WO2023048299A1 - Ｘｋ及び／又はｖｐｓ１３ａの利用 - Google Patents

Ｘｋ及び／又はｖｐｓ１３ａの利用 Download PDF

Info

Publication number
WO2023048299A1
WO2023048299A1 PCT/JP2022/036003 JP2022036003W WO2023048299A1 WO 2023048299 A1 WO2023048299 A1 WO 2023048299A1 JP 2022036003 W JP2022036003 W JP 2022036003W WO 2023048299 A1 WO2023048299 A1 WO 2023048299A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
vps13a
cells
expression
cell
function
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/036003
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
重一 長田
優太 領田
Original Assignee
国立大学法人大阪大学
大塚製薬株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人大阪大学, 大塚製薬株式会社 filed Critical 国立大学法人大阪大学
Publication of WO2023048299A1 publication Critical patent/WO2023048299A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the cell membrane is composed of a lipid bilayer of phospholipids. Phospholipids with different headgroups and acyl residues are asymmetrically distributed between the outer and inner lobes of the cell membrane. Phosphatidylserine (PtdSer), phosphatidylethanolamine (PtdEtn) and phosphatidylinositol (PtdIns) are restricted to the inner leaflet of the cell membrane, while most phosphatidylcholine (PtdCho) and sphingomyelin (SM) are localized to the outer leaflet. . The asymmetric distribution of phospholipids contributes to signal transduction, protein partitioning, and maintenance of membrane integrity. ATP11A and ATP11C, which are P4-type ATPases present in the cell membrane together with CDC50A, act as flippases to maintain PtdSer and PtdEtn in the inner leaflet.
  • Non-Patent Document 1 When cells undergo apoptosis, caspases are activated to cleave ATP11A and ATP11C, and ATP11A and ATP11C are inactivated by an increase in intracellular Ca 2+ in activated platelets. Apoptotic cells expose PtdSer within hours, whereas activated platelets expose PtdSer within minutes.
  • ATP is the intracellular energy currency present in the cytosol at concentrations of approximately 4 mM. Its extracellular concentration is low or in the nanomolar range under physiological conditions, but reaches hundreds of micromolar in inflamed tissue or tumor environments (2, 3, 4). ATP and its metabolites are released from cells and bind to purinergic receptors (P1, P2X and P2Y), which are G protein-coupled receptors or ion channels (Non-Patent Document 2).
  • P2X7 encoded by P2RX7, is an ATP-gated cation channel composed of a protein homotrimer with two transmembrane helices with a short N-terminal cytoplasmic domain and a long C-terminal cytoplasmic domain. It is expressed in a variety of cells, including immune cells and some tumor cells. Brief exposure of P2X7 to high doses of ATP induces the formation of non-selective cation channels leading to potassium efflux and sodium and calcium influx, with reversible PtdSer exposure. On the other hand, prolonged exposure to high concentrations of ATP causes membrane rupture and cell death.
  • mice T cell transformants expressing P2X7 respond to high concentrations of ATP for PtdSer exposure.
  • CRISPR/Cas9 screening identified Eros as a molecule essential for the expression of P2X7 at the cell membrane, and further disclosed a P2X7 receptor expression regulator (Patent Document 1).
  • One challenge is to provide a means of modulating cell death or modulating P2X7 receptor expression.
  • XK and VPS13A are essential for this process.
  • XK and VPS13A form a complex at the cell membrane and scramble the phospholipids (the asymmetry of the phospholipids inside and outside the cell membrane is disrupted by the function of phospholipid scramblase), resulting in membrane rupture and XK
  • the -VPS13A pathway plays an important role in ATP-induced killing of murine CD25 + CD4 + T cells.
  • Item 1 A method for modulating a cell function, comprising contacting a cell in need thereof with at least one selected from the group consisting of an XK expression regulator, an XK function regulator, a VPS13A expression regulator, and a VPS13A function regulator.
  • method including Item 2 A method of modulating cell membrane scrambling (e.g., cell membrane scrambling resulting from stimulation by extracellular ATP) comprising a cell in need thereof and an XK expression modulating agent, an XK function modulating agent, a VPS13A expression modulating agent and VPS13A function A method comprising contacting with at least one selected from the group consisting of a modulating agent.
  • cell membrane scrambling e.g., cell membrane scrambling resulting from stimulation by extracellular ATP
  • Item 3 A method of regulating cell death (e.g., extracellular ATP-dependent cell death), comprising a cell in need thereof, an XK expression modulating agent, an XK function modulating agent, a VPS13A expression modulating agent, and a VPS13A function modulating agent A method comprising contacting with at least one selected from Item 4 A method for suppressing cell death (e.g., extracellular ATP-dependent cell death), comprising a cell in need thereof, an XK expression regulator, an XK function regulator, a VPS13A expression regulator, and a VPS13A function regulator A method comprising contacting with at least one selected from Item 5 A method for promoting cell death (e.g., extracellular ATP-dependent cell death), comprising a cell in need thereof, an XK expression regulator, an XK function regulator, a VPS13A expression regulator, and a VPS13A function regulator A method comprising contacting with at least one selected from Item 6 A method of preventing, ameliorating or
  • a method comprising administering at least one selected from the group consisting of a modulating agent, an XK function modulating agent, a VPS13A expression modulating agent and a VPS13A function modulating agent.
  • Item 7 A method for treating or preventing cancer, comprising administering at least one selected from the group consisting of an XK expression regulator, an XK function regulator, a VPS13A expression regulator, and a VPS13A function regulator to a subject in need thereof.
  • a method comprising: Item 8 A method for modulating P2X7 receptor activity, comprising a cell requiring the same and at least one selected from the group consisting of an XK expression modulating agent, an XK function modulating agent, a VPS13A expression modulating agent and a VPS13A function modulating agent. A method comprising contacting.
  • Item 9 A method for suppressing P2X7 receptor activity, comprising a cell requiring the same and at least one selected from the group consisting of an XK expression regulator, an XK function regulator, a VPS13A expression regulator and a VPS13A function regulator.
  • a method comprising contacting.
  • Item 10 A method for promoting P2X7 receptor activity, comprising: a cell in need thereof and at least one selected from the group consisting of an XK expression regulator, an XK function regulator, a VPS13A expression regulator and a VPS13A function regulator; A method comprising contacting.
  • Item 11 Any one of Items 1 to 4 and 6 to 9, wherein the at least one comprises at least one selected from the group consisting of an XK expression inhibitor, an XK function inhibitor, a VPS13A expression inhibitor and a VPS13A function inhibitor. The method described in .
  • Item 12 Any one of Items 1 to 3, 5 to 8 and 10, wherein the at least one type comprises at least one selected from the group consisting of an XK expression promoter, an XK function promoter, a VPS13A expression promoter and a VPS13A function promoter.
  • the method according to item 1. Item 13 Item 12. The method according to any one of Items 1 to 4, 6 to 9 and 11, wherein said at least one comprises an XK expression inhibitor or a VPS13A expression inhibitor.
  • Item 14 Item 14. The method of Item 13, wherein the XK expression inhibitor or VPS13A expression inhibitor comprises a polynucleotide.
  • the XK expression inhibitor or VPS13A expression inhibitor is XK-specific siRNA or VPS13A-specific siRNA, XK-specific miRNA or VPS13A-specific miRNA, XK-specific antisense nucleic acid or VPS13A-specific antisense nucleic acid, and expression cassettes thereof , and at least one selected from the group consisting of an XK gene editing agent or a VPS13A gene editing agent.
  • Item 16 Any of Items 1, 3, 4, 8, 9, 11 and 13 to 15, wherein the cell is a cell that requires suppression of cell membrane scrambling (e.g., cell membrane scrambling resulting from stimulation by extracellular ATP). The method according to item 1.
  • Item 17 Items 1-3, 5-8, 10 and 12, wherein said at least one comprises an XK expression promoter or a VPS13A expression promoter.
  • Item 18 18. The method of paragraph 17, wherein the XK expression-enhancing agent or VPS13A expression-enhancing agent comprises an XK expression cassette or a VPS13A expression cassette.
  • Item 19 Any of paragraphs 1, 3, 5, 8, 10, 12, 17 and 18, wherein said cell is a cell that requires stimulation of cell membrane scrambling (e.g., cell membrane scrambling resulting from stimulation by extracellular ATP) The method according to item 1.
  • Item 20 20 The method of any one of paragraphs 1-5 and 8-19, wherein said cells are selected from immune cells and genetically modified cells.
  • the immune cells are T cells (e.g., regulatory T cells, memory T cells, iNKT cells, and ⁇ (gamma delta) T cells), macrophages (e.g., microglia), dendritic cells, mast cells, NK cells and B cells selected from, or said genetically modified cells are genetically modified stem cells (e.g., induced pluripotent stem cells (iPS cells)) and cells differentiated therefrom (e.g., iPS cell-derived T cells), genetically modified Hematopoietic stem cells, transgenic hematopoietic progenitor cells (e.g., megakaryocytes), transgenic differentiated blood cells (e.g., platelets, erythrocytes), and transgenic immune cells (e.g., chimeric antigen receptor (CAR) expressing T 21.
  • T cells e.g., regulatory T cells, memory T cells, iNKT cells, and ⁇ (gamma delta) T cells
  • macrophages e.
  • Item 25 The XK expression regulator, XK function regulator, VPS13A expression regulator, VPS13A function regulator, XK expression inhibitor, XK function inhibitor, VPS13A expression inhibitor, VPS13A function inhibitor, XK expression promoter, XK function promoter 25.
  • Item 26 Item 26. The method according to any one of Items 1 to 25, performed in vitro or ex vivo.
  • Section 1A A cell function regulator comprising at least one selected from the group consisting of XK expression regulators, XK function regulators, VPS13A expression regulators and VPS13A function regulators.
  • Item 2A Cell membrane scrambling (e.g., cell membrane scrambling caused by stimulation with extracellular ATP) containing at least one selected from the group consisting of XK expression regulators, XK function regulators, VPS13A expression regulators, and VPS13A function regulators regulator.
  • Item 3A A cell death (for example, extracellular ATP-dependent cell death) regulator comprising at least one selected from the group consisting of XK expression regulators, XK function regulators, VPS13A expression regulators and VPS13A function regulators.
  • Section 4A A cell death (for example, extracellular ATP-dependent cell death) inhibitor containing at least one selected from the group consisting of XK expression inhibitors, XK function inhibitors, VPS13A expression inhibitors and VPS13A function inhibitors.
  • Item 5A A cell death (for example, extracellular ATP-dependent cell death) promoter comprising at least one selected from the group consisting of XK expression promoters, XK function promoters, VPS13A expression promoters and VPS13A function promoters.
  • Item 6A A group consisting of pain, inflammatory diseases, and central nervous system diseases (e.g., depression), including at least one selected from the group consisting of XK expression regulators, XK function regulators, VPS13A expression regulators, and VPS13A function regulators
  • Item 8A An agent for regulating, suppressing, or promoting P2X7 receptor-mediated cellular functions, comprising at least one selected from the group consisting of XK expression regulators, XK function regulators, VPS13A expression regulators, and VPS13A function regulators.
  • Item 9A An inhibitor of P2X7 receptor-mediated cell function, comprising at least one selected from the group consisting of XK expression inhibitors, XK function inhibitors, VPS13A expression inhibitors and VPS13A function inhibitors.
  • Item 10A A P2X7 receptor-mediated cell function promoter comprising at least one selected from the group consisting of XK expression promoters, XK function promoters, VPS13A expression promoters and VPS13A function promoters.
  • Item 11A Any one of Items 1A to 4A and 6A to 9A, wherein the at least one comprises at least one selected from the group consisting of an XK expression inhibitor, an XK function inhibitor, a VPS13A expression inhibitor and a VPS13A function inhibitor.
  • Item 12A Any one of items 1A to 3A, 5A to 8A and 10A, wherein the at least one type comprises at least one selected from the group consisting of an XK expression promoter, an XK function promoter, a VPS13A expression promoter and a VPS13A function promoter.
  • Item 13A The agent according to any one of Items 1A to 4A, 6A to 9A and 11A, comprising an XK expression inhibitor or a VPS13A expression inhibitor.
  • Item 14A The agent according to Item 13A, wherein the XK expression inhibitor or VPS13A expression inhibitor comprises a polynucleotide.
  • Item 15A The XK expression inhibitor or VPS13A expression inhibitor is XK-specific siRNA or VPS13A-specific siRNA, XK-specific miRNA or VPS13A-specific miRNA, XK-specific antisense nucleic acid or VPS13A-specific antisense nucleic acid, and expression cassettes thereof , and XK gene editing agents or VPS13A gene editing agents.
  • Item 16A The agent according to any one of Items 1A, 6A-9A, 11A and 13A-15A for suppressing cell death (eg, extracellular ATP-dependent cell death).
