WO2023063242A1 - ＩＦＮ－γへ選択的に結合するオリゴヌクレオチドを含有する自己免疫性疾患治療薬およびそのオリゴヌクレオチド - Google Patents

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autoimmune disease
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disease
dna
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香織 原田
美幸 堀
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    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers

Definitions

  • the present invention relates to an autoimmune disease therapeutic drug containing an oligonucleotide that selectively binds to interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ) and the oligonucleotide.
  • IFN- ⁇ interferon- ⁇
  • Alopecia areata is a hair loss symptom that occurs widely, regardless of age or gender, and frequently occurs on the head. Recent studies have revealed that an autoimmune abnormality is involved in the onset of alopecia areata, and alopecia areata is now recognized as a type of autoimmune disease. Normal hair follicle tissue and its surroundings are in a tolerant environment with little expression of MHC class I and II. In contrast, in alopecia areata lesions, the expression of MHC class I and II is enhanced, and immune tolerance of hair follicles is broken.
  • activated lymphocytes mainly CD8-positive cytotoxic T cells
  • accumulated around hair follicles recognize and attack self-antigens in hair roots in the tissue of hair loss caused by alopecia areata. and has been verified by various scientific studies (Non-Patent Document 1). It has been confirmed that these activated lymphocytes overproduce interferon ⁇ (IFN- ⁇ ), and this IFN- ⁇ is known to be a factor in the onset of alopecia areata.
  • IFN- ⁇ interferon ⁇
  • MHC class II expression of dendritic cells is also enhanced around the hair follicle of alopecia areata, and the enhanced expression of these MHC class I and II leads to the onset of alopecia areata.
  • IFN- ⁇ is known as a cytokine that is a major cause of the onset of autoimmune diseases (Non-Patent Document 2), and is currently recognized as a potential target for autoimmune disease treatment.
  • Alopecia areata is caused by the binding of IFN- ⁇ , which is overproduced in the hair follicle and its surrounding area, to cell membrane receptors, which transduces signals into the cells through the activation of Janus kinase, resulting in MHC class I and II. It is believed to be caused by overexpression.
  • Non-Patent Document 3 Since hair growth is observed by inhibiting the activity of Janus kinase (Non-Patent Document 3), it is suggested that the treatment of alopecia areata, which suppresses the activity of IFN- ⁇ as a target molecule, may be useful. . Clinical studies in which anti-IFN- ⁇ antibodies were administered to patients with autoimmune diseases such as alopecia areata, rheumatoid arthritis, and multiple sclerosis for the purpose of neutralizing the activity of IFN- ⁇ showed improvement in symptoms. (Non-Patent Document 4).
  • an anti-IFN- ⁇ antibody (1) is a biologic and therefore poses a risk of biological contamination; 3) Since it is a protein formulation, it has problems such as the need for a cold chain for storage and transportation.
  • Janus kinase inhibitors include Tofacitinib (product name: Xeljanz (registered trademark)), Baricitinib (product name: Olumient (registered trademark)), Peficitinib (product name: Smyraf (registered trademark)), Upadacitinib (product name: Rinvok ( (Registered Trademark)) are applied to rheumatoid arthritis, which is an autoimmune disease, and are on the market. Since these Janus kinase inhibitors are low-molecular-weight compounds that can be produced by chemical synthesis, it is believed that they do not have the above-mentioned problems caused by being antibodies.
  • Janus kinase there are multiple subtypes of Janus kinase, including not only IFN- ⁇ receptors, but also interleukin 2 (IL-2) receptors, interleukin 4 (IL-4) receptors, interleukin It is activated by binding to the intracellular domains of multiple cytokine receptors such as 7 (IL-7) receptor and interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ) receptor, and transduces receptor signals.
  • IL-2 interleukin 2
  • IL-4 interleukin 4
  • IFN- ⁇ interferon- ⁇
  • Janus kinase inhibitors may inhibit not only IFN- ⁇ but also signaling of IL-2, IL-4, IL-7, IFN- ⁇ , etc. (Yvan Jamilloux, et. al., Autoimmunity Reviews, 2019, 18, 102390). This raises safety concerns in long-term administration and suggests the possibility of unexpected side effects.
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic drug for autoimmune diseases that can be stored at room temperature.
  • the autoimmune disease therapeutic agent containing the oligonucleotide that selectively binds to IFN- ⁇ of the present invention as an active ingredient and the oligonucleotide adopt the following aspects.
  • a first aspect of the present invention is an autoimmune autoimmune antibody containing, as an active ingredient, a DNA oligonucleotide that has a nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 and selectively binds to interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ).
  • IFN- ⁇ interferon- ⁇
  • the DNA oligonucleotides according to this aspect selectively bind to IFN- ⁇ to exert therapeutic effects on autoimmune diseases.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a sequence obtained by adding an oligonucleotide consisting of 9 natural bases to the 3' end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is a sequence obtained by substituting an arbitrary base for the 53rd base from the 5' end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the base X in the sequence of the DNA oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is an artificially produced base, and the artificially produced base is a low-molecular-weight It may be chemically modified with a compound.
  • the small molecule compound in the first aspect is an anti-inflammatory compound selected from glucocorticoids, tacrolimus, sirolimus, cyclosporine, methotrexate, leflunomide, or erythromycin, azizuthromycin, kanamycin, ofloxacin, gatifloxa It may be an antibiotic selected from syn, tetracycline, vancomycin.
  • the base X in the sequence of the DNA oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is an artificially produced base, and the artificially produced base is a middle molecule It may be chemically modified with a chemical compound, macromolecular compound, biopolymer, or biocompatible polymer.
  • the middle molecular weight compound in the first aspect may have a molecular weight of about 1,000 to 20,000.
  • the polymer compound in this aspect may have a molecular weight of about 20,000 to 400,000.
  • the polymer compound in the first aspect may be any biocompatible polymer having a molecular weight of 20,000 or more.
  • Middle-molecular-weight compounds or high-molecular-weight compounds in this embodiment include, but are not limited to, polyethylene glycol (PEG), bipolar polymers, oligosaccharides, fat-soluble polymers, peptides, oligonucleotides, antibodies, and the like.
  • Antibodies belong to macromolecular compounds
  • PEG, bipolar polymers, oligosaccharides, lipid-soluble polymers, peptides, oligonucleotides belong to medium-molecular compounds or macromolecular compounds depending on their molecular weights.
  • the molecular weight of middle-molecular-weight compounds or high-molecular-weight compounds is represented by the average molecular weight defined by number average molecular weight (Mn) or weight average molecular weight (Mw).
  • the autoimmune disease to be treated is the group consisting of alopecia areata, vitiligo vulgaris, psoriasis, scleroderma, dermatomyositis, atopic dermatitis, cutaneous lupus erythematosus, and IgA dermatitis. It may be an autoimmune skin disease selected from
  • the autoimmune disease to be treated may be an autoimmune disease in the bladder selected from the group consisting of interstitial cystitis and bladder pain syndrome.
  • the autoimmune disease in the eye is selected from the group consisting of uveitis, dry eye, keratitis sicca, episcleritis, and scleritis. It may be a disease.
  • the autoimmune disease to be treated is multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, endometriosis, myocarditis, type I diabetes, thyroiditis, premature ovarian failure, Sjogren's syndrome, Raynaud's syndrome, rheumatoid arthritis, myasthenia gravis, Takayasu's arteritis, Addison's disease, Guillain-Barré syndrome, hypothyroidism, sarcoidosis, hemophagocytic lymphohistiocytosis, thrombotic thrombocytopenic purpura, autoimmune hepatitis It may be a systemic autoimmune disease selected from the group consisting of
  • the autoimmune disease to be treated is selected from the group consisting of Crohn's disease, ulcerative colitis, autoimmune pancreatitis, biliary cholangitis, and autoimmune atrophic gastritis. It may also be an autoimmune disease of the digestive tract.
  • a second aspect of the present invention is a DNA having a nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 and having therapeutic effects on autoimmune diseases by selectively binding to interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ).
  • An oligonucleotide is provided.
