WO2023063763A1 - L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산방법 - Google Patents

L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산방법 Download PDF

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WO2023063763A1
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microorganism
arginine
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seq
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장진숙
김효경
최선형
이지원
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씨제이제일제당 (주)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/10—Citrulline; Arginine; Ornithine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • the present application relates to an L-arginine producing microorganism in which the activity of a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is attenuated; And it relates to a method for producing L-arginine.
  • L-arginine is used for medicine such as liver function promoter, brain function promoter, and comprehensive amino acid preparation, and it is also in the spotlight recently for food such as fish cake additive, health drink additive, and salt substitute for hypertensive patients.
  • the problem to be solved by the present application is to provide a recombinant microorganism of the genus Corynebacterium that produces L-arginine, a method for producing L-arginine using the same, and a use thereof.
  • One object of the present application is to provide a recombinant microorganism of the genus of Corynebacterium that produces L-arginine, in which the activity of a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is attenuated.
  • Another object of the present application is to provide a method for producing L-arginine, comprising culturing a recombinant microorganism of the genus Corynebacterium in which the activity of a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is attenuated in a medium. .
  • a microorganism of the genus Corynebacterium in which the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present application is attenuated can produce L-arginine in high yield and can be usefully used for industrial production.
  • One aspect of the present application is to provide a recombinant microorganism of the genus of Corynebacterium in which the activity of a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is attenuated.
  • the protein of the present application may have, include, consist of, or consist essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be an endogenous protein of the microorganism of the present application, but is not limited thereto.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 can be obtained from NIH GenBank, a known database.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, It may include amino acid sequences that have greater than 99%, 99.5%, 99.7% or 99.9% homology or identity.
  • proteins having such homology or identity and amino acid sequences in which some sequences are deleted, modified, substituted, conservatively substituted or added are also included within the scope of the present application, as long as they are amino acid sequences showing efficacy corresponding to the proteins of the present application. is self-explanatory.
  • sequence additions or deletions naturally occurring mutations, silent mutations, or conservations to the amino acid sequence N-terminus, C-terminus, and/or within that do not alter the function of the protein of the present application. This is the case with redundant substitution.
  • conservative substitution means the substitution of one amino acid with another amino acid having similar structural and/or chemical properties.
  • the protein may have, for example, one or more conservative substitutions while still retaining one or more biological activities.
  • conservative substitutions can generally occur based on similarities in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues.
  • positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine, and histidine
  • negatively charged (acidic) amino acids include glutamic acid and arpartic acid.
  • Nonpolar amino acids among amino acids with uncharged side chains include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, and proline, and are polar or hydrophilic ( hydrophilic) amino acids include serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine, and aromatic amino acids among the amino acids include phenylalanine, tryptophan and tyrosine.
  • the term 'homology' or 'identity' refers to the degree of similarity between two given amino acid sequences or nucleotide sequences and can be expressed as a percentage.
  • the terms homology and identity are often used interchangeably.
  • Sequence homology or identity of conserved polynucleotides or proteins is determined by standard alignment algorithms, together with default gap penalties established by the program used. Substantially homologous or identical sequences are generally capable of hybridizing with all or part of the sequence under moderate or high stringent conditions. It is obvious that hybridization also includes hybridization with polynucleotides containing common codons or codons in consideration of codon degeneracy in polynucleotides.
  • GAP program can define the total number of symbols in the shorter of the two sequences divided by the number of similarly arranged symbols (i.e., nucleotides or amino acids).
  • the default parameters for the GAP program are (1) a binary comparison matrix (containing values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation , pp. 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional penalty of 0.10 for each symbol in each gap (or 10 gap opening penalty, 0.5 gap extension penalty); and (3) no penalty for end gaps.
  • a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be named NCgl1469 gene.
  • polynucleotide is a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are covalently linked in a long chain shape, and is a DNA or RNA strand of a certain length or more, more specifically, encoding the protein means a polynucleotide fragment.
  • the polynucleotide encoding the protein of the present application may include a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide of the present application may have or include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the polynucleotide of the present application may consist of or essentially consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • polynucleotides of the present application are various in the coding region within the range that does not change the amino acid sequence of the protein of the present application in consideration of codon degeneracy or codons preferred in organisms intended to express the protein of the present application. Transformations can be made.
  • the polynucleotide of the present application has 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, having or comprising 97% or more, 98% or more, and less than 100% of a nucleotide sequence, or having at least 70%, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90 or more homology or identity to the sequence of SEQ ID NO: 2; % or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, and may consist essentially of, or consist essentially of, a nucleotide sequence that is less than 100%, but is not limited thereto.
  • the polynucleotide of the present application is not limited as long as it is a probe that can be prepared from a known gene sequence, for example, a sequence that can hybridize under stringent conditions with a sequence complementary to all or part of the polynucleotide sequence of the present application.
  • the "stringent condition” means a condition that allows specific hybridization between polynucleotides. These conditions are described in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
  • polynucleotides with high homology or identity 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, Or a condition in which polynucleotides having 99% or more homology or identity hybridize and polynucleotides having lower homology or identity do not hybridize, or 60 ° C., which is a washing condition for normal southern hybridization, 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, specifically at 60 °C 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more specifically at a salt concentration and temperature corresponding to 68 °C, 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, washing once, specifically 2 to 3 times conditions can be listed.
  • Hybridization requires that two nucleic acids have complementary sequences, although mismatches between bases are possible depending on the stringency of hybridization.
  • complementary is used to describe the relationship between nucleotide bases that are capable of hybridizing to each other. For example, with respect to DNA, adenine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine.
  • the polynucleotides of the present application may also include substantially similar nucleotide sequences as well as isolated nucleic acid fragments that are complementary to the entire sequence.
  • a polynucleotide having homology or identity to the polynucleotide of the present application can be detected using hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55°C and using the above-described conditions.
  • the Tm value may be 60 ° C, 63 ° C or 65 ° C, but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by those skilled in the art according to the purpose.
  • Appropriate stringency for hybridizing the polynucleotides depends on the length of the polynucleotides and the degree of complementarity, parameters well known in the art (e.g., J. Sambrook et al., supra).
  • microorganism or strain
  • microorganism includes both wild-type microorganisms and naturally or artificially genetically modified microorganisms, and causes foreign genes to be inserted or endogenous genes to be activated or inactivated.
  • a microorganism in which a specific mechanism is weakened or enhanced due to it may be a microorganism including genetic modification (modification) for the production of a desired protein, protein or product.
  • the microorganism of the present application includes a microorganism in which a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present application is weakened or a polynucleotide encoding the same is missing; Alternatively, it may be a microorganism (eg, a recombinant microorganism) genetically modified through a vector such that the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present application is attenuated or the polynucleotide encoding it is missing, but is not limited thereto.
  • a microorganism eg, a recombinant microorganism
  • the microorganism of the present application may be a microorganism capable of producing L-arginine.
  • the microorganism of the present application may be a microorganism with increased L-arginine production ability compared to the parent strain.