  • Item 17A The agent according to any one of Items 1A, 3A, 4A, 6A-9A, 11A and 13A-15A, for suppressing cell membrane scrambling (eg, cell membrane scrambling resulting from stimulation by extracellular ATP).
  • Item 18A The agent according to any one of Items 1A to 3A, 5A to 8A, 10A and 12A, comprising an XK expression promoter or a VPS13A expression promoter.
  • Item 19A The agent according to Item 18A, wherein the XK expression-enhancing agent or VPS13A expression-enhancing agent comprises an XK expression cassette or a VPS13A expression cassette.
  • Item 20A The agent of any one of paragraphs 1A, 2A, 6A-8A, 10A, 13A, 18A and 19A for promoting cell death (eg, extracellular ATP-dependent cell death).
  • Item 21A The agent of any one of paragraphs 1A, 3A, 5A-8A, 10A, 12A, 18A and 19A for promoting cell membrane scrambling (eg, cell membrane scrambling resulting from stimulation by extracellular ATP).
  • Item 22A The agent of any one of paragraphs 1A-5A and 8A-21A, wherein said cells are selected from immune cells and genetically modified cells.
  • the immune cells are T cells (e.g., regulatory T cells, memory T cells, iNKT cells, and ⁇ (gamma delta) T cells), macrophages (e.g., microglia), dendritic cells, mast cells, NK cells and B or wherein said genetically modified cells are genetically modified hematopoietic stem cells, genetically modified hematopoietic progenitor cells (e.g., megakaryocytes), genetically modified differentiated blood cells (e.g., platelets, erythrocytes), and genetically modified cells
  • engineered immune cells eg, T cells expressing chimeric antigen receptors (CAR), T cells transduced with cancer antigen recognizing T cell receptors (TCR)).
  • CAR chimeric antigen receptors
  • TCR cancer antigen recognizing T cell receptors
  • Item 24A The agent according to any one of Items 1A-5A and 8A-21A, wherein said cells are T cells.
  • Item 25A The agent according to any one of Items 1A to 5A and 8A to 21A, which is for promoting differentiation into memory T cells and/or maintenance.
  • Item 26A The agent according to any one of Items 1A-5A and 8A-21A, wherein said cells are platelets or erythrocytes.
  • Item 27A The agent according to any one of Items 1A to 26A, which is a pharmaceutical, reagent or food composition.
  • Item 28A A cell into which the agent of any one of Items 1A to 27A has been introduced.
  • Item 29A A T cell into which the agent of any one of Items 5A, 10A and 18A-21A has been introduced.
  • Item 30A The T cell of Paragraph 29A, which can be modulated to transiently render XK or VPS13A expression and/or XK or VPS13A function redundant.
  • Item 31A The T cell of Clause 29A or 30A, wherein the agent of any one of Clauses 4A, 9A and 13A-17A is further introduced.
  • Item 32A The T cell of Paragraph 31A, which is capable of suppressing XK or VPS13A expression and/or XK or VPS13A function after transiently enhancing XK or VPS13A expression and/or XK or VPS13A function.
  • Item 1B Deleting XK and/or VPS13A in cells and/or suppressing the expression and/or function of XK and/or VPS13A in cells A method for producing cells in which cell death is suppressed.
  • Item 2B introducing XK and/or VPS13A into the cell and/or promoting the expression and/or function of XK and/or VPS13A in the cell; A method for producing cells susceptible to high ATP concentration dependent cell death.
  • Item 3B The method of Section 1B or 2B for manufacturing cells for drug delivery.
  • Item 4B The method of any one of paragraphs 1B-3B, performed in vitro or ex vivo.
  • a means of modulating cell death or modulating P2X7 receptor expression is provided.
  • Genome-wide CRISPR screen for genes involved in P2X7-mediated PtdSer exposure (A) Shows the scheme of genome-wide CRISPR screening. (B) Genes targeted by the enriched sgRNAs; genes for which 4, 5 or 6 unique sgRNAs were detected in deep sequencing plotted by abundance (percentage of total reads). (C) Deletion of exon 3 of the Xk gene by sgRNAs of H2A-L1 histone family members. Eleven well-conserved histone H2A-L1 family genes are present in the exon 3 flanking region of the Xk gene. FIG. 13 shows the establishment of P2X7-, Xk- or Vps13a-deficient cell lines.
  • Lane 1 relates to “P2X7 ⁇ / ⁇ 16F ⁇ / ⁇ (DKO)” cells generated by knocking out TMEM16F ⁇ / ⁇ WR19L.
  • Lane 2 relates to "DKO-P2X7” established by transforming DKO with mouse P2X7.
  • Lane 3 relates to 'Xk ⁇ / ⁇ ' which knocked out the Xk gene of DKO-P2X7 in Xk ⁇ / ⁇ DKO-P2X7.
  • Lane 4 relates to Xk ⁇ / ⁇ DKO-P2X7/Xk 'Xk ⁇ / ⁇ -Xk' generated by transforming Xk ⁇ / ⁇ DKO-P2X7 with FLAG-tagged mouse Xk.
  • Lane 5 relates to 'Vps13a ⁇ / ⁇ ' in which the Vps13a gene was knocked out in DKO-P2X7.
  • Lane 6 relates to 'Vps13a ⁇ / ⁇ -Vps13a' in which Vps13a ⁇ / ⁇ DKO-P2X7 was transformed with mouse Vps13a in Vps13a ⁇ / ⁇ DKO-P2X7/Vps13a.
  • Lane 7 relates to 'Xk ⁇ / ⁇ Vps13a ⁇ / ⁇ ' in which the Xk and Vps13a genes were knocked out in DKO-P2X7.
  • Western blotting was performed with antibodies against P2X7, Xk or Vps13a and membranes were stained with CBB. (B) for cell surface expression of P2X7k.
  • Annexin V staining profiles in the PI-negative population are shown on the left.
  • B cells were incubated with 500 ⁇ M ATP in the presence of 250 nM NBD-PC for the indicated times at 4° C., and BSA-unextractable NBD-PC was detected by flow cytometry.
  • C cells were continuously incubated in annexin buffer containing 500 ⁇ M ATP and 2.5 ⁇ g/ml PI at 4° C. for 5 min and room temperature for 10 min and analyzed by flow cytometry. Cell populations considered PI-positive are indicated by bars in the top lane. Experiments were performed in triplicate. Mean fluorescence intensity (MFI) values are shown on the right side of (A) and (B) with SE (bars).
  • MFI Mean fluorescence intensity
  • FIG. 4 shows complex formation between Xk and Vps13a in WR19L cells.
  • A BN-PAGE analysis of Xk and Vps13a in WR19L. Solubilized crude membrane fractions (4.2 ⁇ g of proteins) were separated by BN-PAGE and analyzed by Western blotting with anti-Xk Ab (left panel) or anti-Vps13a Ab (right panel). Each membrane was stained with CBB and shown in the bottom panel.
  • B shows cellular localization of Xk.
  • FIG. 2 shows expression of P2X7, Xk and Vps13a in mouse splenic T cells.
  • CD4 + T cells from Xk +/y and Xk ⁇ /y mice were stained with PE-anti-CD4 mAb and FITC-anti-CD25 mAb. Staining profiles in the SYTOX Blue negative population are shown. Percentage of CD25 + population in CD4 + splenic T cells from 3 different mice is shown as mean ⁇ SE. (B) shows expression of P2X7, Xk and Vps13a in CD4 + T cells. CD25 ⁇ CD4 + and CD25 + CD4 + populations were recovered from splenic CD4 + T cells of Xk +/y and Xk ⁇ /y mice by FACSAria II.
  • FIG. 4 shows involvement of Xk in ATP-induced PtdSer exposure and cell lysis in CD25 + CD4 + T cells.
  • A Shows the effect of Xk on ATP-induced PtdSer exposure in CD4 + T cells.
  • CD4 + T cells from Xk +/y and Xk ⁇ /y mice were mixed with PE-anti-CD4 mAb and FITC-anti-CD25 mAb and incubated at 10° C. for the indicated times in the presence of Annexin V and SYTOX Blue. Stimulated with 500 ⁇ M ATP and analyzed by flow cytometry.
  • Annexin V staining profiles in SYTOX Blue negative CD25 ⁇ CD4 + (left column) and CD25 + CD4 + (right column) populations are shown. Experiments were performed in three different mice and the mean MFI of Annexin V staining in the CD25 + CD4 + population was plotted in (B) with SE (bars).
  • (C) shows the effect of Xk on ATP-induced cytolysis in CD25 + CD4 + T cells.
  • CD4 + T cells from wild-type and Xk-deficient mice were stained sequentially with LIVE/DEAD violet fluorochrome and APC-anti-CD4 mAb and APC-Cy7-anti-CD25 mAb.
  • FIG. 3 shows the conserved structure between Xkr8 and Xk.
  • A Mouse Xk and Xkr8 amino acid sequences were aligned for maximum homology. The ⁇ -helices are numbered and the regions shaded. Helices ⁇ 1- ⁇ 10 are within the membrane.
  • FIG. 2 shows a sequence alignment of H2al1 mutant genes.
  • Nucleotide sequences of 11 mouse H2al1 mutant genes (GenBank NM_001111037, 001242947, 001242949, 001242950, 001025260, 001242951, 001242952, 001242953, 001242954, 0010859587, 001085587) were aligned. Bases not in italics are conserved nucleotides in all 11 variants, nucleotides conserved in 7 or more and 10 or fewer variants are shown in bold italic. Underlining indicates the protospacer sequence and double underlining indicates the protospacer adjacent motif (PAM). Start (ATG) and stop (TGA) codons are shaded in gray.
  • the sequence of H2al1a is SEQ ID NO:9
  • the sequence of H2al1b is SEQ ID NO:10
  • the sequence of H2al1c is SEQ ID NO:11
  • the sequence of H2al1d is SEQ ID NO:12
  • the sequence of H2alle is SEQ ID NO:13
  • the sequence of H2al1f is SEQ ID NO: 14
  • the sequence of H2al1g is SEQ ID NO: 15
  • the sequence of H2al1h is SEQ ID NO: 16
  • the sequence of H2al1i is SEQ ID NO: 17
  • the sequence of H2al1k is SEQ ID NO: 18,
  • the sequence of H2al1m is SEQ ID NO:19. Gene knockout by CRISPR-Cas9 system in mouse WR19L cells.
  • the protospacer sequence is highlighted in shading, the protospacer adjacent motif (PAM) is underlined, and the arrow points to the cleavage site.
  • Identity of an amino acid sequence refers to the degree of matching of two or more comparable amino acid sequences to each other. Therefore, the higher the identity or similarity between two amino acid sequences, the higher the identity or similarity between those sequences.
  • the level of amino acid sequence identity can be determined, for example, using the sequence analysis tool FASTA with default parameters. It can also be determined using the algorithm BLAST by Karlin and Altschul. A program called BLASTX based on such a BLAST algorithm has been developed. Specific methods of these analysis methods are known, and the website of the National Center of Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) can be referred to. "Identity" of base sequences is also defined according to the above.
  • conservative substitution means that an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain.
  • substitutions between amino acid residues having basic side chains such as lysine, arginine, and histidine correspond to conservative substitutions.
  • amino acid residues having acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid
  • amino acid residues having uncharged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine and cysteine
  • alanine, valine, leucine, isoleucine amino acid residues with nonpolar side chains such as proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • amino acid residues with ⁇ -branched side chains such as threonine, valine, isoleucine
  • aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine. Substitutions between amino acid residues are also conservative substitutions.
  • nucleic acid and “polynucleotide” are not particularly limited and include both natural and artificial ones. Specifically, in addition to DNA, RNA, etc., known chemical modification may be applied as exemplified below. Substitution of the phosphate residue of each nucleotide with a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate (PS), methylphosphonate, phosphorodithionate, etc. to prevent degradation by hydrolases such as nucleases can be done.
  • PS phosphorothioate
  • methylphosphonate methylphosphonate
  • phosphorodithionate etc.
  • the hydroxyl group at the 2nd position of the sugar (ribose) of each ribonucleotide is replaced by -OR (R is, for example, CH 3 (2'-O-Me), CH 2 CH 2 OCH 3 (2'-O-MOE), CH2CH2NHC (NH ) NH2 , CH2CONHCH3 , CH2CH2CN, etc.) .
  • R is, for example, CH 3 (2'-O-Me), CH 2 CH 2 OCH 3 (2'-O-MOE), CH2CH2NHC (NH ) NH2 , CH2CONHCH3 , CH2CH2CN, etc.
  • the base moiety pyrimidine, purine
  • phosphate moiety or hydroxyl moiety has been modified with biotin, an amino group, a lower alkylamine group, an acetyl group, or the like.
  • BNA LNA
  • the conformation of the sugar moiety is fixed to the N-type by bridging the 2' oxygen and 4' carbon of the sugar moiety of the nucleotide, can also be used.
