WO2023074096A1 - セラミド組成物 - Google Patents

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WO2023074096A1
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cells
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征克 宮鍋
忍 開
純 荒河
喜範 片倉
義弘 徳満
弘幸 松山
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株式会社ジェヌインR&D
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Definitions

  • ceramide is the main component of intercellular lipids in the human epidermis, the market has been expanding as a functional cosmetic ingredient. It is known that keratin ceramide gradually decreases with aging, and therefore supplementation with topical ceramide is thought to be important for maintaining healthy skin. In addition, free ceramide, which exists as intercellular lipids in the stratum corneum, is free ceramide, and thus free ceramide is also attracting attention.
  • Patent Documents 1 and 2 So far, research has also been conducted to efficiently prepare useful ceramides (for example, Patent Documents 1 and 2).
  • the inventors proceeded with the study with the aim of discovering new functions of ceramide.
  • the present inventors have discovered the possibility that a specific bio-derived ceramide composition can perform a specific function particularly efficiently. Furthermore, among bio-derived ceramide compositions, a ceramide-containing extract obtained by extracting from chicken legs with ethanol (chicken leg ethanol-extracted ceramide composition) can exhibit a particularly preferable effect of enhancing the epithelial barrier function. Found. Based on the above findings, further improvements were made.
  • the disclosure includes, for example, subject matter described in the following sections. Section 1. A chicken leg ethanol-extracted ceramide composition. Item 2. Item 2. The composition according to Item 1, containing ⁇ -O-acylceramide. Item 3. Item 4.
  • composition according to Item 2 wherein the ⁇ -O-acylceramide contained is of the EOS type and the terminal acyl group is a linoleic acid group.
  • Item 4. The composition according to Item 2 or 3, wherein 0.1 to 2% by mass of the ceramide contained is ⁇ -O-acylceramide.
  • Item 5. The composition according to any one of Items 1 to 4, which is for enhancing the epithelial barrier.
  • Item 6. The composition according to any one of Items 1 to 5, which is for skin barrier enhancement or intestinal barrier enhancement.
  • Item 7. Item 7.
  • Item 8. Item 7.
  • Item 10 Item 9. The composition according to any one of Items 1 to 8, wherein 90% by mass or more of the ceramide contained is ceramide NS.
  • a novel bio-derived ceramide composition is provided.
  • a ceramide-containing extract obtained by extracting chicken leg with ethanol (chicken leg ethanol-extracted ceramide composition) is provided.
  • the ceramide composition can be preferably used particularly for strengthening the epithelial barrier.
  • HaCaT cells irradiated with 10 mJ/cm 2 of UVB were added with ceramide and cultured for 24 hours.
  • the results of adding ceramide to HaCaT cells and culturing for 48 hours followed by analyzing the fatty acid composition of ceramide in HaCaT cells using LC-MS are shown.
  • the supernatant of Caco-2 cells treated with ceramide for 24 hours was added to HaCaT cells irradiated with 10 mJ/cm 2 of UVB. Measured results are shown.
  • HaCaT cells irradiated with 10 mJ/cm 2 of UVB were added with the supernatant of Caco-2 cells treated with ceramide for 24 hours, and after 48 hours, ROS was measured using IN Cell Analyzer 2200.
  • the present disclosure preferably includes, but is not limited to, specific bio-derived ceramide compositions and uses thereof, and includes everything disclosed herein and recognized by a person skilled in the art.
  • the ceramide composition encompassed by the present disclosure is a bio-derived ceramide composition, more specifically, a ceramide composition extracted from soy sauce cake, a ceramide composition extracted from Aspergillus oryzae, or a ceramide composition extracted from chicken leg.
  • the ceramide composition means a composition containing ceramide.
  • bio-derived ceramides are sometimes referred to as the ceramide composition of the present disclosure.
  • chicken leg-extracted ceramide compositions are preferred, and among the chicken leg-extracted ceramide compositions, a ceramide-containing extract obtained by extracting chicken leg with ethanol (chicken leg ethanol-extracted ceramide composition). is particularly preferred.
  • the toe portion is particularly preferable.
  • Chicken legs to be subjected to ethanol extraction are preferably pre-dried, and particularly preferably dried and powdered.
  • the ceramide composition of the present disclosure preferably exhibits the effect of enhancing the epithelial barrier function. Therefore, it can be preferably used for strengthening the epithelial barrier.
  • the epithelial barrier a skin barrier (epidermal barrier) and an intestinal barrier (intestinal epithelium) barrier are particularly preferred.
  • the ceramide composition of the present disclosure when used to strengthen the skin barrier, it can be preferably used particularly to prevent the effects of ultraviolet rays on the skin (care for damage). While not wishing to be bound by theory, it is believed that application of the ceramide composition of the present disclosure to the skin increases mitochondria (especially number, area, or membrane potential activity) can be recovered. It can be used as a prophylaxis for UV-damaged skin or as a treatment for UV-damaged skin.
  • the ceramide composition of the present disclosure when used for the skin (for skin barrier enhancement), it can be used, for example, as an external composition or an oral composition (for example, an oral pharmaceutical composition or a food composition). It is preferably used as an external composition.
  • the chicken leg ethanol-extracted ceramide composition can be preferably used as an intestinal barrier, and can be particularly preferably used for strengthening intestinal epithelial cell tight junctions.
  • intestinal barrier can be particularly preferably used for strengthening intestinal epithelial cell tight junctions.
  • claudins particularly claudin 3
  • the defense function against pathogens in the intestinal tract can also be enhanced. When used for such strengthening of defense against infection, it can be used for prevention of infection or treatment after infection.
  • Claudin is a major protein involved in the formation of tight junctions and plays a central role in intercellular barriers at tight junctions.
  • the density and connectivity of tight junctions can be measured using the Trans Epithelial Electric Resistance (TER) as an index, and the ceramide composition of the present disclosure preferably has the TER value. can improve.
  • TER Trans Epithelial Electric Resistance
  • the ceramide composition of the present disclosure when used in the intestinal tract (used as an intestinal barrier), it can be used, for example, as an oral composition (for example, an oral pharmaceutical composition or a food composition) and a composition for intestinal administration. .
  • an oral composition for example, an oral pharmaceutical composition or a food composition
  • a composition for intestinal administration when used as a composition for intestinal administration, it can be administered directly into the intestine by surgical treatment, or can be administered through the anus.
  • Ceramide is a compound having a structure (--NH--CO--) in which an amino group (--NH 2 ) of a sphingoid base is bonded to a carboxyl group (--COOH) of a fatty acid.
  • the alcoholic hydroxyl group (--OH) of the sphingoid base of ceramide is further combined with a polar group such as sugar and phosphoric acid to form glycosphingolipids and phosphosphingolipids, respectively.
  • a polar group such as sugar and phosphoric acid
  • those bound with sugar are particularly called glycosylceramide, and particularly when the sugar is glucose, they are called glucosylceramide.
  • a ceramide in which sugar and phosphoric acid are not bound is particularly called free ceramide.
  • acylceramide when the fatty acid portion of ceramide is an ⁇ -hydroxy fatty acid, and the hydroxy terminal thereof is further ester-bonded with a fatty acid, it is particularly called acylceramide ( ⁇ -O-acylceramide).
  • acylceramide means ⁇ -O-acylceramide.
  • the ceramide composition of the present disclosure preferably contains acylceramide.
  • examples of the fatty acid ester-bonded to the ⁇ -hydroxy terminal include stearic acid, oleic acid, linoleic acid, and linolenic acid. Although not particularly limited, it preferably contains acylceramide in which the fatty acid is linoleic acid.
  • the sphingoid base constituting the free ceramide preferably has 2 or 3 hydroxyl groups, more preferably 3 hydroxyl groups.
  • the sphingoid base preferably has 14 to 22 carbon atoms (14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, or 22), more preferably 16 to 20 carbon atoms. , and those having 18 or 20 carbon atoms are more preferable. Moreover, those having 0 or 1 carbon-carbon double bond are preferable. More specific preferred sphingoid bases include, for example, sphingosine, dihydrosphingosine, phytosphingosine and the like.
  • Fatty acids constituting free ceramide preferably have 16 to 30 carbon atoms (16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or 30). , C18-28 fatty acids are more preferred, C20-26 fatty acids are more preferred, and C22-26 fatty acids are even more preferred. Moreover, fatty acids having 0 or 1 carbon-carbon double bonds are preferred, and fatty acids having 0 carbon-carbon double bonds (that is, saturated fatty acids) are more preferred. Fatty acids having 0, 1, or 2 hydroxyl groups are also preferred. Although not particularly limited, if it has a hydroxyl group, it is preferably an ⁇ -hydroxyl group.
  • the (sphingoid base)-(fatty acid) combination of the ceramide skeleton may be any combination of the above sphingoid bases and fatty acids.
  • a particularly preferred combination is, for example, a combination of (sphingoid base having 2 or 3 (especially 3) hydroxyl groups)-(fatty acid having a hydroxyl group (especially having an ⁇ -hydroxyl group)).
  • the number of hydroxyl groups of the fatty acid is preferably 0, 1, or 2.
  • ceramide AS which is a combination of sphingosine (S) and a fatty acid with 1 hydroxyl group (A)
  • ceramide NS which is a combination of sphingosine (S) and a fatty acid with 0 hydroxyl groups (N)
  • S sphingosine
  • N fatty acid with 0 hydroxyl groups
  • ceramide AP which is a combination of phytosphingosine (P) and a fatty acid with 1 hydroxyl group (A)
  • ceramide NP which is a combination of phytosphingosine (P) and a fatty acid with 0 hydroxyl groups (N)
  • ceramide DP which is a combination of phytosphingosine (P) and a fatty acid having 2 hydroxyl groups (D)
  • Ceramide AP and ceramide NP are commonly used terms, but ceramide DP is a term used in this specification and not a commonly used term. Specific examples of ceramide DP include dihydroxylignocellophytosphingosine and the like.
  • a free ceramide (i) a ceramide skeleton (having 2 or 3 hydroxyl groups, 18 carbon atoms, and a sphingoid base having 0 or 1 carbon-carbon double bond)-(carbon number 16 to 34, 0 or 1 carbon-carbon double bond, 0, 1, or 2 hydroxyl groups), and (ii) a free ceramide that has a ceramide skeleton (2 hydroxyl groups or 3 sphingoid bases with 20 carbon atoms and no carbon-carbon double bonds)-(24 or 25 carbon atoms, 0 carbon-carbon double bonds, 0, 1, or 2 hydroxyl groups
  • a free ceramide that is a combination of fatty acids having a fatty acid) is preferable, and the free ceramide of (i) is more preferable.
  • the ceramide skeleton is (a sphingoid base having two hydroxyl groups, 18 carbon atoms and one carbon-carbon double bond)-(16 to 34 carbon atoms, carbon-carbon double bond Free ceramide, which is a combination of (fatty acid having 0 or 1 bond and 0 hydroxyl group), and (i-2) ceramide skeleton (having 3 hydroxyl groups, 18 carbon atoms, carbon-carbon double bond sphingoid base having 0)-(fatty acid having 20 to 26 carbon atoms, 0 carbon-carbon double bonds, and 0 hydroxyl group) combination is more preferable.
  • the ceramide skeleton (having two hydroxyl groups, 18 carbon atoms and a sphingoid base having one carbon-carbon double bond)-(16 carbon atoms ⁇ 34, fatty acid having 0 carbon-carbon double bonds and 0 hydroxyl groups) is particularly preferred.
  • chicken leg ethanol-extracted ceramide compositions contain acylceramide and are preferred. More specifically, the chicken leg ethanol-extracted ceramide composition contains d18:1-c28-36:0-18:2 (for example, d18:1-c28:0-18:2, d18:1-c30:0 -18:2, d18:1-c32:0-18:2, d18:1-c34:0-18:2, or d18:1-c36:0-18:2) containing acylceramide Among these, those containing 4 or 5 are particularly preferred.
  • Ceramides constituting human stratum corneum intercellular lipids are classified into 7 types of free ceramides according to the type of long-chain fatty acid that forms an amide bond with a long-chain sphingoid base by Downing et al., and their compositions have also been reported (Robson. K.J. et al, J. lipid Res.35, 2060 (1994)).
  • the acylceramide contained in the chicken leg ethanol-extracted ceramide composition is classified as ceramide EOS among the above seven types.
  • ceramide EOP was the only acylceramide prepared by chemical synthesis. Therefore, the chicken leg ethanol-extracted ceramide composition is preferable from the viewpoint of containing ceramide EOS.