  • the DNA oligonucleotides according to this aspect selectively bind to IFN- ⁇ to exert therapeutic effects on autoimmune diseases.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO:2 is a sequence obtained by adding an oligonucleotide consisting of 9 natural bases to the 3' end of the base sequence shown in SEQ ID NO:1.
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 is a sequence obtained by changing the 53rd base from the 5' end of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 to any base X, where X is any natural base or artificial is a base produced in According to this aspect, the artificially produced base in the sequence of the DNA oligonucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 is chemically modified with the above-described low-molecular-weight compound, medium-molecular-weight compound, or high-molecular-weight compound.
  • the autoimmune diseases to be treated by the drug for treating autoimmune diseases according to the second aspect include the above-exemplified autoimmune skin diseases, bladder autoimmune diseases, eye autoimmune diseases, systemic and autoimmune diseases of the digestive tract.
  • the DNA oligonucleotides of the present invention having therapeutic effects on autoimmune diseases can selectively inhibit IFN- ⁇ by selectively binding to IFN- ⁇ .
  • the DNA oligonucleotides of the present invention having therapeutic effects on autoimmune diseases do not require the use of serum or the like for their production, and therefore can be produced without the risk of biological contamination.
  • the DNA oligonucleotides of the present invention having autoimmune disease therapeutic effects can be stored at room temperature, they are advantageous in terms of transportation and storage costs compared to conventional methods, and are convenient for patients to use. can improve sexuality.
  • the DNA oligonucleotide of the present invention inhibits only the action of IFN- ⁇ even when administered for a long period of time, so that Janus kinase Unexpected side effects can be reduced compared to inhibitors and the like.
  • the DNA oligonucleotides of the present invention when compared with anti-IFN- ⁇ antibodies, have lower antigenicity than antibodies, so they can be drugs that can be used for a long period of time.
  • the DNA oligonucleotides of the present invention are safe from biological contamination and can be stored at room temperature.
  • FIG. 2 is a diagram showing changes in the number of hairs on a skin graft tissue graft before and after administration of a DNA oligonucleotide according to an embodiment of the present invention, where the vertical axis indicates the change in the number of hairs per skin graft tissue graft.
  • FIG. 2 shows suppression of MHC class I expression in the root sheath of the hair bulb by administration of a DNA oligonucleotide according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows suppression of MHC class I expression in the outer root sheath by administration of a DNA oligonucleotide according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows suppression of MHC class II expression in the connective tissue root sheath by DNA oligonucleotide administration according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows suppression of MHC class II expression in the outer root sheath by administration of a DNA oligonucleotide according to one embodiment of the present invention.
  • IFN- ⁇ is therefore recognized as a potential target for the treatment of autoimmune diseases.
  • Emapalumab an anti-IFN- ⁇ antibody, was approved by the FDA in 2018 for hemophagocytic lymphohistiocytosis, which is an intractable autoimmune disease similar to the above-mentioned diseases, and was launched under the brand name Gamifant. ing.
  • anti-IFN- ⁇ antibodies are subject to risks such as biological contamination due to being a biological preparation, antigenicity in long-term administration, and storage and transportation conditions due to being a protein preparation. I have an issue. Therefore, it is desired to solve these problems and create effective therapeutic drugs.
  • a DNA aptamer is a single-stranded DNA oligonucleotide that forms a secondary structure or a tertiary structure by forming a complementary strand between complementary sequences in a DNA oligonucleotide molecule. It is a tightly binding ligand molecule. Binding of the DNA aptamer can inhibit, suppress or enhance the activity of the target molecule.
  • a DNA aptamer has a high affinity and high target selectivity equivalent to that of an antibody, although its molecular weight is about 1/10 or less that of an antibody.
  • IFN- ⁇ inhibitors using DNA aptamers can minimize the occurrence of side effects due to off-targets, and DNA aptamers can be produced by chemical synthesis, making them a suitable modality as a means of solving problems. It is considered that it can be.
  • DNA aptamers (1) have a relatively small molecular weight and may be administered through transdermal formulations such as ointments and patches; (4) Since it is DNA, it is sufficiently stable at room temperature under nuclease-free neutral conditions. (5) It has almost no inhibitory activity on cytochrome P450, a drug-metabolizing enzyme. Therefore, it has advantages such as not affecting concomitant drugs, and its usefulness is expected. In addition, DNA aptamers do not cause the problem of the generation of antibodies against antibodies, which is one of the problems when long-term treatment using antibodies is required, and thus long-term administration is possible.
  • the DNA oligonucleotide according to this embodiment can be used as a DNA aptamer.
  • a method of treating diseases using DNA aptamers a method of treating autoimmune diseases by neutralizing IFN- ⁇ by administering the aptamer itself or a modified aptamer is envisioned.
  • the DNA oligonucleotides listed in Table 1 are used as DNA aptamers.
  • This embodiment includes using a DNA oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in Table 1 as a therapeutic agent for autoimmune diseases.
  • the sequence shown in SEQ ID NO: 2 in Table 1 is a sequence obtained by adding an oligonucleotide consisting of 9 natural bases to the 3' end of the sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the sequence shown by SEQ ID NO:3 in Table 1 is a sequence obtained by substituting an arbitrary base X for the 53rd base from the 5' end of the sequence shown by SEQ ID NO:2.
  • X is any natural base, any unnatural base, or a modified base, or modified bases are low-molecular-weight compounds, peptides, oligonucleic acids, oligosaccharides, proteins, and other macromolecules used in living organisms. It represents a compound (biopolymer) or a substance bound with a biocompatible polymer.
  • polymer compounds include polyethylene glycol (PEG) with a molecular weight of 20,000 or more and any biocompatible polymer with a molecular weight of 20,000 or more.
  • a biocompatible polymer is a chemically synthesized product that is generally not used in vivo, and is safe as it does not cause inflammation or toxic reaction even when placed in the body.
  • middle molecular weight compounds include peptides, oligonucleic acids, oligosaccharides, proteins, PEGs, and any biocompatible polymers with molecular weights greater than 1,000 and less than 20,000.
  • low-molecular-weight compounds include antibiotics with a molecular weight of about 200-1000.
  • Functional groups for modification include an azide group (--N 3 ), an amino group (--NH 2 ), a carboxyl group (--COOH) or an active ester thereof, an alkynyl group (--CC) or a cyclic structure containing an alkynyl structure.
  • formyl group (-CHO), hydrazide group (-NH-NH 2 ), hydroxyl group (-OH), thiol group (-SH), cyano group (-CN), vinyl group (-CHCH 2 ), maleimide group are used. It is possible.
  • natural base refers to adenine, guanosine, cytosine, or thymine.
  • non-natural base refers to a base that is artificially synthesized and has properties similar to those of natural bases, and may also be referred to herein as “artificial base”.
  • modified base refers to a base added with a side chain structure having one or more functional groups activated for modification, and is a type of "artificially produced base”. be.
  • modifications include methylation, deamination, rearrangement of atomic positions, thiolation of oxygen at the phosphate site, and introduction of water-soluble or lipid-soluble substituents into the base moiety of natural bases. is mentioned. Specific examples include modified pyrimidines, modified purines, and other heterocyclic bases.
  • Ds in the base sequences of SEQ ID NOS: 1 to 3 in Table 1 represents 7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine, which is an artificial base.
  • the artificial base may be Ds itself or a base obtained by introducing a side chain into Ds.
  • DNA aptamers having the sequences shown in SEQ ID NOS: 1, 2, and 3 in Table 1 are referred to as "aptamer 1,” “aptamer 2,” and “aptamer 1,” respectively. 3” (Aptamer 3).
  • the DNA aptamer (aptamer 2) shown in Table 1 is injected intradermally into an autoimmune hair loss model of immunotolerant mice transplanted with human skin tissue fragments to suppress hair loss, In addition, it was confirmed that hair that had once fallen out can be regenerated (Example 4). Details will be described later.