  • a method of modulating cell membrane scrambling, cell death, and/or P2X7 receptor activity, or a method of treating or preventing a disease comprises a cell in need thereof and an XK expression modulator, an XK function modulator, or VPS13A expression modulator preferably comprising contacting with at least one selected from the group consisting of an agent and a VPS13A function modulating agent.
  • Modulators of cell membrane scrambling, cell death, and/or P2X7 receptor activity, or therapeutic or preventive agents for diseases are the group consisting of XK expression regulators, XK function regulators, VPS13A expression regulators, and VPS13A function regulators It is preferable to include at least one selected from.
  • XK expression regulators, XK function regulators, VPS13A expression regulators, and VPS13A function regulators may be collectively referred to simply as "regulators.”
  • the XK expression regulator regulates the expression of the XK (X-linked Kx blood group antigen) gene.
  • An XK function modulator is one that modulates the function of XK.
  • a VPS13A expression regulator regulates the expression of the VPS13A (vacuolar protein sorting 13 homolog A) gene.
  • a VPS13A function modulating agent modulates the function of VPS13A.
  • the molecular structures of XK and VPS13A and the genes encoding them may differ depending on their origin, and the types of cells (or subjects containing them) from which they are derived (or exist) are not particularly limited.
  • subjects (or sources of cells) include animals such as various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, rabbits, pigs, horses, cows, sheep, goats, and deer.
  • the amino acid sequences of XK and VPS13A derived from various species and the base sequences of XK mRNA and VPS13A mRNA are known.
  • the human XK protein includes a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (NCBI Reference Sequence: NM 021083.3)
  • the human VPS13A protein includes a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (NCBI Reference Sequence: NM_033305 .3)
  • mouse XK protein includes a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (NCBI Reference Sequence: NM 023500.2), etc.
  • Mouse VPS13A protein includes a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (NCBI Reference Sequence: NM_173028.4), etc.
  • Human XK mRNA includes mRNA represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5
  • human VPS13A mRNA is mRNA represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
  • Mouse Xk mRNA includes mRNA represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO:7
  • mouse Vps13a mRNA includes mRNA represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO:8.
  • XK protein, VPS13A protein, XK mRNA, and VPS13A mRNA may also include these splicing variants.
  • XK includes not only human XK but also orthologues of other species.
  • VPS13A includes not only human VPS13A, but also orthologs of other species.
  • XK and VPS13A to be regulated have their original functions, that is, XK functions as a phospholipid scramblase and VPS13A functions as a lipid transporter, amino acid mutations such as substitutions, deletions, additions, and insertions may have Mutations include preferably substitutions, more preferably conservative substitutions, from the viewpoint that activity is less likely to be impaired.
  • the XK mRNA and VPS13A mRNA to be regulated may also have nucleotide mutations such as substitutions, deletions, additions, and insertions, as long as the proteins translated from the mRNAs have their original functions.
  • the mutation is preferably a mutation that does not cause amino acid substitution or a mutation that causes conservative amino acid substitution in the protein translated from the mRNA.
  • Preferred specific examples of the XK protein to be regulated include the protein described in (a) below and the protein described in (b) below: (a) a protein consisting of the amino acid sequence shown in either SEQ ID NO: 1 or 3, and (b) consisting of an amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in either SEQ ID NO: 1 or 3 and at least one selected from the group consisting of proteins having a function as a phospholipid scramblase.
  • the identity is more preferably 90% or higher, more preferably 95% or higher, and even more preferably 98% or higher.
  • Examples of the protein described in (b) above include, for example, (b') substitution, deletion, addition, or insertion of one or more amino acids in the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 and 3. and a protein having a function as a phospholipid scramblase.
  • a plurality is, for example, 2 to 20, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 5, and even more preferably 2 or 3.
  • XK mRNA to be regulated include the mRNA described in (c) below and the mRNA described in (d) below: (c) mRNA consisting of the nucleotide sequence shown in either SEQ ID NO: 5 or 7; and (d) consisting of a nucleotide sequence having 85% or more identity with the nucleotide sequence shown in either SEQ ID NO: 5 or 7. and mRNA encoding a protein having a function as a phospholipid scramblase At least one selected from the group consisting of
  • the identity is more preferably 90% or higher, more preferably 95% or higher, and even more preferably 98% or higher.
  • mRNA described in (d) above is, for example, (d') substitution, deletion, addition, or insertion of one or more bases in the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 5 and 7.
  • mRNA consisting of a base sequence encoded by a phospholipid scramblase and encoding a protein having a function as a phospholipid scramblase are mentioned.
  • a plurality is, for example, 2 to 200, preferably 2 to 100, more preferably 2 to 50, and even more preferably 2 to 10.
  • VPS13A protein to be regulated include the protein described in (e) below and the protein described in (f) below: (e) a protein consisting of the amino acid sequence shown in either SEQ ID NO: 2 or 4, and (f) consisting of an amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in either SEQ ID NO: 2 or 4 , and at least one selected from the group consisting of proteins having a function as a lipid transporter.
  • the identity is more preferably 90% or higher, more preferably 95% or higher, and even more preferably 98% or higher.
  • Examples of the protein described in (f) above include, for example, (f′) substitution, deletion, addition, or insertion of one or more amino acids in the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 and 4.
  • a protein consisting of a sequence of amino acids identified as a lipid transporter and having a function as a lipid transporter.
  • a plurality is, for example, 2 to 20, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 5, and even more preferably 2 or 3.
  • VPS13A mRNA to be regulated include the mRNA described in (g) below and the mRNA described in (h) below: (g) mRNA consisting of the nucleotide sequence shown in either SEQ ID NO: 6 or 8, and (h) consisting of a nucleotide sequence having 85% or more identity with the nucleotide sequence shown in either SEQ ID NO: 6 or 8 and mRNA encoding a protein having a function as a lipid transporter At least one selected from the group consisting of
  • the identity is more preferably 90% or higher, more preferably 95% or higher, and even more preferably 98% or higher.
  • mRNA described in (h) above is, for example, mRNA consisting of a sequence of nucleotides that encodes a protein having a function as a lipid transporter is mentioned.
  • a plurality is, for example, 2 to 200, preferably 2 to 100, more preferably 2 to 50, and even more preferably 2 to 10.
  • the XK expression regulator is not particularly limited as long as it can regulate the expression of the XK protein or XK mRNA expressed in the organism or cell to be subjected to expression regulation. It includes an expression promoter and the like.
  • the VPS13A expression regulating agent is not particularly limited as long as it can regulate the expression of VPS13A protein or VPS13A mRNA expressed in the target organism or cell for expression regulation. etc.
  • the XK expression regulator and/or VPS13A expression regulator can be used singly or in combination of two or more.
  • the XK expression suppressor is not particularly limited as long as it can suppress the expression level of XK protein, XK mRNA, etc.
  • Examples include XK-specific small interfering RNA (siRNA), XK-specific microRNA (miRNA ), XK-specific antisense nucleic acids, expression vectors thereof; XK-specific ribozymes; XK gene editing agents by CRISPR/Cas system, and the like.
  • the VPS13A expression inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the expression level of VPS13A protein, VPS13A mRNA, etc.
  • Examples include VPS13A-specific small interfering RNA (siRNA), VPS13A-specific microRNA (miRNA), VPS13A Specific antisense nucleic acids, expression vectors thereof, XK-specific ribozymes, XK gene editing agents by CRISPR/Cas system, and the like are included.
  • expression suppression means that the expression level of XK protein, VPS13A protein, XK mRNA, or VPS13A mRNA is reduced to, for example, 1/2, 1/3, 1/5, 1/10, 1/20, 1/30, It means suppressing to 1/50, 1/100, 1/200, 1/300, 1/500, 1/1000, 1/10000 or less, and includes setting the expression level to 0.
  • siRNA, miRNA, antisense nucleic acid, and ribozyme XK-specific siRNA are not particularly limited as long as they are double-stranded RNA molecules that specifically suppress the expression of the gene encoding XK.
  • VPS13A-specific siRNA is not particularly limited as long as it is a double-stranded RNA molecule that specifically suppresses the expression of the gene encoding VPS13A.
  • the siRNA is preferably, for example, 18 bases or longer, 19 bases or longer, 20 bases or longer, or 21 bases or longer.
  • the siRNA preferably has a length of, for example, 25 bases or less, 24 bases or less, 23 bases or less, or 22 bases or less.
  • any combination of the upper and lower limits of the siRNA length described herein is assumed. For example, a length with a lower limit of 18 bases and an upper limit of 25 bases, 24 bases, 23 bases, or 22 bases; A length with a lower limit of 20 bases and an upper limit of 25, 24, 23, or 22 bases; a lower limit of 21 bases with an upper limit of 25, 24, 23, or 22 bases. Combinations of lengths that are bases are envisioned.
  • siRNA may be shRNA (small hairpin RNA).
  • a portion of shRNA can be designed to form a stem-loop structure.
  • sequence a if the sequence of a certain region is sequence a, and the complementary strand to sequence a is sequence b, these sequences are present in one RNA strand in the order of sequence a, spacer, and sequence b. and can be designed to be 45-60 bases in length overall.
  • Sequence a is a sequence of a partial region of the target XK-encoding base sequence, and the target region is not particularly limited, and any region can be a candidate.
  • the length of sequence a is 19-25 bases, preferably 19-21 bases.
  • the XK-specific siRNA and VPS13A-specific siRNA may have additional bases at the 5' or 3' ends of the above sequence lengths.
  • the length of the additional bases is usually about 2-4 bases.
  • the additional base may be either DNA or RNA, but using DNA may improve the stability of the nucleic acid.
  • Such additional base sequences include, for example, ug-3', uu-3', tg-3', tt-3', ggg-3', guuu-3', gttt-3', ttttt-3 ', uuuuu-3', and the like, but are not limited to these.
  • the siRNA may have an overhang sequence (overhang) at the 3' end, and specifically includes those with dTdT (dT represents deoxythymidine) added. It may also be a blunt end (blunt end) without terminal addition.
  • the siRNA may have a different number of bases in the sense strand and the antisense strand.
  • an "asymmetrical interfering RNA ( aiRNA)” can be mentioned.
  • the antisense strand is composed of 21 bases
  • the sense strand is composed of 15 bases
  • each end of the antisense strand has an overhang structure of 3 bases.
  • the positions of the target sequences of the XK-specific siRNA and VPS13A-specific siRNA are not particularly limited, but in one embodiment, the 5'-UTR and the start codon to about 50 bases, and regions other than the 3'-UTR It is desirable to select the target sequence from. BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ ) to confirm the specificity of the selected target sequence.
  • a sense strand having a TT or UU 3' overhang at 19-21 bases after AA (or NA), a sequence complementary to the 19-21 bases and TT or A double-stranded RNA consisting of an antisense strand having a UU 3'-terminal overhang may be designed as an siRNA.
  • siRNA which is a precursor of siRNA
  • an arbitrary linker sequence (for example, about 5 to 25 bases) capable of forming a loop structure is appropriately selected, and the sense strand and antisense strand are connected via the linker sequence. It can be designed by concatenating.
  • siRNA and/or shRNA sequences can be searched using search software provided free of charge on various websites. Examples of such sites include the following. siRNA Target Finder provided by Ambion (http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html) Insert design tool for pSilencer® Expression Vector (http://www.ambion.com/ jp/techlib/misc/psilencer_converter.html) GeneSeer provided by RNAi Codex (http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi).
  • siRNA is prepared by synthesizing the sense strand and antisense strand of the target sequence on mRNA with an automatic DNA/RNA synthesizer, and denaturing them in an appropriate annealing buffer at about 90 to about 95°C for about 1 minute. It can be prepared by annealing at about 30 to about 70° C. for about 1 to about 8 hours. It can also be prepared by synthesizing shRNA, which is a precursor of siRNA, and cleaving it with the RNA-cleaving protein dicer. Such XK-specific siRNAs may be commercially available.
  • XK-specific miRNA is optional as long as it inhibits translation of the gene encoding XK.
  • a VPS13A-specific miRNA is optional as long as it inhibits translation of the gene encoding VPS13A.
  • miRNAs may bind to the 3' untranslated region (UTR) of the target and inhibit its translation, rather than cleaving the target mRNA as siRNAs do.
  • miRNA may be pri-miRNA (primary miRNA), pre-miRNA (precursor miRNA), or mature miRNA.
  • the length of miRNA is not particularly limited, and the length of pri-miRNA is usually several hundred to several thousand bases, the length of pre-miRNA is usually 50-80 bases, and the length of mature miRNA is usually 18 bases.
  • the XK-specific miRNA is preferably pre-miRNA or mature miRNA, more preferably mature miRNA.
  • Such XK-specific miRNA and VPS13A-specific miRNA may be synthesized by known methods or purchased from companies that provide synthetic RNAs.
