WO2023074326A1 - 顕微鏡装置及び画像取得方法 - Google Patents

顕微鏡装置及び画像取得方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2023074326A1
WO2023074326A1 PCT/JP2022/037668 JP2022037668W WO2023074326A1 WO 2023074326 A1 WO2023074326 A1 WO 2023074326A1 JP 2022037668 W JP2022037668 W JP 2022037668W WO 2023074326 A1 WO2023074326 A1 WO 2023074326A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
light
excitation light
harmonic
excitation
intensity
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/037668
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
直也 松本
卓 井上
Original Assignee
浜松ホトニクス株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 浜松ホトニクス株式会社 filed Critical 浜松ホトニクス株式会社
Priority to CN202280071824.0A priority Critical patent/CN118176452A/zh
Priority to DE112022005149.3T priority patent/DE112022005149T5/de
Priority to JP2023556272A priority patent/JPWO2023074326A1/ja
Publication of WO2023074326A1 publication Critical patent/WO2023074326A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements

Definitions

  • the present disclosure relates to a microscope device and an image acquisition method.
  • Patent Document 1 discloses a saturated excitation (SAX) microscope.
  • SAX saturated excitation
  • the laser light is modulated so that the time change of the intensity of the laser light, which is the excitation light, becomes a cosine wave.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 disclose combining a SAX microscope and a two-photon excitation microscope. In these documents, the intensity of the excitation light is modulated so that the time change of the intensity of the excitation light becomes a sine wave.
  • multiphoton excitation microscopy an object to be observed is irradiated with a long-wavelength, ultrashort pulsed light such as near-infrared light as excitation light to cause multiphoton excitation such as two-photon excitation in the object to be observed. is detected to create an observation image.
  • this multiphoton excitation microscope since long-wavelength light with excellent object-transmitting properties is used, it is possible to noninvasively observe, for example, the deep part of living tissue.
  • n-photon excitation where n is an integer of 2 or more
  • the fluorescence intensity is proportional to the n-th power of the excitation light intensity. Therefore, when the observation object is irradiated with excitation light having a sinusoidal time waveform to cause n-photon excitation in the observation object, the time waveform of the fluorescence output from the observation object is the n-th power of the sine wave. will be proportional.
  • the present disclosure has been made in view of such problems, has the advantages of both SAX microscopes and multiphoton excitation microscopes, and can create observation images using relatively low-order harmonics. It is an object of the present invention to provide a microscopic device and an image acquisition method that are capable of.
  • the microscope device includes an excitation light output section, an optical system, and a harmonic detection section.
  • the excitation light output unit outputs excitation light.
  • the time waveform of the light intensity of the excitation light includes the n-th root (n is an integer of 2 or more) of the linear function of the sine wave.
  • the maximum value of the light intensity of the excitation light exceeds the saturated excitation intensity in the observed object.
  • the optical system irradiates the observation target with the excitation light output from the excitation light output section.
  • the harmonic detector detects the second harmonic contained in the time waveform of the light intensity of the fluorescence generated in the observed object by the n-photon excitation caused by irradiation with the excitation light.
  • An image acquisition method includes an excitation light output step, an excitation light irradiation step, a harmonic detection step, and an image generation step.
  • pumping light output step pumping light is output.
  • the time waveform of the light intensity of the excitation light includes the n-th root (n is an integer of 2 or more) of the linear function of the sine wave.
  • the maximum value of the light intensity of the excitation light exceeds the saturated excitation intensity in the observed object.
  • the excitation light irradiation step the observation target is irradiated with the excitation light output in the excitation light output step.
  • the harmonic detection step the second harmonic contained in the time waveform of the light intensity of the fluorescence generated in the observed object by the n-photon excitation caused by irradiation with the excitation light is detected.
  • the image generation step an observed image of the observed object is generated based on the second harmonic.
  • the time waveform of the excitation light intensity contains the n-th root of a linear function of a sine wave.
  • the fluorescence intensity is proportional to the n-th power of the excitation light intensity. Therefore, when the observation object is irradiated with excitation light having a time waveform including the n-th root of a linear function of a sine wave to cause n-photon excitation in the observation object, the fluorescence time waveform output from the observation object is is proportional to a linear function of the sine wave, not to the power of the sine wave.
  • observation images can be obtained based on lower-order harmonics such as the second harmonic or the third harmonic. Therefore, according to these microscope devices and image acquisition methods, it is not necessary to reduce the frequency of the excitation light due to restrictions on the frequency range of the device that detects fluorescence, thus avoiding an increase in the time required to create observation images. can do. Alternatively, equipment with a lower frequency range can be used, leading to cost reduction.
  • the excitation light output unit may have a light source that outputs pulsed light and an intensity modulation type optical modulator that modulates the pulsed light output from the light source to generate excitation light.
  • the excitation light output step may include an intensity modulation step of modulating the pulsed light to generate the excitation light.
  • the optical modulator may be an AO modulator.
  • the light source may be a laser light source.
  • the pulsed light may be laser light. This makes it possible to generate, with a simple configuration, excitation light having a high intensity capable of causing n-photon excitation.
  • the minimum value within each period in the time waveform of the light intensity of the excitation light may be greater than 0, or may be received in the harmonic detector or the harmonic detection step. It may be greater than 0.1% and less than 20% of the maximum signal. At and near the minimum value within each period of the time waveform of the excitation light intensity, the intensity of the generated fluorescence is slight, and the detection result is greatly affected by noise. By making the minimum value in each period of the excitation light intensity time waveform larger than 0, the influence of noise can be reduced, the detection accuracy of the second harmonic can be improved, and the observation image can be made clearer.
  • the noise can be reduced to increase the detection accuracy of the second harmonic, and the observation image can be made clearer.
  • the time waveform of the excitation light intensity contains the square root of a linear function of a sine wave
  • the rate of change of the light intensity near the minimum value within each period compared to when the time waveform of the excitation light intensity is a sine wave becomes larger.
  • the temporal waveform of the light intensity near the minimum value within each cycle becomes steep.
  • this rate of change becomes the largest.
  • the change rate of the light intensity near the minimum value in each period can be reduced, and the steepness of the temporal waveform can be reduced.
  • the minimum value in each period greater than 0.1% and less than 20% of the maximum signal that can be received in the harmonic detector or harmonic detection step, The rate of change in light intensity can be reduced, and the steepness of the temporal waveform can be relaxed. Therefore, it becomes easy to shape the time waveform of the excitation light intensity in the excitation light output section, particularly to shape the time waveform near the minimum value in each cycle.
  • the harmonic detection unit includes a photodetection device that generates a signal corresponding to the light intensity of the fluorescence generated in the observed object, and a signal that is input from the photodetection device and included in the time waveform of the signal. a lock-in amplifier that outputs a second harmonic.
  • the harmonic detection step includes generating a signal corresponding to the light intensity of fluorescence generated in the observed object, and outputting the second harmonic contained in the time waveform of the signal. and a step.
  • the harmonic detector may further detect a third harmonic contained in the time waveform of the light intensity of the fluorescence generated in the observed object.
  • the harmonic detection step may further detect a third harmonic contained in the time waveform of the light intensity of the fluorescence generated in the observed object.
  • an observed image of the observed object may be generated based on one or both of the second harmonic and the third harmonic. In this case, it is possible to easily generate an observation image using a harmonic suitable for the observed object, out of the second harmonic and the third harmonic.
  • the time waveform of the light intensity of the excitation light output from the excitation light output unit includes a square root of a linear function of a sine wave
  • the harmonic detection unit or the harmonic detection step includes the excitation light A second harmonic contained in the time waveform of the light intensity of the fluorescence generated in the observed object by two-photon excitation due to the irradiation of .
  • the excitation light output device is used in a fluorescence microscope that generates an observation image based on the time waveform of the light intensity of fluorescence generated in an observation object by two-photon excitation caused by excitation light irradiation.
  • This excitation light output device outputs excitation light in which the time waveform of the light intensity includes the square root of a linear function of a sine wave, and the maximum value of the light intensity exceeds the saturation excitation intensity in the observed object.
  • An excitation method is an excitation method in a fluorescence microscope that generates an observation image based on the time waveform of the light intensity of fluorescence generated in an observation object by two-photon excitation due to irradiation of excitation light.
  • the observation target is irradiated with excitation light whose time waveform of the light intensity includes a square root of a linear function of a sine wave, and the maximum value of the light intensity exceeds the saturation excitation intensity of the observation target.
  • FIG. 1 is a diagram showing the configuration of a microscope apparatus.
  • FIG. 2 is a diagram showing a time waveform of excitation light.
  • FIG. 3 is a diagram showing the configuration of the optical scanner.
  • FIG. 4 is a flow chart for explaining the operation of the microscope device.
  • Part (a) of FIG. 5 conceptually shows the fluorescence intensity distribution in the SAX microscope.
  • Part (b) of FIG. 5 conceptually shows the difference between the theoretical value and the measured value of the fluorescence intensity.
  • Part (a) of FIG. 6 conceptually shows the time waveform of the excitation light intensity.
  • Part (b) of FIG. 6 conceptually shows the time waveform of fluorescence intensity.
  • Part (a) of FIG. 7 conceptually shows the time waveform of the excitation light intensity.
  • Part (a) of FIG. 8 is a graph showing the result of Fourier transform of the time waveform of the light intensity of the fluorescence measured by the microscope device.
  • Part (b) of FIG. 8 is a graph showing the result of Fourier transform of the time waveform of fluorescence intensity measured when the time waveform of excitation light intensity is a sine wave.
  • Part (a) of FIG. 9 is a graph showing the relationship between the light intensity of the fluorescence fundamental wave and the second harmonic measured by the microscope device and the relative intensity of the excitation light. Part (b) of FIG.
  • FIG. 9 shows the light intensity of the fundamental wave, the second harmonic and the third harmonic of the fluorescence measured when the time waveform of the excitation light intensity is a sine wave, and the relative intensity of the excitation light. is a graph showing the relationship of FIG. 10 is a diagram conceptually showing the time waveform of excitation light.
  • FIG. 11 is a graph conceptually showing the relationship between the applied voltage and the output light intensity of a general AO modulator.
  • FIG. 12 is a diagram showing the outline of the configuration of the light irradiation device according to the second embodiment.
  • FIG. 13 is a diagram showing the polarization direction of azimuthally polarized light in a plane perpendicular to the optical axis. Parts (a) to (h) of FIG.
  • FIG. 14 show condensed images of azimuthally polarized light.
  • FIG. 15 is a diagram showing a helical phase pattern.
  • Parts (a) to (h) of FIG. 16 are diagrams showing condensed light images when phase modulation by a helical phase pattern is applied to azimuth polarized light.
  • FIG. 17 is a diagram showing an example of the configuration of a ring mask viewed from the optical axis direction.
  • Parts (a) to (e) of FIG. 18 are diagrams showing an example of the arrangement order of the polarization converter, the phase converter, and the ring mask.
  • FIG. 19 is a flow chart for explaining the operation of the microscope device. Parts (a) and (b) of FIG.
  • FIG. 20 are diagrams showing the condensed spot shape of a cross section including the optical axis and parallel to the optical axis.
  • FIG. 21 is a graph showing the lateral resolution ratio for each aperture ratio when no ring mask is used.
  • FIG. 22 is a graph showing the lateral resolution ratio for each aperture ratio when a ring mask is used.
  • Parts (a) to (d) of FIG. 23 are diagrams showing second harmonic-detected fluorescence in a cross section including the optical axis and parallel to the optical axis direction.
  • Parts (a) to (d) of FIG. 24 are diagrams showing third harmonic-detected fluorescence in a cross section including the optical axis and parallel to the optical axis direction.
  • FIG. 21 is a graph showing the lateral resolution ratio for each aperture ratio when no ring mask is used.
  • FIG. 22 is a graph showing the lateral resolution ratio for each aperture ratio when a ring mask is used.
  • FIG. 25 is a diagram showing a schematic configuration of a light irradiation device according to a second modification.
  • FIG. 26 is a diagram showing an example of a phase pattern forming an amplitude modulation ring mask.
  • FIG. 27 is a diagram showing an example of a phase pattern forming an amplitude modulation ring mask.
  • FIG. 1 is a diagram showing the configuration of a microscope device 1 according to the first embodiment of the present disclosure.
  • the microscope device 1 is a device for acquiring an image of an observation object B, and includes an excitation light output unit (excitation light output device) 10, an optical system 20, a harmonic wave detection unit 30, and an image generation unit 40. and a signal generator (function generator) 50 .
  • Observation object B is, for example, a biological sample.
  • the excitation light output unit 10 outputs excitation light La for exciting the object B to be observed.
  • the excitation light La is coherent light or incoherent light.
  • the wavelength of the excitation light La is included in the near-infrared region, for example. Specifically, the wavelength of the excitation light La is within the range of 650 nm to 1800 nm.
  • the excitation light La is, for example, laser light.
  • the following formula (1) is a formula showing the time waveform of the excitation light La.
  • Ir is the light intensity of the excitation light La
  • t time
  • f frequency
  • a and b are constants.
  • the time waveform of the excitation light La includes the square root of the linear function of the sine wave.
  • FIG. 2 is a diagram conceptually showing an example of the time waveform of the excitation light La shown in Equation (1).
  • the vertical axis represents the light intensity (power) of the excitation light La
  • the horizontal axis represents time.
  • the time waveform of the excitation light La shown in FIG. 2 periodically repeats the minimum light intensity value Imin and the maximum light intensity value Imax.
  • the maximum value Imax of the light intensity in each cycle that is, the time rate of change near the peak value is relatively small, and the time change near the peak value is gentle.
  • the pumping light output unit 10 generates the pumping light La whose light intensity changes periodically in synchronization with the periodic signal from the signal generator 50 .
  • the period of the time waveform of the excitation light La is about 1 MHz to several GHz, and is 80 MHz in one example.
  • the time waveform of this period is shown as a pulse group including a plurality of pulses J arranged in a comb shape and having different intensities.
  • the period of the envelope K connecting the peaks of the pulses J included in the pulse group is, for example, about several tens of kHz to several hundreds of kHz.
  • the frequency of envelope K is less than 200 kHz. In another example, the frequency of envelope K is 1 MHz or less.
  • the frequency f above means the frequency of the envelope K.
  • the pumping light output unit 10 in one embodiment has a light source 11 and an optical modulator 12 .
  • the light source 11 outputs pulsed light Lp.
  • the light source 11 outputs pulsed light Lp having a time width on the order of picoseconds or femtoseconds, for example.
  • the time width of the pulsed light Lp is, for example, the time during which the light intensity of the pulsed light Lp exceeds half of the peak value.
  • the time width of the pulsed light Lp is, for example, within the range of 10 femtoseconds to 50 picoseconds.
  • the light source 11 is, for example, a laser light source, and one example is a mode-locked laser light source.
  • light source 11 may be an incoherent light source such as a light emitting diode.
  • the preferred wavelength range of the pulsed light Lp is the same as the preferred wavelength range of the excitation light La described above.
  • An AO modulator is particularly suitable as the optical modulator 12 when the time width of the pulsed light Lp is on the order of femtoseconds.
  • the excitation light La may be generated by controlling the magnitude of the drive current input to the light source 11, that is, by a direct modulation method. In that case, the optical modulator 12 is unnecessary.
  • the beam expander 21 is optically coupled to the pumping light output section 10 via a space and expands the beam diameter of the pumping light La output from the pumping light output section 10 .
  • the beam expander 21 includes, for example, a pair of lenses 211, 212 optically coupled to each other.
  • One lens 211 is provided in the front stage, that is, closer to the excitation light output section 10 than the other lens 212
  • the other lens 212 is provided in the rear stage, that is, further away from the excitation light output section 10 than the one lens 211 .
  • the front-stage lens 211 diffuses the excitation light La
  • the rear-stage lens 212 parallelizes the excitation light La.
  • the lenses 211 and 212 are glass lenses, for example.
  • the optical scanner 22 is optically coupled with the beam expander 21 through space.
  • the optical scanner 22 scans the irradiation position of the excitation light La on the observation object B by moving the optical axis of the excitation light La within a plane perpendicular to the optical axis of the excitation light La.
  • the optical scanner 22 may be configured with various optical scanners such as galvanometer scanners, resonant mirrors, or polygonal mirrors.
  • optical scanner 22 is a dual-axis galvanometer scanner.
  • FIG. 3 is a diagram showing another example of the optical scanner 22.
  • the optical scanner 22 shown in FIG. 3 has two scanners 221 and 222 . Both scanners 221 and 222 are uniaxial scanners. The scanning direction of the scanner 221 and the scanning direction of the scanner 222 are orthogonal to each other. The scanners 221 and 222 are optically coupled to each other via an optical system 223 such as a relay lens. The scanners 221 and 222 are galvanometer scanners, for example. In this manner, the optical scanner 22 may be configured by combining a plurality of uniaxial scanners.
  • the irradiation position of the observation object B with the excitation light La may be scanned by moving the stage on which the observation object B is placed in a plane perpendicular to the optical axis of the excitation light La. In that case, the optical scanner 22 may not be provided.
  • the relay lens system 23 is provided on the optical path between the optical scanner 22 and the objective lens 25 and optically couples the optical scanner 22 and the objective lens 25 .
  • the relay lens system 23 is, for example, a telecentric relay lens system. If the optical scanner 22 and the objective lens 25 are extremely close, the relay lens system 23 can be omitted.
  • the dichroic mirror 24 transmits one of the excitation light La from the optical scanner 22 and the fluorescence Lb from the observation object B and reflects the other. In the example shown in FIG. 1, the dichroic mirror 24 transmits the excitation light La and reflects the fluorescence Lb. In the example shown in FIG. 1, dichroic mirror 24 is provided on the optical path between relay lens system 23 and objective lens 25 . The dichroic mirror 24 may be provided between the optical scanner 22 and the relay lens system 23 or may be provided between the beam expander 21 and the optical scanner 22 .
  • the objective lens 25 is arranged to face the observation object B, and condenses the excitation light La inside the observation object B.
  • the relative distance between the objective lens 25 and the observed object B is variable.
  • the objective lens 25 may be movable along the optical axis direction of the excitation light La, and the stage (not shown) on which the observation object B is placed may be movable along the optical axis direction of the excitation light La.
  • a mechanism for moving the objective lens 25 or the observation object B can be configured by, for example, a stepping motor or a piezo actuator.
  • the arrangement of the objective lens 25 with respect to the observed object B may be of an erect type or an inverted type.
  • the objective lens 25 concentrates the excitation light La on the observation object B at high density, two-photon excitation occurs in the observation object B, and fluorescence Lb is generated from the observation object B.
  • the wavelength of fluorescence Lb is, for example, within the range of 350 nm to 900 nm.
  • the objective lens 25 also has a function of collecting the fluorescence Lb from the observed object B.
  • the objective lens 25 serves as both an objective lens for the excitation light La and a lens for collecting the fluorescence Lb.
  • a separate objective lens for the excitation light La and a lens for collecting the fluorescence Lb may be provided.
  • an objective lens with a high numerical aperture (NA) may be used for the excitation light La, and the light may be locally focused by aberration correction.
  • An objective lens with a large pupil may be used for fluorescence Lb so that more light can be extracted.
  • An objective lens for excitation light La and a lens for collecting fluorescence Lb are arranged so as to sandwich an observation object B between them, and the excitation light La is emitted from the opposite surface of the observation object B to the incident surface. You may acquire the fluorescence Lb which carries out. In that case, the dichroic mirror 24 becomes unnecessary.
  • the harmonic detector 30 detects the second harmonic (or the second and third harmonics) contained in the time waveform of the light intensity of the fluorescence Lb.
  • harmonic detector 30 includes a photodetector device 31 and a lock-in amplifier 32 .
  • Photodetector device 31 is optically coupled to dichroic mirror 24 .
  • the light detection device 31 is optically connected to the objective lens for collecting the fluorescence Lb. Combined.
  • the photodetection device 31 generates an electrical signal corresponding to the light intensity of the fluorescence Lb generated in the observed object B.
  • the photodetector device 31 is sensitive to the wavelength of the fluorescence Lb and has the frequency range necessary to detect the second harmonic, or both the second and third harmonics of the fluorescence Lb.