  • aptamer 2 or aptamer 3 Pathological analysis of the mechanism of expression of aptamer 2 or aptamer 3 activity in this model revealed that aptamer 2 or aptamer 3 almost completely suppressed the expression of MHC class I and II. Detailed results will be described later. In other words, aptamer 2 or aptamer 3 suppressed the production of MHC class I and II, which are the basis of autoimmunity, by inhibiting the activity of IFN- ⁇ , thereby improving autoimmunity. It is considered that the symptoms of alopecia were improved. This suggests that aptamer 2 or aptamer 3 is effective not only in alopecia areata but also in other autoimmune diseases (Vasiliki Matzaraki, et.
  • DNA oligonucleotides having any of the sequences listed in Table 1 can be used as they are, or modified sites that do not affect the activity of these DNA aptamers can be used.
  • modified DNA aptamers include PEG, peptides, oligonucleotides, and other middle-molecular-weight or high-molecular-weight compounds bound by chemical methods, DNA aptamers multimerized by chemical methods, DNA aptamers in which a part of the sequence is converted or modified are included.
  • the modified portion is preferably a base portion. Artificial bases or modified bases can be modified using existing methods, and the 3' and 5' ends can also be modified.
  • injection formulations can be formulated as vials containing lyophilized powder, vials containing aptamer solution, and prefilled syringes.
  • the DNA aptamer of the present embodiment can be inhaled by inserting nanoparticles adsorbing or containing the DNA aptamer or a solution thereof, or powder obtained by granulating the DNA aptamer into an appropriate size with a granulating material into an inhalation device. It is possible to manufacture as a formulation for
  • the DNA aptamer of this embodiment can be used as an eye drop by dissolving it as it is by utilizing its high water solubility.
  • the DNA aptamer of this embodiment can be converted into fatty nanoparticles, biodegradable polymer nanoparticles such as PLGA (Polylactic-co-Glycolic Acid), gold nanoparticles, and the like. Encapsulated or adhered, dispersed or dissolved in physiological saline, physiological buffer, etc. can be used.
  • biodegradable polymer nanoparticles such as PLGA (Polylactic-co-Glycolic Acid)
  • gold nanoparticles and the like. Encapsulated or adhered, dispersed or dissolved in physiological saline, physiological buffer, etc. can be used.
  • the DNA aptamer of this embodiment can be applied as transdermal topical agents such as solutions, ointments, creams, lotions, milky lotions, emulsions, gels, biodegradable microneedles, poultices, and the like.
  • absorption enhancers include lower alcohols such as ethanol, polyhydric alcohols such as ethylene glycol, fatty acids, esters such as ethyl acetate, surfactants, and ionic liquids. etc. can be considered.
  • lower alcohols such as ethanol
  • polyhydric alcohols such as ethylene glycol
  • fatty acids such as ethyl acetate
  • surfactants such as ethyl acetate
  • ionic liquids etc.
  • the DNA aptamer of the present embodiment can also be used as an administration preparation using a device compatible with methods such as iontophoresis, electroporation, thermalporation, sonophoresis, microneedle array patch, needleless syringe, and micropump, which are physical percutaneous absorption enhancement methods. is possible.
  • Example 1 Synthesis of DNA Aptamers Aptamers 1 and 2 were chemically synthesized by the method described in WO2013/073602 and WO2016/143700.
  • Example 2 Synthesis Example of Aptamer 3 Using the method described in WO 2013/073602 and WO 2016/143700, Amino-Modifier C6-dT Amidite was added to position X in the sequence of SEQ ID NO: 3. introduced to synthesize aptamer 3. Other X-substituted compounds can be synthesized by using commercially available artificial bases or modified base amidites.
  • Example 3 Synthesis of PEG-modified DNA aptamer Aptamer 3 (1 eq) having a primary amine side chain at the base moiety of X, prepared in Example 2, and commercially available NHS-PEG (40000) (1.5 eq) were mixed in a phosphate buffer of pH 7-8 and stirred at room temperature for 1 day. The reaction mixture was concentrated, and the resulting modified product was purified by reverse-phase HPLC to obtain PEG-modified aptamer 3. It was confirmed by SPR (Surface Plasmon Resonance) that the obtained PEG-modified aptamer 3 retained the ability to bind to IFN- ⁇ .
  • SPR Surface Plasmon Resonance
  • PEG-modified DNA aptamers are used to improve pharmacokinetics (PK)-pharmacodynamics (PD) profiles commonly used for oligonucleic acids including proteins, peptides, and aptamers for the purpose of improving pharmacokinetics. and many PEG-modified aptamers have been developed so far. It is known that when the PEG-modified aptamer retains its binding activity to the target protein, it exhibits activity equivalent to that of the aptamer before PEG modification in the body, and the toxicity due to PEG modification is almost non-existent ( C. Simone Fishburn, Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, 97, 10, 4167-4183; Katarina D. Kovacevic, et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 2018-134, 36).
  • Example 4 Confirmation of therapeutic effect using alopecia areata humanized model mouse Step 1 Preparation of humanized model mouse A. Gilhar, et. al. , Journal of Investigative Dermatology, 2013(133), 844-847, a humanized mouse model of alopecia areata induced by intradermal injection of human activated lymphocyte transplantation was prepared.
  • Process 2 The produced humanized model mice were divided into 3 groups, and Vehicle (PBS), Dexamethasone+Minoxidil (Positive control), and Aptamer 2 were administered to each group.
  • vehicle group 15 ⁇ L of PBS was administered to the grafted skin once every two days.
  • aptamer-administered group 15 ⁇ L of aptamer solution in PBS was administered to the grafted skin once every two days, and the concentration of aptamer 2 solution was varied from 12 nM to 300 nM. Gradually increased over the course of the day.
  • dexamethasone+minoxidil 2 mg of dexamethasone and 40 ⁇ L of 5% minoxidil were applied to the grafted skin once a day.
  • FIG. 1 shows changes in the number of hairs on the skin graft before and after administration, and the vertical axis indicates the change in the number of hairs per skin graft.
  • vehicle in Fig. 1
  • hair loss further progressed during the period of administration of PBS, but in the positive control group ("Dexamethasone + Minoxidil” in Fig. 1) and the aptamer administration group ("Aptamer” in Fig. 1), Hair regrowth was observed while preventing further hair loss.
  • MHC class I The results of MHC class I are shown in FIGS. 2A and 2B, and the results of MHC class II are shown in FIGS. 3A and 3B, respectively.
  • the vertical axis represents the expression level of MHC class I (FIGS. 2A and 2B) or II (FIGS. 3A and 3B) in each vehicle group (FIGS. 2A, 2B, 3A, and "Vehicle" in FIG. 3B). It is shown as a relative value when the amount is set to 1.
  • the hair follicle tissue recovered from the breakdown of immune tolerance, and a more fundamental therapeutic effect was obtained.
  • the DNA aptamer according to this embodiment can suppress inflammatory reactions not only in autoimmune skin diseases but also in autoimmune diseases that occur in other tissues such as eyes and bladder by a similar mechanism. It shows that there is a
  • the use of the therapeutic agent containing the DNA aptamer according to the present embodiment can prevent hair loss and further regenerate hair. Further, as a result of pathological analysis, it was confirmed that the administration of the DNA aptamer according to this embodiment can almost completely suppress the expression of MHC class I and II.
  • Example 4 It is considered that the results in Example 4 above were caused by the strong inhibition of IFN- ⁇ activity by the DNA aptamer according to the present embodiment. Therefore, by using the DNA aptamer according to the present embodiment, it is possible to provide an unprecedentedly effective therapeutic drug and therapeutic method for autoimmune diseases such as alopecia areata.
  • the DNA aptamer according to the present embodiment binds to IFN- ⁇ with high specificity.
  • Janus kinase inhibitors Yvan Jamilloux, et. al., Autoimmunity Reviews, 2019, 18, 102390
  • selective IFN- ⁇ activity The suppressing aptamer according to this embodiment can reduce the possibility of developing side effects.
  • DNA aptamers generally have a low possibility of producing anti-DNA aptamer antibodies. Therefore, the DNA aptamer according to this embodiment can be administered over a long period of time in the treatment of autoimmune diseases.
  • the DNA aptamer according to this embodiment can be produced completely by chemical synthesis. Therefore, it can be provided as a safe drug with stable quality and low risk of biological contamination.