  • the XK-specific antisense nucleic acid is a nucleic acid containing a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to the nucleotide sequence of the mRNA of the gene encoding XK, or a part thereof, and is specific and stable to the mRNA. It is a nucleic acid having a function of suppressing XK protein synthesis by forming a double strand and binding.
  • the VPS13A-specific antisense nucleic acid is a nucleic acid comprising a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to the nucleotide sequence of the mRNA of the gene encoding VPS13A, or a part thereof, and is specific and stable to the mRNA.
  • Antisense nucleic acids can be DNA, RNA, or DNA/RNA chimeras.
  • the antisense nucleic acid is DNA
  • an RNA:DNA hybrid formed by the target RNA and the antisense DNA is recognized by endogenous ribonuclease H (RNase H) to cause selective degradation of the target RNA.
  • RNase H endogenous ribonuclease H
  • the target sequence may be not only the sequence in mRNA but also the sequence of the intron region in the early translation product of the XK gene or VPS13A gene.
  • the intron sequence can be determined by comparing the genomic sequence and the cDNA nucleotide sequence of the XK gene using homology search programs such as BLAST and FASTA.
  • the target region of the XK-specific antisense nucleic acid is not limited in length as long as the hybridization of the antisense nucleic acid results in inhibition of translation into the XK protein.
  • the target region of the VPS13A-specific antisense nucleic acid is not limited in length as long as the hybridization of the antisense nucleic acid results in inhibition of translation into the VPS13A protein.
  • a specific antisense nucleic acid may be the entire sequence or a partial sequence of the mRNA encoding XK or VPS13A. Oligonucleotides of about 10 to about 40 bases, particularly about 15 to about 30 bases, are preferred in consideration of ease of synthesis, antigenicity, intracellular translocation, etc., but are not limited to these.
  • the 5'-end hairpin loop, 5'-end untranslated region, translation initiation codon, protein coding region, ORF translation stop codon, 3'-end untranslated region, 3'-end palindromic region, or 3' end of the XK gene may be selected as preferred target regions for antisense nucleic acids, but are not limited thereto.
  • the XK-specific antisense nucleic acid and the VPS13A-specific antisense nucleic acid not only hybridize with the mRNA or early transcription product of the XK gene or VPS13A gene to inhibit protein translation, but also double-stranded DNA. It may be one that binds to a gene to form a triplex and can inhibit transcription into RNA (antigene).
  • XK-specific siRNA, XK-specific miRNA, XK-specific antisense nucleic acid, etc. determine the target sequence of mRNA or early transcripts based on the cDNA sequence or genomic DNA sequence of the XK gene, It can be prepared by synthesizing a sequence complementary thereto using a synthesizer.
  • VPS13A-specific siRNA, VPS13A-specific miRNA, VPS13A-specific antisense nucleic acid, etc. determine the target sequence of mRNA or early transcript based on the cDNA sequence or genomic DNA sequence of the VPS13A gene, It can be prepared by synthesizing a sequence complementary thereto using a synthesizer.
  • Antisense nucleic acids containing various modifications can also be chemically synthesized by known techniques.
  • the XK-specific siRNA, XK-specific miRNA, or XK-specific antisense nucleic acid expression cassette incorporates the XK-specific siRNA, XK-specific miRNA, or XK-specific antisense nucleic acid in an expressible state. It is not particularly limited as long as it is a polynucleotide.
  • the expression cassette is a polynucleotide comprising a promoter sequence and a coding sequence for an XK-specific siRNA, XK-specific miRNA, or XK-specific antisense nucleic acid (optionally also a transcription termination signal sequence). , optionally containing other arrays.
  • VPS13A-specific siRNA, VPS13A-specific miRNA, or VPS13A-specific antisense nucleic acid expression cassette incorporates VPS13A-specific siRNA, VPS13A-specific miRNA, or VPS13A-specific antisense nucleic acid in an expressible state. It is not particularly limited as long as it is a polynucleotide.
  • the expression cassette is a polynucleotide comprising a promoter sequence and a VPS13A-specific siRNA, VPS13A-specific miRNA, or VPS13A-specific antisense nucleic acid coding sequence (and optionally a transcription termination signal sequence). , optionally containing other arrays.
  • the promoter is not particularly limited, for example, RNA polymerase II (polII) promoters such as CMV promoter, EF1 promoter, SV40 promoter, MSCV promoter, hTERT promoter, ⁇ -actin promoter, CAG promoter; mouse and human U6-snRNA promoters; RNA polymerase III (polIII) promoters such as human H1-RNase P RNA promoter, human valine-tRNA promoter, etc., and the like. preferable.
  • RNA polymerase II (polII) promoters such as CMV promoter, EF1 promoter, SV40 promoter, MSCV promoter, hTERT promoter, ⁇ -actin promoter, CAG promoter; mouse and human U6-snRNA promoters; RNA polymerase III (polIII) promoters such as human H1-RNase P RNA promoter, human valine-tRNA promoter, etc., and the like. preferable.
  • XK expression inhibitor is an XK-specific ribozyme.
  • VPS13A expression inhibitors includes VPS13A-specific ribozymes.
  • "Ribozyme" in a narrow sense means RNA having enzymatic activity to cleave nucleic acid, but here also includes DNA as long as it has sequence-specific nucleic acid cleaving activity.
  • the most versatile ribozyme nucleic acids are self-splicing RNAs found in infectious RNAs such as viroids and virusoids, and hammerhead and hairpin types are known.
  • the hammerhead type exhibits enzymatic activity at about 40 bases, and a few bases at each end (about 10 bases in total) adjacent to the part that forms the hammerhead structure are linked to the sequence complementary to the desired cleavage site of the mRNA. By doing so, it is possible to specifically cleave only the target mRNA.
  • This type of ribozyme nucleic acid has the advantage that it does not attack genomic DNA because it uses only RNA as a substrate.
  • a single target sequence can be generated by using a hybrid ribozyme that ligates an RNA motif derived from a viral nucleic acid that can specifically bind to RNA helicase. can be chained.
  • a ribozyme when used in the form of an expression vector containing the DNA encoding it, it should be a hybrid ribozyme in which a tRNA-modified sequence is further ligated in order to promote translocation of the transcript into the cytoplasm. can also
  • the gene editing agent XK gene editing agent is not particularly limited as long as it can suppress the expression of the XK gene by a target sequence-specific nuclease system (eg CRISPR/Cas system). Expression of the XK gene can be suppressed by, for example, disrupting the XK gene or modifying the XK gene promoter to suppress the activity of the promoter.
  • the VPS13A gene editing agent is not particularly limited as long as it can suppress VPS13A gene expression by a target sequence-specific nuclease system (eg, CRISPR/Cas system). Expression of the VPS13A gene can be suppressed by, for example, disrupting the VPS13A gene or modifying the promoter of the VPS13A gene to suppress the activity of the promoter.
  • a vector containing a guide RNA expression cassette targeting the XK gene or its promoter and a Cas protein expression cassette (for XK gene editing vector) can be used, but is not limited to this.
  • a combination of a vector containing a guide RNA targeting the XK gene or its promoter and / or an expression cassette thereof and a vector containing a Cas protein expression cassette and / or an expression cassette thereof can be used as the XK gene It can be used as an editing agent.
  • VPS13A gene editing agent for example, when adopting the CRISPR / Cas system, typically, a vector containing a guide RNA expression cassette targeting the VPS13A gene or its promoter, and a Cas protein expression cassette (for XK gene editing vector) can be used, but is not limited to this.
  • a combination of a vector containing a guide RNA targeting the VPS13A gene or its promoter and / or an expression cassette thereof and a vector containing a Cas protein expression cassette and / or an expression cassette thereof can be used as the VPS13A gene It can be used as an editing agent.
  • the guide RNA expression cassette is not particularly limited as long as it is a polynucleotide used for the purpose of expressing the guide RNA in the organism targeted for metabolic improvement.
  • a typical example of the expression cassette is a polynucleotide comprising a coding sequence of all or part of a promoter and a guide RNA placed under the control of the promoter. Note that "placed under the control of a promoter”, in other words, means that the guide RNA coding sequence is placed such that transcription of the sequence is controlled by the promoter.
  • a mode of placement for example, a mode in which the guide RNA coding sequence is placed directly under the 3′ side of the promoter (for example, between the base at the 3′ end of the promoter and the base at the 5′ end of the guide RNA coding sequence)
  • the number of base pairs (bp) of is, for example, 100 bp or less, preferably 50 bp or less).
  • the promoter of the guide RNA expression cassette is not particularly limited, and a pol II promoter can be used, but a pol III promoter is preferable from the viewpoint of more accurate transcription of relatively short RNAs.
  • pol III promoters include, but are not limited to, mouse and human U6-snRNA promoters, human H1-RNase P RNA promoters, human valine-tRNA promoters, and the like.
  • Various promoters inducible by drugs can also be used.
  • the guide RNA coding sequence is not particularly limited as long as it is a base sequence that encodes the guide RNA.
  • the guide RNA is not particularly limited as long as it is used in the CRISPR/Cas system. can be induced to the target site of genomic DNA.
  • the target site refers to a PAM (Proto-spacer Adjacent Motif) sequence and a 17 to 30 base length (preferably 18 to 25 base length, more preferably 19 to 22 base length) adjacent to its 5′ side. Particularly preferably, it is a site on genomic DNA consisting of a DNA strand (target strand) having a sequence of about 20 nucleotides (base length) and its complementary DNA strand (non-target strand).
  • PAM Proto-spacer Adjacent Motif
  • the guide RNA has a sequence (sometimes referred to as a crRNA (CRISPR RNA) sequence) involved in binding to the target site of genomic DNA, and this crRNA sequence is By binding complementary (preferably complementary and specific) to the sequence, the guide RNA can bind to the target site of the genomic DNA.
  • CRISPR RNA crRNA
  • “Complementary” binding means not only binding based on complete complementary relationships (A and T, and G and C), but also complementary relationships that allow hybridization under stringent conditions. The case of combining based on is also included. Stringent conditions are well known and can be determined, for example, based on the melting temperature (Tm) of the nucleic acid that binds the complex or probe. For example, the conditions for washing after hybridization are usually about "1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 37° C.”. It is preferable that the hybridized state is maintained even after washing under such conditions.
  • a more stringent hybridization condition is about "0.5 x SSC, 0.1% SDS, 42°C”
  • an even more stringent hybridization condition is about "0.1 x SSC, 0.1% SDS, 65°C” for washing. can be done.
  • the sequence that binds to the target sequence is, for example, 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more, particularly preferably 100% or more of the target strand. % identity. It is said that the 12 bases on the 3' side of the sequence that binds to the target sequence in the crRNA sequence are important for the binding of the guide RNA to the target site. Therefore, if the sequence that binds to the target sequence in the crRNA sequence is not completely identical to the target strand, the bases that differ from the target strand are the 12 bases on the 3′ side of the sequence that binds to the target It is preferable to exist other than
  • the guide RNA has a sequence (sometimes referred to as a tracrRNA (trans-activating crRNA) sequence) involved in binding to the Cas protein, and this tracrRNA sequence binds to the Cas protein to activate the Cas protein. It can be directed to a target site in genomic DNA.
  • tracrRNA trans-activating crRNA
  • the tracrRNA sequence is not particularly limited.
  • the tracrRNA sequence is typically an RNA consisting of a sequence of about 50-100 nucleotides in length that can form multiple (usually three) stem-loops, and the sequence differs depending on the type of Cas protein used. .
  • As the tracrRNA sequence various known sequences can be employed depending on the type of Cas protein to be used.
  • the guide RNA usually contains the crRNA sequence and tracrRNA sequence described above.
  • An embodiment of the guide RNA may be a single-stranded RNA (sgRNA) containing a crRNA sequence and a tracrRNA sequence, or an RNA complex formed by complementary binding of an RNA containing a crRNA sequence and an RNA containing a tracrRNA sequence. It can be a body.
  • sgRNA single-stranded RNA
  • the Cas protein expression cassette is not particularly limited as long as it is a polynucleotide used for the purpose of expressing the Cas protein in the organism targeted for metabolic improvement.
  • a typical example of the expression cassette includes a promoter and a polynucleotide comprising a Cas protein coding sequence placed under the control of the promoter.
  • the term "located under the control of a promoter" has the same definition as in the guide RNA expression cassette.
  • the promoter for the Cas protein expression cassette is not particularly limited, and for example, various pol II promoters can be used. MSCV promoter, hTERT promoter, ⁇ -actin promoter, CAG promoter and the like. Various promoters inducible by drugs can also be used.
  • the Cas protein coding sequence is not particularly limited as long as it is a nucleotide sequence that encodes the amino acid sequence of the Cas protein.
  • the Cas protein is not particularly limited as long as it is used in the CRISPR/Cas system.
