WO2023106372A1 - 酵素の測定方法、マイクロチャンバーアレイ、キット、ラマン散乱像の撮影方法、及び目的分子の測定方法 - Google Patents

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WO2023106372A1
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enzyme
selective substrate
reaction product
enzymatic reaction
microchambers
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PCT/JP2022/045297
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力也 渡邉
潤 安藤
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国立研究開発法人理化学研究所
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering

Definitions

  • the present invention relates to an enzyme measurement method, a microchamber array, a kit, a Raman scattering image imaging method, and a target molecule measurement method.
  • Enzymes change the structure of substrate molecules through reactions such as hydrolysis and transfer. Thousands of types of enzymes exist in living organisms and are responsible for functions such as metabolism, absorption, and signal transduction. Body fluids such as blood, saliva, and urine contain trace amounts of enzymes produced in organs, etc., and when a specific organ malfunctions, the activity levels of related enzymes in the body fluids decrease. Conversely, when intracellular enzymes leak into body fluids such as blood due to organ inflammation or degeneration of nerve cells, the activity of related enzymes is enhanced. Since changes in enzyme activity (enzyme concentration) in body fluids correlate with the progression of various diseases, they are often used as minimally invasive and early disease diagnostic indicators.
  • Patent Document 1 describes detection of enzymatic activity at the single-molecule level using a femtoliter-order microchamber.
  • a challenge in expanding disease diagnosis based on enzyme activity is the improvement of enzyme activity measurement technology.
  • the measurement of enzyme activity in a sample has used a labeled substrate that exhibits a fluorescence or color reaction accompanying an enzyme reaction.
  • this is an important method for measuring enzymatic activity with high sensitivity
  • enzyme species that are difficult to measure because bulky labels interfere with enzymatic reactions.
  • multiple types of enzymes react with labeled substrates, making it difficult to discuss only enzymes that contribute to disease from among mixed enzyme groups.
  • Raman scattering spectroscopy especially surface-enhanced Raman scattering (SERS) spectroscopy, which is expected to be highly sensitive, is a promising method for quantifying enzyme activity without labeling.
  • SERS is a highly sensitive vibrational spectroscopy that utilizes an optically enhanced field formed in metal nanostructures.
  • a metal nanostructure with a size smaller than the wavelength is irradiated with light, localized surface plasmons, which are collective excitations of electrons, are induced.
  • the plasmons will interact with each other, and an extremely strong enhanced electric field will be formed between the metal nanostructures.
  • SERS spectroscopy in addition to this electric field enhancement effect, chemical effects derived from metal-molecule interactions are also observed.
  • SERS spectroscopy is promising for increasing the sensitivity of Raman scattering spectroscopy because the signal light intensity is greatly enhanced by the electric field enhancement effect and the chemical effect.
  • the linewidth of the scattering spectrum found in SERS spectroscopy is narrow compared to the fluorescence emission spectrum. Therefore, it is expected that the reaction products of multiple enzymes can be discriminated and the activities of multiple enzymes can be measured at the same time without spectral overlap.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a technique that can measure enzymes in samples without labeling and with excellent sensitivity.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a mixed solution preparation step of preparing a mixed solution containing an enzyme and a selective substrate of the enzyme an array preparation step of preparing a metal nanostructure-immobilized microchamber array having a plurality of microchambers in which metal nanostructures are immobilized; a mixed liquid enclosing step of enclosing the mixed liquid so that the number of molecules of the enzyme is one or less in each of the plurality of microchambers;
  • the metal nanostructure-immobilized microchamber array is illuminated with excitation light, the enzymatic reaction product of the selective substrate or the surface-enhanced Raman scattering intensity derived from the selective substrate changes to a preset value or more.
  • the enzymatic reaction product exhibits a structure different from that of the selective substrate, and the Raman peak is capable of distinguishing between the enzymatic reaction product and the selective substrate. Enzyme measurement method.
  • a mixed solution preparation step of preparing a mixed solution containing an enzyme and a selective substrate of the enzyme an array preparation step of preparing a metal nanostructure-immobilized microchamber array having a plurality of microchambers in which metal nanostructures are immobilized; a mixed liquid enclosing step of enclosing the mixed liquid so that the number of molecules of the enzyme is one or less in each of the plurality of microchambers;
  • a chronological measurement step of measuring to The enzymatic reaction product exhibits a structure different from that of the selective substrate, and the Raman peak is capable of distinguishing between the enzymatic reaction product and the selective substrate.
  • Enzyme measurement method [3] a mixed solution preparation step of preparing a mixed solution containing multiple types of enzymes and multiple types of selective substrates corresponding to the multiple types of enzymes; an array preparation step of preparing a metal nanostructure-immobilized microchamber array having a plurality of microchambers in which metal nanostructures are immobilized; a mixed solution enclosing step of enclosing the mixed solution in each of the plurality of microchambers so that the number of molecules of at least one of the plurality of types of enzymes is 1 or less; When the metal nanostructure-immobilized microchamber array is illuminated with excitation light, the enzymatic reaction product of the selective substrate or the surface-enhanced Raman scattering intensity derived from the selective substrate changes to a preset value or more,
  • a chronological measurement step of measuring to The enzymatic reaction product exhibits a structure different from that of the selective substrate, the Raman peak distinguishes between the enzymatic reaction product and the selective substrate, and the plurality of types of enzymatic reaction products have different structures. and can distinguish between multiple types of the enzymatic reaction products or the selective substrates at the Raman peak, Enzyme measurement method.
  • Enzyme measurement method [6] a mixture preparation step of preparing a mixture containing an enzyme, a selective substrate of the enzyme, and a metal nanostructure; a droplet splitting step of splitting the mixed solution into a plurality of droplets containing one or less molecules of the enzyme; A temporal measurement step of illuminating the plurality of droplets with excitation light to measure the enzymatic reaction product of the selective substrate or the surface-enhanced Raman scattering intensity derived from the selective substrate for each of the plurality of droplets over time. and including The enzymatic reaction product exhibits a structure different from that of the selective substrate, and the Raman peak is capable of distinguishing between the enzymatic reaction product and the selective substrate. Enzyme measurement method.
  • a mixed solution preparation step of preparing a mixed solution containing multiple types of enzymes, multiple types of selective substrates corresponding to the multiple types of enzymes, and metal nanostructures; a droplet splitting step of splitting the mixed solution into a plurality of droplets containing one or less molecules of at least one of the plurality of types of enzymes; By illuminating the plurality of droplets with excitation light, the surface-enhanced Raman scattering intensity derived from the enzyme reaction product of the selective substrate or the selective substrate has changed to a preset value or more, or has a preset threshold value or more.
  • the enzymatic reaction product exhibits a structure different from that of the selective substrate, the Raman peak distinguishes between the enzymatic reaction product and the selective substrate, and the plurality of types of enzymatic reaction products have different structures. and can distinguish between multiple types of the enzymatic reaction products or the selective substrates at the Raman peak, Enzyme measurement method.
  • a mixed solution preparation step of preparing a mixed solution containing multiple types of enzymes, multiple types of selective substrates corresponding to the multiple types of enzymes, and metal nanostructures; a droplet splitting step of splitting the mixed solution into a plurality of droplets containing one or less molecules of at least one of the plurality of types of enzymes; A temporal measurement step of illuminating the plurality of droplets with excitation light to measure the enzymatic reaction product of the selective substrate or the surface-enhanced Raman scattering intensity derived from the selective substrate for each of the plurality of droplets over time.
  • the enzymatic reaction product exhibits a structure different from that of the selective substrate, the Raman peak distinguishes between the enzymatic reaction product and the selective substrate, and the plurality of types of enzymatic reaction products have different structures. and can distinguish between multiple types of the enzymatic reaction products or the selective substrates at the Raman peak, Enzyme measurement method.
  • the metal nanostructure-immobilized microchamber array in which the mixture is enclosed in each microchamber is illuminated with wide-field illumination, and the position of the Raman peak is Acquire a Raman scattering image in the wavelength band of the Raman peak of the enzyme reaction product or the selective substrate using a narrow linewidth bandpass filter that matches the surface-enhanced Raman scattering light intensity and intensity of each microchamber.
  • a method for measuring the enzyme according to claim 1 Acquiring Raman scattering images in the top wavelength band of the Raman peak and the bottom wavelength band of the Raman peak of the enzyme reaction product or the selective substrate, and taking the difference between the two to obtain the The method for measuring an enzyme according to [11], which quantifies surface-enhanced Raman scattering light intensity. [13] The method for measuring an enzyme according to any one of [1] to [12], wherein the enzymatic reaction product has a thiol group.
  • the selective substrate for acetylcholinesterase is MATP+ and the selective substrate for butyrylcholinesterase is butyrylthiocholine.
  • a microchamber array having a plurality of microchambers in which metal nanostructures are immobilized.
  • [21] The method for photographing a Raman scattering image according to [20], further comprising matching the transmission wavelength band of the narrow bandpass filter to the bottom of the Raman peak of the target molecule.
  • [22] The method of taking a Raman scattering image according to [20] or [21], wherein the target molecule is arranged in the plurality of microchambers of a microchamber array having a plurality of microchambers.
  • [23] The method for photographing a Raman scattering image according to [22], wherein metal nanostructures are solid-phased in the plurality of microchambers.
  • the transmission wavelength band of the narrow bandpass filter is aligned with the top of the Raman peak of the target molecule, and the sample is irradiated with laser light expanded to the entire field of view. and extracting the concentration distribution of the target molecule from the obtained Raman scattering image;
  • a method for measuring a target molecule using Raman scattering [26] The method for measuring a target molecule according to [25], further comprising matching the transmission wavelength band of the narrow bandpass filter to the bottom of the Raman peak of the target molecule.
  • Extracting the concentration distribution of the target molecule by taking the difference between the Raman scattering images captured in the top transmission wavelength band and the bottom transmission wavelength band of the Raman peak of the target molecule, [25] or [ 26].
  • this invention includes the following aspects. (1) a mixture preparation step of preparing a mixture containing an enzyme and a selective substrate for the enzyme; an array preparation step of preparing a metal nanostructure-immobilized microchamber array having a plurality of microchambers in which metal nanostructures are immobilized; a mixed liquid enclosing step of enclosing the mixed liquid so that the number of molecules of the enzyme is one or less in each of the plurality of microchambers; When the metal nanostructure-immobilized microchamber array is illuminated with excitation light, the enzymatic reaction product of the selective substrate or the surface-enhanced Raman scattering intensity derived from the selective substrate changes to a preset value or more.
  • a chronological measurement step of measuring to The enzymatic reaction product exhibits a structure different from that of the selective substrate, and the Raman peak is capable of distinguishing between the enzymatic reaction product and the selective substrate. Enzyme measurement method.
  • the mixed solution preparation step preparing a mixed solution containing multiple types of enzymes and multiple types of selective substrates corresponding to the multiple types of enzymes;
  • the mixed solution is enclosed in each of the plurality of microchambers so that the number of molecules of at least one of the plurality of types of enzymes is 1 or less, and
  • a step of measuring the number of bright spots for measuring the number of droplets below the threshold or A temporal measurement step of illuminating the plurality of droplets with excitation light to measure the enzymatic reaction product of the selective substrate or the surface-enhanced Raman scattering intensity derived from the selective substrate for each of the plurality of droplets over time. and including The enzymatic reaction product exhibits a structure different from that of the selective substrate, and the Raman peak is capable of distinguishing between the enzymatic reaction product and the selective substrate. Enzyme measurement method.
  • the mixed solution preparation step preparing a mixed solution containing multiple types of enzymes and multiple types of selective substrates corresponding to the multiple types of enzymes;
  • the mixed solution is divided into a plurality of droplets containing one or less molecules of at least one of the plurality of types of enzymes, and
  • the metal nanostructure-immobilized microchamber array in which the mixture is enclosed in each microchamber is illuminated with wide-field illumination, and the position of the Raman peak is Acquire a Raman scattering image in the wavelength band of the Raman peak of the enzyme reaction product or the selective substrate using a narrow linewidth bandpass filter that matches the surface-enhanced Raman scattering light intensity and intensity of each microchamber.
  • the enzyme is at least one selected from the group consisting of acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase, phospholipase, elastase and amylase.
  • the transmission wavelength band of the narrow bandpass filter is aligned with the top of the Raman peak of the target molecule, and the sample is irradiated with laser light expanded to the entire field of view.
  • the transmission wavelength band of the narrow bandpass filter is adjusted to the top of the Raman peak of the target molecule, and the sample is irradiated with laser light expanded to the entire field of view. and extracting the concentration distribution of the target molecule from the obtained Raman scattering image; A method for measuring a target molecule using Raman scattering.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of an example of a high-speed Raman imaging apparatus used for measurement of a SERS chip.
  • FIG. 2 is an example of rough calculation of the measurement time for each lighting type.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of an example of a SERS chip in which metal nanostructures are solid-phased.
  • FIG. 4 is a schematic cross-sectional view explaining each step of the manufacturing method of the SERS chip.
  • FIG. 5 is a scattering image of a SERS chip in which silver nanoparticles are immobilized on a microchamber array used in Examples.
  • FIG. 6 is a schematic diagram of an optical system of a wide-field Raman microscope used in Examples. The image shown on the left side of FIG.
  • FIG. 7 is a SERS image of a sample in which a mixed solution of acetylcholinesterase (AChE) and acetylthiocholine was enclosed in a SERS chip in the example.
  • the graph shown in the center of FIG. 7 is the SERS spectra in chamber A and chamber B in the SERS image.
  • the figure shown on the right side of FIG. 7 is a schematic diagram of decomposition of acetylthiocholine by acetylcholinesterase and SERS measurement of the decomposition products.
  • the SERS image and the SERS spectrum were acquired with a slit scanning Raman microscope under the conditions of 100 pM acetylcholinesterase and 2 mM acetylthiocholine.
  • FIG. 8 is a graph showing the relationship between the acetylcholinesterase (AChE) concentration and the number of bright spots in Examples. The number of bright spots was obtained with a slit scanning Raman microscope.
  • FIG. 9 is a SERS image of a sample in which a mixed solution of acetylcholinesterase (AChE) and acetylthiocholine was encapsulated in a SERS chip in Example. The SERS image was obtained with a wide-field Raman microscope under the conditions of 10 pM acetylcholinesterase and 2 mM acetylthiocholine.
  • FIG. 10 is a graph showing the relationship between the acetylcholinesterase (AChE) concentration and the number of bright spots in Examples.
  • the number of bright spots was obtained with a wide-field Raman microscope.
  • the dotted line in the graph indicates the value obtained by adding three times the standard deviation to the average number of bright spots when acetylcholinesterase is 0M.
  • the intersection point of the dotted line and the solid line is regarded as the lower limit of detection.
  • the image shown in the upper left of FIG. 11 is a SERS image of a sample in which a mixed solution of acetylcholinesterase (AChE), butyrylcholinesterase (BuChE), MATP+, and butyrylthiocholine was enclosed in a SERS chip in Example.
  • the graph shown in the lower left of FIG. 11 is the SERS spectra in chamber A and chamber B in the SERS image.
  • the diagrams shown in the upper right of FIG. 11 are schematic diagrams (left) of degradation of MATP + by acetylcholinesterase (AChE) and SERS measurement of degradation products, and degradation and degradation products by butyrylcholinesterase (BuChE) butyrylthiocholine.
  • the SERS image and the SERS spectrum were obtained with a slit scanning Raman microscope under the conditions of 100 pM each of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase, and 1 mM each of MATP+ and butyrylthiocholine.
  • Raman spectroscopic imaging device An example of a Raman spectroscopic imaging apparatus used for measurement of a SERS chip (a microchamber array in which a metal nanostructure is solid-phased in each microchamber; details will be described later) in the present technology will be described.
  • a Raman spectroscopic imaging apparatus 100 whose configuration outline is shown in FIG. 1 has a line illumination system and a wide-field illumination system.
  • the laser light (excitation laser) emitted from the laser light source 101 passes through the mirror 103 ⁇ cylindrical lens 104 ⁇ lens 105 ⁇ dichroic filter 109 ⁇ objective lens 112 in order to illuminate the sample 113.
  • a laser beam from a laser light source 101 is shaped into a line by a cylindrical lens 104 .
  • Raman scattered light from the sample 113 passes through the objective lens 112 ⁇ the dichroic filter 109 ⁇ the lens 111 in this order, and forms an image on the CCD 116 along the slit 114 of the spectroscope 115 .
  • Line illumination systems detect the spectrum in parallel to speed it up.
  • the laser light emitted from the laser light source 101 passes through the flip mirror 102 ⁇ lens 107, mirror 108, flip mirror 106 ⁇ dichroic filter 109 ⁇ objective lens 112 in order to illuminate the sample 113.
