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液滴吐出装置用の液セット
JP2020156460A
Japan
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English - Inventor
桃子 塩野入 Momoko Shionoiri 桃子 塩野入 秀和 ▲柳▼沼 秀和 ▲柳▼沼 Hidekazu Yaginuma 千尋 久保 Chihiro Kubo 千尋 久保 崇匡 酒井 Takamasa Sakai 崇匡 酒井 - Current Assignee
- Ricoh Co Ltd
- University of Tokyo NUC
Worldwide applications
2019
JP
Application JP2019120412A events
2020-03-17
2020-03-19
2020-10-01
Status
Pending
Description
translated from
本発明は、細胞を高精度に三次元配置可能な液滴吐出装置用の液セットに関する。
近年、幹細胞技術の進展に伴い、複数の細胞からなる三次元構造体を人工的に形成する技術の開発が行われている。前記三次元構造体を作製するための細胞配置の方法として、細胞シート法、スフェロイド積層法、ゲル押出法、インクジェット法等が知られている。
前記細胞シート法は、その厚みが０．０１μｍ未満の単層の薄いシートを作製し、それを重ね合せて三次元構造体を作製する方法である。しかし、前記細胞シート法では、１枚ずつ作製した細胞シートを重ね合わせるため、効率良く、かつ大量に三次元構造体を製造することができない。
前記スフェロイド積層法は、スフェロイド（細胞凝集体）を積層することによって三次元構造体を作製する方法である。また、前記ゲル押出法は、細胞を含むゲルを連続的にノズルから押出して細胞を積層することにより三次元構造体を作製する方法である。しかし、前記スフェロイド積層法及び前記ゲル押出法は、数百μｍ以上の単位でしか細胞を配置することができず、細胞の高精度な三次元配置ができない。また、前記ゲル押出法は、細胞にかなりの圧力がかかる懸念がある。
一方、インクジェット方式の液滴吐出装置では、細胞が高精度に三次元配置された三次元構造体を造形することが可能である。しかし、使用するインクは、液滴吐出ヘッドとしてのインクジェットヘッドにより吐出可能な程度に低粘度である必要がある。また、細胞を高精度に三次元配置するためには造形時間が短い必要があり、細胞がゲル内で生存可能である必要がある。
例えば、特許文献１、２及び３では、アルギン酸ナトリウム水溶液をインクジェットで吐出することで、細胞が高精度に三次元配置された三次元構造体のゲルを製造する方法が開示されている。アルギン酸ナトリウム水溶液は、原材料を選定することにより、粘度を低く且つゲル化時間も短く設定できることから、高精度な三次元配置が可能である。しかし、アルギン酸と塩化物とのイオン架橋でゲル化することから、細胞用緩衝液又は培地に浸漬することでゲル中の塩化物が徐々に脱離されてゲルが分解し、形状維持が困難である。また、アルギン酸ゲルに内包された細胞はゲル内で長期間生存できないことが知られている。ＥＤＴＡ等でゲルを分解させることも考えられるが、瞬間的にゲルが分解されて細胞の配置が崩壊する上に、細胞への影響も懸念される。
例えば、特許文献４、５及び６では、ゼラチンやフィブリノーゲンを含有する液をインクジェットで吐出することで、三次元構造体のゲルを製造する方法が開示されている。ゼラチンやフィブリノーゲンは低濃度に調整すればインクジェットで吐出可能であり、そのゲルに内包された細胞はゲル内で長期間生存可能である。しかし、低濃度に調整したゼラチン、フィブリノーゲンはゲル化できなくなり、又はゲル化時間が長くなり三次元に細胞を配置しても自重で細胞が沈降してしまうため、細胞を任意に配置することは困難である。
上記従来の状況に鑑み、本発明は、細胞の生存が可能であり、三次元構造体を造形でき、得られる三次元構造体の形状維持が可能な液滴吐出装置用の液セットを提供することを目的とする。
上記課題を解決するため、本発明に係る液滴吐出装置用の液セットは、３以上の分岐を有し、該分岐が側鎖及び／又は末端に１以上の求電子性官能基を有するポリエチレングリコールを骨格として有する、多分岐型ポリマーＡを含む液Ａと、３以上の分岐を有し、該分岐が側鎖及び／又は末端に１以上の求核性官能基を有するポリエチレングリコールを骨格として有する、多分岐型ポリマーＢを含む液Ｂと、を備える液滴吐出装置用の液セットであって、前記液Ａ及び前記液ＢのｐＨが５以上１０以下であり、前記液Ａ及び前記液Ｂにおける前記多分岐型ポリマーの濃度が０．３質量％以上２０質量％以下である、前記液滴吐出装置用の液セットである。
本発明により、細胞の生存が可能であり、三次元構造体を造形でき、得られる三次元構造体の形状維持が可能な液滴吐出装置用の液セットを提供することができる。
以下、実施の形態に基づき本発明を詳細に説明する。
なお、以下に述べる実施の形態は、本発明の好適な実施の形態であるから技術的に好ましい種々の限定が付されているが、本発明の範囲は以下の説明において本発明を限定する旨の記載がない限り、これらの態様に限られるものではない。
なお、以下に述べる実施の形態は、本発明の好適な実施の形態であるから技術的に好ましい種々の限定が付されているが、本発明の範囲は以下の説明において本発明を限定する旨の記載がない限り、これらの態様に限られるものではない。
本発明に係る液滴吐出装置用の液セットは、３以上の分岐を有し、該分岐が側鎖及び／又は末端に１以上の求電子性官能基を有するポリエチレングリコールを骨格として有する、多分岐型ポリマーＡを含む液Ａと、３以上の分岐を有し、該分岐が側鎖及び／又は末端に１以上の求核性官能基を有するポリエチレングリコールを骨格として有する、多分岐型ポリマーＢを含む液Ｂとを備える。以下、各成分について説明する。
＜ポリエチレングリコールを骨格として有する多分岐型ポリマー＞
本発明の液滴吐出装置用の液セットに用いられるポリエチレングリコールを骨格として有する多分岐型ポリマーは、３つ以上のポリエチレングリコール分岐を有するポリマーであって、互いに架橋して網目構造ネットワークを形成する。特に四分岐型ポリマーは均一な網目構造ネットワークを形成し、四分岐型のポリエチレングリコール骨格を有するゲルは、一般にＴｅｔｒａ−ＰＥＧゲルとして知られている。Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧは、それぞれ側鎖及び／又は末端に求電子性の官能基又は求核性の官能基を有する二種の四分岐型ポリマー間のクロスエンドカップリング反応によって網目構造ネットワークが構築される。
本発明の液滴吐出装置用の液セットに用いられるポリエチレングリコールを骨格として有する多分岐型ポリマーは、３つ以上のポリエチレングリコール分岐を有するポリマーであって、互いに架橋して網目構造ネットワークを形成する。特に四分岐型ポリマーは均一な網目構造ネットワークを形成し、四分岐型のポリエチレングリコール骨格を有するゲルは、一般にＴｅｔｒａ−ＰＥＧゲルとして知られている。Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧは、それぞれ側鎖及び／又は末端に求電子性の官能基又は求核性の官能基を有する二種の四分岐型ポリマー間のクロスエンドカップリング反応によって網目構造ネットワークが構築される。
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧゲルは、これまでの研究から、理想的な均一網目構造を有することが報告されている（Matsunaga T, et al., Macromolecules, Vol.42, No.4, pp.1344-1351 (2009)）。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧゲルは、各ポリマー液の単純な二液混合により簡便にその場で作製可能であり、各ポリマー液（本発明における液Ａ及び液Ｂに相当する）のｐＨやポリマー濃度を調節することでゲル化時間を制御することも可能である。上記液Ａ及び液Ｂを液滴吐出ヘッドとしてのインクジェットヘッドで吐出し、ゲル化させ、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧゲルを造形することで、細胞を三次元に配置可能な三次元構造体を製造することができる。そして、上記ゲルはポリエチレングリコールを主成分としているため、生体適合性にも優れている。
ここで、液Ａのポリマーにおける求電子性官能基と液Ｂのポリマーにおける求核性官能基の合計は、６以上であることが好ましい。これらの官能基は、ポリマーの側鎖もしくは末端又はその両方に存在することができるが、末端に存在することが好ましい。また、液Ａのポリマーにおける求電子性官能基の含有量が液Ｂのポリマーにおける求核性官能基の含有量より多い組成であっても良いし、あるいは、液Ｂのポリマーにおける求核性官能基の含有量が液Ａのポリマーにおける求電子性官能基の含有量より多い組成であっても良い。また、好ましい態様として、組成の異なる２種類以上の液Ａ及び液Ｂの組み合わせから、組成の異なる２種類以上のゲル前駆体をいったん形成させ、かかるゲル前駆体をさらに架橋させて三次元構造体のゲルを得ることができる。
液Ａにおける多分岐型ポリマーが有する求電子性官能基は、活性エステル基であるマレイミジル基が望ましい。マレイミジル基に加え、必要に応じて、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基又はニトロフェニル基等を有していても良い。当業者であればその他の公知の活性エステル基を適宜選択して採用することができる。液Ａに含まれる多分岐型ポリマーの中で、求電子性官能基の組成は、同一であっても、異なっても良いが、同一である方が好ましい。官能基の組成が同一であることによって、架橋結合を形成する求核性官能基との反応性が均一になり、均一な立体構造を有するゲルを得やすくなる。
液Ｂにおける多分岐型ポリマーが有する求核性官能基は、チオール基が望ましい。チオール基に加え、必要に応じて、アミノ基、又は−ＣＯ２ＰｈＮＯ２（Ｐｈは、ｏ−、ｍ−、又はｐ−フェニレン基を示す）等を有していても良い。当業者であれば、種々の求核性官能基の中から適宜選択して採用することができる。液Ｂに含まれる多分岐型ポリマーの中で、求核性官能基の組成は、同一であっても、異なっても良いが、同一である方が好ましい。官能基の組成が同一であることによって、架橋結合を形成する求電子性官能基との反応性が均一になり、均一な立体構造を有するゲルを得やすくなる。
側鎖及び／末端に１以上のマレイミジル基を有し、ポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマーとして好ましい非限定的な具体例には、例えば、４つのポリエチレングリコール骨格の分岐を有し、末端にマレイミジル基を有する下記式（Ｉ）で表される化合物が挙げられる。
上記式（Ｉ）中、ｎ２１〜ｎ２４は、それぞれ同一でも又は異なっても良い。ｎ２１〜ｎ２４の値は近いほど、ゲルは均一な立体構造をとることができ、高強度となるので好ましく、同一であることが特に好ましい。ｎ２１〜ｎ２４の値が高過ぎるとゲルの強度が弱くなり、ｎ２１〜ｎ２４の値が低過ぎると化合物の立体障害によりゲルが形成されにくい。そのため、ｎ２１〜ｎ２４は、５以上３００以下の値であることが適当であり、２０以上２５０以下であることが好ましく、３０以上１８０以下がより好ましく、４５以上１１５以下がさらに好ましく、４５以上５５以下であれば特に好ましい。液Ａにおける多分岐型ポリマーの重量平均分子量は、５×１０３以上５×１０４以下であることが好ましく、７．５×１０３以上３×１０４以下であることがより好ましく、１×１０４以上２×１０４以下であることがさらに好ましい。
上記式（Ｉ）中、Ｒ２１〜Ｒ２４は、官能基とコア部分をつなぐリンカー部位である。Ｒ２１〜Ｒ２４は、それぞれ同一でも異なっても良いが、均一な立体構造を有する高強度なゲルを製造するためには同一であることが好ましい。式（Ｉ）中、Ｒ２１〜Ｒ２４は、それぞれ同一又は異なり、Ｃ１〜Ｃ７アルキレン基、Ｃ２〜Ｃ７アルケニレン基、−ＮＨ−Ｒ２５−、−ＣＯ−Ｒ２５−、−Ｒ２６−Ｏ−Ｒ２７−、−Ｒ２６−ＮＨ−Ｒ２７−、−Ｒ２６−ＣＯ２−Ｒ２７−、−Ｒ２６−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒ２７−、−Ｒ２６−ＣＯ−Ｒ２７−、−Ｒ２６−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ２７−、又は−Ｒ２６−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ２７−等である。ここで、Ｒ２５はＣ１〜Ｃ７アルキレン基を示す。Ｒ２６はＣ１〜Ｃ３アルキレン基を示す。Ｒ２７はＣ１〜Ｃ５アルキレン基を示す。
側鎖及び／末端に１以上のチオール基を有し、ポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマーとして好ましい非限定的な具体例には、例えば、４つのポリエチレングリコール骨格の分岐を有し、末端にチオール基を有する下記式（ＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
上記式（ＩＩ）中、ｎ１１〜ｎ１４は、それぞれ同一でも又は異なっても良い。ｎ１１〜ｎ１４の値が近いほど、均一な立体構造をとることができ、高強度となるので好ましく、同一であることが特に好ましい。ｎ１１〜ｎ１４の値が高過ぎるとゲルの強度が弱くなり、ｎ１１〜ｎ１４の値が低過ぎると化合物の立体障害によりゲルが形成されにくい。そのため、ｎ１１〜ｎ１４は、２５以上２５０以下の値であることが好ましく、３５以上１８０以下がより好ましく、５０以上１１５以下がさらに好ましく、５０以上６０以下が特に好ましい。そして、液Ｂにおける多分岐型ポリマーの重量平均分子量は、５×１０３以上５×１０４以下であることが好ましく、７．５×１０３以上３×１０４以下であることがより好ましく、１×１０４以上２×１０４以下であることがさらに好ましい。
上記式（ＩＩ）中、Ｒ１１〜Ｒ１４は、官能基とコア部分をつなぐリンカー部位である。Ｒ１１〜Ｒ１４は、それぞれ同一でも異なっても良いが、均一な立体構造を有する高強度なゲルを製造するためには同一であることが好ましい。式（ＩＩ）中、Ｒ１１〜Ｒ１４は、それぞれ同一又は異なり、Ｃ１〜Ｃ７アルキレン基、Ｃ２〜Ｃ７アルケニレン基、−ＮＨ−Ｒ１５−、−ＣＯ−Ｒ１５−、−Ｒ１６−Ｏ−Ｒ１７−、−Ｒ１６−ＮＨ−Ｒ１７−、−Ｒ１６−ＣＯ２−Ｒ１７−、−Ｒ１６−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒ１７−、−Ｒ１６−ＣＯ−Ｒ１７−、Ｒ１６−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ１７−又は−Ｒ１６−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ１７−等である。ここで、Ｒ１５はＣ１〜Ｃ７アルキレン基を示す。Ｒ１６はＣ１〜Ｃ３アルキレン基を示す。Ｒ１７はＣ１〜Ｃ５アルキレン基を示す。
ここで、「Ｃ１〜Ｃ７アルキレン基」とは、分岐を有しても良い炭素数が１以上７以下のアルキレン基を意味し、直鎖Ｃ１〜Ｃ７アルキレン基又は１つもしくは２つ以上の分岐を有するＣ２〜Ｃ７アルキレン基（分岐を含む炭素数が２以上７以下）を意味する。例として、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基等が挙げられる。より具体的には、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ（ＣＨ３））２−、−（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−（ＣＨ２）３−ＣＨ（ＣＨ３）−、−（ＣＨ２）２−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−（ＣＨ２）６−、−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−、及び−（ＣＨ２）３Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２−等を挙げることができる。
「Ｃ２〜Ｃ７アルケニレン基」とは、鎖中に１個もしくは２個以上の二重結合を有する直鎖状又は分枝鎖状の炭素原子数２〜７個のアルケニレン基であり、例えば、前記アルキレン基から隣り合った炭素原子の水素原子の２〜５個を除いてできる、二重結合を有する２価基が挙げられる。
本明細書において、アルキレン基及びアルケニレン基は、任意の置換基を１個以上有していても良い。そのような置換基として、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれであっても良い）、アミノ基、モノもしくはジ置換アミノ基、置換シリル基、アシル基、又はアリール基等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていても良い。
また、本明細書において、ある官能基について「置換基を有していても良い」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていても良い。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していても良い。
＜緩衝液の種類と濃度＞
本発明の液滴吐出装置用の液セットにおける液Ａ及び液Ｂは、ポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマー成分に加えて、適切な緩衝液を含むことが望ましい。例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸・リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、クエン酸・リン酸緩衝生理食塩水、又は各細胞培養用の培地が挙げられる。液Ａの緩衝液と液Ｂの緩衝液は、同じであっても異なっていても良い。また、液Ａの緩衝液と液Ｂの緩衝液は、それぞれ２種以上の緩衝液を混合して用いても良い。
本発明の液滴吐出装置用の液セットにおける液Ａ及び液Ｂは、ポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマー成分に加えて、適切な緩衝液を含むことが望ましい。例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸・リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、クエン酸・リン酸緩衝生理食塩水、又は各細胞培養用の培地が挙げられる。液Ａの緩衝液と液Ｂの緩衝液は、同じであっても異なっていても良い。また、液Ａの緩衝液と液Ｂの緩衝液は、それぞれ２種以上の緩衝液を混合して用いても良い。
また、緩衝液の濃度は低過ぎると、溶液中のｐＨ緩衝能が低下し、高強度のゲルを製造することができず、逆に、緩衝液濃度が高過ぎても、液Ａに含有されるポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマー成分と液Ｂに含有されるポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマー成分の混合を阻害するために、高強度のゲルを製造することができない。したがって、液Ａ及び液Ｂにおける緩衝液の濃度はそれぞれ２０ｍＭ以上２００ｍＭ以下の範囲内とすることが好ましく、これにより均一構造を有する高強度なゲルを製造することができる。
＜緩衝液のｐＨ及びポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマーの濃度＞
前述のとおり、緩衝液のｐＨ並びに液Ａ及び液Ｂに含有されるポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマーの濃度を調節することで、ゲル化時間を制御することが可能である。これにより細胞の三次元配置に最適なゲル化時間が得られるよう調整することができる。具体的には、液Ａ及び液ＢのｐＨが５以上１０以下となるような緩衝液を用いる。また、液Ａ及び液Ｂに含有されるポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマーの濃度は０．３質量％以上２０質量％以下とする。好ましくは液Ａ及び液ＢのｐＨが６以上１０以下であり、液Ａ及び液Ｂに含有されるポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマーの濃度は１．７質量％以上２０質量％以下であることが好ましい。