  • Ceramide EOS is acylceramide whose sphingoid base portion is sphingosine
  • ceramide EOP is acylceramide whose sphingoid base portion is phytosphingosine.
  • the chicken leg ethanol-extracted ceramide composition may be one in which acylceramide is concentrated using a known method such as HPLC.
  • the chicken leg ethanol-extracted ceramide composition also includes the acylamide concentrate of the chicken leg ethanol extract.
  • the chicken leg ethanol-extracted ceramide composition preferably contains about 0.1 to 2% by mass of acylceramide among the ceramides contained.
  • the upper or lower limit of the range (0.1 to 2% by mass) is, for example, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, or 1.9 wt%.
  • the range is more preferably 0.2 to 1.5% by mass, more preferably 0.3 to 1.2% by mass.
  • the acylceramide content is a preferred example, and may vary, for example, when the acylceramide is concentrated as described above.
  • the chicken leg ethanol-extracted ceramide composition contains acylceramide (preferably d18:1-c28-36:0-18:2 acylceramide), and is said to have extremely important functionality. Conceivable.
  • the acylceramide contained in the chicken leg ethanol-extracted ceramide composition is a so-called EOS type in which the sphingoid base is sphingosine and the fatty acid is an esterified ⁇ fatty acid.
  • the chain length of the ⁇ -hydroxy fatty acid moiety preferably includes 28 to 36 carbon atoms, and the center of the distribution is preferably 30 to 34 carbon atoms.
  • acylceramide which has an ultra-long chain fatty acid group, plays a central role in the skin barrier function even in small amounts.
  • a decrease in EOS-type acylceramide which is known to exist in human stratum corneum intercellular lipids, not only leads to a decrease in barrier function and moisturizing function, but also causes skin barrier dysfunction in atopic dermatitis and the like. It is known to be an aggravating factor for dry skin.
  • the chicken leg ethanol-extracted ceramide composition 90% by mass or more of the ceramides contained is preferably ceramide NS, and 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, or 98% by mass or more. is more preferably ceramide NS.
  • 90% by mass or more of the ceramide contained is preferably the ceramide (i-1) above. , or 98% by mass or more is more preferably the ceramide (i-1).
  • the chicken leg ethanol-extracted ceramide composition 90% by mass or more of the ceramide contained is preferably the ceramide (i-1a) above, and 91, 92, 93, or 94% by mass or more is The ceramide (i-1a) above is more preferred.
  • an example of a preferable chicken leg ethanol-extracted ceramide composition includes d18:1-20:0 in the highest amount, followed by d18:1-22:0 in the next highest amount, and d18 :1-26:0, and the next most preferred composition.
  • d18:1-20:0 is about 25 to 35% by mass (more preferably 27 to 33% by mass)
  • d18:1-22:0 is about 15 to
  • a composition containing about 30% by mass (more preferably 17 to 28% by mass) and about 5 to 20% by mass (more preferably 7 to 18% by mass or 8 to 15% by mass) of d18:1-26:0 is preferred.
  • d18:1-16:0 is preferably contained in an amount of 2 to 8% by mass, more preferably 3 to 7% by mass.
  • d18:1-24:0 is preferably contained in an amount of 4 to 11% by mass, more preferably 5 to 10% by mass or 6 to 9% by mass.
  • d18:1-28:0 is preferably contained in an amount of 2 to 8% by mass, more preferably 3 to 7% by mass.
  • d18:1-18:0 is preferably contained in an amount of 2 to 6% by mass, more preferably 3 to 5% by mass.
  • d18:1-26:1 is preferably contained in an amount of 0.2 to 3% by mass, more preferably 0.5 to 2% by mass.
  • d18:1-30:0 is preferably contained in an amount of 1 to 4% by mass, more preferably 2 to 3.5% by mass.
  • the ceramide composition of the present disclosure can also be nanoized (that is, used as a nanoized ceramide composition).
  • a nano-sized ceramide composition can be obtained, for example, by subjecting a ceramide composition to high pressure treatment.
  • the high-pressure treatment can be carried out using an ultrahigh-pressure wet-type atomization device (for example, Sugino Machine Co., Ltd.: Starburst).
  • the high pressure is, for example, about 100 MPa or higher, preferably about 100 to 300 MPa, more preferably about 120 to 250 MPa.
  • the ceramide composition of the present disclosure can be preferably used as an emulsified composition.
  • a form in which an oil phase is dispersed in an aqueous phase for example, an oil-in-water (O/W) emulsion
  • O/W oil-in-water
  • fats and oils in addition to bio-extracted ceramide (especially chicken leg ethanol-extracted ceramide), fats and oils, nonionic surfactants, phospholipids, proteins, polysaccharides, pH adjusters, thickeners, fragrances, natural pigments, preservatives etc. can be included.
  • the average particle size of oil droplets (that is, dispersed particles) containing ceramide is preferably 500 nm or less.
  • the average particle size of the dispersed particles is preferably 300 nm or less, more preferably 200 nm or less, and even more preferably 150 nm or less.
  • the lower limit of the average particle diameter of the dispersed particles is not particularly limited, but can be, for example, 1 nm or more, preferably 10, 20, or 50 nm or more.
  • the average particle size of dispersed particles means the volume average particle size measured using a dynamic light scattering method.
  • the volume average particle diameter of the dispersed particles can be measured, for example, using a dynamic light scattering method, Nanotrac WAVE II (Verder Scientific). can be measured.
  • a sample separated from the ceramide dispersion composition of the present invention is diluted with pure water so that the concentration of ceramide contained in the sample is 0.1% by mass, and is measured using a quartz cell.
  • 1.600 as the refractive index of the sample
  • 1.333 pure water
  • the viscosity of pure water as the viscosity of the dispersion medium
  • the average particle size of the dispersed particles containing ceramide is determined by the conditions in the production method described below, such as high-pressure emulsification and dispersion conditions (number of passes, pressure, temperature), stirring conditions (shear force, temperature). It can also be adjusted by appropriately adjusting factors such as the ratio of the oil phase and the water phase.
  • an oil phase component and an aqueous phase component may be mixed and pre-dispersed to obtain a coarse dispersion in advance.
  • a means is not particularly limited, and a general stirring device can be used.
  • stirring devices include magnetic stirrers, household mixers, paddle mixers, impeller mixers, homomixers, disper mixers, ultra mixers and the like.
  • the time for the preliminary dispersion treatment is not particularly limited, and can be appropriately set according to the type of stirring device, the composition of the liquid before dispersion treatment, and the like.
  • a coarse dispersion obtained by preliminary dispersion treatment (which may be further mixed with water or the like, if necessary) is subjected to dispersion treatment using an ultrasonic dispersion method (hereinafter referred to as ultrasonic dispersion treatment) or dispersion treatment using a high-pressure emulsification method (hereinafter referred to as high-pressure emulsification treatment).
  • ultrasonic dispersion treatment an ultrasonic dispersion method
  • high-pressure emulsification treatment high-pressure emulsification treatment
  • a coarse dispersion containing the bio-extracted ceramide of the present invention (which may be further mixed with water or the like, if necessary) is subjected to dispersion treatment to obtain dispersed particles containing the bio-extracted ceramide.
  • a fine particle ceramide dispersion composition can be obtained.
  • the dispersion treatment in the main dispersion step is preferably carried out by high-pressure emulsification treatment.
  • High-pressure emulsification treatment means dispersion treatment in which a shearing force of 10 MPa or more is applied to the material to be dispersed. From the viewpoint of miniaturization of dispersed particles, the shearing force applied to the material to be dispersed is preferably 50 or 100 MPa or more, more preferably 150 MPa or more. The upper limit is preferably, for example, 300 MPa or less from the viewpoint of temperature rise and pressure resistance.
  • the means for high-pressure emulsification is not particularly limited, and a general high-pressure emulsification device can be used.
  • High-pressure emulsifying devices include Starburst HJP-25005 (manufactured by Sugino Machine Co., Ltd.), Microfluidizer (manufactured by Microfluidic Co., Ltd.), Nanomizer (manufactured by Yoshida Kikai Kogyo Co., Ltd., Gorlin type homogenizer (manufactured by APV), and Ranier type.
  • Homogenizer manufactured by Lanier
  • high-pressure homogenizer manufactured by Niro Soavi
  • homogenizer manufactured by Sanwa Machinery Co., Ltd.
  • high-pressure homogenizer manufactured by Izumi Food Machinery Co., Ltd.
  • ultra-high pressure homogenizer manufactured by Ika Co., Ltd.
  • a high pressure homogenizer may be mentioned.
  • the temperature during the high-pressure emulsification treatment is preferably set to 30°C to 80°C, more preferably set to 40°C to 70°C.
  • the high-pressure emulsification treatment may be performed once, but in order to improve the uniformity of the entire liquid, it is preferable to perform the high-pressure emulsification treatment two or more times, more preferably two to five times. From the viewpoint of maintaining the particle size of the dispersed particles, it is preferable to cool the emulsified liquid, which is the emulsified and dispersed composition, through a certain cooler within 30 seconds, preferably within 3 seconds, immediately after passing through the chamber.
  • steps may be included as necessary.
  • Other steps include a heat sterilization step and the like.
  • the emulsion may be dried to form a powdered composition.
  • Powderization has many advantages, such as improved portability and reduced transportation costs, in addition to improved long-term storage stability due to the removal of moisture.
  • Such powder compositions are also preferably included in the ceramide composition of the present disclosure.
  • drying means known drying means can be used, and examples include natural drying, heat drying, hot air drying, high frequency drying, ultrasonic drying, reduced pressure drying, vacuum drying, freeze drying, spray drying, and the like. These means may be used alone, or two or more means may be used in combination.
  • an entrapping agent may coexist.
  • entrapping agents water-soluble polysaccharides and oligosaccharides are preferred.
  • the saccharides used as the saccharide entrapping agent in the present invention are preferably saccharides composed of saccharide units as basic units, and the average degree of polymerization of the saccharide units (the number of saccharide units) is from the viewpoint of refining the particle size after rehydration. Therefore, it is generally preferably 60 or less, more preferably 2 to 50. Inulin, raffinose, stachyose, velpascose, and trehalose are preferable as such a sugar entrapping agent from the viewpoint of the effect of stabilizing coalescence of hydrophobic particles.
  • the spray drying method is particularly preferable as the drying means from the viewpoint of achieving both production efficiency and quality.
  • Spray drying is a type of convection hot air drying. A liquid emulsion is sprayed into hot air as fine particles of several hundred micrometers or less, and the fine particles fall through the tower while being dried, thereby being recovered as solid powder. The material is temporarily exposed to hot air, but because the exposure time is very short and the temperature does not rise much due to the latent heat of evaporation of water, thermal denaturation of the material is less likely to occur in the same way as freeze-drying, and recovery is possible. Changes due to water are also small. Cold air can be supplied instead of hot air for very heat sensitive materials. In that case, the drying capacity is lowered, but it is preferable in that milder drying can be achieved.
  • spray dryer SD-1000 Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.
  • spray dryer L-8i Okawara Kakoki Co., Ltd.
  • closed spray dryer CL-12 Okawara Kako Machine Co., Ltd.
  • Spray Dryer ADL310 Yamato Scientific Co., Ltd.
  • Mini Spray Dryer B-290 Buchi Co., Ltd.
  • PJ-MiniMax Powdering Japan Co., Ltd.
  • PHARMASD Niro Co., Ltd.
  • fluidized bed granulator dryer MP-01 Panrex Co., Ltd.
  • fluidized bed built-in spray dryer FSD Nelo Corporation
  • the ceramide composition of the present disclosure can be used as a composition for external use, an oral composition, a composition for intestinal administration, etc., as described above. Moreover, it can be preferably used in the pharmaceutical field and the food field.
  • the composition may consist of ceramide alone, or may be a composition containing ceramide and other components (various bases, carriers, additives, etc.), as described in detail below.
  • the ceramide-containing biological tissue extract itself is also included in the composition. In other words, a ceramide-containing biological tissue extract (and one further blended with other ingredients as necessary) can also be used as the ceramide composition of the present disclosure.
  • the composition is a biological extract It may consist of ceramide alone, or may be a pharmaceutical composition containing other ingredients.
  • the active ingredient, ceramide may optionally be added with pharmaceutically acceptable bases, carriers, additives (e.g., excipients, binders, disintegrants, lubricants, agents, solvents, sweeteners, coloring agents, corrigents, corrigents, surfactants (especially emulsifiers), moisturizing agents, preservatives, pH adjusters, thickening agents, etc.).
