WO2023135259A1 - Procede semi-integre d'extraction assistee par enzymes et de purification d'acides p-hydroxycinnamiques - Google Patents

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WO2023135259A1
WO2023135259A1 PCT/EP2023/050752 EP2023050752W WO2023135259A1 WO 2023135259 A1 WO2023135259 A1 WO 2023135259A1 EP 2023050752 W EP2023050752 W EP 2023050752W WO 2023135259 A1 WO2023135259 A1 WO 2023135259A1
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WO
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acid
hydroxycinnamic
extraction
hydroxycinnamic acids
purification
Prior art date
Application number
PCT/EP2023/050752
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English (en)
Inventor
Florent ALLAIS
Louis MOUTERDE
Irina IOANNOU
Valentin REUNGOAT
Morad CHADNI
Amandine FLOURAT
Hélène DUCATEL
Original Assignee
Institut National Des Sciences Et Industries Du Vivant Et De L'environnement (Agroparistech)
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Publication date
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D11/00—Solvent extraction
    • B01D11/02—Solvent extraction of solids
    • B01D11/0288—Applications, solvents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D11/00—Solvent extraction
    • B01D11/02—Solvent extraction of solids
    • B01D11/0292—Treatment of the solvent
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C51/00—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides
    • C07C51/42—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C07C51/47—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by solid-liquid treatment; by chemisorption
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C51/00—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides
    • C07C51/42—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C07C51/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by liquid-liquid treatment

Definitions

  • the invention relates to the field of the production of p -hydroxycinnamic acids from a lignocellulosic plant biomass. More particularly, the invention relates to a semi-integrated process comprising a first stage of enzymatic hydrolysis and a second stage of purification of the p -hydroxycinnamic acids, thus released, by liquid/liquid extraction using a membrane contactor. This process allows the purification of p -hydroxycinnamic acids from a lignocellulosic plant biomass and their recovery in the organic phase. It is possible to recover the p -hydroxycinnamic acids in the aqueous phase after a back-extraction step.
  • p -Hydroxycinnamic acids are molecules with numerous and diverse biological activities (antioxidant, anti-inflammatory, antimicrobial, etc.). They are also building blocks of choice for the production of anti-UV, antioxidant, antimicrobial molecules, bisphenol A substitutes, biobased monomers and polymers.
  • p -hydroxycinnamic acids can be obtained by chemical synthesis, biotechnologically or by recovery from biomass [1].
  • the third way is to obtain these acids by extraction then purification from biomass.
  • many unit operations must be implemented in order to obtain the p -hydroxycinnamic acids with high purity because these molecules are present in the plant biomass at a level of 1 to 2% by mass.
  • an alkaline hydrolysis makes it possible to release the acids from the walls of the biomass and a quasi-simultaneous extraction then occurs in the medium.
  • the residual liquid media can be purified by different technologies: liquid-liquid extraction, membrane processes [10;19], absorption, adsorption or ion exchange media [12 ; 14; 20; 21].
  • the use of alkaline solutions induces the loss of naturalness of the molecules produced.
  • a process for obtaining polyphenol-enriched honey from plant material is described in patent RO133390A0.
  • the process described in this document comprises 7 steps. Among these 7 steps, 5 steps relate to extraction (extraction and re-extraction), a honey enrichment step and finally a honey recovery step.
  • One of the steps according to the method comprises in particular the addition of a mixture of enzymes composed of hydrolases acting on the polysaccharides of the cell wall and feruloyl esterases, followed by an enzyme-assisted extraction of the plant material in the water for 5 hours at 55-60°C and pH 6.0.
  • the inventors have developed an innovative process for the production of p -hydroxycinnamic acids in an aqueous medium, by extraction and purification from a lignocellulosic plant biomass.
  • the process for the production of p -hydroxycinnamic acids includes the integration of several unit operations in order to reduce the number of steps, and it allows the preservation of the naturalness of the molecules by the implementation of eco-extraction processes using enzymes. It is more generally a process for the selective purification of p -hydroxycinnamic acids. The advantages of this process are numerous.
  • an enzymatic hydrolysis of p -hydroxycinnamic acids is obtained without any pH adjustment (no addition of base or acid).
  • the inventors have shown that it is possible to use enzymatic cocktails directly at the pH of the biomass used, that is to say at a pH lower than the pH of optimal conventional use. Hydrolysis is in fact carried out at a pH below 5.5 (and up to 4.2) whereas the p -hydroxycinnamoyl esterase activity of the enzymatic mixtures is optimal at pH 6.
  • the p - hydroxycinnamoyl esterase of the enzymatic cocktails used is sufficient for significant hydrolysis of p -hydroxycinnamic acids (greater than or equal to 58% depending on the biomass used).
  • the proposed production process is green, sustainable and at controlled costs. No organic solvent is used for the Solid/Liquid extraction, no salt is generated by chemical conversion. The molecules of interest produced by this process are therefore devoid of contaminants.
  • the innovation of the process is based on the combination of an enzymatic conversion with the use of a membrane contactor.
  • the molecules are released into an aqueous medium.
  • these molecules are hydrophobic in nature and will therefore tend to pass into the organic solvent at the level of the contactor.
  • the use of the membrane contactor therefore allows an enrichment of the organic phase in molecules of interest. This contributes to obtaining a high purification yield.
  • the molecules of interest are subsequently recovered in solid form by various conventional methods (evaporation, back-extraction).
  • the use of a membrane contactor allows liquid/liquid extraction with a constant exchange surface and avoiding the formation of emulsions appearing when the aqueous and organic phase come into contact.
  • the purification step has a high selectivity, which makes it possible to reduce the number of unit operations making it possible to recover the p -hydroxycinnamic acids with high purity and thus to reduce the cost of the purification process.
  • the process allows a scale-up with a view to its industrialization.
  • the process therefore makes it possible to envisage the production of large volumes of p -hydroxycinnamic acids, which is moreover in an aqueous medium, which opens the way to new applications in fields where the presence of solvent is prohibited, but also to any application which requires large quantities of p -hydroxycinnamic acids.
  • the lignocellulosic plant biomass used in this process is advantageously a co-product of a transformation process such as pressing, milling, etc.
  • the release of the p -hydroxycinnamic acids present in the biomass is carried out by enzymatic hydrolysis at acid pH.
  • the pH depends on the nature of the biomass but is less than or equal to 5.5. It is obtained naturally without adding an acid or basic solution.
  • the pH is between 4 and 5.5.
  • an enzyme or more generally of a cocktail of enzymes, depends on the nature of the biomass and on the form in which the p -hydroxycinnamic acids are found.
