need for skilled experimenters.
  • a multi-well plate containing highly uniform cells with a CV value of 10% or less can be prepared.
  • Example 1 Linear velocity for ejecting ejection liquid> (the purpose) Using a device equipped with a cell detachment mechanism, the ejection speed of the ejection liquid that can efficiently detach adherent cultured cells is examined.
  • this device was newly developed as a device that can automatically perform processes such as removal of coating liquid, seeding of cell suspension, cell culture, cell detachment, ejection of ejection liquid, collection of cells, induction of differentiation, addition of reagents, and measurement of living cells.
  • PMS coating solution obtained by diluting 0.5 mL of poly-L-lysine, 1.0 mL of Matrigel, and 1.0 mL of synthmax with 47.5 mL of sterilized water (hereinafter referred to as PMS coating solution) was added to a rectangular culture vessel (Greiner bio-one REF: 670180) (long side 127.5 mm ⁇ short side 85 mm).
  • PMS coating solution was added to each well of the multiwell plate at 20 uL/well for 96 wells and at 10 uL/well for 384 wells. The PMS coating solution was removed before seeding the cells.
  • iPS cells 15 mL of a cell suspension containing 0.25 to 0.37 ⁇ 10 4 human iPS cells in StemFit medium containing 10 nM Y-27632 was seeded in the iMatrix-511-coated culture vessel prepared in (1) above. Placed in a 5% CO 2 incubator and cultured at 37°C for 9 days while exchanging the medium every 1 to 3 days, high-density iPS cells with a confluency of 85% or more (21.0 ⁇ 10 4 cells/cm 2 to 35.0 ⁇ 10 4 cells/cm 2 ) were obtained (Fig. 3A).
  • iPS cells (30 ⁇ 10 6 cells) were suspended in 15 mL of NBpDY medium, seeded in PMS-coated vessels, and cultured in a 5% CO 2 incubator. After 4 days, 8 mL of the medium was aspirated, 8 mL of NBpY medium was injected, cultured to induce differentiation, and 3 days later, induced neurons were obtained.
  • the culture vessel treated with the cell detachment solution was placed under the ejection port (FIGS. 3C and 5A).
  • the culture vessel was held at an inclination angle of 10 degrees with respect to the horizontal plane so that the ejection angle of the ejection liquid with respect to the surface of the culture vessel to which the cells adhered was 80 degrees (FIG. 5A).
  • the ejected liquid was ejected vertically from an ejection port consisting of a dispensing tip with a cross-sectional area of 1.77 mm 2 (aperture 3 mm) (Fig. 3C).
  • 2 ⁇ TrypLE Select/PBS+10 nM Y-27632 was used as the ejection liquid, and the ejection liquid was continuously ejected along the linear path for ejection set in the Y-axis direction (the direction of the short side of the culture vessel) shown in FIG. 5B.
  • the ejected liquid was ejected at three linear velocities (147 mm/second, 565 mm/second, or 848 mm/second).
  • the speed of moving the ejection port in the Y-axis direction was 22.7 mm/sec, the moving time was 3 seconds, and the moving distance was 68 mm. After ejecting the ejection liquid, the cells were photographed under a microscope.
  • the presence or absence of cell detachment was determined by analyzing the obtained images using image analysis software Image J. Specifically, the threshold brightness was determined based on the brightness of the cell-existing area and the cell-free area. By binarizing the image based on this threshold luminance, regions where cells remained and regions where cells were detached were distinguished. When a region where cells were detached was observed around the region where the liquid was discharged, it was determined as having cell detachment (+), and when no detached region was observed, it was determined as no cell detachment (-). The determination results are shown in Table 1 below.
  • Cells detached from the culture vessel surface were recovered, and the number of recovered cells and the ratio of the number of surviving cells to the number of recovered cells (cell viability) were evaluated. Specifically, 25 ⁇ L of trypan blue and 25 ⁇ L of cell suspension were mixed in a microtube, injected into a hemocytometer, and the number of cells was counted. Dead cells are stained with trypan blue. Cell viability was calculated by the following (Formula III). ((total number of cells ⁇ number of dead cells)/total number of cells) ⁇ 100 (Formula III)
  • Table 1 shows the results of evaluating the presence or absence of cell detachment and cell viability.
  • iPS cells were detached from the culture vessel in the areas where the ejection liquid was ejected under the conditions of 565 mm/second and 848 mm/second among the three linear velocities (147 mm/second, 565 mm/second, and 848 mm/second) (Fig. 4).
  • the ejection liquid was ejected at a linear velocity of 147 mm/sec, the iPS cells were not detached from the culture vessel. All of the exfoliated iPS cells had a cell viability of 80% or more.
  • iPS cells or induced neurons were cultured in a culture vessel and treated with a cell detachment solution.
  • iN cells described in Japanese Patent No. 6473077 were used as induced neurons.
  • the induced nerve cells are nerve cells induced to differentiate by expressing the Ngn2 transgene in human iPS cells by administration of doxycycline (Dox).
  • the cells were detached by ejecting the ejection solution on the cells after treatment with the cell detachment solution.
  • the linear discharge velocity was set to 1000 mm/sec, and the interval between adjacent linear paths (indicated as ⁇ X in FIG. 5) was set to 15 mm or 28 mm, and the discharged liquid was continuously discharged onto a plurality of linear paths (FIG. 5).
  • 6 linear paths were ejected at intervals of 15 mm (Fig.
  • the iPS cell ejection solution used was 2 ⁇ TrypLE Select/PBS + 10 nM Y-27632, and the induced neuron ejection solution was TrypLE Select (1 ⁇ ) (Life Technologies: REF: 12563-011) + 10 nM Y-27632.
  • the other discharge conditions conformed to the conditions described in (4) of Example 1.
  • the ratio of the number of surviving cells to the number of recovered cells after ejection of the ejection liquid was calculated under the conditions described in Example 1.
  • Table 2 shows the results of evaluating the number of collected cells and cell viability.
  • Example 3 Cell detachment by combining spot discharge and linear path discharge> (the purpose) Cells are detached from the culture vessel by a method of combining spot-like ejection and linear path ejection.
  • the ejected liquid was spot-likely ejected at a linear velocity of 200 mm/sec or 1000 mm/sec from 8 ejection ports arranged at equal intervals of 10 mm in the Y-axis direction (Fig.
  • the culture vessel was held tilted 10 degrees to the opposite side, and spot-like ejection by the dispenser 1 and ejection onto the linear path by the dispenser 2 were performed on the opposite half surface in the same manner as above (Fig. 7-1B).
  • Table 3 shows conditions 3-2 and 3-4, respectively, for iPS cells to be ejected in spot form at a linear velocity of 200 mm/sec or 1000 mm/sec.
  • Condition 3-5 indicates a condition in which spot-like ejection is performed on the induced nerve cells at a linear velocity of 1000 mm/sec.
  • condition 3-1 linear velocity of spot-like discharge: 200 mm/sec
  • condition 3-3 linear speed of spot-like discharge: 1000 mm/sec
  • condition 3-6 shows the result of performing only the discharge onto the linear path without performing the spot-like discharge on the induced nerve cells.
  • the dispenser 1 Under each condition, the dispenser 1 ejected a total of 1000 ⁇ L of the ejection liquid, and the dispenser 2 ejected a total of 3000 ⁇ L of the ejection liquid.
  • the other discharge conditions conformed to the conditions described in (4) of Example 1.
  • Table 3 shows the results of confirming the presence or absence of cell detachment under a microscope after the ejection liquid was ejected under each condition.
  • iPS cells were not detached from the culture vessel at a linear velocity of 200 mm/sec.
  • iPS cells were detached from the culture vessel at a linear velocity of 1000 mm/sec.
  • Table 3, Condition 3-3 When only the ejection onto the linear path and the spot-like ejection at the ejection position A were performed (Table 3, Condition 3-3), a sufficient amount of cells could be recovered, but some iPS cells remained in a place away from the linear path and the ejection position A.
  • the ejection onto the linear path and the spot-like ejection at the ejection positions A and B were combined (Table 3, Conditions 3-4 and 3-5), iPS cells and induced neurons could be exfoliated from the entire surface (Figs. 7-1C, 7-2D, E). In conditions 3-6, the induced neurons could be exfoliated from the entire surface only by discharging onto the linear path.
  • Example 4 Method for recovering exfoliated cells> (the purpose) Investigate a method for efficiently collecting cells detached from culture vessels.
  • Fig. 8 shows the positions where cells were recovered by the recovery method implemented in this example.
  • the recovery method shown in FIGS. 8A and 8B will be referred to as “cell recovery method A”
  • the recovery method shown in FIGS. 8C and D will be referred to as “cell recovery method B”.
  • cell collection method A cells were collected from two locations in the solution with a single pipetting arm.
  • cell collection method B cells were collected from a total of 24 positions (position 3 in FIG. 8D), including 8 positions on the liquid surface (positions 1 and 2 in FIG. 8D) at each of two positions (positions 1 and 2 in FIG. 8C) on the X-axis (positions 1 and 2 in FIG. 8C) and eight positions (position 3 in FIG. 8D) in the liquid (bottom of the container; position 3 in FIG. 8C).
  • the number of recovered cells and cell viability obtained by the recovery methods A and B are shown in Table 4 below.
  • the number of recovered cells was 10 ⁇ 10 6 , which did not meet the standard value.
  • the number of collected cells was 24 ⁇ 10 6 , exceeding the reference value. Therefore, it was found that the detached cells can be efficiently collected by collecting the cells from multiple positions including the liquid surface and the liquid of the cell suspension.
  • Example 5 Detachment of induced neurons from the culture vessel and evaluation of viability> (the purpose) Evaluate conditions for exfoliation recovery of induced neurons with high viability.
  • the ejected liquid was ejected at three types of linear velocities (147 mm/sec, 565 mm/sec, or 903 mm/sec), and the ejected liquid was continuously ejected onto the linear path for ejection set in the Y-axis direction (the direction of the short side of the culture vessel) as in FIG. 5B.
  • the speed of moving the ejection port in the Y-axis direction was 22.7 mm/sec, the moving time was 3 seconds, and the moving distance was 68 mm.
  • the cells were photographed under a microscope.
  • the obtained images were analyzed using image analysis software Image J in the same manner as in Example 1 to determine the presence or absence of cell detachment. The determination results are shown in Table 5 below.
  • the number of surviving cells collected by cell collection method B is shown in Table 5 below.
  • FIGS. 9A to 9C show the state of the surface of the culture vessel after the ejection liquid has been ejected. From the results shown in Table 5 and FIGS. 9A to C, cells could not be sufficiently detached at a low linear velocity (147 mm/sec), and conversely, at a high linear velocity (903 mm/sec), cells were vigorously detached, resulting in the axons becoming entangled (FIG. 9C, dotted line frame).
  • condition 5-3 cell axons tend to entangle each other even during cell collection, resulting in cell aggregates being easily generated, and not all the cells detached with the dispensing tip could be collected, and the number of collected cells was slightly reduced compared to condition 5-2 (Fig. 9D). From the above results, it was found that the difference in linear velocity greatly affects the number of cells recovered and the survival rate.
  • Example 6 Viability evaluation of cells seeded in multiwell plate> (the purpose) The detached and collected induced neurons are seeded in a multiwell plate, and after culturing for 4 days, cell viability and uniformity in each well are evaluated by WST-8.
  • the total cell count, dead cell count, and viable cell count of the obtained cell suspension were measured, and the dead cell contamination rate and cell viability were calculated (shown as the cell viability of Condition 6-1 in Table 6 below).
  • This cell suspension was adjusted to 4,000,000 viable cells/mL, 15 mL of the cell suspension was seeded into each well of a 384-well plate at 25 ⁇ L, and cultured at 37° C. in a 5% CO 2 incubator for 4 days.
  • the total number of cells, the number of dead cells, and the number of viable cells in the obtained cell suspension were measured, and the dead cell contamination rate and cell viability were calculated (shown as the cell viability of Condition 6-2 in Table 6 below).
  • This cell suspension was adjusted to 4,000,000 viable cells/mL, 15 mL of the cell suspension was seeded into each well of a 384-well plate at 25 ⁇ L, and cultured at 37° C. in a 5% CO 2 incubator for 4 days.
  • the total number of cells, the number of dead cells and the number of viable cells in the cell suspension were measured, and the dead cell contamination rate and cell viability were calculated (shown as the cell viability of Condition 6-3 in Table 6 below).
  • This cell suspension was adjusted to 4,000,000 viable cells/mL, 15 mL of the cell suspension was seeded into each well of a 384-well plate at 25 ⁇ L, and cultured at 37° C. in a 5% CO 2 incubator for 4 days.
  • Table 6 shows the dead cell contamination rate and cell survival rate before seeding, and the CV value of cells after seeding. Moreover, the relationship between cell viability and CV value is shown in FIG. 10A.
  • Example 7 Acquisition of immunostained images and calculation of MAP2 positive rate> (the purpose)
  • the exfoliated and collected induced neurons obtained under Condition 6-2 or Condition 6-3 of Example 6 are seeded in a multiwell plate, and after 4 days of culture, the homogeneity of the induced neurons in each well is evaluated by immunostaining.
  • the cell suspension obtained under Condition 6-2 or Condition 6-3 was seeded in a 96-well plate in the same manner as above, and the cell plate was cultured in a 37° C., 5% CO 2 incubator for 4 days. After that, the 96-well plate was washed with PBS, 100 ⁇ L of 4% PFA was added to fix the cells, and the cells were fixed in a refrigerator at 4° C. for 24 hours or longer. After that, 4% PFA was removed, 100 ⁇ L of Permeabilize buffer was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours. Next, the Permeabilize buffer was removed, and after washing with PBS three times, Blocking buffer was added and the plate was allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • An Anti-MAP2 antibody (Abcam: ab183830) was diluted with a blocking buffer to a concentration of 1:500 as a primary antibody, and after removing the blocking buffer, the primary antibody solution was added and maintained at 4° C. overnight (12 hours or longer). After removing the primary antibody solution and washing with PBS, the secondary antibody solution (Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor 488 (Abcam: ab150077) diluted with a blocking buffer at a concentration of 1:2000) was added, shielded from light, and allowed to stand at room temperature for 1 hour. The secondary antibody solution was removed and washing was performed twice with PBS.
  • FIG. 11AB The results of MAP2 immunostaining of cells obtained by the method of condition 6-2 are shown in FIG. 11AB.
  • MAP2-positive cells with nerve axons and MAP2 weakly-positive or MAP2-negative cells without axons were observed (FIG. 11A).
  • FIG. 11B the ratio of MAP2-positive cells (neuronal cells) to total cells was only about 35% (quantification results of 12 wells in a 96-well plate; FIG. 11B).
  • FIG. 11C the results of MAP2 immunostaining of cells obtained by the method of condition 6-3 are shown in Figures 11C and 11D. It was found that most of the cells obtained by the method of Condition 6-3 were MAP2-positive cells (nerve cells) (Fig. 11C). Furthermore, MAP2-positive cells (neuronal cells) accounted for 95% or more of all cells (quantification results of 12 wells in a 96-well plate; FIG. 11D).
  • Example 8 Evaluation of homogeneity of induced neurons> (the purpose) The exfoliated and collected induced neurons obtained by the method of Condition 6-3 of Example 6 are seeded in a 96-well plate, and after 4 days of culture, whether or not the induced neurons in each well retain a homogeneous phenotype is evaluated using the axon length of the neurons as an index.
  • the cell suspension was seeded in a 96-well plate in the same manner as described above by the method of Condition 6-3, and the cell plate was cultured in a 37° C., 5% CO 2 incubator for 4 days. After that, the nerve cells in the wells of the 96-well plate were photographed using the Incucyte Live Cell Analysis System (Sartorius Japan K.K.). The nerve cell in the photographed image was divided into the cell body part and the axon part, and the axon length was calculated.
  • FIG. 12A A photographed image of nerve cells in each well obtained by the method of condition 6-3 is shown in FIG. 12A. Furthermore, the nerve cell in the photographed image was divided into the cell body portion and the axon portion, the axon length was calculated, and the nerve cell axon length in each well is shown in FIG. 12B. The average R and standard deviation ⁇ of the nerve cell axon lengths excluding the 96 peripheral wells were calculated, and the CV value (coefficient of variation) was calculated using Equation IV above. As a result, the CV value of the nerve cell axon lengths in the 96-well plate was 3.19%. It was shown that iPS cells can be automatically induced to differentiate into uniform and homogeneous neurons by using the method of condition 6-3, and it was confirmed that the axon length, which is a characteristic of neurons, was also prepared homogeneously within the well.
  • Example 9 Preparation of vascular endothelial cell plate> (the purpose) Using iPS cells exfoliated by the methods of conditions 2-1 and 3-4 of the example and recovered by cell recovery method B of example 4, induction of differentiation into vascular endothelial cells is examined.
  • the cell suspension was seeded at 650,000 cells/100 ⁇ L in each well of a Matrigel-coated 96-well plate and cultured at 37° C. in a 5% CO 2 incubator for 6 hours. After the iPS cells adhered, the entire medium in the 96-well plate was replaced with EBM-2 (Lonza) Clonetics medium, and differentiation culture was again performed at 37°C in a 5% CO 2 incubator for 3 days. The culture supernatant was removed from the 96-well plate cultured above, washed with PBS, 100 ⁇ L of 4% PFA was added, and the cells were fixed in a refrigerator at 4° C. for 24 hours or longer.