  • additives e.g., excipients, binders, disintegrants, lubricants, agents, solvents, sweeteners, coloring agents, corrigents, corrigents, surfactants (especially emulsifiers), moisturizing agents, preservatives, pH adjusters, thickening agents, etc.
  • Such base materials, carriers, additives and the like are specifically described, for example, in Dictionary of Pharmaceutical Excipients 2016 (Yakuji Nippo Co., Ltd.), and for example, those described therein can be used.
  • the formulation form is also not particularly limited, and the active ingredient and other ingredients are mixed by a conventional method. , suspensions, emulsions, jellies, chewables, soft tablets and the like.
  • tablets may be manufactured by a tableting method. Either a direct compression method in which the mixed raw materials are tableted as they are, or a granule compression method in which the mixed raw materials are granulated and then tableted can be used.
  • capsules may be soft capsules or hard capsules.
  • it can also be used as a cream agent, milky lotion, gel agent, etc. as a composition for external use.
  • a composition for intestinal administration it can be used, for example, as a foam agent.
  • the amount of ceramide compounded in the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited as long as the anti-fatigue effect is exhibited, and can be appropriately set according to the subject. It is preferably 0.0005 to 100% by mass, more preferably 0.005 to 90% by mass, still more preferably 0.05 to 80% by mass. The lower limit may be approximately 10% by mass, 20% by mass, 30% by mass, 40% by mass, 50% by mass, 60% by mass, 70% by mass, or 80% by mass.
  • Subjects to whom the pharmaceutical composition according to the present disclosure is administered include not only humans but also non-human mammals. Mammals exhibiting fatigue can be exemplified, and mammals raised as pets and livestock are particularly preferred. Specific examples include dogs, cats, monkeys, cows, horses, sheep, goats, pigs, rabbits, mice, rats, camels, and llamas. In mammals, as in humans, the pharmaceutical composition of the present invention can also be used prophylactically.
  • the timing of administration of the pharmaceutical composition according to the present disclosure is not particularly limited, and it is possible to appropriately select the timing of administration in consideration of, for example, the formulation form, the age of the subject of administration, the degree of symptoms of the subject of administration, and the like.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present disclosure can be appropriately selected according to the age of the subject of administration, the degree of symptoms of the subject of administration, other conditions, and the like.
  • the amount of ceramide contained as a reference can be appropriately set within a range that does not impair the effects of the present invention. It can be administered once a day or in multiple doses (preferably 2 to 3 times). In the case of mammals as well, the dosage can be appropriately set with reference to the case of the person concerned.
  • the composition (hereinafter sometimes referred to as "food composition according to the present disclosure") contains ceramide and food Hygiene-acceptable bases, carriers, additives, and other ingredients and materials that can be used as foods and drinks are appropriately blended.
  • processed foods containing ceramide for improving or preventing fatigue, beverages, health foods (foods with nutrient function claims, foods for specified health use, etc.), supplements, food for sick people (hospital food, sick food, nursing care food, etc.), etc. can be exemplified.
  • ceramide blended in the food composition is a biological tissue-extracted ceramide extracted from biological (especially animal or plant) tissue, for example, processed foods, health foods ( food with nutrient function claims, food for specified health use, etc.), supplements, food for the sick, and the like.
  • ceramide is powdered, for example, and contained in various foods and drinks such as beverages (juices, etc.), confectionery, breads, soups (including powdered soups, etc.), and processed foods. may
  • the food composition according to the present invention when preparing the food composition according to the present invention as a health food (food with nutrient function claims, food for specified health use, etc.) or supplement, for example, granules, capsules, tablets (chewable It is preferable to prepare it in the form of beverages (drinks), etc. Among them, capsules, tablets, and tablet forms are preferable from the viewpoint of ease of ingestion, but are not particularly limited to these. do not have.
  • the food composition according to the present invention in the form of granules, capsules, tablets and the like can be appropriately prepared according to conventional methods using pharmaceutically and/or food hygienically acceptable carriers. Moreover, even when preparing other forms, conventional methods may be followed.
  • the amount of ceramide compounded in the food composition according to the present disclosure is not particularly limited as long as the effect can be exhibited. , preferably 0.0005 to 100% by mass, more preferably 0.005 to 90% by mass, still more preferably 0.05 to 80% by mass.
  • the lower limit may be approximately 10% by mass, 20% by mass, 30% by mass, 40% by mass, 50% by mass, 60% by mass, 70% by mass, or 80% by mass.
  • the amount of intake, target of intake, etc. of the food composition according to the present disclosure are not particularly limited, it is preferably the same as the pharmaceutical composition according to the present invention described above, for example.
  • hospital food is food provided when hospitalized
  • sick food is food for sick people
  • nursing care food is food for people receiving care.
  • the preparation was performed as follows. That is, a dried product of compressed lees, which is a by-product of soy sauce produced by a conventional method, was subjected to ethanol extraction, and the resulting extract was subjected to solid-liquid separation using ethanol and water to obtain a solid portion. Further, the solid portion was washed with acetone, ethanol and water, dried and pulverized, washed with water, acetone and hexane, and extracted again with ethanol to obtain a solid portion as a ceramide composition.
  • ⁇ Ceramide composition extracted from Aspergillus oryzae> The cells were collected from 300 liters of the koji mold culture solution and dried to obtain a solid. A 2.5-fold amount of ethanol/water mixture was added to the solid and mixed, and extraction was performed with stirring overnight at 40°C. A 1.2-fold amount of ethanol solution was added to the solid portion after collecting the extract, mixed, and extracted with stirring overnight at 40°C. The resulting extracts were combined and distilled under reduced pressure at 45° C. to obtain a concentrated extract. After the concentrated liquid extract was washed with acetone (further washed with ethanol, acetone, etc., if necessary), the obtained insoluble matter was used as an Aspergillus oryzae-extracted ceramide composition.
  • the chicken leg-extracted ceramide composition can be more specifically called a chicken leg ethanol-extracted ceramide composition.
  • FIG. 15 and Table 1 show the content ratio (% by mass) of various free ceramide species in the soy sauce cake-extracted ceramide composition.
  • Table 2 shows the free ceramide molecular species of the koji mold-extracted ceramide composition.
  • Tables 3a and 3b show the content (mg/g) of various free ceramides, and Table 3b shows the content concentration (% by mass) of various free ceramides.
  • Ceramide nano- glycols (other polyols, oils and fats may be added as necessary), an emulsifier, and a ceramide composition were mixed and heated to 100 to 150° C. (a temperature near the melting point of ceramide) to homogenize. Further, an aqueous lecithin dispersion, an aqueous polysaccharide solution, an aqueous water-soluble polymer solution, etc. are added to this and stirred and mixed. Ceramide was nanoized by high pressure treatment. Incidentally, lecithin was used in a mass ratio of about 2 to 5 times that of ceramide.
  • the particle size containing ceramide was measured using a dynamic light scattering system, Nanotrac WAVE II (Verder Scientific). Specifically, the nano-ceramide composition (emulsion) was diluted with pure water so that the ceramide concentration was 0.1% by mass, and this was used as a measurement sample. Using 1.600 as the refractive index of the sample, 1.333 (pure water) as the refractive index of the dispersion medium, and the viscosity of pure water as the viscosity of the dispersion medium, the volume average particle diameter (Mv) was determined. In addition, the ceramide particle size was similarly measured for the ceramide composition before nanoization treatment. The volume average particle size of ceramide in the ceramide composition before nanoization treatment was 4857 nm, and the volume average particle size of ceramide in the nano ceramide composition was 124 nm.
  • soy sauce cake-extracted ceramide composition was nanoized and used as the nanoized ceramide composition.
  • ceramide composition (soy sauce cake-extracted ceramide composition, koji mold-extracted ceramide composition, chicken leg-extracted ceramide composition, nano-sized ceramide composition), glucosylceramide, and synthetic ceramide were used as ceramide samples.
  • concentration of ceramide is the concentration of each ceramide sample.
  • ⁇ extracted ceramide composition may be abbreviated as " ⁇ ceramide”.
  • a ceramide composition extracted from soy sauce cake is sometimes referred to as soy sauce cake ceramide.
  • the chicken leg extract ceramide composition is sometimes referred to as Avian.
  • the glucoside ceramide is manufactured by Maruzen Pharmaceutical Co., Ltd.
  • DMEM medium was prepared by dissolving 4.75 g of Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) medium "Nissui” (2) (Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Japan) in 470 mL of Milli-Q water and adding 0.2 M L-glutamine (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) 10 mL, 50,000 U/mL penicillin (Meiji Seika Pharma, Tokyo, Japan) 1 mL, 0.05 mg/mL streptomycin (Meiji Seika Pharma) 0.5 mL, 10% NaHCO 3 (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to prepare.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • NaHCO 3 Freptomycin
  • HaCaT cells were seeded in a 96-well plate at a density of 6.0 ⁇ 10 4 cells/mL and precultured for 24 hours. After that, samples were added so that the final concentration of ceramide was 5 ⁇ M. After 24 hours, add 100 ⁇ L/well of MitoTracker Red (Invitrogen, USA) diluted to 2.5 ⁇ M with 10% FBS/DMEM to the plate after removing the medium, and incubate at 37°C, 5% CO 2 for 30 minutes. did.
  • MitoTracker Red Invitrogen, USA
  • MitoTracker Green (Invitrogen) diluted to 200 nM with 10% FBS/DMEM, and incubate at 37°C, 5% CO 2 for 30 minutes. did After that, 100 ⁇ L/well of 1 mg/mL Cellstain Hoechst 33342 solution (DOJINDO, Kumamoto, Japan) diluted 500 times with DMEM was added and incubated at 37°C, 5% CO 2 for 30 minutes. rice field. Thereafter, the diluted Hoechst 33345 solution was removed from the 96-well plate, 150 mL of PBS was added, and fluorescence was detected using IN Cell Analyzer 2200 (GE Healthcare). Mito Tracker Red, Mito Tracker Green, and Hoechst 33342 were measured to measure the activity, number, and area of intracellular mitochondria. Images were analyzed with IN Cell Investigator High-content image analysis software (GE Healthcare).
  • ⁇ Evaluation of the effect of ceramide on HaCaT cells via Caco-2 cells Examination of barrier function in the intestinal tract> Human colon cancer-derived cell line CaCo -2 cells were used as a Caco-2 cell cultured human intestinal epithelial cell model. CaCo-2 cells were cultured in a cell culture dish (Greiner bio-one, Tokyo, Japan) at 37°C in the presence of 5% CO2.
  • DMEM medium was prepared by dissolving 4.75 g of Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) medium "Nissui” (2) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan) in 470 mL of Milli-Q water and adding 0.2 M L-glutamine (Fuji Film Wako Pure Chemical, Osaka, Japan) 10 mL, 50,000 U/mL penicillin (Meiji Seika Pharma, Tokyo, Japan) 1 mL, 0.05 mg/mL streptomycin (Meiji Seika Pharma) 0.5 mL, 10% NaHCO 3 (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to prepare.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Mitochondrial activity measurement using IN Cell Analyzer 2200 (Caco-2 cells ⁇ HaCaT cells) Caco-2 cells were seeded at 1.0 ⁇ 10 2 cells/mL in 24 well plates (Corning, NY, USA). After 24 hours, ceramide was added to a final concentration of 5 ⁇ M and cultured for 24 hours. HaCaT cells were seeded at 6.0 ⁇ 10 4 cells/mL in a 96-well plate and incubated for 24 hours. After 48 hours, the number and area of mitochondria and mitochondrial membrane potential activity of HaCaT cells were measured in the same manner as described in "Measurement of mitochondrial activity using IN Cell Analyzer 2200" above.
  • UV damage recovery effect of ceramide on UVB-induced senescent cells Caco-2 cells ⁇ HaCaT cells
  • Caco-2 cells were seeded at 1.0 ⁇ 10 2 cells/mL in 24 well plates (Corning, NY, USA). After 24 hours, ceramide was added to a final concentration of 5 ⁇ M and cultured for 24 hours.
  • HaCaT cells in a subconfluent state were irradiated with UVB at 10 mJ/cm 2 and seeded in a 96-well plate at 6.0 ⁇ 10 4 cells/mL.
  • 50 ⁇ L of the HaCaT cell culture medium was removed, and 50 ⁇ L of the Caco-2 cell culture medium was added thereto.
