WO2023090925A1 - 자동화 분자진단 시스템을 이용한 고처리량 등온 증폭 방법 - Google Patents

자동화 분자진단 시스템을 이용한 고처리량 등온 증폭 방법 Download PDF

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WO2023090925A1
WO2023090925A1 PCT/KR2022/018265 KR2022018265W WO2023090925A1 WO 2023090925 A1 WO2023090925 A1 WO 2023090925A1 KR 2022018265 W KR2022018265 W KR 2022018265W WO 2023090925 A1 WO2023090925 A1 WO 2023090925A1
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WO
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sample
reaction vessel
sample preparation
preparation device
minutes
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PCT/KR2022/018265
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천종윤
박지훈
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주식회사 씨젠
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Publication date
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/02—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations
    • G01N35/04—Details of the conveyor system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices

Definitions

  • the present disclosure relates to a high throughput isothermal amplification method using an automated molecular diagnostic system.
  • Nucleic acid amplification technology is a technique mainly used in the fields of molecular biology and biotechnology, and is a method capable of detecting and analyzing a small amount of target nucleic acid present in a sample.
  • PCR Polymerase chain reaction
  • PCR Polymerase chain reaction
  • a real-time PCR method using a fluorescent substance is a method of detecting an increase in fluorescence intensity due to nucleic acid amplification during a PCR process.
  • the real-time PCR method has the advantage of enabling multiplex detection by using different fluorescent dyes for each target, but has the disadvantage of requiring expensive equipment and requiring a lot of time for detection.
  • an isothermal amplification method has been developed that does not require expensive real-time PCR equipment and can detect target nucleic acids in a faster time than PCR.
  • An example of isothermal amplification is rolling circle amplification (RCA, M. M. Ali, F. Li, Z. Zhang, K. Zhang, D.-K. Kang, J. A. Ankrum, X. C. Le and W. Zhao, Chem. Soc. Rev. , 2014, 43, 3324-3341.), loop-mediated isothermal amplification (LAMP, Y. Mori, H. Kanda and T. Notomi, J. Infect.
  • RPA recombinase polymerase amplification
  • NASBA nucleic acid sequence based amplification
  • SDA strand displacement amplification
  • HAD helicase dependent amplification
  • TMA transcription mediated amplification
  • LAMP LAMP was reported in 2000 by Notomi et al (T. Notomi, H. Okayama, H. Masubuchi, T. Yonekawa, K. Watanabe, N. Amino and T. Hase, Nucleic Acids Res., 2000, 28, E63).
  • Notomi et al T. Notomi, H. Okayama, H. Masubuchi, T. Yonekawa, K. Watanabe, N. Amino and T. Hase, Nucleic Acids Res., 2000, 28, E63.
  • Nagamine et al K. Nagamine, T. Hase and T. Notomi, Mol. Cell. Probes, 2002, 16, 223-229
  • the standard detection method for LAMP is turbidity measurement by precipitation of magnesium pyrophosphate (Y. Mori, K. Nagamine, N. Tomita and T. Notomi, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001, 289, 150-154).
  • other methods include gel electrophoresis, metal indicator for calcium, colorimetric LAMP, coffee-ring effect on colloidal-crystal matrix, paper-based rapid detection of LAMP magnetic bead agglomerates, analysis of melting and annealing curves, intercalation such as SYBR green collating fluorescent dyes, bioluminescence or electrochemiluminescence via pyrophosphate conversion; Recently, a method for detecting fluorescence specific to a target nucleic acid amplification sequence using an assimilating probe (PCT/US2011/041540) has been developed.
  • an isothermal amplification method such as the LAMP method can amplify a gene at one temperature in a short time (usually within 1 hour), so it does not require expensive equipment compared to real-time PCR, and has been applied to rapid on-site diagnosis.
  • the present inventors have developed a high-throughput isothermal amplification method using an automated molecular diagnosis system capable of processing a large amount of samples in a short time as a method to replace conventional molecular diagnosis by real-time PCR.
  • the present inventors have tried to develop a high-throughput isothermal amplification method to replace molecular diagnosis by conventional real-time PCR.
  • the present inventors apply direct lysis, use a 96-well plate as a reaction vessel, and also use an automated molecular diagnostics system including a sample preparation device including a liquid dispensing module, in a short time. It was confirmed that the target nucleic acid could be detected from a large amount of samples.
  • an object of the present disclosure is to provide a high throughput isothermal amplification method using an automated molecular diagnostic system.
  • a high throughput isothermal amplification method using an automated molecular diagnostic system comprising the following steps is provided:
  • the automated molecular diagnosis system includes a sample preparation device, a reaction vessel transfer device, and a sample analysis device, and the sample preparation device includes a direct lysis buffer and isothermal amplification for detecting a target nucleic acid. contain reagents;
  • the sample preparation device includes a liquid handling module for receiving a sample, a direct dissolution buffer, and an isothermal amplification reagent in a reaction vessel, and the liquid handling module includes 8 to 96 pipetting channels. );
  • (d-1) amplifying the target nucleic acid in the sample by reacting the mixture in the reaction vessel at a temperature selected from 50° C. to 75° C. for 10 to 20 minutes;
  • steps (b) to (d) are automatically performed by a control module in the automated molecular diagnosis system.
  • the sample derived from the subject is a swab, saliva, or a mixture thereof.
  • the smear is a nasopharyngeal swab, a nostril swab, an oropharyngeal swab, an oral swab, a saliva swab , genital swab, rectal swab, or a combination of two or more of these.
  • each of the sample preparation device and the sample analysis device is a stand-alone device operated individually.
  • At least one of the sample analysis device and/or the reaction vessel transfer device is located inside a spatially enclosed enclosure.
  • the sample preparation device and the closing structure form a defined passage through which the reaction vessel is transferred, and the reaction vessel transfer device transfers the reaction vessel using the defined passage.
  • the sample preparation device is located above or below the sample analysis device.
  • the reaction vessel is a 96-well plate.
  • the automated molecular diagnostics system further includes an automated container sealer for sealing an upper surface of the reaction container.
  • the automatic container sealer is located on the sample preparation device.
  • the automatic container sealer is located in the closure structure.
  • the target nucleic acid is a viral nucleic acid.
  • the target nucleic acid is an RNA viral nucleic acid.
  • the target nucleic acid is a nucleic acid of SARS-CoV-2.
  • the nucleic acid of SARS-CoV-2 is selected from the group consisting of E gene, N gene, RdRP gene, S gene, and combinations thereof.
  • the isothermal amplification reagent for detecting the target nucleic acid includes an oligonucleotide including a fluorescent molecule and an oligonucleotide including a quencher molecule.
  • the isothermal amplification reagent further comprises an oligonucleotide for amplifying and detecting an internal control.
  • the internal control is RNase P.
  • the isothermal amplification reagent for detecting a target nucleic acid is an isothermal amplification reagent for detecting a plurality of target nucleic acids.
  • the plurality of target nucleic acids is 2 to 5.
  • the method further comprises, prior to step (c), moving the reaction vessel to an automatic vessel sealer with the aid of a reaction vessel transfer device and sealing the upper surface of the reaction vessel.
  • the sealing of the upper surface to the reaction vessel is performed by heat or adhesive.
  • the temperature in step (d-1) is any temperature selected from 60°C to 65°C.
  • step (d-2) is performed at regular time intervals while performing step (d-1).
  • the method takes 18 to 60 minutes per 96 samples.
  • step (b) takes between 7 and 36 minutes per 96 samples.
  • step (b-1) takes between 6 and 13 minutes per 96 samples.
  • step (b-2) takes 5 minutes per 96 samples.
  • step (b-3) takes between 1 and 18 minutes per 96 samples.
  • step (c) takes between 1 and 4 minutes per 96 samples.
  • step (d) takes 15 to 20 minutes per 96 samples.
  • the method of the present invention can detect target nucleic acids from 96 samples within 18 to 60 minutes, it can be usefully applied to large hospitals, entrusted testing institutions, laboratories, etc. that require molecular diagnosis of a large amount of samples.
  • the method of the present invention can maintain high sensitivity even without a purification process when extracting a target nucleic acid from a sample.
  • the method of the present invention can process 96 samples simultaneously by using a system capable of accommodating a 96-well plate.
  • the method of the present invention can reduce the time required for dispensing the liquid required for the reaction by using a system including a liquid dispensing module having 8 to 96 pipetting channels, and operator intervention and errors resulting therefrom. risks can be avoided.
  • FIG. 1 is a front view showing an integrated system according to the present disclosure.
  • FIG. 2 is a right side view illustrating an integrated system according to the present disclosure.
  • FIG. 3 is an exemplary diagram illustrating operational connections of an integrated system according to one embodiment.
  • FIG. 4 is an interior front view illustrating the unitary system of the present disclosure.
  • FIG. 5 is a perspective view illustrating a stand-alone sample preparation device according to an embodiment.
  • FIG. 6 is a perspective view illustrating a closed structure according to an embodiment.
  • FIG. 7 is an exemplary diagram illustrating an operating state of a second opening of a closing structure according to an exemplary embodiment.
  • FIG. 8 is an internal perspective view illustrating a closed structure of an integrated system of an integrated system according to an embodiment.
  • FIG. 9 is a perspective view illustrating a reaction vessel transfer device according to an embodiment.
  • FIG. 10 is a perspective view illustrating an elevation module of a reaction vessel transfer device according to an embodiment.
  • FIG. 11 schematically shows an example of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method.
  • LAMP loop-mediated isothermal amplification
  • FIG. 12 schematically shows an example of a method for detecting a target nucleic acid using an assimilating probe.
  • Example 13 shows the results of high-throughput isothermal amplification by the automated molecular diagnostics system according to the present disclosure using the RT-LAMP reagent (1) containing the fluorescent dye prepared in Example 1-2.
  • Example 14 shows the results of high-throughput isothermal amplification by the automated molecular diagnostics system according to the present disclosure using the RT-LAMP reagent (2) containing the anabolic probe prepared in Example 1-2.
  • the present invention provides a high throughput isothermal amplification method using an automated molecular diagnostic system comprising the following steps:
  • the automated molecular diagnosis system includes a sample preparation device, a reaction container transfer device, and a sample analysis device, and the sample preparation device includes a direct lysis buffer and isothermal amplification for detecting a target nucleic acid. contain reagents;
  • the sample preparation device includes a liquid handling module for receiving a sample, a direct dissolution buffer, and an isothermal amplification reagent in a reaction vessel, and the liquid handling module includes 8 to 96 pipetting channels. );
  • (d-1) amplifying the target nucleic acid in the sample by reacting the mixture in the reaction vessel at a temperature selected from 50° C. to 75° C. for 10 to 20 minutes;
  • steps (b) to (d) are automatically performed by a control module in the automated molecular diagnosis system.
  • a sample collected from a subject is loaded into a sample preparation device in an automated molecular diagnosis system.
  • the automated molecular diagnosis system includes a sample preparation device, a reaction vessel transfer device, and a sample analysis device, and the sample preparation device includes a direct lysis buffer and an isothermal amplification reagent for detecting a target nucleic acid mounted therein. do.
  • the term "subject” refers to an individual suspected of containing a target nucleic acid (eg, a specific pathogen) to be detected using the method of the present disclosure.
  • a target nucleic acid eg, a specific pathogen
  • examples of the subject include, but are not limited to, mammals such as dogs, cats, rodents, primates, and humans, and in particular, humans.
  • sample may refer to any analyte that contains or is suspected to contain a nucleic acid to be detected.
  • the samples include biological samples (eg, cells, tissues, and body fluids) and non-biological samples (eg, food, water, and soil), and the biological samples include, for example, viruses, bacteria, tissues, cells, blood (whole blood). , plasma and serum), lymph, bone marrow, saliva, sputum, swab, aspiration, milk, urine, feces, eye fluid, semen, brain extract, spinal fluid, joint fluid, thymus fluid, bronchial lavage fluid, ascites fluid, or amniotic fluid, but is not limited thereto.
  • biological samples eg, cells, tissues, and body fluids
  • non-biological samples eg, food, water, and soil
  • the biological samples include, for example, viruses, bacteria, tissues, cells, blood (whole blood). , plasma and serum), lymph, bone marrow, saliva, sputum, sw
  • the sample may be used interchangeably with 'specimen' herein.
  • the sample can be obtained from a subject, particularly a mammal, more particularly a human, for example, a swab, saliva, sputum, aspiration, bronchoalveolar It may be bronchoalveolar lavage (BAL), gargle, or blood, but is not limited thereto.
  • a subject particularly a mammal, more particularly a human, for example, a swab, saliva, sputum, aspiration, bronchoalveolar It may be bronchoalveolar lavage (BAL), gargle, or blood, but is not limited thereto.
  • a subject particularly a mammal, more particularly a human, for example, a swab, saliva, sputum, aspiration, bronchoalveolar It may be bronchoalveolar lavage (BAL), gargle, or blood, but is not limited thereto.
  • BAL bronchoalveolar lavage
  • the sample derived from the subject is a swab, saliva, or a mixture thereof.
  • the smear is a nasopharyngeal swab, a nostril swab, an oropharyngeal swab, an oral swab, a saliva swab ), genital swab, rectal swab, or a combination of two or more of these.
  • nucleic acid refers to a polymer of deoxyribonucleotides or ribonucleotides in either single-stranded form or double-stranded form, said nucleotides being different from naturally occurring nucleotides. Derivatives of natural nucleotides, non-natural nucleotides or modified nucleotides that can function in the same way.
  • target nucleic acid refers to a nucleic acid sequence to be detected.
  • the target nucleic acid sequence may be hybridized with some primers or probes included in the isothermal amplification reagent used in the method of the present invention.
  • the target nucleic acid can be a human, animal, plant or microbial nucleic acid.
  • Microorganisms may be fungi, protozoa, bacteria, viruses, or algae.
  • the target nucleic acid may be a viral nucleic acid, and specifically, the target nucleic acid may be an RNA viral nucleic acid.
  • the target nucleic acid may be a respiratory viral nucleic acid.
  • a respiratory viral nucleic acid For example, influenza virus nucleic acid, respiratory syncytial virus (RSV) nucleic acid, adenovirus nucleic acid, enterovirus nucleic acid, parainfluenza virus nucleic acid, metapneumovirus (MPV) nucleic acid, bocavirus nucleic acid, rhinovirus nucleic acids and/or coronavirus nucleic acids, and the like.
  • RSV respiratory syncytial virus
  • MPV metapneumovirus
  • bocavirus nucleic acid bocavirus nucleic acid
  • rhinovirus nucleic acids and/or coronavirus nucleic acids and the like.
  • the target nucleic acid may be Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) viral nucleic acid.
  • SARS-CoV-2 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
  • the nucleic acid of the SARS-CoV-2 virus may be selected from the group consisting of E gene, N gene, RdRP gene, S gene, and combinations thereof.
  • the sample may be obtained from a subject using various sample collection devices.
  • sampling device is used to encompass the means, tools, etc. necessary for taking a sample and maintaining the sample taken.
  • a sampling device includes a container capable of receiving a sample.
  • the sampling device includes a transport medium.
  • the transport medium refers to a transport medium for preservation capable of maintaining sample integrity, eg cell integrity of viruses or bacteria.
  • the transport medium may be based on a saline solution such as phosphate buffered saline (PBS) or normal saline, or may be based on a balanced salt solution such as Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • HBSS Hank's Balanced Salt Solution
  • the transport medium is not an inactivating transport medium. That is, the transport medium does not contain a material for inactivating an organism, such as a virus, that is, a material for lysis.
  • a material for lysis refers to a component used to lyse a sample (ie, cells) in a chemical cell lysis method, and may include, for example, a chaotropic substance. Examples of such chaotropic substances include, but are not limited to, guanidinium or guanidine or similar chemicals.
  • transport medium examples include, but are not limited to, commercially available Copan universal transport medium (UTM), viral transport medium (VTM) or Clinical Virus Transport Medium (CTM) from Noble Biosciences, Inc. don't
  • the transport medium may be a liquid medium.
  • the sampling device may additionally include a sampling swap tool.
  • a sample collected from the subject is installed in a sample preparation device in an automated molecular diagnosis system.
  • the "automated molecular diagnosis system” includes a sample preparation device, a reaction vessel transfer device, and a sample analysis device.
  • automated molecular diagnosis system refers to a system including a plurality of devices in which the process of preparing and analyzing a sample for molecular diagnosis, particularly isothermal amplification (eg, LAMP), can be performed automatically without operator intervention.
  • isothermal amplification eg, LAMP
  • the automated molecular diagnosis system is a fully automated system that cannot perform sample preparation, sample analysis, etc. individually as is well known in the art.
  • Examples of commercially available fully automated systems include the Cobas 6800/Cobas 8800 from Roche, the Panther/Panther Fusion from Hologic, the Alinity from Abbott, and the QIAsymphony from Qiagen.
  • the automated molecular diagnostics system of the present disclosure is an all in one system.
  • an automated molecular diagnosis system is described based on an integrated system, but those skilled in the art will recognize that the above-described fully automated system may be applied in addition to the integrated system.
  • sample preparation device and sample analysis device can be applied to the all-in-one system with license as a stand-alone device.
  • some housings may be changed, and partial approval may be obtained.
  • the sample preparation device and the sample analysis device are stand-alone devices, and approved reagents can be used as they are.
  • the integrated system includes one or more passthrough cavities and a reaction vessel transfer device for operatively connecting the sample preparation device and the sample analysis device, respectively, to be operated. includes
  • sample preparation device refers to a device used to prepare an assay sample that contains or is purported to contain an analyte.
  • sample preparation device is a stand-alone device operated individually.
  • the sample preparation device includes a direct lysis buffer mounted therein and an isothermal amplification reagent for detecting a target nucleic acid.
  • the sample preparation device processes the sample into an optimal state for application to the analysis device, and automatically performs this using a microrobot.
  • the sample preparation process in the present disclosure includes nucleic acid extraction from a sample (eg, specimen), preparation of an isothermal amplification reagent, and combination of the extracted nucleic acid with the isothermal amplification reagent.
  • the sample preparation device includes a housing, and the sample preparation device can be located within a separate hexahedron shaped enclosure.
  • the sample preparation device may provide a reaction vessel therein to a sample analysis device.
  • the sample preparation device may present the reaction vessel therein to the sample analysis device through one or more openings formed in the housing.
  • the sample preparation device can form one or more openings in the housing to provide a reaction vessel therein to the sample analysis device.
  • the closed structure has one or more openings for providing a reaction vessel of the sample preparation device to the sample analysis device. It can be.
  • the sample preparation device includes a nucleic acid extraction module.
  • the nucleic acid extraction module mixes an aliquot of the sample (eg, the sample containing transport medium) directly with an aliquot of the lysis buffer (eg, the buffer loaded in the sample preparation device), and the mixture A process of incubating may be performed.
  • sample eg, the sample containing transport medium
  • lysis buffer eg, the buffer loaded in the sample preparation device
  • sample preparation device may perform a process of mixing the incubated mixture with an aliquot of an isothermal amplification reagent.
  • the sample preparation process in the sample preparation device is implemented through a control device (not shown) for controlling the sample preparation device, and the operation of each sample preparation process is performed by the control device controlling each component.
  • the control device may be configured to be embedded in the sample preparation device, and may be provided as a separate device and connected to the sample preparation device through a network.
  • the control device is of software control type.
  • the control method of the sample preparation device may be controlled by software.
  • Methods implemented as software or algorithms may be stored on a computer-readable recording medium as computer-readable codes or program instructions executable on a processor.
  • a computer-readable recording medium may be distributed among computer systems connected through a network, and computer-readable codes may be stored and executed in a distributed manner.
  • the medium may be readable by a computer, stored in a memory, and executed by a processor.
  • the sample preparation device is an automated liquid handling device.
  • An automated liquid handling device can automatically and programmatically aspirate and/or dispense a desired amount of reagent, sample, or other liquid from a designated container for automation of a chemical or biochemical laboratory.
  • Various configurations of automated liquid handling devices are known to those skilled in the art.
  • All components of the sample preparation device are designed as an integrated device and are located within the system housing.
  • products such as Hamilton's "Microlab VANTAGE”, “Microlab STAR”, “Microlab NIMBUS” or “Microlab Prep” may be used as the sample preparation device (https://www.hamiltoncompany.com/automated- see liquid-handling/platforms).
  • sample analysis device refers to a device used to subject a sample to isothermal amplification, particularly LAMP.
  • sample analysis includes detecting the presence of a target nucleic acid in a sample.
  • a sample analysis device may refer to a device that amplifies a target nucleic acid having a nucleotide sequence of interest and detects the amplified nucleic acid.
  • a sample analysis device may include a nucleic acid amplification device and a nucleic acid detection device.
  • the nucleic acid detection device may include an optical device including a light source and an optical detector.
  • the sample analysis device may include a temperature control device capable of isothermally maintaining the temperature of the sample.
  • the sample analysis device may be an isothermal amplification device (eg, a LAMP device) or a commercially available real-time PCR device, such as a thermal cycler.
  • the sample analysis device may be set to maintain a predetermined temperature, that is, to achieve an isothermal condition.
  • target nucleic acids can be amplified by conventionally known isothermal amplification methods (eg, LAMP methods) and modifications thereof.
  • the nucleic acid detection device included in the sample analysis device of the present invention is a device for detecting target nucleic acids in a sample amplified by the nucleic acid amplification device.
  • the nucleic acid detection device includes an optical module that detects emission light emitted from a fluorescent material in the presence of a target nucleic acid.
  • the optical module is an optics mechanism that analyzes (or monitors) an amplification reaction performed in a nucleic acid amplification device in real time.
  • the optical module may include a plurality of components such as a light source, an optical filter, a convex lens, a beam splitter, and an optical detector, and detects fluorescence generated from a nucleic acid amplification reaction in the optical module in real time. can do.
  • the sample analysis device is a real-time detection device.
  • the sample analysis device is a real-time nucleic acid detection device.
  • the sample analysis device is a real-time isothermal amplification device.
  • the sample analysis device is a real-time PCR device.
  • the sample analysis device is a LAMP device, particularly a real-time LAMP device.
  • the sample analysis device herein is a stand-alone device operated individually.
  • the sample analysis device includes a housing, and the sample analysis device can be located within a separate hexahedron shaped enclosure.
  • a sample analysis device may receive a reaction vessel containing a sample from a sample preparation device.
  • the sample analysis device does not directly receive the reaction vessel from the sample preparation device, but may receive the reaction vessel transferred from the reaction vessel transfer device.
  • the term “enclosure” is a housing-type structure formed of one or more enclosed spaces that can be environmentally/spatially separated from the outside.
  • the closed structure may be in the shape of a hexahedron.
  • the closed structure may be formed in a shape in which a plurality of hexahedrons are connected. At this time, the interior may be connected to one space or separated into a plurality of spaces.
  • the reaction vessel transfer module may be located inside the closed structure.
  • the reaction vessel transfer module may be located outside the closed structure.
  • the reaction vessel transfer module may be located inside the closed structure.
  • An automated container sealer may be located in the closure structure.
  • an environment control means may be included therein to implement an environment in which each device operates as a stand-alone device.
  • the environmental control means is for controlling the temperature, humidity, contamination, etc. inside the closed structure, and may include a heating device, a cooling device, a humidity control device, a fan, a filter, and the like.
  • the term “passthrough cavity” is a configuration for connecting an environmentally/spatially separated sample preparation device and sample analysis device.
  • the opening is a passage through which a reaction vessel prepared with the sample preparation device is moved to the sample analysis device or the sample analysis device in the closed structure so as to spatially connect the sample preparation device and the sample analysis device positioned adjacent to each other.
  • the opening may consist of a first passthrough cavity formed in the sample preparation device and a second passthrough cavity included in the closure structure.
  • the first opening and/or the second opening may include a door device capable of blocking the spatially connected state with each other.
  • the opening/closing device may be included in the first opening or may be included in the second opening. Alternatively, it may be included in both the first opening and the second opening.
  • the opening may be operated to open when the reaction container prepared in the sample preparation device is moved to the sample analyzing device or to the sample analyzing device within the closed structure, and to be closed after the movement is completed.
  • the first opening is formed at the bottom of the sample preparation device, and preferably may be formed on the deck of the sample preparation device.
  • a first opening formed in the deck of the sample preparation device may be positioned below to provide a reaction vessel with a sample analysis device or a sample analysis device positioned within an enclosure.
  • the second opening may be formed on a top surface, a side surface, or a bottom surface of the closure structure so that the reaction container moved from the first opening of the sample preparation device may enter.
  • the closed structure may include a reaction vessel transfer device for transferring the reaction vessel from the first opening through the second opening.
  • reaction vessel transport device can move a reaction vessel used in an integrated system from a sample preparation device to a sample analysis device or a sample analysis device in a closed structure, and can be transported and mounted on each component in a closed structure. It is a device that has
  • the reaction vessel transfer device for moving the reaction vessel from the sample preparation device to the sample analysis device may include at least one robot module.
  • the robot module includes a lift module.
  • the elevating module is a robot module for moving the reaction container up and down, and can move the reaction container of the sample preparation device into the closed structure.
  • the robot module includes a crane module.
  • the crane module can transport the reaction vessel moved into the closed structure within the closed structure and mount it to the component.
  • the robotics module includes robot arms.
  • the robot arm may move the reaction container to a desired position through one or more joint movements.
  • the robot module may operate in up/down, forward/backward, and left/right directions, but in one embodiment, the lift module operates in up/down and left/right directions, and the crane module operates in up/down, forward/backward and left/right directions. It can be operated in left/right directions and rotated.
  • the term “vessel” refers to a space containing substances used in a sample preparation device and a sample analysis device. Substances generally include solutions.
  • a space accommodating substances used in the sample preparation device and the sample analysis device may be used as a "container” or a “carrier”. No special distinction is made between “vessel”, “container” and “carrier”. However, it may be selectively used depending on the device used, the shape, or the internally contained material.
  • reaction vessel refers to a vessel containing a sample (a sample mixed with isothermal amplification reagents) for amplification of a target nucleic acid.
  • a reaction vessel herein means a 96-well plate, which is used in a sample preparation device and a sample analysis device.
  • a 96-well plate herein can process 96 samples (including controls) in one reaction, i.e. simultaneously.
  • FIG. 1 is a front view illustrating an integrated system according to an embodiment
  • FIG. 2 is a right side view illustrating an integrated system according to an embodiment. 1 and 2
  • an all in one system (1000) includes a sample preparation device (1100) and an enclosure (1300).
  • the sample preparation device 1100 can be configured to be located on top of the closing structure 1300. In another implementation, the sample preparation device 1100 can be configured to be positioned on the side of the closure structure 1300. In another embodiment, the sample preparation device 1100 can be configured to be located on the back side of the closure structure 1300. In another embodiment, the sample preparation device 1100 can be configured to be located in front of the closure structure 1300 . In another embodiment, the sample preparation device 1100 can be configured to be located inside the enclosure structure 1300. In another embodiment, the sample preparation device 1100 may be configured to be positioned below the closing structure 1300.
  • the closed structure 1300 is a closed space in the shape of a hexahedron.
  • the closed structure 1300 may accommodate at least one of a sample preparation device 1100, a sample analysis device 1200, and a reaction vessel transfer device 1400.
  • the enclosure structure 1300 can house one or more sample analysis devices 1200 and reaction vessel transfer device 1400. In other implementations, the enclosure structure 1300 can house one or more sample analysis devices 1200. In another embodiment, the enclosure structure 1300 can house the reaction vessel transfer device 1400. In another embodiment, the enclosure structure 1300 can house the sample preparation device 1100 and the reaction vessel transfer device 1400. In another implementation, the closure structure 1300 can house the sample preparation device 1100.
  • Closing structure 1300 can provide an operative connection between one or more devices housed therein and devices located externally.
  • the closure structure 1300 closes a single space.
  • the closing structure 1300 is closed into a single space, at least one of the sample preparation device 1100, the sample analysis device 1200, and the reaction vessel transfer device 1400 is one can be located in the space of
  • the closure structure 1300 closes a plurality of spaces.
  • the closing structure 1300 is closed with a plurality of spaces, at least one of the sample preparation device 1100, the sample analysis device 1200, and the reaction vessel transfer device 1400 is It may be located in any one of a plurality of spaces, or located in any two or more spaces among a plurality of spaces.
  • the sample analysis device 1200 and the reaction vessel transfer device 1400 may be located in the same space.
  • the sample analysis device 1200 and the reaction vessel transfer device 1400 may be located in different spaces.
  • the sample analysis device 1200 and the reaction vessel transfer device 1400 may be located inside the closed structure 1300 .
  • the sample preparation device 1100 is located outside the closed structure 1300 .
  • the closing structure 1300 is a second defined passage through which the reaction vessel transfer device 1400 for transferring the reaction vessel 1500 to be provided to the sample analysis device 1200 from the sample preparation device 1100 is moved.
  • a second passthrough cavity 1310 is formed.
  • the second opening 1310 of the closing structure 1300 is a confirmation passage through which the reaction vessel 1500 is transported, and the reaction vessel transfer device 1400 is connected from the first opening 1130 of the sample preparation device 1100.
  • the reaction container 1500 may be provided to the sample analysis device 1200 through the second opening 1310 of the closing structure 1300 .
  • the location of the second opening 1310 of the closing structure 1300 may be located on any one of the outer surfaces of the closing structure 1300 . As shown in FIG. 6 , when the closing structure 1300 has a hexahedral shape, the second opening 1310 may be formed on an upper surface of the closing structure 1300, but is not limited thereto.
  • the reaction vessel transfer device 1400 moves the reaction vessel 1500 through a path formed between the first passthrough cavity 1130 of the sample preparation device 1100 and the second passthrough cavity 1310 of the closing structure 1300. can be programmed to transfer
  • each opening be located at a distance within a range in which the reaction container transfer device 1400 can move the reaction container 1500 .
  • the closed structure 1300 may be implemented in a shape such as a hexahedron-shaped cabinet, a locker, or a box/case.
  • the closed structure 1300 has front/rear/left/right/upper/lower surfaces closed, and at least one closed structure door 1320 is provided.
  • the closed structure door 1320 is installed in the front/rear, left/right, etc. so that the user can access devices and components located inside.
  • the closed structure 1300 is not sealed, and an air vent 1370 may be formed.
  • At least one of the sample preparation device 1100 , the sample analysis device 1200 , and/or the reaction container transfer device 1400 may be located in the closing structure 1300 .
  • an automated container sealer 1700 for sealing the upper surface inlet of the reaction container 1500 may be located in the closed structure 1300 .
  • a liquid waste collection bin 1330 for recovering various solutions used for preparing an analysis sample in the sample preparation device 1100 may be located in the closed structure 1300 .
  • reaction vessel retrieval container 1360 for recovering the reaction vessel 1500 for which analysis in the sample analysis device 1200 is completed may be located in the closed structure 1300 .
  • reaction vessel recovery bin may be located inside the enclosure structure 1300. In other implementations, the reaction vessel recovery bin may be located outside of the enclosure 1300.
  • reaction vessel recovery box located outside the reaction vessel 1500 is transported from the inside to the outside through a retrieval passthrough cavity 1340 connecting the inside and outside of the closed structure 1300. can be recovered
  • a conveyor 1350 may be installed in the recovery opening 1340 connecting the inside and outside of the closed structure 1300 to be interconnected.
  • the reaction vessel transfer device 1400 puts the reaction vessel 1500 down on the inner conveyor 1350 of the closed structure 1300, the reaction vessel 1500 is moved by the conveyor 1350, and the It can be accommodated in an externally located reaction vessel recovery bin.
  • the conveyor 1350 forms an inclined surface at a lower position on the outside than on the inside.
  • the conveyor 1350 may discharge the reaction container 1500 to the outside of the closed structure 1300 by having a roller on an inclined surface.
  • the reaction vessel 1500 discharged to the outside may be accommodated in a reaction vessel recovery box.
  • conveyor 1350 may be powered. Power can discharge the reaction container 1500 placed on the conveyor 1350 to the outside of the closed structure 1300 by rotating a belt included in the conveyor 1350 .
  • the reaction vessel 1500 discharged to the outside may be accommodated in a reaction vessel recovery box.
  • reaction vessels 1500 accommodated therein may be emptied by a user.
  • the recovery opening 1340 in which the inside and outside of the closing structure 1300 are connected by the conveyor 1350 may include an opening/closing module (not shown).
  • the opening/closing module may be opened when the reaction container 1500 is moved to the reaction container collection box, and is preferably closed in other cases.
  • the opening and closing module may protect the inside of the closed structure 1300 from external contamination.
  • the closing structure 1300 is not completely sealed and is implemented to allow ventilation.
  • the closed structure 1300 includes an environment control unit, and the environment control unit may include a ventilation hole, an exhaust port, a fan, a temperature control unit, a humidity control unit, an air filter, and the like.
  • an air vent (1370) or an exhaust vent (1370) for air circulation in the closed structure 1300, and/or a fan (1380) for discharging air therein ) indicates that one or more are formed.
  • FIG. 3 is an exemplary diagram illustrating operational connections of an integrated system according to one embodiment. As shown in FIG. 3 , the sample preparation device 1100 is located on top of the closing structure 1300 .
  • the sample preparation device 1100 may be installed and operated alone for the preparation of an analysis sample, and according to an embodiment, may be operatively connected to the closed structure 1300 to be used as an integrated system 1000.
  • the sample preparation device 1100 when the sample preparation device 1100 is combined with the closing structure 1300 and used as an integrated system 1000, the sample preparation device 1100 is a lifting module provided in the closing structure 1300 ( A first opening 1130 may be formed so that the 1410 may move inside (see FIG. 5 ).
  • the first opening 1130 is an empty space and is a defined passage through which the reaction container 1500 is moved by the lifting module 1410 .
  • the sample preparation device 1100 When the lifting module 1410 is moved into the sample preparation device 1100, the sample preparation device 1100 includes a reaction vessel 1500 accommodating the analysis sample or a plate accommodating the reaction vessel 1500 ( A plate (not shown) is mounted on the lifting module 1410. The lifting module 1410 moves the mounted reaction vessel 1500 or plate into the closed structure 1300.
  • the sample preparation device 1100 when the sample preparation device 1100 is positioned above the closing structure 1300, the sample preparation device 1100 and the closing structure 1300 are coupled through a coupling mechanism (not shown). It can be.
  • the sample preparation device ( 1100) and the sample analysis device 1200 use the power module used as a stand-alone device as it is.
  • the stand-alone sample preparation device 1100 and the stand-alone sample analysis device 1200 are already commercialized devices and/or previously licensed devices.
  • sample analysis devices 1200-a and 1200-b are positioned below the closing structure 1300.
  • the closing structure 1300 will be described with reference to FIG. 8 as follows.
  • FIG. 8 is an internal perspective view illustrating a closed structure of an integrated system according to an embodiment.
  • the closed structure 1300 includes a reaction vessel transfer device 1400 for providing the reaction vessel 1500 prepared in the sample preparation device 1100 to the sample analysis devices 1200-a and 1200-b. do.
  • the reaction container transfer device 1400 is a robot module, and is particularly composed of a lift module 1410 and a crane module 1430.
  • the reaction vessel transfer device 1400 includes a lifting module 1410 and a crane module 1430.
  • reaction vessel transfer device 1400 includes a lift module 1410.
  • reaction vessel transfer device 1400 includes a crane module 1430.
  • reaction vessel transfer device 1400 includes a robot arm (not shown).
  • reaction vessel transfer device 1400 may include a mechanical device capable of transferring the reaction vessel 1500.
  • the elevating module 1410 and the crane module 1430 may be located inside the closed structure 1300 .
  • the elevating module 1410 and the crane module 1430 included in the closed structure 1300 are robot modules.
  • the robot module moves the reaction vessel 1500 under the control of a control module (not shown) included in the integrated system 1000 .
  • An automated container sealer 1700 for sealing the inlet of the reaction container 1500 may be located in the closed structure 1300 .
  • At least one sample analysis device for analyzing the analysis sample accommodated in the reaction vessel 1500 may be located in the closed structure 1300 .
  • a liquid waste collection bin 1330 for recovering various solutions used for preparing an analysis sample in the sample preparation device 1100 may be located in the closed structure 1300 .
  • a reaction vessel retrieval container (1360) may be located in the closed structure 1300 to recover the reaction vessel 1500 for which analysis has been completed in the sample analysis devices 1200-a and 1200-b. .
  • the enclosure 1300 includes a control module (not shown) that transmits and/or receives data from a plurality of devices operatively coupled to the integrated system 1000 .
  • control module is operatively connected to at least one of the sample preparation device 1100, the sample analysis device 1200, the reaction vessel transfer device 1400, and/or the automatic vessel sealer 1700.
  • a communication channel may be connected for this purpose.
  • the communication channels may be connected wirelessly and/or wired.
  • control module may receive a signal in which preparation of the analysis sample is completed from the sample preparation device 1100 through a communication channel.
  • a control signal for moving the reaction container 1500 of the sample preparation device 1100 to the sample analysis device 1200 may be provided to the reaction container transfer device 1400 through a communication channel.
  • control module may receive a signal in which the analysis of the analysis sample is completed by the sample analysis device 1200 through a communication channel.
  • control module may provide a control signal for moving the reaction container 1500 of the sample analysis device 1200 to the reaction container collection box to the reaction container transfer device 1400 through a communication channel.
  • the closing structure 1300 has a second passthrough cavity 1310 formed on its upper surface through which the lifting module 1410, which moves to the sample preparation device 1100 to receive the reaction vessel 1500, passes.
  • the second opening 1310 may be described as follows with reference to FIGS. 6 and 7 .
  • 6 is a perspective view illustrating a closed structure according to an embodiment.
  • 7 is an exemplary diagram illustrating an operating state of a second opening of a closing structure according to an exemplary embodiment. As shown in FIGS. 6 and 7 , the second opening 1310 is formed on the upper surface of the closing structure 1300 .
  • the second opening 1310 is formed to a size through which a vertical motion guide 1413 and an analytical sample vessel rack 1416 included in the lifting module 1410 can pass.
  • the second opening 1310 is formed to be vertically connected to the first opening 1130 formed in the deck 1110 of the sample preparation device 1100.
  • the second opening 1310 is formed on the right side of the upper surface of the closing structure 1300, and the first opening 1130 is formed on the right side in the plane of the deck 1110.
  • the second opening 1310 may be formed on the left side of the upper surface of the closing structure 1300, and the first opening 1130 may be formed on the left side in the plane of the deck 1110 .
  • the second opening 1310 may be formed on the upper side of the upper surface of the closing structure 1300, and the first opening 1130 may be formed on the upper side in the plane of the deck 1110 there is.
  • the second opening 1310 may be formed on the lower side of the upper surface of the closing structure 1300, and the first opening 1130 may be formed on the lower side in the plane of the deck 1110 there is.
  • the second opening 1310 is a passage through which a part of the elevating module 1410 positioned inside the closing structure 1300 moves into the sample preparation device 1100 (see FIG. 6 ).
  • the second opening 1310 is an open passage through which a portion of the elevating module 1410 inside the closing structure 1300 moves into the sample preparation device 1100, and a portion of the elevating module 1410 When does not move to the sample preparation device 1100, the open second opening 1310 may be closed through an open/close module 1311 provided in the second opening 1310 (see FIG. 7). .
  • the opening/closing module 1311 is provided to block contaminants outside the closing structure 1300 .
  • the opening/closing module 1311 is implemented in a hinge manner and can be opened and closed upward or downward of the upper surface of the closing structure 1300 .
  • the opening/closing module 1311 may be implemented in a sliding manner, and may be opened and closed in a moving manner on the upper surface of the closing structure 1300 .
  • the opening/closing module 1311 may be any type capable of opening and closing the second opening 1310 in a manner other than a hinge type or a sliding type.
  • the lifting module 1410 may be described as follows with reference to FIGS. 9 and 10 .
  • 9 is a perspective view illustrating a reaction vessel transfer device according to an embodiment
  • FIG. 10 is a perspective view illustrating an elevation module of the reaction vessel transfer device according to an embodiment.
  • the elevating module 1410 is a component capable of receiving the reaction container 1500 in the sample preparation device 1100 .
  • the elevation module 1410 represents an operating form of an elevator capable of ascending to the sample preparation device 1100 at the top of the closed structure 1300 in order to receive an analysis sample from the sample preparation device 1100.