  • the Raman light from the sample 113 passes through the objective lens 112 ⁇ dichroic filter 109 ⁇ flip mirror 110 ⁇ lens 117 ⁇ narrow line width bandpass filter 118 in order, and forms an image on the sCMOS of the two-dimensional detector 119.
  • a narrow linewidth bandpass filter 118 matched to the position of the Raman peak specific to the degradation products of the substrate is placed in the imaging optics for widefield illumination. Using the angular dependence of the transmission band, scattering images are obtained at the top and tail of the Raman peak of the decomposition product, and the SERS light intensity in each chamber is quantified from the difference.
  • Fig. 2 shows an example of approximate measurement time for each lighting type. With wide-field illumination, it is expected to analyze 100 or more per second.
  • the scattering intensity derived from the enzymatic reaction product can be selectively extracted by adjusting the angle of the narrow linewidth bandpass filter.
  • SERS chip An example of a microchamber array (SERS chip) in which metal nanostructures are solid-phased in microchambers used in the present technology will be described. However, in the present technology, a droplet can be used instead of the microchamber array, but this will be described separately.
  • the SERS chip according to this technology can obtain uniform SERS light intensity. Ensuring uniformity is to form metal nanostructures uniformly within each chamber. The reason is that strong SERS light is generated in minute gaps (gaps) in the metal nanostructure. It is possible to control the formation of metal nanostructures in the chamber and form numerous gap structures to stabilize the degree of amplification.
  • An example of the microchamber is a cylindrical shape with a glass bottom and a fluororesin periphery. As shown in FIG. 3, it is preferable to chemically modify the glass portion of the bottom surface of the microchamber so that the metal nanostructure covers the entire bottom surface of the chamber. The sensitivity and uniformity can be further improved by optimizing the metal species, shape, size, forming conditions, excitation wavelength, chamber volume, etc. that constitute the metal nanostructure.
  • the SERS chip described above can be manufactured, for example, as follows.
  • a substrate 510 is prepared.
  • Examples of materials for the substrate 510 include glass and resin.
  • Glass is not particularly limited. Examples of glass include quartz glass, borosilicate glass, soda-lime glass, and the like.
  • resins examples include polyethylene, polypropylene, polystyrene, polycarbonate, cyclic polyolefin, and acrylic.
  • polycarbonate is also used as a material for inexpensive mass-producible CDs and DVDs, and is suitable from the viewpoint of low-cost production of microchamber arrays.
  • the material of the substrate 510 is preferably glass or polycarbonate, more preferably glass.
  • a film 700 is laminated on the surface of the substrate 510. Then, as shown in FIG. 4(b), a film 700 is laminated on the surface of the substrate 510. Then, as shown in FIG. 4(b), a film 700 is laminated on the surface of the substrate 510. Then, as shown in FIG. 4(b), a film 700 is laminated on the surface of the substrate 510. Then, as shown in FIG. 4(b), a film 700 is laminated on the surface of the substrate 510.
  • Materials for the film 700 include fluorine-based resins, cyclic polyolefins, silicone-based resins, and the like.
  • the thickness of the membrane 700 is not particularly limited, but can be set as appropriate in consideration of the volume of the microchamber.
  • a resist film 710 is laminated on the surface of the film 700. Then, as shown in FIG. 4(c), a resist film 710 is laminated on the surface of the film 700. Then, as shown in FIG. Subsequently, using a mask having a microchamber array pattern, the resist film 710 is exposed by irradiating active energy rays with an exposure machine. Subsequently, development is performed with a developer to remove the resist film 710 from the portions where the microchambers are to be formed.
  • the film 700 masked with the resist film 710 is etched to form microchambers 530 in the film 700 .
  • the substrate is washed to remove the resist film 710 to obtain an array of microchambers 530 .
  • a microchamber array having a plurality of microchambers is obtained.
  • a metal nanostructure is solid-phased on the bottom surface of the well 530 of the fabricated microchamber array.
  • a cationic functional group is introduced to the bottom surface of the microchambers 530 of the microchamber array.
  • a dispersion of metal nanoparticles and trifluoroacetic acid, which is an aggregation accelerator, are mixed and dropped into the microchamber to form aggregates of negatively charged metal nanoparticles on the bottom surface of the microchamber.
  • microchamber array is obtained in which metal nanostructures, which are aggregates of metal nanoparticles, are solid-phased on the bottom of the microchambers.
  • the volume of the microchamber is not particularly limited, but is preferably 1aL to 1nL, more preferably 1fL to 1pL.
  • "a" (ato), “f” (femto), “p” (pico) and “n” (nano) represent 10 -18 , 10 -15 , 10 -12 and 10 -9 respectively. is a prefix.
  • examples of metal nanostructures include metal nanoparticle aggregates obtained by aggregating metal nanoparticles in the presence of an aggregating agent, and regular array structures of metal nanostructures using the closest-packed array of polystyrene beads as a template. be done.
  • Metal nanostructures also include metal nanodot arrays based on anodized porous alumina.
  • the metal type of the metal nanostructure is not particularly limited, but at least one selected from the group consisting of silver, gold, copper, platinum, palladium, aluminum and titanium is preferable, and the group consisting of silver, gold, platinum and palladium. At least one selected from is more preferable, silver or gold is more preferable, and silver is still more preferable. Two or more different metals may be used in combination. Also, an alloy of two or more metals may be used. Core-shell type particles of two or more kinds of metals can also be used as the metal nanoparticles.
  • the shape of the metal nanoparticles when forming the metal nanostructures using the metal nanoparticles is not particularly limited, but examples thereof include spherical, subspherical, rod-shaped, cubic, elliptical, triangular, bipyramidal, stars, etc. Two or more kinds of metal nanoparticles having different shapes may be used in combination.
  • the average particle size of the primary particles of the metal nanoparticles is not particularly limited, but is preferably 1 to 1500 nm, more preferably 1 to 500 nm, even more preferably 10 to 100 nm.
  • the volume of the primary particles of the metal nanoparticles is not particularly limited, but is preferably 1 nm 3 to 1 ⁇ m 3 .
  • the metal nanoparticles may be metal nanoparticle aggregates in which multiple metal nanoparticles aggregate. Aggregates of metal nanoparticles can be produced, for example, by treating metal nanoparticles (primary particles) with an aggregation promoter such as trifluoroacetic acid to aggregate them.
  • an aggregation promoter such as trifluoroacetic acid
  • the metal nanoparticles can be produced by a conventionally known method.
  • metal nanoparticles as aggregates, a myriad of fine gaps between adjacent particle pairs are formed, and the number of molecules present in the gaps can be increased, so Raman scattering is further enhanced, resulting in increased sensitivity. It becomes easier to improve.
  • the number of microchambers per microchamber array is not particularly limited, but is preferably 100 or more, more preferably 1,000 or more, and even more preferably 10,000 or more.
  • the upper limit of the number of microchambers per microchamber array is not particularly limited, it is preferably 10,000,000 or less because it is undesirable to take too much time to measure the brightness of the bright spots and count the number.
  • the enzymatic reaction of the selective substrate is performed for each microreaction space (microchamber or droplet) enclosing an enzyme of one molecule or less, the selective substrate of the enzyme, and the metal nanostructure.
  • the surface-enhanced Raman scattering intensity derived from the product or the selective substrate is measured, and the surface-enhanced Raman scattering intensity changes by a preset value or more, or the number of reaction spaces that is a preset threshold value or more or a threshold value or less.
  • the function of the enzyme (decomposition of the substrate) is captured for each molecule using a minute reaction space, and the number of enzyme molecules can be directly calculated from the number of minute reaction spaces in which changes are observed. By counting, the enzyme concentration in the specimen can be measured more quantitatively and with high sensitivity.
  • a first embodiment of the enzyme measurement method of the present technology includes a mixed solution preparation step of preparing a mixed solution containing an enzyme and a selective substrate of the enzyme, and a plurality of microchambers in which metal nanostructures are immobilized.
  • a step of measuring the number of bright spots for measuring the number of microchambers that are equal to or greater than or equal to or less than a preset threshold the enzymatic reaction product exhibits a structure different from that of the selective substrate, and the Raman peak can distinguish between the enzymatic reaction product and the selective substrate.
  • Examples of the enzymes include acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase, phospholipase, elastase, amylase, and the like.
  • Acetylcholinesterase is present in nerve tissue, red blood cells, etc., and is one of the neurotransmitters of cholinergic nerves (parasympathetic nerves, motor nerves, sympathetic nerve centers to ganglia). decompose into Although AChE itself is acetylated by Ach degradation and deactivated, deacetylation occurs in several milliseconds and it regains activity.
  • Butyrylcholinesterase (BuChE) is synthesized in the human liver, is present in serum, etc., and degrades various choline esters including ACh.
  • the selective substrate of the enzyme exhibits a structure different from that of the enzymatic reaction product of the selective substrate, and is capable of distinguishing between the enzymatic reaction product and the selective substrate by the Raman peak.
  • the enzymatic reaction product has a molecular structure capable of interacting with the metal nanostructure.
  • the selective substrate of the enzyme can be appropriately selected according to the type of enzyme.
  • -acetylthiomethylpiperidinium The BuChE hydrolysis products of BTC are thiocholine and butyric acid, and the AChE hydrolysis products of MATP+ are 1,1-dimethyl-4-mercaptomethylpiperidinium and acetic acid.
  • Thiocholine and 1,1-dimethyl-4-mercaptomethylpiperidinium are preferable because they have a thiol group (mercapto group) in the molecule and are easily trapped on the surface of the metal nanoparticles described below.
  • Thiocholine and 1,1-dimethyl-4-mercaptomethylpiperidinium are also preferred because they are a combination of compounds that can be easily distinguished from the Raman scattering spectrum.
  • water is preferable as the solvent or dispersion medium for the mixed liquid.
  • the water is preferably ultrapure water such as milli-Q water or ultrafiltered water (UF water), but the water in which the enzyme or selective substrate is dissolved or dispersed may be used as the solvent or dispersion medium for the mixed solution. .
  • the mixed solution may contain a surfactant in addition to the enzyme, selective substrate and solvent.
  • the type of surfactant is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction between the enzyme and its selective substrate.
  • examples include Triton X-100 (t-octylphenoxypolyethoxyethanol; Triton X-100). to be
  • the concentration of the surfactant is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction between the enzyme and its selective substrate.
  • the mixed solution is used so that there is no more than one enzyme molecule per microchamber. If appropriate, the mixture may be diluted and used. Water is preferred as the solvent or dispersion medium used for dilution. As water, ultrapure water such as Milli-Q water and ultrafiltration water (UF water) is preferable.
  • Array preparation step In the array preparation step, a metal nanostructure-immobilized microchamber array (SERS chip) having a plurality of microchambers in which metal nanostructures are immobilized is prepared.
  • SERS chip metal nanostructure-immobilized microchamber array
  • the SERS chip can be manufactured, for example, according to the manufacturing method described above.
  • the mixed solution enclosing step In the mixed solution enclosing step, the mixed solution is enclosed in each of the plurality of microchambers of the SERS chip prepared in the array preparation step so that the number of molecules of the enzyme is one or less. That is, the number of molecules of the enzyme contained in one microchamber is one or less.
  • the mixed solution prepared in the mixed solution preparation step may be used after being diluted as appropriate.
  • the mixed liquid in the SERS chip for example, after distributing the mixed liquid to each microchamber, oil or liquid paraffin is layered and enclosed in the mixed liquid in the microchambers.
  • the SERS chip described above has a high water repellency because the upper surface of the SERS chip is coated with a fluororesin.
  • a reaction product (enzyme reaction product) is generated between the enzyme and its selective substrate. Since the volume of the mixed solution is small, the enzymatic reaction products are located near the metal nanostructures in the mixed solution.
  • LSPR localized surface plasmon resonance
  • SERS Surface-enhanced Raman scattering enhances the Raman scattering intensity of molecules in close proximity to the surface of metal nanoparticles by orders of magnitude.
  • the enzymatic reaction product may exist in the vicinity of the metal nanostructure, but may be adsorbed or bound to the surface of the metal nanostructure.
  • the Raman scattered light can be enhanced and the sensitivity can be further improved.
  • a method for enclosing the mixed liquid in the microchamber is, for example, encapsulation with oil.
  • Oils include, but are not limited to, inert oils such as fomblin, mineral oil, hexadecane, 3M Fluorinert FC-40, 3M Fluorinert FC-70.
  • the surface-enhanced Raman scattering intensity derived from the enzyme reaction product of the selective substrate or the selective substrate has changed by a preset value or more, or is a preset threshold value or more or a threshold value or less. Count the number of chambers.
  • a Raman scattering image may be obtained at the bottom of the Raman peak of the enzyme reaction product or the selective substrate, and the surface-enhanced Raman scattering light intensity may be quantified from the difference between the top and bottom.
  • the number of microchambers whose surface-enhanced Raman scattering intensity has changed to a preset value or more, or whose surface-enhanced Raman scattering intensity is greater than or equal to a preset threshold or less than a threshold is counted.
  • the preset value or threshold is determined, for example, by using a sample containing an enzyme and a selective substrate of the enzyme and a sample that does not contain at least one of the enzyme and the selective substrate of the enzyme.
  • the surface-enhanced Raman scattering light intensity derived from the enzymatic reaction product or the selective substrate can be measured and experimentally obtained as a value capable of distinguishing between the two samples.
  • a method for determining the preset value or threshold is not particularly limited, and can be determined using a general statistical method, for example. By comparing the predetermined value or threshold value and the surface-enhanced Raman scattering light intensity derived from the selective substrate or the enzymatic reaction product of the selective substrate measured in the step of measuring the number of bright spots, the enzyme is contained in the microchamber. It is possible to judge whether or not
  • the narrow linewidth bandpass filter may be composed of a single narrow linewidth bandpass filter, or may be composed of two or more bandpass filters in combination to narrow the transmission band.
  • the narrow linewidth bandpass filter may adjust the transmission band by using the angular dependence of the transmission band.
  • a first embodiment of an enzyme measurement method of the present technology includes a mixed solution preparation step of preparing a mixed solution containing multiple types of enzymes and multiple types of selective substrates corresponding to the multiple types of enzymes, and a metal nanostructure an array preparation step of preparing a metal nanostructure-immobilized microchamber array having a plurality of microchambers immobilized with a body; a mixed solution encapsulating step of enclosing the mixed solution so that the number of molecules is 1 or less; and measuring the number of microchambers in which the surface-enhanced Raman scattering intensity derived from the selective substrate has changed to a preset value or more, or has a preset threshold value or more or a threshold value or less.
  • the enzymatic reaction product exhibits a structure different from that of the selective substrate
  • the Raman peak distinguishes the enzymatic reaction product from the selective substrate
  • the plurality of types of enzymatic reaction products are different from each other.
  • the Raman peaks exhibit different structures and can distinguish multiple types of the enzymatic reaction products or the selective substrates.
  • the basic example of the first embodiment described above is that in the mixed solution preparation step, a mixed solution containing multiple types of enzymes and multiple types of selective substrates corresponding to the multiple types of enzymes is prepared; In the step, the mixed solution is enclosed in each of the plurality of microchambers so that the number of molecules of at least one of the plurality of types of enzymes is 1 or less; The difference is in identifying the enzymatic reaction product or the selective substrate, but the other points are substantially the same.
  • a second embodiment of the enzyme measurement method of the present technology includes a mixed solution preparation step of preparing a mixed solution containing an enzyme and a selective substrate of the enzyme, and a plurality of microchambers in which metal nanostructures are immobilized.
  • the enzymatic reaction product exhibits a structure different from that of the selective substrate, and the Raman peak can distinguish between the enzymatic reaction product and the selective substrate.
  • the step of measuring the number of bright points of the first embodiment is temporal measurement in which surface-enhanced Raman scattering intensity derived from an enzyme reaction product or a selective substrate is measured for each of the plurality of microchambers over time. process has been changed. Others are substantially the same as those of the first embodiment.
  • Measuring the enzymatic activity as a scattering intensity change per unit time by measuring the surface-enhanced Raman scattering intensity derived from the enzymatic reaction product or the selective substrate over time for each of the plurality of microchambers in the time course measurement step. can be done. By measuring the enzyme activity, it is also possible to obtain information such as what the multimeric enzyme is.
  • a second embodiment of the enzyme measurement method of the present technology includes a mixed solution preparation step of preparing a mixed solution containing multiple types of enzymes and multiple types of selective substrates corresponding to the multiple types of enzymes, and a metal nanostructure an array preparation step of preparing a metal nanostructure-immobilized microchamber array having a plurality of microchambers immobilized with a body; a mixed solution encapsulating step of enclosing the mixed solution so that the number of molecules is 1 or less;
  • the enzyme measurement method may include a temporal measurement step of temporally measuring the surface-enhanced Raman scattering intensity derived from the selective substrate for each of the plurality of microchambers.