  • the microorganism of the present application is a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present application in a parent strain (eg, a parent strain that naturally has L-arginine production ability or does not have L-arginine production ability), or a polynucleotide encoding the same. It may be a microorganism endowed with L-arginine-producing ability due to a lack of nucleotides, but is not limited thereto.
  • the recombinant microorganism of the present application is transformed through a vector such that the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present application is weakened or the polynucleotide encoding it is missing, A strain or microorganism in which a protein is weakened or the polynucleotide encoding the same is deficient, and the attenuated protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present application or a polynucleotide encoding the same is present in a natural wild-type microorganism or a microorganism producing L-arginine.
  • the L-arginine-producing ability may be a natural wild-type microorganism or a microorganism having an increased protein or polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 compared to an unmodified microorganism, but is not limited thereto.
  • the non-modified microorganism or parent strain which is a target strain for comparing the increase in the L-arginine production ability
  • the recombinant strain with increased production capacity is about 1% or more, specifically about 1% or more, about 2.5% or more, about 5% or more, about 6% or more, about 7% or more, about 8% or more, about 9% or more, about 10% or more, about 10.5% or more, about 11% or more, about 11.5% or more, about 12% or more, about 12.5% or more, about 13% or more, about 13.5% or more, or about 14% or more (the upper limit is not particularly limited, for example, about 200% or less, about 150% or less, about 100% or less, about 50% or less, about 40% or less, about 30% or less) % or less or about 25% or less) may be increased, but is not limited thereto as long as it has an increased amount of + value compared to the production capacity of the parent strain or unmodified microorganism before mutation.
  • the recombinant strain having increased production capacity has an L-arginine production capacity of about 1.1 times, about 1.12 times, about 1.13 times or more, or about 1.14 times or more (the upper limit is a special There is no limitation, for example, about 10 times or less, about 5 times or less, about 3 times or less, or about 2 times or less) may be increased, but is not limited thereto.
  • the term “about” includes all ranges of ⁇ 0.5, ⁇ 0.4, ⁇ 0.3, ⁇ 0.2, ⁇ 0.1, etc., and includes all ranges equivalent to or similar to the ranges following the term “about”. Not limited.
  • the term "unmodified microorganism” does not exclude strains containing mutations that may occur naturally in microorganisms, and are wild-type strains or wild-type strains themselves, or are genetically modified by natural or artificial factors. It may mean a strain before change.
  • the unmodified microorganism may refer to a microorganism before a weakening of a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 described herein or a polynucleotide encoding the same is lost.
  • the "unmodified microorganism” may be used interchangeably with “strain before transformation”, “microorganism before transformation”, “non-mutated strain”, “unmodified strain”, “non-mutated microorganism” or “reference microorganism”.
  • the microorganisms of the genus Corynebacterium of the present application include Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, and Corynebacterium deserti ( Corynebacterium deserti), Corynebacterium efficiens, Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis, Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium It may be Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris or Corynebacterium flavescens.
  • the recombinant microorganism of the present application may be a microorganism lacking all or part of a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the microorganism of the present application may be a microorganism in which the activity of an arginine repressor (ArgR) is further weakened.
  • the microorganism of the present application may be a microorganism in which all or part of the argR gene is further deleted.
  • the ArgR may include a polypeptide described in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the argR gene may include the polynucleotide described in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14, but is not limited thereto.
  • the microorganism of the present application is a strain or Corynebacterium glutamicum in which the NCgl1469 gene is deleted in Corynebacterium glutamicum KCCM10741P (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999) It may be a strain in which the NCgl1469 gene is deleted in CJ1R.
  • the microorganism of the present application may include ArgF (ornithine carbamoyltransferase subunit F), a polynucleotide encoding the ArgF, or an argF gene.
  • ArgF of the present application may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15.
  • the argF gene of the present application may consist of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16.
  • the term "attenuation" of a protein is a concept that includes both decreased activity or no activity compared to intrinsic activity.
  • the attenuation may be used interchangeably with terms such as inactivation, deficiency, down-regulation, decrease, reduce, and attenuation.
  • the attenuation is when the activity of the protein itself is reduced or eliminated compared to the activity of the protein originally possessed by the microorganism due to mutation of the polynucleotide encoding the protein, inhibition of gene expression or translation into protein of the polynucleotide encoding it.
  • the overall protein activity level and/or concentration (expression level) in the cell is lower than that of the native strain due to inhibition of translation, etc., when the polynucleotide is not expressed at all, and/or when the polynucleotide is expressed Even if it is, it may also include the case where there is no activity of the protein.
  • the "intrinsic activity” refers to the activity of a specific protein originally possessed by the parent strain, wild-type or unmodified microorganism before the transformation, when the character is changed due to genetic mutation caused by natural or artificial factors. This may be used interchangeably with “activation before transformation”. "Inactivation, depletion, reduction, downregulation, reduction, attenuation" of a protein's activity compared to its intrinsic activity means that it is lower than the activity of a specific protein originally possessed by the parent strain or non-transformed microorganism before transformation.
  • Attenuation of the activity of such a protein may be performed by any method known in the art, but is not limited thereto, and may be achieved by applying various methods well known in the art (e.g., Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).
  • modification of the gene sequence encoding the protein such that the activity of the protein is eliminated or attenuated e.g., one or more nucleotides on the nucleotide sequence of the protein gene to encode the modified protein such that the activity of the protein is eliminated or attenuated) deletion / substitution / addition of);
  • an antisense oligonucleotide eg, antisense RNA
  • an antisense oligonucleotide that binds complementarily to the transcript of the gene encoding the protein
  • It may be a combination of two or more selected from 1) to 8), but is not particularly limited thereto.
  • Deletion of part or all of the gene encoding the protein may include removal of the entire polynucleotide encoding the endogenous target protein in the chromosome, replacement with a polynucleotide in which some nucleotides are deleted, or replacement with a marker gene.
  • modification of the expression control region is a deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, resulting in mutations in the expression control region (or expression control sequence), or weaker It may be a replacement with an active sequence.
  • the expression control region includes, but is not limited to, a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence controlling termination of transcription and translation.
  • the above 3) modification of the nucleic acid base sequence encoding the initiation codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the protein encodes another initiation codon with a lower expression rate of the protein compared to the endogenous initiation codon, for example. It may be substituted with a nucleotide sequence to, but is not limited thereto.
  • the modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 4) and 5) may be a deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the amino acid sequence of the protein or the polynucleotide sequence encoding the protein to weaken the activity of the protein.
  • a combination thereof may be a sequence mutation, or replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have weaker activity or an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have no activity, but is not limited thereto.
  • expression of a gene may be inhibited or attenuated by introducing a mutation in a polynucleotide sequence to form a stop codon, but is not limited thereto.
  • antisense oligonucleotide e.g., antisense RNA
  • antisense RNA complementary to the transcript of the gene encoding the protein
  • the term "enhancement" of the activity of a protein means that the activity of the protein is increased compared to the intrinsic activity.
  • the enhancement may be used interchangeably with terms such as activation, up-regulation, overexpression, and increase.
  • activation, enhancement, upregulation, overexpression, and increase may include those that exhibit an activity that was not originally possessed, or those that exhibit enhanced activity compared to intrinsic activity or activity before modification.