前述のとおり、緩衝液のｐＨ並びに液Ａ及び液Ｂに含有されるポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマーの濃度を調節することで、ゲル化時間を制御することが可能である。これにより細胞の三次元配置に最適なゲル化時間が得られるよう調整することができる。具体的には、液Ａ及び液ＢのｐＨが５以上１０以下となるような緩衝液を用いる。また、液Ａ及び液Ｂに含有されるポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマーの濃度は０．３質量％以上２０質量％以下とする。好ましくは液Ａ及び液ＢのｐＨが６以上１０以下であり、液Ａ及び液Ｂに含有されるポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマーの濃度は１．７質量％以上２０質量％以下であることが好ましい。
ｐＨ５未満の酸性溶液であって、かつポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマーの濃度が０．３質量％未満である溶液では、求核性官能基がカチオンの状態となりやすく、互いに反発しやすくなり、カチオン状態の求核性官能基と、もう一方のポリマー成分の電子性官能基との反応性が低下する。これにより、細胞の三次元配置が不可能になる。一方、ポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマーの濃度が２０質量％より高い場合には、インクジェットヘッドから吐出できず、液滴吐出装置用の液としてのインクジェット用インクとして適さない。また、ｐＨが１０より高いアルカリ性溶液中では、上記求核性官能基と求電子性官能基との反応性が高過ぎるため、ゲル化時間が異常に早くなり、各ポリマーがゲルの全体に十分に拡散できず、ゲルが脆くなるため不適である。
また、液Ａ及び液ＢのｐＨが６以上１０以下であり、かつ液Ａ及び液Ｂにおけるポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマーの濃度が１．７質量％以上２０質量％以下であれば、ゲルの造形精度が従来用いられていたアルギン酸ゲルの精度以上になり、細胞をより高精度に三次元配置可能になる。さらに、液Ａ及び液Ｂに線維芽細胞のような接着伸展が可能な細胞を含有させる場合、液Ａ及び液ＢのｐＨが５以上１０以下であり、ポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマーの濃度が０．３質量％以上６．０質量％以下とすることにより、ゲル内に包埋された上記細胞が伸展するスペースを十分に確保することができる。また、液Ａ及び液Ｂにおける多分岐型ポリマーの濃度を０．３質量％以上４．０質量％以下とすることにより、ゲル内の細胞を長期間にわたり生存させることができる。
＜液Ａ及び液Ｂの粘度＞
液Ａ及び液Ｂにおける粘度は、高過ぎると、インクジェットヘッドから吐出できず、液滴吐出装置用の液セットとして適さない。具体的には、液Ａ及び液Ｂの２５℃における粘度は３０ｍＰａ・ｓ以下とする。
液Ａ及び液Ｂにおける粘度は、高過ぎると、インクジェットヘッドから吐出できず、液滴吐出装置用の液セットとして適さない。具体的には、液Ａ及び液Ｂの２５℃における粘度は３０ｍＰａ・ｓ以下とする。
＜求核性官能基と求電子性官能基のモル比＞
上記求核性官能基と求電子性官能基のモル比は、０．５：１〜１．５：１の範囲内となるように液Ａと液Ｂを混合することが好ましい。当該官能基はそれぞれ１：１で反応して架橋し得るので、混合モル比は１：１に近いほど好ましいが、高い強度のハイドロゲルを得るためには０．８：１〜１．２：１の範囲内であることが特に好ましい。
上記求核性官能基と求電子性官能基のモル比は、０．５：１〜１．５：１の範囲内となるように液Ａと液Ｂを混合することが好ましい。当該官能基はそれぞれ１：１で反応して架橋し得るので、混合モル比は１：１に近いほど好ましいが、高い強度のハイドロゲルを得るためには０．８：１〜１．２：１の範囲内であることが特に好ましい。
＜自己組織化生体材料＞
液Ａ及び液Ｂのいずれか一方、又は両方に自己組織化生体材料を混合することができる。自己組織化生体材料は、生体由来の材料であり、かつ、他材料との混合やｐＨ、温度等を調整することで組織化する材料のことである。その種類等について特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、この中でも、細胞の接着因子を含む自己組織化生体材料であれば、本発明の液セットで造形したゲル内において細胞が接着伸展することができる。自己組織化生体材料として、例えば、ジェランガム、アルギン酸カルシウム、アガロース、グァーガム、キサンタンガム、カラギーナン、ペクチン、ローカストビーンガム、タマリンドガム、ダイユータンガム、カルボキシメチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、コラーゲン、ゼラチン、プロテオフリカン、ヒアルロン酸、エンタクチン、エラスチン、キチン、フィブリノーゲン、セルロース、マトリゲル等が使用できる。マトリゲルは、細胞外マトリクスタンパク質を含むマウス肉腫から抽出した可溶性基底膜調製品であり、主成分として、ラミニン及びコラーゲンの他、ヘパラン硫酸プロテオグリカン等を含む。上記のような自己組織化生体材料は、いずれか１種を単独で使用しても良く、２種以上を併用しても良い。
液Ａ及び液Ｂのいずれか一方、又は両方に自己組織化生体材料を混合することができる。自己組織化生体材料は、生体由来の材料であり、かつ、他材料との混合やｐＨ、温度等を調整することで組織化する材料のことである。その種類等について特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、この中でも、細胞の接着因子を含む自己組織化生体材料であれば、本発明の液セットで造形したゲル内において細胞が接着伸展することができる。自己組織化生体材料として、例えば、ジェランガム、アルギン酸カルシウム、アガロース、グァーガム、キサンタンガム、カラギーナン、ペクチン、ローカストビーンガム、タマリンドガム、ダイユータンガム、カルボキシメチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、コラーゲン、ゼラチン、プロテオフリカン、ヒアルロン酸、エンタクチン、エラスチン、キチン、フィブリノーゲン、セルロース、マトリゲル等が使用できる。マトリゲルは、細胞外マトリクスタンパク質を含むマウス肉腫から抽出した可溶性基底膜調製品であり、主成分として、ラミニン及びコラーゲンの他、ヘパラン硫酸プロテオグリカン等を含む。上記のような自己組織化生体材料は、いずれか１種を単独で使用しても良く、２種以上を併用しても良い。
＜細胞＞
液Ａ及び液Ｂのいずれか一方、又は両方に細胞を懸濁させることができる。細胞は、その種類等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、分類学的に、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、全ての細胞を使用することができる。
液Ａ及び液Ｂのいずれか一方、又は両方に細胞を懸濁させることができる。細胞は、その種類等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、分類学的に、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、全ての細胞を使用することができる。
真核細胞としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌等が挙げられる。これらは、いずれか１種を単独で使用しても良く、２種以上を併用しても良い。これらの中でも、動物細胞が好ましく、前記細胞が細胞集合体を形成する場合は、細胞と細胞とが互いに接着し、物理化学的な処理を行わなければ単離しない程度の細胞接着性を有する接着性細胞であることがより好ましい。
接着性細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分化した細胞、未分化の細胞等が挙げられる。
分化した細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞；星細胞；クッパー細胞；血管内皮細胞；類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞；線維芽細胞；骨芽細胞；砕骨細胞；歯根膜由来細胞；表皮角化細胞等の表皮細胞；気管上皮細胞；消化管上皮細胞；子宮頸部上皮細胞；角膜上皮細胞等の上皮細胞；乳腺細胞；ペリサイト；平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞；腎細胞；膵ランゲルハンス島細胞；末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞；軟骨細胞；骨細胞等が挙げられる。前記接着性細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でも良く、又はそれらを何代か継代させたものでも良い。
未分化の細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞；単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞；ｉＰＳ細胞等が挙げられる。
原核細胞としては、例えば、真正細菌、古細菌等が挙げられる。
細胞の具体例として、正常ヒト皮膚線維芽細胞等が挙げられる。正常ヒト皮膚線維芽細胞としては、市販品を用いることができ、前記市販品としては、例えば、商品名：ＣＣ２５０７（Ｌｏｎｚａ社製）等が挙げられる。
＜その他の成分＞
液Ａ及び液Ｂは、必要に応じて、その他の成分を含有することができる。その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培地、架橋剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤等が挙げられる。
液Ａ及び液Ｂは、必要に応じて、その他の成分を含有することができる。その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培地、架橋剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤等が挙げられる。
＜培地＞
前記培地は、三次元構造体の造形と維持に必要な成分を含み、乾燥を防ぎ、浸透圧等の外部環境を整える溶液である。前記培地としては、特に制限はなく、公知の培地の中から用途に応じて適宜選択すれば良い。なお、表面が空気に暴露されている皮膚のように、常時培地内に浸しておく必要のない三次元構造体においては、培地を適宜除去しても良い。
前記培地は、三次元構造体の造形と維持に必要な成分を含み、乾燥を防ぎ、浸透圧等の外部環境を整える溶液である。前記培地としては、特に制限はなく、公知の培地の中から用途に応じて適宜選択すれば良い。なお、表面が空気に暴露されている皮膚のように、常時培地内に浸しておく必要のない三次元構造体においては、培地を適宜除去しても良い。
前記培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、天然培地、半合成培地、合成培地等の組成により分類される種々の培地；半固形培地、液体培地、粉末培地（以下、「粉培地」とも称することがある）等の形状により分類される種々の培地等が挙げられる。これらは、いずれか１種を単独で使用しても良く、２種以上を併用しても良い。細胞が動物由来である場合、動物細胞の培養に用いられる培地であればいずれも用いることができる。
動物細胞の培養に用いられる培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium；Ｄ−ＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ham’s Nutrient Mixture F12）、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（McCoy’s 5A medium）、イーグルＭＥＭ培地（Eagle’s Minimum Essential Medium；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（alpha Modified Eagles’s Minimum Essential Medium；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Minimum Essential Medium）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １０（ケンブレックス社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ−６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（ギブコ社製）、ｍＴｅＳＲ１あるいは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦあるいはリプロＦＦ２（リプロセル社製）、ＰＳＧｒｏ ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（システムバイオサイエンス社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＣＳＴＩ−７培地（細胞科学研究所社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（ギブコ社製）、ＭＦ−Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）等が挙げられる。これらは、いずれか１種を単独で使用しても良く、２種以上を併用しても良い。
培地中の二酸化炭素濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２％以上５％以下が好ましく、３％以上４％以下がより好ましい。前記二酸化炭素濃度が、２％以上５％以下であると、細胞を好適に培養することができる。
＜基材＞
上記の液Ａ及び液Ｂをインクジェットヘッド等の液滴吐出ヘッドから基材上に吐出させ、ゲル化させることにより、三次元構造体を製造することができる。基材としては、細胞の活性や増殖を阻害しないものであれば、その大きさ、形状、構造、材質等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
上記の液Ａ及び液Ｂをインクジェットヘッド等の液滴吐出ヘッドから基材上に吐出させ、ゲル化させることにより、三次元構造体を製造することができる。基材としては、細胞の活性や増殖を阻害しないものであれば、その大きさ、形状、構造、材質等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
基材の大きさとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。基材の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ディッシュ、マルチプレート、フラスコ、セルインサート等の立体形状；ガラスプレート、スライドガラス、カバーガラス等の平板状；平膜状等が挙げられる。
基材の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、多孔質構造、メッシュ構造、凹凸構造、ハニカム構造等が挙げられる。
また、基材の材質としては、例えば、有機材料、無機材料等が挙げられる。これらは、いずれか１種を単独で使用しても良く、２種以上を併用しても良い。
有機材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、トリアセチルセルロース（ＴＡＣ）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、ウレタンアクリレート等のアクリル系材料、セルロース等が挙げられる。
無機材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガラス、セラミックス等が挙げられる。
＜インクジェット方式＞
インクジェット法（液滴吐出法）としては、例えば、オンデマンド方式、コンティニュアス方式等が挙げられる。これらの中でも、コンティニュアス方式は、安定的な吐出状態に至るまでの空吐出があり、液滴量の調整が必要であり、ウェルプレートの各ウェル間を移動する際にも連続的に液滴形成を行い続ける等の理由から、用いる懸濁液のデッドボリュームが多くなる傾向にあるため、上記２つの方式ではオンデマンド方式の方がより好適である。
インクジェット法（液滴吐出法）としては、例えば、オンデマンド方式、コンティニュアス方式等が挙げられる。これらの中でも、コンティニュアス方式は、安定的な吐出状態に至るまでの空吐出があり、液滴量の調整が必要であり、ウェルプレートの各ウェル間を移動する際にも連続的に液滴形成を行い続ける等の理由から、用いる懸濁液のデッドボリュームが多くなる傾向にあるため、上記２つの方式ではオンデマンド方式の方がより好適である。
オンデマンド方式としては、例えば、静電引力によって液滴を引っ張ることによって液滴を形成する静電方式等の既知の複数の方式、液体に圧力を加えることによって液体を吐出する圧力印加方式、加熱による膜沸騰によって液体を吐出するサーマル方式等が挙げられる。これらの中でも、以下の理由から、圧力印加方式が好ましい。
静電方式は、懸濁液を保持して液滴を形成する吐出部に対向して電極を設置する必要があるが、基材構成の自由度を上げるためには電極の配置は無い方が好ましい。
サーマル方式は、局所的な加熱が発生するため、本発明の液セットに用いられるポリマー成分や生体材料である細胞への影響、ヒーター部への焦げ付き（コゲーション）が懸念される。熱による影響は、含有物や基材の用途に依存するため、一概に除外する必要はないが、圧力印加方式は、サーマル方式よりヒーター部への焦げ付きの懸念がないという点で好ましい。
圧力印加方式としては、ピエゾ素子を用いて液体に圧力を加える方式、電磁バルブ等のバルブによって圧力を加える方式等がある。液滴吐出に使用可能な液滴吐出装置の構成例を図１〜３に示す。
図１は、電磁バルブ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。電磁バルブ方式の吐出ヘッドは、電動機１３ａ、電磁弁１１２、液体収容部としての液室を構成する液室壁１１ａ、液３００ａ、及びノズル１１１ａを有する。電磁バルブ方式の吐出ヘッドとしては、例えば、ＴｅｃｈＥｌａｎ社のディスペンサ等が適用可能である。
また、図２は、ピエゾ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。ピエゾ方式の吐出ヘッドは、圧電素子１３ｂ、液体収容部としての液室を構成する液室壁１１ｂ、液３００ｂ、及びノズル１１１ｂを有する。ピエゾ方式の吐出ヘッドとしては、Ｃｙｔｅｎａ社のシングルセルプリンター等がある。
これらの吐出ヘッドはいずれも用いることが可能であるが、電磁バルブによる圧力印加方式では液滴を連続的に押し出して形成するため、液滴を高速に繰り返し形成することができず、精度良く三次元構造体を造形することができない。そのため、高精度な三次元構造体の造形と、製造のスループットの向上とを両立可能なピエゾ方式を用いることが好ましい。
また、細胞を含有させた液を用いる場合、一般的な圧電素子１３ｂを用いたピエゾ方式の吐出ヘッドでは、細胞の沈降によって細胞濃度のムラが発生することや、ノズル詰まりが生じることが問題となる場合がある。このため、より好ましい構成として、図３に示した構成等が挙げられる。図３は、図２における圧電素子を用いたピエゾ方式の吐出ヘッドの変形例を示す模式図である。図３の吐出ヘッドは、圧電素子１３ｃ、液体収容部としての液室を構成する液室壁１１ｃ、液３００ｃ、及びノズル１１１ｃを有する。
図３の吐出ヘッドでは、図示していない制御装置からの電圧を圧電素子１３ｃに対して印加することにより、紙面横方向に圧縮応力が加わりメンブレン１２ｃを紙面上下方向に変形させることができる。