  • the Raman peak distinguishes the enzymatic reaction product from the selective substrate, and the plurality of types of enzymatic reaction products are different from each other.
  • the Raman peaks exhibit different structures and can distinguish multiple types of the enzymatic reaction products or the selective substrates.
  • the basic example of the second embodiment described above is that in the mixed solution preparation step, a mixed solution containing multiple types of enzymes and multiple types of selective substrates corresponding to the multiple types of enzymes is prepared; In the step, the mixed solution is enclosed in each of the plurality of microchambers so that the number of molecules of at least one of the plurality of types of enzymes is 1 or less; The difference is in the identification of the product or the selective substrate, but the rest is substantially the same.
  • a third embodiment of the enzyme measurement method of the present technology includes a mixed solution preparation step of preparing a mixed solution containing an enzyme, a selective substrate of the enzyme, and a metal nanostructure; a droplet splitting step of splitting into a plurality of droplets containing no more than one; and measuring the number of droplets whose surface-enhanced Raman scattering intensity has changed to a preset value or more, or whose surface-enhanced Raman scattering intensity is above or below a preset threshold.
  • the enzymatic reaction product exhibits a structure different from that of the selective substrate, and the Raman peak can distinguish between the enzymatic reaction product and the selective substrate.
  • the first embodiment of the present technology is that a mixed solution containing an enzyme, a selective substrate of the enzyme, and a metal nanostructure is used, and instead of enclosing the mixed solution in a microchamber, one molecule of the enzyme
  • the difference is that the droplets are divided into a plurality of droplets containing one or less droplets.
  • a method of division a method of emulsifying by injecting the mixed liquid into the oil with a jet, and the like can be mentioned.
  • Oils include, but are not limited to, inert oils such as fomblin, mineral oil, hexadecane, 3M Fluorinert FC-40, and 3M Fluorinert FC-70.
  • the Raman scattering intensity of each droplet may be measured two-dimensionally by spreading the droplet on a plane, or one-dimensionally measuring the droplet one by one.
  • a third embodiment of the enzyme measurement method of the present technology includes a mixed solution preparation step of preparing a mixed solution containing a plurality of types of enzymes and a plurality of types of selective substrates corresponding to the plurality of types of enzymes; a droplet splitting step of splitting into a plurality of droplets containing at least one molecule of at least one of the plurality of types of enzymes, and illuminating the plurality of droplets with excitation light to illuminate the
  • the surface-enhanced Raman scattering intensity derived from the enzyme reaction product of the selective substrate or the selective substrate has changed to a preset value or more, or the number of droplets whose intensity is a preset threshold value or more or a threshold value or less is measured.
  • It may be a measuring method of an enzyme including a scoring step. wherein the enzymatic reaction product exhibits a structure different from that of the selective substrate, the Raman peak distinguishes the enzymatic reaction product from the selective substrate, and the plurality of types of enzymatic reaction products are different from each other.
  • the Raman peaks exhibit different structures and can distinguish multiple types of the enzymatic reaction products or the selective substrates.
  • the third embodiment is adapted to multiple types of enzymes and substrates.
  • a fourth embodiment of the enzyme measurement method of the present technology includes a mixed solution preparation step of preparing a mixed solution containing an enzyme, a selective substrate of the enzyme, and a metal nanostructure; a droplet splitting step of splitting into a plurality of droplets containing no more than one; and a temporal measurement step of temporally measuring the surface-enhanced Raman scattering intensity for each of the plurality of droplets.
  • the enzymatic reaction product exhibits a structure different from that of the selective substrate, and the Raman peak can distinguish between the enzymatic reaction product and the selective substrate.
  • the step of measuring the number of bright spots in the third embodiment is changed to a temporal measurement step of temporally measuring the surface-enhanced Raman scattering intensity derived from the enzymatic reaction product for each of the plurality of droplets. ing. Others are substantially the same as those of the third embodiment.
  • the enzyme activity can be measured as a change in scattering intensity per unit time. By measuring the enzyme activity, it is also possible to obtain information such as what the multimeric enzyme is.
  • a fourth embodiment of the enzyme measurement method of the present technology includes a mixed solution preparation step of preparing a mixed solution containing a plurality of types of enzymes and a plurality of types of selective substrates corresponding to the plurality of types of enzymes; a droplet splitting step of splitting into a plurality of droplets containing at least one molecule of at least one of the plurality of types of enzymes, and illuminating the plurality of droplets with excitation light to illuminate the a temporal measurement step of temporally measuring an enzymatic reaction product of a selective substrate or surface-enhanced Raman scattering intensity derived from the selective substrate for each of the plurality of droplets. .
  • the Raman peak distinguishes the enzymatic reaction product from the selective substrate, and the plurality of types of enzymatic reaction products are different from each other.
  • the Raman peaks exhibit different structures and can distinguish multiple types of the enzymatic reaction products or the selective substrates.
  • the fourth embodiment is adapted to multiple types of enzymes and substrates.
  • kits The present technology also includes the above-described SERS chip (a metal nanostructure-immobilized microchamber array having a plurality of microchambers in which metal nanostructures are immobilized), and the above-described first or second embodiment. Also provided are kits containing a protocol describing the procedure for measuring the enzyme. The kit may contain standard reagents and other components in addition to the SERS chip and protocol.
  • One embodiment of the Raman scattering image capturing method of the present technology is to align the transmission wavelength band of a narrow linewidth bandpass filter with the top of the Raman peak of the target molecule, irradiate the sample with a laser beam expanded to the entire field of view, and This is a Raman scattering image capturing method for capturing a Raman scattering image with a two-dimensional photodetector during irradiation.
  • the transmission wavelength band of the narrow linewidth bandpass filter may be matched with the bottom of the Raman peak of the target molecule.
  • the target molecules are arranged in the plurality of microchambers of a microchamber array having a plurality of microchambers.
  • the microchamber array preferably has metal nanostructures immobilized in the plurality of microchambers.
  • the microchamber array for example, the microchamber array of the present technology described above is preferably used, and the target molecule is arranged in each microchamber.
  • the target molecule is preferably arranged on the metal nanostructure.
  • the Raman scattering image capturing method of the present embodiment can be implemented, for example, in the same manner as the enzyme measurement method of the present technology described above.
  • narrow linewidth bandpass filter for example, the same one as that used in the method for measuring the enzyme of the present technology described above can be used.
  • target molecule examples include, but are not limited to, the enzymes described above.
  • One embodiment of the method for measuring a target molecule of the present technology is to align the transmission wavelength band of a narrow linewidth bandpass filter with the top of the Raman peak of the target molecule, irradiate the sample with a laser beam expanded to the entire field of view, and perform laser irradiation.
  • a method for measuring a target molecule using Raman scattering in which a Raman scattering image is captured by a two-dimensional photodetector and the concentration distribution of the target molecule is extracted from the obtained Raman scattering image.
  • the transmission wavelength band of the narrow linewidth bandpass filter may be adjusted to the bottom of the Raman peak of the target molecule.
  • the concentration distribution of the target molecule is obtained by taking the difference between the Raman scattering images photographed in the top transmission wavelength band and the bottom transmission wavelength band of the Raman peak of the target molecule. Extraction is preferred.
  • the target molecule is preferably arranged in the plurality of microchambers of a microchamber array having a plurality of microchambers.
  • the microchamber array preferably has metal nanostructures immobilized in the plurality of microchambers.
  • the microchamber array for example, the microchamber array of the present technology described above is preferably used, and the target molecule is arranged in each microchamber.
  • the target molecule In the method for measuring the target molecule of the present embodiment, it is preferable to dispose the target molecule on the metal nanostructure.
  • the method for measuring the target molecule of the present embodiment can be implemented, for example, in the same manner as the method for measuring the enzyme of the present technology described above.
  • narrow linewidth bandpass filter for example, the same one as that used in the method for measuring the enzyme of the present technology described above can be used.
  • target molecule examples include, but are not limited to, the enzymes described above.
  • This technology can be suitably applied to liquid biopsy. Specifically, for example, by measuring enzymes in liquid components such as blood, detailed information on human cancer can be obtained more quickly and with less invasiveness.
  • cancer-related enzymes include thymidine kinase, galactosyltransferase, and the like.
  • This technique introduces the concept of digital detection into SERS spectroscopy, and is an ultra-sensitive enzyme concentration measurement technique in which the number of enzyme molecules is plotted on the vertical axis.
  • concentration quantification of target molecules has been performed with scattered light intensity as the vertical axis.
  • This technology is unique in that it fuses spectroscopic measurement technology and bio-single-molecule measurement technology.
  • a fluorescent substrate has been used to measure the activity of a single enzyme molecule.
  • This technology captures the Raman scattering light of the enzymatic reaction product itself of the substrate, and can simultaneously quantify multiple substrate degradation reactions of one molecule of enzyme by utilizing the unlabeled and narrow linewidth spectrum.
  • this technology removes the barrier of activity inhibition by fluorescently labeled substrates, broadens the types of enzymes that can be measured, and has the unprecedented advantage of being able to identify enzyme types. .
  • Step S1 A cover glass of 24 mm x 32 mm was placed on a glass stand and immersed in an 8N potassium hydroxide aqueous solution.
  • Step S2 Ultrasonic treatment (90 minutes) was performed.
  • - Process S3 It left still (1 day).
  • - Step S4 Rinse with pure water.
  • Step S5 Water droplets on the glass were removed by an air blow.
  • Step S6 A fluororesin (9% Cytop (fluororesin, manufactured by AGC)) was dropped onto the glass.
  • Step S7 Spin coating was performed at a rotation speed of 1000 rpm for 30 seconds.
  • Step S8 Bake at 80°C for 10 minutes and at 180°C for 1 hour.
  • Step S9 A positive photoresist (AZ P4620 (manufactured by AZ Electronic Materials)) was dropped on the Cytop-coated glass.
  • - Step S10 Spin coating was performed at a rotation speed of 7500 rpm for 30 seconds.
  • - Step S11 Bake at 100°C for 5 minutes.
  • - Step S12 Allowed to stand (5 minutes or more, humidity of 60% or more).
  • Step S13 A chromium mask (holes with a diameter of 1.8 ⁇ m arranged in an array at a pitch of 8 ⁇ m) was brought into close contact with the resist-coated glass.
  • - Step S14 UV exposure for 20 seconds.
  • Step S15 The exposed cover glass was placed on a glass stand and immersed in a developer (AZ300 MIF (manufactured by AZ Electronic Materials)) for 90 seconds.
  • - Step S16 Rinse with pure water.
  • Step S17 Dry etching was performed by a reactive ion etching (RIE) apparatus using oxygen gas (the exposed Cytop without resist protection was removed on the glass).
  • RIE reactive ion etching
  • Step S18 The cover glass was placed on a glass stand and immersed in acetone (to remove the resist).
  • - Step S19 Ultrasonic treatment (90 seconds) was performed.
  • - Step S20 Immerse in isopropanol.
  • - Process S21 It left still (90 seconds).
  • - Step S22 Rinse with pure water.
  • Step S23 Water droplets on the glass were removed by an air blow.
  • - Step S24 The diameter and depth of the Cytop hole were confirmed with a laser microscope.
  • step S7 The rotation speed of step S7 was adjusted between 1000 and 7500 rpm
  • step S10 The rotation speed in step S10 was adjusted between 1000 and 7500 rpm.
  • the diameter and pitch of the photomask in step S13 are not limited to those described above.
  • the chamber in step S24 is assumed to have a diameter of 0.1 to 100 ⁇ m and a depth of 0.01 to 100 ⁇ m.
  • the volume in this case is roughly 1aL to 1nL.
  • the microchamber array had a diameter of 3.2 ⁇ m, a depth of 1.6 ⁇ m, and a pitch of 8 ⁇ m.
  • the microchamber volume was approximately 13 fL.
  • microchamber array produced by the above procedure may be referred to as a "device”.
  • Step 1 Glass hydrophilic treatment
  • Step 2 Ultrasonic treatment (20 minutes) was performed.
  • Process 3 It left still (20 minutes).
  • Step 4 Rinse with Milli-Q water.
  • Step 16 Water droplets on the device were removed by an air blow.
  • Step 17 20 ⁇ L of 40 nm silver nanoparticle dispersion and 20 ⁇ L of 0.03% trifluoroacetic acid (TFA) were mixed and dropped onto the device (TFA was added to promote the formation of aggregates of silver fine particles. rice field).
  • Step 18 Placed on an aluminum block cooled on ice while the liquid droplets were placed thereon.
  • - Process 19 It left still (1 minute).
  • Step 20 While the liquid droplets were placed, it was housed in a high-humidity/light-shielding box and stored in a refrigerator (4°C).
  • - Process 21 It left still (1 day or more). The fabrication of the SERS chip has been completed.
  • the silver nanoparticle dispersion in step 17 is assumed to have a diameter of 1 to 1500 nm.
  • Gold, copper, platinum, palladium, aluminum, titanium, etc. can also be used as other metal species. Alloys of these, core-shell structures, and the like can also be used. Various shapes such as spheres, rods, ellipses, triangles, cubes, bipyramids, and stars can be used for the metal nanoparticles.
  • Fig. 5 is a scattering image of a SERS chip in which aggregates of silver nanoparticles are immobilized on a microchamber array.
  • the surfactant in step 23 was 100 ⁇ M Triton-X in this example.
  • Other surfactants can also be used without particular limitation.
  • the oil in step 24 was Fomblin in this example.
  • Other oils are not particularly limited and can be used.
  • other than Fomblin mineral oil, hexadecane, 3M Fluorinert FC-40 (manufactured by 3M), 3M Fluorinert FC-70 (manufactured by 3M) and the like can be used as the oil.
  • step 25 in addition to absorption by filter paper, a method of sucking the solution with a pipette, a method of flushing with oil using a flow path, etc. can be used without particular limitation.
  • Step 32 The irradiation of the laser light and the exposure of the two-dimensional photodetector were stopped.
  • Step 33 The angle of the narrow linewidth bandpass filter was adjusted to match the transmission wavelength band with the bottom (tail) of the Raman peak of the reaction product.
  • Step 34 The sample was irradiated with laser light expanded to the entire field of view (the irradiation time was the same as in step 30).
  • Step 35 During laser irradiation, a scattered image of the SERS chip was taken with a two-dimensional photodetector (CMOS camera, CCD camera, etc.) (same exposure time as step 31).
  • Step 36 The irradiation of the laser light and the exposure of the two-dimensional photodetector were stopped.
  • Step 37 The sample stage of the microscope was moved.
  • Step 38 Steps 29 to 37 were repeated (in step 37, the sample table was moved in a tiled manner).
  • the exposure time of the detector in steps 31 and 34 is preferably 1 millisecond to 100 seconds. In this example, it was 2 seconds.
  • step 37 scanning was performed 30 times at a vertical pitch of 60 ⁇ m and 9 times at a horizontal pitch of 135 ⁇ m, and a total of 270 points were imaged.
  • FIG. 6 is a schematic diagram of the optical system of a wide-field Raman microscope.
  • Step 39 The difference between the images captured in step 30 (peak top) and step 32 (beak bottom) was obtained for each position of the sample stage.
  • Step 40 The differential images obtained in step 39 were arranged in tiles according to the movement order of the sample stage.
  • Step 41 The number of microchambers (bright spots) brighter than the set threshold was counted.
  • Step 27-s The SERS chip was placed on the sample stage of the microscope. • Step 28-s: The objective lens was focused on the bottom surface of the microchamber. Step 29-s: The sample was irradiated with a linear (y-direction) laser beam (several milliseconds to several tens of seconds).
  • Step 29-s The sample was irradiated with a linear (y-direction) laser beam (several milliseconds to several tens of seconds).
  • Step 29-s The sample was irradiated with a linear (y-direction) laser beam (several milliseconds to several tens of seconds).
  • CMOS camera, CCD camera, etc.) connected to the spectrometer captured a scattered spectral image (y- ⁇ ) of the SERS chip (exposure time: several milliseconds to tens of seconds).
  • Step 31-s The irradiation of the laser light and the exposure of the two-dimensional photodetector were stopped.
  • Step 32-s The sample stage of the microscope was moved in a direction (x direction) perpendicular to the laser line.
  • Step 33-s Steps 29-s to 32-s were repeated.
  • Step 34-s The scattering spectroscopic image (y- ⁇ ) acquired while scanning in the x-direction was reconstructed into xy- ⁇ data.
  • Step 35-s xy- ⁇ 1 and xy- ⁇ 3 were extracted with the ⁇ direction aligned with the top ( ⁇ 1) and bottom ( ⁇ 3) of the Raman peak of the reaction product, respectively.
  • Step 36-s The difference between xy- ⁇ 1 and xy- ⁇ 3 was taken.