  • the "intrinsic activity” refers to the activity of a specific protein originally possessed by a parent strain or unmodified microorganism before transformation when a character is changed due to genetic mutation caused by natural or artificial factors. This may be used interchangeably with “activation before transformation”.
  • “Enhancement”, “upregulation”, “overexpression” or “increase” of the activity of a protein compared to its intrinsic activity means the activity and/or concentration (expression amount) is improved.
  • the enhancement can be achieved by introducing an exogenous protein or enhancing the activity and/or concentration (expression level) of an endogenous protein. Whether or not the activity of the protein is enhanced can be confirmed from an increase in the activity level, expression level, or amount of a product released from the protein.
  • Enhancement of the activity of the protein can be applied by various methods well known in the art, and is not limited as long as the activity of the target protein can be enhanced compared to that of the microorganism before transformation. Specifically, it may be using genetic engineering and / or protein engineering, which is well known to those skilled in the art, which is a routine method of molecular biology, but is not limited thereto (e.g., Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).
  • modification of the polynucleotide sequence encoding the protein to enhance the protein activity eg, modification of the polynucleotide sequence of the protein gene to encode the modified protein to enhance the activity of the protein
  • It may be a combination of two or more selected from 1) to 8), but is not particularly limited thereto.
  • the increase in the intracellular copy number of the polynucleotide encoding the protein is caused by the introduction of a vector into the host cell that can replicate and function independently of the host, to which the polynucleotide encoding the protein is operably linked. may be achieved. Alternatively, it may be achieved by introducing 1 copy or 2 copies or more of the polynucleotide encoding the protein into the chromosome of the host cell.
  • the introduction into the chromosome may be performed by introducing a vector capable of inserting the polynucleotide into the chromosome of the host cell into the host cell, but is not limited thereto. The vector is as described above.
  • the expression control region may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • the original promoter may be replaced with a strong promoter, but is not limited thereto.
  • Examples of known strong promoters include the CJ1 to CJ7 promoter (US Patent US 7662943 B2), lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, tet promoter, gapA promoter, SPL7 promoter, SPL13 (sm3) promoter (US Patent US 10584338 B2), O2 promoter (US Patent US 10273491 B2), tkt promoter, yccA promoter, etc., but are not limited thereto.
  • nucleic acid base sequence modification encoding the initiation codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the protein is, for example, a nucleic acid base encoding another initiation codon with a higher protein expression rate compared to the endogenous initiation codon It may be substituted with a sequence, but is not limited thereto.
  • Modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 4) and 5) above may include deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the amino acid sequence of the protein or the polynucleotide sequence encoding the protein to enhance the activity of the protein.
  • the combination thereof may be a sequence mutation, or replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have stronger activity, or an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to increase activity, but is not limited thereto.
  • the replacement may be specifically performed by inserting the polynucleotide into a chromosome by homologous recombination, but is not limited thereto.
  • the vector used at this time may further include a selection marker for checking whether the chromosome is inserted.
  • the selectable marker is as described above.
  • Introduction of the foreign polynucleotide exhibiting the activity of the protein may be introduction of a foreign polynucleotide encoding a protein exhibiting the same/similar activity to the protein into the host cell.
  • the foreign polynucleotide is not limited in origin or sequence as long as it exhibits the same/similar activity as the protein.
  • the method used for the introduction can be performed by appropriately selecting a known transformation method by a person skilled in the art, and expression of the introduced polynucleotide in a host cell can produce a protein and increase its activity.
  • Codon optimization of polynucleotides encoding proteins is codon optimization of endogenous polynucleotides to increase transcription or translation in host cells, or optimization of transcription and translation of exogenous polynucleotides in host cells. It may be that the codons of this have been optimized.
  • Analyzing the tertiary structure of a protein to select and modify or chemically modify the exposed site for example, by comparing the sequence information of the protein to be analyzed with a database in which sequence information of known proteins is stored, depending on the degree of sequence similarity. It may be to determine a template protein candidate according to the method, confirm the structure based on this, and modify or modify an exposed portion to be chemically modified to be modified or modified.
  • Such enhancement of protein activity is an increase in the activity or concentration of the corresponding protein based on the activity or concentration of the protein expressed in the wild-type or unmodified microbial strain, or an increase in the amount of a product produced from the protein. It may be, but is not limited thereto.
  • the term "vector” includes a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the target polypeptide operably linked to a suitable expression control region (or expression control sequence) so as to express the target polypeptide in a suitable host. DNA preparations may be included.
  • the expression control region may include a promoter capable of initiating transcription, an arbitrary operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation. After transformation into a suitable host cell, the vector can replicate or function independently of the host genome and can integrate into the genome itself.
  • Vectors used in the present application are not particularly limited, and any vectors known in the art may be used.
  • Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A can be used as phage vectors or cosmid vectors, and pDZ-based, pBR-based, and pUC-based plasmid vectors , pBluescriptII-based, pGEM-based, pTZ-based, pCL-based, pET-based, etc. can be used.
  • pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors and the like can be used.
  • a polynucleotide encoding a target polypeptide may be inserted into a chromosome through a vector for chromosomal insertion into a cell. Insertion of the polynucleotide into the chromosome may be performed by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
  • a selection marker for determining whether the chromosome is inserted may be further included.
  • the selectable marker is used to select cells transformed with a vector, that is, to determine whether a target nucleic acid molecule has been inserted, and can exhibit selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or surface polypeptide expression. markers may be used. In an environment treated with a selective agent, only cells expressing the selectable marker survive or exhibit other expression traits, so transformed cells can be selected.
  • the term "transformation” means introducing a vector containing a polynucleotide encoding a target polypeptide into a host cell or microorganism so that the polypeptide encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • the transformed polynucleotide can be expressed in the host cell, it may be inserted into and located in the chromosome of the host cell or located outside the chromosome.
  • the polynucleotide includes DNA and/or RNA encoding a polypeptide of interest.
  • the polynucleotide may be introduced in any form as long as it can be introduced and expressed into a host cell.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a genetic construct containing all elements required for self-expression.
  • the expression cassette may include a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in its own form and operably linked to a sequence necessary for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • operably linked means that the polynucleotide sequence is functionally linked to a promoter sequence that initiates and mediates transcription of the polynucleotide encoding the target protein of the present application.
  • Modification of some or all of the polynucleotides in the microorganism of the present application is (a) genome editing using homologous recombination or genetic scissors (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9) using a vector for chromosomal insertion into the microorganism and / or (b) It may be induced by light and/or chemical treatment, such as ultraviolet light and radiation, but is not limited thereto.
  • a method of modifying part or all of the gene may include a method using DNA recombination technology.
  • a part or all of a gene may be deleted by injecting a nucleotide sequence or vector containing a nucleotide sequence homologous to a target gene into the microorganism to cause homologous recombination.
  • the injected nucleotide sequence or vector may include a dominant selection marker, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present application provides a method for producing L-arginine, comprising culturing a recombinant microorganism of the genus Corynebacterium in which the activity of a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is attenuated in a medium.
  • Proteins, weakened organisms and microorganisms comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are as described in the other aspects.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium may be Corynebacterium glutamicum, but is not limited thereto.
