WO2023075048A1 - 유전자가위 기반 중증열성혈소판감소증후군 바이러스의 신속 검출 - Google Patents

유전자가위 기반 중증열성혈소판감소증후군 바이러스의 신속 검출 Download PDF

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WO2023075048A1
WO2023075048A1 PCT/KR2022/006085 KR2022006085W WO2023075048A1 WO 2023075048 A1 WO2023075048 A1 WO 2023075048A1 KR 2022006085 W KR2022006085 W KR 2022006085W WO 2023075048 A1 WO2023075048 A1 WO 2023075048A1
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sftsv
seq
guide rna
crispr
gene
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PCT/KR2022/006085
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송윤재
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가천대학교 산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease

Definitions

  • SFTSV severe fever with thrombocytopenia syndrome virus
  • SFTSV thrombocytopenia syndrome virus
  • CRISPR-Cas12a and CRISPR-Cas12a CRISPR-Cas12a
  • Severe fever with thrombocytopenia syndrome is an emerging infectious disease caused by the Dabie bandavirus , also known as SFTSV.
  • SFTSV Severe fever with thrombocytopenia syndrome
  • the first suspected cases were reported in Hubei and Henan provinces of China in 2009, and the virus was isolated in 2011 (New England Journal of Medicine 364(16), 1523-1532). After 2013, STFS was also confirmed in Japan and Korea, and cases of infection were continuously reported in these countries (Emerging infectious diseases 19(11), 1892; The Journal of infectious diseases 209(6), 816-827).
  • SFTSV is transmitted by the bite of the tick Haemaphysalis longicornis in China, Japan and Korea.
  • genotypes (A, B, C, D, E, and F) of SFTSV were classified based on L (large segment), M (medium segment), and S (small segment) sequences.
  • L large segment
  • M medium segment
  • S small segment sequences.
  • genotype B predominates
  • genotypes A, D, and F occur less frequently (PLoS neglected tropical diseases 11(9), e0005893).
  • qRT-PCR quantitative reverse transcription polymerase chain reaction
  • RT-PCR quantitative reverse transcription polymerase chain reaction
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Cas12a from Lachnospiraceae bacteria can recognize target DNA using a guide RNA (gRNA) complementary to a target DNA sequence having a T nucleotide-rich protospacer-adjacent motif (PAM) (Nature 532 ( 7600), 522-526). After recognition, LbCas12a is activated and induces non-specific single-stranded DNA cleavage (Science 360, 436-439).
  • gRNA guide RNA
  • PAM protospacer-adjacent motif
  • DETECTR DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter
  • the present inventors conducted research on a method for early and effective detection of SFTSV by applying it to the field, and without extracting separate nucleic acids from samples, SFTSV, which combines HUDSON (heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases) with DETECTR, A rapid, sensitive, field-applicable diagnostic method for detection was developed.
  • An object of the present invention is to provide a method for rapidly and precisely detecting SFTSV using a primer set and guide RNA specific to SFTSV and CRISPR-Cas12a.
  • Another object of the present invention is to provide a primer set and guide RNA for detecting SFTSV.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for detecting SFTSV comprising a primer set and guide RNA specific to SFTSV and CRISPR-Cas12a.
  • One aspect of the present invention is a method for detecting severe fever with thrombocytopenia syndrome virus (SFTSV) using genetic editing,
  • CRISPR-Cas CRISPR-associated protein 12a
  • a single-stranded DNA probe to the product obtained by the isothermal amplification to perform molecular diagnosis by genetic scissors It provides a way to do it.
  • the guide RNA may target the S gene of SFTSV having a PAM sequence rich in T-nucleotides.
  • the PAM sequence may be TTTG or TTTA.
  • the sample may be a sample containing SFTSV, and may be a sample obtained from a subject in need of detection of SFTSV.
  • the sample includes, but is not limited to, saliva, blood, serum, plasma, urine, aspirate, and biopsy samples.
  • the providing of the sample may further include heating the sample to remove nuclease activity and decompose virus particles in the sample.
  • the step of providing the sample dissolves the virus particles present in the sample, and heats and chemically treats RNase present in them, for example, EDTA, without extracting nucleic acids from the sample.
  • a step of inactivating by addition HUDSON, Heatin Unextracted Diagnostic Samples to Obliterate Nucleases may be further included.
  • the isothermal amplification step may include reverse transcription of a sample of the nucleic acid and isothermal amplification using a product obtained by the reverse transcription as a template.
  • the isothermal amplification may be performed by RT-RPA (Reverse Transcription-Recombinase Polymerase Amplification) using an SFTSV-specific primer set consisting of SEQ ID NOs: 1 and 2.
  • RT-RPA Reverse Transcription-Recombinase Polymerase Amplification
  • the guide RNA specific to the S gene of SFTSV in the step of performing the molecular diagnosis may be composed of the sequence of SEQ ID NO: 3 or 4.
  • the guide RNA is designed to enable the gene scissors to act specifically on the S gene of SFTSV of all genotypes.
  • the guide RNA specific to the S gene of SFTSV recognizes the PAM sequence of TTTG and binds specifically to a target having a complementary sequence sequence of SEQ ID NO: 3 may consist of
  • the guide RNA specific to the S gene of SFTSV recognizes the PAM sequence of TTTA and binds specifically to a target having a complementary sequence sequence of SEQ ID NO: 4 may consist of
  • the method for detecting SFTSV can detect SFTSV regardless of the genotype of SFTSV, so that SFTSV of genotypes A, B, C, D, E, and F can be detected.
  • the step of performing molecular diagnosis includes detection of a target site in an isothermal amplification product by the guide RNA, activation of CRISPR-Cas12a, and cleavage of a single-stranded DNA probe by the activated CRISPR-Cas12a Including, the single-stranded DNA probe may not hybridize with the guide RNA and may be labeled with a labeling substance.
  • the CRISPR-Cas12a may be LbCas12a derived from Lachnospiraceae bacteria.
  • the step of performing molecular diagnosis includes determining whether SFTSV is present in the sample by detecting whether the single-stranded DNA probe is cut by fluorescence analysis or lateral flow assay (LFA). can do.
  • LFA lateral flow assay
  • isothermal amplification of the nucleic acid and fluorescence analysis or LFA may be performed at the same temperature.
  • isothermal amplification of the nucleic acid and fluorescence analysis or LFA may be performed at 37°C or 42°C.
  • the single-stranded DNA probe may be double-labeled with a fluorescent material and a quenching material.
  • the single-stranded DNA probe may be double-labeled with biotin and a fluorescent substance.
  • the fluorescent material may be a fluorescent dye including but not limited to FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, and the like.
  • LFA may be performed on a strip.
  • the method is performed using the SFTSV-specific primer set of SEQ ID NOs: 1 and 2 and the SFTSV-specific guide RNA of SEQ ID NO: 3 or 4, and 1 pfu (plaque forming unit) of SFTSV It may have a detection sensitivity of
  • Another aspect of the present invention provides a primer set for detecting SFTSV.
  • the primer set for detecting SFTSV consists of a forward primer composed of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer composed of SEQ ID NO: 2 capable of amplifying the S gene of SFTSV.
  • the primer set for detecting SFTSV may be used in RT-RPA (Reverse Transcription-Recombinase Polymerase Amplification) of the S gene of SFTSV.
  • RT-RPA Reverse Transcription-Recombinase Polymerase Amplification
  • Another aspect of the present invention provides a guide RNA for detecting SFTSV.
  • the guide RNA may be composed of the sequence of SEQ ID NO: 3 that recognizes the PAM sequence of TTTG and specifically binds to the S gene target of SFTSV having a complementary sequence.
  • the guide RNA may be composed of the sequence of SEQ ID NO: 4 that recognizes the PAM sequence of TTTA and specifically binds to the S gene target of SFTSV having a complementary sequence.
  • kits for detecting SFTSV comprising a primer set specific to SFTSV, guide RNA, CRISPR-Cas12a, and a single-stranded DNA probe, wherein the primer set specific to SFTSV comprises the primers of SEQ ID NO: 1 and It consists of a primer of SEQ ID NO: 2, and the guide RNA provides a kit consisting of SEQ ID NO: 3 or 4.