  • the photodetector device 31 may be selected from one-dimensional photodetectors such as photomultiplier tubes or avalanche photodiodes. Alternatively, the photodetector device 31 may be selected from various two-dimensional photodetector elements such as a multi-anode PMT (Photomultiplier Tube), CCD image sensor, or CMOS image sensor.
  • a filter for cutting the wavelength of the excitation light La and the wavelength unnecessary for observation may be provided. good.
  • the lock-in amplifier 32 is electrically connected with the photodetector device 31 and the signal generator 50 .
  • the lock-in amplifier 32 receives from the photodetector device 31 an electrical signal corresponding to the light intensity of the fluorescence Lb. Additionally, the lock-in amplifier 32 receives from the signal generator 50 a sinusoidal signal having the same period as the periodic signal provided to the excitation light output section 10 . Using the sine wave signal from the signal generator 50 as a reference, the lock-in amplifier 32 detects the second harmonic, or the second and third harmonics contained in the time waveform of the signal from the photodetector device 31 . Detect both.
  • the image generator 40 is electrically connected to the lock-in amplifier 32 .
  • the image generation unit 40 receives a signal regarding the magnitude of the second harmonic contained in the time waveform of the light intensity of the fluorescence Lb from the lock-in amplifier 32, and based on this second harmonic, an observation image of the observation object B is generated. to generate Alternatively, the image generation unit 40 receives signals regarding the magnitudes of both the second and third harmonics contained in the time waveform of the light intensity of the fluorescence Lb from the lock-in amplifier 32, and A viewed image of the viewed object B is generated based on one or both of the harmonics.
  • the image generator 40 may be configured by a computer including, for example, a central processing unit (CPU) and memory.
  • the image generator 40 may further have a monitor for displaying the generated image.
  • FIG. 4 is a flowchart for explaining the operation of the microscope device 1 according to this embodiment. An image acquisition method according to the present embodiment will be described together with the operation of the microscope apparatus 1 with reference to FIG.
  • the excitation light output step S1 is performed.
  • the pumping light output step S1 the pumping light output unit 10 outputs the pumping light La.
  • the time waveform of the light intensity of the excitation light La includes the square root of the linear function of the sine wave (see formula (1)).
  • the maximum value Imax of the light intensity of the excitation light La in each period exceeds the saturation excitation intensity at the observed object B.
  • This excitation light output step S1 may include a step S11 of generating the pulsed light Lp in the light source 11 and an intensity modulation step S12 of modulating the pulsed light Lp in the optical modulator 12 to generate the excitation light La.
  • the excitation light irradiation step S2 is performed.
  • the excitation light La output in the excitation light output step S1 is applied to the observation target through the beam expander 21, the optical scanner 22, the relay lens system 23, the dichroic mirror 24, and the objective lens 25.
  • Fluorescence Lb is generated in the observed object B by two-photon excitation caused by the irradiation of the excitation light La.
  • the harmonic detection step S3 is performed.
  • the harmonic detector 30 detects the second harmonic or both the second and third harmonics contained in the time waveform of the light intensity of the fluorescence Lb.
  • the harmonic detection step S3 may include steps S31 and S32.
  • step S31 the photodetector device 31 generates a signal corresponding to the light intensity of the fluorescence Lb generated in the observed object B.
  • step S ⁇ b>32 the lock-in amplifier 32 outputs the second harmonic or both the second and third harmonics contained in the time waveform of the signal generated by the photodetector device 31 .
  • the excitation light output step S1, the excitation light irradiation step S2, and the harmonic detection step S3 are repeated while scanning the irradiation position of the excitation light La on the observation object B with the optical scanner 22 (steps S4 and S5). This provides data on the magnitude of the second harmonic, or both the second and third harmonics, at multiple locations on the object B to be observed.
  • image generation step S6 is performed.
  • the second harmonic contained in the time waveform of the light intensity of the fluorescence Lb is detected in the harmonic detection step S3, in the image generation step S6, the time of the light intensity of the fluorescence Lb at a plurality of irradiation positions of the excitation light La
  • the image generator 40 generates an observed image of the observed object B based on the magnitude of the second harmonic contained in the waveform.
  • the image generator 40 When both the second harmonic and the third harmonic contained in the time waveform of the light intensity of the fluorescence Lb are detected in the harmonic detection step S3, in the image generation step S6, at a plurality of irradiation positions of the excitation light La, The image generator 40 generates an observation image of the observation object B based on the magnitude of one or both of the second harmonic and the third harmonic included in the time waveform of the light intensity of the fluorescence Lb.
  • Part (a) of FIG. 5 is a diagram showing an example of fluorescence intensity distribution in the SAX microscope.
  • the peak intensity of excitation light is set higher than the saturated excitation intensity of the object to be observed.
  • the fluorescence intensity within a certain range from the center of the fluorescence intensity distribution is saturated, and the shape of the fluorescence intensity distribution (see the solid line F2 in the figure) changes from the theoretical value when there is no saturation (broken line F1 in the figure). ). Therefore, by taking the difference between the theoretical value and the measured value of the fluorescence intensity (see solid line F3 in part (b) of FIG. 5), the full width at half maximum of the intensity distribution can be reduced to increase the spatial resolution of the microscope. can.
  • the difference between the theoretical value and the measured value of the fluorescence intensity or a value approximating the difference is obtained by setting the time waveform of the excitation light intensity to a sinusoidal shape and the harmonics of the time waveform of the fluorescence intensity, such as the second harmonic. or obtained by detecting the third harmonic.
  • a long-wavelength ultrashort pulse light such as near-infrared light is used as excitation light to irradiate an object to be observed, causing two-photon excitation in the object to be observed, and detecting and observing the resulting fluorescence. Create an image.
  • this two-photon excitation microscope since long-wavelength light with excellent object-transmittance is used, it is possible to noninvasively observe, for example, the deep part of living tissue.
  • FIG. 6 conceptually shows the time waveform of excitation light intensity in the case of two-photon excitation (see part (a) of FIG. 6) and the time waveform of fluorescence intensity (see part (b) of FIG. 6).
  • FIG. 4 is a diagram showing; As shown in part (b) of FIG. 6, when an observation image is obtained based on fluorescence intensity having a time waveform that is deformed from a sine wave, a third harmonic A need arises to detect higher order harmonics, such as waves or the fifth harmonic. Since there is a limit to the maximum value of the frequency range of a device that detects the excitation light, for example, the lock-in amplifier 32, the frequency of the excitation light has to be reduced in order to detect higher-order harmonics. It takes a long time to create an image. Alternatively, equipment with a high upper frequency range must be introduced, resulting in high costs.
  • the time waveform of the light intensity of the excitation light La includes the square root of the linear function of the sine wave (see formula (1)).
  • the light intensity of the fluorescence Lb is proportional to the square of the light intensity of the excitation light La. Therefore, when the observation object B is irradiated with the excitation light La having a time waveform including the square root of the linear function of the sine wave to cause two-photon excitation in the observation object B, the excitation light output from the observation object B
  • the time waveform of La is proportional to a linear function of the sine wave rather than the square of the sine wave.
  • FIG. 7 is a diagram conceptually showing such a time waveform of excitation light intensity (see part (a) of FIG. 7) and a time waveform of fluorescence intensity (see part (b) of FIG. 7). be.
  • Part (a) of FIG. 8 is a graph showing the result of Fourier transform of the time waveform of the light intensity of the fluorescence Lb measured by the microscope device 1 of this embodiment.
  • Part (b) of FIG. 8 is a graph showing the result of Fourier transform of the time waveform of fluorescence intensity measured when the time waveform of excitation light intensity is a sine wave.
  • Arrows U1 in parts (a) and (b) of FIG. 8 point to the fundamental wave, and only this fundamental wave is generated when not saturated.
  • the excitation light intensity is a magnitude that causes saturation and the time waveform is a sine wave, as shown in part (b) of FIG.
  • Part (a) of FIG. 9 shows the light intensity (fluorescence intensity) of the fundamental wave and the second harmonic of the fluorescence Lb measured by the microscope apparatus 1 of the present embodiment, and the relative intensity of the excitation light La (relative excitation intensity). is a graph showing the relationship between In part (a) of FIG. 9, plot P11 indicates the fundamental wave and plot P12 indicates the second harmonic.
  • Part (b) of FIG. 9 shows the fundamental wave of fluorescence measured when the time waveform of the excitation light intensity is a sine wave, the light intensity (fluorescence intensity) of the second harmonic and the third harmonic, and the excitation light is a graph showing the relationship between the relative intensity (relative excitation intensity) of .
  • the arrangement of the plot of the second harmonic of the fluorescence Lb measured by the microscope apparatus 1 of the present embodiment is the arrangement of the plot of the third harmonic of the fluorescence measured with the time waveform of the excitation light intensity as a sine wave. Approximate. The reason why the arrangement of plot P12 is not similar to the arrangement of plot P23 in the region where the fluorescence intensity is small is considered to be due to measurement error.
  • the second harmonic (or the third harmonic)
  • detection corresponds to detection of the third harmonic (or fifth harmonic) when the time waveform of the excitation light intensity is a sine wave. That is, according to the microscope apparatus 1 of the present embodiment, an observation image can be obtained based on lower-order harmonics than when the time waveform of the excitation light intensity is a sine wave.
  • equipment with a low frequency range upper limit is often cheaper than equipment with a high frequency range, so cost reduction can be achieved.
  • the pumping light output unit 10 includes a light source 11 that outputs pulsed light Lp and an intensity modulation type optical modulator that modulates the pulsed light Lp output from the light source 11 to generate pumping light La. 12 and .
  • the pumping light output step S1 may include an intensity modulating step S12 of modulating the pulsed light Lp to generate the pumping light La. This makes it possible to easily generate the excitation light La including the square root of the linear function of the sine wave in the time waveform of the light intensity.
  • the intensity modulation type optical modulator 12 may be an AO modulator.
  • the AO modulator is suitable for high-speed, non-sinusoidal optical modulation as in this embodiment.
  • the light source 11 may be a laser light source, and the pulsed light Lp may be laser light.
  • the excitation light La having a high light intensity capable of causing two-photon excitation can be generated with a simple configuration.
  • the harmonic detector 30 receives a signal from the photodetector device 31 that generates a signal corresponding to the light intensity of the fluorescence Lb generated in the observation object B, and the signal from the photodetector device 31. and a lock-in amplifier 32 that outputs the second harmonic contained in the time waveform of the signal, or both the second and third harmonics.
  • the harmonic detection step S3 comprises a step S31 of generating a signal corresponding to the light intensity of the fluorescence Lb generated in the observation object B, a second harmonic contained in the time waveform of the signal, or a second harmonic detection. and a step S32 of outputting both the wave and the third harmonic.
  • the harmonic detector 30 may detect the second and third harmonics contained in the time waveform of the light intensity of the fluorescence Lb generated in the observation object B.
  • the harmonic detection step S3 the second and third harmonics included in the time waveform of the light intensity of the fluorescence Lb generated in the observation object B may be detected.
  • an observation image of the observation object B may be generated based on one or both of the second harmonic and the third harmonic. In this case, it is possible to easily generate an observation image using a harmonic suitable for the observed object B, out of the second harmonic and the third harmonic.
  • the minimum value Imin in each period of the time waveform of the light intensity of the excitation light La is set to be larger than 0.1% and larger than 20% of the maximum signal that can be received in the harmonic detector 30 or the harmonic detection step S3. You can make it smaller. As a result, the influence of noise can be reduced, the detection accuracy of the second harmonic and the third harmonic can be improved, and the observation image can be made clearer.
  • FIG. 11 is a graph showing a typical example of the relationship between the applied voltage and the output light intensity of a general AO modulator. As shown in FIG. 11, the output light intensity from the AO modulator changes nonlinearly with respect to the input applied voltage.
  • the minimum value Imin in each period is set to be larger than 0.1% and smaller than 20% of the maximum signal that can be received in the harmonic detector 30 or the harmonic detection step S3, the minimum The rate of change in light intensity near the value Imin can be reduced, and the steepness of the temporal waveform can be relaxed. Therefore, in the excitation light output unit 10 having the AO modulator as the optical modulator 12, it becomes easy to shape the time waveform of the optical intensity of the excitation light La, in particular, to shape the time waveform near the minimum value Imin in each period. .
  • the minimum value in each period in the time waveform of the light intensity of the fluorescence Lb When the minimum value Imin in each period is made larger than 0 as described above, the minimum value in each period in the time waveform of the light intensity of the fluorescence Lb also becomes larger than 0. Therefore, if the time waveform of the light intensity of the fluorescence Lb is used as it is in the lock-in amplifier 32, the detection accuracy of the second harmonic and the third harmonic may be lowered. In order to avoid such a risk, the time waveform of the light intensity of the fluorescence Lb is adjusted in the lock-in amplifier 32 or in the preceding stage of the lock-in amplifier 32 so that the minimum value in each period of the time waveform becomes zero. may In other words, the change in the time waveform of the fluorescence Lb due to the difference between the minimum value Imin of the excitation light La and zero may be canceled. [Second embodiment]
  • FIG. 12 is a diagram showing the configuration of the microscope device 2 according to the second embodiment.
  • the microscope device 2 is a device for acquiring an image of an observation object B.
  • the microscope device 2 includes an excitation light output section (excitation light output device) 10 , an optical system 20A, a harmonic wave detection section 30 , an image generation section 40 and a signal generator 50 .
  • the configurations of the excitation light output section 10, the harmonic wave detection section 30, the image generation section 40, and the signal generator 50 are the same as in the first embodiment.
  • the optical system 20A is an optical system for irradiating the observation object B with the excitation light La output from the excitation light output unit 10.
  • the optical system 20A includes an optical path of the excitation light La reaching the observation object B from the excitation light output unit 10.
  • the optical system 20A includes a beam expander 21, a polarization converter 61, a phase converter 62, a ring mask 63, an optical scanner 22, a relay lens system 23, a dichroic mirror 24, and an objective lens 25. have.
  • the configurations of the beam expander 21, optical scanner 22, relay lens system 23, dichroic mirror 24, and objective lens 25 are the same as in the first embodiment.
  • the polarization converter 61 , the phase converter 62 and the ring mask 63 are provided on the optical path between the beam expander 21 and the optical scanner 22 .
  • the irradiation position of the observation object B with the excitation light La may be scanned by moving the stage on which the observation object B is placed in a plane perpendicular to the optical axis of the excitation light La. .
  • the optical scanner 22 may not be provided.
  • the polarization converter 61 , the phase converter 62 and the ring mask 63 may be provided before the optical scanner 22 .
  • the polarization conversion section 61 is optically coupled to the excitation light output section 10 via the beam expander 21 .
  • the polarization converter 61 receives the excitation light La, converts the excitation light La into azimuth polarized light, and outputs the azimuth polarized light.
  • the polarization state of the excitation light La before input to the polarization conversion section 61 is, for example, linear polarization.
  • FIG. 13 is a diagram showing the polarization direction of azimuthally polarized light in a plane perpendicular to the optical axis. In FIG. 13, arrow A indicates the polarization direction.
  • FIG. 14 is a diagram showing a focused image of azimuthally polarized light. In FIG.
  • the light intensity is indicated by the shades of color, the darker the part, the lower the light intensity, and the lighter the part, the higher the light intensity.
  • parts (a) to (d) show the light intensity distribution in a plane perpendicular to the optical axis
  • parts (e) to (h) show planes containing the optical axis and parallel to the optical axis. shows the light intensity distribution within.
  • the XY coordinate system shown in the drawing is applied to parts (a) to (d).
  • the ZX coordinate system shown in the figure is applied to parts (e) to (h).
  • parts (b) and (f) show the light intensity (
  • Parts (c) and (g) show the light intensity (
  • Parts (d) and (h) show the light intensity (
  • Parts (a) and (e) show the light intensity (
  • the electric field oscillates along the tangential direction of the circumference centered on the optical axis, and the light intensity decreases near the optical axis. Therefore, the light intensity distribution of the azimuthally polarized light in the plane perpendicular to the optical axis is circular.
  • the polarization conversion unit 61 converts the excitation light La input from the excitation light output unit 10 into such azimuth polarized light and outputs the azimuth polarized light.
  • the polarization conversion section 61 can be composed of, for example, an azimuth polarizer or two spatial light modulators.
  • the azimuth polarizer may be a fixed azimuth polarizer processed on a glass plate or a variable azimuth polarizer using liquid crystal.
  • the phase conversion section 62 is optically coupled to the excitation light output section 10 via the beam expander 21 and the polarization conversion section 61 .
  • the phase conversion unit 62 inputs the excitation light La and imparts phase modulation to the excitation light La using a helical phase pattern.
  • FIG. 15 is a diagram showing a helical phase pattern. In FIG. 15, the magnitude of the phase is indicated by the shade of color. As shown in FIG. 15, in the helical phase pattern, the phase changes monotonously according to the angle around the optical axis Q. As shown in FIG. In one example, the phase varies from 0 (rad) to 2 ⁇ (rad) in this spiral phase pattern. That is, the width of the phase change in one round is 2 ⁇ (rad).
  • the phase conversion unit 62 may be composed of, for example, a helical phase plate or a phase modulation spatial light modulator.
  • the phase plate may be, for example, a glass plate processed for phase modulation.
  • FIG. 16 is a diagram showing a condensed image of light that is phase-modulated by a helical phase pattern and azimuthally polarized.
  • the light intensity is indicated by the shades of color, where the darker the part, the lower the light intensity, and the lighter the part, the higher the light intensity.
  • parts (a) to (d) show light intensity distributions in planes perpendicular to the optical axis
  • parts (e) to (h) show planes containing the optical axis and parallel to the optical axis. shows the light intensity distribution within.
  • the XY coordinate system shown in the drawing is applied to parts (a) to (d).
  • the ZX coordinate system shown in the figure is applied to parts (e) to (h).
  • parts (b) and (f) show the light intensity (
  • Parts (c) and (g) show the light intensity (
  • Parts (d) and (h) show the light intensity (
  • Parts (a) and (e) show the light intensity (
  • the light intensity near the optical axis increases, and the light intensity distribution in the plane perpendicular to the optical axis changes from an annular shape to a solid circular shape. Change.
  • the excitation light La passes through the polarization conversion section 61 and the phase conversion section 62 to have such a solid circular light intensity distribution.
  • the ring mask 63 is optically coupled to the excitation light output section 10 via the beam expander 21, the polarization conversion section 61 and the phase conversion section 62.
  • the ring mask 63 receives the excitation light La, spatially modulates the intensity of the excitation light La in the beam cross section of the excitation light La, and outputs the modulated excitation light La.
  • the ring mask 63 has a ring-shaped light shielding portion and transmission portions provided in contact with the inside and outside of the light shielding portion.
  • the ring mask 63 of this embodiment is a so-called multiple ring mask.
  • the ring mask 63 can be composed of, for example, a plate-like member having a light blocking portion and a transmitting portion, or a phase modulation type spatial light modulator.
  • the plate-like member can be constructed by forming a light-shielding film as a light-shielding portion on a light-transmitting plate, for example.
  • Ring masks are classified into amplitude modulation type (in other words, intensity modulation type), phase modulation type, and composite type thereof.
  • the ring mask 63 of this embodiment is of amplitude modulation type.
  • FIG. 17 is a diagram showing an example of the configuration of the ring mask 63 viewed from the optical axis direction.
  • the ring mask 63 has a plurality of ring-shaped light shielding portions provided around the central position.
  • the ring mask 63 has three light blocking portions D1, D2 and D3.
  • the ring mask 63 has a transmission portion E1, a transmission portion E2, a transmission portion E3, a transmission portion E4, and a light shielding portion D4.
  • the transmissive portion E1 is the innermost transmissive portion provided inside the light shielding portion D1.
  • the transmission part E2 is a ring-shaped transmission part provided between the light shielding part D1 and the light shielding part D2.
  • the light transmittance in the transmission portions E1 to E4 is higher than the light transmittance in the light shielding portions D1 to D4.
  • the light transmittance of the transmissive portions E1 to E4 may be 1 or less than 1.
  • the light transmittance of the light shielding portions D1 to D4 may be zero or may be greater than zero.