  • the microorganism may have an arginine transcriptional repressor (ArgR) activity further weakened or an argR gene may be further deleted, but is not limited thereto, as described in another aspect.
  • ArgR arginine transcriptional repressor
  • the term "cultivation” means growing a microorganism of the genus Corynebacterium of the present application under appropriately controlled environmental conditions.
  • the culture process of the present application may be performed according to suitable media and culture conditions known in the art. This culturing process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected strain. Specifically, the culture may be batch, continuous and/or fed-batch, but is not limited thereto.
  • the term "medium” refers to a material in which nutrients required for culturing microorganisms of the genus Corynebacterium of the present application are mixed as main components, including water essential for survival and growth, as well as nutrients and growth supplies, etc.
  • any medium and other culture conditions used for culturing microorganisms of the genus Corynebacterium of the present application may be used without particular limitation as long as they are mediums used for culturing common microorganisms, but any medium used for culturing microorganisms of the genus Corynebacterium of the present application
  • Microorganisms can be cultured while controlling temperature, pH, etc. under aerobic conditions in a conventional medium containing appropriate carbon sources, nitrogen sources, phosphorus, inorganic compounds, amino acids, and/or vitamins.
  • culture media for microorganisms of the genus Corynebacterium can be found in the literature ["Manual of Methods for General Bacteriology” by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)].
  • Examples of the carbon source in the present application include carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, sucrose, and maltose; sugar alcohols such as mannitol and sorbitol; organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid and the like; Amino acids such as glutamic acid, methionine, lysine, and the like may be included.
  • natural organic nutrients such as starch hydrolysate, molasses, blackstrap molasses, rice winter, cassava, sorghum pomace and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pretreated molasses (i.e. converted to reducing sugar).
  • Carbohydrates such as molasses
  • other carbon sources in an appropriate amount may be used in various ways without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more, but are not limited thereto.
  • nitrogen source examples include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate; Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, etc., organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolysate, fish or degradation products thereof, defatted soybean cake or degradation products thereof, etc. can be used These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more, but are not limited thereto.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate
  • Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, etc.
  • organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine,
  • the number of persons may include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • the inorganic compound sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, etc. may be used, and amino acids, vitamins, and/or appropriate precursors may be included. These components or precursors may be added to the medium either batchwise or continuously. However, it is not limited thereto.
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid and the like may be added to the medium in an appropriate manner to adjust the pH of the medium.
  • an antifoaming agent such as a fatty acid polyglycol ester.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the medium, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected without gas injection or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected to maintain the anaerobic and non-aerobic state. It is not.
  • the culture temperature may be maintained at 20 to 45 ° C, specifically 25 to 40 ° C, and may be cultured for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
  • L-arginine produced by the culture of the present application may be secreted into the medium or remain in the cells.
  • the L-arginine production method of the present application includes preparing a microorganism of the genus Corynebacterium of the present application, preparing a medium for culturing the microorganism, or a combination thereof (in any order) , For example, prior to the culturing step, it may be further included.
  • the method for producing L-arginine of the present application may further include a step of recovering L-arginine from the cultured medium (cultured medium) or the cultured medium Corynebacterium genus microorganism.
  • the recovering step may be further included after the culturing step.
  • the recovery may be to collect the desired L-arginine using a suitable method known in the art according to the culture method of the microorganism of the present application, for example, a batch, continuous or fed-batch culture method.
  • a suitable method known in the art according to the culture method of the microorganism of the present application, for example, a batch, continuous or fed-batch culture method.
  • affinity may be used in combination with various chromatography such as doe chromatography, HPLC, or these methods, and the desired L-arginine may be recovered from a medium or microorganism using a suitable method known in the art.
  • the L-arginine production method of the present application may additionally include a purification step.
  • the purification may be performed using suitable methods known in the art.
  • the recovery step and the purification step are performed continuously or discontinuously regardless of order, or simultaneously or integrated into one step. It can be performed, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present application is a Corynebacterium genus microorganism in which the activity of a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present application is attenuated; medium in which it was cultured; Or to provide a composition for preparing L- arginine comprising a combination thereof.
  • composition of the present application may further include any suitable excipient commonly used in amino acid production compositions, and such an excipient may be, for example, a preservative, a wetting agent, a dispersing agent, a suspending agent, a buffer, a stabilizer, or an isotonic agent. However, it is not limited thereto.
  • proteins, weakened substances, microorganisms, cultures, and media containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are as described in the other embodiments above.
  • Another aspect of the present application provides a method for producing a microorganism of the genus Corynebacterium, comprising the step of attenuating the activity of a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Another aspect of the present application provides a use of a microorganism of the genus Corynebacterium for producing L-arginine, in which the activity of a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is attenuated.
  • the protein, attenuation and microorganism containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are as described in the other aspects above. .
  • the plasmid obtained using EZ-Tn5TM ⁇ R6K ⁇ ori/KAN-2>Tnp TransposomeTM Kit (Epicentre) was transformed into Corynebacterium glutamicum KCCM10741P (US 8034602 B2). Transformed with the electric pulse method (Appl. Microbiol. Biothcenol. (1999) 52: 541-545) as a parent strain, and spread on a complex plate medium containing kanamycin (25 mg/l) to secure about 20,000 colonies. did
  • Glucose 10 g Peptone 10 g, Beef extract 5 g, Yeast extract 5 g, Brain Heart Infusion 18.5 g, NaCl 2.5 g, Urea 2 g, Sorbitol 91 g, Agar 20 g (based on 1 liter of distilled water)
  • Glucose 60g Ammonium sulfate 45g, Magnesium sulfate heptahydrate 2g, Potassium phosphate monobasic 2g, Ammonium chloride 10g, Biotin 0.01mg, Thiamine-HCl 0.1mg, Calcium pantothenate 2mg, Nicotinamide 3mg, Ferrous sulfate 10mg, Manganese sulfate 10mg , zinc sulfate 0.02mg, copper sulfate 0.5mg, calcium carbonate 30 g (based on 1 liter of distilled water).
  • KCCM10741P/mt-7 was finally selected as a strain with significantly improved L-arginine production ability.
  • the genomic DNA of KCCM10741P/mt-7 was extracted, cut, linked, transformed into E. coli DH5 ⁇ , and plated on LB solid medium containing kanamycin (25 mg/l). After selecting 20 transformed colonies, a plasmid containing a part of an unknown gene was obtained, and primer 1 (SEQ ID NO: 3) and primer 2 (SEQ ID NO: 3) of EZ-Tn5TM ⁇ R6K ⁇ ori/KAN-2> Tnp TransposomeTM Kit
  • SEQ ID NO: 4 primer 1 (SEQ ID NO: 3) and primer 2 (SEQ ID NO: 3) of EZ-Tn5TM ⁇ R6K ⁇ ori/KAN-2> Tnp TransposomeTM Kit
  • a recombinant vector for deleting the NCgl1469 gene was constructed on the chromosome of a strain of the genus Corynebacterium.
  • primers 3 to 6 were synthesized to prepare a fragment for the deletion of the gene, and these are shown in Table 3.