  • the elevating module 1410 includes a vertical fixed guide 1411 in the form of a column fixed inside the closed structure 1300 .
  • the vertical fixed guide 1411 includes a fixed guide connector 1412 that moves up/down.
  • the elevating module 1410 includes a vertical motion guide 1413 coupled to the fixed guide connector 1412 of the vertical fixed guide 1411 .
  • the vertical motion guide 1413 includes a motion guide connector 1414 that moves up and down.
  • the vertical motion guide 1413 includes a rack guide 1415 coupled to the motion guide connector 1414 .
  • the elevating module 1410 includes a reaction vessel rack (analytical sample vessel rack, 1416) that receives the reaction vessel at the top of the rack guide 1415.
  • a reaction vessel rack analytical sample vessel rack, 1416
  • the lifting module 1410 includes an actuator 1417 that provides power to move the vertical motion guide 1413 in up/down directions.
  • the vertical fixing guide 1411 is coupled to and fixed to at least one of the upper, lower, and/or side surfaces of the closed structure 1300 .
  • the vertical fixed guide 1411 is coupled with the fixed guide connector 1412.
  • the vertical fixed guide 1414 may move the coupled fixed guide connector 1412 in an up/down direction.
  • the vertical fixing guide 1411 may use power provided from the driving device 1417 to move the fixing guide connector 1412 in up/down directions.
  • the size of the vertical fixing guide 1411 is equal to or smaller than the inner height of the closing structure 1300 . As the vertical fixing guide 1411 moves the fixing guide connector 1412 upward, the vertical motion guide 1413 coupled to the fixing guide connector 1412 passes through the second opening 1310 to form the sample preparation device 1100. can be moved to
  • the fixed guide connector 1412 coupled to the vertical fixed guide 1411 couples the vertical motion guide 1413 .
  • the fixed guide connector 1412 moves the vertical motion guide 1413 according to the up/down movement provided by the vertical fixed guide 1411 .
  • the vertical motion guide 1413 may move in up/down directions according to the driving of the vertical fixing guide 1411 .
  • vertical motion guide 1413 is coupled with motion guide connector 1414 .
  • the vertical motion guide 1413 may move the combined motion guide connector 1414 in up/down directions.
  • the vertical motion guide 1413 may use power provided from the driving device 1417 to move the motion guide connector 1414 in up/down directions.
  • the vertical motion guide 1413 may be coupled in a fixed form without moving the motion guide connector 1414 .
  • the motion guide connector 1414 coupled to the vertical motion guide 1413 and receiving up/down movement may be combined with the rack guide 1415.
  • a rack guide 1415 is coupled to the top of the motion guide connector 1414, the vertical fixed guide 1411 moves the vertical motion guide 1413 upward, and the vertical motion guide 1413 moves the rack guide 1415 When moving upward, the rack guide 1415 is moved into the sample preparation device 1100.
  • the motion guide connector 1414 can be coupled with the rack guide 1415.
  • the rack guide 1415 moves inside the sample preparation device 1100 by the movement of the vertical motion guide 1413 and the motion guide connector 1414. can be moved to
  • the vertical motion guide 1413 uses power provided from a driving device 1417 or a separate driving device (not shown) to move the rack guide 1415 in up/down directions.
  • the rack guide 1415 is coupled to the motion guide connector 1414, and a reaction vessel rack 1416 capable of holding the reaction vessel 1500 may be positioned thereon.
  • the reaction vessel rack 1416 is a space in which the reaction vessel 1500 containing the analysis sample is located in the sample preparation device 1100 .
  • the reaction vessel rack 1416 may be used as other expressions of a cradle, such as a pedestal, a cradle, a holder, and the like.
  • the reaction vessel rack 1416 may be moved into the sample preparation device 1100 by movement of the operation guide connector 1414 together with the rack guide 1415 and receive the reaction vessel 1500 .
  • the rack guide 1415 performs horizontal extension movement of the reaction vessel rack 1416 connected thereto.
  • the vertical fixing guide 1411 of the lifting module 1410 moves the fixing guide connector 1412 in up/down directions using power provided from a driving device 1417 .
  • a part of the fixed guide connector 1412 is coupled to the vertical fixed guide 1411, and the other part is coupled to the vertical motion guide 1413.
  • the vertical motion guide 1413 may move into the sample preparation device 1100 according to the upward movement of the coupled fixed guide connector 1412 .
  • the vertical motion guide 1413 may move the motion guide connector 1414 coupled to the other side in up/down directions.
  • the motion guide connector 1414 moving upward by the operation of the vertical motion guide 1413 may move the rack guide 1415 connected thereto into the sample preparation device 1100 .
  • the rack guide 1415 When the rack guide 1415 is moved into the sample preparation device 1100, the rack guide 1415 may horizontally extend and move the upper reaction container rack 1416 a predetermined distance.
  • the transfer module (not shown) provided in the sample preparation device 1100 picks up and moves the prepared reaction vessel 1500 and puts it down on the top of the horizontally extended and moved reaction vessel rack 1416, thereby moving the reaction vessel 1500 is moved to the closing structure 1300.
  • the rack guide 1415 horizontally moves the horizontally extended reaction vessel rack 1416 back to its original position.
  • reaction container 1500 When the reaction container 1500 is ready to be moved to the closed structure 1300, the fixed guide connector 1412 and/or the motion guide connector ( 1414) to the bottom. The reaction vessel 1500 is moved inside the closed structure 1300 .
  • the reaction vessel rack 1416 includes a coupling guide (not shown) corresponding to the reaction vessel 1500 mounted thereon.
  • the coupling guide prevents the reaction vessel 1500 from being separated from the reaction vessel rack 1416 during movement.
  • the driving device 1417 may provide power for horizontal movement of the reaction vessel rack 1416.
  • the rack guide 1415 may receive power from another driving device to horizontally move the reaction vessel rack 1416.
  • the driving device 1417 may provide power to move the lifting module 1410 within the closing structure 1300 .
  • One or more driving devices 1417 may be provided and may be located in one or more locations.
  • drive unit 1417 may use a hydraulic motor. In other implementations, drive unit 1417 may use an electric motor. In another embodiment, the driving device 1417 may use a combination of a hydraulic motor and an electric motor. In another embodiment, the driving device 1417 may use a device capable of generating power other than a hydraulic motor and an electric motor. In another implementation, drive device 1417 may use a hydraulic motor, an electric motor, and a device capable of generating power.
  • One or more drive devices 1417 are provided and may provide power to at least one of the elevating module 1410, the crane module 1430, and/or the reaction container rack 1416 within the closed structure 1300. .
  • the crane module 1430 performs an operation for moving the reaction container 1500 received by the lifting module 1410 from the sample preparation device 1100 to each component of the closing structure 1300.
  • the crane module 1430 includes a horizontal fixed guide, a horizontal motion guide, a gripper lift, a gripper rotation module, and a gripper at the top in the closed structure 1300, and each guide and gripper rotation module ), the gripper can move and rotate in the directions of the X, Y, and Z axes.
  • the crane module 1430 includes a horizontal fixed guide, a fixed guide connector, a horizontal motion guide, and a gripper lift at the top of the closed structure 1300. ), a gripper motion guide, and a gripper, and the gripper can move in the X, Y, and Z axes by each guide and gripper lift.
  • the horizontal fixed guide is combined with the horizontal motion guide by a fixed guide connector.
  • the horizontal fixed guide may be provided in the form of one or more movable rails.
  • the horizontal motion guide is coupled through a rail-type horizontal fixed guide and a fixed guide connector and moves in the X-axis direction.
  • the horizontal fixed guide is provided in the form of two rails to stably move the horizontal motion guide, and the horizontal motion guide can be connected to the two rails and moved in the X-axis direction.
  • One of the two rails of the horizontal fixed guide may move the combined horizontal motion guide in the X-axis direction.
  • the driving device 1417 may provide power for the horizontal fixed guide to move the horizontal motion guide.
  • power for the horizontal fixed guide to move the horizontal motion guide may be provided by a separately provided driving device (not shown).
  • the horizontal motion guide is combined with the gripper lift.
  • the horizontal motion guide is provided in the form of a rail.
  • the gripper lift is coupled to a rail-type horizontal motion guide and moves in the Y-axis direction.
  • a horizontal motion guide providing rail-type movement can move the combined gripper lift in the Y-axis direction.
  • power for the horizontal motion guide to move the gripper lift may be provided by a driving device.
  • power for the horizontal motion guide to move the gripper lift may be provided by a separately provided driving device (not shown).
  • the gripper lift is coupled to the gripper by being connected to a gripper motion guide.
  • the gripper moving guide is coupled to the gripper lift moving in the up/down direction and moves in the Z-axis direction.
  • the gripper list may move the combined gripper in the Z-axis direction.
  • the gripper lift is a combination of two modules.
  • One is a fixed module that is coupled to the horizontal motion guide and moves in the Y axis.
  • the other is a movement module that is coupled to the gripper movement guide and moves the gripper in up/down directions.
  • the gripper movement guide is coupled with a gripper, and the gripper is moved in the Z-axis direction by the movement provided in the up/down directions of the gripper lift.
  • the gripper may be moved to the position of the reaction container 1500 by the operation of the gripper lift and pick up the reaction container 1500 .
  • the gripper may sense the pressure of holding the reaction container 1500 using a pressure sensor or the like to hold the container so that the reaction container 1500 is not damaged.
  • the gripper can rotate the lifted reaction vessel 1500.
  • the gripper movement guide coupled to the gripper lift is coupled with the gripper and the gripper rotation module.
  • the gripper rotation module may rotate and move the gripper.
  • the gripper rotation module consists of a rotation motor.
  • the gripper rotation module can rotate the gripper through a rotation angle of 90 degrees. In other implementations, the gripper rotation module can rotate the gripper through any angle of rotation.
  • One or more driving devices used in the elevating module 1410 and/or the crane module 1430 may be operated using various driving forces.
  • At least one or more of the driving devices may use a hydraulic motor. In other implementations, at least some of the drives may use electric motors. In another embodiment, at least one or more of the driving devices may be used in combination with a hydraulic motor and an electric motor. In another embodiment, at least one or more of the driving devices may use a device capable of generating power other than a hydraulic motor and an electric motor. In another embodiment, at least one of the drive devices may use a hydraulic motor, an electric motor, and a device capable of generating power.
  • the crane module 1430 may move the gripper to an upper position of the reaction vessel rack 1416 of the elevating module 1410 to move the reaction vessel 1500 .
  • the crane module 1430 may pick up the reaction vessel 1500 after lowering the gripper located on the upper portion of the reaction vessel rack 1416 .
  • the operation of the crane module 1430 to move the gripper to the top of the reaction container rack 1416 is moved according to pre-stored position coordinates.
  • the integrated system 1000 stores all positions where the crane module 1430 can move within the closed structure 1300 as coordinate information.
  • the crane module 1430 may move according to coordinate information of a location to be moved.
  • the operation of the crane module 1430 moving the gripper to the top of the reaction vessel rack 1416 is moved by pre-stored position coordinates, and additionally, a position sensor module provided in the closed structure 1300 (not shown) ) to make it stop at the correct position.
  • the position sensor module allows the gripper to stop at a predetermined position by transmitting and receiving signals between the gripper and the reaction container rack 1416 based on an optical signal.
  • the position sensor module includes a reaction vessel rack 1416, an automatic vessel sealer 1700, a sample analysis device 1200-a, 1200-b, a reaction vessel collection box or a conveyor, which are components for which the gripper moves the reaction vessel 1500 1350, etc. may be provided.
  • the lift module 1410 and the crane module 1430 receive power for moving the reaction vessel 1500.
  • the elevating module 1410 receives power from a vertical fixed guide 1411 , a vertical motion guide 1413 and/or a rack guide 1415 .
  • the crane module 1430 is powered by a horizontal fixed guide, a horizontal motion guide, a gripper lift and/or a gripper.
  • Each component receiving power from the lift module 1410 and the crane module 1430 may perform an operation through the following driving method.
  • the elevating module 1410 and/or the crane module 1430 may move the reaction vessel 1500 by providing a belt-type movement. In another embodiment, the elevating module 1410 and/or the crane module 1430 may move the reaction vessel 1500 by providing a chain type of movement. In another embodiment, the lift module 1410 and/or the crane module 1430 may move the reaction vessel 1500 by providing a screw type or jackscrew type of movement. . In another embodiment, the elevating module 1410 and/or the crane module 1430 may move the reaction vessel 1500 by providing a cylinder type of motion. In another embodiment, the elevating module 1410 and/or the crane module 1430 may move the reaction vessel 1500 by providing a hoist type of motion. In another embodiment, the elevating module 1410 and/or the crane module 1430 may move the reaction vessel 1500 through a driving method other than the method described above.
  • the crane module 1430 may move the reaction vessel 1500 picked up from the reaction vessel rack 1416 to be mounted on the automatic vessel sealer 1700.
  • the automatic container sealer 1700 is a device for automatically sealing the upper surface of the reaction container 1500.
  • the automated container sealer 1700 may seal the inlet of the reaction container 1500 containing the analysis sample, and may be implemented as follows.
  • the reaction vessel 1500 is a multi-well plate, and assay samples are accommodated in each multi-well plate having a plurality of closed wells.
  • the automatic container sealer 1700 may seal the upper surface of the reaction container 1500, which is a multi-well plate, to prevent mixing of analysis samples and contamination from the outside.
  • reaction vessel 1500 is a tubular vessel inserted into each well of a multi-well plate.
  • a plurality of connected or individually separated tubes may be inserted into each well of the multi-well plate.
  • the automatic vessel sealer 1700 may seal the upper surface of one or more reaction vessels 1500 inserted into each well of a multi-well plate to prevent mixing of analysis samples and contamination from the outside.
  • the automatic container sealer 1700 may heat-bond the inlet of the reaction container 1500 using a transparent film. Alternatively, adhesion by an adhesive may be performed.
  • the automatic container sealer 1700 may use Hamilton's Plate Sealer product (see https://www.hamiltoncompany.com/automated-liquid-handling/small-devices/hamilton-plate-sealer).
  • the automatic container sealer 1700 can be positioned in a variety of locations within the closure structure 1300.
  • the automatic container sealer 1700 can be positioned between the first sample analysis device 1220-a and the second sample analysis device 1220-b.
  • the reaction container 1500 is horizontally rotated by 90 degrees so that the automatic container sealer ( 1700).
  • Horizontal rotation of the reaction vessel 1500 by 90 degrees may be performed by the gripper rotation module.
  • the crane module 1430 horizontally rotates the reaction vessel 1500 by 90 degrees using a gripper rotation module to mount the reaction vessel 1500 on the automatic container sealer 1700.
  • the automatic container sealer 1700 can be implemented to be positioned elsewhere inside the closure structure 1300.
  • the automatic container sealer 1700 can be implemented to be located in the sample preparation device 1100.
  • the crane module 1430 may move the reaction container 1500 sealed by the automatic container sealer 1700 to be mounted on one of the plurality of sample analysis devices 1220-a and 1220-b.
  • the sample analysis devices 1220-a and 1220-b are devices for automatically analyzing one or more analysis samples accommodated in the reaction vessel 1500.
  • the sample analysis device 1200 is a stand-alone device. That is, the sample analysis device 1200 may be installed and operated independently for analysis of the analysis sample.
  • the sample analysis device 1200 is a device for automatically analyzing one or more analysis samples accommodated in the reaction vessel 1500 .
  • the sample analysis device 1200 may be operatively connected with the sample preparation device 1100 and/or the enclosure structure 1300 to form an integrated system 1100 .
  • the sample analysis device 1200 may include a nucleic acid amplifier for amplifying nucleic acid and/or an optical module for detecting the amplified nucleic acid.
  • the sample analysis device 1200 includes a nucleic acid amplifier and an optical module.
  • sample analysis device 1200 includes a nucleic acid amplifier. In another implementation, the sample analysis device 1200 includes an optical module.
  • a single sample analysis device 1200 can be operatively coupled and applied to the integrated system 1000. In other implementations, a plurality of sample analysis devices 1200 can be operatively coupled to form an integrated system 1000 .
  • the sample analysis device 1200 may be equipped with a reaction container 1500 accommodating the analysis sample prepared in the sample preparation device 1100 .
  • the sample analysis device 1200 may be equipped with a reaction vessel 1500 whose upper surface is sealed by an automatic vessel sealer 1700.
  • the reaction container 1500 may be moved from the sample preparation device 1100 to the automatic container sealer 1700, and after sealing of the upper surface is completed, it may be mounted on the sample analysis device 1200.
  • the sample analyzer 1200 includes a sample holder in which the reaction vessel 1500 is accommodated.
  • the sample analysis device 1200 may include a cover for protecting the sample holder and the reaction vessel 1500 accommodated in the sample holder. In one embodiment, the sample analysis device 1200 is uncovered prior to receiving the reaction vessel 1500. In another embodiment, the sample analysis device 1200 is closed after the reaction vessel 1500 is received.
  • the cover When the sample analysis device 1200 is operated as a stand-alone device, the cover may be opened or closed by a user's command input.
  • the cover of the sample analysis device 1200 may be opened or closed by the control module of the integrated system 1000.
  • the reaction container 1500 may be provided in the form of a multi-well plate for amplification including a plurality of analysis samples to be analyzed in each of a plurality of wells.
  • the sample holder can accommodate one multi-well plate for amplification.
  • a well plate includes n ⁇ m wells (n and m are natural numbers greater than or equal to 2).
  • a well plate in the present disclosure may include 8 X 12 96 wells.
  • the reaction vessel may be equipped with one or more independent reaction vessels.
  • the sample holder can accommodate one or more of each reaction vessel.
  • the reaction vessel may be provided in the form of a strip tube in which two or more sample vessels are connected.
  • the sample holder may accommodate one or more reaction vessels in the form of a strip tube.
  • At least one sample analysis device 1200 receiving the sealed reaction vessel 1500 in the automatic vessel sealer 1700 may be provided in the closing structure 1300 . That is, referring to FIG. 4 , two sample analysis devices 1200-a and 1200-b may be provided inside the closed structure 1300.
  • the sample preparation device 1100 sequentially prepares analysis samples for analysis.
  • any one sample analysis device in the closed structure 1300 moves the first reaction vessel to perform analysis of the first reaction vessel.
  • the sample preparation device 1100 simultaneously or sequentially prepares an analysis sample for analysis.
  • each reaction vessel 1500 is sequentially moved to the closed structure 1300, and the first reaction vessel is one of the sample analysis devices.
  • the second reaction vessel is mounted on another sample analyzer 1200-b.
  • FIG. 5 is a perspective view illustrating a stand-alone sample preparation device according to an embodiment.
  • the sample preparation device 1100 is a stand-alone device. That is, the sample preparation device 1100 may be installed and operated alone to prepare an analysis sample.
  • the sample preparation device 1100 can be operatively connected with the sample analysis device 1200 and/or the enclosure structure 1300 to form an integrated system 1000.
  • the sample preparation device 1100 may include a nucleic acid extraction module and/or a liquid handling module that extracts nucleic acids from an analyte.
  • the sample preparation device 1100 includes a nucleic acid extraction module and a liquid dispensing module.
  • the sample preparation device 1100 includes a nucleic acid extraction module.
  • the sample preparation device 1100 includes a liquid dispensing module.
  • nucleic acid extraction module and/or the liquid dispensing module included in the stand-alone sample preparation device 1100 may be operatively connected to the integrated system 1000 without modification.
  • the sample preparation device 1100 may use a previously used tube-type reagent vessel.
  • the first opening 1130 formed in the sample preparation device 1100 is connected to the reaction vessel 1500 by the reaction vessel transfer device 1400.
  • the reaction vessel transfer device 1400 can be used as a defined passage through which it is transported.
  • the first opening 1130 is formed on the bottom surface of the sample preparation device 1100, but depending on the type of the sample preparation device 1100, the first opening 1130 may have a side surface (front/back). / including left / right), or may be pre-formed on the upper surface.
  • the sample preparation device 1100 when used as an all-in-one system 1000, the sample preparation device 1100 is a first confirmation passage through which the reaction vessel can be transported by the reaction vessel transfer device 1400. An opening 1130 may be formed.
  • the first opening of the sample preparation device 1100 may be formed on any one of a top surface, a bottom surface, or a side surface (including front/back/left/right).
  • the first opening 1130 is formed to a size that allows the reaction vessel 1500 and the reaction vessel transfer device 1400 to transfer the reaction vessel.
  • the sample preparation device 1100 sequentially prepares samples for analysis one by one and analyzes them in the sample analysis device 1200. After this is completed, the prepared assay sample can be provided.
  • the sample preparation device 1100 sequentially prepares each analysis sample to be provided to each sample analysis device, , the prepared analysis sample is provided to one of the sample analysis devices. Thereafter, the next analysis sample prepared by the sample preparation device may be provided to another sample analysis device.
  • the sample preparation device 1100 assigns each analysis sample to be provided to each sample analysis device to the sample analysis device. Prepare the same number or less. Thereafter, the prepared plurality of analysis samples may be provided to corresponding sample analysis devices.
  • the sample preparation device 1100 includes a deck 1110 capable of holding various types of instruments and containers for preparing an analysis sample.
  • the deck 1110 is formed in a form in which components included in the sample preparation device 1100 can be mounted and fixed.
  • the deck 1110 provides a guide, and the guide is inserted into the sample preparation device 1100 in a sliding manner so that the components of the sample preparation device 1100 are positioned on top of the deck 1110 do.
  • the guide is one implementation of the deck 1110 and may be provided in the form of other implementations.
  • one or more components located on the deck 1110 may be fixed during operation of the sample preparation device 1100 by protrusions and/or grooves formed on the bottom of each component.
  • the sample preparation device 1100 may include a planar loading tray 1120 extending from the deck 1110 .
  • the loading tray 1120 is installed to extend with the deck 1110 so that components mounted on the sample preparation device 1100 can be easily moved into the sample preparation device 1100 .
  • the loading tray 1120 is formed with a guide extending or connected to the guide of the deck 1110. Components mounted on the sample preparation device 1100 can be easily moved and mounted by the guide of the deck 1110 and the guide of the loading tray 1120 .
  • the sample preparation device 1100 includes a pipette module (not shown) including pipette arms for dispensing liquid and one or more pipetting channels connected to the pipette arms. are provided
  • the pipette module is configured on the upper side inside the sample preparation device 1100 .
  • a transport module (not shown) for transporting various containers used for sample preparation, including reaction containers, in the sample preparation device 1100 is configured on one side of the sample preparation device 1100. .
  • the transfer module is configured on the top side inside the sample preparation device 1100 together with the pipette module.
  • the transfer module is implemented by a pipetting channel of the pipette module and a gripper (not shown) coupled to the pipetting channel.
  • Each component located on the deck 1110 of the sample preparation device 1100 is arranged in a predetermined position for preparing an analysis sample.
  • the deck 1110 is formed with a first opening 1130 .
  • the first opening 1130 is a space in which the reaction container transfer device 1400 for receiving the reaction container 1500 prepared in the sample preparation device 1100 is moved.
  • the first opening 1300 is formed in such a size that the reaction container transfer device 1400 can receive and move the reaction container 1500 .
  • each component located on deck 1110 can be described as follows.
  • the components described below are generally included in the sample preparation device 1100 and used to prepare an analysis sample, but depending on the type of stand-alone device operated individually, one or more components may not be included. . Or it can be used as a separate device.
  • the sample preparation device 1100 includes a nucleic acid extraction module for extracting nucleic acid from a specimen and various components for amplification reaction setup (eg, PCR setup).
  • a nucleic acid extraction module for extracting nucleic acid from a specimen
  • various components for amplification reaction setup eg, PCR setup.
  • the inside of the sample preparation device 1100 includes a pipette tip adapter, a container carrier, a nucleic acid extraction module, and a multi-well plate adapter. ), a scanner, a waste liquid inlet, a transfer module, a pipette module, and the like.
  • a pipette tip adapter accommodates one or more pipette tips coupled to a pipetting channel.
  • the pipette tip may be coupled to the pipetting channel to aspirate and dispense a solution such as a sample or a reagent contained in the container.
  • One or more pipette tips accommodated in the pipette tip adapter may be provided in different sizes and dispensing amounts according to a preparation work environment such as a size of a container and a volume of a solution to be dispensed.
  • the pipette tip adapter of the sample preparation device is multiple to accommodate tips of various capacities, such as 1 ml, 500 ⁇ l, 300 ⁇ l, 250 ⁇ l, 200 ⁇ l, 150 ⁇ l, 100 ⁇ l and/or 50 ⁇ l.
  • tips of various capacities such as 1 ml, 500 ⁇ l, 300 ⁇ l, 250 ⁇ l, 200 ⁇ l, 150 ⁇ l, 100 ⁇ l and/or 50 ⁇ l.
  • any one or more of the tips having various capacities may be a piercing tip.
  • Each pipette tip adapter can accommodate one or more pipette tips, and the pipette module positions the pipetting channel on top of the pipette tip adapter and moves it toward the pipette tip so that the pipetting channel can engage the pipette tip. do.
  • the number of pipette tip adapters and the capacity and size of each pipette tip accommodated in the pipette tip adapter may be modified or changed according to various embodiments of the present disclosure.
  • the vessel carrier contains various vessels that contain various types of solutions used in the sample preparation device.
  • the sample preparation device may prepare an analysis sample including nucleic acids extracted using the nucleic acid extraction module.
  • Various types of containers are used for the operation of the sample preparation device, and containers other than the well plate may be inserted into the container carrier.
  • the container carrier may be provided in various forms so that each container can be easily inserted and fixed according to the capacity and/or size of the container to be inserted.
  • the container to be inserted includes a container for accommodating a sample, a container for accommodating an extraction reagent, and a container for accommodating a reaction reagent.
  • the container carrier can insert containers in a row or in parallel.
  • the multi-well plate adapter is a structure in which a reaction vessel accommodating a sample to be detected is positioned, and the reaction vessel may be mounted on a sample holder of a sample analysis device.
  • the multi-well plate adapter can load a reaction container (multi-well plate), and a sample for detection can be dispensed into the reaction container (multi-well plate) located in the multi-well plate adapter.
  • a sample for detection can be dispensed into the reaction container (multi-well plate) located in the multi-well plate adapter.
  • two or more multi-well plates used in the sample preparation device may be loaded.
  • the term "multi-well plate" may be used for a reaction vessel adapter.
  • any one of the plurality of multi-well plates provided in the multi-well plate adapter may be moved to a starting position and used for preparing an analysis sample.
  • the multi-well plate is moved to the starting position by the transfer module.
  • the vessel may contain an assay sample or extraction reagent or the like.
  • the vessel is equipped with a cap, and the cap may be a pierceable cap by a pipette tip.
  • the penetrating portion of the cap may be made of a material such as rubber, silicon, or plastic.
  • the pipette tip perforates the upper part of the cap by a downward movement, sucks or dispenses the solution, and then moves to the upper part again.
  • the vessel needs to be secured because the vessel can be lifted together upwards by the pipette tip inserted into the perforated portion of the cap.
  • the holding frame may secure the vessel using the pierceable cap so that the vessel is not moved by the pipette tip.
  • the first opening 1130 is a confirmation passage through which the reaction vessel transfer device 1400 is moved to the sample preparation device 1100 to receive the reaction vessel 1500 .
  • the first opening 1130 is an empty space.
  • the reaction vessel transfer module 1400 is moved from the bottom of the sample preparation device 1100 to the inside of the sample preparation device 1100 . Therefore, the first opening 1130, which is an empty space, is formed on the deck 1110, which is the lower surface of the sample preparation device 1100, or is preferably formed.
  • the first opening 1130 includes an open/close module (not shown).
  • the opening/closing module is provided to block the first opening 1130, an open space into which the reaction vessel transfer device 1400 enters.
  • the reaction vessel transfer device 1400 is moved to the sample preparation device 1100 to receive the reaction vessel prepared in the sample preparation device 1100 .
  • the sample preparation device 1100 may block the first opening 1130 by using an opening/closing module for closing the open space when the reaction vessel transfer device 1400 does not move.
  • the waste unit includes a waste liquid inlet and/or a waste pipette tip collecting unit.
  • the recovery solution inlet may be collected so that the solution used for preparing the analysis sample is discarded, and the pipette tip collection unit may be collected such that the pipette tip used for preparation of the analysis sample is discarded.
  • the recovery solution inlet is connected to a separately located liquid waste collection bin (not shown).
  • the waste solution of the sample preparation device 1100 is moved to be accommodated in the solution recovery box through the recovery solution inlet.
  • pipette tips collected through the pipette tip recovery unit may be moved to and stored in a waste container.
  • a waste container may be located on the deck 1110 of the sample preparation device 1100. In other implementations, a waste container may be located on the bottom of the sample preparation device 1100. In another implementation, the waste container can be located outside of the sample preparation device 1100.
  • the waste container When the waste container is located on the deck 1110, the waste container may be separated from an area where an analysis sample is prepared and a partition.
  • the transfer module is a mechanical device in the form of a gripper for moving a reaction vessel or the like within the sample preparation device 1100 .
  • the transfer module is operated by the control device of the sample preparation device 1100.
  • the transport module is located on the inside rear of the sample preparation device 1100.
  • the transfer module is configured to move the reaction vessel or the like up and down, left and right, back and forth, and rotationally.
  • the transport module is located on top of the inside of the sample preparation device 1100 .
  • the transfer module is configured to move the reaction container up and down, left and right, back and forth, and rotationally through an operation type such as a pipette module.
  • the transfer module is configured to move the reaction vessel up and down, left and right, back and forth, and rotationally using a gripper coupled to at least two pipetting channels of the pipette module.
  • the transfer module may move components necessary for preparing an analysis sample, such as a reaction vessel, a reagent vessel, an adapter, a cartridge, and a multi-well plate, within the sample preparation device 1100 .
  • the transfer module may move the reaction vessel in which the analysis sample is set up to the reaction vessel transfer device 1400 .
  • the reaction vessel transfer device 1400 is moved through the first opening 1130 of the sample preparation device 1100 to receive the prepared reaction vessel.
  • the transfer module moves the reaction vessel to the reaction vessel transfer device 1400, and the reaction vessel transfer device 1400 may move the reaction vessel to the outside of the sample preparation device 1100 through the first opening 1130.
  • the scanner may read an identifying code displayed on a sample, reagent, reaction solution, or the like.
  • the identification code is a mark containing information such as a barcode or matrix code.
  • the scanner may recognize the identification code and receive information such as the type and capacity of the solution contained in the container.
  • a plurality of scanners may be provided, and any one scanner may be configured as needed. Also, the scanner may be configured as a barcode scanner and/or a 2D scanner. This configuration is preferably provided to recognize different types of identification codes marked on the reaction container or the like.
  • the scanner can recognize 1D and/or 2D barcodes.
  • the scanner may obtain information such as the type and/or volume of the solution contained in the container by recognizing an identification code printed or attached to the side of the container.
  • the container includes a reaction container, a reagent container, a sample container, and the like used in the sample preparation device.
  • the scanner may recognize the identification code of the container inserted into the deck 1110.
  • the scanner may sequentially recognize at least one container identification code inserted into the deck 1110.
  • the scanner may move to a position where the container or the carrier accommodating the container is coupled to the deck 1110 and recognize the identification code on the side of the container.
  • the scanner is a 2D barcode scanner (not shown).
  • a matrix (two-dimensional) code can be recognized, and an identification code printed or attached to the bottom of the container can be recognized.
  • the container includes a container used in a sample preparation device such as a reaction container, a reagent container, and a specimen container.
  • the scanner can recognize an identification code printed or attached to the bottom surface of a container inserted into the plate.
  • the scanner can recognize the code of a plurality of containers inserted into the plate at once.
  • the plane on which the vessel is mounted in the scanner is made of a transparent material.
  • the scanner can recognize the identification code on the bottom of the container by using an optical signal passing through a transparent material.
  • the scanner may recognize the identification code of the container as the lower part of the container is photographed.
  • the scanner is a type in which a multi-well plate can be mounted so that an identification code located on a lower surface of a container inserted into the multi-well plate can be recognized.
  • a 2D scanner may use Hamilton's "easyCode Carrier” product (see https://www.hamiltoncompany.com/automated-liquid-handling/small-devices/easycode-carrier).
  • a pipette module which is a solution fractionator, includes a pipette arm and a pipetting channel, and the pipetting channel can move up and down, left and right, and forward and backward automatically by a control device.
  • a pipette arm may include one or more independently or dependently moving pipetting channels.
  • a pipette tip or a needle is coupled to an end of the pipetting channel to be used for aspirating and dispensing a solution.
  • a gripper may be coupled to an end of the pipetting channel, and a transfer capable of moving a container (including a reaction container) used in the sample preparation device 1100 such as a reaction container by the gripper. Can be used as a module.
  • the pipette arm moves one or more pipetting channels to the pipette tip for fractionation, fixes the pipette tip for fractionation to the pipetting channel, and moves the pipette tip with the pipetting channel fixed to a fixed position. It is possible to perform an act of inserting a pipette tip for fractionation into a container at a certain depth, and the like.
  • the pipette arm is located inside the upper portion of the sample preparation device 1100, and the pipetting channel is operated within the sample preparation device 1100 by the pipette arm.
  • One or more pipetting channels couple a pipette tip inserted into a pipette tip adapter to an end of the pipetting channel.
  • the pipette arm may be moved so that the pipetting channel is positioned above the container containing the solution to be dispensed.
  • the pipetting channel is positioned so that it descends in the direction of the container from the moved position to accommodate the solution in the pipette tip, and rises again.
  • the pipetting channel moves to the top of another container to be dispensed by the pipette arm, descends to dispense the solution accommodated in the pipette tip, and then ascends again to end the dispensing.
  • a plurality of pipetting channels may be simultaneously operated, and the number of containers capable of simultaneously dispensing may be determined according to the number of pipetting channels.
  • the pipette tip coupled to the end of the pipette arm and the pipetting channel may be removed.
  • the combined pipette tips may be removed from the pipette tip collection unit located in the waste unit and disposed of in a waste container.
  • each device in order for at least one or more of the sample preparation device 1100, the sample analysis device 1200, and/or the reaction vessel transport device 1400 to be operatively connected to the closure structure 1300, each device must be positioned accurately.
  • the closing structure 1300 and each device include a positioning means.
  • the positioning means of each device is Preference is given to using pre-formed components in the device.
  • At least one of the sample preparation device 1100, the sample analysis device 1200, and/or the reaction vessel transfer device 1400 is spatially closed, and the closing structure 1300 is used as a configuration for spatially closing it. .
  • At least one or more of the sample preparation device 1100, the sample analysis device 1200, and/or the reaction vessel transfer device 1400 are configured to be located inside the closed structure 1300 to operatively connect at least one of them. do.
  • the sample analysis devices 1200-a and 1200-b may be located in the closed structure 1300. At this time, in the sample analysis devices 1200-a and 1200-b, the reaction vessel 1500 containing the analysis sample in the sample preparation device 1100 located outside the closed structure 1300 moves the reaction vessel transfer device 1400. can be moved through
  • the crane module 1430 of the reaction vessel transfer device 1400 provides the reaction vessel 1500 to the sample analysis devices 1200-a and 1200-b.
  • the crane module 1430 can move to a designated location as a robot module, lift the reaction vessel 1500, and set the reaction vessel 1500 down at a designated location.
  • the closing structure 1300 provides a positioning means.
  • the positioning means may be located in the sample analyzing device 1200 and the closing structure 1300 .
  • the first positioning unit of the sample analysis device 1200 may be a fixing unit located at the bottom.
  • the second position determining unit of the closing structure 1300 may be a structure formed at a place where the sample analyzing device 1200 is located.
  • the first positioning means and the second positioning means may be formed in a mutually coupled shape.
  • the sample analysis device 1200 may be fixed to the correct position of the closing structure 1300 even if the first positioning means and the second positioning means do not have separate fastening means.
  • the first positioning means and the second positioning means are provided with mutual fastening means (not shown) so that when the sample analyzing device 1200 is fixed to the correct position of the closing structure 1300, the fastening means It is possible to engage each of the positioning means.
  • the closing structure 1300 such as the reaction vessel transfer device 1400 and the automatic container sealer 1700 according to one embodiment It is preferable that a positioning means matching the closing structure is also formed in each device located inside the .
  • An integral system may locate at least one of a sample preparation device, a sample analysis device, and/or a reaction vessel transport device within a spatially closed enclosure.
  • the integrated system is configured to include the sample analysis device inside the enclosure structure and to position the sample preparation device on top of the enclosure structure.
  • the integrated system includes a control module.
  • the control module controls the sample preparation device to prepare an analysis sample.
  • a control module controls the closure structure to analyze the prepared assay sample.
  • a method of preparing and analyzing an analysis sample by controlling the sample preparation device and the enclosure structure by the control module of the integrated system is as follows.
  • the control module controls the sample preparation device to prepare an analysis sample in a reaction container provided in the sample preparation device.
  • solutions such as a sample, a nucleic acid extraction reagent, and an amplification reaction reagent are prepared so that an analysis sample can be prepared, and the analysis sample is prepared using internal components.
  • the sample preparation device includes preparing the analysis sample by dispensing at least one of a specimen and a reagent; accommodating the analysis sample into the reaction vessel; Alternatively, at least one of the processes of extracting nucleic acids from the sample expected to contain pathogens may be prepared.
  • the control module controls the elevating module in the closed structure to move the reaction container prepared in the sample preparation device to the closed structure.
  • the lifting module moves into the sample preparation device through the second opening formed in the closing structure and the first opening formed in the deck of the sample preparation device.
  • the sample preparation device mounts the reaction vessel on the moved lift module.
  • control module controls the elevation module to move to the closed structure.
  • the first opening is a defined passage through which the reaction vessel can be transported.
  • the closure structure may include a plurality of sample analysis devices for analyzing the analysis sample.
  • the control module controls the sample preparation device to simultaneously or sequentially prepare analysis samples to be analyzed using a plurality of sample analysis devices.
  • the control module controls the elevating module to move the elevating module to the closed structure, the reaction vessel accommodating the analysis sample prepared simultaneously or sequentially in the sample preparation device.
  • the control module controls the elevating module to extend in a horizontal direction so as to easily receive the reaction container.
  • the control module controls the crane module so that the reaction vessel moved to the closed structure is moved to a position where analysis is performed.
  • the crane module may perform a movement operation for moving the reaction vessel moved to the closed structure in up/down/left/right/backward directions.
  • the crane module may perform a rotational operation for horizontally rotating the reaction vessel.
  • the automatic container sealer is contained within a closure structure.
  • the control module controls the crane module to move the reaction container moved from the sample preparation device to the automatic container sealer.
  • An automatic vessel sealer can seal the top surface of the reaction vessel.
  • the control module controls the crane module so that the sealed reaction vessel in the automatic vessel sealer is moved to a position where analysis of the analysis sample is performed.
  • the location where the analysis is performed is the sample analysis device.
  • an automatic container sealer may be included within the sample preparation device.
  • control module moves the reaction container prepared in the sample preparation device to the automatic container sealer.
  • the control module controls the automatic container sealer to seal the upper surface of the moved reaction container.
  • the lifting module may receive the sealed reaction container.
  • control module when a plurality of sample analysis devices are provided and a plurality of reaction containers are sequentially received in the sample preparation device, the control module operates a crane module to move the sequentially moved analysis sample containers to the sample analysis device, respectively. Control.
  • a control module controls the closure structure such that an assay sample received in a reaction vessel within the closure structure is analyzed.
  • the reaction vessel may be moved to the sample analysis device by a crane module.
  • a sample analysis device analyzes the assay sample in the moved reaction vessel and generates a result.
  • the closing structure in which the control module controls the closing structure to perform the analysis of the analysis sample is a sample analysis device.
  • the sample analysis device may be used to perform isothermal amplification, in particular LAMP; Alternatively, at least one or more of the processes of performing analysis on the reaction result may be performed.
  • a sample analysis device is provided at the location where the analysis is performed.
  • the sample analysis device includes a thermal cycler and an optics module.
  • the process of performing the polymerase chain reaction in the sample analysis device uses a thermal cycler, and the process of measuring the reaction result uses an optical module.
  • the sample analysis device may include a cover for analysis of the analysis sample.
  • the control module may provide a control signal to the sample analysis device to open a cover of the sample analysis device to which the reaction container is to be moved. Then, when the crane module provides the reaction container to the sample analysis device, the control module may provide a control signal to close the cover of the sample analysis device.