  • Boundaries between the adjacent transmissive portions and light shielding portions among the transmissive portion E1, the light shielding portion D1, the transmissive portion E2, the light shielding portion D2, the transmissive portion E3, the light shielding portion D3, the transmissive portion E4, and the light shielding portion D4 are concentric circles. It may be elliptical. In the following description, it is assumed that the boundary is a circle.
  • e1 be the width in the radial direction of the transmitting portion E1, that is, the radius.
  • d1 be the width in the radial direction of the light shielding portion D1.
  • e2 be the width in the radial direction of the transmission portion E2.
  • d2 be the width in the radial direction of the light shielding portion D2.
  • e3 be the radial width of the transmission portion E3.
  • d3 be the radial width of the light shielding portion D3.
  • e4 be the radial width of the transmissive portion E4.
  • the radial width of each of the two adjacent light shielding portions among the ring-shaped light shielding portions D1, D2, and D3 is larger than the radial width of the transmissive portion provided between these two light shielding portions. That is, in the ring mask 63 of the present embodiment, the radial widths of the light shielding portions D1 and D2 and the light transmitting portion E2 have a relationship represented by the following equation (4), and the light shielding portions D2 and D3 and the light transmitting portion E2 The width of each E3 in the radial direction has a relationship represented by the following equation (5). All combinations of two adjacent ring-shaped light shielding portions may have such a relationship.
  • the optical scanner 22 is optically coupled to the beam expander 21 via the polarization converter 61 , the phase converter 62 and the ring mask 63 .
  • the objective lens 25 is, for example, a dry objective lens, a water immersion objective lens, an oil immersion objective lens, or a silicone immersion objective lens.
  • an objective lens used for observing a transparent sample may be used. If the objective lens 25 is a water immersion objective lens, its numerical aperture is, for example, 1.2 or more. If the objective lens 25 is an oil immersion objective lens, its numerical aperture is, for example, 1.45 or more.
  • the ratio (NA/R) between the refractive index R of the medium between the objective lens 25 and the observed object B and the numerical aperture NA of the objective lens 25 is, for example, 0.75 or more.
  • FIG. 19 is a flowchart for explaining the operation of the microscope device 2 according to this embodiment. An image acquisition method according to this embodiment will be described together with the operation of the microscope apparatus 2 with reference to FIG. 19 .
  • the excitation light output step S1 is performed.
  • the details of the pumping light output step S1 are the same as in the first embodiment.
  • the excitation light irradiation step S2a is performed.
  • the excitation light La output in the excitation light output step S1 is subjected to the beam expander 21, the polarization converter 61, the phase converter 62, the ring mask 63, the optical scanner 22, the relay lens system 23, the dichroic
  • the observation object B is irradiated via the mirror 24 and the objective lens 25 . That is, in the excitation light irradiation step S2a, the excitation light La output in the excitation light output step S1 is subjected to the polarization conversion processing S21 by the polarization conversion unit 61, the phase conversion processing S22 by the phase conversion unit 62, and the ring mask 63.
  • the polarization conversion process S21 is a process for converting the excitation light La into azimuth polarized light.
  • the phase conversion process S22 is a process of imparting phase modulation to the excitation light La with a helical phase pattern.
  • the excitation light La may be condensed using a water immersion objective lens having a numerical aperture of 1.2 or more. Alternatively, an oil immersion objective lens with a numerical aperture of 1.45 or more may be used to condense the excitation light La.
  • the phase conversion processing S22 and the ring mask processing S23 may each be performed using a phase modulation type spatial light modulator.
  • the harmonic detection step S3 is performed. Details of the harmonic detection step S3 are the same as in the first embodiment.
  • the excitation light output step S1, the excitation light irradiation step S2a, and the harmonic detection step S3 are repeated while scanning the irradiation position of the excitation light La on the observation object B with the optical scanner 22 (steps S4 and S5). This provides data on the magnitude of the second harmonic, or both the second and third harmonics, at multiple locations on the object B to be observed.
  • image generation step S6 is performed. Details of the image generation step S6 are the same as in the first embodiment.
  • the light output from the light source is condensed and irradiated onto the surface or inside of the object to be observed through the condensing lens.
  • the beam waist diameter which is a measure of the size of the condensed light diameter, can only be reduced to about half the wavelength of the light. This is called the diffraction limit.
  • Ring masks include single ring masks and multiple ring masks.
  • the single ring mask has a single ring-shaped light shielding portion and transmission portions provided inside and outside the light shielding portion. Then, the light that has passed through the transmitting portions inside and outside the light shielding portion reaches the condensing position through the condensing lens. At the focusing position, the interference of these two lights allows the light to be focused in an area smaller than the diffraction limit.
  • the multi-ring mask has a plurality of ring-shaped light shielding portions concentrically arranged and a plurality of transmission portions provided between the plurality of light shielding portions. Then, the light passing through each transmitting portion reaches the condensing position through the condensing lens. Even when using such a multi-ring mask, it is possible to exceed the diffraction limit and focus light on a smaller area.
  • Parts (a) and (b) of FIG. 20 are diagrams showing the condensed spot shape of a cross section including the optical axis and parallel to the optical axis.
  • the solid line Ha indicates the condensed spot shape when the ring mask is provided
  • the dashed line Hb indicates the condensed spot shape when the ring mask is not provided.
  • Part (a) of FIG. 20 assumes the case of using a water immersion objective lens with a numerical aperture of 0.9.
  • Part (b) of FIG. 20 assumes the case of using a water immersion objective lens with a numerical aperture of 1.3.
  • the size of the focused spot can be reduced by providing a ring mask.
  • Tables 1 and 2 below are tables showing an example of the relationship between the numerical aperture of the objective lens and the degree of reduction in diameter of the condensed light spot by providing the ring mask in the light irradiation apparatus according to the reference example.
  • the volume improvement rate shown in these tables is the value (A1/A2) obtained by dividing the volume A1 of the focused spot when the ring mask is not provided by the volume A2 of the focused spot when the ring mask is provided.
  • the improvement rate in the lateral direction is obtained by comparing the condensed spot diameter in the direction perpendicular to the optical axis without the ring mask, that is, the diameter Wa1 shown in FIG.
  • the configuration of the ring mask specifically refers to the widths d1 to d3 of the light blocking portions D1 to D3 and the widths e1 to e4 of the transmitting portions E1 to E4.
  • Table 1 assumes a water immersion objective lens as the objective lens.
  • Table 2 assumes an oil immersion objective lens as the objective lens.
  • Table 3 assumes a dry objective as the objective.
  • the volume improvement rate, the lateral improvement rate, and the longitudinal improvement rate are all greater than 1 by providing the ring mask. .
  • the lateral improvement is small compared to the longitudinal improvement.
  • the lateral improvement rate is 1.08 or less, and such a tendency is remarkable.
  • the refractive index of the medium between the water immersion objective lens and the observation object B that is, the immersion liquid is 1.333.
  • the refractive index of the medium between the oil immersion objective lens and the observation object B that is, the immersion liquid is 1.518. It is assumed that the refractive index of the medium between the dry objective lens and the observation object B, namely air, is 1.
  • NA/R the ratio of the numerical aperture NA at which the lateral improvement rate begins to decrease to 1.08 or less and the refractive index R thereof is the water immersion objective lens, oil immersion objective lens, and dry objective lens. is 0.75 or more. If the lateral improvement rate is small, the degree of reduction in the focused spot diameter is small, and the degree of improvement in resolution in a microscope, for example, is also small.
  • the present inventors provided, in addition to the ring mask 63, a polarization conversion section 61 that converts into azimuth polarized light and a phase conversion section 62 that provides phase modulation with a helical phase pattern. It was found that the degree of diameter reduction can be increased. Similarly, the present inventor can increase the degree of reduction in the diameter of the condensed light by performing the polarization conversion processing S21 for converting to azimuth polarized light and the phase conversion processing S22 for providing phase modulation by a helical phase pattern. I found what I can do.
  • FIG. 21 is a graph showing the lateral resolution ratio for each aperture ratio when no ring mask is used.
  • the bar G11 indicates the case where the light irradiating the observation object B is circularly polarized light.
  • a bar G12 indicates the case where the light with which the observation object B is irradiated is radially polarized light.
  • a bar G13 indicates the case where the light illuminating the observation object B is a combination of azimuth polarization and helical phase modulation.
  • the vertical axis indicates the horizontal resolution ratio.
  • the lateral resolution ratio is the lateral resolution at each numerical aperture and each polarization when the numerical aperture of the oil immersion objective lens is 1.50 and the light irradiated to the observation object B is circularly polarized light.
  • the horizontal axis indicates the numerical aperture. Referring to FIG. 21, even when the ring mask is not used, the light irradiated to the observation object B is azimuthally polarized, compared to the case where the light irradiated to the observation object B is circularly polarized light or radially polarized light. It can be seen that the lateral resolution ratio is improved at any numerical aperture when combined with helical phase modulation.
  • FIG. 22 is a graph showing the lateral resolution ratio for each aperture ratio when using a ring mask.
  • the bar G21 indicates the case where the light with which the observation object B is irradiated is circularly polarized light.
  • a bar G22 indicates the case where the light with which the observation object B is irradiated is radially polarized light.
  • a bar G23 indicates the case where the light illuminating the observation object B is a combination of azimuth polarization and helical phase modulation.
  • the vertical axis indicates the horizontal resolution ratio.
  • the lateral resolution ratio is the lateral resolution when the numerical aperture of the oil immersion objective lens is 1.50 and the light illuminating the observation object B is circularly polarized light when the ring mask is not used.
  • the lateral resolution ratio is improved compared to when the ring mask is not used, regardless of the polarization state of the light irradiating the observation object B. .
  • the lateral resolution ratio is remarkably improved.
  • the lateral resolution ratio that is, the lateral improvement rate
  • FIG. 23 is a diagram showing second harmonic-detected fluorescence in a cross section that includes the optical axis and is parallel to the optical axis direction.
  • FIG. 24 is a diagram showing the third harmonic detected fluorescence in the same cross section.
  • the light intensity is indicated by the shades of color, the darker the part, the lower the light intensity, and the lighter the part, the higher the light intensity.
  • parts (a) and (b) show fluorescent images when the excitation light La applied to the observation object B is azimuthally polarized light that has undergone helical phase modulation. showing.
  • Parts (c) and (d) show, as reference examples, fluorescence images when the excitation light La applied to the observation object B is circularly polarized light.
  • parts (a) and (c) show fluorescence images when the ring mask 63 is provided.
  • Parts (b) and (d) show fluorescent images when the ring mask 63 is not provided.
  • the ring mask 63 and the ring mask processing S23 may be of amplitude modulation type.
  • side lobes which are unnecessary condensed portions, tend to occur on both sides of the condensed spot in the optical axis direction.
  • Non-Patent Document 3 discloses reducing the main lobe by causing side lobes to interfere with the main lobe.
  • a confocal optical system is used, and the resolution can be enhanced by the confocal effect of the pinhole, so the generation of such an unnecessary condensed portion is allowed to some extent.
  • the excitation efficiency is lower than that of single-photon excitation microscopes, and in deep observation, aberration causes a large deviation between the pinhole position and the focus position, resulting in light loss. big.
  • the amplitude modulation type ring mask By using the amplitude modulation type ring mask, side lobes, which are unnecessary condensed portions, are reduced compared to the case of using the phase modulation type ring mask. As a result, there is no need to provide a confocal optical system including a pinhole, and it is possible to contribute to miniaturization of the apparatus while suppressing optical loss.
  • the ratio (NA/R) between the refractive index R of the medium between the objective lens 25 and the observation object B and the numerical aperture NA of the objective lens 25 may be 0.75 or more.
  • the ratio (NA/R) between the refractive index R in the medium between the objective lens 25 and the observation object B and the numerical aperture NA of the objective lens 25 is 0.
  • An objective lens 25 of 0.75 or more may be used to condense the excitation light La.
  • the numerical aperture of the objective lens is large as described above, the degree of reduction in the condensed light diameter can be further enhanced.
  • the objective lens a water immersion objective lens, an oil immersion objective lens, a dry objective lens, a silicone immersion objective lens, an objective lens compatible with a clearing solution, or the like can be used.
  • the phase conversion section 62 and the ring mask 63 may each be configured by a phase modulation type spatial light modulator.
  • each of the phase conversion processing S22 and the ring mask processing S23 may be performed using a phase modulation type spatial light modulator.
  • the phase pattern can be easily changed in the phase conversion section 62 or the phase conversion processing S22.
  • the ring mask 63 includes a plurality of ring-shaped light shielding portions D1 to D3 provided around the central position and provided between two adjacent light shielding portions among the plurality of light shielding portions D1 to D3. an innermost layer transmission portion E1 provided inside the innermost layer light shielding portion D1 of the plurality of light shielding portions D1 to D3; and an outermost layer transmitting portion E4 provided outside the outer layer light shielding portion D3.
  • FIG. 25 is a diagram showing a schematic configuration of a microscope device 2A according to a modified example of the second embodiment.
  • the microscope apparatus 2A has a phase modulation type spatial light modulator 28 and an aperture optical system 29 in place of the phase conversion unit 62 and the ring mask 63 of the microscope apparatus 2 described above. It differs from device 2.
  • Other configurations of the microscope device 2A are the same as those of the microscope device 2 of the second embodiment.
  • the pumping light output section 10 and the spatial light modulator 28 may be optically coupled by an optical system such as a mirror 9, for example.
  • the spatial light modulator 28 has both the function of the phase conversion section 62 and the function of the ring mask 63 .
  • the spatial light modulator forming the phase conversion section 62 is common to the spatial light modulator forming the ring mask 63 .
  • the spatial light modulator 28 presents a phase pattern in which a phase pattern for configuring the phase conversion section 62 and a phase pattern for configuring the ring mask 63 are superimposed.
  • a phase pattern for correcting aberration may be superimposed on the phase pattern.
  • the aberrations of the spatial light modulator 28 itself affect the accuracy of the helical phase modulation and are therefore corrected.
  • the spatial light modulator 28 may simultaneously correct aberrations that occur during deep observation, such as spherical aberration that occurs due to the difference in refractive index between the observation object B and the immersion liquid.
  • the spatial light modulator 28 configures an amplitude modulation type ring mask 63 with a phase pattern.
  • FIG. 26 is a diagram showing an example of a phase pattern forming an amplitude modulation ring mask 63.
  • the phase value of each pixel constituting the phase pattern is indicated by the shade of color. The lighter the color, the smaller the phase value, and the darker the color, the larger the phase value.
  • the ring mask 63 is a triple ring mask.
  • the ring mask 63 has a plurality of ring-shaped light blocking portions provided around the central position.
  • the ring mask 63 has two light blocking portions D5 and D6.
  • the ring mask 63 includes the innermost transparent portion E5 provided inside the light shielding portion D5, the ring-shaped transparent portion E6 provided between the light shielding portions D5 and D6, and the light shielding portion D6. It has a ring-shaped outermost transmission portion E7 provided on the outside, and a light shielding portion D7 provided on the outside of the transmission portion E7.
  • the light blocking portions D5 to D7 are composed of gratings whose phase values change periodically, and the phase values of the transmitting portions E5 to E7 are constant. Specifically, in the light shielding portions D5 to D7, a phase distribution that monotonically increases from 0 (rad) to 2 ⁇ (rad) in each period is periodically repeated. Due to such a phase pattern, the emission direction of the light emitted from the light shielding portions D5 to D7 is inclined with respect to the emission direction of the light emitted from the transmission portions E5 to E7.
  • the aperture optical system 29 is provided after the spatial light modulator 28 and is optically coupled with the spatial light modulator 28 .
  • the aperture optical system 29 has a pair of lenses 291 and 292 and an aperture 293 arranged between the lenses 291 and 292 .
  • Light emitted from the spatial light modulator 28 forms a beam waist between the lenses 291 and 292 .
  • Aperture 293 is located at the beam waist and shields at least part of the light emitted from light shielding sections D5 to D7 of spatial light modulator .
  • the light emitted from the light blocking sections D5 to D7 of the spatial light modulator 28 is attenuated or eliminated, and the light emitted from the transmitting sections E5 to E7 passes through the aperture 293.
  • the light transmittance of the transmissive portion is higher than the light transmittance of the light shielding portion.
  • the light transmittance of the transmissive portion is defined as the ratio of the light intensity of the light emitted from the transmissive portions E5 to E7 and passing through the aperture 293 to the light intensity of the light incident on the transmissive portions E5 to E7.
  • the light transmittance of the light shielding portion is defined as the ratio of the light intensity of the light emitted from the light shielding portions D5 to D7 and passing through the aperture 293 to the light intensity of the light incident on the light shielding portions D5 to D7.
  • the light transmittance of the transmissive portion may be 1 or less than 1.
  • the light transmittance of the light shielding portion may be zero or may be greater than zero.
  • the transmission sections E5 to E7 may be composed of gratings whose phase values change periodically, and the phase values of the light shielding sections D5 to D7 may be constant. Specifically, in the transmission sections E5 to E7, a phase distribution that monotonously increases from 0 (rad) to 2 ⁇ (rad) is periodically repeated in each period. Due to such a phase pattern, the emission direction of the light emitted from the transmission portions E5 to E7 is inclined with respect to the emission direction of the light emitted from the light shielding portions D5 to D7. Then, the position of the aperture 293 is slightly shifted in the direction intersecting the optical axis with respect to the beam waist.
  • the aperture 293 shields at least part of the light emitted from the light shielding sections D5 to D7 of the spatial light modulator 28, and also blocks the light from the transmission sections E5 to E7 of the spatial light modulator 28. Emitted light can pass through.
  • the spatial light modulator forming the phase conversion section 62 may be shared with the spatial light modulator forming the ring mask 63 .
  • the common spatial light modulator 28 may present a phase pattern in which the phase pattern for configuring the phase conversion section 62 and the phase pattern for configuring the ring mask 63 are superimposed.
  • the spatial light modulator that performs the phase conversion processing S22 may be shared with the spatial light modulator that performs the ring mask processing S23. Then, the spatial light modulator may present a phase pattern in which the phase pattern for performing the phase conversion processing S22 and the phase pattern for performing the ring mask processing S23 are superimposed.
  • the parts forming the phase conversion section 62 and the parts forming the ring mask 63 can be combined into one to simplify the configuration of the apparatus.
  • the component for performing the phase conversion processing S22 and the component for performing the ring mask processing S23 can be combined into one to simplify the configuration of the apparatus.
  • the microscope device and image acquisition method according to the present disclosure are not limited to the above-described embodiments, and various modifications are possible.
  • the microscope apparatus and image acquisition method according to the present disclosure are effective in generating n-photon excitation (where n is an integer of 2 or more) in an observation target. That is, in the intensity modulation step S12 of the excitation light output step S1, the optical modulator 12 of the excitation light output unit 10 outputs the excitation light La whose optical intensity time waveform includes the nth root of a linear function of a sine wave. Therefore, the descriptions of “two-photon excitation” and “square root” in the above-described embodiments can all be replaced with “n-photon excitation” and “nth root”.
  • the time waveform of the light intensity of the excitation light La is the square root of the linear function of the sine wave over the entire period of each cycle.
  • the time waveform of the light intensity of the excitation light La is a square root of a linear function of a sine wave only in a part of each period, typically a period including the maximum value Imax.
  • the polarization conversion section 61, the phase conversion section 62, and the ring mask 63 are arranged on the optical path between the excitation light output section 10 and the optical scanner 22 as an example. At least one of the polarization converter 61 , phase converter 62 , and ring mask 63 may be arranged on the optical path between the optical scanner 22 and the objective lens 25 . At least one of the polarization conversion section 61, the phase conversion section 62, and the ring mask 63 may be arranged on the optical path between the objective lens 25 and the observed object B.
  • the case where the ring mask 63 is of amplitude modulation type is exemplified. Even if the ring mask 63 is of a phase modulation type or a composite type of an amplitude modulation type and a phase modulation type, by using light combining azimuth polarization and helical phase as in the second embodiment, the condensed diameter can be made smaller.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Multimedia (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)