  • Primer 3 (SEQ ID NO: 5) TCGAGCTCGGTACCC TCAGTGCTCCAACTGCTTG Primer 4 (SEQ ID NO: 6) CTTCAGGGGGATACCAGAATAGCGAAATGAAAAG Primer 5 (SEQ ID NO: 7) CTGGTATCCCCCCTGAAGGCGATTTAAGGGGTCGA Primer 6 (SEQ ID NO: 8) CTCTAGAGGATCCCC GCAGGGGAGTTTGAAAAAC
  • PCR using wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC13869 gDNA as a template using primer pairs of SEQ ID NOs: 5 and 6 and primer pairs of SEQ ID NOs: 7 and 8 to construct a vector deficient in the ORF region based on SEQ ID NO: 2 was performed. At this time, PCR was performed under conditions of denaturation at 95 ° C for 5 minutes, denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, and polymerization at 72 ° C for 30 seconds repeated 30 times, followed by polymerization at 72 ° C for 5 minutes.
  • PCR was denatured at 94°C for 5 minutes, followed by 30 cycles of 95°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, and 72°C for 1 minute, followed by 5 minutes at 72°C.
  • the pDCM2 vector (Korean Publication No. 10-2020-0136813) was treated with smaI, and the PCR product obtained above was subjected to fusion cloning.
  • In-Fusion® HD cloning kit (Clontech) was used.
  • the plasmid obtained as a result of the cloning was named pDCM2- ⁇ NCgl1469.
  • Corynebacterium glutamicum KCCM10741P an L-arginine producing strain, was transformed by homologous recombination on the chromosome using pDCM2- ⁇ NCgl1469 (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999).
  • the composition of the seed medium and production medium is as follows, respectively.
  • Glucose 20g Ammonium sulfate 45g, Magnesium sulfate heptahydrate 2g, Potassium phosphate monobasic 2g, Ammonium chloride 10g, Biotin 0.01mg, Thiamine-HCl 0.1mg, Calcium pantothenate 2mg, Nicotinamide 3mg Ferrous sulfate 10mg, Manganese sulfate 10mg, Zinc sulfate 0.02mg, copper sulfate 0.5mg, (based on 1 liter of distilled water).
  • Glucose 60g Ammonium sulfate 45g, Magnesium sulfate heptahydrate 2g, Potassium phosphate monobasic 2g, Ammonium chloride 10g, Biotin 0.01mg, Thiamine-HCl 0.1mg, Calcium pantothenate 2mg, Nicotinamide 3mg, Ferrous sulfate 10mg, Manganese sulfate 10mg , zinc sulfate 0.02mg, copper sulfate 0.5mg, calcium carbonate 30 g (based on 1 liter of distilled water).
  • KCCM10741P- ⁇ increased the L-arginine production ability by an average of 19.8% compared to the parent strain.
  • a strain producing L-arginine was prepared by introducing one mutation (argR gene defect, hereinafter referred to as ⁇ argR) into a wild strain of Corynebacterium glutamicum (ATCC13869).
  • the recombinant vector for ⁇ argR was prepared in the same manner as in Example 4, and the primers used for vector construction are shown in Table 5.
  • Primer 7 TCGAGCTCGGTACCC AGCAGGCCTTAAGGGTAAG Primer 8 (SEQ ID NO: 10) AGGGGCGCTGTCTTACCTCGGCTGGTGGGCCAGC Primer 9 (SEQ ID NO: 11) GGTAAGACAGCGCCCCTAGTTCAAGGCTTGTTAATC Primer 10 (SEQ ID NO: 12) CTCTAGAGGATCCCC ACCGTTGAACTGCTTGCCAG
  • the plasmid was named pDCM2- ⁇ argR.
  • the Corynebacterium glutamicum wild strain ATCC13869 was transformed in the same manner as in Example 5 using pDCM2- ⁇ argR, and the chromosome of the transformant was subjected to PCR using primers 7 and 10.
  • a strain lacking argR was identified and named as Corynebacterium glutamicum CJ1R.
  • a strain in which the NCgl1469 gene was deleted was prepared in the same manner as in Example 5 for the Corynebacterium glutamicum CJ1R and named CJ1R- ⁇ NCgl1469.
  • the CJ1R- ⁇ NCgl1469 was cultured in the same manner as in Example 5, and after the culture was completed, the L-arginine production ability was measured by HPLC (Waters 2478) and is shown in Table 6 below.
  • CJ1R- ⁇ increased the L-arginine production ability by an average of 19.7% compared to the parent strain CJ1R.

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Abstract

본 출원은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 약화된, L-아르기닌 생산 미생물 및 이를 이용한, L-아르기닌 제조방법에 관한 것이다.

Description

L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-아르기닌 생산방법
본 출원은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 활성이 약화된, L-아르기닌 생산 미생물; 및 L-아르기닌의 제조방법에 관한 것이다.
L-아르기닌(L-arginine) 은 간 기능 촉진제, 뇌기능 촉진제, 종합 아미노산 제제 등의 의약용으로 사용되고 있으며, 생선묵 첨가제, 건강음료 첨가제, 고혈압 환자의 식염 대체용 등의 식품용으로도 최근 각광받고 있는 물질이다. 산업적으로 이용 가능한 고농도의 아르기닌을 생산하기 위하여 미생물을 이용하려는 연구가 지속적으로 이루어지고 있으며, 글루타민산(glutamate) 생산 균주인 브레비박테리움(Brevibacterium) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium)속 미생물로부터 유도된 변이주를 이용하는 방법, 세포융합으로 생육 개선된 아미노산 생산 균주를 이용하는 방법 등이 보고되었다(미국등록특허공보 US 8034602 B2).
본 출원의 해결하고자 하는 과제는 L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 재조합 미생물, 이를 이용한 L-아르기닌 제조방법, 및 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 활성이 약화된, L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 (the genus of Corynebacterium) 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 활성이 약화된 코리네박테리움 속 재조합 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-아르기닌 제조방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 약화된 코리네박테리움 속 미생물은 고수율로 L-아르기닌을 생산할 수 있어 산업적 생산에 유용하게 이용될 수 있다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 출원의 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 활성이 약화된 코리네박테리움 속 (the genus of Corynebacterium) 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 단백질은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다.
본 출원에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 본 출원 미생물의 내재적 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스인 미국국립보건원 진뱅크(NIH GenBank)에서 얻을 수 있다. 본 출원에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 상기 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 출원의 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 단백질은 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 전하를 띠는 곁사슬(electrically charged amino acid)을 갖는 아미노산 중 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 알지닌, 리신, 및 히스티딘을, 음으로 하전된(산성) 아미노산은 글루탐산 및 아르파르트산을 포함하고; 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged amino acid)을 갖는 아미노산 중 비극성 아미노산(nonpolar amino acid)은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린을 포함하고, 극성(polar) 또는 친수성(hydrophilic) 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고, 상기 아미노산 중 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다.
본 출원에서 용어, '상동성 (homology)' 또는 '동일성 (identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 핵산염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
본 출원에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 NCgl1469 유전자로 명명될 수 있다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
본 출원의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1으로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산염기 서열을 포함할 수 있다. 본 출원의 일 예로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 핵산염기 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 핵산염기 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다.