  • This enzymatic cocktail will contain at least one p- hydroxycinnamoyl esterase, for example a feruloyl esterase.
  • the hydrolysis is carried out by an enzymatic preparation (cocktail of enzymes) comprising at least one p- hydroxycinnamoyl esterase and optionally another enzyme chosen from a pectinase, a hemicellulase, a beta- glucanase, a xylanase, an arabinoxylase, etc.
  • an enzymatic preparation comprising at least one p- hydroxycinnamoyl esterase and optionally another enzyme chosen from a pectinase, a hemicellulase, a beta- glucanase, a xylanase, an arabinoxylase, etc.
  • the preparation adapted to the biomass is chosen by the person skilled in the art.
  • Suitable enzyme cocktails are the following commercial mixes: Pectinex Ultra SP-L, celluclast 1.5L, Ultraflo L, Pectinase Protease MSD, D740L, D686L, D793L, D692L, D040L, P062L, C013L and G015L.
  • the hydrolysis is carried out by at least one enzyme such as rumen FAE or an enzymatic cocktail comprising at least one p -hydroxycinnamoyl esterase activity chosen from Depol 740L, Ultraflo XL, Deltazym VR AC-100, Pectinase PL Amano, Celluclast 1.5L, Pectinex Ultra SP-L.
  • at least one enzyme such as rumen FAE or an enzymatic cocktail comprising at least one p -hydroxycinnamoyl esterase activity chosen from Depol 740L, Ultraflo XL, Deltazym VR AC-100, Pectinase PL Amano, Celluclast 1.5L, Pectinex Ultra SP-L.
  • the purification step must take place in a medium whose pH is between 4 and 6. Either the plant matrix naturally allows acidification of the medium and the pH is appropriate for purification step 2, or step d hydrolysis has led to an increase in the pH and this must be adjusted between 4 and 6.
  • the adjustment of the pH, if necessary, is carried out by adding an acid solution, the person skilled in the art knows conventional methods of pH adjustment.
  • Step 2 is carried out in an aqueous medium using an organic solvent. Any organic solvent adapted to the nature of the molecule of interest to be purified may be used.
  • the organic solvent or more generally the mixture of organic solvents, to be used is chosen from at least one of the following solvents: 4-methylpentan-2-one (MIBK), methoxycyclopentane (CPME), fatty alcohols (octanol, decanol, oleyl alcohol), fatty esters (octyl acetate, lauryl acetate).
  • MIBK 4-methylpentan-2-one
  • CPME methoxycyclopentane
  • fatty alcohols octanol, decanol, oleyl alcohol
  • fatty esters octyl acetate, lauryl acetate
  • the membrane contactor is hollow fiber but other configurations such as flat membranes could be used. Hollow fiber membrane contactors can vary in number, length and diameter of fibers, porosity and number of pores as well as exchange surface.
  • the organic solvent used in step 2 can be chosen from at least one of the following solvents: 4-methylpentan-2-one (MIBK), methoxycyclopentane (CPME), fatty alcohols (octanol, decanol, oleyl alcohol), esters fatty (octyl acetate, lauryl acetate).
  • the solvent is chosen from MIBK or CPME, most preferably it is CPME.
  • This process therefore allows the purification of p -hydroxycinnamic acids from a lignocellulosic biomass and their recovery in the organic phase.
  • This back-extraction step consists in extracting the p -hydroxycinnamic acid from the organic solvent either by evaporation for volatile solvents, or by liquid-liquid extraction for non-volatile solvents using a basic solution.
  • the basic solution used for this back-extraction step can be, for example, a sodium hydroxide solution concentrated at 2.5 grams per liter of pH 12 but can be of a different ionic nature, the person skilled in the art knows the classic basic solutions for the back-extraction of 'a compound.
  • the method makes it possible to produce sinapic acid from mustard bran and/or rapeseed cake, or any other biomass comprising sinapic acid in free or bound form. .
  • the method makes it possible to produce ferulic acid from wheat bran, and/or beet pulp and/or corn cob and/or rice bran , or any other biomass comprising ferulic acid in free or bound form.
  • the method makes it possible to produce caffeic acid from endive roots and/or coffee grounds, or any other biomass comprising caffeic acid in the free form or linked.
  • the p -hydroxycinnamic acids produced by applying the process according to the invention can be used as finished products or platform molecules for the markets of fine chemicals, cosmetics, specialty chemicals, plant protection, agro-food and biomaterials.
  • the process according to the invention is composed of unit operations which have been optimized according to the initial biomass of the acid to be produced in order to provide a high yield and a high degree of purity.
  • the general implementation remains the same for any type of biomass.
  • the control process consists of individually optimized unit operations, without studying the process as a whole.
  • the control extraction was carried out in a mixture of 70%v ethanol and 30%v water at 75°C.
  • Control conversion is based on chemical hydrolysis.
  • concentration obtained by the control process is the maximum concentration of p -hydroxycinnamic acid that can be obtained from the starting biomass.
  • Table 1 summarizes the operating conditions implemented for each of Examples 2 to 5.
  • Example 2 Example 3
  • Example 4 Example 5 Enzyme Assisted Extraction Extraction in aqueous medium S/L ratio 10 – 100 mL/g DM 100 mL/g DM 2 to 10% DM 1/10 - 1/50 gM/ml Extraction temperature 30 to 100°C 100°C 30 to 60°C Ambient temp-100°C Time From 20 min to 2h40 40 mins 6 -24h 5 - 120 mins Hydrolysis enzymes Depol 740L, Ultraflo XL, Deltazym VR AC-100, Pectinase PL Amano, Rumen FAE Deltazym VR AC-100 Ultraflo XL (G)/ Pectinase PL (P) / Celluclast 1.5L (C) Pectinase PL "Amano" / Pectinex Ultra SP/ temperature 30 – 75°C 50°C 30 to 60°C Ambient T°-60°C pH 4.2 ⁇ 0.1 5.5 3.75 – 5.75 4-
  • the screening of the enzymatic cocktails consisted in measuring their secondary activity (caffeoyl, feruloyl or sinapoyl esterase). For this, on a model solution of p -hydroxycinnamic acid ester, the esterase activity of the cocktail was measured by spectrophotometry (difference in absorbance between the ester form and the acid form of the dosed molecules). The degree of conversion of the ester into p -hydroxycinnamic acid was measured for 10 minutes at temperatures of 25 - 35 - 45 - 50 - 55°C and at a pH of 6 - 7 - 8. The cocktail retained is that which allows the best conversion rate.