Abstract

顕微鏡装置は、励起光出力部と、光学系と、高調波検出部と、を備える。励起光出力部は、励起光を出力する。励起光の光強度の時間波形は、正弦波の一次関数のｎ乗根（ｎは２以上の整数）を含む。励起光の光強度の最大値は、観察対象物における飽和励起強度を超える。光学系は、励起光出力部から出力された励起光を観察対象物に照射する。励起光の照射によるｎ光子励起によって、観察対象物において蛍光が生じる。高調波検出部は、蛍光の光強度の時間波形に含まれる第２高調波を検出する。

Description

顕微鏡装置及び画像取得方法
　本開示は、顕微鏡装置及び画像取得方法に関する。
　特許文献１は、飽和励起（Saturated Excitation：ＳＡＸ）顕微鏡を開示している。この文献では、励起光であるレーザ光の強度の時間変化が余弦波となるようにレーザ光を変調している。
　非特許文献１及び２は、ＳＡＸ顕微鏡と二光子励起顕微鏡とを組み合わせることを開示している。これらの文献では、励起光の強度の時間変化が正弦波となるように励起光の強度を変調している。
国際公開第２００６／０６１９４７号
Sandeep Chakraborty et al., "Saturated two-photon excitation fluorescence microscopy for the visualization of cerebral neural networks at millimeters deep depth", Journal of Biophotonics, August 2018 Anh Dung Nguyen et al., "3D super-resolved in vitro multiphoton microscopy by saturation of excitation", Optics Express Volume 23, Issue 17 pp.22667-22675 (2015)
　一般に、ＳＡＸ顕微鏡では、観察対象物へ正弦波状の時間波形を有する励起光を照射することにより観察対象物を励起して蛍光を出力させるとともに、励起光のピーク強度を観察対象物の飽和励起強度よりも大きくすることによって、蛍光のピーク強度を飽和させる。そして、蛍光の時間波形に含まれる高調波成分、例えば第２高調波を検出し、この高調波成分に基づいて観察画像を作成する。これにより、観察画像の空間分解能を高めることができる。
　多光子励起顕微鏡では、例えば近赤外光といった長波長の超短パルス光を励起光として観察対象物へ照射し、観察対象物において二光子励起などの多光子励起を生じさせ、それにより生じる蛍光を検出して観察画像を作成する。この多光子励起顕微鏡によれば、物体透過性に優れる長波長の光を用いるので、例えば生体組織の深部を非侵襲的に観察することが可能になる。
　上記の各利点を有するＳＡＸ顕微鏡と多光子励起顕微鏡とを組み合わせることにより、これらの利点を兼ね備える顕微鏡が実現され得る。しかしながら、ｎ光子励起（ｎは２以上の整数）においては、蛍光強度は励起光強度のｎ乗に比例する。したがって、観察対象物へ正弦波状の時間波形を有する励起光を照射し、観察対象物においてｎ光子励起を生じさせると、観察対象物から出力される蛍光の時間波形は、正弦波のｎ乗に比例することとなる。このような時間波形を有する蛍光強度に基づいて観察画像を得ようとすると、例えば特許文献２に記載されているように、第３高調波、第５高調波といった次数の高い高調波を検出する必要が生じる。蛍光を検出するデバイスの周波数範囲には限度があるので、次数の高い高調波を検出しようとすれば、励起光の周波数を小さくせざるを得ず、観察画像の作成に要する時間が長くなってしまう。あるいは、周波数範囲の上限が高い機器を導入せざるを得ず、コスト高となってしまう。
　本開示は、このような問題点に鑑みてなされたものであり、ＳＡＸ顕微鏡及び多光子励起顕微鏡の双方の利点を有し、次数の比較的低い高調波を用いて観察画像を作成することが可能な顕微鏡装置及び画像取得方法を提供することを目的とする。
　上述した課題を解決するために、本開示による顕微鏡装置は、励起光出力部と、光学系と、高調波検出部と、を備える。励起光出力部は、励起光を出力する。励起光の光強度の時間波形は正弦波の一次関数のｎ乗根（ｎは２以上の整数）を含む。励起光の光強度の最大値は観察対象物における飽和励起強度を超える。光学系は、励起光出力部から出力された励起光を観察対象物に照射する。高調波検出部は、励起光の照射によるｎ光子励起によって観察対象物において生じた蛍光の光強度の時間波形に含まれる第２高調波を検出する。
　本開示による画像取得方法は、励起光出力ステップと、励起光照射ステップと、高調波検出ステップと、画像生成ステップと、を含む。励起光出力ステップでは、励起光を出力する。励起光の光強度の時間波形は正弦波の一次関数のｎ乗根（ｎは２以上の整数）を含む。励起光の光強度の最大値は観察対象物における飽和励起強度を超える。励起光照射ステップでは、励起光出力ステップにおいて出力された励起光を観察対象物に照射する。高調波検出ステップでは、励起光の照射によるｎ光子励起によって観察対象物において生じた蛍光の光強度の時間波形に含まれる第２高調波を検出する。画像生成ステップでは、第２高調波に基づいて観察対象物の観察画像を生成する。
　これらの顕微鏡装置および画像取得方法では、励起光強度の時間波形が正弦波の一次関数のｎ乗根を含む。前述したように、ｎ光子励起においては、蛍光強度は励起光強度のｎ乗に比例する。したがって、正弦波の一次関数のｎ乗根を含む時間波形を有する励起光を観察対象物へ照射し、観察対象物においてｎ光子励起を生じさせると、観察対象物から出力される蛍光の時間波形は、正弦波のｎ乗ではなく、正弦波の一次関数に比例する。したがって、一般的なＳＡＸ顕微鏡と同様に、第２高調波または第３高調波といった、より次数の低い高調波に基づいて観察画像を得ることができる。故に、これらの顕微鏡装置および画像取得方法によれば、蛍光を検出するデバイスの周波数範囲の制約により励起光の周波数を小さくする必要がないので、観察画像の作成に要する時間が長くなることを回避することができる。あるいは、周波数範囲の低い機器を使用できるのでコスト低減につながる。
　上記の顕微鏡装置において、励起光出力部は、パルス光を出力する光源と、光源から出力されたパルス光を変調して励起光を生成する強度変調型の光変調器と、を有してもよい。同様に、上記の画像取得方法において、励起光出力ステップは、パルス光を変調して励起光を生成する強度変調ステップを含んでもよい。このような構成および方法によって、光強度の時間波形に正弦波の一次関数のｎ乗根を含む励起光を容易に生成することができる。この場合、光変調器はＡＯ変調器であってもよい。
　上記の顕微鏡装置において、光源はレーザ光源であってもよい。同様に、上記の画像取得方法において、パルス光はレーザ光であってもよい。これにより、ｎ光子励起を生じさせ得る大きな光強度を有する励起光を簡易な構成により生成することができる。
　上記の顕微鏡装置及び画像取得方法において、励起光の光強度の時間波形における各周期内の最小値は、０より大きくてもよく、或いは、高調波検出部または高調波検出ステップにおいて受け取ることができる最大信号の０．１％より大きく２０％より小さくてもよい。励起光強度の時間波形における各周期内の最小値及びその付近においては、発生する蛍光の強度は僅かであり、その検出結果はノイズの影響を大きく受ける。励起光強度の時間波形における各周期内の最小値を０よりも大きくすることによって、ノイズの影響を小さくして第２高調波の検出精度を高め、観察画像をより明瞭にすることができる。或いは、励起光強度の時間波形における各周期内の最小値を、高調波検出部または高調波検出ステップにおいて受け取ることができる最大信号の０．１％より大きく且つ２０％より小さくすることによって、ノイズの影響を小さくして第２高調波の検出精度を高め、観察画像をより明瞭にすることができる。励起光強度の時間波形が正弦波の一次関数の平方根を含む場合には、励起光強度の時間波形が正弦波である場合と比較して、各周期内の最小値付近における光強度の変化率が大きくなる。言い換えると、各周期内の最小値付近における光強度の時間波形が急峻になる。そして、各周期内の最小値が０である場合に、この変化率は最も大きくなる。各周期内の最小値を０よりも大きくすることによって、各周期内の最小値付近における光強度の変化率を小さくし、時間波形の急峻さを緩和することができる。或いは、各周期内の最小値を、高調波検出部または高調波検出ステップにおいて受け取ることができる最大信号の０．１％より大きく且つ２０％より小さくすることによって、各周期内の最小値付近における光強度の変化率を小さくし、時間波形の急峻さを緩和することができる。よって、励起光出力部における、励起光強度の時間波形の成形、特に、各周期内の最小値付近の時間波形の成形が容易になる。
　上記の顕微鏡装置において、高調波検出部は、観察対象物において生じた蛍光の光強度に応じた信号を生成する光検出デバイスと、光検出デバイスから信号を入力し、信号の時間波形に含まれる第２高調波を出力するロックインアンプと、を有してもよい。同様に、上記の画像取得方法において、高調波検出ステップは、観察対象物において生じた蛍光の光強度に応じた信号を生成するステップと、信号の時間波形に含まれる第２高調波を出力するステップと、を含んでもよい。これらの構成および方法によって、第２高調波を簡易に且つ精度良く検出することができる。
　上記の顕微鏡装置において、高調波検出部は、観察対象物において生じた蛍光の光強度の時間波形に含まれる第３高調波を更に検出してもよい。同様に、上記の画像取得方法において、高調波検出ステップでは、観察対象物において生じた蛍光の光強度の時間波形に含まれる第３高調波を更に検出してもよい。そして、画像生成ステップでは、第２高調波及び第３高調波の一方または両方に基づいて観察対象物の観察画像を生成してもよい。この場合、第２高調波及び第３高調波のうち観察対象物に適した高調波による観察画像を簡便に生成することができる。
　上記の顕微鏡装置及び画像取得方法において、励起光出力部から出力される励起光の光強度の時間波形は正弦波の一次関数の平方根を含み、高調波検出部または高調波検出ステップは、励起光の照射による二光子励起によって観察対象物において生じた蛍光の光強度の時間波形に含まれる第２高調波を検出してもよい。
　本開示による励起光出力装置は、励起光の照射による二光子励起によって観察対象物において生じた蛍光の光強度の時間波形に基づいて観察画像を生成する蛍光顕微鏡において用いられる。この励起光出力装置は、光強度の時間波形が正弦波の一次関数の平方根を含み、光強度の最大値が観察対象物における飽和励起強度を超える励起光を出力する。本開示による励起方法は、励起光の照射による二光子励起によって観察対象物において生じた蛍光の光強度の時間波形に基づいて観察画像を生成する蛍光顕微鏡における励起方法である。この励起方法では、光強度の時間波形が正弦波の一次関数の平方根を含み、光強度の最大値が観察対象物における飽和励起強度を超える励起光を観察対象物に照射して観察対象物を励起する。
　これらの励起光出力装置および励起方法では、励起光強度の時間波形が正弦波の一次関数の平方根を含む。前述したように、二光子励起においては、蛍光強度は励起光強度の二乗に比例する。したがって、正弦波の一次関数の平方根を含む時間波形を有する励起光を観察対象物へ照射し、観察対象物において二光子励起を生じさせると、観察対象物から出力される蛍光の時間波形は、正弦波の二乗ではなく、正弦波の一次関数に比例することとなる。したがって、第２高調波または第３高調波といった、より次数の低い高調波に基づいて観察画像を得ることができる。故に、これらの励起光出力装置および励起方法によれば、蛍光を検出するデバイスの周波数範囲の制約により励起光の周波数を小さくする必要がないので、観察画像の作成に要する時間が長くなることを回避することができる。あるいは、周波数範囲の低い機器を使用できるのでコスト低減につながる。
　本開示によれば、ＳＡＸ顕微鏡及び多光子励起顕微鏡の双方の利点を有し、次数の比較的低い高調波を用いて観察画像を作成することが可能な顕微鏡装置及び画像取得方法を提供できる。
図１は、顕微鏡装置の構成を示す図である。 図２は、励起光の時間波形を示す図である。 図３は、光スキャナの構成を示す図である。 図４は、顕微鏡装置の動作を説明するためのフローチャートである。 図５の（ａ）部は、ＳＡＸ顕微鏡における蛍光の強度分布を概念的に示す図である。図５の（ｂ）部は、蛍光強度の理論値と実測値との差分を概念的に示す図である。 図６の（ａ）部は、励起光強度の時間波形を概念的に示す図である。図６の（ｂ）部は、蛍光強度の時間波形を概念的に示す図である。 図７の（ａ）部は、励起光強度の時間波形を概念的に示す図である。図７の（ｂ）部は、蛍光強度の時間波形を概念的に示す図である。 図８の（ａ）部は、顕微鏡装置において測定された蛍光の光強度の時間波形をフーリエ変換した結果を示すグラフである。図８の（ｂ）部は、励起光強度の時間波形を正弦波とした場合に測定された蛍光強度の時間波形をフーリエ変換した結果を示すグラフである。 図９の（ａ）部は、顕微鏡装置において測定された蛍光の基本波及び第２高調波の光強度と、励起光の相対強度との関係を示すグラフである。図９の（ｂ）部は、励起光強度の時間波形を正弦波とした場合に測定された蛍光の基本波、第２高調波及び第３高調波の光強度と、励起光の相対強度との関係を示すグラフである。 図１０は、励起光の時間波形を概念的に示す図である。 図１１は、一般的なＡＯ変調器の印加電圧と出力光強度との関係を概念的に示すグラフである。 図１２は、第２実施形態に係る光照射装置の構成の概略を示す図である。 図１３は、光軸に垂直な面内におけるアジマス偏光の偏光方向を示す図である。 図１４の（ａ）部～（ｈ）部は、アジマス偏光の集光像を示す図である。 図１５は、らせん型の位相パターンを示す図である。 図１６の（ａ）部～（ｈ）部は、らせん型の位相パターンによる位相変調をアジマス偏光に与えた場合の集光像を示す図である。 図１７は、光軸方向から見たリングマスクの構成の一例を示す図である。 図１８の（ａ）部～（ｅ）部は、偏光変換部、位相変換部、及びリングマスクの並び順の例を示す図である。 図１９は、顕微鏡装置の動作を説明するためのフローチャートである。 図２０の（ａ）部及び（ｂ）部は、光軸を含み光軸に平行な断面の集光スポット形状を示す図である。 図２１は、リングマスクを用いない場合における、開口率毎の横分解能比を示すグラフである。 図２２は、リングマスクを用いた場合における、開口率毎の横分解能比を示すグラフである。 図２３の（ａ）部～（ｄ）部は、光軸を含み光軸方向に平行な断面における第２高調波検出した蛍光を示す図である。 図２４の（ａ）部～（ｄ）部は、光軸を含み光軸方向に平行な断面における第３高調波検出した蛍光を示す図である。 図２５は、第２変形例に係る光照射装置の構成の概略を示す図である。 図２６は、振幅変調型のリングマスクを構成する位相パターンの例を示す図である。 図２７は、振幅変調型のリングマスクを構成する位相パターンの例を示す図である。
　以下、添付図面を参照しながら本開示による顕微鏡装置および画像取得方法の実施の形態を詳細に説明する。図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
［第１実施形態］
　図１は、本開示の第１実施形態に係る顕微鏡装置１の構成を示す図である。顕微鏡装置１は、観察対象物Ｂの画像を取得するための装置であって、励起光出力部（励起光出力装置）１０と、光学系２０と、高調波検出部３０と、画像生成部４０と、信号発生器（ファンクションジェネレータ）５０と、を備えている。観察対象物Ｂは、例えば生体試料である。
　励起光出力部１０は、観察対象物Ｂを励起するための励起光Ｌａを出力する。励起光Ｌａは、コヒーレントな光またはインコヒーレントな光である。励起光Ｌａの波長は、例えば近赤外域に含まれる。具体的には、励起光Ｌａの波長は、６５０ｎｍ～１８００ｎｍの範囲内である。励起光Ｌａは、例えばレーザ光である。下記の数式（１）は、励起光Ｌａの時間波形を示す数式である。数式（１）において、Ｉｒは励起光Ｌａの光強度であり、ｔは時間であり、ｆは周波数であり、ａ，ｂは定数である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 数式（１）に示されるように、励起光Ｌａの時間波形は、正弦波の一次関数の平方根を含む。数式（２）は、励起光Ｌａの時間波形の一例として、ａ＝１／２、ｆ＝１／２π、ｂ＝１／２の場合を示す数式である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 図２は、数式（１）に示された励起光Ｌａの時間波形の一例を概念的に示す図である。図２において、縦軸は励起光Ｌａの光強度（パワー）を表し、横軸は時間を表す。図２に示される励起光Ｌａの時間波形は、光強度の最小値Ｉｍｉｎと光強度の最大値Ｉｍａｘとを周期的に繰り返す。各周期における光強度の最大値Ｉｍａｘすなわちピーク値付近における時間変化率は比較的小さく、ピーク値付近における時間変化は緩やかである。一方、各周期における光強度の最小値Ｉｍｉｎすなわちボトム値付近における時間変化率は比較的大きく、ボトム値付近における時間変化は急峻である。各周期における励起光Ｌａの光強度の最大値Ｉｍａｘは、観察対象物Ｂにおける飽和励起強度を超える大きさに設定される。励起光出力部１０は、このように光強度が周期的に変化する励起光Ｌａを、信号発生器５０からの周期的な信号に同期して生成する。励起光Ｌａの時間波形の周期は１ＭＨｚから数ＧＨｚ程度であり、一例では８０ＭＨｚである。図２において、この周期の時間波形は、櫛型状に並んでおり互いに強度の異なる複数のパルスＪを含むパルス群として示されている。図には、複数のパルスＪのうち一部のパルスＪのみ示されている。一方、パルス群に含まれる複数のパルスＪのピークを繋いだ包絡線Ｋの周期は、例えば数十ｋＨｚ～数百ｋＨｚ程度である。一例では包絡線Ｋの周波数は２００ｋＨｚ以下である。また別の一例では包絡線Ｋの周波数は１ＭＨｚ以下である。上記の周波数ｆは、包絡線Ｋの周波数を意味する。
　一実施形態における励起光出力部１０は、光源１１と、光変調器１２とを有する。光源１１は、パルス光Ｌｐを出力する。光源１１は、例えばピコ秒オーダーまたはフェムト秒オーダーの時間幅を有するパルス光Ｌｐを出力する。ここで、パルス光Ｌｐの時間幅とは、例えばパルス光Ｌｐの光強度がピーク値の半分を超える時間である。具体的には、パルス光Ｌｐの時間幅は、例えば１０フェムト秒～５０ピコ秒の範囲内である。光源１１は、例えばレーザ光源であり、一例ではモード同期レーザ光源である。或いは、光源１１は、発光ダイオードといったインコヒーレントな光源であってもよい。パルス光Ｌｐの好適な波長範囲は、前述した励起光Ｌａの好適な波長範囲と同じである。
　光変調器１２は、強度変調型の光変調器である。光変調器１２は、空間または光導波路を介して光源１１と光学的に結合されている。光変調器１２は、信号発生器５０と電気的に接続されている。光変調器１２は、光源１１から出力されたパルス光Ｌｐを変調して励起光Ｌａを生成する。光変調器１２におけるパルス光Ｌｐの変調は、信号発生器５０からの出力信号と同期している。光変調器１２は、例えば電気光学（Electro-Optic；ＥＯ）変調器、音響光学（Acousto-Optic；ＡＯ）変調器、透過率もしくは反射率を動的に制御可能な液晶またはＮＤ（Neutral Density）フィルタ、といった様々な変調器から選択され得る。パルス光Ｌｐの時間幅がフェムト秒オーダーである場合には、光変調器１２としてＡＯ変調器が特に好適である。光変調器１２によらず、光源１１に入力される駆動電流の大きさを制御することによって、すなわち直接変調方式によって、励起光Ｌａを生成してもよい。その場合、光変調器１２は不要である。
