WO2023095414A1 - 微小粒子の計測方法、微小粒子計測装置及び微小粒子計測システム - Google Patents

Abstract

実施形態の微小粒子の計測方法は、照明光を測定対象の微小粒子を含む液体に対して出射する光源と、照明光を集光する対物レンズと、集光された照明光を結像する結像レンズと、結像された照明光を検出するセンサと、を備えた微小粒子の計測装置で実行される微小粒子の計測方法であって、計測対象の微小粒子の透過光強度が最大となる位置から対物レンズまでの距離を測定するステップと、微小粒子の粒子径及び測定した距離に基づいて、計測対象の微小粒子の屈折率を算出するステップと、を備える。

Description

微小粒子の計測方法、微小粒子計測装置及び微小粒子計測システム

　本発明の実施形態は、微小粒子の計測方法、微小粒子計測装置及び微小粒子計測システムに関する。

　従来、測定光を汚泥中に入射してそれに対する光応答を観測することで汚泥濃度及び汚泥粒子径を測定する手法が提案されている。
　この手法を用いた測定装置は、測定光を照射する光源部、セル等を備えた測定部、及び、測定光を受光するセンサを有する検出部を備えている。

　汚泥濃度検出ではランベルト・ベールの法則（Lambert-Beer　law）に基づいて、測定部に入射した光に対して透過した光の強度を検出部で測定し、予め測定した検量線を用いて得られた信号レベルから濃度を測定することができる。

　しかし、この手法による濃度測定では、あらかじめ検量線を作成する必要があり、ランベルト・ベールの法則は入射光と透過光の強度変化を見ているのでセンサの感度により測定できる濃度に制限があるという課題があった。

特開２００４－３１７３５０号公報

　ところで、有機系廃水処理では様々な有用微生物を利用して、排水中の有機物分解、窒素やリンの除去等を行っていた。実際の運用では汚泥濃度と水質に基づいて処理状況を測定することで微生物全体の量を制御している。

　したがって有用微生物の濃度のみを検出する方法があれば、制御が安定することにより処理性能の向上が期待できる。
　しかしながら、従来の手法では、測定装置が高価で、検出時間に時間がかかったり、微小な現象の変化等を定量的に測定することできなかったりして実用的ではないという課題があった。

　本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、簡易な構成で迅速に定量測定が可能な微小粒子の計測方法、微小粒子計測装置及び微小粒子計測システムを提供することを目的としている。

　実施形態の微小粒子の計測方法は、照明光を測定対象の微小粒子を含む液体に対して出射する光源と、照明光を集光する対物レンズと、集光された照明光を結像する結像レンズと、結像された照明光を検出するセンサと、を備えた微小粒子の計測装置で実行される微小粒子の計測方法であって、計測対象の微小粒子の透過光強度が最大となる位置から対物レンズまでの距離を測定するステップと、微小粒子の粒子径及び測定した距離に基づいて、計測対象の微小粒子の屈折率を算出するステップと、を備える。

図１は、実施形態の微小粒子計測装置の概要構成図である。 図２は、光線追跡行列におけるパラメータの説明図である。 図３は、バチルス属菌株の芽胞（微小粒子）について透過光強度が最大となるときのバチルス属株菌の芽胞と対物レンズとの間の距離ｚに対する実際の対物レンズの位置の差と、相対透過光強度と、の関係を説明する図である。 図４は、粒子径＝３０μｍのアクリル粒子について透過光強度が最大となるときのアクリル粒子（微小粒子）と対物レンズとの間の距離ｚに対する実際の対物レンズの位置の差と、相対透過光強度と、の関係を説明する図である。 図５は、実施形態の微小粒子数計測処理の処理フローチャートである。 図６は、微小粒子として、バチルス属菌株の芽胞の個数計測処理の処理フローチャートである。 図７は、本変形例の原理説明図である。 図８は、有機系排水処理の処理フローチャートである。 図９は、機械学習の処理フローチャートである。 図１０は、機械学習で用いる検量線の一例の説明図である。 図１１は、顕微鏡画像を、画像処理した処理結果の説明図である。

　図１は、実施形態の微小粒子計測装置の概要構成図である。
　微小粒子計測装置１０は、照明光Ｌを出射する光源１１と、測定用試料ＳＰを保持するスライドガラス（プレパラート）１２を支持するステージ１３と、ステージ１３を光軸に沿って図１の上下方向に駆動するステージ駆動部１４と、スライドガラス１２の位置を検出する測距部として機能するレーザ変位計１５と、照明光Ｌを集光して平行光とする対物レンズ１６と、平行光となった照明光Ｌを集光して結像する結像レンズ１７と、結像レンズ１７により結像された像を撮像するイメージセンサ１８と、計測処理部として機能し、計測処理及び微小粒子計測装置１０全体の制御を行う計測制御部１９と、を備えている。
　上記構成において、光源１１、対物レンズ１６及び結像レンズ１７は、光学系を構成している。

