WO2023106271A1 - ハイドロゲル、インクジェット用インク、細胞培養体の作製方法、細胞含有ゲル粒子及びその製造方法 - Google Patents
ハイドロゲル、インクジェット用インク、細胞培養体の作製方法、細胞含有ゲル粒子及びその製造方法 Download PDFInfo
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Classifications
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
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- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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-
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
Definitions
- the present invention belongs to the technical fields of hydrogels, inkjet inks, methods for producing cell cultures using the inkjet inks, cell-containing gel particles and methods for producing the same, methods for culturing cells, and cell evaluation plates.
- hydrogel composition that allows cells to be patterned in three dimensions and that can be cultured for a long period of time.
- a 3D model made of conventional collagen material has cell adhesiveness, the gelation time is slow and rapid gel formation is not possible in the place where culture is performed. difficult to obtain.
- alginate gel is an example of a material that quickly gels and has excellent molding properties. is limited.
- a guest material may be added for the purpose of supplementing cell adhesiveness.
- Patent Document 1 describes a hydrogel composition comprising a hydrogel obtained by cross-linking a four-branched polymer having a polyethylene glycol backbone and a guest substance, wherein the guest substance is collagen peptide or the like.
- a hydrogel composition is disclosed which is characterized by having a cell adhesion factor.
- it while adding such a guest material, it often requires a high level of technology to ensure the amount and dispersibility of the material, and there may be a trade-off with the formability, so there is still room for improvement. rice field.
- in vitro cell culture technology involves seeding at the optimum seeding density and culturing under conditions (adhesion/suspension conditions) that match the cells.
- the culture When performing an assay by culturing cells that are difficult to obtain, such as patient-derived cells, the culture must be performed with a small number of cells.
- methods for culturing with a small number of cells include single cell culture, spheroid culture, and liquid-phase droplet culture technology. Cell encapsulation techniques for culturing cells within are already known.
- the particle size becomes large, making it difficult to observe, and in long-term culture, the size of the particle size affects the permeability of the culture solution to nutrients, oxygen, etc., resulting in a low survival rate.
- Patent Document 2 the volume of the collagen gel particles is as large as 3 ⁇ l, and the problem of reducing the size of the particles has not been solved.
- the number of cells encased in the hydrogel is small, it becomes even more difficult to maintain cell viability. That is, when using a hydrogel material that improves encapsulation sculptability in a state where the number of cells per particle is small, the cell viability cannot be maintained, while using a hydrogel material that can improve the cell viability There was a problem that the moldability was poor, the particle size became large, observation became difficult, and, as a result, long-term culture could not be carried out.
- JP 2020-150846 A Japanese Patent No. 6817619 WO 95/18216
- the object of the present invention is to provide a hydrogel that achieves both gel formability and cell adhesiveness and allows long-term cell culture.
- the present invention is not limited to cell types, and aims to make it possible to culture hydrogels containing cells while maintaining the plasticity and cell viability.
- the present invention provides a polybranched polymer having a polyethylene glycol as a skeleton and containing one or more electrophilic functional groups or nucleophilic functional groups in side chains and/or terminals, and two or more in side chains and/or terminals.
- a hydrogel crosslinked with a linear polymer containing a nucleophilic functional group or an electrophilic functional group wherein the linear polymer is a protein, peptide or polysaccharide, and the electrophilic the functional group is one or more selected from the group consisting of a maleimidyl group, an N-hydroxy-succinimidyl (NHS) group, a sulfosuccinimidyl group, a phthalimidyl group, an imidazoyl group, an acryloyl group and a nitrophenyl group;
- the nuclear functional group is characterized by being one or more selected from the group consisting of a thiol group, an amino group and --CO 2 PhNO 2 .
- the present inventors have developed a hydrogel that wraps cells by cross-linking a multi-branched polymer having a specific structure with polyethylene glycol as a skeleton and a linear polymer such as a protein having a specific functional group at the side chain or end.
- the inventors have found that the above problems can be solved by forming
- the present invention provides a polybranched polymer having a polyethylene glycol skeleton and containing one or more electrophilic functional groups or nucleophilic functional groups in side chains and/or terminals, and two or more in side chains and/or terminals.
- a cell-containing gel particle in which cells are encased in a hydrogel obtained by cross-linking a linear polymer containing a nucleophilic functional group or an electrophilic functional group, wherein the linear polymer comprises a protein, a peptide or polysaccharide, wherein the electrophilic functional group consists of a maleimidyl group, an N-hydroxy-succinimidyl (NHS) group, a sulfosuccinimidyl group, a phthalimidyl group, an imidazoyl group, an acryloyl group and a nitrophenyl group; wherein the nucleophilic functional group is one or more selected from the group consisting of a thiol group, an amino group and —CO 2 PhNO 2 .
- the linear polymer comprises a protein, a peptide or polysaccharide
- the electrophilic functional group consists of a maleimidyl group, an N-hydroxy-succinimidy
- hydrogel that achieves both gel formability and cell adhesiveness and allows long-term cell culture.
- FIG. 1 is a schematic diagram showing one embodiment of cell-containing gel particles according to the present invention.
- FIG. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic diagram showing an embodiment of a method for culturing cells according to the present invention.
- FIG. 3 is a schematic diagram showing another embodiment of the method for culturing cells according to the present invention.
- 1 is a schematic diagram showing an embodiment of a cell evaluation plate according to the present invention;
- FIG. 1 is a microscopic observation image of a cell culture body according to Example 1.
- FIG. 4 is an observation image of a cell culture body according to Example 2 with a confocal microscope.
- FIG. 10 is an observation image of a cell culture body according to Example 3 with a fluorescence microscope.
- FIG. 10 (a) is a plan view and (b) is a side view of a layered body containing a cell culture produced in Example 5.
- FIG. (a) is a side view of a laminate containing a cell culture produced in Example 6.
- FIG. (b) is an enlarged view of part A of (a).
- 11 is a microscopic observation image of a cell culture body according to Example 6.
- FIG. 4 is a microscopic observation image of a cell culture body according to Comparative Example 1.
- FIG. 4 is an observation image of a cell culture body according to Comparative Example 2 with a confocal microscope.
- FIG. 10 is an image showing the results of observation of cell-containing gel particles in Example 7 with a phase-contrast microscope.
- FIG. 10 is an image showing the results of observation by a phase-contrast microscope of cell-containing gel particles in Example 8.
- FIG. 10 is an image showing the observation results of cell-containing gel particles in Example 10 with a fluorescence microscope.
- FIG. FIG. 11 is an image showing the results of observation by a phase-contrast microscope of cell-containing gel particles in Example 11.
- FIG. 10 is an image showing the results of observation by a phase-contrast microscope of cell-containing gel particles in Example 12.
- FIG. 11 is an image showing the results of observation by a phase-contrast microscope of cell-containing gel particles in Example 13.
- FIG. 10 is a graph showing the measurement results of IL-8 amount versus LPS concentration in Example 14.
- the hydrogel according to this embodiment includes a polybranched polymer containing polyethylene glycol as a skeleton and one or more electrophilic functional groups or nucleophilic functional groups in side chains and/or ends, and It is characterized by being crosslinked with a linear polymer containing two or more nucleophilic functional groups or electrophilic functional groups.
- Hydrogel refers to a gel that has a three-dimensional network structure and retains a large amount of water inside the space of the network structure, for example, a polysaccharide gel such as agar, a protein gel such as jelly, and A good example is a super absorbent polymer gel such as acrylic acid polymer. In general, hydrogels allow various substances to be incorporated into the gel through the included water.
- the hydrogel 1 of the present embodiment includes an electrophilic functional group 21 such as a maleimidyl group of the four-branched polymer 2 and a nucleophilic functional group 31 such as a thiol group of the linear polymer 3. It is formed by cross-linking and has a structure in which a four-branched polymer and a linear polymer are dispersed. It is not limited to the example of FIG. 1, and the four-branched polymer may have a nucleophilic functional group and one linear polymer may have an electrophilic functional group.
- Each component constituting the hydrogel 1 will be described below.
- a hyperbranched polymer in this embodiment is a polymer having at least three polyethylene glycol branches that are crosslinked to each other to form a meshwork network.
- the hyperbranched polymer is a polymer having four polyethylene glycol branches; such a polyethylene glycol backbone tetra-antennary polymer is known as Tetra-PEG.
- Tetra-PEG has one or more electrophilic or nucleophilic functional groups on its side chains and/or ends. Cross-linking with the linear polymer through these functional groups constructs a mesh structure network. Since this polymer has PEG as its main component, it is also excellent in biocompatibility.
- the electrophilic functional groups in the hyperbranched polymer are selected from the group consisting of maleimidyl groups, N-hydroxy-succinimidyl (NHS) groups, sulfosuccinimidyl groups, phthalimidyl groups, imidazoyl groups, acryloyl groups and nitrophenyl groups. There are more than one type of A maleimidyl group is preferred.
- the composition of the electrophilic functional groups in the multibranched polymer may be the same or different, but the same is preferred. When the composition of the functional groups is the same, the reactivity with the nucleophilic functional groups of the linear polymer forming the cross-linked bonds becomes uniform, and a gel having a uniform three-dimensional structure can be easily obtained.
- polybranched polymers having one or more maleimidyl groups at the side chains and/or terminals and having a polyethylene glycol skeleton include compounds represented by the following formula (I) having maleimidyl groups at the terminals.
- n 21 to n 24 may be the same or different. The closer the values of n 21 to n 24 are, the more preferably the gel can have a uniform three-dimensional structure and the higher the strength. If the values of n 21 to n 24 are too high, the strength of the gel will be weak, and if the values of n 21 to n 24 are too low, gel formation will be difficult due to steric hindrance of the compound. Therefore, n 21 to n 24 are suitably values of 5 or more and 300 or less, preferably 20 or more and 250 or less, more preferably 30 or more and 180 or less, further preferably 45 or more and 115 or less, and 45 More than 55 or less is particularly preferable.
- the weight average molecular weight of the multibranched polymer having an electrophilic functional group is preferably 5 ⁇ 10 3 or more and 5 ⁇ 10 4 or less, more preferably 7.5 ⁇ 10 3 or more and 3 ⁇ 10 4 or less. It is preferably 1 ⁇ 10 4 or more and 2 ⁇ 10 4 or less, more preferably.
- R 21 to R 24 are linker moieties that connect the functional group and the core portion.
- R 21 to R 24 may be the same or different, but are preferably the same in order to produce a high-strength gel having a uniform three-dimensional structure.
- R 21 to R 24 are the same or different, and are C 1 to C 7 alkylene group, C 2 to C 7 alkenylene group, —NH—R 25 —, —CO—R 25 —, —R 26 -OR 27 -, -R 26 -NH-R 27 -, -R 26 -CO 2 -R 27 -, -R 26 -CO 2 -NH-R 27 -, -R 26 -CO-R 27 -, -R 26 -NH-CO-R 27 -, or -R 26 -CO-NH-R 27 -.
- R 25 represents a C 1 -C 7 alkylene group.
- R 26 represents a C 1 -C 3 alkylene group.
- R 27 represents a C 1 -C 5 alkylene group.
- the nucleophilic functional group in the multibranched polymer is one or more selected from the group consisting of a thiol group, an amino group and --CO 2 PhNO 2 .
- Ph here represents an o-, m- or p-phenylene group.
- the composition of the nucleophilic functional groups in the multibranched polymer may be the same or different, but is preferably the same. When the composition of the functional groups is the same, the reactivity of the crosslinked linear polymer with the electrophilic functional groups becomes uniform, making it easier to obtain a gel having a uniform steric structure.
- polybranched polymers having one or more thiol groups at the side chains and/or terminals and having a polyethylene glycol skeleton examples include compounds represented by the following formula (II) having thiol groups at the terminals.
- n 11 to n 14 may be the same or different. The closer the values of n 11 to n 14 are, the more uniform the three-dimensional structure can be obtained and the higher the strength, which is preferable, and it is particularly preferable that they are the same. If the values of n 11 to n 14 are too high, the strength of the gel will be weak, and if the values of n 11 to n 14 are too low, gel formation will be difficult due to steric hindrance of the compound. Therefore, n 11 to n 14 are preferably 25 or more and 250 or less, more preferably 35 or more and 180 or less, even more preferably 50 or more and 115 or less, and particularly preferably 50 or more and 60 or less.
- the weight-average molecular weight of the multibranched polymer having a nucleophilic functional group is preferably 5 ⁇ 10 3 or more and 5 ⁇ 10 4 or less, and is 7.5 ⁇ 10 3 or more and 3 ⁇ 10 4 or less. is more preferable, and more preferably 1 ⁇ 10 4 or more and 2 ⁇ 10 4 or less.
- R 11 to R 14 are linker moieties that connect the functional group and the core portion.
- R 11 to R 14 may be the same or different, but are preferably the same in order to produce a high-strength gel having a uniform three-dimensional structure.
- R 11 to R 14 are the same or different, and are C 1 to C 7 alkylene group, C 2 to C 7 alkenylene group, —NH—R 15 —, —CO—R 15 —, —R 16 -OR 17 -, -R 16 -NH-R 17 -, -R 16 -CO 2 -R 17 -, -R 16 -CO 2 -NH-R 17 -, -R 16 -CO-R 17 -, R 16 -NH-CO-R 17 -, or -R 16 -CO-NH-R 17 -.
- R 15 represents a C 1 -C 7 alkylene group.
- R 16 represents a C 1 -C 3 alkylene group.
- R 17 represents a C 1 -C 5 alkylene group.
- C 1 to C 7 alkylene group means an alkylene group having 1 to 7 carbon atoms which may be branched, and is a linear C 1 to C 7 alkylene group or one or two It means a C 2 -C 7 alkylene group having 1 or more branches (1 or more and 7 or less carbon atoms including branches). Examples include methylene group, ethylene group, propylene group, butylene group and the like.
- the “C 2 -C 7 alkenylene group” is a linear or branched alkenylene group having 2 to 7 carbon atoms and having one or more double bonds in the chain, for example , a divalent group having a double bond, which is formed by removing 2 to 5 hydrogen atoms of adjacent carbon atoms from the above alkylene group.
- the alkylene group and alkenylene group may have one or more arbitrary substituents.
- substituents include alkoxy groups, halogen atoms (which may be fluorine atoms, chlorine atoms, bromine atoms, or iodine atoms), amino groups, mono- or di-substituted amino groups, substituted silyl groups, Acyl groups, aryl groups, and the like can be mentioned, but are not limited to these. When having two or more substituents, they may be the same or different.
- substituents include, but are not limited to, alkyl groups, alkoxy groups, hydroxyl groups, carboxyl groups, halogen atoms, sulfo groups, amino groups, alkoxycarbonyl groups, and oxo groups. These substituents may further have a substituent.
- a linear polymer that forms a hydrogel by a cross-linking reaction with a multibranched polymer contains two or more nucleophilic functional groups or electrophilic functional groups in side chains and/or terminals.
- the hyperbranched polymer has electrophilic functional groups
- the linear polymer has nucleophilic functional groups
- linear Like polymers have electrophilic functional groups.
- the contents of the electrophilic functional group and the nucleophilic functional group are the same as in the case of the hyperbranched polymer described above.
- a linear polymer is a protein, peptide or polysaccharide.
- the protein is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include collagen, fibrin, albumin, fibronectin, laminin, tenascin, entactin, elastin and compounds derived therefrom. In particular, it is preferable to use gelatin as the linear polymer.
- a peptide is a polymer of two or more amino acid residues via a peptide bond (amide bond). Applicable peptides include collagen peptides and the like. Peptides may be dipeptides, tripeptides, oligopeptides (about 10 amino acids), or polypeptides (several tens to hundreds of amino acids).
- polysaccharides are not particularly limited and can be appropriately selected, and examples thereof include cellulose, chitin, chitosan, hyaluronic acid, alginic acid, starch, pectin and the like. Any one of these linear polymers may be used alone, or two or more thereof may be used in combination. Complexes of proteins and sugars such as proteoglycans are also applicable.
- the molecular weight of the linear polymer is not particularly limited as long as it can exist inside the hydrogel. As linear polymers containing two or more nucleophilic functional groups or electrophilic functional groups in side chains and/or terminals, gelatin having thiol groups in side chains is shown below.
- the hydrogel can contain cells.
- the hydrogel of the present embodiment is excellent in gel shaping properties, has cell adhesiveness due to the linear polymer, and allows long-term cell culture in the hydrogel.
- the type of cell is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. cells can be used.
- Eukaryotic cells include, for example, animal cells, insect cells, plant cells, fungi, and the like. Any one of these may be used alone, or two or more thereof may be used in combination. Among these, animal cells are preferable, and when the cells form a cell aggregate, the cells adhere to each other and have cell adhesiveness to the extent that they cannot be isolated unless a physicochemical treatment is performed. Sex cells are more preferred.
- the adhesive cells are not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples include differentiated cells and undifferentiated cells.
- Differentiated cells include, for example, hepatocytes, which are parenchymal cells of the liver; stellate cells; Kupffer cells; vascular endothelial cells; cells; periodontal ligament-derived cells; epidermal cells such as epidermal keratinocytes; tracheal epithelial cells; gastrointestinal epithelial cells; cervical epithelial cells; kidney cells; pancreatic Langerhans islet cells; nerve cells such as peripheral nerve cells and optic nerve cells; chondrocytes; In hydrogels containing nerve cells, the adherent cells may be primary cells taken directly from a tissue or organ, or they may be passaged for several generations.
- the undifferentiated cells are not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
- Unipotent stem cells such as vascular endothelial progenitor cells having unipotency; iPS cells and the like.
- Prokaryotic cells include, for example, eubacteria and archaea.
- cells include normal human skin fibroblasts.
- normal human skin fibroblasts commercial products can be used, and examples of the commercial products include CC2507 (trade name) (manufactured by Lonza).
- the cells may contain cell aggregates (spheroids) that have undergone a culture process in advance.
- Hydrogels containing cell aggregates can undergo maturation and differentiation superior to those in which cells are present in a dispersed state in hydrogels.
- the size of the cell aggregate is not particularly limited, it is preferably 100 ⁇ m or less in diameter, for example.
- the cells can contain at least one or more types of cells.
- a hydrogel containing two or more types of cells it is possible to produce a cell culture that promotes functional expression of cells more than a single cell type due to interaction between cell types.
- extracellular matrix may be added to the hydrogel that wraps the cells.
- the extracellular matrix is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. Examples include proteins, glycoproteins, and proliferation/growth factors such as hepatocyte growth factor, fibroblast growth factor, and nerve growth factor, depending on the cell. Any one of these may be used alone, or two or more thereof may be used in combination. These are known to promote adhesion, proliferation, and differentiation of cells, and by being contained in hydrogels, they can function as triggers to change the morphology of cells within the formed hydrogels.
- the hydrogel as described above includes a first solution containing a polybranched polymer having a skeleton of polyethylene glycol and containing one or more electrophilic functional groups or nucleophilic functional groups in side chains and/or ends; and/or a second solution containing a linear polymer containing two or more nucleophilic or electrophilic functional groups at its ends.
- a hydrogel can be obtained by mixing and cross-linking the first solution and the second solution.
- the second solution may be mixed with the first solution and then the first solution and the second solution may be mixed. You can choose.
- the first solution may be mixed with the second solution and then the first solution and the second solution may be mixed.
- the above ink is used as an inkjet ink, and the first solution or the second solution is ejected by an inkjet method, and the other second solution or the first solution is landed, so that the first solution and the second solution They can be mixed to form a hydrogel.
- the second solution or the first solution which is the target to be landed, may be, for example, a liquid that fills the inside of the container, or may be in the state of a liquid film that has been applied on the substrate in advance. Alternatively, in the state of liquid droplets previously discharged onto a substrate by an inkjet method, or in the state of a liquid film having various shapes such as lines formed by contacting and coalescing a large number of continuously discharged droplets. It can be.
- the term “inkjet” refers to means for ejecting droplets of a solution contained in a liquid chamber from ejection holes (nozzles) of an inkjet head to land on a target site. Since the ejection method can eject minute solutions (droplets) from the ejection holes, it is possible to fabricate a three-dimensional structure with high precision. By using the inkjet method, the first solution and the second solution can be mixed with a resolution of, for example, 500 ⁇ m or less.
- either one or both of the first solution and the second solution of the inkjet ink can contain the above-described cells.
- a cell-containing first solution can be ejected by an inkjet method onto a cell-free second solution on a substrate to form a cell-containing hydrogel (cell culture).
- the first solution and the second solution can be mixed on a substrate having a pattern structure on its surface.
- the pattern structure include an uneven structure formed in a periodic or arbitrary pattern.
- the pattern structure may be formed such that the surface of the base material itself has a pattern such as unevenness, or the above-described hydrogel containing no cells may be formed in a predetermined pattern on the surface of a flat base material. may be placed in By forming a cell culture body in a patterned structure, it is possible to conduct an experiment as to how the patterned structure affects the migration and extension of cells in the hydrogel.
- a cell culture formed from an inkjet ink containing cells can be heated as necessary and brought into contact with another cell culture, whereby the cell cultures can be combined.
- the temperature for heating varies depending on the composition of the hydrogel and the type of cells, but there is no particular problem as long as the temperature does not excessively damage the cells contained in the cell culture. °C or less. There is no problem even if the temperature is raised to 40° C. or more if it is partially and for a very short time.
- the present invention also provides a first solution containing a multi-branched polymer having a polyethylene glycol skeleton and having one or more nucleophilic functional groups or electrophilic functional groups in side chains and/or terminals. and a second solution containing a linear polymer having one or more nucleophilic functional groups or the other functional group of the electrophilic functional groups in side chains and/or ends of the retained second solution.
- the present invention also relates to a method for producing a cell culture, including a gel forming step of forming one or more hydrogels by landing droplets ejected by a droplet ejection device so as to be in contact with one solution.
- the hyperbranched polymer and the linear polymer are as described above for the hydrogel.
- at least one of the first solution and the second solution may contain cells. The cells contained are as described above.
- the holding step is a step of holding the first solution on a support, hydrogel, or the like.
- the support may be impregnated with the first solution by, for example, immersing the support in the first solution, and the first solution may be retained on the entire surface and/or inside of the support.
- the first solution may be fixed and held at a specific position on the surface of the support or the surface of the hydrogel by ejecting the first solution by an ejection method using a droplet ejection device such as an inkjet method.
- the cell layer may be used as a support to retain the first solution.
- the "support” is a member that holds the first solution.
- the material of the support is not particularly limited as long as it does not inhibit the activity or proliferation of cells, and can be appropriately selected according to the purpose.
- a material to which cells can adhere or a material to which a cell-adhesive material easily adsorbs is preferable.
- Supports can be roughly divided into organic materials and inorganic materials.
- organic materials include synthetic resins, silicone-based materials, natural resins, cellulose structures (wood, paper, etc.), chitin structures, natural fibers (silk, hair, cotton, spongy fibers, etc.), and the like.
- a cell layer adhered to a substrate or the like can also serve as an organic material-based support.
- Synthetic resins include, for example, polyethylene terephthalate (PET), polystyrene (PS), polycarbonate (PC), TAC (triacetylcellulose), polyimide (PI), nylon (Ny), low density polyethylene (LDPE), medium density polyethylene (MDPE), vinyl chloride, vinylidene chloride, polyphenylene sulfide, polyether sulfone, polyethylene naphthalate, polypropylene, acrylic materials such as urethane acrylate, etc., and silicone materials such as polydimethylsiloxane (PDMS). etc. are included.
- inorganic materials include glass (including glass fiber), earthenware (ceramics, enamel, etc.), metals, carbon fibers, calcium phosphate structures (bones, teeth, shells, etc.).
- the above materials may be used alone, or two or more organic materials, inorganic materials, or organic and inorganic materials may be used in combination.
- examples thereof include fiber reinforced plastics (FRP) in which carbon fibers or glass fibers are combined with synthetic resins.
- FRP fiber reinforced plastics
- the size of the support can be appropriately selected depending on the purpose.
- the shape of the support is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, it may have a three-dimensional shape such as a dish, multiplate, flask, membrane, cell insert, or the like, or it may have a plate shape or flat film shape such as a glass plate, slide glass, cover glass, and the like.
- the structure of the support is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include porous structure, mesh structure, uneven structure, and honeycomb structure. A porous structure, a mesh structure, or the like is particularly preferable as a support because it can hold a large amount of solution.
- the gel-forming step includes mixing the first solution and the second solution by landing the second solution with the droplet ejection device so as to come into contact with the first solution held in the holding step.
- the nucleophilic functional groups and electrophilic reactive groups of the multibranched polymer and the linear polymer are reacted and bonded to form a hydrogel.
- Contiguously means that the first solution and the second solution are allowed to mix through contact.
- a "droplet ejection device” is a means of ejecting a solution contained in a liquid chamber into droplets and landing them on a target site.
- the ejection method of the ejection device include an inkjet method and a dispenser method such as a gel extrusion method.
- a solution is injected from an ejection hole (nozzle). Since the ejection method can eject minute solutions (sometimes referred to as droplets) from the ejection holes, a highly accurate three-dimensional structure can be manufactured. At this time, the droplets ejected from the droplet ejection device may or may not contain cells.
- the amount of droplets to be ejected can be any liquid amount. preferably 9 pL or more, 15 pL or more, 20 pL or more, 30 pL or more, 40 pL or more, 50 pL or more, 60 pL or more, 70 pL or more, 80 pL or more, 90 pL or more, or 100 pL or more, and 900 pL or less, 800 pL or less, 700 pL or less, 600 pL or less; 500 pL or less, 400 pL or less, 300 pL or less.