  • the mustard bran is suspended in an aqueous solution (milliQ water). The whole is stirred (mechanical stirring at 60 rpm) and heated to 100°C for 20 minutes. A rest period of 30 minutes in an oil bath thermostated at 40°C is carried out. Once the temperature of 40°C has been reached, the enzymatic solution is then added, allowing the conversion into sinapic acid to be carried out.
  • the hydrolysis in optimal conditions was carried out at a temperature of 40° C. and a pH of 4.2 for a rate of conversion of sinapine into sinapic acid of 58%.
  • the separation of the solid and the liquid extract is carried out by centrifugation (4000 g, 20 min, 4°C).
  • the latter is filtered by microfiltration in order to remove particles with a diameter greater than 2-3 ⁇ m.
  • the filtrate obtained corresponds to the aqueous phase.
  • Purification is carried out by liquid/liquid extraction through a membrane (membrane contactor).
  • An aqueous phase containing sinapic acid is brought into contact through a membrane with an organic phase.
  • Sinapic acid having more affinity with the organic phase than with the aqueous phase it will diffuse and enrich the organic phase.
  • different methods can be used to recover sinapic acid in solid form.
  • the yield of the extraction of sinapic acid is greater than 87% for a degree of purity of 49% using MIBK as solvent and 62% using CPME as solvent.
  • the rapeseed meal is suspended in an aqueous solution (milliQ water).
  • the whole is stirred (mechanical stirring at 60 rpm) and heated to 100°C for 20 minutes. Cooling is carried out using an oil bath thermostated at 40°C for 50 minutes to reach a temperature of 50°C.
  • the enzymatic solution is then added, making it possible to carry out the conversion into sinapic acid.
  • the hydrolysis in optimal conditions was carried out at a temperature of 50° C. and a pH of 5.5 for a rate of conversion of sinapine into sinapic acid greater than 80%.
  • the separation of the solid and the liquid extract is carried out by centrifugation (4000 g, 20 min, 4°C).
  • the latter is filtered by microfiltration in order to remove particles with a diameter greater than 2-3 ⁇ m.
  • the filtrate obtained corresponds to the aqueous phase.
  • This is acidified to pH 4.5 with acetic acid.
  • Purification is carried out by liquid/liquid extraction through a membrane (membrane contactor).
  • An aqueous phase containing sinapic acid is brought into contact through a membrane with an organic phase.
  • Sinapic acid having more affinity with the organic phase than with the aqueous phase it will diffuse and enrich the organic phase.
  • different methods can be used to recover sinapic acid in solid form.
  • the yield of the extraction of sinapic acid is greater than 81% using MIBK or octyl acetate as solvent.
  • Wheat bran (not destarched) undergoes grinding then sieving to obtain particles of size between 180 ⁇ m and 850 ⁇ m.
  • the wheat bran is then autoclaved (121°C for 20 min) and suspended in an aqueous solution (milliQ water) at 50°C.
  • the enzymes are then added to the medium which remains stirred for 24 hours, which allows the production of ferulic acid from the lignocellulose of wheat bran.
  • Hydrolysis under optimal conditions was carried out at a temperature of 50° C. and a pH of 4.2 for a ferulic acid release rate of 71%.
  • the separation of the solid and the liquid extract is carried out by centrifugation (4000g, 20 min, 4°C).
  • the latter is filtered by microfiltration in order to remove particles with a diameter greater than 2-3 ⁇ m.
  • the filtrate obtained corresponds to the aqueous phase.
  • Purification is carried out by liquid/liquid extraction through a membrane (membrane contactor).
  • An aqueous phase containing ferulic acid is brought into contact through a membrane with an organic phase. Since ferulic acid has more affinity with the organic phase than with the aqueous phase, it will diffuse and enrich the organic phase.
  • different methods can be implemented to recover ferulic acid in solid form.
  • the yield of the extraction of ferulic acid is greater than 85% for a degree of purity of 46% using MIBK as solvent and 52% using CPME as solvent.
  • the dried and ground endive roots ( ⁇ 500 ⁇ m) are suspended in an aqueous solution (milliQ water).
  • the enzymatic solution is added to simultaneously perform the extraction of chlorogenic acid and its conversion into caffeic acid.
  • the whole is then stirred using a magnetic stirrer (600 rpm) and heated to 30°C for 60 minutes. Hydrolysis in optimal conditions was carried out at a temperature of 30° C. and a pH of 4.2 for a rate of conversion of chlorogenic acid into caffeic acid greater than 98%.
  • the separation of the solid and the liquid extract is carried out by centrifugation.
  • the latter is filtered by microfiltration in order to remove particles with a diameter greater than 2-3 ⁇ m.
  • the filtrate obtained corresponds to the aqueous phase.
  • Purification is carried out by liquid/liquid extraction through a membrane (membrane contactor).
  • An aqueous phase containing caffeic acid is brought into contact through a membrane with an organic phase. Since caffeic acid has more affinity with the organic phase than with the aqueous phase, it will diffuse and enrich the organic phase.
  • different methods can be used to recover caffeic acid in solid form.

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Abstract

L'invention a trait au domaine de la production d'acides p-hydroxycinnamiques. Plus particulièrement l'invention concerne un procédé semi-intégré comprenant une première étape d'hydrolyse enzymatique et une seconde étape de purification des acides p-hydroxycinnamiques, ainsi libérés, par extraction liquide/liquide utilisant un contacteur membranaire. Ce procédé permet la purification d'acides p-hydroxycinnamiques à partir d'une biomasse végétale et leur récupération en phase organique. Il est envisageable de récupérer les acides p-hydroxycinnamiques en phase aqueuse après une étape de désextraction.

Description

PROCEDE SEMI-INTEGRE D’EXTRACTION ASSISTEE PAR ENZYMES ET DE PURIFICATION D’ACIDES P-HYDROXYCINNAMIQUES
L’invention a trait au domaine de la production d’acides p-hydroxycinnamiques à partir d’une biomasse végétale lignocellulosique. Plus particulièrement l’invention concerne un procédé semi-intégré comprenant une première étape d’hydrolyse enzymatique et une seconde étape de purification des acides p-hydroxycinnamiques, ainsi libérés, par extraction liquide/liquide utilisant un contacteur membranaire. Ce procédé permet la purification d’acides p-hydroxycinnamiques à partir d’une biomasse végétale lignocellulosique et leur récupération en phase organique. Il est envisageable de récupérer les acides p-hydroxycinnamiques en phase aqueuse après une étape de désextraction.