  • EBM-2 Longza
  • Blocking Buffer a solution of Blocking Solution (manufactured by Nacalai) diluted 5-fold with pure water), 50 ⁇ L of a primary antibody solution containing Anti-CD31 antibody (Mouse Monoclona Ab9498) at a concentration of 1:500 was added to a 96-well plate on which cells were fixed, and incubated for 12 hours. left undisturbed. After that, the primary antibody solution was removed, and a Blocking Buffer containing Donkey anti-Mouse IgG (H&L) AlexaFluor (registered trademark) 488 at a concentration of 1:500 was added as a secondary antibody, and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • H&L Donkey anti-Mouse IgG
  • AlexaFluor registered trademark
  • a 1000-fold diluted solution of DAPI in Blocking Buffer was added to the wells, shielded from light, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. After removing the solution in the wells and washing the wells twice with PBS, they were observed under a fluorescence microscope (Keyence BZ-X810) to observe CD31-positive cells, which are positive markers for vascular endothelial cells. Furthermore, the number of vascular endothelial cells in a 96-well plate was measured according to the method described above for measuring the number of viable cells by WST in "(Measurement of number of viable cells by WST)" in Example 6.
  • Cell Counting Kit-8 (tetrazolium salt WST-8 [2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4disulfphenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt], Dojindo) solution 10 ⁇ L was injected into each well of the 96-well plate at a rate of 10 ⁇ L/sec. After reacting the multiwell plate in a 37° C., 5% CO 2 incubator for 3 hours or more, the absorbance of each well at 450 nm and 656 nm was measured, and the corrected absorbance was measured. The average value R and standard deviation ⁇ in 96 wells were calculated, and the CV value was calculated by Equation IV above.
  • Table 7 shows the number of recovered iPS cells and cell viability.
  • iPS cell lines two types of iPS cell lines (iPS cells derived from healthy elderly people/iPS cells derived from patients with dementia of the Alzheimer's type) had a cell viability of 90% or more.
  • the iPS cells collected by the above method were induced to differentiate into vascular endothelial cells, immunostained for the vascular endothelial cell marker CD31, and then observed under a fluorescence microscope. The results are shown in FIG. It was revealed that CD31-positive cells can be obtained from two types of iPS cell lines.
  • the CV value between each well of the iPS cell-derived vascular endothelial cells of Alzheimer's disease patients was 6.92%.
  • iPS cells can be automatically differentiated into homogeneous neurons and vascular endothelial cells by using the method of condition 6-3 compared to condition 6-2.

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Abstract

培養容器から接着細胞を低障害かつ効率的に剥離する方法を提供することを課題とする。　接着培養した細胞を培養容器から剥離する方法であって、前記培養容器に細胞剥離液を加えて前記細胞を細胞剥離液で処理する、細胞剥離液処理工程、及び前記細胞剥離液処理後の前記細胞に対して吐出液を吐出して、前記培養容器表面から前記細胞を剥離する、剥離工程を含み、前記剥離工程において吐出液を吐出する線速度が３００ｍｍ／秒～１５００ｍｍ／秒であり、かつ前記剥離工程は、前記培養容器表面にスポット状に吐出液を吐出し、隣接するスポットの中心間距離が４ｍｍ～３３ｍｍであるか、又は前記培養容器表面に設定した４ｍｍ～３３ｍｍ間隔の線状路上に吐出液を連続して吐出する、前記方法を提供する。

Description

細胞剥離方法、及び細胞剥離機構を搭載する装置
　本発明は、接着培養した細胞を培養容器から剥離する方法、接着性の幹細胞から分化細胞を生産する方法、及び細胞剥離機構を搭載する装置等に関する。
　薬剤の有効性や安全性を評価する細胞アッセイでは、候補薬剤の存在下で細胞を培養し、薬剤に対する反応が測定される。細胞アッセイにおいて薬剤効果を精度よく測定するためには、異なる試験群及び対照群の間で培養条件を一定にする必要があるが、化合物ライブラリー等の万単位の候補薬剤を対象として効果を比較する場合には、この点がしばしば困難となる。
　近年、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の作製技術が確立された結果、患者自身の細胞からｉＰＳ細胞を作製し、ｉＰＳ細胞から疾患関連細胞を作出することが可能となった。疾患の病態をより忠実に再現し得る患者由来の細胞を対象として創薬スクリーニングを実施することにより、効果の高い新たな治療薬が開発されることが期待されている。
　しかし、患者由来のｉＰＳ細胞から疾患関連細胞を作製して薬剤効果の測定対象とする場合、患者細胞の採取から薬剤スクリーニングを行うまでに、細胞の初期化、増殖、及び分化誘導を含む、多数のステップを長期間に亘って実施する必要がある。ｉＰＳ細胞から均質な細胞を大量に作製して創薬スクリーニングに供するためには、各ステップを効率的かつ再現性よく行う高度に熟練した手技が要求される。
　特にｉＰＳ細胞は接着細胞であり、分化誘導を経て得られる幹細胞、前駆細胞、及び／又は分化細胞等も接着細胞である場合が多い。接着細胞ではその増殖や分化誘導等のために培養容器を移し替える各ステップで培養容器から細胞を剥離し回収する作業が伴う。
　例えばＨｅＬａ細胞等の株化細胞を取り扱う場合、細胞の性質が安定であり、単一細胞でも長時間生存可能である。それ故、強い剥離活性を有するトリプシン等を含む剥離液中に細胞を浸漬させて細胞剥離を行うことができる。剥離液中では、細胞間の接着、及び細胞と基質との間の接着が解離する結果、徐々に細胞が剥離液中に浮遊する。さらに培養容器の揺動やプロテアーゼ不活化液の添加を行うことによって、細胞懸濁液を調製することができる。
　一方、ｉＰＳ細胞等の幹細胞の剥離では、ＨｅＬａ細胞等の株化細胞と比較して細胞の性質が不安定であり、剥離操作の影響を受け易い。そのため、強い剥離活性を有するトリプシン等ではなく、剥離活性が比較的弱いアキュターゼやトリプルセレクト（ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ）等を含む剥離液がしばしば使用される。このような剥離液では細胞の接着力が弱まるものの、大部分は接着したまま浮遊しない。それ故、剥離液を浸漬した後、依然として接着した状態の細胞(残余接着細胞)を回収するために、セルスクレーパー等を用いて細胞を培養容器から物理的に剥離するステップが必要となる。
　ここで、セルスクレーパー等を用いて細胞を培養容器から剥離する作業は、得られる細胞の生存率等に実験者の手技が大きく影響し得る。熟練した実験者であっても、細胞を効率的かつ再現性よく回収することは困難であり、負担も大きい点が問題となっている。
　細胞剥離作業において実験者の負担を軽減するために、培養容器から細胞を剥離する作業を自動化して行う装置が開発されている。特許文献１には、培養容器を揺動させることにより細胞を剥離する装置が開示されている。しかし、細胞を剥離するために揺動を用いる場合には、長時間に亘って高速で揺動し続ける必要や、強い剥離活性を有する剥離液を使用する必要があり、細胞へのダメージを無視できない。例えば、ゲノムの変異、細胞膜の分解、及び細胞内プロテアーゼの溶出等に加えて、幹細胞の分化能が損なわれる影響を回避することができない。
　したがって、接着細胞を培養容器から低障害かつ効率的に剥離及び回収する新たな細胞剥離方法、並びに回収した細胞から細胞アッセイに供する均一な細胞を調製する新たな方法が必要とされている。
特許第６７１８３０３号
　本発明の目的は、培養容器から接着細胞を低障害かつ効率的に剥離する方法を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、接着培養した細胞を剥離するための装置を新たに開発した。この装置は培養容器の表面に吐出液を吐出する吐出部を備えており、接着細胞に対して吐出液を吐出することで細胞を剥離することができる。本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、吐出液を接着細胞に対して特定の線速度で吐出することにより、細胞が効率的に剥離されることを見出した。さらに、培養容器表面に対してスポット状及び／又は線状の吐出パターンで吐出液を吐出することによって、細胞回収率及び細胞生存率を大幅に上昇させることに成功した。本発明は、上記知見に基づくものであって以下を提供する。
（１）接着培養した細胞を培養容器から剥離する方法であって、前記培養容器に細胞剥離液を加えて前記細胞を細胞剥離液で処理する、細胞剥離液処理工程、及び前記細胞剥離液処理後の前記細胞に対して吐出液を吐出して、前記培養容器表面から前記細胞を剥離する、剥離工程を含み、前記剥離工程において吐出液を吐出する線速度が３００ｍｍ／秒～１５００ｍｍ／秒であり、かつ前記剥離工程は、前記培養容器表面にスポット状に吐出液を吐出し、隣接するスポットの中心間距離が４ｍｍ～３３ｍｍであるか、又は前記培養容器表面に設定した４ｍｍ～３３ｍｍ間隔の線状路上に吐出液を連続して吐出する、前記方法。
（２）前記細胞剥離液がプロテアーゼ及び／又はキレート剤を含む、（１）に記載の方法。
（３）前記細胞剥離液処理工程において細胞剥離液による処理を１分間～３０分間、及び／又は１５℃～４５℃で行う、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記細胞剥離液処理工程において前記培養容器を揺動する、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記揺動を振幅２ｍｍかつ／又は振動数１Ｈｚ～８．５Ｈｚで行う、（４）に記載の方法。
（６）前記細胞剥離液処理工程と前記剥離工程との間に細胞剥離液を除去する、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記剥離工程において、前記細胞が接着した前記培養容器表面に対する吐出液の吐出角度が７５度～８５度である、（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記剥離工程において、吐出液を吐出する吐出口の口径が０．１ｍｍ～２．０ｍｍである、（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記剥離工程後の前記細胞を回収する回収工程をさらに含む、（１）～（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記回収工程が、剥離した前記細胞を含む細胞懸濁液の液面及び液中を含む複数の位置から前記細胞を回収することを含む、（９）に記載の方法。
（１１）前記細胞が、接着性の、幹細胞、前駆細胞、分化細胞、株化細胞、又は不死化細胞である、（１）～（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記幹細胞が、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、及び神経幹細胞からなる群から選択される、（１１）に記載の方法。
（１３）前記幹細胞が、人工多能性幹細胞である、（１２）に記載の方法。
（１４）前記剥離工程が、前記培養容器表面にスポット状に吐出液を吐出し、隣接するスポットの中心間距離が４ｍｍ～２０ｍｍであるか、又は前記培養容器表面に設定した４ｍｍ～２０ｍｍ間隔の線状路上に吐出液を連続して吐出する、（１３）に記載の方法。
（１５）培養容器表面における単位面積当たりの細胞数が２１．０×１０４細胞／ｃｍ２以上である、（１３）又は（１４）に記載の方法。
（１６）前記細胞剥離液が２×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを含む、（１３）～（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）前記分化細胞が神経細胞、又は血管内皮細胞である、（１１）に記載の方法。
（１８）前記剥離工程は、前記培養容器表面にスポット状に吐出液を吐出し、隣接するスポットの中心間距離が２３ｍｍ～３３ｍｍであるか、又は前記培養容器表面に設定した２３ｍｍ～３３ｍｍ間隔の線状路上に吐出液を連続して吐出する、（１７）に記載の方法。
（１９）前記細胞剥離液処理工程から前記回収工程までを繰り返す繰り返し工程を含む、（９）及びそれを引用する（１０）～（１８）のいずれかに記載の方法。
（２０）接着性の幹細胞から分化細胞を生産する方法であって、第１培養容器において前記幹細胞を接着培養する第１培養工程、前記第１培養容器に第１細胞剥離液を加えて前記幹細胞を第１細胞剥離液で処理する、第１細胞剥離液処理工程、前記第１細胞剥離液処理工程後の前記幹細胞に対して第１吐出液を吐出して、前記第１培養容器表面から前記幹細胞を剥離する、第１剥離工程、前記第１剥離工程後に前記幹細胞を回収する第１回収工程、前記第１回収工程で回収した前記幹細胞に分化誘導剤を加える、分化誘導工程、前記分化誘導工程で得られた前駆細胞及び／又は分化細胞を第２培養容器において培養する第２培養工程、前記第２培養容器に第２細胞剥離液を加えて前記前駆細胞及び／又は前記分化細胞を第２細胞剥離液で処理する、第２細胞剥離液処理工程、及び前記第２細胞剥離液処理後の前記前駆細胞及び／又は前記分化細胞に対して第２吐出液を吐出して、前記第２培養容器表面から前記前駆細胞及び／又は前記分化細胞を剥離する、第２剥離工程を含み、前記第１剥離工程において第１吐出液を吐出する線速度、及び／又は前記第２剥離工程において第２吐出液を吐出する線速度が３００ｍｍ／秒～１５００ｍｍ／秒であり、かつ前記第１剥離工程及び／又は前記第２剥離工程は、前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器の表面にスポット状に吐出液を吐出し、隣接するスポットの中心間距離が４ｍｍ～３３ｍｍであるか、又は前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器の表面に設定した４ｍｍ～３３ｍｍ間隔の線状路上に吐出液を連続して吐出する、前記方法。
（２１）前記第２剥離工程後の前記前駆細胞及び／又は前記分化細胞を回収する第２回収工程、及び前記第２回収工程で回収した前記前駆細胞及び／又は前記分化細胞をマルチウェルプレートに播種する播種工程をさらに含む、（２０）に記載の方法。