  • Step 37-s The number of microchambers (bright spots) brighter than the set threshold was counted.
  • the scanning pitch (x direction) in step 32-s is 0.5 ⁇ m in this example.
  • the length (y-direction) of the linear laser was 140 ⁇ m in this example.
  • the SERS spectra derived from 1,1-dimethyl-4-mercaptomethylpiperidinium, which is an enzymatic reaction product by acetylcholinesterase, and thiocholine, which is an enzymatic reaction product by butyrylcholinesterase, are shown. observed in different microchambers.
  • the enzyme concentration in the sample can be quantified with high sensitivity, the function of the enzyme (substrate decomposition) can be detected more quantitatively for each molecule. Furthermore, substrates with different reactivities can be used to simultaneously identify and quantify a plurality of enzymatic activities. INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it becomes possible to quantify the concentration of an enzyme in a sample, which has been impossible due to lack of sensitivity and discriminative ability, and can widely contribute to medical and biological research.
  • DESCRIPTION OF SYMBOLS 100 High-speed Raman spectral imaging apparatus 101... Laser light source 102, 106, 110... Flip mirror for optical path switching 103, 108... Mirror, 104... Cylindrical lens, 105, 107, 111, 117... Lens, 109... Dichroic filter , 114... Slit, 115... Spectroscope, 116... CCD, 118... Narrow line width bandpass filter, 119... sCMOS, 112... Objective lens, 113... Sample, 510... Substrate, 530... Well, 700... Film, 710... resist film

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Abstract

酵素の測定方法は、酵素及び前記酵素の選択的基質を含む混合液を準備する混合液準備工程と、金属ナノ構造体を固相化した複数のマイクロチャンバーを有する金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを準備するアレイ準備工程と、前記複数のマイクロチャンバーのそれぞれに前記酵素の分子が１個以下となるように前記混合液を封入する混合液封入工程と、前記金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを励起光で照明して、前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度が予め設定した値以上に変化した、又は予め設定した閾値以上若しくは閾値以下であるマイクロチャンバーの個数を計測する輝点数計測工程と、を含む。

Description

酵素の測定方法、マイクロチャンバーアレイ、キット、ラマン散乱像の撮影方法、及び目的分子の測定方法
　本発明は、酵素の測定方法、マイクロチャンバーアレイ、キット、ラマン散乱像の撮影方法、及び目的分子の測定方法に関する。本願は、２０２１年１２月８日に、日本に出願された特願２０２１－１９９６４２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　酵素は、加水分解や転移などの反応を介し、基質分子の構造を変化させる。生体内には数千種類の酵素が存在し、代謝、吸収、信号伝達などの機能を担う。血液や唾液、尿などの体液中には、臓器等で産生された酵素が微量に含まれ、特定の臓器が機能不全に陥ると、体液中の関連酵素の活性値も低下する。逆に、細胞内の酵素が臓器の炎症や神経細胞の変性などで血液などの体液中へ漏出すると、関連酵素の活性が亢進する。こうした体液中における酵素活性（酵素濃度）の変化は、種々の疾患の進行と相関するため、低侵襲かつ早期の疾患診断指標として重用されている。
　特許文献１には、フェムトリットルオーダーの大きさのマイクロチャンバーを用いて１分子レベルで酵素活性を検出することが記載されている。
　酵素活性をベースとした疾患診断の拡充にあたり課題となるのが、酵素活性計測技術の改善である。従来、検体中の酵素活性計測は、酵素反応に伴い蛍光又は呈色反応を示す標識基質が用いられてきた。高感度に酵素活性を計測できる重要な手法であるが、一方で、嵩高い標識が酵素反応の妨げとなり、計測困難な酵素種が数多く存在する。さらに、標識基質に複数種の酵素が反応してしまい、混在する酵素群から疾患に寄与する酵素種のみ議論することが困難な場面も多い。酵素を無標識、高感度、かつ複数種の酵素を高精度に識別できる、新たな分析技術の開発が急務である。
　酵素活性を無標識で定量する手法として、ラマン散乱分光法、なかでも高感度化の見込める表面増強ラマン散乱（Ｓｕｒｆａｃｅ－ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｒａｍａｎ　Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，ＳＥＲＳ）分光法は有望である。ＳＥＲＳは、金属ナノ構造体に形成される光増強場を利用した高感度の振動分光法である。波長より小さなサイズの金属ナノ構造体に光を照射すると、電子の集団励起である局在表面プラズモンが誘起される。ここで金属ナノ構造体の間隔を狭めると、プラズモンどうしが相互作用するようになり、金属ナノ構造体の間に極めて強い増強電場が形成されるようになる。さらにＳＥＲＳ分光法では、この電場増強効果に加え、金属と分子の相互作用に由来する化学効果も見られる。電場増強効果と化学効果により信号光強度が大幅に向上するため、ＳＥＲＳ分光法はラマン散乱分光法の高感度化に有望である。さらに、ＳＥＲＳ分光法に見られる散乱スペクトルの線幅は、蛍光発光スペクトルと比較して狭い。このため、スペクトルの重なりなく、複数酵素の反応生成物を見分けて、複数同時に多数の酵素活性を計測することも期待できる。しかしながら、緻密な金属ナノ構造体の制御が求められ、定量性と再現性に課題があるため、従来型の散乱強度を縦軸にとるＳＥＲＳ分光法では、検体中の微量な酵素が示す反応生成物を捉え、低濃度域で酵素濃度の定量的な議論を行うことが困難である。
日本国特開２００４－３０９４０５号公報
　本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、試料中の酵素を無標識かつ優れた感度で測定できる技術を提供する。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］　酵素及び前記酵素の選択的基質を含む混合液を準備する混合液準備工程と、
　金属ナノ構造体を固相化した複数のマイクロチャンバーを有する金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを準備するアレイ準備工程と、
　前記複数のマイクロチャンバーのそれぞれに前記酵素の分子が１個以下となるように前記混合液を封入する混合液封入工程と、
　前記金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを励起光で照明して、前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度が予め設定した値以上に変化した、又は予め設定した閾値以上若しくは閾値以下であるマイクロチャンバーの個数を計測する輝点数計測工程と、を含み、
　前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、かつ、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別できる、
酵素の測定方法。
［２］　酵素及び前記酵素の選択的基質を含む混合液を準備する混合液準備工程と、
　金属ナノ構造体を固相化した複数のマイクロチャンバーを有する金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを準備するアレイ準備工程と、
　前記複数のマイクロチャンバーのそれぞれに前記酵素の分子が１個以下となるように前記混合液を封入する混合液封入工程と、
　前記金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度を前記複数のマイクロチャンバー毎に経時的に測定する経時測定工程と、を含み、
　前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、かつ、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別できる、
酵素の測定方法。
［３］　複数種類の酵素及び前記複数種類の酵素に対応する複数種類の選択的基質を含む混合液を準備する混合液準備工程と、
　金属ナノ構造体を固相化した複数のマイクロチャンバーを有する金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを準備するアレイ準備工程と、
　前記複数のマイクロチャンバーのそれぞれに前記複数種類の酵素のうち少なくともいずれか１種類の分子が１個以下となるように前記混合液を封入する混合液封入工程と、
　前記金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度が予め設定した値以上に変化した、又は予め設定した閾値以上若しくは閾値以下であるマイクロチャンバーの個数を計測する輝点数計測工程と、を含み、
　前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別でき、かつ、複数種類の前記酵素反応生成物は互いに異なる構造を示し、ラマンピークで複数種類の前記酵素反応生成物又は前記選択的基質を区別できる、
酵素の測定方法。
［４］　複数種類の酵素及び前記複数種類の酵素に対応する複数種類の選択的基質を含む混合液を準備する混合液準備工程と、
　金属ナノ構造体を固相化した複数のマイクロチャンバーを有する金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを準備するアレイ準備工程と、
　前記複数のマイクロチャンバーのそれぞれに前記複数種類の酵素のうち少なくともいずれか１種類の分子が１個以下となるように前記混合液を封入する混合液封入工程と、
　前記金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度を前記複数のマイクロチャンバー毎に経時的に測定する経時測定工程と、を含み、
　前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別でき、かつ、複数種類の前記酵素反応生成物は互いに異なる構造を示し、ラマンピークで複数種類の前記酵素反応生成物又は前記選択的基質を区別できる、
酵素の測定方法。
［５］　酵素、前記酵素の選択的基質及び金属ナノ構造体を含む混合液を準備する混合液準備工程と、
　前記混合液を前記酵素の分子が１個以下となるように含む複数のドロップレットに分割するドロップレット分割工程と、
　前記複数のドロップレットを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度が予め設定した値以上に変化した、又は予め設定した閾値以上若しくは閾値以下であるドロップレットの個数を計測する輝点数計測工程と、を含み、
　前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、かつ、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別できる、
酵素の測定方法。
［６］　酵素、前記酵素の選択的基質及び金属ナノ構造体を含む混合液を準備する混合液準備工程と、
　前記混合液を前記酵素の分子が１個以下となるように含む複数のドロップレットに分割するドロップレット分割工程と、
　前記複数のドロップレットを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度を前記複数のドロップレット毎に経時的に測定する経時測定工程と、を含み、
　前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、かつ、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別できる、
酵素の測定方法。
［７］　複数種類の酵素、前記複数種類の酵素に対応する複数種類の選択的基質及び金属ナノ構造体を含む混合液を準備する混合液準備工程と、
　前記混合液を前記複数種類の酵素のうち少なくともいずれか１種類の分子が１個以下となるように含む複数のドロップレットに分割するドロップレット分割工程と、
　前記複数のドロップレットを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度が予め設定した値以上に変化した、又は予め設定した閾値以上若しくは閾値以下であるドロップレットの個数を計測する輝点数計測工程と、を含み、
　前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別でき、かつ、複数種類の前記酵素反応生成物は互いに異なる構造を示し、ラマンピークで複数種類の前記酵素反応生成物又は前記選択的基質を区別できる、
酵素の測定方法。
［８］　複数種類の酵素、前記複数種類の酵素に対応する複数種類の選択的基質及び金属ナノ構造体を含む混合液を準備する混合液準備工程と、
　前記混合液を前記複数種類の酵素のうち少なくともいずれか１種類の分子が１個以下となるように含む複数のドロップレットに分割するドロップレット分割工程と、
　前記複数のドロップレットを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度を前記複数のドロップレット毎に経時的に測定する経時測定工程と、を含み、
　前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別でき、かつ、複数種類の前記酵素反応生成物は互いに異なる構造を示し、ラマンピークで複数種類の前記酵素反応生成物又は前記選択的基質を区別できる、
酵素の測定方法。
［９］　前記輝点数計測工程又は前記経時測定工程において、前記混合液を各マイクロチャンバーに封入した前記金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを、広視野照明で照明し、前記ラマンピークの位置に適合する狭線幅のバンドパスフィルターを用いて、前記酵素反応生成物又は前記選択的基質のラマンピークの波長帯でラマン散乱像を取得し、各マイクロチャンバーの表面増強ラマン散乱光強度と強度の経時変化を定量する、［１］～［４］のいずれかに記載の酵素の測定方法。
［１０］　前記酵素反応生成物又は前記選択的基質のラマンピークのトップの波長帯及び前記ラマンピークのボトムの波長帯でラマン散乱像を取得し、両者の差分をとることにより、各マイクロチャンバーの表面増強ラマン散乱光強度と強度の経時変化を定量する、［９］に記載の酵素の測定方法。
［１１］　前記輝点数計測工程又は前記経時測定工程において、前記混合液を分割した複数のドロップレットを、広視野照明で照明し、前記ラマンピークの位置に適合する狭線幅のバンドパスフィルターを用いて、前記酵素反応生成物又は前記選択的基質のラマンピークの波長帯でラマン散乱像を取得し、各ドロップレットの表面増強ラマン散乱光強度を定量する、［５］～［８］のいずれかに記載の酵素の測定方法。
［１２］　前記酵素反応生成物又は前記選択的基質のラマンピークのトップの波長帯及び前記ラマンピークのボトムの波長帯でラマン散乱像を取得し、両者の差分をとることにより、各ドロップレットの表面増強ラマン散乱光強度を定量する、［１１］に記載の酵素の測定方法。
［１３］　前記酵素反応生成物がチオール基を有する、［１］～［１２］のいずれかに記載の酵素の測定方法。
［１４］　前記金属ナノ構造体が金属ナノ粒子の凝集体である、［１］～［１３］のいずれかに記載の酵素の測定方法。
［１５］　前記酵素が、アセチルコリンエステラーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ、ホスホリパーゼ、エラスターゼ及びアミラーゼからなる群から選択される少なくとも１種である、［１］～［１４］のいずれかに記載の酵素の測定方法。
［１６］　アセチルコリンエステラーゼの選択的基質がＭＡＴＰ＋であり、ブチリルコリンエステラーゼの選択的基質がブチリルチオコリンである、［１５］に記載の酵素の測定方法。
［１７］　金属ナノ構造体を固相化した複数のマイクロチャンバーを有するマイクロチャンバーアレイ。
［１８］　前記金属ナノ構造体が金属ナノ粒子の凝集体である、［１７］に記載のマイクロチャンバーアレイ。
［１９］　［１７］又は［１８］に記載のマイクロチャンバーアレイと、［１］～［４］、[９]、[１０]、［１３］～［１６］のいずれかに記載の酵素の測定方法の手順を記載したプロトコールとを含む、キット。