Domaine de l’invention
Les acides p-hydroxycinnamiques sont des molécules disposant de nombreuses et diverses activités biologiques (antioxydante, anti-inflammatoire, antimicrobienne…). Ils sont également des synthons de choix pour la production de molécules anti-UV, antioxydantes, antimicrobiennes, de substituts au bisphénol A, de monomères et polymères biosourcés.
Actuellement, les acides p-hydroxycinnamiques peuvent s’obtenir par synthèse chimique, par voie biotechnologique ou par récupération à partir de la biomasse [1].
La voie de synthèse chimique la plus utilisée est une condensation de Knoevenagel-Doebner entre l’acide malonique et l’aldéhyde correspondant, avec utilisation de pyridine comme solvant et d'aniline comme catalyseur. Des développements pour rendre la synthèse plus verte ont été opérés, en substituant la pyridine par de l'éthanol et l'aniline par de la proline, cependant les acides p-hydroxycinnamiques obtenus ne peuvent avoir la mention « molécule naturelle » [2-5].
En ce qui concerne la production par voie biotechnologique, la construction et l'insertion d'une voie métabolique dans des levures ainsi que la surexpression des gènes correspondant permet de produire les acides p-hydroxycinnamiques [6-9]. Les molécules obtenues peuvent être considérées naturelles, cependant, seule la voie de production d’acide p-coumarique a actuellement une productivité suffisamment élevée pour être industrialisable.
La 3e voie est l’obtention de ces acides par extraction puis purification à partir de biomasse. Dans ce cas, de nombreuses opérations unitaires doivent être mises en œuvre afin d’obtenir les acides p-hydroxycinnamiques avec une grande pureté car ces molécules sont présentes dans la biomasse végétale à hauteur de 1 à 2% massique.
De nombreux travaux sont recensés dans la littérature mais peu ont travaillé au développement d’une chaine de production d’acides p-hydroxycinnamiques de l’extraction à la purification. Même si des rendements élevés peuvent être atteints après purification, le coût de production reste un obstacle à l’industrialisation. Deux cas de figure sont rencontrés : soit l’acide ou ses dérivés sont présents sous forme libre (par exemple dans le son de moutarde [10-12], les tourteaux de colza [13-15], les co-produits d’endives [16-18]) soit ils sont présents sous forme liée aux parois végétales (par exemple dans le son de blé [19-21]). Dans le premier cas, il est nécessaire d’extraire la molécule puis éventuellement de la convertir en acide p-hydroxycinnamique. Cette conversion s’effectue la plupart du temps à l’aide de solutions alcalines. Dans le second cas, une hydrolyse alcaline permet de libérer les acides des parois de la biomasse et une extraction quasi-simultanée se produit alors dans le milieu. Dans les deux cas, les milieux liquides résiduels peuvent être purifiés par différentes technologies : l’extraction liquide-liquide, les procédés membranaires [10 ;19], les supports d’absorption, d’adsorption ou d’échange d’ions [12 ; 14 ; 20 ; 21]. Toutefois, l’utilisation de solutions alcalines induit la perte de naturalité des molécules produites. Certaines études ont privilégié l’emploi d’enzymes, permettant alors de conserver la naturalité des molécules, cependant il est alors nécessaire d’adapter les conditions opératoires des autres opérations unitaires à leur utilisation.
L’obtention des acides p-hydroxycinnamiques par extraction/purification à partir de la biomasse semble être la voie la plus pertinente en termes de développement et d’exploitation, notamment par l’utilisation possible de co-produits agro-industriels. Toutefois, aucun procédé industrialisable flexible et applicable à l’ensemble des acides p-hydroxycinnamiques n’est disponible à ce jour.
L’art antérieur rapporte des études portant sur chaque opération unitaire comme par exemple l’extraction des dérivés d’acides p-hydroxycinnamiques (sinapine, acide chlorogénique), la conversion enzymatique en acides p-hydroxycinnamiques ou leur purification. Seul Thiel et al. (2015) ont proposé un procédé intégré de séparation pour récupérer simultanément les protéines, l’acide sinapique et l’acide phytique à partir de colza (WO 2015/181203 AI). Ce brevet met en œuvre une extraction aqueuse avec une hydrolyse alcaline simultanée suivie par une purification par adsorption sur zéolithes.
Un procédé d’obtention de miel enrichi en polyphénols à partir d’un matériau végétal est décrit dans le brevet RO133390A0. Le procédé décrit dans ce document comprend 7 étapes. Parmi ces 7 étapes, 5 étapes concernent l’extraction (extraction et ré-extraction), une étape d’enrichissement en miel et enfin une étape de récupération du miel. L’une des étapes selon le procédé comprend notamment l’ajout d’un mélange d’enzymes composé d’hydrolases agissant sur les polysaccharides de la paroi cellulaire et de feruloyl estérases, suivi d’une extraction assistée par enzymes du matériel végétal dans l’eau pendant 5 heures à 55-60 °C et à pH 6,0.
La conversion enzymatique pour l’obtention d’acides p-hydroxycinnamiques à la suite d’une extraction aqueuse a été étudiée par Odinot et al. (2017). Ils ont décrit un procédé de préparation d’un composé vinylphénolique à partir d’un acide hydroxycinnamique précurseur issu d’un tourteau oléagineux (WO2017/072450 A1). Les enzymes utilisées ont été produites par des souches d’Aspergillus Niger.
Construire des filières industrielles pour la production de ces acides p-hydroxycinnamiques et leurs nombreux dérivés à haute valeur ajoutée requiert un accès à ces acides en volumes relativement importants, mais surtout avec un coût suffisamment bas. A ces contraintes s’ajoutent l’intérêt des consommateurs pour des molécules « naturelles » par rapport à des molécules issues de synthèse chimique.
Il existe un besoin de disposer d’un procédé industrialisable de purification d’acides p-hydroxycinnamiques à partir d’une biomasse.
Les inventeurs ont développé un procédé innovant de production d’acides p-hydroxycinnamiques dans un milieu aqueux, par voie d’extraction et de purification à partir d’une biomasse végétale lignocellulosique.
Plus particulièrement, le procédé selon l’invention comprend les deux étapes suivantes, représentées à la  :
  • Etape 1 : Extraction solide/liquide avec hydrolyse enzymatique à un pH inférieur à 5.5 desdits acides p-hydroxycinnamiques qui sont soit greffés aux hémicelluloses, soit présents sous forme de dérivés esters ;
  • Etape 2 : Purification des dits acides p-hydroxycinnamiques libérés à l’étape 1 par une extraction liquide/liquide couplée à un contacteur membranaire composé de membranes à fibres creuses à partir d’un milieu aqueux vers un solvant organique.
Il permet notamment la production au niveau industriel d’acide sinapique, d’acide férulique et d’acide caféique.