본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 핵산염기 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 핵산염기 서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 핵산염기 서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ΥSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃ 0.1ΥSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1ΥSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산염기 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
본 출원에서 용어, "미생물(또는, 균주)"는 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 단백질, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.
본 출원의 미생물은 본 출원의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 약화 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결손된 미생물; 또는 본 출원의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 약화 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결손 되도록 벡터를 통해 유전적으로 변형된 미생물 (예컨대, 재조합 미생물)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 미생물은 L-아르기닌 생산능을 가진 미생물일 수 있다.
본 출원의 미생물은 모균주에 비해 L-아르기닌 생산능이 증가된 미생물일 수 있다.
본 출원의 미생물은 모균주(예컨대, 자연적으로 L-아르기닌 생산능을 가지거나 L-아르기닌 생산능이 없는 모균주)에 본 출원의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 약화 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결손되어 L-아르기닌 생산능이 부여된 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 본 출원의 재조합 미생물은, 본 출원의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 약화 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결손되도록 벡터를 통해 형질 전환되어, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 약화 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결손된 균주 또는 미생물로서, 천연의 야생형 미생물 또는 L-아르기닌을 생산하는 미생물에 본 출원의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 약화 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결손되어, L-아르기닌 생산능이 천연의 야생형 미생물 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 비변형된 미생물에 비하여 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
그 예로, 상기 L-아르기닌 생산능의 증가 여부를 비교하는 대상 균주인 비변형 미생물 또는 모균주는 ATCC13869균주 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999) 또는 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869에서 argR 유전자가 결손된 균주(예컨대, 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ1R)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 L-아르기닌 생산능에 비하여 약 1% 이상, 구체적으로는 약 1% 이상, 약 2.5% 이상, 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 10.5% 이상, 약 11% 이상, 약 11.5%이상, 약 12% 이상, 약 12.5% 이상, 약 13% 이상, 약 13.5% 이상 또는 약 14% 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 200% 이하, 약 150% 이하, 약 100% 이하, 약 50% 이하, 약 40% 이하, 약 30% 이하 또는 약 25% 이하 일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 생산능에 비해 +값의 증가량을 갖는 한, 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물에 비하여, L-아르기닌 생산능이 약 1.1배 이상, 약 1.12배 이상, 약 1.13배 이상 또는 1.14배 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 10배 이하, 약 5배 이하, 약 3배 이하, 또는 약 2배 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용어 "약(about)"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 본 명세서에 기재된 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 약화 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 결손이 되기 전의 미생물을 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 "변형 전 균주", "변형 전 미생물", "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
본 출원의 또 다른 일 예로, 본 출원의 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 재조합 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 전체 또는 일부가 결손된 미생물일 수 있다.
또한, 본 출원의 미생물은 아르기닌 전사 억제 인자(ArgR, arginine repressor)의 활성이 추가적으로 약화된 미생물일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 미생물은 argR 유전자 전체 또는 일부가 추가로 결손된 미생물일 수 있다.
상기 ArgR은 서열번호 13의 아미노산 서열로 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 argR 유전자는 서열번호 14의 핵산염기 서열로 기재된 폴리뉴클레오티드을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 본 출원의 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999)에서 NCgl1469유전자가 결손된 균주 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ1R 에서 NCgl1469유전자가 결손된 균주 일 수 있다.
또한, 본 출원의 미생물은 ArgF (Ornithine carbamoyltransferase subunit F), 상기 ArgF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 argF 유전자를 포함할 수 있다. 본 출원의 ArgF는 서열번호 15로 기재되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 또한, 본 출원의 argF 유전자는 서열번호 16으로 기재되는 핵산염기 서열로 이루어질 수 있다.
본 출원에서 용어, 단백질의 "약화"는 내재적 활성에 비하여 활성이 감소되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 약화는 불활성화(inactivation), 결핍(deficiency), 하향조절(down-regulation), 감소(decrease), 저하(reduce), 감쇠(attenuation) 등의 용어와 혼용될 수 있다.
상기 약화는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 단백질 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 단백질의 활성에 비해 감소 또는 제거된 경우, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유전자의 발현 저해 또는 단백질로의 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 단백질 활성 정도 및/또는 농도(발현량)가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 전혀 이루어지지 않은 경우, 및/또는 폴리뉴클레오티드의 발현이 되더라도 단백질의 활성이 없는 경우 역시 포함할 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주, 야생형 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 "불활성화, 결핍, 감소, 하향조절, 저하, 감쇠"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성에 비하여 낮아진 것을 의미한다.
이러한 단백질의 활성의 약화는, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다(예컨대, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 단백질의 약화는
1) 단백질을 코딩하는 유전자 전체 또는 일부의 결손;
2) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형;
3) 단백질의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 단백질을 구성하는 아미노산 서열의 변형(예컨대, 아미노산 서열 상의 1 이상의 아미노산의 삭제/치환/부가);
4) 단백질의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 단백질을 코딩하는 유전자 서열의 변형 (예를 들어, 단백질의 활성이 제거 또는 약화되도록 변형된 단백질을 코딩하도록 상기 단백질 유전자의 핵산염기 서열 상의 1 이상의 핵산염기의 삭제/치환/부가);
5) 단백질을 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 핵산염기 서열의 변형;
6) 단백질을 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입;
7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 단백질을 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가;
8) 단백질을 코딩하는 유전자 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE); 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
예컨대,
상기 1) 단백질을 코딩하는 상기 유전자 일부 또는 전체의 결손은, 염색체 내 내재적 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 전체의 제거, 일부 뉴클레오티드가 결실된 폴리뉴클레오티드로의 교체 또는 마커 유전자로 교체일 수 있다.
또한, 상기 2) 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형은, 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절영역(또는 발현조절서열) 상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 3) 단백질을 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 핵산염기 서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 단백질의 발현율이 더 낮은 다른 개시코돈을 코딩하는 핵산염기 서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은 단백질의 활성을 약화하도록 상기 단백질의 아미노산 서열 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 없도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열 내 변이를 도입하여 종결 코돈을 형성시킴으로써, 유전자의 발현을 저해하거나 약화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 6) 단백질을 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입은 예를 들어 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]을 참고할 수 있다.
상기 7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 단백질을 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가는 mRNA 번역을 불가능하게 하거나 속도를 저하시키는 것일 수 있다.
상기 8) 단백질을 코딩하는 유전자서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE)는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 전사체에 상보적인 안티센스 뉴클레오티드를 만들어 활성을 약화하는 것일 수 있다.