  • the kit may be used to detect SFTSV by RT-RPA and CRISPR-Cas12a based detection.
  • the kit may further include a reagent for detection by fluorescence or LFA.
  • SFTSV severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, which is a negative single-stranded RNA composed of three segments, L (large), M (medium), and S (small). It is a virus with a genome of The L segment encodes an RNA-dependent RNA polymerase responsible for replication and transcription of viral RNA, the M segment encodes a glycoprotein precursor that is processed into Gn and Gs constituting the envelope, and the S segment encodes As an ambisense RNA, it encodes two proteins.
  • the antisense RNA of the S segment encodes a nucleocapsid protein (NP), and the sense RNA encodes a nonstructural protein (NS).
  • NP functions in viral replication and transcription, and NS regulates the host immune response (Experimental & Molecular Medicine 53(5), 713-722; New England Journal of Medicine 364(16), 1523-1532; Virologica Sinica 32( 1), 51-62).
  • isothermal amplification refers to a method of amplifying nucleic acids by incubation at a single temperature without a thermocycler, and is used interchangeably with “isothermal nucleic acid amplification”.
  • Isothermal amplification is a nucleic acid amplification that does not rely on thermal denaturation of the target nucleic acid during the amplification reaction and does not require a rapid change in temperature, so it can be performed inside and outside the laboratory environment.
  • Isothermal amplification methods include, but are not limited to, loop-mediated isothermal amplification (LAMP), recombinase polymerase amplification (RPA), and the like.
  • LAMP loop-mediated isothermal amplification
  • RPA recombinase polymerase amplification
  • the term “genetic scissors” refers to a CRISPR (Clustered Interspaced Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) -Cas (CRISPR-associated) protein.
  • Scissors-based molecular diagnosis consists of signal amplification, signal conversion, and signal generation. Isothermal amplification such as RPA and LAMP is mainly used for signal amplification, CRISPR gene scissors technology is used for signal conversion, and signal generation For this, various fluorescent substances or proteins are used.
  • CRISPR-Cas protein is a type of CRISPR-Cas protein, and refers to a CRISPR protein having an activity of randomly cleaving non-targeted single-stranded DNA (ssDNA) when activated by the detection of target DNA. and is used interchangeably with “CRISPR-Cas12a” or “CRISPR/Cas12a”.
  • Cas12a from Lachnospiraceae bacteria recognizes its target DNA using a guide RNA complementary to the target DNA sequence and a T nucleotide-rich protospacer-adjacent motif (PAM) in the target, and after recognition, activated LbCas12a not only catalyzes target DNA cleavage, but also promotes non-specific ssDNA cleavage (Chen et al., 2018, Science 360, 436-439).
  • PAM protospacer-adjacent motif
  • the term "molecular diagnosis” refers to DETECTR, which is a molecular diagnosis technology based on CRISPR-Cas12a.
  • DETECTR DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter
  • HPV human papillomavirus
  • DETECTR utilizes the activity of randomly cleaving single-stranded DNA when Cas12a is activated by recognizing target DNA, using a guide RNA that specifically binds to the target site and a single-stranded DNA probe or reporter that does not bind to the target site. This is a method for diagnosing the presence of target DNA by generating easily measurable fluorescence signals.
  • single-stranded DNA probe refers to a reporter used to determine the presence or absence of a target nucleic acid by DETECTR, and may be a single-stranded DNA having a sequence that does not hybridize to a target site. It can be labeled with a Fluorophore-Quencher pair or the like so that it can generate a detectable signal when cleaved by activated Cas12a.
  • LFA also called lateral flow assay
  • lateral flow assay is a well-known technique for pregnancy diagnosis kits, and means an assay that enables rapid detection without skilled personnel or expensive equipment. If a sample solution such as blood is dropped on a device such as a strip, bacteria or viruses in the sample can be detected in a short time using lateral flow and specific target binding such as antigen-antibody reaction, mainly in a sandwich method. nanoparticles are used.
  • LFA has high field applicability because it produces results that can be confirmed with the naked eye.
  • a method and kit for rapidly detecting severe fever with thrombocytopenia syndrome virus (SFTSV) using genetic scissors according to one embodiment of the present invention rapidly detects severe fever with thrombocytopenia syndrome virus using isothermal amplification and CRISPR-Cas12 in situ. and high sensitivity detection, enabling early diagnosis of SFTSV infection without special expertise, technology, equipment, or infrastructure.
  • Figure 1 shows the target site of the SFTSV S gene for SFTSV DETECTR according to one embodiment of the present invention and the location of gRNA and primers for its recognition and amplification.
  • Figure 2 shows a schematic diagram of CRISPR-Cas12a-based SFTSV DETECTR combined with fluorescence analysis or lateral flow assay (LFA) according to one embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a schematic diagram showing a method for distinguishing a positive result from a negative result in an LF strip by SFTSV DETECTR combined with LFA according to one embodiment of the present invention.
  • C-line indicates a control line and T-line indicates a test line.
  • Figure 4 shows the detection of lentiviruses pseudotyped with SFTSV S gene using DETECTR combined with a fluorescence assay according to an embodiment of the present invention.
  • Lentiviruses pseudotyped with the SFTSV S gene 100 colony forming units (CFU)
  • IAV and IBV 100 plaque forming units (PFU)
  • HCV and HEV 100 genome copies
  • Figure 5 shows the sensitivity of the SFTSV DETECTR assay according to one embodiment of the present invention.
  • Lentiviruses pseudotyped with different concentrations of the SFTSV S gene (1.0 x 10 -1 to 1.0 x 10 2 CFU per reaction) were lysed via HUDSON, and via RT-RPA using a primer set specific to the SFTSV S gene.
  • amplified 5A and B show the results of RT-RPA amplicon detection by SFTSV DETECTR combined with LFA using gRNAs S1 and S2 corresponding to all SFTSV genotypic variants, respectively. Fluorescence saturation occurred within 10 minutes. LFA results were evaluated 2 minutes after reacting the strip with the sample.
  • FIG. 6 to 8 show the results of applying SFTSV DETECTR according to one embodiment of the present invention to clinical samples.
  • Figure 6 shows the results obtained by extracting RNA from patient plasma samples and performing RT-PCR for detection of SFTSV. PCR products (1510 bp) were visualized by gel electrophoresis.
  • IAV A/Puerto Rico/8/1934
  • IBV B/Brisbane/60/2008
  • HCV JFH-1
  • 47832c HCV
  • a fragment (SEQ ID NO: 7) from nucleotide 1216 to nucleotide 1370 of the SFTSV S gene sequence was synthesized (Macrogen, Seoul, Korea) and amplified by PCR using the following primers: forward direction Primer (5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAAAGTCTGAGCCTTCGCTTCT-3′: SEQ ID NO: 5) and reverse primer (5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGCTATGTTCTTCTCCATCAAGAAC-3′: SEQ ID NO: 6).
  • forward direction Primer (5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAAAGTCTGAGCCTTCGCTTCT-3′: SEQ ID NO: 5)
  • reverse primer 5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGCTATGTTCTTCTCCATCAAGAAC-3′: SEQ ID NO: 6).
  • BP and LR Gateway reactions were performed to generate the pLenti CMV SFTS S gene segment
  • HEK293T cells were cultured using OmicsfectTM according to the manufacturer's instructions (Omics Biotechnology, Seoul, Korea) to generate pLenti CMV SFTSV S gene segments, pMD2.G, pMDLg/pRRE. and co-transfected with pRSV-Rev.
  • pMD2.G pMDLg/pRRE and pRSV-Rev were kindly donated by Didier Trono (pMD2.G Addgene plasmid # 12259; http://n2t.net addgene:12259; RRID:Addgene_12259, pMDLg/pRRE Addgene plasmid # 12251; http http://n2t.net/addgene:12251; RRID:Addgene_12251, pRSV-Rev Addgene plasmid # 12253; http://n2t.net/addgene:12253; RRID:Addgene_12253)) (Journal of virology 72(11), 8463 -8471).
  • the culture medium was filtered through a 0.45 ⁇ m filter (Sartorius, Gottingen, Germany) to obtain virus.