  • various Cas proteins that can bind to a target site of genomic DNA in a complex with a guide RNA and cleave the target site can be used. can do.
  • Cas proteins derived from various organisms are known, for example, Cas9 protein (type II) derived from S. pyogenes, Cas9 protein (type I-A1) derived from S. solfataricus, and Cas9 protein derived from S. solfataricus. (I-A2 type), Cas9 protein from H. walsbyl (type I-B), Cas9 protein from E. coli (type I-E), Cas9 protein from E.
  • Cas9 protein is preferred, and Cas9 protein endogenously possessed by bacteria belonging to the genus Streptococcus is more preferred.
  • Amino acid sequences of various Cas proteins and information on their coding sequences can be easily obtained on various databases such as NCBI.
  • the Cas protein may be a wild-type double-strand truncated Cas protein or a nickase-type Cas protein.
  • the Cas protein may have amino acid sequence mutations (e.g., substitutions, deletions, insertions, additions, etc.) as long as it does not impair its activity. It may be one to which a protein such as is added.
  • protein tags include biotin, His tag, FLAG tag, Halo tag, MBP tag, HA tag, Myc tag, V5 tag, PA tag and the like.
  • Signal sequences include, for example, cytoplasmic translocation signals.
  • the XK gene-editing vector and the VPS13A gene-editing vector may have other sequences.
  • Other sequences are not particularly limited, and various known sequences that can be contained in an expression vector can be employed. Examples of such sequences include origins of replication, drug resistance genes, and the like.
  • Drug resistance genes include, for example, chloramphenicol resistance gene, tetracycline resistance gene, neomycin resistance gene, erythromycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, hygromycin resistance gene, and puromycin resistance gene.
  • the type of vector is not particularly limited, and includes, for example, plasmid vectors such as animal cell expression plasmids; viral vectors such as retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses, and Sendai viruses; and Agrobacterium vectors. be done.
  • the XK gene editing agent and VPS13A gene editing agent can be easily produced according to known genetic engineering techniques. For example, it can be produced using PCR, restriction enzyme cleavage, DNA ligation technology, in vitro transcription/translation technology, recombinant protein production technology, and the like.
  • the XK expression promoter is not particularly limited as long as it can increase the amount of XK in cells.
  • the VPS13A expression promoter is not particularly limited as long as it can increase the amount of VPS13A in cells.
  • Examples of XK expression promoters include XK expression cassettes.
  • the XK expression cassette is not particularly limited as long as XK is incorporated in an expressible state.
  • an expression cassette for XK comprises a promoter sequence and a polynucleotide comprising the XK coding sequence (and optionally a transcription termination signal sequence).
  • VPS13A expression promoters include, for example, VPS13A expression cassettes.
  • the VPS13A expression cassette is not particularly limited as long as VPS13A is incorporated in an expressible state.
  • an expression cassette for VPS13A comprises a promoter sequence and a polynucleotide comprising the VPS13A coding sequence (and optionally a transcription termination signal sequence).
  • Expression cassettes can also be in the form of vectors.
  • the expression vector is not particularly limited, and includes, for example, plasmid vectors such as animal cell expression plasmids; virus vectors such as retrovirus, lentivirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, Sendai virus, and the like.
  • the promoter is not particularly limited, and includes, for example, CMV promoter, EF1 promoter, SV40 promoter, MSCV promoter, hTERT promoter, ⁇ actin promoter, CAG promoter and the like. Various promoters inducible by drugs can also be used.
  • the expression vector may contain other elements that the expression vector may contain.
  • Other elements include, for example, replication origins and drug resistance genes.
  • the drug resistance gene is not particularly limited, but for example, chloramphenicol resistance gene, tetracycline resistance gene, neomycin resistance gene, erythromycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, hygromycin resistance gene, puromycin resistance gene, etc. is mentioned.
  • Expression vectors for XK and VPS13A can be easily obtained according to known genetic engineering techniques. For example, it can be produced using PCR, restriction enzyme cleavage, DNA ligation technology, and the like.
  • XK expression promoters include XK transcription activators, their expression vectors, and low-molecular-weight compounds capable of activating XK transcription.
  • VPS13A expression promoters include VPS13A transcription activators, their expression vectors, low-molecular-weight compounds capable of activating VPS13A transcription, and the like.
  • the embodiment of the expression vector is the same as the above XK expression vector.
  • Function regulators XK function regulators are not particularly limited as long as they can regulate the function of XK protein or XK mRNA expressed in an organism or cell whose expression is to be regulated. Including function promoters and the like.
  • the VPS13A function regulator is not particularly limited as long as it can regulate the function of the VPS13A protein or VPS13A mRNA expressed in the organism or cell whose expression is to be regulated. etc.
  • the XK function modulating agent and VPS13A function modulating agent can be used singly or in combination of two or more.
  • XK function regulators include XK neutralizing antibodies.
  • An XK-neutralizing antibody refers to an antibody that has the property of inhibiting the function of XK by binding to XK.
  • VPS13A function regulators include, for example, VPS13A neutralizing antibodies.
  • a VPS13A neutralizing antibody refers to an antibody that has the property of inhibiting the function of VPS13A by binding to VPS13A.
  • Antibodies include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single-chain antibodies, or portions of the above antibodies that have antigen-binding properties, such as Fab fragments and fragments generated by Fab expression libraries.
  • the antibody may be an antibody that has antigen-binding to a polypeptide consisting of at least 8 consecutive amino acids, preferably 15 amino acids, more preferably 20 amino acids in the amino acid sequence of XK or VPS13A.
  • Antibody production methods are well known, and the antibodies used in the present invention can also be produced according to them.
  • the antibody of the present invention is a polyclonal antibody
  • XK or VPS13A expressed in Escherichia coli or the like and purified according to a conventional method is used, or an oligopeptide having a partial amino acid sequence of XK or VPS13A is prepared according to a conventional method. It can be synthesized, immunized to a non-human animal such as a rabbit, and obtained from the serum of the immunized animal according to a conventional method.
  • spleens obtained by immunizing non-human animals such as mice with XK or VPS13A, or oligopeptides having a partial amino acid sequence of XK or VPS13A, expressed and purified in Escherichia coli or the like according to a conventional method It can be obtained from hybridoma cells prepared by fusing cells with myeloma cells.
  • multiple antibodies are available, for example, Polyclonal Anti-XK Antibody (Cat. No. HPA019036) from Atlas Antibodies, Chorein Antibody (Cat. No. NBP1-85641) from Novus Biologicals, etc. can also be used.
  • XK or VPS13A which is used as an immunizing antigen for the production of antibodies, is prepared based on known gene sequence information by DNA cloning, construction of each plasmid, transfection into hosts, culture of transformants, and production of proteins from cultures. It can be obtained by recovery operation. These operations can be performed according to methods known to those skilled in the art.
  • a recombinant DNA capable of expressing the gene encoding XK or VPS13A in a desired host cell is prepared, transformed by introducing it into the host cell, and the transformant is cultured.
  • the protein By recovering the target protein from the resulting culture, the protein can be obtained as an immunizing antigen for producing the antibody of the present invention.
  • a partial peptide of XK or VPS13A can also be produced by a general chemical synthesis method (peptide synthesis) according to known gene sequence information.
  • the antibody may be prepared using an oligopeptide having a partial amino acid sequence of XK or VPS13A.
  • the oligo(poly)peptides used for the production of such antibodies need not have functional biological activity, but should preferably have immunogenic properties similar to XK or VPS13A.
  • An oligo(poly)peptide preferably having this immunogenic property and consisting of at least 8 consecutive amino acids, preferably 15 amino acids, more preferably 20 amino acids in the amino acid sequence of XK or VPS13A can be exemplified.
  • Antibodies against such oligo(poly)peptides can also be produced by enhancing the immunological response using various adjuvants depending on the host.
  • adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and surface agents such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin and dinitrophenol.
  • Active substances human adjuvants such as BCG (Bacille Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum.
  • XK function regulator and VPS13A function regulator in addition to the above neutralizing antibodies, XK or VPS13A antagonists, agonists, dominant negative mutants, etc. can be used. Also, when a protein such as a neutralizing antibody is employed as a function regulator, its expression cassette can be employed instead. As for the expression cassette, those described in the above "expression regulator" can be used.
  • XK and VPS13A are important for cell membrane scrambling and necrosis induced by ATP binding to P2X7. Therefore, at least one selected from the group consisting of XK expression regulators, XK function regulators, VPS13A expression regulators and VPS13A function regulators (active ingredient) is used for applications utilizing cell membrane scrambling and necrosis (e.g., pharmaceutical , reagents, food compositions, oral compositions, health-promoting agents, nutritional supplements (such as supplements), etc.).
  • the active ingredient can be used as it is or made into various compositions together with commonly used ingredients and applied (for example, administration, ingestion, inoculation, contact, etc.) to animals, humans, and various cells.
  • the method of contacting the cell with the modulating agent is arbitrary and can be appropriately selected according to the purpose. Contacting can be in vivo, in vitro or ex vivo.
  • the method of administering the modulating agent to animals is arbitrary and can be appropriately selected according to the purpose, the type of the modulating agent, and the like.
  • An XK modulator and/or a VPS13A modulator can be used to regulate various phenomena related to cell membrane scrambling and necrosis induced by binding of ATP to P2X7.
  • XK modulators and/or VPS13A modulators can be used to treat or prevent inflammation (in one aspect, but not particularly limited to, nitric oxide-independent inflammation), pain, and central nervous system disorders, cancer, etc. .
  • rheumatoid arthritis osteoarthritis, interstitial cystitis, interstitial fibrosis, psoriasis, septic shock, sepsis, allergic dermatitis, asthma, allergic asthma, mild to severe asthma, Steroid-resistant asthma, idiopathic pulmonary fibrosis, allergic rhinitis, chronic obstructive pulmonary disease, airway hyperreactivity, acute and chronic pain, neuropathic pain, inflammatory pain, migraine, spontaneous pain, opioid-induced pain, diabetes neuropathy, postherpetic neuralgia, low back pain, chemotherapy-induced neuropathic pain, fibromyalgia, neuropathic pain, mood disorders, depression, major depression, major depressive disorder, treatment-resistant depression, bipolar disorder , Anxiety Depression, Anxiety Disorder, Cognition, Sleep Disorders, Multiple Sclerosis, Epileptic Seizures, Parkinson's Disease, Schizophrenia, Alzheimer's Disease, Huntington's Disease, Amyotrophic Lateral S
  • hypertension myocardial infarction, ischemic heart disease, ischemia, etc.
  • ureteral obstruction lower urinary tract syndrome, lower urinary tract dysfunction (e.g., incontinence, etc.)
  • heart transplant disease osteoporosis/osteopetrosis, secretion of exocrine glands It is possible to prevent or improve diseases related to function, glaucoma, nephritis, glomerulonephritis, Chagas disease, chlamydia infection, neuroblastoma, tuberculosis, polycystic kidney disease, cancer, acne, etc. .
  • Target cells for the XK regulatory agent and/or VPS13A regulatory agent are not particularly limited, for example, immune cells (T cells (e.g., CD25 + CD4 + regulatory T cells), etc.), vascular endothelial cells, endothelial progenitor cells , stem cells (e.g., bone marrow-derived stem cells, adipose tissue-derived stem cells, mesenchymal stem cells, pluripotent stem cells (iPS cells, ES cells, etc.), muscle cells (skeletal muscle cells, smooth muscle cells, cardiomyocytes), muscle Examples include progenitor cells (eg, myocardial progenitor cells, myoblasts, etc.), nerve cells, and the like.
  • T cells e.g., CD25 + CD4 + regulatory T cells
  • stem cells e.g., bone marrow-derived stem cells, adipose tissue-derived stem cells, mesenchymal stem cells, pluripotent stem cells (iPS cells, ES cells, etc.
  • the cell is preferably a cell that requires cell membrane scrambling (eg, cell membrane scrambling resulting from stimulation with extracellular ATP).
  • the cells are preferably immune cells.
  • immune cells include T cells (e.g., regulatory T cells, memory T cells, iNKT cells, and ⁇ (gamma delta) T cells), macrophages (e.g., microglia), dendritic cells, mast cells, NK Cells, B cells and the like can be mentioned.
  • the cells are preferably T cells.
  • the cell is preferably a cell that requires promotion of differentiation and/or maintenance into memory T cells.
  • the cells are preferably platelets or red blood cells.
  • the cells are preferably genetically modified cells.
  • Genetically modified cells are not particularly limited, but can be produced using the above-described cells. , iPS cell-derived T cells), genetically engineered hematopoietic stem cells, genetically engineered hematopoietic progenitor cells (e.g., megakaryocytes), genetically engineered differentiated blood cells (e.g., platelets, erythrocytes), and genetically engineered immune cells (e.g., T cells expressing chimeric antigen receptors (CAR), T cells transfected with cancer antigen-recognizing T cell receptors (TCR)) can be mentioned.