　光学系２０は、励起光出力部１０と空間を介して光学的に結合されている。光学系２０は、励起光出力部１０から出力された励起光Ｌａを観察対象物Ｂに照射する。一実施形態では、光学系２０は、ビームエキスパンダ２１と、光スキャナ２２と、リレーレンズ系２３と、ダイクロイックミラー２４と、対物レンズ２５と、を有する。
　ビームエキスパンダ２１は、空間を介して励起光出力部１０と光学的に結合され、励起光出力部１０から出力された励起光Ｌａのビーム径を拡大する。ビームエキスパンダ２１は、例えば互いに光結合された一対のレンズ２１１，２１２を含む。一方のレンズ２１１は前段、すなわち他方のレンズ２１２よりも励起光出力部１０寄りに設けられ、他方のレンズ２１２は後段、すなわち一方のレンズ２１１よりも励起光出力部１０から離れて設けられる。前段のレンズ２１１は励起光Ｌａを拡散させ、後段のレンズ２１２は励起光Ｌａを平行化する。レンズ２１１，２１２は、例えばガラスレンズである。
　光スキャナ２２は、空間を介してビームエキスパンダ２１と光学的に結合されている。光スキャナ２２は、励起光Ｌａの光軸に垂直な面内において励起光Ｌａの光軸を移動させることにより、観察対象物Ｂにおける励起光Ｌａの照射位置を走査する。光スキャナ２２は、ガルバノスキャナ、共振ミラー若しくはポリゴンミラーいった様々な光スキャナによって構成され得る。一例では、光スキャナ２２は二軸ガルバノスキャナである。
　図３は、光スキャナ２２の他の一例を示す図である。図３に示される光スキャナ２２は、二つのスキャナ２２１，２２２を有する。スキャナ２２１，２２２はいずれも一軸のスキャナである。スキャナ２２１の走査方向と、スキャナ２２２の走査方向とは互いに直交する。スキャナ２２１とスキャナ２２２とは、リレーレンズといった光学系２２３を介して互いに光結合されている。スキャナ２２１，２２２は、例えばガルバノスキャナである。このように、一軸のスキャナを複数個組み合わせて光スキャナ２２を構成してもよい。観察対象物Ｂを載置したステージを励起光Ｌａの光軸に垂直な面内において移動させることによって、観察対象物Ｂにおける励起光Ｌａの照射位置を走査してもよい。その場合、光スキャナ２２は設けられなくてもよい。
　リレーレンズ系２３は、光スキャナ２２と対物レンズ２５との間の光路上に設けられ、光スキャナ２２と対物レンズ２５とを光学的に結合する。リレーレンズ系２３は、例えばテレセントリックリレーレンズ系である。光スキャナ２２と対物レンズ２５とが極めて近い場合には、リレーレンズ系２３を省くことも可能である。
　ダイクロイックミラー２４は、光スキャナ２２からの励起光Ｌａ、及び観察対象物Ｂからの蛍光Ｌｂのうち一方を透過し、他方を反射する。図１に示される例では、ダイクロイックミラー２４は、励起光Ｌａを透過し、蛍光Ｌｂを反射する。図１に示される例では、ダイクロイックミラー２４は、リレーレンズ系２３と対物レンズ２５との間の光路上に設けられている。ダイクロイックミラー２４は、光スキャナ２２とリレーレンズ系２３との間に設けられてもよく、ビームエキスパンダ２１と光スキャナ２２との間に設けられてもよい。
　対物レンズ２５は、観察対象物Ｂと対向するように配置され、観察対象物Ｂの内部に励起光Ｌａを集光する。対物レンズ２５と観察対象物Ｂとの間の相対距離は可変である。対物レンズ２５が励起光Ｌａの光軸方向に沿って移動可能であってもよく、観察対象物Ｂを載置するステージ（不図示）が励起光Ｌａの光軸方向に沿って移動可能であってもよい。対物レンズ２５または観察対象物Ｂを移動させるための機構は、例えばステッピングモータ若しくはピエゾアクチュエータによって構成され得る。観察対象物Ｂに対する対物レンズ２５の配置は、正立型であってもよく、倒立型であってもよい。
　対物レンズ２５が観察対象物Ｂにおいて励起光Ｌａを高密度に集光することにより、観察対象物Ｂにおいて二光子励起が生じ、観察対象物Ｂから蛍光Ｌｂが発生する。蛍光Ｌｂの波長は、例えば３５０ｎｍ～９００ｎｍの範囲内である。対物レンズ２５は、観察対象物Ｂからの蛍光Ｌｂを集める機能も有する。図示例では、このように対物レンズ２５が励起光Ｌａのための対物レンズと蛍光Ｌｂを集めるレンズとを兼ねている。励起光Ｌａのための対物レンズと蛍光Ｌｂを集めるレンズとが別個に設けられてもよい。例えば、励起光Ｌａのために開口数（ＮＡ）が高い対物レンズを用い、収差補正により局所的に集光させてもよい。蛍光Ｌｂのために瞳の大きな対物レンズを用い、より多くの光を取り出せるようにしてもよい。励起光Ｌａのための対物レンズと蛍光Ｌｂを集めるレンズとをそれらの間に観察対象物Ｂを挟むように配置して、観察対象物Ｂにおける励起光Ｌａの入射面とは反対の面から出射する蛍光Ｌｂを取得してもよい。その場合、ダイクロイックミラー２４は不要となる。
　高調波検出部３０は、蛍光Ｌｂの光強度の時間波形に含まれる第２高調波（または第２高調波及び第３高調波）を検出する。一実施形態では、高調波検出部３０は、光検出デバイス３１と、ロックインアンプ３２と、を有する。光検出デバイス３１は、ダイクロイックミラー２４と光学的に結合されている。或いは、励起光Ｌａを集光するための対物レンズと蛍光Ｌｂを集めるための対物レンズとが別個に設けられる場合には、光検出デバイス３１は、蛍光Ｌｂを集めるための対物レンズと光学的に結合されている。光検出デバイス３１は、観察対象物Ｂにおいて生じた蛍光Ｌｂの光強度に応じた電気的な信号を生成する。光検出デバイス３１は、蛍光Ｌｂの波長に感度を有するとともに、蛍光Ｌｂの第２高調波、または第２高調波及び第３高調波の両方を検出するために必要な周波数範囲を有する。光検出デバイス３１は、光電子増倍管、またはアバランシェホトダイオードといった一次元光検出素子から選択され得る。或いは、光検出デバイス３１としては、マルチアノードＰＭＴ（Photomultiplier Tube）、ＣＣＤイメージセンサ、またはＣＭＯＳイメージセンサといった様々な二次元光検出素子が選択されてもよい。高調波検出部３０とダイクロイックミラー２４（または蛍光Ｌｂを集めるためのレンズ）との間の光路上に、励起光Ｌａの波長、及び観察に不要な波長をカットするためのフィルタが設けられてもよい。
　ロックインアンプ３２は、光検出デバイス３１及び信号発生器５０と電気的に接続されている。ロックインアンプ３２は、蛍光Ｌｂの光強度に応じた電気的な信号を光検出デバイス３１から入力する。加えて、ロックインアンプ３２は、励起光出力部１０へ提供される周期的な信号と同じ周期を有する正弦波信号を信号発生器５０から入力する。ロックインアンプ３２は、信号発生器５０からの正弦波信号を基準として用いつつ、光検出デバイス３１からの信号の時間波形に含まれる第２高調波、または第２高調波及び第３高調波の両方を検出する。
　画像生成部４０は、ロックインアンプ３２と電気的に接続されている。画像生成部４０は、ロックインアンプ３２から蛍光Ｌｂの光強度の時間波形に含まれる第２高調波の大きさに関する信号を受け、この第２高調波に基づいて、観察対象物Ｂの観察画像を生成する。或いは、画像生成部４０は、ロックインアンプ３２から蛍光Ｌｂの光強度の時間波形に含まれる第２高調波及び第３高調波の両方の大きさに関する信号を受け、第２高調波及び第３高調波の一方または両方に基づいて、観察対象物Ｂの観察画像を生成する。画像生成部４０は、例えば中央演算処理装置（ＣＰＵ）及びメモリを含むコンピュータによって構成され得る。画像生成部４０は、生成した画像を表示するためのモニタを更に有してもよい。
　図４は、本実施形態に係る顕微鏡装置１の動作を説明するためのフローチャートである。図４を参照しながら、顕微鏡装置１の動作とともに本実施形態に係る画像取得方法について説明する。
　まず、励起光出力ステップＳ１を行う。励起光出力ステップＳ１では、励起光出力部１０が励起光Ｌａを出力する。前述したように、励起光Ｌａの光強度の時間波形は、正弦波の一次関数の平方根を含む（数式（１）を参照）。各周期における励起光Ｌａの光強度の最大値Ｉｍａｘは、観察対象物Ｂにおける飽和励起強度を超える。この励起光出力ステップＳ１は、光源１１においてパルス光Ｌｐを生成するステップＳ１１と、光変調器１２においてパルス光Ｌｐを変調して励起光Ｌａを生成する強度変調ステップＳ１２とを含んでもよい。
　次に、励起光照射ステップＳ２を行う。励起光照射ステップＳ２では、励起光出力ステップＳ１において出力された励起光Ｌａを、ビームエキスパンダ２１、光スキャナ２２、リレーレンズ系２３、ダイクロイックミラー２４、及び対物レンズ２５を介して、観察対象物Ｂに照射する。励起光Ｌａの照射による二光子励起によって、観察対象物Ｂにおいて蛍光Ｌｂが生じる。
　続いて、高調波検出ステップＳ３を行う。高調波検出ステップＳ３では、蛍光Ｌｂの光強度の時間波形に含まれる第２高調波、または第２高調波及び第３高調波の両方を、高調波検出部３０が検出する。高調波検出ステップＳ３は、ステップＳ３１と、ステップＳ３２と、を含んでもよい。ステップＳ３１では、観察対象物Ｂにおいて生じた蛍光Ｌｂの光強度に応じた信号を光検出デバイス３１が生成する。ステップＳ３２では、光検出デバイス３１により生成された信号の時間波形に含まれる第２高調波、または第２高調波及び第３高調波の両方をロックインアンプ３２が出力する。
　上記の励起光出力ステップＳ１、励起光照射ステップＳ２、及び高調波検出ステップＳ３を、光スキャナ２２によって観察対象物Ｂにおける励起光Ｌａの照射位置を走査しながら繰り返し行う（ステップＳ４，Ｓ５）。これにより、観察対象物Ｂの複数の位置における第２高調波、または第２高調波及び第３高調波の両方の大きさに関するデータが得られる。
　光スキャナ２２による走査が終了したのち（ステップＳ４；ＹＥＳ）、画像生成ステップＳ６を行う。高調波検出ステップＳ３において蛍光Ｌｂの光強度の時間波形に含まれる第２高調波が検出された場合、画像生成ステップＳ６では、励起光Ｌａの複数の照射位置における、蛍光Ｌｂの光強度の時間波形に含まれる第２高調波の大きさに基づいて、画像生成部４０が観察対象物Ｂの観察画像を生成する。高調波検出ステップＳ３において蛍光Ｌｂの光強度の時間波形に含まれる第２高調波及び第３高調波の両方が検出された場合、画像生成ステップＳ６では、励起光Ｌａの複数の照射位置における、蛍光Ｌｂの光強度の時間波形に含まれる第２高調波及び第３高調波の一方もしくは両方の大きさに基づいて、画像生成部４０が観察対象物Ｂの観察画像を生成する。
　以上に説明した本実施形態の顕微鏡装置１および画像取得方法が奏する効果について、従来の顕微鏡装置が有する課題とともに説明する。
　図５の（ａ）部は、ＳＡＸ顕微鏡における蛍光の強度分布の一例を示す図である。ＳＡＸ顕微鏡では、励起光のピーク強度を観察対象物の飽和励起強度よりも大きくする。これにより、蛍光強度の分布の中心から或る範囲内の蛍光強度が飽和し、蛍光強度の分布形状（図中の実線Ｆ２を参照）が、飽和が無い場合の理論値（図中の破線Ｆ１を参照）から変化する。したがって、蛍光強度の理論値と実測値との差分を取ることにより（図５の（ｂ）部の実線Ｆ３を参照）、強度分布の半値全幅を小さくして、顕微鏡の空間分解能を高めることができる。蛍光強度の理論値と実測値との差分または差分に近似する値は、単光子励起の場合、励起光強度の時間波形を正弦波状とし、蛍光強度の時間波形の高調波、例えば第２高調波または第３高調波を検出することによって得られる。
　二光子励起顕微鏡では、例えば近赤外光といった長波長の超短パルス光を励起光として観察対象物へ照射し、観察対象物において二光子励起を生じさせ、それにより生じる蛍光を検出して観察画像を作成する。この二光子励起顕微鏡によれば、物体透過性に優れる長波長の光を用いるので、例えば生体組織の深部を非侵襲的に観察することが可能になる。
　上記の各利点を有するＳＡＸ顕微鏡と二光子励起顕微鏡とを組み合わせることができれば、これらの利点を兼ね備える顕微鏡が実現される。しかしながら、二光子励起においては、蛍光強度は励起光強度の二乗に比例する。したがって、観察対象物へ正弦波状の時間波形を有する励起光を照射し、観察対象物において二光子励起を生じさせると、観察対象物から出力される励起光の時間波形は、正弦波の二乗に比例することとなる。図６は、二光子励起の場合における励起光強度の時間波形（図６の（ａ）部を参照）と、蛍光強度の時間波形（図６の（ｂ）部を参照）とを概念的に示す図である。図６の（ｂ）部に示されるような、正弦波から変形した時間波形を有する蛍光強度に基づいて観察画像を得ようとすると、例えば特許文献２に記載されているように、第３高調波または第５高調波といった、次数の高い高調波を検出する必要が生じる。励起光を検出するデバイス、例えばロックインアンプ３２の周波数範囲の最大値には限度があるので、次数の高い高調波を検出しようとすれば、励起光の周波数を小さくせざるを得ず、観察画像の作成に要する時間が長くなってしまう。あるいは、周波数範囲の上限が高い機器を導入せざるを得ず、コスト高となってしまう。
　本実施形態の顕微鏡装置１および画像取得方法では、励起光Ｌａの光強度の時間波形が正弦波の一次関数の平方根を含む（数式（１）を参照）。上述したように、二光子励起においては、蛍光Ｌｂの光強度は励起光Ｌａの光強度の二乗に比例する。したがって、正弦波の一次関数の平方根を含む時間波形を有する励起光Ｌａを観察対象物Ｂへ照射し、観察対象物Ｂにおいて二光子励起を生じさせると、観察対象物Ｂから出力される励起光Ｌａの時間波形は、正弦波の二乗ではなく、正弦波の一次関数に比例する。図７は、そのような励起光強度の時間波形（図７の（ａ）部を参照）と、蛍光強度の時間波形（図７の（ｂ）部を参照）とを概念的に示す図である。
　したがって、本実施形態の顕微鏡装置１および画像取得方法によれば、一般的なＳＡＸ顕微鏡と同様に、第２高調波または第３高調波といった、より次数の低い高調波に基づいて観察画像を得ることができる。これにより、光検出デバイス３１の周波数範囲の制約により励起光Ｌａの周波数を小さくする必要がないので、観察画像の作成に要する時間が長くなることを回避することができる。あるいは、周波数範囲の上限が低い機器を使用できるのでコスト低減につながる。
　上記の効果を検証するため、本発明者は、本実施形態の顕微鏡装置１において蛍光Ｌｂの光強度を測定した。また比較のため、本発明者は、励起光強度の時間波形を正弦波として蛍光強度を測定した。これらの測定においては、励起光強度、励起光の波長を同じとし、観察対象物Ｂとして同じものを用いた。
　図８の（ａ）部は、本実施形態の顕微鏡装置１において測定された蛍光Ｌｂの光強度の時間波形をフーリエ変換した結果を示すグラフである。図８の（ｂ）部は、励起光強度の時間波形を正弦波とした場合に測定された蛍光強度の時間波形をフーリエ変換した結果を示すグラフである。図８の（ａ）部及び（ｂ）部の矢印Ｕ１は基本波を指しており、飽和させない場合にはこの基本波のみが生じる。励起光強度を飽和が生じる大きさとしてその時間波形を正弦波とした場合、図８の（ｂ）部に示されるように、基本波に加えて、飽和に起因して第２高調波（矢印Ｕ２）、第３高調波（矢印Ｕ３）、第４高調波（矢印Ｕ４）、第５高調波（矢印Ｕ５）、及び第６高調波（矢印Ｕ６）が発生する。これに対し、本実施形態の顕微鏡装置１では、図８の（ａ）部に示されるように、基本波に加えて、飽和に起因して第２高調波（矢印Ｖ２）及び第３高調波（矢印Ｖ３）が発生する。この測定結果では、図８の（ａ）部の第２高調波（矢印Ｖ２）の蛍光強度は、図８の（ｂ）部の第３高調波（矢印Ｕ３）の蛍光強度とほぼ等しくなった。また、図８の（ａ）部の第３高調波（矢印Ｖ３）の蛍光強度は、図８の（ｂ）部の第５高調波（矢印Ｕ５）の蛍光強度とほぼ等しくなった。
　図９の（ａ）部は、本実施形態の顕微鏡装置１において測定された蛍光Ｌｂの基本波及び第２高調波の光強度（蛍光強度）と、励起光Ｌａの相対強度（相対励起強度）との関係を示すグラフである。図９の（ａ）部において、プロットＰ１１は基本波を示し、プロットＰ１２は第２高調波を示す。図９の（ｂ）部は、励起光強度の時間波形を正弦波とした場合に測定された蛍光の基本波、第２高調波及び第３高調波の光強度（蛍光強度）と、励起光の相対強度（相対励起強度）との関係を示すグラフである。図９の（ｂ）部において、プロットＰ２１は基本波を示し、プロットＰ２２は第２高調波を示し、プロットＰ２３は第３高調波を示す。励起光の相対強度とは、光変調器１２から出力された後の周期的な励起光Ｌａの強度であり、光変調器１２によって出力できる最大の強度を１としたときの比である。図９の（ａ）部と図９の（ｂ）部とを比較すると、図９の（ａ）部のプロットＰ１２の配置が、図９の（ｂ）部のプロットＰ２３の配置と、概ね近似していることがわかる。すなわち、本実施形態の顕微鏡装置１において測定された蛍光Ｌｂの第２高調波のプロットの配置は、励起光強度の時間波形を正弦波として測定された蛍光の第３高調波のプロットの配置と概ね近似する。蛍光強度が小さい領域においてプロットＰ１２の配置がプロットＰ２３の配置と近似していないのは、測定誤差によるものと考えられる。
　以上に示された測定結果から、励起光Ｌａの光強度の時間波形が正弦波の一次関数の平方根を含む本実施形態の顕微鏡装置１においては、第２高調波（または第３高調波）の検出が、励起光強度の時間波形が正弦波である場合における第３高調波（または第５高調波）の検出に相当することがわかる。すなわち、本実施形態の顕微鏡装置１によれば、励起光強度の時間波形を正弦波とする場合と比較して、より次数の低い高調波に基づいて観察画像を得ることができる。一般的に、周波数範囲の上限が低い機器は、高い機器に比べて安価であることが多いため、コストの低減を図ることができる。
　本実施形態のように、励起光出力部１０は、パルス光Ｌｐを出力する光源１１と、光源１１から出力されたパルス光Ｌｐを変調して励起光Ｌａを生成する強度変調型の光変調器１２と、を有してもよい。同様に、励起光出力ステップＳ１は、パルス光Ｌｐを変調して励起光Ｌａを生成する強度変調ステップＳ１２を含んでもよい。これにより、光強度の時間波形に正弦波の一次関数の平方根を含む励起光Ｌａを、容易に生成することができる。強度変調型の光変調器１２は、ＡＯ変調器であってもよい。ＡＯ変調器は、本実施形態のような高速且つ非正弦波状の光変調に適している。
　本実施形態のように、光源１１はレーザ光源であり、パルス光Ｌｐはレーザ光であってもよい。これにより、二光子励起を生じさせ得る大きな光強度を有する励起光Ｌａを簡易な構成により生成することができる。
　本実施形態のように、高調波検出部３０は、観察対象物Ｂにおいて生じた蛍光Ｌｂの光強度に応じた信号を生成する光検出デバイス３１と、光検出デバイス３１から信号を入力し、その信号の時間波形に含まれる第２高調波、または第２高調波及び第３高調波の両方を出力するロックインアンプ３２と、を有してもよい。同様に、高調波検出ステップＳ３は、観察対象物Ｂにおいて生じた蛍光Ｌｂの光強度に応じた信号を生成するステップＳ３１と、その信号の時間波形に含まれる第２高調波、または第２高調波及び第３高調波の両方を出力するステップＳ３２と、を含んでもよい。これにより、第２高調波、または第２高調波及び第３高調波の両方を、簡易に且つ精度良く検出することができる。
　本実施形態のように、高調波検出部３０は、観察対象物Ｂにおいて生じた蛍光Ｌｂの光強度の時間波形に含まれる第２高調波及び第３高調波を検出してもよい。同様に、高調波検出ステップＳ３では、観察対象物Ｂにおいて生じた蛍光Ｌｂの光強度の時間波形に含まれる第２高調波及び第３高調波を検出してもよい。そして、画像生成ステップＳ６では、第２高調波及び第３高調波の一方または両方に基づいて、観察対象物Ｂの観察画像を生成してもよい。この場合、第２高調波及び第３高調波のうち観察対象物Ｂに適した高調波による観察画像を簡便に生成することができる。