  • the DNA aptamer according to this embodiment can be manufactured at a lower cost than biologics. Further, in the case of biologics, low-temperature conditions are required for their preservation, whereas DNA aptamers are stable even at room temperature. Therefore, a cold chain is not necessarily required in transportation and storage of a formulation containing the DNA aptamer according to this embodiment.
  • the DNA aptamer according to this embodiment By making the DNA aptamer according to this embodiment into a transdermal preparation, it is possible to provide a therapeutic drug that is easy to use, with no invasiveness in administration, and a low risk of side effects.
  • the therapeutic agent containing the DNA aptamer according to this embodiment as an injection, it is possible to adapt to systemic autoimmune diseases. Also, when it is used as an injection, it can be made into a formulation that is easy for patients to use, such as a prefilled syringe that can be stored at room temperature.

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Abstract

ＩＦＮ－γを選択的に阻害することができ、生物学的汚染のおそれが無く、室温での保存が可能である自己免疫性疾患治療薬を提供することを目的とする。配列番号１から３のいずれかに記載の塩基配列を有し、ＩＦＮ－γへ選択的に結合するＤＮＡオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する自己免疫性疾患治療薬を提供する。別の態様として、配列番号１から３のいずれかに記載の塩基配列を有し、ＩＦＮ－γへ選択的に結合することで自己免疫性疾患治療効果を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドを提供する。

Description

ＩＦＮ－γへ選択的に結合するオリゴヌクレオチドを含有する自己免疫性疾患治療薬およびそのオリゴヌクレオチド
　本発明は、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）へ選択的に結合するオリゴヌクレオチドを含有する自己免疫性疾患治療薬およびそのオリゴヌクレオチドに関するものである。
　円形脱毛症は年齢、性別に関係なく、広く発症する脱毛症状で、頭部に頻発する。近年の研究により、円形脱毛症の発症原因には自己免疫異常が関与していることが明らかになっており、現代では円形脱毛症は自己免疫性疾患の一種と認識されている。正常な毛包組織およびその周辺部は免疫寛容な環境にあり、ＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩおよびＩＩの発現がほとんどない。これに対して、円形脱毛症病変部ではＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩおよびＩＩの発現が亢進し、毛包の免疫寛容が破綻している。
　円形脱毛症による脱毛部の組織においては、毛包周辺部に集積した活性化されたリンパ球（主としてＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞）が毛根部分の自己抗原を認識、攻撃するといった反応が知られており、種々の科学的研究により検証されている（非特許文献１）。これらの活性化されたリンパ球は、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）を過剰に産生する事が確認されており、このＩＦＮ－γは円形脱毛症の発症の要因となっていることが知られている。ＩＦＮ－γは近位外毛根鞘や毛母細胞のＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩおよびＩＩの発現を誘導し、毛包の免疫寛容を破綻させる。また円形脱毛症の毛包周囲では、樹状細胞のＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩＩ発現も亢進しており、これらのＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩおよびＩＩの発現亢進が円形脱毛症の発症に繋がっている。
　ＩＦＮ－γは、自己免疫性疾患の発症の主要な原因となるサイトカインとして知られ（非特許文献２）、現在では自己免疫性疾患治療の有力なターゲットとして認識されている。円形脱毛症は、毛包およびその周辺部において過剰産生されたＩＦＮ－γが細胞膜受容体に結合することにより、ヤヌスキナーゼの活性化を介して細胞内にシグナルを伝達し、ＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩおよびＩＩを過剰発現することが原因で発症すると考えられている。ヤヌスキナーゼの活性を阻害することで発毛が認められる（非特許文献３）ことから、ＩＦＮ－γを標的分子としてその活性を抑制する円形脱毛症の治療が有用である可能性が示唆される。ＩＦＮ－γの活性を中和する目的で、抗ＩＦＮ－γ抗体を、円形脱毛症、間接リウマチ、多発性硬化症等の自己免疫性疾患の患者に投与した臨床研究では、症状の改善が認められている（非特許文献４）。
Ｊｉｌｌｉａｎ　Ｆ．Ｒｏｒｋ，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ．，２０１６，Ａｕｇｕｓｔ；２８（４），４６３－４６９． Ｓｉｍｏｎ　Ｓｋｕｒｋｏｖｉｃｈ，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ　Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００５，１（１），１１－２５． Ａｎｉｓｅｈ　Ｓａｍａｄｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，２０１７，２８（６），４７６－４８３． Ｂ．Ｓｋｕｒｋｏｖｉｃｈ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｒｎｓｔ　Ｓｃｈｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓ．　Ｆｏｕｎｄ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，２００６，５６，１－２７．
　以上で述べたように、ＩＦＮ－γ活性の阻害薬については、自己免疫性疾患の治療薬として有望である可能性が高い。これまで、ＩＦＮ－γの活性を阻害する薬剤としては、抗体、ヤヌスキナーゼ阻害剤が開発されてきた。しかしながら、例えば抗ＩＦＮ－γ抗体は、（１）生物製剤であるため、生物学的汚染などのリスクがある、（２）異種抗体である場合、長期投与においては抗原性が問題となる、（３）タンパク製剤であるため、保存や輸送にコールドチェインが必要である、等の課題を有している。
　また上述の課題（２）に関し、一般的な抗体薬に対する抗体産生率は３０％程度あるといわれている。このため、長期の治療が必要となる場合には、抗体に対する抗体が生じてアナフィラキシー反応の原因となり、治療継続が困難となるような事例がしばしば認められる。
　また、上述の課題（１）に関しては、生物製剤の製造工程において血清などがしばしば用いられるため、ウィルス等の汚染リスクの可能性が懸念される。課題（３）に関しては、常に低温での取り扱いが必要になるため、輸送、保存のコストが増大するのに加え、使用する患者の利便性も低下する。
　ヤヌスキナーゼ阻害剤としては、Ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂ（製品名：ゼルヤンツ（登録商標））、Ｂａｒｉｃｉｔｉｎｉｂ（製品名：オルミエント（登録商標））、Ｐｅｆｉｃｉｔｉｎｉｂ（製品名：スマイラフ（登録商標））、Ｕｐａｄａｃｉｔｉｎｉｂ（製品名：リンヴォック（登録商標））の４種が、自己免疫性疾患である関節リウマチに適用されて上市されている。これらのヤヌスキナーゼ阻害剤は、化学合成で生産できる低分子化合物であるため、抗体であることが原因となる上述した課題はないと考えられる。その一方で、ヤヌスキナーゼは、複数のサブタイプが存在し、ＩＦＮ－γの受容体だけでなく、インターロイキン２（ＩＬ－２）受容体、インターロイキン４（ＩＬ－４）受容体、インターロイキン７（ＩＬ－７）受容体、インターフェロンα（ＩＦＮ－α）受容体等の複数のサイトカイン受容体の細胞内ドメインに結合して活性化され、受容体シグナルを伝達する。
　このため、ヤヌスキナーゼ阻害剤は、ＩＦＮ－γだけでなく、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＦＮ－α等のシグナリングを阻害する可能性がある（Ｙｖａｎ　Ｊａｍｉｌｌｏｕｘ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０１９，１８，１０２３９０）。このことは、長期投与における安全性の懸念材料となっており、予期せぬ副作用が発現する可能性を示唆する。