（２２）前記幹細胞が人工多能性幹細胞である、（２０）又は（２１）に記載の方法。
（２３）前記分化細胞が神経細胞である、（２０）～（２２）のいずれかに記載の方法。
（２４）接着培養した細胞を剥離する細胞剥離機構を搭載する装置であって、前記細胞が接着した培養容器に細胞剥離液を添加する細胞剥離液添加部、及び前記培養容器表面に吐出液を吐出する吐出部を備え、前記吐出部は、３００ｍｍ／秒～１５００ｍｍ／秒の線速度で吐出液を吐出し、前記培養容器表面に吐出液を吐出する位置を制御する吐出位置制御手段を含む、前記装置。
（２５）前記培養容器表面から剥離した前記細胞を回収する細胞回収部をさらに備えた、（２４）に記載の装置。
（２６）前記吐出部が、前記培養容器表面に対する吐出液の吐出角度を調整する吐出角度制御手段を含む、（２４）又は（２５）に記載の装置。
（２７）前記細胞剥離液添加部が前記培養容器を揺動することができる、（２４）～（２６）のいずれかに記載の装置。
（２８）前記吐出部が、口径０．１ｍｍ～２．０ｍｍの吐出口を有する、（２４）～（２７）のいずれかに記載の装置。
（２９）前記吐出位置制御手段は、スポット状に剥離液を吐出させ、隣接するスポット間の間隔が４ｍｍ～３３ｍｍである、（２４）～（２８）のいずれかに記載の装置。
（３０）前記吐出位置制御手段は、培養容器表面に設定した４ｍｍ～３３ｍｍ間隔の線状路上に剥離液を連続して吐出させる、（２４）～（２８）のいずれかに記載の装置。
（３１）前記細胞回収部は、剥離した前記細胞を含む細胞懸濁液において前記細胞を回収する位置を制御する回収位置制御手段を含む、（２５）、及びそれを引用する（２６）～（３０）のいずれかに記載の装置。
（３２）前記回収位置制御手段は、前記細胞懸濁液の液面及び液中を含む複数の位置から前記細胞を回収させる、（３１）に記載の装置。
（３３）（２４）～（３２）のいずれかに記載の装置を用いる、（１）～（２３）のいずれかに記載の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2022-006552号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、培養容器から接着細胞を低障害かつ効率的に剥離することができる。
本発明の細胞剥離方法における一実施形態の各工程を示す図である。本発明の細胞剥離方法は、細胞を細胞剥離液で処理する細胞剥離液処理工程（Ｓ０１０１）、及び細胞を剥離する剥離工程（Ｓ０１０４）を必須工程として含み、細胞剥離液除去工程（Ｓ０１０３）、及び剥離された細胞を回収する回収工程（Ｓ０１０６）を選択工程として含む。 本発明の分化細胞生産方法における一実施形態の各工程を示す図である。本発明の分化細胞生産方法は、第１培養工程（Ｓ０２０１）、第１細胞剥離液処理工程（Ｓ０２０２）、第１剥離工程（Ｓ０２０３）、第１回収工程（Ｓ０２０４）、分化誘導工程（Ｓ０２０５）、第２培養工程（Ｓ０２０６）、第２細胞剥離液処理工程（Ｓ０２０７）、及び第２剥離工程（Ｓ０２０８）を必須工程として含み、第２回収工程（Ｓ０２１０）及び播種工程（Ｓ０２１２）を選択工程として含む。 接着培養した細胞を細胞剥離液で処理し、吐出液で剥離する過程を示す図である。図３Ａは、接着培養により得られたコンフルエンシー８５％以上の高密度ｉＰＳ細胞を示す。図３Ｂは、細胞剥離液として２×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔにより処理した後のｉＰＳ細胞を示す。図３Ｃは、培養容器表面に対して吐出液を吐出する様子を示す。 吐出液により細胞を剥離した後の培養容器表面を示す図である。図４Ａは、複数の線状路（矢印）上へ吐出液を吐出した後の培養容器表面を示す。吐出液を吐出していない領域（白色）には剥離されていない細胞が残っている。図４Ｂは、吐出液を吐出して細胞が剥離された領域と細胞が剥離されていない領域の拡大図を示す。 吐出液の吐出方法を示す図である。図５Ａは、水平面に対して傾斜角度１０度で培養容器を保持した状態で、一定の間隔（ΔＸ）で複数の線状路上に吐出液を連続して吐出する方法を示す。図５Ｂは、吐出液を連続して吐出する線状路を示す。線状路は互いに一定の間隔（ΔＸ）で配置されている。 吐出液をスポット状に吐出する方法を例示する図である。図６Ａは、８連分注アームによる８箇所（吐出位置Ａ）への吐出、及び吐出位置Ａから一定の距離（ΔＹ）ずれた位置（吐出位置Ｂ）への吐出を例示する。図６Ｂは、図６Ａで示す吐出位置Ａ及びＢの吐出をＸ軸方向に一定の間隔（ΔＸ）で繰り返す方法により吐出する位置を例示する。 スポット状吐出と線状路上への吐出とを組み合せる吐出方法の例を示す図である。図７－１Ａは、スポット状吐出と線状路上への吐出とを行う位置の一例を示す。図７－１Ｂは、培養容器の底面全体における吐出位置を例示する。図７－１Ｃは、吐出によりｉＰＳ細胞が剥離した領域を示す。矢頭はスポット状吐出によって剥離した領域、矢印は線状路上への吐出によって剥離した領域を示す。 図７－１の続きである。図７－２Ｄは、線状路上への吐出により、誘導神経細胞を剥離する前後の培養容器表面を示す。左の写真は剥離前、右の写真は剥離後の培養容器表面を示す。図７－２Ｅは、スポット状吐出と線状路上への吐出とを組み合わせることにより、誘導神経細胞を剥離する前後の培養容器表面を示す。左の写真は剥離前、右の写真は剥離後の培養容器表面を示す。 剥離した細胞を培養容器から回収する方法を示す図である。図８Ａは、回収方法Ａにより細胞懸濁液を回収する液中の位置を示す。図８Ｂは、回収方法Ａにより細胞懸濁液を回収する２つの位置を示す。図８Ｃは、回収方法Ｂにより細胞懸濁液を回収する液面の位置（回収位置１、２）及び液中の位置（回収位置３）を示す。図８Ｄは、回収方法Ｂにより細胞懸濁液を回収する２４か所の位置を例示する。 誘導神経細胞を剥離した結果を示す図である。図９Ａ～図９Ｃは、それぞれ所定の線速度による線状路上への吐出により、誘導神経細胞を剥離した後の培養容器表面を示す。図９Ａは、条件５－１の結果を示す。図９Ｂは、条件５－２の結果を示す。図９Ｃは、条件５－３の結果を示す。点線の枠内は、軸索同士の絡まりを示す。図９Ｄは、条件５－３で細胞を回収する際に分注チップ内で細胞が凝集して詰まった様子を示す。 播種した細胞懸濁液における細胞生存率と、３８４ウェルプレートにおけるＣＶ値の関係を示す図である。図１０Ａは細胞生存率とＣＶ値の関係を評価した結果を示す。図中、「条件１」は実施例６の条件６－１、「条件２」は条件６－２、「条件３」は条件６－３に対応する。図１０Ｂは、実施例６の条件６－３における補正吸光度測定結果（複数の９６ウェル）を示す。 実施例６の条件６－２で得られた細胞（細胞生存率６０％）、及び条件６－３で得られた細胞（細胞生存率８９％）に対するＭＡＰ２免疫染色の結果を示す図である。図１１Ａは、条件６－２で得られた細胞のＭＡＰ２免疫染色の結果を示す。矢頭は、細胞核（ＤＡＰＩ）は確認できるが、ＭＡＰ２シグナルが確認できない細胞を示す。図１１Ｂは、条件６－２で得られた細胞におけるＭＡＰ２陽性細胞の割合を示す。図１１Ｃは、条件６－３で得られた細胞のＭＡＰ２免疫染色の結果を示す。図１１Ｄは、条件６－３で得られた細胞におけるＭＡＰ２陽性細胞の割合を示す。 実施例８において剥離回収後に培養した誘導神経細胞を解析した結果を示す図である。図１２Ａは、各ウェル内の神経細胞の撮影画像を示す。矢頭は神経細胞の細胞体を示し、矢印は神経細胞の軸索を示す。図１２Ｂは、９６ウェルプレートの各ウェルにおける神経細胞の軸索長を示す。 実施例９においてｉＰＳ細胞から分化誘導した血管内皮細胞を免疫染色後に蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。
１．細胞剥離方法
１－１．概要
　本発明の第１の態様は、接着培養した細胞を培養容器から剥離する方法（以下、「細胞剥離方法」とも表記する）である。本態様の細胞剥離方法は、細胞剥離液処理工程及び剥離工程を含む。本態様の細胞剥離方法によれば、接着培養した細胞を培養容器から効率的に剥離することができる。
１－２．用語の定義
　本明細書で頻用する以下の用語について定義する。
　本明細書において「剥離」とは、細胞が培養容器の表面から物理的に離れることをいう。細胞はシングルセル単位で剥離されてもよく、又は細胞塊単位で剥離されてもよい。剥離の例として、物理的剥離、酵素的剥離、化学的剥離、及びこれらの任意の組合せ等が挙げられる。
　本明細書において「物理的剥離」とは、細胞を含む培養容器の全体若しくは表面又は培養液に物理的な刺激を与えて細胞を剥離する方法をいう。例えば、セルスクレーパー等の細胞剥離手段を用いて培養容器表面を擦る機械的剥離、吐出液を培養容器表面に吐出する方法（「スプラッシング」とも呼ばれる）、培養容器に揺動や振動を与える方法、及び超音波処理等が挙げられる。
　本明細書において「酵素的剥離」は、細胞剥離活性を有する酵素を用いて細胞を剥離する方法をいう。酵素的剥離に用いる酵素の例として、トリプシン、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ、コラゲナーゼ、アキュターゼ、プロナーゼ、パパイン、及びディスパーゼ等のプロテアーゼが挙げられる。酵素的剥離に用いるプロテアーゼは限定しないが、ｉＰＳ細胞等の幹細胞を剥離する場合は比較的活性が低いプロテアーゼ（例えば、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ、コラゲナーゼ、アキュターゼ）が好ましい。
　本明細書において「化学的剥離」とは、キレート剤等の化合物を用いて細胞を剥離する方法をいう。化合物は、カルシウムイオンやマグネシウムイオンを結合できることが好ましく、キレート剤の例として、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、Ｎ’－（２－ヒドロキシエチル）エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’－三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）、１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシド）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸（ＢＡＰＴＡ）等が挙げられる。キレート剤以外の例として、カルシウムイオンやマグネシウムイオンと結合する、リン酸イオンを含むリン酸塩や、炭酸イオンを含む炭酸塩を使用することもできる。例えばリン酸緩衝液等の洗浄剤を使用することができる。
　物理的剥離、酵素的剥離、及び化学的剥離は、２以上の剥離方法を組み合わせて使用することもできる。例えば、酵素的剥離と化学的剥離とを組み合わせる場合、トリプシン等のプロテアーゼとＥＤＴＡ等のキレート剤を組み合わせることができる。例えば、市販の細胞剥離剤として、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）等を使用することもできる。また、酵素的剥離及び／又は化学的剥離により細胞と培養容器表面との接着を弱めた後に、セルスクレーパーやスプラッシング等による物理的剥離を行うこともできる。
　本明細書において「培養容器」は、細胞を培養可能な容器であれば、その素材、形状、及びサイズ等は問わない。培養容器の具体的な素材として、例えば合成樹脂、天然樹脂、ガラス、プラスチック、金属等が挙げられる。培養容器の具体的形状として、例えば三角柱、立方体、又は直方体等の多角柱、半球形や円柱（例えば底面の形状が円形のもの）等を挙げることができるが、底面が平面（例えば長方形や円形）となっているものが好ましい。培養容器の例として、ペトリディッシュ（シャーレ）、培養フラスコ、プレート、トレイ、及びチップ等が挙げられる。プレートは、マルチウェルプレートであってもよい。「マルチウェルプレート」とは、複数のウェル（すなわち２以上のウェル）を含むプレートを意味する。限定しないが、例えば６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、９６ウェルプレート、１９２ウェルプレート、３８４ウェルプレート、及び１５３６ウェルプレート等を使用することができる。チップの例として、Ｏｒｇａｎ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ及び生体機能チップ等が挙げられる。
　培養容器は、細胞接着や細胞増殖の促進のため、その表面にコーティングを施すことができる。培養容器のコーティングにはコーティング剤が用いられる。コーティング剤の例として、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、エンタクチン、コラーゲン（例えばコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩ）、ゼラチン、ポリ－Ｌ－オルニチン、ポリ－Ｄ－リジン、ポリ－Ｌ－リジン、又はマトリゲル（登録商標）、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ(登録商標)II－Ｓマトリックス等を使用することができる。
　本明細書において「接着性の細胞」又は「接着細胞」とは、培養容器に付着しながら増殖する細胞を意味し、培地中に浮遊した状態で増殖する浮遊細胞と対比される。接着細胞は、接着性の、真核細胞、例えば昆虫細胞、鳥類細胞（例えばニワトリ細胞）、及び哺乳動物細胞（例えば、マウス細胞、チンパンジー細胞、及びヒト細胞）であり得る。好ましくは接着性の哺乳動物細胞である。接着細胞の例として、接着性の、幹細胞、前駆細胞、分化細胞、株化細胞、又は不死化細胞が挙げられる。
　本明細書において「幹細胞」は、自己複製能及び多分化能（様々な細胞に分化する能力）を有する細胞である。本明細書において接着性の幹細胞の例として、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ；ｉＰＳＣ；ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ；ＥＳＣ；ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ；ＭＳ細胞；ＭＳＣ）、及び神経幹細胞等が挙げられる。
　本明細書において「前駆細胞」は、幹細胞と分化細胞との中間の分化段階に位置する細胞である。本明細書において前駆細胞には、幹細胞から誘導された細胞であって、分化細胞に最終分化する前の未成熟な細胞が含まれる。前駆細胞の具体例として、神経前駆細胞、心血管前駆細胞、心筋前駆細胞、骨髄系共通前駆細胞、T前駆細胞、衛星細胞、膵前駆細胞、骨芽細胞等が挙げられる。
　本明細書において「分化細胞」は、通常の生理的条件下では異なる細胞型にさらに分化しない細胞である。本明細書において、分化細胞の自己複製能の有無は問わない。分化細胞の例として、神経前細胞、神経細胞、血管内皮細胞、血管壁細胞、心筋細胞、上皮細胞、線維芽細胞、アストロサイト、グリア細胞、肝細胞、膵島細胞、間葉系細胞、筋肉細胞、血球細胞等、及びその任意の組合せが挙げられる。分化細胞は、ｉＰＳ細胞等の幹細胞から誘導した分化細胞であってもよい。本明細書においてｉＰＳ細胞から誘導した神経細胞を特に「誘導神経細胞」（例えば、特許第６４７３０７７号における「ｉＮ」）という。分化細胞は、単一細胞種、又は複数細胞種のいずれであってもよい。また、株化細胞の例として、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等が挙げられる。不死化細胞の例として、ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１（腎近位尿細管上皮不死化細胞）、ＴＥＬＯＨＡＥＣ（大動脈内皮細胞）等が挙げられる。
　「ｉＰＳ細胞」は、体細胞から誘導処理により得られる、ＥＳ細胞に近い分化全能性を有する細胞である。ｉＰＳ細胞は、様々な種類の細胞から様々な方法によって得ることができる。通常、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＣ－ＭＹＣタンパク質の４つのリプログラミング因子を体細胞に導入することによって作製される。ｉＰＳ細胞は接着性であり、コロニー形成しつつ増殖する性質を有するため、通常の細胞と比較して剥離されにくい性質を有する。
１－３．方法
　本態様の細胞剥離方法は、細胞剥離液処理工程及び剥離工程を必須工程として含み、細胞剥離液除去工程及び／又は回収工程を選択工程として含む。また、本態様の細胞剥離方法は、細胞剥離液処理工程から回収工程までを繰り返す繰り返し工程を含むこともできる。以下、各工程を具体的に説明する。
（細胞剥離液処理工程）
　本態様において細胞剥離液処理工程は、培養容器に細胞剥離液を加えて細胞を細胞剥離液で処理する工程である。
　本明細書において「細胞剥離液」は、細胞剥離作用を有する成分（以下、「細胞剥離成分」という）を少なくとも１種類含む液体である。細胞剥離液に含まれる細胞剥離成分は、酵素的剥離及び／又は化学的剥離に用いられる成分であればよく、酵素的剥離であればトリプシン、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ、コラゲナーゼ、アキュターゼ、プロナーゼ、パパイン、及びディスパーゼ等のプロテアーゼ、及び／又はＤＮａｓｅ　Ｉ等のヌクレアーゼ、化学的剥離であれば、キレート剤（例えばＥＤＴＡ又はＥＧＴＡ）、又はカルシウムイオンやマグネシウムイオンを結合し得る塩（例えばリン酸塩又は炭酸塩）を使用することができる。リン酸塩を含む水溶液として、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用することもできる。また、複数の細胞剥離成分を組み合わせてもよく、例えばトリプシンとコラゲナーゼを含む剥離剤としてＣＴＫを使用することもできる。