본 출원에서 용어, 단백질의 활성의 "강화"는, 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 활성화, 강화, 상향조절, 과발현, 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 "강화", "상향조절", "과발현" 또는 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 강화는 외래의 단백질을 도입하거나, 내재적인 단백질의 활성 강화 및/또는 농도(발현량)를 통해 달성할 수 있다. 상기 단백질의 활성의 강화 여부는 해당 단백질의 활성 정도, 발현량 또는 해당 단백질로부터 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 단백질의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 단백질의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 단백질의 강화는
1) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가;
2) 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역을 활성이 강력한 서열로 교체;
3) 단백질을 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 핵산염기 서열의 변형;
4) 단백질 활성이 강화되도록 상기 단백질의 아미노산 서열의 변형;
5) 단백질 활성이 강화도록 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 단백질의 활성이 강화되도록 변형된 단백질을 코딩하도록 상기 단백질 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);
6) 단백질의 활성을 나타내는 외래 단백질 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 단백질의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로,
*상기 1) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 해당 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터의 숙주세포 내로의 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 또는, 해당 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.
상기 2) 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일 예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 CJ1 내지 CJ7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터, yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 단백질을 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 핵산염기 서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 단백질 발현율이 더 높은 다른 개시코돈을 코딩하는 핵산염기 서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 단백질의 활성을 강화하도록 상기 단백질의 아미노산 서열 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 증가하도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 전술한 바와 같다.
상기 6) 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주세포 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 단백질이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
상기 7) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.
상기 8) 단백질의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 단백질의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.
이와 같은 단백질 활성의 강화는, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도 발현량이 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 단백질로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 핵산염기 서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위 (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 활성이 약화된 코리네박테리움 속 재조합 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-아르기닌 제조방법을 제공한다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 약화 및 미생물 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 미생물은 아르기닌 전사 억제 인자(ArgR) 활성이 추가로 약화되거나, argR 유전자가 추가로 결손된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 이에 대해서는 다른 태양에서 기재한 바와 같다.
본 출원에서, 용어 "배양"은 본 출원의 코리네박테리움 속 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 본 출원의 코리네박테리움 속 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 코리네박테리움 속 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 코리네박테리움 속 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
구체적으로, 코리네박테리움 속 미생물에 대한 배양 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 출원의 코리네박테리움 속 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에서 배양온도는 20 내지 45℃ 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에 의하여 제조된 L-아르기닌은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
본 출원의 L-아르기닌 제조방법은, 본 출원의 코리네박테리움 속 미생물을 준비하는 단계, 상기 미생물을 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 L-아르기닌 생산방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 배양에 따른 배지 코리네박테리움 속 미생물로부터 L-아르기닌을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 L-아르기닌을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 L-아르기닌을 회수할 수 있다.
또한, 본 출원의 L-아르기닌 생산방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 L-아르기닌 생산방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 활성이 약화된 코리네 박테리움 속 미생물; 이를 배양한 배지; 또는 이들의 조합을 포함하는 L-아르기닌 제조용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 조성물은 아미노산 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 조성물에서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 약화, 미생물, 배양 및 배지 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 활성을 약화하는 단계를 포함하는, 코리네박테리움 속 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 활성이 약화된, 코리네박테리움 속 미생물의 L-아르기닌 생산 용도를 제공한다.
상기 코리네박테리움 속 미생물의 제조방법 및 코리네박테리움 속 미생물의 L-아르기닌 생산 용도에 있어서 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 약화 및 미생물 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
실시예 1. 트랜스포존을 이용한 무작위적 돌연변이 라이브러리 제작 및 스크리닝
L-아르기닌 생산능이 증가된 균주를 얻기 위하여, EZ-Tn5™ <R6Kγori/KAN-2>Tnp Transposome™ Kit(Epicentre)를 사용하여 얻은 플라스미드를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P(US 8034602 B2)를 모균주로 하여 전기펄스법(Appl. Microbiol. Biothcenol.(1999)52:541-545)으로 형질전환하고, 카나마이신 (25 ㎎/ℓ)이 포함된 복합평판배지에 도말하여 약 20,000개의 콜로니를 확보하였다.
<복합평판배지 (pH 7.0)>
포도당 10 g, 펩톤 10 g, Beef extract 5 g, 효모 추출물 5 g, Brain Heart Infusion 18.5 g, NaCl 2.5 g, 요소 2 g, 소르비톨 91 g, 한천 20g (증류수 1 리터 기준)
닌하이드린 방법(Moore, S., Stein, W. H., Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids. J. Biol. Chem.1948, 176, 367-388)을 이용하여 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P 균주 대비 L-아르기닌 생산능이 향상된 상위 7종의 돌연변이주를 선별하였다.
실시예 2: 선별된 무작위적 돌연변이주들의 L-아르기닌 생산능 분석
상기 실시예 1에서 선발한 7종의 돌연변이주들을 대상으로 L-아르기닌 생산능이 재현성있게 증가된 균주들을 최종 선별하기 위하여, 하기의 배지를 이용한 플라스크 배양을 실시하였다. 배양이 완료된 후 HPLC를 이용하여 배양액 내 L-아르기닌 농도를 분석하였고, 각 돌연변이주들의 L-아르기닌 생산 농도를 하기 표 1에 나타내었다.
<생산배지 (pH 7.2)>
포도당 60g, 황산암모늄 45g, 황산마그네슘7수염 2g, 제1인산칼륨 2g, 염화암모늄 10g, 비오틴 0.01mg, 티아민-HCl 0.1mg, 판토텐산칼슘 2mg, 니코틴아마이드 3mg, 황산제1철 10mg, 황산망간 10mg, 황산아연 0.02mg, 황산구리 0.5mg, 탄산칼슘 30 g (증류수 1리터 기준).
선별한 무작위 돌연변이주 7종의 L-아르기닌 생산 농도
　 균주 L-아르기닌(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 KCCM10741P 3 3.1 3.3 3.13
1 KCCM10741P/mt-1 3.1 3 3.1 3.07
2 KCCM10741P/mt-2 3 2.9 3 2.97
3 KCCM10741P/mt-3 3.1 3 3.1 3.07
4 KCCM10741P/mt-4 2.9 3 3.2 3.03
5 KCCM10741P/mt-5 3.1 3.3 2.8 3.07
6 KCCM10741P/mt-6 2.9 3.1 3.2 3.07
7 KCCM10741P/mt-7 3.4 3.7 3.8 3.63
선별한 10종의 변이주들 중 L-아르기닌 생산능이 의미있게 향상된 균주로서 KCCM10741P/mt-7을 최종 선별하였다.
실시예 3: 최종 선별주에서의 L-아르기닌 생산능 증가 원인 규명
상기 실시예 2의 KCCM10741P/mt-7에서 트랜스포존의 무작위적인 삽입에 의해 불활성화된 유전자를 동정하였다.
구체적으로, KCCM10741P/mt-7의 Genomic DNA를 추출하여 절단한 후 연결하여 대장균 DH5α에 형질전환하고, 카나마이신 (25 mg/l)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 형질전환된 콜로니 20종을 선별한 후, 미지의 유전자 일부가 포함된 플라스미드를 획득하였고, EZ-Tn5™ <R6Kγori/KAN-2> Tnp Transposome™ Kit의 프라이머 1(서열번호 3) 및 프라이머 2(서열번호 4)를 사용하여 핵산염기 서열을 분석한 결과 미국 국립보건원의 유전자은행(NIH Genbank)에 보고된 핵산염기 서열에 근거하여 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자가 불활성화되어 있음을 알게 되었다.