　本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、ＩＦＮ－γを選択的に阻害することができ、生物学的汚染のおそれが無く、長期投与においても抗原性が問題とならず、室温での保存が可能である自己免疫性疾患治療薬を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するために、本発明のＩＦＮ－γへ選択的に結合するオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する自己免疫性疾患治療薬およびそのオリゴヌクレオチドは以下の態様を採用する。
　本発明の第１の態様は、配列番号１から３のいずれかに記載の塩基配列を有し、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）へ選択的に結合するＤＮＡオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する自己免疫性疾患治療薬を提供する。本態様に係るＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＩＦＮ－γへ選択的に結合することで自己免疫性疾患治療効果を発揮する。
　配列番号２に記載の塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列の３′末端に９残基の天然型塩基からなるオリゴヌクレオチドを付加した配列である。
　配列番号３に記載の塩基配列は、配列番号２に記載の塩基配列の５′末端から５３番目の塩基を任意の塩基に置換した配列である。
　上記第１の態様においては、配列番号３に示される塩基配列を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列中の塩基Ｘが人工的に製造された塩基であり、該人工的に製造された塩基が、低分子化合物で化学修飾されていてもよい。
　上記第１の態様における低分子化合物は、グルココルチコイド、タクロリムス、シロリムス、サイクロスポリン、メトトレキサート、レフルノミドから選択される抗炎症化合物であるか、または、エリスロマイシン、アジズスロマイシン、カナマイシン、オフロキサシン、ガチフロキサシン、テトラサイクリン、バンコマイシンから選択される抗生物質であってもよい。
　上記第１の態様においては、配列番号３に示される塩基配列を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列中の塩基Ｘが人工的に製造された塩基であり、該人工的に製造された塩基が、中分子化合物、高分子化合物、生体高分子、または生体親和性のあるポリマーで化学修飾されていてもよい。
　上記第１の態様における中分子化合物は、分子量が１０００～２００００程度であってもよい。本態様における高分子化合物は、分子量が２００００～４０００００程度であってもよい。
　上記第１の態様における高分子化合物は、分子量２００００以上の生体親和性のある任意の高分子であってもよい。本態様における中分子化合物または高分子化合物としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、双極性ポリマー、オリゴ糖、脂溶性ポリマー、ペプチド、オリゴヌクレオチド、抗体等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。抗体は高分子化合物に属するが、ＰＥＧ、双極性ポリマー、オリゴ糖、脂溶性ポリマー、ペプチド、オリゴヌクレオチドは、その分子量によって、中分子化合物または高分子化合物に属する。中分子化合物または高分子化合物の分子量は、数平均分子量（Ｍｎ）または重量平均分子量（Ｍｗ）で定義される平均分子量で表される。
　上記第１の態様においては、治療対象とする自己免疫性疾患が、円形脱毛症、尋常性白斑、乾癬、強皮症、皮膚筋炎、アトピー性皮膚炎、皮膚エリテマトーデス、ＩｇＡ性皮膚炎からなる群から選択される自己免疫性皮膚疾患であってもよい。
　上記第１の態様においては、治療対象とする自己免疫性疾患が、間質性膀胱炎および膀胱痛症候群からなる群から選択される、膀胱における自己免疫性疾患であってもよい。
　上記第１の態様においては、治療対象とする自己免疫性疾患が、ぶどう膜炎、ドライアイ、乾性角膜炎、上強膜炎、強膜炎からなる群から選択される、目における自己免疫性疾患であってもよい。
　上記第１の態様においては、治療対象とする自己免疫性疾患が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、子宮内膜症、心筋炎、Ｉ型糖尿病、甲状腺炎、早期卵巣不全、シェーングレン症候群、レイノー症候群、関節リウマチ、重症筋無力症、高安動脈炎、アジソン病、ギラン・バレー症候群、甲状腺機能低下症、サルコイドーシス、血球貪食性リンパ組織球症、血栓性血小板減少性紫斑病、自己免疫性肝炎からなる群から選択される全身性の自己免疫性疾患であってもよい。
　本発明の上記第１の態様においては、治療対象とする自己免疫性疾患が、クローン病、潰瘍性大腸炎、自己免疫性膵炎、胆汁性胆道炎、自己免疫性萎縮性胃炎からなる群から選択される消化器の自己免疫性疾患であってもよい。
　本発明の第２の態様は、配列番号１から３のいずれかに記載の塩基配列を有し、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）へ選択的に結合することで自己免疫性疾患治療効果を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドを提供する。本態様に係るＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＩＦＮ－γへ選択的に結合することで自己免疫性疾患治療効果を発揮する。配列番号２に記載の塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列の３′末端に９残基の天然型塩基からなるオリゴヌクレオチドを付加した配列である。配列番号３に記載の塩基配列は、配列番号２に記載の塩基配列の５′末端から５３番目の塩基を任意の塩基Ｘに変化させた配列であり、Ｘは任意の天然型塩基または人工的に製造された塩基である。本態様に係る、配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列中の人工的に製造された塩基が、上述した低分子化合物、中分子化合物、または高分子化合物で化学修飾されていてもよい。
　上記第２の態様に係る自己免疫性疾患治療薬が治療対象とする自己免疫性疾患は、上で例示した自己免疫性皮膚疾患、膀胱における自己免疫性疾患、目における自己免疫性疾患、全身性の自己免疫性疾患、消化器の自己免疫性疾患であってもよい。
　本発明の自己免疫性疾患治療効果を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドによれば、ＩＦＮ－γに選択的に結合することで、ＩＦＮ－γを選択的に阻害することができる。また、本発明の自己免疫性疾患治療効果を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドによれば、その製造に血清などを用いる必要が無いため、生物学的汚染のおそれ無く製造することができる。また、本発明の自己免疫性疾患治療効果を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドは、室温での保存が可能であるため、輸送、保存のコスト面で従来法と比較して有利であり、使用する患者の利便性を向上させることができる。
　本発明のＤＮＡオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する自己免疫性疾患治療薬によれば、長期投与を行う場合にも、本発明のＤＮＡオリゴヌクレオチドはＩＦＮ－γの働きのみを阻害するため、ヤヌスキナーゼ阻害剤等と比較して、予期せぬ副作用を低減することができる。また、抗ＩＦＮ－γ抗体と比較した場合にも、本発明のＤＮＡオリゴヌクレオチドは抗体と比べて抗原性が低いことから、長期使用が可能な薬剤となる。さらに、本発明のＤＮＡオリゴヌクレオチドは、生物学的汚染のおそれが無く、室温での保存が可能である。
本発明の一実施形態に係るＤＮＡオリゴヌクレオチドの投与前と投与後の移植皮膚組織片上の毛髪の本数の変化を示す図であり、縦軸は移植皮膚組織片あたりの毛髪本数の変化を示している。 本発明の一実施形態に係るＤＮＡオリゴヌクレオチド投与による、毛球部毛根鞘におけるＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩの発現抑制を示す図である。 本発明の一実施形態に係るＤＮＡオリゴヌクレオチド投与による、外毛根鞘におけるＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩの発現抑制を示す図である。 本発明の一実施形態に係るＤＮＡオリゴヌクレオチド投与による、結合組織性毛根鞘におけるＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩＩの発現抑制を示す図である。 本発明の一実施形態に係るＤＮＡオリゴヌクレオチド投与による、外毛根鞘におけるＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩＩの発現抑制を示す図である。
　円形脱毛症の発症の要因となっている過剰なＩＦＮ－γの産生は、Ｔ細胞膜上での主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）　ｃｌａｓｓ　ＩＩの発現を誘導し（Ｖｉｋｔｏｒ　Ｓｔｅｉｍｌｅ，ｅｔ．ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４，２６５（５１６８），１０６－１０９；Ｃａｒｍｅｎ　Ｇｉａｎｆｒａｎｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１８（８９），１－１０；Ｇｉｕｌｉｏ　Ｃａｖａｌｌｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０１６，　１１３（５），１３６３－１３６８）、さらに免疫を抑制的にコントロールする制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ　ｃｅｌｌ）の分化を抑制することが知られている（Ｓｕｓａｎ　Ａ．Ａｌａｌｅｈａｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１５，４５，９８８－９９８）。上記機序は、自己免疫性疾患発症の主な原因の１つと考えられている。よってＩＦＮ－γは、自己免疫性疾患治療の有力なターゲットとして認識されている。抗ＩＦＮ－γ抗体であるＥｍａｐａｌｕｍａｂについては、上述の疾患と同じく難治性の自己免疫性疾患である血球貪食性リンパ組織球症を適用として２０１８年にＦＤＡが承認し、Ｇａｍｉｆａｎｔの商標名で上市されている。