  • the control module controls the crane module to remove the analysis-completed reaction vessel from the location where the analysis is performed.
  • control module controls the crane module so that the analysis-completed reaction vessel can be moved to the reaction vessel collection box.
  • the present invention provides a memory, at least one processor configured to access the memory, and one or more program codes stored in the memory and configured to be executed by the processor, when an automated molecular diagnosis system is executed by the processor, A sample preparation device, a sample analysis device, a reaction vessel transfer device, and a closing structure, each including an opening through which the sample preparation device and the closing structure are operatively connected, wherein a lifting module located in the closing structure
  • the system for moving the reaction vessel to the sample preparation device through the opening to move the reaction vessel to the sample analysis device causes a control module to cause the reaction vessel containing the analysis sample to move from the sample preparation device to the sample preparation device.
  • the sample preparation device and the sample analysis device are stand-alone devices; Controlling, by the control module, the reaction vessel transfer device so that the reaction vessel for which analysis of the analysis sample is completed is removed from the sample analysis device, wherein at least one of the sample analysis device and/or the reaction vessel transfer device is removed.
  • One device is located inside an enclosure that is spatially enclosed, and the sample preparation device and the enclosure form a defined passage through which the reaction container is transported, and the reaction container
  • the transfer device includes an instruction for performing transfer of the reaction vessel using the confirmation passage.
  • the present invention provides a non-transitory computer-readable storage medium storing instructions executed by one or more processors when executed by one or more processors, wherein the instructions are a sample preparation device, a sample analysis device, a reaction It includes a container transfer device and a closing structure, each including an opening through which the sample preparation device and the closing structure are operatively connected, wherein a lifting module located in the closing structure moves to the sample preparation device through the opening.
  • the control module of the automated molecular diagnosis system determines the reaction in which the analysis sample is received.
  • the sample preparation device and the sample analysis device are stand-alone devices; Controlling, by the control module, the reaction vessel transfer device so that the reaction vessel for which analysis of the analysis sample is completed is removed from the sample analysis device, wherein at least one of the sample analysis device and/or the reaction vessel transfer device is removed.
  • One device is located inside an enclosure that is spatially enclosed, and the sample preparation device and the enclosure form a defined passage through which the reaction container is transported, and the reaction container
  • the conveying device is configured to perform conveying of the reaction vessel using the definitive passage.
  • Step (b) of the present disclosure is a sample preparation device, (b-1) directly mixing the sample loaded in step (a) with a dissolution buffer, (b-2) mixing the mixture at 15 °C to 35 °C 3 After incubation for 5 minutes to 5 minutes to obtain a lysate, (b-3) the obtained lysate is mixed with an isothermal amplification reagent to complete sample preparation.
  • Step (b) is performed by the automated molecular diagnosis system described above in step (a). Therefore, descriptions of common contents between steps (a) and (b) are omitted in order to avoid excessive complexity of this specification.
  • the sample preparation device includes a liquid handling module for receiving a sample, a direct lysis buffer and an isothermal amplification reagent into a reaction vessel.
  • a sample is directly mixed with a lysis buffer, incubated for 3 to 5 minutes without a separate nucleic acid purification step, and an isothermal amplification reaction can be performed immediately, thereby extracting and purifying nucleic acids from the sample. It has the advantage of being rapid compared to conventional isothermal amplification reactions that require steps.
  • Samples are directly mixed with lysis buffer.
  • direct lysis buffer refers to a composition that acts or has an activity so that nucleic acids can be directly extracted from various samples containing nucleic acids. Specifically, when a sample extracted from a subject comes into contact with the direct lysis buffer, tissues of organisms present in the sample, such as cells of animals or plants, yeast, bacteria, viruses, etc., are destroyed, thereby destroying the tissue contained therein A lysate in which the target nucleic acid is eluted may be generated.
  • One feature of the present invention is to obtain enough nucleic acid to perform a nucleic acid amplification reaction simply by using a lysis buffer directly without performing a complicated nucleic acid extraction and purification process from a sample.
  • nucleic acid extraction methods require lysis of organisms, binding of nucleic acids to substrates, washing of nucleic acids, purification of nucleic acids, and elution of nucleic acids.
  • the collected sample is incubated in a lysis buffer to expose nucleic acid by destroying cell walls and membranes, and then the exposed nucleic acid is bound to a specific structure such as a membrane or a bead.
  • pure nucleic acids are obtained by isolating nucleic acids from the constructs using step-by-step buffers.
  • nucleic acid extraction methods require devices, reagents, and tools for each step, and a lot of time and money are consumed as each process is performed while moving a sample.
  • modules for nucleic acid extraction and nucleic acid amplification are provided, respectively, and reagents and tools such as pipettes for nucleic acid extraction are additionally required.
  • direct lysis buffers used in methods according to the present disclosure allow direct extraction of nucleic acids from cells in a sample without the need to discard or exchange the transport medium for another buffer. Therefore, it is possible to save time and cost by allowing the sample to be directly put into the nucleic acid amplification step without going through a complicated nucleic acid purification process.
  • the direct dissolution buffer mixed with the sample in step (b-1) of the present disclosure may be a conventionally known buffer, which may be a commercially available buffer or a buffer prepared in-house.
  • the direct dissolution buffer may include a buffer component and a non-ionic surfactant.
  • buffer components include, but are not limited to, tris(hydroxymethyl)aminomethane (tris for short) and acid salts of tris(hydroxymethyl)aminomethane (eg, Tris-HCl).
  • nonionic surfactants examples include polyethylene glycol based nonionic surfactants such as polyethylene glycol octylphenyl ether (commercially available as Triton x-100). Additional examples of suitable nonionic surfactants include polysorbate surfactants such as polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (commercially available as polysorbate 20 or Tween® 20).
  • the direct dissolution buffer may be 30-500 mM Tris at pH 6.0-7.0, including 0.1-1.5% (v/v) of Triton X-100, specifically, 0.8-1.2% ( It may be 300-500 mM Tris at pH 6.5, including v/v) Triton X-100, and more specifically, 400 mM Tris at pH 6.5, including 1% (v/v) Triton X-100. It may be Tris, but is not limited thereto.
  • the direct lysis buffer is urea; Primary salts containing monovalent cations; secondary salts containing divalent cations; and a phosphate-based buffer
  • the primary salt may be any one selected from the group consisting of LiCl, NaCl, KCl, Kl, NaBr, NaNO 3 , KNO 3 and combinations thereof
  • the secondary salt is It may be any one selected from the group consisting of MgCl 2 , CaCl 2 , NiCl 2 , CaCO 3 , MgBr 2 , CaSO 4 , MgSO 4 and combinations thereof
  • the phosphate-based buffer is a phosphate buffer, PBS (phosphate buffered saline), It may be any one selected from the group consisting of DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline), NaH 2 PO 4 , Na 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , K 2 HPO 4 , K 3 PO 4 , and combinations thereof.
  • step (b-1) the sample loaded in step (a) (including transport medium) and the direct dissolution buffer are 2 ⁇ l to 1,000 ⁇ l, 2 ⁇ l to 900 ⁇ l, 2 ⁇ l to 900 ⁇ l, respectively.
  • the amount of sample is 50 ⁇ l and the amount of direct lysis buffer is 50 ⁇ l.
  • the mixing of the sample and the direct dissolution buffer in step (b-1) is performed in a vessel separate from the reaction vessel in step (b-3) described below.
  • the vessel used in the step (b-1) may be the same type as or a different type from the reaction vessel in the step (b-3).
  • the container used in the step (b-1) is the same as or different from the reaction container in the step (b-3) means that the container used in the step (b-1) is It means having the same or different number and arrangement of wells compared to the reaction vessel.
  • the container used in the step (b-1) may be provided in the form of a well plate having a plurality of wells capable of accommodating a plurality of samples to be analyzed and a direct dissolution buffer.
  • the well plate includes n ⁇ m wells (n and m are natural numbers of 2 or greater).
  • the well plate may have a rectangular shape in which n X m wells are arranged in rows and columns. For example, 4 X 4 16 wells are shown.
  • Well plates are 2 x 2 4 wells, 3 x 3 9 wells, 4 x 4 16 wells, 5 x 5 25 wells, 6 x 6 36 wells, 7 x 7 49 wells, or 8 x 8 wells. 64 wells and the like.
  • the well plate may be 2 X 4 8 wells, 3 X 6 18 wells, 4 X 8 32 wells, 5 X 10 50 wells, 6 X 12 72 wells, 7 X 14 98 wells, or 8 X 10 wells. 16 of 128 wells, etc.
  • the well plate is 2 X 6 wells of 12 wells, 3 X 9 wells of 27 wells, 4 X 12 wells of 48 wells, 5 X 15 wells of 75 wells, 6 X 18 wells of 108 wells, 7 X 21 wells of 147 wells, or 8 X 24 of 192 wells, etc.
  • the well plate may be 2 X 8 16 wells, 3 X 12 36 wells, 4 X 16 64 wells, 5 X 20 100 wells, 6 X 24 144 wells, 7 X 28 196 wells, or 8 X 28 wells. 32 of 256 wells, etc.
  • the well plate may include 96 wells of 8 X 12, 192 wells of 12 X 16, or 384 wells of 16 X 24.
  • the vessel used in step (b-1) may be a plate having the same or more wells compared to the vessel used in step (b-3).
  • the vessel used in step (b-3) is a 96-well plate
  • the vessel used in step (b-1) may be a 96-well plate, a 192-well plate or a 384-well plate.
  • step (b-1) is performed by a liquid dispensing module having 8 to 96 pipetting channels.
  • step (b-2) of the present disclosure the mixture is incubated at 15° C. to 35° C. for 3 minutes to 5 minutes to obtain a lysate.
  • the incubation temperature of the mixture may be adjusted according to test results such as yield of lysate obtained by those skilled in the art, and may be selected from 15 ° C to 35 ° C, any one selected from 15 ° C to 25 ° C, 15 ° C to 35 ° C. It may be any one temperature selected from 20 ° C, any one selected from 20 ° C to 30 ° C, or any one selected from 25 ° C to 30 ° C, or specifically room temperature.
  • the incubation time of the mixture may be adjusted according to test results such as yield of lysate obtained by those skilled in the art, and may be any one time selected from 3 to 5 minutes, or specifically 5 minutes.
  • step (b-2) the sample is directly brought into contact with the lysis buffer to destroy organisms, such as pathogens, contained in the sample, thereby generating a lysate in which the target nucleic acid is eluted.
  • step (b-2) may be performed after completing step (b-1) described above.
  • the mixture can be incubated in step (b-2).
  • the incubation in step (b-2) may be performed during the process of step (b-1) described above and/or during the process of step (b-3) described below. This is especially true when there are multiple samples and the number of pipetting channels is less than the number of samples, so that the entire sample cannot be directly mixed with the lysis buffer at one time. For example, among the n samples, there is an interval of time from when the first sample is directly mixed with the dissolution buffer until the second through nth samples are directly mixed with the dissolution buffer.
  • step (b-3) After the nth sample is directly mixed with the lysis buffer, there is a time interval until the lysate of the 1st to n-1th samples is mixed with the isothermal amplification reagent in the next step, step (b-3). If this time interval corresponds to 3 to 5 minutes required by step (b-2) of the present disclosure, each sample is considered to have been incubated during the interval and may not be subjected to separate incubation.
  • incubation of the first sample may be performed for the time required to mix the remaining 2 to n samples and the direct lysis buffer, and the nth sample and the direct lysis buffer After mixing, incubation of the n-th sample may be performed for a time required for mixing the lysates of the 1st to n-1th samples and the isothermal amplification reagent in the next step, step (b-3).
  • step (b-3) of the present disclosure sample preparation is completed by mixing the lysate with an isothermal amplification reagent in a reaction vessel.
  • an isothermal amplification reaction is prepared by mixing the lysate obtained from the sample with an isothermal amplification reagent.
  • the method according to the present disclosure may be performed by various isothermal amplification methods.
  • rolling circle amplication RCA, M. M. Ali, F. Li, Z. Zhang, K. Zhang, D.-K. Kang, J. A. Ankrum, X. C. Le and W. Zhao, Chem. Soc. Rev., 2014, 43 , 3324-3341.
  • loop-mediated isothermal amplication LAMP, Y. Mori, H. Kanda and T. Notomi, J. Infect. Chemother., 2013, 19, 404-411
  • RPA recombinase polymerase amplication
  • the isothermal amplification reaction may be LAMP (Loop-mediated isothermal amplification).
  • LAMP is mainly described as an example of an isothermal amplification reaction, but those skilled in the art will recognize that various isothermal amplification reactions other than LAMP can be applied.
  • the isothermal amplification reaction may include a reverse transcription reaction step. Details thereof can be found in Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); and Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988).
  • Reverse transcription is a reaction in which cDNA is synthesized from RNA by a reverse transcription reaction using a reverse transcriptase.
  • reverse transcriptase also called RNA-dependent DNA polymerase, refers to an enzyme that synthesizes complementary DNA using RNA as a template.
  • the reverse transcriptase in the present disclosure may use reverse transcriptases originating from various sources, such as Avian Myeloblastosis Virus-derived Reverse Transcriptase (AMV RTase), murine leukemia virus-derived Reverse transcriptase (Murine Leukemia Virus-derived Reverse Transcriptase; MuLV RTase) and Rous-Associated Virus 2 Reverse Transcriptase (RAV-2 RTase) may be used, but are not limited thereto.
  • AMV RTase Avian Myeloblastosis Virus-derived Reverse Transcriptase
  • MuLV RTase murine leukemia virus-derived Reverse Transcriptase
  • RAV-2 RTase Rous-Associated Virus 2 Reverse Transcriptase
  • Reverse transcriptase requires a primer to synthesize cDNA from an RNA template.
  • primers There are three types of primers used in the reverse transcription reaction: (i) an oligo dT primer that anneals to the poly A tail of mRNA and synthesizes cDNA from the 3'-end, (ii) a random nucleotide of 6-9 nt in size. and (iii) a target specific primer that synthesizes only the target cDNA.
  • the isothermal amplification reagent for detecting the target nucleic acid may include a reagent for reverse transcription reaction.
  • the reagent for the reverse transcription reaction may include a reverse transcription polymerase and/or a reverse transcription primer.
  • the reverse transcription primer may be an oligo dT-primer, a random primer, or a target-specific primer.
  • the reverse transcription primer may be a target-specific primer.
  • the target-specific primers are used to synthesize cDNA in a reverse transcription reaction, and then form a primer pair or a primer set with another primer in a target nucleic acid sequence amplification reaction to be used as a primer pair for amplification of the obtained cDNA.
  • the reagent for the reverse transcription reaction may optionally include reagents necessary for carrying out the reverse transcription reaction, such as a buffer and deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs).
  • dNTPs deoxyribonucleotide triphosphates
  • Optimal amounts of reagents to be used in a particular reaction can be readily determined by one skilled in the art having the benefit of this disclosure.
  • Components of the reverse transcription reaction composition may be present in individual containers or a plurality of components may be present in one container.
  • the isothermal amplification reaction may be RT-LAMP (Loop-mediated isothermal amplification).
  • the isothermal amplification reagent may be a LAMP reagent, and according to a particular embodiment, may be an RT-LAMP reagent.
  • Loop-Mediated Isothermal Amplification is a nucleic acid amplification method capable of amplifying a target nucleic acid with high sensitivity and specificity under isothermal conditions (Notomi, T. et al. 2000. Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic Acids Res 28, E63).
  • the LAMP method uses a DNA polymerase having strand displacement activity and at least 4 to 6 primer sets specifically designed at various sites of a target nucleic acid.
  • primer refers to a single-stranded oligonucleotide used in an amplification reaction, and refers to a nucleic acid molecule that is extended by covalently adding a nucleotide to its 3' end in a nucleic acid amplification or synthesis reaction using a polymerase. .
  • the four primers are composed of two outer primers and two inner primers, and the outer primers are forward outer (F3) primers and backward outer primers.
  • outer, B3) consists of two primers and serves to unwind DNA double strands during the non-cyclic step of the reaction.
  • the inner primer consists of two types, a forward inner primer (FIP) and a backward inner primer (BIP), and nucleotides corresponding to the forward and reverse nucleotide sequences to form a loop essential for the LAMP reaction.
  • the additional two primers consist of a forward loop (LoopF) primer and two reverse loop (LoopB) primers, and attach to a nucleotide sequence to which the inner primer does not bind to accelerate the LAMP reaction.
  • Primer sets used for LAMP are designed for six distinct regions (F3, F2, F1, B1c, B2c and B3) on the target nucleic acid, and F3 and B3 are the two outer primers to determine the size of the amplified product FIP and BIP are two inner primers.
  • FIP is composed of F1c and F2 sequences
  • BIP is a hybrid primer composed of B1c and B2 sequences.
  • the LAMP reaction largely includes an initial construct production step and a cycling amplification step, and unlike PCR, it does not include a single-stranded denaturation step.
  • the F2 of FIP binds to the F2c region to initiate elongation.
  • BIP works in the same way.
  • the F3 primer binds to the F3c region to initiate DNA synthesis in a strand displacement manner, and is released as the DNA strand extended in FIP is replaced.
  • the single-strand released in this way forms a loop at its 5' end through F1/F1c binding, and the synthesis reaction proceeds in the same way for BIP and B3 primers, resulting in a dumbbell-shaped single-stranded nucleic acid molecule with loops formed at both ends. is formed
  • DNA synthesis starts from the 3' end of the F1 region, and a cycling step proceeds.
  • the accelerating primer, LB or LF primer binds to the single-stranded region of the above-described dumbbell structure and binds to a loop between B1 and B2 or a loop between F1 and F2.
  • the use of LB or LF primers increases the origin where DNA synthesis begins, resulting in an effect of speeding up the reaction rate.
  • six rings are usually formed in the process, and only two rings are used as origins for synthesis.
  • all six rings are used as origins for synthesis, and synthesis occurs for a predetermined period of time. The amount of DNA produced increases.
  • the RT-LAMP reagent for detecting the target nucleic acid may include 4 to 6 primer sets for amplifying the target nucleic acid.
  • the RT-LAMP reagent for detecting the target nucleic acid includes 6 primer sets, F3 primer, B3 primer, FIP primer, BIP primer, Loop F primer (LF), and Loop B (LB) for amplifying the target nucleic acid.
  • 6 primer sets F3 primer, B3 primer, FIP primer, BIP primer, Loop F primer (LF), and Loop B (LB) for amplifying the target nucleic acid.
  • the appropriate length of the primer may be determined by taking into consideration a number of factors, such as temperature, application field, source of the primer, and length of the final amplification product.
  • the length of the primer may be at least 10 nucleotides, at least 15 nucleotides for F3 and B3, at least 30 nucleotides for FIP and BIP, and at least 15 nucleotides for LF and LB, but is not limited thereto.
  • the primer set is prepared using commercially available primer design software, such as Primer Explorer V5 (Fujitsu, Japan), LAVA (LAMP Assay Versatile Analysis) and LAMP Designer (PREMIER), in consideration of the characteristics of the LAMP reaction and the characteristics of the primers. It can be designed using various design software such as Biosoft).
  • primer design software such as Primer Explorer V5 (Fujitsu, Japan), LAVA (LAMP Assay Versatile Analysis) and LAMP Designer (PREMIER), in consideration of the characteristics of the LAMP reaction and the characteristics of the primers. It can be designed using various design software such as Biosoft).
  • the RT-LAMP reagent may additionally include reverse transcriptase, DNA polymerase, dNTPs, buffer, and/or magnesium.
  • the DNA polymerase that may be included in the RT-LAMP reagent is a polymerase derived from a thermophilic microorganism, and may include, in particular, a polymerase lacking a 5'->3' exonuclease function.
  • a polymerase lacking a 5'->3' exonuclease function.
  • the DNA polymerase may be Bst DNA polymerase, but (i) has strand displacement activity, and (ii) maintains thermodynamic activity that allows the reaction product, the polymer, to form a ring structure. It is not limited to Bst DNA polymerase if it satisfies two main requirements that can cause a polymerization reaction at a temperature (eg, between 50 ° C and 75 ° C). In addition, for the RT-LAMP reaction, a GspSSD DNA polymerase having a faster amplification ability and a stronger reverse transcriptase activity than the Bst DNA polymerase mainly used in the existing LAMP reaction may be used, but is not limited thereto.
  • the RT-LAMP reagent may additionally include a nucleotide analog instead of dNTPs.
  • Nucleotide analogues are those that are modified or not found in nature and which can polymerize alone or together with natural nucleotides in the process of template-directed DNA synthesis.
  • buffers that may be included in the RT-LAMP reagent include, but are not limited to, sodium phosphate buffer, potassium phosphate buffer, Tris-HCl buffer, or Tricine buffer.
  • magnesium that may be included in the RT-LAMP reagent may be in the form of a salt such as magnesium acetate, magnesium chloride or magnesium sulfate.
  • the reaction vessel used in step (b-3) of the present disclosure may be provided in the form of a well plate having a plurality of wells capable of receiving the lysate and an isothermal amplification reagent (eg, RT-LAMP reagent).
  • the well plate includes n ⁇ m wells (n and m are natural numbers of 2 or greater).
  • the well plate may have a rectangular shape in which n X m wells are arranged in rows and columns. For example, 4 X 4 16 wells are shown.
  • Well plates are 2 x 2 4 wells, 3 x 3 9 wells, 4 x 4 16 wells, 5 x 5 25 wells, 6 x 6 36 wells, 7 x 7 49 wells, or 8 x 8 wells. 64 wells and the like.
  • the well plate may be 2 X 4 8 wells, 3 X 6 18 wells, 4 X 8 32 wells, 5 X 10 50 wells, 6 X 12 72 wells, 7 X 14 98 wells, or 8 X 10 wells. 16 of 128 wells, etc.
  • the well plate is 2 X 6 wells of 12 wells, 3 X 9 wells of 27 wells, 4 X 12 wells of 48 wells, 5 X 15 wells of 75 wells, 6 X 18 wells of 108 wells, 7 X 21 wells of 147 wells, or 8 X 24 of 192 wells, etc.
  • the well plate may be 2 X 8 16 wells, 3 X 12 36 wells, 4 X 16 64 wells, 5 X 20 100 wells, 6 X 24 144 wells, 7 X 28 196 wells, or 8 X 28 wells. 32 of 256 wells, etc.
  • the well plate may include 96 wells of 8 X 12, 192 wells of 12 X 16, or 384 wells of 16 X 24.
  • the reaction vessel is a 96-well plate.
  • step (b-3) is performed by a liquid dispensing module having 8 to 96 pipetting channels.
  • the liquid dispensing module comprises 8 pipetting channels.
  • the liquid dispensing module includes 96 pipetting channels.
  • the liquid dispensing module includes 8 pipetting channels and 96 pipetting channels.
  • the 8 pipetting channels that may be used herein are channels whose spacing can be adjusted, whereas the 96 pipetting channels are channels whose spacing is tailored to a 96-well plate and thus may be non-adjustable channels. These 96 pipetting channels may be referred to as pipetting channel heads.
  • the 96 pipetting channels may have channels arranged in an 8 ⁇ 12 array to simultaneously process all wells of an 8 ⁇ 12 96-well plate widely used in the art.
  • the method according to the present disclosure is a high-throughput isothermal amplification method capable of processing a plurality of samples (eg, 96 samples). This may be achieved by a liquid dispensing module comprising multi-pipetting channels (eg, 8 to 96 pipetting channels).
  • a liquid dispensing module comprising multi-pipetting channels (eg, 8 to 96 pipetting channels).
  • step (c) the reaction vessel containing the mixture prepared in step (b) is transferred to the sample analysis device with the aid of the aforementioned reaction vessel transfer device.
  • reaction vessel transfer device and the movement of the reaction vessel by it refer to the description in the above step (b).
  • a step of moving the reaction vessel to an automatic vessel sealer with the help of a reaction vessel transfer device and sealing an upper surface of the reaction vessel may be further included prior to the step (c).
  • the sealing of the upper surface to the reaction vessel may be performed by heat or adhesive.
  • the sealing may be performed by the automatic container sealer described above in step (a).
  • step (d) in the sample analysis device, (d-1) amplifying the target nucleic acid in the sample by reacting the mixture in the reaction vessel at a temperature selected from 50 to 75° C. for 10 to 20 minutes; (d-2) Detect the amplified product.
  • Step (d) described above is a process of performing (d-1) an isothermal amplification reaction and (d-2) detecting an amplification product from the isothermal amplification reaction.
  • the step (d) is a process of (d-1) performing a LAMP reaction and (d-2) detecting an amplification product from the LAMP reaction.
  • step (d) is performed in a sample analysis device, and a detailed description of the sample analysis device refers to the disclosure of step (a).
  • the temperature for the step (d-1) is a temperature suitable for DNA polymerase activity, which can be easily determined by a person skilled in the art in consideration of the enzyme used in the reaction and the target nucleic acid.
  • the temperature for step (d-1) is any temperature selected from 50 °C to 70 °C, any temperature selected from 50 °C to 65 °C, any temperature selected from 55 °C to 75 °C, 55 °C to 70 °C Any temperature selected from, any temperature selected from 55 ° C to 65 ° C, any temperature selected from 60 ° C to 75 ° C, any temperature selected from 60 ° C to 70 ° C, or any temperature selected from 60 ° C to 65 ° C.
  • the temperature for step (d-1) is 60°C, 61°C or 62°C, and in more specific embodiments is 62°C.
  • the time for step (d-1) of the present disclosure refers to a time sufficient for significant amplification of a target nucleic acid to be observed by an isothermal amplification reaction, such as a LAMP reaction, which is dependent on the sensitivity of the reaction, expected to be included in the sample It may be adjusted in consideration of the amount of the target nucleic acid to be used. As an example, the time for step (d-1) can be increased to increase sensitivity.
  • the time for step (d-1) is any time selected from 10 to 20 minutes, any time selected from 12 to 20 minutes, any time selected from 15 to 20 minutes or any selected from 12 to 18 minutes It's time. In certain embodiments, the time for step (d-1) is 15 minutes or 20 minutes, and in more specific embodiments is 20 minutes.
  • step (d-2) may detect the amplified product by a nucleic acid detection device.
  • step (d-2) may be performed in an end-point manner or may be performed in a real-time manner.
  • the step (d-2) may be performed at regular time intervals while performing the step (d-1), for example, the step (d-2) may be performed by performing the step (d-1). It may be performed every 30 seconds, 1 minute, 1 minute 30 seconds, 2 minutes, 3 minutes, 4 minutes or 5 minutes during the exercise.
  • the detection of the amplification product is fluorescence measurement using SYBR Green I, color change of an indicator such as phenol red, turbidity, precipitate formation, DNA laddering, capillary electrophoresis, DNA chip, gel electrophoresis, radioactivity measurement , or phosphorescence measurement, but is not limited thereto.
  • the amplified product can be detected by a color change of the mixture in the reaction vessel following DNA synthesis.
  • the RT-LAMP reagent may include an appropriate indicator.
  • hydroxy naphthol blue (HNB) may be used as a dye that changes color in response to magnesium ion concentration in the RT-LAMP reagent.
  • quantitative or qualitative analysis of the target nucleic acid can be performed by comparison with the amplified products of positive and/or negative control samples.
  • isothermal amplification is confirmed in real time without separate electrophoresis or SYBR Green I addition after reaction using a nucleic acid detection device capable of detecting fluorescent dyes in real time during the RT-LAMP reaction, and annealing It is also possible to check whether the target nucleic acid is amplified through the peak.
  • the amplified product can be detected by a direct or indirect method.
  • detectably labeled primers or probes
  • amplification of the target nucleic acid is detected through a signal emitted through the labeled primer after specific binding to the target nucleic acid, and real-time detection is possible.
  • a labeled probe capable of binding to the amplified target nucleic acid may be used.
  • Detectably labeled herein means a substance capable of emitting a detectable signal using any suitable method such as spectroscopic, optical, photochemical, biochemical, enzymatic, electrical and/or immunochemical methods. means the labeled substance.
  • Such materials may include, for example, fluorescent moieties, chemiluminescent moieties, bioluminescent moieties, magnetic particles, enzymes, substrates, radioactive and chromophore materials.
  • a label for detection may include a fluorescent label, a luminescent label, a chemiluminescent label, an electrochemical label, and a metal label.
  • the label may be used as a label itself, such as an intercalating dye.
  • a single label or an interactive dual label comprising a donor molecule and an acceptor molecule may be used in the form of binding to one or more oligonucleotides.
  • the single label may include a fluorescent label, a luminescent label, a chemiluminescent label, or an electrochemical label and a metal label.
  • the single label provides different signals (eg, different signal strengths) depending on whether it is present on the double strand or on the single strand.
  • the single label may be a fluorescent label.
  • the single label may be linked to an oligonucleotide by various methods.
  • the label is linked to the primer (or probe) through a spacer containing carbon atoms (eg, 3-carbon spacer, 6-carbon spacer or 12-carbon spacer).
  • Interactive labeling systems include signal generating systems in which energy is non-radioactively transferred between a donor molecule (reporter molecule) and an acceptor molecule (quencher molecule).
  • a fluorescence resonance energy transfer (FRET) labeling system includes a fluorescence reporter molecule (donor molecule) and a quencher molecule (acceptor molecule).
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the energy donor is fluorescent, but the energy acceptor can be either fluorescent or non-fluorescent.
  • the energy donor is non-fluorescent, such as a chromophore, and the energy acceptor is fluorescent.
  • the energy donor is luminescent, eg bioluminescent, chemiluminescent or electrochemiluminescent and the acceptor is fluorescent.
  • Interactive dual labels include pairs of labels that provide a detectable signal based on contact-mediated quenching (Salvatore et al., Nucleic Acids Research, 2002 (30) no.21 e122 and Johansson et al., J. AM. CHEM. SOC 2002 (124) pp 6950-6956).
  • the interactive label system includes all or any cases involving signal change due to interaction between at least two molecules (eg, dyes).
  • Reporter molecules and quencher molecules useful as single or dual labels can include any molecule known in the art. Examples include: Cy2 TM (506), YO-PRO TM -1 (509), YOYO TM -1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX TM (519), Alexa TM ( 520), Rhodamine 110 (520), Oregon Green TM 500 (522), Oregon Green TM 488 (524), RiboGreen TM (525), Rhodamine Green TM (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green TM (531) , Calcium Green TM (533), TO-PRO TM -1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 ( 568), BODIPY564/570 (570), Cy3 TM (570), Alexa TM 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange
  • the reporter molecule and quencher molecule may each be fluorescent.
  • the reporter molecule may be fluorescent while the quencher molecule may be non-fluorescent.
  • non-fluorescent dark quenchers capable of quenching fluorescence of a wide range of wavelengths or specific wavelengths may be used in the present disclosure.
  • the quencher molecule is fluorescent, a target nucleic acid sequence can be detected from a signal change of the fluorescent quencher molecule.
  • Reporter molecules and quencher molecules can be linked to oligonucleotides according to conventional methods.
  • the reporter molecule and the quencher molecule can be linked to the probe via a spacer comprising at least 3 carbon atoms (eg, a 3-carbon spacer, a 6-carbon spacer, a 9-carbon spacer, or a 12-carbon spacer).
  • techniques for detecting fluorescence specifically for a nucleic acid amplification sequence by a LAMP reaction may be used.
  • a two-stranded probe specifically designed for a nucleic acid amplification sequence an assimilation probe method (WO 2011/163425 A1) for real-time measurement using FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) principle can be used, and among the two-stranded probes A reporter molecule is attached to the 5' end of one strand, and a quencher molecule is attached to the 3' end of the other strand.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • the assimilation probe is designed as a probe in which a reporter molecule is attached to the 5' end of one of the loop primers among the six LAMP primers, and a part of the complementary sequence is designed to 3' end.
  • the remaining probes to which the quencher is attached are designed, and a total of 7 oligonucleotides (ie, 6 primers and the remaining probes to which the quencher is attached) are used.
  • a fluorescence detection method using a probe similar to an anabolic probe a method using a pair of probes by designing a fluorescent probe (fluorophore-labeled primer/probe) and a quencher probe (quencher-labeled probe) to have complementary sequences (WO 2013/065574 A1) and the like may be used, but are not limited thereto.
  • detection of the amplified product may be performed by measuring fluorescence.
  • the isothermal amplification reagent for detecting the target nucleic acid may include an oligonucleotide including a fluorescent molecule and an oligonucleotide including a quencher molecule.
  • the RT-LAMP reagent for detecting the target nucleic acid may include an oligonucleotide including a fluorescent molecule and an oligonucleotide including a quencher molecule.
  • one of the six LAMP primers included in the RT-LAMP reagent may be used as an oligonucleotide containing the fluorescent molecule or an oligonucleotide containing the quencher molecule, for example, FIP, BIP, LF or LB may be labeled with a fluorescent molecule or a quencher molecule and designed as an oligonucleotide containing the fluorescent molecule or an oligonucleotide containing the quencher molecule.
  • the isothermal amplification reagent for detecting a target nucleic acid may be an isothermal amplification reagent for detecting a plurality of target nucleic acids, for example, the plurality of target nucleic acids may be 2 to 5, specifically 2 to 4, More specifically, it may be three.
  • the isothermal amplification reagent for detecting a plurality of target nucleic acids refers to an isothermal amplification reagent capable of detecting a plurality of target nucleic acids in one reaction vessel.
  • the method of the present invention can process a large amount of samples in a short time by an automated molecular diagnosis system.
  • the method of the present invention can achieve high throughput with the aid of a liquid dispensing module comprising 8 to 96 pipetting channels and by using a large capacity vessel such as a 96-well plate as a reaction vessel.
  • a total of 18 to 60 minutes per 96 samples may be required.
  • the time required refers to the time from when the sample is loaded to the sample preparation device in the automated molecular diagnosis system until the detection of the amplification product is completed. That is, the time means the time required from step (b) to completion of step (d) of the method of the present invention.
  • the time required means the time required when the method of the present invention is applied to all 96 samples, and the required time can be shortened when the number of samples is less than 96.
  • step (b) to step (d) herein may be referred to as one round, and therefore, the time required refers to the time required per one round.
  • the method of the present invention may take a total of 18 to 60 minutes per round.
  • the total time required for the method of the present invention is the performance of the sample preparation device, the reaction vessel transfer device and the sample analysis device in the automated molecular diagnostic system, the performance of the liquid dispensing module in the sample preparation device, and the number of pipetting channels included in the liquid dispensing module. , depending on whether the direct lysis buffer has been pre-dispensed into the vessel, whether the isothermal amplification reagent has been pre-dispensed into the vessel, and the like.
  • the total required time of the method of the present invention may be reduced as the performance of the sample preparation device, the reaction vessel transfer device, and the sample analysis device in the automated molecular diagnostic system, or the performance of the liquid dispensing module in the sample preparation device is better, , can be reduced as the number of pipetting channels included in the liquid dispensing module increases, and when direct lysis buffer is pre-dispensed into the container (for example, when using a commercial product in which direct lysis buffer is dispensed into each well) ) can be reduced, and can be reduced if the isothermal amplification reagent is pre-dispensed into the vessel (eg, when using a commercial product with RT-LAMP reagent dispensed into each well).
  • the total duration of the method of the present invention is 18 to 60 minutes, 20 to 60 minutes, 25 to 60 minutes, 30 to 60 minutes, 35 to 60 minutes, 40 to 60 minutes, 45 to 60 minutes , 50 to 60 minutes, 55 to 60 minutes, 18 to 55 minutes, 18 to 50 minutes, 18 to 45 minutes, 18 to 40 minutes, 18 to 35 minutes, 18 to 30 minutes, 18 minutes to 25 minutes, 18 minutes to 20 minutes, 20 minutes to 55 minutes, 20 minutes to 50 minutes, 20 minutes to 45 minutes, 20 minutes to 40 minutes, 20 minutes to 35 minutes, 20 minutes to 30 minutes, 20 minutes to 25 minutes, 25 minutes to 55 minutes, 25 minutes to 50 minutes, 25 minutes to 45 minutes, 25 minutes to 40 minutes, 25 minutes to 35 minutes, 25 minutes to 30 minutes, 30 minutes to 55 minutes, 30 minutes to 50 minutes , 30 to 45 minutes, 30 to 40 minutes, 30 to 35 minutes, 35 to 50 minutes, 35 to 40 minutes, 40 minutes, 30 to 35 minutes, 35 to 50 minutes, 35 to 40 minutes, 40 to 55 minutes, 45 minutes to 50 minutes, or 50 to 55 minutes.
  • step (b) may take between 7 and 36 minutes per 96 samples. That is, step (b) per round of the method of the present invention takes 7 to 36 minutes.
  • the time refers to the time required to complete steps (b-1), (b-2) and (b-3).
  • the total time required for step (b) is the performance of the sample preparation device in the automated molecular diagnostics system, the performance of the liquid dispensing module in the sample preparation device, the number of pipetting channels included in the liquid dispensing module, and the direct dissolution buffer in the container in advance. It may vary from 7 minutes to 36 minutes depending on whether it is dispensed or not, whether the isothermal amplification reagent has been previously dispensed into the container, and the like.
  • the total time required for step (b) is 7 to 36 minutes, 10 to 36 minutes, 15 to 36 minutes, 20 to 36 minutes, 25 to 36 minutes, 30 to 36 minutes, 35 to 36 minutes minutes, 7 minutes to 35 minutes, 7 minutes to 30 minutes, 7 minutes to 25 minutes, 7 minutes to 20 minutes, 7 minutes to 15 minutes, 7 minutes to 10 minutes, 10 minutes to 35 minutes, 10 minutes to 30 minutes, 10 to 25 minutes, 10 to 20 minutes, 10 to 15 minutes, 15 to 35 minutes, 15 to 30 minutes, 15 to 25 minutes, 15 to 20 minutes, 20 to 35 minutes, or 25 minutes to 30 minutes.
  • step (b-1) may take 6 to 13 minutes per 96 samples. That is, step (b-1) per round of the method of the present invention takes 6 to 13 minutes.
  • the time means the time required to directly dispense the dissolution buffer into each well of the container and then dispense the sample into each well.
  • the total time required for step (b-1) is the performance of the sample preparation device in the automated molecular diagnostics system, the performance of the liquid dispensing module in the sample preparation device, the number of pipetting channels included in the liquid dispensing module, and the direct dissolution buffer in the container. It may vary in the range of 6 minutes to 13 minutes depending on whether it is pre-dispensed or not.
  • the total time required for step (b-1) was 6 to 13 minutes, 7 to 13 minutes, 8 to 13 minutes, 9 to 13 minutes, 10 to 13 minutes, 11 to 13 minutes, 12 minutes to 13 minutes, 6 to 12 minutes, 6 to 11 minutes, 6 to 10 minutes, 6 to 9 minutes, 6 to 8 minutes, 6 to 7 minutes, 7 to 12 minutes, 7 to 11 minutes minutes, 7 to 10 minutes, 7 to 9 minutes, 7 to 8 minutes, 8 to 12 minutes, 8 to 11 minutes, 8 to 10 minutes, 8 to 9 minutes, 9 to 12 minutes, It may be 9 to 11 minutes, 9 to 10 minutes, 10 to 12 minutes, or 10 to 11 minutes.
  • step (b-2) may take 3 to 5 minutes per 96 samples. That is, step (b-2) per round of the method of the present invention takes 3 to 5 minutes.
  • the time means the time during which the mixture of the sample and the direct lysis buffer is incubated.
  • step (b-2) may overlap with other steps. For example, 3 to 5 minutes of step (b-2) may be performed together while mixing the lysate and isothermal amplification reagent in step (b-3).
  • the total time required for step (b-2) may be 3 to 5 minutes, 3 to 4 minutes, or 4 to 5 minutes.
  • step (b-3) may take from 1 minute to 18 minutes per 96 samples. That is, step (b-3) per round of the method of the present invention takes from 1 minute to 18 minutes.
  • the time means the time required to dispense the isothermal amplification reagent after dispensing the lysate into the reaction container.
  • the total time required for step (b-3) is the performance of the sample preparation device in the automated molecular diagnostics system, the performance of the liquid dispensing module in the sample preparation device, the number of pipetting channels included in the liquid dispensing module, and the isothermal amplification reagent in the container. It may vary in the range of 1 minute to 18 minutes depending on whether or not it is pre-dispensed.