　細胞剥離液における細胞剥離成分の濃度は、限定しない。例えば、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔであれば、１０×ＴｒｙｐＬＥ　ＳｅｌｅｃｔをＰＢＳで５倍希釈した２×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ／ＰＢＳ、１×ＴｒｙｐＬＥ　ＳｅｌｅｃｔをＮｕｅｒｏｂａｓａｌ　ｐｌｕｓ　Ｍｅｄｉｕｍで２倍希釈した０．５×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ／ＮｂＭを使用することができる。例えば、細胞が人工多能性幹細胞である場合、２×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを含む細胞剥離液を使用することができる。また、キレート剤であれば、０．１ｍＭ以上のＥＤＴＡを含む緩衝液（例えば１ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ又は０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ）や、０．１Ｍ　ＥＧＴＡを含む緩衝液を使用することができる。
　一実施形態において、細胞剥離液は、上記の細胞剥離成分に加えてＹ－２７６３２等のＲＯＣＫ特異的阻害剤を含んでもよい。ＲＯＣＫ特異的阻害剤を添加することによって、ｉＰＳ細胞等の幹細胞の細胞死を防ぐことができる。
　細胞剥離液成分の種類と濃度は、剥離する細胞の種類に応じて適宜選択することができる。ｉＰＳ細胞の剥離には、例えば１０ｎＭ　Ｙ－２７６３２を含む２×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ／ＰＢＳを用いることができる。誘導神経細胞等の神経細胞の剥離には、例えば１×ＴｒｙｐＬＥ　ＳｅｌｅｃｔとＮｅｕｒｏｂａｓａｌ　ｐｌｕｓ　Ｍｅｄｉｕｍとを８：７の比率で混合した剥離液を使用することができる。
　細胞剥離液処理工程において細胞剥離液で細胞を処理する時間は、上記の細胞剥離成分の活性や濃度によって、適宜設定すればよい。例えば、３０秒間以上、１分間以上、２分間以上、３分間以上、５分間以上、１０分間以上、１５分間以上、２０分間以上、３０分間以上、４５分間以上、１時間以上、かつ／又は６時間以下、５時間以下、４時間以下、３時間以下、例えば、１分間～２時間、１分間～１時間、１分間～３０分間、１０分間～２０分間、又は１５分間～１８分間であってもよい。
　細胞剥離液処理工程において細胞剥離液で細胞を処理する温度は、細胞剥離成分が剥離活性を有する温度であり、細胞の品質に大きく影響しない温度であればよく、例えば１５℃～４５℃、２０℃～４２℃、２５℃～４０℃、３０℃～３９℃、３５℃～３８℃、又は３６℃～３７℃であってもよい。
　一実施形態において、本工程では培養容器を揺動することができる。揺動の条件は、細胞の剥離をさらに促進し得るものであれば、特に限定しない。揺動の振幅は、限定しないが、例えば１ｍｍ以上、２ｍｍ以上、３ｍｍ以上、４ｍｍ以上、５ｍｍ以上、１０ｍｍ以上、若しくは２０ｍｍ以上、及び／又は１００ｍｍ以下、９０ｍｍ以下、８０ｍｍ以下、７０ｍｍ以下、６０ｍｍ以下、５０ｍｍ以下、４０ｍｍ以下、若しくは３０ｍｍ以下であってもよく、例えば１ｍｍ～４ｍｍ、２ｍｍ又は３ｍｍであってもよい。揺動の振動数は、限定しないが、例えば、０．５Ｈｚ以上、１Ｈｚ以上、２Ｈｚ以上、３Ｈｚ以上、若しくは４Ｈｚ以上、４０Ｈｚ以下、３０Ｈｚ以下、２０Ｈｚ以下、１０Ｈｚ以下、若しくは５Ｈｚ以下であってもよく、例えば１Ｈｚ～１０Ｈｚ又は１Ｈｚ～８．５Ｈｚであってもよい。
　細胞剥離液処理工程に供する細胞のコンフルエンシーは、限定しないが、十分量の細胞を回収可能であり、かつ細胞が良好な生育状態を維持できる範囲が好ましい。具体的には、例えば、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、若しくは９０％以上、かつ／又は１００％未満、９９％未満、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、若しくは９２％未満であってもよい。好ましくは、コンフルエンシーは８０％以上１００％未満であり、例えば８０％～９８％、８５％～９５％、又は９０％～９２％であってもよい。上記範囲のコンフルエンシーに対応する具体的な細胞密度範囲として、１×１０４細胞／ｃｍ２～１００×１０４細胞／ｃｍ２、５×１０４細胞／ｃｍ２～８０×１０４細胞／ｃｍ２、１０×１０４細胞／ｃｍ２～６０×１０４細胞／ｃｍ２、又は２０×１０４細胞／ｃｍ２～４０×１０４細胞／ｃｍ２が挙げられる。好ましい細胞密度範囲の一例は、２１×１０４細胞／ｃｍ２～３５×１０４細胞／ｃｍ２である。一実施形態において、細胞は幹細胞（例えば人工多能性幹細胞）であり、その細胞密度範囲は２１×１０４細胞／ｃｍ２以上であってもよい。
　一実施形態において、本工程は実験者が行うことができる。
　別の実施形態において、本工程は装置（例えば、後述の第３態様に記載の細胞剥離機構搭載装置）を用いて行うことができる。
　細胞剥離液処理工程により細胞と培養容器表面との間の接着力が低下するが、一部又は全部の細胞が培養容器表面から完全には剥離していないことが好ましい。
（細胞剥離液除去工程）
　本態様において細胞剥離液除去工程は、細胞剥離成分を除去する、又は失活させることを目的として、上記細胞剥離液処理工程と後述の剥離工程との間で細胞剥離液を除去する選択的工程である。本態様の方法が本工程を含む場合、細胞剥離成分が後の工程で作用することを防ぎ、細胞へのダメージを防ぐことができるため好ましい。
　細胞剥離液の除去方法は特に限定せず、細胞が一緒に除去されない方法であればよい。例えば、吸引やデカンテーションにより除去してもよい。
　細胞剥離成分を失活させる方法は、細胞剥離成分の種類に応じて公知の方法から適宜選択することができる。例えば、細胞剥離成分がプロテアーゼであれば、プロテアーゼ阻害剤（例えばトリプシンインヒビター等）や血清含有培地等のプロテアーゼ不活性化液を添加してもよい。
　一実施形態において、本工程は実験者が行うことができる。
　別の実施形態において、本工程は装置（例えば、後述の第３態様に記載の細胞剥離機構搭載装置）を用いて行うことができる。
（剥離工程）
　本態様において剥離工程は、上記細胞剥離液処理工程後の細胞に対して吐出液を吐出して、培養容器表面から細胞を剥離する工程である。
　本明細書において「吐出液」とは、上述の細胞剥離液処理工程で接着力が弱まった細胞（本明細書において「残余接着細胞」と表記する場合がある）に対して吐出される液体をいう。吐出液の種類は、特に限定しない。上述の細胞剥離液と同じものを使用することもできるが、プロテアーゼ等の分解酵素を含まない液体であることが好ましく、例えばＰＢＳ等の緩衝液や任意の培地を用いることもできる。培地は特に限定せず、市販培地を使用してもよい。一例を挙げればＤＭＥＭ培地、ハムＦ１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地、イーグルＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地等を使用してもよい。一実施形態では、上述の細胞剥離液と同じ組成を有する吐出液が使用される。
　剥離工程では、吐出液を吐出する線速度は３００ｍｍ／秒～１５００ｍｍ／秒である。本明細書において「線速度」とは吐出液が吐出口を通過する速度を指す。吐出液の線速度は、単位時間当たりに吐出口を通過する吐出液の量を吐出口の断面積で割ることで計算することができる。剥離工程において吐出液を吐出する線速度は３００ｍｍ／秒～１５００ｍｍ／秒であればよく、例えば３００ｍｍ／秒～１４００ｍｍ／秒、３５０ｍｍ／秒～１３００ｍｍ／秒、４００ｍｍ／秒～１２００ｍｍ／秒、又は５００ｍｍ／秒～１１００ｍｍ／秒であってもよく、好ましくは５５０ｍｍ／秒～１０５０ｍｍ／秒である。さらなる線速度の例として、４００ｍｍ／秒～７００ｍｍ／秒若しくは５００ｍｍ／秒～６００ｍｍ／秒、７００ｍｍ／秒～１０００ｍｍ／秒若しくは８００ｍｍ／秒～９００ｍｍ／秒、７００ｍｍ／秒～１１００ｍｍ／秒若しくは８００ｍｍ／秒～１０００ｍｍ／秒、又は８００ｍｍ／秒～１２００ｍｍ／秒若しくは９００ｍｍ／秒～１１００ｍｍ／秒が例示される。
　一実施形態において、細胞は幹細胞（例えば人工多能性幹細胞）であり、剥離工程において吐出液を吐出する線速度は３００ｍｍ／秒～１５００ｍｍ／秒、好ましくは４００ｍｍ／秒～１２００ｍｍ／秒、５００ｍｍ／秒～１１００ｍｍ／秒、又は５５０ｍｍ／秒～１０５０ｍｍ／秒であり、さらなる線速度の例として、４００ｍｍ／秒～７００ｍｍ／秒若しくは５００ｍｍ／秒～６００ｍｍ／秒、７００ｍｍ／秒～１０００ｍｍ／秒若しくは８００ｍｍ／秒～９００ｍｍ／秒、又は８００ｍｍ／秒～１２００ｍｍ／秒若しくは９００ｍｍ／秒～１１００ｍｍ／秒が例示される。
　一実施形態において、細胞は神経細胞（例えば人工多能性幹細胞から分化誘導された神経細胞）であり、剥離工程において吐出液を吐出する線速度は５００ｍｍ／秒～１１００ｍｍ／秒又は５５０ｍｍ／秒～１０５０ｍｍ／秒であってもよく、或いは３００ｍｍ／秒～８５０ｍｍ／秒、４００ｍｍ／秒～８００ｍｍ／秒、又は４００ｍｍ／秒～７００ｍｍ／秒であってもよく、さらなる線速度の例として、４００ｍｍ／秒～７００ｍｍ／秒若しくは５００ｍｍ／秒～６００ｍｍ／秒、７００ｍｍ／秒～１０００ｍｍ／秒若しくは８００ｍｍ／秒～９００ｍｍ／秒、７００ｍｍ／秒～１１００ｍｍ／秒若しくは８００ｍｍ／秒～１０００ｍｍ／秒、又は８００ｍｍ／秒～１２００ｍｍ／秒若しくは９００ｍｍ／秒～１１００ｍｍ／秒が例示される。
　本態様の一実施形態では、培養容器表面にスポット状に吐出液を吐出することができる。「スポット状に吐出液を吐出する」（以下「スポット状吐出」とも表記する）とは、吐出位置を変えずに同じ位置で一定時間吐出する吐出方法、又は同じ位置で一定時間吐出した後に吐出位置を移動して一定時間吐出することを繰り返す吐出方法をいう。スポット状吐出では、吐出液を吐出した位置から一定距離の範囲内に含まれる細胞が剥離される。
　剥離工程においてスポット状吐出を行う場合、隣接するスポットの中心間距離は、４ｍｍ～３３ｍｍである。「隣接するスポットの中心間距離」（以下、単に「中心間距離」とも表記する）とは、吐出液を吐出する複数の位置の間の距離を意味する。中心間距離は４ｍｍ～３３ｍｍの範囲で適宜設定することができる。より具体的には、中心間距離は４ｍｍ以上、４．５ｍｍ以上、５ｍｍ以上、６ｍｍ以上、７ｍｍ以上、８ｍｍ以上、９ｍｍ以上、１０ｍｍ以上、１１ｍｍ以上、１２ｍｍ以上、１３ｍｍ以上、１４ｍｍ以上、１５ｍｍ以上、１６ｍｍ以上、２０ｍｍ以上、２５ｍｍ以上、若しくは２８ｍｍ以上、及び／又は３３ｍｍ以下、２８ｍｍ以下、２５ｍｍ以下、２０ｍｍ以下、１６ｍｍ以下、１５ｍｍ以下、１４ｍｍ以下、１３ｍｍ以下、１２ｍｍ以下、１１ｍｍ以下、１０ｍｍ以下、９ｍｍ以下、８ｍｍ以下、７ｍｍ以下、６ｍｍ以下、若しくは５．５ｍｍ以下であってもよい。一実施形態において、中心間距離は、４ｍｍ～３０ｍｍ、４ｍｍ～２８ｍｍ、４ｍｍ～２５ｍｍ、４ｍｍ～２２ｍｍ、４ｍｍ～２１ｍｍ、４ｍｍ～２０ｍｍ、５ｍｍ～１９ｍｍ、６ｍｍ～１８ｍｍ、７ｍｍ～１７ｍｍ、８ｍｍ～１６ｍｍ、９ｍｍ～１５ｍｍ、１０ｍｍ～１４ｍｍ、又は１１ｍｍ～１３ｍｍであってもよい。さらなる一実施形態において、中心間距離は４ｍｍ～１５ｍｍ、４ｍｍ～１２ｍｍ、４ｍｍ～１０ｍｍ、４ｍｍ～９ｍｍ、４ｍｍ～８ｍｍ、４ｍｍ～７ｍｍ、４ｍｍ～６ｍｍ、又は４．５ｍｍ～５．５ｍｍであってもよい。好適な中心間距離は、剥離する細胞の種類、使用する剥離に含まれる細胞剥離成分の種類及び濃度、並びに吐出線速度等によって適宜選択することができる。例えば、ｉＰＳ細胞を２×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ＋１０ｎＭ　Ｙ－２７６３２等で剥離する場合、４００ｍｍ／秒～６００ｍｍ／秒の線速度であれば１０ｍｍ～１９ｍｍの中心間距離、又は６００ｍｍ／秒～１２００ｍｍ／秒の線速度であれば４ｍｍ～１８ｍｍの中心間距離とすることができる。
　一実施形態において、スポット状吐出の１回の吐出液量は、１０００μＬ以下、７５０μＬ以下、若しくは５００μＬ以下、及び／又は２０μＬ以上、５０μＬ以上、若しくは１００μＬであってもよく、例えば５００μＬ、２５０μＬ、１００μＬであってもよい。また、スポット状吐出の１回の吐出時間は１０秒以下、５秒以下、若しくは１秒以下、及び／又は０．０１秒以上、０．１秒以上、若しくは０．５秒以上であってもよく、例えば１．０秒、１．５秒、又は２．０秒であってもよい。
　本態様の一実施形態では、培養容器表面に設定した線状路上に吐出液を連続して吐出することができる（以下、「線状路上への吐出」とも表記する）。本明細書で「線状路」とは、線状形態を示す吐出位置である。ここでいう「線状形態」とは、１本のレール状形態をいう。線状路上への吐出では、培養容器表面に設定した４ｍｍ～３３ｍｍ間隔の線状路上に吐出液が連続して吐出される。「４ｍｍ～３３ｍｍ間隔の線状路」とは、線状路は１本の線状路内の異なる部分が４ｍｍ～３３ｍｍ間隔で設定されていること、及び／又は複数の線状路が４ｍｍ～３３ｍｍの間隔が設定されていることをいう。より具体的には、線状路は４ｍｍ以上、４．５ｍｍ以上、５ｍｍ以上、６ｍｍ以上、７ｍｍ以上、８ｍｍ以上、９ｍｍ以上、１０ｍｍ以上、１１ｍｍ以上、１２ｍｍ以上、１３ｍｍ以上、１４ｍｍ以上、１５ｍｍ以上、１６ｍｍ以上、２０ｍｍ以上、２５ｍｍ以上、若しくは２８ｍｍ以上、及び／又は３３ｍｍ以下、２８ｍｍ以下、２５ｍｍ以下、２０ｍｍ以下、１６ｍｍ以下、１５ｍｍ以下、１４ｍｍ以下、１３ｍｍ以下、１２ｍｍ以下、１１ｍｍ以下、１０ｍｍ以下、９ｍｍ以下、８ｍｍ以下、７ｍｍ以下、６ｍｍ以下、若しくは５．５ｍｍ以下の間隔であってもよい。一実施形態において、線状路は４ｍｍ～３３ｍｍ間隔であればよく、例えば４ｍｍ～３０ｍｍ、４ｍｍ～２８ｍｍ、４ｍｍ～２５ｍｍ、４ｍｍ～２２ｍｍ、４ｍｍ～２１ｍｍ、４ｍｍ～２０ｍｍ、５ｍｍ～１９ｍｍ、６ｍｍ～１８ｍｍ間隔、７ｍｍ～１７ｍｍ間隔、８ｍｍ～１６ｍｍ間隔、９ｍｍ～１５ｍｍ間隔、１０ｍｍ～１４ｍｍ間隔、又は１１ｍｍ～１３ｍｍ間隔であってもよい。さらなる一実施形態において、線状路は６ｍｍ～３３ｍｍの間隔であり、例示的なさらなる範囲として６ｍｍ～２０ｍｍ、１０ｍｍ～３３ｍｍ、９ｍｍ～３０ｍｍ、６ｍｍ～１６ｍｍ、８ｍｍ～１４ｍｍ、１０ｍｍ～１２ｍｍ、１０ｍｍ～２０ｍｍ、１２ｍｍ～１８ｍｍ、１４ｍｍ～１６ｍｍ、２３ｍｍ～３３ｍｍ、２５ｍｍ～３１ｍｍ、又は２７ｍｍ～２９ｍｍの間隔が挙げられる。
　線状路間の好適な間隔は、吐出線速度に応じて適宜選択することができる。例えば３００ｍｍ／秒～８５０ｍｍ／秒の線速度であれば１０ｍｍ～１９ｍｍの間隔、８５０ｍｍ／秒～１５００ｍｍ／秒の線速度であれば４ｍｍ～１０ｍｍの間隔を用いることができる。特に細胞剥離液と同じ組成を有する吐出液を使用する場合、細胞剥離成分に基づく酵素的剥離及び／又は化学的剥離が、吐出液の吐出に基づく物理的剥離と同時に進行し得る。物理的剥離の作用は線速度が速いほどが向上し得る一方、酵素的剥離及び／又は化学的剥離の作用は線速度が遅いほど細胞剥離液が吐出位置により長く留まり有利となり得るため、両方の作用が十分に得られる線速度であることが好ましい。
　また、線状路上への吐出では、培養容器に対する吐出口の位置を移動させながら吐出が行われる。吐出口の移動速度は、限定しないが、例えば０．１ｍｍ／秒以上、０．５ｍｍ／秒以上、１ｍｍ／秒以上、２ｍｍ／秒、５ｍｍ／秒以上、若しくは１０ｍｍ／秒以上、及び／又は５０ｍｍ／秒以下、４０ｍｍ／秒以下、若しくは３０ｍｍ／秒以下であってもよく、例えば２０ｍｍ／秒、２２．７ｍｍ／秒、又は２５ｍｍ／秒であってもよい。
　線状路上への吐出の１回の吐出液量は、例えば０．１ｍＬ～２０ｍＬ、０．５ｍＬ～１０ｍＬ、又は１ｍＬ～４．５ｍＬであってよい。また、線状路上への吐出の１回の吐出時間は、例えば０．１秒～１０秒、０．５秒～５秒、又は０．５秒～３秒であってもよい。
　さらなる実施形態において、吐出液は上述のスポット状吐出と線状路上への吐出を組み合わせて吐出することができる。例えば、培養容器表面においてスポット状吐出と線状路上への吐出を交互に行うことで細胞を効率的に剥離することができる。
　一実施形態において、細胞は幹細胞（例えば人工多能性幹細胞）であり、隣接するスポットの中心間距離は４ｍｍ～２０ｍｍであり、及び／又は線状路間の間隔は４ｍｍ～２０ｍｍであり、好ましくは隣接するスポットの中心間距離は４ｍｍ～１５ｍｍであり、及び／又は線状路間の間隔は４ｍｍ～１５ｍｍである。
　さらなる一実施形態において、細胞は幹細胞（例えば人工多能性幹細胞）であり、吐出液を吐出する線速度、隣接するスポットの中心間距離、及び線状路間の間隔は、上述した範囲の任意の組合せから選択することができる。組合せの一例を挙げれば、限定するものではないが、線速度は５００ｍｍ／秒～１１００ｍｍ／秒であり、中心間距離は４ｍｍ～８ｍｍ、４ｍｍ～７ｍｍ、４ｍｍ～６ｍｍ、又は４．５ｍｍ～５．５ｍｍであり、線状路間の間隔は６ｍｍ～３３ｍｍ、９ｍｍ～３０ｍｍ、又は９ｍｍ～１７ｍｍであってもよい。
　一実施形態において、細胞は神経細胞（例えば人工多能性幹細胞から分化誘導された神経細胞）であり、隣接するスポットの中心間距離は２３ｍｍ～３３ｍｍであり、及び／又は線状路間の間隔は２３ｍｍ～３３ｍｍであり、好ましくは隣接するスポットの中心間距離は２５ｍｍ～３０ｍｍであり、及び／又は線状路間の間隔は２５ｍｍ～３０ｍｍである。
　さらなる一実施形態において、細胞は神経細胞（例えば人工多能性幹細胞から分化誘導された神経細胞）であり、吐出液を吐出する線速度、隣接するスポットの中心間距離、及び線状路間の間隔は、上述した範囲の任意の組合せから選択することができる。組合せの一例を挙げれば、限定するものではないが、線速度は５００ｍｍ／秒～１１００ｍｍ／秒、５００ｍｍ／秒～１０００ｍｍ／秒、又は５００ｍｍ／秒～６００ｍｍ／秒であり、中心間距離は４ｍｍ～８ｍｍ、４ｍｍ～７ｍｍ、４ｍｍ～６ｍｍ、又は４．５ｍｍ～５．５ｍｍであり、線状路間の間隔は６ｍｍ～３３ｍｍ、６ｍｍ～１６ｍｍ、又は２３ｍｍ～３３ｍｍであってもよい。