  • polybrene Prior to transduction, polybrene was added to the filtrate at a final concentration of 10 ⁇ g/mL.
  • Lentiviral titers were determined according to the MD Anderson Cancer Center Limiting Dilution-Colony Counting protocol ( https://www.mdanderson.org/ ). Virus handling was performed in a BSL-2 (Biosafety level 2) laboratory.
  • RT-PCR was performed to amplify the complete S (small) segment of viral RNA from stored serum as previously reported. Specifically, with a total of 20 ⁇ l of reaction solution including 8 ⁇ l of one-step RT-PCR premix, 7 ⁇ l of detection solution and 5 ⁇ l of RNA template, RT-PCR was performed under the following conditions: 30 ⁇ l at 45 ° C.
  • Virus was lysed using Heating Unextracted Diagnostic Samples to Obliterate Nucleases (HUDSON) as described by Myhrvold et al. (Myhrvold et al., Science 360(6387), 444-448).
  • HUDSON Heating Unextracted Diagnostic Samples to Obliterate Nucleases
  • TCEP tris(2-carboxyethyl)phosphine
  • EDTA tris(2-carboxyethyl)phosphine
  • the reaction mixture was incubated using a thermocycler in the following order: 50°C for 20 minutes, and 95°C for 5 minutes.
  • the RT-RPA reaction mixture consisted of 29.5 ⁇ l rehydration buffer, 2.4 ⁇ l forward and reverse primers (10 ⁇ M each), 1 ⁇ l TOPscriptTM Reverse Transcriptase (Enzynomics, Daejeon, Korea), 1 ⁇ l RNase inhibitor (Enzynomics) and 2.5 ⁇ l of 280 mM magnesium acetate was included. Sample and nuclease-free water were added to the reaction mixture to obtain a final volume of 50 ⁇ l. For HUDSON-treated virus-containing cultures, 1 ⁇ l of sample was added to the reaction mixture, and for HUSON-treated patient plasma, 5 ⁇ l of sample was added. The reaction mixture was incubated at 42° C. for 30 minutes.
  • LbCas12a trans-cleavage assay was performed (Broughton et al., 2020, Nature Biotechnology 38, 870-774).
  • LbCas12a and gRNA were added to 1 ⁇ NEBuffer 2.1 to obtain final concentrations of 50 nM and 62.5 nM, respectively.
  • the reaction mixture was incubated at 37° C. for 30 minutes.
  • RT-RPA product For fluorescence analysis, 2 ⁇ l of RT-RPA product, 80 ⁇ l NEBuffer 2.1, 18 ⁇ l LbCas12a-gRNA complex, and 2 ⁇ l of 10 ⁇ M Fluorophore Quencher (FQ)-labeled reporter (/56-FAM/TTATT/3IABkFQ/, Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) was added directly to a 96-well microplate. After incubation at 37° C. for 10 minutes, fluorescence results were obtained ( ⁇ ex, 485 nm; ⁇ em, 535 nm).
  • FQ Fluorophore Quencher
  • RT-RPA product For LFA, 2 ⁇ l RT-RPA product was mixed with 40 ⁇ l of 1x NEBuffer 2.1, 36 ⁇ l LbCas12a-gRNA complex, and 2 ⁇ l 10 ⁇ M lateral flow cleavage reporter (/56-FAM/TTATT/3Bio/ , Integrated DNA Technologies) and incubated at 37° C. for 10 minutes. A lateral flow strip (Milenia HybriDetect 1, TwistDx) was applied to the sample and the result was read after 2 minutes.
  • Example 1 Detection of SFTSV using DETECTR.
  • DETECTR for SFTSV SFTSV DETECTR
  • Figures 1 to 3 show a schematic of the design of primers and gRNA for SFTSV DETECTR, fluorescence analysis or DETECTR combined with LFA.
  • a diagnostic sample containing SFTSV was lysed through HUDSON, and viral nucleic acid was amplified using reverse transcription recombinase polymerase amplification (RT-RPA) with a primer set specific to the SFTSV S gene.
  • RT-RPA reverse transcription recombinase polymerase amplification
  • RT-RPA amplicons were incubated with gRNAs targeting the LbCas12a and SFTSV S genes and analyzed by fluorescence analysis using a ssDNA-fluorescent material (FAM) quencher (FQ)-labeled reporter or by LFA using an ssDNA-FAM-biotin reporter.
  • FAM ssDNA-fluorescent material
  • FQ quencher
  • S1 and S2 Two gRNAs (S1 and S2) were designed for detection of all genotypic variants. Table 2 shows gRNA sequences and PAM sequences.
  • lentiviruses pseudotyped with SFTSV S gene segments were generated. Lentiviruses pseudotyped with SFTSV S gene segments were lysed via HUDSON without extraction and SFTSV DETECTR combined with fluorescence analysis was performed. To establish the specificity of SFTSV DETECTR, Influenza A virus (IAV), Influenza B virus (IBV), Hepatitis C virus (HCV), and Hepatitis E virus (HEV) were used as controls. Both gRNAs successfully targeted the RT-RPA amplicon.
  • IAV Influenza A virus
  • IBV Influenza B virus
  • HCV Hepatitis C virus
  • HEV Hepatitis E virus
  • SFTSV DETECTR combined with fluorescence assay successfully detected lentiviruses pseudotyped with the SFTSV S gene, without cross-reactivity to IAV, IBV, HCV and HEV.
  • the results are shown in FIG. 4 .
  • the minimum reaction times required for HUDSON, RT-RPA, and target detection were 10 min, 30 min, and 10 min, respectively (FIG. 2).
  • LFA took an additional 2 minutes for interpretation of the results. Therefore, the SFTSV DETECTR system of the present inventors can effectively detect SFTSV from diagnostic samples within 50 and 52 minutes by fluorescence analysis and LFA, respectively.
  • Example 2 Determination of the sensitivity (LoD) of the SFTSV DETECTR assay.
  • Lentiviruses pseudotyped with the SFTSV S gene were lysed by HUDSON at various CFUs per reaction (1.0 x 10 -1 , 1.0 x 10 0 , 1.0 x 10 1 , and 1.0 x 10 2 CFU), and SFTSV DETECTR was performed SFTSV was detected. The results are shown in FIG. 5 . Using fluorescence assay and LFA, SFTSV DETECTR was able to detect lentivirus pseudotyped with the SFTSV S gene up to 1 x 100 CFU per reaction. Both S1 and S2 gRNAs showed similar activity in the detection of SFTSV.
  • SFTSV DETECTR was used to detect SFTSV in patient plasma samples and the results were compared with those of RT-PCR diagnostic tests.
  • 4 Patients # 1-4
  • SFTSV DETECTR fluorescence analysis using S1 and S2 gRNAs and SFTSV DETECTR combined with LFA also confirmed infection in the same four patients (Patients # 1-4) ( FIGS. 7 and 8 ).
  • LAMP which is a well-known isothermal amplification method
  • four or more primers are required, but since various genotypes of SFTSV cannot be amplified by one set of LAMP primers, LAMP was not adopted.
  • the SFTSV DETECTR system by RT-RPA and CRISPR-Cas12a showed no cross-reactivity to other RNA viruses including IAV, IBV, HCV and HEV.
  • SFTSV DETECTR showed similar sensitivity to RT-PCR, but took a shorter time to detect the virus in patients' plasma samples. Without separate RNA extraction, viral nucleic acids from patients' plasma samples were successfully lysed with HUDSON, amplified and detected with SFTSV DETECTR under isothermal conditions. Our results confirmed the clinical applicability of SFTSV DETECTR, supporting the possibility of replacing RT-PCR.
  • LF strips were used for rapid evaluation of reads.
  • the LFA results showed a similar degree of sensitivity and accuracy to those obtained by fluorometry.
  • the present inventors performed RT-RPA at 37 °C instead of 42 °C or performed target detection analysis at 42 °C instead of 37 °C. Although the fluorescence signal decreased by 25%, there was no problem in reading the result. Therefore, with the development of a novel pre-treatment method that does not require a thermocycler and does not cause the problem of false positive bands caused by LFA, SFTSV DETECTR can be effectively used to establish a field-implementable diagnostic test kit.