［２０］　狭線幅バンドパスフィルターの透過波長帯を目的分子のラマンピークのトップに合わせ、視野全体に拡大したレーザー光を試料に照射し、レーザー照射中、２次元光検出器でラマン散乱像を撮像する、ラマン散乱像の撮影方法。
［２１］　さらに、前記狭線幅バンドパスフィルターの透過波長帯を前記目的分子のラマンピークのボトムに合わせる、［２０］に記載のラマン散乱像の撮影方法。
［２２］　複数のマイクロチャンバーを有するマイクロチャンバーアレイの前記複数のマイクロチャンバーに前記目的分子を配置する、［２０］又は［２１］に記載のラマン散乱像の撮影方法。
［２３］　前記複数のマイクロチャンバーに金属ナノ構造体を固相化している、［２２］に記載のラマン散乱像の撮影方法。
［２４］　前記目的分子を金属ナノ構造体上に配置する、［２０］又は［２１］に記載のラマン散乱像の撮影方法。
［２５］　狭線幅バンドパスフィルターの透過波長帯を目的分子のラマンピークのトップに合わせ、視野全体に拡大したレーザー光を試料に照射し、レーザー照射中、２次元光検出器でラマン散乱像を撮像し、
　得られたラマン散乱像から前記目的分子の濃度分布を抽出する、
ラマン散乱を用いた目的分子の測定方法。
［２６］　さらに、前記狭線幅バンドパスフィルターの透過波長帯を前記目的分子のラマンピークのボトムに合わせる、［２５］に記載の目的分子の測定方法。
［２７］　前記目的分子のラマンピークの前記トップの透過波長帯及びボトムの透過波長帯で撮影したラマン散乱像の差分をとることにより、前記目的分子の濃度分布を抽出する、［２５］又は［２６］に記載の目的分子の測定方法。
［２８］　複数のマイクロチャンバーを有するマイクロチャンバーアレイの前記複数のマイクロチャンバーに前記目的分子を配置する、［２５］～［２７］のいずれかに記載の目的分子の測定方法。
［２９］　前記複数のマイクロチャンバーに金属ナノ構造体を固相化している、［２８］に記載の目的分子の測定方法。
［３０］　前記目的分子を金属ナノ構造体上に配置する、［２５］～［２７］のいずれかに記載の目的分子の測定方法。
　また、本発明は以下の態様を含む。
（１）　酵素及び前記酵素の選択的基質を含む混合液を準備する混合液準備工程と、
　金属ナノ構造体を固相化した複数のマイクロチャンバーを有する金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを準備するアレイ準備工程と、
　前記複数のマイクロチャンバーのそれぞれに前記酵素の分子が１個以下となるように前記混合液を封入する混合液封入工程と、
　前記金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを励起光で照明して、前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度が予め設定した値以上に変化した、又は予め設定した閾値以上若しくは閾値以下であるマイクロチャンバーの個数を計測する輝点数計測工程、又は、
　前記金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度を前記複数のマイクロチャンバー毎に経時的に測定する経時測定工程と、を含み、
　前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、かつ、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別できる、
酵素の測定方法。
（２）　前記混合液準備工程において、複数種類の酵素及び前記複数種類の酵素に対応する複数種類の選択的基質を含む混合液を準備し、
　前記混合液封入工程において、前記複数のマイクロチャンバーのそれぞれに前記複数種類の酵素のうち少なくともいずれか１種類の分子が１個以下となるように前記混合液を封入し、且つ、
　複数種類の前記酵素反応生成物は互いに異なる構造を示し、ラマンピークで複数種類の前記酵素反応生成物又は前記選択的基質を区別できる、（１）に記載の酵素の測定方法。
（３）　酵素、前記酵素の選択的基質及び金属ナノ構造体を含む混合液を準備する混合液準備工程と、
　前記混合液を前記酵素の分子が１個以下となるように含む複数のドロップレットに分割するドロップレット分割工程と、
　前記複数のドロップレットを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度が予め設定した値以上に変化した、又は予め設定した閾値以上若しくは閾値以下であるドロップレットの個数を計測する輝点数計測工程、又は、
　前記複数のドロップレットを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度を前記複数のドロップレット毎に経時的に測定する経時測定工程と、を含み、
　前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、かつ、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別できる、
酵素の測定方法。
（４）　前記混合液準備工程において、複数種類の酵素及び前記複数種類の酵素に対応する複数種類の選択的基質を含む混合液を準備し、
　前記ドロップレット分割工程において、前記混合液を前記複数種類の酵素のうち少なくともいずれか１種類の分子が１個以下となるように含む複数のドロップレットに分割し、且つ、
　複数種類の前記酵素反応生成物は互いに異なる構造を示し、ラマンピークで複数種類の前記酵素反応生成物又は前記選択的基質を区別できる、（３）に記載の酵素の測定方法。
（５）　前記輝点数計測工程又は前記経時測定工程において、前記混合液を各マイクロチャンバーに封入した前記金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを、広視野照明で照明し、前記ラマンピークの位置に適合する狭線幅のバンドパスフィルターを用いて、前記酵素反応生成物又は前記選択的基質のラマンピークの波長帯でラマン散乱像を取得し、各マイクロチャンバーの表面増強ラマン散乱光強度と強度の経時変化を定量する、（１）又は（２）に記載の酵素の測定方法。
（６）　前記酵素反応生成物又は前記選択的基質のラマンピークのトップの波長帯及び前記ラマンピークのボトムの波長帯でラマン散乱像を取得し、両者の差分をとることにより、各マイクロチャンバーの表面増強ラマン散乱光強度と強度の経時変化を定量する、（５）に記載の酵素の測定方法。
（７）　前記輝点数計測工程又は前記経時測定工程において、前記混合液を分割した複数のドロップレットを、広視野照明で照明し、前記ラマンピークの位置に適合する狭線幅のバンドパスフィルターを用いて、前記酵素反応生成物又は前記選択的基質のラマンピークの波長帯でラマン散乱像を取得し、各ドロップレットの表面増強ラマン散乱光強度を定量する、（３）又は（４）に記載の酵素の測定方法。
（８）　前記酵素反応生成物又は前記選択的基質のラマンピークのトップの波長帯及び前記ラマンピークのボトムの波長帯でラマン散乱像を取得し、両者の差分をとることにより、各ドロップレットの表面増強ラマン散乱光強度を定量する、（７）に記載の酵素の測定方法。
（９）　前記酵素反応生成物がチオール基を有する、（１）～（８）のいずれかに記載の酵素の測定方法。
（１０）　前記金属ナノ構造体が金属ナノ粒子の凝集体である、（１）～（９）のいずれかに記載の酵素の測定方法。
（１１）　前記酵素が、アセチルコリンエステラーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ、ホスホリパーゼ、エラスターゼ及びアミラーゼからなる群から選択される少なくとも１種である、（１）～（１０）のいずれかに記載の酵素の測定方法。
（１２）　アセチルコリンエステラーゼの選択的基質がＭＡＴＰ＋であり、ブチリルコリンエステラーゼの選択的基質がブチリルチオコリンである、（１１）に記載の酵素の測定方法。
（１３）　金属ナノ構造体を固相化した複数のマイクロチャンバーを有するマイクロチャンバーアレイ。
（１４）　前記金属ナノ構造体が金属ナノ粒子の凝集体である、（１３）に記載のマイクロチャンバーアレイ。
（１５）　（１３）又は（１４）に記載のマイクロチャンバーアレイと、（１）、（２）、（５）、（６）、（９）～（１２）のいずれかに記載の酵素の測定方法の手順を記載したプロトコールとを含む、キット。
（１６）　狭線幅バンドパスフィルターの透過波長帯を目的分子のラマンピークのトップに合わせ、視野全体に拡大したレーザー光を試料に照射し、レーザー照射中、２次元光検出器でラマン散乱像を撮像する、ラマン散乱像の撮影方法。
（１７）　さらに、前記狭線幅バンドパスフィルターの透過波長帯を前記目的分子のラマンピークのボトムに合わせる、（１６）に記載のラマン散乱像の撮影方法。
（１８）　複数のマイクロチャンバーを有するマイクロチャンバーアレイの前記複数のマイクロチャンバーに前記目的分子を配置する、（１６）又は（１７）に記載のラマン散乱像の撮影方法。
（１９）　前記複数のマイクロチャンバーに金属ナノ構造体を固相化している、（１８）に記載のラマン散乱像の撮影方法。
（２０）　前記目的分子を金属ナノ構造体上に配置する、（１６）又は（１７）に記載のラマン散乱像の撮影方法。
（２１）　狭線幅バンドパスフィルターの透過波長帯を目的分子のラマンピークのトップに合わせ、視野全体に拡大したレーザー光を試料に照射し、レーザー照射中、２次元光検出器でラマン散乱像を撮像し、
　得られたラマン散乱像から前記目的分子の濃度分布を抽出する、
ラマン散乱を用いた目的分子の測定方法。
（２２）　さらに、前記狭線幅バンドパスフィルターの透過波長帯を前記目的分子のラマンピークのボトムに合わせる、（２１）に記載の目的分子の測定方法。
（２３）　前記目的分子のラマンピークの前記トップの透過波長帯及びボトムの透過波長帯で撮影したラマン散乱像の差分をとることにより、前記目的分子の濃度分布を抽出する、（２１）又は（２２）に記載の目的分子の測定方法。
（２４）　複数のマイクロチャンバーを有するマイクロチャンバーアレイの前記複数のマイクロチャンバーに前記目的分子を配置する、（２１）～（２３）のいずれかに記載の目的分子の測定方法。
（２５）　前記複数のマイクロチャンバーに金属ナノ構造体を固相化している、（２４）に記載の目的分子の測定方法。
（２６）　前記目的分子を金属ナノ構造体上に配置する、（２１）～（２３）のいずれかに記載の目的分子の測定方法。
　本発明によれば、試料中の酵素を無標識かつ優れた感度で検出できる技術を提供することができる。
図１は、ＳＥＲＳチップの計測に用いる高速ラマンイメージング装置の一例の構成概要図である。 図２は、照明形式毎の計測時間の概算例である。 図３は、金属ナノ構造体を固相化したＳＥＲＳチップの一例の模式図である。 図４は、ＳＥＲＳチップの製造方法の各工程を説明する模式断面図である。 図５は、実施例で用いた、マイクロチャンバーアレイに銀ナノ粒子を固相化したＳＥＲＳチップの散乱像である。 図６は、実施例で用いた、広視野ラマン顕微鏡の光学系模式図である。 図７の左に示す画像は、実施例における、アセチルコリンエステラーゼ(ＡＣｈＥ)、アセチルチオコリン混合液をＳＥＲＳチップに封入した試料のＳＥＲＳ像である。図７の中央に示すグラフは、前記ＳＥＲＳ像中のチャンバーＡ、チャンバーＢにおけるＳＥＲＳスペクトルである。図７の右に示す図は、アセチルコリンエステラーゼによるアセチルチオコリンの分解と分解生成物のＳＥＲＳ計測の模式図である。前記ＳＥＲＳ像及び前記ＳＥＲＳスペクトルは、アセチルコリンエステラーゼ　１００ｐＭ、アセチルチオコリン　２ｍＭの条件下にて、スリット走査ラマン顕微鏡で取得した。 図８は、実施例における、アセチルコリンエステラーゼ(ＡＣｈＥ)濃度と輝点数の関係を示すグラフである。前記輝点数は、スリット走査ラマン顕微鏡で取得した。 図９は、実施例における、アセチルコリンエステラーゼ(ＡＣｈＥ)、アセチルチオコリン混合液をＳＥＲＳチップに封入した試料のＳＥＲＳ像である。前記ＳＥＲＳ像は、アセチルコリンエステラーゼ　１０ｐＭ、アセチルチオコリン　２ｍＭの条件下にて、広視野ラマン顕微鏡で取得した。 図１０は、実施例における、アセチルコリンエステラーゼ(ＡＣｈＥ)濃度と輝点数の関係を示すグラフである。前記輝点数は、広視野ラマン顕微鏡で取得した。前記グラフ中の点線は、アセチルコリンエステラーゼ０Ｍの時の輝点数の平均値にその標準偏差の３倍を足した値を示す。点線と実線の交点を検出下限とみなす。 図１１の左上に示す画像は、実施例における、アセチルコリンエステラーゼ(ＡＣｈＥ)、ブチリルコリンエステラーゼ(ＢｕＣｈＥ)、ＭＡＴＰ+、ブチリルチオコリン混合液をＳＥＲＳチップに封入した試料のＳＥＲＳ像である。図１１の左下に示すグラフは、前記ＳＥＲＳ像中のチャンバーＡ、チャンバーＢにおけるＳＥＲＳスペクトルである。図１１の右上に示す図は、アセチルコリンエステラーゼ(ＡＣｈＥ)によるＭＡＴＰ+の分解と分解生成物のＳＥＲＳ計測の模式図（左）、及び、ブチリルコリンエステラーゼ(ＢｕＣｈＥ)ブチリルチオコリンによる分解と分解生成物のＳＥＲＳ計測の模式図（右）である。前記ＳＥＲＳ像及び前記ＳＥＲＳスペクトルは、アセチルコリンエステラーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ　各１００ｐＭ、ＭＡＴＰ+、ブチリルチオコリン　各１ｍＭの条件下にて、スリット走査ラマン顕微鏡で取得した。
　以下、図面を適宜参照しつつ、本技術の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
［ラマン分光イメージング装置］
　本技術においてＳＥＲＳチップ（各マイクロチャンバーに金属ナノ構造体を固相化したマイクロチャンバーアレイ。詳細は後述する。）の計測に用いるラマン分光イメージング装置の一例について説明する。
　図１に構成概要を示すラマン分光イメージング装置１００は、ライン照明系及び広視野照明系を有する。
　ライン照明系では、レーザー光源１０１を発したレーザー光（励起レーザー）が、ミラー１０３→シリンドリカルレンズ１０４→レンズ１０５→ダイクロイックフィルター１０９→対物レンズ１１２の順に通過して試料１１３を照明する。レーザー光源１０１からのレーザー光が、シリンドリカルレンズ１０４でライン状に成形される。試料１１３からのラマン散乱光は、対物レンズ１１２→ダイクロイックフィルター１０９→レンズ１１１の順に通過して、分光器１１５のスリット１１４に沿ってＣＣＤ１１６に結像する。ライン照明系では、スペクトルを並列に検出して高速化する。
　広視野照明系では、レーザー光源１０１を発したレーザー光が、フリップミラー１０２→レンズ１０７、ミラー１０８、フリップミラー１０６→ダイクロイックフィルター１０９→対物レンズ１１２の順に通過して試料１１３を照明する。試料１１３からのラマン光は、対物レンズ１１２→ダイクロイックフィルター１０９→フリップミラー１１０→レンズ１１７→狭線幅バンドパスフィルター１１８の順に通過して、２次元検出器１１９のｓＣＭＯＳに結像する。基質の分解生成物に特異的なラマンピークの位置に適合する狭線幅バンドパスフィルター１１８が広視野照明用の結像光学系に配置される。透過帯の角度依存性を利用し、分解生成物のラマンピークのトップと裾で散乱像をそれぞれ取得し、その差分から各チャンバーのＳＥＲＳ光強度を定量する。
　図２に照明形式毎の計測時間の概算例を示す。広視野照明により、秒間１００個以上を分析することが見込める。基質の酵素反応生成物を試料に用いた場合、狭線幅バンドパスフィルターの角度調整によって、当該酵素反応生成物由来の散乱強度を選択的に抽出できる。
［ＳＥＲＳチップ］
　本技術において用いる、マイクロチャンバーに金属ナノ構造体を固相化したマイクロチャンバーアレイ（ＳＥＲＳチップ）の一例について説明する。ただし、本技術では、マイクロチャンバーアレイに代えてドロップレットを用いることもできるが、これについては別途説明する。
　本技術に係るＳＥＲＳチップは均一なＳＥＲＳ光強度が得られる。均一性の確保は、各チャンバー内で均一に金属ナノ構造体を形成させることにある。その理由は、強いＳＥＲＳ光は、金属ナノ構造体の微細な隙間（ギャップ）において生じるためである。チャンバー内における金属ナノ構造体の形成を制御し、無数のギャップ構造を形成して増幅度を安定化させることができる。マイクロチャンバーの一例は、底面がガラス、周辺がフッ素樹脂の円柱状である。図３に示すように、マイクロチャンバー底面のガラス部を化学修飾して、金属ナノ構造体がチャンバー下面の全域をカバーするようにすることが好ましい。金属ナノ構造体を構成する金属種、形状、サイズ、形成条件、励起波長、チャンバー容積等を最適化することにより、感度と均一性をより向上させることができる。
　上述したＳＥＲＳチップは、例えば、次のようにして製造することができる。
　まず、図４（ａ）に示すように、基板５１０を準備する。
　基板５１０の材質としては、ガラス、樹脂等が挙げられる。
　ガラスは特に限定されない。例えば、ガラスとしては、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、ソーダ石灰ガラスなどが挙げられる。
　樹脂としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、環状ポリオレフィン、アクリル等が挙げられる。樹脂の中でも、ポリカーボネートは、安価に大量生産可能なＣＤ、ＤＶＤの材質としても使用されており、マイクロチャンバーアレイを低コストに製造する観点からも好適である。
　基板５１０の材質としては、ガラス又はポリカーボネートが好ましく、ガラスがより好ましい。
　続いて、図４（ｂ）に示すように、基板５１０の表面に、膜７００を積層する。
　膜７００の材質としては、フッ素系樹脂、環状ポリオレフィン、シリコーン系樹脂等が挙げられる。
　膜７００の厚さは、特に限定されないが、マイクロチャンバーの容積を考慮して適宜設定することができる。
　続いて、図４（ｃ）に示すように、膜７００の表面にレジスト膜７１０を積層する。続いて、マイクロチャンバーアレイのパターンのマスクを用いて、露光機で活性エネルギー線を照射してレジスト膜７１０を露光する。続いて現像液で現像し、マイクロチャンバーを形成する部分のレジスト膜７１０を除去する。
　続いて、図４（ｅ）に示すように、レジスト膜７１０でマスクされた膜７００を、エッチングすることにより、膜７００にマイクロチャンバー５３０を形成する。
　続いて、図４（ｆ）に示すように、基板を洗浄することにより、レジスト膜７１０を除去し、マイクロチャンバー５３０のアレイを得る。ここまでの工程により、マイクロチャンバーを複数個有するマイクロチャンバーアレイが得られる。
　続いて、作製したマイクロチャンバーアレイのウェル５３０の底面に金属ナノ構造体を固相化する。
　まず、マイクロチャンバーアレイのマイクロチャンバー５３０の底面にカチオン性官能基を導入する。