［１］計測原理
　まず微小粒子の計測原理について説明する。
［１．１］屈折率及び粒子径
　液体中の微小粒子の背面側から照明光を照射した場合、当該微小粒子のレンズ効果により、照明光は微小粒子の粒子径及び屈折率に対応する位置に集光される。
　ここで、集光位置に近づくほど透過光強度は高くなり、集光位置で透過光強度が最大となり、ふたたび集光位置から離れることにより、透過光強度は低下する。

　すなわち、透過光強度が最大となる位置が集光位置である。
　このとき、対物レンズと透過光強度が最大となる位置との間の距離を測定することにより、集光位置を特定することができる。
　この場合において、照明光の光路は、次式により表すことができるので、対物レンズと透過光強度が最大となる位置との間の距離に加えて、微小粒子の粒子径がわかっていれば、下記の光線追跡行列により表された方程式を解くことで、微小粒子の屈折率がわかることとなる。

　図２は、光線追跡行列におけるパラメータの説明図である。
　上記光線追跡行列において、微小粒子ＰＣの半径をｒとし、微小粒子の屈折率をｎとし、対象となる微小粒子において照明光Ｌの透過光強度が最大となるときの微小粒子と対物レンズ１６との間の距離をｚとし、微小粒子に照明光Ｌが入射したときの光軸からの距離をｘ_０とし、微小粒子に照明光Ｌが入射したときの入射角度をｕ_０とし、イメージセンサ１８に入射した照明光Ｌの光軸からの距離をｘ_１とし、イメージセンサ１８に入射した照明光Ｌの入射角度をｕ_１とする。

　さらに、対物レンズ１６と結像レンズ１７との距離をｌ_１とし、結像レンズ１７とイメージセンサ１８との距離をｌ_２とし、対物レンズの焦点距離をｆ_１とし、結像レンズ１７の焦点距離をｆ_２とする。
　同様に微小粒子の屈折率がわかっていれば、上記光線追跡行列により表された方程式を解くことにより、微小粒子の粒子径がわかることとなる。

［１．２］有用微生物の検出、個数測定、濃度測定
　有機系排水処理において用いられる有用微生物は、条件によっては、微小粒子とみなすことが可能である。
　この場合において、条件とは、例えば、有用微生物が芽胞を形成している場合である。芽胞を形成している場合には、形状等が変化しなくなるとともに、その形状も有用微生物によりほぼ一定であるためである。

　有用微生物の芽胞は、固有の大きさ（粒子径に相当）及び固有の屈折率を有していることから、微小粒子と同様に取り扱うことにより、このような有用微生物の検出、観測視野あたりの個数（ひいては、濃度）を計測することが可能となる。
　この場合において、濃度を計測する場合には、光軸方向に沿って、観察位置（画像撮像位置）を走査することにより、観察視野×走査距離に対応する容積中における有用微生物の個数を計測することで、濃度の計測が可能となる。

　ところで、屈折率が既知で粒径が１μｍ以下である汚泥中のバチルス（Bacillus）属菌株の芽胞では、透過光強度が最大となる距離ｚに対応する位置は画像取得においての焦点距離ｆ_１に対応する被写界深度内（実効的な焦点位置）に位置することがわかった。
　このため、あらかじめ設定した透過光強度閾値に基づいて閾値以上の光強度を持つ部分をバチルス属菌株の芽胞と見なすことができることがわかった。

　この場合において、バチルス属菌株の芽胞を含む液体の透過光強度は、バチルス属菌株の芽胞を含まない液体の透過光強度よりも大きくなる。
　したがって、バチルス属菌株の芽胞を含むか否かの判断を行うための透過光強度の閾値を、芽胞を含まない液中における透過光強度よりやや大きな値に設定することにより、バチルス属菌株の芽胞を確実に検出することができる。

　さらに設定した透過光強度閾値を用いて、試料を光軸方向に連続的に移動させつつ、順次画像を撮像し、撮像画像から得られた場所毎（画素毎）の透過光強度と微小粒子としてのバチルス属菌株の芽胞の大きさ（粒子径）を判断基準とする機械学習を組み合わせることでバチルス属菌株の芽胞の検出及び個数の計測、ひいては、バチルス属菌株の濃度の計測を高精度化することが可能となる。