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Abstract

유전자 가위 기반 중증열성혈소판감소증후군 바이러스(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus: SFTSV)의 신속 검출 방법 및 키트에 관한 것으로, 구체적으로, 중증열성혈소판감소증후군 바이러스(SFTSV)에 특이적인 프라이머 세트와 가이드 RNA, 및 CRISPR-Cas12a를 이용하여, 중증열성혈소판감소증후군 바이러스를 신속하게 검출하는 분자진단 방법 및 그를 위한 키트가 개시된다.

Description

유전자가위 기반 중증열성혈소판감소증후군 바이러스의 신속 검출
유전자 가위 기반 중증열성혈소판감소증후군 바이러스(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus: SFTSV)의 신속 검출 방법 및 키트에 관한 것으로, 구체적으로, 중증열성혈소판감소증후군 바이러스(SFTSV)에 특이적인 프라이머 세트와 가이드 RNA, 및 CRISPR-Cas12a를 이용하여, 중증열성혈소판감소증후군 바이러스를 신속하게 검출하는 분자진단 방법 및 그를 위한 키트가 개시된다.
중증 열성 혈소판 감소 증후군(SFTS)은 SFTSV로도 알려진, 다비 반다바이러스(Dabie bandavirus)에 의해 유발되는 신종 전염성 질병이다. 최초로 의심되는 사례는 2009년 중국 후베이성 및 헤난성에서 보고되었고, 바이러스는 2011년에 분리되었다(New England Journal of Medicine 364(16), 1523-1532). 2013년 이후, STFS는 일본 및 한국에서도 확인되었고, 이들 국가에서 감염 사례가 지속적으로 보고되었다 (Emerging infectious diseases 19(11), 1892; The Journal of infectious diseases 209(6), 816-827). SFTSV는 중국, 일본 및 한국의 진드기 헤마피살리스 롱지코르니스(Haemaphysalis longicornis)에 물리는 것에 의해 전파된다. L(large segment), M(medium segment), 및 S(small segment) 서열에 근거하여 SFTSV의 6종의 유전형(A, B, C, D, E, 및 F)이 분류되었다. 중국에서는 6종의 모든 유전형이 만연하고, 한국에서는 유전형 B가 대부분이며, 유전형 A, D, 및 F는 더 낮은 빈도로 발생한다 (PLoS neglected tropical diseases 11(9), e0005893).
고열, 근육통, 두통, 복통, 구토, 및 기침, 및 혈소판감소증, 백혈구감소증 및 위장관 출혈과 같은 임상적 증상이 SFTS 감염의 일반적 증상이다. 중국, 일본 및 한국에서 SFTS의 사망률은 각각 4.8%, 27% 및 23.3%이고, 연령에 따라 증가되는 것으로 보고되었다(JCI insight 5(2); Virologica Sinica 32(1), 51-62). 평균적으로, 60세 이상의 노년층이 감염에 더 취약하다 (Hu et al. 2018; Park et al. 2019b; Sun et al. 2017). 현재 SFTS에 대한 백신이나 치료제는 없고, 단지 대증적 치료만이 제공되고 있어서, 성공적인 치료를 위해 SFTSV 감염의 조기 진단의 중요성을 보여준다.
정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 또는 RT-PCR을 이용한 핵산-기반 테스트가 SFTSV 진단을 위한 기술을 제공한다. 이 방법들은 낮은 카피수 및 다양한 SFTSV 서브타입의 바이러스를 효과적으로 검출하나, 써모사이클러(thermocycler)를 포함한 특별한 장비, RNA 추출, 및 숙련된 인력을 필요로 하므로 신속한 현장 진단에 이용하기에는 한계가 있다. SFTSV에 대한 항체를 검출하는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)가 SFTSV의 검출을 위해 추가적으로 개발되었으나, 상업적으로 활용되지는 못했다 (Journal of clinical microbiology 50(2), 372-377).
최근에, CRISPR(clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats) 및 Cas(CRISPR-associated) 시스템을 이용한 현장응용성이 높은 신속 진단 기법이 도입되었다(Cell discovery 4(1), 1-4; Nature communications 10(1), 1-9). 라크노스피라세애(Lachnospiraceae) 박테리아로부터의 Cas12a는 T 뉴클레오티드-풍부 PAM(protospacer-adjacent motif)을 갖는 표적 DNA 서열에 상보적인 가이드 RNA (gRNA)를 이용하여 표적 DNA를 인식할 수 있다 (Nature 532(7600), 522-526). 인식 후에, LbCas12a가 활성화되어 비특이적 단일-가닥 DNA 절단을 유도한다(Science 360, 436-439). LbCas12a의 트랜스-절단 활성 및 등온 핵산 증폭에 기반하여, DETECTR(DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter)로 명명된 신규한 분자 진단 방법이 개발되었고 (Science 360, 436-439) SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2), HPV(human papilloma virus), IAV(influenza A virus) 및 IBV(influenza virus)를 포함한 바이러스 감염의 진단에 성공적으로 적용되었다 (Broughton et al. 2020; Chen et al. 2018; Park et al. 2021).
본 발명자들은 현장에 적용하여 SFTSV를 조기에 효과적으로 검출할 수 있는 방법에 대한 연구를 수행하여, 시료로부터 별도의 핵산의 추출 없이, HUDSON(heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases)을 DETECTR와 결합시킨, SFTSV 검출을 위한 신속하고, 민감하며, 현장-적용가능한 진단 방법을 개발하였다.
본 발명은 SFTSV에 특이적인 프라이머 세트 및 가이드 RNA와 CRISPR-Cas12a를 이용하여 SFTSV를 신속하고 정밀하게 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, SFTSV 검출용 프라이머 세트 및 가이드 RNA를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, SFTSV에 특이적인 프라이머 세트 및 가이드 RNA와 CRISPR-Cas12a를 포함하는 SFTSV 검출용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양태는 유전자 가위를 이용하여 중증열성혈소판감소증후군 바이러스(SFTSV)를 검출하는 방법으로서,
시료를 제공하는 단계,
SFTSV의 S 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 시료 중 핵산을 등온증폭시키는 단계, 및
상기 등온증폭에 의해 수득된 산물에 SFTSV의 S 유전자에 특이적인 가이드 RNA와 CRISPR-Cas(CRISPR-associated protein) 12a, 및 단일가닥 DNA 프로브를 첨가하여 유전자 가위에 의한 분자진단을 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 가이드 RNA는 T-뉴클레오티드가 풍부한 PAM 서열을 갖는 SFTSV의 S 유전자를 표적으로 하는 것인 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 PAM 서열은 TTTG 또는 TTTA일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 시료는 SFTSV를 포함하는 시료일 수 있고, SFTSV의 검출이 필요한 대상으로부터 수득된 시료일 수 있다. 상기 시료는 타액, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 흡입물, 및 생검 시료를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 시료를 제공하는 단계는 상기 시료를 가열하여 상기 시료 중 핵산분해효소 활성을 제거하고 바이러스 입자를 분해시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 시료를 제공하는 단계는 시료 중 핵산을 추출하는 단계 없이, 시료 중에 존재하는 바이러스 입자를 용해시키고, 이들 중에 존재하는 RNase를 열과 화학적 처리, 예를 들면, EDTA의 첨가에 의해 불활성화시키는 단계(HUDSON, Heatin Unextracted Diagnostic Samples to Obliterate Nucleases)를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 등온증폭시키는 단계는 상기 핵산 중 시료를 역전사시키는 단계 및 역전사에 의해 수득된 산물을 주형으로 등온증폭 반응을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 등온증폭시키는 단계는 서열번호 1과 2로 이루어진 SFTSV 특이적 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA(Reverse Transcription-Recombinase Polymerase Amplification)에 의해 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 분자진단을 수행하는 단계에서 SFTSV의 S 유전자에 특이적인 가이드 RNA는 서열번호 3 또는 4의 서열로 구성되는 것일 수 있다. 