　金属ナノ粒子の分散液と凝集促進剤であるトリフルオロ酢酸とを混合し、マイクロチャンバーに滴下して、マイクロチャンバーの底面に負に帯電した金属ナノ粒子の凝集体を形成させる。
　これによりマイクロチャンバー底面に金属ナノ粒子の凝集体である金属ナノ構造体が固相化されたマイクロチャンバーアレイが得られる。
　前記マイクロチャンバーの容積は、特に限定されないが、１ａＬ～１ｎＬが好ましく、１ｆＬ～１ｐＬがより好ましい。なお、「ａ」（アト）、「ｆ」（フェムト）、「ｐ」（ピコ）、「ｎ」（ナノ）は、それぞれ、１０－１８、１０－１５、１０－１２、１０－９を表す接頭辞である。
　上述した例では、金属ナノ構造体として金属ナノ粒子の凝集体を用いる場合について説明したが、限定されるわけではない。金属ナノ構造体の近傍には高度に局在化した電場が存在しており、この高強度の局在電場内に分子が存在すると、その分子の光学応答性が著しく変調される。このような変調の顕著な例が、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）である。従って、金属ナノ構造体としては、金属ナノ粒子を凝集剤の存在下で凝集させた金属ナノ粒子凝集体、ポリスチレンビーズの最密充填配列をテンプレートとした金属ナノ構造体の規則配列構造などが挙げられる。また、金属ナノ構造体としては、陽極酸化ポーラスアルミナに基づく金属ナノドットアレイも挙げられる。
　金属ナノ構造体の金属の種類は特に限定されないが、銀、金、銅、プラチナ、パラジウム、アルミ及びチタンからなる群から選択される少なくとも１種が好ましく、銀、金、プラチナ及びパラジウムからなる群から選択される少なくとも１種がより好ましく、銀又は金がさらに好ましく、銀がいっそう好ましい。異なる種類の金属を２種類以上併用してもよい。また、２種類以上の金属の合金を用いてもよい。金属ナノ粒子としては、２種類以上の金属のコアシェル型粒子等も使用し得る。
　金属ナノ構造体を、金属ナノ粒子を用いて構成する場合の金属ナノ粒子の形状は、特に限定されないが、例えば、球形、亜球形、ロッド形、キューブ形、楕円形、三角形、双角錐形、星形などが挙げられる。異なる形状の金属ナノ粒子を２種類以上併用してもよい。
　金属ナノ粒子の一次粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、１～１５００ｎｍが好ましく、１～５００ｎｍがより好ましく、１０～１００ｎｍがさらに好ましい。また、金属ナノ粒子の一次粒子の体積は、特に限定されないが、１ｎｍ３～１μｍ３が好ましい。
　金属ナノ粒子は複数の金属ナノ粒子が凝集した金属ナノ粒子凝集体であってもよい。金属ナノ粒子の凝集体は、例えば、金属ナノ粒子（一次粒子）をトリフルオロ酢酸等の凝集促進剤で処理して凝集させることにより製造することができる。
　なお、金属ナノ粒子は、従来公知の方法によって製造することができる。
　金属ナノ粒子を凝集体として用いることにより、近接した粒子対の微細な間隙が無数に形成され、間隙に存在する分子数を増加させることができることから、ラマン散乱がさらに増強されるため、感度をさらに向上しやすくなる。
　マイクロチャンバーアレイあたりのマイクロチャンバーの数は、特に限定されないが、１００個以上が好ましく、１，０００個以上がより好ましく、１０，０００個以上がさらに好ましい。マイクロチャンバーアレイあたりのマイクロチャンバーの数の上限は特に限定されないが、輝点の輝度計測及び個数のカウントに時間がかかりすぎることは好ましくないため、１０，０００，０００個以下が好ましい。
［酵素の測定方法］
　本技術の酵素の測定方法では、１分子以下の酵素、前記酵素の選択的基質、及び金属ナノ構造体を封入した微小反応空間（マイクロチャンバー又はドロップレット）毎に、前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度を測定し、該表面増強ラマン散乱強度が予め設定した値以上に変化した、又は予め設定した閾値以上若しくは閾値以下である反応空間の個数を計測する。本技術の酵素の測定方法によれば、微小な反応空間を用いて酵素の働き（基質の分解）を１分子毎に捉え、変化の見られた微小反応空間の個数から酵素分子の個数を直接勘定することにより、検体中の酵素濃度をより定量的かつ高感度に計測できる。
　以下、本技術の酵素の測定方法の具体的な実施形態について詳細に説明する。
＜第１の実施形態＞
　本技術の酵素の測定方法の第１の実施形態は、酵素及び前記酵素の選択的基質を含む混合液を準備する混合液準備工程と、金属ナノ構造体を固相化した複数のマイクロチャンバーを有する金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを準備するアレイ準備工程と、前記複数のマイクロチャンバーのそれぞれに前記酵素の分子が１個以下となるように前記混合液を封入する混合液封入工程と、前記金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを励起光で照明して、前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度が予め設定した値以上に変化した、又は予め設定した閾値以上若しくは閾値以下であるマイクロチャンバーの個数を計測する輝点数計測工程と、を含む酵素の測定方法である。ここで、前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、かつ、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別できる。
（混合液準備工程）
　混合液準備工程では、酵素及び前記酵素の選択的基質を含む混合液を準備する。
　前記酵素としては、例えば、アセチルコリンエステラーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ、ホスホリパーゼ、エラスターゼ、アミラーゼ等が挙げられる。
　アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）は、神経組織、赤血球などに存在し、コリン作動性神経（副交感神経、運動神経、交感神経の中枢～神経節）の神経伝達物質の１種であるアセチルコリン（ＡＣｈ）をコリンに分解する。ＡＣｈＥ自身はＡｃｈ分解によりアセチル化され、失活するものの、数ミリ秒で脱アセチル化が起こり、再び活性を得る。
　ブチリルコリンエステラーゼ（ＢｕＣｈＥ）は、ヒトでは肝臓で合成され、血清などに存在し、ＡＣｈを含む様々なコリンエステル類を分解する。
　酵素の選択的基質は、該選択的基質の酵素反応生成物とは異なる構造を示し、かつ、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別できるものである。ここで、前記酵素反応生成物は、前記金属ナノ構造体と相互作用しうる分子構造を有する。
　酵素の選択的基質は酵素の種類に応じて適宜選択できるが、例えば、ＢｕＣｈＥの選択的基質としてブチリルチオコリン（ＢＴＣ）が挙げられ、ＡＣｈＥの選択的基質としてＭＡＴＰ＋（１，１－ジメチル－４－アセチルチオメチルピペリジニウム）が挙げられる。ＢＴＣのＢｕＣｈＥによる加水分解産物は、チオコリンと酪酸であり、ＭＡＴＰ＋のＡＣｈＥによる加水分解産物は１，１－ジメチル－４－メルカプトメチルピペリジニウムと酢酸である。チオコリン及び１，１－ジメチル－４－メルカプトメチルピペリジニウムは、分子内にチオール基（メルカプト基）を有するため、後述する金属ナノ粒子の表面に捕捉されやすいことから好ましい。また、チオコリン及び１，１－ジメチル－４－メルカプトメチルピペリジニウムは、ラマン散乱スペクトルから区別しやすい化合物の組合せであることからも好ましい。
　混合液準備工程において、混合液の溶媒又は分散媒としては、水が好ましい。水としては、ミリＱ水、限外ろ過水（ＵＦ水）等の超純水が好ましいが、酵素や選択的基質を溶解、分散している水をそのまま混合液の溶媒又は分散媒としてもよい。
　混合液準備工程において、混合液は酵素、選択的基質及び溶媒の他に、界面活性剤を含んでもよい。
　界面活性剤の種類は、酵素とその選択的基質との反応を阻害しないものであれば特に限定されないが、例えば、トリトンＸ－１００（ｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール；Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）が挙げられる
　界面活性剤の濃度は、酵素とその選択的基質との反応を阻害しない濃度であれば特に限定されないが、例えば、混合液中で１～５００μＭとすることが挙げられる。
　混合液は、マイクロチャンバー１つにつき酵素の分子が１個以下となるように用いる。適切な場合には、混合液を希釈して用いてもよい。希釈のために用いる溶媒又は分散媒としては、水が好ましい。水としては、ミリＱ水、限外ろ過水（ＵＦ水）等の超純水が好ましい。
（アレイ準備工程）
　アレイ準備工程では、金属ナノ構造体を固相化した複数のマイクロチャンバーを有する金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイ（ＳＥＲＳチップ）を準備する。
　ＳＥＲＳチップは、例えば、上述した製造方法に従って製造することができる。
（混合液封入工程）
　混合液封入工程では、アレイ準備工程で準備したＳＥＲＳチップの複数のマイクロチャンバーのそれぞれに前記酵素の分子が１個以下となるように前記混合液を封入する。すなわち、マイクロチャンバー１個あたりに含まれる前記酵素の分子は１個以下である。混合液準備工程で準備した混合液は、適切な場合には希釈した上で用いてもよい。
　ＳＥＲＳチップへの混合液の封入は、例えば、混合液を各マイクロチャンバーに分配した後、オイルや流動パラフィンをマイクロチャンバー内の混合液に重層して封入する方法が挙げられる。上述したＳＥＲＳチップは、ＳＥＲＳチップの上面がフッ素系樹脂でコーティングされているため、撥水性が高い。
　混合液封入工程において、酵素とその選択的基質との反応産物（酵素反応産物）が生成する。混合液の体積は小さいため、混合液中で酵素反応産物は金属ナノ構造体の近傍に位置する。本技術では、金属ナノ構造体に励起光を当てることにより、金属ナノ構造体の表面では局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ，Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｐｌａｓｍｏｎ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）が起こる。プラズモン共鳴が局在化することの影響により、ナノ粒子の表面近傍には強い電場が発生し、さらには、二つのナノ粒子の近接部近傍では特に強い電場が誘起されることとなる。表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）では、金属ナノ粒子の表面に近接した分子のラマン散乱強度が何桁も増強する。
　酵素反応産物は、金属ナノ構造体の近傍に存在すればよいが、金属ナノ構造体の表面に吸着、結合等していてもよい。特に、金属ナノ構造体に酵素反応産物が結合するように、例えば、酵素反応産物がチオール基を有するように選択的基質を選択することが好ましい。金属ナノ構造体に酵素反応産物が結合すると、ラマン散乱光を増強して、さらに感度を向上させることができる。
　混合液のマイクロチャンバーへの封入方法は、例えば、油により封入することが挙げられる。油としては、フォンブリン、ミネラルオイル、ヘキサデカン、３ＭフロリナートＦＣ－４０、３ＭフロリナートＦＣ－７０など、不活性の油が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（輝点数計測工程）
　輝点数計測工程では、前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度が予め設定した値以上に変化した、又は予め設定した閾値以上若しくは閾値以下であるマイクロチャンバーの個数を計測する。
　より詳細には、広視野照明で前記ＳＥＲＳチップを照明し、前記ラマンピーク位置に適合する狭線幅のバンドパスフィルターを用いて、前記酵素反応生成物又は前記選択的基質のラマンピークのトップでラマン散乱像を取得して各マイクロチャンバーの表面増強ラマン散乱光強度を定量する。
　さらに、前記酵素反応生成物又は前記選択的基質のラマンピークのボトムでラマン散乱像を取得して、トップとボトムの差分から表面増強ラマン散乱光強度を定量してもよい。
　表面増強ラマン散乱強度が予め設定した値以上に変化した、又は予め設定した閾値以上若しくは閾値以下であるマイクロチャンバーの個数を計測する。
　前記予め設定した値又は閾値は、例えば、酵素及び前記酵素の選択的基質を含む試料と、酵素及び前記酵素の選択的基質のうち少なくともいずれか一方を含まない試料とを用いて、選択的基質の酵素反応生成物又は選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱光強度を測定し、両試料を区別できる値として実験的に求めることができる。前記予め設定した値又は閾値の決定方法としては特に限定されず、例えば、一般的な統計学的手法を用いて決定することができる。前記予め設定した値又は閾値と、輝点数計測工程において測定した選択的基質の酵素反応生成物又は選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱光強度を比較することで、マイクロチャンバーに酵素が含まれるか否かを判断することができる。
　狭線幅のバンドパスフィルターは、１枚の狭線幅バンドパスフィルターによって構成してもよいし、２枚以上のバンドパスフィルターを組み合わせて透過帯域を狭くしてもよい。
　また、狭線幅のバンドパスフィルターは、透過帯の角度依存性を利用して、透過帯域を調整してもよい。
（第１の実施形態の拡張例－複数種類の酵素の測定方法）
　本技術の酵素の測定方法の第１の実施形態は、複数種類の酵素及び前記複数種類の酵素に対応する複数種類の選択的基質を含む混合液を準備する混合液準備工程と、金属ナノ構造体を固相化した複数のマイクロチャンバーを有する金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを準備するアレイ準備工程と、前記複数のマイクロチャンバーのそれぞれに前記複数種類の酵素のうち少なくともいずれか１種類の分子が１個以下となるように前記混合液を封入する混合液封入工程と、前記金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度が予め設定した値以上に変化した、又は予め設定した閾値以上若しくは閾値以下であるマイクロチャンバーの個数を計測する輝点数計測工程と、を含む酵素の測定方法であってもよい。ここで、前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別でき、かつ、複数種類の前記酵素反応生成物は互いに異なる構造を示し、ラマンピークで複数種類の前記酵素反応生成物又は前記選択的基質を区別できる。
　上述した第１の実施形態の基本例とは、混合液準備工程において、複数種類の酵素及び前記複数種類の酵素に対応する複数種類の選択的基質を含む混合液を準備する点、混合液封入工程において、複数のマイクロチャンバーのそれぞれに前記複数種類の酵素のうち少なくともいずれか１種類の分子が１個以下となるように前記混合液を封入する点、輝点計測工程において、複数種類の前記酵素反応生成物又は前記選択的基質を識別する点が相違するが、その他の点は略同じである。
＜第２の実施形態＞
　本技術の酵素の測定方法の第２の実施形態は、酵素及び前記酵素の選択的基質を含む混合液を準備する混合液準備工程と、金属ナノ構造体を固相化した複数のマイクロチャンバーを有する金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを準備するアレイ準備工程と、前記複数のマイクロチャンバーのそれぞれに前記酵素の分子が１個以下となるように前記混合液を封入する混合液封入工程と、前記金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度を前記複数のマイクロチャンバー毎に経時的に測定する経時測定工程と、を含む。ここで、前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、かつ、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別できる。
　第２の実施形態では、第１の実施形態の輝点数計測工程が、酵素反応生成物又は選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度を前記複数のマイクロチャンバー毎に経時的に測定する経時測定工程に変更されている。その他は、第１の実施形態と略同様である。
　経時測定工程において酵素反応生成物又は選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度を前記複数のマイクロチャンバー毎に経時的に測定することにより、酵素活性を単位時間あたりの散乱強度変化として測定することができる。酵素活性を測定することにより、例えば、多量体酵素が何量体であるか等の情報を得ることもできる。
（第２の実施形態の拡張例）
　本技術の酵素の測定方法の第２の実施形態は、複数種類の酵素及び前記複数種類の酵素に対応する複数種類の選択的基質を含む混合液を準備する混合液準備工程と、金属ナノ構造体を固相化した複数のマイクロチャンバーを有する金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを準備するアレイ準備工程と、前記複数のマイクロチャンバーのそれぞれに前記複数種類の酵素のうち少なくともいずれか１種類の分子が１個以下となるように前記混合液を封入する混合液封入工程と、前記金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度を前記複数のマイクロチャンバー毎に経時的に測定する経時測定工程と、を含む酵素の測定方法であってもよい。ここで、前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別でき、かつ、複数種類の前記酵素反応生成物は互いに異なる構造を示し、ラマンピークで複数種類の前記酵素反応生成物又は前記選択的基質を区別できる。
　上述した第２の実施形態の基本例とは、混合液準備工程において、複数種類の酵素及び前記複数種類の酵素に対応する複数種類の選択的基質を含む混合液を準備する点、混合液封入工程において、複数のマイクロチャンバーのそれぞれに前記複数種類の酵素のうち少なくともいずれか１種類の分子が１個以下となるように前記混合液を封入する点、経時測定工程において複数種類の前記酵素反応生成物又は前記選択的基質を識別する点が相違するが、その他の点は略同じである。