- “Impact” refers to bringing the solution into contact with the target site. This is accomplished by ejecting droplets onto the target site via a dispensing method.
- the cell content is preferably 5 ⁇ 10 5 cell/mL to 1 ⁇ 10 8 cell/mL, more preferably 1 ⁇ 10 6 cell/mL to 5 ⁇ 10 7 cell/mL. preferable. If the cell density is lower than this content, it is difficult to form a hydrogel containing an appropriate number of cells.
- the position where the solution is discharged There are no particular restrictions on the position where the solution is discharged. What is necessary is just to discharge so that a solution may land on a desired target position. Also, the impact sites may be separated from each other, and may partially contact or overlap each other.
- the hydrogel can be usually formed as a dot-shaped hydrogel by one landing, although not limited.
- the term “dot (shape)” refers to a point-like shape. Therefore, the shape is not limited to a perfect circle or a hemisphere, and may be any shape such as a substantially circular shape, a substantially hemispherical shape, a polygonal shape, a substantially polygonal shape, an irregular shape, or a combination thereof.
- the dot may have a predetermined length and thickness in terms of three-dimensional structure.
- hydrogels of various shapes are formed with the dot-shaped hydrogel as the minimum unit.
- the volume of the hydrogel formed by the cross-linking reaction caused by one impact depends on the number of times the second solution is discharged to the same location.
- the volume of the dot-shaped hydrogel increases as the ejection hole diameter increases and as the number of ejections to the same location increases. Therefore, the volume of the dot-shaped hydrogel can be adjusted by changing the number of ejections to the same location and the ejection hole diameter.
- the volume of the dot-shaped hydrogel in this specification is 9 pL or more, 15 pL or more, 20 pL or more, 30 pL or more, 40 pL or more, 50 pL or more, 60 pL or more, 70 pL or more, 80 pL or more, 90 pL or more, or 100 pL or more. , and preferably 900 pL or less, 800 pL or less, 700 pL or less, 600 pL or less, 500 pL or less, 400 pL or less, 300 pL or less.
- the diameter of the dot-shaped hydrogel is not limited, it may be in the range of 10 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less, and the thickness may be in the range of 5 ⁇ m or more and 150 ⁇ m or less.
- a plurality of dot-shaped hydrogels may be formed.
- the dot-shaped hydrogels may be in contact with each other entirely or partially.
- By arranging a plurality of dot-shaped hydrogels in a row it is possible to form not only dot-shaped hydrogels but also arbitrary-shaped hydrogels.
- the shape can be appropriately selected depending on the purpose.
- a linear hydrogel can be formed by arranging dots in one axial direction.
- the number of cells contained in the dot-shaped hydrogel depends on the concentration of the contained cells, so the cell density can be controlled by the number of times the dot-shaped hydrogel is formed.
- a medium is a solution that contains components necessary for maintaining the shape of a cell culture and maintaining the survival of cells, prevents drying, and adjusts the external environment such as osmotic pressure.
- the medium is not particularly limited, and may be appropriately selected from known medium according to the application.
- Examples of the medium include medium classified by composition such as natural medium, semi-synthetic medium, and synthetic medium; shapes such as semi-solid medium, liquid medium, powder medium (hereinafter sometimes referred to as "powder medium"), etc. Examples include media classified by Any one of these may be used alone, or two or more thereof may be used in combination. When the cells are derived from animals, any medium can be used as long as it is used for culturing animal cells.
- the medium used for culturing animal cells is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
- Medium Ham's Nutrient Mixture F12
- D-MEM/F12 medium McCoy's 5A medium (McCoy's 5A medium), Eagle's MEM medium (Eagles's Minimum Essential Medium; EMEM), ⁇ MEM medium (alpha Modified Eagles 's Minimum Essential Medium ( ⁇ MEM), MEM medium (Minimum Essential Medium), RPMI1640 medium, Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), MCDB131 medium, William medium E, IPL41 medium, F ischer's medium, StemPro34 (manufactured by Invitrogen), X-VIVO 10 (manufactured by Cambrex), X-VIVO 15 (manufactured by Cambrex), HPGM (manufactured by Cambrex), StemSpan H3000 (manufactured by Stemcell Technology), StemSpan
- the carbon dioxide concentration in the medium is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose, but is preferably 2% or more and 5% or less. Cells can be preferably cultured when the carbon dioxide concentration is 2% or more and 5% or less.
- the cell-containing gel particles 5 of the present embodiment are polybranched polymers containing polyethylene glycol as a backbone and one or more electrophilic or nucleophilic functional groups in side chains and/or ends. and a linear polymer containing two or more nucleophilic functional groups or electrophilic functional groups on the side chains and/or the ends thereof are crosslinked.
- Each component constituting the cell-containing gel particles 1 will be described below.
- the multibranched polymer in this embodiment is a polymer having a plurality of polyethylene glycol branches, which are crosslinked to each other to form a mesh structure network.
- the hyperbranched polymer has four polyethylene glycol branches, and such a polyethylene glycol backbone tetra-antennary polymer is known as Tetra-PEG.
- Tetra-PEG has one or more electrophilic or nucleophilic functional groups on its side chains and/or ends. Cross-linking with the linear polymer through these functional groups constructs a mesh structure network.
- the electrophilic functional groups in the hyperbranched polymer are selected from the group consisting of maleimidyl groups, N-hydroxy-succinimidyl (NHS) groups, sulfosuccinimidyl groups, phthalimidyl groups, imidazoyl groups, acryloyl groups and nitrophenyl groups.
- the composition of the electrophilic functional groups in the multibranched polymer may be the same or different, but the same is preferred. When the composition of the functional groups is the same, the reactivity with the nucleophilic functional groups of the linear polymer forming the cross-linked bonds becomes uniform, and a gel having a uniform three-dimensional structure can be easily obtained.
- polybranched polymers having one or more maleimidyl groups at the side chains and/or terminals and having a polyethylene glycol skeleton include compounds represented by the following formula (I) having maleimidyl groups at the terminals.
- n 21 to n 24 may be the same or different. The closer the values of n 21 to n 24 are, the more preferably the gel can have a uniform three-dimensional structure and the higher the strength. If the values of n 21 to n 24 are too high, the strength of the gel will be weak, and if the values of n 21 to n 24 are too low, gel formation will be difficult due to steric hindrance of the compound. Therefore, n 21 to n 24 are suitably values of 5 or more and 300 or less, preferably 20 or more and 250 or less, more preferably 30 or more and 180 or less, further preferably 45 or more and 115 or less, and 45 More than 55 or less is particularly preferable.
- the weight average molecular weight of the multibranched polymer having an electrophilic functional group is preferably 5 ⁇ 10 3 or more and 5 ⁇ 10 4 or less, more preferably 7.5 ⁇ 10 3 or more and 3 ⁇ 10 4 or less. It is preferably 1 ⁇ 10 4 or more and 2 ⁇ 10 4 or less, more preferably.
- R 21 to R 24 are linker moieties that connect the functional group and the core portion.
- R 21 to R 24 may be the same or different, but are preferably the same in order to produce a high-strength gel having a uniform three-dimensional structure.
- R 21 to R 24 are the same or different, and are C 1 to C 7 alkylene group, C 2 to C 7 alkenylene group, —NH—R 25 —, —CO—R 25 —, —R 26 -OR 27 -, -R 26 -NH-R 27 -, -R 26 -CO 2 -R 27 -, -R 26 -CO 2 -NH-R 27 -, -R 26 -CO-R 27 -, -R 26 -NH-CO-R 27 -, or -R 26 -CO-NH-R 27 -.
- R 25 represents a C 1 -C 7 alkylene group.
- R 26 represents a C 1 -C 3 alkylene group.
- R 27 represents a C 1 -C 5 alkylene group.
- the nucleophilic functional group in the multibranched polymer is one or more selected from the group consisting of a thiol group, an amino group and --CO 2 PhNO 2 .
- the composition of the nucleophilic functional groups in the multibranched polymer may be the same or different, but is preferably the same. When the composition of the functional groups is the same, the reactivity of the crosslinked linear polymer with the electrophilic functional groups becomes uniform, making it easier to obtain a gel having a uniform steric structure.
- polybranched polymers having one or more thiol groups at the side chains and/or terminals and having a polyethylene glycol skeleton examples include compounds represented by the following formula (II) having thiol groups at the terminals.
- n 11 to n 14 may be the same or different. The closer the values of n 11 to n 14 are, the more uniform the three-dimensional structure can be obtained and the higher the strength, which is preferable, and it is particularly preferable that they are the same. If the values of n 11 to n 14 are too high, the strength of the gel will be weak, and if the values of n 11 to n 14 are too low, gel formation will be difficult due to steric hindrance of the compound. Therefore, n 11 to n 14 are preferably 25 or more and 250 or less, more preferably 35 or more and 180 or less, even more preferably 50 or more and 115 or less, and particularly preferably 50 or more and 60 or less.
- the weight-average molecular weight of the multibranched polymer having a nucleophilic functional group is preferably 5 ⁇ 10 3 or more and 5 ⁇ 10 4 or less, and is 7.5 ⁇ 10 3 or more and 3 ⁇ 10 4 or less. is more preferable, and more preferably 1 ⁇ 10 4 or more and 2 ⁇ 10 4 or less.
- R 11 to R 14 are linker moieties that connect the functional group and the core portion.
- R 11 to R 14 may be the same or different, but are preferably the same in order to produce a high-strength gel having a uniform three-dimensional structure.
- R 11 to R 14 are the same or different, and are C 1 to C 7 alkylene group, C 2 to C 7 alkenylene group, —NH—R 15 —, —CO—R 15 —, —R 16 -OR 17 -, -R 16 -NH-R 17 -, -R 16 -CO 2 -R 17 -, -R 16 -CO 2 -NH-R 17 -, -R 16 -CO-R 17 -, R 16 -NH-CO-R 17 -, or -R 16 -CO-NH-R 17 -.
- R 15 represents a C 1 -C 7 alkylene group.
- R 16 represents a C 1 -C 3 alkylene group.
- R 17 represents a C 1 -C 5 alkylene group.
- C 1 to C 7 alkylene group means an alkylene group having 1 to 7 carbon atoms which may be branched, and is a linear C 1 to C 7 alkylene group or one or two It means a C 2 -C 7 alkylene group having 1 or more branches (1 or more and 7 or less carbon atoms including branches). Examples include methylene group, ethylene group, propylene group, butylene group and the like.
- the “C 2 -C 7 alkenylene group” is a linear or branched alkenylene group having 2 to 7 carbon atoms and having one or more double bonds in the chain, for example , a divalent group having a double bond, which is formed by removing 2 to 5 hydrogen atoms of adjacent carbon atoms from the above alkylene group.
- the alkylene group and alkenylene group may have one or more arbitrary substituents.
- substituents include alkoxy groups, halogen atoms (which may be fluorine atoms, chlorine atoms, bromine atoms, or iodine atoms), amino groups, mono- or di-substituted amino groups, substituted silyl groups, Acyl groups, aryl groups, and the like can be mentioned, but are not limited to these. When having two or more substituents, they may be the same or different.
- substituents include, but are not limited to, alkyl groups, alkoxy groups, hydroxyl groups, carboxyl groups, halogen atoms, sulfo groups, amino groups, alkoxycarbonyl groups, and oxo groups. These substituents may further have a substituent.
- a linear polymer that forms a hydrogel by a cross-linking reaction with a multibranched polymer contains two or more nucleophilic functional groups or electrophilic functional groups in side chains and/or terminals.
- the hyperbranched polymer has electrophilic functional groups
- the linear polymer has nucleophilic functional groups
- linear Like polymers have electrophilic functional groups.
- the contents of the electrophilic functional group and the nucleophilic functional group are the same as in the case of the hyperbranched polymer described above.
- a linear polymer is a protein, peptide or polysaccharide.
- the protein is not particularly limited as long as it does not adversely affect cells, and can be appropriately selected depending on the purpose. Examples thereof include collagen, fibrin, albumin, and the like. In particular, it is preferable to use gelatin as the linear polymer.
- a peptide is a polymer of two or more amino acid residues via a peptide bond (amide bond). Peptides may be dipeptides, tripeptides, oligopeptides (about 10 amino acids), or polypeptides (several tens to hundreds of amino acids), but they gel under normal temperature and normal pressure. preferably not.
- polysaccharides are not particularly limited and can be appropriately selected, and examples thereof include cellulose, chitin, chitosan, hyaluronic acid, alginic acid, starch, pectin and the like. Any one of these linear polymers may be used alone, or two or more thereof may be used in combination.
- linear polymers containing two or more nucleophilic functional groups or electrophilic functional groups in side chains and/or terminals gelatin having thiol groups in side chains is shown below.
- the type of cell is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. cells can be used.
- Eukaryotic cells include, for example, animal cells, insect cells, plant cells, fungi, and the like. Any one of these may be used alone, or two or more thereof may be used in combination. Among these, animal cells are preferable, and when the cells form a cell aggregate, the cells adhere to each other and have cell adhesiveness to the extent that they cannot be isolated unless a physicochemical treatment is performed. Sex cells are more preferred.
- the adhesive cells are not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples include differentiated cells and undifferentiated cells.
- Differentiated cells include, for example, hepatocytes, which are parenchymal cells of the liver; stellate cells; Kupffer cells; vascular endothelial cells; cells; periodontal ligament-derived cells; epidermal cells such as epidermal keratinocytes; tracheal epithelial cells; gastrointestinal epithelial cells; cervical epithelial cells; kidney cells; pancreatic Langerhans islet cells; nerve cells such as peripheral nerve cells and optic nerve cells; chondrocytes; The adherent cells may be primary cells taken directly from a tissue or organ, or they may be subcultured for several generations.
- the undifferentiated cells are not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
- Unipotent stem cells such as vascular endothelial progenitor cells having unipotency; iPS cells and the like.
- Prokaryotic cells include, for example, eubacteria and archaea.
- cells include normal human skin fibroblasts.
- normal human skin fibroblasts commercial products can be used, and examples of the commercial products include CC2507 (trade name) (manufactured by Lonza).
- Cell-containing microgel particles are formed in vitro, and therefore culture vessels, media, and other known materials necessary for maintenance of function expression, cell survival, etc. are appropriately used depending on the application.
- the cell-containing gel particles contain one or more cells and have a spherical or ellipsoidal shape.
- a plurality of cell types may be contained, and may be in contact with a substrate such as a culture vessel.
- the density of cells is not particularly limited, and cells may be directly bonded to each other.
- Hydrogels present around cells are gels obtained by cross-end coupling reactions between hyperbranched polymers and linear polymers.
- the gel concentration (mass % concentration (w/w) of gel molecules in the hydrogel) is preferably 0.6% to 8%.
- the diameter of the cell-containing gel particles can be appropriately set according to the type of cells and the state of culturing the cells, but if it is in the range of 60 ⁇ m to 500 ⁇ m, the cells contained in the hydrogel can be easily observed. preferable.
- the diameter refers to the average value of the long axis and short axis of the gel particles in the microscopic image obtained by observing the cell-containing gel particles under a microscope.
- An extracellular matrix may be added to the hydrogel 50 that wraps the cells 51 as necessary.
- the extracellular matrix is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. Examples include proteins, glycoproteins, and proliferation/growth factors such as hepatocyte growth factor, fibroblast growth factor, and nerve growth factor, depending on the cell. Any one of these may be used alone, or two or more thereof may be used in combination. These are known to promote adhesion, proliferation, and differentiation of cells, and by being included in the hydrogel 50, they can function as triggers for changing the morphology of cells within the formed gel particles.
- the cell-containing gel particles 62 of the present embodiment are obtained by adding droplets of a first solution 60 containing a multibranched polymer and cells to a second solution containing a linear polymer but not containing cells, which is placed in a culture container 63. 61 can be made. Alternatively, the cells may be contained in the second solution rather than the first solution, and droplets of the second solution may be mixed with the cell-free first solution.
- the culture vessel 63 is composed of a base material that serves as a base and support necessary for forming and maintaining cell-containing gel particles, and examples thereof include vessels made of resin, glass, metal, and the like.
- a base material that serves as a base and support necessary for forming and maintaining cell-containing gel particles
- examples thereof include vessels made of resin, glass, metal, and the like.
- the shape of the substrate not only a planar shape but also a perforated shape, a mesh shape, an uneven shape, a honeycomb shape, and the like can be used, and the substrate may be appropriately selected depending on the application. It is preferable to use a multi-well type culture plate, insert, or the like that has high light transmittance and does not autofluoresce/luminesce.
- cell-containing gel particles 62 formed by cross-linking a first solution 60 and a second solution 61 are present in a medium 64 filled in a culture vessel 63, and cell culture is performed in this state. It can be performed. As shown in FIG. 3, in the cell culture performed with the cell-containing gel particles 62 surrounded by the medium 64, even one cell can be cultured and survives and spreads within the cell-containing gel particles 62. Cells can be observed. Moreover, when nerve cells are used, the neurites are characterized by staying within the cell-containing gel particles 62 .
- the top of the culture vessel 63 is open for loading and unloading the culture medium 64 and the drug, but a closed system capable of circulation culture or a chip type having a microchannel may be used.
- a droplet of a first solution 70 containing cells is dropped onto a second solution 71 on a substrate, and a cross-linking reaction is performed to form cell-containing gel particles 72.
- Cell culture can be performed in a state in which the gel particles 72 are adhered to and held in the culture container 73 and the culture container 73 is filled with the culture medium 74 .
- the medium that fills the culture vessel is a solution that contains components necessary for maintaining the shape of the cell-containing gel particles and maintaining the survival of the cells, prevents drying, and adjusts the external environment such as osmotic pressure.
- the medium is not particularly limited, and may be appropriately selected from known medium according to the application.
- Examples of the medium include medium classified by composition such as natural medium, semi-synthetic medium, and synthetic medium; shapes such as semi-solid medium, liquid medium, powder medium (hereinafter sometimes referred to as "powder medium"), etc. Examples include media classified by Any one of these may be used alone, or two or more thereof may be used in combination. When the cells are derived from animals, any medium can be used as long as it is used for culturing animal cells.
- the medium used for culturing animal cells is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
- Medium Ham's Nutrient Mixture F12
- D-MEM/F12 medium McCoy's 5A medium (McCoy's 5A medium), Eagle's MEM medium (Eagles's Minimum Essential Medium; EMEM), ⁇ MEM medium (alpha Modified Eagles 's Minimum Essential Medium ( ⁇ MEM), MEM medium (Minimum Essential Medium), RPMI1640 medium, Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), MCDB131 medium, William medium E, IPL41 medium, F ischer's medium, StemPro34 (manufactured by Invitrogen), X-VIVO 10 (manufactured by Cambrex), X-VIVO 15 (manufactured by Cambrex), HPGM (manufactured by Cambrex), StemSpan H3000 (manufactured by Stemcell Technology), StemSpan
- the carbon dioxide concentration in the medium is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose, but is preferably 2% or more and 5% or less. Cells can be preferably cultured when the carbon dioxide concentration is 2% or more and 5% or less.
- FIG. 5 shows one embodiment of the cell evaluation plate according to the present invention.
- the cell evaluation plate 8 of FIG. 5 has a substrate with a large number of wells 80 and cell-containing gel particles 81 in each well 80 .
- the number of wells is not particularly limited, and individual cell-containing gel particles 81 may have the same composition with respect to the types of cells, hydrogel, etc., or may have different compositions.
- Such a cell evaluation plate 8 can be suitably used for high-throughput screening.
- Example 1 Preparation of first solution Tetra-PEG-maleimidyl (SUNBRIGHT PTE-100MA, manufactured by Yuka Sangyo Co., Ltd.) 0.02 g is added to phosphate buffered saline (manufactured by Life Technologies, hereinafter also referred to as PBS (-). ) to 1 ml, a first solution containing 2% Tetra-PEG-maleimidyl was prepared.
- PBS phosphate buffered saline
- Gelatin-SH thiol functionalized gelatin, manufactured by Sigma-Aldrich
- PBS PBS
- Example 2 (1) Preparation of first solution Tetra-PEG-maleimidyl (SUNBRIGHT PTE-100MA, manufactured by Yuka Sangyo Co., Ltd.) 0.02 g is added to phosphate buffered saline (manufactured by Life Technologies, hereinafter also referred to as PBS (-). ) to 1 ml, a first solution containing 2% Tetra-PEG-maleimidyl was prepared.
- PBS phosphate buffered saline
- Gelatin-SH thiol functionalized gelatin, manufactured by Sigma-Aldrich
- PBS PBS
- the cell suspension in the dish was transferred to one 15 ml centrifuge tube, centrifuged (H-19FM, manufactured by KOKUSAN, 200 ⁇ g, 3 minutes), and the supernatant was removed using an aspirator. After removal, 2 mL of DMEM containing FBS was added to the centrifuge tube and gently pipetted to disperse the cells to obtain a cell suspension. 100 ⁇ L of the cell suspension was taken out into an Eppendorf tube, the sample was aspirated into a cassette (Via1-Cassette, manufactured by Chemometec), and the number of cells was counted using a cell counter (NucleoCounter NC-3000, manufactured by Chemometec). The number of cells in the liquid was determined.
- the first solution prepared in (1) was added to obtain a cell-containing first solution comprising a cell suspension containing 2% Tetra-PEG-maleimidyl and having a cell concentration of 5 ⁇ 10 6 cells/mL.
- Example 3 The basic procedure was the same as in Example 2. However, in this example, two or more types of gel precursors with different mixing ratios were formed in the first solution, nerve cells were used instead of HUVEC cells, and cell cultures were produced by inkjet. , different from the second embodiment.
- the first solution prepared in (1) is added, containing 1% Tetra-PEG-maleimidyl and 0.1% gelatin-SH, and containing cells consisting of a cell suspension with a cell concentration of 1 ⁇ 10 7 /mL A first solution was obtained.
- Example 2 Preparation of cell culture
- the second solution in Example 2 was applied to an 18 mm square cover glass (No. 1 Thickness 0.13 to 0.17 mm, manufactured by Matsunami Glass Co., Ltd.). After filling the liquid chamber of the inkjet head with the cell-containing first solution prepared in (2), drop one drop at a time onto the cover glass to let the cell-containing first solution land on the second solution, and react the two liquids.
- Cell cultures were prepared by After gel formation, the coverslip was transferred to a 35 mm dish, filled with medium, confirmed with a microscope that gel was formed, and placed in an incubator at 37°C and 5% CO 2 environment and cultured for 14 days.
- ⁇ 3 tubulin antibody ( ⁇ 3-Tubulin (D71G9) XP Rabbit mAb #5568, manufactured by Cell Signaling Technology, hereinafter referred to as “TUBB3”) and PEG antibody (Anti-PEG antibody-BSA and Azidefree by Rat monoclonal, abcam) 1 % BSA. After blocking, the supernatant was removed and the above primary antibody dilution was added and incubated overnight at 4°C. On the next day, washing with PBS was performed three times, and a secondary antibody solution diluted with a 1% BSA solution was added and incubated for 1 hour. After that, the work was performed while shielding the light with aluminum foil or the like.
- a Hoechst solution diluted with PBS was added to perform nuclear staining for 5 minutes.
- the PBS wash was repeated twice and the mounting medium was added dropwise.
- Observation was performed using a fluorescence microscope (Zeiss), and it was confirmed that cells in the hydrogel on day 14 of culture expressed TUBB3, which is a neuronal cell marker (Fig. 8).
- TUBB3 which is a neuronal cell marker
- Example 4 The basic procedure conformed to Example 3. However, this example is different from Example 3 in that HUVEC cells and HepG2 cells (human liver cancer-derived cell line) are used, and cell cultures are layered by inkjet.
- HUVEC cells and HepG2 cells human liver cancer-derived cell line
- HepG2 cell culture In an incubator, 10% by mass fetal bovine serum (hereinafter referred to as "FBS") and 1% by mass antibiotic (Antibiotic-Antimycotic Mixed Stock Solution (100x), manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd. ) containing Dulbecco's Modified Eagle Medium (trade name: DMEM (1X), manufactured by Thermo Fisher Scientific, hereinafter referred to as "DMEM”), HepG2 cells were cultured in a 100 mm dish for 72 hours.
- FBS fetal bovine serum
- 100x Antibiotic-Antimycotic Mixed Stock Solution
- DMEM (1X Dulbecco's Modified Eagle Medium
- HepG2 cells were dispersed to obtain a cell suspension.
- the prepared first solution was added to obtain a HepG2 cell-containing first solution consisting of a cell suspension containing 2% Tetra-PEG-maleimidyl and having a cell concentration of 1 ⁇ 10 7 cells/mL.
- the second solution was impregnated with the droplet-like HUVEC cell-containing first solution to form a second layer of cell culture.
- cell cultures of the third layer (HepG2 cells) and the fourth layer (HUVEC cells) are formed, and finally three-dimensional cells consisting of four layers of cell-containing hydrogels. A culture was obtained.
- the three-dimensional cell culture was transferred to a 35 mm dish containing 1 mL of DMEM containing 10% by weight FBS and 1% by weight of antibiotics and 1 mL of endothelial cell basal medium in a 37°C, 5 vol% CO2 environment. Placed in an incubator (described above).
- Observation was performed using a confocal microscope (FV10, manufactured by Olympus), and cells in the hydrogel on day 7 of culture expressed albumin, a marker for HepG2 cells, and CD31, a marker for HUVEC cells, and spread. I was able to confirm that In addition, it was observed that a layered structure of HepG2 cells was formed in the 1st and 3rd layers, and that HUVEC cells were formed in the 2nd and 4th layers.
- FV10 confocal microscope
- Example 5 The basic procedure conformed to Example 3. However, this example differs from Example 3 in that HUVEC cells are used and cell cultures are layered by inkjet.