상기 가이드 RNA는 모든 유전형의 SFTSV의 S 유전자에 유전자 가위가 특이적으로 작용할 수 있게 하도록 설계된 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 분자진단을 수행하는 단계에서 SFTSV의 S 유전자에 특이적인 가이드 RNA는 TTTG의 PAM 서열을 인식하고 상보적인 서열을 갖는 표적에 특이적으로 결합하는 서열번호 3의 서열로 구성될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 분자진단을 수행하는 단계에서 SFTSV의 S 유전자에 특이적인 가이드 RNA는 TTTA의 PAM 서열을 인식하고 상보적인 서열을 갖는 표적에 특이적으로 결합하는 서열번호 4의 서열로 구성될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 SFTSV를 검출하는 방법은 SFTSV의 유전형에 관계없이 SFTSV를 검출할 수 있어서, 유전형 A, B, C, D, E, 및 F의 SFTSV를 검출할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 분자진단을 수행하는 단계는 상기 가이드 RNA에 의한 등온증폭 산물 중 표적 부위의 검출, CRISPR-Cas12a의 활성화, 및 활성화된 CRISPR-Cas12a에 의한 단일가닥 DNA 프로브의 절단을 포함하며, 상기 단일가닥 DNA 프로브는 상기 가이드 RNA와 혼성화되지 않고, 표지 물질로 표지된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 CRISPR-Cas12a는 라크노스피라세애(Lachnospiraceae) 박테리아로부터 유래된 LbCas12a일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 분자진단을 수행하는 단계는 단일가닥 DNA 프로브의 절단 여부를 형광 분석이나 LFA(lateral flow assay)에 의해 검출하여 상기 시료 중 SFTSV의 존재 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 핵산을 등온증폭시키는 단계와 형광 분석 또는 LFA는 동일한 온도에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 핵산을 등온증폭시키는 단계와 형광 분석 또는 LFA는 37℃ 또는 42℃에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 단일가닥 DNA 프로브는 형광물질과 소광물질로 이중 표지될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 단일가닥 DNA 프로브는 비오틴과 형광물질에 의해 이중 표지될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 형광물질은 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 형광 염료일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, LFA는 스트립 상에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 방법은 서열번호 1과 2로 이루어진 SFTSV 특이적 프라이머 세트 및 서열번호 3 또는 4의 SFTSV 특이적 가이드 RNA를 이용하여 수행되고, 1 pfu(plaque forming unit)의 SFTSV의 검출 민감도를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 SFTSV 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 SFTSV 검출용 프라이머 세트는 SFTSV의 S 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 1로 구성된 정방향 프라이머와 서열번호 2로 구성된 역방향 프라이머로 이루어진다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 SFTSV 검출용 프라이머 세트는 SFTSV의 S 유전자의 RT-RPA(Reverse Transcription-Recombinase Polymerase Amplification)에서 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 SFTSV 검출용 가이드 RNA를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 가이드 RNA는 TTTG의 PAM 서열을 인식하고 상보적인 서열을 갖는 SFTSV의 S 유전자 표적에 특이적으로 결합하는 서열번호 3의 서열로 구성될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 가이드 RNA는 TTTA의 PAM 서열을 인식하고 상보적인 서열을 갖는 SFTSV의 S 유전자 표적에 특이적으로 결합하는 서열번호 4의 서열로 구성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 SFTSV에 특이적인 프라이머 세트와 가이드 RNA, CRISPR-Cas12a, 및 단일가닥 DNA 프로브를 포함하는, SFTSV 검출용 키트로서, 상기 SFTSV에 특이적인 프라이머 세트는 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머로 구성되고, 상기 가이드 RNA는 서열번호 3 또는 4로 구성되는 것인 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 키트는 RT-RPA 및 CRISPR-Cas12a 기반 검출에 의해 SFTSV를 검출하기 위해 이용되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 키트는 형광법 또는 LFA에 의한 검출을 위한 시약을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 다르게 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "SFTSV"는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스를 의미하고, 이 바이러스는 3개의 세그먼트, L(large), M(medium), 및 S(small)로 구성된 음성 단일-가닥 RNA를 게놈으로 갖는 바이러스이다. L 세그먼트는 바이러스 RNA의 복제 및 전사를 담당하는 RNA-의존성 RNA 폴리머라아제를 코딩하고, M 세그먼트는 외피를 구성하는 Gn 및 Gs로 가공되는, 당단백질(glycoprotein) 전구체를 코딩하며, S 세그먼트는 양쪽성(ambisense) RNA로서, 2개의 단백질 코딩한다. S 세그먼트의 안티센스 RNA는 NP(nucleocapsid protein)를 코딩하고, 센스 RNA는 NS(nonstructural protein)를 코딩한다. NP는 바이러스 복제 및 전사에서 기능하고, NS는 숙주 면역 반응을 조절한다 (Experimental & Molecular Medicine 53(5), 713-722; New England Journal of Medicine 364(16), 1523-1532; Virologica Sinica 32(1), 51-62).
본 명세서에서 사용된 용어, "등온 증폭"은 써모사이클러 없이, 단일 온도에서의 인큐베이션에 의해 핵산을 증폭하는 방법을 의미하며, "등온 핵산 증폭"과 호환적으로 사용된다. 등온 증폭은 증폭 반응 동안 표적 핵산의 열 변성에 의존하지 않으며, 온도의 빠른 변화를 필요로 하지 않는 핵산 증폭이므로, 실험실 환경 내부 및 외부에서 수행될 수 있다. 등온 증폭 방법은 루프-매개 등온 증폭(LAMP), 재조합효소 중합효소 증폭(RPA), 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "유전자가위"는 크리스퍼(CRISPR: Clustered Interspaced Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas (CRISPR-associated) 단백질을 의미한다. 유전자가위 기반 분자진단은 신호 증폭, 신호 변환, 및 신호 발생으로 구성되며, 신호 증폭을 위해 주로 RPA 및 LAMP와 같은 등온 증폭이 이용되고, 신호 변환을 위해 크리스퍼 유전자 가위 기술이 이용되며, 신호 발생을 위해 다양한 형광 물질이나 단백질이 이용된다.
본 명세서에서 사용된 용어, "Cas12a"는 CRISPR-Cas 단백질의 일종으로, 표적 DNA의 검출에 의해 활성화되면 비표적화된 단일가닥 DNA(ssDNA)를 무작위적으로 절단하는 활성을 갖는 크리스퍼 단백질을 의미하며, "CRISPR-Cas12a" 또는 "CRISPR/Cas12a"와 호환적으로 사용된다. 라크노스피라세애(Lachnospiraceae) 박테리아로부터의 Cas12a는 표적 DNA 서열에 상보적인 가이드 RNA 및 표적에 있는 T 뉴클레오티드-풍부 PAM(protospacer-adjacent motif)을 이용하여 그의 표적 DNA를 인식하고, 인식 후에, 활성화된 LbCas12a는 표적 DNA 절단을 촉매할 뿐 아니라, 비특이적 ssDNA 절단을 촉진한다(Chen et al., 2018, Science 360, 436-439). 이러한 Cas12a의 활성을 이용하여 유전자가위에 기반한 분자진단방법이 개발되고 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "분자진단"은 CRISPR-Cas12a에 기반한 분자진단 기술인 DETECTR를 의미한다. DETECTR(DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter) 분석법은 LbCas12a의 트랜스-절단 활성 및 RPA와 같은 등온 핵산 증폭 기술을 이용하여, 임상 시료 중 HPV(human papillomavirus)의 신속하고 특이적인 검출을 위해 개발되었다(Chen et al., 2018, Science 360, 436-439). DETECTR는 Cas12a가 표적 DNA를 인지하여 활성화되었을 때 단일가닥 DNA를 무작위로 절단하는 활성을 이용하여, 표적 부위에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA와 표적 부위에 결합하지 않는 단일가닥 DNA 프로브 또는 리포터를 이용하여 표적 DNA의 존재 여부를 용이하게 측정가능한 형광 신호의 발생으로 진단하는 방법이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "단일가닥 DNA 프로브"는 DETECTR에 의해 표적 핵산의 존재 여부를 확인하기 위해 이용되는 리포터를 의미하며, 표적 부위와 혼성화되지 않는 서열의 단일가닥 DNA일 수 있다. 활성화된 Cas12a에 의해 절단될 때 검출가능한 신호를 생성할 수 있도록 형광-소광물질(Fluorophore-Quencher) 쌍 등에 의해 표지될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "LFA"는 측방 유동 분석(lateral flow assay)으로도 불리며, 임신 진단 키트로 잘 알려진 기술로서 숙련된 인력이나 값비싼 장비 없이도 빠른 검출을 가능하게 하는 분석법을 의미한다. 혈액과 같은 시료 용액을 스트립과 같은 장치에 떨어뜨리기만 하면 측방 유동과 항원항체 반응과 같은 특이적 표적 결합을 이용해 단시간 내에 시료 중의 박테리아나 바이러스를 검출할 수 있고, 주로 샌드위치 방식으로 형광/발색 표지나 나노입자가 사용된다. 특히, LFA는 육안으로 확인가능한 결과를 도출하므로 현장응용성이 높다.