프라이머 핵산염기 서열
프라이머 1(서열번호 3) ACCTACAACAAAGCTCTCATCAACC
프라이머 2(서열번호 4) CTACCCTGTGGAACACCTACATCT
야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869에서 서열번호 2를 blast search한 결과 NCgl1469 유전자임을 확인하였다.
실시예 4: NCgl1469 유전자 결손을 위한 재조합 벡터 제작
NCgl1469 유전자의 불활성화가 L-아르기닌 생산에 미치는 영향을 재확인하기 위해서 코리네박테리움 속 균주의 염색체 상에서 NCgl1469 유전자를 결손시키기 위한 재조합 벡터를 제작하였다.
먼저, 상기 유전자의 결손을 위한 단편을 제작하기 위하여 프라이머 3 내지 6을 합성하였고 이를 표 3에 나타내었다.
프라이머 핵산염기 서열
프라이머 3 (서열번호 5) TCGAGCTCGGTACCC TCAGTGCTCCAACTGCTTG
프라이머 4 (서열번호 6) CTTCAGGGGGATACCAGAATAGCGAAATGAAAAG
프라이머 5 (서열번호 7) CTGGTATCCCCCTGAAGGCGATTTAAGGGGTCGA
프라이머 6 (서열번호 8) CTCTAGAGGATCCCC GCAGGGGAGTTTGAAAAAC
서열번호 2에 근거하여 ORF 부위를 결손하는 벡터제작을 위하여 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍과 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍을 이용하여 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 gDNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 이때, PCR은 변성 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응 조건으로 수행하였다. 상기에서 얻어진 두 단편의 혼합물을 주형으로 서열번호 5 및 8의 프라이머 쌍을 이용하여 다시 오버랩핑(overlapping) PCR을 수행하여 단편을 수득하였다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 수행하였다. pDCM2 벡터(대한민국 공개번호 제 10-2020-0136813호)는 smaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 클로닝 결과로 얻은 플라스미드를 pDCM2-△NCgl1469라 명명하였다.
실시예 5: NCgl1469 유전자가 결손된 균주의 제작 및 L-아르기닌 생산능 평가-1
pDCM2-△NCgl1469을 이용하여 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P를 형질 전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999).
그 후, 4%의 수크로오스를 포함하는 고체평판배지에서 2차 재조합을 하였다. 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 프라이머 3과 프라이머 6을 이용하여 PCR법을 통하여 염색체상에서 서열번호 2의 유전자가 결손된 균주를 확인하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P-△NCgl1469라 명명하였다.
상기 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P-△NCgl1469 균주의 L-아르기닌 생산능을 분석하기 위해 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P 균주와 함께 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
하기의 종배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P와 KCCM10741P-△NCgl1469를 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 72시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
<종배지 (pH 7.2)>
포도당 20g, 황산암모늄 45g, 황산마그네슘7수염 2g, 제1인산칼륨 2g, 염화암모늄 10g, 비오틴 0.01mg, 티아민-HCl 0.1mg, 판토텐산칼슘 2mg, 니코틴아마이드 3mg 황산제1철 10mg, 황산망간 10mg, 황산아연 0.02mg, 황산구리 0.5mg, (증류수 1리터 기준).
<생산배지 (pH 7.2)>
포도당 60g, 황산암모늄 45g, 황산마그네슘7수염 2g, 제1인산칼륨 2g, 염화암모늄 10g, 비오틴 0.01mg, 티아민-HCl 0.1mg, 판토텐산칼슘 2mg, 니코틴아마이드 3mg, 황산제1철 10mg, 황산망간 10mg, 황산아연 0.02mg, 황산구리 0.5mg, 탄산칼슘 30 g (증류수 1리터 기준).
배양 종료 후 HPLC (Waters 2478)에 의해 L-아르기닌의 생산능을 측정하여 하기 표 4에 나타내었다.
　 균주 L-아르기닌(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 KCCM10741P 2.9 3.0 3.05 2.98
실험군 KCCM10741P-△NCgl1469 3.5 3.4 3.8 3.57
그 결과, KCCM10741P-β는, 모균주 대비 L-아르기닌 생산능이 평균 19.8% 증가함을 확인하였다.
실시예 6: NCgl1469 유전자가 결손된 균주의 제작 및 L-아르기닌 생산능 평가-2
L-아르기닌을 생산하는 다른 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서도 실시예 5와 동일한 효과가 있는지를 확인하였다.
구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 야생주(ATCC13869)에 1종의 변이(argR 유전자 결손, 이하 △argR로 기재)를 도입하여 L-아르기닌을 생산하는 균주를 제작 하였다.
△argR을 위한 재조합 벡터는 상기 실시예 4의 재조합벡터 제조방법과 동일한 방법으로 제작되었으며, 벡터 제작에 사용된 프라이머는 표 5과 같다.
프라이머 핵산염기 서열
프라이머 7 (서열번호 9) TCGAGCTCGGTACCC AGCAGGCCTTAAGGGTAAG
프라이머 8 (서열번호 10) AGGGGCGCTGTCTTACCTCGGCTGGTGGGCCAGC
프라이머 9 (서열번호 11) GGTAAGACAGCGCCCCTAGTTCAAGGCTTGTTAATC
프라이머 10 (서열번호 12) CTCTAGAGGATCCCC ACCGTTGAACTGCTTGCCAG
PCR을 통해 상기 목적한 유전자가 삽입된 플라스미드로 선별한 후, 이 플라스미드를 pDCM2-△argR이라 명명하였다. pDCM2-△argR을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 야생주 ATCC13869를 상기 실시예 5과 같은 방법으로 형질 전환시켰으며, 형질 전환주를 대상으로 프라이머 7과 프라이머 10을 이용하여 PCR법을 통하여 염색체상에서 argR이 결손된 균주를 확인하고 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ1R라 명명하였다. 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ1R을 대상으로 상기 실시예 5와 같은 방법으로 NCgl1469 유전자가 결손된 균주를 제작하고 CJ1R-△NCgl1469로 명명하였다.
상기 CJ1R-△NCgl1469를 상기 실시예 5과 동일한 방법으로 배양하고, 배양 종료 후 HPLC (Waters 2478)에 의해 L-아르기닌의 생산능을 측정하여 하기 표 6에 나타내었다.
　 균주 L-아르기닌(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 CJ1R 1.5 1.45 1.6 1.52
실험군 CJ1R-△NCgl1469 1.85 1.72 1.9 1.82
그 결과, CJ1R-β는 모균주 CJ1R에 비하여 L-아르기닌 생산능이 평균 19.7% 증가함을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 활성이 약화되고, L-아르기닌을 생산하는, 코리네박테리움 속 (the genus of Corynebacterium) 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 활성이 약화되지 않은 모균주에 비해 L-아르기닌 생산능이 증가된, 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가적으로 아르기닌 전사 억제 인자(arginine repressor)의 활성이 약화된, 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결손된, 미생물.
  6. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 활성이 약화된 코리네박테리움 속 재조합 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-아르기닌 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인, 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 추가적으로 아르기닌 전사 억제 인자가 약화된 것인, 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 미생물은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 핵산염기 서열이 결손된 것인, 방법.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 미생물의 L-아르기닌 생산 용도.
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