- Tetra-PEG-maleimidyl (SUNBRIGHT PTE-100MA, manufactured by Yuka Sangyo Co., Ltd.) 0.02 g was added to phosphate buffered saline (manufactured by Life Technologies, hereinafter referred to as PBS (- A first cell-free solution containing 2% Tetra-PEG-maleimidyl was prepared.
- Example 6 The basic procedure was according to Example 5. However, this example differs from Example 5 in that the nerve cells used in Example 3 are used.
- FIG. A formed laminate was produced.
- FIG. 10(b) which is a schematic enlargement of part A of FIG. 10(a)
- cells C extend within the cell culture body 10 .
- FIG. 11 is an image of the line-shaped cell culture 10 observed under a microscope. From the results of FIG. 11, it was confirmed that when a line-shaped cell culture was produced by inkjet, the cells spread along the entire line regardless of the shape of the ejected droplets.
- Example 1 A hydrogel was prepared in the same manner as in Example 1 using Tetra-PEG-maleimidyl as the first solution and Tetra-PEG-SH as the second solution, and observed. As shown in FIG. , most of the cells were not stretched.
- Tetra-PEG-maleimidyl and Tetra-PEG-SH As a hydrogel covering the cells, Tetra-PEG-maleimidyl and Tetra-PEG-SH (SUNBRIGHT PTE-100SH, manufactured by Yuka Sangyo Co., Ltd.) in a mass ratio of 1% with respect to phosphate buffered saline, thrombin from bovine plasma, manufactured by Sigma-Aldrich) 20 U/mL, and fibrinogen (Fibrinogen from bovine plasma, manufactured by Sigma-Aldrich) were mixed so that the mass ratio was 1%. Cell cultures were prepared in the same manner, and cell spreading was observed. The results are shown in FIG. From FIG. 13, it was confirmed that the morphology of the HUVEC cells after incubation was in a round state and spread cells, suggesting that it is difficult to spread almost all cells in the hydrogel for long-term culture. .
- Comparative Example 3 As Comparative Example 3, sodium alginate (SKAT ONE, manufactured by Kimika) was added at a mass ratio of 1%, and gelatin-SH was added at a mass ratio of 2%. -)) and a calcium chloride solution in which calcium chloride dihydrate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is dissolved in distilled water so as to be 100 mmol / L, the mass ratio A cell culture was prepared in the same manner as in Example 2 except that a calcium alginate gel was formed by mixing at a ratio of 1:1, and cell spreading was observed. As a result, it was confirmed that the morphology of the HUVEC cells after incubation remained round and did not extend, and that the calcium alginate gel gradually collapsed as the dish was shaken. was also found to be missing.
- Example 4 Cell cultures were prepared in the same manner as in Example 3 using Tetra-PEG-maleimidyl and Matrigel as the first solution and Tetra-PEG-SH as the second solution, and observed. Cells were not stretched.
- Example 2 From the results in Table 1, it was confirmed that cells could spread on the hydrogel surface of Example 1, and it was confirmed that cells could not spread on the normal Tetra-PEG gel surface of Comparative Example 1.
- the cell culture of Example 2 was found to be a cell culture capable of efficiently spreading HUVEC cells compared to the guest-added normal Tetra-PEG gel (Comparative Example 2) and alginate gel (Comparative Example 3). confirmed.
- Example 3 and Comparative Example 4 it was confirmed that similar results could be obtained even with cell cultures produced by inkjet.
- a cell culture body having both gel forming property and cell adhesiveness can be obtained.
- Example 7 Preparation of cell-containing gel particles using 3T3 cells (adhesive cells)
- first solution Tetra-PEG-maleimidyl (trade name: SUNBRIGHT PTE-100MA, manufactured by Yuka Sangyo Co., Ltd.) After dissolving 0.02 g in 1 ml of phosphate buffered saline (manufactured by Life Technologies, hereinafter also referred to as PBS(-)), a first solution containing 2% Tetra-PEG-maleimidyl was prepared.
- the cell suspension in the dish was transferred to one 15 ml centrifuge tube, centrifuged (trade name: H-19FM, manufactured by KOKUSAN, 200 ⁇ g, 3 minutes), and the supernatant was removed using an aspirator. After removal, 2 mL of NCS-containing DMEM was added to the centrifuge tube and gently pipetted to disperse the cells and obtain a cell suspension. 100 ⁇ L of the cell suspension was taken out into an Eppendorf tube, the sample was aspirated into a cassette (trade name: Via1-Cassette, manufactured by Chemometec), and a cell counter (trade name: NucleoCounter NC-3000, manufactured by Chemometec) was used.
- a cassette trade name: Via1-Cassette, manufactured by Chemometec
- a cell counter trade name: NucleoCounter NC-3000, manufactured by Chemometec
- the number of cells was counted to determine the number of cells in the liquid.
- a portion of the cell suspension was transferred to a 15 ml centrifuge tube, centrifuged (200 ⁇ g, 3 minutes), and the supernatant was removed using a pipette.
- the first solution prepared in (1) was added to obtain a cell-containing first solution comprising a cell suspension containing 2% Tetra-PEG-maleimidyl and having a cell concentration of 1 ⁇ 10 7 cells/mL.
- the membrane was transferred to a 35 mm dish, DMEM containing NCS was applied to float the gel particles, and the membrane was dispensed into a 96-well plate. After confirming the presence of gel particles with a microscope, the cells were placed in an incubator at 37° C. and 5% CO 2 environment and cultured for 7 days.
- Example 8 Preparation of cell-containing gel particles using CHO cells (floating cells) (1) Preparation of first solution The same procedure as in Example 7 was performed.
- Ham's F12 (trade name: F-12 Ham , Sigma-Aldrich, hereinafter referred to as "Ham's F12”
- CHO pMAM-luc cells
- JCRB Cell Bank hereinafter referred to as "CHO”
- the first solution prepared in (1) was added to obtain a cell-containing first solution comprising a cell suspension containing 2% Tetra-PEG-maleimidyl and having a cell concentration of 1 ⁇ 10 7 cells/mL.
- Example 9 Evaluation of cell viability (1) Staining of cells
- the cell-containing gel particles produced in Example 7 were used for evaluation. Propidium (manufactured by Sigma Aldrich, hereinafter referred to as "PI”) and Hoechst33342 (H3570, manufactured by Thermo Fisher Scientific, hereinafter referred to as "Hoechst”) were diluted with a medium to 0.5 ng/ml and incubated at 37°C. bottom. After incubation for 1 hour, the cell-containing gel particles were observed with a fluorescence microscope (manufactured by Olympus) to obtain an image.
- PI Propidium
- Hoechst33342 H3570, manufactured by Thermo Fisher Scientific
- the number of PI-stained cells is the number of dead cells
- the total number of Hoechst-stained cells is the total number of cells. (%) was calculated by (number of dead cells/number of total cells) ⁇ 100.
- Example 10 Production of Cell-Containing Gel Particles Using Nerve Cells (1) Preparation of First Solution The same procedure as in Example 7 was carried out.
- PBS washing 4% paraformaldehyde (trade name: 4% paraformaldehyde/phosphate buffer, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., hereinafter referred to as “4% PFA”) was added and allowed to stand for 20 minutes. to fix the cells.
- the PBS wash was repeated three times after removal of the supernatant. The supernatant was removed, and 0.1% Triton was added to perform cell membrane permeabilization for 10 minutes.
- ⁇ 3 tubulin antibody (trade name: ⁇ 3-Tubulin (D71G9) XP Rabbit mAb #5568, manufactured by Cell Signaling Technology, hereinafter referred to as “TUBB3”)
- PEG antibody (trade name: Anti-Polyethylene glycol antibody [26A04] BSA and Azide free (ab94764), abcam) was diluted in 1% BSA. After blocking, the supernatant was removed and the above primary antibody dilution was added and incubated overnight at 4°C.
- Example 11 Size of Cell-Containing Gel Particles (1) Preparation of First Solution The same procedure as in Example 7 was carried out.
- Gel particles with a diameter of 200 ⁇ m were produced in the same manner as in Example 7.
- 1 ⁇ L of the second solution was dropped into a 35 mm dish, and 1 ⁇ L of the cell-containing first solution prepared in (3) was injected into the droplet.
- DMEM was gently added to the 35 mm dish and placed in an incubator at 37° C., 5% CO 2 environment and cultured for 7 days.
- cell-containing gel particles were observed with a phase contrast microscope. As a result, as shown in FIG. 17, it was confirmed that cardiomyocytes were beating in the gel particles. It was also confirmed that individual cells could be observed with cell-containing gel particles with a diameter of 200 ⁇ m, but individual cells could not be observed in detail with gel particles with a diameter of 2 mm.
- Example 12 Cell-Containing Gel Particles Containing One Cell (1) Preparation of First Solution The same procedure as in Example 7 was carried out.
- Example 9 (4) Evaluation of cell viability The same procedure as in Example 9 was carried out, and the results are summarized in Table 3 below. As shown in Table 3, it was confirmed that cell viability could not be maintained within alginic acid microgel particles for up to one week.
- Table 6 summarizes the results of the cell-containing gel particles prepared with a diameter of 500 ⁇ m or less as ⁇ and a case with a diameter of more than 500 ⁇ m as x. As shown in Table 6, it was confirmed that when collagen was used, microgel particles of 500 ⁇ m or less could not be produced.
- Example 13 Cell-containing gel particles containing planktonic cells were cultured under adhesive conditions (1) Preparation of first solution The same procedure as in Example 7 was carried out.
- Table 7 summarizes the cases in which the cell survival rate was 75% or more after 4 days and 7 days of culture of the cell-containing gel particles. As shown in Table 7, it was confirmed that cell viability could be maintained even when HyB, which is a planktonic cell, was cultured in cell-containing gel particles adhered to a substrate.
- Example 14 Measurement of IL-8 secretion by LPS stimulation (1) Preparation of first solution The same procedure as in Example 7 was carried out.
- LPS treatment After culturing the cell-containing gel particles for 2 days, lipopolysaccharide (hereinafter referred to as LPS) was added to the medium at concentrations of 10 pg/mL, 100 pg/mL and 10000 pg/mL. , cultured for 24 hours. As a control, wells without LPS treatment were also prepared.
- LPS lipopolysaccharide
- ELISA IL-8 ELISA was performed using the culture supernatant of the cell-containing gel particles treated with LPS for 24 hours.
- IL-8 Human Uncoated ELISA Kit (Invitrogen) was used for ELISA, and experiments were performed according to the specified protocol. Absorbance at 450 nm was measured with a plate reader, and the IL-8 concentration of each sample was estimated from the standard. As a result, as shown in FIG. It was shown that
- hydrogel 2 four-branched polymer 3 linear polymer 10 cell culture 20 hydrogel 21 electrophilic functional group 30 cover glass 31 nucleophilic functional group 5 cell-containing gel particles 50 hydrogel 51 cell 60 first solution 61 Second solution 62 Cell-containing gel particles 63 Culture vessel 64 Medium 70 First solution 71 Second solution 72 Cell-containing gel particles 73 Culture vessel 74 Medium 8 Cell evaluation plate 80 Well 81 Cell-containing gel particles C Cells Referenced herein All publications, patents and patent applications are hereby incorporated by reference in their entirety.
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Abstract
ゲル造形性と細胞接着性を両立させた、細胞の長期培養が可能なハイドロゲルを提供することを目的とする。 ポリエチレングリコールを骨格とし、側鎖及び/又は末端に1以上の求電子性官能基又は求核性官能基を含む四分岐型ポリマー2と、側鎖及び/又は末端に2以上の求核性官能基又は求電子性官能基を含む直鎖状ポリマー3とが架橋してなるハイドロゲル1であって、前記直鎖状ポリマー3が、タンパク質、ペプチド又は多糖類であり、前記求電子性官能基が、マレイミジル基、N-ヒドロキシ-スクシンイミジル(NHS)基、スルホスクシンイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基及びニトロフェニル基よりなる群から選択される一種以上であり、前記求核性官能基が、チオール基、アミノ基及び-CO2PhNO2よりなる群から選択される一種以上であることを特徴とする。
Description
本発明は、ハイドロゲル、インクジェット用インク、そのインクジェット用インクを用いる細胞培養体の作製方法、細胞含有ゲル粒子及びその製造方法、細胞の培養方法、並びに細胞評価プレートの技術分野に属する。
細胞を3次元にパターニングすることができ、長期培養可能なハイドロゲル組成物が求められている。従来のコラーゲンの材料による3次元モデルは細胞接着性を有するものの、ゲル化時間が遅く、培養が行われる場での速やかなゲル形成ができないため、細胞の位置がランダムとなり評価結果の再現性を得ることが難しい。一方、速やかにゲル化する造形性の良い材料としてアルギン酸ゲル等が挙げられるが、一般に造形性に優れたゲル材は細胞接着性を示さないことが多く、モデルの長期培養が困難であるため用途が限定されてしまう。また、アルギン酸ゲルやポリマーの材料では細胞接着性を補う目的でゲスト材料を添加することもある。例えば、(特許文献1)には、ポリエチレングリコールを骨格とする四分岐型ポリマーが互いに架橋してなるハイドロゲルとゲスト物質とを含むハイドロゲル組成物であって、当該ゲスト物質がコラーゲンペプチド等の細胞接着因子を有することを特徴とする、ハイドロゲル組成物が開示されている。しかし、このようなゲスト材料を添加しつつ、添加量や分散性を確保するには高い技術を要することが多く、造形性とトレードオフとなってしまう場合がありえるため、なお改良の余地があった。
ところで、In vitroにおける細胞培養技術では、至適播種密度で播種し、細胞に合った条件(接着/浮遊条件)で培養を行う。患者由来の細胞といった入手しにくい細胞を培養してアッセイを行う際には、少ない細胞数で培養を実施しなければならない。一般的に、少ない細胞で培養する方法としては、シングルセル培養やスフェロイド培養、液相ドロップレット培養技術等があり、その中でも生存率が高く、少ない細胞数でも容易にハンドリングできる手法として、ハイドロゲルの中で細胞を培養する細胞カプセル化技術が既に知られている。