  • the total time required for step (b-3) is 1 to 18 minutes, 1 to 15 minutes, 1 to 10 minutes, 1 to 5 minutes, 5 to 18 minutes, 5 to 15 minutes, 5 minutes to 10 minutes, 10 to 18 minutes, 10 to 15 minutes, or 15 to 18 minutes.
  • step (c) may take from 1 to 4 minutes per 96 samples. That is, step (c) per round of the method of the present invention takes 1 to 4 minutes.
  • the time refers to the time required to transfer the reaction vessel from the sample preparation device to the sample analysis device and, optionally, to seal the reaction vessel using an automatic vessel sealer.
  • the total time required for step (c) may vary in the range of 1 minute to 4 minutes depending on the performance of the sample transfer device in the automated molecular diagnostic system and, optionally, the sealing speed of the automatic container sealer.
  • the total time required for step (c) may be 1 minute to 4 minutes, 1 minute to 3 minutes, 1 minute to 2 minutes, 2 minutes to 4 minutes, 2 minutes to 3 minutes, or 3 minutes to 4 minutes.
  • step (d) may take 10 to 20 minutes per 96 samples. That is, step (d) per round of the method of the present invention takes 10 to 20 minutes.
  • the time means the time required to perform isothermal amplification in the sample analysis device.
  • the total time required for step (d) may vary in the range of 10 to 20 minutes depending on the performance of the sample analysis device in the automated molecular diagnosis system.
  • the total time required for step (c) is 10 to 20 minutes, 10 to 17 minutes, 10 to 15 minutes, 10 to 13 minutes, 13 to 20 minutes, 13 to 17 minutes, 15 to 20 minutes minutes, or 15 to 17 minutes.
  • Example 1 High-throughput isothermal amplification using an automated molecular diagnostic system
  • RT-LAMP was performed using an automated molecular diagnostics system consisting of:
  • a sample preparation device comprising a liquid dispensing module
  • a sample analysis device comprising a nucleic acid amplification device and a nucleic acid detection device.
  • the liquid dispensing module in the automated molecular diagnostic system includes 8 pipetting channels.
  • the sample prepared in Example 1-1 the direct lysis buffer (Swab: Direct TM Extraction Kit, Cat. No. 9799140107), and the RT-LAMP reagent for detecting target nucleic acid prepared in Example 1-2 are added in advance to the sample preparation device. fitted.
  • the direct lysis buffer Swab: Direct TM Extraction Kit, Cat. No. 9799140107
  • the RT-LAMP reagent for detecting target nucleic acid prepared in Example 1-2 are added in advance to the sample preparation device. fitted.
  • the gene of the genome of bacteriophage MS2 (ATCC: 15597-B1) composed of RNA was used, and the bacteriophage MS2 prepared at a concentration of 10 4 PFU/ ⁇ L was placed in a sample transport medium (Transport media, Copan Universal Transport medium, Cat . _ / ⁇ L) of bacteriophage MS2 samples were prepared in three each.
  • a sample transport medium Transport media, Copan Universal Transport medium, Cat . _ / ⁇ L
  • F3 (SEQ ID NO: 1) 4 pmoles
  • B3 (SEQ ID NO: 2) 4 pmoles
  • FIP (SEQ ID NO: 3) 32 pmoles
  • BIP (SEQ ID NO: 4) 32 pmoles
  • LF (SEQ ID NO: 5) 8 pmoles
  • LB (SEQ ID NO: 6) 8 pmoles
  • WarmStart ® RTx Reverse Transcriptase (NEB, Cat. No. M0380L) 4 ⁇ L
  • Bst 2.0 WarmStart ® DNA polymerase (NEB, Cat. No.
  • RT-LAMP reagent (1) 8 ⁇ L, 10 mM
  • a final 150 ⁇ L of RT-LAMP reagent (1) was prepared by including 28 ⁇ L of dNTP Mix, 12 ⁇ L of 100 mM MgSO 4 , 15 ⁇ L of 10X Isothermal Amplification Buffer (NEB, B0537S) and 25 ⁇ L of 8X Evagreen.
  • the primer sets F3, B3, FIP, BIP, LF and LB
  • assimilation probes LB-assimilation probe and quenching oligo
  • F3 (SEQ ID NO: 1) 4 pmoles, B3 (SEQ ID NO: 2) 4 pmoles, FIP (SEQ ID NO: 3) 32 pmoles, BIP (SEQ ID NO: 4) 32 pmoles, LF (SEQ ID NO: 5) 10 pmole, LB (SEQ ID NO: 6) 4 pmole, LB-assimilation probe (SEQ ID NO: 7) 6 pmole, quenching oligo (SEQ ID NO: 8) 8 pmole, WarmStart ® RTx Reverse Transcriptase (NEB, Cat. No. M0380L ) 4 ⁇ L, Bst 2.0 WarmStart ® DNA polymerase (NEB, Cat. No.
  • M0538L 8 ⁇ L, 10 mM dNTP Mix 28 ⁇ L, 100 mM MgSO 4 12 ⁇ L, and 10X Isothermal Amplification Buffer (NEB, B0537S) 15 ⁇ L to prepare a final 150 ⁇ L of RT-LAMP reagent (2).
  • RT-LAMP was performed using an automated molecular diagnostic system according to the following protocol.
  • the target nucleic acid sequence could be specifically isothermally amplified and detected in 42 minutes by the high-throughput isothermal amplification method using the automated molecular diagnosis system according to the present disclosure. .

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Abstract

본 개시는 자동화 분자진단 시스템을 이용한 고처리량(High throughput) 등온 증폭 방법에 관한 것이다. 본 개시에 따른 방법은 짧은 시간 내에 대량의 샘플로부터 타겟 핵산을 신속하게 검출할 수 있으므로, 대량의 샘플의 분자진단이 필요한 대형 병원, 수탁 검사 기관, 연구소 등에서 유용하게 적용될 수 있다.

Description

자동화 분자진단 시스템을 이용한 고처리량 등온 증폭 방법
본 개시는 자동화 분자진단 시스템을 이용한 고처리량(High throughput) 등온 증폭 방법에 관한 것이다.
핵산 증폭 기술은 분자생물학 및 생명공학 분야에서 주로 사용되는 기술로 샘플 내에 존재하는 소량의 타겟 핵산을 검출하고 분석할 수 있는 방법이다. 핵산 증폭을 위해 PCR(Polymerase chain reaction) 기술이 가장 흔히 사용되며, 이는 이중 가닥 DNA를 단일 가닥 DNA로 변성시킨 후, 여기에 프라이머를 어닐링시키고, 어닐링된 프라이머를 중합효소에 의해 연장시키는 일련의 과정을 반복한다.
형광물질을 이용한 실시간 PCR 방법은 PCR 과정 중에 핵산 증폭에 따른 형광 세기의 증가를 검출하는 방법이다. 실시간 PCR 방법은 타겟마다 상이한 형광 염료를 사용함으로써 멀티플렉스 검출이 가능한 장점이 있으나, 고가의 장비가 필요하고 검출까지 시간이 많이 소요되는 단점이 있다.
PCR 방법의 대안으로서, 고가의 실시간 PCR 장비가 필요 없으며 PCR에 비해 더 빠른 시간 내에 타겟 핵산을 검출할 수 있는 등온증폭법(Isothermal amplification method)이 개발되었다. 등온증폭법의 예로는 rolling circle amplification(RCA, M. M. Ali, F. Li, Z. Zhang, K. Zhang, D.-K. Kang, J. A. Ankrum, X. C. Le and W. Zhao, Chem. Soc. Rev., 2014, 43, 3324-3341.), loop-mediated isothermal amplification(LAMP, Y. Mori, H. Kanda and T. Notomi, J. Infect. Chemother., 2013, 19, 404-411), recombinase polymerase amplification(RPA, J. Li, J. Macdonald and F. von Stetten, Analyst, 2018, 144, 31-67), nucleic acid sequence based amplification(NASBA, A. Borst, J. Verhoef, E. Boel and A. C. Fluit, Clin. Lab., 2002, 48, 487-492), strand displacement amplication(SDA, B. J. Toley, I. Covelli, Y. Belousov, S. Ramachandran, E. Kline, N. Scarr, N. Vermeulen, W. Mahoney, B. R. Lutz and P. Yager, Analyst, 2015, 140, 7540-7549), helicase dependent amplification (HAD, M. Vincent, Y. Xu and H. Kong, EMBO Rep., 2004, 5, 795-800), transcription mediated amplification (TMA, L. Comanor, Am. J. Gastroenterol., 2001, 96, 2968-2972) 등이 있다.
상기 등온증폭법 중에서 LAMP 방법이 가장 널리 사용되고 있다. LAMP는 2000년에 Notomi et al(T. Notomi, H. Okayama, H. Masubuchi, T. Yonekawa, K. Watanabe, N. Amino and T. Hase, Nucleic Acids Res., 2000, 28, E63)에 의해 처음으로 개발된 후 Nagamine et al(K. Nagamine, T. Hase and T. Notomi, Mol. Cell. Probes, 2002, 16, 223-229)에 의해 증폭 가속화를 위한 추가의 프라이머를 사용하는 것으로 최적화되었다.
LAMP의 표준 검출 방법은 마그네슘 피로포스페이트의 침전에 의한 탁도 측정법(Y. Mori, K. Nagamine, N. Tomita and T. Notomi, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001, 289, 150-154)이며, 그 외 방법으로서 겔 전기 영동, 칼슘에 대한 금속 지시자, 비색 LAMP, 콜로이드-결정 기질에 대한 커피-링 효과, LAMP 마그네틱 비드 응집체의 페이퍼 기반 신속 검출, 멜팅 및 어닐링 곡선 분석, SYBR green과 같은 인터컬레이팅 형광 염료, 피로포스페이트 전환을 통한 생물발광 또는 전기화학발광 등이 있다. 최근에는 동화 프로브(Assimilating probe)를 사용하여 타겟 핵산 증폭 서열에 특이적인 형광을 검출하는 방법(PCT/US2011/041540)이 개발되었다.
일반적으로, LAMP 방법과 같은 등온 증폭 방법은 짧은 시간내(주로 1시간 이내)에 한 온도에서 유전자를 증폭할 수 있어, 실시간 PCR에 비해 고가의 장비가 필요하지 않아 현장 신속진단에 적용되어 왔다.
하지만, 이러한 등온 증폭 방법을 이용한 현장 신속진단은 최근 발생한 코로나 팬데믹과 같이 대량의 샘플의 분석이 필요한 상황에서는 실시간 PCR 방법에 비해 불리하다.
본 발명자들은 종래 실시간 PCR에 의한 분자진단을 대체하기 위한 방법으로서 짧은 시간 내에 대량의 샘플을 처리할 수 있는 자동화 분자진단 시스템을 이용한 고처리량 등온 증폭 방법을 개발하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 종래 실시간 PCR에 의한 분자진단을 대체하기 위한 고처리량 등온 증폭 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 직접 용해(direct lysis)를 적용하고, 반응 용기로서 96-웰 플레이트를 사용하며, 또한 액체 분주 모듈을 포함하는 샘플 준비 장치를 포함하는 자동화 분자진단 시스템을 사용함으로써 짧은 시간 내에 대량의 샘플로부터 타겟 핵산을 검출할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 개시의 목적은 자동화 분자진단 시스템을 이용한 고처리량(High throughput) 등온 증폭 방법을 제공하는 것이다.
일 양태에 따르면, 다음 단계를 포함하는 자동화 분자진단 시스템을 이용한 고처리량(High throughput) 등온 증폭 방법이 제공된다:
(a) 대상체로부터 채취된 샘플을 자동화 분자진단 시스템 내의 샘플 준비 장치에 장착하는 단계; 상기 자동화 분자진단 시스템은 샘플 준비 장치, 반응 용기 이송 장치 및 샘플 분석 장치를 포함하고, 상기 샘플 준비 장치는 그 안에 장착된 직접 용해 버퍼(direct lysis buffer) 및 타겟 핵산 검출용 등온 증폭 (isothermal amplification) 시약을 포함하고;
(b) 상기 샘플 준비 장치에서,
(b-1) 상기 샘플을 직접 용해 버퍼와 혼합하는 단계;
(b-2) 상기 혼합물을 15℃ 내지 35℃에서 3분 내지 5분간 인큐베이션(incubation)하여 용해물(lysate)을 수득하는 단계; 및
(b-3) 상기 용해물을 반응 용기에서 등온 증폭 시약과 혼합하여 샘플 준비를 완료하는 단계;
상기 샘플 준비 장치는, 샘플, 직접 용해 버퍼 및 등온 증폭 시약을 반응 용기에 수용시키기 위한 액체 분주 모듈(liquid handling module)을 포함하며, 상기 액체 분주 모듈은 8개 내지 96개의 피펫팅 채널(pipetting channel)을 포함하고;
(c) 상기 혼합물이 포함된 반응 용기를 반응 용기 이송 장치의 도움으로 샘플 분석 장치로 이동시키는 단계;
(d) 상기 샘플 분석 장치에서,
(d-1) 상기 반응 용기 내의 혼합물을 50℃ 내지 75℃로부터 선택된 어느 온도에서 10분 내지 20분간 반응시켜 샘플 내의 타겟 핵산을 증폭하는 단계;
(d-2) 증폭된 산물을 검출하는 단계.
상기 단계 (b) 내지 (d)는 자동화 분자진단 시스템 내의 제어 모듈에 의해 자동으로 수행된다.
일 구현예에서, 상기 대상체로부터 유래된 샘플은 도말물(swab), 타액, 또는 이들의 혼합물이다.
일 구현예에서, 상기 도말물은 비인두 도말물(nasopharyngeal swab), 전비강 도말물(nostril swab), 구인두 도말물(oropharyngeal swab), 구강 도말물(oral swab), 침 도말물(saliva swab), 생식기 도말물(genital swab), 직장 도말물(rectal swab) 또는 이들 중 둘 이상의 혼합 도말물이다.
일 구현예에서, 상기 샘플 준비 장치 및 샘플 분석 장치 각각은 개별적으로 동작되는 stand-alone 장치이다.
일 구현예에서, 상기 샘플 분석 장치 및/또는 상기 반응 용기 이송 장치 중 적어도 하나의 장치는 공간적으로 폐쇄(enclosed)되는 폐쇄 구조물(enclosure)의 내부에 위치한다.
일 구현예에서, 상기 샘플 준비 장치 및 상기 폐쇄 구조물은 반응 용기가 이송되는 확정 통로(defined passage)를 형성하고, 상기 반응 용기 이송 장치는 상기 확정 통로를 이용하여 상기 반응 용기를 이송시킨다.
일 구현예에서, 상기 샘플 준비 장치는 상기 샘플 분석 장치의 위 또는 아래에 위치한다.
일 구현예에서, 상기 반응 용기는 96-웰 플레이트이다.
일 구현예에서, 상기 자동화 분자진단 시스템은 상기 반응 용기의 상부면을 실링(sealing)하기 위한 자동 용기 실러(automated container sealer)를 추가적으로 더 포함한다.
일 구현예에서, 상기 자동 용기 실러는 상기 샘플 준비 장치에 위치한다.
일 구현예에서, 상기 자동 용기 실러는 상기 폐쇄 구조물에 위치한다.
일 구현예에서, 상기 타겟 핵산은 바이러스 핵산이다.
일 구현예에서, 상기 타겟 핵산은 RNA 바이러스 핵산이다.
일 구현예에서, 상기 타겟 핵산은 SARS-CoV-2의 핵산이다.
일 구현예에서, 상기 SARS-CoV-2의 핵산은 E 유전자, N 유전자, RdRP 유전자, S 유전자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 상기 타겟 핵산 검출용 등온 증폭 시약은 형광 분자를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 및 퀀처 분자를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 등온 증폭 시약은 내부대조군을 증폭 및 검출하기 위한 올리고뉴클레오타이드를 추가적으로 포함한다.
일 구현예에서, 상기 내부대조군은 RNase P이다.
일 구현예에서, 상기 타겟 핵산 검출용 등온 증폭 시약은 복수의 타겟 핵산 검출용 등온 증폭 시약이다.
일 구현예에서, 상기 복수의 타겟 핵산은 2 내지 5개이다.
일 구현예에서, 상기 방법은 상기 단계 (c) 이전에 반응 용기를 반응 용기 이송 장치의 도움으로 자동 용기 실러로 이동시키고 상기 반응 용기의 상부면을 실링하는 단계를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 상기 반응 용기에 상부면의 실링은 열 또는 접착제에 의해 수행된다.
일 구현예에서, 상기 단계 (d-1)의 온도는 60℃ 내지 65℃로부터 선택된 어느 온도이다.
일 구현예에서, 상기 단계 (d-2)는 단계 (d-1)를 수행하는 동안 일정 시간 간격마다 실시된다.
일 구현예에서, 상기 방법은 96개의 샘플당 18분 내지 60분이 소요된다.
일 구현예에서, 상기 단계 (b)는 96개의 샘플당 7분 내지 36분이 소요된다.
일 구현예에서, 상기 단계 (b-1)은 96개의 샘플당 6분 내지 13분이 소요된다.
일 구현예에서, 상기 단계 (b-2)은 96개의 샘플당 5분이 소요된다.
일 구현예에서, 상기 단계 (b-3)은 96개의 샘플당 1분 내지 18분이 소요된다.
일 구현예에서, 상기 단계 (c)는 96개의 샘플당 1분 내지 4분이 소요된다.
일 구현예에서, 상기 단계 (d)는 96개의 샘플당 15분 내지 20분이 소요된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명의 방법은 18분 내지 60분 내에 96개의 샘플로부터 타겟 핵산을 검출할 수 있으므로, 대량의 샘플의 분자진단이 필요한 대형 병원, 수탁 검사 기관, 연구소 등에서 유용하게 적용될 수 있다.
(b) 본 발명의 방법은 직접 용해(direct lysis)와 등온 증폭을 조합함으로써 샘플로부터 타겟 핵산 추출시 정제 과정을 생략하고도 높은 민감도를 유지할 수 있다.
(c) 본 발명의 방법은 96-웰 플레이트를 수용할 수 있는 시스템을 사용함으로써 96개의 샘플을 동시에 처리할 수 있다.
(d) 본 발명의 방법은 8개 내지 96개의 피펫팅 채널을 갖는 액체 분주 모듈을 포함하는 시스템을 사용함으로써 반응에 필요한 액체를 분주하는 데 걸리는 시간을 단축할 수 있고 작업자의 개입 및 이에 따른 오류 발생 위험을 방지할 수 있다.
(e) 본 발명의 방법은 자동화 분자진단 시스템 내의 제어 모듈에 의해 자동으로 수행되므로 검사의 재현성 및 작업자의 피로도를 개선할 수 있다.
도 1은 본 개시내용에 따른 일체형 시스템을 나타내는 정면도이다.
도 2는 본 개시내용에 따른 일체형 시스템을 나타내는 우측면도이다.
도 3은 일 구현예에 따른 일체형 시스템의 작동적인 연결을 나타내는 예시도이다.
도 4는 본 개시내용의 일체형 시스템을 나타내는 내부 정면도이다.
도 5는 일 구현예에 따른 stand-alone 샘플 준비 장치를 나타내는 사시도이다.
도 6은 일 구현예에 따른 폐쇄 구조물을 나타내는 사시도이다.
도 7은 일 구현예에 따른 폐쇄 구조물의 제2 개구부의 동작 상태를 나타내기 위한 예시도이다.
도 8은 일 구현예에 따른 일체형 시스템의 일체형 시스템의 폐쇄 구조물을 나타내는 내부 사시도이다.
도 9는 일 구현예에 따른 반응 용기 이송 장치를 나타내는 사시도이다.
도 10은 일 구현예에 따른 반응 용기 이송 장치의 승강 모듈을 나타내는 사시도이다.
도 11은 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 방법의 일 예를 도식적으로 보여준다.
도 12는 동화 프로브(Assimilating probe)를 이용한 타겟 핵산 검출 방법의 일 예를 도식적으로 보여준다.
도 13은 실시예 1-2에서 제조한 형광 염료를 포함하는 RT-LAMP 시약(1)을 이용한 본 개시에 따른 자동화 분자진단 시스템에 의한 고처리량 등온 증폭 결과를 나타낸다.
도 14는 실시예 1-2에서 제조한 동화 프로브를 포함하는 RT-LAMP 시약(2)를 이용한 본 개시에 따른 자동화 분자진단 시스템에 의한 고처리량 등온 증폭 결과를 나타낸다.
본 발명은 다음 단계를 포함하는 자동화 분자진단 시스템을 이용한 고처리량(High throughput) 등온 증폭 방법을 제공한다:
(a) 대상체로부터 채취된 샘플을 자동화 분자진단 시스템 내의 샘플 준비 장치에 장착하는 단계; 상기 자동화 분자진단 시스템은 샘플 준비 장치, 반응 용기 이송 장치 및 샘플 분석 장치를 포함하고, 상기 샘플 준비 장치는 그 안에 장착된 직접 용해 버퍼(direct lysis buffer) 및 타겟 핵산 검출용 등온 증폭(isothermal amplification) 시약을 포함하고;
(b) 상기 샘플 준비 장치에서,
(b-1) 상기 샘플을 직접 용해 버퍼와 혼합하는 단계;
(b-2) 상기 혼합물을 15℃ 내지 35℃에서 3분 내지 5분간 인큐베이션하여 용해물을 수득하는 단계; 및
(b-3) 상기 용해물을 반응 용기에서 등온 증폭 시약과 혼합하여 샘플 준비를 완료하는 단계;
상기 샘플 준비 장치는, 샘플, 직접 용해 버퍼 및 등온 증폭 시약을 반응 용기에 수용시키기 위한 액체 분주 모듈(liquid handling module)을 포함하며, 상기 액체 분주 모듈은 8개 내지 96개의 피펫팅 채널(pipetting channel)을 포함하고;
(c) 상기 혼합물이 포함된 반응 용기를 반응 용기 이송 장치의 도움으로 샘플 분석 장치로 이동시키는 단계;
(d) 상기 샘플 분석 장치에서,
(d-1) 상기 반응 용기 내의 혼합물을 50℃ 내지 75℃로부터 선택된 어느 온도에서 10분 내지 20분간 반응시켜 샘플 내의 타겟 핵산을 증폭하는 단계;
(d-2) 증폭된 산물을 검출하는 단계.
상기 단계 (b) 내지 (d)는 자동화 분자진단 시스템 내의 제어 모듈에 의해 자동으로 수행된다.
이하에서 각 단계에 따라 본 발명을 보다 상세하게 설명한다:
단계 (a): 샘플을 자동화 분자진단 시스템 내의 샘플 준비 장치에 장착
본 개시의 단계 (a)에서는, 대상체로부터 채취된 샘플을 자동화 분자진단 시스템 내의 샘플 준비 장치에 장착한다. 여기서, 상기 자동화 분자진단 시스템은 샘플 준비 장치, 반응 용기 이송 장치 및 샘플 분석 장치를 포함하고, 상기 샘플 준비 장치는 그 안에 장착된 직접 용해 버퍼 및 타겟 핵산 검출용 등온 증폭 (isothermal amplification) 시약을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체(subject)"는 본 개시의 방법을 이용하여 검출하고자 하는 타겟 핵산(예컨대, 특정 병원체)을 포함하고 있을 것으로 의심되는 개체를 의미한다. 상기 대상체의 예는 비제한적으로 개, 고양이, 설치류, 영장류, 인간 등의 포유동물을 들 수 있으며, 특히 인간이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "샘플"은 검출하고자 하는 핵산을 포함하거나 포함하고 있을 것으로 의심되는 임의의 분석 물질을 의미할 수 있다. 예컨대, 상기 샘플은 생물학적 샘플(예컨대, 세포, 조직 및 체액) 및 비생물학적 샘플(예컨대, 음식물, 물 및 토양)을 포함하며, 상기 생물학적 샘플은 예컨대, 바이러스, 세균, 조직, 세포, 혈액(전혈, 혈장 및 혈청 포함), 림프, 골수액, 타액, 객담(sputum), 도말물(swab), 흡인액(aspiration), 우유, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 기관지 세척액, 복수 또는 양막액일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 샘플은 본원에서 '검체'와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 샘플은 대상체, 특히 포유동물, 보다 특히 인간으로부터 얻을 수 있으며, 예를 들어, 도말물(swab), 타액(saliva), 객담(sputum), 흡인액(aspiration), 기관지폐포세척(bronchoalveolar lavage; BAL), 가글(gargle) 또는 혈액일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
특정 구현예에 있어서, 상기 대상체로부터 유래된 샘플은 도말물(swab), 타액, 또는 이들의 혼합물이다.
일 구현예에 있어서, 상기 도말물은 비인두 도말물(nasopharyngeal swab), 전비강 도말물(nostril swab), 구인두 도말물(oropharyngeal swab), 구강 도말물(oral swab), 침 도말물(saliva swab), 생식기 도말물(genital swab), 직장 도말물(rectal swab) 또는 이들 중 둘 이상의 혼합 도말물이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산", "핵산 서열" 또는 "핵산 분자"는 단일-가닥 형태 또는 이중-가닥 형태의 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 폴리머를 의미하며, 상기 뉴클레오타이드는 자연(naturally occurring) 뉴클레오타이드와 동일한 방식으로 기능(function)할 수 있는 자연 뉴클레오타이드의 유도체, 비-자연 뉴클레오타이드 또는 변형 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "타겟 핵산", "타겟 핵산 서열" 또는 "타겟 서열"은 검출하고자 하는 핵산 서열을 의미한다. 상기 타겟 핵산 서열은 본 발명의 방법에 사용되는 등온 증폭 시약에 포함된 일부 프라이머 또는 프로브와 혼성화될 수 있다.
일 구현예에서, 타겟 핵산은 인간, 동물, 식물 또는 미생물의 핵산일 수 있다. 미생물은 진균(Fungi), 원생동물(protozoa), 세균(bacteria), 바이러스(virus) 또는 조류(Algae) 등 일 수 있다.
일 구현예에서, 타겟 핵산은 바이러스 핵산일 수 있으며, 구체적으로, 상기 타겟 핵산은 RNA 바이러스 핵산일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 타겟 핵산은 호흡기 바이러스 핵산일 수 있다. 예컨대, 인플루엔자 바이러스 핵산, 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus; RSV) 핵산, 아데노바이러스 핵산, 엔테로바이러스 핵산, 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus) 핵산, 메타뉴모바이러스(metapneumovirus; MPV) 핵산, 보카바이러스 핵산, 라이노바이러스 핵산 및/또는 코로나바이러스 핵산 등을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 타겟 핵산은 SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 바이러스 핵산일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 SARS-CoV-2 바이러스의 핵산은 E 유전자, N 유전자, RdRP 유전자, S 유전자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 샘플은 대상체로부터 다양한 샘플 채취 장치(sample collection device)를 이용하여 얻을 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "샘플 채취 장치"는 샘플을 채취하고 채취된 샘플을 유지하는 데 필요한 수단, 도구 등을 포괄하기 위해 사용된다.
일 구현예에서, 샘플 채취 장치는 샘플을 수용할 수 있는 용기를 포함한다.
다른 구현예에서, 샘플 채취 장치는 수송 배지(transport medium)를 포함한다. 상기 수송 배지는 샘플의 온전성(sample integrity), 예컨대, 바이러스 또는 박테리아의 세포 온전성(cell integrity)을 유지할 수 있는 보존용 수송 배지를 지칭한다. 상기 수송 배지는 식염수, 예컨대 PBS(phosphate buffered saline) 또는 노말 식염수(normal saline) 기반이거나, 또는 균형 염(balanced salt) 용액, 예컨대 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution) 기반일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 수송 배지는 불활성화(inactivating) 수송 배지가 아니다. 즉, 상기 수송 배지는 유기체, 예컨대 바이러스를 불활성화시키는 물질, 즉 검체 용해용 물질(material for lysis)을 포함하지 않는다. 본 개시에서 용어 "용해용 물질(material for lysis)"은 화학적 세포 용해 방식으로 검체(즉, 세포)를 용해하기 위해 사용되는 성분을 의미하며, 예컨대, 카오트로픽 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 카오트로픽 물질의 예로는 구아니디늄 또는 구아니딘 또는 유사한 화학물질을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
상기 수송 배지의 예로는 시판 중인 Copan 유니버설 수송 배지(universal transport medium; UTM), 바이러스 수송 배지(viral transport medium; VTM) 또는 Noble Biosciences, Inc의 CTM(Clinical Virus Transport Medium)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에 있어서, 상기 수송 배지는 액체 배지(liquid medium)일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 샘플 채취 장치는 샘플 채취 스왑 도구를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 대상체로부터 채취된 샘플은 자동화 분자진단 시스템 내의 샘플 준비 장치에 장착된다. 상기 자동화 분자진단 시스템"은 샘플 준비 장치, 반응 용기 이송 장치 및 샘플 분석 장치를 포함한다.
본원에서 "자동화 분자진단 시스템"은 분자진단, 특히 등온 증폭(예컨대, LAMP)을 위해 샘플을 준비하고 분석하는 과정이 작업자의 개입 없이 자동으로 수행될 수 있는 복수의 장치들을 포함하는 시스템을 가리키기 위해 사용된다.
일 구현예에서, 상기 자동화 분자진단 시스템은 당업계에 널리 공지된 바와 같은 개별적으로 샘플 준비, 샘플 분석 등을 수행할 수 없는 완전 자동화 시스템(Full automation system)이다. 상업적으로 이용가능한 완전 자동화 시스템의 예는 Roche사의 Cobas 6800/Cobas 8800, Hologic사의 Panther/Panther Fusion, Abbott사의 Alinity, Qiagen사의 QIAsymphony 등을 들 수 있다.
특정 구현예에서, 본원의 자동화 분자진단 시스템은 일체형 시스템(all in one system)이다. 본원에서는 상세한 설명의 전반에 걸쳐 자동화 분자진단 시스템을 일체형 시스템에 기반하여 설명하나 당업자라면 일체형 시스템 외에도 전술한 완전 자동화 시스템이 적용될 수 있음을 인식할 것이다.
샘플 준비 장치 및 샘플 분석 장치는 stand-alone 장치로 인허가된 상태로 일체형 시스템에 적용될 수 있다. 대안적으로, 일체형 시스템으로의 적용을 위해 일부 하우징 등의 변경을 수행하고, 이에 대한 부분 인허가를 진행할 수 있다.
따라서, 샘플 준비 장치 및 샘플 분석 장치는 stand-alone 장치로 인허가된 시약을 그대로 사용할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 일체형 시스템은 각각 동작되는 샘플 준비 장치와 샘플 분석 장치를 작동적으로 연결(operatively connecting)하기 위한 하나 이상의 하나 이상의 개구부(passthrough cavity)와 반응 용기 이송 장치(reaction vessel transfer device)를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "샘플 준비 장치(sample preparation device)"는 분석물(analyte)을 포함하거나 포함할 것으로 추정되는 분석 샘플을 준비하기 위하여 사용되는 장치를 나타낸다. 일 구현예에서, 샘플 준비 장치는 개별적으로 동작되는 stand-alone 장치이다.
본원에서, 샘플 준비 장치는 그 안에 장착된 직접 용해 버퍼 및 타겟 핵산 검출용 등온 증폭 시약을 포함한다.
샘플 준비 장치는 샘플을 분석 장치에 적용하기 위한 최적 상태로 처리하며, 이를 마이크로 로봇을 이용하여 자동으로 수행한다. 본 개시에서의 샘플 준비 과정은 샘플(예컨대, 검체)로부터 핵산 추출, 등온 증폭 시약의 제작 및 추출된 핵산과 등온 증폭 시약의 조합을 포함한다.
일 구현예에서, 샘플 준비 장치는 하우징을 포함하며, 샘플 준비 장치는 별도의 육면체(hexahedron) 형태의 폐쇄 구조물(enclosure) 내에 위치할 수 있다.
샘플 준비 장치는 내부의 반응 용기를 샘플 분석 장치에게 제공할 수 있다.
일 구현예에서, 샘플 준비 장치는 하우징에 하나 이상으로 형성된 개구부를 통해 내부의 반응 용기를 샘플 분석 장치에게 제공할 수 있다.
다른 구현예에서, 샘플 준비 장치는 내부의 반응 용기를 샘플 분석 장치에게 제공하기 위하여, 하우징에 하나 이상의 개구부를 형성할 수 있다.
다른 구현예에서, 샘플 준비 장치가 폐쇄 구조물 내부에 위치하고, 샘플 분석 장치가 폐쇄 구조물의 외부에 위치하는 경우, 폐쇄 구조물은 샘플 준비 장치의 반응 용기를 샘플 분석 장치에게 제공하기 위하여 하나 이상의 개구부가 형성될 수 있다.
일 구현예에서, 샘플 준비 장치는 핵산 추출 모듈(nucleic acid extraction module)을 포함한다.
상기 핵산 추출 모듈은 샘플(예를 들어, 수송 배지를 포함하는 샘플)의 분취물(aliquot)을 직접 용해 버퍼(예를 들어, 샘플 준비 장치에 장착된 버퍼)의 분취물과 혼합하고, 상기 혼합물을 인큐베이션하는 과정을 수행할 수 있다.
또한, 샘플 준비 장치는 상기 인큐베이션된 혼합물을 등온 증폭 시약의 분취물과 혼합하는 과정을 수행할 수 있다.
샘플 준비 장치에서 샘플의 준비 과정은 샘플 준비 장치를 제어하기 위한 제어 기기(미도시)를 통해 구현되며, 각 샘플의 준비 과정의 동작은 제어 기기가 각 구성요소에 대한 제어를 수행하여 이루어진다.
제어 기기는 샘플 준비 장치에 임베디드 되도록 구성될 수 있고, 별도의 장치로 구비되어 샘플 준비 장치와 네트워크를 통해 연결될 수 있다.
본 발명에 따른 제어 기기는 소프트웨어 제어형이다. 샘플 준비 장치의 제어 방법은 소프트웨어(software)로 제어될 수 있다. 소프트웨어 또는 알고리즘으로 구현되는 방법들은 프로세서 상에서 실행 가능한 컴퓨터가 읽을 수 있는 코드들 또는 프로그램 명령들로써 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록 매체 상에 저장될 수 있다.
여기서 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록 매체로 마그네틱 저장 매체(예컨대, ROM(read-only memory), RAM(random access memory), 플로피 디스크, 하드 디스크 등) 및 광학적 판독 매체(예컨대, 시디롬(CD-ROM), 디브이디(DVD, Digital Versatile Disc)) 등이 있다. 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록 매체는 네트워크로 연결된 컴퓨터 시스템들에 분산되어, 분산 방식으로 컴퓨터가 판독 가능한 코드가 저장되고 실행될 수 있다. 매체는 컴퓨터에 의해 판독 가능하며, 메모리에 저장되고, 프로세서에서 실행될 수 있다.
본 발명에 따른 샘플 준비 장치는 자동화된 액체 취급 장치(automated liquid handling device)이다. 자동화된 액체 취급 장치는 화학적 또는 생화학적 실험실의 자동화를 위해 지정된 컨테이너로부터 원하는 양의 시약, 샘플 또는 다른 액체를 자동적 및 프로그램으로 흡입 및/또는 분배할 수 있다. 자동화된 액체 취급 장치의 다양한 구성은 당업자에게 공지되어 있다.
샘플 준비 장치의 모든 구성요소는 통합된 장치로서 설계되고 시스템 하우징 내에 위치된다.
일 구현예에서, 샘플 준비 장치는 Hamilton사의 "Microlab VANTAGE", "Microlab STAR", "Microlab NIMBUS" 또는 "Microlab Prep" 등의 제품을 사용할 수 있다 (https://www.hamiltoncompany.com/automated-liquid-handling/platforms 참조).
본원에서 사용된 용어 "샘플 분석 장치(sample analysis device)"는 샘플을 등온 증폭, 특히 LAMP에 적용하기 위하여 사용되는 장치를 의미한다.
본원에서, 샘플 분석은 샘플 내의 타겟 핵산의 존재를 검출하는 것을 포함한다.
샘플 분석 장치는 관심 뉴클레오타이드 서열을 갖는 타겟 핵산을 증폭하고, 증폭된 핵산을 검출하는 기기를 의미할 수 있다.
샘플 분석 장치는 핵산 증폭 기기 및 핵산 검출 기기를 포함할 수 있다. 상기 핵산 검출 기기는 광원 및 광 검출기를 포함하는 광학 기기를 포함할 수 있다.
또한, 샘플 분석 장치는 샘플의 온도를 등온으로 유지시킬 수 있는 온도 제어 기기를 포함할 수 있다.
상기 샘플 분석 장치는 등온 증폭 장치(예컨대, LAMP 장치)이거나 또는 시판 중인 실시간 PCR 장치, 예컨대 써멀 사이클러(thermal cycler)일 수 있다. 샘플 분석 장치가 실시간 PCR 장치인 경우, 상기 샘플 분석 장치는 미리 정해진 온도를 유지하도록, 즉 등온 조건을 달성하도록 설정될 수 있다.
상기 샘플 분석 장치에서, 타겟 핵산은 종래 공지된 등온 증폭 방법(예컨대, LAMP 방법) 및 이의 변형에 의해 증폭될 수 있다.
한편, 본 발명의 샘플 분석 장치에 포함되는 핵산 검출 기기는 핵산 증폭 기기를 통해 증폭된 샘플 내의 타겟 핵산을 검출하기 위한 장치이다.
일 구현예에서, 상기 핵산 검출 기기는 타겟 핵산의 존재시에 형광 물질로부터 방출되는 방출광(emission light)을 검출하는 광학 모듈(optical module)을 포함한다.
광학 모듈은 핵산 증폭 기기에서 수행된 증폭 반응을 실시간으로 분석(또는 모니터링)하는 광학 장치(optics mechanism)이다. 일 구현예로, 광학 모듈은 복수로 구비되는 광원, 광학 필터, 볼록 렌즈, 빔 스플리터, 광 검출기 등의 구성요소로 이루어질 수 있으며, 광학 모듈에서 진행되는 핵산 증폭 반응에서 발생되는 형광을 실시간으로 검출할 수 있다.
일 구현예에서, 샘플 분석 장치는 실시간 검출 장치이다.
일 구현예에서, 샘플 분석 장치는 실시간 핵산 검출 장치이다.
일 구현예에서, 샘플 분석 장치는 실시간 등온 증폭 장치이다.
일 구현예에서, 샘플 분석 장치는 실시간 PCR 장치이다.
일 구현예에서, 샘플 분석 장치는 LAMP 장치, 특히 실시간 LAMP 장치이다.
본원에서 샘플 분석 장치는 개별적으로 동작되는 stand-alone 장치이다.
일 구현예에서, 샘플 분석 장치는 하우징을 포함하며, 샘플 분석 장치는 별도의 육면체(hexahedron) 형태의 폐쇄 구조물(enclosure) 내에 위치할 수 있다.
샘플 분석 장치는 샘플 준비 장치로부터 샘플을 포함하는 반응 용기를 수신할 수 있다.
샘플 분석 장치는 샘플 준비 장치로부터 반응 용기를 직접 수신하지 않으며, 반응 용기 이송 장치로부터 이송되는 반응 용기를 수신할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "폐쇄 구조물(enclosure)"은 외부와 환경적/공간적으로 분리될 수 있는 하나 이상의 닫힌 공간으로 형성된 하우징 형태의 구조물이다.
일 구현예에서, 폐쇄 구조물은 육면체(hexahedron) 형상으로 이루어질 수 있다.
다른 구현예에서, 폐쇄 구조물은 복수의 육면체가 연결된 형상으로 이루어질 수 있다. 이때, 내부는 하나의 공간으로 연결되거나, 복수의 공간으로 분리될 수 있다.
일 구현예에서, 폐쇄 구조물의 외부에 샘플 준비 장치가 위치하며, 내부에 샘플 분석 장치가 위치하는 경우, 반응 용기 이송 모듈은 폐쇄 구조물의 내부에 위치할 수 있다.
다른 구현예에서, 폐쇄 구조물의 외부에 샘플 분석 장치가 위치하며, 내부에 샘플 준비 장치가 위치하는 경우, 반응 용기 이송 모듈은 폐쇄 구조물의 외부에 위치할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 폐쇄 구조물의 내부에 샘플 준비 장치와 샘플 분석 장치가 위치하는 경우, 반응 용기 이송 모듈은 폐쇄 구조물의 내부에 위치할 수 있다.