Avantages de l’invention
Le procédé de production d’acides p-hydroxycinnamiques comprend l’intégration de plusieurs opérations unitaires afin de réduire le nombre d’étapes, et il permet la conservation de la naturalité des molécules par la mise en œuvre de procédés d’éco-extraction utilisant des enzymes. Il s’agit plus globalement d’un procédé de purification sélective des acides p-hydroxycinnamiques. Les avantages de ce procédé sont nombreux.
En premier lieu, il s’agit d’un procédé intégrant l’extraction et l’hydrolyse enzymatique en une seule étape, sans changement de milieu. Ainsi l’optimisation des deux opérations a été faite sous contraintes. Le gain de cette intégration est la diminution des volumes utilisés, la suppression d’étapes intermédiaires pour changer le solvant entre l’extraction et la conversion.
De plus, une hydrolyse enzymatique des acides p-hydroxycinnamiques est obtenue sans aucun ajustement de pH (pas d'ajout de base ou d'acide). En effet, les inventeurs ont montré qu’il est possible d’utiliser des cocktails enzymatiques directement au pH de la biomasse mise en œuvre, c’est-à-dire à un pH inférieur au pH d’utilisation classique optimale. L’hydrolyse est en effet réalisée à un pH inférieur à 5.5 (et jusqu'à 4.2) alors que l'activité p -hydroxycinnamoyl estérase des mélanges enzymatiques est optimale à pH 6. A ce pH inférieur à 5.5, l’activité p -hydroxycinnamoyl estérase des cocktails enzymatiques mis en œuvre est suffisante pour une hydrolyse importante des acides p-hydroxycinnamiques (supérieur ou égale à 58% selon la biomasse mise en œuvre). Il en résulte deux avantages : on s’affranchit de l’étape d’ajustement du pH par ajout de solutions acides et on conserve de ce fait la naturalité des acides p-hydroxycinnamiques.
En second lieu, le procédé de production proposé est vert, durable et à coûts maitrisés. Aucun solvant organique n’est utilisé pour l’extraction Solide/Liquide, aucun sel n’est généré par conversion chimique. Les molécules d’intérêt produites par ce procédé sont donc dénuées de contaminants.
En particulier, l’innovation du procédé repose sur la combinaison d’une conversion enzymatique avec l’utilisation d’un contacteur membranaire. Lors de l’étape d’extraction-hydrolyse enzymatique, les molécules sont libérées dans un milieu aqueux. Or, ces molécules sont de nature hydrophobe et vont donc avoir tendance à passer dans le solvant organique au niveau du contacteur. L’utilisation du contacteur membranaire permet donc un enrichissement de la phase organique en molécules d’intérêt. Ceci contribue à l’obtention d’un rendement de purification élevé. Les molécules d’intérêt étant par la suite récupérées sous forme solide par différentes méthodes classiques (évaporation, désextraction). L’utilisation d’un contacteur membranaire permet une extraction liquide/liquide avec une surface d’échange constante et en évitant la formation d’émulsions apparaissant lors de la mise en contact de la phase aqueuse et organique.
En troisième lieu, l’étape de purification présente une forte sélectivité, ce qui permet de diminuer le nombre d’opérations unitaires permettant de récupérer les acides p-hydroxycinnamiques avec une pureté élevée et ainsi de diminuer le coût du procédé de purification.
Enfin, compte tenu des optimisations décrites précédemment, le procédé permet une montée en échelle en vue de son industrialisation. Le procédé permet donc d’envisager la production de volumes importants d’acides p-hydroxycinnamiques, qui plus est en milieu aqueux, ce qui ouvre la voie à de nouvelles applications dans des domaines où la présence de solvant est proscrite, mais également à toute application qui requiert des quantités importantes d’acides p-hydroxycinnamiques.
 DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
La présente invention concerne un procédé de production d’acides p-hydroxycinnamiques à partir d’une biomasse végétale lignocellulosique, comprenant deux étapes :
  • Etape 1 : Extraction solide/liquide avec hydrolyse enzymatique à un pH inférieur à 5.5 desdits acides p-hydroxycinnamiques qui sont soit greffés aux hémicelluloses, soit présents sous forme de dérivés esters ;
  • Etape 2 : Purification des dits acides p-hydroxycinnamiques libérés à l’étape 1 par une extraction liquide/liquide couplée à un contacteur membranaire composé de membranes à fibres creuses à partir d’un milieu aqueux vers un solvant organique.
La biomasse végétale lignocellulosique utilisée dans ce procédé est avantageusement un coproduit d’un procédé de transformation tel qu’un pressage, une mouture….
La libération des acides p-hydroxycinnamiques présents dans la biomasse est réalisée par hydrolyse enzymatique à pH acide. Le pH dépend de la nature de la biomasse mais est inférieur ou égal à 5.5. Il est obtenu naturellement sans ajout de solution acide ou basique. De manière préférée, le pH est compris entre 4 et 5.5.
Le choix d’une enzyme, ou plus généralement d’un cocktail d’enzymes, dépend de la nature de la biomasse et de la forme sous laquelle se trouvent les acides p-hydroxycinnamiques. Ce cocktail enzymatique contiendra au minimum une p-hydroxycinnamoyl estérase, par exemple une feruloyl estérase.
Lorsque les acides p-hydroxycinnamiques sont greffés aux hémicelluloses, l’hydrolyse est réalisée par une préparation enzymatique (cocktail d’enzymes) comprenant au moins une p-hydroxycinnamoyl estérase et éventuellement une autre enzyme choisie parmi une pectinase, une hemicellulase, une beta-glucanase, une xylanase, une arabinoxylase… la préparation adaptée à la biomasse est choisie par l’homme du métier.
Des exemples de cocktails enzymatiques appropriés sont les mélanges commerciaux suivants : Pectinex Ultra SP-L, celluclast 1.5L, Ultraflo L, Pectinase Protease MSD, D740L, D686L, D793L, D692L, D040L, P062L, C013L et G015L.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, il s’agit d’un cocktail d’enzymes. Des exemples de tels cocktails permettant la libération des acides p-hydroxycinnamiques greffés aux hémicelluloses sont :
  • Pectinex Ultra SP-L (mélange de pectinases, hémicellulases et beta-glucanases)
  • Celluclast 1.5L
  • UltraFlo L, (mélange de beta-glucanase et d’arabinoxylanase)
  • Pectinase PL
  • Protease MSD
  • D740L (mélange comprenant une ferulic acid estérase (FAE), cellulase (CEL), et xylanase)
  • D686L (mélange comprenant une béta-glucanase)
  • D793L (mélange comprenant une béta-glucanase et une cellulase)
  • D692L (mélange comprenant une ferulic acid estérase (FAE) et une cellulase)
  • D040L (mélange comprenant une cellulase, des pectinases et une béta-glucosidase)
  • P062L
  • C013L (mélange comprenant une cellulase)
  • G015L.