　本工程で吐出する吐出液の総量は、限定しない。例えば１ｍＬ～１００ｍＬ、２ｍＬ～５０ｍＬ、３ｍＬ～３０ｍＬ、５ｍＬ～２０ｍＬ、又は７ｍＬ～１５ｍＬであってもよい。
　本工程で吐出液を吐出する際の培養容器表面は、水平方向に保持されていてもよく、又は水平方向に対して一定の傾斜角度で保持されていてもよい。水平方向に対する培養容器表面の傾斜角度の範囲は、限定しないが、例えば０度～４５度、１度～３０度、又は１度～２０度であってもよく、好ましくは１０度である。
　また、本工程では、吐出角度は、限定しない。本明細書において「吐出角度」とは、細胞が接着した培養容器表面に対して吐出する角度を意味し、０度～９０度の範囲で表記する。したがって、例えば９５度～１０５度は７５度～８５度と同義である。具体的な吐出角度は９０度（垂直方向）であっても、垂直方向から傾斜した角度であってもよい。より具体的には、吐出角度は、例えば、４５度～９０度、５０度～９０度、５５度～９０度、６０度～９０度、６５度～９０度、７０度～９０度、又は７５度～８５度、好ましくは７９．５度～８０．５度又は８０度であってもよい。
　吐出液を吐出する吐出口の口径は、隣接するスポット又は線状路が互いに重なり合わない範囲であれば、限定しない。例えば、０．０５ｍｍ以上、０．１ｍｍ以上、若しくは０．３ｍｍ以上、及び／又は５．０ｍｍ以下、４．５ｍｍ以下、４．０ｍｍ以下、３．５ｍｍ以下、３．０ｍｍ以下、２．５ｍｍ以下、２．０ｍｍ以下であってもよく、好ましくは０．０５ｍｍ～５ｍｍ、０．０５ｍｍ～４ｍｍ、０．０５ｍｍ～３ｍｍ、０．１ｍｍ～２．０ｍｍ若しくは０．３ｍｍ～１．５ｍｍである。
　一実施形態において、本工程は実験者が行うことができる。
　別の実施形態において、本工程は装置（例えば、後述の第３態様に記載の細胞剥離機構搭載装置）を用いて行うことができる。
（回収工程）
　本態様において回収工程は、上記剥離工程後の細胞を培養容器から回収する選択的工程である。
　本工程において、培養容器から細胞を回収する方法は限定しない。例えば、細胞を含む細胞懸濁液を吸引やデカンテーションにより回収してもよい。吸引する場合は、培養容器を傾けることによって特定の方向に集めた細胞懸濁液を吸引することもできる。
　細胞懸濁液から細胞を回収する位置は限定しない。例えば、剥離した細胞を含む細胞懸濁液の液面から回収してもよいし、液中から回収してもよく、液面及び液中を含む複数の位置から回収してもよい。
　本工程で回収する細胞数は、限定しないが、例えば、１×１０５個以上、１×１０６個以上、又は１０×１０６個以上、好ましくは１５×１０６個以上である。また、本工程で回収する細胞の生存率は、限定しないが、例えば７０％以上、８０％以上、又は９０％以上であることが好ましく、例えば９２％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上である。
　一実施形態において、本工程は実験者が行うことができる。
　別の実施形態において、本工程は装置（例えば、後述の第３態様に記載の細胞剥離機構搭載装置）を用いて行うことができる。
（繰り返し工程）
　本態様において繰り返し工程は、上記の細胞剥離液処理工程から回収工程までを繰り返す選択的工程である。上記の細胞剥離液処理工程から回収工程と、繰り返し工程で剥離し回収する細胞種は、同一であっても異なっていてもよい。例えば、上記の細胞剥離液処理工程から回収工程では、幹細胞を剥離及び回収し、繰り返し工程では、幹細胞を分化誘導して得られた前駆細胞や分化細胞を剥離し回収してもよい。本工程の繰り返し回数は限定しない。
　一実施形態において、本工程は実験者が行うことができる。
　別の実施形態において、本工程は装置（例えば、後述の第３態様に記載の細胞剥離機構搭載装置）を用いて行うことができる。
１－４．効果
　本態様の細胞剥離方法によれば、培養容器から高い回収率及び生存率で細胞を剥離及び回収することができる。例えば、患者から採取した細胞を初期化して得られるｉＰＳ細胞、前駆細胞、及び／又は分化細胞について、接着培養後に高い回収率及び生存率で細胞を剥離及び回収することができる。
　一般的に細胞密度の高い接着細胞は、培養容器からの剥離が困難であることが知られている。本態様の細胞剥離方法によれば、高コンフルエンシーの接着細胞であっても培養容器から効率的に回収することができる。
　また、本態様の細胞剥離方法で回収したｉＰＳ細胞等の幹細胞は、細胞へのダメージが低減されており、均一性が高く、分化能が維持されている。
　また、本態様における工程の全部又は一部を装置（例えば、後述の第３態様に記載の細胞剥離機構搭載装置）を用いて行うことによって、実験者の熟練した手技を要することなく、効率的かつ再現性よく細胞を剥離及び回収することができる。
２．分化細胞の生産方法
２－１．概要
　本発明の第２の態様は、接着性の幹細胞から分化細胞を生産する方法（以下、「分化細胞の生産方法」とも表記する）である。本態様の分化細胞の生産方法は、培養した接着性の幹細胞を第１態様の細胞剥離方法により剥離し、さらに分化誘導して得られる前駆細胞及び／又は分化細胞を培養して第１態様の細胞剥離方法により剥離することを含む。本態様の生産方法によれば、接着性の幹細胞から分化細胞を効率的に生産することができる。
２－２．方法
　本態様の分化細胞の生産方法は、第１培養工程、第１細胞剥離液処理工程、第１剥離工程、第１回収工程、分化誘導工程、第２培養工程、第２細胞剥離液処理工程、及び第２剥離工程を必須工程として含み、第２回収工程及び／又は播種工程を選択工程として含む。以下、各工程を具体的に説明する。
（第１培養工程）
　本態様において第１培養工程は、第１培養容器において接着性の幹細胞を接着培養する第１培養工程である。
　本工程で培養する幹細胞は、接着性の幹細胞であれば限定しない。例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、ＭＳ細胞、又は神経幹細胞であってもよい。一実施形態において、ｉＰＳ細胞は、ヒト患者に由来する。例えば、家族性ＡＤ患者由来ｉＰＳ細胞、孤発性ＡＤ患者由来ｉＰＳ細胞、又は健常高齢者由来ｉＰＳ細胞であってもよい。
　また、本工程における温度、ＣＯ２濃度、培養期間、及び培地交換頻度等の培養条件は、限定しない。例えば、３７℃、５％ＣＯ２で静置培養し、２日毎に半量ずつ培地交換し、細胞の増殖状況によって１日間～１００日間、１日間～４０日間、例えば２日間～３０日間、３日間～２０日間、４日間～１０日間、又は５日間～８日間培養してもよい。
　培養に用いる培地は、公知の培地を適宜選択して用いることができる。例えば、任意の動物細胞培養用液体培地を基礎培地とし、必要に応じて他の成分（血清、血清代替試薬、増殖因子等）を適宜添加することにより調製することができる。基礎培地としては、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＮＢｐ培地、及びこれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、又はＮＢｐＤＹ培地）等の培地を使用することができるが、特に限定されない。基礎培地に添加する他の成分の例としては、Ｙ－２７６３２等のＲＯＣＫ特異的阻害剤や、ドキシサイクリンが挙げられる。
　また、上記の培養に用いる培地は、一般的に市販されている無血清培地を用いても良い。例えば、ＳＴＫ１やＳＴＫ２（ＤＳファーマバイオメディカル社）、ＥＸＰＲＥＰ　ＭＳＣ　Ｍｅｄｉｕｍ（バイオミメティクスシンパシーズ社）、Ｃｏｒｎｉｎｇ　ｓｔｅｍｇｒｏヒト間葉系幹細胞培地（コーニング社）等が挙げられるが、特に限定されない。基礎培地に対して添加する他の成分としては、例えば、アルブミン、血清、血清代替試薬又は増殖因子等が挙げられる。
　また、培養する幹細胞がｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であれば、市販の霊長類ＥＳ細胞用培地又は霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地等を用いてもよい。これらの培地には、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の培養に適する公知の添加物、例えば、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７（Ｒ）サプリメント、インシュリン、ｂＦＧＦ、アクチビンＡ、ヘパリン、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）インヒビター、及び／又はＧＳＫ－３インヒビター等の添加物を添加してもよい。
（第１細胞剥離液処理工程）
　本態様において第１細胞剥離液処理工程は、第１培養容器に第１細胞剥離液を加えて幹細胞を第１細胞剥離液で処理する工程である。本工程は第１態様に記載の細胞剥離液除去工程に準じて行うことができる。そのため、ここでの詳細な説明は省略する。
（第１剥離工程）
　本態様において第１剥離工程は、第１細胞剥離液処理工程後の幹細胞に対して第１吐出液を吐出して、第１培養容器表面から幹細胞を剥離する工程である。本工程は第１態様に記載の剥離工程に準じて行うことができる。そのため、ここでの詳細な説明は省略する。
（第１回収工程）
　本態様において第１回収工程は、第１剥離工程後に幹細胞を回収する工程である。本工程は第１態様に記載の回収工程に準じて行うことができる。そのため、ここでの詳細な説明は省略する。
（分化誘導工程）
　本態様において分化誘導工程は、第１回収工程で回収した幹細胞に分化誘導剤を加える工程である。
　本明細書において「分化誘導」とは、分化能を有する細胞に対して分化を進行させることを指し、前駆細胞等の分化の途上の状態まで分化させることや、前駆細胞からさらに分化が進んだ分化細胞まで分化させることを包含する。本工程においては、幹細胞を前駆細胞及び／又は分化細胞に分化させることをいう。
　本明細書において「分化誘導剤」とは、幹細胞から前駆細胞及び／又は分化細胞への分化を誘導する活性を有する薬剤をいう。本工程においては、幹細胞の前駆細胞及び／又は分化細胞への分化を誘導する活性を有する薬剤が該当する。分化誘導剤は低分子化合物又はタンパク質等の高分子のいずれであってもよい。
　一実施形態において、分化誘導剤は神経誘導剤である。神経誘導剤の具体例として、Ｓｈｈタンパク質、ＮＧＦタンパク質、Ｎｏｇｇｉｎタンパク質、Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎタンパク質、ＮＴ－３タンパク質、ＮＴ－４タンパク質、ＨＧＦタンパク質の他、ＧＳＫ－３阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）、γ－セクレターゼ阻害剤（例えばＤＡＰＴ）、及び１７－β－Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ等が挙げられる。
　具体的な分化誘導方法の例としては、分化誘導剤を添加した培地中で幹細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件下にて静置培養し、２～３日目に半量培地交換、又は全量培地交換し、細胞の増殖状況によって１日間～４０日間、例えば２日間～３０日間、３日間～２０日間、４日間～１０日間、又は５日間～８日間培養することによって、前駆細胞及び／又は分化細胞への分化を誘導することができる。
　本態様の方法が後述の播種工程後に第２分化誘導工程を含む場合、本工程を「第１分化誘導工程」ということもできる。
（第２培養工程）
　本態様において第２培養工程は、分化誘導工程で得られた前駆細胞及び／又は分化細胞を第２培養容器において培養する工程である。本工程は上述の第１培養工程に準じて行うことができる。そのため、ここでの詳細な説明は省略する。
（第２細胞剥離液処理工程）
　本態様において第２細胞剥離液処理工程は、第２培養容器に第２細胞剥離液を加えて前駆細胞及び／又は分化細胞を第２細胞剥離液で処理する工程である。本工程は第１態様に記載の細胞剥離液処理工程に準じて行うことができる。そのため、ここでの詳細な説明は省略する。
（第２剥離工程）
　本態様において第２剥離工程は、第２細胞剥離液処理後の前駆細胞及び／又は分化細胞に対して第２吐出液を吐出して、第２培養容器表面から前駆細胞及び／又は分化細胞を剥離する工程である。本工程は第１態様に記載の剥離工程に準じて行うことができる。そのため、ここでの詳細な説明は省略する。
（第２回収工程）
　本態様において第２回収工程は、第２剥離工程後の前駆細胞及び／又は分化細胞を回収する選択的工程である。本工程は第１態様に記載の回収工程に準じて行うことができる。そのため、ここでの詳細な説明は省略する。
　本工程で回収された細胞又は細胞塊は、播種前に必要に応じて懸濁することもできる。例えば４５０μＬ／秒以上のピペッティングを２回以上（例えば１０回以上）繰り返し、単一細胞に分散させることによって、均一な細胞懸濁液を調製することができるため好ましい。
（播種工程）
　本態様において播種工程は、第２回収工程で回収した前駆細胞及び／又は分化細胞をマルチウェルプレート等の培養容器に播種する選択的工程である。
　本工程において播種方法は限定しない。細胞培養分野で一般的に使用される方法のように、ピペット等を用いて細胞塊を含む溶液の一部を採取し、新たな培地を入れたマルチウェルプレート等の培養容器に播種すればよい。細胞を新たな培地に播種する際には、新たな培地を入れた培養容器を培養温度下に配置して、培地を予熱しておくことが好ましい。
　播種量は限定しない。新たな培地の容量や、培養開始時の所望する細胞濃度、培養すべき対象細胞の種類等を勘案し、適宜定めればよい。例えば、マルチウェルプレートの各ウェル当たりの細胞数は、１万細胞／ウェル～１０万細胞／ウェル、２万細胞／ウェル～９万細胞／ウェル、又は３万細胞／ウェル～８万細胞／ウェル、又は４万細胞／ウェル～６万細胞／ウェルであってもよい。より具体的な播種量は、９６ウェルプレートであれば４万細胞／ウェル～１０万細胞／ウェル、３８４ウェルプレートであれば、１万細胞／ウェル～２．５万細胞／ウェルであってもよい。具体的には、以下の（式Ｉ）で総細胞数を計算し、式（ＩＩ）で細胞懸濁液の総液量を計算することができる。
　総細胞数　＝　Ａ×Ｂ×Ｃ＋Ｄ　　　　　（式Ｉ）
（式中、「Ａ」はマルチウェルプレートの作製枚数であり、「Ｂ」はウェル当たりの播種細胞数である。「Ｃ」は１枚のマルチウェルプレートに含まれるウェル数に応じて決定される数値であり、例えば９６ウェルプレートであれば「１００」、３８４ウェルプレートであれば「４００」等の所定値を使用することができる。「Ｄ」は余剰細胞数であり、例えばＢ×Ｃ／２で計算される数値を用いることができる。）
　総液量　＝　Ａ×Ｅ×Ｃ＋Ｆ　　　　　　（式ＩＩ）
（式中、「Ａ」はマルチウェルプレートの作製枚数であり、「Ｅ」はウェル当たりの播種液量である。「Ｃ」は１枚のマルチウェルプレートに含まれるウェル数に応じて決定される数値であり、例えば９６ウェルプレートであれば「１００」、３８４ウェルプレートであれば「４００」等の所定値を使用することができる。「Ｆ」は余剰液量であり、例えばＥ×Ｃ／２で計算される数値を用いることができる。）
　細胞懸濁液をマルチウェルプレートに播種後、容器を軽く揺する等して、播種した細胞が容器内である程度均一に分散されるようにするとよい。
　本工程で播種した前駆細胞及び／又は分化細胞は第１培養工程と同様の方法で培養することができる。
　本工程によって播種された細胞（例えばマルチウェルプレートの各ウェルにおける細胞）は、細胞生存率等の品質についてＣＶ値２０％以下又は１５％以下、好ましくは１０％以下の均一性を示し得る。
　本工程において播種した前駆細胞は分化細胞となり得る。例えば、過培養によって分化細胞となり得る。しかし、必要な場合には分化誘導剤を加える第２分化誘導工程を行って分化誘導を促進してもよい。
　また、前駆細胞及び／又は分化細胞をマルチウェルプレート等の培養容器に播種する際には、必要に応じて培養容器からコーティング剤を除去し、ＰＢＳ等で洗浄してもよい。
２－３．効果
　本態様の分化細胞の生産方法によれば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、又はＭＳ細胞等の接着性の幹細胞から神経細胞等の分化細胞を効率的に生産することができる。
　また、本態様における全工程又は一部の工程を装置（例えば、後述の第３態様に記載の細胞剥離機構搭載装置）を用いて行うことによって、実験者の負担を軽減して、効率的かつ再現性よく分化細胞を生産することができる。
　本態様の分化細胞の生産方法によれば、ＣＶ値１０％以下の均一性の高い細胞を含むマルチウェルプレートを作製することができる。当該マルチウェルプレートを使用することにより、測定精度が高く、再現性の高い細胞アッセイが可能となる。
３．細胞剥離機構搭載装置
３－１．概要
　本発明の第１の態様は、細胞剥離機構を搭載する装置（以下、「細胞剥離機構搭載装置」とも表記する）である。本態様の細胞剥離機構搭載装置は、細胞剥離液添加部及び吐出部を備えている。本態様の細胞剥離機構搭載装置によれば、接着培養した細胞を培養容器から効率的に剥離することができる。本態様の細胞剥離機構搭載装置は、接着培養した細胞を剥離する細胞剥離装置ということもできる。
３－２．構成
　本態様の細胞剥離機構搭載装置は、細胞剥離液添加部及び吐出部を必須の構成として含み、細胞回収部を選択的構成として含む。本態様の細胞剥離機構搭載装置は、さらなる選択的構成として分化誘導部、細胞播種部、細胞観察部、及び／又は搬送部を含むことができる。以下、各部について具体的に説明する。
（細胞剥離液添加部）
　本態様の細胞剥離機構搭載装置において細胞剥離液添加部は、細胞が接着した培養容器に細胞剥離液を添加することができる。
　細胞剥離液添加部は、細胞剥離液を添加するためのピペット（ピペットチップ）を備えていてもよい。ピペットチップは、シリンジポンプ等のポンプと接続することにより、細胞剥離液の吸引及び／又は吐出を行うことができる。