폐쇄 구조물에는 자동 용기 실러(automated container sealer)가 위치할 수 있다.
폐쇄 구조물은 샘플 준비 장치 및/또는 샘플 분석 장치가 내부에 위치하는 경우, 각각의 장치들이 stand-alone 장치로 동작하는 환경을 구현하기 위해 내부에 환경 조절 수단을 포함할 수 있다.
환경 조절 수단은 폐쇄 구조물 내부의 온도, 습도, 오염 등을 조절하기 위한 것으로, 온열 장치, 냉각 장치, 습도 조절 장치, 팬, 필터 등으로 이루어질 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "개구부(passthrough cavity)"는 환경적/공간적으로 분리된 샘플 준비 장치와 샘플 분석 장치를 연결하기 위한 구성이다. 개구부는 인접하게 위치한 샘플 준비 장치와 샘플 분석 장치를 상호 공간적으로 연결하도록, 샘플 준비 장치로 준비된 반응 용기가 샘플 분석 장치 또는 폐쇄 구조물 내의 샘플 분석 장치로 이동되는 통로(passage)이다.
일 구현예에서, 개구부는 샘플 준비 장치에 형성된 제1 개구부(1st passthrough cavity)와 폐쇄 구조물에 포함된 제2 개구부(2nd passthrough cavity)로 구성될 수 있다.
다른 구현예에서, 제1 개구부 및/또는 제2 개구부는 상호 공간적으로 연결된 상태를 차단할 수 있는 개폐 장치(door device)를 포함할 수 있다. 개폐 장치는 제1 개구부에 포함될 수 있으며, 제2 개구부에 포함될 수도 있다. 또는 제1 개구부 및 제2 개구부에 모두 포함될 수 있다.
개구부는 샘플 준비 장치에서 준비된 반응 용기가 샘플 분석 장치 또는 폐쇄 구조물 내의 샘플 분석 장치로 이동되는 경우에 개방되고, 이동이 완료된 이후 폐쇄되도록 동작될 수 있다.
제1 개구부는 샘플 준비 장치의 하부에 형성되며, 바람직하게는 샘플 준비 장치의 덱(deck)에 형성될 수 있다. 샘플 준비 장치의 덱에 형성된 제1 개구부는 하부에 위치하여 샘플 분석 장치 또는 폐쇄 구조물 내에 위치하는 샘플 분석 장치로 반응 용기를 제공할 수 있다.
제2 개구부는 샘플 준비 장치의 제1 개구부에서 이동되는 반응 용기가 진입할 수 있도록 폐쇄 구조물의 상부면, 측면 또는 저면에 형성될 수 있다.
또한, 폐쇄 구조물에는 제1 개구부로부터 제2 개구부를 통해 반응 용기를 이송시키기 위한 반응 용기 이송 장치가 포함될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "반응 용기 이송 장치"는 일체형 시스템에서 사용되는 반응 용기를 샘플 준비 장치에서 샘플 분석 장치 또는 폐쇄 구조물 내의 샘플 분석 장치로 이동시키고, 폐쇄 구조물 내의 각 구성요소에 이송 및 장착할 수 있는 장치이다.
일 구현예에서, 반응 용기를 샘플 준비 장치에서 샘플 분석 장치에 이동시키기 위한 반응 용기 이송 장치는 적어도 하나 이상의 로봇 모듈을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 로봇 모듈은 승강 모듈(lift module)을 포함한다. 승강 모듈은 반응 용기를 상하로 이동시키기 위한 로봇 모듈이며, 샘플 준비 장치의 반응 용기를 폐쇄 구조물 내로 이동시킬 수 있다.
다른 구현예에서, 로봇 모듈은 크레인 모듈(crane module)을 포함한다. 크레인 모듈은 폐쇄 구조물 내로 이동된 반응 용기를 폐쇄 구조물 내에서 이송하고 이를 구성요소에 장착할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 로봇 모듈은 로봇 암(robot arms)을 포함한다. 로봇 암은 하나 이상의 관절 운동을 통해 반응 용기를 원하는 위치로 이동시킬 수 있다.
로봇 모듈은 상/하, 전/후, 좌우 방향으로 동작될 수 있으나, 일 구현예에서, 승강 모듈은 상/하 및 좌/우 방향으로 동작되고, 크레인 모듈은 상/하, 전/후 및 좌/우 방향으로 동작되고, 회전될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "용기(vessel)"는 샘플 준비 장치 및 샘플 분석 장치에서 사용되는 물질을 수용하는 공간을 말한다. 물질은 일반적으로 용액을 포함한다. 본 명세서에서 샘플 준비 장치 및 샘플 분석 장치에서 사용되는 물질을 수용하는 공간은 "container" 또는 "carrier"로 사용될 수 있다. "vessel", "container" 및 "carrier"를 특별히 구분하지 않는다. 다만, 사용되는 장치, 형태 또는 내부 수용 물질 등에 따라 선택적으로 사용할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "반응 용기"는 타겟 핵산의 증폭을 위해 샘플(등온 증폭 시약과 혼합된 샘플)이 함유된 용기를 지칭한다.
본원에서 반응 용기는 96-웰 플레이트를 의미하며, 이는 샘플 준비 장치 및 샘플 분석 장치에서 사용된다. 본원에서 96-웰 플레이트는 96개의 샘플(대조군 포함)을 하나의 반응으로, 즉 동시에 처리할 수 있다.
도 1은 일 구현예에 따른 일체형 시스템을 나타내는 정면도이며, 도 2는 일 구현예에 따른 일체형 시스템을 나타내는 우측면도이다. 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 일 구현예에서, 일체형 시스템(all in one system, 1000)은 샘플 준비 장치(sample preparation device, 1100)와 폐쇄 구조물(enclosure, 1300)을 포함한다.
일 구현예에서, 샘플 준비 장치(1100)는 폐쇄 구조물(1300)의 상부에 위치하도록 구성될 수 있다. 다른 구현예에서, 샘플 준비 장치(1100)는 폐쇄 구조물(1300)의 측면에 위치하도록 구성될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 샘플 준비 장치(1100)는 폐쇄 구조물(1300)의 후면에 위치하도록 구성될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 샘플 준비 장치(1100)는 폐쇄 구조물(1300)의 전면에 위치하도록 구성될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 샘플 준비 장치(1100)는 폐쇄 구조물(1300)의 내부에 위치하도록 구성될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 샘플 준비 장치(1100)는 폐쇄 구조물(1300)의 하부에 위치하도록 구성될 수 있다.
폐쇄 구조물(1300)은 육면체 형상의 닫힌 공간이다.
폐쇄 구조물(1300)은 샘플 준비 장치(1100), 샘플 분석 장치(sample analysis device, 1200), 반응 용기 이송 장치(reaction vessel transfer device, 1400) 중 적어도 하나 이상의 장치를 수용할 수 있다.
일 구현예에서, 폐쇄 구조물(1300)은 하나 이상의 샘플 분석 장치(1200) 및 반응 용기 이송 장치(1400)를 수용할 수 있다. 다른 구현예에서, 폐쇄 구조물(1300)은 하나 이상의 샘플 분석 장치(1200)를 수용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 폐쇄 구조물(1300)은 반응 용기 이송 장치(1400)를 수용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 폐쇄 구조물(1300)은 샘플 준비 장치(1100) 및 반응 용기 이송 장치(1400)를 수용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 폐쇄 구조물(1300)은 샘플 준비 장치(1100)를 수용할 수 있다.
폐쇄 구조물(1300)은 내부에 수용되는 하나 이상의 장치와 외부에 위치하는 장치들 사이의 작동적인 연결을 제공할 수 있다.
일 구현예에서, 폐쇄 구조물(1300)은 단일 공간을 폐쇄된다. 폐쇄 구조물(1300)이 단일 공간으로 폐쇄되는 경우, 샘플 준비 장치(1100), 샘플 분석 장치(sample analysis device, 1200), 반응 용기 이송 장치(reaction vessel transfer device, 1400) 중 적어도 하나 이상의 장치는 하나의 공간에 위치할 수 있다.
다른 구현예에서, 폐쇄 구조물(1300)은 복수의 공간을 폐쇄한다. 폐쇄 구조물(1300)이 복수의 공간으로 폐쇄되는 경우, 샘플 준비 장치(1100), 샘플 분석 장치(sample analysis device, 1200), 반응 용기 이송 장치(reaction vessel transfer device, 1400) 중 적어도 하나 이상의 장치는 복수의 공간 중 어느 하나의 공간에 위치하거나, 복수의 공간 중 어느 둘 이상의 공간에 위치할 수 있다. 예를 들어, 단일 공간을 가지는 폐쇄 구조물(1300)에는 샘플 분석 장치(1200) 및 반응 용기 이송 장치(1400)가 같은 공간 내에 위치할 수 있다. 예를 들어, 복수의 공간을 가지는 폐쇄 구조물(1300)에는 샘플 분석 장치(1200) 및 반응 용기 이송 장치(1400)는 서로 다른 공간에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 폐쇄 구조물(1300)의 내부에 샘플 분석 장치(1200) 및 반응 용기 이송 장치(1400)가 위치할 수 있다. 이때, 샘플 준비 장치(1100)는 폐쇄 구조물(1300)의 외부에 위치한다.
폐쇄 구조물(1300)은 샘플 준비 장치(1100)로부터 샘플 분석 장치(1200)에게 제공될 반응 용기(1500)를 이송하기 위한 반응 용기 이송 장치(1400)가 이동되는 확정 통로(defined passage)인 제2 개구부(2nd passthrough cavity, 1310)가 형성된다.
폐쇄 구조물(1300)의 제2 개구부(1310)는 반응 용기(1500)가 이송되는 확정 통로(passage)이며, 반응 용기 이송 장치(1400)는 샘플 준비 장치(1100)의 제1 개구부(1130)로부터 폐쇄 구조물(1300)의 제2 개구부(1310)를 통해 샘플 분석 장치(1200)에 반응 용기(1500)를 제공할 수 있다.
폐쇄 구조물(1300)의 제2 개구부(1310)의 위치는 폐쇄 구조물(1300)의 외측면 중에서 어느 하나의 면에 위치될 수 있다. 도 6에 도시된 바와 같이, 폐쇄 구조물(1300)이 육면체의 형상인 경우, 제2 개구부(1310)는 폐쇄 구조물(1300)의 상부면에 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
반응 용기 이송 장치(1400)는 샘플 준비 장치(1100)의 제1 개구부(1st passthrough cavity, 1130)로부터 폐쇄 구조물(1300)의 제2 개구부(1310) 사이에 형성되는 경로를 통해 반응 용기(1500)를 이송하도록 프로그래밍 될 수 있다.
따라서, 반응 용기 이송 장치(1400)가 반응 용기(1500)를 이동시킬 수 있는 범위 내의 거리에 각각의 개구부가 위치하는 것이 바람직하다.
폐쇄 구조물(1300)은 육면체 형태의 캐비닛(cabinet), 락커(locker), 상자(box/case) 등의 형상으로 구현될 수 있다. 폐쇄 구조물(1300)은 전/후/좌/우/상/하면이 폐쇄되며, 적어도 하나의 폐쇄 구조물 문(door, 1320)이 구비되는 형태이다. 폐쇄 구조물 문(1320)은 사용자가 내부에 위치하는 장치 및 구성요소들에 접근할 수 있도록 전/후, 좌/우 등에 설치된다.
폐쇄 구조물(1300)은 밀폐(seal)되지 않으며, 환기구(air vent, 1370)가 형성될 수 있다.
폐쇄 구조물(1300)은 샘플 준비 장치(1100), 샘플 분석 장치(1200) 및/또는 반응 용기 이송 장치(1400) 중 적어도 하나 이상이 위치될 수 있다.
또한, 폐쇄 구조물(1300)에는 반응 용기(1500)의 상부면 주입구를 실링(sealing)하기 위한 자동 용기 실러(automated container sealer, 1700)가 위치할 수 있다.
또한, 폐쇄 구조물(1300)에는 샘플 준비 장치(1100)에서 분석 샘플의 준비를 위해 사용된 다양한 용액을 회수하기 위한 용액 회수함(liquid waste collection bin, 1330)이 위치할 수 있다.
또한, 폐쇄 구조물(1300)에는 샘플 분석 장치(1200)에서 분석의 수행이 완료된 반응 용기(1500)를 회수하기 위한 반응 용기 회수함(reaction vessel retrieval container, 1360)이 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 반응 용기 회수함은 폐쇄 구조물(1300)의 내부에 위치할 수 있다. 다른 구현예에서, 반응 용기 회수함은 폐쇄 구조물(1300)의 외부에 위치할 수 있다.
외부에 위치하는 반응 용기 회수함은 폐쇄 구조물(1300)의 내부와 외부를 연결하는 회수 개구부(retrieval passthrough cavity, 1340)를 통해 반응 용기(1500)가 내부에서 외부로 이송됨에 반응 용기(1500)를 회수할 수 있다.
반응 용기(1500)의 이동을 위해 폐쇄 구조물(1300)의 내부와 외부를 연결하는 회수 개구부(1340)에는 컨베이어(conveyor, 1350)가 설치되어 상호 연결될 수 있다. 반응 용기 이송 장치(1400)가 폐쇄 구조물(1300)의 내측 컨베이어(1350)에 반응 용기(1500)를 내려 놓으면, 반응 용기(1500)는 컨베이어(1350)에 의해 이동하고, 폐쇄 구조물(1300)의 외부에 위치한 반응 용기 회수함에 수용될 수 있다.
일 구현예에서, 컨베이어(1350)는 내부보다 외부의 위치가 낮은 경사면을 형성한다. 컨베이어(1350)는 경사면에 롤러가 구비됨으로써, 반응 용기(1500)를 폐쇄 구조물(1300)의 외부로 배출할 수 있다. 외부로 배출되는 반응 용기(1500)는 반응 용기 회수함에 수용될 수 있다.
다른 구현예에서, 컨베이어(1350)는 동력으로 구동될 수 있다. 동력은 컨베이어(1350)에 포함된 밸트 등을 회전시킴으로써, 컨베이어(1350)에 올려지는 반응 용기(1500)를 폐쇄 구조물(1300)의 외부로 배출할 수 있다. 외부로 배출되는 반응 용기(1500)는 반응 용기 회수함에 수용될 수 있다.
반응 용기 회수함은 사용자에 의해 내부에 수용된 하나 이상의 반응 용기(1500)가 비워질 수 있다.
폐쇄 구조물(1300)의 내부와 외부가 컨베이어(1350)에 의해 연결되는 회수 개구부(1340)는 개폐 모듈(미도시)을 포함할 수 있다. 개폐 모듈은 반응 용기(1500)가 반응 용기 회수함으로 이동되는 경우에 열릴 수 있으며, 그 외의 경우에는 닫혀 있는 것이 바람직하다. 개폐 모듈은 외부의 오염으로부터 폐쇄 구조물(1300)의 내부를 보호할 수 있다.
일 구현예에서, 폐쇄 구조물(1300)은 완전 밀폐되지 않으며, 환기가 가능하도록 구현되어 있다. 이를 위해 폐쇄 구조물(1300)에는 환경 조절 수단을 포함하고 있으며, 환경 조절 수단은 환기구, 배기구, 팬, 온도 조절 수단, 습도 조절 수단, 공기 필터 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 도 6 및 도 8에서는 폐쇄 구조물(1300) 내의 공기 순환을 위한 환기구(air vent, 1370) 또는 배기구(exhaust vent, 1370), 및/또는 내부의 공기를 배출하기 위한 팬(fan, 1380)이 하나 이상 형성되어 있는 것을 나타내고 있다.
도 3은 일 구현예에 따른 일체형 시스템의 작동적인 연결을 나타내는 예시도이다. 도 3에 도시된 바와 같이, 샘플 준비 장치(1100)는 폐쇄 구조물(1300)의 상부에 위치한다.
샘플 준비 장치(1100)는 분석 샘플의 준비를 위해 단독으로 설치되어 동작될 수 있으며, 일 구현예에 따라, 폐쇄 구조물(1300)과 작동적으로 연결되어 일체형 시스템(1000)으로 사용될 수 있다.
일 구현예에 따라, 샘플 준비 장치(1100)가 폐쇄 구조물(1300)과 결합되어, 일체형 시스템(1000)으로 사용되는 경우, 샘플 준비 장치(1100)는 폐쇄 구조물(1300)에 구비되는 승강 모듈(1410)이 내부로 이동할 수 있도록 제1 개구부(1130)를 형성할 수 있다(도 5 참조). 제1 개구부(1130)는 비어 있는 공간이며, 반응 용기(1500)가 승강 모듈(1410)에 의해 이동되는 확정 통로(defined passage)이다.
승강 모듈(1410)이 샘플 준비 장치(1100)의 내부로 이동되는 경우, 샘플 준비 장치(1100)는 분석 샘플을 수용하는 반응 용기(reaction vessel, 1500) 또는 반응 용기(1500)를 수용하는 플레이트(plate, 미도시)를 승강 모듈(1410)에 장착한다. 승강 모듈(1410)은 장착된 반응 용기(1500) 또는 플레이트를 폐쇄 구조물(1300)의 내부로 이동시킨다.
일 구현예에 따라, 샘플 준비 장치(1100)가 폐쇄 구조물(1300)의 상부에 위치하는 경우, 샘플 준비 장치(1100)와 폐쇄 구조물(1300)은 결합 장치(coupling mechanism, 미도시)를 통해 결합될 수 있다.
일 구현예에서, 샘플 준비 장치(1100) 및 샘플 분석 장치(1200) 중 적어도 어느 하나 이상의 장치가 폐쇄 구조물(1300)과 작동적으로 연결되어 일체형 시스템(1000)으로 사용되는 경우, 샘플 준비 장치(1100) 및 샘플 분석 장치(1200)는 stand-alone 장치로 사용되던 전원 모듈을 그대로 사용한다.
일 구현예에서, stand-alone 샘플 준비 장치(1100) 및 stand-alone 샘플 분석 장치(1200) 중 적어도 어느 하나 이상이 폐쇄 구조물(1300)과 작동적으로 연결되어 일체형 시스템(1000)으로 사용되는 경우, stand-alone 샘플 준비 장치(1100) 및 stand-alone 샘플 분석 장치(1200)는 이미 상용화된 장치 및/또는 기 인허가 받은 장치이다.
이에 따라, 폐쇄 구조물(1300)과 작동적으로 연결되어 일체형 시스템(1000)으로 사용하여도 별도의 인허가가 필요 없거나, 부분 수정이 있을 수 있다.
도 4는 일 구현예의 일체형 시스템을 나타내는 내부 정면도이다. 도 4에 도시된 바와 같이, 폐쇄 구조물(1300)의 하부에 샘플 분석 장치(1200-a, 1200-b)가 위치한다.
폐쇄 구조물(1300)을 도 8을 참조하여 설명하면 다음과 같다.
도 8은 일 구현예에 따른 일체형 시스템의 폐쇄 구조물을 나타내는 내부 사시도이다.
일 구현예에서, 폐쇄 구조물(1300)는 샘플 준비 장치(1100)에서 준비된 반응 용기(1500)를 샘플 분석 장치(1200-a, 1200-b)에게 제공하기 위한 반응 용기 이송 장치(1400)를 포함한다.
반응 용기 이송 장치(1400)는 로봇 모듈이며, 특히 승강 모듈(lift module, 1410)과 크레인 모듈(crane module, 1430)로 구성되어 있다.
일 구현예에서, 반응 용기 이송 장치(1400)는 승강 모듈(1410) 및 크레인 모듈(1430)을 포함하여 구성된다.
다른 구현예에서, 반응 용기 이송 장치(1400)는 승강 모듈(1410)을 포함하여 구성된다.
또 다른 구현예에서, 반응 용기 이송 장치(1400)는 크레인 모듈(1430)을 포함하여 구성된다.
또 다른 구현예에서, 반응 용기 이송 장치(1400)는 로봇 암(미도시)을 포함하여 구성된다.
또 다른 구현예에서, 반응 용기 이송 장치(1400)는 반응 용기(1500)를 이송할 수 있는 기계적인 장치를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 승강 모듈(1410)과 크레인 모듈(1430)은 폐쇄 구조물(1300)의 내측에 위치할 수 있다.
폐쇄 구조물(1300)에 포함되는 승강 모듈(1410) 및 크레인 모듈(1430)은 로봇 모듈이다. 로봇 모듈은 일체형 시스템(1000)에 포함된 제어 모듈(미도시)의 제어에 의해 반응 용기(1500)를 이동시킨다.
폐쇄 구조물(1300)에는 반응 용기(1500)의 주입구를 실링(sealing)하기 위한 자동 용기 실러(automated container sealer, 1700)가 위치할 수 있다.
폐쇄 구조물(1300)에는 반응 용기(1500)에 수용된 분석 샘플을 분석하기 위한 적어도 하나 이상의 샘플 분석 장치(sample analysis device, 1200-a, 1200-b)가 위치할 수 있다.
폐쇄 구조물(1300)에는 샘플 준비 장치(1100)에서 분석 샘플의 준비를 위해 사용된 다양한 용액을 회수하기 위한 용액 회수함(liquid waste collection bin, 1330)이 위치할 수 있다.
폐쇄 구조물(1300)에는 샘플 분석 장치(1200-a, 1200-b)에서 분석의 수행이 완료된 반응 용기(1500)를 회수하기 위한 반응 용기 회수함(reaction vessel retrieval container, 1360)이 위치할 수 있다.
폐쇄 구조물(1300)은 일체형 시스템(1000)에 작동적으로 연결되는 복수의 장치로부터 데이터를 송신 및/또는 수신하는 제어 모듈(control module, 미도시)을 포함한다.
일 구현예에서, 제어 모듈은 샘플 준비 장치(1100), 샘플 분석 장치(1200), 반응 용기 이송 장치(1400) 및/또는 자동 용기 실러(1700) 중 적어도 어느 하나 이상의 장치와 작동적으로 연결되기 위하여 통신 채널이 연결될 수 있다. 예를 들어, 통신 채널은 무선 및/또는 유선으로 연결될 수 있다.
일 구현예에서, 제어 모듈은 샘플 준비 장치(1100)에서 분석 샘플의 준비가 완료된 신호를 통신 채널을 이용하여 수신할 수 있다.
또한, 샘플 준비 장치(1100)의 반응 용기(1500)를 샘플 분석 장치(1200)로 이동시키는 제어 신호를 통신 채널을 이용하여 반응 용기 이송 장치(1400)에 제공할 수 있다.
또한, 제어 모듈은 샘플 분석 장치(1200)에서 분석 샘플에 대한 분석이 완료된 신호를 통신 채널을 이용하여 수신할 수 있다.
또한, 제어 모듈은 샘플 분석 장치(1200)의 반응 용기(1500)를 반응 용기 회수함으로 이동시키는 제어 신호를 통신 채널을 이용하여 반응 용기 이송 장치(1400)에 제공할 수 있다.
폐쇄 구조물(1300)은 반응 용기(1500)를 수신하기 위해 샘플 준비 장치(1100)로 이동하는 승강 모듈(1410)이 통과되는 제2 개구부(2nd passthrough cavity, 1310)가 상부면에 형성된다.
일 구현예에 따라, 제2 개구부(1310)는 도 6 및 도 7을 참조하여 다음과 같이 설명할 수 있다. 도 6은 일 구현예에 따른 폐쇄 구조물을 나타내는 사시도이다. 도 7은 일 구현예에 따른 폐쇄 구조물의 제2 개구부의 동작 상태를 나타내기 위한 예시도이다. 도 6 및 도 7에 도시된 바와 같이, 제2 개구부(1310)는 폐쇄 구조물(1300)의 상부면에 형성된다.
제2 개구부(1310)는 승강 모듈(1410)에 포함되는 수직 동작 가이드(vertical motion guide, 1413)와 반응 용기 렉(analytical sample vessel rack, 1416)이 통과될 수 있는 크기로 형성된다.
제2 개구부(1310)는 샘플 준비 장치(1100)의 덱(1110)에 형성된 제1 개구부(1130)와 수직으로 연결되도록 형성된다.
일 구현예에서, 제2 개구부(1310)는 폐쇄 구조물(1300)의 상부면에서 우측면에 형성되고, 제1 개구부(1130)는 덱(1110)의 평면에서 우측면에 형성된다. 다른 구현예에서, 제2 개구부(1310)는 폐쇄 구조물(1300)의 상부면에서 좌측면에 형성될 수 있고, 제1 개구부(1130)는 덱(1110)의 평면에서 좌측면에 형성될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제2 개구부(1310)는 폐쇄 구조물(1300)의 상부면에서 상측면에 형성될 수 있고, 제1 개구부(1130)는 덱(1110)의 평면에서 상측면에 형성될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제2 개구부(1310)는 폐쇄 구조물(1300)의 상부면에서 하측면에 형성될 수 있고, 제1 개구부(1130)는 덱(1110)의 평면에서 하측면에 형성될 수 있다.
일 구현예에서, 제2 개구부(1310)는 폐쇄 구조물(1300) 내측에 위치하는 승강 모듈(1410)의 일부가 샘플 준비 장치(1100)의 내부로 이동하기 위한 통로이다(도 6 참조).
다른 구현예에서, 제2 개구부(1310)는 폐쇄 구조물(1300) 내측의 승강 모듈(1410)의 일부가 샘플 준비 장치(1100)의 내부로 이동하기 위한 열려진 통로이며, 승강 모듈(1410)의 일부가 샘플 준비 장치(1100)로 이동하지 않는 경우에는 제2 개구부(1310)에 구비된 개폐 모듈(open/close module, 1311)을 통해 열려진 제2 개구부(1310)를 닫을 수 있다(도 7 참조).
개폐 모듈(1311)은 폐쇄 구조물(1300) 외부의 오염물질을 차단하기 위하여 구비된다.
일 구현예에서, 개폐 모듈(1311)은 힌지(hinge) 방식으로 구현되어, 폐쇄 구조물(1300)의 상부면의 상측 또는 하측으로 개폐될 수 있다. 다른 구현예에서, 개폐 모듈(1311)은 슬라이딩(sliding) 방식으로 구현되어, 폐쇄 구조물(1300)의 상부면에서 이동되는 형태로 개폐될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 개폐 모듈(1311)은 힌지 방식 또는 슬라이딩 방식 이외의 방식으로 제2 개구부(1310)를 열고 닫을 수 있는 형태인 경우, 어떠한 것을 사용할 수 있다.
도 7의 (a)에서와 같이, 승강 모듈(1410)이 폐쇄 구조물(1300)의 내측에 위치할 때, 제2 개구부(1310)의 개폐 모듈(1311)은 닫힌다.
도 7의 (b)에서와 같이, 승강 모듈(1410)이 샘플 준비 장치(1100)로 이동할 때 제2 개구부(1310)의 개폐 모듈(1311)은 열린다. 그리고, 제2 개구부(1310)의 개폐 모듈(1311)은 승강 모듈(1410)이 폐쇄 구조물(1300) 내로 이동한 후 닫힌다.
일 구현예에 따라, 승강 모듈(1410)은 도 9 및 도 10을 참조하여 다음과 같이 설명할 수 있다. 도 9는 일 구현예에 따른 반응 용기 이송 장치를 나타내는 사시도이고, 도 10은 일 구현예에 따른 반응 용기 이송 장치의 승강 모듈을 나타내는 사시도이다.
승강 모듈(1410)은 샘플 준비 장치(1100)에서 반응 용기(1500)를 수신할 수 있는 구성이다. 승강 모듈(1410)은 샘플 준비 장치(1100)로부터 분석 샘플을 수신하기 위해, 폐쇄 구조물(1300)의 상부에 있는 샘플 준비 장치(1100)로 상승할 수 있는 엘리베이터(elevator)의 동작 형태를 나타낸다.
승강 모듈(1410)은 폐쇄 구조물(1300)의 내부에서 고정된 기둥 형태의 수직 고정 가이드(vertical fixed guide, 1411)를 포함한다. 수직 고정 가이드(1411)는 상/하로 이동되는 고정 가이드 커넥터(1412)를 포함한다. 승강 모듈(1410)은 수직 고정 가이드(1411)의 고정 가이드 커넥터(1412)에 결합되는 수직 동작 가이드(vertical motion guide, 1413)를 포함한다.
수직 동작 가이드(1413)는 상/하로 이동되는 동작 가이드 커넥터(motion guide connector, 1414)를 포함한다. 수직 동작 가이드(1413)는 동작 가이드 커넥터(1414)에 결합되는 렉 가이드(rack guide, 1415)를 포함한다.
승강 모듈(1410)은 렉 가이드(1415)의 상부에서 반응 용기를 수신하는 반응 용기 렉(analytical sample vessel rack, 1416)을 포함한다.
승강 모듈(1410)은 수직 동작 가이드(1413)를 상/하 방향으로 이동시키기 위한 동력을 제공하는 구동장치(actuator, 1417)를 포함한다.
수직 고정 가이드(1411)는 폐쇄 구조물(1300) 내부의 상부, 하부 및/또는 측면 중 적어도 어느 하나 이상에 결합되어 고정된다. 수직 고정 가이드(1411)는 고정 가이드 커넥터(1412)와 결합된다. 수직 고정 가이드(1414)는 결합된 고정 가이드 커넥터(1412)를 상/하 방향으로 이동시킬 수 있다.
수직 고정 가이드(1411)는 고정 가이드 커넥터(1412)를 상/하 방향으로 이동시키기 위해 구동장치(1417)에서 제공되는 동력을 사용할 수 있다.
수직 고정 가이드(1411)의 크기는 폐쇄 구조물(1300)의 내부 높이보다 같거나 작다. 수직 고정 가이드(1411)는 고정 가이드 커넥터(1412)를 상부로 이동시킴에 따라 고정 가이드 커넥터(1412)에 결합된 수직 동작 가이드(1413)가 제2 개구부(1310)을 지나 샘플 준비 장치(1100)로 이동될 수 있다.
수직 고정 가이드(1411)에 결합된 고정 가이드 커넥터(1412)는 수직 동작 가이드(1413)를 결합한다. 고정 가이드 커넥터(1412)는 수직 고정 가이드(1411)에서 제공하는 상/하 움직임에 따라 수직 동작 가이드(1413)를 이동시킨다.
수직 동작 가이드(1413)는 수직 고정 가이드(1411)의 구동에 따라 상/하 방향으로 이동될 수 있다.
일 구현예에서, 수직 동작 가이드(1413)는 동작 가이드 커넥터(1414)와 결합된다. 수직 동작 가이드(1413)는 결합된 동작 가이드 커넥터(1414)를 상/하 방향으로 이동시킬 수 있다.
수직 동작 가이드(1413)는 동작 가이드 커넥터(1414)를 상/하 방향으로 이동시키기 위해 구동 장치(1417)에서 제공되는 동력을 사용할 수 있다.
다른 구현예에서, 수직 동작 가이드(1413)는 동작 가이드 커넥터(1414)를 이동시키지 않으며, 고정된 형태로 결합될 수 있다.
일 구현예에서, 수직 동작 가이드(1413)에 결합되어 상/하 움직임을 제공받는 동작 가이드 커넥터(1414)는 렉 가이드(1415)와 결합될 수 있다.
동작 가이드 커넥터(1414)의 상부에는 렉 가이드(1415)가 결합되어 있으며, 수직 고정 가이드(1411)가 수직 동작 가이드(1413)를 상부로 이동시키고, 수직 동작 가이드(1413)가 렉 가이드(1415)를 상부로 이동시키는 경우, 렉 가이드(1415)는 샘플 준비 장치(1100)의 내부로 이동된다.
다른 구현예에서, 동작 가이드 커넥터(1414)는 렉 가이드(1415)와 결합될 수 있다.
수직 고정 가이드(1411)가 고정 가이드 커넥터(1412)를 상부로 이동시키면, 수직 동작 가이드(1413) 및 동작 가이드 커넥터(1414)의 움직임에 의해 렉 가이드(1415)가 샘플 준비 장치(1100)의 내부로 이동될 수 있다.
수직 동작 가이드(1413)는 렉 가이드(1415)를 상/하 방향으로 이동시키기 위해 구동 장치(1417) 또는 별도의 구동장치(미도시)에서 제공되는 동력을 사용한다.
렉 가이드(1415)는 동작 가이드 커넥터(1414)에 결합되며, 반응 용기(1500)를 거치할 수 있는 반응 용기 렉(1416)이 상부에 위치할 수 있다.
반응 용기 렉(1416)은 샘플 준비 장치(1100) 내에서 분석 샘플이 수용된 반응 용기(1500)가 위치하는 공간이다. 반응 용기 렉(1416)은 거치대의 다른 표현으로는 받침대(pedestal), 크래들(cradle), 홀더(holder) 등의 이름으로 사용될 수 있다.
반응 용기 렉(1416)은 렉 가이드(1415)와 함께 동작 가이드 커넥터(1414)의 움직임에 의해 샘플 준비 장치(1100)의 내부로 이동되고, 반응 용기(1500)를 수신할 수 있다.
렉 가이드(1415)는 상부에 연결된 반응 용기 렉(1416)의 수평 방향으로의 연장 이동(extension movement)을 수행한다.
승강 모듈(1410)의 수직 고정 가이드(1411)는 구동 장치(1417)에서 제공되는 동력을 사용하여 고정 가이드 커넥터(1412)를 상/하 방향으로 이동시킨다. 고정 가이드 커넥터(1412)의 일부는 수직 고정 가이드(1411)에 결합되어 있으며, 다른 일부는 수직 동작 가이드(1413)에 결합되어 있다.
수직 동작 가이드(1413)는 결합된 고정 가이드 커넥터(1412)의 상부 이동에 따라 샘플 준비 장치(1100)의 내부로 이동할 수 있다. 또한, 수직 동작 가이드(1413)은 타측에 결합된 동작 가이드 커넥터(1414)를 상/하 방향으로 이동시킬 수 있다. 수직 동작 가이드(1413)의 동작에 의해 상측으로 이동하는 동작 가이드 커넥터(1414)는 상부에 연결된 렉 가이드(1415)를 샘플 준비 장치(1100)의 내부로 이동시킬 수 있다.
렉 가이드(1415)가 샘플 준비 장치(1100)의 내부로 이동되면, 렉 가이드(1415)는 상부에 위치한 반응 용기 렉(1416)을 소정 거리 수평 연장 이동시킬 수 있다.
샘플 준비 장치(1100)에 구비되는 이송 모듈(미도시)은 준비된 반응 용기(1500)를 집어 올려 이동시키고, 수평 연장 이동된 반응 용기 렉(1416)의 상부에 내려 놓음으로써, 반응 용기(1500)가 폐쇄 구조물(1300)로 이동될 수 있도록 한다.
렉 가이드(1415)는 반응 용기 렉(1416)의 상부에 반응 용기(1500)가 장착되는 경우, 수평 연장 이동된 반응 용기 렉(1416)을 다시 원래의 위치로 수평 이동시킨다.
수직 고정 가이드(1411) 및/또는 수직 동작 가이드(1413)는 반응 용기(1500)가 폐쇄 구조물(1300)로 이동될 준비가 완료된 경우, 결합된 고정 가이드 커넥터(1412) 및/또는 동작 가이드 커넥터(1414)를 하부로 이동시킨다. 반응 용기(1500)는 폐쇄 구조물(1300)의 내부로 이동된다.
반응 용기 렉(1416)은 상부에 장착되는 반응 용기(1500)에 대응하는 결합 가이드(미도시)를 포함한다. 결합 가이드는 반응 용기(1500)가 이동 중에서 반응 용기 렉(1416)으로부터 이탈되지 않도록 한다.
일 구현예에서, 구동 장치(1417)는 반응 용기 렉(1416)의 수평 이동을 위한 동력을 제공할 수 있다.
다른 구현예에서, 반응 용기 렉(1416)의 수평 이동을 위해서 렉 가이드(1415)는 다른 구동 장치의 동력을 제공받을 수 있다.
구동 장치(1417)는 폐쇄 구조물(1300) 내의 승강 모듈(1410)을 움직이는 동력을 제공할 수 있다. 구동 장치(1417)는 하나 이상으로 구비되며, 하나 이상의 장소에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 구동 장치(1417)는 유압 모터를 사용할 수 있다. 다른 구현예에서, 구동 장치(1417)는 전기 모터를 사용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 구동 장치(1417)는 유압 모터와 전기 모터를 혼용하여 사용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 구동 장치(1417)는 유압 모터 및 전기 모터를 제외한 동력을 생성할 수 있는 장치를 사용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 구동 장치(1417)는 유압 모터, 전기 모터 및 동력을 생성할 수 있는 장치를 사용할 수 있다.
구동 장치(1417)는 하나 이상으로 구비되며, 폐쇄 구조물(1300) 내의 승강 모듈(1410), 크레인 모듈(1430) 및/또는 반응 용기 렉(1416) 중 적어도 어느 하나 이상에 동력을 제공할 수 있다.
크레인 모듈(1430)은 승강 모듈(1410)이 샘플 준비 장치(1100)로부터 수신한 반응 용기(1500)를 폐쇄 구조물(1300)의 각 구성요소로 이동하기 위한 동작을 수행한다.
일 구현예에서, 크레인 모듈(1430)은 폐쇄 구조물(1300) 내의 상부에 수평 고정 가이드, 수평 동작 가이드, 그리퍼 리프트, 그리퍼 회전 모듈 및 그리퍼를 포함하며, 각각의 가이드 및 그리퍼 회전 모듈(gripper rotation module)에 의해 그리퍼는 X, Y, Z 축 방향으로 이동 및 회전 이동을 할 수 있다. 다른 구현예에서, 크레인 모듈(1430)은 폐쇄 구조물(1300) 내의 상부에 수평 고정 가이드(horizontal fixed guide), 고정 가이드 커넥터(guide connector), 수평 동작 가이드(horizontal motion guide), 그리퍼 리프트(gripper lift), 그리퍼 이동 가이드(gripper motion guide) 및 그리퍼(gripper)를 포함하며, 각각의 가이드 및 그리퍼 리프트에 의해 그리퍼는 X, Y, Z 축으로 이동할 수 있다.
수평 고정 가이드는 고정 가이드 커넥터에 의해 수평 동작 가이드와 결합되어 있다.
수평 고정 가이드는 하나 이상의 이동 가능한 레일 형태로 제공될 수 있다. 수평 동작 가이드는 레일 형태의 수평 고정 가이드와 고정 가이드 커넥터를 통해 결합되어 X 축 방향으로 이동된다.
수평 고정 가이드는 수평 동작 가이드를 안정적으로 이동시키기 위해 두 개의 레일 형태로 구비되며, 수평 동작 가이드는 두 개의 레일에 연결되어 X 축 방향으로 이동될 수 있다. 수평 고정 가이드의 두 개의 레일 중에서 어느 하나의 레일은 결합된 수평 동작 가이드를 X 축 방향으로 이동시킬 수 있다.
일 구현예에서, 수평 고정 가이드가 수평 동작 가이드를 이동시키는 동력은 구동 장치(1417)에서 제공할 수 있다. 다른 구현예에서, 수평 고정 가이드가 수평 동작 가이드를 이동시키는 동력은 별도로 구비되는 구동 장치(미도시)에서 제공될 수 있다.
수평 동작 가이드는 그리퍼 리프트와 결합되어 있다.
수평 동작 가이드는 레일 형태로 구비된다. 그리퍼 리프트는 레일 형태의 수평 동작 가이드에 결합되어 Y 축 방향으로 이동된다. 레일 형태의 움직임을 제공하는 수평 동작 가이드는 결합된 그리퍼 리프트를 Y 축 방향으로 이동시킬 수 있다.
일 구현예에서, 수평 동작 가이드가 그리퍼 리프트를 이동시키는 동력은 구동 장치에서 제공할 수 있다.
다른 구현예에서, 수평 동작 가이드가 그리퍼 리프트를 이동시키는 동력은 별도로 구비되는 구동 장치(미도시)에서 제공될 수 있다.
그리퍼 리프트는 그리퍼 이동 가이드(gripper motion guide)에 연결되어 그리퍼와 결합되어 있다. 그리퍼 이동 가이드는 상/하 방향으로 이동되는 그리퍼 리프트에 결합되어 Z 축 방향으로 이동된다. 그리퍼 리스트는 결합된 그리퍼를 Z 축 방향으로 이동시킬 수 있다.