　この場合における機械学習としては、微小粒子の濃度が異なる複数の試料を予め調整し、各試料毎に検査者の人手による検出結果が機械学習による検出結果と等しくなるように、教師あり学習を行って、学習対象の微小粒子の粒子径及び屈折率に対応して得られる微小粒子の検出あるいは個数の計測結果を得るようにすればよい。

［２］第１実施形態
　次に第１実施形態について説明する。
　図３は、バチルス属菌株の芽胞（微小粒子）について透過光強度が最大となるときのバチルス属株菌の芽胞と対物レンズとの間の距離ｚに対する実際の対物レンズの位置の差と、相対透過光強度と、の関係を説明する図である。
　また、図４は、粒子径＝３０μｍのアクリル粒子について透過光強度が最大となるときのアクリル粒子（微小粒子）と対物レンズとの間の距離ｚに対する実際の対物レンズの位置の差と、相対透過光強度と、の関係を説明する図である。

　まずバチルス属菌株の芽胞及びアクリル粒子について、イメージセンサ１８により焦点位置における画像を取得した。
　その後、ステージ駆動部１４によりステージ１３を光軸方向に沿って上下方向に駆動し、イメージセンサ１８上でそれぞれの微小粒子の相対透過光強度が最大となるときの対物レンズ１６の位置と、実際の対物レンズ１６の位置との位置差Δｚをレーザ変位計１５により測定した。

　図３（Ａ）は、バチルス属菌株の芽胞を含む液体において、相対透過光強度が最大となった場合の撮像画像である。図３（Ａ）に示すように、撮像領域の中心で相対透過光強度が最大となっていることがわかる。
　そして、図３（Ｂ）に示すように、バチルス属菌株の芽胞を含む液体においては、位置差Δｚ＝０μｍで相対透過光強度が最大となると算出された。
　これに対し、図４（Ｂ）に示すように、粒子径＝３０μｍのアクリル粒子を含む液体の場合、バチルス属菌株の芽胞において相対透過光強度が最大となった位置差Δ０μｍにおいては、相対透過光強度は負の値を有している。すなわち、透過光強度は、背景光強度より低くなっていることがわかる場合の撮像画像である。図４（Ａ）に示すように、アクリル粒子の周辺で相対透過光強度が最小となっていることがわかる。
　そして、図４（Ｂ）に示すように、粒子径＝３０μｍのアクリル粒子を含む液体においては、位置差Δｚ＝±１５μｍより外側で相対透過光強度が最大となると算出された。

　そして、図４（Ｃ）は、粒子径＝３０μｍのアクリル粒子を含む液体において、相対透過光強度が最大となった場合の撮像画像である。図４（Ｃ）に示すように、撮像領域の中心で相対透過光強度が最大となっていることがわかる。
　そして、図４（Ｄ）に示すように、粒子径＝３０μｍのアクリル粒子を含む液体においては、位置差Δｚ＝２６μｍで相対透過光強度が最大となると算出された。

　この計測結果に基づき、上述した光線追跡行列を用いてバチルス属菌株の芽胞及び３０μｍのアクリル粒子について、透過光強度が最大となるときの微小粒子であるバチルス属菌株の芽胞及び粒子径＝３０μｍのアクリル粒子から対物レンズ１６迄の距離ｚと、対物レンズの焦点距離との差に相当する位置差Δｚを算出した。この位置差Δｚの算出結果によれば、バチルス属菌株の芽胞を含む液体における位置差Δｚ＝０．９μｍ、粒子径３０μｍのアクリル粒子を含む液体における位置差Δｚ＝２２．５μｍとなり、レーザ変位計を用いた計測結果とほぼ一致することがわかった。このときの対物レンズ１６と結像レンズ１７との距離をｌ_１＝１３０ｍｍ、結像レンズ１７とイメージセンサ１８との距離をｌ_２＝１６４．５ｍｍ、対物レンズの焦点距離をｆ_１＝４．１１２５ｍｍ、結像レンズ１７の焦点距離をｆ_２＝１６４．５ｍｍとした。またバチルス属菌株の芽胞の半径ｒ＝１μｍ、屈折率ｎ＝１．４とし、アクリル粒子の屈折率ｎ＝１．５とした。

　特に、バチルス属菌株の芽胞を含む液体における位置差Δｚ＝０．９μｍは、実効的に対物レンズの焦点距離と等しく（被写界深度内）、相対透過光強度は、焦点位置において最大となることがわかった。
　このことから、バチルス属菌株の芽胞の計測においては、焦点距離における透過光強度（実施形態では、相対透過光強度）を測定することで、バチルス属菌株の芽胞の検出が可能であるということがわかった。