  • CAR chimeric antigen receptors
  • TCR cancer antigen-recognizing T cell receptors
  • An XK modulator and/or a VPS13A modulator can be used to modulate (eg, suppress or promote) P2X7 receptor activity or P2X7 receptor expression in a subject organism or subject cell.
  • XK modulators and/or VPS13A modulators can be used to modulate P2X7 receptor-mediated cellular function in a subject organism or subject cell.
  • the cell function mediated by the P2X7 receptor is not particularly limited as long as it affects the function and characteristics of the cell via the P2X7 receptor, for example, cell membrane scrambling (PtdSer exposure), Induction of death, etc., are also exemplified in Di Virgilio et al. (2017, Immunity. 47:15-31).
  • Target organisms for XK modulators and/or VPS13A modulators are not particularly limited, and various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, rabbits, pigs, horses, cows, sheep, goats, and deer animals and the like.
  • the preferred subject organism is a human.
  • the form of the XK regulator and/or VPS13A regulator is not particularly limited, and can be appropriately designed according to its use.
  • the application is pharmaceuticals, health-promoting agents, nutritional supplements (supplements, etc.), for example, tablets (including orally disintegrating tablets, chewable tablets, effervescent tablets, lozenges, jelly-like drops, etc.) are used.
  • the form is liquid, gel or solid food such as juice, soft drink, tea, soup, soy milk, salad oil, dressing, yoghurt, jelly, pudding, furikake, powdered milk for infants, Cake mixes, powdered or liquid dairy products, breads, cookies, and the like.
  • the form may be, for example, liquid (solution, milky lotion, suspension, etc.), semisolid (gel, cream, paste, etc.), solid (tablet, particulate, capsule, film, etc.). agent, kneaded product, molten solid, waxy solid, elastic solid, etc.), more specifically, dentifrice (toothpaste, liquid dentifrice, liquid dentifrice, toothpaste, etc.), mouthwash, coating medicines, patches, mouth fresheners, foods (eg, chewing gum, tablet candy, candy, gummies, films, lozenges, etc.), and the like.
  • the XK modulator and/or VPS13A modulator may further contain other components as necessary.
  • Other ingredients are not particularly limited as long as they are ingredients that can be blended in pharmaceuticals, food compositions, oral compositions, health-promoting agents, nutritional supplements (supplements, etc.). , carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, thickeners, moisturizers, colorants, perfumes, chelating agents and the like.
  • the content of the active ingredient of the XK regulator and/or VPS13A regulator depends on the type of active ingredient, application, mode of use, target, condition of target, etc., and is not limited, but is for example 0.0001. It can be up to 100% by weight, preferably 0.001 to 50% by weight.
  • the amount of application e.g., administration, ingestion, inoculation, contact, etc.
  • the amount of application is not particularly limited as long as it is an effective amount that exhibits efficacy. 0.1 to 1000 mg/kg body weight per day.
  • the above dosage is preferably administered once a day or in 2 to 3 divided doses, and can be adjusted appropriately according to age, condition and symptoms.
  • Cells In one embodiment, it relates to cells into which an XK modulating agent has been introduced.
  • the cells containing at least one selected from the group consisting of XK expression promoters and XK function promoters are T cells (T cells of the present invention), they are suitable as T cells to be used in CAR-T therapy. can be used.
  • the T cells of the present invention are cells that can regulate XK expression and/or XK function to transiently increase. is preferred.
  • a regulation method for example, by using an expression cassette whose expression is regulated by a drug-responsive promoter as a promoter of XK expression and/or XK function, addition of the drug results in XK expression and/or XK function. can be transiently enhanced.
  • the T cells are further introduced with the regulatory agent of the present invention containing at least one selected from the group consisting of XK expression inhibitors and XK function inhibitors.
  • the regulatory agent of the present invention containing at least one selected from the group consisting of XK expression inhibitors and XK function inhibitors.
  • Deleting XK and/or VPS13A in a cell and/or suppressing the expression and/or function of XK and/or VPS13A in a cell can be performed using a modulating agent as described above.
  • Cells may be produced in vivo, in vitro, and ex vivo.
  • the cells are susceptible to cell death due to high ATP concentration stimulation.
  • a method of producing cells having a propensity to undergo cell death due to high ATP concentration stimulation is provided. This makes it possible to provide cells capable of causing the required programmed cell death under high ATP concentrations.
  • Introducing XK and/or VPS13A into a cell and/or promoting the expression and/or function of XK and/or VPS13A in a cell can be performed using a modulating agent as described above.
  • Cell production may be performed in vivo, in vitro, or ex vivo.
  • pPEF-BOS was derived from pEF-BOS (Mizushima and Nagata, 1990, Nucleic Acids Res. 18:5322) into which the SV40 early promoter-driven puromycin resistance gene was introduced from pPUR (Clontech).
  • the pX459v2 plasmid (Ran et al., 2013, Nat. Protoc. 8:2281-2308) was obtained from Addgene.
  • pCMV-VSV-G (Miyoshi et al., 1998, J. Virol. 72:8150-8157) was provided by H. Miyoshi (RIKEN BioResource Research Center).
  • pMXs-puro retroviral vector (Kitamura et al., 2003, Exp. Hematol. 31:1007-1014) and pGag-pol-IRES-bsr packaging plasmid (Morita et al., 2000, Gene Ther. 7:1063- 1066) were obtained from T. Kitamura (Institute of Medical Science, University of Tokyo). pAdVAntage was purchased from Promega.
  • Alexa 647-conjugated rat anti-mouse P2X7 mAb (clone Hano43) was obtained from Bio-Rad Laboratories. PE or APC conjugated rat anti-mouse CD4 mAb (clone RM4-5) was obtained from BD Biosciences. FITC- or APC-Cy7-rat anti-mouse CD25 mAb (clone PC61) was obtained from BioLegend. Rabbit anti-P2X7 Ab was obtained from Alomone Labs (APR-004). Rabbit anti-XK Ab (HPA019036) and rabbit anti-Chorein Ab (NBP1-85641) were obtained from Atlas Antibodies and Novus biologicals, respectively.
  • Mouse anti-Na + /K + -ATPase mAb (clone 464.6) was obtained from Abcam.
  • HRP-goat antibody against rabbit Ig (P0448) or mouse Ig (P0447) was obtained from Agilent Technologies.
  • Cy5-Annexin V was obtained from BD Biosciences.
  • SYTOX Blue and Hoechst 33342 were obtained from Thermo Fisher Scientific.
  • 1-oleoyl-2- ⁇ 6-[(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl ⁇ -sn-glycero-3-phosphocholine (NBD-PC) is Obtained from Avanti Polar Lipids.
  • n-dodecyl- ⁇ -D-maltopyranoside (DDM) and cholesteryl hemisuccinate (CHS) were obtained from Dojindo Molecular Technologies and Merck, respectively.
  • Genome-Wide CRISPR Screening Mouse CRISPR Knockout Pooled Library (Genome-Scale CRISPR/Cas9 Knockout [GeCKO] v2) (Joung et al., 2017, Nat. Protoc. 12:828-863, Shalem et al., 2014, Science. 343: 84-87) was performed as described by Ryoden et al., (2020, J. Immunol.). Briefly, 2 ⁇ 10 7 DKO transformants expressing mouse P2X7 and Cas9 were infected with lentivirus carrying the GeCKO v2 sgRNA library at a multiplicity of infection of 0.3 and treated with 1 ⁇ g/ml puromycin.
  • annexin buffer 10 mM HEPES-NaOH (pH 7.5), 140 mM NaCl and 2.5 mM CaCl 2 ) for 5 minutes. bottom.
  • Cells were diluted 15-fold with cold buffer, centrifuged at 300 g for 3 minutes and suspended in 3 ml annexin buffer containing Cy5-annexin V. Approximately 0.8% of cells with the lowest ability to bind Annexin V were harvested and expanded by FACSAria II (BD Biosciences).
  • PCR products were purified and analyzed by MiSeq (Illumina) using MiSeq Reagent Kit v3 (Illumina). NGS reads were correlated with reference sgRNA sequences in the library and the number of each sgRNA was counted.
  • Xk and Vps13a genes in WR19L cells were knocked out using the CRISPR/Cas9 system.
  • Each complementary oligonucleotide (Xk, 5′-CTTTCTCCACCTCCTCTGAA-3′; VPS13A, 5′-TGACCAACTTTAACTTTGAA-3′) bearing the sgRNA target sequence was annealed, ligated into the pX459v2 plasmid and run in a NEPA21 superelectroporator (Nepagene stock). company) into WR19L cells by electroporation. If necessary, transfections were performed twice with an interval of 3 days.
  • Mouse Xk cDNA (NM_023500) was tagged with FLAG or enhanced GFP (EGFP) at the C-terminus and pMXs- inserted into the puro vector.
  • Mouse Vps13a cDNA (NM_173028) was generated from C57BL/6J mouse bone marrow by RT-PCR and inserted into pPEF-BOS. The authenticity of the cDNA was confirmed by DNA sequencing.
  • HEK293T cells were transfected with pMXs-puro having Xk cDNA together with pGag-pol-IRES-bsr, pCMV-VSV-G and pAdVAntage using Fugene 6 (Promega) and cultured for 48 hours.
  • Retroviruses in the supernatant were harvested by centrifugation at 6000 g for 16 hours at 4° C. and used to infect WR19L cells.
  • pPEF-BOS with Vps13a cDNA was introduced into WR19L cells by electroporation with NEPA21.
  • Stable transformants were selected by culturing in the presence of 1 ⁇ g/ml puromycin.
  • mice C57BL/6N-A tm1Brd Xk tm1a (KOMP) Mbp /MbpMmucd
  • MMRRC Mutant Mouse Resources and Research Centers
  • B6.Cg-Tg(CAG- Cre) CZ-MO2Osb) RIKEN BioResource Research Center
  • CD4 + T cells were stained on ice with 1 ⁇ g/ml PE-labeled anti-CD4 mAb or APC-labeled anti-CD4 mAb and 1 ⁇ g/ml FITC-anti-CD25 mAb in PBS/FCS for 30 minutes, washed with PBS, Analyzed by flow cytometry using a FACSCanto II or collected by FACSAria II (BD Biosciences).
  • ATP-induced PtdSer exposure and cell death As described, dead cells were detected by PI staining essentially as described. Briefly, DKO-derived cells in RPMI 1640-10% FCS were pre-incubated for 10 minutes at 4°C, harvested by centrifugation, and treated with 300- to 400-fold diluted Cy5-annexin V and 2.5 ⁇ g/ml PI. Resuspend in cold annexin buffer containing. Cells were stimulated with 500 ⁇ M ATP for 5 minutes at 4° C. and an aliquot of cells was analyzed by flow cytometry using a FACSCanto II. The remaining cells were kept at room temperature for an additional 10 minutes and analyzed by flow cytometry.
  • CD4 + T cells were first stained with 1 ⁇ g/ml PE-anti-CD4 mAb and 1 ⁇ g/ml FITC-anti-CD25 mAb for 30 minutes on ice. were preincubated in PBS at 10°C for 10 minutes and incubated with ATP at 10°C in annexin buffer containing Cy5-annexin V and 250 nM SYTOX Blue. To assay ATP-dependent cell death, 1 ⁇ 10 6 CD4 + T cells were incubated with 1000-fold diluted Violet Dead Cell Stain (LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, Thermo Fisher Scientific) in PBS.
  • Violet Dead Cell Stain LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, Thermo Fisher Scientific
  • ATP-Induced Internalization of PtdCho Internalization of phosphatidylcholine (PtdCho) into the inner leaflet of the cell membrane was assayed as described by Suzuki et al., (2010, Nature. 468:834-838). Briefly, 3 ⁇ 10 5 cells in RPMI 1640-10% FCS were pre-incubated for 10 min at 4° C., harvested by centrifugation and added to 300 ⁇ l cold annexin buffer containing 250 nM NBD-PC and 500 ⁇ M ATP. Incubated at 4°C in medium. After incubation, 90 ⁇ l aliquots were mixed with 150 ⁇ l annexin buffer containing 5 mg/ml fatty acid-free BSA, incubated on ice for 1 minute and analyzed by FACSCanto II.
  • 1.8-3.2 ⁇ 10 7 cells were washed with PBS and placed in 2.5 ml solution A (10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 1 mM p-APMSF). Homogenized at 4° C. using a Dounce homogenizer. The homogenate was diluted with 2.5 ml of solution B (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 500 mM sucrose, 100 mM KCl, 10 mM MgCl 2 and 1 mM p-APMSF) and heated at 4° C. for 10 min at 800 g and 8000 g for 10 min. Nuclei and mitochondria were removed by sequential centrifugation.
  • solution A 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 1 mM p-APMSF.