  • the number and area of mitochondria and mitochondrial membrane potential activity of HaCaT cells were measured by the same method as described in "Recovery effect of ceramide on UVB-induced senescent cells”.
  • a Cell Culture Insert (FALCON) was set in a 24-well plate for Transepithelial Electrical Resistance (TER) measurement .
  • Caco-2 cells were seeded at 2.0 ⁇ 10 5 cells/well, and carnosine was added to 10 mM after 48 hours. It was added every 3 days and cultured for 2 weeks.
  • Millicell ERS-2 (Japan Millipore, Tokyo) was used to measure transepithelial electrical resistance.
  • the electrodes were set in Millicell ERS-2, sterilized by soaking the electrodes in a 70% ethanol solution for 10 minutes, and then dried and soaked in DMEM medium. Next, the measurement was performed by inserting electrodes inside and outside the Cell Culture Insert. Calculation of the measured value was performed with reference to the following formula.
  • TER ( ⁇ cm 2 ) (measured value - blank) x (insert area)
  • Mitochondrial activity recovery effect by IN Cell Analyzer 2200 Number and area of mitochondria per cell (Mitotracker Green) and mitochondrial membrane potential when HaCaT cells were irradiated with UVB at 10 mJ/cm 2 and treated with ceramide for 48 hours. Activity (Mitotracker Red) was measured using an IN Cell Analyzer 2200. ( Figure 3)

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Abstract

新規セラミド組成物が提供される。具体的には、鶏脚エタノール抽出セラミド組成物が提供される。

Description

セラミド組成物
　本開示は、セラミド組成物及びその用途等に関する。なお、本明細書に記載される全ての文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
　近年、セラミドはヒト表皮の細胞間脂質の主成分であることから、機能性化粧品素材等として市場を拡大している。加齢による角質セラミドは徐々に減少することが知られており、このため外用セラミドの補給が健康な肌を保つために重要ではないかと考えられている。また、角質層細胞間脂質として存在するセラミドは遊離型のフリーセラミドであることから、フリーセラミドにも注目が集まっている。
　これまでに、有用なセラミドを効率的に調製するための研究も行われてきている（例えば特許文献１及び特許文献２）。
特開２０１２－１２６９１０号公報 国際公開第２０１９／０４９９６４号
　本発明者らは、セラミドの新たな機能を見出すことを目的に検討を進めた。
　本発明者らは、特定の生体由来セラミド組成物が、特定の機能を特に効率的に奏し得る可能性を見いだした。またさらに、生体由来セラミド組成物の中でも、鶏脚からエタノールにより抽出して得られるセラミド含有抽出物（鶏脚エタノール抽出セラミド組成物）が、特に好ましい上皮バリア機能を強化する効果を奏し得ることを見いだした。以上の知見に基づき、さらに改良を重ねた。
　本開示は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
鶏脚エタノール抽出セラミド組成物。
項２.
ω－Ｏ－アシルセラミドを含有する、項１に記載の組成物。
項３．
含有されるω－Ｏ－アシルセラミドがＥＯＳ型であり、かつ末端アシル基がリノール酸基である、項２に記載の組成物
項４．
含有されるセラミドのうち、０．１～２質量％がω－Ｏ－アシルセラミドである、項２又は３に記載の組成物。
項５．
上皮バリア強化用である、項１～４のいずれかに記載の組成物。
項６．
皮膚バリア強化用若しくは腸管バリア強化用である、項１～５のいずれかに記載の組成物。
項７．
紫外線による皮膚へのダメージをケアするための、項６に記載の皮膚バリア強化用組成物。
項８．
腸管上皮細胞タイトジャンクション強化のための、項６に記載の腸管バリア強化用組成物。
項９．
含有されるセラミドのうち、９０質量％以上が、セラミド骨格が（ヒドロキシル基を２個有し、炭素数１８で、炭素間二重結合を１個有するスフィンゴイド塩基）－（炭素数１６～３４、炭素間二重結合を０又は１個、ヒドロキシル基を０個有する脂肪酸）の組み合わせであるフリーセラミドである、項１～８のいずれかに記載の組成物。
項１０．
含有されるセラミドのうち、９０質量％以上がセラミドＮＳである、項１～８のいずれかに記載の組成物。
　新規な生体由来セラミド組成物が提供される。特に、鶏脚からエタノールにより抽出して得られるセラミド含有抽出物（鶏脚エタノール抽出セラミド組成物）が提供される。当該セラミド組成物は、特に上皮バリア強化用として好ましく用いることができる。
HaCaT細胞にセラミドを添加し、48時間培養後、IN Cell Analyzer 2200を用いてミトコンドリア数、面積、膜電位活性を測定した結果を示す。(n=3; ***p <0.001, **p<0.01, *p<0.05, Student’s t-test) 10 mJ/cm2のUVB照射をしたHaCaT細胞にセラミドを添加し、24時間培養後、IN Cell Analyzer 2200を用いてROSを測定した結果を示す。（n=3; ***p <0.001, **p<0.01, *p<0.05, Student’s t-test) 10 mJ/cm2のUVB照射をしたHaCaT細胞にセラミドを添加し、24時間培養後、IN Cell Analyzer 2200を用いてミトコンドリア数、面積、膜電位活性を測定した結果を示す。(n=3; ***p <0.001, **p<0.01, *p<0.05, Student’s t-test) HaCaT細胞にセラミドを添加し、48時間培養後、LC-MSを用いてHaCaT細胞内のセラミドの脂肪酸組成を分析した結果を示す。 10 mJ/cm2のUVB照射をしたHaCaT細胞にセラミドで24時間処理したCaco-2細胞の上清を添加し、48時間後、IN Cell Analyzer 2200を用いてミトコンドリア数、面積、膜電位活性を測定した結果を示す。(n=3; ***p <0.001, **p<0.01, *p<0.05,#=0.08 Student’s t-test) 10 mJ/cm2のUVB照射をしたHaCaT細胞にセラミドで24時間処理したCaco-2細胞の上清を添加し、48時間後、IN Cell Analyzer 2200を用いてROSを測定した結果を示す。(n=3; ***p <0.001, **p<0.01, *p<0.05, #p<0.15, Student’s t-test) 10 mJ/cm2のUVB照射をしたHaCaT細胞にセラミドで24時間処理したCaco-2細胞の上清を添加し、48時間後、IN Cell Analyzer 2200を用いてミトコンドリア数、面積、膜電位活性を測定した結果を示す。(n=3; ***p <0.001, **p<0.01, *p<0.05, Student’s t-test) Caco-2細胞にセラミドを添加し、24時間培養後、Claudin-3のmRNA発現量を測定した結果を示す。(n=3; ***p <0.001, **p<0.01, *p<0.05, Student’s t-test) 醤油粕抽出セラミド組成物における各種フリーセラミド種の含有割合（質量％）を示す。
　以下、本開示に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。本開示は、特定の生体由来セラミド組成物及びその用途等を好ましく包含するが、これらに限定されるわけではなく、本開示は本明細書に開示され当業者が認識できる全てを包含する。
　本開示に包含されるセラミド組成物は、生体由来セラミド組成物であり、より具体的には、醤油粕抽出セラミド組成物、麹菌抽出セラミド組成物、又は鶏脚抽出セラミド組成物である。なお、セラミド組成物とは、セラミドを含有する組成物、という意味あいである。これらの生体由来セラミドを、本開示のセラミド組成物ということがある。本開示のセラミド組成物の中でも、鶏脚抽出セラミド組成物が好ましく、鶏脚抽出セラミド組成物の中でも、鶏脚からエタノールにより抽出して得られるセラミド含有抽出物（鶏脚エタノール抽出セラミド組成物）が、特に好ましい。また、鶏脚としては、足先部分（もみじ）が特に好ましい。また、鶏脚（特にもみじ）の表皮部分をエタノール抽出に供することが好ましい。エタノール抽出に供される鶏脚は、予め乾燥したものが好ましく、乾燥粉末状のものが特に好ましい。
　本開示のセラミド組成物、特に鶏脚エタノール抽出セラミド組成物は、上皮バリア機能を強化する効果を好ましく奏する。このため、上皮バリア強化用として好ましく用いることができる。上皮バリアとしては、特に皮膚バリア（表皮バリア）や腸管バリア（腸管上皮）バリアを好ましく挙げることができる。
　本開示のセラミド組成物、特に鶏脚エタノール抽出セラミド組成物を、皮膚バリア強化用として用いる場合、特に皮膚に対する紫外線の影響を防ぐ（ダメージをケアする）ために好ましく用いることができる。理論に拘束されることを望むものではないが、これは、本開示のセラミド組成物を皮膚に適用することにより、紫外線によってダメージを受ける若しくは受けた皮膚の細胞において、ミトコンドリア（特に数、面積、若しくは膜電位活性）を回復させることが可能となり得るからである。なお、紫外線でダメージを受ける皮膚のために予防として、又は紫外線でダメージを受けた皮膚のために治療用として、用いることができる。
　なお、本開示のセラミド組成物を皮膚のために用いる場合（皮膚バリア強化用として用いる場合）には、例えば外用組成物又は経口組成物（例えば経口医薬組成物若しくは食品組成物）として用いることができ、外用組成物として用いることが好ましい。
　本開示のセラミド組成物の中でも、特に鶏脚エタノール抽出セラミド組成物を、腸管バリア用として好ましく用いることができ、特に腸管上皮細胞タイトジャンクション強化のために好ましく用いることができる。理論に拘束されることを望むものではないが、これは、特に鶏脚エタノール抽出セラミド組成物を、腸管に適用することにより、腸管の細胞におけるクローディン（特にクローディン３）の発現を亢進させることが可能となり得るからである。また、タイトジャンクションが強化されることにより、腸管における病原体からの感染防御機能も高められ得る。このような感染防御強化用として用いる場合、感染予防のため若しくは感染後の治療のために用いることができる。なお、クローディンは、タイトジャンクションの形成に係る主要なタンパク質であり、タイトジャンクションにおける細胞間バリアの中心的な働きを担っている。
　また、タイトジャンクションの密集性と結合性については，経上皮電気抵抗値(Trans Epithelial Electric Resistance；TER)を指標として測定することも可能であり、本開示のセラミド組成物は、好ましく当該TER値を向上させ得る。
　なお、本開示のセラミド組成物を腸管に用いる場合（腸管バリア用として用いる場合）には、例えば経口組成物（例えば経口医薬組成物若しくは食品組成物）及び腸投与用組成物として用いることができる。腸投与用組成物として用いる場合は、外科的処置により直接腸に投与することもでき、また肛門から投与することもできる。