　すなわち、バチルス属菌株の芽胞が含まれている試料溶液において、透過光強度が最大となるときのバチルス属株菌の芽胞と対物レンズとの間の距離ｚ（＝対物レンズ焦点距離）における透過光強度が所定の透過光強度閾値を超えており、微小粒子の粒径が所定のバチルス属菌株の芽胞の粒径範囲内、かつ、微小粒子の屈折率が所定のバチルス属菌株の芽胞の屈折率範囲内である場合には、バチルス属菌株の芽胞が検出されたと容易に判定することができるのである。

　同様に、粒子径＝３０μｍのアクリル粒子が含まれている試料溶液において、透過光強度が最大となるときのアクリル粒子と対物レンズとの間の距離ｚ＋Δｚ（上述の例の場合、Δｚ＝２６μｍ）における透過光強度が所定の透過光強度閾値を超えており、微小粒子の粒径が所定の粒子径＝３０μｍのアクリル粒子の粒径範囲内、かつ、微小粒子の屈折率が所定の粒子径＝３０μｍのアクリル粒子の屈折率範囲内である場合には、粒子径＝３０μｍのアクリル粒子が検出されたと容易に判定することができるのである。

　これらを利用して、バチルス属菌株の芽胞が含まれている試料溶液あるいは粒子径＝３０μｍのアクリル粒子が含まれている試料溶液において、対物レンズの焦点位置を光軸方向に徐々にずらしてゆき、（相対）光透過強度を検出することで、試料溶液中に点在するバチルス属菌株の芽胞あるいはアクリル粒子の検出視野内における位置を特定し、かつ、その個数を計数することが可能となり、ひいては、光軸方向におけるトータルの移動距離を求めることで、所定体積中のバチルス属菌株の芽胞あるいはアクリル粒子の濃度を算出することができる。

　次に一般的な微小粒子の計測処理について説明する。
　図５は、実施形態の微小粒子数計測処理の処理フローチャートである。
　まず、光学系を用いて微小粒子の透過光強度最大位置と、対物レンズ１６との間の距離をレーザ変位計１５により測定する（ステップＳ１１）。
　続いて、イメージセンサ１８により微小粒子の画像を取得し、画像認識により微小粒子の粒子径を算出する（ステップＳ１２）。
　続いて、光学系の情報である対物レンズ１６と結像レンズ１７の距離ｌ_１、結像レンズとイメージセンサとの距離ｌ_２、対物レンズ１６の焦点距離ｆ_１及び結像レンズ１７の焦点距離ｆ_２を用いて、光線追跡行列を解いて、微小粒子の屈折率を算出する（ステップＳ１３）。
　さらにステップＳにおいて取得した微小粒子の画像及び算出した微小粒子の屈折率に基づいて、測定対象の微小粒子と同一の屈折率を有する微小粒子を微小粒子の画像において特定し、画像認識により微小粒子の個数を計測する（ステップＳ１４）。
　より詳細には、画像に含まれる一または複数の微小粒子の画像から測定対象の微小粒子と同一の屈折率を有する微小粒子の個数を計測することで測定対象の微小粒子の個数を計測することとなる。

　次により具体的な計測処理として、バチルス属菌株の芽胞の計測処理について説明する。
　図６は、微小粒子として、バチルス属菌株の芽胞の個数計測処理の処理フローチャートである。

　初期状態において、用いる光学系の焦点距離は、所定の初期値に調整されているものとする。
　まず、光学系を用いてイメージセンサによりバチルス属菌株の芽胞溶液の透過画像を取得する（ステップＳ２１）。

　続いて、バチルス属菌株の芽胞の透過光強度が背景光強度を超えているか否かを判断する（ステップＳ２２）。
　すなわち、相対透過光強度［＝（透過光強度－背景光強度）／透過光強度］が正の値を有しているか否かを判断する。

　この場合において、撮像画像に含まれる微小粒子が、バチルス属菌株の芽胞であるか否かは、撮像画像において各微小粒子の粒子径を計測し、その粒子径がバチルス属菌株の芽胞の所定の粒子径範囲に属しており、次式で表される上述した光線追跡行列を計測した微小粒子の粒子径に基づいて解くことで得られる微小粒子の屈折率がバチルス属菌株の芽胞の所定の屈折率範囲に属しているか否かを判断することとなる。

　ステップＳ２２の判断において、バチルス属菌株の芽胞の透過光強度が背景光強度を超えている場合には（ステップＳ２２；Ｙｅｓ）、透過光強度の判別閾値をバチルス属菌株の芽胞の透過光強度と、背景光強度との間の値に決定する（ステップＳ２３）。
　例えば、相対透過光強度［＝（透過光強度－背景光強度）／透過光強度］＝０．０２に設定する。