그리퍼 리프트은 두 가지 모듈이 결합된 형태이다.
하나는 수평 동작 가이드에 결합되어, Y 축으로 이동되는 고정 모듈이다. 다른 하나는 그리퍼 이동 가이드와 결합되어, 그리퍼를 상/하 방향으로 이동시키는 이동 모듈이다. 그리퍼 이동 가이드는 그리퍼가 결합되어 있으며, 그리퍼 리프트의 상/하 방향으로 제공되는 움직임에 의해 그리퍼가 Z 축 방향으로 이동된다.
그리퍼는 그리퍼 리프트의 동작에 의해 반응 용기(1500)의 위치까지 이동되어 반응 용기(1500)를 집어 올릴 수 있다. 그리퍼는 압력 센서 등을 이용하여 반응 용기(1500)를 집는 압력을 감지하여, 반응 용기(1500)가 파손되지 않도록 용기를 잡을 수 있다.
일 구현예에서, 그리퍼는 집어 올린 반응 용기(1500)를 회전시킬 수 있다.
그리퍼 리프트에 결합된 그리퍼 이동 가이드는 그리퍼 및 그리퍼 회전 모듈과 결합되어 있다. 그리퍼 회전 모듈은 그리퍼를 회전 이동시킬 수 있다. 그리퍼 회전 모듈은 회전 모터로 이루어진다.
일 구현예에서, 그리퍼 회전 모듈은 그리퍼를 90도의 회전각으로 회전시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 그리퍼 회전 모듈은 모든 회전각으로 그리퍼를 회전시킬 수 있다.
승강 모듈(1410) 및/또는 크레인 모듈(1430)에서 사용되는 하나 이상의 구동 장치는 다양한 구동력을 사용하여 동작될 수 있다.
일 구현예에서, 구동 장치 중 적어도 어느 하나 이상은 유압 모터를 사용할 수 있다. 다른 구현예에서, 구동 장치 중 적어도 어느 이상은 전기 모터를 사용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 구동 장치 중 적어도 어느 하나 이상은 유압 모터와 전기 모터를 혼용하여 사용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 구동 장치 중 적어도 어느 하나 이상은 유압 모터 및 전기 모터를 제외한 동력을 생성할 수 있는 장치를 사용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 구동 장치 중 적어도 어느 하나 이상은 유압 모터, 전기 모터 및 동력을 생성할 수 있는 장치를 사용할 수 있다.
크레인 모듈(1430)은 반응 용기(1500)를 이동시키기 위하여 그리퍼를 승강 모듈(1410)의 반응 용기 렉(1416)의 상부 위치까지 이동시킬 수 있다. 크레인 모듈(1430)은 반응 용기 렉(1416)의 상부에 위치한 그리퍼를 내려 보낸 후 반응 용기(1500)를 집어 올릴 수 있다.
일 구현예에서, 크레인 모듈(1430)이 그리퍼를 반응 용기 렉(1416)의 상부로 이동시키는 동작은 미리 저장된 위치 좌표에 의해 이동한다.
일체형 시스템(1000)은 크레인 모듈(1430)이 폐쇄 구조물(1300) 내에서 이동할 수 있는 모든 위치를 좌표 정보로 저장한다. 크레인 모듈(1430)은 이동될 위치의 좌표 정보에 따라 이동을 수행할 수 있다.
다른 구현예에서, 크레인 모듈(1430)이 그리퍼를 반응 용기 렉(1416)의 상부로 이동시키는 동작은 미리 저장된 위치 좌표에 의해 이동하고, 추가로 폐쇄 구조물(1300) 내에 구비되는 위치 센서 모듈(미도시)에 의해 정위치에 정지할 수 있도록 한다. 위치 센서 모듈은 광 신호를 기반으로 그리퍼와 반응 용기 렉(1416)이 상호 신호를 송수신하여 정해진 위치에 그리퍼가 멈출 수 있도록 한다.
위치 센서 모듈은 그리퍼가 반응 용기(1500)를 이동시키는 구성요소인 반응 용기 렉(1416), 자동 용기 실러(1700), 샘플 분석 장치(1200-a, 1200-b), 반응 용기 회수함 또는 컨베이어(1350) 등에 구비될 수 있다.
폐쇄 구조물(1300) 내에 포함되는 반응 용기 이송 장치(1400) 중에서 승강 모듈(1410)과 크레인 모듈(1430)은 반응 용기(1500)를 이동하기 위한 동력을 제공받는다.
승강 모듈(1410)은 수직 고정 가이드(1411), 수직 동작 가이드(1413) 및/또는 렉 가이드(1415)에서 동력을 제공받는다.
크레인 모듈(1430)은 수평 고정 가이드, 수평 동작 가이드, 그리퍼 리프트 및/또는 그리퍼에서 동력을 제공받는다.
승강 모듈(1410) 및 크레인 모듈(1430)에서 동력을 제공받는 각 구성요소들은 다음의 구동 방식을 통해 동작을 수행할 수 있다.
일 구현예에서, 승강 모듈(1410) 및/또는 크레인 모듈(1430)은 벨트 방식(belt type)의 움직임을 제공하여 반응 용기(1500)를 이동시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 승강 모듈(1410) 및/또는 크레인 모듈(1430)은 체인 방식(chain type)의 움직임을 제공하여 반응 용기(1500)를 이동시킬 수 있다. 또 다른 구현예에서, 승강 모듈(1410) 및/또는 크레인 모듈(1430)은 스크류 방식(screw type) 또는 잭-스크류 방식(jackscrew type)의 움직임을 제공하여 반응 용기(1500)를 이동시킬 수 있다. 또 다른 구현예에서, 승강 모듈(1410) 및/또는 크레인 모듈(1430)은 실린더 방식(cylinder type)의 움직임을 제공하여 반응 용기(1500)를 이동시킬 수 있다. 또 다른 구현예에서, 승강 모듈(1410) 및/또는 크레인 모듈(1430)은 호이스트 방식(hoist type)의 움직임을 제공하여 반응 용기(1500)를 이동시킬 수 있다. 또 다른 구현예에서, 승강 모듈(1410) 및/또는 크레인 모듈(1430)은 상기에 기재된 방식 이외의 구동 방식을 통해 반응 용기(1500)를 이동시킬 수 있다.
크레인 모듈(1430)은 반응 용기 렉(1416)에서 집어 올린 반응 용기(1500)가 자동 용기 실러(1700)에 장착되도록 이동시킬 수 있다. 자동 용기 실러(1700)은 반응 용기(1500)의 상부면을 자동으로 실링하기 위한 장치이다.
자동 용기 실러(automated container sealer, 1700)는 분석 샘플이 수용된 반응 용기(1500)의 주입구를 실링(sealing)할 수 있으며, 다음과 같이 구현될 수 있다.
일 구현예에서, 반응 용기(1500)는 멀티 웰 플레이트이며, 하부가 폐쇄된 복수의 웰이 형성된 멀티 웰 플레이트 각각에 분석 샘플이 수용된다.
자동 용기 실러(1700)는 멀티 웰 플레이트인 반응 용기(1500)의 상부면을 실링(sealing)하여 분석 샘플의 혼합 및 외부로부터의 오염을 방지할 수 있다.
다른 구현예에서, 반응 용기(1500)는 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 삽입되는 튜브 형태의 용기이다. 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 복수개로 연결된 또는 개별적으로 분리된 튜브들이 삽입될 수 있다.
자동 용기 실러(1700)는 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 삽입되는 하나 이상의 반응 용기(1500)의 상부면을 실링하여 분석 샘플의 혼합 및 외부로부터의 오염을 방지할 수 있다.
자동 용기 실러(1700)는 투명 필름을 사용하여 반응 용기(1500)의 주입구를 열 접착할 수 있다. 또는 접착제에 의한 접착을 할 수 있다.
일 구현예에서, 자동 용기 실러(1700)는 Hamilton사의 Plate Sealer 제품을 사용할 수 있다(https://www.hamiltoncompany.com/automated-liquid-handling/small-devices/hamilton-plate-sealer 참조).
자동 용기 실러(1700)는 폐쇄 구조물(1300) 내에서 다양하게 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 자동 용기 실러(1700)는 제1 샘플 분석 장치(1220-a) 및 제2 샘플 분석 장치(1220-b)의 사이에 위치할 수 있다.
자동 용기 실러(1700)가 제1 샘플 분석 장치(1220-a) 및 제2 샘플 분석 장치(1220-b)의 사이에 위치하는 경우, 반응 용기(1500)는 90도 수평 회전하여 자동 용기 실러(1700)에 장착될 수 있다.
반응 용기(1500)의 90도 수평 회전은 그리퍼 회전 모듈에 의해 수행될 수 있다.
크레인 모듈(1430)은 반응 용기(1500)를 자동 용기 실러(1700)에 장착하기 위해, 그리퍼 회전 모듈을 이용하여 반응 용기(1500)를 90도 수평 회전시킨다.
다른 구현예에서, 자동 용기 실러(1700)는 폐쇄 구조물(1300)의 내측 다른 장소에 위치하도록 구현될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 자동 용기 실러(1700)는 샘플 준비 장치(1100)에 위치하도록 구현될 수 있다.
크레인 모듈(1430)은 자동 용기 실러(1700)에서 실링된 반응 용기(1500)를 복수의 샘플 분석 장치(1220-a, 1220-b) 중 어느 하나에 장착되도록 이동시킬 수 있다. 샘플 분석 장치(1220-a, 1220-b)는 반응 용기(1500) 내에 수용된 하나 이상의 분석 샘플을 자동으로 분석하기 위한 장치이다.
일 구현예에 따른 샘플 분석 장치(1200)는 stand-alone 장치이다. 즉, 샘플 분석 장치(1200)는 분석 샘플의 분석을 위해 단독으로 설치되어 동작될 수 있다.
샘플 분석 장치(1200)는 반응 용기(1500) 내에 수용된 하나 이상의 분석 샘플을 자동으로 분석하기 위한 장치이다.
일 구현예에 따라, 샘플 분석 장치(1200)는 샘플 준비 장치(1100) 및/또는 폐쇄 구조물(1300)과 작동적으로 연결되어 일체형 시스템(1100)으로 사용될 수 있다.
샘플 분석 장치(1200)는 핵산을 증폭하기 위한 핵산 증폭기(nucleic acid amplifier) 및/또는 증폭된 핵산을 검출하기 위한 광학 모듈(optical module)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 샘플 분석 장치(1200)는 핵산 증폭기 및 광학 모듈을 포함한다.
다른 구현예에서, 샘플 분석 장치(1200)는 핵산 증폭기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 샘플 분석 장치(1200)는 광학 모듈을 포함한다.
일 구현예에서, 하나의 샘플 분석 장치(1200)가 작동적으로 연결되어 일체형 시스템(1000)에 적용될 수 있다. 다른 구현예에서, 복수의 샘플 분석 장치(1200)가 작동적으로 연결되어 일체형 시스템(1000)에 적용될 수 있다.
샘플 분석 장치(1200)에는 샘플 준비 장치(1100)에서 준비된 분석 샘플을 수용하는 반응 용기(1500)가 장착될 수 있다.
일 구현예에서, 샘플 분석 장치(1200)는 자동 용기 실러(1700)에 의해 상면이 실링된 반응 용기(1500)가 장착될 수 있다. 이를 위해 반응 용기(1500)는 샘플 준비 장치(1100)에서 자동 용기 실러(1700)로 이동되어, 상부면의 실링이 완료된 이후, 샘플 분석 장치(1200)에 장착될 수 있다.
샘플 분석 장치(1200)에는 반응 용기(1500)가 수용되는 샘플 홀더(sample holder)가 구비된다.
샘플 분석 장치(1200)는 샘플 홀더 및 샘플 홀더에 수용되는 반응 용기(1500)를 보호하기 위한 덮개가 구비될 수 있다. 일 구현예에서, 샘플 분석 장치(1200)는 반응 용기(1500)를 수용하기 이전에 덮개가 개방된다. 다른 구현예에서, 샘플 분석 장치(1200)는 반응 용기(1500)가 수용된 이후에 덮개가 닫힌다.
샘플 분석 장치(1200)가 stand-alone 장치로 동작되는 경우에 덮개는 사용자의 명령 입력에 의해 개방되거나 닫힐 수 있다.
일체형 시스템(1000)으로 작동적으로 연결되는 경우, 샘플 분석 장치(1200)는 일체형 시스템(1000)의 제어 모듈에 의해 덮개가 개방되거나, 닫힐 수 있다.
일 구현예에서, 반응 용기(1500)는 분석하고자 하는 복수의 분석 샘플을 복수의 웰 각각에 포함하는 증폭용 멀티 웰 플레이트의 형태로 구비될 수 있다. 이 경우, 샘플 홀더는 하나의 증폭용 멀티 웰 플레이트를 수용할 수 있다. 웰 플레이트는 n X m 개(n 및 m은 2 이상의 자연수)의 웰들을 포함한다. 본 개시내용에서 웰 플레이트는 8 X 12의 96웰을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 반응 용기는 독립된 반응 용기가 하나 이상 구비될 수 있다. 이 경우, 샘플 홀더는 각각의 반응 용기를 하나 이상 수용할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 반응 용기는 둘 이상의 샘플 용기가 연결된 스트립 튜브의 형태로 구비될 수 있다. 이 경우, 샘플 홀더는 스트립 튜브 형태의 반응 용기를 하나 이상 수용할 수 있다.
일 구현예에서, 자동 용기 실러(1700)에서 실링된 반응 용기(1500)를 수신하는 샘플 분석 장치(1200)는 폐쇄 구조물(1300) 내에 적어도 하나 이상으로 구비될 수 있다. 즉, 도 4를 참조하면, 폐쇄 구조물(1300)의 내부에는 두 개의 샘플 분석 장치(1200-a, 1200-b)가 구비될 수 있다.
일 구현예에서, 폐쇄 구조물(1300) 내에 샘플 분석 장치가 두 개로 구성된 경우, 샘플 준비 장치(1100)는 분석을 위한 분석 샘플을 순차적으로 준비한다. 샘플 준비 장치(1100)에서 제1 반응 용기가 준비되는 경우, 폐쇄 구조물(1300) 내의 어느 하나의 샘플 분석 장치가 제1 반응 용기의 분석을 수행하도록 제1 반응 용기를 이동시킨다.
샘플 준비 장치(1100)에서 제2 반응 용기가 준비되는 경우, 폐쇄 구조물(1300) 내의 다른 하나의 샘플 분석 장치가 제2 반응 용기의 분석을 수행하도록 제2 반응 용기를 이동시킨다.
다른 구현예에서, 폐쇄 구조물(1300) 내에 샘플 분석 장치가 두 개로 구성된 경우, 샘플 준비 장치(1100)는 분석을 위한 분석 샘플을 동시 또는 순차적으로 준비한다. 샘플 준비 장치(1100)에서 제1 반응 용기와 제2 반응 용기가 준비된 경우, 각각의 반응 용기(1500)를 순차적으로 폐쇄 구조물(1300)로 이동하되, 제1 반응 용기가 어느 하나의 샘플 분석 장치(1200-a)에 장착되면, 제2 반응 용기가 다른 하나의 샘플 분석 장치(1200-b)에 장착된다.
도 5는 일 구현예에 따른 stand-alone 샘플 준비 장치를 나타내는 사시도이다. 도 5에 도시된 바와 같이, 샘플 준비 장치(1100)는 stand-alone 장치이다. 즉, 샘플 준비 장치(1100)는 분석 샘플의 준비를 위해 단독으로 설치되어 동작될 수 있다.
일 구현예에 따라, 샘플 준비 장치(1100)는 샘플 분석 장치(1200) 및/또는 폐쇄 구조물(1300)과 작동적으로 연결되어 일체형 시스템(1000)으로 사용될 수 있다.
샘플 준비 장치(1100)는 분석물로부터 핵산을 추출하는 핵산 추출 모듈(nucleic acid extraction module) 및/또는 액체 분주 모듈(liquid handling module)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 샘플 준비 장치(1100)는 핵산 추출 모듈 및 액체 분주 모듈을 포함한다.
다른 구현예에서, 샘플 준비 장치(1100)는 핵산 추출 모듈을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 샘플 준비 장치(1100)는 액체 분주 모듈을 포함한다.
본 개시내용에서 stand-alone 샘플 준비 장치(1100)에 포함되는 핵산 추출 모듈 및/또는 액체 분주 모듈은 변형되지 않고 일체형 시스템(1000)에 작동적으로 연결될 수 있다.
또한, stand-alone 샘플 준비 장치(1100)가 일체형 시스템(1000)에 작동적으로 연결되는 경우, 샘플 준비 장치(1100)는 기 사용하던 튜브 형태의 시약 용기를 사용할 수 있다.
일 구현예에서, 샘플 준비 장치(1100)가 일체형 시스템(1000)으로 사용되는 경우, 샘플 준비 장치(1100)에 형성된 제1 개구부(1130)는 반응 용기 이송 장치(1400)에 의해 반응 용기(1500)가 이송되는 확정 통로(defined passage)로 사용될 수 있다.
도 5에 도시된 바와 같이, 제1 개구부(1130)는 샘플 준비 장치(1100)의 저면에 형성되어 있으나, 샘플 준비 장치(1100)의 종류에 따라 제1 개구부(1130)는 측면(전/후/좌/우 포함)에 형성되거나, 상부면에 기 형성되어 있을 수 있다.
다른 구현예에서, 샘플 준비 장치(1100)가 일체형 시스템(1000)으로 사용되는 경우, 샘플 준비 장치(1100)는 반응 용기 이송 장치(1400)에 의해 반응 용기가 이송될 수 있는 확정 통로인 제1 개구부(1130)를 형성할 수 있다.
샘플 준비 장치(1100)의 제1 개구부는 상부면, 저면 또는 측면(전/후/좌/우 포함) 중 어느 하나에 형성될 수 있다.
제1 개구부(1130)는 반응 용기(1500)와 반응 용기를 이송하는 반응 용기 이송 장치(1400)가 이동될 수 있는 크기로 형성되어 있다.
일 구현예에서, 일체형 시스템(1000)에 사용되는 샘플 분석 장치(1200)가 하나로 구비되는 경우, 샘플 준비 장치(1100)는 분석 샘플의 준비를 하나씩 순차적으로 준비하여 샘플 분석 장치(1200)에서 분석이 완료된 이후, 준비된 분석 샘플을 제공할 수 있다.
다른 구현예에서, 일체형 시스템(1000)에 사용되는 샘플 분석 장치(1200)가 복수로 구비되는 경우, 샘플 준비 장치(1100)는 각각의 샘플 분석 장치에 제공할 각각의 분석 샘플을 순차적으로 준비하고, 준비된 분석 샘플을 어느 하나의 샘플 분석 장치에 제공한다. 이후, 샘플 준비 장치에서 준비되는 다음의 분석 샘플은 다른 하나의 샘플 분석 장치에 제공할 수 있다.
다른 구현예에서, 일체형 시스템(1000)에 사용되는 샘플 분석 장치(1200)가 복수로 구비되는 경우, 샘플 준비 장치(1100)는 각각의 샘플 분석 장치에 제공할 각각의 분석 샘플을 샘플 분석 장치의 수와 같거나 이보다 적게 준비한다. 이후, 준비된 복수의 분석 샘플을 대응하는 각각의 샘플 분석 장치에 제공할 수 있다.
샘플 준비 장치(1100)는 분석 샘플을 준비하기 위한 다양한 종류의 기구 및 용기를 거치할 수 있는 덱(deck, 1110)을 포함한다. 덱(1110)은 샘플 준비 장치(1100)에 포함되는 구성요소들이 장착 및 고정될 수 있는 형태로 이루어진다.
일 구현예에서, 덱(1110)은 가이드를 제공하며, 가이드는 샘플 준비 장치(1100)의 구성요소들이 슬라이딩 방식으로 샘플 준비 장치(1100)의 내부로 삽입되어 덱(1110)의 상부에 위치하도록 한다.
가이드는 덱(1110)의 일 구현예이며, 다른 구현예의 형태로 제공될 수 있다.
일 구현예에서, 덱(1110) 상에 위치한 하나 이상의 구성요소는 각각의 구성요소의 하부에 형성된 돌기 및/또는 홈 등에 의해 샘플 준비 장치(1100)의 동작 중에 고정될 수 있다.
샘플 준비 장치(1100)에는 덱(1110)에서 연장되는 평면의 로딩 트레이(loading tray, 1120)가 포함될 수 있다. 로딩 트레이(1120)는 샘플 준비 장치(1100)에 장착되는 구성요소들이 용이하게 샘플 준비 장치(1100)의 내부로 이동될 수 있도록 덱(1110)과 연장되어 설치된다. 로딩 트레이(1120)는 덱(1110)의 가이드와 연장 또는 연결되는 가이드가 형성되어 있다. 덱(1110)의 가이드와 로딩 트레이(1120)의 가이드에 의해 샘플 준비 장치(1100)에 장착되는 구성요소들이 용이하게 이동되어 장착될 수 있다.
일 구현예에서, 샘플 준비 장치(1100)는 액체의 분주를 위한 피펫 암(pipette arms)과 피펫 암에 연결된 하나 이상의 피펫팅 채널(pipetting channel)을 포함하는 피펫 모듈(pipette module, 미도시)이 구비된다. 피펫 모듈은 샘플 준비 장치(1100) 내부의 상부 측에 구성된다.
또한, 샘플 준비 장치(1100)에서 반응 용기를 포함하여, 샘플 준비를 위해 사용되는 다양한 용기 등을 이송하기 위한 이송 모듈(transport module, 미도시)이 샘플 준비 장치(1100) 내부의 일측에 구성된다.
다른 구현예에서, 이송 모듈은 피펫 모듈과 함께 샘플 준비 장치(1100) 내부의 상부 측에 구성된다.
또 다른 구현예에서, 이송 모듈은 피펫 모듈의 피펫팅 채널과 피펫팅 채널에 결합되는 그리퍼(gripper, 미도시)에 의해 구현된다.
샘플 준비 장치(1100)의 덱(1110)에 위치하는 각 구성요소는 분석 샘플의 준비를 위해 정해진 위치에 배치되어 있다.
덱(1110)은 제1 개구부(1130)가 형성된다. 제1 개구부(1130)는 샘플 준비 장치(1100)에서 준비된 반응 용기(1500)를 수신하기 위한 반응 용기 이송 장치(1400)가 이동되는 공간이다. 제1 개구부(1300)는 반응 용기 이송 장치(1400)가 반응 용기(1500)를 수신하여 이동될 수 있는 크기로 형성된다.
일 구현예에서, 덱(1110)에 위치하는 각 구성요소는 다음과 같이 설명될 수 있다. 다음에서 설명되는 구성요소들은 일반적으로 샘플 준비 장치(1100)에 포함되어 분석 샘플을 준비하기 위해 사용되고 있으나, 개별적으로 동작되는 stand-alone 장치의 종류에 따라 어느 하나 이상의 구성요소가 포함되지 않을 수도 있다. 또는 별도의 장치로 사용될 수 있다.
샘플 준비 장치(1100)의 모든 구성요소는 통합된 장치로서 설계된다. 샘플 준비 장치(1100)는 검체의 핵산을 추출하는 핵산 추출 모듈과 증폭 반응 셋업(예를 들어, PCR 셋업)을 위한 다양한 구성요소를 포함한다.
일 구현예에 따른 샘플 준비 장치(1100)의 내부는 피펫 팁 어댑터(pipette tip adapter), 용기 캐리어(container carrier), 핵산 추출 모듈(nucleic acid extraction module), 멀티 웰 플레이트 어댑터(multi-well plate adapter), 스캐너(scanner), 회수 용액 주입구(waste liquid inlet), 이송 모듈(transfer module) 및 피펫 모듈(pipette moduel) 등을 포함할 수 있다.
피펫 팁 어댑터는 피펫팅 채널에 결합되는 하나 이상의 피펫 팁을 수용한다. 피펫 팁은 피펫팅 채널에 결합되어 용기에 수용된 검체 또는 시약 등의 용액을 흡입(aspirate) 및 분주(dispense)할 수 있다.
피펫 팁 어댑터에 수용되는 하나 이상의 피펫 팁은 용기의 크기, 분주되는 용액의 양(volume) 등의 준비 작업 환경에 따라 크기 및 분주량이 서로 다른 종류로 구비될 수 있다.
일 구현예에서, 샘플 준비 장치의 피펫 팁 어댑터는 1㎖, 500㎕, 300㎕, 250㎕, 200㎕, 150㎕, 100㎕ 및/또는 50㎕ 등의 다양한 용량의 팁을 수용할 수 있도록 복수 개로 구비될 수 있다. 또한, 다양한 용량의 팁 중 어느 하나 이상의 팁은 피어싱 팁(piercing tip)일 수 있다.
각각의 피펫 팁 어댑터는 하나 이상의 피펫 팁을 수용할 수 있으며, 피펫 모듈이 피펫팅 채널을 피펫 팁 어댑터의 상부에 위치시킨 후, 피펫 팁 방향으로 이동시켜서 피펫팅 채널이 피펫 팁을 결합할 수 있도록 한다.
피펫 팁 어댑터의 개수 및 피펫 팁 어댑터에 수용되는 피펫 팁의 각 용량 및 크기 등은 본 개시내용의 다양한 실시예에 따라 변형 또는 변경되어 사용할 수 있다.
용기 캐리어는 샘플 준비 장치에서 사용되는 다양한 종류의 용액을 수용하는 다양한 용기를 포함하고 있다. 샘플 준비 장치는 핵산 추출 모듈을 이용하여 추출된 핵산을 포함하는 분석 샘플을 제조할 수 있다. 샘플 준비 장치의 동작에는 다양한 종류의 용기가 사용되는데, 용기 캐리어는 그 중에서 웰 플레이트를 제외한 용기들이 삽입될 수 있다.
용기 캐리어는 삽입되는 용기의 용량 및/또는 크기에 따라 각각의 용기가 용이하게 삽입 및 고정될 수 있도록 다양한 형태로 구비될 수 있다.
일 구현예에서, 삽입되는 용기는 검체를 수용하는 용기, 추출 시약이 수용된 용기 및 반응 시약을 수용하는 용기 등을 포함한다. 용기 캐리어는 용기를 일렬 또는 병렬로 삽입할 수 있다.
멀티 웰 플레이트 어댑터는 검출이 수행될 검체를 수용하는 반응 용기가 위치할 수 있는 구조물이며, 반응 용기는 샘플 분석 장치의 샘플 홀더에 장착될 수 있다.
멀티 웰 플레이트 어댑터는 반응 용기(멀티 웰 플레이트)를 적재할 수 있으며, 검출을 위한 검체는 멀티 웰 플레이트 어댑터에 위치하는 반응 용기(멀티 웰 플레이트)에 분주될 수 있다. 멀티 웰 플레이트 어댑터는 샘플 준비 장치에 사용되는 멀티 웰 플레이트가 2개 이상 적재될 수 있다. 일 구현예에서 용어 "멀티 웰 플레이트"는 반응 용기 어댑터로 사용될 수 있다.
이때, 멀티 웰 플레이트 어댑터에 구비된 복수의 멀티 웰 플레이트 중 어느 하나는 출발 위치로 이동되어, 분석 샘플을 준비하기 위한 작업에 사용될 수 있다. 멀티 웰 플레이트는 이송 모듈에 의해 출발 위치로 이동된다.
고정 프레임에는 다양한 용기가 직접 또는 어댑터 등을 통해 장착될 수 있다. 용기는 분석 샘플 또는 추출 시약 등을 수용할 수 있다. 용기는 캡(cap)이 장착되어 있으며, 캡은 피펫 팁에 의해 관통가능한 것(pierceable cap)일 수 있다. 캡의 관통되는 부분은 고무, 실리콘, 플라스틱 등의 소재로 제작될 수 있다.
피펫 팁은 하강 동작에 의해 캡의 상부를 천공하고, 용액의 흡입 또는 분주를 수행한 후 다시 상부로 이동한다. 피펫 팁이 용기로부터 상부로 이동할 때, 캡의 천공된 부분에 삽입된 피펫 팁에 의해 용기가 함께 상부로 함께 들어올려질 수 있기 때문에 용기가 고정되어야 할 필요가 있다. 고정 프레임은 관통가능한 캡을 사용하는 용기가 피펫 팁에 의해 움직이지 않도록 용기를 고정할 수 있다.
제1 개구부(1130)는 반응 용기 이송 장치(1400)가 반응 용기(1500)를 수신하기 위해 샘플 준비 장치(1100)로 이동되는 확정 통로이다.
일 구현예에서, 제1 개구부(1130)는 비어 있는 공간이다. 반응 용기 이송 모듈(1400)은 샘플 준비 장치(1100)의 하부에서 샘플 준비 장치(1100)의 내부로 이동된다. 따라서, 비어 있는 공간인 제1 개구부(1130)는 샘플 준비 장치(1100)의 하부면인 덱(1110)에 형성되어 있거나, 형성되는 것이 바람직하다.
다른 구현예에서, 제1 개구부(1130)는 개폐 모듈(open/close module, 미도시)을 포함한다. 개폐 모듈은 제1 개구부(1130)인 반응 용기 이송 장치(1400)가 진입하는 개방된 공간을 차단하기 위해 구비된다. 반응 용기 이송 장치(1400)는 샘플 준비 장치(1100)에서 준비된 반응 용기를 수신하기 위해 샘플 준비 장치(1100)로 이동된다. 샘플 준비 장치(1100)는 반응 용기 이송 장치(1400)가 이동하지 않는 시간에 개방된 공간을 폐쇄하기 위한 개폐 모듈을 이용하여 제1 개구부(1130)를 차단할 수 있다.
폐기물부는 회수 용액 주입구(waste liquid inlet) 및/또는 피펫 팁 회수부(waste pipette tip collecting unit)를 포함한다. 회수 용액 주입구는 분석 샘플의 준비를 위해 사용된 용액이 폐기되도록 수거될 수 있으며, 피펫 팁 회수부는 분석 샘플의 준비를 위해 사용된 피펫 팁이 폐기되도록 수거될 수 있다.
일 구현예에서, 회수 용액 주입구는 별도로 위치하는 용액 회수함(liquid waste collection bin, 미도시)과 연결된다. 샘플 준비 장치(1100)의 폐기 용액은 회수 용액 주입구를 통해 용액 회수함에 수용될 수 있도록 이동된다.
또한, 피펫 팁 회수부를 통해 수거되는 피펫 팁은 폐기물 컨테이너로 이동되어 보관될 수 있다. 일 구현예에서, 폐기물 컨테이너는 샘플 준비 장치(1100)의 덱(1110)에 위치할 수 있다. 다른 구현예에서, 폐기물 컨테이너는 샘플 준비 장치(1100)의 저면에 위치할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 폐기물 컨테이너는 샘플 준비 장치(1100)의 외부에 위치할 수 있다.
폐기물 컨테이너가 덱(1110)에 위치하는 경우, 폐기물 컨테이너는 분석 샘플이 준비되는 영역과 파티션 등으로 분리될 수 있다.
이송 모듈은 샘플 준비 장치(1100) 내에서 반응 용기 등을 이동시키기 위한 집게(gripper) 형태의 기계 장치이다. 이송 모듈은 샘플 준비 장치(1100)의 제어 기기에 의해 동작된다.
일 구현예에서, 이송 모듈은 샘플 준비 장치(1100)의 내측 후면에 위치한다. 이송 모듈은 반응 용기 등을 상하, 좌우, 전후 및 회전 이동시킬 수 있도록 구성된다.
다른 구현예에서, 이송 모듈은 샘플 준비 장치(1100)의 내측 상부에 위치한다. 이송 모듈은 피펫 모듈과 같은 동작 형태를 통해 반응 용기 등을 상하, 좌우, 전후 및 회전 이동시킬 수 있도록 구성된다.
또 다른 구현예에서, 이송 모듈은 피펫 모듈의 피펫팅 채널 중 적어도 2개의 피펫팅 채널에 결합되는 그리퍼를 이용하여 반응 용기 등을 상하, 좌우, 전후 및 회전 이동시킬 수 있도록 구성된다.
이송 모듈은 반응 용기, 시약 용기, 어댑터, 카트리지, 멀티 웰 플레이트 등의 분석 샘플의 준비에 필요한 구성요소를 샘플 준비 장치(1100) 내에서 이동시킬 수 있다.
일 구현예에서, 이송 모듈은 분석 샘플의 셋업이 완료된 반응 용기를 반응 용기 이송 장치(1400)로 이동시킬 수 있다. 반응 용기 이송 장치(1400)는 준비가 완료된 반응 용기를 수신하기 위해 샘플 준비 장치(1100)의 제1 개구부(1130)를 통해 이동된다. 이송 모듈은 반응 용기 이송 장치(1400)에 반응 용기를 이동시키며, 반응 용기 이송 장치(1400)는 제1 개구부(1130)를 통해 샘플 준비 장치(1100)의 외부로 반응 용기를 이동시킬 수 있다.
스캐너는 검체, 시약, 반응액 등에 표시되는 식별 코드(identifying code)를 확인(reading)할 수 있다. 식별 코드는 바코드(barcode), 매트릭스 코드(matrix code) 등의 정보를 포함하는 표시이다. 스캐너는 식별 코드를 인식하여 용기에 수용된 용액의 종류 및 용액의 용량 등의 정보를 제공받을 수 있다.
일 구현예에서, 스캐너는 복수개로 구비될 수 있으며 필요에 따라 어느 하나의 스캐너로 구성될 수 있다. 또한, 스캐너는 바코드 스캐너 및/또는 2D 스캐너로 구성될 수 있다. 이러한 구성은 반응 용기 등에 표기된 서로 다른 종류의 식별 코드를 인식할 수 있도록 구비되는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 스캐너는 1D 및/또는 2D 바코드를 인식할 수 있다. 스캐너는 용기의 측면에 인쇄 또는 부착된 식별 코드를 인식하여 용기에 수용된 용액의 종류 및/또는 용액의 용량 등의 정보를 수득할 수 있다. 용기는 샘플 준비 장치에서 사용되는 반응 용기, 시약 용기, 검체 용기 등을 포함한다. 스캐너는 덱(1110)에 삽입되는 용기의 식별 코드를 인식할 수 있다. 스캐너는 덱(1110)에 삽입되는 적어도 하나 이상의 용기 식별 코드를 순차적으로 인식할 수 있다. 스캐너는 용기 또는 용기를 수용한 캐리어가 덱(1110)에 결합되는 위치까지 이동하여 용기 측면의 식별 코드를 인식할 수 있다.
다른 구현예에서, 스캐너는 2D 바코드 스캐너(미도시)이다. 매트릭스(2차원) 코드를 인식할 수 있으며, 용기의 저면에 인쇄 또는 부착된 식별 코드를 인식할 수 있다. 용기는 반응 용기, 시약 용기, 검체 용기 등의 샘플 준비 장치에서 사용되는 용기를 포함한다.
이에 따라, 각각의 웰에서 저면의 전부 또는 일부에 개구부를 가지도록 형성된 플레이트가 스캐너에 장착되면, 스캐너는 플레이트에 삽입된 용기의 저면에 인쇄 또는 부착된 식별코드를 인식할 수 있다. 스캐너는 플레이트에 복수 개로 삽입된 용기의 코드를 한 번에 인식할 수 있다.
일 구현예에서, 스캐너에서 용기가 장착되는 평면은 투명한 소재로 되어 있다. 스캐너는 투명한 소재를 투과하는 광신호 등을 이용하여 용기 저면의 식별 코드를 인식할 수 있다. 또한, 스캐너는 용기의 하부를 촬영함에 따라 용기의 식별 코드를 인식할 수 있다. 스캐너는 멀티 웰 플레이트에 삽입된 용기의 저면에 위치한 식별 코드를 인식할 수 있도록 멀티 웰 플레이트가 거치될 수 있는 형태이다.
일 구현예에 따른 2D 스캐너는 Hamilton사의 "easyCode Carrier" 제품을 사용할 수 있다(https://www.hamiltoncompany.com/automated-liquid-handling/small-devices/easycode-carrier 참조).
피펫 모듈은 도면에 도시되지 않았으나, 샘플 준비 장치(1100)의 내측 상부에 위치한다. 용액 분획기인 피펫 모듈(pipette module)은 피펫 암(pipette arm)과 피펫팅 채널(pipetting channel)을 포함하며, 피펫팅 채널은 제어 기기에 의해 자동으로 상하, 좌우, 전후로 이동할 수 있다.
피펫 암은 독립적으로 또는 종속적으로 이동하는 피펫팅 채널을 하나 이상 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 피펫팅 채널의 말단에는 피펫 팁(pipette tip) 또는 니들(needle)이 결합되어 용액의 흡입(aspirate) 및 분주(dispense)에 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 피펫팅 채널의 말단에는 그리퍼(gripper)가 결합될 수 있으며, 그리퍼에 의해 반응 용기 등의 샘플 준비 장치(1100)에서 사용되는 용기(반응 용기 포함) 등을 이동시킬 수 있는 이송 모듈로 사용될 수 있다.
피펫 암은 하나 이상 포함된 피펫팅 채널을 분획용 피펫 팁(pipette tip)으로 이동하는 행위, 피펫팅 채널에 분획용 피펫 팁을 고정시키는 행위, 피펫팅 채널이 고정된 피펫 팁을 일정한 장소로 이동시키는 행위, 일정한 깊이로 분획용 피펫 팁을 용기에 삽입하는 행위 등을 수행할 수 있다.
피펫 암은 샘플 준비 장치(1100) 내측 상부에 위치하고, 피펫팅 채널은 피펫 암에 의해 샘플 준비 장치(1100) 내에서 동작된다. 하나 이상의 피펫팅 채널은 피펫 팁 어댑터에 삽입된 피펫 팁을 피펫팅 채널의 단부에 결합한다.
피펫 암은 피펫팅 채널이 분주하고자 하는 용액이 수용된 용기의 상부에 위치하도록 이동시킬 수 있다. 피펫팅 채널은 이동된 위치에서 용기 방향으로 하강하여 피펫 팁에 용액을 수용시키고, 다시 상승하도록 위치한다. 피펫팅 채널은 피펫 암에 의해 분주될 다른 용기의 상부로 이동하고, 하강하여 피펫 팁에 수용된 용액을 분주한 이후 다시 상승함으로써 분주를 종료할 수 있다.
복수의 피펫팅 채널은 동시에 동작될 수 있으며, 피펫팅 채널의 개수에 따라 동시에 분주할 수 있는 용기의 개수가 결정될 수 있다.
피펫 암과 피펫팅 채널은 분주가 완료된 이후, 단부에 결합된 피펫 팁을 제거할 수 있다. 결합된 피펫 팁은 폐기물부에 위치하는 피펫 팁 회수부에서 제거되고, 폐기물 컨테이너에 폐기될 수 있다.
일 구현예에서, 샘플 준비 장치(1100), 샘플 분석 장치(1200) 및/또는 반응 용기 이송 장치(1400) 중 적어도 어느 하나 이상의 장치가 폐쇄 구조물(1300)과 작동적으로 연결되기 위해서는 각각의 장치가 정확하게 위치하여야 한다. 이를 위해 폐쇄 구조물(1300)과 각 장치에는 위치 결정 수단을 포함하고 있다.
샘플 준비 장치(1100), 샘플 분석 장치(1200) 및/또는 반응 용기 이송 장치(1400)는 외부 변형이 이루어지지 않도록 하여 폐쇄 구조물(1300)과 결합되어야 하기 때문에 각각의 장치들의 위치 결정 수단은 각 장치에 기 형성된 구성요소를 사용하는 것이 바람직하다.
샘플 준비 장치(1100), 샘플 분석 장치(1200) 및/또는 반응 용기 이송 장치(1400) 중 적어도 어느 하나 이상은 공간적으로 폐쇄되어 있으며, 공간적으로 폐쇄하기 위한 구성으로 폐쇄 구조물(1300)이 사용되고 있다.
샘플 준비 장치(1100), 샘플 분석 장치(1200) 및/또는 반응 용기 이송 장치(1400) 중 적어도 어느 하나 이상을 작동적으로 연결하기 위해서 폐쇄 구조물(1300) 내부에 적어도 어느 하나 이상이 위치되도록 구성된다.