図４は、圧電素子に印加する電圧の一例を示す模式図である。また、図５は、圧電素子に印加する電圧の他の一例を示す模式図である。図４は、液滴を形成するための駆動電圧を示す。電圧（ＶＡ、ＶＢ、ＶＣ）の強弱により、液滴を形成することができる。図５は、液滴の吐出を行わずに液（インク、懸濁液）を撹拌するための電圧を示している。すなわち、液滴を吐出しない期間中に、液滴を吐出するほどには強くない複数のパルスを入力することによって、液室内の液を撹拌することが可能であり、細胞沈降による濃度分布の発生を抑制することができる。
三次元構造体は、基材上に液Ａ及び液Ｂをインクジェットヘッドで吐出し、ゲル化させることにより形成することができる。液Ａ及び液Ｂは、基材上に別々に吐出し、基材上で混合させてゲル化させても良いし、吐出する直前に液Ａ及び液Ｂを混合し、ゲル化前に吐出し、基材上でゲル化反応を完了させて三次元構造体を形成しても良い。また、液Ａ及び液Ｂを別々に吐出する場合は、液Ａ及び液Ｂを吐出した後に、再度、液Ａ及び液Ｂを吐出する工程を複数回繰り返しても良い。
次に、実施例及び比較例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、無水リン酸水素二ナトリウム（型番：１９７−０２８６５、和光純薬株式会社製）１．１５ｇとリン酸二水素ナトリウム０．２２８ｇ（型番：１９７−０９７０５、和光純薬株式会社製）を超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは７．４であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、無水リン酸水素二ナトリウム（型番：１９７−０２８６５、和光純薬株式会社製）１．１５ｇとリン酸二水素ナトリウム０．２２８ｇ（型番：１９７−０９７０５、和光純薬株式会社製）を超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは７．４であった。
・液Ａの調製
末端にマレイミジル基を有するＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル（商品名：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＰＴＥ−１００ＭＡ、油化産業株式会社製、重量平均分子量１０，０００）０．３９ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルター（商品名：Ｍｉｎｉｓａｒｔ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ １７５４９７Ｋ、ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）で濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が１９．５質量％である液Ａを調製した。
末端にマレイミジル基を有するＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル（商品名：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＰＴＥ−１００ＭＡ、油化産業株式会社製、重量平均分子量１０，０００）０．３９ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルター（商品名：Ｍｉｎｉｓａｒｔ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ １７５４９７Ｋ、ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）で濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が１９．５質量％である液Ａを調製した。
・液Ｂの調製
末端にチオール基を有するＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ（商品名：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＰＴＥ−１００ＳＨ、油化産業株式会社製、重量平均分子量１０，０００）０．３９ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルター（商品名：Ｍｉｎｉｓａｒｔ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ １７５４９７Ｋ、ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）で濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が１９．５質量％である液Ｂを調製した。
末端にチオール基を有するＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ（商品名：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＰＴＥ−１００ＳＨ、油化産業株式会社製、重量平均分子量１０，０００）０．３９ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルター（商品名：Ｍｉｎｉｓａｒｔ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ １７５４９７Ｋ、ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）で濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が１９．５質量％である液Ｂを調製した。
・細胞の培養
インキュベーター（商品名：ＫＭ−ＣＣ１７ＲＵ２、パナソニック株式会社製、３７℃、５体積％ＣＯ２環境）内において、１０質量％ウシ胎児血清（以下、「ＦＢＳ」とも称することがある）及び１質量％抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｄ Ｓｔｏｃｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００ｘ）、ナカライテスク株式会社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（商品名：ＤＭＥＭ（１Ｘ）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、以下、「ＤＭＥＭ」とも称することがある）を用い、１００ｍｍディッシュ４枚にて市販の正常ヒト皮膚線維芽細胞（商品名：ＣＣ２５０７、Ｌｏｎｚａ社製以下、「ＮＨＤＦ」とも称することがある）を７２時間培養した。
インキュベーター（商品名：ＫＭ−ＣＣ１７ＲＵ２、パナソニック株式会社製、３７℃、５体積％ＣＯ２環境）内において、１０質量％ウシ胎児血清（以下、「ＦＢＳ」とも称することがある）及び１質量％抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｄ Ｓｔｏｃｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００ｘ）、ナカライテスク株式会社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（商品名：ＤＭＥＭ（１Ｘ）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、以下、「ＤＭＥＭ」とも称することがある）を用い、１００ｍｍディッシュ４枚にて市販の正常ヒト皮膚線維芽細胞（商品名：ＣＣ２５０７、Ｌｏｎｚａ社製以下、「ＮＨＤＦ」とも称することがある）を７２時間培養した。
・細胞の染色
冷凍保存された緑色蛍光染料（商品名：Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を室温（２５℃）まで解凍し、１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）の濃度でジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」とも称することがある）へ溶解させ、ＦＢＳなしＤＭＥＭと混合し、濃度１０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）の緑色蛍光染料含有ＦＢＳなしＤＭＥＭを調製した。次に、培養したＮＨＤＦのディッシュ４枚に前記緑色蛍光染料含有ＦＢＳなしＤＭＥＭをディッシュ１枚あたり５ｍＬ添加し、インキュベーター内で３０分間染色した。その後、アスピレータを用いて上澄みを除去した。ディッシュに、ダルベッコりん酸緩衝生理食塩水（商品名：ＤＰＢＳ（１Ｘ）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、以下「ＤＰＢＳ」とも称することがある）をディッシュ１枚あたり５ｍＬ加え、アスピレータでＤＰＢＳを吸引除去し、表面を洗浄した。ＤＰＢＳによる洗浄作業を２回繰り返した後、０．０５質量％トリプシン−０．０５質量％ＥＤＴＡ溶液（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）をディッシュ１枚あたり２ｍＬ加え、インキュベーター内にて５分間加温し、ディッシュから細胞を剥離した。位相差顕微鏡（装置名：ＣＫＸ４１、オリンパス株式会社製）により細胞の剥離を確認後、ＦＢＳ入りＤＭＥＭをディッシュ１枚あたり４ｍＬ加え、トリプシンを失活させた。ディッシュ４枚分の細胞懸濁液を５０ｍｌ遠沈管１本に移し、遠心分離（商品名：Ｈ−１９ＦＭ、ＫＯＫＵＳＡＮ社製、１．２×１０３ｒｐｍ、５分間、５℃）を行い、アスピレータを用いて上清を除去した。除去後、遠沈管にＦＢＳ入りＤＭＥＭを２ｍＬ添加し、穏やかにピペッティングを行い、細胞を分散させ細胞懸濁液を得た。その細胞懸濁液から２０μＬをエッペンドルフチューブに取り出し、０．４質量％トリパンブルー染色液２０μＬを加えてピペッティングを行った。染色した細胞懸濁液から２０μＬ取り出してＰＭＭＡ製プラスチックスライドに乗せ、セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、インビトロジェン社製）を用いて細胞数を計測し、液の細胞数を求めた。
冷凍保存された緑色蛍光染料（商品名：Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を室温（２５℃）まで解凍し、１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）の濃度でジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」とも称することがある）へ溶解させ、ＦＢＳなしＤＭＥＭと混合し、濃度１０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）の緑色蛍光染料含有ＦＢＳなしＤＭＥＭを調製した。次に、培養したＮＨＤＦのディッシュ４枚に前記緑色蛍光染料含有ＦＢＳなしＤＭＥＭをディッシュ１枚あたり５ｍＬ添加し、インキュベーター内で３０分間染色した。その後、アスピレータを用いて上澄みを除去した。ディッシュに、ダルベッコりん酸緩衝生理食塩水（商品名：ＤＰＢＳ（１Ｘ）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、以下「ＤＰＢＳ」とも称することがある）をディッシュ１枚あたり５ｍＬ加え、アスピレータでＤＰＢＳを吸引除去し、表面を洗浄した。ＤＰＢＳによる洗浄作業を２回繰り返した後、０．０５質量％トリプシン−０．０５質量％ＥＤＴＡ溶液（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）をディッシュ１枚あたり２ｍＬ加え、インキュベーター内にて５分間加温し、ディッシュから細胞を剥離した。位相差顕微鏡（装置名：ＣＫＸ４１、オリンパス株式会社製）により細胞の剥離を確認後、ＦＢＳ入りＤＭＥＭをディッシュ１枚あたり４ｍＬ加え、トリプシンを失活させた。ディッシュ４枚分の細胞懸濁液を５０ｍｌ遠沈管１本に移し、遠心分離（商品名：Ｈ−１９ＦＭ、ＫＯＫＵＳＡＮ社製、１．２×１０３ｒｐｍ、５分間、５℃）を行い、アスピレータを用いて上清を除去した。除去後、遠沈管にＦＢＳ入りＤＭＥＭを２ｍＬ添加し、穏やかにピペッティングを行い、細胞を分散させ細胞懸濁液を得た。その細胞懸濁液から２０μＬをエッペンドルフチューブに取り出し、０．４質量％トリパンブルー染色液２０μＬを加えてピペッティングを行った。染色した細胞懸濁液から２０μＬ取り出してＰＭＭＡ製プラスチックスライドに乗せ、セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、インビトロジェン社製）を用いて細胞数を計測し、液の細胞数を求めた。
・染色された細胞懸濁液の作製
上記染色された細胞懸濁液の一部をエッペンドルフチューブに移し、遠心分離（装置名：ｍｉｎｉＳ ｐｉｎ、エッペンドルフ社製、２．５×１０３ｒｐｍ、１分間）を行い、次に、ピペットを用いて上清を除去した。除去後、ＦＢＳなしＤＭＥＭを添加し、細胞濃度が１×１０６個／ｍＬの染色された細胞懸濁液を得た。
上記染色された細胞懸濁液の一部をエッペンドルフチューブに移し、遠心分離（装置名：ｍｉｎｉＳ ｐｉｎ、エッペンドルフ社製、２．５×１０３ｒｐｍ、１分間）を行い、次に、ピペットを用いて上清を除去した。除去後、ＦＢＳなしＤＭＥＭを添加し、細胞濃度が１×１０６個／ｍＬの染色された細胞懸濁液を得た。
・基材の準備
Ｓｙｌｇａｒｄ１８４ ＳＩＬＩＣＯＮＥ Ｅｌａｓｔｏｍｅｒ Ｋｉｔ ０．５ｋｇ ＫＩＴ（型番：４０１９８６２、ＤＯＷ ＳＩＬＩＣＯＮＥＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製）を用いて厚み２００μｍ厚のシリコーンゴム（ＰＤＭＳ）の板を作製した。得られたＰＤＭＳを１ｃｍ角に切り出した。
Ｓｙｌｇａｒｄ１８４ ＳＩＬＩＣＯＮＥ Ｅｌａｓｔｏｍｅｒ Ｋｉｔ ０．５ｋｇ ＫＩＴ（型番：４０１９８６２、ＤＯＷ ＳＩＬＩＣＯＮＥＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製）を用いて厚み２００μｍ厚のシリコーンゴム（ＰＤＭＳ）の板を作製した。得られたＰＤＭＳを１ｃｍ角に切り出した。
１８ｍｍ角のカバーガラス（商品名：Ｎｏ．１ Ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ０．１３〜０．１７ｍｍ、松波硝子製）の上に、上記１ｃｍ角のＰＤＭＳの板を間に空気が入らないように載せた。前記カバーガラスとＰＤＭＳの板を３．５ｃｍディッシュ（型番：３０００−０３５、ＡＧＣテクノグラス製）の中に入れた。そして、安全キャビネットの中に上記３．５ｃｍディッシュを入れ、ＵＶライトを１５分照射して滅菌したものを基材とした。
・ゲルの作製
上記液Ａ及び液Ｂにそれぞれヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液（型番：Ｐ１３０４ＭＰ、サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を８μｌ添加した。図３のピエゾ方式の吐出ヘッド（ノズル径１００μｍ）を用いて、吐出周波数１００Ｈｚで上記基材上の同一箇所に上記ＰＩ溶液入りの液Ａを５０滴吐出し、次に上記ＰＩ溶液入りの液Ｂを５０滴吐出し、１秒静置した。上記ＰＩ溶液入りの液Ａの吐出、ＰＩ溶液入りの液Ｂの吐出、１秒静置の動作を１４０回繰り返し、上記基材上にドーム形状のゲルを作製した。
上記液Ａ及び液Ｂにそれぞれヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液（型番：Ｐ１３０４ＭＰ、サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を８μｌ添加した。図３のピエゾ方式の吐出ヘッド（ノズル径１００μｍ）を用いて、吐出周波数１００Ｈｚで上記基材上の同一箇所に上記ＰＩ溶液入りの液Ａを５０滴吐出し、次に上記ＰＩ溶液入りの液Ｂを５０滴吐出し、１秒静置した。上記ＰＩ溶液入りの液Ａの吐出、ＰＩ溶液入りの液Ｂの吐出、１秒静置の動作を１４０回繰り返し、上記基材上にドーム形状のゲルを作製した。
・ゲル表面への細胞の配置
図３のピエゾ方式の細胞吐出ヘッド（ノズル径１００μｍ）を用いて、上記のドーム形状のゲルの表面に上記染色された細胞懸濁液を６０００滴吐出し、ゲルの表面に細胞３０００個を配置した。その後、速やかに３．５ｃｍディッシュの中にマイクロピペットでＦＢＳ入りＤＭＥＭ３ｍｌを添加し、インキュベーター（３７℃、５体積％ＣＯ２環境）内に入れた。これにより、「表面に細胞を配置したゲル」を作製した。
図３のピエゾ方式の細胞吐出ヘッド（ノズル径１００μｍ）を用いて、上記のドーム形状のゲルの表面に上記染色された細胞懸濁液を６０００滴吐出し、ゲルの表面に細胞３０００個を配置した。その後、速やかに３．５ｃｍディッシュの中にマイクロピペットでＦＢＳ入りＤＭＥＭ３ｍｌを添加し、インキュベーター（３７℃、５体積％ＣＯ２環境）内に入れた。これにより、「表面に細胞を配置したゲル」を作製した。
・染色なし細胞懸濁液の作製
上記と同様の方法で細胞を培養し、細胞の染色はせずに細胞懸濁液を作製した。
上記と同様の方法で細胞を培養し、細胞の染色はせずに細胞懸濁液を作製した。
・細胞懸濁した液Ａの調製
上記の染色なし細胞懸濁液１２５μｌをエッペンドルフチューブに移し遠心分離（２．５×１０３ｒｐｍ、１分間）を行い、マイクロピペットを用いて上清を除去した。上記エッペンドルフチューブに、液Ａを２５０μｌ添加して、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度１９．５質量％、細胞濃度５×１０５個／ｍｌの細胞懸濁した液Ａを調製した。
上記の染色なし細胞懸濁液１２５μｌをエッペンドルフチューブに移し遠心分離（２．５×１０３ｒｐｍ、１分間）を行い、マイクロピペットを用いて上清を除去した。上記エッペンドルフチューブに、液Ａを２５０μｌ添加して、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度１９．５質量％、細胞濃度５×１０５個／ｍｌの細胞懸濁した液Ａを調製した。
・細胞懸濁した液Ｂの調製
液Ａと同様にして、液Ｂについても上記エッペンドルフチューブに液Ｂを２５０μｌ添加して、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度１９．５質量％、細胞濃度５×１０５個／ｍｌの細胞懸濁した液Ｂを調製した。
液Ａと同様にして、液Ｂについても上記エッペンドルフチューブに液Ｂを２５０μｌ添加して、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度１９．５質量％、細胞濃度５×１０５個／ｍｌの細胞懸濁した液Ｂを調製した。
・細胞がゲル内に三次元積層されているゲルのインクジェットヘッドでの作製
上記と同様の方法で基材を準備した。ゲルの作製は上記の「ゲル表面への細胞の配置」の液Ａを細胞懸濁した液Ａに変更し、液Ｂを細胞懸濁した液Ｂに変更する以外は同様に実施した。その後、速やかに３．５ｃｍディッシュの中にマイクロピペットでＤＭＥＭ３ｍｌ添加し、インキュベーター（３７℃、５体積％ＣＯ２環境）内に入れ２４時間培養した。これにより、インクジェットヘッドで「細胞がゲル内に三次元積層されているゲル」を作製した。
上記と同様の方法で基材を準備した。ゲルの作製は上記の「ゲル表面への細胞の配置」の液Ａを細胞懸濁した液Ａに変更し、液Ｂを細胞懸濁した液Ｂに変更する以外は同様に実施した。その後、速やかに３．５ｃｍディッシュの中にマイクロピペットでＤＭＥＭ３ｍｌ添加し、インキュベーター（３７℃、５体積％ＣＯ２環境）内に入れ２４時間培養した。これにより、インクジェットヘッドで「細胞がゲル内に三次元積層されているゲル」を作製した。
〔実施例２〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、無水リン酸水素二ナトリウム０．７６ｇと無水クエン酸０．４３ｇ（型番：０３０−０５５２５、和光純薬株式会社製）を超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは５．２であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、無水リン酸水素二ナトリウム０．７６ｇと無水クエン酸０．４３ｇ（型番：０３０−０５５２５、和光純薬株式会社製）を超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは５．２であった。