　続いて決定した透過光強度の判別閾値に基づいて、ステップＳ２１で取得したバチルス属菌株の芽胞溶液の透過画像の二値化画像を生成する（ステップＳ２４）。
　生成された二値化画像は、例えば、バチルス属菌株の芽胞の透過光部分が白（「１」）で表示され、背景光部分が黒（「０」）で表示される。
　したがって、この場合には、黒で囲まれた白の領域がバチルス属菌株の芽胞が存在する領域となるので、二値化画像における黒で囲まれた白の領域の数を数えることにより芽胞の個数計測が行える（ステップＳ２５）。
　一方、ステップＳ２２の判断において、バチルス属菌株の芽胞の透過光強度が背景光強度以下である場合には（ステップＳ２２；Ｎｏ）、計測制御部１９は、ステージ駆動部１４を制御して、対物レンズ１６の焦点位置を調整し（ステップＳ２６）、再び処理をステップＳ２１に移行して、再び芽胞溶液の透過画像を取得する（ステップＳ２１）。そして同様にステップＳ２２からの処理を、芽胞の個数計測が完了するまで繰り返す。
　以上の説明のように、本実施形態によれば、判別閾値を決定可能な芽胞溶液の透過画像が取得可能な状態であれば、容易に芽胞の個数を計測することが可能となる。

［２．１］第１実施形態の変形例
　以上の説明は、単にバチルス属菌株の芽胞の個数を計測する場合のものであったが、本変形例は、バチルス属菌株の芽胞の濃度を計測する場合のものである。

　図７は、本変形例の原理説明図である。
　ステージ駆動部１４によりステージ１３を光軸方向に沿って走査して複数の透過光画像（あるいは動画）を取得した場合、走査方向における位置Ｐ１、Ｐ２に位置するバチルス属菌株の芽胞ＳＰ１、ＳＰ２がそれぞれ丁度、対物レンズの焦点位置に位置する場合、当該芽胞における透過光強度が最大となる。

　したがって、光軸方向に沿って走査しながら透過光強度が最大となる位置に位置する微小粒子を上述した手法により、バチルス属菌株の芽胞と特定できた場合、イメージセンサ１８の視野ＦＶ及び走査距離ＳＣＬで特定される立方体の容積内には、２個の芽胞ＳＰ１、ＳＰ２が存在していることがわかる。

　この場合において、視野ＦＶの面積をＡＲ（μｍ^２）とすると、視野ＦＶ及び走査距離ＳＣＬ（μｍ）で特定される立方体の容積Ｖは、
　　　　Ｖ＝ＡＲ×ＳＣＬ（μｍ^３）
で表され、芽胞の濃度＝２／Ｖとなる。

　同様にして、立方体内にＮ個の芽胞が含まれる場合の、芽胞の濃度＝Ｎ／Ｖとなる。
　したがって、本変形例によれば容易に芽胞の濃度、ひいては、微小粒子の濃度を算出することができる。

［３］第２実施形態
　次に有機系排水処理において、実施形態の微小粒子計測装置を適用する場合の第２実施形態について説明する。

　図８は、有機系排水処理の処理フローチャートである。
　まず、有機系排水処理の処理対象の排水から試料溶液を取得する（ステップＳ３１）。
　次に試料溶液に対し、所定の条件で加熱し、あるいは、所定の条件で薬品による前処理を行い、試料溶液に含まれるバチルス属菌栄養型細胞の芽胞化を行う（ステップＳ３２）。

　続いて、ステージ駆動部１４によりステージを駆動して、光軸方向に沿って、対物レンズの焦点位置を実効的に走査するとともに、操作状態に応じて複数の透過光画像を取得する（ステップＳ３３）。

　そして透過光画像に含まれる微小粒子の粒子径及び透過光強度の変化を検出し、相対透過光強度が最大の位置に芽胞が含まれるものとして走査範囲内で芽胞の検出を行う（ステップＳ３４）。

　この場合において、芽胞であるか否かは、透過光強度が最大となるときのバチルス属株菌の芽胞と対物レンズとの間の距離ｚ（＝対物レンズ焦点距離）における透過光強度が所定の閾値を超えており、微小粒子の粒径が所定のバチルス属菌株の芽胞の粒径範囲内であるか否かに基づいて判定する。

　この結果、機械学習の結果により得られる機械学習済モデルを用いて、観察視野×操作距離に等しい容積中のバチルス属菌株の芽胞の個数がカウントできるので、単位容積あたりの芽胞濃度を計測する（ステップＳ３５）。

　ここで、機械学習の手法について述べる。
　図９は、機械学習の処理フローチャートである。
　機械学習においては、まずバチルス属菌株の芽胞及び汚泥の透過光画像を取得する（ステップＳ４１）。