しかし、今までの細胞カプセル化技術による培養は、細胞を包むハイドロゲルに造形性を考慮したアルギン酸を用いた手法が多い。しかし、アルギン酸のハイドロゲルでは細胞種によっては短期間でも生存することが難しい。例えば、(特許文献2)には、異方性を有するコラーゲンビーズを作製する目的で、アルギン酸とコラーゲンを混合したハイドロゲルで細胞を包み、アルギン酸の素早いゲル化により、コラーゲンがゲル化するまでのゲル粒子の造形性を維持する方法が開示されている。しかし、この技術では、ゲル化させる際にカルシウム溶液に細胞を接触させるため、細胞の生存率を維持することが困難であった。
また、細胞の生存率を考慮したコラーゲンやゼラチン等の細胞外マトリックスを用いた手法が知られている。例えば、(特許文献3)には、少量の動物細胞でも正確で十分な感受性試験を行うこと、及び共培養時の細胞間相互作用を明確に観察・測定する目的で、コラーゲン溶液に動物細胞を分散させ、その細胞含有コラーゲン液滴を支持体表面でゲル化させて滴塊状のコラーゲンゲルを作成し、培養液を加えて動物細胞の培養を行う培養方法が開示されている。これらのコラーゲン等を利用する方法では、生存率は維持できるが造形性が悪く、造形性を維持するために細胞とハイドロゲルが入った粒子の周囲にさらにハイドロゲルや他の材料をコーティングしている。そのため、粒子径が大きくなってしまい、観察が困難かつ、長期培養するには粒子径の大きさが培養液の栄養素、酸素等の透過性に影響し、結果的に生存率が低くなるという問題があった。上記(特許文献2)においても、コラーゲンゲルの粒子の体積は3μlと大きく、粒子を小さくするという課題は解決できていない。
さらに、ハイドロゲルに包まれている細胞数が少なければ、さらに細胞の生存率の維持は難しくなる。すなわち、1粒子当たりの細胞数が少ない状態でカプセル化の造形性を向上させるハイドロゲル材料を用いると細胞生存率が維持できず、一方で細胞生存率を向上可能なハイドロゲル材料を用いると、造形性が悪く、粒子径が大きくなり、観察が困難となり、かつ結果的に長期の培養はできないという問題があった。
そこで本発明は、ゲル造形性と細胞接着性を両立させた、細胞の長期培養が可能なハイドロゲルを提供することを目的とする。
また、本発明は、細胞種に限定されず、細胞を含んだハイドロゲルの造形性と細胞の生存率を維持したまま培養可能にすることを目的とする。
本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、ゲル化時間が速い、ポリエチレングリコールを骨格とする特定構造の多分岐型ポリマーと、細胞接着性を有するタンパク質等の直鎖状ポリマーとの架橋によりハイドロゲルを形成することで上記課題が解決できることを見出し、発明を完成した。
すなわち、本発明は、ポリエチレングリコールを骨格とし、側鎖及び/又は末端に1以上の求電子性官能基又は求核性官能基を含む多分岐型ポリマーと、側鎖及び/又は末端に2以上の求核性官能基又は求電子性官能基を含む直鎖状ポリマーとが架橋してなるハイドロゲルであって、前記直鎖状ポリマーが、タンパク質、ペプチド又は多糖類であり、前記求電子性官能基が、マレイミジル基、N-ヒドロキシ-スクシンイミジル(NHS)基、スルホスクシンイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基及びニトロフェニル基よりなる群から選択される一種以上であり、前記求核性官能基が、チオール基、アミノ基及び-CO2PhNO2よりなる群から選択される一種以上であることを特徴とする。
また、本発明者らは、ポリエチレングリコールを骨格とする特定構造の多分岐型ポリマーと、側鎖や末端に特定の官能基を有するタンパク質等の直鎖状ポリマーとの架橋によって細胞を包むハイドロゲルを形成することにより上記課題が解決できることを見出し、発明を完成した。
すなわち、本発明は、ポリエチレングリコールを骨格とし側鎖及び/又は末端に1以上の求電子性官能基又は求核性官能基を含む多分岐型ポリマーと、側鎖及び/又は末端に2以上の求核性官能基又は求電子性官能基を含む直鎖状ポリマーとが架橋してなるハイドロゲルにより、細胞が包まれている細胞含有ゲル粒子であって、前記直鎖状ポリマーが、タンパク質、ペプチド又は多糖類であり、前記求電子性官能基が、マレイミジル基、N-ヒドロキシ-スクシンイミジル(NHS)基、スルホスクシンイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基及びニトロフェニル基よりなる群から選択される一種以上であり、前記求核性官能基が、チオール基、アミノ基及び-CO2PhNO2よりなる群から選択される一種以上であることを特徴とする。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2021-197665、2021-197639号の開示内容を包含する。
本発明によれば、ゲル造形性と細胞接着性を両立させた、細胞の長期培養が可能なハイドロゲルを提供することができる。
また、本発明によれば、細胞種の限定無く、細胞1個でも細胞生存率を維持したまま培養することができる。
以下、実施の形態に基づき本発明を詳細に説明する。
なお、以下に述べる実施の形態は、本発明の好適な実施の形態であるから技術的に好ましい種々の限定が付されているが、本発明の範囲は以下の説明において本発明を限定する旨の記載がない限り、これらの態様に限られるものではない。
なお、以下に述べる実施の形態は、本発明の好適な実施の形態であるから技術的に好ましい種々の限定が付されているが、本発明の範囲は以下の説明において本発明を限定する旨の記載がない限り、これらの態様に限られるものではない。
本実施形態に係るハイドロゲルは、ポリエチレングリコールを骨格とし側鎖及び/又は末端に1以上の求電子性官能基又は求核性官能基を含む多分岐型ポリマーと、側鎖及び/又は末端に2以上の求核性官能基又は求電子性官能基を含む直鎖状ポリマーとが架橋してなることを特徴とする。
「ハイドロゲル」とは、三次元網目構造を有し、その網目構造の空間内部に多量の水を保持するゲルをいい、例えば、寒天のような多糖類ゲルやゼリーのようなタンパク質ゲル、及びアクリル酸重合体のような高吸水性高分子ゲル等は、その好例である。一般に、ハイドロゲルは、包含する水を介して様々な物質をゲル内に取り込ませることができる。
本実施形態のハイドロゲルの典型的構成を図1に模式的に示す。図1に示すように、本実施形態のハイドロゲル1は、四分岐型ポリマー2のマレイミジル基等の求電子性官能基21と、直鎖状ポリマー3のチオール基等の求核性官能基31とが架橋することで形成され、四分岐型ポリマーと直鎖状ポリマーが分散して存在する構造を有する。図1の例に限定されず、四分岐型ポリマーが求核性官能基を有し、一方の直鎖状ポリマーが求電子性官能基を有していても良い。以下、ハイドロゲル1を構成する各成分について説明する。
<多分岐型ポリマー>
本実施形態における多分岐型ポリマーは、少なくとも3つのポリエチレングリコール分岐を有するポリマーであって、互いに架橋して網目構造ネットワークを形成する。好ましい態様において、多分岐型ポリマーは、4つのポリエチレングリコール分岐を有するポリマーであり、このようなポリエチレングリコールを骨格とする四分岐型ポリマーは、Tetra-PEGとして知られている。Tetra-PEGは、側鎖及び/又は末端に1以上の求電子性の官能基又は求核性の官能基を有している。これらの官能基を介して直鎖状ポリマーと架橋し、網目構造ネットワークが構築される。このポリマーは、PEGを主成分としているため、生体適合性にも優れている。
本実施形態における多分岐型ポリマーは、少なくとも3つのポリエチレングリコール分岐を有するポリマーであって、互いに架橋して網目構造ネットワークを形成する。好ましい態様において、多分岐型ポリマーは、4つのポリエチレングリコール分岐を有するポリマーであり、このようなポリエチレングリコールを骨格とする四分岐型ポリマーは、Tetra-PEGとして知られている。Tetra-PEGは、側鎖及び/又は末端に1以上の求電子性の官能基又は求核性の官能基を有している。これらの官能基を介して直鎖状ポリマーと架橋し、網目構造ネットワークが構築される。このポリマーは、PEGを主成分としているため、生体適合性にも優れている。
多分岐型ポリマーにおける求電子性官能基としては、マレイミジル基、N-ヒドロキシ-スクシンイミジル(NHS)基、スルホスクシンイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基及びニトロフェニル基よりなる群から選択される一種以上である。好ましくは、マレイミジル基である。多分岐型ポリマーの中で、求電子性官能基の組成は、同一であっても、異なっても良いが、同一である方が好ましい。官能基の組成が同一であることによって、架橋結合を形成する直鎖状ポリマーの求核性官能基との反応性が均一になり、均一な立体構造を有するゲルを得やすくなる。
側鎖及び/又は末端に1以上のマレイミジル基を有し、ポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマーの例として、末端にマレイミジル基を有する下記式(I)で表される化合物が挙げられる。
上記式(I)中、n21~n24は、それぞれ同一でも又は異なっても良い。n21~n24の値は近いほど、ゲルは均一な立体構造をとることができ、高強度となるので好ましく、同一であることが特に好ましい。n21~n24の値が高過ぎるとゲルの強度が弱くなり、n21~n24の値が低過ぎると化合物の立体障害によりゲルが形成されにくい。そのため、n21~n24は、5以上300以下の値であることが適当であり、20以上250以下であることが好ましく、30以上180以下がより好ましく、45以上115以下がさらに好ましく、45以上55以下であれば特に好ましい。求電子性官能基を有する多分岐型ポリマーの重量平均分子量は、5×103以上5×104以下であることが好ましく、7.5×103以上3×104以下であることがより好ましく、1×104以上2×104以下であることがさらに好ましい。
上記式(I)中、R21~R24は、官能基とコア部分をつなぐリンカー部位である。R21~R24は、それぞれ同一でも異なっても良いが、均一な立体構造を有する高強度なゲルを製造するためには同一であることが好ましい。式(I)中、R21~R24は、それぞれ同一又は異なり、C1~C7アルキレン基、C2~C7アルケニレン基、-NH-R25-、-CO-R25-、-R26-O-R27-、-R26-NH-R27-、-R26-CO2-R27-、-R26-CO2-NH-R27-、-R26-CO-R27-、-R26-NH-CO-R27-、又は-R26-CO-NH-R27-等である。ここで、R25はC1~C7アルキレン基を示す。R26はC1~C3アルキレン基を示す。R27はC1~C5アルキレン基を示す。
また、多分岐型ポリマーにおける求核性官能基としては、チオール基、アミノ基及び-CO2PhNO2よりなる群から選択される一種以上である。ここで、Phは、o-、m-又はp-フェニレン基を表す。多分岐型ポリマーの中で、求核性官能基の組成は、同一であっても、異なっても良いが、同一である方が好ましい。官能基の組成が同一であることによって、架橋結合を形成する直鎖状ポリマーの求電子性官能基との反応性が均一になり、均一な立体構造を有するゲルを得やすくなる。
側鎖及び/末端に1以上のチオール基を有し、ポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマーの例として、末端にチオール基を有する下記式(II)で表される化合物が挙げられる。
上記式(II)中、n11~n14は、それぞれ同一でも又は異なっても良い。n11~n14の値が近いほど、均一な立体構造をとることができ、高強度となるので好ましく、同一であることが特に好ましい。n11~n14の値が高過ぎるとゲルの強度が弱くなり、n11~n14の値が低過ぎると化合物の立体障害によりゲルが形成されにくい。そのため、n11~n14は、25以上250以下の値であることが好ましく、35以上180以下がより好ましく、50以上115以下がさらに好ましく、50以上60以下が特に好ましい。そして、求核性官能基を有する多分岐型ポリマーの重量平均分子量は、5×103以上5×104以下であることが好ましく、7.5×103以上3×104以下であることがより好ましく、1×104以上2×104以下であることがさらに好ましい。
上記式(II)中、R11~R14は、官能基とコア部分をつなぐリンカー部位である。R11~R14は、それぞれ同一でも異なっても良いが、均一な立体構造を有する高強度なゲルを製造するためには同一であることが好ましい。式(II)中、R11~R14は、それぞれ同一又は異なり、C1~C7アルキレン基、C2~C7アルケニレン基、-NH-R15-、-CO-R15-、-R16-O-R17-、-R16-NH-R17-、-R16-CO2-R17-、-R16-CO2-NH-R17-、-R16-CO-R17-、R16-NH-CO-R17-又は-R16-CO-NH-R17-等である。ここで、R15はC1~C7アルキレン基を示す。R16はC1~C3アルキレン基を示す。R17はC1~C5アルキレン基を示す。
ここで、「C1~C7アルキレン基」とは、分岐を有しても良い炭素数が1以上7以下のアルキレン基を意味し、直鎖C1~C7アルキレン基又は1つもしくは2つ以上の分岐を有するC2~C7アルキレン基(分岐を含む炭素数が1以上7以下)を意味する。例として、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基等が挙げられる。より具体的には、-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-CH(CH3)-、-(CH2)3-、-(CH(CH3))2-、-(CH2)2-CH(CH3)-、-(CH2)3-CH(CH3)-、-(CH2)2-CH(C2H5)-、-(CH2)6-、-(CH2)2-C(C2H5)2-、及び-(CH2)3C(CH3)2CH2-等を挙げることができる。
「C2~C7アルケニレン基」とは、鎖中に1個もしくは2個以上の二重結合を有する直鎖状又は分枝鎖状の炭素原子数2~7個のアルケニレン基であり、例えば、前記アルキレン基から隣り合った炭素原子の水素原子の2~5個を除いてできる、二重結合を有する2価基が挙げられる。
本明細書において、アルキレン基及びアルケニレン基は、任意の置換基を1個以上有していても良い。そのような置換基として、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子(フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれであっても良い)、アミノ基、モノもしくはジ置換アミノ基、置換シリル基、アシル基、又はアリール基等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。2個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていても良い。
また、本明細書において、ある官能基について「置換基を有していても良い」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、2個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていても良い。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していても良い。
<直鎖状ポリマー>
多分岐型ポリマーと架橋反応によりハイドロゲルを形成する直鎖状ポリマーは、側鎖及び/又は末端に2以上の求核性官能基又は求電子性官能基を含む。架橋させるため、多分岐型ポリマーが求電子性官能基を有する場合は、直鎖状ポリマーは求核性官能基を有し、多分岐型ポリマーが求核性官能基を有する場合は、直鎖状ポリマーは求電子性官能基を有する。求電子性官能基及び求核性官能基の内容は、上述の多分岐型ポリマーの場合と同様である。
多分岐型ポリマーと架橋反応によりハイドロゲルを形成する直鎖状ポリマーは、側鎖及び/又は末端に2以上の求核性官能基又は求電子性官能基を含む。架橋させるため、多分岐型ポリマーが求電子性官能基を有する場合は、直鎖状ポリマーは求核性官能基を有し、多分岐型ポリマーが求核性官能基を有する場合は、直鎖状ポリマーは求電子性官能基を有する。求電子性官能基及び求核性官能基の内容は、上述の多分岐型ポリマーの場合と同様である。
多分岐型ポリマーと直鎖状ポリマーにおける求核性官能基と求電子性官能基のモル比は、0.5:1~1.5:1の範囲内であることが好ましい。当該官能基はそれぞれの成分が1:1のモル比で反応して架橋し得るので、混合モル比は1:1に近いほど好ましいが、高い強度のハイドロゲルを得るためには求核性官能基:求電子性官能基=0.8:1~1.2:1の範囲内であることが特に好ましい。これらの官能基は、多分岐型ポリマー及び直鎖状ポリマーのそれぞれの末端に存在することがさらに好ましい。好ましい態様において、混合比が異なる2種類以上のゲル前駆体を一旦形成させた上で、かかるゲル前駆体をさらに架橋させて目的のハイドロゲルを得ることもできる。
直鎖状ポリマーは、タンパク質、ペプチド又は多糖類である。タンパク質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、コラーゲン、フィブリン、アルブミン、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、エンタクチン、エラスチン及びそれらに由来する化合物等が挙げられる。特に、直鎖状ポリマーとしてゼラチンを用いることが好ましい。また、ペプチドは、アミノ酸の2残基以上がペプチド結合(アミド結合)を介して重合したものである。適用可能なペプチドとしては、コラーゲンペプチド等が挙げられる。ペプチドは、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド(アミノ酸が約10個程度のもの)、ポリペプチド(アミノ酸が数十~数百個のもの)のいずれであっても良い。さらに、多糖類としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、セルロース、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸、デンプン、ペクチン等が挙げられる。これらの直鎖状ポリマーは、いずれか1種を単独で使用しても良いし、2種以上を併用しても良い。また、プロテオグリカン等のタンパク質と糖の複合体も適用可能である。直鎖状ポリマーの分子量は、ハイドロゲル内部に存在し得る範囲のものであれば特に制限はされないが、好ましくは、分子量が100~500000であることができる。側鎖及び/又は末端に2以上の求核性官能基又は求電子性官能基を含む直鎖状ポリマーとして、側鎖にチオール基を有するゼラチンを下記に示す。
<細胞>
本実施形態において、ハイドロゲルは細胞を含むことができる。本実施形態のハイドロゲルは、ゲルの造形性に優れ、また直鎖状ポリマーに起因して細胞接着性を有し、ハイドロゲル中において細胞の長期培養が可能である。細胞の種類等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、分類学的に、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、全ての細胞を使用することができる。
本実施形態において、ハイドロゲルは細胞を含むことができる。本実施形態のハイドロゲルは、ゲルの造形性に優れ、また直鎖状ポリマーに起因して細胞接着性を有し、ハイドロゲル中において細胞の長期培養が可能である。細胞の種類等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、分類学的に、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、全ての細胞を使用することができる。
真核細胞としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌等が挙げられる。これらは、いずれか1種を単独で使用しても良く、2種以上を併用しても良い。これらの中でも、動物細胞が好ましく、前記細胞が細胞集合体を形成する場合は、細胞と細胞とが互いに接着し、物理化学的な処理を行わなければ単離しない程度の細胞接着性を有する接着性細胞であることがより好ましい。
接着性細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分化した細胞、未分化の細胞等が挙げられる。
分化した細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞;星細胞;クッパー細胞;血管内皮細胞;類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞;線維芽細胞;骨芽細胞;砕骨細胞;歯根膜由来細胞;表皮角化細胞等の表皮細胞;気管上皮細胞;消化管上皮細胞;子宮頸部上皮細胞;角膜上皮細胞等の上皮細胞;乳腺細胞;ペリサイト;平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞;腎細胞;膵ランゲルハンス島細胞;末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞;軟骨細胞;骨細胞等が挙げられる。神経細胞を含むハイドロゲルでは、前記接着性細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でも良く、又はそれらを何代か継代させたものでも良い。
未分化の細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞;単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞;iPS細胞等が挙げられる。
原核細胞としては、例えば、真正細菌、古細菌等が挙げられる。
細胞の具体例として、正常ヒト皮膚線維芽細胞等が挙げられる。正常ヒト皮膚線維芽細胞としては、市販品を用いることができ、前記市販品としては、例えば、商品名:CC2507(Lonza社製)等が挙げられる。
また、細胞として、予め培養工程を経た細胞凝集体(スフェロイド)を含んでいても良い。細胞凝集体を含むハイドロゲルでは、細胞が分散状態でハイドロゲルに存在するよりも優れた成熟、分化を行うことができる。細胞凝集体のサイズは、特に限定されるものではないが、例えば直径が100μm以下であることが好ましい。
細胞として、少なくとも1種類以上の細胞を含むことができる。2種類以上の細胞を含むハイドロゲルでは、細胞種間の相互作用により、単一の細胞種よりも細胞の機能発現を促した細胞培養体を作製することが可能である。
細胞を包むハイドロゲルには、必要に応じて細胞外基質を添加しても良い。細胞外基質は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、フィブリン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン等の細胞外基質タンパク質、糖タンパク質や、細胞に応じて肝細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子等の増殖・成長因子が挙げられる。これらは、いずれか1種を単独で使用しても良いし、2種以上を併用しても良い。これらによって細胞の接着や増殖、分化が促されることが知られており、ハイドロゲルに含ませることで、形成したハイドロゲル内の細胞の形態を変化させるトリガーとして機能させることができる。
以上のようなハイドロゲルは、ポリエチレングリコールを骨格とし側鎖及び/又は末端に1以上の求電子性官能基又は求核性官能基を含む多分岐型ポリマーを含む第1溶液と、側鎖及び/又は末端に2以上の求核性官能基又は求電子性官能基を含む直鎖状ポリマーを含む第2溶液とから構成されるインクから形成することができる。具体的には、第1溶液と第2溶液とを混合して架橋させることにより、ハイドロゲルを得ることができる。また、第2溶液を第1溶液へ混合したうえで該第1溶液と第2溶液を混合させてよく、あらかじめ混合する第2溶液の量は著しい増粘やゲル化がしない範囲であれば適宜選択できる。同様に第1溶液を第2溶液へ混合したうえで第1溶液と該第2溶液を混合させてよい。
上記インクは、インクジェット用インクとして用い、第1溶液又は第2溶液をインクジェット法にて吐出し、他方の第2溶液又は第1溶液に対して着弾させることで、第1溶液と第2溶液を混合しハイドロゲルを形成することができる。着弾させる目標である第2溶液又は第1溶液は、例えば容器内を満たす液体であっても良いし、予め基材上に塗布した液膜の状態であっても良い。あるいは、インクジェット法にて予め基材上に吐出された液滴の状態、あるいは連続的に吐出された多数の液滴同士が接触・合体してライン状等の種々の形状を有する液膜状態であっても良い。ここで、「インクジェット」とは、液室中に収納された溶液をインクジェットヘッドの吐出孔(ノズル)から液滴にして射出し、対象部位に着弾させる手段である。前記吐出方法は、前記吐出孔からの微小な溶液(液滴)を吐出することが可能なため、高精度な三次元構造体を作製することができる。インクジェット法を用いることにより、例えば、500μm以下の解像度で第1溶液と第2溶液とを混合することができる。
この際、インクジェット用インクの第1溶液及び第2溶液のいずれか一方又は両方が、上述の細胞を含むことができる。例えば、基材上の細胞を含まない第2溶液に対し、細胞を含む第1溶液をインクジェット法により吐出し、細胞を含むハイドロゲル(細胞培養体)を形成することができる。
細胞を含むインクジェット用インクから細胞培養体を作製する場合、表面にパターン構造を有する基材上において第1溶液と第2溶液を混合することができる。パターン構造としては、周期的又は任意のパターンで形成された凹凸構造が挙げられる。なお、パターン構造は、基材の表面自体が凹凸等のパターンを有するように形成されていても良いし、平らな基材の表面上に、例えば細胞を含まない上述のハイドロゲルが所定のパターンで配置されていても良い。パターン構造状に細胞培養体を形成することにより、例えばハイドロゲル内における細胞の遊走・伸展状態がパターン構造によってどのような影響を受けるか等に関して実験を行うことができる。
また、細胞を含むインクジェット用インクから形成した細胞培養体は、必要に応じて加温し、別の細胞培養体と接触させることにより、細胞培養体同士を合体させることができる。加温する場合の温度は、ハイドロゲルの組成や細胞の種類によっても異なるが、細胞培養体に含まれる細胞に過度のダメージを与えてしまう温度でなければ特に問題はなく、例えば0℃以上40℃以下であることが好ましい。部分的かつごく短時間であれば40℃以上に上げても問題ない。
本発明はまた、ポリエチレングリコールを骨格とし、側鎖及び/又は末端に1以上の求核性官能基又は求電子性官能基のいずれか一方の官能基を有する多分岐型ポリマーを含む第1溶液を保持させる保持工程、及び側鎖及び/又は末端に1以上の求核性官能基又は求電子性官能基の他方の官能基を有する直鎖状ポリマーを含む第2溶液を前記保持された第1溶液と接触するように液滴吐出装置で吐出した液滴を着弾させてなる1以上のハイドロゲルを形成するゲル形成工程を含む、細胞培養体の製造方法にも関する。ここで、多分岐型ポリマー及び直鎖状ポリマーについては、ハイドロゲルについて上述したとおりである。
また、第1溶液または第2溶液の少なくとも一方には、細胞が含まれてよい。含まれる細胞としては、上述したとおりである。
また、第1溶液または第2溶液の少なくとも一方には、細胞が含まれてよい。含まれる細胞としては、上述したとおりである。
保持工程は、支持体やハイドロゲル等の上に第1溶液を保持させる工程である。例えば、第1溶液中に支持体を浸漬する等により、第1溶液を支持体に含浸させて、その表面全体及び/又は内部に第1溶液を保持させても良いし、次工程で詳述するインクジェット法等の液滴吐出装置による吐出方法で第1溶液を吐出して、支持体表面やハイドロゲル表面の特定の位置に第1溶液を固着保持させても良い。また、細胞層を支持体として用いて第1溶液を保持させても良い。ここで「支持体」とは、第1溶液を保持する部材である。支持体の材質、細胞の活性や増殖を阻害しないものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。好ましくは細胞が固着可能な材質、又は細胞接着性材料が吸着しやすい材質である。