・液Ａの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル０．００７ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が０．３５質量％である液Ａを調製した。
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル０．００７ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が０．３５質量％である液Ａを調製した。
・液Ｂの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ０．００７ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が０．３５質量％である液Ｂを調製した。
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ０．００７ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が０．３５質量％である液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例３〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、無水リン酸水素二ナトリウム０．９４ｇと無水クエン酸０．３２ｇを超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは６．２であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、無水リン酸水素二ナトリウム０．９４ｇと無水クエン酸０．３２ｇを超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは６．２であった。
・液Ａの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル０．０３６ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が１．８質量％である液Ａを調製した。
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル０．０３６ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が１．８質量％である液Ａを調製した。
・液Ｂの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ０．０３６ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が１．８質量％である液Ｂを調製した。
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ０．０３６ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が１．８質量％である液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例４〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、無水リン酸水素二ナトリウム０．８６ｇと無水クエン酸０．３８ｇを超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは５．８であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、無水リン酸水素二ナトリウム０．８６ｇと無水クエン酸０．３８ｇを超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは５．８であった。
・液Ａの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル０．０３２ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が１．６質量％である液Ａを調製した。
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル０．０３２ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が１．６質量％である液Ａを調製した。
・液Ｂの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ０．０３２ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が１．６質量％である液Ｂを調製した。
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ０．０３２ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が１．６質量％である液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例５〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、水酸化ナトリウム０．１１ｇ（型番：１３１０−７３−２、和光純薬株式会社製）とグリシン０．３７５ｇ（型番：０７３−００７３２、和光純薬株式会社製）を超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは９．８であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、水酸化ナトリウム０．１１ｇ（型番：１３１０−７３−２、和光純薬株式会社製）とグリシン０．３７５ｇ（型番：０７３−００７３２、和光純薬株式会社製）を超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは９．８であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例１の緩衝液を上記のｐＨは９．８の緩衝液に変更した以外は、実施例１と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
実施例１の緩衝液を上記のｐＨは９．８の緩衝液に変更した以外は、実施例１と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例６〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例２と同様に調製した。ｐＨは５．２であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例２と同様に調製した。ｐＨは５．２であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例１の緩衝液を上記のｐＨは５．２の緩衝液に変更した以外は、実施例１と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
実施例１の緩衝液を上記のｐＨは５．２の緩衝液に変更した以外は、実施例１と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例７〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例５と同様に調製した。ｐＨは９．８であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例５と同様に調製した。ｐＨは９．８であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例２の緩衝液を上記のｐＨは９．８の緩衝液に変更した以外は、実施例２と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
実施例２の緩衝液を上記のｐＨは９．８の緩衝液に変更した以外は、実施例２と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例８〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例５と同様に調製した。ｐＨは９．８であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例５と同様に調製した。ｐＨは９．８であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例３の緩衝液を上記のｐＨ９．８の緩衝液に変更した以外は、実施例３と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
実施例３の緩衝液を上記のｐＨ９．８の緩衝液に変更した以外は、実施例３と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例９〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様に調製した。ｐＨは７．４であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様に調製した。ｐＨは７．４であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例１において、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの重量を０．１１６ｇに変更し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量を０．１１６ｇに変更した以外は、実施例１と同様に実施した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度５．８質量％の液Ａ、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度５．８質量％の液Ｂを調製した。
実施例１において、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの重量を０．１１６ｇに変更し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量を０．１１６ｇに変更した以外は、実施例１と同様に実施した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度５．８質量％の液Ａ、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度５．８質量％の液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例１０〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様に調製した。ｐＨは７．４であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様に調製した。ｐＨは７．４であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例１において、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの重量を０．１２４ｇに変更し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量を０．１２４ｇに変更した以外は、実施例１と同様に実施した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度６．２質量％の液Ａ、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度６．２質量％の液Ｂを調製した。
実施例１において、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの重量を０．１２４ｇに変更し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量を０．１２４ｇに変更した以外は、実施例１と同様に実施した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度６．２質量％の液Ａ、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度６．２質量％の液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例１１〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例２と同様にして調製した。ｐＨは５．２であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例２と同様にして調製した。ｐＨは５．２であった。
・トロンビン液の調製
トロンビン（商品名：Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ Ｐｌａｓｍａ、Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ社製）が２００Ｕ／ｍＬになるようにＤＰＢＳで希釈し、トロンビン液を調製した。
トロンビン（商品名：Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ Ｐｌａｓｍａ、Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ社製）が２００Ｕ／ｍＬになるようにＤＰＢＳで希釈し、トロンビン液を調製した。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例２と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した後、液Ａにはフィブリノーゲン（商品名：Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｐｌａｓｍａ、Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ社製）０．０２ｇを添加してマイクロチューブローテータ（型番：ＭＴＲ−１０３、アイリス株式会社製）で溶解させ、液Ｂには上記トロンビン液を５０μｌ添加した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度０．３５質量％、フィブリノーゲンの濃度１．０質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度０．３５質量％、トロンビンの濃度５Ｕ／ｍｌの液Ｂを調製した。
実施例２と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した後、液Ａにはフィブリノーゲン（商品名：Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｐｌａｓｍａ、Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ社製）０．０２ｇを添加してマイクロチューブローテータ（型番：ＭＴＲ−１０３、アイリス株式会社製）で溶解させ、液Ｂには上記トロンビン液を５０μｌ添加した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度０．３５質量％、フィブリノーゲンの濃度１．０質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度０．３５質量％、トロンビンの濃度５Ｕ／ｍｌの液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例１２〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例２と同様にして調製した。ｐＨは５．２であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例２と同様にして調製した。ｐＨは５．２であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例２と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した後、それぞれにマトリゲル原液（型番：３５４２３４、Ｃｏｒｎｉｎｇ製）２０μｌを添加した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度０．３５質量％、マトリゲルの濃度０．１質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度０．３５質量％、マトリゲルの濃度０．１質量％の液Ｂを調製した。
実施例２と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した後、それぞれにマトリゲル原液（型番：３５４２３４、Ｃｏｒｎｉｎｇ製）２０μｌを添加した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度０．３５質量％、マトリゲルの濃度０．１質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度０．３５質量％、マトリゲルの濃度０．１質量％の液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例１３〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例９と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した後、液Ａにはフィブリノーゲン０．０２ｇを添加してマイクロチューブローテータで溶解させ、液Ｂには実施例１１に記載のトロンビン液を５０μｌ添加した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度５．８質量％、フィブリノーゲンの濃度１．０質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度５．８質量％、トロンビンの濃度５Ｕ／ｍｌの液Ｂを調製した。
実施例９と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した後、液Ａにはフィブリノーゲン０．０２ｇを添加してマイクロチューブローテータで溶解させ、液Ｂには実施例１１に記載のトロンビン液を５０μｌ添加した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度５．８質量％、フィブリノーゲンの濃度１．０質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度５．８質量％、トロンビンの濃度５Ｕ／ｍｌの液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例１４〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例９と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した後、それぞれにマトリゲル原液２０μｌを添加した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度５．８質量％、マトリゲルの濃度０．１質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度５．８質量％、マトリゲルの濃度０．１質量％の液Ｂを調製した。