　続いて取得した透過光画像に基づいて、正解及び不正解の教示による機械学習がなされ（ステップＳ４２）、機械学習結果が計測制御部１９に格納され、計測制御部１９は、透過光画像におけるバチルス属株菌の検出を自動的に行えるようになる。

　図１０は、機械学習で用いる検量線の一例の説明図である。
　この検量線の作成においては、汚泥と芽胞溶液とを所定の比率で混合して得られる調整濃度に対して、実施形態の装置での検出濃度を求めた。

　本例において、調整濃度としては、５×１０^３［cells/mL］、１×１０^４［cells/mL］、５×１０^４［cells/mL］、１×１０^５［cells/mL］、５×１０^５［cells/mL］、１×１０^６［cells/mL］、５×１０^６［cells/mL］、１×１０^７［cells/mL］、５×１０^７［cells/mL］の９段階とした。

　実際の濃度の調整としては、５×１０^７［cells/mL］の液を調整し、これを汚泥により薄めることにより、上記調整濃度としている。
　また、芽胞濃度の測定については、芽胞溶液を血球計算盤に滴下して個数をカウントすることにより行った。

　より詳細には、血球計算盤の画像を撮像し、得られた画像の視野は４２２μｍ×３５３μｍであった。この場合に、血球計算盤の深さが、０．１ｍｍであったので、視野中に１個の芽胞が含まれる場合の芽胞濃度は、６．７１３×１０^４［cells/mL］と算出できる。
　機械学習に用いる検量線としては、５×１０^５［cells/mL］未満の領域については、図１０に破線で示すように、芽胞濃度＝５×１０^５［cells/mL］～５×１０^７［cells/mL］の範囲の検量線を直線とみなして、外挿した直線を用いている。
　この結果、機械学習による検出濃度の検量線として用いることにより、未知の濃度の芽胞溶液の濃度を算出することが可能となる。

　図８に戻り、続いて、計測濃度（濃度計測結果）が優占化濃度以上であるか否かを判断する（ステップＳ３６）。
　ここで、優占化濃度とは、生物群集において、量が特に多く当該群衆の特徴を代表し、決定づける濃度となっている状態をいう。

　すなわち、本実施形態においては、バチルス属菌株の芽胞の個体量が多く、バチルス属菌株の特性が顕著に表れる濃度となっているということである。

　ステップＳ３６の判断において、計測濃度（濃度計測結果）が優占化濃度未満である場合には（ステップＳ３６；Ｎｏ）、処理対象の排水において、バチルス属菌株が優占状態ではないので、バチルス属菌株を用いた排水の有機系排水処理を迅速に行わせるために処理対象排水に対し、バチルス属菌株を添加するように指示を行う。これにより作業者は、処理対象の排水にバチルス属菌株を添加する（ステップＳ３７）。

　続いて、再び処理をステップＳ３１に移行し、有機系排水処理の処理対象の排水から試料溶液を取得する（ステップＳ３１）。

　以下、同様にして、ステップＳ３１～ステップＳ３７の処理を繰り返して、処理対象の排水に含まれるバチルス属菌株の濃度が優占化濃度を超えるようにする。

　一方、ステップＳ３６の判断において、計測濃度（濃度計測結果）が優占化濃度以上である場合には（ステップＳ３６；Ｙｅｓ）、有機系排水処理において、バチルス属菌株が有効に働いて、排水の処理を行うことが可能な状態であると判断されるため、処理を終了する。
　以上の説明のように、第２実施形態によれば、有機系排水処理において、処理対象の排水において、バチルス属菌株の優占化状態に迅速に移行させることができ、排水処理を迅速、かつ、確実に行わせることができる。

［４］第３実施形態
　次に第３実施形態について説明する。
　図１１は、顕微鏡画像を、画像処理した処理結果の説明図である。
　図１１（Ａ）は、画像処理後の二値化画像の説明図である。
　また図１１（Ｂ）は、一つの芽胞を含む領域ＡＲ１について相対透過光強度と閾値との関係を示す図である。

　光軸方向に対物レンズの焦点位置を走査した場合、図１１（Ｂ）に示すように、相対透過光強度＝０．０２を判別用閾値Ｉｔｈとした場合に、芽胞存在位置（図中、位置＝０）においては、相対透過光強度が急激に増加し、容易に判別用閾値Iｔｈを超える。
　したがって、この領域には芽胞が存在すると推定されるので、対応する領域の値を１とし、それ以外の領域を０とする二値化を行う。

　この結果、図１１（Ａ）に示すように、例えば、芽胞の存在位置を観測視野中に各黒点で示すことができるのである。実際の装置においては、黒点は、例えば、赤色で表示することにより、より観察者にとって認識しやすい表示態様とすることが可能である。