支持体は、有機材料、無機材料に大別できる。有機材料には、例えば、合成樹脂、シリコーン系材料、天然樹脂、セルロース構造体(木材、紙等)、キチン質構造体、天然繊維(絹、毛、木綿、海綿質繊維等)等が挙げられる。また、基板上等に固着した細胞層も有機材料系の支持体となり得る。合成樹脂には、例えば、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリスチレン(PS)、ポリカーボネート(PC)、TAC(トリアセチルセルロース)、ポリイミド(PI)、ナイロン(Ny)、低密度ポリエチレン(LDPE)、中密度ポリエチレン(MDPE)、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、又はウレタンアクリレート等のアクリル系材料等が、また、シリコーン系材料には、例えばポリジメチルシロキサン(PDMS)等が含まれる。無機材料には、例えば、ガラス(グラスファイバーを含む)、陶器(セラミックス、ホーロー等)、金属、炭素繊維、リン酸カルシウム構造体(骨、歯、貝殻等)等が挙げられる。
上記材料は、単独で使用してもよく、2種以上の、有機材料、無機又は有機材料と無機材料を組み合わせて併用してもよい。例えば、炭素繊維若しくはグラスファイバーと合成樹脂とを組み合わせた繊維強化プラスチック(FRP)等が挙げられる。
支持体の大きさについては特に制限はない。目的に応じて適宜選択することができる。支持体の形状については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ディッシュ、マルチプレート、フラスコ、メンブレン、セルインサート等の立体形状であってもよいし、ガラスプレート、スライドグラス、カバーグラス等の平板状又は平膜状であってもよい。
支持体の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、多孔質構造、メッシュ構造、凹凸構造、ハニカム構造等が挙げられる。多孔質構造、メッシュ構造等は、多量の溶液を保持することができるため、支持体として特に好ましい。
ゲル形成工程は、保持工程において保持された第1溶液と接触するように第2溶液を液滴吐出装置で着弾させることで、第1溶液と第2溶液が混合することにより、それぞれに含まれる多分岐型ポリマー及び直鎖型ポリマーとが有する求核性官能基及び求電子性反応基が反応して結合し、ハイドロゲルが形成される工程である。「接触するように」とは、第1溶液と第2溶液が接触を介して混合させることを意味する。
「液滴吐出装置」とは、液室中に収納された溶液を液滴にして射出し、対象部位に着弾させる手段である。吐出装置の吐出方法としてはインクジェット法、ゲル押し出し法のディスペンサ法等が挙げられる。インクジェット法では、溶液が吐出孔(ノズル)から射出される。吐出方法は、吐出孔からの微小な溶液(液滴と称すことがある)を吐出することが可能なため、高精度な三次元構造体を作製することができる。この際、液滴吐出装置より吐出される液滴には、細胞を含んでも含まなくてもよい。
吐出される液滴の量は、任意の液量とすることができる。好ましくは、9pL以上、15pL以上、20pL以上、30pL以上、40pL以上、50pL以上、60pL以上、70pL以上、80pL以上、90pL以上、又は100pL以上、そして900pL以下、800pL以下、700pL以下、600pL以下、500pL以下、400pL以下、300pL以下である。
「着弾」とは、溶液を標的部位に接触させることをいう。これは、吐出方法により標的部位に対して液滴を吐出することで達成される。
第2溶液が細胞を含む場合、細胞の含有量は、5×105cell/mL~1×108cell/mLが好ましく、1×106cell/mL~5×107cell/mLはより好ましい。この含有量よりも細胞密度が低いと適切な細胞数を含むハイドロゲルが形成しづらく、また逆に高いとインクジェット法等の吐出方法による溶液吐出が困難になる。
溶液を吐出する位置は、特に制限はしない。所望の標的位置に溶液が着弾するように吐出すればよい。また、それぞれの着弾部位は離れていてもよいし、一部が接触又は重なっていてもよい。
ゲル形成は、求核性官能基と求電子性官能基を有するポリマー同士の反応によるため、第2溶液が第1溶液に着弾することでハイドロゲルが形成される。第2溶液を液滴吐出装置で吐出させた場合、1度の着弾で、ハイドロゲルは、限定はしないが、通常、ドット状ハイドロゲルとして形成され得る。本明細書において「ドット(形)状」とは、点状の形状を言う。したがって、真円形状や半球形状に限られず、略円形状や略半球形状の他、多角形状、略多角形状、不定形、又はそれらの組み合わせ等、いずれの形状であってもよい。また、ドット(形)状は、三次元構造的には、所定の長さと厚みを有していればよい。第2溶液が複数回吐出される場合は、ドット状ハイドロゲルを最小単位とする多彩な形状のハイドロゲルが形成される。
1回の着弾による架橋反応で形成されるハイドロゲル、すなわちドット状ハイドロゲルの体積は、第2溶液の同一箇所への吐出回数に依存する。また、吐出孔径が大きいほど、同一箇所への吐出回数が増えるほどドット状ハイドロゲルの体積は大きくなる。したがって、同一箇所への吐出回数、吐出孔径を変えることで、ドット状ハイドロゲルの体積を調製することができる。限定はしないが、本明細書におけるドット状ハイドロゲルの体積は、9pL以上、15pL以上、20pL以上、30pL以上、40pL以上、50pL以上、60pL以上、70pL以上、80pL以上、90pL以上、又は100pL以上、そして900pL以下、800pL以下、700pL以下、600pL以下、500pL以下、400pL以下、300pL以下が好ましい。ドット状ハイドロゲルの直径は、限定はしないが、10μm以上300μm以下、厚さは5μm以上150μm以下の範囲であればよい。
本工程では、1度の工程で第2溶液が任意回数吐出されるため、複数個のドット状ハイドロゲルが形成されることがある。ドット状ハイドロゲルは、全部又は一部が接触していてもよい。複数のドット状ハイドロゲルが連なって配置されることで、点状のみならず、任意形状のハイドロゲルを形成できる。形状は、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、1軸方向にドットを並べることで、線状ハイドロゲルを形成することができる。また、線状ハイドロゲルを隙間なく同一平面状に並べることで膜状(面状)ハイドロゲルを形成することもできる。ドット状ハイドロゲル同士の融合や隔離を制御することで、線状や膜状のハイドロゲルになると、各ドット状ハイドロゲル中に含まれる細胞の移動、伸展を制御、抑制することができる。更に、膜状ハイドロゲルを形成することにより、ゲルを容易に積層できるようになる。
また、溶液に細胞を含有させた場合、ドット状ハイドロゲル内に含まれる細胞の数は含有させた濃度に依存するため、ドット状ハイドロゲルを形成する回数で細胞密度を制御することができる。
<培地>
作製した細胞培養体は、適当な培地中に配置することにより、ハイドロゲル内の細胞を長期培養することができる。培地は、細胞培養体の形状維持と細胞の生存維持に必要な成分を含み、乾燥を防ぎ、浸透圧等の外部環境を整える溶液である。前記培地としては、特に制限はなく、公知の培地の中から、用途に応じて適宜選択すれば良い。
作製した細胞培養体は、適当な培地中に配置することにより、ハイドロゲル内の細胞を長期培養することができる。培地は、細胞培養体の形状維持と細胞の生存維持に必要な成分を含み、乾燥を防ぎ、浸透圧等の外部環境を整える溶液である。前記培地としては、特に制限はなく、公知の培地の中から、用途に応じて適宜選択すれば良い。
前記培地としては、例えば、天然培地、半合成培地、合成培地等の組成により分類される培地;半固形培地、液体培地、粉末培地(以下、「粉培地」とも称することがある)等の形状により分類される培地等が挙げられる。これらは、いずれか1種を単独で使用しても良く、2種以上を併用しても良い。細胞が動物由来である場合、動物細胞の培養に用いられる培地であればいずれも用いることができる。
動物細胞の培養に用いられる培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium;D-MEM)、ハムF12培地(Ham’s Nutrient Mixture F12)、D-MEM/F12培地、マッコイ5A培地(McCoy’s 5A medium)、イーグルMEM培地(Eagles’s Minimum Essential Medium;EMEM)、αMEM培地(alpha Modified Eagles’s Minimum Essential Medium;αMEM)、MEM培地(Minimum Essential Medium)、RPMI1640培地、イスコフ改変ダルベッコ培地(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium;IMDM)、MCDB131培地、ウィリアム培地E、IPL41培地、Fischer’s培地、StemPro34(インビトロジェン社製)、X-VIVO 10(ケンブレックス社製)、X-VIVO 15(ケンブレックス社製)、HPGM(ケンブレックス社製)、StemSpan H3000(ステムセルテクノロジー社製)、StemSpanSFEM(ステムセルテクノロジー社製)、StemlineII(シグマアルドリッチ社製)、QBSF-60(クオリティバイオロジカル社製)、StemProhESCSFM(インビトロジェン社製)、Essential8(登録商標)培地(ギブコ社製)、Stemfit AK02N(味の素社製)、Stemfit Basic 02(味の素社製)、mTeSR1或いは2培地(ステムセルテクノロジー社製)、リプロFFあるいはリプロFF2(リプロセル社製)、PSGro hESC/iPSC培地(システムバイオサイエンス社製)、NutriStem(登録商標)培地(バイオロジカルインダストリーズ社製)、CSTI-7培地(細胞科学研究所社製)、MesenPRO RS培地(ギブコ社製)、MF-Medium(登録商標)間葉系幹細胞増殖培地(東洋紡株式会社製)、Sf-900II(インビトロジェン社製)、Opti-Pro(インビトロジェン社製)等が挙げられる。これらは、いずれか1種を単独で使用しても良く、2種以上を併用しても良い。
培地中の二酸化炭素濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、2%以上5%以下が好ましい。前記二酸化炭素濃度が2%以上5%以下であると、細胞を好適に培養させることができる。
次に、本発明に係る細胞含有ゲル粒子の一実施形態を図2に基づき説明する。図2に示すように、本実施形態の細胞含有ゲル粒子5は、ポリエチレングリコールを骨格とし側鎖及び/又は末端に1以上の求電子性官能基又は求核性官能基を含む多分岐型ポリマーと、側鎖及び/又は末端に2以上の求核性官能基又は求電子性官能基を含む直鎖状ポリマーとが架橋してなるハイドロゲル50により、細胞51が包まれている。以下、細胞含有ゲル粒子1を構成する各成分について説明する。
<多分岐型ポリマー>
本実施形態における多分岐型ポリマーは、複数のポリエチレングリコール分岐を有するポリマーであって、互いに架橋して網目構造ネットワークを形成する。好ましい態様において、多分岐型ポリマーは4つのポリエチレングリコール分岐を有し、このようなポリエチレングリコールを骨格とする四分岐型ポリマーは、Tetra-PEGとして知られている。Tetra-PEGは、側鎖及び/又は末端に1以上の求電子性の官能基又は求核性の官能基を有している。これらの官能基を介して直鎖状ポリマーと架橋し、網目構造ネットワークが構築される。
本実施形態における多分岐型ポリマーは、複数のポリエチレングリコール分岐を有するポリマーであって、互いに架橋して網目構造ネットワークを形成する。好ましい態様において、多分岐型ポリマーは4つのポリエチレングリコール分岐を有し、このようなポリエチレングリコールを骨格とする四分岐型ポリマーは、Tetra-PEGとして知られている。Tetra-PEGは、側鎖及び/又は末端に1以上の求電子性の官能基又は求核性の官能基を有している。これらの官能基を介して直鎖状ポリマーと架橋し、網目構造ネットワークが構築される。
多分岐型ポリマーにおける求電子性官能基としては、マレイミジル基、N-ヒドロキシ-スクシンイミジル(NHS)基、スルホスクシンイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基及びニトロフェニル基よりなる群から選択される一種以上である。多分岐型ポリマーの中で、求電子性官能基の組成は、同一であっても、異なっても良いが、同一である方が好ましい。官能基の組成が同一であることによって、架橋結合を形成する直鎖状ポリマーの求核性官能基との反応性が均一になり、均一な立体構造を有するゲルを得やすくなる。
側鎖及び/又は末端に1以上のマレイミジル基を有し、ポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマーの例として、末端にマレイミジル基を有する下記式(I)で表される化合物が挙げられる。
上記式(I)中、n21~n24は、それぞれ同一でも又は異なっても良い。n21~n24の値は近いほど、ゲルは均一な立体構造をとることができ、高強度となるので好ましく、同一であることが特に好ましい。n21~n24の値が高過ぎるとゲルの強度が弱くなり、n21~n24の値が低過ぎると化合物の立体障害によりゲルが形成されにくい。そのため、n21~n24は、5以上300以下の値であることが適当であり、20以上250以下であることが好ましく、30以上180以下がより好ましく、45以上115以下がさらに好ましく、45以上55以下であれば特に好ましい。求電子性官能基を有する多分岐型ポリマーの重量平均分子量は、5×103以上5×104以下であることが好ましく、7.5×103以上3×104以下であることがより好ましく、1×104以上2×104以下であることがさらに好ましい。
上記式(I)中、R21~R24は、官能基とコア部分をつなぐリンカー部位である。R21~R24は、それぞれ同一でも異なっても良いが、均一な立体構造を有する高強度なゲルを製造するためには同一であることが好ましい。式(I)中、R21~R24は、それぞれ同一又は異なり、C1~C7アルキレン基、C2~C7アルケニレン基、-NH-R25-、-CO-R25-、-R26-O-R27-、-R26-NH-R27-、-R26-CO2-R27-、-R26-CO2-NH-R27-、-R26-CO-R27-、-R26-NH-CO-R27-、又は-R26-CO-NH-R27-等である。ここで、R25はC1~C7アルキレン基を示す。R26はC1~C3アルキレン基を示す。R27はC1~C5アルキレン基を示す。
また、多分岐型ポリマーにおける求核性官能基としては、チオール基、アミノ基及び-CO2PhNO2よりなる群から選択される一種以上である。多分岐型ポリマーの中で、求核性官能基の組成は、同一であっても、異なっても良いが、同一である方が好ましい。官能基の組成が同一であることによって、架橋結合を形成する直鎖状ポリマーの求電子性官能基との反応性が均一になり、均一な立体構造を有するゲルを得やすくなる。
側鎖及び/末端に1以上のチオール基を有し、ポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマーの例として、末端にチオール基を有する下記式(II)で表される化合物が挙げられる。
上記式(II)中、n11~n14は、それぞれ同一でも又は異なっても良い。n11~n14の値が近いほど、均一な立体構造をとることができ、高強度となるので好ましく、同一であることが特に好ましい。n11~n14の値が高過ぎるとゲルの強度が弱くなり、n11~n14の値が低過ぎると化合物の立体障害によりゲルが形成されにくい。そのため、n11~n14は、25以上250以下の値であることが好ましく、35以上180以下がより好ましく、50以上115以下がさらに好ましく、50以上60以下が特に好ましい。そして、求核性官能基を有する多分岐型ポリマーの重量平均分子量は、5×103以上5×104以下であることが好ましく、7.5×103以上3×104以下であることがより好ましく、1×104以上2×104以下であることがさらに好ましい。
上記式(II)中、R11~R14は、官能基とコア部分をつなぐリンカー部位である。R11~R14は、それぞれ同一でも異なっても良いが、均一な立体構造を有する高強度なゲルを製造するためには同一であることが好ましい。式(II)中、R11~R14は、それぞれ同一又は異なり、C1~C7アルキレン基、C2~C7アルケニレン基、-NH-R15-、-CO-R15-、-R16-O-R17-、-R16-NH-R17-、-R16-CO2-R17-、-R16-CO2-NH-R17-、-R16-CO-R17-、R16-NH-CO-R17-又は-R16-CO-NH-R17-等である。ここで、R15はC1~C7アルキレン基を示す。R16はC1~C3アルキレン基を示す。R17はC1~C5アルキレン基を示す。
ここで、「C1~C7アルキレン基」とは、分岐を有しても良い炭素数が1以上7以下のアルキレン基を意味し、直鎖C1~C7アルキレン基又は1つもしくは2つ以上の分岐を有するC2~C7アルキレン基(分岐を含む炭素数が1以上7以下)を意味する。例として、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基等が挙げられる。より具体的には、-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-CH(CH3)-、-(CH2)3-、-(CH(CH3))2-、-(CH2)2-CH(CH3)-、-(CH2)3-CH(CH3)-、-(CH2)2-CH(C2H5)-、-(CH2)6-、-(CH2)2-C(C2H5)2-、及び-(CH2)3C(CH3)2CH2-等を挙げることができる。
「C2~C7アルケニレン基」とは、鎖中に1個もしくは2個以上の二重結合を有する直鎖状又は分枝鎖状の炭素原子数2~7個のアルケニレン基であり、例えば、前記アルキレン基から隣り合った炭素原子の水素原子の2~5個を除いてできる、二重結合を有する2価基が挙げられる。
本明細書において、アルキレン基及びアルケニレン基は、任意の置換基を1個以上有していても良い。そのような置換基として、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子(フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれであっても良い)、アミノ基、モノもしくはジ置換アミノ基、置換シリル基、アシル基、又はアリール基等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。2個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていても良い。
また、本明細書において、ある官能基について「置換基を有していても良い」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、2個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていても良い。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していても良い。
<直鎖状ポリマー>
多分岐型ポリマーと架橋反応によりハイドロゲルを形成する直鎖状ポリマーは、側鎖及び/又は末端に2以上の求核性官能基又は求電子性官能基を含む。架橋させるため、多分岐型ポリマーが求電子性官能基を有する場合は、直鎖状ポリマーは求核性官能基を有し、多分岐型ポリマーが求核性官能基を有する場合は、直鎖状ポリマーは求電子性官能基を有する。求電子性官能基及び求核性官能基の内容は、上述の多分岐型ポリマーの場合と同様である。
多分岐型ポリマーと架橋反応によりハイドロゲルを形成する直鎖状ポリマーは、側鎖及び/又は末端に2以上の求核性官能基又は求電子性官能基を含む。架橋させるため、多分岐型ポリマーが求電子性官能基を有する場合は、直鎖状ポリマーは求核性官能基を有し、多分岐型ポリマーが求核性官能基を有する場合は、直鎖状ポリマーは求電子性官能基を有する。求電子性官能基及び求核性官能基の内容は、上述の多分岐型ポリマーの場合と同様である。
直鎖状ポリマーは、タンパク質、ペプチド又は多糖類である。タンパク質としては、細胞に悪影響を及ぼさない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、コラーゲン、フィブリン、アルブミン等が挙げられる。特に、直鎖状ポリマーとしてゼラチンを用いることが好ましい。また、ペプチドは、アミノ酸の2残基以上がペプチド結合(アミド結合)を介して重合したものである。ペプチドは、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド(アミノ酸が約10個程度のもの)、ポリペプチド(アミノ酸が数十~数百個のもの)のいずれであっても良いが、常温常圧下でゲル化しないことが好ましい。さらに、多糖類としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、セルロース、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸、デンプン、ペクチン等が挙げられる。これらの直鎖状ポリマーは、いずれか1種を単独で使用しても良いし、2種以上を併用しても良い。側鎖及び/又は末端に2以上の求核性官能基又は求電子性官能基を含む直鎖状ポリマーとして、側鎖にチオール基を有するゼラチンを下記に示す。
<細胞>
細胞の種類等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、分類学的に、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、全ての細胞を使用することができる。
細胞の種類等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、分類学的に、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、全ての細胞を使用することができる。
真核細胞としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌等が挙げられる。これらは、いずれか1種を単独で使用しても良く、2種以上を併用しても良い。これらの中でも、動物細胞が好ましく、前記細胞が細胞集合体を形成する場合は、細胞と細胞とが互いに接着し、物理化学的な処理を行わなければ単離しない程度の細胞接着性を有する接着性細胞であることがより好ましい。
接着性細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分化した細胞、未分化の細胞等が挙げられる。
分化した細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞;星細胞;クッパー細胞;血管内皮細胞;類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞;線維芽細胞;骨芽細胞;砕骨細胞;歯根膜由来細胞;表皮角化細胞等の表皮細胞;気管上皮細胞;消化管上皮細胞;子宮頸部上皮細胞;角膜上皮細胞等の上皮細胞;乳腺細胞;ペリサイト;平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞;腎細胞;膵ランゲルハンス島細胞;末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞;軟骨細胞;骨細胞等が挙げられる。前記接着性細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でも良く、又はそれらを何代か継代させたものでも良い。
未分化の細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞;単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞;iPS細胞等が挙げられる。
原核細胞としては、例えば、真正細菌、古細菌等が挙げられる。
細胞の具体例として、正常ヒト皮膚線維芽細胞等が挙げられる。正常ヒト皮膚線維芽細胞としては、市販品を用いることができ、前記市販品としては、例えば、商品名:CC2507(Lonza社製)等が挙げられる。
<細胞含有ゲル粒子>
細胞含有微小ゲル粒子はin vitroにおいて形成されるものであり、そのために用途に応じて機能発現、細胞生存等の維持に必要な培養容器、培地、及びその他公知の材料を適宜使用する。前記細胞含有ゲル粒子は1又は複数の細胞を含み、球形もしくは楕円体の形状であるものとする。含有される細胞種は複数種類含まれていてもよく、培養容器等の基板に接していてもよい。細胞の密度については特に制限はなく、細胞同士が直接結合していても良い。細胞周囲に存在するハイドロゲルは多分岐型ポリマー及び直鎖状ポリマー間のクロスエンドカップリング反応によって得られたゲルである。ゲル濃度(ハイドロゲルにおけるゲル分子の質量%濃度(w/w))は0.6%~8%が好ましい。
細胞含有微小ゲル粒子はin vitroにおいて形成されるものであり、そのために用途に応じて機能発現、細胞生存等の維持に必要な培養容器、培地、及びその他公知の材料を適宜使用する。前記細胞含有ゲル粒子は1又は複数の細胞を含み、球形もしくは楕円体の形状であるものとする。含有される細胞種は複数種類含まれていてもよく、培養容器等の基板に接していてもよい。細胞の密度については特に制限はなく、細胞同士が直接結合していても良い。細胞周囲に存在するハイドロゲルは多分岐型ポリマー及び直鎖状ポリマー間のクロスエンドカップリング反応によって得られたゲルである。ゲル濃度(ハイドロゲルにおけるゲル分子の質量%濃度(w/w))は0.6%~8%が好ましい。
細胞含有ゲル粒子の直径は、細胞の種類や、細胞を培養する状態に応じて適宜設定することができるが、60μm~500μmの範囲であると、ハイドロゲル中に含まれる細胞を観察しやすいため好ましい。なお、ここで直径とは、細胞含有ゲル粒子を顕微鏡で観察し、顕微鏡像におけるゲル粒子の長軸と短軸の平均値をいう。
細胞51を包むハイドロゲル50には、必要に応じて細胞外基質を添加しても良い。細胞外基質は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、フィブリン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン等の細胞外基質タンパク質、糖タンパク質や、細胞に応じて肝細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子等の増殖・成長因子が挙げられる。これらは、いずれか1種を単独で使用しても良いし、2種以上を併用しても良い。これらによって細胞の接着や増殖、分化が促されることが知られており、ハイドロゲル50に含ませることで、形成したゲル粒子内の細胞の形態を変化させるトリガーとして機能させることができる。
<細胞含有ゲル粒子の作製方法>
上述の細胞含有ゲル粒子の作製方法について、図3に基づき説明する。本実施形態の細胞含有ゲル粒子62は、多分岐型ポリマー及び細胞を含む第1溶液60の液滴を、培養容器63内に入れられた、細胞を含まず直鎖状ポリマーを含む第2溶液61に混合することにより作製することができる。あるいは、細胞は第1溶液ではなく第2溶液に含み、第2溶液の液滴を、細胞を含まない第1溶液に混合しても良い。
上述の細胞含有ゲル粒子の作製方法について、図3に基づき説明する。本実施形態の細胞含有ゲル粒子62は、多分岐型ポリマー及び細胞を含む第1溶液60の液滴を、培養容器63内に入れられた、細胞を含まず直鎖状ポリマーを含む第2溶液61に混合することにより作製することができる。あるいは、細胞は第1溶液ではなく第2溶液に含み、第2溶液の液滴を、細胞を含まない第1溶液に混合しても良い。
<培養容器>
培養容器63は、細胞含有ゲル粒子の形成及び維持に必要な土台や支持体となる基材からなり、例えば樹脂製、ガラス製、金属製等の容器が挙げられる。基材の形状は平面状のみならず、穴が開いたもの、メッシュ状、凹凸のあるもの、ハニカム等が使用可能であり、用途に応じて適宜選択すれば良い。光透過性が高く、自己蛍光/発光しないマルチウェルタイプのカルチャープレートやインサート等を用いることが好ましい。
培養容器63は、細胞含有ゲル粒子の形成及び維持に必要な土台や支持体となる基材からなり、例えば樹脂製、ガラス製、金属製等の容器が挙げられる。基材の形状は平面状のみならず、穴が開いたもの、メッシュ状、凹凸のあるもの、ハニカム等が使用可能であり、用途に応じて適宜選択すれば良い。光透過性が高く、自己蛍光/発光しないマルチウェルタイプのカルチャープレートやインサート等を用いることが好ましい。
図3の例では、第1溶液60と第2溶液61との架橋により形成される細胞含有ゲル粒子62が培養容器63内に充填された培地64中に存在しており、この状態で細胞培養を行うことができる。図3のように、細胞含有ゲル粒子62が培地64に囲まれた状態で行う細胞培養では、細胞1個であっても培養を行うことができ、細胞含有ゲル粒子62内で生存・伸展する細胞を観察可能である。また、神経細胞を用いる場合、神経突起が細胞含有ゲル粒子62内に留まる特徴がある。なお、図3の例では培地64や薬剤の出し入れのために培養容器63の上部が開いた形であるが、閉鎖系で環流培養が可能なものやマイクロ流路を持つチップ型等でも良い。