  • SDS-PAGE, Blue Native PAGE and Western Blotting SDS-PAGE was performed by subjecting whole cell lysates to SDS sample buffer (62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 10% glycerol, 2.5% 2-fold). Mercaptoethanol and 0.005% bromophenol blue) were incubated at room temperature for 2 hours, and separated by 7.5% or 10% SDS-PAGE (Nacalai Tesque, Inc.). Precision Plus Protein Dual Color Standards (Bio-Rad Laboratories) and HiMark Pre-stained Protein Standards (Thermo Fisher Scientific) were used as molecular weight markers.
  • ATP analog BzATP (2'(3')-O-(4-benzoylbenzoyl)ATP) activates P2X7 but not other P2rx family members.
  • DKO-P2X7 transformants reversibly expose PtdSer in response to BzATP.
  • DKO-P2X7 cells are treated with BzATP at 4° C., the cells expose PtdSer within 5 minutes.
  • BzATP was removed from the buffer, the exposed PtdSer remained on the cell surface for at least 30 minutes at 4°C, but rapidly internalized at 37°C. This property was exploited in a CRISPR/Cas9 screen for molecules involved in P2X7-mediated PtdSer exposure.
  • DKO-P2X7 cells were transformed with Cas9 and subsequently with the GeCKO library (Shalem et al., 2014, Science. 343:84-87) at a multiplicity of infection of 0.3 (Fig. 1A ).
  • Cells were stimulated with BzATP and populations with low annexin V staining were sorted. This procedure of stimulation with BzATP, selection and expansion was repeated three times.
  • the sgRNA sequences integrated into the genomic DNA of sorted cells were analyzed by next generation sequencing (NGS).
  • sgRNAs targeting Eros were the most enriched, accounting for 8.2% of all reads (Fig. 1B). Eros, as a chaperone, was required for P2X7 to be stably expressed in the cell membrane. Further analysis of NGS reads identified 34 genes with 4-6 unique sgRNA sequences (Fig. 1B). Among them, 7.3% of sgRNAs were against Xk. In addition, we noted enrichment of sgRNAs for 11 H2al1 histone family members whose genes are located downstream of intron 2 and exon 3 of the Xk gene on the X chromosome (Fig. 1C).
  • Xk is a membrane protein with unknown function, but its mutations are known to be involved in McLeod syndrome (MLS), a neuroacanthocytosis.
  • Another syndrome called chorea acanthrocytosis (ChAc) with a similar phenotype (neural acanthrocytic syndrome) is known to be caused by loss-of-function mutations in the Vps13a gene.
  • Five different sgRNAs against Vps13a were enriched in cell populations showing reduced ability to expose PtdSer in response to BzATP.
  • the Vps13a gene ranked next to H2al1 or Xk and accounted for approximately 1% of all reads (Fig. 1B).
  • Xk and Vps13a are dispensable for P2X7 expression on the cell surface. It was also shown that null mutation or exogenous expression of Xk had no effect on the expression level of Vps13a and vice versa.
  • DKO-P2X7 cells Upon stimulation with high concentrations of ATP (500 ⁇ M) at 4° C., DKO-P2X7 cells robustly exposed PtdSer within 5 min (FIG. 3A). DKO cells did not respond to ATP for PtdSer exposure, confirming that P2X7 mediates ATP-induced PtdSer exposure. Deletion of either Xk or Vps13a markedly reduced ATP-induced PtdSer exposure to similar levels (Fig. 3A). Transformation of Xk ⁇ / ⁇ or Vps13a ⁇ / ⁇ cells with the respective genes rescued the ability of the cells to expose PtdSer upon ATP stimulation, confirming that decreased PtdSer exposure was due to the lack of Xk or Vps13a. rice field. Double deletion of Xk and Vps13a had no additive effect on PtdSer exposure, suggesting that Xk and Vps13a function in the same pathway.
  • Vps13a Mammalian Vps13a, a protein with a Mr of approximately 360 kDa, belongs to the VPS13 family and is present at membrane contact sites (Leonzino et al., 2021, Biochim. Biophys. Acta.).
  • Several human VPS13 family members and yeast Vps13 have been shown to transport phospholipids from the ER to intracellular organelles, particularly mitochondria (Kumar et al., 2018, J. Cell Biol. 217:3625- 3639, Yeshaw et al., 2019, eLife. 8:e43561).
  • Membrane fractions were prepared from DKO, DKO-P2X7, Xk ⁇ / ⁇ DKO-P2X7 and Vps13a ⁇ / ⁇ DKO-P2X7 and washed with the neutral detergents 1.0% DDM (n-dodecyl- ⁇ -maltopyranoside) and 0 It was solubilized with .1% CHS (cholesteryl hemisuccinate) and separated by Blue native PAGE (BN-PAGE) (Fig. 4A).
  • the 270 kDa band may be a dimer of Xk with a calculated Mr of 51114, and the 760 kDa band may be a complex of Xk and Vps13a.
  • Western blotting with anti-Vps13a Ab detected a 760 kDa band in DKO and DKO-P2X7 cells.
  • a null mutation of Xk resulted in an undetectable 760 kDa band with anti-Vps13a (Fig. 4A), suggesting that most of the Vps13a in the membrane was associated with Xk.
  • Vps13a protein in whole cell lysates was not reduced by the Xk null mutation (Fig. 2A), indicating that Vps13a is tethered or recruited to the membrane by Xk. was done.
  • Fig. 2A When GFP-tagged Xk protein was expressed in DKO-P2X7 cells, most of the GFP was present at the plasma membrane (Fig. 4B), suggesting that Xk and Vps13a function at the plasma membrane.
  • the Vps13 null mutation did not adversely affect Xk localization at the plasma membrane, indicating that Vps13a is not required for Xk localization at the plasma membrane.
  • CD25 + CD4 + T cells are susceptible to high concentrations of ATP for PtdSer exposure and cell death.
  • Xk and Vps13a were prepared CD25 + or CD25 ⁇ CD4 + T cells from the spleens of wild-type and Xk ⁇ /y mice (FIG. 5A), P2X7, Xk and Vps13a expression. Consistent with previous reports, Western blotting with anti-P2X7 Ab showed that P2X7 expression on CD25 + CD4 + T cells was approximately 3-fold higher than that on CD25 ⁇ CD4 + T cells. (Fig. 5B).
  • Xk and Vps13a were expressed at similar levels among CD25 + or CD25 ⁇ CD4 + T cells.
  • Analysis of CD4 + splenocyte membrane proteins by BN-PAGE showed that Xk was present in the 760 kDa and 270 kDa bands as seen in WR19L cells (FIG. 5C).
  • Anti-Vps13a Ab recognized a 760 kDa band, the intensity of which was strongly but not completely reduced in Xk-null CD4 + T cells, suggesting that Vps13a primarily complexes with Xk to form a 760 kDa complex. shown.
  • a faint band at approximately 670 kDa may represent a complex that Vps13a forms with other proteins in the membrane, as discussed above in WR19L cells.
  • PtdSer exposure and necrotic cell death were followed by treating CD4 + T cells with 500 ⁇ M ATP at 10° C. or 37° C., respectively.
  • CD25 + CD4 + T cells gradually exposed PtdSer in response to ATP, consistent with their P2X7 expression levels, whereas CD25 ⁇ CD4 + T cells Did not respond to ATP.
  • Depletion of Xk in CD25 + CD4 + T cells delayed the kinetics of PtdSer exposure to approximately 40% of wild-type cells.
  • Generation of PI-positive necrotic cells was also delayed in the absence of Xk, especially in the early stages or within 15 minutes after stimulation with ATP (Figs. 6C and 6D).
  • Xk and Vps13a complexed at the cell membrane, consistent with recent reports that Xk and Vps13a can co-immunoprecipitate (Park et al., 2020, Mol. Biol. Cell. 31:2425-2436).
  • Xk is a paralog of Xkr8 that bidirectionally and non-specifically scrambles phospholipids at the plasma membrane in a caspase- or kinase-dependent manner.
  • ATP binding to P2X7 activates the Xk-Vps13 complex and scrambles phospholipids.
  • ATP-engaging P2X7 mediates a variety of biological processes including PtdSer exposure, formation of nonspecific cation channels, macromolecular permeabilization, ATP release, membrane blebbing and actin reorganization, cytokine secretion, cell death, and cell growth. provoke