Lorsque les acides p-hydroxycinnamiques sont présents sous forme de dérivés esters, l’hydrolyse est réalisée par au moins une enzyme telle que la FAE rumen ou un cocktail enzymatique comprenant au moins une activité p-hydroxycinnamoyl estérase choisi parmi Depol 740L, Ultraflo XL, Deltazym VR AC-100, Pectinase PL Amano, Celluclast 1.5L, Pectinex Ultra SP-L.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, il s’agit d’un cocktail d’enzymes. Des exemples de tels cocktails permettant la libération des acides p-hydroxycinnamiques présents sous forme d’esters sont :
  • Depol 740L,
  • Ultraflo XL,
  • Deltazym VR AC-100,
  • Pectinase PL « Amano »,
  • Celluclast 1.5L,
  • Pectinex Ultra SP-L.
L’étape de purification doit avoir lieu dans un milieu dont le pH est compris entre 4 et 6. Soit la matrice végétale permet naturellement l’acidification du milieu et le pH est approprié à l’étape 2 de purification, soit l’étape d’hydrolyse a conduit à une augmentation du pH et celui-ci- doit être ajusté entre 4 et 6. L’ajustement du pH, s’il est nécessaire, est réalisé en ajoutant une solution d’acide, l’homme du métier connait les méthodes classiques d’ajustement du pH.
L’étape 2 est réalisée dans un milieu aqueux en utilisant un solvant organique. Tout solvant organique adapté à la nature de la molécule d’intérêt à purifier pourra être utilisé.
Le solvant organique, ou plus généralement le mélange de solvants organiques, à utiliser est choisi parmi au moins l’un des solvants suivants : 4-méthylpentan-2-one (MIBK), méthoxycyclopentane (CPME), alcools gras (octanol, décanol, alcool oléique), esters gras (acétate d’octyle, acétate de lauryle).
Le contacteur membranaire est à fibres creuses mais d’autres configurations telles que les membranes planes pourraient être utilisées. Les contacteurs membranaires à fibres creuses peuvent varier en fonction du nombre, de la longueur et du diamètre des fibres, de la porosité et du nombre de pores ainsi que de la surface d’échange.
Les différentes étapes du procédé de purification sélective des acides p-hydroxycinnamiques peuvent être résumées ainsi :
  • Disposer d’une biomasse végétale lignocellulosique
  • Mise en suspension en solution aqueuse après un éventuel broyage en fonction de la nature de la biomasse
  • Chauffage de ladite solution aqueuse (typiquement entre 30 et 120 °C en fonction de la biomasse)
  • Refroidissement entre 30 et 50 °C (avant ajout des enzymes)
  • Ajout d’une solution enzymatique ayant une activité p-hydroxycinnamoyl estérase permettant de réaliser soit la libération des acides greffés aux hémicelluloses, soit la conversion des acides sous forme de dérivés esters 
  • Séparation du solide et de l’extrait liquide par centrifugation
  • Microfiltration (afin d’enlever les particules ayant un diamètre supérieur à 2-3 µm) pour obtention d’un filtrat aqueux
  • Ajustement du pH du filtrat aqueux entre 4 et 6, si nécessaire
  • Purification desdites acides par extraction liquide/liquide à travers une membrane avec une phase organique.
Le solvant organique utilisé à l’étape 2 peut être choisi parmi au moins l’un des solvants suivants : 4-méthylpentan-2-one (MIBK), méthoxycyclopentane (CPME), alcools gras (octanol, décanol, alcool oléique), esters gras (acétate d’octyle, acétate de lauryle). De manière préférée, le solvant est choisi parmi le MIBK ou le CPME, de manière tout à fait préférée, il s’agit du CPME.
Ce procédé permet donc la purification d’acides p-hydroxycinnamiques à partir d’une biomasse lignocellulosique et leur récupération en phase organique. Pour disposer des acides p-hydroxycinnamiques en phase aqueuse, il est possible de réaliser une étape supplémentaire de désextraction à partir de la phase organique.
Cette étape de désextraction consiste à extraire l’acide p-hydroxycinnamique du solvant organique soit par évaporation pour des solvants volatils, soit par extraction liquide-liquide pour des solvants non volatils à l’aide d’une solution basique. La solution basique utilisée pour cette étape de désextraction peut être par exemple une solution de soude concentrée à 2,5 grammes par litre de pH 12 mais peut être de nature ionique différente, l’homme du métier connait les solutions basiques classiques pour la désextraction d'un composé.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le procédé permet de produire de l’acide sinapique à partir de son de moutarde et/ou de tourteaux de colza, ou toute autre biomasse comportant de l’acide sinapique sous forme libre ou liée.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, le procédé permet de produire de l’acide férulique à partir de son de blé, et/ou de pulpe de betterave et/ou de rafle de maïs et/ou de son de riz, ou toute autre biomasse comportant de l’acide férulique sous forme libre ou liée.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le procédé permet de produire de l’acide caféique à partir de racines d’endive et/ou de marc de café, ou toute autre biomasse comportant de l’acide caféique sous forme libre ou liée.
Les acides p-hydroxycinnamiques produits en appliquant le procédé selon l’invention peuvent être utilisés en tant que produits finis ou molécules plateformes pour les marchés de la chimie fine, de la cosmétique, de la chimie de spécialité, de la protection des plantes, de l’agro-alimentaire et des biomatériaux.
DESCRIPTION DES FIGURES
 : Représentation synthétique des deux étapes du procédé de production des acides p-hydroxycinnamiques selon l’invention.
 : Représentation industrielle du procédé de production d’acides p-hydroxycinnamiques selon l’invention.
PARTIE EXPERIMENTALE
EXEMPLE 1 : Description des principes généraux du procédé d’extraction d’acides p -hydroxycinnamiques selon l’invention
Le procédé selon l’invention est composé d’opérations unitaires qui ont été optimisées en fonction de la biomasse initiale de l’acide à produire pour fournir un fort rendement et un degré de pureté élevé. Cependant la mise en œuvre générale reste la même pour tout type de biomasse.