別の実施形態として、図4に示すように、細胞を含む第1溶液70の液滴を基板上の第2溶液71に滴下し、架橋反応により細胞含有ゲル粒子72を形成し、この細胞含有ゲル粒子72を培養容器73に接着させて保持させ、培養容器73を培地74で満たした状態で細胞培養を行うことができる。細胞含有ゲル粒子72を培養容器73に接触させた状態で細胞培養を行うことにより、浮遊細胞を接触条件で培養することができ、また、顕微鏡による観察もしやすいという利点がある。
<培地>
培養容器を満たす培地は、細胞含有ゲル粒子の形状維持と細胞の生存維持に必要な成分を含み、乾燥を防ぎ、浸透圧等の外部環境を整える溶液である。前記培地としては、特に制限はなく、公知の培地の中から、用途に応じて適宜選択すれば良い。
培養容器を満たす培地は、細胞含有ゲル粒子の形状維持と細胞の生存維持に必要な成分を含み、乾燥を防ぎ、浸透圧等の外部環境を整える溶液である。前記培地としては、特に制限はなく、公知の培地の中から、用途に応じて適宜選択すれば良い。
前記培地としては、例えば、天然培地、半合成培地、合成培地等の組成により分類される培地;半固形培地、液体培地、粉末培地(以下、「粉培地」とも称することがある)等の形状により分類される培地等が挙げられる。これらは、いずれか1種を単独で使用しても良く、2種以上を併用しても良い。細胞が動物由来である場合、動物細胞の培養に用いられる培地であればいずれも用いることができる。
動物細胞の培養に用いられる培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium;D-MEM)、ハムF12培地(Ham’s Nutrient Mixture F12)、D-MEM/F12培地、マッコイ5A培地(McCoy’s 5A medium)、イーグルMEM培地(Eagles’s Minimum Essential Medium;EMEM)、αMEM培地(alpha Modified Eagles’s Minimum Essential Medium;αMEM)、MEM培地(Minimum Essential Medium)、RPMI1640培地、イスコフ改変ダルベッコ培地(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium;IMDM)、MCDB131培地、ウィリアム培地E、IPL41培地、Fischer’s培地、StemPro34(インビトロジェン社製)、X-VIVO 10(ケンブレックス社製)、X-VIVO 15(ケンブレックス社製)、HPGM(ケンブレックス社製)、StemSpan H3000(ステムセルテクノロジー社製)、StemSpanSFEM(ステムセルテクノロジー社製)、StemlineII(シグマアルドリッチ社製)、QBSF-60(クオリティバイオロジカル社製)、StemProhESCSFM(インビトロジェン社製)、Essential8(登録商標)培地(ギブコ社製)、Stemfit AK02N(味の素社製)、Stemfit Basic 02(味の素社製)、mTeSR1或いは2培地(ステムセルテクノロジー社製)、リプロFFあるいはリプロFF2(リプロセル社製)、PSGro hESC/iPSC培地(システムバイオサイエンス社製)、NutriStem(登録商標)培地(バイオロジカルインダストリーズ社製)、CSTI-7培地(細胞科学研究所社製)、MesenPRO RS培地(ギブコ社製)、MF-Medium(登録商標)間葉系幹細胞増殖培地(東洋紡株式会社製)、Sf-900II(インビトロジェン社製)、Opti-Pro(インビトロジェン社製)等が挙げられる。これらは、いずれか1種を単独で使用しても良く、2種以上を併用しても良い。
培地中の二酸化炭素濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、2%以上5%以下が好ましい。前記二酸化炭素濃度が2%以上5%以下であると、細胞を好適に培養させることができる。
図5には、本発明に係る細胞評価プレートの一実施形態を示す。図5の細胞評価プレート8は、基板が多数のウェル80を有し、それぞれのウェル80内に細胞含有ゲル粒子81を備える。ウェルの数は特に限定されるものではなく、また個々の細胞含有ゲル粒子81は細胞やハイドロゲルの種類等に関して同じ組成であっても良いし、異なる組成であっても良い。このような細胞評価プレート8は、ハイスループットスクリーニングに好適に用いることができる。
以下、実施例及び比較例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
(実施例1)
(1)第1溶液の調製
Tetra-PEG-マレイミジル(SUNBRIGHT PTE-100MA、油化産業株式会社製)0.02gをリン酸緩衝生理食塩水(Life Technologies社製、以下、PBS(-)とも称する)1mlに溶解後、2%Tetra-PEG-マレイミジルを含む第1溶液を調製した。
(1)第1溶液の調製
Tetra-PEG-マレイミジル(SUNBRIGHT PTE-100MA、油化産業株式会社製)0.02gをリン酸緩衝生理食塩水(Life Technologies社製、以下、PBS(-)とも称する)1mlに溶解後、2%Tetra-PEG-マレイミジルを含む第1溶液を調製した。
(2)第2溶液の調製
ゼラチン-SH(Thiol functionalized gelatin、Sigma-Aldrich社製)0.05gにPBS(-)1mlを加え、37℃で一晩溶解し、5%ゼラチン-SHを含む第2溶液を調製した。
ゼラチン-SH(Thiol functionalized gelatin、Sigma-Aldrich社製)0.05gにPBS(-)1mlを加え、37℃で一晩溶解し、5%ゼラチン-SHを含む第2溶液を調製した。
(3)ハイドロゲルの作製
(2)で調整した第2溶液を96ウェルプレートに10μL滴下した後、その滴下した第2溶液に対して(1)で作製した第1溶液10μLを撹拌・混合してハイドロゲルを作製した。
(2)で調整した第2溶液を96ウェルプレートに10μL滴下した後、その滴下した第2溶液に対して(1)で作製した第1溶液10μLを撹拌・混合してハイドロゲルを作製した。
(4)神経細胞の播種
凍結保存されているグルタミン酸作動性神経細胞の入ったバイアルを37℃温浴で融解後、15mL遠沈管1本に移し、DMEMを5mL加えて懸濁した。その細胞懸濁液から100μLをエッペンドルフチューブに取り出し、カセットにサンプルを吸引し、セルカウンターを用いて細胞数を計測し、液中の細胞数を求めた。15mL遠沈管の細胞懸濁液は遠心分離(200×g、3分)を行い、アスピレータを用いて上清を除去した後PBS(-)で細胞濃度が1×106個/mLの細胞懸濁液に調整した。その細胞懸濁液を(3)で作製したハイドロゲルに細胞数が1×104個になるように播種して細胞培養体を作製した。
凍結保存されているグルタミン酸作動性神経細胞の入ったバイアルを37℃温浴で融解後、15mL遠沈管1本に移し、DMEMを5mL加えて懸濁した。その細胞懸濁液から100μLをエッペンドルフチューブに取り出し、カセットにサンプルを吸引し、セルカウンターを用いて細胞数を計測し、液中の細胞数を求めた。15mL遠沈管の細胞懸濁液は遠心分離(200×g、3分)を行い、アスピレータを用いて上清を除去した後PBS(-)で細胞濃度が1×106個/mLの細胞懸濁液に調整した。その細胞懸濁液を(3)で作製したハイドロゲルに細胞数が1×104個になるように播種して細胞培養体を作製した。
(5)細胞の観察
作製した細胞培養体について、培養7日後のハイドロゲル表面の細胞の形態を、細胞が伸展しているかどうかで評価した。ハイドロゲル内の細胞の形態を顕微鏡(CKX41、オリンパス社製)で観察した。結果を図6に示す。図6に示すように、ハイドロゲル表面で神経細胞が伸展していることが確認できた。
作製した細胞培養体について、培養7日後のハイドロゲル表面の細胞の形態を、細胞が伸展しているかどうかで評価した。ハイドロゲル内の細胞の形態を顕微鏡(CKX41、オリンパス社製)で観察した。結果を図6に示す。図6に示すように、ハイドロゲル表面で神経細胞が伸展していることが確認できた。
(実施例2)
(1)第1溶液の調製
Tetra-PEG-マレイミジル(SUNBRIGHT PTE-100MA、油化産業株式会社製)0.02gをリン酸緩衝生理食塩水(Life Technologies社製、以下、PBS(-)とも称する)1mlに溶解後、2%Tetra-PEG-マレイミジルを含む第1溶液を調製した。
(1)第1溶液の調製
Tetra-PEG-マレイミジル(SUNBRIGHT PTE-100MA、油化産業株式会社製)0.02gをリン酸緩衝生理食塩水(Life Technologies社製、以下、PBS(-)とも称する)1mlに溶解後、2%Tetra-PEG-マレイミジルを含む第1溶液を調製した。
(2)第2溶液の調製
ゼラチン-SH(Thiol functionalized gelatin、Sigma-Aldrich社製)0.05gにPBS(-)1mlを加え、37℃で一晩溶解し、5%ゼラチン-SHを含む第2溶液を調製した。
ゼラチン-SH(Thiol functionalized gelatin、Sigma-Aldrich社製)0.05gにPBS(-)1mlを加え、37℃で一晩溶解し、5%ゼラチン-SHを含む第2溶液を調製した。
(3)ヒト臍帯静脈内皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell;以下「HUVEC」又は「HUVEC細胞」と表記する)の培養
HUVEC細胞を内皮細胞基本培地(Culture system containing EBMTM-2 Basal Medium(CC-3156)、EGMTM-2 SingleQuotsTM Supplements(CC-4176)、Lonza社製)を用いて、100mmディッシュにて、37℃、5体積%CO2環境のインキュベーター(KM-CC17RU2、パナソニック株式会社製、37℃、5体積%CO2環境)で培養した。
HUVEC細胞を内皮細胞基本培地(Culture system containing EBMTM-2 Basal Medium(CC-3156)、EGMTM-2 SingleQuotsTM Supplements(CC-4176)、Lonza社製)を用いて、100mmディッシュにて、37℃、5体積%CO2環境のインキュベーター(KM-CC17RU2、パナソニック株式会社製、37℃、5体積%CO2環境)で培養した。
(4)HUVEC細胞含有第1溶液の作製
ディッシュにPBS(-)を5mL加え、アスピレータでPBS(-)を吸引除去し、表面を洗浄した。PBS(-)による洗浄作業後、0.05%トリプシン-0.05%EDTA溶液(life technologies社製)をディッシュに2mL加え、インキュベーター内にて5分間加温し、ディッシュから細胞を剥離した。位相差顕微鏡(装置名:CKX41、オリンパス株式会社製)により細胞の剥離を確認後、FBS入りDMEMをディッシュに2mL加え、トリプシンを失活させた。ディッシュの細胞懸濁液を15ml遠沈管1本に移し、遠心分離(H-19FM、KOKUSAN社製、200×g、3分)を行い、アスピレータを用いて上清を除去した。除去後、遠沈管にFBS入りDMEMを2mL添加し、穏やかにピペッティングを行い、細胞を分散させ細胞懸濁液を得た。その細胞懸濁液から100μLをエッペンドルフチューブに取り出し、カセット(Via1-Cassette、chemometec社製)にサンプルを吸引し、セルカウンター(NucleoCounter NC-3000、chemometec社製)を用いて細胞数を計測し、液中の細胞数を求めた。細胞懸濁液の一部を15ml遠沈管に移して遠心分離(200×g、3分間)を行い、ピペットを用いて上清を除去した。(1)で調製した第1溶液を添加し、2%Tetra-PEG-マレイミジルを含み、細胞濃度が5×106個/mLの細胞懸濁液からなる細胞含有第1溶液を得た。
ディッシュにPBS(-)を5mL加え、アスピレータでPBS(-)を吸引除去し、表面を洗浄した。PBS(-)による洗浄作業後、0.05%トリプシン-0.05%EDTA溶液(life technologies社製)をディッシュに2mL加え、インキュベーター内にて5分間加温し、ディッシュから細胞を剥離した。位相差顕微鏡(装置名:CKX41、オリンパス株式会社製)により細胞の剥離を確認後、FBS入りDMEMをディッシュに2mL加え、トリプシンを失活させた。ディッシュの細胞懸濁液を15ml遠沈管1本に移し、遠心分離(H-19FM、KOKUSAN社製、200×g、3分)を行い、アスピレータを用いて上清を除去した。除去後、遠沈管にFBS入りDMEMを2mL添加し、穏やかにピペッティングを行い、細胞を分散させ細胞懸濁液を得た。その細胞懸濁液から100μLをエッペンドルフチューブに取り出し、カセット(Via1-Cassette、chemometec社製)にサンプルを吸引し、セルカウンター(NucleoCounter NC-3000、chemometec社製)を用いて細胞数を計測し、液中の細胞数を求めた。細胞懸濁液の一部を15ml遠沈管に移して遠心分離(200×g、3分間)を行い、ピペットを用いて上清を除去した。(1)で調製した第1溶液を添加し、2%Tetra-PEG-マレイミジルを含み、細胞濃度が5×106個/mLの細胞懸濁液からなる細胞含有第1溶液を得た。
(5)細胞培養体の作製
(2)で調整した第2溶液を35mmディッシュ(型番:3000-035、AGCテクノグラス製)に3μL滴下した後、その滴下した第2溶液に対して(4)で作製した細胞含有第1溶液3μLを撹拌・混合して、ハイドロゲルに細胞が封入された細胞培養体を作製した。
(2)で調整した第2溶液を35mmディッシュ(型番:3000-035、AGCテクノグラス製)に3μL滴下した後、その滴下した第2溶液に対して(4)で作製した細胞含有第1溶液3μLを撹拌・混合して、ハイドロゲルに細胞が封入された細胞培養体を作製した。
(6)細胞の観察
作製した細胞培養体について、培養7日後のハイドロゲル内の細胞の形態を、細胞が伸展しているかどうかで評価した。35mmディッシュの中の培地にカルセインAM(-Cellstain(登録商標)-Calcein-AM solution、富士フイルム和光純薬社製)を添加し、再び37℃、5体積%CO2環境のインキュベーター(前述)内で1時間培養した。培養1時間後、ハイドロゲル内の細胞の形態を共焦点顕微鏡で観察した。結果を図7に示す。図7に示すように、ハイドロゲル内でHUVEC細胞が伸展していることが確認できた。
作製した細胞培養体について、培養7日後のハイドロゲル内の細胞の形態を、細胞が伸展しているかどうかで評価した。35mmディッシュの中の培地にカルセインAM(-Cellstain(登録商標)-Calcein-AM solution、富士フイルム和光純薬社製)を添加し、再び37℃、5体積%CO2環境のインキュベーター(前述)内で1時間培養した。培養1時間後、ハイドロゲル内の細胞の形態を共焦点顕微鏡で観察した。結果を図7に示す。図7に示すように、ハイドロゲル内でHUVEC細胞が伸展していることが確認できた。
(実施例3)
基本的な手順は、実施例2に準じた。ただし、本実施例では、第1溶液にて混合比が異なる2種類以上のゲル前駆体を形成させた点、HUVEC細胞ではなく神経細胞を使用する点、インクジェットで細胞培養体を作製する点で、実施例2と異なる。
基本的な手順は、実施例2に準じた。ただし、本実施例では、第1溶液にて混合比が異なる2種類以上のゲル前駆体を形成させた点、HUVEC細胞ではなく神経細胞を使用する点、インクジェットで細胞培養体を作製する点で、実施例2と異なる。
(1)第1溶液の調製
Tetra-PEG-マレイミジル0.02gをPBS(-)1mlに溶解した。さらに、実施例2で作製した第2溶液を用いて2%Tetra-PEG-マレイミジル及び0.1%Thiol Gelatinを含む第1溶液を調製した。
Tetra-PEG-マレイミジル0.02gをPBS(-)1mlに溶解した。さらに、実施例2で作製した第2溶液を用いて2%Tetra-PEG-マレイミジル及び0.1%Thiol Gelatinを含む第1溶液を調製した。
(2)神経細胞含有第1溶液の作製
凍結保存されているグルタミン酸作動性神経細胞の入ったバイアルを37℃温浴で融解後、15mL遠沈管1本に移し、DMEMを5mL加えて懸濁した。その細胞懸濁液から100μLをエッペンドルフチューブに取り出し、カセットにサンプルを吸引し、セルカウンターを用いて細胞数を計測し、液中の細胞数を求めた。15mL遠沈管の細胞懸濁液は遠心分離(200×g、3分)を行い、アスピレータを用いて上清を除去した。(1)で調製した第1溶液を添加し、1%Tetra-PEG-マレイミジル及び0.1%ゼラチン-SHを含み、細胞濃度が1×107個/mLの細胞懸濁液からなる細胞含有第1溶液を得た。
凍結保存されているグルタミン酸作動性神経細胞の入ったバイアルを37℃温浴で融解後、15mL遠沈管1本に移し、DMEMを5mL加えて懸濁した。その細胞懸濁液から100μLをエッペンドルフチューブに取り出し、カセットにサンプルを吸引し、セルカウンターを用いて細胞数を計測し、液中の細胞数を求めた。15mL遠沈管の細胞懸濁液は遠心分離(200×g、3分)を行い、アスピレータを用いて上清を除去した。(1)で調製した第1溶液を添加し、1%Tetra-PEG-マレイミジル及び0.1%ゼラチン-SHを含み、細胞濃度が1×107個/mLの細胞懸濁液からなる細胞含有第1溶液を得た。
(3)細胞培養体の作製
18mm角カバーグラス(No.1 Thickness 0.13~0.17mm、松波硝子社製)に実施例2における第2溶液を塗布した。(2)で調製した細胞含有第1溶液をインクジェットヘッドの液室に充填した後、上記カバーグラス上に1滴ずつ滴下して第2溶液に細胞含有第1溶液を着弾させ、2液の反応によって、細胞培養体を作製した。ゲル形成後、カバーグラスを35mmディッシュに移して培地を充填した後に顕微鏡でゲルが形成されていることを確認し、37℃、5%CO2環境のインキュベーター内に入れて14日間培養した。
18mm角カバーグラス(No.1 Thickness 0.13~0.17mm、松波硝子社製)に実施例2における第2溶液を塗布した。(2)で調製した細胞含有第1溶液をインクジェットヘッドの液室に充填した後、上記カバーグラス上に1滴ずつ滴下して第2溶液に細胞含有第1溶液を着弾させ、2液の反応によって、細胞培養体を作製した。ゲル形成後、カバーグラスを35mmディッシュに移して培地を充填した後に顕微鏡でゲルが形成されていることを確認し、37℃、5%CO2環境のインキュベーター内に入れて14日間培養した。
(4)免疫蛍光染色
上清除去後、PBS(-)を加えて洗浄した(以下「PBS洗浄」と称する)。上清を除去し、4%パラホルムアルデヒド(以下「4%PFA」と称する)を加えて20分静置して細胞を固定した。上清除去後にPBS洗浄を3回繰り返した。上清を除去し、0.1%Tritonを加えて10分間細胞膜透過処理を行った。PBS洗浄を3回繰り返した後、1%BSAで1時間ブロッキングを行った。β3チューブリン抗体(β3-Tubulin(D71G9)XP Rabbit mAb#5568、Cell Signaling Technology社製、以下「TUBB3」と称する)及びPEG抗体(Anti-PEG抗体-BSA and Azidefree by Rat monoclonal、abcam)を1%BSAで希釈した。ブロッキング後、上清を除去し、上記の一次抗体希釈液を加えて4℃で一晩インキュベートした。翌日、PBS洗浄を3回行い、1%BSA溶液で希釈した二次抗体溶液を加えて1時間インキュベートした。これ以降はアルミホイル等で遮光しながら作業を行った。上清除去後、PBSで希釈したHoechst溶液を加えて5分間核染色を行った。PBS洗浄を2回繰り返し、封入剤を滴下した。蛍光顕微鏡(Zeiss社)を用いて観察を行い、培養14日目のハイドロゲル内の細胞が神経細胞のマーカーであるTUBB3を発現していることを確認できた(図8)。また、神経突起がゲルの輪郭に沿って折れていることから、ゲル内に神経突起が留まる様子を観察できた。
上清除去後、PBS(-)を加えて洗浄した(以下「PBS洗浄」と称する)。上清を除去し、4%パラホルムアルデヒド(以下「4%PFA」と称する)を加えて20分静置して細胞を固定した。上清除去後にPBS洗浄を3回繰り返した。上清を除去し、0.1%Tritonを加えて10分間細胞膜透過処理を行った。PBS洗浄を3回繰り返した後、1%BSAで1時間ブロッキングを行った。β3チューブリン抗体(β3-Tubulin(D71G9)XP Rabbit mAb#5568、Cell Signaling Technology社製、以下「TUBB3」と称する)及びPEG抗体(Anti-PEG抗体-BSA and Azidefree by Rat monoclonal、abcam)を1%BSAで希釈した。ブロッキング後、上清を除去し、上記の一次抗体希釈液を加えて4℃で一晩インキュベートした。翌日、PBS洗浄を3回行い、1%BSA溶液で希釈した二次抗体溶液を加えて1時間インキュベートした。これ以降はアルミホイル等で遮光しながら作業を行った。上清除去後、PBSで希釈したHoechst溶液を加えて5分間核染色を行った。PBS洗浄を2回繰り返し、封入剤を滴下した。蛍光顕微鏡(Zeiss社)を用いて観察を行い、培養14日目のハイドロゲル内の細胞が神経細胞のマーカーであるTUBB3を発現していることを確認できた(図8)。また、神経突起がゲルの輪郭に沿って折れていることから、ゲル内に神経突起が留まる様子を観察できた。
(実施例4)
基本的な手順は、実施例3に準じた。ただし、本実施例では、HUVEC細胞とHepG2細胞(ヒト肝癌由来細胞株)を使用する点、インクジェットで細胞培養体を積層する点で、実施例3と異なる。
基本的な手順は、実施例3に準じた。ただし、本実施例では、HUVEC細胞とHepG2細胞(ヒト肝癌由来細胞株)を使用する点、インクジェットで細胞培養体を積層する点で、実施例3と異なる。
(1)HepG2細胞の培養
インキュベーター内において、10質量%ウシ胎児血清(以下、「FBS」と表記する)及び1質量%抗生物質(Antibiotic-Antimycoti c Mixed Stock Solution(100x)、ナカライテスク株式会社製)を含むDulbecco’s Modified Eagle Medium(商品名:DMEM(1X)、Thermo Fisher Scientific社製、以下、「DMEM」と表記する)を用い、100mmディッシュにてHepG2細胞を72時間培養した。
インキュベーター内において、10質量%ウシ胎児血清(以下、「FBS」と表記する)及び1質量%抗生物質(Antibiotic-Antimycoti c Mixed Stock Solution(100x)、ナカライテスク株式会社製)を含むDulbecco’s Modified Eagle Medium(商品名:DMEM(1X)、Thermo Fisher Scientific社製、以下、「DMEM」と表記する)を用い、100mmディッシュにてHepG2細胞を72時間培養した。
(2)HepG2細胞含有第1溶液の作製
HUVEC細胞と同様にHepG2細胞を分散させ細胞懸濁液を得た。調製した第1溶液を添加し、2%Tetra-PEG-マレイミジルを含み、細胞濃度が1×107個/mLの細胞懸濁液からなるHepG2細胞含有第1溶液を得た。
HUVEC細胞と同様にHepG2細胞を分散させ細胞懸濁液を得た。調製した第1溶液を添加し、2%Tetra-PEG-マレイミジルを含み、細胞濃度が1×107個/mLの細胞懸濁液からなるHepG2細胞含有第1溶液を得た。
(3)HUVEC細胞含有第1溶液の作製
実施例2と同様にして、細胞濃度が1×107個/mLの細胞懸濁液からなるHUVEC細胞含有第1溶液を得た。
実施例2と同様にして、細胞濃度が1×107個/mLの細胞懸濁液からなるHUVEC細胞含有第1溶液を得た。
(4)細胞培養体の作製
HepG2細胞含有第1溶液が充填されたインクジェットヘッドで18mm角カバーグラス上の10mm×20mmの領域に100μmピッチで液滴を1滴ずつ滴下した。その後、これを第2溶液の入ったディッシュに浸漬し、液滴状のHepG2細胞含有第1溶液に第2溶液を含浸させ、細胞培養体を形成した。
続いて、HUVEC細胞含有第1溶液の充填されたインクジェットヘッドで上記細胞培養体上の5mm×10mmの領域に100μmピッチで液滴を1滴ずつ滴下した。その後、液滴状のHUVEC細胞含有第1溶液に第2溶液を含浸させ、2層目の細胞培養体を形成した。
インクジェットヘッドで同様の作業を繰り返すことで、3層目(HepG2細胞)、及び4層目(HUVEC細胞)の細胞培養体を形成させ、最終的に4層の細胞含有ハイドロゲルからなる三次元細胞培養体を得た。
最後に、10質量%FBS及び1質量%抗生物質を含むDMEMが1mLと、内皮細胞基本培地が1mL入った35mmディッシュに三次元細胞培養体を移して、37℃、5体積%CO2環境のインキュベーター(前述)内に入れた。
HepG2細胞含有第1溶液が充填されたインクジェットヘッドで18mm角カバーグラス上の10mm×20mmの領域に100μmピッチで液滴を1滴ずつ滴下した。その後、これを第2溶液の入ったディッシュに浸漬し、液滴状のHepG2細胞含有第1溶液に第2溶液を含浸させ、細胞培養体を形成した。
続いて、HUVEC細胞含有第1溶液の充填されたインクジェットヘッドで上記細胞培養体上の5mm×10mmの領域に100μmピッチで液滴を1滴ずつ滴下した。その後、液滴状のHUVEC細胞含有第1溶液に第2溶液を含浸させ、2層目の細胞培養体を形成した。
インクジェットヘッドで同様の作業を繰り返すことで、3層目(HepG2細胞)、及び4層目(HUVEC細胞)の細胞培養体を形成させ、最終的に4層の細胞含有ハイドロゲルからなる三次元細胞培養体を得た。
最後に、10質量%FBS及び1質量%抗生物質を含むDMEMが1mLと、内皮細胞基本培地が1mL入った35mmディッシュに三次元細胞培養体を移して、37℃、5体積%CO2環境のインキュベーター(前述)内に入れた。
(5)免疫蛍光染色
上清除去後、PBS(-)を加えて洗浄した。上清を除去し、4%PFAを加えて20分静置して細胞を固定した。上清除去後にPBS洗浄を3回繰り返した。上清を除去し、0.1%Tritonを加えて10分間細胞膜透過処理を行った。PBS洗浄を3回繰り返した後、1%BSAで1時間ブロッキングを行った。アルブミン抗体(Anti-Albumin antibody、abcam社製)及びCD31抗体(Anti-CD31 antibody、abcam)を1%BSAで希釈した。ブロッキング後、上清を除去し、上記の一次抗体希釈液を加えて4℃で一晩インキュベートした。翌日、PBS洗浄を3回行い、1%BSA溶液で希釈した二次抗体溶液を加えて1時間インキュベートした。これ以降はアルミホイル等で遮光しながら作業を行った。上清除去後、PBSで希釈したHoechst溶液を加えて5分間核染色を行った。PBS洗浄を2回繰り返し、封入剤を滴下した。共焦点顕微鏡(FV10、オリンパス社製)を用いて観察を行い、培養7日目のハイドロゲル内の細胞がHepG2細胞のマーカーであるアルブミンとHUVEC細胞のマーカーであるCD31を発現して伸展していることを確認できた。また、1、3層目にHepG2細胞、2、4層目にHUVEC細胞の層構造を形成していることを観察できた。
上清除去後、PBS(-)を加えて洗浄した。上清を除去し、4%PFAを加えて20分静置して細胞を固定した。上清除去後にPBS洗浄を3回繰り返した。上清を除去し、0.1%Tritonを加えて10分間細胞膜透過処理を行った。PBS洗浄を3回繰り返した後、1%BSAで1時間ブロッキングを行った。アルブミン抗体(Anti-Albumin antibody、abcam社製)及びCD31抗体(Anti-CD31 antibody、abcam)を1%BSAで希釈した。ブロッキング後、上清を除去し、上記の一次抗体希釈液を加えて4℃で一晩インキュベートした。翌日、PBS洗浄を3回行い、1%BSA溶液で希釈した二次抗体溶液を加えて1時間インキュベートした。これ以降はアルミホイル等で遮光しながら作業を行った。上清除去後、PBSで希釈したHoechst溶液を加えて5分間核染色を行った。PBS洗浄を2回繰り返し、封入剤を滴下した。共焦点顕微鏡(FV10、オリンパス社製)を用いて観察を行い、培養7日目のハイドロゲル内の細胞がHepG2細胞のマーカーであるアルブミンとHUVEC細胞のマーカーであるCD31を発現して伸展していることを確認できた。また、1、3層目にHepG2細胞、2、4層目にHUVEC細胞の層構造を形成していることを観察できた。
(実施例5)
基本的な手順は、実施例3に準じた。ただし、本実施例では、HUVEC細胞を使用する点、インクジェットで細胞培養体を積層する点で、実施例3と異なる。
基本的な手順は、実施例3に準じた。ただし、本実施例では、HUVEC細胞を使用する点、インクジェットで細胞培養体を積層する点で、実施例3と異なる。