본 발명의 일 구체예에 따른 유전자 가위를 이용하여 중증열성혈소판감소증후군 바이러스(SFTSV)를 신속하게 검출하는 방법 및 키트는 현장에서 등온 증폭 및 CRISPR-Cas12를 이용하여 중증열성혈소판감소증후군 바이러스를 신속하고, 높은 민감도로 검출할 수 있게 하여, 특별한 전문지식이나 기술, 기기, 기반시설이 없어도 SFTSV 감염을 조기에 진단할 수 있게 한다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 SFTSV DETECTR를 위한 SFTSV S 유전자의 표적 부위 및 그의 인식 및 증폭을 위한 gRNA 및 프라이머의 위치를 보여준다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 형광 분석법 또는 LFA(lateral flow assay)와 결합된, CRISPR-Cas12a-기반 SFTSV DETECTR의 개략도를 보여준다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 LFA와 결합된 SFTSV DETECTR에 의한 LF 스트립에서 양성 결과와 음성 결과를 구별하는 방법을 보여주는 개략도이다. 도면 중 C-line은 대조군 라인(control line), T-line은 테스트 라인(test line)을 의미한다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른 형광 분석법과 결합된 DETECTR를 이용한 SFTSV S 유전자로 슈도타입화된 렌티바이러스(lentiviruses pseudotyped with SFTSV S gene)의 검출을 보여준다. SFTSV S 유전자 (100 CFU(colony forming units)), IAV 및 IBV (100 PFU(plaque forming units)) 및 HCV 및 HEV (100 게놈 카피)로 슈도타입화된 렌티바이러스를 HUDSON을 통해 용해시키고, 바이러스 핵산을 SFTSV S 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA를 통해 증폭시켰다. 도 4의 A 및 B는 각각 모든 SFTSV 유전형 변이체에 상응하는 gRNA S1 및 S2를 이용하여 형광 분석법과 결합된 SFTSV DETECTR에 의해 RT-RPA 앰플리콘을 검출한 결과를 나타낸다. 형광 포화는 10분 내에 일어났다. 값들은 평균 ± 표준 편차 (오류 막대)로 표시된다 (n = 3개의 재현물; * 시료간 p < 0.05, two-sample t-test).
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 SFTSV DETECTR 분석법의 민감도를 보여준다. 상이한 농도의 SFTSV S 유전자로 슈도타입화된 렌티바이러스(반응당 1.0 x 10-1 내지 1.0 x 102 CFU)를 HUDSON을 통해 용해시키고, SFTSV S 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA를 통해 증폭시켰다. 도 5의 A 및 B는 각각 모든 SFTSV 유전형 변이체에 상응하는 gRNA S1 및 S2를 이용하여 LFA와 결합된 SFTSV DETECTR에 의해 RT-RPA 앰플리콘을 검출한 결과를 나타낸다. 형광 포화는 10분 내에 일어났다. LFA 결과는 스트립을 시료와 반응시킨 후 2분 경과 시에 평가했다. 값들은 평균 ± 표준 편차 (오류 막대)로 표시된다 (n = 3개의 재현물; * 시료간 p < 0.05, two-sample t-test). C-line, 대조군 라인; T-line, 테스트 라인; NTC, 주형 불포함 대조군(no template control).
도 6 내지 8은 본 발명의 일 구체예에 다른 SFTSV DETECTR를 임상 시료에 적용한 결과를 보여준다. 도 6은 환자 혈장 시료로부터 RNA를 추출하고 SFTSV 검출을 위한 RT-PCR을 수행하여 얻은 결과를 나타낸다. PCR 산물(1510 bp)을 겔 전기영동에 의해 시각화시켰다. 도 7 및 8 각각 HUDSON-처리 환자 혈장 시료를 이용하여 SFTSV S 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA를 통해 바이러스 핵산을 증폭하고, 각각 모든 SFTSV 유전형 변이체에 상응하는 gRNA S1 및 S2를 이용하여 LFA와 결합된 SFTSV DETECTR에 의해 RT-RPA 앰플리콘을 검출한 결과를 나타낸다. 형광 포화는 10분 내에 일어났다. LFA 결과는 스트립을 시료와 반응시킨 후 2분 경과 시에 평가했다. 값들은 평균 ± 표준 편차 (오류 막대)로 표시된다 (n = 3개의 재현물; * 시료간 p < 0.05, two-sample t-test). C-line, 대조군 라인; T-line, 테스트 라인; NTC, 주형 불포함 대조군(no template control).
하기에서, 본 발명은 첨부된 도면을 참조하여, 실시예를 통해 더 설명된다. 그러나, 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것으로 해석되지 않는다.
재료 및 방법
1. 바이러스
IAV (A/Puerto Rico/8/1934), IBV (B/Brisbane/60/2008), HCV (JFH-1) 및 (47832c)의 증식 및 적정은 이전에 기술된 바와 같이(Kim et al. 2019; Park et al. 2019a; Schemmerer et al. 2016; Yi 2010) 수행했다. SFTSV S 유전자 단편에 의해 슈도타입화된 렌티바이러스를 제조하기 위해, pLenti CMV Puro DEST를 이용한 GATEWAY 클로닝을 통해 pLenti CMV SFTSV S 유전자 단편 벡터를 생성했다. pLenti CMV Puro DEST (w118-1) 구조체는 Eric Campeau 및 Paul Kaufman으로부터 기증받았다 (Addgene #17452 ; http://n2t.net/addgene:17452 ; RRID: Addgene 17452) (PloS one 4(8), e6529). SFTSV S 유전자 서열(GenBank Accession No.KP663745.1)의 1216번 뉴클레오티드로부터 1370번 뉴클레오티드까지의 단편(서열번호 7)을 합성하고(Macrogen, Seoul, Korea) 하기 프라이머를 이용한 PCR을 통해 증폭시켰다: 정방향 프라이머(5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAAAGTCTGAGCCTTCGCTTCT-3': 서열번호 5) 및 역방향 프라이머(5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGCTATGTTCTTCTCCATCAAGAAC-3': 서열번호 6). 뒤이어, BP 및 LR Gateway 반응(Invitrogen, Massachusetts, USA)을 수행하여 pLenti CMV SFTS S 유전자 세그먼트를 생성시켰다.
SFTSV S 유전자로 슈도타입화된 렌티바이러스의 생산을 위해, HEK293T 세포를 제조사(Omics Biotechnology, Seoul, Korea)의 설명서에 따라 Omicsfect™를 이용하여 pLenti CMV SFTSV S 유전자 세그먼트, pMD2.G, pMDLg/pRRE 및 pRSV-Rev로 동시-형질감염시켰다. pMD2.G, pMDLg/pRRE 및 pRSV-Rev는 Didier Trono로부터 기증받았다 (pMD2.G Addgene plasmid # 12259; http://n2t.net addgene:12259; RRID:Addgene_12259, pMDLg/pRRE Addgene plasmid # 12251; http://n2t.net/addgene:12251; RRID:Addgene_12251, pRSV-Rev Addgene plasmid # 12253; http://n2t.net/addgene:12253; RRID:Addgene_12253)) (Journal of virology 72(11), 8463-8471). 형질감염 후 48시간 차에, 배양 배지를 0.45㎛ 필터 (Sartorius, Gottingen, Germany)를 통해 여과시켜 바이러스를 수득했다. 형질도입 전에, 폴리브렌(polybrene)을 10 ㎍/mL의 최종 농도로 여과액에 첨가했다. MD 앤더슨 암 센터(MD Anderson Cancer Center)의 제한 희석-콜로니 계수(Limiting Dilution-Colony Counting) 프로토콜에 따라 렌티바이러스 역가를 결정했다 (https://www.mdanderson.org/). 바이러스의 취급은 BSL-2(Biosafety level 2) 실험실에서 수행했다.