샘플 분석 장치(1200-a, 1200-b)는 폐쇄 구조물(1300)에 위치할 수 있다. 이때, 샘플 분석 장치(1200-a, 1200-b)에는 폐쇄 구조물(1300)의 외부에 위치하는 샘플 준비 장치(1100)에서 분석 샘플이 수용된 반응 용기(1500)가 반응 용기 이송 장치(1400)를 통해 이동될 수 있다.
특히, 샘플 분석 장치(1200-a, 1200-b)에는 반응 용기 이송 장치(1400) 중에서 크레인 모듈(1430)이 반응 용기(1500)를 제공한다. 크레인 모듈(1430)은 로봇 모듈로 지정된 위치로 이동하여 반응 용기(1500)를 들어올리고, 지정된 장소에 반응 용기(1500)를 내려 놓을 수 있다.
만약, 샘플 분석 장치(1200-a, 1200-b)의 위치가 정해진 위치에서 조금이라도 벗어나는 경우에는 반응 용기(1500)가 정확한 위치에 놓일 수 없기 때문에 적절한 분석이 진행될 수 없다. 따라서, 샘플 분석 장치(1200-a, 1200-b)는 폐쇄 구조물(1300) 내에서 정해진 위치에 정확하게 위치 또는 결합되어야 한다. 이를 위해 폐쇄 구조물(1300)은 위치 결정(positioning) 수단을 제공하고 있다.
위치 결정 수단은 샘플 분석 장치(1200)와 폐쇄 구조물(1300)에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 샘플 분석 장치(1200)의 제1 위치 결정 수단은 하부에 위치하는 고정 수단이 될 수 있다. 또한, 폐쇄 구조물(1300)의 제2 위치 결정 수단은 샘플 분석 장치(1200)가 위치되는 장소에 형성된 구조물일 수 있다.
제1 위치 결정 수단과 제2 위치 결정 수단은 상호 결합될 수 있는 형상으로 이루어질 수 있다.
일 구현예에 따라, 제1 위치 결정 수단과 제2 위치 결정 수단은 상호 별도의 체결 수단가 없더라도, 샘플 분석 장치(1200)는 폐쇄 구조물(1300)의 정확한 위치에 고정될 수 있다.
다른 구현예에 따라, 제1 위치 결정 수단과 제2 위치 결정 수단은 상호 체결 수단(미도시)를 구비하여 샘플 분석 장치(1200)가 폐쇄 구조물(1300)의 정확한 위치에 고정되는 경우, 체결 수단으로 각각의 위치 결정 수단들을 체결할 수 있다.
상기에서 샘플 분석 장치(1200)와 폐쇄 구조물(1300) 사이의 위치 결정 수단에 대해 설명하였으나, 일 구현예에 따른 반응 용기 이송 장치(1400), 자동 용기 실러(1700) 등의 폐쇄 구조물(1300)의 내부에 위치하는 각각의 장치에서도 폐쇄 구조물과 매칭하는 위치 결정 수단이 형성되어 있는 것이 바람직하다.
일체형 시스템은 샘플 준비 장치, 샘플 분석 장치 및/또는 반응 용기 이송 장치 중 적어도 하나의 장치를 공간적으로 폐쇄되는 페쇄 구조물 내부에 위치시킬 수 있다.
일 구현예와 같이, 일체형 시스템은 샘플 분석 장치를 폐쇄 구조물의 내부에 구비하고, 샘플 준비 장치를 폐쇄 구조물의 상부에 위치하도록 구성한다.
일체형 시스템은 제어 모듈(control module)을 포함한다. 제어 모듈은 샘플 준비 장치가 분석 샘플(analysis sample)을 준비하도록 제어한다. 제어 모듈은 폐쇄 구조물이 준비된 분석 샘플을 분석하도록 제어한다.
일체형 시스템의 제어 모듈이 샘플 준비 장치 및 폐쇄 구조물을 제어하여 분석 샘플의 준비 및 분석을 수행하는 방법은 다음과 같다.
제어 모듈은 샘플 준비 장치 내에 구비된 반응 용기에 분석 샘플(analysis sample)이 준비되도록 샘플 준비 장치를 제어한다.
샘플 준비 장치는 분석 샘플이 준비될 수 있도록 검체, 핵산 추출 시약, 증폭 반응 시약 등의 용액이 준비되어 있으며, 내부의 구성요소를 이용하여 분석 샘플을 준비한다.
샘플 준비 장치는 검체(specimen) 및 시약(reagent) 중 적어도 어느 하나 이상의 분주를 수행하여 상기 분석 샘플을 제조하는 과정; 상기 분석 샘플을 상기 반응 용기에 수용시키는 과정; 또는 병원체를 포함할 것으로 예상되는 상기 검체로부터 핵산을 추출하는 과정 중 적어도 어느 하나 이상의 준비를 수행할 수 있다.
제어 모듈은 샘플 준비 장치에서 준비된 반응 용기가 폐쇄 구조물로 이동되도록 폐쇄 구조물 내의 승강 모듈을 제어한다.
상기 단계에서, 승강 모듈은 폐쇄 구조물에 형성된 제2 개구부 및 샘플 준비 장치의 덱에 형성된 제1 개구부 통해 샘플 준비 장치의 내부로 이동한다. 샘플 준비 장치는 이동된 승강 모듈에 반응 용기를 장착한다.
제어 모듈은 승강 모듈에 반응 용기가 장착되면, 승강 모듈이 폐쇄 구조물로 이동하도록 제어한다.
제1 개구부는 반응 용기가 이송될 수 있는 확정 통로(defined passage)이다.
일 구현예에서, 폐쇄 구조물은 분석 샘플을 분석하기 위한 샘플 분석 장치를 복수 개로 구비할 수 있다.
제어 모듈은 복수 개로 구비되는 샘플 분석 장치를 이용하여 분석할 분석 샘플을 동시 또는 순차적으로 준비될 수 있도록 샘플 준비 장치를 제어한다.
제어 모듈은 샘플 준비 장치에서 동시 또는 순차적으로 준비되는 분석 샘플을 수용하는 반응 용기를 승강 모듈이 폐쇄 구조물로 이동할 수 있도록 승강 모듈을 제어한다.
상기 단계에서, 승강 모듈이 반응 용기를 수신하기 위해 샘플 준비 장치로 이동된 경우, 제어 모듈은 승강 모듈은 반응 용기를 용이하게 수신하도록 수평 방향으로 연장 이동(extension movement)하도록 승강 모듈을 제어한다.
제어 모듈은 폐쇄 구조물로 이동된 반응 용기가 분석이 수행되는 위치로 이동되도록 크레인 모듈을 제어한다.
크레인 모듈은 폐쇄 구조물에 이동된 반응 용기를 상하/좌우/전후 방향으로 이동시키기 위한 이동 동작을 수행할 수 있다. 크레인 모듈은 반응 용기를 수평 회전시키기 위한 회전 동작을 수행할 수 있다.
일 구현예에서, 자동 용기 실러는 폐쇄 구조물 내에 포함된다.
폐쇄 구조물 내에 자동 용기 실러가 구비되는 경우, 제어 모듈은 샘플 준비 장치에서 이동된 반응 용기를 자동 용기 실러에 이동되도록 크레인 모듈을 제어한다. 자동 용기 실러는 반응 용기의 상면을 실링할 수 있다.
제어 모듈은 자동 용기 실러에서 실링된 반응 용기가 분석 샘플의 분석이 수행되는 위치로 이동되도록 크레인 모듈을 제어한다. 분석이 수행되는 위치는 샘플 분석 장치이다.
다른 구현예에서, 자동 용기 실러는 샘플 준비 장치 내에 포함될 수 있다.
샘플 준비 장치 내에 자동 용기 실러가 구비되는 경우, 제어 모듈은 샘플 준비 장치에서 준비가 완료된 반응 용기를 자동 용기 실러에 이동한다. 제어 모듈은 이동된 반응 용기의 상면이 실링되도록 자동 용기 실러를 제어한다.
샘플 준비 장치 내에 자동 용기 실러가 구비되는 경우, 승강 모듈은 실링이 완료된 반응 용기를 수신할 수 있다.
일 구현예에서, 샘플 분석 장치가 복수 개로 구비되고, 샘플 준비 장치에서 복수 개의 반응 용기가 순차적으로 수신된 경우, 제어 모듈은 순차적으로 이동되는 분석샘플 용기를 각각 샘플 분석 장치에 이동되도록 크레인 모듈을 제어한다.
제어 모듈은 폐쇄 구조물 내의 반응 용기에 수용된 분석 샘플이 분석되도록 폐쇄 구조물을 제어한다.
상기 단계에서, 반응 용기는 크레인 모듈에 의해 샘플 분석 장치로 이동될 수 있다. 샘플 분석 장치는 이동된 반응 용기의 분석 샘플을 분석하고 결과를 생성한다.
상기 단계에서, 제어 모듈이 분석 샘플의 분석이 수행되도록 폐쇄 구조물을 제어하는 폐쇄 구조물은 샘플 분석 장치(sample analysis device)이다.
샘플 분석 장치는 등온 증폭, 특히 LAMP를 수행하는 과정; 또는 반응 결과에 대한 분석을 수행하는 과정 중 적어도 어느 하나 이상을 수행할 수 있다.
샘플 분석 장치는 분석이 수행되는 위치에 구비된다.
샘플 분석 장치는 써멀 사이클러(thermal cycler) 및 광학 모듈(optics module)을 포함한다. 샘플 분석 장치에서 중합효소 연쇄 반응을 수행하는 과정은 써멀 사이클러를 이용하며, 반응 결과를 측정하기 위한 과정은 광학 모듈을 이용한다.
샘플 분석 장치는 분석 샘플의 분석을 위해 덮개(cover)가 구비될 수 있다. 제어 모듈은 반응 용기가 이동될 샘플 분석 장치의 덮개가 개방(open)되도록 샘플 분석 장치에 제어 신호를 제공할 수 있다. 이후, 크레인 모듈이 샘플 분석 장치에 반응 용기를 제공한 경우, 제어 모듈은 샘플 분석 장치의 덮개가 닫힐(close) 수 있는 제어 신호를 제공할 수 있다.
제어 모듈은 분석이 완료된 반응 용기를 분석이 수행되는 위치에서 제거되도록 크레인 모듈을 제어한다.
상기 단계에서, 제어 모듈은 분석이 완료된 반응 용기가 반응 용기 회수함으로 이동될 수 있도록 크레인 모듈을 제어한다.
일 양태에 따르면, 본 발명은 메모리, 상기 메모리에 엑세스 하도록 구성된 적어도 하나 이상의 프로세서 및 상기 메모리에 저장되고 상기 프로세서에 의해 실행되도록 구성된 하나 이상의 프로그램 코드는, 자동화 분자진단 시스템이 프로세서에 의해 실행될 때, 샘플 준비 장치, 샘플 분석 장치, 반응 용기 이송 장치 및 폐쇄 구조물을 포함하며, 상기 샘플 준비 장치 및 상기 폐쇄 구조물이 작동적으로 연결되기 위한 각각의 개구부를 포함하되, 상기 폐쇄 구조물에 위치하는 승강 모듈이 상기 개구부를 통해 상기 샘플 준비 장치로 이동하여 반응 용기(reaction vessel)를 샘플 분석 장치로 이동될 수 있도록 하는 시스템은 제어 모듈로 하여금, 제어 모듈이, 분석 샘플이 수용된 반응 용기가 샘플 준비 장치에서 샘플 분석 장치로 이송되도록 반응 용기 이송 장치를 제어하는 단계; 상기 샘플 준비 장치 및 상기 샘플 분석 장치는 stand-alone 장치이며; 상기 제어 모듈이, 상기 분석 샘플의 분석이 완료된 상기 반응 용기가 상기 샘플 분석 장치에서 제거되도록 상기 반응 용기 이송 장치를 제어하는 단계를 포함하되, 상기 샘플 분석 장치 및/또는 상기 반응 용기 이송 장치 중 적어도 하나의 장치는 공간적으로 폐쇄(enclosed)되는 폐쇄 구조물(enclosure)의 내부에 위치하며, 상기 샘플 준비 장치 및 상기 폐쇄 구조물은 상기 반응 용기가 이송되는 확정 통로(defined passage)가 형성되며, 상기 반응 용기 이송 장치는 상기 확정 통로를 이용하여 상기 반응 용기를 이송시키는 것을 수행하도록 하는 명령어를 포함한다.
상기 본 발명의 일 양태에 기재되는 각 구성요소는 전술한 내용과 중복되므로 그 기재를 생략한다.
일 양태에 따르면, 본 발명은 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 하나 이상의 프로세서에 의해 수행되는 명령어들을 저장하는 비 일시적 컴퓨터 판독 가능 저장매체에 있어서, 상기 명령어들은 샘플 준비 장치, 샘플 분석 장치, 반응 용기 이송 장치 및 폐쇄 구조물을 포함하며, 상기 샘플 준비 장치 및 폐쇄 구조물이 작동적으로 연결되기 위한 각각의 개구부를 포함하되, 상기 폐쇄 구조물에 위치하는 승강 모듈이 상기 개구부를 통해 상기 샘플 준비 장치로 이동하여 반응 용기(reaction vessel)를 상기 샘플 분석 장치로 이동될 수 있도록 하는 일체형 시스템이 상기 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 자동화 분자진단 시스템의 제어 모듈로 하여금, 제어 모듈이, 분석 샘플이 수용된 반응 용기가 샘플 준비 장치에서 샘플 분석 장치로 이송되도록 반응 용기 이송 장치를 제어하는 단계; 상기 샘플 준비 장치 및 상기 샘플 분석 장치는 stand-alone 장치이며; 상기 제어 모듈이, 상기 분석 샘플의 분석이 완료된 상기 반응 용기가 상기 샘플 분석 장치에서 제거되도록 상기 반응 용기 이송 장치를 제어하는 단계를 포함하되, 상기 샘플 분석 장치 및/또는 상기 반응 용기 이송 장치 중 적어도 하나의 장치는 공간적으로 폐쇄(enclosed)되는 폐쇄 구조물(enclosure)의 내부에 위치하며, 상기 샘플 준비 장치 및 상기 폐쇄 구조물은 상기 반응 용기가 이송되는 확정 통로(defined passage)가 형성되며, 상기 반응 용기 이송 장치는 상기 확정 통로를 이용하여 상기 반응 용기를 이송시키는 것을 수행하도록 한다.
상기 본 발명의 일 양태에 기재되는 각 구성요소는 전술한 내용과 중복되므로 그 기재를 생략한다.
단계 (b): 샘플 준비 장치에서 샘플 준비를 완료
본 개시의 단계 (b)는 샘플 준비 장치에서, (b-1) 상기 단계 (a)에서 장착된 샘플을 직접 용해 버퍼와 혼합하고, (b-2) 상기 혼합물을 15℃ 내지 35℃에서 3분 내지 5분간 인큐베이션하여 용해물을 수득한 다음, (b-3) 상기 수득한 용해물을 등온 증폭 시약과 혼합하여 샘플 준비를 완료한다.
단계 (b)는 단계 (a)에서 상술한 상기 자동화 분자진단 시스템에 의해 수행된다. 따라서, 단계 (a) 및 단계 (b) 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 개시내용에 따르면, 상기 샘플 준비 장치는 샘플, 직접 용해 버퍼 및 등온 증폭 시약을 반응 용기에 수용시키기 위한 액체 분주 모듈(liquid handling module)을 포함한다.
본 개시에 따른 방법은 샘플을 직접 용해 버퍼와 혼합한 다음, 별도의 핵산을 정제하는 단계 없이, 3분 내지 5분간 인큐베이션하고 등온 증폭 반응을 바로 수행할 수 있어, 샘플로부터 핵산을 추출하고 정제하는 단계가 필요한 종래 등온 증폭 반응에 비해 신속하다는 장점이 있다.
(b-1) 샘플과 직접 용해 버퍼와의 혼합
샘플은 직접 용해 버퍼와 혼합된다.
본원에서 사용되는 용어 "직접 용해 버퍼(direct lysis buffer)"는 핵산을 포함하고 있는 다양한 샘플로부터 바로 핵산이 추출될 수 있도록 작용하거나 그러한 활성을 갖는 조성물을 의미한다. 구체적으로, 대상체로부터 추출된 샘플이 상기 직접 용해 버퍼와 접촉되면, 샘플 내에 존재하는 유기체, 예컨대, 동물이나 식물의 세포, 효모, 박테리아, 바이러스 등의 병원체의 조직이 파괴됨으로써 그 내부에 포함되어 있는 타겟 핵산이 용출된 용해물이 생성될 수 있다.
본 발명의 하나의 특징은 샘플로부터 복잡한 핵산 추출 및 정제 과정을 수행하지 않고 직접 용해 버퍼를 사용하여 간단하게 핵산 증폭 반응을 수행할 수 있을 정도의 핵산을 수득하는 것이다.
종래의 핵산 추출 방법은 유기체의 용해(Lysis), 핵산의 기질에의 결합(binding), 핵산의 세척(wash), 핵산의 정제(Purification) 및 용리(Elution)를 필요로 한다. 구체적으로, 상기 종래의 핵산 추출 방법에 따르면, 채취한 샘플을 용해 버퍼에서 인큐베이션하여 세포벽 및 세포막 등을 파괴함으로써 핵산을 노출시킨 후, 노출된 핵산을 멤브레인이나 비드 등 특정 구조물에 결합시킨다. 이후, 단계별 버퍼를 이용하여 구조물로부터 핵산을 분리함으로써 순수한 핵산을 수득한다. 이와 같이, 종래의 핵산 추출 방법은 각 단계별 장치, 시약 및 도구가 필요하고, 샘플을 이동하면서 각 과정을 실시함에 따라 많은 시간과 비용이 소모된다. 예를 들어, 기존의 PCR 분자진단의 경우 핵산 추출 및 핵산 증폭을 위한 모듈이 각각 구비되어 있으며, 핵산 추출을 위한 시약 및 피펫 등의 도구가 추가로 필요하다.
이러한 종래의 방법으로 핵산을 추출하는 경우, 고순도의 핵산을 추출하는 것이 가능하지만, 추출하는 과정에 오랜 시간이 소요되고 절차가 다소 복잡하여, 긴급한 상황이나 대규모 진단이 필요한 상황에서 적합하지 못한 실정이다.
이에 반해, 본 개시내용에 따른 방법에서 사용되는 직접 용해 버퍼는 수송 배지를 버리거나 다른 버퍼로 교환할 필요 없이 샘플 내의 세포로부터 핵산의 직접 추출을 가능하게 한다. 따라서, 복잡한 핵산 정제 과정을 거치지 않고도 샘플을 바로 핵산 증폭 단계에 투입될 수 있게 함으로써 시간과 비용을 절감할 수 있게 한다.
본 개시내용의 단계(b-1)에서 샘플과 혼합되는 직접 용해 버퍼는 종래 공지된 버퍼일 수 있으며, 이는 상업적으로 이용가능한 버퍼거나 in-house에서 제조된 버퍼일 수 있다.
일 구현예에서, 직접 용해 버퍼는 버퍼 성분 및 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.
상기 버퍼 성분의 예는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(줄여서 트리스) 및 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄의 산 염(예컨대, Tris-HCl)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 비이온성 계면활성제의 예는 폴리에틸렌 글리콜 기반 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 옥틸페닐 에테르(Triton x-100로서 상업적으로 이용가능함)를 포함한다. 적합한 비이온성 계면활성제의 추가적인 예는 폴리소르베이트 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트(폴리소르베이트 20 또는 Tween® 20으로서 상업적으로 이용가능함)를 포함한다.
상업적으로 이용가능한 직접 용해 버퍼는 Swab:Direct™ Extraction Kit(Cat. No. 9799140107; Genesystem), KGIC™ DRX solution(Cat. No. KGIC DRX02-15ML; KGIC), Asan Easy Test COVID-19 Ag에 포함된 버퍼(Asan pharm. Co. Ltd), STANDARD Q COVID-19 AG test에 포함된 버퍼(SD Biosensor), CellAmp Direct Lysis set (Cat. No. 3738A), Luna Cell Ready Lysis Module(Cat. No. E3032S; NEB), XpressAmp Direct Amplification Reagent(Cat. No. A8882; Promega) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 직접 용해 버퍼는 0.1~1.5 %(v/v)의 Triton X-100을 포함하는, pH 6.0~7.0의 30~500 mM Tris일 수 있고, 구체적으로, 0.8~1.2 %(v/v)의 Triton X-100을 포함하는, pH 6.5의 300~500 mM Tris일 수 있으며, 더욱 구체적으로, 1 %(v/v)의 Triton X-100을 포함하는, pH 6.5의 400 mM Tris일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
다른 구현예에서, 상기 직접 용해 버퍼는 우레아(urea); 1가 양이온을 포함하는 제1염; 2가 양이온을 포함하는 제2염; 및 포스페이트계 버퍼를 포함할 수 있으며, 상기 제1염은 LiCl, NaCl, KCl, Kl, NaBr, NaNO3, KNO3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 상기 제2염은 MgCl2, CaCl2, NiCl2, CaCO3, MgBr2, CaSO4, MgSO4 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 상기 포스페이트계 버퍼는 포스페이트 버퍼, PBS(phosphate buffered saline), DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline), NaH2 PO4, Na2HPO4, KH2PO4, K2HPO4, K3PO4 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단계 (b-1)에서, 상기 단계 (a)에서 장착된 샘플(수송 배지 포함)과 상기 직접 용해 버퍼는 각각 2 ㎕ 내지 1,000㎕, 2 ㎕ 내지 900㎕, 2 ㎕ 내지 800㎕, 2 ㎕ 내지 700㎕, 2 ㎕ 내지 600㎕, 2 ㎕ 내지 500㎕, 2 ㎕ 내지 400㎕, 2 ㎕ 내지 300㎕, 2 ㎕ 내지 200㎕, 2 ㎕ 내지 100㎕가, 2 ㎕ 내지 50㎕가 서로 혼합될 수 있고, 구체적으로 5 ㎕ 내지 300㎕, 5㎕ 내지 200㎕ 또는 5㎕ 내지 100㎕가 서로 혼합될 수 있으며, 보다 구체적으로, 20 ㎕ 내지 300㎕, 20㎕ 내지 200㎕ 또는 20㎕ 내지 100㎕가 서로 혼합될 수 있으며, 보다 더 구체적으로, 30㎕ 내지 70㎕가 서로 혼합될 수 있다. 일 특정 구현예에서, 상기 샘플의 양은 50 ㎕이고, 상기 직접 용해 버퍼의 양은 50 ㎕이다.
일 구현예에서, 상기 단계 (b-1)에서의 샘플과 직접 용해 버퍼의 혼합은 이하 설명할 단계 (b-3)에서의 반응 용기와 별개의 용기에서 수행된다.
상기 단계 (b-1)에서 사용되는 용기는 단계 (b-3)에서의 반응 용기와 동일한 종류이거나 상이한 종류일 수 있다. 상기 단계 (b-1)에서 사용되는 용기가 단계 (b-3)에서의 반응 용기와 동일하거나 상이한 종류라는 것은 상기 단계 (b-1)에서 사용되는 용기가 상기 단계 (b-3)에서의 반응 용기와 비교하여 동일하거나 상이한 개수 및 배치의 웰을 갖는다는 것을 의미한다.
상기 단계 (b-1)에서 사용되는 용기는 분석하고자 하는 복수의 샘플 및 직접 용해 버퍼를 수용할 수 있는 복수의 웰을 갖는 웰 플레이트의 형태로 구비될 수 있다. 상기 웰 플레이트는 n X m 개(n 및 m은 2 이상의 자연수)의 웰들을 포함한다. 웰 플레이트는 n X m 개의 웰들이 행, 열로 배열된 직사각형 형태일 수 있다. 예를 들어, 4 X 4의 16웰들을 나타낸다.
웰 플레이트의 다양한 예시는 다음과 같다.
웰 플레이트는 2 X 2의 4웰, 3 X 3의 9웰, 4 X 4의 16웰, 5 X 5의 25웰, 6 X 6의 36웰, 7 X 7의 49웰, 또는 8 X 8의 64웰 등을 포함할 수 있다. 또한, 웰 플레이트는 2 X 4의 8웰, 3 X 6의 18웰, 4 X 8의 32웰, 5 X 10의 50웰, 6 X 12의 72웰, 7 X 14의 98웰, 또는 8 X 16의 128웰 등을 포함할 수 있다. 또한, 웰 플레이트는 2 X 6의 12웰, 3 X 9의 27웰, 4 X 12의 48웰, 5 X 15의 75웰, 6 X 18의 108웰, 7 X 21의 147웰, 또는 8 X 24의 192웰 등을 포함할 수 있다. 또한, 웰 플레이트는 2 X 8의 16웰, 3 X 12의 36웰, 4 X 16의 64웰, 5 X 20의 100웰, 6 X 24의 144웰, 7 X 28의 196웰, 또는 8 X 32의 256웰 등을 포함할 수 있다. 또한, 웰 플레이트는 8 X 12의 96웰, 12 X 16의 192웰, 또는 16 X 24의 384웰 등을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 단계 (b-1)에서 사용되는 용기는 상기 단계 (b-3)에서 사용되는 용기와 비교하여 동일하거나 더 많은 웰을 갖는 플레이트일 수 있다. 일 예로서, 상기 단계 (b-3)에서 사용되는 용기가 96-웰 플레이트인 경우, 상기 단계 (b-1)에서 사용되는 용기는 96-웰 플레이트이거나 192-웰 플레이트 또는 384-웰 플레이트일 수 있다.
상기 단계 (b-1)에서의 혼합은 8 내지 96개의 피펫팅 채널을 갖는 액체 분주 모듈에 의해 수행된다.
(b-2) 혼합물의 인큐베이션
본 개시내용의 단계 (b-2)에서는 상기 혼합물을 15℃ 내지 35℃에서 3분 내지 5분간 인큐베이션하여 용해물을 수득한다.
상기 혼합물의 인큐베이션 온도는 당업자에 의한 용해물 수득 수율 등의 시험 결과에 따라 조정될 수 있으며, 15℃ 내지 35℃중 선택된 어느 하나의 온도, 15℃내지 25℃중 선택된 어느 하나의 온도, 15℃ 내지 20℃ 중 선택된 어느 하나의 온도, 20℃ 내지 30℃ 중 선택된 어느 하나의 온도, 또는 25℃ 내지 30℃ 중 선택된 어느 하나의 온도일 수 있거나, 구체적으로 실온일 수 있다.
상기 혼합물의 인큐베이션 시간은 당업자에 의한 용해물 수득 수율 등의 시험 결과에 따라 조정될 수 있으며, 3분 내지 5분 중 선택된 어느 하나의 시간일 수 있거나, 구체적으로 5분일 수 있다.
상기 단계 (b-2)의 인큐베이션 동안 샘플이 직접 용해 버퍼와 접촉되어 샘플 내에 포함된 유기체, 예컨대 병원체가 파괴됨으로써 타겟 핵산이 용출된 용해물이 생성된다.
일 구현예에서, 단계 (b-2)의 인큐베이션은 전술한 단계 (b-1)을 완료한 후에 수행될 수 있다. 예를 들어, 단계 (b-1)에서 샘플을 직접 용해 버퍼와 혼합한 후에, 단계 (b-2)에서 상기 혼합물을 인큐베이션할 수 있다.
다른 구현예에서, 단계 (b-2)의 인큐베이션은 전술한 단계 (b-1)의 과정 동안 및/또는 후술한 단계 (b-3)의 과정 동안에 수행될 수 있다. 이는 특히 샘플이 복수 개이고 피펫팅 채널의 개수가 샘플의 개수보다 적어서 한 번에 전체 샘플을 직접 용해 버퍼와 혼합할 수 없는 경우에 적용된다. 예를 들어, n개의 샘플 중, 1번째 샘플을 직접 용해 버퍼와 혼합한 후 2번째 내지 n번째 샘플을 직접 용해 버퍼와 혼합할 때까지 시간의 간격이 존재한다. 또한, n번째 샘플을 직접 용해 버퍼를 혼합한 후, 다음 단계인 단계 (b-3)에서 1 내지 n-1번째 샘플의 용해물을 등온 증폭 시약과 혼합할 때까지 시간의 간격이 존재한다. 이 시간의 간격이 본 개시내용의 단계 (b-2)에서 요구하는 3분 내지 5분에 해당하는 경우, 각 샘플은 상기 간격 동안 인큐베이션된 것으로 간주되어 별도의 인큐베이션을 두지 않을 수 있다. 예컨대, 1번째 샘플과 직접 용해 버퍼를 혼합한 다음, 1번째 샘플의 인큐베이션은 나머지 2 내지 n개의 샘플과 직접 용해 버퍼를 혼합하는데 소요되는 시간 동안 실시될 수 있고, n번째 샘플과 직접 용해 버퍼를 혼합한 다음, n번째 샘플의 인큐베이션은 다음 단계인 단계 (b-3)에서 1번째 내지 n-1번째 샘플의 용해물과 등온 증폭 시약과 혼합하는데 소요되는 시간 동안 실시될 수 있다.
(b-3) 용해물과 등온 증폭 시약의 혼합
본 개시내용의 단계 (b-3)에서는 상기 용해물을 반응 용기에서 등온 증폭 시약과 혼합하여 샘플 준비를 완료한다.
본 단계에서는 샘플로부터 수득된 용해물을 등온 증폭 시약과 혼합하여 등온 증폭 반응을 준비한다.
본 개시에 따른 방법은 다양한 등온증폭법에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, rolling circle amplication(RCA, M. M. Ali, F. Li, Z. Zhang, K. Zhang, D.-K. Kang, J. A. Ankrum, X. C. Le and W. Zhao, Chem. Soc. Rev., 2014, 43, 3324-3341.), loop-mediated isothermal amplication(LAMP, Y. Mori, H. Kanda and T. Notomi, J. Infect. Chemother., 2013, 19, 404-411), recombinase polymerase amplication(RPA, J. Li, J. Macdonald and F. von Stetten, Analyst, 2018, 144, 31-67), nucleic acid sequence based amplication(NASBA, A. Borst, J. Verhoef, E. Boel and A. C. Fluit, Clin. Lab., 2002, 48, 487-492), strand displacement amplication(SDA, B. J. Toley, I. Covelli, Y. Belousov, S. Ramachandran, E. Kline, N. Scarr, N. Vermeulen, W. Mahoney, B. R. Lutz and P. Yager, Analyst, 2015, 140, 7540-7549), helicase dependent amplication (HAD, M. Vincent, Y. Xu and H. Kong, EMBO Rep., 2004, 5, 795-800), transcriptionmediated amplication (TMA, L. Comanor, Am. J. Gastroenterol., 2001, 96, 2968-2972) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 상기 등온 증폭 반응은 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)일 수 있다.
본원에서는 상세한 설명의 전반에 걸쳐 등온 증폭 반응의 예로서 LAMP를 위주로 설명하나 당업자라면 LAMP 외에도 다양한 등온 증폭 반응이 적용될 수 있음을 인식할 것이다.
일 구현예에서, 타겟 핵산이 RNA인 경우, 상기 등온 증폭 반응은 역전사 반응 단계를 포함할 수 있다. 이의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 Noonan, K. F. 등, Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)에 개시되어 있다.
역전사 반응(Reverse Transcription)은 역전사 효소를 이용한 역전사 반응에 의해 RNA로부터 cDNA를 합성하는 반응이다.
본 명세서에서 용어 "역전사 효소"는 RNA-의존적 DNA 중합효소라고도 불리며, RNA를 주형으로 하여 상보적인 DNA를 합성하는 효소를 의미한다.
본 개시내용에서 역전사 효소는 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소를 사용할 수 있으며, 예를 들어, 조류 골수아세포증바이러스-유래 역전사 효소(Avian Myeloblastosis Virus-derived Reverse Transcriptase; AMV RTase), 쥐류 백혈병 바이러스-유래 역전사 효소(Murine Leukemia Virus-derived Reverse Transcriptase; MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사효소(Rous-Associated Virus 2 Reverse Transcriptase; RAV-2 RTase)를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
역전사 효소는 RNA 주형으로부터 cDNA를 합성하기 위하여 프라이머(primer)를 필요로 한다. 역전사 반응에서 사용되는 프라이머는 크게 세 종류의 프라이머가 있다: (i) mRNA의 poly A tail에 어닐링되어 3'-말단에서부터 cDNA를 합성하는 oligo dT 프라이머, (ii) 6~9 nt 크기의 무작위 뉴클레오타이드로 만들어져 RNA 모든 영역에서 합성을 시작는 랜덤 프라이머(random primer) 및 (iii) 타겟 cDNA만을 합성하는 타겟 특이적 프라이머(target specific primer)이다.
일 구현예에서, 상기 타겟 핵산 검출용 등온 증폭 시약은 역전사 반응용 시약을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 역전사 반응용 시약은 역전사 중합효소 및/또는 역전사 프라이머를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 역전사 프라이머는 올리고 dT-프라이머, 랜덤 프라이머 또는 타겟 특이적 프라이머일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 역전사 프라이머는 타겟 특이적 프라이머일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 타겟 특이적 프라이머는 역전사 반응에서 cDNA를 합성하는데 이용되고, 이어서 타겟 핵산 서열 증폭 반응에서 다른 프라이머와 프라이머 쌍 또는 프라이머 세트를 이루어 상기 수득된 cDNA의 증폭용 프라이머 쌍으로 이용될 수 있다.
본 개시에서, 상기 역전사 반응용 시약은 버퍼, dNTPs(deoxyribonucleotide triphosphates)와 같은 역전사 반응을 실시하는데 필요한 시약들을 선택적으로 포함할 수 있다. 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은 본 개시사항의 이점을 알고 있는 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 상기 역전사 반응용 조성물의 구성성분들은 개별 용기 내에 존재하거나 복수의 구성성분들이 하나의 용기 내에 존재할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 등온 증폭 반응은 RT-LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 등온 증폭 시약은 LAMP 시약일 수 있으며, 특정 구현예에 따르면, RT-LAMP 시약일 수 있다.
고리-매개 등온 증폭(Loop-Mediated Isothermal Amplification; LAMP)은 등온조건에서 높은 민감도와 특이성으로 타겟 핵산을 증폭할 수 있는 핵산 증폭 방법이다(Notomi, T. et al. 2000. Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic Acids Res 28, E63). LAMP 방법은 가닥 치환(strand displacement) 활성을 갖는 DNA 중합효소 및 타겟 핵산의 여러 부위에서 특이적으로 고안된 최소 4개 내지 6개의 프라이머 세트를 사용한다.
본원에서 사용된 용어 "프라이머"는 증폭 반응에 사용되는 단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드로 중합효소를 이용한 핵산 증폭 또는 합성 반응에서 그 3' 말단에 뉴클레오타이드가 공유결합에 의해 추가되어 연장되는 핵산 분자를 지칭한다.
LAMP 반응을 위해서는 필수적으로 4종의 프라이머(F3, B3, FIP, BIP)가 필요하며, 반응 속도를 향상시키기 위해 2종의 프라이머(LF, LB)를 추가적으로 사용할 수 있다. 도 11을 참조하여 설명하면, 상기 4종의 프라이머는 외부(outer) 프라이머 2종과 내부(inner) 프라이머 2종으로 구성되며, 외부 프라이머는 정방향 외부(forward outer, F3) 프라이머와 역방향 외부(backward outer, B3) 프라이머 2종으로 구성되고 반응의 비순환기(non-cyclic step) 동안 DNA 이중 가닥을 풀어주는 역할을 한다. 내부 프라이머는 정방향 내부 프라이머(forward inner primer, FIP)와 역방향 내부 프라이머(backward inner primer, BIP) 2종으로 구성되고 LAMP 반응에 필수적인 고리(loop)를 만들 수 있도록 정방향 및 역방향 염기서열에 해당하는 뉴클레오타이드로 구성된다. 추가 2종의 프라이머는 정방향 고리(forward loop, LoopF) 프라이머와 역방향 고리(backward loop, LoopB) 프라이머 2종으로 구성되며 내부(inner) 프라이머가 결합하지 않는 염기서열에 부착하여 LAMP 반응을 가속화시킨다.
LAMP에 사용되는 프라이머 세트는 타겟 핵산 상의 6개의 구분되는 영역(F3, F2, F1, B1c, B2c 및 B3)에 대하여 디자인되며, F3 및 B3는 두 개의 바깥쪽 프라이머로 증폭되는 산물의 크기를 결정하며, FIP 및 BIP는 두 개의 안쪽 프라이머로 FIP는 F1c 서열 및 F2 서열로 구성되고, BIP는 B1c 및 B2 서열로 구성되는 하이브리드 프라이머이다.
LAMP 반응은 크게 개시 구조 생산 단계 및 사이클링 증폭 단계를 포함하며, PCR과 달리 단일 가닥으로 변성시키는 단계를 포함하지 않는다. 개시 구조 생산단계에서 FIP의 F2가 F2c 영역에 결합하여 신장을 개시한다. BIP도 이와 마찬가지로 진행된다. F3 프라이머는 F3c 영역에 결합하여 가닥 치환 방식으로 DNA 합성을 시작하여, FIP에서 신장된 DNA 가닥이 교체되면서 방출된다. 이렇게 방출된 단일 가닥은 F1/F1c 결합을 통해 그 5'말단에 고리를 형성하게 되고, BIP 및 B3 프라이머도 동일한 방식으로 합성 반응이 진행되어, 덤벨 모양의 양 말단에 고리가 형성된 단일 가닥 핵산 분자가 형성된다. 이어 F1 영역의 3' 말단으로부터 DNA 합성이 시작되며, 사이클링 단계가 진행된다.
가속 프라이머인 LB 또는 LF 프라이머는 상술한 덤벨 구조의 단일 가닥 부위에 결합하며 B1 및 B2 사이의 고리 또는 F1 및 F2 사이의 고리에 결합한다. LB 또는 LF 프라이머를 사용하며 DNA 합성이 시작되는 origin이 증가하여 결국 반응 속도가 빨라지는 효과를 가져온다. LAMP 반응에서는 그 과정에서 통상 6개의 고리가 형성되며, 두 개의 고리만이 합성 기원으로 사용되나, LB 및 LF 프라이머를 사용하는 경우에는 6개의 모든 고리가 합성 기원으로 사용되어, 소정의 시간 동안 합성되는 DNA 양이 증가하게 된다.
각 F3 프라이머, B3 프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, Loop F 프라이머 (LF), 및 Loop B (LB) 프라이머의 특징 및 기능에 대한 보다 상세한 설명은 Notomi et al(T. Notomi, H. Okayama, H. Masubuchi, T. Yonekawa, K. Watanabe, N. Amino and T. Hase, Nucleic Acids Res., 2000, 28, E63) 및 Nagamine et al(K. Nagamine, T. Hase and T. Notomi, Mol. Cell. Probes, 2002, 16, 223-229)을 참조할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 타겟 핵산 검출용 RT-LAMP 시약은 타겟 핵산을 증폭하기 위한 4개 내지 6개의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 타겟 핵산 검출용 RT-LAMP 시약은 타겟 핵산을 증폭하기 위한 6개의 프라이머 세트, F3 프라이머, B3 프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, Loop F 프라이머 (LF), 및 Loop B (LB)프라이머를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야, 프라이머의 소스(source) 및 최종 증폭 산물의 길이 등을 고려하여 결정될 수 있다. 예컨대, 프라이머의 길이는 최소 10 뉴클레오타이드일 수 있으며, F3와 B3의 경우 최소 15 뉴클레오타이드, FIP와 BIP의 경우 최소 30 뉴클레오타이드, LF와 LB의 경우 최소 15 뉴클레오타이드일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 상기 프라이머 세트는 LAMP 반응의 특징 및 프라이머의 특징을 고려하여, 시중의 프라이머 디자인 소프트웨어, 예컨대, Primer Explorer V5 (Fujitsu, Japan), LAVA (LAMP Assay Versatile Analysis) 및 LAMP Designer (PREMIER Biosoft)와 같은 다양한 디자인 소프트웨어를 사용하여 디자인될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 RT-LAMP 시약은 역전사 효소, DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 및/또는 마그네슘 등을 추가적으로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 RT-LAMP 시약에 포함될 수 있는 DNA 중합효소는 호열성 미생물 유래의 중합효소로서, 특히 5'->3' 엑소뉴클레아제 기능이 결여된 중합효소를 포함할 수 있다. 예컨대, Bacillus stearothermophilus(Bst) DNA 중합효소, Thermus thermophilus(Tth) DNA 중합효소, Thermusaquaticus(Taq) DNA 중합효소, Thermococcuslitoralis DNA 중합효소; Pyrococcusfuriosus(Pfu) DNA 중합효소, 및 Bacillus caldotenax DNA 중합효소를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, DNA 중합효소는 Bst DNA 중합효소일 수 있으나, (i) 가닥 치환(strand displacement) 활성을 가지고, (ii) 반응 산물인 중합체가 고리구조를 형성할 수 있는 열역학적 활동성이 유지되는 온도 (예컨대, 50℃ 내지 75℃ 사이)에서 중합반응을 일으킬 수 있는 두 가지 주요 요건을 만족할 경우 Bst DNA 중합효소에 한정되지 않는다. 또한, RT-LAMP 반응을 위해 기존의 LAMP 반응에서 주로 사용되어진 Bst DNA 중합효소보다 빠른 증폭 능력과 강력한 역전사효소 활성을 가지고 있는 GspSSD DNA 중합효소 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 RT-LAMP 시약은 dNTPs 대신 뉴클레오타이드 유사체(analog)를 추가적으로 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 유사체는 변형되거나 또는 자연에서 발견되지 않는 것으로 주형 유도된 DNA 합성 과정에서 천연의 뉴클레오타이드와 함께 또는 단독으로 중합될 수 있는 것이다.