［５］実施形態の変形例
　以上の説明においては、予め濃度調整を行った試料により得られる検量線を用いて濃度計測を行う場合について説明したが、従来のマイクロコロニー法、シーケンス法などによる菌数濃度の計測結果を用いて濃度計測を行うように構成することも可能である。

　以上の説明は、微小粒子計測装置をスタンドアロンで構成する場合であったが、ローカル端末側でイメージセンサ（撮像装置）により取得した透過光画像を通信インタフェース及び通信ネットワークを介してクラウドサーバに転送し、クラウドサーバ側で透過光画像に含まれる計測対象の微小粒子（例えば、バチルス属菌株の芽胞）を特定し、微小粒子数（例えば、バチルス属菌株の芽胞数）、微小粒子濃度（例えば、バチルス属菌株の芽胞濃度）を算出し、通信ネットワークを介して、ローカル端末側に通知するようにすることも可能である。

　上記構成において、クラウドサーバは、計測対象の微小粒子を特定するに際し、検出された微小粒子の屈折率が所定の屈折率範囲に属し、かつ、計測対象の微小粒子の粒径が所定粒径範囲に属する場合に、当該検出された微小粒子を計測対象の微小粒子であると特定する。

　またクラウドサーバに計測基準を設定する場合に、機械学習において、透過光画像と、人手による対応する微小粒子の特定結果を用いて、教師あり学習を行うことにより、判別用閾値Iｔｈを自動的に設定するように構成することも可能である。

　以上の説明のように、各実施形態によれば、測定対象の微小粒子を含む溶液の透過光画像を取得し、微小粒子の粒径を測定し、光線追跡行列に基づいて、微小粒子の屈折率を算出することで、溶液中の測定対象の微小粒子を容易に特定して、当該微小粒子の計測（個数あるいは濃度）を迅速に計測することができる。

　特に溶液として、有機系排水処理の処理対象の汚泥の透過光画像を取得して、機械学習の学習結果に基づいてバチルス属菌株の芽胞濃度を自動的に測定することが可能となるので、従来の検出方法であるμコロニー法や、シーケンス法と比較して、安価な装置構成で、短時間に濃度測定することが可能となる。

　この結果、継続的にバチルス属菌株の芽胞濃度の変化を容易に短時間で捉えることが可能となり、有機系排水処理の処理性能の向上が容易に図れる。

　本実施形態の微小粒子計測装置（計測処理部）は、ＣＰＵなどの制御装置と、ＲＯＭ（Read　Only　Memory）やＲＡＭなどの記憶装置と、ＨＤＤ、ＣＤドライブ装置などの外部記憶装置と、ディスプレイ装置などの表示装置と、キーボードやマウスなどの入力装置を備えており、通常のコンピュータを利用したハードウェア構成となっている。
　本実施形態の微小粒子計測装置（計測制御部）で実行されるプログラムは、インストール可能な形式又は実行可能な形式のファイルで、ＤＶＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　Ｄｉｓｋ）、ＵＳＢメモリ、ＳＳＤ（Solid　State　Drive）などの半導体記憶装置等のコンピュータで読み取り可能な記録媒体に記録されて提供される。
　また、本実施形態の微小粒子計測装置（計測処理部）で実行されるプログラムを、インターネット等のネットワークに接続されたコンピュータ上に格納し、ネットワーク経由でダウンロードさせることにより提供するように構成しても良い。また、本実施形態の装置で実行されるプログラムをインターネット等のネットワーク経由で提供または配布するように構成しても良い。
　また、本実施形態の微小粒子計測装置（計測処理部）のプログラムを、ＲＯＭ等に予め組み込んで提供するように構成してもよい。

　本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。

Claims (13)