［第１変形例］
　数式（１）に示される励起光Ｌａの時間波形、すなわち正弦波の一次関数の平方根を含む時間波形は、数式（２）及び図２に示された例に限られない。例えば、図２に示された例では、励起光Ｌａの時間波形、すなわち包絡線Ｋにおける各周期内の最小値Ｉｍｉｎが０となっているが、各周期内の最小値Ｉｍｉｎは０より大きくてもよい。言い換えると、数式（１）において、定数ｂはａより大きくてもよい。或いは、励起光Ｌａの時間波形における各周期内の最小値Ｉｍｉｎは、高調波検出部３０、具体的にはロックインアンプ３２、が受け取ることができる最大信号の０．１％または５％より大きく、２０％より小さくてもよい。図１０は、そのような励起光Ｌａの時間波形を概念的に示す図である。本変形例においても、各周期における励起光Ｌａの光強度の最大値Ｉｍａｘは、観察対象物Ｂにおける飽和励起強度を超える大きさに設定される。
　数式（３）は、本変形例における励起光Ｌａの時間波形の一例を示す数式である。但し、αは０より大きく１より小さい実数である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
 数式（３）に示される励起光Ｌａの時間波形は、光強度（１－α）と光強度１とを周期的に繰り返す。すなわち、励起光Ｌａの時間波形における各周期内の最大値Ｉｍａｘは１であり、最小値Ｉｍｉｎは（１－α）である。
　励起光Ｌａの光強度の時間波形における各周期内の最小値Ｉｍｉｎ及びその付近においては、発生する蛍光Ｌｂの強度は僅かであり、その検出結果はノイズの影響を大きく受ける。本変形例のように、励起光Ｌａの光強度の時間波形における各周期内の最小値Ｉｍｉｎを０よりも大きくすることによって、ノイズの影響を小さくして第２高調波及び第３高調波の検出精度を高め、観察画像をより明瞭にすることができる。或いは、励起光Ｌａの光強度の時間波形における各周期内の最小値Ｉｍｉｎを、高調波検出部３０又は高調波検出ステップＳ３において受け取ることができる最大信号の０．１％より大きく且つ２０％より小さくしてもよい。これにより、ノイズの影響を小さくして第２高調波及び第３高調波の検出精度を高め、観察画像をより明瞭にすることができる。
　励起光Ｌａの光強度の時間波形が正弦波の一次関数の平方根を含む場合には、励起光強度の時間波形が正弦波である場合と比較して、各周期内の最小値Ｉｍｉｎ付近における光強度の変化率が大きくなる。言い換えると、各周期内の最小値Ｉｍｉｎ付近における光強度の時間波形が急峻になる。そして、各周期内の最小値Ｉｍｉｎが０である場合に、この変化率は最も大きくなる（図２を参照）。ここで、図１１は、一般的なＡＯ変調器の印加電圧と出力光強度との関係の典型例を示すグラフである。図１１に示されるように、ＡＯ変調器からの出力光強度は、入力される印加電圧に対して非線形に変化する。そして、印加電圧が低い領域においては、出力光強度の変化が極めて緩やかである。このため、励起光Ｌａの光強度が小さい期間において光強度の変化率が大きいと、ＡＯ変調器への印加電圧を急激に変化させる必要が生じるので、印加電圧の制御が容易ではなくなる。このような課題に対し、本変形例のように、各周期内の最小値Ｉｍｉｎを０よりも大きくすることによって、各周期内の最小値Ｉｍｉｎ付近における光強度の変化率を小さくし、時間波形の急峻さを緩和することができる。或いは、各周期内の最小値Ｉｍｉｎを、高調波検出部３０又は高調波検出ステップＳ３において受け取ることができる最大信号の０．１％より大きく且つ２０％より小さくすることによって、各周期内の最小値Ｉｍｉｎ付近における光強度の変化率を小さくし、時間波形の急峻さを緩和することができる。よって、光変調器１２としてＡＯ変調器を有する励起光出力部１０における、励起光Ｌａの光強度の時間波形の成形、特に、各周期内の最小値Ｉｍｉｎ付近の時間波形の成形が容易になる。
　上記のように各周期内の最小値Ｉｍｉｎを０よりも大きくする場合、蛍光Ｌｂの光強度の時間波形における各周期内の最小値もまた０より大きくなる。したがって、ロックインアンプ３２において蛍光Ｌｂの光強度の時間波形をそのまま用いると、第２高調波及び第３高調波の検出精度が低下するおそれがある。このようなおそれを回避するために、ロックインアンプ３２内またはロックインアンプ３２の前段において、蛍光Ｌｂの光強度の時間波形における各周期内の最小値がゼロになるように時間波形を調整してもよい。言い換えると、励起光Ｌａの最小値Ｉｍｉｎとゼロとの差に起因する、蛍光Ｌｂの時間波形の変動分をキャンセルしてもよい。
［第２実施形態］
　図１２は、第２実施形態に係る顕微鏡装置２の構成を示す図である。顕微鏡装置２は、観察対象物Ｂの画像を取得するための装置である。顕微鏡装置２は、励起光出力部（励起光出力装置）１０と、光学系２０Ａと、高調波検出部３０と、画像生成部４０と、信号発生器５０と、を備えている。励起光出力部１０、高調波検出部３０、画像生成部４０、及び信号発生器５０の構成は、第１実施形態と同様である。
　光学系２０Ａは、励起光出力部１０から出力された励起光Ｌａを、観察対象物Ｂに照射するための光学系である。光学系２０Ａは、励起光出力部１０から観察対象物Ｂに達する励起光Ｌａの光路を含む。光学系２０Ａは、ビームエキスパンダ２１と、偏光変換部６１と、位相変換部６２と、リングマスク６３と、光スキャナ２２と、リレーレンズ系２３と、ダイクロイックミラー２４と、対物レンズ２５と、を有する。ビームエキスパンダ２１、光スキャナ２２、リレーレンズ系２３、ダイクロイックミラー２４、及び対物レンズ２５の構成は、第１実施形態と同様である。図示例では、偏光変換部６１、位相変換部６２、及びリングマスク６３は、ビームエキスパンダ２１と光スキャナ２２との間の光路上に設けられている。本実施形態においても、観察対象物Ｂを載置したステージを励起光Ｌａの光軸に垂直な面内において移動させることによって、観察対象物Ｂにおける励起光Ｌａの照射位置を走査してもよい。その場合、光スキャナ２２は設けられなくてもよい。光スキャナ２２が設けられる場合、偏光変換部６１、位相変換部６２、及びリングマスク６３は光スキャナ２２の前段に設けられてもよい。
　偏光変換部６１は、ビームエキスパンダ２１を介して励起光出力部１０と光学的に結合されている。偏光変換部６１は、励起光Ｌａを入力し、励起光Ｌａをアジマス偏光に変換して出力する。偏光変換部６１に入力される前の励起光Ｌａの偏光状態は、例えば直線偏光である。図１３は、光軸に垂直な面内におけるアジマス偏光の偏光方向を示す図である。図１３において、矢印Ａは偏光方向を示す。図１４は、アジマス偏光の集光像を示す図である。図１４において、光強度が色の濃淡で示されており、濃い部分ほど光強度が小さく、淡い部分ほど光強度が大きい。図１４において、（ａ）部～（ｄ）部は光軸に対して垂直な面内における光強度分布を示し、（ｅ）部～（ｈ）部は光軸を含み光軸に平行な面内における光強度分布を示す。図中に示されるＸＹ座標系は、（ａ）部～（ｄ）部に適用される。図中に示されるＺＸ座標系は、（ｅ）部～（ｈ）部に適用される。図１４において、（ｂ）部及び（ｆ）部は、電界のＸ方向すなわち光軸に垂直な方向の振動成分Ｅｘによる光強度（｜Ｅｘ｜２）を示す。（ｃ）部及び（ｇ）部は、電界のＹ方向すなわち光軸及びＸ方向に垂直な方向の振動成分Ｅｙによる光強度（｜Ｅｙ｜２）を示す。（ｄ）部及び（ｈ）部は、電界のＺ方向すなわち光軸方向の振動成分Ｅｚによる光強度（｜Ｅｚ｜２）を示す。（ａ）部及び（ｅ）部は、電界の全方向の振動成分を合成した光強度（｜Ｅｘ｜２＋｜Ｅｙ｜２＋｜Ｅｚ｜２）を示す。図１３及び図１４に示されるように、アジマス偏光では、光軸を中心とする円周の接線方向に電界の振動方向が沿っており、光軸付近では光強度が小さくなる。したがって、光軸に垂直な面内におけるアジマス偏光の光強度分布は円環状となる。偏光変換部６１は、励起光出力部１０から入力された励起光Ｌａをこのようなアジマス偏光に変換して出力する。偏光変換部６１は、例えばアジマス偏光子または２つの空間光変調器によって構成され得る。アジマス偏光子は、ガラスプレートに加工を施した固定式のもの、または液晶を用いた可変式のものであってもよい。
　位相変換部６２は、ビームエキスパンダ２１及び偏光変換部６１を介して励起光出力部１０と光学的に結合されている。位相変換部６２は、励起光Ｌａを入力し、励起光Ｌａにらせん型の位相パターンによる位相変調を与える。図１５は、らせん型の位相パターンを示す図である。図１５において、位相の大きさが色の濃淡で示されており、淡い部分ほど位相が小さく、濃い部分ほど位相が大きい。図１５に示されるように、らせん型の位相パターンでは、光軸Ｑまわりの角度に応じて位相が単調に変化する。一例では、このらせん型の位相パターンにおいて位相は０（ｒａｄ）から２π（ｒａｄ）まで変化する。すなわち、一周回での位相変化の幅は２π（ｒａｄ）である。位相変換部６２は、例えば、らせん型の位相板または位相変調型の空間光変調器によって構成され得る。位相板は、例えばガラスプレートに位相変調のための加工を施したものであってもよい。
　図１６は、らせん型の位相パターンによる位相変調とアジマス偏光とを与えた光の集光像を示す図である。図１６において、光強度が色の濃淡で示されており、濃い部分ほど光強度が小さく、淡い部分ほど光強度が大きい。図１６において、（ａ）部～（ｄ）部は光軸に対して垂直な面内における光強度分布を示し、（ｅ）部～（ｈ）部は光軸を含み光軸に平行な面内における光強度分布を示す。図中に示されるＸＹ座標系は、（ａ）部～（ｄ）部に適用される。図中に示されるＺＸ座標系は、（ｅ）部～（ｈ）部に適用される。図１６において、（ｂ）部及び（ｆ）部は、電界のＸ方向すなわち光軸に垂直な方向の振動成分Ｅｘによる光強度（｜Ｅｘ｜２）を示す。（ｃ）部及び（ｇ）部は、電界のＹ方向すなわち光軸及びＸ方向に垂直な方向の振動成分Ｅｙによる光強度（｜Ｅｙ｜２）を示す。（ｄ）部及び（ｈ）部は、電界のＺ方向すなわち光軸方向の振動成分Ｅｚによる光強度（｜Ｅｚ｜２）を示す。（ａ）部及び（ｅ）部は、電界の全方向の振動成分を合成した光強度（｜Ｅｘ｜２＋｜Ｅｙ｜２＋｜Ｅｚ｜２）を示す。図１６に示されるように、アジマス偏光にらせん型の位相パターンを組み合わせると、光軸付近の光強度が大きくなり、光軸に垂直な面内における光強度分布が円環状から中実な円形に変化する。励起光Ｌａは、偏光変換部６１及び位相変換部６２を通過することにより、このような中実な円形の光強度分布を有することとなる。
　リングマスク６３は、ビームエキスパンダ２１、偏光変換部６１及び位相変換部６２を介して励起光出力部１０と光学的に結合されている。リングマスク６３は、励起光Ｌａを入力し、励起光Ｌａのビーム断面において励起光Ｌａを空間的に強度変調して、当該変調後の励起光Ｌａを出力する。リングマスク６３は、リング形状の遮光部と、その遮光部の内側および外側それぞれに接して設けられた透過部と、を有する。本実施形態のリングマスク６３は、いわゆる多重リングマスクである。リングマスク６３は、例えば、遮光部及び透過部が形成された板状部材、または位相変調型の空間光変調器によって構成され得る。板状部材は、例えば光透過性の板材上に遮光部としての光遮蔽性膜が形成されることによって構成され得る。リングマスクには振幅変調型（言い換えると強度変調型）、位相変調型、及びそれらの複合型が存在する。本実施形態のリングマスク６３は振幅変調型である。
　図１７は、光軸方向から見たリングマスク６３の構成の一例を示す図である。このリングマスク６３は、中心位置の周りに設けられた複数のリング形状の遮光部を有する。図示例では、リングマスク６３は、３個の遮光部Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３を有する。さらに、リングマスク６３は、透過部Ｅ１と、透過部Ｅ２と、透過部Ｅ３と、透過部Ｅ４と、遮光部Ｄ４と、を有する。透過部Ｅ１は、遮光部Ｄ１の内側に設けられた最内層の透過部である。透過部Ｅ２は、遮光部Ｄ１と遮光部Ｄ２との間に設けられたリング形状の透過部である。透過部Ｅ３は、遮光部Ｄ２と遮光部Ｄ３との間に設けられたリング形状の透過部である。透過部Ｅ４は、遮光部Ｄ３の外側に設けられたリング形状の最外層の透過部である。遮光部Ｄ４は、透過部Ｅ４の外側に設けられている。
　透過部Ｅ１～Ｅ４における光透過率は、遮光部Ｄ１～Ｄ４における光透過率より大きい。透過部Ｅ１～Ｅ４における光透過率は、１であってもよいし、１より小さくてもよい。遮光部Ｄ１～Ｄ４における光透過率は、０であってもよいし、０より大きくてもよい。透過部Ｅ１、遮光部Ｄ１、透過部Ｅ２、遮光部Ｄ２、透過部Ｅ３、遮光部Ｄ３、透過部Ｅ４および遮光部Ｄ４のうちの隣り合う透過部と遮光部との間の境界は、同心円であってもよし、楕円であってもよい。以下では、境界が円であるとして説明をする。透過部Ｅ１の径方向の幅すなわち半径をｅ１とする。遮光部Ｄ１の径方向の幅をｄ１とする。透過部Ｅ２の径方向の幅をｅ２とする。遮光部Ｄ２の径方向の幅をｄ２とする。透過部Ｅ３の径方向の幅をｅ３とする。遮光部Ｄ３の径方向の幅をｄ３とする。透過部Ｅ４の径方向の幅をｅ４とする。
　リング形状の遮光部Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３のうちの隣り合う二つの遮光部それぞれの径方向の幅は、これら二つの遮光部の間に設けられた透過部の径方向の幅より大きい。すなわち、本実施形態のリングマスク６３においては、遮光部Ｄ１，Ｄ２および透過部Ｅ２それぞれの径方向の幅が下記（４）式で表される関係を有し、遮光部Ｄ２，Ｄ３および透過部Ｅ３それぞれの径方向の幅が下記（５）式で表される関係を有する。隣り合う二つのリング形状の遮光部の全ての組合せについて、このような関係を有してもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
　本実施形態において、偏光変換部６１、位相変換部６２、及びリングマスク６３の並び順は図１２に示された例に限られず、様々に変更可能である。すなわち、偏光変換部６１、位相変換部６２、及びリングマスク６３は、励起光出力部１０から見て、図１８の（ａ）部～（ｅ）部のいずれかに示される順序で並んでいてもよい。
図１８の（ａ）部：励起光出力部１０から見て偏光変換部６１、リングマスク６３、位相変換部６２の順。
図１８の（ｂ）部：励起光出力部１０から見て位相変換部６２、偏光変換部６１、リングマスク６３の順。
図１８の（ｃ）部：励起光出力部１０から見て位相変換部６２、リングマスク６３、偏光変換部６１の順。
図１８の（ｄ）部：励起光出力部１０から見てリングマスク６３、偏光変換部６１、位相変換部６２の順。
図１８の（ｅ）部：励起光出力部１０から見てリングマスク６３、位相変換部６２、偏光変換部６１の順。
　再び図１２を参照する。本実施形態において、光スキャナ２２は、偏光変換部６１、位相変換部６２、及びリングマスク６３を介してビームエキスパンダ２１と光学的に結合されている。
　本実施形態において、対物レンズ２５は、例えば乾燥対物レンズ、水浸対物レンズ、油浸対物レンズまたはシリコーン浸対物レンズである。対物レンズ２５として、透明化した試料を観察するために用いられる対物レンズが用いられてもよい。対物レンズ２５が水浸対物レンズである場合、その開口数は例えば１．２以上である。対物レンズ２５が油浸対物レンズである場合、その開口数は例えば１．４５以上である。対物レンズ２５と観察対象物Ｂとの間の媒質における屈折率Ｒと対物レンズ２５の開口数ＮＡとの比（ＮＡ／Ｒ）は、例えば０．７５以上である。
　図１９は、本実施形態に係る顕微鏡装置２の動作を説明するためのフローチャートである。図１９を参照しながら、顕微鏡装置２の動作とともに本実施形態に係る画像取得方法について説明する。
　まず、励起光出力ステップＳ１を行う。励起光出力ステップＳ１の詳細は、第１実施形態と同様である。
　次に、励起光照射ステップＳ２ａを行う。励起光照射ステップＳ２ａでは、励起光出力ステップＳ１において出力された励起光Ｌａを、ビームエキスパンダ２１、偏光変換部６１、位相変換部６２、リングマスク６３、光スキャナ２２、リレーレンズ系２３、ダイクロイックミラー２４、及び対物レンズ２５を介して、観察対象物Ｂに照射する。すなわち、励起光照射ステップＳ２ａでは、励起光出力ステップＳ１において出力された励起光Ｌａに対し、偏光変換部６１による偏光変換処理Ｓ２１、位相変換部６２による位相変換処理Ｓ２２、及びリングマスク６３によるリングマスク処理Ｓ２３を行う。更に、励起光照射ステップＳ２ａでは、対物レンズ２５を用いて観察対象物Ｂにおいて励起光Ｌａを集光させる集光処理Ｓ２４を行う。偏光変換処理Ｓ２１は、励起光Ｌａをアジマス偏光に変換する処理である。位相変換処理Ｓ２２は、らせん型の位相パターンによる位相変調を励起光Ｌａに与える処理である。励起光照射ステップＳ２ａの集光処理Ｓ２４では、開口数が１．２以上である水浸対物レンズを用いて励起光Ｌａを集光させてもよい。或いは、開口数が１．４５以上である油浸対物レンズを用いて励起光Ｌａを集光させてもよい。位相変換処理Ｓ２２及びリングマスク処理Ｓ２３を、それぞれ位相変調型の空間光変調器を用いて行ってもよい。
　続いて、高調波検出ステップＳ３を行う。高調波検出ステップＳ３の詳細は、第１実施形態と同様である。
　上記の励起光出力ステップＳ１、励起光照射ステップＳ２ａ、及び高調波検出ステップＳ３を、光スキャナ２２によって観察対象物Ｂにおける励起光Ｌａの照射位置を走査しながら繰り返し行う（ステップＳ４，Ｓ５）。これにより、観察対象物Ｂの複数の位置における第２高調波、または第２高調波及び第３高調波の両方の大きさに関するデータが得られる。
　光スキャナ２２による走査が終了したのち（ステップＳ４；ＹＥＳ）、画像生成ステップＳ６を行う。画像生成ステップＳ６の詳細は、第１実施形態と同様である。
　以上に説明した本実施形態の顕微鏡装置２及び画像取得方法によれば、第１実施形態と同様の作用効果を得ることができる。加えて、本実施形態の顕微鏡装置２及び画像取得方法によれば、以下に説明する作用効果をも得ることができる。
　顕微鏡装置において、光源から出力される光は、集光レンズを経て観察対象物の表面または内部に集光照射される。このように光を集光する場合、その集光径の大きさの目安であるビームウェスト径は、光の波長の半分程度までしか小さくすることができない。これは回折限界と呼ばれる。
　回折限界を超えて集光径を小さくするためには、リングマスクが用いられる。リングマスクには、単リングマスクと多重リングマスクとが存在する。単リングマスクは、単一のリング形状の遮光部と、その遮光部の内側および外側それぞれに設けられた透過部とを有する。そして、遮光部の内側および外側それぞれの透過部を通過した光が集光レンズを経て集光位置に到達する。集光位置において、これら二つの光が干渉することにより、回折限界より小さい領域に光を集光することができる。多重リングマスクは、同心円状に配置された複数のリング形状の遮光部と、これら複数の遮光部の間に設けられた複数の透過部とを有する。そして、各透過部を通過した光が集光レンズを経て集光位置に到達する。このような多重リングマスクを用いる場合であっても、回折限界を超えて、より小さい領域に光を集光することができる。
　図２０の（ａ）部及び（ｂ）部は、光軸を含み光軸に平行な断面の集光スポット形状を示す図である。これらの図において、実線Ｈａはリングマスクを設けたときの集光スポット形状を示し、破線Ｈｂはリングマスクを設けないときの集光スポット形状を示す。図２０の（ａ）部は、開口数が０．９である水浸対物レンズを用いる場合を想定している。図２０の（ｂ）部は、開口数が１．３である水浸対物レンズを用いる場合を想定している。図２０に示されるように、リングマスクを設けることによって、集光スポットの大きさを縮小することができる。