　セラミドはスフィンゴイド塩基のアミノ基（－ＮＨ２）に脂肪酸のカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）が結合した構造（－ＮＨ－ＣＯ－）を有する化合物である。セラミドのスフィンゴイド塩基のアルコール性ヒドロキシル基（－ＯＨ）に、更に糖及びリン酸などの極性基が結合し、それぞれスフィンゴ糖脂質及びスフィンゴリン脂質となる。ここで、糖が結合したものを特にグリコシルセラミドと呼び、特に糖がグルコースである場合グルコシルセラミドと呼ぶ。セラミドに糖及びリン酸が結合していない場合を特にフリーセラミドと呼ぶ。また、セラミドの脂肪酸部分がωヒドロキシ脂肪酸であり、そのヒドロキシ末端にさらに脂肪酸がエステル結合している場合を特にアシルセラミド（ω－Ｏ－アシルセラミド）と呼ぶ。本明細書では、特に断らない限り、アシルセラミドとはω－Ｏ－アシルセラミドのことを意味する。本開示のセラミド組成物は、アシルセラミドを含有することが好ましい。
　さらに、このωヒドロキシ末端にエステル結合する脂肪酸としては、例えばステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸などが挙げられ、本開示のセラミド組成物（特に鶏脚エタノール抽出セラミド組成物）としては、特に限定はされないが、当該脂肪酸がリノール酸であるアシルセラミドを含有することが好ましい。
　フリーセラミドを構成するスフィンゴイド塩基としては、ヒドロキシル基を２又は３個有するものが好ましく、３個有するものがより好ましい。また、当該スフィンゴイド塩基は、炭素数１４～２２（１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２）であるものが好ましく、炭素数１６～２０であるものがより好ましく、炭素数１８又は２０であるものがさらに好ましい。また、炭素間二重結合を０又は１有するものが好ましい。より具体的な好ましいスフィンゴイド塩基としては、例えばスフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン等が挙げられる。
　フリーセラミドを構成する脂肪酸としては、炭素数１６～３０（１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）の脂肪酸が好ましく、炭素数１８～２８の脂肪酸がより好ましく、炭素数２０～２６の脂肪酸がさらに好ましく、炭素数２２～２６の脂肪酸がよりさらに好ましい。また、炭素間二重結合を０又は１個有する脂肪酸が好ましく、０個有する脂肪酸（すなわち飽和脂肪酸）がより好ましい。また、ヒドロキシル基を０、１、又は２個有する脂肪酸が好ましい。特に制限されないが、ヒドロキシル基を有する場合、α－ヒドロキシル基であることが好ましい。
　フリーセラミドにおいて、セラミド骨格の（スフィンゴイド塩基）－（脂肪酸）の組み合わせは、上記のスフィンゴイド塩基及び脂肪酸をどのように組み合わせたものであってもよい。中でも好ましい組み合わせとして、例えば、（ヒドロキシル基を２又は３（特に３）個有するスフィンゴイド塩基）－（ヒドロキシル基を有する（特にα－ヒドロキシル基を有する）脂肪酸）の組み合わせが挙げられる。当該脂肪酸のヒドロキシル基数は０、１、又は２が好ましい。
　例えば、スフィンゴシン（Ｓ）とヒドロキシル基数１の脂肪酸（Ａ）の組み合わせであるセラミドＡＳ、スフィンゴシン（Ｓ）とヒドロキシル基数０脂肪酸（Ｎ）の組み合わせであるセラミドＮＳ等が好ましく挙げられる。
　また例えば、フィトスフィンゴシン（Ｐ）とヒドロキシル基数１の脂肪酸（Ａ）の組み合わせであるセラミドＡＰ、フィトスフィンゴシン（Ｐ）とヒドロキシル基数０脂肪酸（Ｎ）の組み合わせであるセラミドＮＰ等が好ましく挙げられる。またさらに、フィトスフィンゴシン（Ｐ）とヒドロキシル基数２の脂肪酸（Ｄ）の組み合わせであるセラミドＤＰも好ましく例示できる。なお、セラミドＡＰ、及びセラミドＮＰは一般に使用される用語であるが、セラミドＤＰは本明細書中で使用する用語であって、一般に使用される用語ではない。セラミドＤＰとしては、具体的には例えば、ジヒドロキシリグノセロイルフィトスフィンゴシン等が挙げられる。
　これらのなかでも、フリーセラミドとして、（ｉ）セラミド骨格が（ヒドロキシル基を２個又は３個有し、炭素数１８で、炭素間二重結合を０又は１個有するスフィンゴイド塩基）－（炭素数１６～３４、炭素間二重結合を０又は１個、ヒドロキシル基を０、１、又は２個有する脂肪酸）の組み合わせであるフリーセラミド、並びに、（ｉｉ）セラミド骨格が（ヒドロキシル基を２個又は３個有し、炭素数２０で、炭素間二重結合を有さないスフィンゴイド塩基）－（炭素数２４又は２５、炭素間二重結合が０、ヒドロキシル基を０、１、又は２個有する脂肪酸）の組み合わせであるフリーセラミド、が好ましく、（ｉ）のフリーセラミドがより好ましい。なかでも、（ｉ－１）セラミド骨格が（ヒドロキシル基を２個有し、炭素数１８で、炭素間二重結合を１個有するスフィンゴイド塩基）－（炭素数１６～３４、炭素間二重結合を０又は１個、ヒドロキシル基を０個有する脂肪酸）の組み合わせであるフリーセラミドや、（ｉ－２）セラミド骨格が（ヒドロキシル基を３個有し、炭素数１８で、炭素間二重結合を０個有するスフィンゴイド塩基）－（炭素数２０～２６、炭素間二重結合を０個、ヒドロキシル基を０個有する脂肪酸）の組み合わせであるフリーセラミドが、さらに好ましい。また、（ｉ－１）の中でも、（ｉ－１ａ）セラミド骨格が（ヒドロキシル基を２個有し、炭素数１８で、炭素間二重結合を１個有するスフィンゴイド塩基）－（炭素数１６～３４、炭素間二重結合を０個、ヒドロキシル基を０個有する脂肪酸）の組み合わせであるフリーセラミドが特に好ましい。
　より具体的には例えば、ｄ１８：０－１６：０、ｄ１８：０－１８：０、ｄ１８：０－２０：０、ｄ１８：０－２２：０、ｄ１８：１－１６：０、ｄ１８：１－１８：０、ｄ１８：１－２０：０、ｄ１８：１－２２：０、ｄ１８：１－２４：０、ｄ１８：１－２６：０、ｄ１８：１－２６：１、ｄ１８：１－２８：０、ｄ１８：１－３０：０、ｄ１８：１－３２：０、ｄ１８：１－３２：１、ｄ１８：１－３４：０、ｄ１８：１－３４：１、ｄ１８：０－１６：０ｈ、ｄ１８：０－１８：０ｈ、ｄ１８：０－２０：０ｈ、ｄ１８：０－２２：０ｈ、ｄ１８：１－１６：０ｈ、ｄ１８：１－１８：０ｈ、ｄ１８：１－２０：０ｈ、ｄ１８：１－２２：０ｈ、ｄ１８：１－２４：０ｈ、ｄ１８：１－２６：０ｈ、ｄ１８：１－２８：０ｈ、ｄ１８：１－３０：０ｈ、ｄ１８：１－３２：０ｈ、ｄ１８：１－３４：０ｈ、ｄ１８：１－３４：１ｈ、ｔ１８：０－２３：０ｈ、ｔ１８：１－２３：０ｈ、ｔ１８：０－２４：０ｈ、ｔ１８：１－２４：０ｈ、ｔ２０：０－２４：０ｈ、ｔ１８：１－２６：０ｈ、ｔ１８：０－２５：０ｈ、及びｔ１８：０－２４：０ｈ２等が挙げられる。なお、当該表記について「ｔ１８：０－２２：０ｈ」を例に挙げて説明すると、この前半部分の「ｔ１８：０」がスフィンゴイド塩基についての情報であって、ヒドロキシル基を３個（「ｔ」）有し、炭素数が「１８」で、炭素間二重結合を「０」個有する（すなわち、炭素間二重結合を有さない）スフィンゴイド塩基を示している。ヒドロキシル基が２個の場合は「ｄ」で表す。また、この後半部分「２２：０ｈ」が脂肪酸についての情報であって、炭素数「２２」、炭素間二重結合が「０」、ヒドロキシル基を１個有する（「ｈ」）脂肪酸である脂肪酸であることを示している。「ｈ２」はヒドロキシル基を２個有することを示す。なお、「２２ｈ：０」のように、「ｈ」を炭素数のすぐ後ろに記載する場合や、ヒドロキシル基が０個の場合には「２２：０」と「ｈ」を記載しない場合もある（逆に言えば、「ｈ」が付記されていない場合はヒドロキシル基が０個ということである）。また、例えば「ｃ２２：０」のように、炭素数の前に「ｃ」を付ける場合もある。
　本開示のセラミド組成物の中でも、鶏脚エタノール抽出セラミド組成物は、アシルセラミドを含有しており、好ましい。より具体的には、鶏脚エタノール抽出セラミド組成物は、ｄ１８：１－ｃ２８～３６：０－１８：２（例えば、ｄ１８：１－ｃ２８：０－１８：２、ｄ１８：１－ｃ３０：０－１８：２、ｄ１８：１－ｃ３２：０－１８：２、ｄ１８：１－ｃ３４：０－１８：２、又はｄ１８：１－ｃ３６：０－１８：２）のアシルセラミドを含有するものが好ましく、これらの中の４種又は５種含有するものが特に好ましい。
　ヒト角層細胞間脂質を構成するセラミドは、Downingらにより長鎖スフィンゴイド塩基とアミド結合している長鎖脂肪酸の種類によって７種類の遊離セラミドに分類され、組成も報告されている（Robson.K.J.et al,J.lipid Res.35,2060(1994)） 。鶏脚エタノール抽出セラミド組成物に含有されるアシルセラミドは、上記７種類の中で、セラミドＥＯＳに分類される。これまで、化学合成により調整されるアシルセラミドはセラミドＥＯＰだけだったが、セラミドＥＯＰはヒトの肌には殆ど含まれず、むしろヒト型として知られているのはセラミドＥＯＳである。よってセラミドＥＯＳが含有されるという観点からも鶏脚エタノール抽出セラミド組成物は好ましい。なお、セラミドＥＯＳはスフィンゴイド塩基部分がスフィンゴシンのアシルセラミドであり、セラミドＥＯＰはスフィンゴイド塩基部分がフィトスフィンゴシンのアシルセラミドである。
　鶏脚エタノール抽出セラミド組成物は、例えばＨＰＬＣ等公知の方法を用いて、アシルセラミドが濃縮されたものであってもよい。言い換えれば、鶏脚エタノール抽出セラミド組成物は、鶏脚エタノール抽出物のアシルアミド濃縮物も包含する。
　また特に限定はされないが、鶏脚エタノール抽出セラミド組成物は、含有されるセラミドのうち、０．１～２質量％程度がアシルセラミドであるものが好ましい。当該範囲（０．１～２質量％）の上限又は下限は例えば、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、又は１．９質量％であってもよい。例えば当該範囲は０．２～１．５質量％がより好ましく、０．３～１．２質量％がさらに好ましい。当該アシルセラミド含有量は好ましい一例であって、例えば上記のようにアシルセラミドを濃縮した場合には変動しうる。
　鶏脚エタノール抽出セラミド組成物には、上記の通り、アシルセラミド（好ましくはｄ１８：１－ｃ２８～３６：０－１８：２のアシルセラミド）が含まれ、きわめて重要な機能性を担っていると考えられる。
　鶏脚エタノール抽出セラミド組成物に含まれるアシルセラミドは、スフィンゴイド塩基がスフィンゴシンであり、脂肪酸がエステル化ω脂肪酸である、いわゆるＥＯＳ型であり、更にω脂肪酸のヒドロキシ基とエステル化している脂肪酸が主にリノール酸である。また、ωヒドロキシ脂肪酸部分の鎖長としては、炭素数２８から３６まで含むことが好ましく、その分布の中心は炭素数３０から３４であることが好ましい。
　超長鎖の脂肪酸基を有するアシルセラミドは、少量でも肌のバリア機能にとって中心的な役割を果たしている事はよく知られている。特に、ヒトの角層細胞間脂質に存在が認められているＥＯＳ型のアシルセラミドの減少は、単にバリア機能や保湿機能の低下をもたらすだけでなく、アトピー性皮膚炎などにおける皮膚バリア機能障害やドライスキンの憎悪因子となっていることが知られている。
　また、鶏脚エタノール抽出セラミド組成物は、含有されるセラミドのうち、９０質量％以上がセラミドＮＳであることが好ましく、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は９８質量％以上がセラミドＮＳであることがより好ましい。また、鶏脚エタノール抽出セラミド組成物は、含有されるセラミドのうち、９０質量％以上が上記（ｉ－１）のセラミドであることが好ましく、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は９８質量％以上が上記（ｉ－１）のセラミドであることがより好ましい。またさらに、鶏脚エタノール抽出セラミド組成物は、含有されるセラミドのうち、９０質量％以上が上記（ｉ－１ａ）のセラミドであることが好ましく、９１、９２、９３、又は９４質量％以上が上記（ｉ－１ａ）のセラミドであることがより好ましい。
　また、特に限定はされないが、好ましい鶏脚エタノール抽出セラミド組成物の一例としては、ｄ１８：１－２０：０が最も多く含まれ、ｄ１８：１－２２：０がその次に多く含まれ、ｄ１８：１－２６：０、がさらにその次に多く含まれる組成物が好ましい。例えば、この含有量の多さの順序は守られつつ、ｄ１８：１－２０：０が２５～３５質量％（より好ましくは２７～３３質量％）程度、ｄ１８：１－２２：０が１５～３０質量％（より好ましくは１７～２８質量％）程度、ｄ１８：１－２６：０が５～２０質量％（より好ましくは７～１８質量％又は８～１５質量％）程度、含まれる組成物が好ましい。
　また、ｄ１８：１－１６：０は、２～８質量％含まれることが好ましく、３～７質量％含まれることがより好ましい。ｄ１８：１－２４：０は、４～１１質量％含まれることが好ましく、５～１０質量％又は６～９質量％含まれることがより好ましい。ｄ１８：１－２８：０は、２～８質量％含まれることが好ましく、３～７質量％含まれることがより好ましい。
　さらにまた、ｄ１８：１－１８：０は、２～６質量％含まれることが好ましく、３～５質量％含まれることがより好ましい。ｄ１８：１－２６：１は、０．２～３質量％含まれることが好ましく、０．５～２質量％含まれることがより好ましい。ｄ１８：１－３０：０は、１～４質量％含まれることが好ましく、２～３．５質量％含まれることがより好ましい。