(1)細胞非含有第1溶液の調製
Tetra-PEG-マレイミジル(SUNBRIGHT PTE-100MA、油化産業株式会社製)0.02gをリン酸緩衝生理食塩水(Life Technologies社製、以下、PBS(-)とも称する)1mlに溶解し、2%Tetra-PEG-マレイミジルを含む細胞非含有第1溶液を調製した。
Tetra-PEG-マレイミジル(SUNBRIGHT PTE-100MA、油化産業株式会社製)0.02gをリン酸緩衝生理食塩水(Life Technologies社製、以下、PBS(-)とも称する)1mlに溶解し、2%Tetra-PEG-マレイミジルを含む細胞非含有第1溶液を調製した。
(2)HUVEC細胞含有第1溶液の作製
1%Tetra-PEG-マレイミジルを含む第1溶液を調製し、細胞濃度が1×107個/mLの細胞懸濁液からなるHUVEC細胞含有第1溶液を得た。
1%Tetra-PEG-マレイミジルを含む第1溶液を調製し、細胞濃度が1×107個/mLの細胞懸濁液からなるHUVEC細胞含有第1溶液を得た。
(3)細胞培養体の作製
細胞非含有第1溶液が充填されたインクジェットヘッドで18mm角カバーグラス上の5mm×10mmの領域に100μmピッチで液滴を1滴ずつ滴下した。その後、実施例2で調製した第2溶液の入ったディッシュにカバーガラスを設置し、液滴状の細胞非含有第1溶液に第2溶液を含浸させ、ハイドロゲルを形成した。
続いて、ゲル積層形成工程として、HUVEC細胞含有第1溶液の充填されたインクジェットヘッドにより上記ハイドロゲルを横断するように100μmピッチで液滴を1滴ずつ滴下することで、図9に示すように、カバーガラス30上にハイドロゲル20が配置され、ハイドロゲル20を横断するように長さ15mmのライン状の細胞培養体10が形成された積層体を作製した。
細胞非含有第1溶液が充填されたインクジェットヘッドで18mm角カバーグラス上の5mm×10mmの領域に100μmピッチで液滴を1滴ずつ滴下した。その後、実施例2で調製した第2溶液の入ったディッシュにカバーガラスを設置し、液滴状の細胞非含有第1溶液に第2溶液を含浸させ、ハイドロゲルを形成した。
続いて、ゲル積層形成工程として、HUVEC細胞含有第1溶液の充填されたインクジェットヘッドにより上記ハイドロゲルを横断するように100μmピッチで液滴を1滴ずつ滴下することで、図9に示すように、カバーガラス30上にハイドロゲル20が配置され、ハイドロゲル20を横断するように長さ15mmのライン状の細胞培養体10が形成された積層体を作製した。
(4)免疫蛍光染色
上清除去後、PBS(-)を加えて洗浄した。上清を除去し、4%PFAを加えて20分静置して細胞を固定した。上清除去後にPBS洗浄を3回繰り返した。上清を除去し、0.1%Tritonを加えて10分間細胞膜透過処理を行った。PBS洗浄を3回繰り返した後、1%BSAで1時間ブロッキングを行った。CD31抗体(Anti-CD31 antibody、abcam)を1%BSAで希釈した。ブロッキング後、上清を除去し、上記の一次抗体希釈液を加えて4℃で一晩インキュベートした。翌日、PBS洗浄を3回行い、1%BSA溶液で希釈した二次抗体溶液を加えて1時間インキュベートした。これ以降はアルミホイル等で遮光しながら作業を行った。上清除去後、PBSで希釈したHoechst溶液を加えて5分間核染色を行った。PBS洗浄を2回繰り返し、封入剤を滴下した。共焦点顕微鏡(FV10、オリンパス社製)を用いて観察を行い、培養7日目のハイドロゲル内の細胞がHUVEC細胞のマーカーであるCD31を発現して伸展していることを確認できた。
上清除去後、PBS(-)を加えて洗浄した。上清を除去し、4%PFAを加えて20分静置して細胞を固定した。上清除去後にPBS洗浄を3回繰り返した。上清を除去し、0.1%Tritonを加えて10分間細胞膜透過処理を行った。PBS洗浄を3回繰り返した後、1%BSAで1時間ブロッキングを行った。CD31抗体(Anti-CD31 antibody、abcam)を1%BSAで希釈した。ブロッキング後、上清を除去し、上記の一次抗体希釈液を加えて4℃で一晩インキュベートした。翌日、PBS洗浄を3回行い、1%BSA溶液で希釈した二次抗体溶液を加えて1時間インキュベートした。これ以降はアルミホイル等で遮光しながら作業を行った。上清除去後、PBSで希釈したHoechst溶液を加えて5分間核染色を行った。PBS洗浄を2回繰り返し、封入剤を滴下した。共焦点顕微鏡(FV10、オリンパス社製)を用いて観察を行い、培養7日目のハイドロゲル内の細胞がHUVEC細胞のマーカーであるCD31を発現して伸展していることを確認できた。
(実施例6)
基本的な手順は、実施例5に準じた。ただし、本実施例では実施例3で使用した神経細胞を使用する点で、実施例5と異なる。インクジェットで細胞を含むインクを滴下することにより、図10(a)に示すように、カバーガラス30上にハイドロゲル20が配置され、ハイドロゲル20を横断するようにライン状の細胞培養体10が形成された積層体を作製した。この積層体では、図10(a)のA部分を模式的に拡大した図10(b)に示すように、細胞培養体10内で細胞Cが伸展する。図11は、ライン状の細胞培養体10を顕微鏡で観察した画像である。図11の結果より、インクジェットでライン状の細胞培養体を作製した場合に、吐出された液滴の形状に依存せず、全体のラインに沿って細胞が伸展していることが確認できた。
基本的な手順は、実施例5に準じた。ただし、本実施例では実施例3で使用した神経細胞を使用する点で、実施例5と異なる。インクジェットで細胞を含むインクを滴下することにより、図10(a)に示すように、カバーガラス30上にハイドロゲル20が配置され、ハイドロゲル20を横断するようにライン状の細胞培養体10が形成された積層体を作製した。この積層体では、図10(a)のA部分を模式的に拡大した図10(b)に示すように、細胞培養体10内で細胞Cが伸展する。図11は、ライン状の細胞培養体10を顕微鏡で観察した画像である。図11の結果より、インクジェットでライン状の細胞培養体を作製した場合に、吐出された液滴の形状に依存せず、全体のラインに沿って細胞が伸展していることが確認できた。
(比較例1)
第1溶液をTetra-PEG-マレイミジル、第2溶液をTetra-PEG-SHとして実施例1と同様にハイドロゲルを作製し観察したところ、図12に示すように神経細胞は伸展せず丸いままで、ほとんどの細胞が伸展していなかった。
第1溶液をTetra-PEG-マレイミジル、第2溶液をTetra-PEG-SHとして実施例1と同様にハイドロゲルを作製し観察したところ、図12に示すように神経細胞は伸展せず丸いままで、ほとんどの細胞が伸展していなかった。
(比較例2)
細胞を被覆するハイドロゲルとして、リン酸緩衝生理食塩水に対してTetra-PEG-マレイミジルとTetra-PEG-SH(SUNBRIGHT PTE-100SH、油化産業株式会社製)を質量比1%、トロンビン(Thrombin from bovine Plasma、Sigma-Aldrich社製)20U/mL、フィブリノーゲン(Fibrinogen from bovine plasma、Sigma-Aldrich社製)を質量比1%になるように混合させたゲルを用いた以外は、実施例2と同様にして細胞培養体を作製し、細胞伸展を観察した。その結果を図13に示す。図13から、インキュベート後のHUVEC細胞の形態は丸いままの状態と伸展した細胞が確認でき、ハイドロゲル内でほとんどのすべての細胞を伸展させて長期培養するのは困難であることが示唆された。
細胞を被覆するハイドロゲルとして、リン酸緩衝生理食塩水に対してTetra-PEG-マレイミジルとTetra-PEG-SH(SUNBRIGHT PTE-100SH、油化産業株式会社製)を質量比1%、トロンビン(Thrombin from bovine Plasma、Sigma-Aldrich社製)20U/mL、フィブリノーゲン(Fibrinogen from bovine plasma、Sigma-Aldrich社製)を質量比1%になるように混合させたゲルを用いた以外は、実施例2と同様にして細胞培養体を作製し、細胞伸展を観察した。その結果を図13に示す。図13から、インキュベート後のHUVEC細胞の形態は丸いままの状態と伸展した細胞が確認でき、ハイドロゲル内でほとんどのすべての細胞を伸展させて長期培養するのは困難であることが示唆された。
(比較例3)
比較例3として、アルギン酸ナトリウム(SKAT ONE、キミカ製)を質量比1%となるよう、ゼラチン-SHを質量比2%となるようリン酸緩衝生理食塩水(Life Technologies社製、以下、PBS(-)とも称する)へ溶解させたアルギン酸ナトリウム溶液と、塩化カルシウム二水和物(和光純薬工業株式会社製)を100mmol/Lとなるよう蒸留水へ溶解させた塩化カルシウム溶液とを、質量比1:1となるように混合することでアルギン酸カルシウムゲルを形成した以外は、実施例2と同様にして細胞培養体を作製し、細胞伸展を観察した。その結果、インキュベート後のHUVEC細胞の形態は伸展せず丸いままであり、さらにアルギン酸カルシウムゲルが、ディッシュを揺らすとともに徐々に崩壊していく様子も確認され、培養時の足場材料としての安定性にも欠けることが確認された。
比較例3として、アルギン酸ナトリウム(SKAT ONE、キミカ製)を質量比1%となるよう、ゼラチン-SHを質量比2%となるようリン酸緩衝生理食塩水(Life Technologies社製、以下、PBS(-)とも称する)へ溶解させたアルギン酸ナトリウム溶液と、塩化カルシウム二水和物(和光純薬工業株式会社製)を100mmol/Lとなるよう蒸留水へ溶解させた塩化カルシウム溶液とを、質量比1:1となるように混合することでアルギン酸カルシウムゲルを形成した以外は、実施例2と同様にして細胞培養体を作製し、細胞伸展を観察した。その結果、インキュベート後のHUVEC細胞の形態は伸展せず丸いままであり、さらにアルギン酸カルシウムゲルが、ディッシュを揺らすとともに徐々に崩壊していく様子も確認され、培養時の足場材料としての安定性にも欠けることが確認された。
(比較例4)
第1溶液をTetra-PEG-マレイミジルとマトリゲル、第2溶液をTetra-PEG-SHとして実施例3と同様に細胞培養体を作製し観察したところ、神経細胞は伸展せず丸いままで、ほとんどの細胞が伸展していなかった。
第1溶液をTetra-PEG-マレイミジルとマトリゲル、第2溶液をTetra-PEG-SHとして実施例3と同様に細胞培養体を作製し観察したところ、神経細胞は伸展せず丸いままで、ほとんどの細胞が伸展していなかった。
各実施例、及び各比較例の方法により形成した細胞培養体を以下に説明する方法で評価し、その結果を表1にまとめた。
(ゲル内長期培養後の細胞形態の評価)
培養7日以降の細胞の形態から、50%以上細胞が伸展していた場合〇、伸展していなかった場合×とした。細胞の伸展の有無は、細胞の仮足が見えていれば伸展していると判断した。
培養7日以降の細胞の形態から、50%以上細胞が伸展していた場合〇、伸展していなかった場合×とした。細胞の伸展の有無は、細胞の仮足が見えていれば伸展していると判断した。
表1の結果より、実施例1のハイドロゲル表面では細胞が伸展できることを確認し、比較例1の通常のTetra-PEGゲル表面では細胞が伸展できないことを確認した。実施例2の細胞培養体は、ゲストを添加した通常のTetra-PEGゲル(比較例2)やアルギン酸ゲル(比較例3)に比べHUVEC細胞を効率的に伸展可能な細胞培養体であることを確認した。また、実施例3と比較例4から、インクジェットで作製した細胞培養体であっても同様の結果が得られることを確認した。すなわち、本発明のとおりゲル化時間が速いポリマー材料と細胞接着性を有する水溶性タンパク質を架橋させてハイドロゲルを形成することによって、ゲル造形性と細胞接着性を両立させた細胞培養体を得ることができ、細胞の長期培養が可能であることを確認することができた。
(実施例7)3T3細胞(接着性細胞)を用いた細胞含有ゲル粒子の作製
(1)第1溶液の調製
Tetra-PEG-マレイミジル(商品名:SUNBRIGHT PTE-100MA、油化産業株式会社製)0.02gをリン酸緩衝生理食塩水(Life Technologies社製、以下、PBS(-)とも称する)1mlに溶解後、2%Tetra-PEG-マレイミジルを含む第1溶液を調製した。
(1)第1溶液の調製
Tetra-PEG-マレイミジル(商品名:SUNBRIGHT PTE-100MA、油化産業株式会社製)0.02gをリン酸緩衝生理食塩水(Life Technologies社製、以下、PBS(-)とも称する)1mlに溶解後、2%Tetra-PEG-マレイミジルを含む第1溶液を調製した。
(2)第2溶液の調製
Thiol Gelatin(商品名:Thiol functionalized gelatin、Sigma-Aldrich社製)0.05gにPBS(-)1mlを加え、37℃で一晩溶解し、5%Thiol Gelatinを含む第2溶液を調製した。
Thiol Gelatin(商品名:Thiol functionalized gelatin、Sigma-Aldrich社製)0.05gにPBS(-)1mlを加え、37℃で一晩溶解し、5%Thiol Gelatinを含む第2溶液を調製した。
(3)細胞の培養
インキュベーター(商品名:KM-CC17RU2、パナソニック株式会社製、37℃、5%CO2環境)内において、10%新生仔ウシ血清(商品名:Newborn Calf Serum、Sigma-Aldrich社製、以下、「NCS」と称する)を含むDulbecco’s Modified Eagle Medium(商品名:DMEM(1X)、Life technologies社製、以下、「DMEM」と称する)を用い、100mmディッシュにて3T3/NIH細胞(JCRB Cell Bank、以下、「3T3」と称する)を72時間培養した。
インキュベーター(商品名:KM-CC17RU2、パナソニック株式会社製、37℃、5%CO2環境)内において、10%新生仔ウシ血清(商品名:Newborn Calf Serum、Sigma-Aldrich社製、以下、「NCS」と称する)を含むDulbecco’s Modified Eagle Medium(商品名:DMEM(1X)、Life technologies社製、以下、「DMEM」と称する)を用い、100mmディッシュにて3T3/NIH細胞(JCRB Cell Bank、以下、「3T3」と称する)を72時間培養した。
(4)細胞懸濁液の作製
ディッシュにPBS(-)を5mL加え、アスピレータでPBS(-)を吸引除去し、表面を洗浄した。PBS(-)による洗浄作業後、0.05%トリプシン-0.05%EDTA溶液(life technologies社製)をディッシュに2mL加え、インキュベーター内にて5分間加温し、ディッシュから細胞を剥離した。位相差顕微鏡(装置名:CKX41、オリンパス株式会社製)により細胞の剥離を確認後、NCS入りDMEMをディッシュに2mL加え、トリプシンを失活させた。ディッシュの細胞懸濁液を15ml遠沈管1本に移し、遠心分離(商品名:H-19FM、KOKUSAN社製、200×g、3分)を行い、アスピレータを用いて上清を除去した。除去後、遠沈管にNCS入りDMEMを2mL添加し、穏やかにピペッティングを行い、細胞を分散させ細胞懸濁液を得た。その細胞懸濁液から100μLをエッペンドルフチューブに取り出し、カセット(商品名:Via1-Cassette、chemometec社製)にサンプルを吸引し、セルカウンター(商品名:NucleoCounter NC-3000、chemometec社製)を用いて細胞数を計測し、液中の細胞数を求めた。細胞懸濁液の一部を15ml遠沈管に移して遠心分離(200×g、3分間)を行い、ピペットを用いて上清を除去した。(1)で調製した第1溶液を添加し、2%Tetra-PEG-マレイミジルを含み、細胞濃度が1×107個/mLの細胞懸濁液からなる細胞含有第1溶液を得た。
ディッシュにPBS(-)を5mL加え、アスピレータでPBS(-)を吸引除去し、表面を洗浄した。PBS(-)による洗浄作業後、0.05%トリプシン-0.05%EDTA溶液(life technologies社製)をディッシュに2mL加え、インキュベーター内にて5分間加温し、ディッシュから細胞を剥離した。位相差顕微鏡(装置名:CKX41、オリンパス株式会社製)により細胞の剥離を確認後、NCS入りDMEMをディッシュに2mL加え、トリプシンを失活させた。ディッシュの細胞懸濁液を15ml遠沈管1本に移し、遠心分離(商品名:H-19FM、KOKUSAN社製、200×g、3分)を行い、アスピレータを用いて上清を除去した。除去後、遠沈管にNCS入りDMEMを2mL添加し、穏やかにピペッティングを行い、細胞を分散させ細胞懸濁液を得た。その細胞懸濁液から100μLをエッペンドルフチューブに取り出し、カセット(商品名:Via1-Cassette、chemometec社製)にサンプルを吸引し、セルカウンター(商品名:NucleoCounter NC-3000、chemometec社製)を用いて細胞数を計測し、液中の細胞数を求めた。細胞懸濁液の一部を15ml遠沈管に移して遠心分離(200×g、3分間)を行い、ピペットを用いて上清を除去した。(1)で調製した第1溶液を添加し、2%Tetra-PEG-マレイミジルを含み、細胞濃度が1×107個/mLの細胞懸濁液からなる細胞含有第1溶液を得た。
(5)細胞含有ゲル粒子の作製
35mmディッシュ内に直径13mmのポリエステル製多孔質培養メンブレン(商品名:ipCELLCULTURE Track Etched Membrane pore size:0.45μm pore density:4E6cm-2thickness:12μm、it4ip社製)を入れて第2溶液を2mL加え、メンブレンに第2溶液を含浸させた。(4)で調製した細胞含有第1溶液をインクジェットヘッドの液室に充填した後、上記メンブレン上に1滴ずつ滴下して第2溶液に細胞含有第1溶液を着弾させ、2液の反応によって、細胞含有ゲル粒子を作製した。ゲル形成後、メンブレンを35mmディッシュに移してNCS入りDMEMをかけてゲル粒子を浮かせ、96ウェルプレートに分注した。顕微鏡でゲル粒子が入っていることを確認し、37℃、5%CO2環境のインキュベーター内に入れて7日間培養した。
35mmディッシュ内に直径13mmのポリエステル製多孔質培養メンブレン(商品名:ipCELLCULTURE Track Etched Membrane pore size:0.45μm pore density:4E6cm-2thickness:12μm、it4ip社製)を入れて第2溶液を2mL加え、メンブレンに第2溶液を含浸させた。(4)で調製した細胞含有第1溶液をインクジェットヘッドの液室に充填した後、上記メンブレン上に1滴ずつ滴下して第2溶液に細胞含有第1溶液を着弾させ、2液の反応によって、細胞含有ゲル粒子を作製した。ゲル形成後、メンブレンを35mmディッシュに移してNCS入りDMEMをかけてゲル粒子を浮かせ、96ウェルプレートに分注した。顕微鏡でゲル粒子が入っていることを確認し、37℃、5%CO2環境のインキュベーター内に入れて7日間培養した。
(6)細胞含有ゲル粒子の観察
前記細胞含有ゲル粒子を位相差顕微鏡で観察した。その結果、図14に示すように、接着性細胞である3T3細胞がゲル内で培養できていることが確認できた。基板に直接接着していなくても、ゲル内で伸展している様子が観察できた。
前記細胞含有ゲル粒子を位相差顕微鏡で観察した。その結果、図14に示すように、接着性細胞である3T3細胞がゲル内で培養できていることが確認できた。基板に直接接着していなくても、ゲル内で伸展している様子が観察できた。
(実施例8)CHO細胞(浮遊性細胞)を用いた細胞含有ゲル粒子の作製
(1)第1溶液の調製
実施例7と同様に行った。
(1)第1溶液の調製
実施例7と同様に行った。
(2)第2溶液の調製
実施例7と同様に行った。
実施例7と同様に行った。
(3)細胞の培養
インキュベーター内において、10%ウシ胎児血清(商品名:Fetal Bovine Serum、GEヘルスケア社製、以下「FBS」と称する)を含むHam’s F12(商品名:F-12 Ham、Sigma-Aldrich社製、以下「Ham’s F12」と称する)を用い、100mmディッシュにてCHO(pMAM-luc)細胞(JCRB Cell Bank、以下「CHO」と称する)を72時間培養した。
インキュベーター内において、10%ウシ胎児血清(商品名:Fetal Bovine Serum、GEヘルスケア社製、以下「FBS」と称する)を含むHam’s F12(商品名:F-12 Ham、Sigma-Aldrich社製、以下「Ham’s F12」と称する)を用い、100mmディッシュにてCHO(pMAM-luc)細胞(JCRB Cell Bank、以下「CHO」と称する)を72時間培養した。
(4)細胞懸濁液の作製
ディッシュにPBS(-)を5mL加え、アスピレータでPBS(-)を吸引除去し、表面を洗浄した。PBS(-)による洗浄作業後、0.05%トリプシン-0.05%EDTA溶液をディッシュに2mL加え、インキュベーター内にて5分間加温し、ディッシュから細胞を剥離した。FBS入りHam’s F12をディッシュに2mL加え、トリプシンを失活させた。ディッシュの細胞懸濁液を15ml遠沈管1本に移し、遠心分離(200×g、3分)を行い、アスピレータを用いて上清を除去した。除去後、遠沈管にFBS入りHam’s F12を2mL添加し、穏やかにピペッティングを行い、細胞を分散させ細胞懸濁液を得た。その細胞懸濁液から100μLをエッペンドルフチューブに取り出し、カセットにサンプルを吸引し、セルカウンターを用いて細胞数を計測し、液中の細胞数を求めた。細胞懸濁液の一部を15ml遠沈管に移して遠心分離(200×g、3分)を行い、ピペットを用いて上清を除去した。(1)で調製した第1溶液を添加し、2%Tetra-PEG-マレイミジルを含み、細胞濃度が1×107個/mLの細胞懸濁液からなる細胞含有第1溶液を得た。
ディッシュにPBS(-)を5mL加え、アスピレータでPBS(-)を吸引除去し、表面を洗浄した。PBS(-)による洗浄作業後、0.05%トリプシン-0.05%EDTA溶液をディッシュに2mL加え、インキュベーター内にて5分間加温し、ディッシュから細胞を剥離した。FBS入りHam’s F12をディッシュに2mL加え、トリプシンを失活させた。ディッシュの細胞懸濁液を15ml遠沈管1本に移し、遠心分離(200×g、3分)を行い、アスピレータを用いて上清を除去した。除去後、遠沈管にFBS入りHam’s F12を2mL添加し、穏やかにピペッティングを行い、細胞を分散させ細胞懸濁液を得た。その細胞懸濁液から100μLをエッペンドルフチューブに取り出し、カセットにサンプルを吸引し、セルカウンターを用いて細胞数を計測し、液中の細胞数を求めた。細胞懸濁液の一部を15ml遠沈管に移して遠心分離(200×g、3分)を行い、ピペットを用いて上清を除去した。(1)で調製した第1溶液を添加し、2%Tetra-PEG-マレイミジルを含み、細胞濃度が1×107個/mLの細胞懸濁液からなる細胞含有第1溶液を得た。
(5)細胞含有ゲル粒子の作製
実施例7と同様に行い、37℃、5%CO2環境のインキュベーター内に入れて5日間培養した。
実施例7と同様に行い、37℃、5%CO2環境のインキュベーター内に入れて5日間培養した。
(6)細胞含有ゲル粒子の観察
前記細胞含有ゲル粒子を位相差顕微鏡で観察した。その結果、図15に示すように、浮遊性細胞であるCHO細胞がゲル内で培養できていることが確認できた。
前記細胞含有ゲル粒子を位相差顕微鏡で観察した。その結果、図15に示すように、浮遊性細胞であるCHO細胞がゲル内で培養できていることが確認できた。
(実施例9)細胞生存率の評価
(1)細胞の染色
実施例7で作製した細胞含有ゲル粒子を用いて評価を行った。Propidium(Sigma Aldrich社製、以下「PI」と称する)及びHoechst33342(H3570、Thermo Fisher Scientific社製、以下「Hoechst」と称する)を培地で0.5ng/mlになるよう希釈し、37℃でインキュベートした。1時間のインキュベート後、蛍光顕微鏡(オリンパス社製)で細胞含有ゲル粒子を観察し、画像を得た。
(1)細胞の染色
実施例7で作製した細胞含有ゲル粒子を用いて評価を行った。Propidium(Sigma Aldrich社製、以下「PI」と称する)及びHoechst33342(H3570、Thermo Fisher Scientific社製、以下「Hoechst」と称する)を培地で0.5ng/mlになるよう希釈し、37℃でインキュベートした。1時間のインキュベート後、蛍光顕微鏡(オリンパス社製)で細胞含有ゲル粒子を観察し、画像を得た。
(2)細胞生存率の算出
(1)で得られた画像をもとに、PIで染色された細胞の数を死細胞数、Hoechstで染色された細胞の総数を全細胞数として、生存率(%)を(死細胞数/全細胞数)×100で算出した。
(1)で得られた画像をもとに、PIで染色された細胞の数を死細胞数、Hoechstで染色された細胞の総数を全細胞数として、生存率(%)を(死細胞数/全細胞数)×100で算出した。
(3)判定基準
細胞含有ゲル粒子の培養4日後及び7日後に、細胞生存率が75%以上の場合を○とし、表2にまとめた。表2に示すように、ゲル粒子内で1週間培養しても細胞生存率を維持できることを確認できた。
細胞含有ゲル粒子の培養4日後及び7日後に、細胞生存率が75%以上の場合を○とし、表2にまとめた。表2に示すように、ゲル粒子内で1週間培養しても細胞生存率を維持できることを確認できた。
(実施例10)神経細胞を用いた細胞含有ゲル粒子の作製
(1)第1溶液の調製
実施例7と同様に行った。
(1)第1溶液の調製
実施例7と同様に行った。
(2)第2溶液の調製
実施例7と同様に行った。
実施例7と同様に行った。
(3)細胞懸濁液の作製
凍結保存されているグルタミン酸作動性神経細胞の入ったバイアルを37℃温浴で融解後、15mL遠沈管1本に移し、DMEMを5mL加えて懸濁した。その細胞懸濁液から 100μLをエッペンドルフチューブに取り出し、カセットにサンプルを吸引し、セルカウンターを用いて細胞数を計測し、液中の細胞数を求めた。15mL遠沈管の細胞懸濁液は遠心分離(200×g、3分)を行い、アスピレータを用いて上清を除去した。(1)及び(2)で調製した第1溶液及び第2溶液を用いて、1%Tetra-PEG-マレイミジル及び0.1%Thiol Gelatinを含み、細胞濃度が1×107個/mLの細胞懸濁液からなる細胞含有第1溶液を得た。
凍結保存されているグルタミン酸作動性神経細胞の入ったバイアルを37℃温浴で融解後、15mL遠沈管1本に移し、DMEMを5mL加えて懸濁した。その細胞懸濁液から 100μLをエッペンドルフチューブに取り出し、カセットにサンプルを吸引し、セルカウンターを用いて細胞数を計測し、液中の細胞数を求めた。15mL遠沈管の細胞懸濁液は遠心分離(200×g、3分)を行い、アスピレータを用いて上清を除去した。(1)及び(2)で調製した第1溶液及び第2溶液を用いて、1%Tetra-PEG-マレイミジル及び0.1%Thiol Gelatinを含み、細胞濃度が1×107個/mLの細胞懸濁液からなる細胞含有第1溶液を得た。
(4)細胞含有ゲル粒子の作製
実施例7と同様に行い、37℃、5%CO2環境のインキュベーター内に入れて7日間培養した。
実施例7と同様に行い、37℃、5%CO2環境のインキュベーター内に入れて7日間培養した。
(5)細胞含有ゲル粒子の免疫蛍光染色
上清除去後、PBS(-)を加えて洗浄した(以下「PBS洗浄」と称する)。上清を除去し、4%パラホルムアルデヒド(商品名:4%パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液、富士フィルム和光純薬株式会社製、以下「4%PFA」と称する)を加えて20分静置して細胞を固定した。上清除去後にPBS洗浄を3回繰り返した。上清を除去し、0.1%Tritonを加えて10分間細胞膜透過処理を行った。PBS洗浄を3回繰り返した後、1%BSAで1時間ブロッキングを行った。β3チューブリン抗体(商品名:β3-Tubulin(D71G9)XP Rabbit mAb#5568、Cell Signaling Technology社製、以下「TUBB3」と称する)及びPEG抗体(商品名:Anti-Polyethylene glycol 抗体[26A04]BSA and Azide free(ab94764)、abcam社)を1%BSAで希釈した。ブロッキング後、上清を除去し、上記の一次抗体希釈液を加えて4℃で一晩インキュベートした。翌日、PBS洗浄を3回行い、1%BSA溶液で希釈した二次抗体溶液を加えて1時間インキュベートした。これ以降はアルミホイル等で遮光しながら作業を行った。上清除去後、PBSで希釈したHoechst溶液を加えて5分間核染色を行った。PBS洗浄を2回繰り返し、封入剤(商品名:Fluoromount、DBS社)を滴下した。蛍光顕微鏡(Zeiss社)を用いて観察を行い、培養7日目のゲル粒子内の細胞が神経細胞のマーカーであるTUBB3を発現していることを確認できた(図16)。また、神経突起がゲルの輪郭に沿って折れていることから、ゲル内に神経突起が留まる様子を観察できた。