＜第３の実施形態＞
　本技術の酵素の測定方法の第３の実施形態は、酵素、前記酵素の選択的基質及び金属ナノ構造体を含む混合液を準備する混合液準備工程と、前記混合液を前記酵素の分子が１個以下となるように含む複数のドロップレットに分割するドロップレット分割工程と、前記複数のドロップレットを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度が予め設定した値以上に変化した、又は予め設定した閾値以上若しくは閾値以下であるドロップレットの個数を計測する輝点数計測工程と、を含む酵素の測定方法である。ここで、前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、かつ、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別できる。
　本技術の第１の実施形態とは、酵素、前記酵素の選択的基質及び金属ナノ構造体を含む混合液を用いる点、混合液をマイクロチャンバーに封入することに代えて、酵素の分子が１個以下となるように含む複数のドロップレットに分割する点が相違する。分割の方法としては、混合液を油中にジェットで注入してエマルジョン化する方法などが挙げられる。　
　油としては、フォンブリン、ミネラルオイル、ヘキサデカン、３ＭフロリナートＦＣ－４０、３ＭフロリナートＦＣ－７０など、不活性の油が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　各ドロップレットのラマン散乱強度の測定は、ドロップレットを平面上に広げて二次元で測定してもよいし、ドロップレットを１個ずつ１次元で測定してもよい。
（第３の実施形態の拡張例－複数種類の酵素の測定）
　本技術の酵素の測定方法の第３の実施形態は、複数種類の酵素及び前記複数種類の酵素に対応する複数種類の選択的基質を含む混合液を準備する混合液準備工程と、前記混合液を前記複数種類の酵素のうち少なくともいずれか１種類の分子が１個以下となるように含む複数のドロップレットに分割するドロップレット分割工程と、前記複数のドロップレットを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度が予め設定した値以上に変化した、又は予め設定した閾値以上若しくは閾値以下であるドロップレットの個数を計測する輝点数計測工程と、を含む酵素の測定方法であってもよい。ここで、前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別でき、かつ、複数種類の前記酵素反応生成物は互いに異なる構造を示し、ラマンピークで複数種類の前記酵素反応生成物又は前記選択的基質を区別できる。
　第１の実施形態の拡張例と同様に、第３の実施形態を複数種類の酵素及び基質に対応させるものである。
＜第４の実施形態＞
　本技術の酵素の測定方法の第４の実施形態は、酵素、前記酵素の選択的基質及び金属ナノ構造体を含む混合液を準備する混合液準備工程と、前記混合液を前記酵素の分子が１個以下となるように含む複数のドロップレットに分割するドロップレット分割工程と、前記複数のドロップレットを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度を前記複数のドロップレット毎に経時的に測定する経時測定工程と、を含む。ここで、前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、かつ、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別できる。
　第４の実施形態では、第３の実施形態の輝点数計測工程が、酵素反応生成物に由来する表面増強ラマン散乱強度を前記複数のドロップレット毎に経時的に測定する経時測定工程に変更されている。その他は、第３の実施形態と略同様である。
　経時測定工程において酵素反応生成物に由来する表面増強ラマン散乱強度を前記複数のマイクロチャンバー毎に経時的に測定することにより、酵素活性を単位時間あたりの散乱強度変化として測定することができる。酵素活性を測定することにより、例えば、多量体酵素が何量体であるか等の情報を得ることもできる。
（第４の実施形態の拡張例－複数種類の酵素の測定）
　本技術の酵素の測定方法の第４の実施形態は、複数種類の酵素及び前記複数種類の酵素に対応する複数種類の選択的基質を含む混合液を準備する混合液準備工程と、前記混合液を前記複数種類の酵素のうち少なくともいずれか１種類の分子が１個以下となるように含む複数のドロップレットに分割するドロップレット分割工程と、前記複数のドロップレットを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度を前記複数のドロップレット毎に経時的に測定する経時測定工程と、を含む酵素の測定方法であってもよい。ここで、前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別でき、かつ、複数種類の前記酵素反応生成物は互いに異なる構造を示し、ラマンピークで複数種類の前記酵素反応生成物又は前記選択的基質を区別できる。
　第１の実施形態の拡張例と同様に、第４の実施形態を複数種類の酵素及び基質に対応させるものである。
［キット］
　本技術は、また、上述したＳＥＲＳチップ（金属ナノ構造体を固相化した複数のマイクロチャンバーを有する金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイ）と、上述した第１又は第２の実施形態の酵素の測定方法の手順を記載したプロトコールとを含む、キットも提供する。本キットは、ＳＥＲＳチップ及びプロトコールの他に、標準試薬、その他の構成品を含んでもよい。
［ラマン散乱像の撮影方法］
　本技術のラマン散乱像の撮影方法の一実施形態は、狭線幅バンドパスフィルターの透過波長帯を目的分子のラマンピークのトップに合わせ、視野全体に拡大したレーザー光を試料に照射し、レーザー照射中、２次元光検出器でラマン散乱像を撮像する、ラマン散乱像の撮影方法である。
　本実施形態のラマン散乱像の撮影方法では、さらに、前記狭線幅バンドパスフィルターの透過波長帯を前記目的分子のラマンピークのボトムに合わせてもよい。
　本実施形態のラマン散乱像の撮影方法は、複数のマイクロチャンバーを有するマイクロチャンバーアレイの前記複数のマイクロチャンバーに前記目的分子を配置することが好ましい。
　前記マイクロチャンバーアレイは、前記複数のマイクロチャンバーに金属ナノ構造体を固相化していることが好ましい。
　前記マイクロチャンバーアレイとしては、例えば、上述した本技術のマイクロチャンバーアレイを用い、各マイクロチャンバーに前記目的分子を配置することが好ましい。
　本実施形態のラマン散乱像の撮影方法は、前記目的分子を金属ナノ構造体上に配置することが好ましい。
　本実施形態のラマン散乱像の撮影方法は、例えば、上述した本技術の酵素の測定方法と同様にして実施することができる。
　前記狭線幅バンドパスフィルターは、例えば、上述した本技術の酵素の測定方法で用いるものと同様のものを用いることができる。
　前記目的分子としては、例えば、前述した酵素が挙げられるが、限定されるものではない。
［目的分子の測定方法］
　本技術の目的分子の測定方法の一実施形態は、狭線幅バンドパスフィルターの透過波長帯を目的分子のラマンピークのトップに合わせ、視野全体に拡大したレーザー光を試料に照射し、レーザー照射中、２次元光検出器でラマン散乱像を撮像し、得られたラマン散乱像から前記目的分子の濃度分布を抽出する、ラマン散乱を用いた目的分子の測定方法である。
　本実施形態の目的分子の測定方法では、さらに、前記狭線幅バンドパスフィルターの透過波長帯を前記目的分子のラマンピークのボトムに合わせてもよい。
　本実施形態の目的分子の測定方法では、前記目的分子のラマンピークの前記トップの透過波長帯及びボトムの透過波長帯で撮影したラマン散乱像の差分をとることにより、前記目的分子の濃度分布を抽出することが好ましい。
　本実施形態の目的分子の測定方法は、複数のマイクロチャンバーを有するマイクロチャンバーアレイの前記複数のマイクロチャンバーに前記目的分子を配置することが好ましい。
　前記マイクロチャンバーアレイは、前記複数のマイクロチャンバーに金属ナノ構造体を固相化していることが好ましい。
　前記マイクロチャンバーアレイとしては、例えば、上述した本技術のマイクロチャンバーアレイを用い、各マイクロチャンバーに前記目的分子を配置することが好ましい。
　本実施形態の目的分子の測定方法は、前記目的分子を金属ナノ構造体上に配置することが好ましい。
　本実施形態の目的分子の測定方法は、例えば、上述した本技術の酵素の測定方法と同様にして実施することができる。
　前記狭線幅バンドパスフィルターは、例えば、上述した本技術の酵素の測定方法で用いるものと同様のものを用いることができる。
　前記目的分子としては、例えば、前述した酵素が挙げられるが、限定されるものではない。
［本技術の適用］
　本技術は、リキッドバイオプシーに好適に適用できる。具体的には、例えば、血液等の液体成分中の酵素を測定することにより、ヒトのがんに関する詳細な情報を、より迅速かつより低侵襲で得ることができる。がん関連酵素としては、例えば、チミジンキナーゼ、ガラクトース転移酵素などが挙げられる。
［従来技術と比して有利な点］
　本技術は、ＳＥＲＳ分光法にデジタル検出の概念を導入し、酵素分子の個数を縦軸とした超高感度酵素濃度測定技術である。従来、ＳＥＲＳ分光法は、散乱光強度を縦軸として、標的分子の濃度定量が行われてきた。しかし、極めて緻密な金属ナノ構造体の制御が求められ、特に低濃度域において、定量性及び再現性を担保することが困難であった。本技術では、輝点数から分子の数を直接勘定するデジタル検出の概念を利用し、酵素濃度を、ｆＭ（フェムトモーラー＝１０－１５モーラー）オーダーの低濃度域においても高い再現性及び定量性で計測することができる。
　本技術は、分光計測技術と生体１分子計測技術とを融合した点に独自性がある。従来、酵素１分子の活性計測には蛍光基質が用いられてきた。本技術は、基質の酵素反応産物自身のラマン散乱光を捉えることで、酵素１分子の基質分解反応を、無標識、かつ狭線幅のスペクトルを生かして複数同時に定量できる。また、無標識であることから、本技術は、蛍光標識基質による活性阻害という壁を取り払い、計測可能な酵素種を広げるうえに、酵素種の識別もできるというこれまでにない有利な点も有する。
　以下、実施例によって本発明をより具体的に説明する。しかし、本発明は後述する実施例に限定されるものではない。
［ＳＥＲＳチップの作製］
＜マイクロチャンバーアレイの作製（工程Ｓ１～Ｓ２４）＞
・工程Ｓ１：　２４ｍｍ×３２ｍｍのカバーガラスをガラス立てにたて、８Ｎ水酸化カリウム水溶液に浸した。
・工程Ｓ２：　超音波処理（９０分）を行った。
・工程Ｓ３：　静置した（１日）。
・工程Ｓ４：　純水ですすいだ。
・工程Ｓ５：　エアブローでガラス上の水滴を除去した。
・工程Ｓ６：　フッ素系樹脂（９％のＣｙｔｏｐ（フッ素系樹脂、ＡＧＣ社製））をガラス上に滴下した。
・工程Ｓ７：　回転数１０００ｒｐｍで３０秒間スピンコートした。
・工程Ｓ８：　８０℃で１０分間、１８０℃で１時間ベークした。
・工程Ｓ９：　ポジ型のフォトレジスト（ＡＺ　Ｐ４６２０（ＡＺエレクトロニックマテリアルズ社製））をＣｙｔｏｐ塗布済のガラス上に滴下した。
・工程Ｓ１０：　回転数７５００ｒｐｍで３０秒間スピンコートした。
・工程Ｓ１１：　１００℃で５分間ベークした。
・工程Ｓ１２：　静置した（５分以上、湿度６０％以上）。
・工程Ｓ１３：　クロムマスク（直径１．８μｍのホールを８μｍピッチでアレイ状に配列）をレジスト塗布済のガラスと密着させた。
・工程Ｓ１４：　２０秒間紫外線露光した。
・工程Ｓ１５：　露光後のカバーガラスをガラス立てにたて、現像液（ＡＺ３００　ＭＩＦ（ＡＺエレクトロニックマテリアルズ社製））に９０秒間浸した。
・工程Ｓ１６：　純水ですすいだ。
・工程Ｓ１７：　酸素ガスを用いた反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）装置によるドライエッチングを行った（ガラス上で、レジスト保護のない露出したＣｙｔｏｐを除去した）。
・工程Ｓ１８：　カバーガラスをガラス立てにたて、アセトンに浸した（レジスト除去のため）。
・工程Ｓ１９：　超音波処理（９０秒）を行った。
・工程Ｓ２０：　イソプロパノールに浸した。
・工程Ｓ２１：　静置した（９０秒）。
・工程Ｓ２２：　純水ですすいだ。
・工程Ｓ２３：　エアブローでガラス上の水滴を除去した。
・工程Ｓ２４：　レーザー顕微鏡でＣｙｔｏｐの穴の直径と深さを確認した。
（備考１）工程Ｓ７の回転数は１０００～７５００ｒｐｍの間で調整した
（備考２）工程Ｓ１０の回転数は１０００～７５００ｒｐｍの間で調整した。
（備考３）工程Ｓ１３のフォトマスクの直径及びピッチは上述したものに限定されない。
（備考４）工程Ｓ２４のチャンバーは、直径０．１～１００μｍ、深さ０．０１～１００μｍの範囲を想定している。この場合の容積は大まかに１ａＬ～１ｎＬとなる。上記例では直径３．２μｍ、深さ１．６μｍ、ピッチ８μｍのマイクロチャンバーアレイであった。マイクロチャンバー容積は約１３ｆＬであった。
　以下、上述の手順で作製したマイクロチャンバーアレイを「デバイス」という場合がある。
＜金属ナノ粒子の固相化（工程１～２１）＞
（ガラスの親水化処理）
・工程１：　デバイスをガラス立てにたて、４Ｎ水酸化カリウム水溶液に浸した。
・工程２：　超音波処理（２０分）を行った。
・工程３：　静置した（２０分）。
・工程４：　ミリＱ水ですすいだ。
（ガラスのＡＰＴＥＳ処理）
・工程５：　エアブローで上の水滴を除去した。
・工程６：　水滴除去したデバイスをガラス立てにたて、アセトンに浸した。
・工程７：　アセトンから取り出し、０．２％の３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を溶解したアセトンに浸した。
・工程８：　静置した（１時間）。
・工程９：　ＡＰＴＥＳ溶液からデバイスを取り出し、アセトンに浸してリンスした（２回）。
・工程１０：　アセトンから取り出して静置した（１０分）。
（ＡＰＴＥＳ処理ガラスの洗浄）
・工程１１：　エタノールに浸した。
・工程１２：　超音波処理（１０分）を行った。
・工程１３：　ミリＱ水ですすいだ。
・工程１４：　ミリＱ水に浸した。
・工程１５：　超音波処理（５分）を行った。
（銀ナノ粒子の凝集体形成とデバイスへの固相化）
・工程１６：　エアブローでデバイス上の水滴を除去した。
・工程１７：　４０ｎｍの銀ナノ粒子分散液２０μＬと０．０３％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）２０μＬを混合し、デバイス上に滴下した（ＴＦＡは銀微粒子の凝集体の形成を促進するために加えた）。
・工程１８：　液滴を乗せたまま、氷上で冷却したアルミブロックに乗せた。
・工程１９：　静置した（１分）。
・工程２０：　液滴を乗せたまま、高湿・遮光ボックスに収納し、冷蔵庫（４℃）内で保存した。
・工程２１：　静置した（１日以上）。ＳＥＲＳチップの作製が完了した。
（備考６）工程１７の銀ナノ粒子分散液は、直径１～１５００ｎｍを想定している。他の金属種として、金、銅、プラチナ、パラジウム、アルミ、チタン等も用いることができる。また、これらの合金や、コアシェル構造等も用いることができる。金属ナノ粒子の形状は、球、ロッド、楕円、三角、キューブ、双角錐、星など、様々な形状のものを用いることができる。
　図５は、マイクロチャンバーアレイに銀ナノ粒子の凝集体を固相化したＳＥＲＳチップの散乱像である。
［酵素１分子のＳＥＲＳチップへの封入（工程２２～２６）］
＜酵素のＳＥＲＳチップへの封入＞
・工程２２：　ＳＥＲＳチップ上の液滴を除去した。
・工程２３：　液滴のあった位置に、酵素－基質－界面活性剤の混合液４０μＬを滴下した。
・工程２４：　油４０μＬを滴下した。
・工程２５：　ろ紙で混合溶液を吸収した。
・工程２６：　静置した（２０分以上）。
（備考７）工程２３の界面活性剤は、本例では１００μＭのＴｒｉｔｏｎ－Ｘであった。その他の界面活性剤も特に限定されず使用できる。
（備考８）工程２４の油は、本例ではフォンブリンであった。その他の油も特に限定されず使用できる。例えば、油として、フォンブリンの他に、ミネラルオイル、ヘキサデカン、３ＭフロリナートＦＣ－４０（スリーエム社製）、３ＭフロリナートＦＣ－７０（スリーエム社製）などを使用することもできる。
（備考９）工程２５は、ろ紙による吸収以外に、ピペットによる溶液の吸引する方法や、流路を使って油で押し流す方法なども特に限定されず用いることができる。
［ラマン顕微鏡による観察（工程２７～４１）］
＜酵素を封入したＳＥＲＳチップのラマン計測－広視野ラマン顕微鏡の場合＞
・工程２７：　顕微鏡の試料台にＳＥＲＳチップを設置した。
・工程２８：　対物レンズの焦点をマイクロチャンバー底面に合わせた。
・工程２９：　狭線幅バンドパスフィルターの角度を調整し、透過波長帯を反応生成物のラマンピークのトップに合わせた。
・工程３０：　視野全体に拡大したレーザー光を試料に照射した。
・工程３１：　レーザー照射中、２次元光検出器（ＣＭＯＳカメラ、ＣＣＤカメラ等）でＳＥＲＳチップの散乱像を撮像した。
・工程３２：　レーザー光の照射と２次元光検出器の露光を止めた。
・工程３３：　狭線幅バンドパスフィルターの角度を調整し、透過波長帯を反応生成物のラマンピークのボトム（裾）に合わせた。
・工程３４：　視野全体に拡大したレーザー光を試料に照射した（工程３０と同じ照射時間とした）。
・工程３５：　レーザー照射中、２次元光検出器（ＣＭＯＳカメラ、ＣＣＤカメラ等）でＳＥＲＳチップの散乱像を撮像した（工程３１と同じ露光時間）。
・工程３６：　レーザー光の照射と２次元光検出器の露光を止めた。
・工程３７：　顕微鏡の試料台を移動させた。
・工程３８：　工程２９～工程３７を繰り返した（工程３７では、試料台をタイル状に移動させた）。
（備考１０）工程３１、工程３４の撮像面積は、１００μｍ２～１０ｍｍ２であることが好ましい。本例では６０μｍ×１３５μｍ＝８１００μｍ２であった。
（備考１１）工程３１、工程３４の検出器の露光時間は、１ミリ秒～１００秒が好ましい。本例では２秒であった。
（備考１２）工程３７は、本例では縦６０μｍピッチで３０回、横１３５μｍピッチで９回走査し、合計２７０箇所撮像した。
（備考１３）２種類の酵素を計測する場合は、工程２９～工程３２を追加でもう一度行った（ピークトップ１、ピークトップ２、ビークボトム１、ビークボトム２）。ただし、２種の反応生成物のピークが近く、ボトムが共通する場合は、再度ボトムを撮像しなくてもよい。
　図６は、広視野ラマン顕微鏡の光学系模式図である。
＜ＳＥＲＳ計測結果の解析－広視野顕微鏡の場合＞