　しかしながら、抗ＩＦＮ－γ抗体は、上述のように、生物製剤であることに起因する生物学的汚染などのリスク、長期投与における抗原性、タンパク製剤であることに起因する保存や輸送条件等の課題を有している。このため、これらの課題を解決し、かつ有効な治療薬の創出が望まれている。
　そこで本発明者らは、上述した課題を解決する手段としてＤＮＡアプタマーを用いたＩＦＮ－γ阻害薬の開発を試みた。ＤＮＡアプタマーとは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド分子内の相補配列同士が相補鎖を形成することで、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが二次構造や三次構造を形成し、その立体構造によって標的分子と特異的かつ強固に結合するリガンド分子である。ＤＮＡアプタマーの結合により、標的分子の活性を阻害、抑制または亢進することが可能である。ＤＮＡアプタマーは、抗体よりも分子量が約１／１０以下と小さいにも関わらず、抗体と同等の高い親和性を有し、高いターゲット選択性を持つ。このため、ＤＮＡアプタマーを用いたＩＦＮ－γ阻害薬は、オフターゲットによる副作用の発生を最小限に抑えられ、またＤＮＡアプタマーは化学合成で生産可能であることから、課題解決の手段として適したモダリティとなり得ると考えられる。
　ＤＮＡアプタマーは、（１）分子量が比較的小さく、塗り薬、貼付剤などの経皮製剤による投与ができる可能性がある、（２）化学合成品であるため生物学的汚染リスクが低い、（３）一般に抗原性が低い、（４）ＤＮＡであるため、核酸分解酵素フリーの中性条件では室温で十分な安定性がある、（５）薬物代謝酵素であるチトクロームＰ４５０への阻害活性がほとんどないことから併用の薬剤に影響を与えない、等の利点があり、その有用性が期待されている。またＤＮＡアプタマーは、抗体を用いた長期の治療が必要となる場合の問題の一つである、抗体に対する抗体が生じる、といった問題も生じることはないため、長期投与も可能である。
　本実施形態に係るＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡアプタマーとして用いることができる。ＤＮＡアプタマーを用いて疾患を治療する具体的な手法としては、アプタマーそのものまたはアプタマーの修飾体の投与によってＩＦＮ－γを中和することで自己免疫性疾患を治療する方法が想定される。本実施形態においては、表１に記載のＤＮＡオリゴヌクレオチドをＤＮＡアプタマーとして用いる。本実施形態は、表１に記載の塩基配列を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドを自己免疫性疾患治療薬として使用することを含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１の配列番号２で示した配列は、配列番号１で示した配列の３′末端に、９残基の天然型塩基からなるオリゴヌクレオチドを付加した配列である。表１の配列番号３で示した配列は、配列番号２で示した配列の５′末端から５３番目の塩基を任意の塩基Ｘに置換した配列である。Ｘは、任意の天然型塩基、任意の非天然型塩基、または、修飾塩基であるか、修飾塩基に低分子化合物、ペプチド、オリゴ核酸、オリゴ糖、タンパク質など、生体で利用されている高分子化合物（生体高分子）や、生体親和性のあるポリマーが結合されたものを表す。
　高分子化合物の例としては、分子量２００００以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や、分子量２００００以上の生体親和性のある任意の高分子が挙げられる。生体親和性のあるポリマーとは、通常、生体内では用いられていない化学合成品であって、生体内に入れても炎症や毒性反応を起こすことがない安全なものをいう。中分子化合物の例としては、分子量が１０００より大きく２００００より小さいペプチド、オリゴ核酸、オリゴ糖、タンパク質、ＰＥＧ、生体親和性のある任意のポリマーが挙げられる。低分子化合物の例としては、分子量が２００～１０００程度である抗生物質が挙げられる。
　修飾のための官能基としては、アジド基（－Ｎ３）、アミノ基（－ＮＨ２）、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）またはその活性エステル、アルキニル基（－ＣＣ）またはアルキニル構造を含んだ環状構造、ホルミル基（－ＣＨＯ）、ヒドラジド基（－ＮＨ－ＮＨ２）、水酸基（－ＯＨ）、チオール基（－ＳＨ）、シアノ基（－ＣＮ）、ビニル基（－ＣＨＣＨ２）、マレイミド基が使用可能である。
　本明細書において「天然型塩基」とは、アデニン、グアノシン、シトシン、チミンのいずれかをいう。本明細書において「非天然型塩基」とは、人工的に合成され、天然型塩基に類似した性質を有する塩基をいい、本明細書中では「人工塩基」と記載することもある。本明細書において「修飾塩基」とは、修飾のために活性化された官能基を１つまたは複数有する側鎖構造を付加された塩基をいい、「人工的に製造された塩基」の一種である。修飾の例としては、天然型塩基に対し、メチル化、脱アミノ化、原子位置の入れ替え、リン酸部位の酸素のチオ化、塩基部分への水溶性または脂溶性置換基の導入を行ったものが挙げられる。具体的には修飾化ピリミジン、修飾化プリン、他の複素環塩基等が挙げられる。表１の配列番号１から３の塩基配列中のＤｓは、人工塩基である、７－（２－チエニル）イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジンを示している。人工塩基としては、Ｄｓそのものの他に、Ｄｓに側鎖を導入した塩基を用いてもよい。以下、本実施形態においては、表１の配列番号１，２，３で示した配列を有するＤＮＡアプタマーを、それぞれ、「アプタマー１」（Ａｐｔａｍｅｒ　１）、「アプタマー２」（Ａｐｔａｍｅｒ　２）、「アプタマー３」（Ａｐｔａｍｅｒ　３）と称する。
　本実施形態においては、ヒト皮膚組織片を移植した免疫寛容マウスの自己免疫性脱毛モデルに対し、表１に記載のＤＮＡアプタマー（アプタマー２）を移植皮内注射することで、脱毛を抑制し、かつ一度抜けた毛髪の再生を促す結果を確認した（実施例４）。詳細は後述する。
　このモデルにおける、アプタマー２またはアプタマー３の活性発現のメカニズムを病理学的に解析した結果、アプタマー２またはアプタマー３はＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩおよびＩＩの発現をほぼ完全に抑制していた。詳細な結果は後述する。つまりアプタマー２またはアプタマー３は、ＩＦＮ－γの活性を阻害することで、自己免疫性の発現のもととなる、ＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩおよびＩＩの産生を抑制して自己免疫性を改善したことで、円形脱毛症の症状を改善したものと考えられる。このことは、アプタマー２またはアプタマー３が、円形脱毛症のみならず、その他の自己免疫性疾患（Ｖａｓｉｌｉｋｉ　Ｍａｔｚａｒａｋｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１７，１８：７６；Ｇｉｕｌｉｏ　Ｃａｖａｌｌｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０１６，１１３（５），１３６３－１３６８）の治療薬としても有用であり、ＤＮＡアプタマーでのＩＦＮ－γ阻害剤の提供が問題解決の手段となり得ることを示している。
　ＤＮＡアプタマーとしては、表１に記載の配列のいずれかを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドをそのまま用いることも可能であり、またはそれらのＤＮＡアプタマーの活性に影響を与えない部位を修飾したものを用いることも可能である。ＤＮＡアプタマーの修飾体の例としては、ＰＥＧ、ペプチド、オリゴヌクレオチド等の中分子または高分子化合物を化学的な方法で結合させたもの、同じＤＮＡアプタマー同士を化学的な方法で多量化したもの、ＤＮＡアプタマーの配列の一部を変換または修飾したものが挙げられる。本実施形態に係るＤＮＡオリゴヌクレオチドを修飾してＤＮＡアプタマーとして用いる場合には、修飾部分としては塩基部分が好ましい。既存の方法を用いて、人工塩基または修飾塩基を修飾することができ、また３′末端、５′末端を修飾することもできる。
　全身投与用の製剤としては、注射用製剤として、凍結乾燥紛末が入ったバイアル、アプタマー溶液が入ったバイアル、プレフィルドシリンジとして製剤化が可能である。
　本実施形態のＤＮＡアプタマーは、そのＤＮＡアプタマーまたはその溶液を吸着または包含したナノ粒子や、ＤＮＡアプタマーを造粒材とともに適切な大きさに造粒した粉体を吸入用デバイスに入れることで、吸入用製剤として製造することが可能である。
　本実施形態のＤＮＡアプタマーは、その高い水溶性を利用してそのまま溶解させることで、点眼薬として使用することが可能である。
　注射用製剤、吸入用製剤および点眼薬としては、本実施形態のＤＮＡアプタマーを脂肪性ナノ粒子、ＰＬＧＡ（Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ－ｃｏ－Ｇｌｙｃｏｌｉｃ　Ａｃｉｄ）のような生分解性ポリマーのナノ粒子、金ナノ粒子等に封入または接着して、生理的食塩水、生理的緩衝液等に分散または溶解したものを使用することが可能である。
　本実施形態のＤＮＡアプタマーは、溶液、軟膏、クリーム、ローション、乳液、エマルジョン、ジェル、生分解性マイクロニードル、ハップ剤等の経皮局所投与剤としての適用が可能である。