Quatre exemples de mise en œuvre de ce procédé à partir de biomasse différente sont décrits ci-après :
  • La récupération d’acide sinapique à partir de son de moutarde (Exemple 2)
  • La récupération d’acide sinapique à partir de tourteaux de colza (Exemple 3)
  • La récupération d’acide férulique à partir de son de blé (Exemple 4)
  • La récupération d’acide caféique à partir de racines d’endive (Exemple 5)
Pour chaque exemple, un schéma descriptif précisant les conditions opératoires de chaque opération unitaire est fourni ; les étapes générales sont représentées à la .
La teneur en acide p-hydroxycinnamique a été déterminée par chromatographie liquide à l’aide de solutions standards. Le rendement en acide p-hydroxycinnamique est déterminée selon l’équation 1 :
Avec , la concentration en acide p-hydroxycinnamique (mg/gMatière Sèche) obtenue soit par une opération unitaire ou par le procédé semi-intégré proposé dans ce document et , la concentration en acide p-hydroxycinnamique (mg/gMatière Sèche) obtenue par un procédé témoin.
Le procédé témoin est constitué d’opérations unitaires optimisées individuellement, sans étudier le procédé dans sa globalité. L’extraction témoin a été réalisée dans un mélange 70%v éthanol et 30%v eau à 75 °C. La conversion témoin est basée sur une hydrolyse chimique. Nous considérons que la concentration obtenue par le procédé témoin est la concentration maximum en acide p-hydroxycinnamique que l’on peut obtenir à partir de la biomasse de départ.
La pureté de l’extrait en sortie de purification est déterminée selon l’équation 2 :
Avec , la masse d’acide p-hydroxycinnamique (mg) obtenue soit après chaque opération unitaire soit après purification et , la masse de matière sèche présente dans l’extrait purifié.
Les résultats obtenus portent sur l’optimisation de l’extraction assistée par enzymes et du procédé de purification. Le tableau 1 résume les conditions opératoires mises en œuvre pour chacun des exemples 2 à 5.
Etape Conditions opératoires Exemple 2 Exemple 3 Exemple 4 Exemple 5
Extraction assistée par enzymes Extraction en milieu aqueux Ratio S/L 10 – 100 mL/gMS 100 mL/gMS 2 à 10% MS 1/10 - 1/50 gM/mLS
T° d’extraction 30 à 100 °C 100 °C 30 à 60 °C T° amb-100 °C
Temps De 20 min à 2h40 40 min 6 -24h 5 - 120 min
Hydrolyse Enzymes Depol 740L, Ultraflo XL, Deltazym VR AC-100, Pectinase PL Amano, Rumen FAE Deltazym VR AC-100 Ultraflo XL (G)/ Pectinase PL (P) / Celluclast 1.5L (C) Pectinase PL "Amano" / Pectinex Ultra SP/
T° 30 – 75 °C 50 °C 30 à 60 °C T° amb-60 °C
pH 4,2 ± 0,1 5,5 3,75 – 5,75 4-à-8
Concentration Enzyme 60 – 1250 µL/gMS 1250 µL(solution enzymatique)/gMS Ratio G/C : de 20% à 100%
De 0 à 2 mL pour 100 mL (P)		 50 à 150 mg de solution enzymatique/g MS
Purification Solvants (phase organique) MIBK, CPME, octanol, acétate d’octyle, acétate de lauryle MIBK, acétate d’octyle, alcool oléique Acétate d’éthyle
Octanol
Décanol
Alcool oléique
MIBK
pH milieu aqueux 4,2 ± 0,1 pH 4,0 – 5,9 5,5 5,5
Ratio aqueux/
organique 		(1 :1) et (1:2)v avec l’hydrolysat végétal
(1:2)v – (1:10)v avec une solution modèle 		(1:1)v max avec l’hydrolysat végétal (1 :1) et (1:2)v avec l’hydrolysat végétal
(1:2)v – (1:5)v avec une solution modèle
T° Ambiante
Tableau 1 : Conditions opératoires mises en œuvre dans le cadre de l’optimisation
Le screening des cocktails enzymatiques a consisté à mesurer leur activité secondaire (caffeoyl, feruloyl ou sinapoyl estérase). Pour cela, sur une solution modèle d’ester d’acide p-hydroxycinnamique, l’activité estérase du cocktail a été mesurée par spectrophotométrie (différence d'absorbance entre la forme ester et la forme acide des molécules dosées). Le taux de conversion de l’ester en acide p-hydroxycinnamique a été mesuré durant 10 minutes aux températures 25 - 35 - 45 - 50 - 55 °C et à un pH de 6 - 7 - 8. Le cocktail retenu est celui qui permet le meilleur taux de conversion.
Ces expériences de screening ont confirmé que l’hydrolyse enzymatique peut être menée à pH acide, sans ajustement du pH et en restant au pH de la biomasse, soit jusqu'à un pH compris entre 4 et 5,5.
EXEMPLE 2 : Production d’acide sinapique à partir de son de moutarde
Le son de moutarde est mis en suspension dans une solution aqueuse (eau milliQ). L’ensemble est agité (agitation mécanique à 60 rpm) et chauffée à 100 °C pendant 20 minutes. Un temps de repos de 30 minutes dans un bain d’huile thermostaté à 40 °C est opéré. Une fois la température de 40 °C atteinte, la solution enzymatique est alors ajoutée permettant de réaliser la conversion en acide sinapique. L'hydrolyse en condition optimale a été réalisée à une température de 40 °C et un pH de 4,2 pour un taux de conversion de la sinapine en acide sinapique de 58%.
La séparation du solide et de l’extrait liquide est effectuée par centrifugation (4000 g, 20 min, 4 °C). Ce dernier est filtré par microfiltration afin d’enlever les particules ayant un diamètre supérieur à 2-3 µm. Le filtrat obtenu correspond à la phase aqueuse. La purification s’effectue par extraction liquide/liquide à travers une membrane (contacteur membranaire). Une phase aqueuse contenant l’acide sinapique est mise en contact à travers une membrane avec une phase organique. L’acide sinapique ayant plus d’affinité avec la phase organique qu’avec la phase aqueuse, celui-ci va diffuser et enrichir la phase organique. En fonction du type de phase organique, différentes méthodes pourront être mises en œuvre pour récupérer l’acide sinapique sous forme solide. Le rendement de l'extraction de l'acide sinapique est supérieur à 87% pour un taux de pureté de 49% en utilisant comme solvant le MIBK et de 62% en utilisant comme solvant le CPME.
EXEMPLE 3 : Production d’acide sinapique à partir de tourteaux de colza
Le tourteau de colza est mis en suspension dans une solution aqueuse (eau milliQ). L’ensemble est agité (agitation mécanique à 60 rpm) et chauffée à 100 °C pendant 20 minutes. Un refroidissement est opéré à l’aide d’un bain d’huile thermostaté à 40 °C pendant 50 minutes pour atteindre la température de 50 °C. La solution enzymatique est alors ajoutée permettant de réaliser la conversion en acide sinapique. L'hydrolyse en condition optimale a été réalisée à une température de 50 °C et un pH de 5,5 pour un taux de conversion de la sinapine en acide sinapique supérieur à 80%.