・工程３９：　工程３０（ピークトップ）と工程３２（ビークボトム）で撮像した画像の差分を、試料台の位置毎にとった。
・工程４０：　工程３９で取得した差分の画像を、試料台の移動順にあわせてタイル状に並べた。
・工程４１：　設定した閾値よりも明るいマイクロチャンバー（輝点）の数を数えた。
＜酵素を封入したＳＥＲＳチップのラマン計測－スリット走査ラマン顕微鏡の場合＞
・工程２７－ｓ：　顕微鏡の試料台にＳＥＲＳチップを設置した。
・工程２８－ｓ：　対物レンズの焦点をマイクロチャンバー底面に合わせた。
・工程２９－ｓ：　ライン状（ｙ方向）に成形したレーザー光を試料に照射した（数ミリ秒～数十秒）。
・工程３０－ｓ：　レーザー照射中、分光器に接続した２次元光検出器（ＣＭＯＳカメラ、ＣＣＤカメラ等）でＳＥＲＳチップの散乱分光像（ｙ－λ）を撮像した（露光時間　数ミリ秒～数十秒）。λは散乱スペクトルの波長方向を示す。
・工程３１－ｓ：　レーザー光の照射と２次元光検出器の露光を止めた。
・工程３２－ｓ：　顕微鏡の試料台を、レーザーのラインと直行する向き（ｘ方向）に移動させた。
・工程３３－ｓ：　工程２９－ｓ～３２－ｓを繰り返した。
＜ＳＥＲＳ計測結果の解析－スリット走査ラマン顕微鏡の場合＞
・工程３４－ｓ：　ｘ方向に走査しながら取得した散乱分光像（ｙ－λ）を、ｘ－ｙ－λのデータに再構成した。
・工程３５－ｓ：　λ方向を反応生成物のラマンピークのトップ（λ１）とボトム（λ３）にそれぞれ合わせたｘ－ｙ－λ１、ｘ－ｙ－λ３を抽出した。
・工程３６－ｓ：　ｘ－ｙ－λ１とｘ－ｙ－λ３の差分をとった。
・工程３７－ｓ：　設定した閾値よりも明るいマイクロチャンバー（輝点）の数を数えた。
（備考１４）工程３２－ｓの走査ピッチ（ｘ方向）は、本例では０．５μｍである。ライン状のレーザーの長さ（ｙ方向）は、本例では１４０μｍであった。
（備考１５）２種類の酵素を計測する場合は、工程３５－ｓでラマンピークのトップ（λ１）、トップ（λ２）、ボトム（λ３）のｘ－ｙ－λ１、ｘ－ｙ－λ２、ｘ－ｙ－λ３を抽出した。さらに、工程３６－ｓでｘ－ｙ－λ１とｘ－ｙ－λ３の差分、ｘ－ｙ－λ２とｘ－ｙ－λ３の差分をそれぞれとった。
＜＜実験結果＞＞
　実験結果を図７～図１１に示す。
　図７に示すように、チャンバーＡでは酵素反応生成物であるチオコリンに由来するＳＥＲＳスペクトルが検出されたが、チャンバーＢでは検出されなかった。
　図８に示すように、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の濃度依存的に輝点数が増加することが示された。
　図９に示すように、広視野ラマン顕微鏡を用いた場合においても、スリット走査ラマン顕微鏡を用いた場合と同様に、酵素反応生成物であるチオコリンに由来するＳＥＲＳ光（輝点）が観察された。
　図１０に示すように、広視野ラマン顕微鏡を用いた場合においても、スリット走査ラマン顕微鏡を用いた場合と同様に、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の濃度依存的に輝点数が増加することが示された。
　図１１に示すように、アセチルコリンエステラーゼによる酵素反応生成物である１，１－ジメチル－４－メルカプトメチルピペリジニウム、及び、ブチリルコリンエステラーゼによる酵素反応生成物であるチオコリンに由来するＳＥＲＳスペクトルがそれぞれ異なるマイクロチャンバー内において観察された。
　以上のことから、本技術によれば、試料中の酵素を無標識かつ優れた感度で検出できることが示された。また、反応性の異なる基質を用いて、複数種類の酵素活性を同時に識別及び定量できることも示された。
　生体内には数千種の酵素が存在し、代謝や吸収などの生体機能を発現している。酵素活性の異常は、臓器の機能不全や炎症、神経変性などの疾患を鋭敏に反映するため、早期疾患診断の指標として有望である。本発明では、ＳＥＲＳ分光法と微細加工技術を融合し、検体中の微量な酵素濃度を高感度かつ無標識で定量することができる、高感度1分子計測法を提供できる。特に、金属ナノ構造体を具備したマイクロチャンバーアレイ（ＳＥＲＳチップ）を用いると、酵素１分子を封入したチャンバー毎に、反応生成物をＳＥＲＳ光（輝点）から直接捉え、輝点のデジタルカウントにより検体中の酵素濃度を高感度に定量できるため、より定量的に酵素の働き（基質の分解）を１分子毎に捉えることができる。さらに、反応性の異なる基質を用い、複数種の酵素活性を同時に識別・定量することもできる。本発明により、感度及び識別能の不足により精査不能であった検体中の酵素の濃度定量が可能となり、広く医学・生物学研究に貢献することができる。
　１００…高速ラマン分光イメージング装置、１０１…レーザー光源、１０２，１０６，１１０…光路切替用フリップミラー、１０３，１０８…ミラー、１０４…シリンドリカルレンズ、１０５，１０７，１１１，１１７…レンズ、１０９…ダイクロイックフィルター、１１４…スリット、１１５…分光器、１１６…ＣＣＤ、１１８…狭線幅バンドパスフィルター、１１９…ｓＣＭＯＳ、１１２…対物レンズ、１１３…試料、５１０…基板、５３０…ウェル、７００…膜、７１０…レジスト膜

Claims (30)

  1. 　酵素及び前記酵素の選択的基質を含む混合液を準備する混合液準備工程と、
    　金属ナノ構造体を固相化した複数のマイクロチャンバーを有する金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを準備するアレイ準備工程と、
    　前記複数のマイクロチャンバーのそれぞれに前記酵素の分子が１個以下となるように前記混合液を封入する混合液封入工程と、
    　前記金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを励起光で照明して、前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度が予め設定した値以上に変化した、又は予め設定した閾値以上若しくは閾値以下であるマイクロチャンバーの個数を計測する輝点数計測工程と、を含み、
    　前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、かつ、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別できる、
    酵素の測定方法。
  2. 　酵素及び前記酵素の選択的基質を含む混合液を準備する混合液準備工程と、
    　金属ナノ構造体を固相化した複数のマイクロチャンバーを有する金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを準備するアレイ準備工程と、
    　前記複数のマイクロチャンバーのそれぞれに前記酵素の分子が１個以下となるように前記混合液を封入する混合液封入工程と、
    　前記金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度を前記複数のマイクロチャンバー毎に経時的に測定する経時測定工程と、を含み、
    　前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、かつ、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別できる、
    酵素の測定方法。
  3. 　複数種類の酵素及び前記複数種類の酵素に対応する複数種類の選択的基質を含む混合液を準備する混合液準備工程と、
    　金属ナノ構造体を固相化した複数のマイクロチャンバーを有する金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを準備するアレイ準備工程と、
    　前記複数のマイクロチャンバーのそれぞれに前記複数種類の酵素のうち少なくともいずれか１種類の分子が１個以下となるように前記混合液を封入する混合液封入工程と、
    　前記金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度が予め設定した値以上に変化した、又は予め設定した閾値以上若しくは閾値以下であるマイクロチャンバーの個数を計測する輝点数計測工程と、を含み、
    　前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別でき、かつ、複数種類の前記酵素反応生成物は互いに異なる構造を示し、ラマンピークで複数種類の前記酵素反応生成物又は前記選択的基質を区別できる、
    酵素の測定方法。
  4. 　複数種類の酵素及び前記複数種類の酵素に対応する複数種類の選択的基質を含む混合液を準備する混合液準備工程と、
    　金属ナノ構造体を固相化した複数のマイクロチャンバーを有する金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを準備するアレイ準備工程と、
    　前記複数のマイクロチャンバーのそれぞれに前記複数種類の酵素のうち少なくともいずれか１種類の分子が１個以下となるように前記混合液を封入する混合液封入工程と、
    　前記金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度を前記複数のマイクロチャンバー毎に経時的に測定する経時測定工程と、を含み、
    　前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別でき、かつ、複数種類の前記酵素反応生成物は互いに異なる構造を示し、ラマンピークで複数種類の前記酵素反応生成物又は前記選択的基質を区別できる、
    酵素の測定方法。
  5. 　酵素、前記酵素の選択的基質及び金属ナノ構造体を含む混合液を準備する混合液準備工程と、
    　前記混合液を前記酵素の分子が１個以下となるように含む複数のドロップレットに分割するドロップレット分割工程と、
    　前記複数のドロップレットを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度が予め設定した値以上に変化した、又は予め設定した閾値以上若しくは閾値以下であるドロップレットの個数を計測する輝点数計測工程と、を含み、
    　前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、かつ、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別できる、
    酵素の測定方法。
  6. 　酵素、前記酵素の選択的基質及び金属ナノ構造体を含む混合液を準備する混合液準備工程と、
    　前記混合液を前記酵素の分子が１個以下となるように含む複数のドロップレットに分割するドロップレット分割工程と、
    　前記複数のドロップレットを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度を前記複数のドロップレット毎に経時的に測定する経時測定工程と、を含み、
    　前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、かつ、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別できる、
    酵素の測定方法。
  7. 　複数種類の酵素、前記複数種類の酵素に対応する複数種類の選択的基質及び金属ナノ構造体を含む混合液を準備する混合液準備工程と、
    　前記混合液を前記複数種類の酵素のうち少なくともいずれか１種類の分子が１個以下となるように含む複数のドロップレットに分割するドロップレット分割工程と、
    　前記複数のドロップレットを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度が予め設定した値以上に変化した、又は予め設定した閾値以上若しくは閾値以下であるドロップレットの個数を計測する輝点数計測工程と、を含み、
    　前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別でき、かつ、複数種類の前記酵素反応生成物は互いに異なる構造を示し、ラマンピークで複数種類の前記酵素反応生成物又は前記選択的基質を区別できる、
    酵素の測定方法。
  8. 　複数種類の酵素、前記複数種類の酵素に対応する複数種類の選択的基質及び金属ナノ構造体を含む混合液を準備する混合液準備工程と、
    　前記混合液を前記複数種類の酵素のうち少なくともいずれか１種類の分子が１個以下となるように含む複数のドロップレットに分割するドロップレット分割工程と、
    　前記複数のドロップレットを励起光で照明して前記選択的基質の酵素反応生成物又は前記選択的基質に由来する表面増強ラマン散乱強度を前記複数のドロップレット毎に経時的に測定する経時測定工程と、を含み、
    　前記酵素反応生成物が前記選択的基質とは異なる構造を示し、ラマンピークで前記酵素反応生成物と前記選択的基質とを区別でき、かつ、複数種類の前記酵素反応生成物は互いに異なる構造を示し、ラマンピークで複数種類の前記酵素反応生成物又は前記選択的基質を区別できる、
    酵素の測定方法。
  9. 　前記輝点数計測工程又は前記経時測定工程において、前記混合液を各マイクロチャンバーに封入した前記金属ナノ構造体固相化マイクロチャンバーアレイを、広視野照明で照明し、前記ラマンピークの位置に適合する狭線幅のバンドパスフィルターを用いて、前記酵素反応生成物又は前記選択的基質のラマンピークの波長帯でラマン散乱像を取得し、各マイクロチャンバーの表面増強ラマン散乱光強度と強度の経時変化を定量する、請求項１～４のいずれか１項に記載の酵素の測定方法。
  10. 　前記酵素反応生成物又は前記選択的基質のラマンピークのトップの波長帯及び前記ラマンピークのボトムの波長帯でラマン散乱像を取得し、両者の差分をとることにより、各マイクロチャンバーの表面増強ラマン散乱光強度と強度の経時変化を定量する、請求項９に記載の酵素の測定方法。
  11. 　前記輝点数計測工程又は前記経時測定工程において、前記混合液を分割した複数のドロップレットを、広視野照明で照明し、前記ラマンピークの位置に適合する狭線幅のバンドパスフィルターを用いて、前記酵素反応生成物又は前記選択的基質のラマンピークの波長帯でラマン散乱像を取得し、各ドロップレットの表面増強ラマン散乱光強度を定量する、請求項５～８のいずれか１項に記載の酵素の測定方法。
  12. 　前記酵素反応生成物又は前記選択的基質のラマンピークのトップの波長帯及び前記ラマンピークのボトムの波長帯でラマン散乱像を取得し、両者の差分をとることにより、各ドロップレットの表面増強ラマン散乱光強度を定量する、請求項１１に記載の酵素の測定方法。
  13. 　前記酵素反応生成物がチオール基を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の酵素の測定方法。
  14. 　前記金属ナノ構造体が金属ナノ粒子の凝集体である、請求項１～８のいずれか１項に記載の酵素の測定方法。
  15. 　前記酵素が、アセチルコリンエステラーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ、ホスホリパーゼ、エラスターゼ及びアミラーゼからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１～８のいずれか１項に記載の酵素の測定方法。
  16. 　アセチルコリンエステラーゼの選択的基質がＭＡＴＰ＋であり、ブチリルコリンエステラーゼの選択的基質がブチリルチオコリンである、請求項１５に記載の酵素の測定方法。
  17. 　金属ナノ構造体を固相化した複数のマイクロチャンバーを有するマイクロチャンバーアレイ。
  18. 　前記金属ナノ構造体が金属ナノ粒子の凝集体である、請求項１７に記載のマイクロチャンバーアレイ。
  19. 　請求項１７又は１８に記載のマイクロチャンバーアレイと、請求項１～４のいずれか１項に記載の酵素の測定方法の手順を記載したプロトコールとを含む、キット。
  20. 　狭線幅バンドパスフィルターの透過波長帯を目的分子のラマンピークのトップに合わせ、視野全体に拡大したレーザー光を試料に照射し、レーザー照射中、２次元光検出器でラマン散乱像を撮像する、ラマン散乱像の撮影方法。
  21. 　さらに、前記狭線幅バンドパスフィルターの透過波長帯を前記目的分子のラマンピークのボトムに合わせる、請求項２０に記載のラマン散乱像の撮影方法。
  22. 　複数のマイクロチャンバーを有するマイクロチャンバーアレイの前記複数のマイクロチャンバーに前記目的分子を配置する、請求項２０又は２１に記載のラマン散乱像の撮影方法。
  23. 　前記複数のマイクロチャンバーに金属ナノ構造体を固相化している、請求項２２に記載のラマン散乱像の撮影方法。
  24. 　前記目的分子を金属ナノ構造体上に配置する、請求項２０又は２１に記載のラマン散乱像の撮影方法。
  25. 　狭線幅バンドパスフィルターの透過波長帯を目的分子のラマンピークのトップに合わせ、視野全体に拡大したレーザー光を試料に照射し、レーザー照射中、２次元光検出器でラマン散乱像を撮像し、
    　得られたラマン散乱像から前記目的分子の濃度分布を抽出する、
    ラマン散乱を用いた目的分子の測定方法。
  26. 　さらに、前記狭線幅バンドパスフィルターの透過波長帯を前記目的分子のラマンピークのボトムに合わせる、請求項２５に記載の目的分子の測定方法。
  27. 　前記目的分子のラマンピークの前記トップの透過波長帯及びボトムの透過波長帯で撮影したラマン散乱像の差分をとることにより、前記目的分子の濃度分布を抽出する、請求項２５又は２６に記載の目的分子の測定方法。
  28. 　複数のマイクロチャンバーを有するマイクロチャンバーアレイの前記複数のマイクロチャンバーに前記目的分子を配置する、請求項２７に記載の目的分子の測定方法。
  29. 　前記複数のマイクロチャンバーに金属ナノ構造体を固相化している、請求項２８に記載の目的分子の測定方法。
  30. 　前記目的分子を金属ナノ構造体上に配置する、請求項２７に記載の目的分子の測定方法。
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LI ET AL.: "A practical wide-field Raman imaging method with high spectral and spatial resolution", REVIEW OF SCIENTIFIC INSTRUMENTS, vol. 89, 2018, pages 083103 - 1-083103-5, XP012230541, DOI: 10.1063/1.5041529 *

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