　参考例として、円偏光に多重リングマスクを適用する場合を考える。下記の表１及び表２は、参考例に係る光照射装置における、対物レンズの開口数と、リングマスクを設けることによる集光スポットの小径化の程度との関係の一例を示す表である。これらの表に示される体積改善率は、リングマスクを設けない場合における集光スポットの体積Ａ１を、リングマスクを設けた場合における集光スポットの体積Ａ２で除算した値（Ａ１／Ａ２）である。横方向改善率は、リングマスクを設けない場合における光軸に垂直な方向の集光スポット径、すなわち図２０に示される径Ｗａ１を、リングマスクを設けた場合における光軸に垂直な方向の集光スポット径、すなわち図２０に示される幅Ｗａ２で除算した値（Ｗａ１／Ｗａ２）である。縦方向改善率は、リングマスクを設けない場合における光軸方向の集光スポット長さ、すなわち図２０に示される長さＷｂ１を、リングマスクを設けた場合における光軸方向の集光スポット長さ、すなわち図２０に示される長さＷｂ２で除算した値（Ｗｂ１／Ｗｂ２）である。集光スポット径及び集光スポット長さは、光強度分布の半値全幅（ＦＷＨＭ）である。これらの例では、リングマスクを４重の遮光部を有する多重リングマスクとし、サイドローブの光強度がメインローブすなわち集光スポットの光強度の２．５％以下となる条件で、集光スポットの体積を最小化させるリングマスクの構成の探索を行った。リングマスクの構成とは、具体的には、遮光部Ｄ１～Ｄ３の幅ｄ１～ｄ３、及び透過部Ｅ１～Ｅ４の幅ｅ１～ｅ４を指す。表１は、対物レンズとして水浸対物レンズを想定している。表２は、対物レンズとして油浸対物レンズを想定している。表３は、対物レンズとして乾燥対物レンズを想定している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表１及び表２に示されるように、対物レンズの種類及び開口数にかかわらず、リングマスクを設けることによって、体積改善率、横方向改善率及び縦方向改善率のいずれもが１より大きくなる。しかしながら、横方向改善率は、縦方向改善率と比較して小さい。特に、水浸対物レンズでは開口数が１．０５以上、油浸対物レンズでは開口数が１．２５以上、乾燥対物レンズでは開口数が０．８以上といった、開口数が大きい対物レンズを用いる場合においては、横方向改善率が１．０８以下となり、そのような傾向が顕著である。ここで、水浸対物レンズと観察対象物Ｂとの間の媒質すなわち浸液の屈折率を１．３３３とする。油浸対物レンズと観察対象物Ｂとの間の媒質すなわち浸液の屈折率を１．５１８とする。乾燥対物レンズと観察対象物Ｂとの間の媒質すなわち空気の屈折率を１とする。このとき、横方向改善率が１．０８以下に低下し始める開口数ＮＡと、これらの屈折率Ｒとの比（ＮＡ／Ｒ）は、水浸対物レンズ、油浸対物レンズ、及び乾燥対物レンズのいずれにおいても、０．７５以上となる。横方向改善率が小さいと、集光スポット径の小径化の程度が小さく、例えば顕微鏡における解像度の向上の程度も小さくなる。
　上記の問題に対し、本発明者は、リングマスク６３に加えて、アジマス偏光に変換する偏光変換部６１、及びらせん型の位相パターンによる位相変調を与える位相変換部６２を設けることによって、集光径の小径化の程度を高めることができることを見出した。同様に、本発明者は、アジマス偏光に変換する偏光変換処理Ｓ２１、及びらせん型の位相パターンによる位相変調を与える位相変換処理Ｓ２２を行うことによって、集光径の小径化の程度を高めることができることを見出した。
　図２１は、リングマスクを用いない場合における、開口率毎の横分解能比を示すグラフである。図２１において、棒線Ｇ１１は、観察対象物Ｂに照射される光が円偏光である場合を示す。棒線Ｇ１２は、観察対象物Ｂに照射される光がラジアル偏光である場合を示す。棒線Ｇ１３は、観察対象物Ｂに照射される光がアジマス偏光とらせん型の位相変調との組み合わせである場合を示す。縦軸は、横分解能比を示す。横分解能比は、油浸対物レンズの開口数が１．５０であり且つ観察対象物Ｂに照射される光が円偏光であるときの横分解能を、各開口数及び各偏光での横分解能で除算した値である。横軸は開口数を示す。図２１を参照すると、リングマスクを用いない場合でも、観察対象物Ｂに照射される光が円偏光またはラジアル偏光である場合と比較して、観察対象物Ｂに照射される光がアジマス偏光とらせん型の位相変調との組み合わせである場合には、横分解能比がいずれの開口数においても向上することがわかる。
　図２２は、リングマスクを用いた場合における、開口率毎の横分解能比を示すグラフである。図２２において、棒線Ｇ２１は、観察対象物Ｂに照射される光が円偏光である場合を示す。棒線Ｇ２２は、観察対象物Ｂに照射される光がラジアル偏光である場合を示す。棒線Ｇ２３は、観察対象物Ｂに照射される光がアジマス偏光とらせん型の位相変調との組み合わせである場合を示す。縦軸は、横分解能比を示す。横分解能比は、リングマスクを用いない場合における、油浸対物レンズの開口数が１．５０であり且つ観察対象物Ｂに照射される光が円偏光であるときの横分解能を、リングマスクを用いた場合の各開口数及び各偏光での横分解能で除算した値である。横軸は開口数を示す。図２２を参照すると、リングマスクを用いた場合には、観察対象物Ｂに照射される光がいずれの偏光状態である場合でも、リングマスクを用いない場合と比較して横分解能比は向上する。特に、観察対象物Ｂに照射される光がアジマス偏光とらせん型の位相変調との組み合わせである場合には、横分解能比が格段に向上する。
　このように、リングマスクに加えて、アジマス偏光とらせん型の位相変調とを組み合わせた光を観察対象物Ｂに照射することによって、横分解能比すなわち横方向改善率が格段に向上する。したがって、本実施形態によれば、集光径の小径化の程度を高めることができる。
　図２３は、光軸を含み光軸方向に平行な断面における第２高調波検出した蛍光を示す図である。図２４は、同断面における第３高調波検出した蛍光を示す図である。これらの図において、光強度が色の濃淡で示されており、濃い部分ほど光強度が小さく、淡い部分ほど光強度が大きい。図２３及び図２４において、（ａ）部及び（ｂ）部は、観察対象物Ｂに照射される励起光Ｌａがアジマス偏光にらせん型の位相変調を与えられた光である場合の蛍光像を示している。（ｃ）部及び（ｄ）部は、参考例として、観察対象物Ｂに照射される励起光Ｌａが円偏光である場合の蛍光像を示している。図２３及び図２４において、（ａ）部及び（ｃ）部は、リングマスク６３が設けられたときの蛍光像を示している。（ｂ）及び（ｄ）部は、リングマスク６３が設けられないときの蛍光像を示している。
　図２３及び図２４において、（ａ）部及び（ｃ）部を（ｂ）部及び（ｄ）部と比較すると、リングマスク６３が設けられる場合には、リングマスク６３が設けられない場合よりも蛍光像の横方向と縦方向の寸法が小さくなることがわかる。図２３及び図２４において、（ａ）部及び（ｂ）部を（ｃ）部及び（ｄ）部と比較すると、観察対象物Ｂに照射される励起光Ｌａがアジマス偏光にらせん型の位相変調を与えられた光である場合には、観察対象物Ｂに照射される励起光Ｌａが円偏光である場合よりも特に蛍光像の横方向の寸法が小さくなることがわかる。
　前述したように、リングマスク６３及びリングマスク処理Ｓ２３は振幅変調型であってもよい。リングマスクには振幅変調型、位相変調型、及びこれらの複合型が存在する。位相変調型の光利用効率は振幅変調型の光利用効率よりも高いので、位相変調型によれば損失を低減しつつ効率的に光を照射することができる。しかし、位相変調型のリングマスクを用いると、光軸方向における集光スポットの両隣に、不要な集光部分であるサイドローブが生じやすい。例えば非特許文献３には、サイドローブをメインローブに干渉させることによってメインローブを小さくすることが開示されている。例えば単光子励起型の蛍光顕微鏡などでは共焦点光学系を用い、ピンホールによるコンフォーカル効果によって解像度を高めることができるので、このような不要な集光部分の発生は或る程度許容される。しかし、例えば二光子励起型の蛍光顕微鏡などでは、励起効率が単光子励起型よりも低く、更に、深部観察時には収差の影響によりピンホール位置と集光位置とに大きなずれが生じるので光損失が大きい。振幅変調型のリングマスクを用いることにより、位相変調型のリングマスクを用いる場合と比較して、不要な集光部分であるサイドローブが低減される。これにより、ピンホールを含む共焦点光学系を設けずに済み、光損失を抑えつつ装置の小型化に寄与できる。
　対物レンズ２５と観察対象物Ｂとの間の媒質における屈折率Ｒと対物レンズ２５の開口数ＮＡとの比（ＮＡ／Ｒ）は、０．７５以上であってもよい。同様に、励起光照射ステップＳ２の集光処理Ｓ２４において、対物レンズ２５と観察対象物Ｂとの間の媒質における屈折率Ｒと対物レンズ２５の開口数ＮＡとの比（ＮＡ／Ｒ）が０．７５以上である対物レンズ２５を用いて、励起光Ｌａを集光させてもよい。本実施形態の顕微鏡装置２及び画像取得方法によれば、このように対物レンズの開口数が大きい場合に、集光径の小径化の程度をより高めることができる。対物レンズとしては、水浸対物レンズ、油浸対物レンズ、乾燥対物レンズ、シリコーン浸対物レンズ、または透明化溶液に対応した対物レンズなどを使用可能である。
　前述したように、位相変換部６２及びリングマスク６３は、それぞれ位相変調型の空間光変調器によって構成されてもよい。同様に、位相変換処理Ｓ２２及びリングマスク処理Ｓ２３のそれぞれを、位相変調型の空間光変調器を用いて行ってもよい。この場合、位相変換部６２または位相変換処理Ｓ２２における位相パターンの変更を容易に行うことができる。更に、リングマスク６３またはリングマスク処理Ｓ２３における遮光部Ｄ１～Ｄ３の幅ｄ１～ｄ３及び透過部Ｅ１～Ｅ４の幅ｅ１～ｅ４の変更を容易に行うことができる。
　前述したように、リングマスク６３は、中心位置の周りに設けられたリング形状の複数の遮光部Ｄ１～Ｄ３と、複数の遮光部Ｄ１～Ｄ３のうちの隣り合う二つの遮光部の間に設けられた透過部Ｅ２，Ｅ３と、複数の遮光部Ｄ１～Ｄ３のうちの最内層の遮光部Ｄ１の内側に設けられた最内層の透過部Ｅ１と、複数の遮光部Ｄ１～Ｄ３のうちの最外層の遮光部Ｄ３の外側に設けられた最外層の透過部Ｅ４と、を有してもよい。このような多重リングマスクを用いることにより、集光径の小径化の程度をより高めることができる。
　［第２変形例］
　図２５は、第２実施形態の一変形例に係る顕微鏡装置２Ａの構成の概略を示す図である。顕微鏡装置２Ａは、上述した顕微鏡装置２の位相変換部６２及びリングマスク６３に代えて、位相変調型の空間光変調器２８及びアパーチャ光学系２９を備えている点で、第２実施形態の顕微鏡装置２と相違する。顕微鏡装置２Ａの他の構成は第２実施形態の顕微鏡装置２と同様である。励起光出力部１０と空間光変調器２８との相対的な配置によっては、励起光出力部１０と空間光変調器２８とは例えばミラー９といった光学系によって光結合されてもよい。
　空間光変調器２８は、位相変換部６２の機能と、リングマスク６３の機能とを兼ねている。言い換えると、本変形例において、位相変換部６２を構成する空間光変調器は、リングマスク６３を構成する空間光変調器と共通である。空間光変調器２８は、位相変換部６２を構成するための位相パターンと、リングマスク６３を構成するための位相パターンとを重畳した位相パターンを呈示する。位相パターンには、更に、収差を補正するための位相パターンが重畳されてもよい。特に、空間光変調器２８自身が有する収差は、らせん型の位相変調の精度に影響するので、補正される。深部観察の際に生じる収差、例えば、観察対象物Ｂと浸液との屈折率差から生じる球面収差などを、空間光変調器２８によって同時に補正してもよい。空間光変調器２８は、位相パターンによって振幅変調型のリングマスク６３を構成する。図２６は、振幅変調型のリングマスク６３を構成する位相パターンの例を示す図である。図２６においては、位相パターンを構成する各画素の位相値が色の濃淡で示されており、色が淡いほど位相値が小さく、色が濃いほど位相値が大きい。この例では、リングマスク６３は３重のリングマスクである。すなわち、このリングマスク６３は、中心位置の周りに設けられた複数のリング形状の遮光部を有する。図示例では、リングマスク６３は２個の遮光部Ｄ５，Ｄ６を有する。さらに、リングマスク６３は、遮光部Ｄ５の内側に設けられた最内層の透過部Ｅ５と、遮光部Ｄ５と遮光部Ｄ６との間に設けられたリング形状の透過部Ｅ６と、遮光部Ｄ６の外側に設けられたリング形状の最外層の透過部Ｅ７と、透過部Ｅ７の外側に設けられた遮光部Ｄ７と、を有する。
　遮光部Ｄ５～Ｄ７は、位相値が周期的に変化するグレーティングによって構成され、透過部Ｅ５～Ｅ７の位相値は一定とされている。具体的には、遮光部Ｄ５～Ｄ７では、各周期において０（ｒａｄ）から２π（ｒａｄ）まで単調に増加する位相分布が周期的に繰り返されている。このような位相パターンによって、透過部Ｅ５～Ｅ７から出射される光の出射方向に対し、遮光部Ｄ５～Ｄ７から出射される光の出射方向は傾く。
　再び図２５を参照する。アパーチャ光学系２９は、空間光変調器２８の後段に設けられ、空間光変調器２８と光学的に結合されている。アパーチャ光学系２９は、一対のレンズ２９１，２９２と、レンズ２９１，２９２の間に配置されたアパーチャ２９３とを有する。空間光変調器２８から出射された光は、レンズ２９１とレンズ２９２との間にビームウエストを形成する。アパーチャ２９３はビームウエストに位置し、空間光変調器２８の遮光部Ｄ５～Ｄ７から出射された光の少なくとも一部を遮蔽する。これにより、空間光変調器２８の遮光部Ｄ５～Ｄ７から出射した光は減光または排除され、透過部Ｅ５～Ｅ７から出射した光は、アパーチャ２９３を通過する。本変形例においても、透過部の光透過率は、遮光部の光透過率より大きい。透過部の光透過率は、透過部Ｅ５～Ｅ７に入射した光の光強度に対する、透過部Ｅ５～Ｅ７から出射してアパーチャ２９３を通過した光の光強度の割合として定義される。遮光部の光透過率は、遮光部Ｄ５～Ｄ７に入射した光の光強度に対する、遮光部Ｄ５～Ｄ７から出射してアパーチャ２９３を通過した光の光強度の割合として定義される。透過部の光透過率は、１であってもよいし、１より小さくてもよい。遮光部の光透過率は、０であってもよいし、０より大きくてもよい。
　或いは、図２７に示されるように、透過部Ｅ５～Ｅ７は、位相値が周期的に変化するグレーティングによって構成され、遮光部Ｄ５～Ｄ７の位相値は一定とされてもよい。具体的には、透過部Ｅ５～Ｅ７では、各周期において０（ｒａｄ）から２π（ｒａｄ）まで単調に増加する位相分布が周期的に繰り返されている。このような位相パターンによって、遮光部Ｄ５～Ｄ７から出射される光の出射方向に対し、透過部Ｅ５～Ｅ７から出射される光の出射方向は傾くこととなる。そして、アパーチャ２９３の位置を、ビームウエストに対して、光軸と交差する方向に僅かにずらす。このような形態であっても、アパーチャ２９３は、空間光変調器２８の遮光部Ｄ５～Ｄ７から出射された光の少なくとも一部を遮蔽するとともに、空間光変調器２８の透過部Ｅ５～Ｅ７から出射された光を通過させることができる。
　本変形例のように、位相変換部６２を構成する空間光変調器は、リングマスク６３を構成する空間光変調器と共通であってもよい。そして、共通の空間光変調器２８は、位相変換部６２を構成するための位相パターンと、リングマスク６３を構成するための位相パターンとを重畳した位相パターンを呈示してもよい。同様に、第２実施形態の画像取得方法（図１９を参照）において、位相変換処理Ｓ２２を行う空間光変調器は、リングマスク処理Ｓ２３を行う空間光変調器と共通であってもよい。そして、その空間光変調器は、位相変換処理Ｓ２２を行うための位相パターンと、リングマスク処理Ｓ２３を行うための位相パターンとを重畳した位相パターンを呈示してもよい。この場合、位相変換部６２を構成する部品とリングマスク６３を構成する部品とを一つにまとめて、装置の構成を簡素化することができる。或いは、位相変換処理Ｓ２２を行う部品とリングマスク処理Ｓ２３を行う部品とを一つにまとめて、装置の構成を簡素化することができる。
　本開示による顕微鏡装置および画像取得方法は、上述した実施形態に限られるものではなく、他に様々な変形が可能である。例えば、上記実施形態では観察対象物において二光子励起を生じさせる場合について説明した。本開示による顕微鏡装置および画像取得方法は、観察対象物においてｎ光子励起（ｎは２以上の整数）を生じさせる場合に有効である。すなわち、励起光出力ステップＳ１の強度変調ステップＳ１２において、励起光出力部１０の光変調器１２は、光強度の時間波形が正弦波の一次関数のｎ乗根を含む励起光Ｌａを出力する。従って、上述した実施形態における「二光子励起」及び「平方根」との記載は、全て「ｎ光子励起」及び「ｎ乗根」に置き換えることができる。
　上記実施形態では、励起光Ｌａの光強度の時間波形が、各周期の全ての期間において、正弦波の一次関数の平方根となっている。このような形態に限られず、励起光Ｌａの光強度の時間波形が、各周期の一部の期間、典型的には最大値Ｉｍａｘを含む期間のみにおいて、正弦波の一次関数の平方根となっていてもよい。
　第２実施形態では、偏光変換部６１、位相変換部６２、及びリングマスク６３が、励起光出力部１０と光スキャナ２２との間の光路上に配置される場合を例示した。偏光変換部６１、位相変換部６２、及びリングマスク６３のうち少なくとも一つの要素は、光スキャナ２２と対物レンズ２５との間の光路上に配置されてもよい。偏光変換部６１、位相変換部６２、及びリングマスク６３のうち少なくとも一つの要素は、対物レンズ２５と観察対象物Ｂとの間の光路上に配置されてもよい。
　第２実施形態では、リングマスク６３が振幅変調型である場合を例示した。リングマスク６３が位相変調型か、または振幅変調型と位相変調型との複合型であっても、第２実施形態のようにアジマス偏光及びらせん位相を組み合わせた光を用いることにより、集光径を小径化することができる。
　好適な実施の形態において本発明の原理を図示し説明してきたが、本発明は、そのような原理から逸脱することなく配置および詳細において変更され得ることは、当業者によって認識される。本発明は、本実施の形態に開示された特定の構成に限定されるものではない。したがって、特許請求の範囲およびその精神の範囲から来る全ての修正および変更に権利を請求する。
　１，２，２Ａ…顕微鏡装置、９…ミラー、１０…励起光出力部、１１…光源、１２…光変調器、２０，２０Ａ…光学系、２１…ビームエキスパンダ、２２…光スキャナ、２３…リレーレンズ系、２４…ダイクロイックミラー、２５…対物レンズ、２８…空間光変調器、２９…アパーチャ光学系、３０…高調波検出部、４０…画像生成部、５０…信号発生器、２１１，２１２…レンズ、２２１，２２２…スキャナ、２２３…光学系、３１…光検出デバイス、３２…ロックインアンプ、６１…偏光変換部、６２…位相変換部、６３…リングマスク、Ｓ１…励起光出力ステップ、Ｓ１２…強度変調ステップ、Ｓ２，Ｓ２ａ…励起光照射ステップ、Ｓ３…高調波検出ステップ、Ｓ６…画像生成ステップ、Ｓ４，Ｓ５，Ｓ１１，Ｓ３１，Ｓ３２…ステップ、Ｓ２１…偏光変換処理、Ｓ２２…位相変換処理、Ｓ２３…リングマスク処理、Ｓ２４…集光処理、Ｂ…観察対象物、Ｊ…パルス、Ｋ…包絡線、Ｇ１１～Ｇ１３，Ｇ２１～Ｇ２３…棒線、Ｈａ，Ｈｂ…集光スポット形状、Ｌａ…励起光、Ｌｂ…蛍光、Ｌｐ…パルス光、Ｐ１１，Ｐ１２，Ｐ２１～Ｐ２３…プロット、Ｑ…光軸、Ｗａ１…径、Ｗａ２…幅、Ｗｂ１，Ｗｂ２…長さ。