　一実施形態において、細胞剥離液添加部は、細胞剥離成分が剥離活性を有する温度に培養容器を保持することができる。例えば１５℃～４５℃、２０℃～４２℃、２５℃～４０℃、３０℃～３９℃、３５℃～３８℃、又は３６℃～３７℃に温度を維持することができる。
　一実施形態において、細胞剥離液添加部は、培養容器に添加される細胞剥離液の温度を制御することができる。
　一実施形態において、細胞剥離液添加部は、細胞の剥離をさらに促進し得るように培養容器を揺動することができる。揺動の振幅は、限定しないが、例えば１ｍｍ以上、２ｍｍ以上、３ｍｍ以上、４ｍｍ以上、５ｍｍ以上、１０ｍｍ以上、若しくは２０ｍｍ以上、及び／又は１００ｍｍ以下、９０ｍｍ以下、８０ｍｍ以下、７０ｍｍ以下、６０ｍｍ以下、５０ｍｍ以下、４０ｍｍ以下、若しくは３０ｍｍ以下であってもよく、例えば１ｍｍ～４ｍｍ、２ｍｍ又は３ｍｍであってもよい。揺動の振動数は、限定しないが、例えば、０．５Ｈｚ以上、１Ｈｚ以上、２Ｈｚ以上、３Ｈｚ以上、若しくは４Ｈｚ以上、４０Ｈｚ以下、３０Ｈｚ以下、２０Ｈｚ以下、１０Ｈｚ以下、若しくは５Ｈｚ以下であってもよく、例えば１Ｈｚ～１０Ｈｚ又は１Ｈｚ～８．５Ｈｚであってもよい。さらなる実施形態において、細胞剥離液添加部は培養容器を揺動する速度を制御する揺動速度制御手段を含む。揺動速度範囲は、例えば上記の振動数の範囲から選択することができる。
（吐出部）
　本態様の細胞剥離機構搭載装置において吐出部は、培養容器表面に吐出液を吐出することができる。吐出部は、３００ｍｍ／秒～１５００ｍｍ／秒の線速度で吐出液を吐出することができる。吐出部が吐出液を吐出する線速度は、例えば３００ｍｍ／秒～１４００ｍｍ／秒、３５０ｍｍ／秒～１３００ｍｍ／秒、４００ｍｍ／秒～１２００ｍｍ／秒、又は５００ｍｍ／秒～１１００ｍｍ／秒であってもよく、好ましくは５５０ｍｍ／秒～１０５０ｍｍ／秒であってもよい。吐出部が吐出液を吐出する線速度のさらなる範囲として、４００ｍｍ／秒～７００ｍｍ／秒若しくは５００ｍｍ／秒～６００ｍｍ／秒、７００ｍｍ／秒～１０００ｍｍ／秒若しくは８００ｍｍ／秒～９００ｍｍ／秒、７００ｍｍ／秒～１１００ｍｍ／秒若しくは８００ｍｍ／秒～１０００ｍｍ／秒、又は８００ｍｍ／秒～１２００ｍｍ／秒若しくは９００ｍｍ／秒～１１００ｍｍ／秒も例示される。
　吐出部は、培養容器に対して吐出液を吐出する吐出口を備えることができる。吐出口の口径は、限定しないが、例えば０．０５ｍｍ～５ｍｍ、０．０５ｍｍ～４ｍｍ、０．０５ｍｍ～３ｍｍ、０．１ｍｍ～２．０ｍｍ、又は０．３ｍｍ～１．５ｍｍであってもよい。吐出口の断面積は、例えば０．００２ｍｍ２～２０ｍｍ２、０．００２ｍｍ２～１３ｍｍ２、０．００２ｍｍ２～７ｍｍ２、０．０１ｍｍ２～４ｍｍ２、又は０．１ｍｍ２～１．８ｍｍ２であってもよい。
　吐出口は、例えばピペット（ピペットチップ）の先端部であってもよい。ピペット等の吐出口は、シリンジポンプ等のポンプと接続することにより、吐出液の吸引及び／又は吐出を行うことができる。
　一実施形態において、吐出部は、吐出位置制御手段を含む。吐出位置制御手段は、培養容器表面に吐出液を吐出する位置及び／又は吐出角度を制御する手段である。さらなる実施形態において、吐出位置制御手段は、スポット状に剥離液を吐出させることができる。隣接するスポット間の間隔は、４ｍｍ以上、４．５ｍｍ以上、５ｍｍ以上、６ｍｍ以上、７ｍｍ以上、８ｍｍ以上、９ｍｍ以上、１０ｍｍ以上、１１ｍｍ以上、１２ｍｍ以上、１３ｍｍ以上、１４ｍｍ以上、１５ｍｍ以上、１６ｍｍ以上、２０ｍｍ以上、２５ｍｍ以上、若しくは２８ｍｍ以上、及び／又は３３ｍｍ以下、２８ｍｍ以下、２５ｍｍ以下、２０ｍｍ以下、１６ｍｍ以下、１５ｍｍ以下、１４ｍｍ以下、１３ｍｍ以下、１２ｍｍ以下、１１ｍｍ以下、１０ｍｍ以下、９ｍｍ以下、８ｍｍ以下、７ｍｍ以下、６ｍｍ以下、若しくは５．５ｍｍ以下であってもよい。一実施形態において、隣接するスポット間の間隔は、４ｍｍ～３３ｍｍ、４ｍｍ～３０ｍｍ、４ｍｍ～２８ｍｍ、４ｍｍ～２５ｍｍ、４ｍｍ～２２ｍｍ、４ｍｍ～２１ｍｍ、４ｍｍ～２０ｍｍ、５ｍｍ～１９ｍｍ、６ｍｍ～１８ｍｍ、７ｍｍ～１７ｍｍ、８ｍｍ～１６ｍｍ、９ｍｍ～１５ｍｍ、１０ｍｍ～１４ｍｍ、又は１１ｍｍ～１３ｍｍであってもよい。さらなる一実施形態において、隣接するスポット間の間隔は、４ｍｍ～１５ｍｍ、４ｍｍ～１２ｍｍ、４ｍｍ～１０ｍｍ、４ｍｍ～９ｍｍ、４ｍｍ～８ｍｍ、４ｍｍ～７ｍｍ、４ｍｍ～６ｍｍ、又は４．５ｍｍ～５．５ｍｍであってもよい。また、さらなる実施形態において、吐出位置制御手段は、培養容器表面に設定した線状路上に剥離液を連続して吐出させることができる。線状路間の間隔は、例えば４ｍｍ以上、４．５ｍｍ以上、５ｍｍ以上、６ｍｍ以上、７ｍｍ以上、８ｍｍ以上、９ｍｍ以上、１０ｍｍ以上、１１ｍｍ以上、１２ｍｍ以上、１３ｍｍ以上、１４ｍｍ以上、１５ｍｍ以上、１６ｍｍ以上、２０ｍｍ以上、２５ｍｍ以上、若しくは２８ｍｍ以上、及び／又は３３ｍｍ以下、２８ｍｍ以下、２５ｍｍ以下、２０ｍｍ以下、１６ｍｍ以下、１５ｍｍ以下、１４ｍｍ以下、１３ｍｍ以下、１２ｍｍ以下、１１ｍｍ以下、１０ｍｍ以下、９ｍｍ以下、８ｍｍ以下、７ｍｍ以下、６ｍｍ以下、若しくは５．５ｍｍ以下であってもよい。一実施形態において、線状路間の間隔は、４ｍｍ～３３ｍｍ、４ｍｍ～３０ｍｍ、４ｍｍ～２８ｍｍ、４ｍｍ～２５ｍｍ、４ｍｍ～２２ｍｍ、４ｍｍ～２１ｍｍ、４ｍｍ～２０ｍｍ、５ｍｍ～１９ｍｍ、６ｍｍ～１８ｍｍ、７ｍｍ～１７ｍｍ、８ｍｍ～１６ｍｍ、９ｍｍ～１５ｍｍ、１０ｍｍ～１４ｍｍ、又は１１ｍｍ～１３ｍｍであってもよい。さらなる一実施形態において、線状路間の間隔は６ｍｍ～３３ｍｍの間隔であり、例示的なさらなる範囲として６ｍｍ～２０ｍｍ、１０ｍｍ～３３ｍｍ、６ｍｍ～１６ｍｍ、８ｍｍ～１４ｍｍ、１０ｍｍ～１２ｍｍ、１０ｍｍ～２０ｍｍ、１２ｍｍ～１８ｍｍ、１４ｍｍ～１６ｍｍ、２３ｍｍ～３３ｍｍ、２５ｍｍ～３１ｍｍ、又は２７ｍｍ～２９ｍｍの間隔が挙げられる。吐出角度は、鉛直方向に対して０度～４５度、１度～３０度、又は１度～２０度であってもよい。
　吐出部は、吐出される吐出液の温度を制御する手段を備えていてもよい。
（細胞回収部）
　本態様の細胞剥離機構搭載装置において細胞回収部は、培養容器表面から剥離した前記細胞を回収することができる。
　細胞回収部は、ピペット（ピペットチップ）をシリンジポンプ等のポンプと接続したものを使用してもよい。例えば、上述の吐出部と同様の構成のものを使用して細胞懸濁液を吸引することもできる。
　一実施形態において、細胞回収部は回収位置制御手段を含むことができる。回収位置制御手段は、剥離した細胞を含む細胞懸濁液において細胞を回収する位置を制御する手段である。回収位置制御手段は、細胞懸濁液の液面及び液中を含む複数の位置から細胞を回収させるものであってもよい。
　さらなる実施形態において、細胞回収部は、回収した細胞を回収液から分離する手段を備えていてもよい。細胞を回収液から分離する手段には、遠心分離機が例示される。細胞回収部は、分離した細胞に新たな培地を添加し、必要に応じて単分散までピペッティングを行うことができる。
（分化誘導部）
　本態様の細胞剥離機構搭載装置において分化誘導部は、細胞回収部で回収した幹細胞等の細胞に分化誘導剤を加えることができる。
（細胞播種部）
　本態様の細胞剥離機構搭載装置において細胞播種部は、細胞回収部で回収した前駆細胞及び／又は分化細胞等の細胞を例えば上記式Ｉ及び上記式ＩＩを用いて総細胞数と総液量を計算し、マルチウェルプレート等の培養容器に播種するための細胞懸濁液を調製することができる。
　一実施形態において、細胞播種部は、細胞懸濁液を培養容器に播種する前に、培養容器からコーティング剤を除去することができる。
（搬送部）
　本態様の細胞剥離機構搭載装置において搬送部は、マルチウェルプレート等の培養容器を各部の間で搬送することができる。例えば、搬送部は、搬送手段として搬送アームを備えることができる。搬送アームは培養容器を掴み、所定の部まで培養容器を搬送することができる。
　一実施形態において、搬送部は、搬送速度制御手段を含むことができる。搬送速度制御手段は、培養容器中の内容液が搬送時にこぼれないように、搬送される培養容器の種類（例えば、１ウェルプレート、又は６、２４、４８、９６、３８４、若しくは１５３６ウェルプレート等のマルチウェルプレート)に応じた適切な速度に搬送速度を制御することができる。
（細胞観察部）
　本態様の細胞剥離機構搭載装置において細胞観察部は、培養容器における細胞を観察することができる。細胞観察部は、顕微鏡下等で細胞を撮影することができる。細胞観察部は、細胞を撮影して得られた画像に基づいて、コンフルエンシーを算出し、細胞数を測定し、及び／又は細胞生存率を算出することもできる。
３－３．効果
　本態様の細胞剥離機構搭載装置によれば、第１態様の細胞剥離方法、及び第２態様の分化細胞の生産方法を効率的に実施することができる。
　本態様の細胞剥離機構搭載装置によれば、実験者の熟練した手技を要することなく、効率的かつ再現性よく分化細胞を生産することができる。例えば、ＣＶ値１０％以下の均一性の高い細胞を含むマルチウェルプレートを作製することができる。
＜実施例１：吐出液を吐出する線速度＞
（目的）
　細胞剥離機構搭載装置を用いて、接着培養した細胞を効率的に剥離することができる吐出液の吐出速度について検討する。
　なお、当該装置は、コ―ティング液の除去、細胞懸濁液の播種、細胞培養、細胞剥離、吐出液の吐出、細胞の回収、分化誘導、試薬の添加、及び生細胞計測等の工程を自動で実施できる装置として新たに開発された。
（方法と結果）
（１）培養容器のコーティング
　培養容器のコーティングは以下の方法で行った。
（ａ）ｉＭａｔｒｉｘ－５１１コーティング容器の準備
　１００μＬの０．５μｇ／μＬ　ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（Ｌａｍｉｎｉｎ－５１１　Ｅ８）（ニッピ、８９２００１／８９２００２）と１５ｍＬのＰＢＳとを混合した混合液を長方形型（長辺１２７．５ｍｍ×短辺８５ｍｍ）の培養容器（Ｇｒｅｉｎｅｒ　ｂｉｏ－ｏｎｅ　ＲＥＦ：６７０１８０）に添加した。すぐに培養容器を揺らして混合液を培養容器全体に広げた後、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で１時間以上静置した。なお、細胞を播種する前に、前記混合液は除去した。
（ｂ）ＰＭＳコーティング容器の準備
　ポリ－Ｌ－リジン０．５ｍＬ、マトリゲル１．０ｍＬ、シンセマックス１．０ｍＬを４７．５ｍＬの滅菌水で希釈したコーティング液（以下、ＰＭＳコート液という）を長方形型（長辺１２７．５ｍｍ×短辺８５ｍｍ）の培養容器（Ｇｒｅｉｎｅｒ　ｂｉｏ－ｏｎｅ　ＲＥＦ：６７０１８０）に１５ｍＬ添加した。また、マルチウェルプレートには、９６ウェルの場合は２０ｕＬ／ウェルで、３８４ウェルの場合は１０ｕＬ／ウェルでＰＭＳコート液を各ウェルに添加した。なお、細胞を播種する前に、前記ＰＭＳコート液は除去した。
（２）細胞培養
（ｉＰＳ細胞）
　１０ｎＭ　Ｙ－２７６３２含有ＳｔｅｍＦｉｔ培地に０．２５～０．３７×１０４細胞個のヒトｉＰＳ細胞を含む細胞懸濁液１５ｍＬを上記（１）で準備したｉＭａｔｒｉｘ－５１１コーティング培養容器に播種した。５％ＣＯ２インキュベーターに静置し、１～３日毎に培地交換を行いながら３７℃で９日間培養を行い、コンフルエンシー８５％以上（２１．０×１０４細胞／ｃｍ２～３５．０×１０４細胞／ｃｍ２）の高密度ｉＰＳ細胞が得られた（図３Ａ）。
（誘導神経細胞）
　ｉＰＳ細胞（３０×１０６個）をＮＢｐＤＹ培地１５ｍＬに懸濁し、ＰＭＳコーティング容器に播種し、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。４日後、８ｍＬの培地を吸引後、８ｍＬのＮＢｐＹ培地を注入し、分化誘導培養し３日後に誘導神経細胞を得た。
（３）細胞剥離液処理
　細胞観察部でコンフルエンシーを確認した後、培地を除去した。１５ｍＬのＰＢＳを加え、プレートを揺らしながら細胞全体を洗浄した後、ＰＢＳを除去した。
　２×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（１０×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で５倍希釈した液に剥離液）を培養容器に１５ｍＬ加え、プレートを揺らして全体に行き渡らせた後、振動機能付き恒温槽において３７℃で１５分間静置し、その後Ｙ軸方向に振幅２ｍｍかつ４Ｈｚで３分間振動することで、細胞間、及び細胞基質間の接着力を弱めた（図３Ｂ）。次いでプレートを水平方向に対して１０度傾斜した。
（４）培養容器からのｉＰＳ細胞の剥離
　細胞剥離液処理後の培養容器を吐出口の下に設置した（図３Ｃ、図５Ａ）。培養容器は、細胞が接着した培養容器表面に対する吐出液の吐出角度が８０度となるように、水平面に対する培養容器底面の傾斜角度を１０度として保持した（図５Ａ）。吐出液は断面積１．７７ｍｍ２（口径３ｍｍ）の分注チップからなる吐出口から鉛直方向に吐出した（図３Ｃ）。吐出液として２×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ／ＰＢＳ＋１０ｎＭ　Ｙ－２７６３２を使用し、図５Ｂに示すＹ軸方向（培養容器の短辺の方向）に設定した吐出用線状路上に吐出液を連続して吐出した。吐出液は、３種類の線速度（１４７ｍｍ／秒、５６５ｍｍ／秒、又は８４８ｍｍ／秒）で吐出した。吐出口をＹ軸方向に移動する速度は２２．７ｍｍ／秒、移動時間は３秒、移動距離は６８ｍｍとした。吐出液を吐出した後、細胞を顕微鏡下で撮影した。得られた画像を画像解析ソフトＩｍａｇｅ　Ｊを用いて解析することによって、細胞剥離の有無を判定した。具体的には、細胞が存在する領域、及び細胞が存在しない領域の輝度に基づいて、閾値輝度を決定した。この閾値輝度に基づいて画像を二値化することによって、細胞が残存する領域と細胞が剥離された領域とを区別した。吐出液を吐出した領域の周囲で細胞が剥離された領域が観察された場合を細胞剥離有（＋）、剥離された領域が観察されなかった場合を細胞剥離無（－）として判定した。判定結果を以下の表１に示す。
　培養容器表面から剥離した細胞を回収し、回収された細胞数、及び回収細胞数における生存細胞数の割合（細胞生存率）を評価した。具体的には、マイクロチューブにトリパンブルー２５μＬと細胞懸濁液２５μＬを混和し、血球計算盤に注入し、細胞数を計測した。死細胞はトリパンブルーで染色される。細胞生存率は、以下の（式ＩＩＩ）によって算出した。
　（（総細胞数―死細胞数）／総細胞数）×１００　　　（式ＩＩＩ）
　細胞剥離の有無及び細胞生存率を評価した結果を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　３種類の線速度（１４７ｍｍ／秒、５６５ｍｍ／秒、及び８４８ｍｍ／秒）のうち、５６５ｍｍ／秒及び８４８ｍｍ／秒の条件で吐出液を吐出した領域では、ｉＰＳ細胞が培養容器から剥離した（図４）。一方、１４７ｍｍ／秒の線速度で吐出液を吐出した場合は、培養容器からｉＰＳ細胞が剥離しなかった。なお、剥離したｉＰＳ細胞はいずれも８０％以上の細胞生存率であった。
＜実施例２：吐出用線状路の間隔＞
（目的）
　細胞に対して線状路上に吐出液を連続して吐出する際に、効率的に細胞を剥離し得る線状路間の間隔について検討する。
（方法と結果）
　実施例１と同様の方法により、培養容器においてｉＰＳ細胞又は誘導神経細胞を培養し、細胞剥離液による処理を行った。本明細書の実施例では、誘導神経細胞として、特許第６４７３０７７号に記載のｉＮ細胞を使用した。具体的には、誘導神経細胞は、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）投与によりヒトｉＰＳ細胞においてＮｇｎ２導入遺伝子を発現させることによって分化誘導した神経細胞である。
　細胞剥離液による処理に続いて、細胞剥離液処理後の細胞に対して吐出液を吐出して細胞剥離を行った。水平面に対する培養容器底面の傾斜角度を１０度に保持した状態で、吐出線速度を１０００ｍｍ／秒、隣り合う線状路間の間隔（図５においてΔＸとして示す）を１５ｍｍ又は２８ｍｍに設定し、複数の線状路上に吐出液を連続して吐出した（図５）。まず、培養容器の底面のうち傾斜により高い位置に保持された半面に対して、１５ｍｍ間隔で吐出する場合は６本の線状路上に（図５Ｂ、ΔＸ＝１５ｍｍ）、２８ｍｍ間隔で吐出する場合は４本の線状路上に（図５Ｂ、ΔＸ＝２８ｍｍ）、吐出を実施した。次に、培養容器を反対側に１０度傾斜させた状態で保持し、残りの半面に対して同様に吐出を行った。各条件ではそれぞれ合計３０００μＬの吐出液を使用した。
　ｉＰＳ細胞の吐出液は、２×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ／ＰＢＳ＋１０ｎＭ　Ｙ－２７６３２を使用し、誘導神経細胞の吐出液は、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ(１×)（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社：ＲＥＦ：１２５６３－０１１）＋１０ｎＭ　Ｙ－２７６３２を使用した。それ以外の吐出条件は、実施例１の（４）に記載の条件に準じた。
　吐出液を吐出後の回収細胞数における生存細胞数の割合は、実施例１に記載した条件で算出した。
　回収細胞数及び細胞生存率を評価した結果を以下の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示す結果から、いずれの条件においても十分量の細胞を回収することができたが、より好適な線状路間の間隔が細胞の種類によって異なることが判明した。ｉＰＳ細胞では、２８ｍｍ間隔と比較して１５ｍｍ間隔で吐出を行った場合に細胞をより多く回収できた（表２：条件２－１と条件２－２との比較）。一方、誘導神経細胞では、１５ｍｍ間隔と比較して、２８ｍｍ間隔で吐出を行った場合に細胞をより多く回収できた（表２：条件２－３と条件２－４との比較）。高密度培養したｉＰＳ細胞は、細胞剥離液による処理だけでは剥離し難いため、線状路間の間隔を狭く設定した吐出方法により回収効率を向上させることができると考えられる。一方、誘導神経細胞では、細胞剥離液による処理で剥離し易いものの、凝集し易い性質を有することから、線状路間の間隔を大きくした方が回収効率が高くなると考えられる。