実施例９と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した後、それぞれにマトリゲル原液２０μｌを添加した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度５．８質量％、マトリゲルの濃度０．１質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度５．８質量％、マトリゲルの濃度０．１質量％の液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例１５〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例１０と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した後、液Ａにはフィブリノーゲン０．０２ｇを添加してマイクロチューブローテータで溶解させ、液Ｂには実施例１１に記載のトロンビン液を５０μｌ添加した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度６．２質量％、フィブリノーゲンの濃度１．０質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度６．２質量％、トロンビンの濃度５Ｕ／ｍｌの液Ｂを調製した。
実施例１０と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した後、液Ａにはフィブリノーゲン０．０２ｇを添加してマイクロチューブローテータで溶解させ、液Ｂには実施例１１に記載のトロンビン液を５０μｌ添加した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度６．２質量％、フィブリノーゲンの濃度１．０質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度６．２質量％、トロンビンの濃度５Ｕ／ｍｌの液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例１６〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、無水リン酸水素二ナトリウム０．７３ｇと無水クエン酸０．４７ｇを超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは５．０であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、無水リン酸水素二ナトリウム０．７３ｇと無水クエン酸０．４７ｇを超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは５．０であった。
・液Ａの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル０．００６ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が０．３質量％である液Ａを調製した。
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル０．００６ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が０．３質量％である液Ａを調製した。
・液Ｂの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ０．００６ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が０．３質量％である液Ｂを調製した。
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ０．００６ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が０．３質量％である液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例１７〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１６と同様に調製した。ｐＨは５．０であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１６と同様に調製した。ｐＨは５．０であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例１６において、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの重量を０．０８ｇに変更し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量を０．０８ｇに変更した以外は、実施例１６と同様に実施した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度４．０質量％の液Ａ、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度４．０質量％の液Ｂを調製した。
実施例１６において、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの重量を０．０８ｇに変更し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量を０．０８ｇに変更した以外は、実施例１６と同様に実施した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度４．０質量％の液Ａ、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度４．０質量％の液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例１８〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、水酸化ナトリウム０．１３ｇとグリシン０．３７５ｇを超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは１０．０であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、水酸化ナトリウム０．１３ｇとグリシン０．３７５ｇを超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは１０．０であった。
・液Ａの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル０．０８ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が４．０質量％である液Ａを調製した。
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル０．０８ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が４．０質量％である液Ａを調製した。
・液Ｂの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ０．０８ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が４．０質量％である液Ｂを調製した。
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ０．０８ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が４．０質量％である液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例１９〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１８と同様に調製した。ｐＨは１０．０であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１８と同様に調製した。ｐＨは１０．０であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例１８において、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの重量を０．００６ｇに変更し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量を０．００６ｇに変更した以外は、実施例１８と同様に実施した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度０．３質量％の液Ａ、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度０．３質量％の液Ｂを調製した。
実施例１８において、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの重量を０．００６ｇに変更し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量を０．００６ｇに変更した以外は、実施例１８と同様に実施した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度０．３質量％の液Ａ、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度０．３質量％の液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例２０〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例１に記載のＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量をそれぞれ０．４０ｇに変更し、それぞれの液の濃度を２０．０質量％に変更した以外は、実施例１と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
実施例１に記載のＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量をそれぞれ０．４０ｇに変更し、それぞれの液の濃度を２０．０質量％に変更した以外は、実施例１と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例２１〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例１に記載のＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量をそれぞれ０．０８ｇに変更し、それぞれの液の濃度を４．０質量％に変更した以外は、実施例１と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
実施例１に記載のＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量をそれぞれ０．０８ｇに変更し、それぞれの液の濃度を４．０質量％に変更した以外は、実施例１と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例２２〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例１に記載のＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量をそれぞれ０．０４ｇに変更し、それぞれの液の濃度を２．０質量％に変更した以外は、実施例１と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
実施例１に記載のＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量をそれぞれ０．０４ｇに変更し、それぞれの液の濃度を２．０質量％に変更した以外は、実施例１と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例２３〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例１に記載のＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量をそれぞれ０．０２ｇに変更し、それぞれの液の濃度を１．０質量％に変更した以外は、実施例１と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
実施例１に記載のＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量をそれぞれ０．０２ｇに変更し、それぞれの液の濃度を１．０質量％に変更した以外は、実施例１と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例２４〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例１に記載のＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量をそれぞれ０．００６ｇに変更し、それぞれの液の濃度を０．３質量％に変更した以外は、実施例１と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
実施例１に記載のＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量をそれぞれ０．００６ｇに変更し、それぞれの液の濃度を０．３質量％に変更した以外は、実施例１と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例２５〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、無水リン酸水素二ナトリウム２．６９ｇと無水リン酸二水素ナトリウム０．１３ｇを超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは８．０であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、無水リン酸水素二ナトリウム２．６９ｇと無水リン酸二水素ナトリウム０．１３ｇを超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは８．０であった。
・液Ａの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル０．０８ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が４．０質量％である液Ａを調製した。
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル０．０８ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が４．０質量％である液Ａを調製した。
・液Ｂの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ０．０８ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が４．０質量％である液Ｂを調製した。
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ０．０８ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が４．０質量％である液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例２６〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例２５と同様にして調製した。ｐＨは８．０であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例２５と同様にして調製した。ｐＨは８．０であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例２５に記載のＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量をそれぞれ０．００６ｇに変更し、それぞれの液の濃度を０．３質量％に変更した以外は、実施例２５と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
実施例２５に記載のＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量をそれぞれ０．００６ｇに変更し、それぞれの液の濃度を０．３質量％に変更した以外は、実施例２５と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例２７〕
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例２２の緩衝液をＤＭＥＭに変更する以外は、実施例２２と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。ｐＨは７．４であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例２２の緩衝液をＤＭＥＭに変更する以外は、実施例２２と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。ｐＨは７．４であった。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例２８〕
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例２３の緩衝液をＤＭＥＭに変更する以外は、実施例２３と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。ｐＨは７．４であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例２３の緩衝液をＤＭＥＭに変更する以外は、実施例２３と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。ｐＨは７．４であった。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例２９〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例２２と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した後、液Ａにはフィブリノーゲン０．００２ｇを添加してマイクロチューブローテータで溶解させ、液Ｂには実施例１１に記載のトロンビン液を５０μｌ添加した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度２．０質量％、フィブリノーゲンの濃度０．１質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度２．０質量％、トロンビンの濃度５Ｕ／ｍｌの液Ｂを調製した。
実施例２２と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した後、液Ａにはフィブリノーゲン０．００２ｇを添加してマイクロチューブローテータで溶解させ、液Ｂには実施例１１に記載のトロンビン液を５０μｌ添加した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度２．０質量％、フィブリノーゲンの濃度０．１質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度２．０質量％、トロンビンの濃度５Ｕ／ｍｌの液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例３０〕