　本開示のセラミド組成物は、ナノ化して用いる（つまり、ナノ化セラミド組成物として用いる）こともできる。ナノ化セラミド組成物は、例えば、セラミド組成物を高圧処理して得ることができる。高圧処理は超高圧湿式微粒化装置（例えば（株）スギノマシン：スターバースト）により行うことができる。高圧としては、例えば１００ＭＰａ以上程度が挙げられ、１００～３００ＭＰａ程度が好ましく、１２０～２５０ＭＰａ程度がより好ましい。
　　本開示のセラミド組成物は、乳化組成物として好ましく用いることができる。特に水相に油相が分散している形態（例えば水中油滴（Ｏ／Ｗ）エマルジョン）であることが好ましい。この場合、生体抽出セラミド（特に鶏脚エタノール抽出セラミド）以外に、油脂類、非イオン性界面活性剤、リン脂質、蛋白質、多糖類、ｐＨ調整剤、増粘剤、香料、天然色素、防腐剤などを含むことが出来る。
　Ｏ／Ｗエマルジョンの形態である場合、セラミドを含む油滴（すなわち分散粒子）の平均粒径は、５００ｎｍ以下であることが好ましい。貯蔵経時安定性及び生体利用効率の観点から、分散粒子の平均粒径は、好ましくは３００ｎｍ以下であり、より好ましくは２００ｎｍ以下であり、さらに好ましくは１５０ｎｍ以下である。分散粒子の平均粒径の下限値としては、特に制限はないが、例えば、１ｎｍ以上とすることができ、好ましくは１０、２０、若しくは５０ｎｍ以上とすることができる。
　本開示において、分散粒子の平均粒径とは、動的光散乱法を用いて測定される体積平均粒径を意味する。
　動的光散乱法により平均粒径を測定可能な市販の測定装置としては、粒子径分布測定装置ナノトラックＷＡＶＥＩＩ（ヴァーダーサイエンティフィック）、ゼータサイザーＵＬＴＲＡ（マルバーン）、粒径・分子量測定システムＥＬＳＺ－２０００Ｓ（大塚電子）、ナノ粒子解析装置ＳＺ－１００Ｖ２（堀場製作所）等が挙げられる。
　本明細書において、分散粒子の体積平均粒径は、例えば動的光散乱方式であるナノトラックＷＡＶＥII（ヴァーダーサイエンティフィック）を用いて測定することができ、具体的には、次のように測定できる。本発明のセラミド分散組成物から分取した試料に含まれるセラミドの濃度が０．１質量％になるように純水で希釈し、石英セルを用いて測定する。試料屈折率として１．６００、分散媒屈折率として１．３３３（純水）、分散媒の粘度として純水の粘度を用い、体積平均粒径（Ｍｖ）として求める。
　なお、セラミドを含む分散粒子の平均粒径は、組成物の成分以外に、以下に述べる製造方法における条件、例えば高圧乳化分散条件（パス回数、圧力、温度）、撹拌条件（せん断力、温度）、油相と水相比率等の要因を適宜調整することによっても調整することができる。
　乳化組成物とする場合、油相成分と水相成分とを混ぜて予備分散処理して、予め粗分散液を得てもよい。そのような手段としては、特に限定されるものではなく、一般的な攪拌装置を用いることができる。攪拌装置としては、例えば、マグネチックスターラー、家庭用ミキサー、パドルミキサー、インペラーミキサー、ホモミキサー、ディスパーミキサー、ウルトラミキサー等が挙げられる。
　予備分散処理の時間は、特に限定されるものではなく、攪拌装置の種類、分散処理前液の組成等に応じて、適宜設定することができる。
　分散処理工程は、例えば、予備分散処理にて得られた粗分散液（必要に応じて、さらに水等を混合してもよい）を、超音波分散法を用いた分散処理（以下、超音波分散処理と称する。）又は高圧乳化法を用いた分散処理（以下、高圧乳化処理と称する）することにより行うことができる。
　分散処理工程では、本発明の生体抽出セラミドを含む粗分散液（必要に応じて、さらに水等を混合してもよい）を、分散処理することで、生体抽出セラミドを含有する分散粒子を含む微粒子セラミド分散組成物を得ることができる。
　本分散工程における分散処理は、分散粒子の微細化の観点からは高圧乳化処理により行うことが好ましい。
　高圧乳化処理とは、１０ＭＰａ以上の剪断力を被分散物に付加する分散処理を意味する。分散粒子の微細化の観点から、被分散物に付加する剪断力は、５０若しくは１００ＭＰａ以上であることが好ましく、１５０ＭＰａ以上であることがより好ましい。上限値は、温度上昇及び耐圧性の観点から例えば３００ＭＰａ以下であることが好ましい。
　高圧乳化処理の手段としては、特に限定されるものではなく、一般的な高圧乳化装置を用いることができる。高圧乳化装置としては、スターバーストＨＪＰ－２５００５（（株）スギノマシン製）、マイクロフルイダイザー（マイクロフルイディスク社製）、ナノマイザー（吉田機械興業社製、ゴーリンタイプホモジナイザー（ＡＰＶ社製）、ラニエタイプホモジナイザー（ラニエ社製）、高圧ホモジナイザー（ニロ・ソアビ社製）、ホモゲナイザー（三和機械（株）製）、高圧ホモゲナイザー（イズミフードマシナリ（株）製）、超高圧ホモジナイザー（イカ社製）等の高圧ホモジナイザーが挙げられる。
　高圧乳化処理の際の温度は、３０℃～８０℃に設定することが好ましく、４０℃～７０℃に設定することがより好ましい。
　高圧乳化処理を行う回数は１回でもよいが、液全体の均一性を高めるためには、高圧乳化処理を２回以上行うことが好ましく、２回～５回行うことがより好ましい。また、乳化分散された組成物である乳化液はチャンバー通過直後３０秒以内、好ましくは３秒以内に何らかの冷却器を通して冷却することが、分散粒子の粒子径保持の観点から好ましい。
　上記した予備分散処理工程及び本分散処理工程の他、必要に応じて、その他の工程を含んでもよい。その他の工程としては、加熱殺菌工程等が挙げられる。
　またさらに、エマルションを乾燥する工程を経て、粉末化組成物としてもよい。粉末化は、水分が除去されることによる長期間保存性の向上以外にも、携帯性の向上、輸送費の低減などメリットは大きい。このような粉末組成物も本開示のセラミド組成物に好ましく包含される。
　乾燥手段としては、公知の乾燥手段を用いることができ、例えば、自然乾燥、加熱乾燥、熱風乾燥、高周波乾燥、超音波乾燥、減圧乾燥、真空乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥等が挙げられる。これらの手段は単独で用いてもよいが、２種以上の手段を組み合わせて用いることもできる。
　この乾燥過程における、疎水性粒子の凝集合一を防ぐ目的で、包括剤を共存させてもよい。包括剤としては、水に易溶性の多糖類、オリゴ糖類が好ましい。本発明における糖類包括剤として用いられる糖類とは、糖単位を基本単位として構成された糖類が好ましく、糖単位の平均重合度（糖単位数）としては、復水後の粒径微細化の観点から、一般に６０以下であることが好ましく、２～５０であることが更に好ましい。このような糖類包括剤としては、疎水性粒子の合一安定化効果の観点から、イヌリン、ラフィノース、スタキオース、ベルパスコース、トレハロースが好ましい。
　また、本発明では、乾燥手段として、生産効率と品質を両立する観点から噴霧乾燥法が特に好ましい。噴霧乾燥は対流熱風乾燥の一種である。液状のエマルションが熱風中に数１００μｍ以下の微小な粒子として噴霧され、乾燥されながら塔内を落下して行くことで固体粉末として回収される。素材は一時的に熱風に曝されるが、曝されている時間が非常に短いことと水の蒸発潜熱のため余り温度が上がらないことから、凍結乾燥同様に素材の熱変性が起きにくく、復水による変化も小さいものである。非常に熱に弱い素材の場合、熱風の代わりに冷風を供給することも可能である。その場合、乾燥能力は落ちるが、よりマイルドな乾燥を実現できる点で好ましい。
　市販の噴霧乾燥機の例としては、噴霧乾燥機スプレードライヤＳＤ－１０００（東京理化器械（株））、スプレードライヤＬ－８ｉ（大川原化工機（株））、クローズドスプレードライヤＣＬ－１２（大川原化工機（株））、スプレードライヤＡＤＬ３１０（ヤマト科学（株））、ミニスプレードライヤＢ－２９０（ビュッヒ社）、ＰＪ－ＭｉｎｉＭａｘ（パウダリングジャパン（株））、ＰＨＡＲＭＡＳＤ（ニロ社）等が挙げられるがこれに限定されることはない。
　　また、例えば流動層造粒乾燥機ＭＰ－０１（（株）パウレック）、流動層内蔵型スプレードライヤＦＳＤ（ニロ社）等のように。乾燥と造粒とを同時に行える装置で、乾燥と同時に取り扱い性の優れた顆粒状にすることも好ましい。
　本開示のセラミド組成物は、上記の通り、外用組成物、経口組成物、腸投与用組成物等として用いることができる。また、医薬分野及び食品分野において好ましく用いることができる。当該組成物は、以下に詳述するように、セラミドのみからなるものでもよいし、セラミド及び他の成分（各種基剤、担体、添加剤等）を含む組成物であってもよい。セラミド含有生体組織抽出物そのものも当該組成物に含まれる。つまり、セラミド含有生体組織抽出物（及び必要に応じてさらに他の成分が配合されたもの）も本開示のセラミド組成物として用い得る。
　本開示のセラミド組成物を医薬分野（医薬品及び医薬部外品を含む）にて用いる場合、当該組成物（以下「本開示に係る医薬組成物」と記載することがある）は、各生体抽出セラミドのみからなるものでもよいし、他の成分を配合した医薬組成物でもよい。例えば、本発明に係る医薬組成物においては、有効成分であるセラミドに、必要に応じて薬学的に許容される基剤、担体、添加剤（例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶剤、甘味剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、界面活性剤（特に乳化剤）、保湿剤、保存剤、ｐＨ調整剤、粘稠化剤等）等を配合することができる。このような基材、担体、添加剤等は、例えば医薬品添加物辞典２０１６（株式会社薬事日報社）に具体的に記載されており、例えばこれに記載されるものを用いることができる。また製剤形態も特に制限されず、常法により有効成分及びその他の成分を混合し、例えば経口組成物としては、錠剤、被覆錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゼリー剤、チュアブル剤、ソフト錠剤等の製剤に調製することができる。例えば、錠剤の製造は打錠法により行い得る。混合した原料をそのまま打錠する直接打錠法、混合した原料を顆粒にしてから打錠する顆粒打錠法、のいずれも用い得る。また例えば、カプセル剤の場合はソフトカプセル及びハードカプセルのいずれであってもよい。また例えば、外用組成物としては、クリーム剤、乳液、ジェル剤等として用いることもできる。また例えば、腸投与用組成物としては、例えばフォーム剤として用いることができる。
　本発明に係る医薬組成物におけるセラミドの配合量は、抗疲労効果が発揮される限り特に制限されず、対象者に応じて適宜設定できる。好ましくは０．０００５～１００質量％、より好ましくは０．００５～９０質量％、さらに好ましくは０．０５～８０質量％である。なお、下限は１０質量％、２０質量％、３０質量％、４０質量％、５０質量％、６０質量％、７０質量％、又は８０質量％程度であってもよい。
　本開示に係る医薬組成物を投与する対象には、ヒトのみならず、非ヒト哺乳動物も含まれる。疲労を示す哺乳動物が例示でき、特にペット及び家畜として飼育される哺乳動物が好ましい。具体的には、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、ラクダ、リャマ等が例示できる。哺乳動物の場合も、人の場合と同様、本発明に係る医薬組成物を予防的に用いることもできる。
　本開示に係る医薬組成物の投与時期は特に限定されず、例えば製剤形態、投与対象の年齢、投与対象の症状の程度等を考慮して適宜投与時期を選択することが可能である。
　本開示に係る医薬組成物の投与量は、投与対象の年齢、投与対象の症状の程度、その他の条件等に応じて適宜選択され得る。特に含まれるセラミド量を基準として、本発明の効果が損なわれない範囲で適宜設定することができる。なお、１日１回又は複数回（好ましくは２～３回）に分けて投与することができる。哺乳動物の場合も、当該人の場合を参考として適宜投与量を設定できる。
　本開示のセラミド組成物を食品組成物（例えば飲食品や食品添加物）として用いる場合、当該組成物（以下「本開示に係る食品組成物」と記載することがある）は、セラミド、及び食品衛生学上許容される基剤、担体、添加剤、その他飲食品として利用され得る成分・材料等が適宜配合されたものである。例えば、セラミドを含む、疲労改善用若しくは予防用の加工食品、飲料、健康食品（栄養機能食品、特定保健用食品等）、サプリメント、病者用食品（病院食、病人食又は介護食等）等の食品組成物が例示できる。特に制限はされないが、当該食品組成物に配合されるセラミドが生物（特に動物又は植物）組織から抽出された生体組織抽出セラミドである場合は、例えば当該セラミドが配合された加工食品、健康食品（栄養機能食品、特定保健用食品等）、サプリメント、病者用食品等であることが好ましい。また、セラミドを例えば粉末状にする等して、飲料類（ジュース等）、菓子類、パン類、スープ類（粉末スープ等を含む）、加工食品等の各種飲食品に含有させたものであってもよい。