La séparation du solide et de l’extrait liquide est effectuée par centrifugation (4000 g, 20 min, 4 °C). Ce dernier est filtré par microfiltration afin d’enlever les particules ayant un diamètre supérieur à 2-3 µm. Le filtrat obtenu correspond à la phase aqueuse. Celle-ci est acidifiée à pH 4,5 avec de l’acide acétique. La purification s’effectue par extraction liquide/liquide à travers une membrane (contacteur membranaire). Une phase aqueuse contenant l’acide sinapique est mise en contact à travers une membrane avec une phase organique. L’acide sinapique ayant plus d’affinité avec la phase organique qu’avec la phase aqueuse, celui-ci va diffuser et enrichir la phase organique. En fonction du type de phase organique, différentes méthodes pourront être mises en œuvre pour récupérer l’acide sinapique sous forme solide. Le rendement de l'extraction de l'acide sinapique est supérieur à 81% en utilisant comme solvant le MIBK ou l'acétate d'octyle.
EXEMPLE 4 : Production d’acide férulique à partir de son de blé
Le son de blé (non désamidonné) subit un broyage puis un tamisage pour obtenir des particules de taille comprise entre 180 μm et 850 μm. Le son de blé est ensuite autoclavé (121 °C pendant 20 min) et mis en suspension dans une solution aqueuse (eau milliQ) à 50 °C. Les enzymes sont ensuite ajoutées au milieu qui reste agité pendant 24h, ce qui permet l’obtention d’acide férulique à partir de la lignocellulose du son de blé. L'hydrolyse en condition optimale a été réalisée à une température de 50 °C et un pH de 4.2 pour un taux de libération de l'acide férulique de 71%.
La séparation du solide et de l’extrait liquide est effectuée par centrifugation (4000g, 20 min, 4 °C). Ce dernier est filtré par microfiltration afin d’enlever les particules ayant un diamètre supérieur à 2-3 µm. Le filtrat obtenu correspond à la phase aqueuse. La purification s’effectue par extraction liquide/liquide à travers une membrane (contacteur membranaire). Une phase aqueuse contenant l’acide férulique est mis en contact à travers une membrane avec une phase organique. L’acide férulique ayant plus d’affinité avec la phase organique qu’avec la phase aqueuse, celui-ci va diffuser et enrichir la phase organique. En fonction du type de phase organique, différentes méthodes pourront être mises en œuvre pour récupérer l’acide férulique sous forme solide. Le rendement de l'extraction de l'acide férulique est supérieur à 85% pour un taux de pureté de 46% en utilisant comme solvant le MIBK et de 52% en utilisant comme solvant le CPME.
EXEMPLE 5 : Production d’acide caféique à partir de co-produits d’endives
Les racines d’endives séchées et broyées (<500 µm) sont mises en suspension dans une solution aqueuse (eau milliQ). La solution enzymatique est ajoutée afin de réaliser simultanément l’extraction de l’acide chlorogénique et sa conversion en acide caféique. L’ensemble est alors agité à l’aide d’un agitateur magnétique (600 rpm) et chauffée à 30 °C pendant 60 minutes. L'hydrolyse en condition optimale a été réalisée à une température de 30°C et un pH de 4.2 pour un taux de conversion de l'acide chlorogénique en acide caféique supérieur à 98%.
La séparation du solide et de l’extrait liquide est effectuée par centrifugation. Ce dernier est filtré par microfiltration afin d’enlever les particules ayant un diamètre supérieur à 2-3 µm. Le filtrat obtenu correspond à la phase aqueuse. La purification s’effectue par extraction liquide/liquide à travers une membrane (contacteur membranaire). Une phase aqueuse contenant l’acide caféique est mis en contact à travers une membrane avec une phase organique. L’acide caféique ayant plus d’affinité avec la phase organique qu’avec la phase aqueuse, celui-ci va diffuser et enrichir la phase organique. En fonction du type de phase organique, différentes méthodes pourront être mises en œuvre pour récupérer l’acide caféique sous forme solide.

Claims (9)

  1. Procédé de production d’acides p-hydroxycinnamiques à partir d’une biomasse végétale lignocellulosique, comprenant deux étapes :
    • Etape 1 : Extraction solide/liquide avec hydrolyse enzymatique à un pH inférieur à 5,5 desdits acides p-hydroxycinnamiques qui sont soit greffés aux hémicelluloses, soit présents sous forme de dérivés esters ;
    • Etape 2 : Purification des dits acides p-hydroxycinnamiques libérés à l’étape 1 par une extraction liquide/liquide couplée à un contacteur membranaire composé de membranes à fibres creuses à partir d’un milieu aqueux vers un solvant organique.
  2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ladite hydrolyse enzymatique est réalisée grâce à un cocktail enzymatique comprenant au moins une p-hydroxycinnamoyl estérase.
  3. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le pH de ladite étape 1 est compris entre 4 et 5,5.
  4. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le pH de l’étape 2 est ajusté entre 4 et 6 lorsque le pH du milieu à l’issue de l’étape 1 est supérieur ou inférieur à cette valeur.
  5. Procédé selon l’une des revendications précédentes caractérisé en ce que ledit solvant organique est choisi parmi au moins l’un des solvants suivants : 4-méthylpentan-2-one (MIBK), méthoxycyclopentane (CPME), alcools gras (octanol, décanol, alcool oléique), esters gras (acétate d’octyle, acétate de lauryle).
  6. Procédé selon l’une des revendications précédentes comprenant en outre une étape de désextraction desdits acides p-hydroxycinnamiques du solvant organique, soit par évaporation pour des solvants volatils, soit par extraction liquide-liquide pour des solvants non volatils, à l’aide d’une solution basique.
  7. Procédé selon l’une des revendications 1 à 5 dans lequel ledit acide p-hydroxycinnamique est de l’acide sinapique à partir de son de moutarde et/ou de tourteaux de colza
  8. Procédé selon l’une des revendications 1 à 5 dans lequel ledit acide p-hydroxycinnamique est de l’acide férulique à partir de son de blé, de pulpe de betterave, de rafle de maïs.
  9. Procédé selon l’une des revendications 1 à 5 dans lequel ledit acide p-hydroxycinnamique est de l’acide caféique à partir de racines d’endive et/ou marc de café
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