Claims (17)

  1. 　光強度の時間波形が正弦波の一次関数のｎ乗根（ｎは２以上の整数）を含み、光強度の最大値が観察対象物における飽和励起強度を超える励起光を出力する励起光出力部と、
    　前記励起光出力部から出力された前記励起光を観察対象物に照射する光学系と、
    　前記励起光の照射によるｎ光子励起によって前記観察対象物において生じた蛍光の光強度の時間波形に含まれる第２高調波を検出する高調波検出部と、
    　を備える、顕微鏡装置。
  2. 　前記励起光出力部は、
    　パルス光を出力する光源と、
    　前記光源から出力された前記パルス光を変調して前記励起光を生成する強度変調型の光変調器と、
    　を有する、請求項１に記載の顕微鏡装置。
  3. 　前記光変調器はＡＯ変調器である、請求項２に記載の顕微鏡装置。
  4. 　前記光源はレーザ光源である、請求項２または３に記載の顕微鏡装置。
  5. 　前記励起光の光強度の時間波形における各周期内の最小値が０より大きい、請求項１～４のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
  6. 　前記励起光の光強度の時間波形における各周期内の最小値は、前記高調波検出部が受け取ることができる最大信号の０．１％より大きく２０％より小さい、請求項５に記載の顕微鏡装置。
  7. 　前記高調波検出部は、
    　前記観察対象物において生じた前記蛍光の光強度に応じた信号を生成する光検出デバイスと、
    　前記光検出デバイスから前記信号を入力し、前記信号の時間波形に含まれる第２高調波を出力するロックインアンプと、
    　を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
  8. 　前記高調波検出部は、前記観察対象物において生じた前記蛍光の光強度の時間波形に含まれる第３高調波を更に検出する、請求項１～７のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
  9. 　前記励起光出力部から出力される前記励起光の前記光強度の時間波形が正弦波の一次関数の平方根を含み、
    　前記高調波検出部は、前記励起光の照射による二光子励起によって前記観察対象物において生じた前記蛍光の光強度の時間波形に含まれる前記第２高調波を検出する、請求項１～８のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
  10. 　光強度の時間波形が正弦波の一次関数のｎ乗根（ｎは２以上の整数）を含み、光強度の最大値が観察対象物における飽和励起強度を超える励起光を出力する励起光出力ステップと、
    　前記励起光出力ステップにおいて出力された前記励起光を観察対象物に照射する励起光照射ステップと、
    　前記励起光の照射によるｎ光子励起によって前記観察対象物において生じた蛍光の光強度の時間波形に含まれる第２高調波を検出する高調波検出ステップと、
    　前記第２高調波に基づいて前記観察対象物の観察画像を生成する画像生成ステップと、
    　を含む、画像取得方法。
  11. 　前記励起光出力ステップは、
    　パルス光を変調して前記励起光を生成する強度変調ステップを含む、請求項１０に記載の画像取得方法。
  12. 　前記パルス光はレーザ光である、請求項１１に記載の画像取得方法。
  13. 　前記励起光の光強度の時間波形における各周期内の最小値が０より大きい、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の画像取得方法。
  14. 　前記励起光の光強度の時間波形における各周期内の最小値は、前記高調波検出ステップにおいて受け取ることができる最大信号の０．１％より大きく２０％より小さい、請求項１３に記載の画像取得方法。
  15. 　前記高調波検出ステップは、
    　前記観察対象物において生じた前記蛍光の光強度に応じた信号を生成するステップと、
    　前記信号の時間波形に含まれる第２高調波を出力するステップと、
    　を含む、請求項１０～１４のいずれか１項に記載の画像取得方法。
  16. 　前記高調波検出ステップでは、前記観察対象物において生じた前記蛍光の光強度の時間波形に含まれる第３高調波を更に検出し、
    　前記画像生成ステップでは、前記第２高調波及び前記第３高調波の一方または両方に基づいて前記観察対象物の観察画像を生成する、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の画像取得方法。
  17. 　前記励起光出力ステップにおいて出力される前記励起光の光強度の時間波形が正弦波の一次関数の平方根を含み、
    　前記高調波検出ステップにおいて、前記励起光の照射による二光子励起によって前記観察対象物において生じた前記蛍光の光強度の時間波形に含まれる前記第２高調波を検出する、請求項１０～１６のいずれか１項に記載の画像取得方法。
PCT/JP2022/037668 2021-10-28 2022-10-07 顕微鏡装置及び画像取得方法 WO2023074326A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202280071824.0A CN118176452A (zh) 2021-10-28 2022-10-07 显微镜装置及图像获取方法
DE112022005149.3T DE112022005149T5 (de) 2021-10-28 2022-10-07 Mikroskop und Bildverarbeitungsverfahren
JP2023556272A JPWO2023074326A1 (ja) 2021-10-28 2022-10-07

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021176274 2021-10-28
JP2021-176274 2021-10-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023074326A1 true WO2023074326A1 (ja) 2023-05-04

Family

ID=86159302

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/037668 WO2023074326A1 (ja) 2021-10-28 2022-10-07 顕微鏡装置及び画像取得方法

Country Status (4)

Country Link
JP (1) JPWO2023074326A1 (ja)
CN (1) CN118176452A (ja)
DE (1) DE112022005149T5 (ja)
WO (1) WO2023074326A1 (ja)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210191095A1 (en) * 2016-03-10 2021-06-24 University Of Notre Dame Super-sensitivity multiphoton frequency-domain fluorescence lifetime imaging microscopy

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006061947A1 (ja) 2004-12-08 2006-06-15 Osaka University 蛍光顕微鏡及び観察方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210191095A1 (en) * 2016-03-10 2021-06-24 University Of Notre Dame Super-sensitivity multiphoton frequency-domain fluorescence lifetime imaging microscopy

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAKRABORTY SANDEEP, LEE SZU-YU, LEE JYE-CHANG, YEN CHEN-TUNG, SUN CHI-KUANG: "Saturated two-photon excitation fluorescence microscopy for the visualization of cerebral neural networks at millimeters deep depth", JOURNAL OF BIOPHOTONICS, WILEY - VCH VERLAG, DE, vol. 12, no. 1, 1 January 2019 (2019-01-01), DE , pages e201800136, XP093061181, ISSN: 1864-063X, DOI: 10.1002/jbio.201800136 *
NGUYEN ANH DUNG, DUPORT FRANÇOIS, BOUWENS ARNO, VANHOLSBEECK FRÉDÉRIQUE, EGRISE DOMINIQUE, VAN SIMAEYS GAETAN, EMPLIT PHILIPPE, GO: "3D super-resolved in vitro multiphoton microscopy by saturation of excitation", OPTICS EXPRESS, vol. 23, no. 17, 24 August 2015 (2015-08-24), pages 22667, XP093061182, DOI: 10.1364/OE.23.022667 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN118176452A (zh) 2024-06-11
JPWO2023074326A1 (ja) 2023-05-04
DE112022005149T5 (de) 2024-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20150362713A1 (en) Rapid adaptive optical microscopy over large multicellular volumes
CN108303806B (zh) 一种深度成像超分辨显微成像系统
US9201008B2 (en) Method and system for obtaining an extended-depth-of-field volumetric image using laser scanning imaging
CN102735617B (zh) 一种超分辨显微方法和装置
US9001321B2 (en) Microscope and observation method
CN105973853B (zh) 一种基于双模式竞争激发的超分辨显微方法和装置
CN102798622B (zh) 一种基于强度差分的三维超分辨显微方法和装置
CN106770095A (zh) 一种基于非线性光斑调制的超分辨显微成像方法和装置
JP5463913B2 (ja) 広帯域光増幅器、光パルス発生装置及び光学機器
CN110146473B (zh) 一种轴向超分辨的双光子荧光显微装置及方法
JP2007233370A (ja) 試料を高い空間分解能で検査するための方法および顕微鏡
Meng et al. Fast two-snapshot structured illumination for temporal focusing microscopy with enhanced axial resolution
JP2015072462A (ja) 超解像観察装置及び超解像観察方法
WO2016039148A1 (ja) 光照射装置および光照射方法
US9729800B2 (en) Image generation system
WO2023074029A1 (ja) 光照射装置、顕微鏡装置、光照射方法、及び画像取得方法
WO2017169597A1 (ja) 画像取得装置および画像取得方法
CN102866137B (zh) 一种二维超分辨显微方法和装置
WO2023074326A1 (ja) 顕微鏡装置及び画像取得方法
JP2016038218A (ja) 光学測定装置及び光学測定方法
RU2579640C1 (ru) Конфокальный спектроанализатор изображений
CN116559126A (zh) 一种互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统
JP6673497B2 (ja) 蛍光観察装置
JP7504990B2 (ja) 多重リングマスク、光照射装置、光学顕微鏡および光音響顕微鏡
JP6940564B2 (ja) 光照射装置および光照射方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22886656

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2023556272

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202280071824.0

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 112022005149

Country of ref document: DE