2. 임상 시료
테스트된 9명의 환자 중에서, 4명이 제주대학교 병원(대한민국, 제주도)에서 SFTS로 확진되었다. SFTSV의 분자적 진단을 위해, QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 보관된 환자 혈청으로부터 RNA를 추출했다. 이전에 보고된 바와 같이 보관되었던 혈청으로부터의 바이러스 RNA의 완전한 S(small) 세그먼트를 증폭시키기 위해 RT-PCR을 수행했다. 구체적으로, 8 ㎕의 one-step RT-PCR premix, 7 ㎕의 검출 용액 및 5 ㎕의 RNA 주형을 포함하는 총 20 ㎕의 반응액으로, 하기 조건 하에 RT-PCR을 수행했다: 45℃에서 30분, 90℃에서 10분 인큐베이션 후에, 95℃에서 15초, 및 48℃에서 30초로 이루어진 사이클을 45회 반복했다. (The American journal of tropical medicine and hygiene 95(6), 1351-1357; The American journal of tropical medicine and hygiene 93(3), 468). 본 연구는 제주대학교 병원의 IRB(Institutional Review Board)로부터 승인받았다(IRB file no. 2018-11-002).
3. HUDSON
Myhrvold 등에 의해 개시된 바와 같이, 바이러스를 HUDSON(Heating Unextracted Diagnostic Samples to Obliterate Nucleases)을 이용하여 용해시켰다(Myhrvold et al., Science 360(6387), 444-448). IAV, IBV, HCV 및 HEV의 배양 배지에서 RNase를 불활성화시키기 위해 각각 TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine) 및 EDTA를 100 mM 및 1 mM의 최종 농도로 첨가했다. 반응 혼합물을 써모사이클러를 이용하여 하기의 순서로 인큐베이션시켰다: 50℃에서 20분, 및 95℃에서 5분. 혈액 혈장에서 RNase를 불활성화시키기 위해, 시료에 TCEP 및 EDTA를 각각 100 mM 및 1 mM의 최종 농도로 첨가했다. 시료를 써모사이클러를 이용하여 50℃에서 5분, 뒤이어 64℃에서 5분 인큐베이션시켰다. HUDSON 후 혼합물의 고형화를 방지하기 위해 RNase-불포함 물을 1:4의 비율로 첨가했다.
4. DETECTR 분석
제조사의 매뉴얼에 따라 설계된 프라이머(표 1)로, TwistAmp Basic 키트 (TwistDx, Cambridge,　UK)를 이용하여 RT-RPA를 통해 바이러스 RNA를 증폭시켰다. RT-RPA 반응 혼합물은 29.5 ㎕ 재수화 완충액, 2.4 ㎕ 정방향 및 역방향 프라이머(각각 10 μM), 1 ㎕ TOPscript™ Reverse Transcriptase (Enzynomics, Daejeon, Korea), 1 ㎕ RNase 억제제 (Enzynomics) 및 2.5 ㎕의 280 mM 마그네슘 아세테이트를 포함했다. 시료 및 뉴클레아제-불포함 물을 반응 혼합물에 첨가하여 50 ㎕의 최종 부피를 얻었다. HUDSON-처리 바이러스 함유 배양액의 경우, 반응 혼합물에 1 ㎕의 시료를 첨가하고, HUSON-처리 환자 혈장의 경우, 5 ㎕의 시료를 첨가했다. 반응 혼합물을 42℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다.
Broughton 등에 의해 개시된 방법과 유사하게, LbCas12a 트랜스-절단 분석을 수행했다(Broughton et al., 2020, Nature Biotechnology 38, 870-774). LbCas12a-gRNA 복합체를 형성하기 위해, LbCas12a 및 gRNA를 각각 1Х NEBuffer 2.1에 첨가하여 50 nM 및 62.5 nM의 최종 농도를 얻었다. RT-RPA 반응을 위해 반응 혼합물을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다.
형광 분석을 위해, 2 ㎕의 RT-RPA 산물, 80 ㎕ NEBuffer 2.1, 18 ㎕ LbCas12a-gRNA 복합체, 및 2 ㎕의 10 μM FQ(Fluorophore Quencher)-표지 리포터(/56-FAM/TTATT/3IABkFQ/, Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)를 직접 96-웰 마이크로플레이트에 첨가했다. 37℃에서 10분 동안 인큐베이션시킨 후에, 형광 결과를 얻었다(λex, 485 nm; λem, 535 nm).
LFA를 위해, 2 ㎕ RT-RPA 산물을 40 ㎕의 1x NEBuffer 2.1, 36 ㎕ LbCas12a-gRNA 복합체, 및 2 ㎕ 10 μM 측방 유동 절단 리포터(lateral flow cleavage reporter)(/56-FAM/TTATT/3Bio/, Integrated DNA Technologies)와 37℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. LF 스트립(lateral flow strip) (Milenia HybriDetect 1, TwistDx)을 시료에 적용하고, 2분 후에 결과를 판독했다.
실시예 1. DETECTR를 이용한 SFTSV의 검출.
신속하고 민감한 진단을 구현하기 위해, SFTSV를 위한 DETECTR(SFTSV DETECTR)를 설계했다. 도 1 내지 3에 SFTSV DETECTR를 위한 프라이머와 gRNA의 설계, 형광 분석 또는 LFA와 결합된 DETECTR의 개략도가 도시된다. SFTSV를 포함하는 진단용 시료를 HUDSON을 통해 용해시키고, SFTSV S 유전자에 특이적인 프라이머 세트에 의한 RT-RPA(everse transcription recombinase polymerase amplification)를 이용하여 바이러스 핵산을 증폭시켰다. 사용된 프라이머 세트의 서열이 표 1에 표시된다. RT-RPA 앰플리콘을 LbCas12a 및 SFTSV S 유전자를 표적으로 하는 gRNA와 인큐베이션시키고 ssDNA-형광물질 (FAM) 소광물질 (FQ)-표지 리포터를 이용한 형광 분석 또는 ssDNA-FAM-비오틴 리포터를 이용한 LFA에 의해 LbCas12a의 트랜스-절단 활성을 결정했다. 모든 유전형 변이체의 검출을 위해 2종의 gRNA (S1 및 S2)를 설계했다. 표 2에 gRNA 서열 및 PAM 서열이 표시된다.
SFTSV DETECTR를 검증하고 최적화하기 위해, SFTSV S 유전자 세그먼트로 슈도타입화된 렌티바이러스를 생성했다. SFTSV S 유전자 세그먼트로 슈도타입화된 렌티바이러스를 추출없이, HUDSON을 통해 용해시키고, 형광 분석과 결합된 SFTSV DETECTR를 수행했다. SFTSV DETECTR의 특이도를 확립하기 위해, IAV(Influenza A virus), IBV(influenza B virus), HCV(hepatitis C virus) 및 HEV(hepatitis E virus)를 대조군으로 이용했다. 2종의 gRNA는 모두 성공적으로 RT-RPA 앰플리콘을 표적으로 인식했다. 또한, 형광 분석과 결합된 SFTSV DETECTR는 IAV, IBV, HCV 및 HEV에 대한 교차 반응 없이, SFTSV S 유전자로 슈도타입화된 렌티바이러스를 성공적으로 검출했다. 도 4에 결과가 도시된다. HUDSON, RT-RPA 및 표적 검출을 위해 요구되는 최소 반응 시간은 각각 10분, 30분, 및 10분이었다(도 2). LFA는 결과 해석을 위해 추가적으로 2분을 더 소요했다. 따라서, 본 발명자들의 SFTSV DETECTR 시스템은 형광 분석 및 LFA에 의해 각각 50분 및 52분 내에 진단용 시료로부터 SFTSV를 효과적으로 검출할 수 있다.