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例２９のフィブリノーゲンの添加量を０．０２ｇに変更する以外は、実施例２９と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度２．０質量％、フィブリノーゲンの濃度１．０質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度２．０質量％、トロンビンの濃度５Ｕ／ｍｌの液Ｂを調製した。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例２９のフィブリノーゲンの添加量を０．０２ｇに変更する以外は、実施例２９と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度２．０質量％、フィブリノーゲンの濃度１．０質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度２．０質量％、トロンビンの濃度５Ｕ／ｍｌの液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例３１〕
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例２９のフィブリノーゲンの添加量を０．０３ｇに変更する以外は、実施例２９と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度２．０質量％、フィブリノーゲンの濃度１．５質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度２．０質量％、トロンビンの濃度５Ｕ／ｍｌの液Ｂを調製した。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例２９のフィブリノーゲンの添加量を０．０３ｇに変更する以外は、実施例２９と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度２．０質量％、フィブリノーゲンの濃度１．５質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度２．０質量％、トロンビンの濃度５Ｕ／ｍｌの液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例３２〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例２２と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した後、それぞれにマトリゲル原液１０μｌを添加した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度２．０質量％、マトリゲルの濃度０．０５質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度２．０質量％、マトリゲルの濃度０．０５質量％の液Ｂを調製した。
実施例２２と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した後、それぞれにマトリゲル原液１０μｌを添加した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度２．０質量％、マトリゲルの濃度０．０５質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度２．０質量％、マトリゲルの濃度０．０５質量％の液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例３３〕
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例３２のマトリゲル原液の添加量を２０μｌに変更する以外は、実施例３２と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度２．０質量％、マトリゲルの濃度０．１質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度２．０質量％、マトリゲルの濃度０．１質量％の液Ｂを調製した。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例３２のマトリゲル原液の添加量を２０μｌに変更する以外は、実施例３２と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度２．０質量％、マトリゲルの濃度０．１質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度２．０質量％、マトリゲルの濃度０．１質量％の液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔実施例３４〕
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例３２のマトリゲル原液の添加量を２００μｌに変更する以外は、実施例３２と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度２．０質量％、マトリゲルの濃度１．０質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度２．０質量％、マトリゲルの濃度１．０質量％の液Ｂを調製した。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例３２のマトリゲル原液の添加量を２００μｌに変更する以外は、実施例３２と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。これにより、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度２．０質量％、マトリゲルの濃度１．０質量％の液Ａを調製した。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度２．０質量％、マトリゲルの濃度１．０質量％の液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施例１と同様に実施した。
〔比較例１〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例１と同様にして調製した。ｐＨは７．４であった。
・液Ａ及び液Ｂの調製
実施例１に記載のＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量をそれぞれ０．４１ｇに変更し、それぞれの液の濃度を２０．５質量％に変更した以外は、実施例１と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
実施例１に記載のＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの重量をそれぞれ０．４１ｇに変更し、それぞれの液の濃度を２０．５質量％に変更した以外は、実施例１と同様にして液Ａ及び液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は、液Ａ及び液Ｂがインクジェットヘッドで吐出不可であったため、実施しなかった。
〔比較例２〕
・アルギン酸ナトリウム水溶液の調製
アルギン酸ナトリウム（商品名：キミカアルギンＳＫＡＴ−ＯＮＥ、株式会社キミカ製）１．５ｇを超純水１００ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルター（商品名：Ｍｉｎｉｓａｒｔ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ １７５４９７Ｋ、ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）で濾過し、濃度１．５質量％のアルギン酸ナトリウム水溶液を調製した。このアルギン酸ナトリウム水溶液を液Ａとして用いた。
・アルギン酸ナトリウム水溶液の調製
アルギン酸ナトリウム（商品名：キミカアルギンＳＫＡＴ−ＯＮＥ、株式会社キミカ製）１．５ｇを超純水１００ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルター（商品名：Ｍｉｎｉｓａｒｔ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ １７５４９７Ｋ、ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）で濾過し、濃度１．５質量％のアルギン酸ナトリウム水溶液を調製した。このアルギン酸ナトリウム水溶液を液Ａとして用いた。
・塩化カルシウム水溶液の調製
塩化カルシウム（型番：１９２−１３９２５、和光純薬工業株式会社製）０．５８４ｇを超純水１００ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルター（商品名：Ｍｉｎｉｓａｒｔ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ １７５４９７Ｋ、ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）で濾過し、濃度０．５８質量％の塩化カルシウム水溶液を調製した。この塩化カルシウム水溶液を液Ｂとして用いた。
塩化カルシウム（型番：１９２−１３９２５、和光純薬工業株式会社製）０．５８４ｇを超純水１００ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルター（商品名：Ｍｉｎｉｓａｒｔ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ １７５４９７Ｋ、ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）で濾過し、濃度０．５８質量％の塩化カルシウム水溶液を調製した。この塩化カルシウム水溶液を液Ｂとして用いた。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置を実施例１と同様に実施した。「表面に細胞を配置したゲル」は２４時間の形状維持が不可であったが、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製も実施例１と同様に実施した。「細胞がゲル内に三次元積層されているゲル」は２４時間の培養中に基材から浮遊し、ゲルの大きさは作製直後の半分程度に減少していた。
〔比較例３〕
・アルギン酸ナトリウム水溶液及び塩化カルシウム水溶液の調製
比較例２に記載のアルギン酸ナトリウムの重量を２．０ｇに変更し、アルギン酸ナトリウム水溶液の濃度を２．０質量％に変更した以外は、比較例２と同様にしてアルギン酸ナトリウム水溶液（液Ａ）、塩化カルシウム水溶液（液Ｂ）を調製した。
・アルギン酸ナトリウム水溶液及び塩化カルシウム水溶液の調製
比較例２に記載のアルギン酸ナトリウムの重量を２．０ｇに変更し、アルギン酸ナトリウム水溶液の濃度を２．０質量％に変更した以外は、比較例２と同様にしてアルギン酸ナトリウム水溶液（液Ａ）、塩化カルシウム水溶液（液Ｂ）を調製した。
細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置は、液Ａ及び液Ｂがインクジェットヘッドで吐出不可であったため、実施しなかった。
なお、参考として、液Ａと液Ｂで作製したゲル内で細胞が生存可能か評価するため、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製は実施例１と同様に実施し、「細胞がゲル内に三次元積層されているゲル」を手作業で作製した。
・細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの手作業での作製
実施例１と同様の方法で基材を準備した。マイクロピペットで基材の上に液Ａを３．５μｌ滴下した。さらに、前記液滴の上にマイクロピペットで液Ｂを３．５μｌ滴下し、数回ピペッティングをしてゲルを作製した。その後、速やかに３．５ｃｍディッシュの中にマイクロピペットでＤＭＥＭを３ｍｌ添加し、インキュベーター（３７℃、５体積％ＣＯ２環境）内に入れ２４時間培養した。これにより、手作業で「細胞がゲル内に三次元積層されているゲル」を作製した。
実施例１と同様の方法で基材を準備した。マイクロピペットで基材の上に液Ａを３．５μｌ滴下した。さらに、前記液滴の上にマイクロピペットで液Ｂを３．５μｌ滴下し、数回ピペッティングをしてゲルを作製した。その後、速やかに３．５ｃｍディッシュの中にマイクロピペットでＤＭＥＭを３ｍｌ添加し、インキュベーター（３７℃、５体積％ＣＯ２環境）内に入れ２４時間培養した。これにより、手作業で「細胞がゲル内に三次元積層されているゲル」を作製した。
〔比較例４〕
・フィブリノーゲン液の調製
フィブリノーゲン０．０１ｇをＤＰＢＳ１ｍｌに添加し、マイクロチューブローテータで溶解させ、濃度１．０質量％のフィブリノーゲン液を調製した。このフィブリノーゲン液を液Ａとして用いた。
・フィブリノーゲン液の調製
フィブリノーゲン０．０１ｇをＤＰＢＳ１ｍｌに添加し、マイクロチューブローテータで溶解させ、濃度１．０質量％のフィブリノーゲン液を調製した。このフィブリノーゲン液を液Ａとして用いた。
・トロンビン液の調製
ＤＰＢＳ９００μｌに実施例１１に記載の濃度２００Ｕ／ｍｌのトロンビン液を１００μｌ添加し、濃度２０Ｕ／ｍｌのトロンビン液を調製した。このトロンビン液を液Ｂとして用いた。
ＤＰＢＳ９００μｌに実施例１１に記載の濃度２００Ｕ／ｍｌのトロンビン液を１００μｌ添加し、濃度２０Ｕ／ｍｌのトロンビン液を調製した。このトロンビン液を液Ｂとして用いた。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置を実施例１と同様に実施した。「表面に細胞を配置したゲル」は、細胞が全て沈殿して細胞を三次元配置できなかったため、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施しなかった。
〔比較例５〕
・フィブリノーゲン液及びトロンビン液の調製
比較例４におけるフィブリノーゲンの重量を０．０２ｇに変更した以外は、比較例４と同様にしてフィブリノーゲン液（液Ａ）、及びトロンビン液（液Ｂ）を調製した。
・フィブリノーゲン液及びトロンビン液の調製
比較例４におけるフィブリノーゲンの重量を０．０２ｇに変更した以外は、比較例４と同様にしてフィブリノーゲン液（液Ａ）、及びトロンビン液（液Ｂ）を調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は、液Ａ及び液Ｂがインクジェットヘッドで吐出不可であったため、実施しなかった。
〔比較例６〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、無水リン酸水素二ナトリウム０．７０ｇと無水クエン酸０．４９ｇを超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは４．８であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、無水リン酸水素二ナトリウム０．７０ｇと無水クエン酸０．４９ｇを超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは４．８であった。
・液Ａの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル０．００５ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が０．２５質量％である液Ａを調製した。
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル０．００５ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が０．２５質量％である液Ａを調製した。
・液Ｂの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ０．００５ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が０．２５質量％である液Ｂを調製した。
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ０．００５ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が０．２５質量％である液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置を実施例１と同様に実施した。「表面に細胞を配置したゲル」は細胞の半分以上が沈殿して細胞を三次元配置できなかったため、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施しなかった。
〔比較例７〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、無水リン酸水素二ナトリウム０．５０ｇと無水クエン酸０．６２ｇを超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは３．８であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、無水リン酸水素二ナトリウム０．５０ｇと無水クエン酸０．６２ｇを超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは３．８であった。
・液Ａの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル０．０１４ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が０．７質量％である液Ａを調製した。
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル０．０１４ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が０．７質量％である液Ａを調製した。
・液Ｂの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ０．０１４ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が０．７質量％である液Ｂを調製した。
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ０．０１４ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が０．７質量％である液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置を実施例１と同様に実施した。「表面に細胞を配置したゲル」は細胞の半分以上が沈殿して細胞を三次元配置できなかったため、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施しなかった。
〔比較例８〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、水酸化ナトリウム０．１５ｇとグリシン０．３７５ｇを超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは１０．４であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、水酸化ナトリウム０．１５ｇとグリシン０．３７５ｇを超純水１００ｍｌに溶解させることで調製した。ｐＨは１０．４であった。
・液Ａの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル０．３９ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が１９．５質量％である液Ａを調製した。
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル０．３９ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が１９．５質量％である液Ａを調製した。
・液Ｂの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ０．３９ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が１９．５質量％である液Ｂを調製した。