일 구현예에서, 상기 RT-LAMP 시약에 포함될 수 있는 버퍼는 소디움 포스페이트 버퍼, 포타슘 포스페이트 버퍼, Tris-HCl 버퍼 또는 Tricine 버퍼 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 상기 RT-LAMP 시약에 포함될 수 있는 마그네슘은 마그네슘 아세테이트, 마그네슘 클로라이드 또는 마그네슘 설페이트와 같은 염의 형태일 수 있다.
본 개시내용의 단계 (b-3)에서 사용되는 반응 용기는 용해물과 등온 증폭 시약(예컨대, RT-LAMP 시약)을 수용할 수 있는 복수의 웰을 갖는 웰 플레이트의 형태로 구비될 수 있다. 상기 웰 플레이트는 n X m 개(n 및 m은 2 이상의 자연수)의 웰들을 포함한다. 웰 플레이트는 n X m 개의 웰들이 행, 열로 배열된 직사각형 형태일 수 있다. 예를 들어, 4 X 4의 16웰들을 나타낸다.
웰 플레이트의 다양한 예시는 다음과 같다.
웰 플레이트는 2 X 2의 4웰, 3 X 3의 9웰, 4 X 4의 16웰, 5 X 5의 25웰, 6 X 6의 36웰, 7 X 7의 49웰, 또는 8 X 8의 64웰 등을 포함할 수 있다. 또한, 웰 플레이트는 2 X 4의 8웰, 3 X 6의 18웰, 4 X 8의 32웰, 5 X 10의 50웰, 6 X 12의 72웰, 7 X 14의 98웰, 또는 8 X 16의 128웰 등을 포함할 수 있다. 또한, 웰 플레이트는 2 X 6의 12웰, 3 X 9의 27웰, 4 X 12의 48웰, 5 X 15의 75웰, 6 X 18의 108웰, 7 X 21의 147웰, 또는 8 X 24의 192웰 등을 포함할 수 있다. 또한, 웰 플레이트는 2 X 8의 16웰, 3 X 12의 36웰, 4 X 16의 64웰, 5 X 20의 100웰, 6 X 24의 144웰, 7 X 28의 196웰, 또는 8 X 32의 256웰 등을 포함할 수 있다. 또한, 웰 플레이트는 8 X 12의 96웰, 12 X 16의 192웰, 또는 16 X 24의 384웰 등을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 반응 용기는 96-웰 플레이트이다.
상기 단계 (b-3)에서의 혼합은 8 내지 96개의 피펫팅 채널을 갖는 액체 분주 모듈에 의해 수행된다.
일 구현예에서, 상기 액체 분주 모듈은 8개의 피펫팅 채널을 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 액체 분주 모듈은 96개의 피펫팅 채널을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 액체 분주 모듈은 8개의 피펫팅 채널 및 96개의 피펫팅 채널을 포함한다.
본원에서 사용될 수 있는 8개의 피펫팅 채널은 그 간격이 조절될 수 있는 채널인 반면, 96개의 피펫팅 채널은 그 간격이 96-웰 플레이트에 맞춰져 있어 조절이 불가능한 채널일 수 있다. 이러한 96개의 피펫팅 채널은 피펫팅 채널 헤드로 지칭될 수 있다. 상기 96개의 피펫팅 채널은 당업계에서 널리 사용되는 8 X 12의 96-웰 플레이트의 전체 웰을 동시에 처리하기 위해 8 X 12로 배열된 채널을 가질 수 있다.
본 개시에 따른 방법은 복수 개의 샘플(예컨대, 96개의 샘플)을 처리할 수 있는 고처리량 등온 증폭 방법이다. 이는 멀티-피펫팅 채널(예컨대, 8개 내지 96개의 피펫팅 채널)을 포함하는 액체 분주 모듈에 의해 달성될 수 있다.
단계 (c): 반응 용기의 샘플 분석 장치로의 이동
단계 (c)에서, 단계 (b)에서 제조된 혼합물이 포함된 반응 용기가 상술한 반응 용기 이송 장치의 도움으로 샘플 분석 장치로 이동된다.
상기 반응 용기 이송 장치 및 이에 의한 반응 용기의 이동은 전술한 단계 (b)에서의 설명을 참조한다.
일 구현예에서, 상기 단계 (c) 이전에 반응 용기를 반응 용기 이송 장치의 도움으로 자동 용기 실러로 이동시키고 상기 반응 용기의 상부면을 실링하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 반응 용기에 상부면의 실링은 열 또는 접착제에 의해 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 실링은 상기 단계 (a)에서 상술한 자동 용기 실러에 의해 수행될 수 있다.
단계 (d): 등온 증폭 반응 및 타겟 핵산의 검출
단계 (d)에서, 상기 샘플 분석 장치에서, (d-1) 상기 반응 용기 내의 혼합물을 50 내지 75℃로부터 선택된 어느 온도에서 10분 내지 20분간 반응시켜 샘플 내의 타겟 핵산을 증폭하고; (d-2) 증폭된 산물을 검출한다.
전술한 단계 (d)는 (d-1) 등온 증폭 반응을 수행하고, (d-2) 등온 증폭 반응으로부터의 증폭 산물을 검출하는 과정이다.
일 구현예에서, 상기 단계 (d)는 (d-1) LAMP 반응을 수행하고 (d-2) LAMP 반응으로부터의 증폭 산물을 검출하는 과정이다.
상기 단계 (d)는 샘플 분석 장치에서 수행되며, 상기 샘플 분석 장치의 구체적인 설명은 단계 (a)의 개시를 참조한다.
상기 단계 (d-1)을 위한 온도는 DNA 중합효소 활성에 적합한 온도로서, 이는 반응에 사용되는 효소, 타겟 핵산을 고려하여 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
일 구현예에서, 단계 (d-1)을 위한 온도는 50℃내지 70℃로부터 선택된 어느 온도, 50℃내지 65℃로부터 선택된 어느 온도, 55℃내지 75℃로부터 선택된 어느 온도, 55℃내지 70℃로부터 선택된 어느 온도, 55℃내지 65℃로부터 선택된 어느 온도, 60℃ 내지 75℃로부터 선택된 어느 온도, 60℃내지 70℃로부터 선택된 어느 온도 또는 60℃내지 65℃로부터 선택된 어느 온도이다. 특정 구현예에서, 단계 (d-1)을 위한 온도는 60℃, 61℃ 또는 62℃이며, 보다 특정 구현예에서 62℃이다.
본 개시내용의 단계 (d-1)을 위한 시간은 등온 증폭 반응, 예컨대, LAMP 반응에 의해 타겟 핵산의 유의한 증폭이 관찰되기에 충분한 시간을 지칭하며, 이는 반응의 민감도, 샘플에 포함될 것으로 예상되는 타겟 핵산의 양 등을 고려하여 조정될 수 있다. 일 예로서, 단계 (d-1)을 위한 시간은 민감도를 높이기 위해 증가될 수 있다.
일 구현예에서, 단계 (d-1)을 위한 시간은 10 내지 20분으로부터 선택된 어느 시간, 12 내지 20분으로부터 선택된 어느 시간, 15 내지 20분으로부터 선택된 어느 시간 또는 12분 내지 18분으로부터 선택된 어느 시간이다. 특정 구현예에서 단계 (d-1)을 위한 시간은 15분 또는 20분이며, 보다 특정 구현예에서 20분이다.
일 구현예에서, 단계 (d-2)는 핵산 검출 기기에 의해 증폭된 산물을 검출할 수 있다.
일 구현예에서, 단계 (d-2)는 종점(end-point) 방식으로 수행되거나 실시간(real-time) 방식으로 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단계 (d-2)는 단계 (d-1)를 수행하는 동안 일정 시간 간격마다 실시될 수 있으며, 예컨대, 상기 단계 (d-2)는 단계 (d-1)를 수행하는 동안 30초, 1분, 1분 30초, 2분, 3분, 4분 또는 5분마다 실시될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 증폭 산물의 검출은 SYBR Green I을 이용한 형광 측정, 페놀 레드와 같은 지시약의 색상 변화, 탁색도, 침전물 생성, DNA laddering, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 증폭된 산물은 DNA 합성에 따른 반응 용기 내의 혼합물의 색변화로 검출될 수 있다. 이 경우, RT-LAMP 시약은 적절한 지시 시약(indicator)를 포함할 수 있으며, 예컨대, RT-LAMP 시약 중 마그네슘 이온 농도에 반응하여 색이 변하는 염료로서 HNB(hydroxy naphthol blue)를 사용할 수 있다. 또한, 양성 및/또는 음성 대조군 샘플의 증폭된 산물과 비교하여 타겟 핵산의 정량 또는 정성 분석할 수 있다.
일 구현예에서, RT-LAMP 반응 중 형광염료 등을 실시간으로 검출할 수 있는 핵산 검출 기기를 이용하여 별도의 전기영동(electrophoresis)이나 반응 후의 SYBR Green I 추가 없이 실시간으로 등온 증폭을 확인하고, annealing peak를 통해서 타겟 핵산의 증폭 여부를 확인할 수도 있다.
일 구현예에서, 상기 증폭된 산물은 직접적 또는 간접적 방법에 의해 검출될 수 있다. 직접적 방법에서는 검출가능하게 표지된 프라이머(또는 프로브)가 사용될 수 있으며, 타겟 핵산에 특이적 결합 후 표지된 프라이머를 통해 방출되는 신호를 통해 타겟 핵산의 증폭여부가 검출되며, 실시간 검출이 가능하다. 간접적 검출방법에서는 증폭된 타겟 핵산에 결합할 수 있는 표지된 프로브가 사용될 수 있다. 본원에서 검출가능하게 표지된 것의 의미는 분광학적, 광학적, 광화학적, 생화학적, 효소적, 전기적 및/또는 면역화학적 방법과 같은 임의의 적절한 방법을 이용하여 검출가능한 신호를 방출할 수 있는 물질로 표지된 물질을 의미한다. 이러한 물질은 예를 들면 형광 모이어티, 화학발광 모이어티, 생발광 모이어티, 자성입자, 효소, 기질, 방사능 및 발색단 물질을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 검출을 위한 표지(label)는 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 전기화학적 표지 및 금속 표지를 포함할 수 있다. 상기 표지는 인터컬레이팅 염료(intercalating dye)와 같이 표지 자체로 사용될 수 있다. 또는 단일 표지 또는 공여체 분자(donor molecule) 및 수용체 분자(acceptor molecule)를 포함하는 상호작용적인 이중 표지가 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 결합된 형태로 사용될 수 있다.
상기 단일 표지는 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 또는 전기화학적 표지 및 금속 표지를 포함할 수 있다. 상기 단일 표지는 이중 가닥 또는 단일 가닥 상에 존재하는지에 따라 서로 다른 시그널(예컨대, 다른 시그널 세기)을 제공한다.
구체적인 구현예에서, 상기 단일 표지는 형광 표지일 수 있다.
상기 단일표지는 다양한 방법에 의해 올리고뉴클레오티드에 연결될 수 있다. 예를 들어, 표지는 탄소 원자들을 포함하는 스페어서(spacer)를 통해 프라이머(또는 프로브)에 연결된다(예컨대, 3-carbon spacer, 6-carbon spacer 또는 12-carbon spacer).
상호작용적 표지 시스템은 공여체 분자(리포터 분자) 및 수용체 분자(퀀처 분자) 사이에 에너지가 비-방사능적(non-radioactively)으로 전달되는 시그널 발생 시스템을 포함한다.
상기 상호작용적 표지 시스템의 대표적 예로서, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 시스템은 형광 리포터 분자(공여체 분자) 및 퀀처 분자(수용체 분자)를 포함한다. FRET에서 에너지 공여체는 형광성이나, 에너지 수용체는 형광성 또는 비-형광성일 수 있다. 상호작용적 표지 시스템의 다른 형태에서, 에너지 공여체는 비-형광성, 예컨대, 크로모포어(chromophore)이고 에너지 수용체는 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템의 또 다른 형태에서, 에너지 공여체는 발광성(luminescent), 예컨대, 생물발광성, 화학발광성 또는 전기화학발광성이며 수용체는 형광성이다.
상호작용적 이중 표지는 접촉-매개 퀀칭(contact-mediated quenching)에 기반하여 검출 가능한 시그널을 제공하는 표지 쌍을 포함한다(Salvatore et al., Nucleic Acids Research, 2002 (30) no.21 e122 and Johansson et al., J. AM. CHEM. SOC 2002 (124) pp 6950-6956). 상기 상호작용적 표지 시스템은 최소 2개 분자(예를 들어, 염료) 간의 상호작용에 의한 시그널 변화를 포함하는 모든 또는 어떠한 케이스를 포함한다.
단일 표지 또는 이중 표지로 유용한 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 알려진 어떠한 분자도 포함할 수 있다. 그 예로는 다음과 같다: Cy2TM (506), YO-PROTM-1 (509), YOYOTM-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorXTM (519), AlexaTM (520), Rhodamine 110 (520), Oregon GreenTM 500 (522), Oregon GreenTM 488 (524), RiboGreenTM (525), Rhodamine GreenTM (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium GreenTM(531), Calcium GreenTM (533), TO-PROTM-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3TM (570), AlexaTM 546 (570), TRITC (572), Magnesium OrangeTM (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium OrangeTM(576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine RedTM (590), Cy3.5TM (596), ROX (608), Calcium CrimsonTM (615), AlexaTM 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PROTM-3 (631), YOYOTM-3 (631), R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PROTM-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5TM (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 최대 발광 파장이다.
적합한 리포터-퀀처 쌍은 다음과 같이 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce 등, editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White 등, Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996) 미국 특허 번호 제3,996,345호 및 제4,351,760호.
리포터 분자 및 퀀처 분자는 각각 형광성일 수 있다. 또한, 리포터 분자는 형광성이나 퀀처 분자는 비-형광성일 수 있다. 예를 들어, 광범위 파장 또는 특정 파장의 형광을 퀀칭 할 수 있는 비-형광성 다크 퀀처를 본 개시에서 이용할 수 있다. 퀀처 분자가 형광성일 경우, 형광성 퀀처 분자의 시그널 변화로부터 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다.
리포터 분자 및 퀀처 분자는 종래 방법들에 따라 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 예를 들어, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최소 3개의 탄소 원자를 포함하는 스페이서(예컨대, 3-탄소 스페이서, 6-탄소 스페이서, 9-탄소 스페이서 또는 12-탄소 스페이서)를 통해 프로브에 연결될 수 있다.
일 구현예에서, LAMP 반응에 의한 핵산 증폭 서열 특이적으로 형광을 검출하기 위한 기술들이 이용될 수 있다. 예컨대, 핵산 증폭 서열 특이적으로 설계된 두 가닥의 프로브로서 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 원리를 이용하여 실시간 측정하는 동화 프로브 방법(WO 2011/163425 A1)이 이용될 수 있으며, 상기 두 가닥의 프로브 중 한 가닥에는 5'말단에 리포터 분자가 부착되고, 다른 한쪽 가닥에는 3' 말단에 퀀처 분자가 부착되어 있다. 구체적으로, 도 12를 참조하여 설명하면, 동화 프로브는 6개의 LAMP 프라이머 중 loop primer 중 하나를 5'말단에 리포터 분자를 부착시킨 프로브로서 디자인하고, 이에 상보적인 서열을 일부를 디자인하여 3' 말단에 퀀처를 부착시킨 나머지 프로브를 디자인하여 총 7종의 올리고뉴클레오타이드(즉, 6개의 프라이머 및 퀀처를 부착시킨 나머지 프로브)를 이용한다.
또한, 동화 프로브와 유사한 프로브를 사용하는 형광 검출법으로 형광 프로브(fluorophore-labeled primer/probe)와 퀀처 프로브(quencher-labeled probe)를 상보적인 서열을 갖도록 설계하여 한 쌍의 프로브를 사용하는 방법(WO 2013/065574 A1) 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 상기 증폭된 산물의 검출은 형광을 측정하여 실시될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 타겟 핵산 검출용 등온 증폭 시약은 형광 분자를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 및 퀀처 분자를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 타겟 핵산 검출용 RT-LAMP 시약은 형광 분자를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 및 퀀처 분자를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, RT-LAMP 시약에 포함되어 있는 6개의 LAMP 프라이머 중 하나가 상기 형광 분자를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 퀀처 분자를 포함하는 올리고뉴클레오타이드로 사용될 수 있으며, 예컨대, FIP, BIP, LF 또는 LB가 형광 분자 또는 퀀처 분자로 표지되어, 상기 형광 분자를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 퀀처 분자를 포함하는 올리고뉴클레오타이드로서 디자인될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 타겟 핵산 검출용 등온 증폭 시약은 복수의 타겟 핵산 검출용 등온 증폭 시약일 수 있으며, 예컨대, 상기 복수의 타겟 핵산은 2 내지 5개일 수 있으며, 구체적으로 2개 내지 4개, 보다 구체적으로 3개일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 복수의 타겟 핵산 검출용 등온 증폭 시약은 하나의 반응 용기 안에서 복수의 타겟 핵산을 검출할 수 있는 등온 증폭 시약을 의미한다.
본 발명의 방법의 처리량
본 발명의 방법은 자동화 분자진단 시스템에 의해 대량의 샘플을 빠른 시간 내에 처리할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 8개 내지 96개의 피펫팅 채널을 포함하는 액체 분주 모듈의 도움으로, 그리고 반응 용기로서 96-웰 플레이트와 같은 대용량 용기를 사용함으로써 고처리량을 달성할 수 있다.
본 발명의 방법은 다음과 같은 처리량을 갖는 것을 특징으로 한다:
본 발명의 방법에 의하면, 96개의 샘플당 총 18분 내지 60분이 소요될 수 있다. 상기 소요되는 시간은 샘플을 자동화 분자진단 시스템 내의 샘플 준비 장치에 장착한 이후부터 증폭 산물의 검출이 완료될 때까지의 시간을 의미한다. 즉, 상기 시간은 본 발명의 방법의 단계 (b)부터 단계 (d)의 완료시까지 소요되는 시간을 의미한다. 상기 소요되는 시간은 96개 전체의 샘플에 대해 본 발명의 방법을 적용했을 때 소요되는 시간을 의미하는 것이며, 샘플이 96개 미만인 경우에 상기 소요되는 시간은 단축될 수 있다.
본원에서 단계 (b)부터 단계 (d)까지의 과정은 하나의 라운드로 지칭될 수 있으며, 따라서, 상기 소요되는 시간은 하나의 라운드당 소요되는 시간을 지칭한다.
다시 말하면, 본 발명의 방법은 하나의 라운드당 총 18분 내지 60분이 소요될 수 있다.
본 발명의 방법의 총 소요 시간은 자동화 분자진단 시스템 내의 샘플 준비 장치, 반응 용기 이송 장치 및 샘플 분석 장치의 성능, 샘플 준비 장치 내의 액체 분주 모듈의 성능, 액체 분주 모듈에 포함된 피펫팅 채널의 개수, 직접 용해 버퍼가 용기에 미리 분주되어 있는지 여부, 등온 증폭 시약이 용기에 미리 분주되어 있는지 여부 등에 따라 18분 내지 60분 범위에서 달라질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법의 총 소요 시간은 자동화 분자진단 시스템 내의 샘플 준비 장치, 반응 용기 이송 장치 및 샘플 분석 장치의 성능, 또는 샘플 준비 장치 내의 액체 분주 모듈의 성능이 우수할수록 감소될 수 있고, 액체 분주 모듈에 포함된 피펫팅 채널의 개수가 많을수록 감소될 수 있으며, 직접 용해 버퍼가 용기에 미리 분주되어 있는 경우(예를 들어, 직접 용해 버퍼가 각 웰에 분주된 상업적인 제품을 사용하는 경우) 감소될 수 있고, 등온 증폭 시약이 용기에 미리 분주되어 있는 경우(예를 들어, RT-LAMP 시약이 각 웰에 분주된 상업적인 제품을 사용하는 경우) 감소될 수 있다.
본 발명의 방법의 총 소요 시간은 18분 내지 60분, 20분 내지 60분, 25분 내지 60분, 30분 내지 60분, 35분 내지 60분, 40분 내지 60분, 45분 내지 60분, 50분 내지 60분, 55분 내지 60분, 18분 내지 55분, 18분 내지 50분, 18분 내지 45분, 18분 내지 40분, 18분 내지 35분, 18분 내지 30분, 18분 내지 25분, 18분 내지 20분, 20분 내지 55분, 20분 내지 50분, 20분 내지 45분, 20분 내지 40분, 20분 내지 35분, 20분 내지 30분, 20분 내지 25분, 25분 내지 55분, 25분 내지 50분, 25분 내지 45분, 25분 내지 40분, 25분 내지 35분, 25분 내지 30분, 30분 내지 55분, 30분 내지 50분, 30분 내지 45분, 30분 내지 40분, 30분 내지 35분, 35분 내지 55분, 35분 내지 50분, 35분 내지 45분, 35분 내지 40분, 40분 내지 55분, 45분 내지 50분, 또는 50분 내지 55분일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 단계 (b)는 96개의 샘플당 7분 내지 36분이 소요될 수 있다. 즉, 본 발명의 방법의 한 라운드당 단계 (b)는 7분 내지 36분이 소요된다. 상기 시간은 단계 (b-1), (b-2) 및 (b-3)을 완료하는 데 소요되는 시간을 의미한다.
상기 단계 (b)의 총 소요 시간은 자동화 분자진단 시스템 내의 샘플 준비 장치의 성능, 샘플 준비 장치 내의 액체 분주 모듈의 성능, 액체 분주 모듈에 포함된 피펫팅 채널의 개수, 직접 용해 버퍼가 용기에 미리 분주되어 있는지 여부, 등온 증폭 시약이 용기에 미리 분주되어 있는지 여부 등에 따라 7분 내지 36분 범위에서 달라질 수 있다.
상기 단계 (b)의 총 소요 시간은 7분 내지 36분, 10분 내지 36분, 15분 내지 36분, 20분 내지 36분, 25분 내지 36분, 30분 내지 36분, 35분 내지 36분, 7분 내지 35분, 7분 내지 30분, 7분 내지 25분, 7분 내지 20분, 7분 내지 15분, 7분 내지 10분, 10분 내지 35분, 10분 내지 30분, 10분 내지 25분, 10분 내지 20분, 10분 내지 15분, 15분 내지 35분, 15분 내지 30분, 15분 내지 25분, 15분 내지 20분, 20분 내지 35분, 또는 25분 내지 30분일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 단계 (b-1)은 96개의 샘플당 6분 내지 13분이 소요될 수 있다. 즉, 본 발명의 방법의 한 라운드당 단계 (b-1)은 6분 내지 13분이 소요된다. 상기 시간은 용기의 각 웰에 직접 용해 버퍼를 분주한 후 각 웰에 샘플을 분주하는 데 소요되는 시간을 의미한다.
상기 단계 (b-1)의 총 소요 시간은 자동화 분자진단 시스템 내의 샘플 준비 장치의 성능, 샘플 준비 장치 내의 액체 분주 모듈의 성능, 액체 분주 모듈에 포함된 피펫팅 채널의 개수, 직접 용해 버퍼가 용기에 미리 분주되어 있는지 여부 등에 따라 6분 내지 13분 범위에서 달라질 수 있다.
상기 단계 (b-1)의 총 소요 시간은 6분 내지 13분, 7분 내지 13분, 8분 내지 13분, 9분 내지 13분, 10분 내지 13분, 11분 내지 13분, 12분 내지 13분, 6분 내지 12분, 6분 내지 11분, 6분 내지 10분, 6분 내지 9분, 6분 내지 8분, 6분 내지 7분, 7분 내지 12분, 7분 내지 11분, 7분 내지 10분, 7분 내지 9분, 7분 내지 8분, 8분 내지 12분, 8분 내지 11분, 8분 내지 10분, 8분 내지 9분, 9분 내지 12분, 9분 내지 11분, 9분 내지 10분, 10분 내지 12분, 10분 내지 11분일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 단계 (b-2)는 96개의 샘플당 3분 내지 5분이 소요될 수 있다. 즉, 본 발명의 방법의 한 라운드당 단계 (b-2)는 3분 내지 5분이 소요된다. 상기 시간은 샘플과 직접 용해 버퍼의 혼합물이 인큐베이션되는 시간을 의미한다.
상기 단계 (b-2)의 총 소요 시간은 다른 단계와 중복될 수 있다. 예를 들어, 단계 (b-2)의 3분 내지 5분은 단계 (b-3)에서 lysate와 등온 증폭 시약을 혼합하는 동안 함께 수행될 수 있다.
상기 단계 (b-2)의 총 소요 시간은 3분 내지 5분, 3분 내지 4분, 또는 4분 내지 5분일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 단계 (b-3)은 96개의 샘플당 1분 내지 18분이 소요될 수 있다. 즉, 본 발명의 방법의 한 라운드당 단계 (b-3)은 1분 내지 18분이 소요된다. 상기 시간은 lysate를 반응 용기에 분주한 다음, 등온 증폭 시약을 분주하는 데 소요되는 시간을 의미한다.
상기 단계 (b-3)의 총 소요 시간은 자동화 분자진단 시스템 내의 샘플 준비 장치의 성능, 샘플 준비 장치 내의 액체 분주 모듈의 성능, 액체 분주 모듈에 포함된 피펫팅 채널의 개수, 등온 증폭 시약이 용기에 미리 분주되어 있는지 여부 등에 따라 1분 내지 18분 범위에서 달라질 수 있다.
상기 단계 (b-3)의 총 소요 시간은 1분 내지 18분, 1분 내지 15분, 1분 내지 10분, 1분 내지 5분, 5분 내지 18분, 5분 내지 15분, 5분 내지 10분, 10분 내지 18분, 10분 내지 15분, 또는 15분 내지 18분일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 단계 (c)는 96개의 샘플당 1분 내지 4분이 소요될 수 있다. 즉, 본 발명의 방법의 한 라운드당 단계 (c)는 1분 내지 4분이 소요된다. 상기 시간은 반응 용기를 샘플 준비 장치로부터 샘플 분석 장치로 이동시키고, 선택적으로 자동 용기 실러를 사용하여 반응 용기를 실링하는 데 소요되는 시간을 의미한다.
상기 단계 (c)의 총 소요 시간은 자동화 분자진단 시스템 내의 샘플 이송 장치의 성능, 및 선택적으로 자동 용기 실러의 실링 속도 등에 따라 1분 내지 4분 범위에서 달라질 수 있다.
상기 단계 (c)의 총 소요 시간은 1분 내지 4분, 1분 내지 3분, 1분 내지 2분, 2분 내지 4분, 2분 내지 3분, 또는 3분 내지 4분일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 단계 (d)는 96개의 샘플당 10분 내지 20분이 소요될 수 있다. 즉, 본 발명의 방법의 한 라운드당 단계 (d)는 10분 내지 20분이 소요된다. 상기 시간은 샘플 분석 장치에서 등온 증폭을 실시하는 데 소요되는 시간을 의미한다.
상기 단계 (d)의 총 소요 시간은 자동화 분자진단 시스템 내의 샘플 분석 장치의 성능 등에 따라 10분 내지 20분 범위에서 달라질 수 있다.
상기 단계 (c)의 총 소요 시간은 10분 내지 20분, 10분 내지 17분, 10분 내지 15분, 10분 내지 13분, 13분 내지 20분, 13분 내지 17분, 15분 내지 20분, 또는 15분 내지 17분일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 첨부된 청구항에 제시된 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예
실시예 1: 자동화 분자진단 시스템을 이용한 고처리량 등온 증폭
본 개시에 따라, 자동화 분자진단 시스템을 이용하여 고처리량 등온 증폭 반응을 수행할 수 있는지 확인하였다.
이를 위하여, 하기로 구성된 자동화 분자진단 시스템을 이용하여 RT-LAMP를 수행하였다:
(i) 액체 분주 모듈을 포함하는 샘플 준비 장치,
(ii) 반응 용기 이송 장치,
(iii) 자동 용기 실러, 및
(iv) 핵산 증폭 기기 및 핵산 검출 기기를 포함하는 샘플 분석 장치.
상기 자동화 분자진단 시스템 내의 액체 분주 모듈은 8개의 피펫팅 채널을 포함한다.
상기 샘플 준비 장치에 하기 실시예 1-1에서 준비한 샘플, 직접 용해 버퍼(Swab:DirectTM Extraction Kit, Cat. No. 9799140107) 및 실시예 1-2에서 준비한 타겟 핵산 검출용 RT-LAMP 시약을 미리 장착하였다.
1-1. 샘플의 준비
타겟 핵산으로, RNA로 구성이 되어 있는 박테리오파지 MS2 (ATCC: 15597-B1) 게놈의 유전자를 사용하였으며, 104 PFU/μL의 농도로 준비된 박테리오파지 MS2를 검체 수송배지(Transport media, Copan Universal Transport medium, Cat. No. 3C047N)를 이용하여 10배씩 연속 희석하고, 총 3가지 농도(농도 1: 4×103 PFU/μL, 농도 2: 4×102 PFU/μL, 농도 3: 4×101 PFU/μL)의 박테리오파지 MS2 샘플을 각각 3개씩 준비하였다. 상기 준비된 3가지 농도의 박테리오파지 MS2 샘플 9개 및 증류수를 포함하는 음성 대조군 샘플 3개를 자동화 분자진단 시스템 내 샘플 준비 장치에 직접 용해 버퍼 및 RT-LAMP 시약과 함께 장착시켰다.
1-2. RT-LAMP 시약의 제조
(1) 형광 염료를 포함하는 RT-LAMP 시약의 제조
박테리오파지 MS2 타겟 핵산을 RT-LAMP 반응을 통해 증폭하기 위하여, 총 6종의 프라이머 세트(F3, B3, FIP, BIP, LF 및 LB)를 하기 표 1과 같이 준비하였다.
Figure PCTKR2022018265-appb-img-000001
이어서, F3 (서열번호 : 1) 4 pmole, B3 (서열번호 : 2) 4 pmole, FIP (서열번호 : 3) 32 pmole, BIP (서열번호 : 4) 각각 32 pmole, LF (서열번호 : 5) 8 pmole, LB (서열번호 : 6) 8 pmole, WarmStart® RTx Reverse Transcriptase (NEB, Cat. No. M0380L) 4 μL, Bst 2.0 WarmStart® DNA polymerase (NEB, Cat. No. M0538L) 8 μL, 10 mM dNTP Mix 28 μL, 100 mM MgSO4 12 μL, 10X Isothermal Amplification Buffer (NEB, B0537S) 15 μL 및 8X Evagreen 25μL 를 포함하여 최종 150μL의 RT-LAMP 시약 (1)을 제조하였다.
(2) 동화 프로브를 포함하는 RT-LAMP 시약의 제조
박테리오파지 MS2 타겟 핵산을 RT-LAMP 반응을 통해 증폭하기 위하여, 상기 표 1의 프라이머 세트(F3, B3, FIP, BIP, LF 및 LB) 및 동화 프로브(LB-동화프로브 및 퀀칭 올리고)를 하기 표 2와 같이 준비하였다.
Figure PCTKR2022018265-appb-img-000002
이어서, F3 (서열번호 : 1) 4 pmole, B3 (서열번호 : 2) 4 pmole, FIP (서열번호 : 3) 32 pmole, BIP (서열번호 : 4) 각각 32 pmole, LF (서열번호 : 5) 10 pmole, LB (서열번호 : 6) 4 pmole, LB-동화 프로브 (서열번호 : 7) 6 pmole, 퀀칭 올리고 (서열번호 : 8) 8 pmole, WarmStart® RTx Reverse Transcriptase (NEB, Cat. No. M0380L) 4 μL, Bst 2.0 WarmStart® DNA polymerase (NEB, Cat. No. M0538L) 8 μL, 10 mM dNTP Mix 28 μL, 100 mM MgSO4 12 μL, 및 10X Isothermal Amplification Buffer (NEB, B0537S) 15 μL를 포함하여 최종 150 μL의 RT-LAMP 시약 (2)를 제조하였다.
이후, 하기 프로토콜에 따라, 자동화 분자진단 시스템을 이용하여 RT-LAMP를 실시하였다.
<프로토콜>
1.샘플 준비 장치에서,
1-1. 상기 농도 1 내지 3의 검체 수송 배지에 희석된 박테리오파지 MS2 샘플 50μL와 직접 용해 버퍼 50μL의 혼합
1-2. 실온에서 5분간 인큐베이션
1-3. 96-웰 플레이트 반응 용기에 상기 1-2의 혼합물 5μL와 RT-LAMP 시약 (1) 또는 (2) 15μL의 혼합
2. 반응 용기 이송 장치의 도움으로 상기 1-3의 RT-LAMP 반응 혼합물을 포함하는 반응 용기를 자동 용기 실러로 이동
3. 자동 용기 실러를 이용하여 상기 2의 혼합물을 포함하는 반응용기 상부면의 실링
4. 반응 용기 이송 장치의 도움으로 상기 실링된 반응 용기를 샘플 분석 장치로 이동
5. 샘플 분석 장치에서,
5-1. 상기 혼합물을 62℃에서 20분 동안 RT-LAMP 반응
5-2. 60초 마다 증폭된 산물을 검출
그 결과, 도 13 및 도 14에 나타난 바와 같이, 본 개시에 따른 자동화 분자진단 시스템을 이용한 고처리량 등온 증폭방법에 의해 42분만에 타겟 핵산 서열을 특이적으로 등온 증폭하여 검출할 수 있음을 확인하였다.

Claims (34)

  1. 다음 단계를 포함하는 자동화 분자진단 시스템을 이용한 고처리량(High throughput) 등온 증폭 방법:
    (a) 대상체로부터 채취된 샘플을 자동화 분자진단 시스템 내의 샘플 준비 장치에 장착하는 단계; 상기 자동화 분자진단 시스템은 샘플 준비 장치, 반응 용기 이송 장치 및 샘플 분석 장치를 포함하고, 상기 샘플 준비 장치는 그 안에 장착된 직접 용해 버퍼(direct lysis buffer) 및 타겟 핵산 검출용 등온 증폭(isothermal amplification) 시약을 포함하고;
    (b) 상기 샘플 준비 장치에서,
    (b-1) 상기 샘플을 직접 용해 버퍼와 혼합하는 단계;
    (b-2) 상기 혼합물을 15℃ 내지 35℃에서 3분 내지 5분간 인큐베이션(incubation)하여 용해물(lysate)을 수득하는 단계; 및
    (b-3) 상기 용해물을 반응 용기에서 등온 증폭 시약과 혼합하여 샘플 준비를 완료하는 단계;
    상기 샘플 준비 장치는, 샘플, 직접 용해 버퍼 및 등온 증폭 시약을 반응 용기에 수용시키기 위한 액체 분주 모듈(liquid handling module)을 포함하며, 상기 액체 분주 모듈은 8개 내지 96개의 피펫팅 채널(pipetting channel)을 포함하고;
    (c) 상기 혼합물이 포함된 반응 용기를 반응 용기 이송 장치의 도움으로 샘플 분석 장치로 이동시키는 단계;
    (d) 상기 샘플 분석 장치에서,
    (d-1) 상기 반응 용기 내의 혼합물을 50℃ 내지 75℃로부터 선택된 어느 온도에서 10분 내지 20분간 반응시켜 샘플 내의 타겟 핵산을 증폭하는 단계;
    (d-2) 증폭된 산물을 검출하는 단계.
    상기 단계 (b) 내지 (d)는 자동화 분자진단 시스템 내의 제어 모듈에 의해 자동으로 수행된다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 등온 증폭 방법은 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 등온 증폭 시약은 LAMP 시약인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 등온 증폭 시약은 RT-LMAP(Reverse-transcription Loop-mediated isothermal amplification) 시약인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 대상체로부터 유래된 샘플은 도말물(swab), 타액, 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 도말물은 비인두 도말물(nasopharyngeal swab), 전비강 도말물(nostril swab), 구인두 도말물(oropharyngeal swab), 구강 도말물(oral swab), 침 도말물(saliva swab), 생식기 도말물(genital swab), 직장 도말물(rectal swab) 또는 이들 중 둘 이상의 혼합 도말물인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 샘플 준비 장치 및 샘플 분석 장치 각각은 개별적으로 동작되는 stand-alone 장치인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 샘플 분석 장치 및/또는 상기 반응 용기 이송 장치 중 적어도 하나의 장치는 공간적으로 폐쇄(enclosed)되는 폐쇄 구조물(enclosure)의 내부에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 샘플 준비 장치 및 상기 폐쇄 구조물은 반응 용기가 이송되는 확정 통로(defined passage)를 형성하고, 상기 반응 용기 이송 장치는 상기 확정 통로를 이용하여 상기 반응 용기를 이송시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 샘플 준비 장치는 상기 샘플 분석 장치의 위 또는 아래에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 반응 용기는 96-웰 플레이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 자동화 분자진단 시스템은 상기 반응 용기의 상부면을 실링(sealing)하기 위한 자동 용기 실러(automated container sealer)를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 자동 용기 실러는 상기 샘플 준비 장치에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 자동 용기 실러는 상기 폐쇄 구조물에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 타겟 핵산은 바이러스로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 바이러스는 RNA 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 RNA 바이러스는 SARS-CoV-2인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 타겟 핵산은 SARS-CoV-2에서의 E 유전자, N 유전자, RdRP 유전자, S 유전자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 타겟 핵산 검출용 등온 증폭 시약은 형광 분자를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 및 퀀처 분자를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 등온 증폭 시약은 내부대조군을 증폭 및 검출하기 위한 올리고뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 내부대조군은 RNase P인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 타겟 핵산 검출용 등온 증폭 시약은 복수의 타겟 핵산 검출용 등온 증폭 시약인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 복수의 타겟 핵산은 2 내지 5개의 타겟 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 단계 (c) 이전에 반응 용기를 반응 용기 이송 장치의 도움으로 자동 용기 실러로 이동시키고 상기 반응 용기의 상부면을 실링하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 반응 용기에 상부면의 실링은 열 또는 접착제에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 단계 (d-1)의 온도는 60℃ 내지 65℃로부터 선택된 어느 온도인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제1항에 있어서, 상기 단계 (d-2)는 단계 (d-1)를 수행하는 동안 일정 시간 간격마다 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제1항에 있어서, 상기 방법은 96개의 샘플당 18분 내지 60분이 소요되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)는 96개의 샘플당 7분 내지 36분이 소요되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제1항에 있어서, 상기 단계 (b-1)은 96개의 샘플당 6분 내지 13분이 소요되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제1항에 있어서, 상기 단계 (b-2)은 96개의 샘플당 3분 내지 5분이 소요되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제1항에 있어서, 상기 단계 (b-3)은 96개의 샘플당 1분 내지 18분이 소요되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제1항에 있어서, 상기 단계 (c)는 96개의 샘플당 1분 내지 4분이 소요되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제1항에 있어서, 상기 단계 (d)는 96개의 샘플당 10분 내지 20분이 소요되는 것을 특징으로 하는 방법.
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