上清除去後、PBS(-)を加えて洗浄した(以下「PBS洗浄」と称する)。上清を除去し、4%パラホルムアルデヒド(商品名:4%パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液、富士フィルム和光純薬株式会社製、以下「4%PFA」と称する)を加えて20分静置して細胞を固定した。上清除去後にPBS洗浄を3回繰り返した。上清を除去し、0.1%Tritonを加えて10分間細胞膜透過処理を行った。PBS洗浄を3回繰り返した後、1%BSAで1時間ブロッキングを行った。β3チューブリン抗体(商品名:β3-Tubulin(D71G9)XP Rabbit mAb#5568、Cell Signaling Technology社製、以下「TUBB3」と称する)及びPEG抗体(商品名:Anti-Polyethylene glycol 抗体[26A04]BSA and Azide free(ab94764)、abcam社)を1%BSAで希釈した。ブロッキング後、上清を除去し、上記の一次抗体希釈液を加えて4℃で一晩インキュベートした。翌日、PBS洗浄を3回行い、1%BSA溶液で希釈した二次抗体溶液を加えて1時間インキュベートした。これ以降はアルミホイル等で遮光しながら作業を行った。上清除去後、PBSで希釈したHoechst溶液を加えて5分間核染色を行った。PBS洗浄を2回繰り返し、封入剤(商品名:Fluoromount、DBS社)を滴下した。蛍光顕微鏡(Zeiss社)を用いて観察を行い、培養7日目のゲル粒子内の細胞が神経細胞のマーカーであるTUBB3を発現していることを確認できた(図16)。また、神経突起がゲルの輪郭に沿って折れていることから、ゲル内に神経突起が留まる様子を観察できた。
(実施例11)細胞含有ゲル粒子のサイズ
(1)第1溶液の調製
実施例7と同様に行った。
(1)第1溶液の調製
実施例7と同様に行った。
(2)第2溶液の調製
実施例7と同様に行った。
実施例7と同様に行った。
(3)細胞懸濁液の作製
凍結保存されている心筋細胞の入ったバイアルを37℃温浴で融解後、15mL遠沈管1本に移し、DMEMを10mL加えて懸濁した。その細胞懸濁液から100μLをエッペンドルフチューブに取り出し、カセットにサンプルを吸引し、セルカウンターを用いて細胞数を計測し、液中の細胞数を求めた。15mL遠沈管から一部細胞懸濁液を分注して遠心分離(200×g、3分)を行い、アスピレータを用いて上清を除去した。(1)及び(2)で調製した第1溶液及び第2溶液を用いて、1%Tetra-PEG-マレイミジル及び0.1%Thiol Gelatinを含み、細胞濃度が1×107個/mLの細胞懸濁液からなる細胞含有第1溶液を得た。
凍結保存されている心筋細胞の入ったバイアルを37℃温浴で融解後、15mL遠沈管1本に移し、DMEMを10mL加えて懸濁した。その細胞懸濁液から100μLをエッペンドルフチューブに取り出し、カセットにサンプルを吸引し、セルカウンターを用いて細胞数を計測し、液中の細胞数を求めた。15mL遠沈管から一部細胞懸濁液を分注して遠心分離(200×g、3分)を行い、アスピレータを用いて上清を除去した。(1)及び(2)で調製した第1溶液及び第2溶液を用いて、1%Tetra-PEG-マレイミジル及び0.1%Thiol Gelatinを含み、細胞濃度が1×107個/mLの細胞懸濁液からなる細胞含有第1溶液を得た。
(4)ゲル粒子の作製
直径200μmのゲル粒子の作製は実施例7と同様に行った。直径2mmのゲル粒子は、35mmディッシュ内に第2溶液を1μL滴下し、この液滴内に(3)で調製した細胞含有第1溶液を1μL注入した。ゲル形成後、35mmディッシュにDMEMを静かに添加し、37℃、5%CO2環境のインキュベーター内に入れて7日間培養した。
直径200μmのゲル粒子の作製は実施例7と同様に行った。直径2mmのゲル粒子は、35mmディッシュ内に第2溶液を1μL滴下し、この液滴内に(3)で調製した細胞含有第1溶液を1μL注入した。ゲル形成後、35mmディッシュにDMEMを静かに添加し、37℃、5%CO2環境のインキュベーター内に入れて7日間培養した。
(5)細胞含有ゲル粒子の観察
前記細胞含有ゲル粒子を位相差顕微鏡で観察した。その結果、図17に示すように、ゲル粒子内において、心筋細胞が拍動している様子が確認できた。また、直径200μmの細胞含有ゲル粒子では個々の細胞を観察できるが、直径2mmのゲル粒子では個々の細胞を詳細に観察できないことが確認できた。
前記細胞含有ゲル粒子を位相差顕微鏡で観察した。その結果、図17に示すように、ゲル粒子内において、心筋細胞が拍動している様子が確認できた。また、直径200μmの細胞含有ゲル粒子では個々の細胞を観察できるが、直径2mmのゲル粒子では個々の細胞を詳細に観察できないことが確認できた。
(実施例12)細胞1個を含む細胞含有ゲル粒子
(1)第1溶液の調製
実施例7と同様に行った。
(1)第1溶液の調製
実施例7と同様に行った。
(2)第2溶液の調製
実施例7と同様に行った。
実施例7と同様に行った。
(3)細胞の培養
実施例7と同様に行った。
実施例7と同様に行った。
(4)細胞懸濁液の作製
実施例7と同様に行い、細胞濃度が1×106個/mLの細胞懸濁液からなる細胞含有第1溶液を得た。
実施例7と同様に行い、細胞濃度が1×106個/mLの細胞懸濁液からなる細胞含有第1溶液を得た。
(5)細胞含有ゲル粒子の作製
実施例7と同様に行った。
実施例7と同様に行った。
(6)細胞含有ゲル粒子の観察
前記細胞含有ゲル粒子を培養1日後、3日後及び7日後に位相差顕微鏡で観察した。その結果、図18に示すように、細胞が1個だけ入っていた細胞含有ゲル粒子において、7日後には細胞が増殖している様子が観察された。このことから、細胞1個だけでも細胞含有ゲル粒子内での培養が可能であることが確認できた。
前記細胞含有ゲル粒子を培養1日後、3日後及び7日後に位相差顕微鏡で観察した。その結果、図18に示すように、細胞が1個だけ入っていた細胞含有ゲル粒子において、7日後には細胞が増殖している様子が観察された。このことから、細胞1個だけでも細胞含有ゲル粒子内での培養が可能であることが確認できた。
(比較例5)アルギン酸を用いた細胞含有ゲル粒子
基本的な手順は実施例7と同様に実施した。ただし、第1溶液と第2溶液は以下の材料で作製した。
基本的な手順は実施例7と同様に実施した。ただし、第1溶液と第2溶液は以下の材料で作製した。
(1)第1溶液の調製
塩化カルシウム(型番:192-13925、和光純薬工業株式会社製)(以下「CaCl2」と表記する)0.584gを超純水100mLに溶解後、100mmol/LのCaCl2水溶液からなる第1溶液を調製した。
塩化カルシウム(型番:192-13925、和光純薬工業株式会社製)(以下「CaCl2」と表記する)0.584gを超純水100mLに溶解後、100mmol/LのCaCl2水溶液からなる第1溶液を調製した。
(2)第2溶液の調製
アルギン酸ナトリウム(商品名:キミカアルギンSKAT-ONE、株式会社キミカ製)20mgを超純水2mLに溶解後、濃度1.0%のアルギン酸ナトリウム水溶液を調製した。
アルギン酸ナトリウム(商品名:キミカアルギンSKAT-ONE、株式会社キミカ製)20mgを超純水2mLに溶解後、濃度1.0%のアルギン酸ナトリウム水溶液を調製した。
(3)粒子径の判定基準
作製した細胞含有ゲル粒子の直径が500μm以下である場合を〇、500μm超の場合を×として、以下の表3にまとめた。表3に示すように、アルギン酸ナトリウムを用いた場合、500μm以下の微小ゲル粒子を作製できることを確認した。
作製した細胞含有ゲル粒子の直径が500μm以下である場合を〇、500μm超の場合を×として、以下の表3にまとめた。表3に示すように、アルギン酸ナトリウムを用いた場合、500μm以下の微小ゲル粒子を作製できることを確認した。
(4)細胞生存率の評価
実施例9と同様に行い、培養7日後の細胞生存率が75%以上の場合を○、75%未満の場合を×とし、以下の表3にまとめた。表3に示すように、アルギン酸の微小ゲル粒子内では1週間後まで細胞生存率を維持できないことを確認した。
実施例9と同様に行い、培養7日後の細胞生存率が75%以上の場合を○、75%未満の場合を×とし、以下の表3にまとめた。表3に示すように、アルギン酸の微小ゲル粒子内では1週間後まで細胞生存率を維持できないことを確認した。
(比較例6)コラーゲンを用いた細胞含有ゲル粒子
(1)コラーゲン溶液の調製
コラーゲンゲル培養キット(新田ゼラチン株式会社)を用いて調製し、4℃で保管した。
(1)コラーゲン溶液の調製
コラーゲンゲル培養キット(新田ゼラチン株式会社)を用いて調製し、4℃で保管した。
(2)細胞懸濁液の調製
(1)で調製したコラーゲン溶液を用いて、細胞濃度が1×106個/mLの細胞懸濁液を調製した。
(1)で調製したコラーゲン溶液を用いて、細胞濃度が1×106個/mLの細胞懸濁液を調製した。
(3)細胞含有ゲル粒子の作製
(2)で調製した細胞懸濁液を35mmディッシュに1μLずつ滴下し、37℃で10分ゲル化させた後、培地を加えた。ゲル粒子は37℃、5%CO2環境のインキュベーター内に入れて7日間培養した。
(2)で調製した細胞懸濁液を35mmディッシュに1μLずつ滴下し、37℃で10分ゲル化させた後、培地を加えた。ゲル粒子は37℃、5%CO2環境のインキュベーター内に入れて7日間培養した。
(4)粒子径の判定基準
作製した細胞含有ゲル粒子の直径が500μm以下である場合を〇、500μm超の場合を×として、以下の表4にまとめた。表4に示すように、コラーゲンを用いた場合、500μm以下の微小ゲル粒子を作製できないことを確認した。
作製した細胞含有ゲル粒子の直径が500μm以下である場合を〇、500μm超の場合を×として、以下の表4にまとめた。表4に示すように、コラーゲンを用いた場合、500μm以下の微小ゲル粒子を作製できないことを確認した。
(5)細胞生存率の評価
実施例9と同様に行い、培養7日後の細胞生存率が75%以上の場合を○、75%未満の場合を×とし、以下の表4にまとめた。表4に示すように、コラーゲンゲル粒子内では1週間後まで細胞生存率を維持できることを確認した。
実施例9と同様に行い、培養7日後の細胞生存率が75%以上の場合を○、75%未満の場合を×とし、以下の表4にまとめた。表4に示すように、コラーゲンゲル粒子内では1週間後まで細胞生存率を維持できることを確認した。
(比較例7)ゼラチンを用いた細胞含有ゲル粒子
(1)ゼラチン溶液の調製
Thiol Gelatin0.05gにPBS(-)1mlを加え、37℃で一晩溶解し、5%Thiol Gelatin溶液を調製した。
(1)ゼラチン溶液の調製
Thiol Gelatin0.05gにPBS(-)1mlを加え、37℃で一晩溶解し、5%Thiol Gelatin溶液を調製した。
(2)細胞懸濁液の調製
(1)で調製したゼラチン溶液を用いて、細胞濃度が1×106個/mLの細胞懸濁液を調製した。
(1)で調製したゼラチン溶液を用いて、細胞濃度が1×106個/mLの細胞懸濁液を調製した。
(3)細胞含有ゲル粒子の作製
(2)で調製した細胞懸濁液を35mmディッシュに1μLずつ滴下し、4℃でゲル化させた後、培地を加えた。ゲル粒子は37℃、5%CO2環境のインキュベーター内に入れて7日間培養した。
(2)で調製した細胞懸濁液を35mmディッシュに1μLずつ滴下し、4℃でゲル化させた後、培地を加えた。ゲル粒子は37℃、5%CO2環境のインキュベーター内に入れて7日間培養した。
(4)粒子径の判定基準
作製した細胞含有ゲル粒子の直径が500μm以下である場合を〇、500μm超の場合を×として、以下の表5にまとめた。表5に示すように、ゼラチンを用いた場合、500μm以下の微小ゲル粒子を作製できないことを確認した。
作製した細胞含有ゲル粒子の直径が500μm以下である場合を〇、500μm超の場合を×として、以下の表5にまとめた。表5に示すように、ゼラチンを用いた場合、500μm以下の微小ゲル粒子を作製できないことを確認した。
(5)細胞生存率の評価
4℃でゲル化させたゲル粒子を37℃のインキュベーターで培養した結果、ゲルが融解してしまったため、ゲル内で培養した細胞の生存率は評価できなかった。
4℃でゲル化させたゲル粒子を37℃のインキュベーターで培養した結果、ゲルが融解してしまったため、ゲル内で培養した細胞の生存率は評価できなかった。
(比較例8)PEG-SHを用いた細胞含有ゲル粒子
基本的な手順は実施例7と同様に実施した。ただし、第2溶液は以下の材料で作製した。
(1)第2溶液の調製
Tetra-PEG-SH(商品名:SUNBRIGHT PTE-100SH、油化産業株式会社製)をPBS(-)に溶解後、2%Tetra-PEG-SHを含む第1溶液を調製した。
基本的な手順は実施例7と同様に実施した。ただし、第2溶液は以下の材料で作製した。
(1)第2溶液の調製
Tetra-PEG-SH(商品名:SUNBRIGHT PTE-100SH、油化産業株式会社製)をPBS(-)に溶解後、2%Tetra-PEG-SHを含む第1溶液を調製した。
(2)粒子径の判定基準
作製した細胞含有ゲル粒子の直径が500μm以下である場合を〇、500μm超の場合を×として、以下の表6にまとめた。表6に示すように、コラーゲンを用いた場合、500μm以下の微小ゲル粒子を作製できないことを確認した。
作製した細胞含有ゲル粒子の直径が500μm以下である場合を〇、500μm超の場合を×として、以下の表6にまとめた。表6に示すように、コラーゲンを用いた場合、500μm以下の微小ゲル粒子を作製できないことを確認した。
(3)細胞生存率の評価
実施例9と同様に行い、培養7日後の細胞生存率が75%以上の場合を○、75%未満の場合を×とし、以下の表6にまとめた。表6に示すように、PEG-SHを用いたゲル粒子内では、1週間後まで細胞生存率を維持できないことを確認した。
実施例9と同様に行い、培養7日後の細胞生存率が75%以上の場合を○、75%未満の場合を×とし、以下の表6にまとめた。表6に示すように、PEG-SHを用いたゲル粒子内では、1週間後まで細胞生存率を維持できないことを確認した。
(実施例13)浮遊性細胞を含む細胞含有ゲル粒子を接着条件で培養
(1)第1溶液の調製
実施例7と同様に行った。
(1)第1溶液の調製
実施例7と同様に行った。
(2)第2溶液の調製
実施例7と同様に行った。
実施例7と同様に行った。
(3)細胞懸濁液の作製
実施例10と同様に行い、1%Tetra-PEG-マレイミジル及び0.1%Thiol Gelatinを含み、抗体産生ハイブリドーマ(JCRB Cell Bank、以下「HyB」と称する)の細胞濃度が1×107個/mLの細胞懸濁液からなる細胞含有第1溶液を得た。
実施例10と同様に行い、1%Tetra-PEG-マレイミジル及び0.1%Thiol Gelatinを含み、抗体産生ハイブリドーマ(JCRB Cell Bank、以下「HyB」と称する)の細胞濃度が1×107個/mLの細胞懸濁液からなる細胞含有第1溶液を得た。
(4)細胞含有ゲル粒子の作製
35mmディッシュ内に18mm角カバーガラス(商品名:No.1 Thickness 0.13~0.17mm、松波硝子社製)を入れて第2溶液を1mL加え、カバーガラス表面に第2溶液をコーティングさせた。(3)で調製した細胞含有第1溶液をインクジェットヘッドの液室に充填した後、上記カバーガラス上に1滴ずつ滴下して第2溶液に細胞含有第1溶液を着弾させ、2液の反応によって、細胞含有ゲル粒子を作製した。ゲル形成後、カバーガラスを35mmディッシュに移して10%FBS入りDMEMを静かに添加し、37℃、5%CO2環境のインキュベーター内に入れて7日間培養した。
35mmディッシュ内に18mm角カバーガラス(商品名:No.1 Thickness 0.13~0.17mm、松波硝子社製)を入れて第2溶液を1mL加え、カバーガラス表面に第2溶液をコーティングさせた。(3)で調製した細胞含有第1溶液をインクジェットヘッドの液室に充填した後、上記カバーガラス上に1滴ずつ滴下して第2溶液に細胞含有第1溶液を着弾させ、2液の反応によって、細胞含有ゲル粒子を作製した。ゲル形成後、カバーガラスを35mmディッシュに移して10%FBS入りDMEMを静かに添加し、37℃、5%CO2環境のインキュベーター内に入れて7日間培養した。
(5)細胞含有ゲル粒子の観察
前記細胞含有ゲル粒子を培養1日後、4日後及び7日後に位相差顕微鏡で観察した。その結果、図19に示すように、細胞含有ゲル粒子を接着させて培養することにより、細胞を見失うことなく追跡観察が可能であることを確認できた。
前記細胞含有ゲル粒子を培養1日後、4日後及び7日後に位相差顕微鏡で観察した。その結果、図19に示すように、細胞含有ゲル粒子を接着させて培養することにより、細胞を見失うことなく追跡観察が可能であることを確認できた。
(6)細胞生存率の算出
実施例9と同様にPI/Hoechst染色を行い、染色画像を得た。PIで染色された細胞の数を死細胞数、Hoechstで染色された細胞の総数を全細胞数として、生存率(%)を(死細胞数/全細胞数)×100で算出した。
実施例9と同様にPI/Hoechst染色を行い、染色画像を得た。PIで染色された細胞の数を死細胞数、Hoechstで染色された細胞の総数を全細胞数として、生存率(%)を(死細胞数/全細胞数)×100で算出した。
(7)判定基準
前記細胞含有ゲル粒子の培養4日後及び7日後に、細胞生存率が75%以上の場合を○とし、表7にまとめた。表7に示すように、浮遊性細胞であるHyBを基板に接着させた細胞含有ゲル粒子内で培養しても細胞生存率を維持できることを確認できた。
前記細胞含有ゲル粒子の培養4日後及び7日後に、細胞生存率が75%以上の場合を○とし、表7にまとめた。表7に示すように、浮遊性細胞であるHyBを基板に接着させた細胞含有ゲル粒子内で培養しても細胞生存率を維持できることを確認できた。
(実施例14)LPS刺激によるIL-8分泌量の測定
(1)第1溶液の調製
実施例7と同様に行った。
(1)第1溶液の調製
実施例7と同様に行った。
(2)第2溶液の調製
実施例7と同様に行った。
実施例7と同様に行った。
(3)細胞懸濁液の作製
実施例7と同様に行い、2%Tetra-PEG-マレイミジル及び0.1%Thiol Gelatinを含み、HUVEC UmbilicalVein Endo Cells(LONZA、以下「HUVEC」と称する)の細胞濃度が1×107個/mLの細胞懸濁液からなる細胞含有第1溶液を得た。
実施例7と同様に行い、2%Tetra-PEG-マレイミジル及び0.1%Thiol Gelatinを含み、HUVEC UmbilicalVein Endo Cells(LONZA、以下「HUVEC」と称する)の細胞濃度が1×107個/mLの細胞懸濁液からなる細胞含有第1溶液を得た。
(4)細胞含有ゲル粒子の作製
96ウェルプレートの各ウェル内に第2溶液を添加した。(3)で調製した細胞含有第1溶液をインクジェットヘッドの液室に充填した後、上記96ウェルプレートに9滴ずつ滴下して第2溶液に細胞含有第1溶液を着弾させ、2液の反応によって、細胞含有ゲル粒子を作製した。ゲル形成後、Endothelial Cell Growth Basal Medium-2(LONZA社、以下EBM-2と称する)を静かに添加し、37℃、5%CO2環境のインキュベーター内に入れて2日間培養した。
96ウェルプレートの各ウェル内に第2溶液を添加した。(3)で調製した細胞含有第1溶液をインクジェットヘッドの液室に充填した後、上記96ウェルプレートに9滴ずつ滴下して第2溶液に細胞含有第1溶液を着弾させ、2液の反応によって、細胞含有ゲル粒子を作製した。ゲル形成後、Endothelial Cell Growth Basal Medium-2(LONZA社、以下EBM-2と称する)を静かに添加し、37℃、5%CO2環境のインキュベーター内に入れて2日間培養した。
(5)LPS処理
前記細胞含有ゲル粒子を2日間培養した後、リポポリサッカライド(以下、LPSと称する)を10pg/mL、100pg/mL、10000pg/mLの濃度となるように培地中に添加し、24時間培養した。コントロールとして、LPS処理をしないウェルも作製した。
前記細胞含有ゲル粒子を2日間培養した後、リポポリサッカライド(以下、LPSと称する)を10pg/mL、100pg/mL、10000pg/mLの濃度となるように培地中に添加し、24時間培養した。コントロールとして、LPS処理をしないウェルも作製した。
(6)ELISA
前記LPSで24時間処理した細胞含有ゲル粒子の培養上清を用いて、IL-8のELISAを実施した。ELISAにはIL-8 Human Uncoated ELISA Kit(Invitrogen社)を用い、指定されたプロトコールに従って実験を行った。プレートリーダーで450nmの吸光度を測定し、スタンダードから各サンプルのIL-8濃度を推定した結果、図20に示すように、LPSの濃度依存的に上清中のIL-8の量が増加していることが示された。
前記LPSで24時間処理した細胞含有ゲル粒子の培養上清を用いて、IL-8のELISAを実施した。ELISAにはIL-8 Human Uncoated ELISA Kit(Invitrogen社)を用い、指定されたプロトコールに従って実験を行った。プレートリーダーで450nmの吸光度を測定し、スタンダードから各サンプルのIL-8濃度を推定した結果、図20に示すように、LPSの濃度依存的に上清中のIL-8の量が増加していることが示された。
1 ハイドロゲル
2 四分岐型ポリマー
3 直鎖状ポリマー
10 細胞培養体
20 ハイドロゲル
21 求電子性官能基
30 カバーガラス
31 求核性官能基
5 細胞含有ゲル粒子
50 ハイドロゲル
51 細胞
60 第1溶液
61 第2溶液
62 細胞含有ゲル粒子
63 培養容器
64 培地
70 第1溶液
71 第2溶液
72 細胞含有ゲル粒子
73 培養容器
74 培地
8 細胞評価プレート
80 ウェル
81 細胞含有ゲル粒子
C 細胞
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
2 四分岐型ポリマー
3 直鎖状ポリマー
10 細胞培養体
20 ハイドロゲル
21 求電子性官能基
30 カバーガラス
31 求核性官能基
5 細胞含有ゲル粒子
50 ハイドロゲル
51 細胞
60 第1溶液
61 第2溶液
62 細胞含有ゲル粒子
63 培養容器
64 培地
70 第1溶液
71 第2溶液
72 細胞含有ゲル粒子
73 培養容器
74 培地
8 細胞評価プレート
80 ウェル
81 細胞含有ゲル粒子
C 細胞
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
Claims (20)
- ポリエチレングリコールを骨格とし、側鎖及び/又は末端に1以上の求電子性官能基又は求核性官能基を含む多分岐型ポリマーと、側鎖及び/又は末端に2以上の求核性官能基又は求電子性官能基を含む直鎖状ポリマーとが架橋してなるハイドロゲルであって、
前記直鎖状ポリマーが、タンパク質、ペプチド又は多糖類であり、
前記求電子性官能基が、マレイミジル基、N-ヒドロキシ-スクシンイミジル(NHS)基、スルホスクシンイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基及びニトロフェニル基よりなる群から選択される一種以上であり、
前記求核性官能基が、チオール基、アミノ基及び-CO2PhNO2よりなる群から選択される一種以上である、
前記ハイドロゲル。 - 前記直鎖状ポリマーが、ゼラチンである請求項1に記載のハイドロゲル。
- さらに細胞を含む請求項1又は2に記載のハイドロゲル。
- 前記細胞が、少なくとも2種類以上の細胞である請求項3に記載のハイドロゲル。
- 前記細胞が神経細胞である請求項3に記載のハイドロゲル。
- ポリエチレングリコールを骨格とし、側鎖及び/又は末端に1以上の求電子性官能基又は求核性官能基を含む多分岐型ポリマーを含む第1溶液と、
側鎖及び/又は末端に2以上の求核性官能基又は求電子性官能基を含む直鎖状ポリマーを含む第2溶液と、
から構成されるインクジェット用インクであって、
前記直鎖状ポリマーが、タンパク質、ペプチド又は多糖類であり、
前記求電子性官能基が、マレイミジル基、N-ヒドロキシ-スクシンイミジル(NHS)基、スルホスクシンイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基及びニトロフェニル基よりなる群から選択される一種以上であり、
前記求核性官能基が、チオール基、アミノ基及び-CO2PhNO2よりなる群から選択される一種以上である、
前記インクジェット用インク。 - 前記直鎖状ポリマーが、ゼラチンである請求項6に記載のインクジェット用インク。
- 前記第1溶液若しくは前記第2溶液のいずれか一方又は両方が、細胞を含む、請求項6又は7に記載のインクジェット用インク。
- 前記細胞が、神経細胞である請求項8に記載のインクジェット用インク。
- 細胞培養体の作製方法であって、
ポリエチレングリコールを骨格とし、側鎖及び/又は末端に1以上の求核性官能基又は求電子性官能基のいずれか一方の官能基を有する多分岐型ポリマーを含む第1溶液を保持させる保持工程、及び
側鎖及び/又は末端に1以上の求核性官能基又は求電子性官能基の他方の官能基を有する直鎖状ポリマーを含む第2溶液を前記保持された第1溶液と接触するように液滴吐出装置で吐出した液滴を着弾させてなる1以上のハイドロゲルを形成するゲル形成工程
を含み、
前記直鎖状ポリマーが、タンパク質、ペプチド又は多糖類であり、
前記求電子性官能基が、マレイミジル基、N-ヒドロキシ-スクシンイミジル(NHS)基、スルホスクシンイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基及びニトロフェニル基よりなる群から選択される一種以上であり、
前記求核性官能基が、チオール基、アミノ基及び-CO2PhNO2よりなる群から選択される一種以上であり、
前記第1溶液又は前記第2溶液の少なくとも一方が細胞を含む、
前記細胞培養体の作製方法。 - 前記第1溶液と前記第2溶液とを接触させる際に、前記第1溶液及び/又は前記第2溶液をインクジェット法にて吐出する請求項10に記載の細胞培養体の作製方法。
- 500μm以下の解像度で前記第1溶液と前記第2溶液とを接触させる請求項11に記載の細胞培養体の作製方法。
- ポリエチレングリコールを骨格とし、側鎖及び/又は末端に1以上の求電子性官能基又は求核性官能基を含む多分岐型ポリマーと、側鎖及び/又は末端に2以上の求核性官能基又は求電子性官能基を含む直鎖状ポリマーとが架橋してなるハイドロゲルにより、細胞が包まれている細胞含有ゲル粒子であって、
前記直鎖状ポリマーが、タンパク質、ペプチド又は多糖類であり、
前記求電子性官能基が、マレイミジル基、N-ヒドロキシ-スクシンイミジル(NHS)基、スルホスクシンイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基及びニトロフェニル基よりなる群から選択される一種以上であり、
前記求核性官能基が、チオール基、アミノ基及び-CO2PhNO2よりなる群から選択される一種以上である、
前記細胞含有ゲル粒子。 - 前記直鎖状ポリマーが、ゼラチンである請求項13に記載の細胞含有ゲル粒子。
- 直径が60μm~500μmである請求項13又は14に記載の細胞含有ゲル粒子。
- ポリエチレングリコールを骨格とし、側鎖及び/又は末端に1以上の求電子性官能基又は求核性官能基を含む多分岐型ポリマーを含む第1溶液と、
側鎖及び/又は末端に2以上の求核性官能基又は求電子性官能基を含む直鎖状ポリマーを含む第2溶液と、
を混合する工程であって、
前記直鎖状ポリマーが、タンパク質、ペプチド又は多糖類であり、
前記求電子性官能基が、マレイミジル基、N-ヒドロキシ-スクシンイミジル(NHS)基、スルホスクシンイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基及びニトロフェニル基よりなる群から選択される一種以上であり、
前記求核性官能基が、チオール基、アミノ基及び-CO2PhNO2よりなる群から選択される一種以上であり、
前記第1溶液又は前記第2溶液が細胞を含み、
前記細胞を含む前記第1溶液又は前記第2溶液の液滴を、前記細胞を含まない前記第2溶液又は前記第1溶液に混合する前記工程を含む、
細胞含有ゲル粒子の作製方法。 - 前記直鎖状ポリマーが、ゼラチンである請求項16に記載の細胞含有ゲル粒子の作製方法。
- 請求項13~15のいずれか一項に記載の細胞含有ゲル粒子を培養容器内に設置し、前記細胞含有ゲル粒子が前記培養容器に接触しない状態で細胞の培養を行う、細胞の培養方法。
- 請求項13~15のいずれか一項に記載の細胞含有ゲル粒子を培養容器に接着させ、前記細胞含有ゲル粒子を前記培養容器に保持した状態で細胞の培養を行う、細胞の培養方法。
- 請求項13~15のいずれか一項に記載の細胞含有ゲル粒子を備える細胞評価プレート。
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