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ０．３９ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が１９．５質量％である液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置を実施例１と同様に実施した。「表面に細胞を配置したゲル」は２４時間の形状維持が不可であったため、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施しなかった。
〔比較例９〕
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例４と同様にして調製した。ｐＨは５．８であった。
・緩衝液の調製
緩衝液は、実施例４と同様にして調製した。ｐＨは５．８であった。
・液Ａの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル０．００５ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が０．２５質量％である液Ａを調製した。
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル０．００５ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルの濃度が０．２５質量％である液Ａを調製した。
・液Ｂの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ０．００５ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が０．２５質量％である液Ｂを調製した。
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ０．００５ｇを上記の緩衝液２ｍｌに溶解後、平均孔径０．２μｍフィルターで濾過し、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が０．２５質量％である液Ｂを調製した。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置を実施例１と同様に実施した。「表面に細胞を配置したゲル」は細胞の半分以上が沈殿して細胞を三次元配置できなかったため、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施しなかった。
〔比較例１０〕
・マトリゲル液の調製
マトリゲル原液０．２ｇを実施例１に記載の緩衝液２０ｍｌに溶解させ、濃度１．０質量％のマトリゲル液を調製した。このマトリゲル液を液Ａ及び液Ｂとして用いた。
・マトリゲル液の調製
マトリゲル原液０．２ｇを実施例１に記載の緩衝液２０ｍｌに溶解させ、濃度１．０質量％のマトリゲル液を調製した。このマトリゲル液を液Ａ及び液Ｂとして用いた。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置を実施例１と同様に実施した。「表面に細胞を配置したゲル」は細胞の半分以上が沈殿して細胞を三次元配置できなかったため、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は実施しなかった。
〔比較例１１〕
・マトリゲル液の調製
マトリゲル原液０．４ｇを実施例１に記載の緩衝液２０ｍｌに溶解させ、濃度２．０質量％のマトリゲル液を調製した。このマトリゲル液を液Ａ及び液Ｂとして用いた。
・マトリゲル液の調製
マトリゲル原液０．４ｇを実施例１に記載の緩衝液２０ｍｌに溶解させ、濃度２．０質量％のマトリゲル液を調製した。このマトリゲル液を液Ａ及び液Ｂとして用いた。
細胞の培養、細胞の染色、染色された細胞懸濁液の作製、基材の準備、ゲルの作製、ゲル表面への細胞の配置、染色なし細胞懸濁液の作製、細胞懸濁した液Ａの調製、細胞懸濁した液Ｂの調製、細胞がゲル内に三次元積層されているゲルの作製は、液Ａ及び液Ｂがインクジェットヘッドで吐出不可であったため、実施しなかった。
＜インク液の粘度測定＞
インクジェットヘッドによる吐出が可能な液の粘度上限を調べるため、実施例１、１１〜１５、２０及び２９〜３４、並びに比較例１〜５及び１０〜１１の液Ａと液Ｂの粘度を測定した。実施例２〜１０、１６〜１９及び２１〜２８、比較例６〜９の液Ａと液ＢはＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル又はＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が２０質量％以下であることから、実施例１の粘度以下であることが明白であるため測定は実施しなかった。測定を実施しない実施例及び比較例については、表１における該当する欄に「−」を付している。
インクジェットヘッドによる吐出が可能な液の粘度上限を調べるため、実施例１、１１〜１５、２０及び２９〜３４、並びに比較例１〜５及び１０〜１１の液Ａと液Ｂの粘度を測定した。実施例２〜１０、１６〜１９及び２１〜２８、比較例６〜９の液Ａと液ＢはＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル又はＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が２０質量％以下であることから、実施例１の粘度以下であることが明白であるため測定は実施しなかった。測定を実施しない実施例及び比較例については、表１における該当する欄に「−」を付している。
粘度測定はアントンパール社のレオメータを用いて動的・回転測定を以下の条件で実施した。せん断速度が１０００／ｓの時の粘度（ｍＰａ・ｓ）を液の粘度として採用した。結果を表１に示す。
・装置：Ｐｈｙｓｉｃａ ＭＣＲ３０１
・コーンプレート：ＣＰ５０−１
・温度：２５℃
・液量：１ｍｌ
・変数：せん断速度
・変数条件：対数昇降
・変数範囲：１〜１０００／ｓ
・測定点：１３点
・測定間隔：１０秒で固定
・装置：Ｐｈｙｓｉｃａ ＭＣＲ３０１
・コーンプレート：ＣＰ５０−１
・温度：２５℃
・液量：１ｍｌ
・変数：せん断速度
・変数条件：対数昇降
・変数範囲：１〜１０００／ｓ
・測定点：１３点
・測定間隔：１０秒で固定
＜インクジェットヘッドによる液の吐出評価＞
インクジェットヘッドによる吐出が可能な液の粘度上限を調べるため、産業用インクジェットヘッド（商品名：ＭＨ２４２０、リコーインダストリー株式会社製）及び図３のピエゾ方式の吐出ヘッド（ノズル径１００μｍ）を用い、実施例１〜３４、比較例１〜１１の液Ａ及び液Ｂの吐出性を評価した。各液においてヘッドノズルから滴下されるインクの液滴を観察した。
インクジェットヘッドによる吐出が可能な液の粘度上限を調べるため、産業用インクジェットヘッド（商品名：ＭＨ２４２０、リコーインダストリー株式会社製）及び図３のピエゾ方式の吐出ヘッド（ノズル径１００μｍ）を用い、実施例１〜３４、比較例１〜１１の液Ａ及び液Ｂの吐出性を評価した。各液においてヘッドノズルから滴下されるインクの液滴を観察した。
図６は、インクの液滴観察機構１Ｂの模式図である。ヘッドのノズル１２１から滴下された液滴１３０’を側方から撮像する高速カメラ３０と、液滴の滴下に同期して液滴に光を照射するストロボ照明装置６０と、メンブレン１２Ｂへの電圧印加の制御手段７０及び駆動手段２０が備え付けられている。高速カメラ３０のシャッタを開くタイミングをメンブレン１２Ｂへの電圧印加のタイミングで同期させて行なった。
仕様範囲内の印加電圧で各ノズルから液滴が吐出すれば〇、仕様範囲の最大の印加電圧でも吐出しないもの、又は半分以上のノズルが目詰まり等によって吐出しないものを×とした。結果を表１に示す。
表１の結果から、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル及びＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨを含む溶液は、どちらのインクジェットヘッドでも濃度２０質量％、すなわち粘度３０ｍＰａ・ｓの液まで吐出可能であることが確認された。アルギン酸ナトリウムは濃度１．５質量％の液まで、フィブリノーゲンは１．０質量％の液までどちらのインクジェットヘッドでも吐出可能であることが確認された。フィブリノーゲン溶液はビンガム流体であるため、低粘度の２．０質量％の液でもＭＨ２４２０ヘッドでは吐出できなかった。吐出が不可であった比較例１、３、５及び１１は、下記の液の毒性評価以降の試験を実施しなかった。
＜液の毒性評価＞
上記のインクジェットヘッドによる液の吐出評価で吐出可能であった実施例１〜３４及び比較例２、４、６〜１０について、液の細胞への毒性を評価するため、各インク液に細胞を２時間浸漬した後の細胞の生存率をＷＳＴ−１アッセイで算出した。
上記のインクジェットヘッドによる液の吐出評価で吐出可能であった実施例１〜３４及び比較例２、４、６〜１０について、液の細胞への毒性を評価するため、各インク液に細胞を２時間浸漬した後の細胞の生存率をＷＳＴ−１アッセイで算出した。
それぞれの細胞懸濁した液Ａと液Ｂを１５ｍｌ遠沈管で２時間静置後、遠心分離し（１．２×１０３ｒｐｍ、５分間、５℃）、アスピレータを用いて上清を除去した。除去後、遠沈管にＦＢＳ入りＤＭＥＭを２ｍＬ添加し、穏やかにピペッティングを行い、細胞を分散させ再び細胞懸濁液を得た。上記再分散した細胞懸濁液を９６ウェルプレートの８ウェルに２００μｌずつ添加し、インキュベーター内で２４時間培養した。
２４時間培養後、各ウェルにＷＳＴ−１（商品名：Ｐｒｅｍｉｘ ＷＳＴ−１ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、タカラバイオ製）を２０μｌずつ添加し、１時間呈色した。呈色後の各ウェルをプレートレーダー（商品名：Ｃｙｔａｔｉｏｎ５ イメージングプレートリーダー、バイオテック株式会社）で、４５０ｎｍと６２０ｎｍ（リファレンス用）の吸光度を測定し、４５０ｎｍと６２０ｎｍの吸光度の比を算出した。
前記８ウェルの平均値を生存率算出用の値として採用した。生存率１００％の参考値（コントロール）として、ＦＢＳ入りＤＭＥＭ中に室温下で２時間静置後、２４時間培養した液を採用した。生存率が７５％以上であれば毒性がないと判断し、〇とした。結果を表１に示す（表１中の「液の毒性」の欄を参照）。
表１の結果から、緩衝液のｐＨ、すなわち液Ａ及び液ＢのｐＨが３．８（比較例７）以外の液は細胞への毒性がないことが確認できた。このことから、少なくともＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル及びＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が０．３質量％以上２０質量％以下であり、かつ緩衝液のｐＨ、すなわち液Ａ及び液ＢのｐＨが５以上１０以下であれば、細胞への毒性がないことが確認された。
＜細胞三次元配置評価＞
インクジェットヘッドによるインクの吐出評価で吐出可能であった実施例１〜３４及び比較例２、４、６〜１０において、三次元配置が可能であるか否か、すなわち細胞を任意の位置に配置可能であるか否かについて評価した。
インクジェットヘッドによるインクの吐出評価で吐出可能であった実施例１〜３４及び比較例２、４、６〜１０において、三次元配置が可能であるか否か、すなわち細胞を任意の位置に配置可能であるか否かについて評価した。
各実施例及び比較例に記載の「表面に細胞を配置したゲル」を作製した１時間後、ゲルの形状を共焦点顕微鏡（商品名：ＦＶ１０、オリンパス社製）で観察し、ゲルの表面に配置した細胞が表面近傍に固定されているかを確認した。半数以上の細胞が沈殿せず表面近傍に固定されていれば〇、半数以上の細胞がゲルの高さの半分より下側に存在（下の基材まで沈殿している細胞も含む）していれば×とした。結果を表１に示す（表１中の「三次元配置」の欄を参照）。
表１の結果から、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル及びＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が０．３質量％以上２０質量％以下であり、かつ緩衝液のｐＨ、すなわち液Ａ及び液ＢのｐＨが５以上であれば、細胞を任意に三次元配置できることが確認された。また、アルギン酸ゲル（比較例２）も、細胞を任意に三次元配置できることが確認された。一方、フィブリンゲル（比較例４）は、インクジェットヘッドで吐出可能な１．０質量％濃度では細胞の三次元配置が不可能であることが確認された。同様に、マトリゲル（比較例１０）も、インクジェットヘッドで吐出可能な１．０質量％濃度では細胞の三次元配置が不可能であることが確認された。
＜ゲルの造形精度評価＞
インクジェットヘッドによる液の吐出が可能であり、液の細胞への毒性がなく、細胞の三次元配置が可能な実施例１〜３４及び比較例２、８において、ゲルの造形精度評価として、造形したドーム形状のゲルのアスペクト比を算出した。
インクジェットヘッドによる液の吐出が可能であり、液の細胞への毒性がなく、細胞の三次元配置が可能な実施例１〜３４及び比較例２、８において、ゲルの造形精度評価として、造形したドーム形状のゲルのアスペクト比を算出した。
アスペクト比は、ゲルの形状を共焦点顕微鏡で観察し、ドーム形状のゲルの直径及び高さを計測し、（ゲルの高さ）／（ゲルの直径）で算出した。アスペクト比が従来の造形剤として使われていたアルギン酸ゲル（比較例２）のアスペクト比である０．１９以上である場合は◎、０．１９未満である場合は〇とした。結果を表１に示す（表１中の「造形精度」の欄を参照）。
表１の結果から、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル及びＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が１．７質量％以上２０質量％以下であり、かつ緩衝液のｐＨが６以上であれば、従来造形剤として使われていたアルギン酸ゲル（比較例２）よりもアスペクト比が高く、造形精度が特に優れることが確認された。
＜形状維持評価＞
インクジェットヘッドによる液の吐出が可能であり、液の細胞への毒性がなく、細胞の三次元配置が可能な実施例１〜３４及び比較例２、８において、ゲルの形状維持評価を実施した。
インクジェットヘッドによる液の吐出が可能であり、液の細胞への毒性がなく、細胞の三次元配置が可能な実施例１〜３４及び比較例２、８において、ゲルの形状維持評価を実施した。
各実施例及び比較例に記載の「表面に細胞を配置したゲル」を作製した３時間後、６時間後、２４時間後、７２時間後、１６８時間後に、それぞれ３．５ｃｍディッシュの中のＤＭＥＭ３ｍｌをマイクロピペットで１５ｍｌの遠心管に回収し、代わりに新しいＦＢＳ入りＤＭＥＭを３ｍｌ添加して、再びインキュベーター（３７℃、５体積％ＣＯ２環境）内に入れた。前記１５ｍｌ遠沈管１本を遠心分離（商品名：Ｈ−１９ＦＭ、ＫＯＫＵＳＡＮ社製、１．２×１０３ｒｐｍ、５分間、５℃）し、アスピレータで上澄み液を除去し、新たにＤＭＥＭ５００μｌを添加し、ピペッティングして再び細胞懸濁液を得た。
再び得た前記の細胞懸濁液をマイクロピペットで９６ウェルプレート（商品名：９６ｗｅｌｌ細胞培養用プレート、平底、低蒸発タイプ、フタ付ポリスチレン、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の１ウェルに添加した。ウェルに添加して２時間後、プレートリーダーで前記ウェルの中の細胞数をカウントした。
上記カウントした細胞数の合計が７５０個を超えた場合、すなわち全細胞の１／４以上の細胞がゲルの表面から離脱していれば×とした。上記カウントした細胞数の合計が７５０個を超えない場合、すなわち全細胞の３／４以上の細胞がゲルの表面に維持されていれば〇とした。結果を表１に示す（表１中の「形状維持」の欄を参照）。
表１の結果から、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル及びＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が０．３質量％以上２０質量％以下であり、かつ緩衝液のｐＨ、すなわち液Ａ及び液ＢのｐＨが５以上１０以下であれば、ゲルの形状を１６８時間以上維持できることが確認された。一方、緩衝液のｐＨ、すなわち液Ａ及び液ＢのｐＨが１０より高い場合（比較例８）は、ゲルが脆くなり造形後６時間までに形状が崩れることが確認された。また、アルギン酸ゲル（比較例２）も造形後６時間までに形状が崩れることが確認された。
＜三次元構造体上の細胞形態評価＞
インクジェットヘッドによる液の吐出が可能であり、液の細胞への毒性がなく、細胞の三次元配置が可能で、形状維持が可能であった実施例１〜３４において、それぞれ２４時間、７２時間後、１６８時間培養後の三次元構造体、すなわち「表面に細胞を配置したゲル」の表面に配置された細胞の形態評価を実施した。また、参考として、形状維持評価において、形状維持ができずに全細胞の１／４以上の細胞がゲルの表面から離脱してしまった比較例２について、２４時間培養後の試料のみ同様に評価を実施した。７２時間後、１６８時間後は三次元構造が壊れていたため評価を実施しなかった。
インクジェットヘッドによる液の吐出が可能であり、液の細胞への毒性がなく、細胞の三次元配置が可能で、形状維持が可能であった実施例１〜３４において、それぞれ２４時間、７２時間後、１６８時間培養後の三次元構造体、すなわち「表面に細胞を配置したゲル」の表面に配置された細胞の形態評価を実施した。また、参考として、形状維持評価において、形状維持ができずに全細胞の１／４以上の細胞がゲルの表面から離脱してしまった比較例２について、２４時間培養後の試料のみ同様に評価を実施した。７２時間後、１６８時間後は三次元構造が壊れていたため評価を実施しなかった。
三次元構造体、すなわち「表面に細胞を配置したゲル」の表面に配置された細胞の形態を観察し、細胞の伸展の有無を評価した。評価結果を表１に示す（表１中の「細胞形態１」の欄を参照）。配置した細胞数のほぼ全てが伸展していればＡ、伸展していなければＣとした。細胞の伸展の有無は、細胞の仮足が見えていれば伸展しているものと判断した。
表１の結果から、自己組織化生体材料として、少なくともフィブリノーゲン０．１〜１．５質量％、あるいは少なくともマトリゲル濃度０．０５〜１．０質量％を混合することで、三次元構造体上の細胞が伸展することが確認された。
＜三次元積層内の生存率評価＞
インクジェットヘッドによる液の吐出が可能であり、液の細胞への毒性がなく、細胞の三次元配置が可能で、形状維持が可能であった実施例１〜３４において、「細胞がゲル内に三次元積層されているゲル」内の細胞の生存可否を評価した。また、参考として、形状維持評価において、形状維持ができずに全細胞の１／４以上の細胞がゲルの表面から離脱してしまった比較例２についても同様の評価を実施し、インクジェットヘッドで吐出不可であった比較例３についても、手作業で作製した「細胞がゲル内に三次元積層されているゲル」を用いて同様の評価を実施した。ゲル内の細胞の生存率算出はＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色により、三次元積層を破壊せずに算出した。
インクジェットヘッドによる液の吐出が可能であり、液の細胞への毒性がなく、細胞の三次元配置が可能で、形状維持が可能であった実施例１〜３４において、「細胞がゲル内に三次元積層されているゲル」内の細胞の生存可否を評価した。また、参考として、形状維持評価において、形状維持ができずに全細胞の１／４以上の細胞がゲルの表面から離脱してしまった比較例２についても同様の評価を実施し、インクジェットヘッドで吐出不可であった比較例３についても、手作業で作製した「細胞がゲル内に三次元積層されているゲル」を用いて同様の評価を実施した。ゲル内の細胞の生存率算出はＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色により、三次元積層を破壊せずに算出した。
・ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色用の培地の調製
ＦＢＳ入りＤＭＥＭ６０ｍｌにＰＩ溶液を３０μｌ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（型番：Ｈ３５７０、ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を１２μｌ添加し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色用の培地を作製した。
ＦＢＳ入りＤＭＥＭ６０ｍｌにＰＩ溶液を３０μｌ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（型番：Ｈ３５７０、ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を１２μｌ添加し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色用の培地を作製した。