＜実施例３：スポット状吐出と線状路上への吐出とを組合せた細胞剥離＞
（目的）
　スポット状の吐出と線状路上への吐出とを組み合せる方法で培養容器から細胞を剥離する。
（方法と結果）
　実施例１と同様の方法により、培養容器においてｉＰＳ細胞又は誘導神経細胞を培養し、細胞剥離液によって処理した細胞に対して吐出液を吐出して細胞剥離を行った。本実施例では、吐出は、スポット状吐出と線状路上への吐出とを組み合わせて行った。各々の吐出は異なる２つの分注機を用いて行い、スポット状吐出は８連分注アームを有する分注機１で、線状路上への吐出は単一分注アームを有する分注機２で行った。
　具体的には、水平面に対する培養容器底面の傾斜角度を１０度に保持した状態で、培養容器の底面のうち、傾斜により高い位置に保持された半面に対して、スポット状吐出と線状路上への吐出とを行った。まず、分注機１によるスポット状吐出では、Ｙ軸方向に１０ｍｍごと等間隔で配置された８個の吐出口から吐出液を２００ｍｍ／秒又は１０００ｍｍ／秒の線速度でスポット状に吐出し（図６Ａ、吐出位置Ａ、各吐出口当たり１．０ｍＬ）、さらにＹ軸方向に５ｍｍ移動した位置で８個の吐出口から同様にスポット状吐出を行った（図６Ａ、吐出位置Ｂ）。計１６か所へのスポット状吐出を、１１ｍｍの間隔でＸ軸方向に６つの位置に対して行った（図６Ｂ）。次いで分注機２により、吐出線速度を５６５ｍｍ／秒、隣り合う線状路間の間隔を１１ｍｍに設定し、スポット状吐出を行った位置の間に設定した６本の線状路上に吐出液を連続して吐出した（図７－１Ａ）。続いて培養容器を反対側に１０度傾斜させた状態で保持し、反対側の半分の面に対して分注機１によるスポット状吐出及び分注機２による線状路上への吐出を上と同様に行った（図７－１Ｂ）。ｉＰＳ細胞に対してスポット状吐出を２００ｍｍ／秒又は１０００ｍｍ／秒の線速度で行う条件を、以下の表３でそれぞれ条件３－２及び条件３－４として示す。また、誘導神経細胞に対してスポット状吐出を１０００ｍｍ／秒の線速度で行う条件を条件３－５として示す。
　比較対照として、ｉＰＳ細胞に対してスポット状吐出をＸ軸上の各位置で、吐出位置Ａの８点だけに対して行い、吐出位置Ｂでは吐出しない条件で吐出を行った結果を以下の表３においてそれぞれ条件３－１（スポット状吐出の線速度：２００ｍｍ／秒）及び条件３－３（スポット状吐出の線速度：１０００ｍｍ／秒）として示す。また、誘導神経細胞に対してスポット状吐出を行わず、線状路上への吐出のみを行った結果を条件３－６として示す。
　なお、各条件では分注機１により合計１０００μＬの吐出液を吐出し、分注機２により合計３０００μＬの吐出液を吐出した。それ以外の吐出条件は、実施例１の（４）に記載の条件に準じた。各条件下で吐出液を吐出した後に細胞剥離の有無を顕微鏡下で確認した結果を以下の表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示すように、２００ｍｍ／秒の線速度では、培養容器からｉＰＳ細胞が剥離されなかった。一方、１０００ｍｍ／秒の線速度では、培養容器からｉＰＳ細胞が剥離された。線状路上への吐出及び吐出位置Ａでのスポット状吐出のみを行った場合（表３、条件３－３）では、十分量の細胞を回収することができたが、線状路及び吐出位置Ａから離れた箇所に一部ｉＰＳ細胞の残存が見られた。これに対して、線状路上への吐出と吐出位置Ａ、Ｂでのスポット状の吐出を組み合わせた場合（表３、条件３－４、及び３－５）では、ｉＰＳ細胞及び誘導神経細胞を全面から剥離することができた（図７－１Ｃ、図７－２Ｄ、Ｅ）。条件３－６では、線状路上への吐出のみによって、誘導神経細胞を全面から剥離することができた。
＜実施例４：剥離した細胞を回収する方法＞
（目的）
　培養容器から剥離した細胞を効率的に回収できる方法を検討する。
（方法と結果）
　実施例３の条件３－４と同様の方法により培養容器からｉＰＳ細胞を剥離した後の培養容器を目視観察した結果、傾斜角１０度で保持した培養容器において剥離後の細胞は培養容器底面に液面が接する位置から４０ｍｍ～６０ｍｍの液面付近に溜まりやすいことが判明した。この観察結果に基づき、培養容器中で異なる位置から細胞を回収した場合において回収細胞数及び細胞生存率を検討した。回収細胞数及び細胞生存率の測定方法は実施例２に記載の方法に準じた。
　本実施例において実施した回収方法で細胞を回収した位置を図８に示す。以下、図８Ａ、Ｂに示す回収方法を「細胞回収方法Ａ」と称し、図８Ｃ、Ｄに示す回収方法を「細胞回収方法Ｂ」と称する。細胞回収方法Ａでは、単一分注アームにより液中の２つの位置から細胞を回収した。一方、細胞回収方法Ｂでは、８連分注アームにより、Ｘ軸上の２か所（図８Ｃにおける位置１及び２）の各々における液面の８か所（図８Ｄにおける位置１及び２）、及び液中（容器の底；図８Ｃにおける位置３）の８か所（図８Ｄにおける位置３）を合わせた計２４個の位置から細胞を回収した。回収方法Ａ及びＢで得られた回収細胞数及び細胞生存率を以下の表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　細胞回収方法Ａでは回収細胞数１０×１０６個であり、基準値に満たなかった。一方、細胞回収方法Ｂでは、回収細胞数２４×１０６個であり、基準値を超えた。よって、剥離後の細胞は、細胞懸濁液の液面及び液中を含む複数の位置から細胞を回収することにより、効率的に回収可能であることが判明した。
＜実施例５：培養容器からの誘導神経細胞の剥離と生存率評価＞
（目的）
　誘導神経細胞を高生存率で剥離回収する条件を評価する。
（方法と結果）
（１）細胞培養
　高密度ｉＰＳ細胞を上記実施例の条件１－１（実施例１）かつ条件２－１（実施例２）かつ条件３－４（実施例３）の方法で剥離し、実施例４の細胞回収方法Ｂにより回収した。得られたｉＰＳ細胞（３０×１０６個）をＮＢｐＤＹ培地１５ｍＬに懸濁し、ＰＭＳコーティング容器に播種し、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。４日後、８ｍＬの培地を吸引後、８ｍＬのＮＢｐＹ培地を注入し、分化誘導培養し３日後に誘導神経細胞を得た。
（２）細胞剥離液処理
　誘導神経細胞の培地を除去し、１５ｍＬのＰＢＳを加え、プレートを揺らしながら細胞全体を洗浄した後、ＰＢＳを除去した。誘導神経細胞の細胞剥離液には、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ(１×)＋１０ｎＭ　Ｙ－２７６３２を使用した。細胞剥離液を培養容器に７ｍＬ加え、プレートを揺らして全体に行き渡らせた後、振動機能付き恒温槽において３７℃で３分静置し、その後Ｙ軸方向に振幅２ｍｍかつ４Ｈｚで２分間振動することで、細胞間、及び細胞基質間の接着力を弱めた。次いで、ＮＢｐＤＹ培地を７ｍＬ加え、プレートを水平方向に対して１０度傾斜した。
（３）培養容器からの誘導神経細胞の剥離
　細胞剥離液処理後の誘導神経細胞の培養容器を吐出口の下に設置し、培養容器表面に対する吐出液の吐出角度が８０度となるように、水平面に対する培養容器底面の傾斜角度を１０度として保持した。吐出液は、断面積１．７７ｍｍ２（口径３ｍｍ）の分注チップからなる吐出口から鉛直方向に吐出し、吐出液としてＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ(１×)＋１０ｎＭ　Ｙ－２７６３２を使用した。吐出液は、３種類の線速度（１４７ｍｍ／秒、５６５ｍｍ／秒、又は９０３ｍｍ／秒）で吐出し、図５Ｂと同様にＹ軸方向（培養容器の短辺の方向）に設定した吐出用線状路上に吐出液を連続して吐出した。吐出口をＹ軸方向に移動する速度は２２．７ｍｍ／秒、移動時間は３秒、移動距離は６８ｍｍとした。吐出液を吐出した後、細胞を顕微鏡下で撮影した。得られた画像を画像解析ソフトＩｍａｇｅ　Ｊを用いて、実施例１と同様に解析することによって、細胞剥離の有無を判定した。判定結果を以下の表５に示す。細胞回収方法Ｂで回収した細胞生存数を以下の表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　３種類の線速度（１４７ｍｍ／秒、５６５ｍｍ／秒、及び９０３ｍｍ／秒）では、５６５ｍｍ／秒及び９０３ｍｍ／秒の条件で吐出液を吐出した領域では、誘導神経細胞が培養容器から剥離し、十分量の細胞を回収することができたが、１４７ｍｍ／秒の線速度で吐出液を吐出した領域では、培養容器表面に誘導神経細胞が残ることが分かった。吐出液を吐出した後の培養容器の表面の様子を図９Ａ～Ｃに示す。表５及び図９Ａ～Ｃに示す結果から、低い線速度（１４７ｍｍ／秒）では細胞を十分に剥離させることができず、逆に高い線速度（９０３ｍｍ／秒）では、勢いよく細胞が剥がれる結果として軸索同士が絡まってしまうことが分かった（図９Ｃ、点線枠内）。更に、条件５－３では、細胞回収時においても細胞の軸索同士が絡まる結果として細胞凝集物が生じやすく、分注チップで剥離した細胞の全てを回収しきれず、条件５－２と比較して回収細胞数に若干の低下がみられた（図９Ｄ）。以上の結果より、線速度の違いが細胞の回収数及び生存率に大きく影響することが判明した。
＜実施例６：マルチウェルプレートに播種した細胞の生存率評価＞
（目的）
　剥離回収後の誘導神経細胞をマルチウェルプレートに播種し、４日間培養後に各ウェルにおける細胞の生存率及び均一性をＷＳＴ－８により評価する。
（方法と結果）
　以下の条件６－１～条件６－３の各条件で細胞を剥離回収し、マルチウェルプレートに細胞を播種した。
（条件６－１）
　高密度ｉＰＳ細胞を上記実施例の条件２－１（実施例２）かつ条件３－４（実施例３）の方法で剥離し、実施例４の細胞回収方法Ｂにより回収した。得られたｉＰＳ細胞（３０×１０６個）をＮＢｐＤＹ培地１５ｍＬに懸濁し培養した。４日後、８ｍＬの培地を吸引後、８ｍＬのＮＢｐＹ培地を注入し、分化誘導培養した。更に３日後、誘導神経細胞を上記実施例の条件２－４（実施例２）かつ条件３－５（実施例３）で剥離し、実施例４の細胞回収方法Ｂと同条件で誘導神経細胞を回収し、細胞懸濁液のまま３時間静置した。得られた細胞懸濁液の総細胞数、死細胞数及び生存細胞数を測定し、死細胞混入率及び細胞生存率を算出した(以下の表６において条件６－１の細胞生存率として示す)。この細胞懸濁液を４００万生細胞／ｍＬに調製し、細胞懸濁液１５ｍＬを３８４ウェルプレートの各ウェルに２５μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで４日間培養した。
（条件６－２）
　高密度ｉＰＳ細胞を上記実施例の条件２－１（実施例２）かつ条件３－４（実施例３）の方法で剥離し、実施例４の細胞回収方法Ｂにより回収した。得られたｉＰＳ細胞（３０×１０６個）をＮＢｐＤＹ培地１５ｍＬに懸濁し培養した。４日後、８ｍＬの培地を吸引後、８ｍＬのＮＢｐＹ培地を注入し、分化誘導培養した。更に３日後、誘導神経細胞を上記実施例の条件２－４（実施例２）かつ条件３－５（実施例３）で剥離し、実施例４の細胞回収方法Ｂと同条件で誘導神経細胞を回収した。得られた細胞懸濁液の総細胞数、死細胞数及び生存細胞数を測定し、死細胞混入率及び細胞生存率を算出した(以下の表６において条件６－２の細胞生存率として示す)。この細胞懸濁液を４００万生細胞／ｍＬに調製し、細胞懸濁液１５ｍＬを３８４ウェルプレートの各ウェルに２５μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで４日間培養した。
（条件６－３）
　高密度ｉＰＳ細胞を上記実施例の条件２－１（実施例２）かつ条件３－４（実施例３）の方法で剥離し、実施例４の細胞回収方法Ｂにより回収した。得られたｉＰＳ細胞（３０×１０６個）をＮＢｐＤＹ培地１５ｍＬに懸濁し培養した。４日後、８ｍＬの培地を吸引後、８ｍＬのＮＢｐＹ培地を注入し、分化誘導培養した。更に３日後、誘導神経細胞を上記実施例５の条件５－２で剥離し、実施例４の細胞回収方法Ｂと同条件で誘導神経細胞を回収した。前記細胞の懸濁液の総細胞数、死細胞数及び生存細胞数を測定し、死細胞混入率及び細胞生存率を算出した(以下の表６において条件６－３の細胞生存率として示す)。この細胞懸濁液を４００万生細胞／ｍＬに調製し、細胞懸濁液１５ｍＬを３８４ウェルプレートの各ウェルに２５μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで４日間培養した。
（ＷＳＴによる生細胞数の測定）
　Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（テトラゾリウム塩ＷＳＴ－８［２－（２－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（２，４ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ］，同仁化学）の溶液２．５μＬを前記３８４ウェルプレートの各ウェルに１０μＬ／秒の速度で注入した。溶液の注入は、液面から１ｍｍ下に配置した分注チップ先端から行った。上記マルチウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３時間以上反応後、各ウェルの４５０ｎｍ及び６５６ｎｍにおける吸光度を計測し、補正吸光度を測定した。
　３８４個のウェルにおける平均値Ｒ及び標準偏差σを計算して、以下の（式ＩＶ）によりＣＶ値（変動係数）を算出した。
　ＣＶ値（％）＝σ／Ｒ×１００　　　　　　（式ＩＶ）
　播種前における死細胞混入率及び細胞生存率、並びに播種後の細胞のＣＶ値を以下の表６に示す。また、細胞生存率とＣＶ値の関係を図１０Ａに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６及び図１０Ａに示す結果から、細胞生存率が高い細胞懸濁液ではＣＶ値が低い結果が得られた。この結果から、細胞生存率が高い細胞懸濁液をマルチウェルプレートに播種することによって、細胞の品質についてウェル間でのばらつきを低く抑えることができることが示された。細胞生存率約７０％以上の細胞懸濁液を播種することによって、ＣＶ値を１０％以下に抑えた細胞プレートが調製可能になった。上記の条件６－３で得られた細胞から４００万個/ｍＬの細胞懸濁液を調製後、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ細胞懸濁液を播種し、細胞プレート２枚を作製した。前記細胞プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで４日間培養し後、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８の溶液を前記細胞プレートの各ウェルに１０μＬで注入し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３時間以上反応後、各ウェルの４５０ｎｍ及び６５６ｎｍにおける吸光度を計測し、補正吸光度を測定した。９６個のウェルにおける平均値Ｒ及び標準偏差σを計算して、上記の式ＩＶによりＣＶ値（変動係数）を算出した。図１０Ｂの結果より、９６ウェルプレート２枚のそれぞれのＣＶ値（％）は５．０４と６．２０であった。いずれの９６ウェルプレートにおいても、ＣＶ値を１０％以下に抑えたプレート間のばらつきが極めて低い細胞プレートが調製可能になった。
＜実施例７：免疫染色画像の取得、及びＭＡＰ２陽性率の算出＞
（目的）
　実施例６の条件６－２又は条件６－３で得られた剥離回収後の誘導神経細胞をマルチウェルプレートに播種し、４日間培養後に各ウェルの誘導神経細胞の均質性を免疫染色により評価する。
（方法）
　条件６－２又は条件６－３で得られた細胞懸濁液を前記同様、９６ウェルプレートに播種し、前記細胞プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで４日間培養した。その後、９６ウェルプレートをＰＢＳで洗浄後、４％ＰＦＡを１００μＬ添加し、細胞を固定し、４℃冷蔵庫で２４時間以上固定した。その後、４％ＰＦＡを除去し、Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ　ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ添加し、２時間室温で静置した。次に、Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ　ｂｕｆｆｅｒを除去し、ＰＢＳで３回洗浄操作を行った後にＢｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを添加し、室温で２時間、静置した。一次抗体にＡｎｔｉ－ＭＡＰ２抗体（アブカム：ａｂ１８３８３０）を１：５００の濃度でＢｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒで希釈し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを除去後、前記一次抗体溶液を添加し、４℃で一終夜（１２時間以上）維持した。一次抗体溶液を除去し、ＰＢＳで洗浄後、二次抗体（Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｈ＆Ｌ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８（アブカム：ａｂ１５００７７）を１：２０００の濃度でＢｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒで希釈した二次抗体溶液を添加し、遮光し、室温で１時間静置した。二次抗体溶液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄操作を行った。ＰＢＳでＤＡＰＩを１０００倍希釈した溶液をウェルに添加し、遮光し、室温で１０分間静置した。ウェル内の溶液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄後、蛍光顕微鏡（キーエンスＢＺ－Ｘ８１０）で観察を行った。次いで、全細胞数（ＤＡＰＩ陽性細胞数）及びＭＡＰ２陽性細胞数（神経細胞数）をカウントし、ＭＡＰ２陽性率を算出した。