　経皮投与剤を製造する工程では、吸収促進剤として、エタノールのような低級アルコール類、エチレングリコールのような多価アルコール類、脂肪酸、酢酸エチルのようなエステル類、界面活性剤、イオン性液体等を使用することが考えられる。また、経皮投与剤の製造にあたっては、ポリ乳酸のような生分解性ポリマーやリポソームを用いてのナノパーティクル化による製造工程が適用可能であり、これらの工程は、目的に応じて適宜組み合わせることが可能である。
　本実施形態のＤＮＡアプタマーは、物理的経皮吸収促進法であるＩｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｈｅｒｍａｌｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｏｎｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｎｅｅｄｌｅ　ａｒｒａｙ　ｐａｔｃｈ、Ｎｅｅｄｌｅｌｅｓｓ　ｓｙｒｉｎｇｅ、マイクロポンプ等の方法に対応するデバイスを用いる投与製剤としても使用することが可能である。
実施例１：ＤＮＡアプタマーの合成
　アプタマー１およびアプタマー２については、国際公開第２０１３／０７３６０２号および国際公開第２０１６／１４３７００号に記載されている方法で化学合成した。
実施例２：アプタマー３の合成例
　国際公開第２０１３／０７３６０２号および国際公開第２０１６／１４３７００号に記載の方法を用い、配列番号３の配列のＸの位置に、Ａｍｉｎｏ－Ｍｏｄｉｆｉｅｒ　Ｃ６－ｄＴ　Ａｍｉｄｉｔｅを導入して、アプタマー３を合成した。その他のＸ置換体に関しては、市販の人工塩基または修飾塩基のアミダイトを用いることにより合成できる。
実施例３：ＰＥＧ修飾ＤＮＡアプタマーの合成
　実施例２で製造した、Ｘの塩基部分に１級アミン側鎖を有するアプタマー３（１ｅｑ）と、市販のＮＨＳ－ＰＥＧ（４００００）（１．５ｅｑ）とをｐＨ７～８のリン酸バッファー中で混合し、室温下１日撹拌した。反応液を濃縮し、生成した修飾体を逆相ＨＰＬＣで精製し、アプタマー３のＰＥＧ修飾体を得た。得られたアプタマー３のＰＥＧ修飾体については、ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｐｌａｓｍｏｎ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）にてＩＦＮ－γとの結合能を保持していることを確認した。
　ＤＮＡアプタマーのＰＥＧ修飾体は、体内動態改善を目的として、タンパク質、ペプチド、アプタマーを含むオリゴ核酸に一般的に用いられているＰｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ（ＰＫ）－Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ（ＰＤ）プロファイルの改善のために用いられており、これまで多くのＰＥＧ修飾アプタマーが開発されている。ＰＥＧ修飾アプタマーのターゲットタンパク質に対しての結合活性が保持されている場合、体内でＰＥＧ修飾前のアプタマーと同等な活性を示し、また、ＰＥＧ修飾による毒性発現も殆ど無いことが知られている（Ｃ．Ｓｉｍｏｎｅ　Ｆｉｓｈｂｕｒｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００８，９７，１０，４１６７－４１８３；Ｋａｔａｒｉｎａ　Ｄ．Ｋｏｖａｃｅｖｉｃ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０１８，１３４，３６－５０）。
実施例４：円形脱毛症ヒト化モデルマウスを用いた治療効果の確認
工程１　ヒト化モデルマウスの作製
　Ａ．Ｇｉｌｈａｒ，　ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１３（１３３），８４４－８４７に記載の方法に従い、ヒト活性化リンパ球の移植皮内注射により誘発される円形脱毛症のヒト化モデルマウスを作製した。
工程２
　作製したヒト化モデルマウスを３群に分け、それぞれに、Ｖｅｈｉｃｌｅ（ＰＢＳ）、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ＋Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ　（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ）、アプタマー２を投与した。Ｖｅｈｉｃｌｅ群に対しては、ＰＢＳ１５μＬを２日に１回移植皮膚に投与した。アプタマー２を投与する群（以下、「アプタマー投与群」という）に対しては、アプタマーのＰＢＳ溶液１５μＬを２日に１回移植皮膚に投与し、アプタマー２の溶液の濃度を１２ｎＭから３００ｎＭまで１４３日間で徐々に増加させた。Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ＋Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌを投与する群に対しては、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ２ｍｇと５％Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ４０μＬを、１日１回、移植皮膚に塗布した。
　実施例４での投与後の結果を図１に示す。図１は投与前と投与後の移植皮膚組織片上の毛髪の本数の変化を示したもので、縦軸は移植皮膚組織片あたりの毛髪本数の変化を示している。Ｖｅｈｉｃｌｅ群（図１の「Ｖｅｈｉｃｌｅ」）では、ＰＢＳの投与期間中にさらに脱毛が進行したが、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ群（図１の「Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ＋Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ」）およびアプタマー投与群（図１の「Ａｐｔａｍｅｒ」）では、更なる脱毛を防止すると同時に、毛髪の再生が観察された。
　毛根組織周辺の病理学的解析結果からは、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ群とアプタマー投与群とで、顕著なＣＤ８陽性Ｔ細胞の浸潤抑制が観察された。このことから、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ群およびアプタマー投与群では、炎症反応の抑制により脱毛の進行が抑制され、毛髪の再生が促進されたと考えられる。
　さらに、実施例４での投与後における毛根周辺組織のＭＨＣの発現を調べた。ＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩの結果を図２Ａおよび図２Ｂに、ＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩＩの結果を図３Ａおよび図３Ｂに、それぞれ示す。縦軸は、ＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩ（図２Ａおよび図２Ｂ）またはＩＩ（図３Ａおよび図３Ｂ）の発現量を、それぞれのＶｅｈｉｃｌｅ群（図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ、図３Ｂの「Ｖｅｈｉｃｌｅ」）における発現量を１とした場合の相対値として示している。
　ＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩおよびＩＩともに、アプタマー投与群（図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ、図３Ｂの「Ａｐｔａｍｅｒ」）のみで発現抑制が見られた。このことは、炎症を抑制し、毛髪再生を促進したメカニズムが、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ群（図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ、図３Ｂの「Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ＋Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ」）とアプタマー投与群とでは異なることを示している。Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ群では、グルココルチコイド受容体の活性化による直接的な炎症抑制が示され、アプタマー投与群では、自己免疫性の原因となるＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩおよびＩＩの産生を抑制することで、炎症が抑制されたものと考えられる。換言すると、アプタマー投与群においては、毛包組織が免疫寛容の破綻から回復しており、より根本的な治療効果が得られたと考えられる。この結果は、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーが、自己免疫性の皮膚疾患だけでなく、目や膀胱など、他の組織に生じる自己免疫性疾患についても、同様なメカニズムで炎症反応を抑制できる可能性があることを示している。
　本実施形態に係るＤＮＡアプタマーを含有する治療薬を用いると、脱毛を防ぐことができ、さらに毛髪の再生が可能であることを確認することができた。また、病理解析の結果、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーを投与することで、ＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩおよびＩＩの発現をほぼ完全に抑制できることを確認できた。