1. 　照明光を測定対象の微小粒子を含む液体に対して出射する光源と、照明光を集光する対物レンズと、集光された照明光を結像する結像レンズと、結像された照明光を検出するセンサと、を備えた微小粒子の計測装置で実行される微小粒子の計測方法であって、
   　計測対象の微小粒子の透過光強度が最大となる位置から前記対物レンズまでの距離を測定するステップと、
   　前記微小粒子の粒子径及び測定した距離に基づいて、前記計測対象の微小粒子の屈折率を算出するステップと、
   　を備えた微小粒子の計測方法。
2. 　前記センサは、イメージセンサであり、
   　前記センサにより撮像した前記微小粒子を含む画像に基づいて、前記粒子径を算出するステップを備えた、
   　請求項１に記載の微小粒子の計測方法。
3. 　前記センサ上で透過光強度として最大になるときの前記微小粒子と前記対物レンズの距離を算出するステップと、
   　前記対物レンズと前記結像レンズの距離、前記結像レンズと前記センサの距離、前記対物レンズの焦点距離、前記結像レンズの焦点距離、前記照明光が半径ｒの前記微小粒子に入射する位置及び入射角度を用いて、所定の光線追跡行列により観測粒子の屈折率を算出するステップと、
   　を備えた、請求項１に記載の微小粒子の計測方法。
4. 　前記微小粒子は、屈折率が既知で粒径が１μｍ以下である汚泥中のバチルス属菌株の芽胞であり、
   　前記対物レンズの焦点距離における前記透過光強度が、所定の透過光強度閾値以上となる領域に前記芽胞が存在すると推定するステップを備えた、
   　請求項１に記載の微小粒子の計測方法。
5. 　前記芽胞を含まない液中における透過光強度を前記透過光強度閾値とする、
   　請求項４に記載の微小粒子の計測方法。
6. 　前記透過光強度と、透過光画像との関係について予め機械学習を行うステップと、
   　前記透過光画像を取得するステップと、
   　前記透過光画像に対し、前記機械学習により前記芽胞の検出及び個数計測を行うステップと、
   　を備えた請求項４に記載の微小粒子の計測方法。
7. 　照明光を測定対象の微小粒子を含む液体に対して出射する光源と、
   　照明光を集光する対物レンズと、
   　集光された照明光を結像する結像レンズと、
   　結像された照明光を検出し、透過光画像を出力するイメージセンサと、
   　計測対象の微小粒子の透過光強度が最大となる位置から前記対物レンズまでの距離を測定する測距部と、
   　前記微小粒子の粒子径及び測定した距離に基づいて、前記計測対象の微小粒子の屈折率を算出する計測処理部と、
   　を備えた微小粒子計測装置。
8. 　前記計測処理部は、前記透過光画像に含まれる前記微小粒子の画像に基づき、前記粒子径を算出する、
   　請求項７に記載の微小粒子計測装置。
9. 　前記計測処理部は、前記イメージセンサ上で透過光強度として最大になるときの前記微小粒子と前記対物レンズの距離を算出し、
   　前記対物レンズと前記結像レンズの距離、前記結像レンズと前記イメージセンサの距離、前記対物レンズの焦点距離、前記結像レンズの焦点距離、前記照明光が半径ｒの前記微小粒子に入射する位置及び入射角度を用いて、所定の光線追跡行列により観測粒子の屈折率を算出する、
   　請求項７に記載の微小粒子計測装置。
10. 　前記微小粒子は、屈折率が既知で粒径が１μｍ以下である汚泥中のバチルス属菌株の芽胞であり、
    　前記計測処理部は、前記対物レンズの焦点距離における前記透過光強度が、所定の透過光強度閾値以上となる領域に前記芽胞が存在すると推定する、
    　請求項７に記載の微小粒子計測装置。
11. 　照明光を測定対象の微小粒子を含む液体に対して出射する光源と、照明光を集光する対物レンズと、集光された照明光を結像する結像レンズと、結像された照明光を検出し、透過光画像を出力するイメージセンサと、計測対象の微小粒子の透過光強度が最大となる位置から前記対物レンズまでの距離を測定する測距部と、前記透過光画像及び前記計測対象の微小粒子の透過光強度が最大となる位置から前記対物レンズまでの距離を通信ネットワークを介して送信する通信インタフェースと、を備えたローカル端末と、
    　前記通信ネットワークを介して前記ローカル端末と通信可能に接続され、前記透過光画像に基づいて前記微小粒子の粒子径を算出し、前記計測対象の微小粒子の透過光強度が最大となる位置から前記対物レンズまでの距離に基づいて、前記計測対象の微小粒子の屈折率を算出し、前記粒子径及び前記屈折率に基づいて、前記微小粒子を特定して、特定結果を前記ローカル端末に通知するクラウドサーバと、
    　を備えた微小粒子計測システム。
12. 　前記クラウドサーバは、前記対物レンズと前記結像レンズの距離、前記結像レンズと前記イメージセンサの距離、前記対物レンズの焦点距離、前記結像レンズの焦点距離、前記照明光が半径ｒの前記微小粒子に入射する位置及び入射角度を用いて、所定の光線追跡行列により観測粒子の屈折率を算出する、
    　請求項１１に記載の微小粒子計測システム。
13. 　前記微小粒子は、屈折率が既知で粒径が１μｍ以下である汚泥中のバチルス属菌株の芽胞であり、
    　前記クラウドサーバは、前記対物レンズの焦点距離における前記透過光強度が、所定の透過光強度閾値以上となる領域に前記芽胞が存在すると推定する、
    　請求項１１に記載の微小粒子計測システム。

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