적용 바이러스 유전자 프라이머 서열
RT-RPA SFTS
 S
 SFTS-S-F AAGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACG(서열번호 1)
SFTS-S-R TGGACAAAGCGTCTACGCTGCAGTCCTCGC(서열번호 2)
바이러스 유전자 gRNA 서열 PAM
SFTS S S1 CAGGGAAGAACACCGATCTT(서열번호 3) TTTG
SFTS S S2 TTGCCTCAAAAGGTGTGGTG (서열번호 4) TTTA
실시예 2. SFTSV DETECTR 분석의 민감도(LoD)의 결정.
SFTSV S 유전자로 슈도타입화된 렌티바이러스를 반응당 다양한 CFU(1.0 x 10-1, 1.0 x 100, 1.0 x 101, 및 1.0 x 102 CFU)로 HUDSON에 의해 용해시키고, SFTSV DETECTR을 수행하여 SFTSV를 검출했다. 도 5에 결과가 도시된다. 형광 분석 및 LFA를 이용하여, SFTSV DETECTR는 반응당 1 x 100 CFU까지 SFTSV S 유전자로 슈도타입화된 렌티바이러스를 검출할 수 있었다. S1 및 S2 gRNA 모두 SFTSV의 검출에서 유사한 활성을 보였다.
실시예 3. SFTSV DETECTR의 임상시료로의 적용
임상 적용성을 평가하기 위해, SFTSV DETECTR를 이용하여 환자 혈장 시료에서 SFTSV를 검출하고, 결과를 RT-PCR 진단 테스트의 결과와 비교했다. SFTSV 감염으로 의심되어 입원한 9명의 환자 중에서, 4명 (환자 # 1-4)이 RT-PCR에 의해 SFTSV에 감염된 것으로 확인되었다(도 6). RT-PCR 결과와 일치되게, S1 및 S2 gRNA를 이용한 형광 분석 및 LFA와 결합된 SFTSV DETECTR도 동일한 4명의 환자 (환자 # 1-4)에서 감염을 확인했다(도 7 및 8). 이러한 결과는 SFTSV DETECTR가 임상 시료에서의 SFTSV 검출에 대해 RT-PCR과 유사한 민감도를 갖는다는 것을 명확하게 보여준다.
본 연구에서, 본 발명자들은 SFTSV에 대한 신속하고 민감한 CRISPR-Cas12-기반 진단 방법(SFTSV DETECTR)을 개발했고, 형광 분석법 및 LFA와 결합하여, 각각 50분 및 52분 내에 반응당 1 x 100 CFU의 LoD(Limit of Dectection)로 SFTSV를 성공적으로 검출할 수 있었다. 모든 보고된 SFTSV 유전형 변이체의 검출을 위한 2개의 gRNA를 설계하고 SFTSV DETECTR에서 이용하였다. 바이러스 RNA의 증폭을 위해 RT-RPA를 선택했다. 잘 알려진 등온 증폭 방법인 LAMP의 경우, 4종 이상의 프라이머가 요구되나, 1 세트의 LAMP 프라이머에 의해 SFTSV의 다양한 유전형을 증폭할 수 없으므로, LAMP를 채택하지 않았다. RT-RPA 및 CRISPR-Cas12a에 의한 SFTSV DETECTR 시스템은 IAV, IBV, HCV 및 HEV를 포함한 다른 RNA 바이러스에 대해 교차-반응성을 보이지 않았다.
SFTSV DETECTR는 RT-PCR과 유사한 민감도를 보이나, 환자의 혈장 시료 중 바이러스 검출을 위해 더 짧은 시간을 소요했다. 별도의 RNA 추출 없이, 환자의 혈장 시료로부터 바이러스 핵산을 HUDSON을 통해 성공적으로 용해시키고 등온 조건 하에서 SFTSV DETECTR로 증폭시키고 검출했다. 본 발명자들의 결과는 SFTSV DETECTR의 임상적 적용성을 확인하여, RT-PCR을 대체할 가능성을 뒷받침했다.
현장 구현성(field deployability)을 확보하기 위해, 판독물의 신속한 평가를 위한 LF 스트립을 이용했다. LFA 결과는 형광 분석법에 의해 수득된 결과와 유사한 정도의 민감도 및 정확성을 보였다. 또한, 본 발명자들은 반응 온도를 맞추기 위해, RT-RPA를 42℃가 아닌 37℃에서 수행하거나 표적 검출 분석을 37℃가 아닌 42℃에서 수행했다. 형광 신호가 25% 감소했으나, 결과 판독에는 문제가 없었다. 따라서, 써모사이클러가 필요하지 않고, LFA에 의한 위양성 밴드의 문제를 일으키지 않는 신규한 전-처리 방법의 개발로, SFTSV DETECTR는 현장-구현가능한 진단 테스트 키트를 확립하기 위해 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims (19)

  1. 유전자 가위를 이용하여 중증열성혈소판감소증후군 바이러스(SFTSV)를 검출하는 방법으로서,
    시료를 제공하는 단계,
    SFTSV의 S 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 시료 중 핵산을 등온증폭시키는 단계, 및
    상기 등온증폭에 의해 수득된 산물에 SFTSV의 S 유전자에 특이적인 가이드 RNA와 CRISPR-Cas(CRISPR-associated protein) 12a, 및 단일가닥 DNA 프로브를 첨가하여 유전자 가위에 의한 분자진단을 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 SFTSV의 S 유전자에 특이적인 프라이머 세트는 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머로 구성되는 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 가이드 RNA는 T-뉴클레오티드가 풍부한 PAM 서열을 갖는 SFTSV의 S 유전자를 표적으로 하는 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 시료를 제공하는 단계는 상기 시료를 가열하여 상기 시료 중 핵산분해효소 활성을 제거하고 바이러스 입자를 분해시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 등온증폭시키는 단계는 서열번호 1과 2로 이루어진 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA(Reverse Transcription-Recombinase Polymerase Amplification)에 의해 수행되는 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 3 또는 4의 서열로 구성되는 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 분자진단을 수행하는 단계는 상기 가이드 RNA에 의한 등온증폭 산물 중 표적 부위의 검출, CRISPR-Cas12a의 활성화, 및 활성화된 CRISPR-Cas12a에 의한 단일가닥 DNA 프로브의 절단을 포함하며, 상기 단일가닥 DNA 프로브는 상기 가이드 RNA와 혼성화되지 않고 표지 물질로 표지된 것인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 CRISPR-Cas12a는 라크노스피라세애(Lachnospiraceae) 박테리아로부터 유래된 LbCas12a인 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 분자진단을 수행하는 단계는 단일가닥 DNA 프로브의 절단 여부를 형광 분석이나 LFA(lateral flow assay)에 의해 검출하여 상기 시료 중 SFTSV의 존재 여부를 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 LFA는 스트립 상에서 수행되는 것인 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 등온증폭시키는 단계와 형광 분석 또는 LFA는 동일한 온도에서 수행되는 것인 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 온도는 37℃ 또는 42℃인 것인 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 서열번호 1과 2로 이루어진 SFTSV 특이적 프라이머 세트 및 서열번호 3 또는 4의 SFTSV 특이적 가이드 RNA를 이용하여 수행되고, 1 pfu(plaque forming unit)의 SFTSV의 검출 민감도를 갖는 것인 방법.
  14. SFTSV의 S 유전자에 특이적인 프라이머 세트와 가이드 RNA, CRISPR-Cas12a, 및 단일가닥 DNA 프로브를 포함하는, SFTSV 검출용 키트로서, 상기 SFTSV의 S 유전자에 특이적인 프라이머 세트는 서열번호 1로 구성된 프라이머 및 서열번호 2로 구성된 프라이머로 구성되고, 상기 가이드 RNA는 서열번호 3 또는 4로 구성되는 것인 키트.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 키트는 RT-RPA 및 CRISPR-Cas12a 기반 검출에 의해 SFTSV를 1 pfu의 민감도로 검출하는 것인 키트.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 키트는 형광법 또는 LFA에 의한 검출을 위한 시약을 더 포함하는 것인 키트.
  17. 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진, SFTSV 검출용 프라이머 세트.
  18. 서열번호 3으로 구성된, SFTSV 검출용 가이드 RNA.
  19. 서열번호 4로 구성된, SFTSV 검출용 가이드 RNA.
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