・生存率算出用の画像の取得
実施例１〜３４及び比較例２、比較例３の「細胞がゲル内に三次元配置されているゲル」を２４時間培養後、３．５ｃｍディッシュの中のＦＢＳ入りＤＭＥＭ３ｍｌを上記の生存率評価用の培地３ｍｌと置換し、再びインキュベーター（３７℃、５体積％ＣＯ２環境）内で１時間培養した。培養１時間後、ゲル内の細胞を共焦点顕微鏡で観察し、その三次元画像をＴＩＦＦファイルで保存した。比較例２及び比較例３は、２４時間の培養中に基材から浮遊し、ゲルの大きさは作製直後の半分程度に減少していたが、同様に生存率を算出した。
実施例１〜３４及び比較例２、比較例３の「細胞がゲル内に三次元配置されているゲル」を２４時間培養後、３．５ｃｍディッシュの中のＦＢＳ入りＤＭＥＭ３ｍｌを上記の生存率評価用の培地３ｍｌと置換し、再びインキュベーター（３７℃、５体積％ＣＯ２環境）内で１時間培養した。培養１時間後、ゲル内の細胞を共焦点顕微鏡で観察し、その三次元画像をＴＩＦＦファイルで保存した。比較例２及び比較例３は、２４時間の培養中に基材から浮遊し、ゲルの大きさは作製直後の半分程度に減少していたが、同様に生存率を算出した。
実施例２〜４、７〜１９、２１〜３４は、さらに４８時間培養後（合計７２時間培養後）、上記の２４時間培養後の評価と同様に実施し、生存率を算出した。
実施例２〜４、７〜８、１１〜１２、１６〜１９、２１〜３４は、さらに９６時間培養後（合計１６８時間培養後）、上記の２４時間培養後の評価と同様に実施し、生存率を算出した。
・ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色による生存率算出
上記ＴＩＦＦファイルを画像処理ソフトＭｅｔａＭｏｒｐｈ（モレキュラーデバイスジャパン株式会社製）を用いてスタック形式に変換し、画像処理ソフトＩｍａｇｅＪを用いて色別に分離した。得られた赤色と青色の画像をそれぞれ２値化し、ノイズ除去及び凝集細胞の分離処理を施した。処理した各画像を再びＭｅｔａＭｏｒｐｈを用いてＺ軸補正し、細胞数をカウントした。ＰＩ溶液で染色された細胞を死細胞、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色された細胞を全細胞として、生存率（％）は１−（死細胞数）×１００／（全細胞数）で算出した。図７は実施例１３の死細胞を４Ｄ Ｖｉｅｗｅｒで表示した画像である。図８は実施例１３の全細胞を４Ｄ Ｖｉｅｗｅｒで表示した画像である。
上記ＴＩＦＦファイルを画像処理ソフトＭｅｔａＭｏｒｐｈ（モレキュラーデバイスジャパン株式会社製）を用いてスタック形式に変換し、画像処理ソフトＩｍａｇｅＪを用いて色別に分離した。得られた赤色と青色の画像をそれぞれ２値化し、ノイズ除去及び凝集細胞の分離処理を施した。処理した各画像を再びＭｅｔａＭｏｒｐｈを用いてＺ軸補正し、細胞数をカウントした。ＰＩ溶液で染色された細胞を死細胞、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色された細胞を全細胞として、生存率（％）は１−（死細胞数）×１００／（全細胞数）で算出した。図７は実施例１３の死細胞を４Ｄ Ｖｉｅｗｅｒで表示した画像である。図８は実施例１３の全細胞を４Ｄ Ｖｉｅｗｅｒで表示した画像である。
・評価基準
三次元積層内の細胞の生存率が９０％以上であれば◎、７５％以上９０％未満であれば〇、７５％未満であれば×とした。結果を表１に示す（表１中の「生存率」の欄を参照）。
三次元積層内の細胞の生存率が９０％以上であれば◎、７５％以上９０％未満であれば〇、７５％未満であれば×とした。結果を表１に示す（表１中の「生存率」の欄を参照）。
表１の結果から、インクジェットヘッドによる液の吐出が可能であり、液の細胞への毒性がなく、細胞の三次元配置が可能で、形状維持が可能であったＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル及びＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が０．３質量％以上２０質量％以下であり、かつ緩衝液のｐＨ、すなわち液Ａ及び液ＢのｐＨが５以上１０以下であれば、三次元積層内で細胞が生存可能であることが確認された。
また、少なくともＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル及びＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が０．３質量％以上６．０質量％以下であれば、三次元積層内で細胞が７２時間以上生存可能であることが確認された。
さらに、少なくともＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル及びＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が０．３質量％以上４．０質量％以下であれば、三次元積層内で細胞が１６８時間以上生存可能であることが確認された。
一方、アルギン酸ゲルの三次元積層内（比較例２及び比較例３）では、細胞が生存できないことが確認された。
＜三次元積層内の細胞形態評価＞
インクジェットヘッドによる液の吐出が可能であり、液の細胞への毒性がなく、細胞の三次元配置が可能で、形状維持が可能であり、三次元積層内で細胞の生存が可能であった実施例１〜３４において、２４時間培養後の「細胞がゲル内に三次元積層されているゲル」内の細胞形態を評価した。
インクジェットヘッドによる液の吐出が可能であり、液の細胞への毒性がなく、細胞の三次元配置が可能で、形状維持が可能であり、三次元積層内で細胞の生存が可能であった実施例１〜３４において、２４時間培養後の「細胞がゲル内に三次元積層されているゲル」内の細胞形態を評価した。
実施例２〜４、７〜１９、２１〜３４は、さらに４８時間培養後（合計７２時間培養後）、上記の２４時間培養後の評価と同様に実施し、細胞形態を評価した。
実施例２〜４、７〜８、１１〜１２、１６〜１９、２１〜３４は、さらに９６時間培養後（合計１６８時間培養後）、上記の２４時間培養後の評価と同様に実施し、細胞形態を評価した。
また、参考として、三次元積層内で細胞の生存ができなかった比較例２は、２４時間培養後の試料のみ同様に評価を実施し、比較例３についても、手作業で作製した「細胞がゲル内に三次元積層されているゲル」を用いて２４時間培養後の試料のみ同様に評価を実施した。７２時間後、１６８時間後は三次元構造が壊れていたため評価を実施しなかった。
・細胞形態評価用の培地の調製
ＦＢＳ入りＤＭＥＭ６０ｍｌにＣａｌｃｅｉｎ、ＡＭ（型番：Ｌ３２２４、ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を１２μｌ添加し、細胞形態評価用の培地を作製した。
ＦＢＳ入りＤＭＥＭ６０ｍｌにＣａｌｃｅｉｎ、ＡＭ（型番：Ｌ３２２４、ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を１２μｌ添加し、細胞形態評価用の培地を作製した。
・細胞形態評価
上記の三次元積層内の生存率評価における生存率算出後に、３．５ｃｍディッシュの中の生存率算出用の培地３ｍｌを上記の細胞形態評価用の培地３ｍｌに置換し、再びインキュベーター（３７℃、５体積％ＣＯ２環境）内で１時間培養した。培養１時間後、三次元積層内の細胞の形態を共焦点顕微鏡で観察した。図９、図１０は、それぞれ実施例１３、１５の三次元積層内の細胞を上側から観察した画像である。
上記の三次元積層内の生存率評価における生存率算出後に、３．５ｃｍディッシュの中の生存率算出用の培地３ｍｌを上記の細胞形態評価用の培地３ｍｌに置換し、再びインキュベーター（３７℃、５体積％ＣＯ２環境）内で１時間培養した。培養１時間後、三次元積層内の細胞の形態を共焦点顕微鏡で観察した。図９、図１０は、それぞれ実施例１３、１５の三次元積層内の細胞を上側から観察した画像である。
・評価基準
ほぼ全ての細胞が伸展していればＡ、半数以上の細胞が伸展していればＢ、伸展していなければＣとした。伸展の有無は細胞の仮足が見えていれば伸展しているものと判断した。結果を表１に示す（表１中の「細胞形態２」の欄を参照）。
ほぼ全ての細胞が伸展していればＡ、半数以上の細胞が伸展していればＢ、伸展していなければＣとした。伸展の有無は細胞の仮足が見えていれば伸展しているものと判断した。結果を表１に示す（表１中の「細胞形態２」の欄を参照）。
表１の結果から、自己組織化生体材料として、少なくともフィブリノーゲン０．１〜１．５質量％、または少なくともマトリゲル０．０５〜１．０質量％を混合することで、三次元積層内の細胞が伸展することが確認された。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル及びＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が０．３質量％以上６．０質量％以下であれば、三次元積層内のほぼ全ての細胞が伸展することが確認された。
表１における液の粘度測定、インクジェットヘッドによる液の吐出評価、液の毒性評価、細胞三次元配置評価、形状維持評価、三次元積層内の生存率評価の結果から、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル及びＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が０．３質量％以上２０質量％以下であり（液Ａ及び液Ｂの２５℃における粘度が３０ｍＰａ・ｓ以下）であり、かつ緩衝液のｐＨ、すなわち液Ａ及び液ＢのｐＨが５以上１０以下であれば、インクジェットヘッドで吐出可能であり、細胞への毒性がなく、細胞を任意に三次元配置可能であり、その形状を維持でき、三次元積層内で細胞が生存可能であることが確認された。
さらに、表１の三次元積層内の生存率評価の結果から、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル及びＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が０．３質量％以上４．０質量％以下であれば、１６８時間以上の長期培養後も、高い生存率の維持が可能であることが確認された。
さらに、表１の造形精度評価の結果から、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル及びＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が１．７質量％以上２０質量％以下であり、かつ緩衝液のｐＨ、すなわち液Ａ及び液ＢのｐＨが６以上１０以下であれば、その造形精度が特に優れることが確認された。
また、表１の三次元構造体上の細胞形態評価、三次元積層内の細胞形態評価の結果から、液Ａ及び液Ｂに自己組織化生体材料が混合されていれば、三次元構造体上及び三次元積層内で細胞が伸展可能であることが確認された。さらに、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル及びＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨの濃度が０．３質量％以上６．０質量％以下であれば、三次元積層内のほぼ全ての細胞が伸展することが確認された。
本発明の態様としては、例えば、以下の＜１＞〜＜１１＞が挙げられる。
＜１＞３以上の分岐を有し、該分岐が側鎖及び／又は末端に１以上の求電子性官能基を有するポリエチレングリコールを骨格として有する、多分岐型ポリマーＡを含む液Ａと、３以上の分岐を有し、該分岐が側鎖及び／又は末端に１以上の求核性官能基を有するポリエチレングリコールを骨格として有する、多分岐型ポリマーＢを含む液Ｂと、を備える液滴吐出装置用の液セットであって、前記液Ａ及び前記液ＢのｐＨが５以上１０以下であり、前記液Ａ及び前記液Ｂにおける前記多分岐型ポリマーの濃度が０．３質量％以上２０質量％以下である、前記液滴吐出装置用の液セット。
＜２＞前記求電子性官能基が、マレイミジル基、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基、及びニトロフェニル基よりなる群から選択され、前記求核性官能基が、チオール基、アミノ基、及び−ＣＯ２ＰｈＮＯ２よりなる群から選択される上記＜１＞に記載の液滴吐出装置用の液セット。
＜３＞前記多分岐型ポリマーＡ及びＢが共に四分岐型ポリマーである上記＜１＞又は＜２＞に記載の液滴吐出要の液セット。
＜４＞前記求電子性官能基がマレイミジル基であり、前記求核性官能基がチオール基である、上記＜１＞〜＜３＞のいずれか一項に記載の液滴吐出装置用の液セット。
＜５＞前記液Ａ及び前記液Ｂの２５℃における粘度が３０ｍＰａ・ｓ以下である上記＜１＞〜＜４＞のいずれか一項に記載の液滴吐出装置用の液セット。
＜６＞前記液Ａ及び前記液Ｂにおける前記多分岐型ポリマーの濃度が０．３質量％以上６．０質量％以下である上記＜１＞〜＜５＞のいずれか一項に記載の液滴吐出装置用の液セット。
＜７＞前記液Ａ及び前記液Ｂにおける前記多分岐型ポリマーの濃度が０．３質量％以上４．０質量％以下である上記＜１＞〜＜６＞のいずれか一項に記載の液滴吐出装置用の液セット。
＜８＞前記液Ａ及び前記液ＢのｐＨが６以上１０以下であり、前記液Ａ及び前記液Ｂにおける前記多分岐型ポリマーの濃度が１．７質量％以上２０質量％以下である上記＜１＞〜＜５＞のいずれか一項に記載の液滴吐出装置用の液セット。
＜９＞前記液Ａ及び前記液Ｂのいずれか一方、又は両方に自己組織化生体材料が混合されている上記＜１＞〜＜８＞のいずれか一項に記載の液滴吐出装置用の液セット。
＜１０＞前記自己組織化生体材料が、ラミニン及びコラーゲンを含むゲル、フィブリノーゲン、ゼラチン及びエラスチンからなる群から選択される一種以上である上記＜９＞に記載の液滴吐出装置用の液セット。
＜１１＞前記液Ａ及び前記液Ｂのいずれか一方、又は両方に細胞が懸濁されている上記＜１＞〜＜１０＞のいずれか一項に記載の液滴吐出装置用の液セット。
＜１＞３以上の分岐を有し、該分岐が側鎖及び／又は末端に１以上の求電子性官能基を有するポリエチレングリコールを骨格として有する、多分岐型ポリマーＡを含む液Ａと、３以上の分岐を有し、該分岐が側鎖及び／又は末端に１以上の求核性官能基を有するポリエチレングリコールを骨格として有する、多分岐型ポリマーＢを含む液Ｂと、を備える液滴吐出装置用の液セットであって、前記液Ａ及び前記液ＢのｐＨが５以上１０以下であり、前記液Ａ及び前記液Ｂにおける前記多分岐型ポリマーの濃度が０．３質量％以上２０質量％以下である、前記液滴吐出装置用の液セット。
＜２＞前記求電子性官能基が、マレイミジル基、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基、及びニトロフェニル基よりなる群から選択され、前記求核性官能基が、チオール基、アミノ基、及び−ＣＯ２ＰｈＮＯ２よりなる群から選択される上記＜１＞に記載の液滴吐出装置用の液セット。
＜３＞前記多分岐型ポリマーＡ及びＢが共に四分岐型ポリマーである上記＜１＞又は＜２＞に記載の液滴吐出要の液セット。
＜４＞前記求電子性官能基がマレイミジル基であり、前記求核性官能基がチオール基である、上記＜１＞〜＜３＞のいずれか一項に記載の液滴吐出装置用の液セット。
＜５＞前記液Ａ及び前記液Ｂの２５℃における粘度が３０ｍＰａ・ｓ以下である上記＜１＞〜＜４＞のいずれか一項に記載の液滴吐出装置用の液セット。
＜６＞前記液Ａ及び前記液Ｂにおける前記多分岐型ポリマーの濃度が０．３質量％以上６．０質量％以下である上記＜１＞〜＜５＞のいずれか一項に記載の液滴吐出装置用の液セット。
＜７＞前記液Ａ及び前記液Ｂにおける前記多分岐型ポリマーの濃度が０．３質量％以上４．０質量％以下である上記＜１＞〜＜６＞のいずれか一項に記載の液滴吐出装置用の液セット。
＜８＞前記液Ａ及び前記液ＢのｐＨが６以上１０以下であり、前記液Ａ及び前記液Ｂにおける前記多分岐型ポリマーの濃度が１．７質量％以上２０質量％以下である上記＜１＞〜＜５＞のいずれか一項に記載の液滴吐出装置用の液セット。
＜９＞前記液Ａ及び前記液Ｂのいずれか一方、又は両方に自己組織化生体材料が混合されている上記＜１＞〜＜８＞のいずれか一項に記載の液滴吐出装置用の液セット。
＜１０＞前記自己組織化生体材料が、ラミニン及びコラーゲンを含むゲル、フィブリノーゲン、ゼラチン及びエラスチンからなる群から選択される一種以上である上記＜９＞に記載の液滴吐出装置用の液セット。
＜１１＞前記液Ａ及び前記液Ｂのいずれか一方、又は両方に細胞が懸濁されている上記＜１＞〜＜１０＞のいずれか一項に記載の液滴吐出装置用の液セット。
前記＜１＞〜＜１１＞のいずれか１つに記載の液滴吐出装置用の液セットは、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。
１Ｂ 液滴観察機構
１０Ｂ 吐出ヘッド
１１ａ、１１ｂ、１１ｃ、１１Ｂ 液室壁
１２ｃ、１２Ｂ メンブレン
１３ａ 電動機
１３ｂ、１３ｃ、１３Ｂ 圧電素子
２０ 駆動手段
３０ 高速カメラ
６０ ストロボ照明装置
７０ 制御手段
１１１ａ、１１１ｂ、１１１ｃ、１２１ ノズル
１１２ 電磁弁
１１５ 大気開放部
１３０’ 液滴
３００、３００ａ、３００ｂ、３００ｃ 液
３５０ 細胞
１０Ｂ 吐出ヘッド
１１ａ、１１ｂ、１１ｃ、１１Ｂ 液室壁
１２ｃ、１２Ｂ メンブレン
１３ａ 電動機
１３ｂ、１３ｃ、１３Ｂ 圧電素子
２０ 駆動手段
３０ 高速カメラ
６０ ストロボ照明装置
７０ 制御手段
１１１ａ、１１１ｂ、１１１ｃ、１２１ ノズル
１１２ 電磁弁
１１５ 大気開放部
１３０’ 液滴
３００、３００ａ、３００ｂ、３００ｃ 液
３５０ 細胞
Claims (11)
Hide Dependent
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Claims (11)
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- ３以上の分岐を有し、該分岐が側鎖及び／又は末端に１以上の求電子性官能基を有するポリエチレングリコールを骨格として有する、多分岐型ポリマーＡを含む液Ａと、
３以上の分岐を有し、該分岐が側鎖及び／又は末端に１以上の求核性官能基を有するポリエチレングリコールを骨格として有する、多分岐型ポリマーＢを含む液Ｂと、
を備える液滴吐出装置用の液セットであって、
前記液Ａ及び前記液ＢのｐＨが５以上１０以下であり、
前記液Ａ及び前記液Ｂにおける前記多分岐型ポリマーの濃度が０．３質量％以上２０質量％以下である、前記液滴吐出装置用の液セット。 - 前記求電子性官能基が、マレイミジル基、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基、及びニトロフェニル基よりなる群から選択され、
前記求核性官能基が、チオール基、アミノ基、及び−ＣＯ２ＰｈＮＯ２よりなる群から選択される請求項１に記載の液滴吐出装置用の液セット。 - 前記多分岐型ポリマーＡ及びＢが共に四分岐型ポリマーである請求項１又は２に記載の液滴吐出装置用の液セット。
- 前記求電子性官能基がマレイミジル基であり、前記求核性官能基がチオール基である請求項１〜３のいずれか一項に記載の液滴吐出装置用の液セット。
- 前記液Ａ及び前記液Ｂの２５℃における粘度が３０ｍＰａ・ｓ以下である請求項１〜４のいずれか一項に記載の液滴吐出装置用の液セット。
- 前記液Ａ及び前記液Ｂにおける前記多分岐型ポリマーの濃度が０．３質量％以上６．０質量％以下である請求項１〜５のいずれか一項に記載の液滴吐出装置用の液セット。
- 前記液Ａ及び前記液Ｂにおける前記多分岐型ポリマーの濃度が０．３質量％以上４．０質量％以下である請求項１〜６のいずれか一項に記載の液滴吐出装置用の液セット。
- 前記液Ａ及び前記液ＢのｐＨが６以上１０以下であり、前記液Ａ及び前記液Ｂにおける前記多分岐型ポリマーの濃度が１．７質量％以上２０質量％以下である請求項１〜５のいずれか一項に記載の液滴吐出装置用の液セット。
- 前記液Ａ及び前記液Ｂのいずれか一方、又は両方に自己組織化生体材料が混合されている請求項１〜８のいずれか一項に記載の液滴吐出装置用の液セット。
- 前記自己組織化生体材料が、ラミニン及びコラーゲンを含むゲル、フィブリノーゲン、ゼラチン及びエラスチンからなる群から選択される一種以上である請求項９に記載の液滴吐出装置用の液セット。
- 前記液Ａ及び前記液Ｂのいずれか一方、又は両方に細胞が懸濁されている請求項１〜１０のいずれか一項に記載の液滴吐出装置用の液セット。