　なお、健康食品（栄養機能食品、特定保健用食品等）、サプリメントとして、本発明に係る食品組成物を調製する場合は、継続的な摂取が行いやすいように、例えば顆粒、カプセル、錠剤（チュアブル剤等を含む）、飲料（ドリンク剤）等の形態に調製することが好ましく、なかでもカプセル、タブレット、錠剤の形態が摂取の簡便さの点からは好ましいが、特にこれらに限定されるものではない。顆粒、カプセル、錠剤等の形態の、本発明に係る食品組成物は、薬学的及び／又は食品衛生学的に許容される担体等を用いて、常法に従って適宜調製することができる。また、他の形態に調製する場合であっても、従来の方法に従えばよい。
　本開示に係る食品組成物におけるセラミドの配合量は、効果が発揮され得る限り特に制限されない。、好ましくは０．０００５～１００質量％、より好ましくは０．００５～９０質量％、さらに好ましくは０．０５～８０質量％である。なお、下限は１０質量％、２０質量％、３０質量％、４０質量％、５０質量％、６０質量％、７０質量％、又は８０質量％程度であってもよい。
　本開示に係る食品組成物の、摂取量、摂取対象等は、特に限定はされないが、例えば上述した本発明に係る医薬組成物と同様であることが好ましい。
　なお、病院食とは病院に入院した際に供される食事であり、病人食は病人用の食事であり、介護食とは被介護者用の食事である。
　なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本開示は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。
　また、上述した本開示の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本開示に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本開示には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。
　以下、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
セラミド組成物の調製
＜醤油粕抽出セラミド組成物＞
　特開２０１２－１２６９１０号公報に記載の方法を参考に、醤油の搾り粕をエタノール抽出し、溶媒分画して高純度フリーセラミドを精製して、セラミド組成物を得た。
　より具体的には、次のようにして当該調製を行った。すなわち、常法により製造された醤油の副産物である圧搾粕の乾燥物についてエタノール抽出を行い、得られた抽出物をエタノール及び水を用いて固液分離して固形部を得た。さらに当該固形部をアセトン、エタノール、及び水で洗浄し、乾燥及び粉砕してさらに水、アセトン、及びヘキサンで洗浄したのち、再度エタノール抽出して得られた固形部をセラミド組成物として得た。
＜麹菌抽出セラミド組成物＞
　麹菌培養液３００リットルから菌体を集菌し乾燥して固形物を得た。当該固形物に２．５倍量のエタノール／水混合液を加えて混合し、４０℃で一晩撹拌抽出を行った。抽出液回収後の固形部に１．２倍量のエタノール溶液を加えて混合し、４０℃で一晩撹拌抽出を行った。得られた抽出液を合わせて４５℃で減圧蒸留して、濃縮エキスを得た。当該濃縮液エキスをアセトンで洗浄した後、（必要に応じてエタノール、アセトン等によりさらに洗浄して）得られた不溶物を麹菌抽出セラミド組成物として用いた。
＜鶏脚抽出セラミド組成物＞
　鶏乾燥物に２．５倍量の９５％エタノールを加えて混合し、４０℃で一晩撹拌抽出を行った。抽出液回収後の固形部に１．２倍量のエタノールを加えて混合し、４０℃で一晩撹拌抽出を行った。得られた抽出液を合わせて４５℃で減圧蒸留して、濃縮エキスを得た。当該濃縮液エキスをアセトンで洗浄した後、（必要に応じてエタノール、アセトン等によりさらに洗浄して）得られた不要物を鶏脚抽出セラミド組成物として用いた。なお、当該鶏脚抽出セラミド組成物は、より詳細には、鶏脚エタノール抽出セラミド組成物といえる。
セラミド組成物のＬＣ－ＭＳによる組成分析
　各セラミド組成物をＬＣ－ＭＳ（高速液体クロマトグラフ質量分析計）にて解析し、各セラミド組成物に含まれる各種フリーセラミド種について分析した。
　醤油粕抽出セラミド組成物における各種フリーセラミド種の含有割合（質量％）について、図１５及び表１に示す。ｔ１８：０－２４：０ｈ、ｔ１８：１－２４：０ｈ、及びｔ２０：０－２４：０ｈの３種のフリーセラミド種で、当該セラミド組成物の５０質量％以上を占めていた。また、その他にもフリーセラミドが含まれることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、麹菌抽出セラミド組成物のフリーセラミド分子種を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　また、鶏脚抽出セラミド組成物については、４ロット調製を行い、含まれる各種フリーセラミド種について分析した。結果を表３ａ及び表３ｂに示す。表３ａには各種フリーセラミドの含有量（ｍｇ／ｇ）で示し、表３ｂには各種フリーセラミドの含有濃度（質量％）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表中、(d18:1-c28:0-18:2) (d18:1-c30:0-18:2)(d18:1-c32:0-18:2)(d18:1-c34:0-18:2)(d18:1-c36:0-18:2)がアシルセラミドを表す。
セラミドのナノ化
　グリコール類（必要に応じてその他ポリオール、油脂等を加えてもよい）、乳化剤、及びセラミド組成物を混合し、１００～１５０℃（セラミド融点近傍温度）に加熱し均一にした。これにさらにレシチン水分散液、多糖類水溶液、水溶性ポリマー水溶液等を加えて撹拌混合し、得られた混合液を超高圧湿式微粒化装置（（株）スギノマシン：スターバースト）により１００ＭＰa以上の高圧で処理することでセラミドをナノ化した。なお、レシチンは、セラミドに対して、質量比で２～５倍程度用いた。
　また、得られたナノ化セラミド組成物については、動的光散乱方式であるナノトラックＷＡＶＥＩＩ（ヴァーダーサイエンティフィック）を用いて、セラミドを含有する粒子径を測定した。具体的には、ナノ化セラミド組成物（乳化物）を、セラミド濃度が０．１質量％になるように純水で希釈し、これを測定サンプルとした。試料屈折率として１．６００、分散媒屈折率として１．３３３（純水）、分散媒の粘度として純水の粘度を用い、体積平均粒子径（Ｍｖ）を求めた。また、ナノ化処理前のセラミド組成物についても同様にセラミド粒子径を測定した。ナノ化処理前のセラミド組成物におけるセラミドの体積平均粒子径は４８５７ｎｍであり、ナノ化セラミド組成物におけるセラミドの体積平均粒子径は１２４ｎｍであった。
　以下、当該醤油粕抽出セラミド組成物をナノ化したものを、ナノ化セラミド組成物として用いた。
　各セラミド組成物（醤油粕抽出セラミド組成物、麹菌抽出セラミド組成物、鶏脚抽出セラミド組成物、ナノ化セラミド組成物）並びにグルコシルセラミド、合成セラミドをセラミドサンプルして用いた。以下の検討において、セラミドの濃度とは、それぞれのセラミドサンプルの濃度である。また、以下の記載では、「○○抽出セラミド組成物」との記載を「○○セラミド」と略記することがある。例えば醤油粕抽出セラミド組成物を醤油粕セラミドと表記することがある。また、鶏脚抽出セラミド組成物をアビアンと表記することがある。なお、グルコシドセラミドとして丸善製薬株式会社製（パインセラ粉末）を、合成セラミドとして高砂香料工業株式会社製（セラミドNG「CERAMIDE TIC-001」）を、ＮＡＣとして富士フィルム和光製（N-アセチル－L－システイン）を、それぞれ用いた。
［検討方法］
＜セラミドのHaCaT細胞におけるバリア機能増強評価＞
HaCaT細胞培養
　ヒト皮膚のモデル細胞として、ヒト表皮角化細胞株HaCaT細胞を用いた。細胞は非働化した10% Fetal bovine serum（FBS；Life Technologies, CA, USA）添加DMEM培地（Dulbecco’s Modified Eagle Medium；Nissui, Tokyo, Japan）を用いて、細胞培養ディッシュ（Greiner bio-one, Tokyo, Japan）にて、37℃、5％ CO2存在下で継代培養した。DMEM培地は、470 mLのMilli-Q水に対してDulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）培地「ニッスイ」（２）（日水製薬, Tokyo, Japan) 4.75 g を溶解し、0.2 M L-グルタミン (富士フィルム和光純薬, Osaka, Japan) 10 mL、5万U/mLペニシリン (Meiji Seika ファルマ, Tokyo, Japan) 1 mL、0.05 mg/mLストレプトマイシン(Meiji Seika ファルマ) 0.5 mL、10% NaHCO3 (富士フィルム和光純薬) 6 mLを添加し、作製した。
IN Cell Analyzer 2200を用いたミトコンドリア活性測定
　HaCaT細胞を6.0×104 cells/ mLの密度で96 well plateに播種し、24時間前培養を行った。その後、セラミドを終濃度5 μMとなるようにサンプル添加を行った。24時間後、培地除去後のplateに10 % FBS/DMEMで2.5 μMに希釈したMitoTracker Red (Invitrogen, USA)を100 μL/ well添加し、37℃、5% CO2条件下で30分間インキュベートを行なった。30分後、MitoTracker Red入りの培地を除去し、10 % FBS/DMEMで200 nMに希釈したMitoTracker Green (Invitrogen)を100 μL/ well添加し、37℃、5% CO2条件下で30分間インキュベートを行なった。その後、1 mg/mLのCellstain Hoechst 33342溶液 (DOJINDO, Kumamoto, Japan)をDMEMで500倍に希釈した溶液を100 μL/ well添加し、37℃、5 % CO2条件下で30分間インキュベートを行なった。その後、希釈Hoechst 33345溶液を96 well plateから除去し、PBS 150 mLを添加してIN Cell Analyzer 2200 (GE Healthcare)を用いて蛍光の検出を行った。Mito Tracker Red及びMito Tracker Green、Hoechst 33342の蛍光量を測定することで細胞内のミトコンドリアの活性、数、及び面積を調べた。画像は、IN Cell Investigator High-content image analysis software (GE Healthcare)で解析した。
IN Cell Analyzer 2200を用いたROS測定
　10 mL dishに播種したサブコンフルエント状態のHaCaT細胞を、UVクロスリンカー(CL-1000 Ultraviolet Crosslinker, UVP, Upland, CA,USA) 内でディッシュのフタを外した状態でUVB10 mJ/cm2により照射を行い、その後はすぐに10% FBS含有DMEM培地10 mLを入れて37℃、5% CO2存在下でインキュベートした。また、無処理の細胞にはUVBを照射せず培地の交換のみを行った。24時間後にNon-UVBとUVB照射の細胞の培養液を捨て、1×PBSにより洗浄し、トリプシンで細胞を剥がし、96ウェルプレートに3×103cellsになるように播種した。4時間後セラミド処理し、24時間インキュベートした。その後、HaCaT細胞における細胞内ROSの産生を、BES-H2O2-AC（和光純薬工業）を用いて製造者のプロトコールに従って測定した。96ウェルプレート内の培養液を除去し、細胞を4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）緩衝液（pH 7.4）で2回洗浄した。CellstainR-Hoechst 33342 solution（Dojindo）を1: 500の比率で1×PBSと混合して細胞にかけた後、室温で30分遮光静置した。その後、HEPES（pH 7.4）中の5 μM BES-H2O2-ACを1: 1000およびHoechst 33342（Dojindo）を1: 400の割合で混合し、細胞と共に37℃で60分間インキュベートし、プロトコールは「HaCaT_eGFP20190627」を使用し、IN Cell Analyzer 2200 (GE Healthcare)にて画像を取得した。画像は IN Cell Analyzer 2200 Workstation(GE Healthcare)にて解析し、ROSの発現量を調べた。
UVB誘導性老化細胞におけるセラミドのUV障害回復効果
　サブコンフルエント状態の細胞にUVBを10 mJ/cm2照射した細胞を用いて、上記「IN Cell Analyzer 2200を用いたミトコンドリア活性測定」と同様の実験を行った。
HaCaT細胞のヒト型セラミド合成評価