　上記実施例４における結果は、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーによりＩＦＮ－γの活性が強力に阻害されたことで生じたものであると考えられる。このため、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーを用いて、円形脱毛症をはじめとする自己免疫性疾患に対する、これまでにない有効な治療薬および治療法を提供することができる。
　また上記実施例の結果から、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーは、ＩＦＮ－γに対して高い特異性で結合していると考えられる。薬理学的性質上、複数のサイトカインシグナルの抑制を免れないヤヌスキナーゼ阻害剤（Ｙｖａｎ　Ｊａｍｉｌｌｏｕｘ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０１９，１８，１０２３９０）と比較した場合、ＩＦＮ－γ活性を選択的に抑制する本実施形態に係るアプタマーは、副作用の発現の可能性を低くすることができる。
　ＤＮＡアプタマーは、一般的に、抗ＤＮＡアプタマー抗体の産生の可能性が低い。このため、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーは、自己免疫性疾患の治療において長期にわたる投与が可能となる。
　本実施形態に係るＤＮＡアプタマーは、完全に化学合成によって製造可能である。このため、品質が安定し、かつ、生物学的汚染リスクが低い、安全な薬剤として提供することができる。
　本実施形態に係るＤＮＡアプタマーは、生物製剤と比較して、安価で製造することが可能である。また生物製剤の場合、その保存に低温条件が必要であるのに対し、ＤＮＡアプタマーは室温でも安定である。このため、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーを含有する製剤の輸送、保存において、コールドチェインを必ずしも必要とすることがない。
　本実施形態に係るＤＮＡアプタマーを経皮投与製剤とすることで、投与の侵襲性が無く、副作用の危険性が低く、使いやすい治療薬を提供することができる。
　本実施形態に係るＤＮＡアプタマーを含有する治療薬を注射剤として全身投与することで、全身性の自己免疫性疾患への適応が可能である。また注射薬とする際にも、室温での保存が可能なプレフィルドシリンジ等、患者が使いやすい製剤とすることが可能である。

Claims (20)

  1. 　配列番号１から３のいずれかに記載の塩基配列を有し、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）へ選択的に結合するＤＮＡオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する自己免疫性疾患治療薬。
  2. 　配列番号３に示される塩基配列を有する前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列中の塩基Ｘが人工的に製造された塩基であり、前記人工的に製造された塩基が、低分子化合物で化学修飾されている、請求項１に記載の自己免疫性疾患治療薬。
  3. 　前記低分子化合物が、グルココルチコイド、タクロリムス、シロリムス、サイクロスポリン、メトトレキサート、レフルノミドから選択される抗炎症化合物であるか、または、エリスロマイシン、アジズスロマイシン、カナマイシン、オフロキサシン、ガチフロキサシン、テトラサイクリン、バンコマイシンから選択される抗生物質である、請求項２に記載の自己免疫性疾患治療薬。
  4. 　配列番号３に示される塩基配列を有する前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列中の塩基Ｘが人工的に製造された塩基であり、前記人工的に製造された塩基が中分子化合物、高分子化合物、生体高分子、または生体親和性のあるポリマーで化学修飾されている、請求項１に記載の自己免疫性疾患治療薬。
  5. 　前記高分子化合物が、分子量２００００以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、または、分子量２００００以上の生体親和性のある任意の高分子である、請求項４に記載の自己免疫性疾患治療薬。
  6. 　配列番号１から３のいずれかに記載の塩基配列を有し、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）へ選択的に結合することで自己免疫性疾患治療効果を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド。
  7. 　配列番号３に示される塩基配列中の塩基Ｘが人工的に製造された塩基であり、前記人工的に製造された塩基が、低分子化合物で化学修飾された、請求項６に記載の自己免疫性疾患治療効果を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド。
  8. 　前記低分子化合物が、グルココルチコイド、タクロリムス、シロリムス、サイクロスポリン、メトトレキサート、レフルノミドから選択される抗炎症化合物であるか、または、エリスロマイシン、アジズスロマイシン、カナマイシン、オフロキサシン、ガチフロキサシン、テトラサイクリン、バンコマイシンから選択される抗生物質である、請求項７に記載の自己免疫性疾患治療効果を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド。
  9. 　配列番号３に示される塩基配列中の塩基Ｘが人工的に製造された塩基であり、前記人工的に製造された塩基が、中分子化合物、高分子化合物、生体高分子、または生体親和性のあるポリマーで化学修飾された、請求項６に記載の自己免疫性疾患治療効果を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド。
  10. 　前記人工的に製造された塩基を修飾する前記高分子化合物が、分子量２００００以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、または、分子量２００００以上の生体親和性のある任意の高分子である、請求項９に記載の自己免疫性疾患治療効果を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド。
  11. 　治療対象とする自己免疫性疾患が、円形脱毛症、尋常性白斑、乾癬、強皮症、皮膚筋炎、アトピー性皮膚炎、皮膚エリテマトーデス、ＩｇＡ性皮膚炎からなる群から選択される自己免疫性皮膚疾患である、請求項１から５のいずれか１項に記載の自己免疫性疾患治療薬。
  12. 　治療対象とする自己免疫性疾患が、間質性膀胱炎および膀胱痛症候群からなる群から選択される、膀胱における自己免疫性疾患である、請求項１から５のいずれか１項に記載の自己免疫性疾患治療薬。
  13. 　治療対象とする自己免疫性疾患が、ぶどう膜炎、ドライアイ、乾性角膜炎、上強膜炎・強膜炎からなる群から選択される、目における自己免疫性疾患である、請求項１から５のいずれか１項に記載の自己免疫性疾患治療薬。
  14. 　治療対象とする自己免疫性疾患が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、子宮内膜症、心筋炎、Ｉ型糖尿病、甲状腺炎、早期卵巣不全、シェーングレン症候群、レイノー症候群、関節リウマチ、重症筋無力症、高安動脈炎、アジソン病、ギラン・バレー症候群、甲状腺機能低下症、サルコイドーシス、血球貪食性リンパ組織球症、血栓性血小板減少性紫斑病、自己免疫性肝炎からなる群から選択される、全身性の自己免疫性疾患である、請求項１から５のいずれか１項に記載の自己免疫性疾患治療薬。
  15. 　治療対象とする自己免疫性疾患が、クローン病、潰瘍性大腸炎、自己免疫性膵炎、胆汁性胆道炎、自己免疫性萎縮性胃炎からなる群から選択される消化器の自己免疫性疾患である、請求項１から５のいずれか１項に記載の自己免疫性疾患治療薬。
  16. 　治療対象とする自己免疫性疾患が、円形脱毛症、尋常性白斑、乾癬、強皮症、皮膚筋炎、アトピー性皮膚炎、皮膚エリテマトーデス、ＩｇＡ性皮膚炎から選択される自己免疫性皮膚疾患である、請求項６から１０のいずれか１項に記載のＤＮＡオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する自己免疫性疾患治療薬。
  17. 　治療対象とする自己免疫性疾患が、間質性膀胱炎および膀胱痛症候群からなる群から選択される、膀胱における自己免疫性疾患である、請求項６から１０のいずれか１項に記載のＤＮＡオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する自己免疫性疾患治療薬。
  18. 　治療対象とする自己免疫性疾患が、ぶどう膜炎、ドライアイ、乾性角膜炎、上強膜炎、強膜炎からなる群から選択される、目における自己免疫性疾患である、請求項６から１０のいずれか１項に記載のＤＮＡオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する自己免疫性疾患治療薬。
  19. 　治療対象とする自己免疫性疾患が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、子宮内膜症、心筋炎、Ｉ型糖尿病、甲状腺炎、早期卵巣不全、シェーングレン症候群、レイノー症候群、関節リウマチ、重症筋無力症、高安動脈炎、アジソン病、ギラン・バレー症候群、甲状腺機能低下症、サルコイドーシス、血球貪食性リンパ組織球症、血栓性血小板減少性紫斑病、自己免疫性肝炎からなる群から選択される、全身性の自己免疫性疾患である、請求項６から１０のいずれか１項に記載のＤＮＡオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する自己免疫性疾患治療薬。
  20. 　治療対象とする自己免疫性疾患が、クローン病、潰瘍性大腸炎、自己免疫性膵炎、胆汁性胆道炎、自己免疫性萎縮性胃炎からなる群から選択される消化器の自己免疫性疾患である、請求項６から１０のいずれか１項に記載のＤＮＡオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する自己免疫性疾患治療薬。
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