（結果）
　条件６－２の方法により得られた細胞のＭＡＰ２免疫染色の結果を図１１ＡＢに示す。条件６－２の方法により得られた細胞では、神経軸索を有するＭＡＰ２陽性細胞、及び軸索を有しないＭＡＰ２弱陽性細胞又はＭＡＰ２陰性細胞（図１１Ａにおいて矢印で示す）が観察された（図１１Ａ）。この方法では、全体の細胞に対するＭＡＰ２陽性細胞（神経細胞）の割合は約３５％に過ぎなかった（９６ウェルプレート中の１２ウェルの定量結果；図１１Ｂ）。
　次に、条件６－３の方法により得られた細胞のＭＡＰ２免疫染色の結果を図１１Ｃ、Ｄに示す。条件６－３の方法により得られた細胞の大部分がＭＡＰ２陽性細胞（神経細胞）であることが分かった（図１１Ｃ）。さらに、全体の細胞に対してＭＡＰ２陽性細胞（神経細胞）は９５％以上を占めた（９６ウェルプレート中の１２ウェルの定量結果；図１１Ｄ）。
＜実施例８：誘導神経細胞の均質性評価＞
（目的）
　実施例６の条件６－３の方法により得られた剥離回収後の誘導神経細胞を９６ウェルプレートに播種し、４日間培養後に各ウェルの誘導神経細胞が均質な表現系を保持しているか否かを、神経細胞の軸索長を指標として評価する。
（方法）
　条件６－３の方法により細胞懸濁液を前記同様、９６ウェルプレートに播種し、前記細胞プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで４日間培養した。その後、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞解析システム（ザルトリウス・ジャパン株式会社）を用いて９６ウェルプレートのウェル内の神経細胞を撮影した。撮影画像の神経細胞を細胞体箇所と軸索箇所に区分けし、軸索長を算出した。
（結果）
　条件６－３の方法により得られた各ウェル内の神経細胞の撮影画像を図１２Ａに示した。更に、撮影画像から撮影画像の神経細胞を細胞体箇所と軸索箇所に区分けし、軸索長を算出し、各ウェル内の神経細胞軸索長を図１２Ｂに示した。９６個の外周部のウェルを除く神経細胞の軸索長の平均値Ｒ及び標準偏差σを計算して、上記の式ＩＶによりＣＶ値（変動係数）を算出した結果、９６ウェルプレート内の神経細胞軸索長のＣＶ値は３．１９％であった。条件６－３の方法を用いることによって、自動でｉＰＳ細胞を均一、且つ均質な神経細胞へ分化誘導が可能であることが示され、神経細胞の特徴である軸索長もウェル内で均質に調製することを確認した。
＜実施例９：血管内皮細胞プレートの調製＞
（目的）
　実施例の条件２－１かつ条件３－４の方法で剥離し、実施例４の細胞回収方法Ｂで回収したｉＰＳ細胞を用いて血管内皮細胞への分化誘導を検討する。
（方法）
　高密度ｉＰＳ細胞を上記実施例の条件２－１（実施例２）かつ条件３－４（実施例３）の方法で剥離し、実施例４の細胞回収方法Ｂにより回収し、回収細胞数と細胞生存率を示す。更に、前記操作で得られたｉＰＳ細胞をＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ社製）に終濃度５０μＬ／ｍＬのＧ４１８と１０ｎＭのＹ－２７６３２（ナカライ社製）を添加した培地１５ｍＬに懸濁した。マトリゲルコーティング済み９６ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液を６５万細胞／１００μＬで播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで６時間培養した。ｉＰＳ細胞が接着した後、９６ウェルプレート内の培地をＥＢＭ－２（Ｌｏｎｚａ）Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ培地に全量交換し、再度３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３日間分化培養した。前記で培養した９６ウェルプレートから培養上清を除去し、ＰＢＳで洗浄後、４％ＰＦＡを１００μＬ添加し、４℃冷蔵庫で２４時間以上かけて細胞を固定した。その後、４％ＰＦＡを除去し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライ社製）に純水で５倍希釈した溶液）で２回洗浄後、Ａｎｔｉ－ＣＤ３１抗体（Ｍｏｕｓｅ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａ　Ａｂ９４９８）を１：５００の濃度で含む一次抗体溶液を細胞を固定した９６ウェルプレートに５０μＬずつ添加し、１２時間静置した。その後、一次抗体溶液を除去し、二次抗体としてＤｏｎｋｅｙ　ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　（Ｈ＆Ｌ）　ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）　４８８を１：５００の濃度で含むＢｌｏｃｋｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒを添加し、室温で２時間静置した。二次抗体溶液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄操作を行った後に、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ＢｕｆｆｅｒにＤＡＰＩを１０００倍希釈した溶液をウェルに添加し、遮光し、室温で１０分間静置した。ウェル内の溶液を除し、ＰＢＳで２回洗浄後、蛍光顕微鏡（キーエンスＢＺ－Ｘ８１０）で観察を行い、血管内皮細胞の陽性マーカーであるＣＤ３１陽性細胞を観察した。更に、実施例６の「（ＷＳＴによる生細胞数の測定）」にてＷＳＴによる生細胞数の測定について上述した方法に準じて、血管内皮細胞の９６ウェルプレート内での細胞数を測定した。具体的には、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（テトラゾリウム塩ＷＳＴ－８［２－（２－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（２，４ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ］，同仁化学）の溶液１０μＬを前記９６ウェルプレートの各ウェルに１０μＬ／秒の速度で注入した。上記マルチウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３時間以上反応後、各ウェルの４５０ｎｍ及び６５６ｎｍにおける吸光度を計測し、補正吸光度を測定した。９６個のウェルにおける平均値Ｒ及び標準偏差σを計算し、上記式ＩＶによりＣＶ値を算出した。
＜結果＞
　以下の表７にｉＰＳ細胞の回収細胞数と細胞生存率を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　２種類のｉＰＳ細胞株（健常高齢者由来ｉＰＳ細胞／アルツハイマー型認知症患者由来ｉＰＳ細胞）とも細胞生存率は９０％以上であることを確認した。前記方法で回収したｉＰＳ細胞を血管内皮細胞に分化誘導し、血管内皮細胞マーカーＣＤ３１に対する免疫染色後に蛍光顕微鏡で観察した結果を図１３に示す。２種類のｉＰＳ細胞株からＣＤ３１陽性細胞が得られることが明らかになった。更に、上記方法で調製したｉＰＳ細胞由来血管内皮細胞が９６ウェルプレート内で均一な細胞数で調製できていることを確認する為、上記方法でＷＳＴによる生細胞数の測定を行った結果を以下の表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 　健常高齢者のｉＰＳ細胞由来血管内皮細胞の各ウェル間のＣＶ値は、９．９８％であった（ｎ＝２８８）。アルツハイマー型認知症患者のｉＰＳ細胞由来血管内皮細胞の各ウェル間のＣＶ値は、６．９２％であった。
　以上の結果より、条件６－２と比較して条件６－３の方法を用いることによって、自動でｉＰＳ細胞を均質な神経細胞や血管内皮細胞に分化誘導できることが示された。
　実施例５～９の結果より、本発明の方法及び装置を用いることによって、スクリーニング用の細胞アッセイに適した均質、且つ均一な細胞プレートを作製できることが明らかになった。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (33)

  1. 　接着培養した細胞を培養容器から剥離する方法であって、
    　前記培養容器に細胞剥離液を加えて前記細胞を細胞剥離液で処理する、細胞剥離液処理工程、及び
    　前記細胞剥離液処理後の前記細胞に対して吐出液を吐出して、前記培養容器表面から前記細胞を剥離する、剥離工程
    を含み、
    　前記剥離工程において吐出液を吐出する線速度が３００ｍｍ／秒～１５００ｍｍ／秒であり、かつ
    　前記剥離工程は、
    　　前記培養容器表面にスポット状に吐出液を吐出し、隣接するスポットの中心間距離が４ｍｍ～３３ｍｍであるか、又は
    　　前記培養容器表面に設定した４ｍｍ～３３ｍｍ間隔の線状路上に吐出液を連続して吐出する、前記方法。
  2. 　前記細胞剥離液がプロテアーゼ及び／又はキレート剤を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記細胞剥離液処理工程において細胞剥離液による処理を１分間～３０分間、及び／又は１５℃～４５℃で行う、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記細胞剥離液処理工程において前記培養容器を揺動する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記揺動を振幅２ｍｍかつ／又は振動数１Ｈｚ～８．５Ｈｚで行う、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記細胞剥離液処理工程と前記剥離工程との間に細胞剥離液を除去する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記剥離工程において、前記細胞が接着した前記培養容器表面に対する吐出液の吐出角度が７５度～８５度である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記剥離工程において、吐出液を吐出する吐出口の口径が０．１ｍｍ～２．０ｍｍである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記剥離工程後の前記細胞を回収する回収工程をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　前記回収工程が、剥離した前記細胞を含む細胞懸濁液の液面及び液中を含む複数の位置から前記細胞を回収することを含む、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記細胞が、接着性の、幹細胞、前駆細胞、分化細胞、株化細胞、又は不死化細胞である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　前記幹細胞が、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、及び神経幹細胞からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 　前記幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記剥離工程が、
    　　前記培養容器表面にスポット状に吐出液を吐出し、隣接するスポットの中心間距離が４ｍｍ～２０ｍｍであるか、又は
    　　前記培養容器表面に設定した４ｍｍ～２０ｍｍ間隔の線状路上に吐出液を連続して吐出する、請求項１３に記載の方法。
  15. 　培養容器表面における単位面積当たりの細胞数が２１．０×１０４細胞／ｃｍ２以上である、請求項１３又は１４に記載の方法。
  16. 　前記細胞剥離液が２×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 　前記分化細胞が神経細胞、又は血管内皮細胞である、請求項１１に記載の方法。
  18. 　前記剥離工程は、
    　　前記培養容器表面にスポット状に吐出液を吐出し、隣接するスポットの中心間距離が２３ｍｍ～３３ｍｍであるか、又は
    　　前記培養容器表面に設定した２３ｍｍ～３３ｍｍ間隔の線状路上に吐出液を連続して吐出する、請求項１７に記載の方法。
  19. 　前記細胞剥離液処理工程から前記回収工程までを繰り返す繰り返し工程を含む、請求項９及びそれを引用する請求項１０～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 　接着性の幹細胞から分化細胞を生産する方法であって、
    　第１培養容器において前記幹細胞を接着培養する第１培養工程、
    　前記第１培養容器に第１細胞剥離液を加えて前記幹細胞を第１細胞剥離液で処理する、第１細胞剥離液処理工程、
    　前記第１細胞剥離液処理工程後の前記幹細胞に対して第１吐出液を吐出して、前記第１培養容器表面から前記幹細胞を剥離する、第１剥離工程、
    　前記第１剥離工程後に前記幹細胞を回収する第１回収工程、
    　前記第１回収工程で回収した前記幹細胞に分化誘導剤を加える、分化誘導工程、
    　前記分化誘導工程で得られた前駆細胞及び／又は分化細胞を第２培養容器において培養する第２培養工程、
    　前記第２培養容器に第２細胞剥離液を加えて前記前駆細胞及び／又は前記分化細胞を第２細胞剥離液で処理する、第２細胞剥離液処理工程、及び
    　前記第２細胞剥離液処理後の前記前駆細胞及び／又は前記分化細胞に対して第２吐出液を吐出して、前記第２培養容器表面から前記前駆細胞及び／又は前記分化細胞を剥離する、第２剥離工程
    を含み、前記第１剥離工程において第１吐出液を吐出する線速度、及び／又は前記第２剥離工程において第２吐出液を吐出する線速度が３００ｍｍ／秒～１５００ｍｍ／秒であり、かつ
    　前記第１剥離工程及び／又は前記第２剥離工程は、
    　　前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器の表面にスポット状に吐出液を吐出し、隣接するスポットの中心間距離が４ｍｍ～３３ｍｍであるか、又は
    　　前記第１培養容器及び／又は前記第２培養容器の表面に設定した４ｍｍ～３３ｍｍ間隔の線状路上に吐出液を連続して吐出する、前記方法。
  21. 　前記第２剥離工程後の前記前駆細胞及び／又は前記分化細胞を回収する第２回収工程、及び
    　前記第２回収工程で回収した前記前駆細胞及び／又は前記分化細胞をマルチウェルプレートに播種する播種工程
    をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 　前記幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項２０又は２１に記載の方法。
  23. 　前記分化細胞が神経細胞である、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 　接着培養した細胞を剥離する細胞剥離機構を搭載する装置であって、
    　前記細胞が接着した培養容器に細胞剥離液を添加する細胞剥離液添加部、及び
    　前記培養容器表面に吐出液を吐出する吐出部
    を備え、
    　前記吐出部は、３００ｍｍ／秒～１５００ｍｍ／秒の線速度で吐出液を吐出し、前記培養容器表面に吐出液を吐出する位置を制御する吐出位置制御手段を含む、前記装置。
  25. 　前記培養容器表面から剥離した前記細胞を回収する細胞回収部をさらに備えた、請求項２４に記載の装置。
  26. 　前記吐出部が、前記培養容器表面に対する吐出液の吐出角度を調整する吐出角度制御手段を含む、請求項２４又は２５に記載の装置。
  27. 　前記細胞剥離液添加部が前記培養容器を揺動することができる、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の装置。
  28. 　前記吐出部が、口径０．１ｍｍ～２．０ｍｍの吐出口を有する、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の装置。
  29. 　前記吐出位置制御手段は、スポット状に剥離液を吐出させ、隣接するスポット間の間隔が４ｍｍ～３３ｍｍである、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の装置。
  30. 　前記吐出位置制御手段は、培養容器表面に設定した４ｍｍ～３３ｍｍ間隔の線状路上に剥離液を連続して吐出させる、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の装置。
  31. 　前記細胞回収部は、剥離した前記細胞を含む細胞懸濁液において前記細胞を回収する位置を制御する回収位置制御手段を含む、請求項２５、及びそれを引用する請求項２６～３０のいずれか一項に記載の装置。
  32. 　前記回収位置制御手段は、前記細胞懸濁液の液面及び液中を含む複数の位置から前記細胞を回収させる、請求項３１に記載の装置。
  33. 　請求項２４～３２のいずれか一項に記載の装置を用いる、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
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