　10 mL dishで培養したサブコンフルエント状態のHaCaT細胞にセラミドを終濃度5 μMとなるようにサンプル添加を行った。48時間後、培地を除去し、1×PBS 5mlで洗浄後、トリプシン1.5 mLを添加してディッシュ全体に浸透させ、除去した。37℃、5% CO2条件下で8分間インキュベートし、DMEMで細胞をはがし取り、15 mLチューブに細胞を集め、12000 rpmで3分間遠心することで細胞のペレットを集めた。LC-MSを用いてHaCaT細胞に含まれるセラミドの脂肪酸組成を解析した。
＜セラミドがCaco-2細胞を介してHaCaT細胞に与える影響評価：腸管におけるバリア機能の検討＞
Caco-2細胞培養
　ヒト腸管上皮細胞モデルとして、ヒト結腸癌由来細胞株CaCo-2細胞を用いた。CaCo-2細胞は、10%非働化 Fetal Bovine Serum（FBS）(56℃の恒温槽で35分間加熱することで補体を不活性化したもの)含有DMEM培地を用いて、細胞培養ディッシュ（Greiner bio-one, Tokyo, Japan）にて37℃、5 % CO2存在下で継代培養した。DMEM培地は、470 mLのMilli-Q水に対してDulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）培地「ニッスイ」（２）（日水製薬, Tokyo, Japan) 4.75 gを溶解し、0.2 M L-グルタミン(富士フィルム和光純薬, Osaka, Japan) 10 mL、5万U/mLペニシリン(Meiji Seika ファルマ, Tokyo, Japan) 1 mL、0.05 mg/mLストレプトマイシン(Meiji Seika ファルマ) 0.5 mL、10% NaHCO3 (富士フィルム和光純薬) 6 mLを添加し、作製した。
IN Cell Analyzer 2200を用いたミトコンドリア活性測定（Caco-2細胞→HaCaT細胞）
　Caco-2細胞を1.0×102 cells/mLで24 well plate(Corning, NY, USA)に播種した。24時間後、終濃度5 μMのセラミドを添加し、24時間培養した。6.0×104  cells/mLで96 well plateに播種し、24時間インキュベートしたHaCaT細胞の培養液を50 μL除去し、そこにCaco-2細胞の培養液を50 μL添加した。その48時間後、上記「IN Cell Analyzer 2200を用いたミトコンドリア活性測定」に記載の方法と同様の方法でHaCaT細胞のミトコンドリア数・面積、ミトコンドリア膜電位活性を測定した。
IN Cell Analyzer 2200を用いたROS測定（Caco-2細胞→HaCaT細胞）
　Caco-2細胞を1.0×102 cells/mL で24 well plate(Corning, NY, USA)に播種した。24時間後、終濃度5 μMのセラミドを添加し、24時間培養した。6.0×104  cells/mLで96 well plateに播種し、24時間インキュベートしたHaCaT細胞の培養液を50 μL除去し、そこにCaco-2細胞の培養液を50 μL添加した。その48時間後、上記「IN Cell Analyzer 2200を用いたROS測定」に記載の方法と同様の方法でHaCaT細胞のROSを測定した。
UVB誘導性老化細胞におけるセラミドのUV障害回復効果（Caco-2細胞→HaCaT細胞）
　Caco-2細胞を1.0×102 cells/mLで24 well plate(Corning, NY, USA)に播種した。24時間後、終濃度5 μMのセラミドを添加し、24時間培養した。
　サブコンフルエント状態のHaCaT細胞にUVBを10 mJ/cm2照射し、6.0×104  cells/mLで96 well plateに播種した。24時間後、HaCaT細胞の培養液を50 μL除去し、そこにCaco-2細胞の培養液を50 μL添加した。48時間後、「UVB誘導性老化細胞におけるセラミドのUV障害回復効果」に記載の方法と同様の方法でHaCaT細胞のミトコンドリア数・面積、ミトコンドリア膜電位活性を測定した。
Transepithelial Electrical Resistance （TER）測定
　24 wellプレートにCell Culture Insert (FALCON)をセットした。Caco-2細胞を2.0 × 105 cells/wellで播種し、48時間後にカルノシンを10 mMとなるように添加した。3日間間隔で添加して、2週間培養を行なった。
　経上皮電気抵抗値の測定にはMillicell ERS-2（日本ミリポア, 東京）を用いた。実験前にMillicell ERS-2に電極をセットし、70％エタノール溶液に電極を10分間浸して殺菌消毒をし、その後電極を乾燥させてDMEM培地に浸した。次に、Cell Culture Insertの内側と外側にそれぞれ電極を挿入して測定を行った。測定値の計算は以下の式を参考に行なった。
　TER (Ω・cm2) = (測定値-blank)×(インサート面積)  
［検討結果］
IN Cell Analyzer 2200を用いたミトコンドリア活性測定
　HaCaT細胞をセラミドで48時間処理した際の1細胞あたりのミトコンドリアの数、面積(Mitotracker Green)及びミトコンドリア膜電位活性(Mitotracker Red)をIN Cell Analyzer 2200を用いて測定した。グリコシルセラミド、合成セラミド、醤油粕セラミド、麹菌セラミド、アビアンセラミド、非ナノ化セラミドはHaCaTのミトコンドリア数を有意に増加させた。グリコシルセラミド、醤油粕セラミド、麹菌セラミド、アビアンセラミドがHaCaTのミトコンドリア面積を有意に増加させた。 (図１)
IN Cell Analyzer 2200を用いたROS測定
　HaCaT細胞に10 mJ/cm2のUVB照射をしたのちに、セラミドで24時間処理した際のROSレベルをIN Cell Analyzer 2200を用いて測定した。その結果、麹菌セラミドのみがROSを有意に減少させた。(図２)
IN Cell Analyzer 2200によるミトコンドリア活性回復効果
　HaCaT細胞に10 mJ/cm2のUVB照射をしたのちに、セラミドで48時間処理した際の1細胞あたりのミトコンドリアの数・面積(Mitotracker Green)及びミトコンドリア膜電位活性(Mitotracker Red)をIN Cell Analyzer 2200を用いて測定した。 (図３)
LC-MSを用いた天然ヒト型セラミドのヒト型セラミド合成評価
　サブコンフルエント状態のHaCaT細胞をセラミドで48時間処理し、LC-MSを用いてHaCaT細胞の脂肪酸組成を測定した。その結果、醤油粕セラミド、麹菌セラミド、アビアンセラミドを添加したHaCaT細胞において、炭素数24の長鎖脂肪酸を持つヒト型セラミドが有意に増加した。(図４)
IN Cell Analyzer 2200を用いたミトコンドリア活性測定（Caco-2細胞→HaCaT細胞）
　Caco-2細胞をセラミドで24時間処理し、その上清をHaCaT細胞に添加し48時間処理した際の1細胞あたりのミトコンドリアの数・面積(Mitotracker Green)及びミトコンドリア膜電位活性(Mitotracker Red)をIN Cell Analyzer 2200を用いて測定した。 (図５)
IN Cell Analyzer 2200を用いたROS測定（Caco-2細胞→HaCaT細胞）
　Caco-2細胞をセラミドで24時間処理し、その上清を10 mJ/cm2のUVB照射をしたHaCaT細胞に添加し24時間処理した際のROSレベルをIN Cell Analyzer 2200を用いて測定した。その結果、麹菌セラミド、ナノ化セラミドがROSを有意に減少させた。(図６)
IN Cell Analyzer 2200によるミトコンドリア活性回復効果（Caco-2細胞→HaCaT細胞）
　Caco-2細胞をセラミドで24時間処理し、その上清を10 mJ/cm2のUVB照射をしたHaCaT細胞に添加し24時間処理した際の1細胞あたりのミトコンドリアの数・面積(Mitotracker Green)及びミトコンドリア膜電位活(Mitotracker Red)をIN Cell Analyzer 2200を用いて測定した。 (図７)
天然ヒト型セラミドのCaCo-2細胞におけるバリア機能増強評価
内在性Claudin3発現量の測定（Caco-2細胞）
　Caco-2細胞をセラミドで24時間処理した際の内在性Claudin3発現量を定量RT-PCRで測定した。その結果、グリコシルセラミド、アビアンセラミドを添加したCaco-2においてClaudin3が有意に増強された。(図８)

Claims (10)

  1. 鶏脚エタノール抽出セラミド組成物。
  2. ω－Ｏ－アシルセラミドを含有する、請求項１に記載の組成物。
  3. 含有されるω－Ｏ－アシルセラミドがＥＯＳ型であり、かつ末端アシル基がリノール酸基である、請求項２に記載の組成物。
  4. 含有されるセラミドのうち、０．１～２質量％がω－Ｏ－アシルセラミドである、請求項２又は３に記載の組成物。
  5. 上皮バリア強化用である、請求項１又は２に記載の組成物。
  6. 皮膚バリア強化用若しくは腸管バリア強化用である、請求項１又は２に記載の組成物。
  7. 紫外線による皮膚へのダメージをケアするための、請求項６に記載の皮膚バリア強化用組成物。
  8. 腸管上皮細胞タイトジャンクション強化のための、請求項６に記載の腸管バリア強化用組成物。
  9. 含有されるセラミドのうち、９０質量％以上が、セラミド骨格が（ヒドロキシル基を２個有し、炭素数１８で、炭素間二重結合を１個有するスフィンゴイド塩基）－（炭素数１６～３４、炭素間二重結合を０又は１個、ヒドロキシル基を０個有する脂肪酸）の組み合わせであるフリーセラミドである、請求項１又は２に記載の組成物。
  10. 含有されるセラミドのうち、９０質量％以上がセラミドＮＳである、請求項１又は２に記載の組成物。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012126910A (ja) 2010-07-23 2012-07-05 Miyanabe Masakatsu 発酵粕由来スフィンゴ脂質
KR101645917B1 (ko) * 2016-02-02 2016-08-12 양형열 관절건강에 도움이 되는 한약재 및 그의 제조방법
WO2019049964A1 (ja) * 2017-09-07 2019-03-14 株式会社ジェヌインＲ＆Ｄ 抗疲労経口組成物
JP2020097539A (ja) * 2018-12-18 2020-06-25 株式会社ジェヌインＲ＆Ｄ セラミド分散組成物

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190006027A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Accenture Global Solutions Limited Automatic identification and extraction of medical conditions and evidences from electronic health records

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012126910A (ja) 2010-07-23 2012-07-05 Miyanabe Masakatsu 発酵粕由来スフィンゴ脂質
KR101645917B1 (ko) * 2016-02-02 2016-08-12 양형열 관절건강에 도움이 되는 한약재 및 그의 제조방법
WO2019049964A1 (ja) * 2017-09-07 2019-03-14 株式会社ジェヌインＲ＆Ｄ 抗疲労経口組成物
JP2020097539A (ja) * 2018-12-18 2020-06-25 株式会社ジェヌインＲ＆Ｄ セラミド分散組成物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FATYASARI NATA IRYANTI, IRAWAN CHAIRUL, RAMADHAN LAZUARDI, RIZKY RAMADHANI MUHAMMAD: "Influence of Soy Protein Isolate on Gelatin-based Edible Film Properties", MATEC WEB OF CONFERENCES, vol. 156, 1 January 2018 (2018-01-01), pages 01014, XP093060626, DOI: 10.1051/matecconf/201815601014 *
ROBSON K. J ET AL., J. LIPID RES, vol. 35, 1994, pages 2060

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