  • CD25 + CD4 + regulatory T cells but not CD25 ⁇ CD4 + T cells or CD8 + T cells, express P2X7, high concentrations of ATP in inflamed tissue and tumor milieu can counteract infected or tumor cells. It is thought to enhance the immune system by down-regulating regulatory T cells to However, when this system becomes overactive, it can lead to autoimmune diseases. T cells expose PtdSer in a variety of situations, such as adhesion to endothelial cells and activation upon antigen recognition. These results suggest that since this system is involved in the homeostasis of nerve cells, erythrocytes, and muscle cells, it is possible to regulate its expression, functionality, and complex formation in vivo or in vitro. By doing so, we have shown that it can be used in DDS in pharmaceuticals, switch technology for turning ON/OFF expression and function of proteins, and in homeostasis of cells, which are shown in this specification.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

ＸＫ発現調節剤、ＸＫ機能調節剤、ＶＰＳ１３Ａ発現調節剤及びＶＰＳ１３Ａ機能調節剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、細胞膜スクランブリング（例えば、細胞外ＡＴＰによる刺激に起因する細胞膜スクランブリング）調節剤が提供される。

Description

ＸＫ及び／又はＶＰＳ１３Ａの利用
　ＸＫ及びＶＰＳ１３Ａに関する技術が開示される。
　細胞膜は、リン脂質の脂質二重層から構成される。異なる頭部基及びアシル残基を有するリン脂質が細胞膜の外葉と内葉との間に非対称に分布している。ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰｔｄＥｔｎ）及びホスファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎｓ）は、細胞膜の内葉に限定され、大部分のホスファチジルコリン（ＰｔｄＣｈｏ）及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）は、外葉に局在化する。リン脂質の非対称な分布は、シグナル伝達、タンパク質の分配、及び膜の完全性の維持に寄与する。ＣＤＣ５０Ａとともに細胞膜に存在するＰ４型ＡＴＰアーゼであるＡＴＰ１１Ａ及びＡＴＰ１１Ｃは、ＰｔｄＳｅｒ及びＰｔｄＥｔｎを内葉に維持するためのフリッパーゼとして働く。
　細胞膜でのリン脂質の非対称な分布は、様々な生物学的プロセスにおいて破られる。細胞表面に露出したＰｔｄＳｅｒは、シグナル伝達分子として機能するか、又は酵素を活性化する。本発明者らは近年、アポトーシス細胞及び活性化血小板がＰｔｄＳｅｒを細胞表面に露出させる分子機構を解明した（非特許文献１）。細胞がアポトーシスを起こすと、カスパーゼが活性化してＡＴＰ１１Ａ及びＡＴＰ１１Ｃを切断し、活性化血小板における細胞内Ｃａ２＋の増加によりＡＴＰ１１Ａ及びＡＴＰ１１Ｃが不活性化される。アポトーシス細胞では数時間以内にＰｔｄＳｅｒが露出するが、活性化血小板では数分以内にＰｔｄＳｅｒが露出する。フリッパーゼの遮断は、疎水性脂質二重層中でその親水性頭部基を移動させることが困難であるため、ＰｔｄＳｅｒを急速に露出させるには十分でない。カスパーゼ又はＣａ２＋は、それぞれＸＫＲ８又はＴＭＥＭ１６Ｆを活性化し、リン脂質を内向き及び外向きの両方に非特異的に移動させるリン脂質スクランブラーゼを働かせる。細胞膜のこれらのスクランブラーゼは、リン脂質の親水性頭部基が２つの脂質層間で移動するための通路又は裂け目をもたらす。このようにして細胞外表面に移されたＰｔｄＳｅｒは、アポトーシス細胞の「ｅａｔ　ｍｅ」シグナルとして機能するか、又は血液凝固因子に血小板上の足場を与える（非特許文献１）。
　ＰｔｄＳｅｒを細胞表面に露出させる他のプロセスには、高濃度のＡＴＰによるＴリンパ球の刺激があることが知られている。ＡＴＰは、およそ４ｍＭの濃度でサイトゾルに存在する細胞内エネルギー通貨である。その細胞外濃度は、生理的条件下では低いか又はナノモル範囲であるが、炎症組織又は腫瘍環境においては数百マイクロモルに達する（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。ＡＴＰ及びその代謝産物は、細胞から放出されて、Ｇタンパク質共役受容体又はイオンチャネルであるプリン作動性受容体（Ｐ１、Ｐ２Ｘ及びＰ２Ｙ）に結合する（非特許文献２）。Ｐ２ＲＸ７によってコードされるＰ２Ｘ７は、短いＮ末端細胞質ドメイン及び長いＣ末端細胞質ドメインを有する２つの膜貫通ヘリックスを有するタンパク質のホモトリマーから構成されるＡＴＰゲートカチオンチャネルである。これは免疫細胞及び一部の腫瘍細胞を含む様々な細胞において発現される。Ｐ２Ｘ７を高用量のＡＴＰに短時間曝露すると、カリウムの流出、並びにナトリウム及びカルシウムの流入をもたらす非選択的カチオンチャネルの形成が誘導され、これは可逆的なＰｔｄＳｅｒ露出を伴う。一方、高濃度のＡＴＰへの長時間の曝露により、膜が破裂して細胞が死滅する。パイロトーシスと呼ばれるマクロファージにおけるこのタイプの細胞死は、カスパーゼ１を活性化するＮＬＲＰ３インフラマソーム、続いて孔形成タンパク質であるガスダーミンＤ及びニンジュリン１（ＮＩＮＪ１）によって媒介される。一方、Ｐ２Ｘ７を媒介した急速な細胞収縮及びＰｔｄＳｅｒ露出の温度依存性がマウスＴ細胞に見られないことから、インフラマソーム非依存性の細胞死経路の存在が示唆された。
　本発明者らは、Ｐ２Ｘ７を発現するマウスＴ細胞形質転換体がＰｔｄＳｅｒ露出について高濃度のＡＴＰに応答することを発見している。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニングにより、細胞膜でのＰ２Ｘ７の発現に不可欠な分子としてＥｒｏｓを特定し、更にＰ２Ｘ７受容体発現調節剤について開示した（特許文献１）
WO2020/241499
Nagata, S. et al., 2016. Exposure of phosphatidylserine on the cell surface. Cell Death Differ. 23:952-961 Linden, J., et al., 2019. Purine release, metabolism, and signaling in the inflammatory response. Annu. Rev. Immunol. 37:325-347 Pellegatti, P., et al., 2008. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase PLoS ONE. 3:e2599 Wilhelm, K., et al., 2010. Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R. Nat. Med. 16:1434-1438
　細胞死の調節又はP2X7受容体発現を調節する手段を提供することが１つの課題である。
　Ｔ細胞株におけるＰ２Ｘ７媒介ＰｔｄＳｅｒ露出に関与する分子を更に特性評価し、ＸＫ及びＶＰＳ１３Ａがこのプロセスに必須であることが見出された。ＸＫ及びＶＰＳ１３Ａは、細胞膜で複合体を形成し、リン脂質をスクランブル（細胞膜の内側と外側のリン脂質の非対称性がリン脂質スクランブラーゼの機能により崩壊すること）して膜の破裂をもたらし、ＸＫ－ＶＰＳ１３Ａ経路がマウスＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡＴＰ誘導死滅に重要な役割を果たすことも確認された。これらの結果から、ＸＫ－ＶＰＳ１３Ａに媒介されるリン脂質のスクランブリング（及び細胞死滅）が、免疫系及び神経系において極めて重要な役割を果たすことが示唆された。斯かる知見に基づき、更なる検討を重ね、下記に代表される発明が提供される。
項１
　細胞機能を調節する方法であって、それを必要とする細胞とＸＫ発現調節剤、ＸＫ機能調節剤、ＶＰＳ１３Ａ発現調節剤及びＶＰＳ１３Ａ機能調節剤からなる群から選択される少なくとも１種とを接触させることを含む、方法。
項２
　細胞膜スクランブリング（例えば、細胞外ＡＴＰによる刺激に起因する細胞膜スクランブリング）を調節する方法であって、それを必要とする細胞とＸＫ発現調節剤、ＸＫ機能調節剤、ＶＰＳ１３Ａ発現調節剤及びＶＰＳ１３Ａ機能調節剤からなる群から選択される少なくとも１種とを接触させることを含む、方法。
項３
　細胞死（例えば、細胞外ＡＴＰ依存性細胞死）を調節する方法であって、それを必要とする細胞とＸＫ発現調節剤、ＸＫ機能調節剤、ＶＰＳ１３Ａ発現調節剤及びＶＰＳ１３Ａ機能調節剤からなる群から選択される少なくとも１種とを接触させることを含む、方法。
項４
　細胞死（例えば、細胞外ＡＴＰ依存性細胞死）を抑制する方法であって、それを必要とする細胞とＸＫ発現調節剤、ＸＫ機能調節剤、ＶＰＳ１３Ａ発現調節剤及びＶＰＳ１３Ａ機能調節剤からなる群から選択される少なくとも１種とを接触させることを含む、方法。
項５
　細胞死（例えば、細胞外ＡＴＰ依存性細胞死）を促進する方法であって、それを必要とする細胞とＸＫ発現調節剤、ＸＫ機能調節剤、ＶＰＳ１３Ａ発現調節剤及びＶＰＳ１３Ａ機能調節剤からなる群から選択される少なくとも１種とを接触させることを含む、方法。
項６
　疼痛、炎症性疾患及び中枢神経系疾患（例えば、抑鬱）からなる群から選択される少なくとも１つの症状又は疾患を予防、改善又は治療する方法であって、それを必要とする被験体にＸＫ発現調節剤、ＸＫ機能調節剤、ＶＰＳ１３Ａ発現調節剤及びＶＰＳ１３Ａ機能調節剤からなる群から選択される少なくとも１種を投与することを含む、方法。
項７
　癌を治療又は予防する方法であって、それを必要とする被験体にＸＫ発現調節剤、ＸＫ機能調節剤、ＶＰＳ１３Ａ発現調節剤及びＶＰＳ１３Ａ機能調節剤からなる群から選択される少なくとも１種を投与することを含む、方法。
項８
　Ｐ２Ｘ７受容体活性を調節する方法であって、それを必要とする細胞とＸＫ発現調節剤、ＸＫ機能調節剤、ＶＰＳ１３Ａ発現調節剤及びＶＰＳ１３Ａ機能調節剤からなる群から選択される少なくとも１種とを接触させることを含む、方法。
項９
　Ｐ２Ｘ７受容体活性を抑制する方法であって、それを必要とする細胞とＸＫ発現調節剤、ＸＫ機能調節剤、ＶＰＳ１３Ａ発現調節剤及びＶＰＳ１３Ａ機能調節剤からなる群から選択される少なくとも１種とを接触させることを含む、方法。
項１０
　Ｐ２Ｘ７受容体活性を促進する方法であって、それを必要とする細胞とＸＫ発現調節剤、ＸＫ機能調節剤、ＶＰＳ１３Ａ発現調節剤及びＶＰＳ１３Ａ機能調節剤からなる群から選択される少なくとも１種とを接触させることを含む、方法。
項１１
　前記少なくとも１種がＸＫ発現抑制剤、ＸＫ機能抑制剤、ＶＰＳ１３Ａ発現抑制剤及びＶＰＳ１３Ａ機能抑制剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、項１～４及び６～９のいずれか一項に記載の方法。
項１２
　前記少なくとも１種がＸＫ発現促進剤、ＸＫ機能促進剤、ＶＰＳ１３Ａ発現促進剤及びＶＰＳ１３Ａ機能促進剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、項１～３、５～８及び１０のいずれか一項に記載の方法。
項１３
　前記少なくとも１種がＸＫ発現抑制剤又はＶＰＳ１３Ａ発現抑制剤を含む、項１～４、６～９及び１１のいずれか一項に記載の方法。
項１４
　前記ＸＫ発現抑制剤又はＶＰＳ１３Ａ発現抑制剤がポリヌクレオチドを含む、項１３に記載の方法。
項１５
　前記ＸＫ発現抑制剤又はＶＰＳ１３Ａ発現抑制剤がＸＫ特異的ｓｉＲＮＡ又はＶＰＳ１３Ａ特異的ｓｉＲＮＡ、ＸＫ特異的ｍｉＲＮＡ又はＶＰＳ１３Ａ特異的ｍｉＲＮＡ、ＸＫ特異的アンチセンス核酸又はＶＰＳ１３Ａ特異的アンチセンス核酸、及びそれらの発現カセット、並びにＸＫ遺伝子編集剤又はＶＰＳ１３Ａ遺伝子編集剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、項１３又は１４に記載の方法。
項１６
　前記細胞が細胞膜スクランブリング（例えば、細胞外ＡＴＰによる刺激に起因する細胞膜スクランブリング）の抑制を必要とする細胞である、項１、３、４、８、９、１１及び１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
項１７
　前記少なくとも１種がＸＫ発現促進剤又はＶＰＳ１３Ａ発現促進剤を含む、項１～３、５～８、１０及び１２に記載の方法。
項１８
　前記ＸＫ発現促進剤又はＶＰＳ１３Ａ発現促進剤がＸＫ発現カセット又はＶＰＳ１３Ａ発現カセットを含む、項１７に記載の方法。
項１９
　前記細胞が細胞膜スクランブリング（例えば、細胞外ＡＴＰによる刺激に起因する細胞膜スクランブリング）の促進を必要とする細胞である、項１、３、５、８、１０、１２、１７及び１８のいずれか一項に記載の方法。
項２０
　前記細胞が免疫細胞及び遺伝子組換え細胞から選択される、項１～５及び８～１９のいずれか一項に記載の方法。
項２１
　前記免疫細胞がＴ細胞（例えば、制御性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、ｉＮＫＴ細胞、及びγδ（ガンマ・デルタ）Ｔ細胞）、マクロファージ（例えば、ミクログリア）、樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞及びＢ細胞から選択されるか、又は前記遺伝子組換え細胞が遺伝子組換え幹細胞（例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞））及びそこから分化した細胞（例えば、ｉＰＳ細胞由来Ｔ細胞）、遺伝子組換え造血幹細胞、遺伝子組換え造血前駆細胞（例えば、巨核球）、遺伝子組換え分化血液細胞（例えば、血小板、赤血球）、及び遺伝子組換え免疫細胞（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞、がん抗原認識Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を導入したＴ細胞）から選択される、項２０に記載の方法。
項２２
　前記細胞がＴ細胞である、項１～５及び８～１９のいずれか一項に記載の方法。
項２３
　前記細胞が記憶Ｔ細胞への分化及び／又は維持の促進を必要とする細胞である、項１～５及び８～１９のいずれか一項に記載の方法。
項２４
　前記細胞が血小板又は赤血球である、項１～５及び８～１９のいずれか一項に記載の方法。
項２５
　前記ＸＫ発現調節剤、ＸＫ機能調節剤、ＶＰＳ１３Ａ発現調節剤、ＶＰＳ１３Ａ機能調節剤、ＸＫ発現抑制剤、ＸＫ機能抑制剤、ＶＰＳ１３Ａ発現抑制剤、ＶＰＳ１３Ａ機能抑制剤、ＸＫ発現促進剤、ＸＫ機能促進剤、ＶＰＳ１３Ａ発現促進剤又はＶＰＳ１３Ａ機能促進剤が薬剤、試薬又は食品組成物である、項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
項２６
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｅｘ　ｖｉｖｏで行われる、項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
項１Ａ
　ＸＫ発現調節剤、ＸＫ機能調節剤、ＶＰＳ１３Ａ発現調節剤及びＶＰＳ１３Ａ機能調節剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、細胞機能調節剤。
項２Ａ
　ＸＫ発現調節剤、ＸＫ機能調節剤、ＶＰＳ１３Ａ発現調節剤及びＶＰＳ１３Ａ機能調節剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、細胞膜スクランブリング（例えば、細胞外ＡＴＰによる刺激に起因する細胞膜スクランブリング）調節剤。
項３Ａ
　ＸＫ発現調節剤、ＸＫ機能調節剤、ＶＰＳ１３Ａ発現調節剤及びＶＰＳ１３Ａ機能調節剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、細胞死（例えば、細胞外ＡＴＰ依存性細胞死）調節剤。
項４Ａ
　ＸＫ発現抑制剤、ＸＫ機能抑制剤、ＶＰＳ１３Ａ発現抑制剤及びＶＰＳ１３Ａ機能抑制剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、細胞死（例えば、細胞外ＡＴＰ依存性細胞死）抑制剤。
項５Ａ
　ＸＫ発現促進剤、ＸＫ機能促進剤、ＶＰＳ１３Ａ発現促進剤及びＶＰＳ１３Ａ機能促進剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、細胞死（例えば、細胞外ＡＴＰ依存性細胞死）促進剤。
項６Ａ
　ＸＫ発現調節剤、ＸＫ機能調節剤、ＶＰＳ１３Ａ発現調節剤及びＶＰＳ１３Ａ機能調節剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、疼痛、炎症性疾患及び中枢神経系疾患（例えば、抑鬱）からなる群から選択される少なくとも１つの症状又は疾患の予防、改善又は治療剤。
項７Ａ
　ＸＫ発現調節剤、ＸＫ機能調節剤、ＶＰＳ１３Ａ発現調節剤及びＶＰＳ１３Ａ機能調節剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、癌の治療又は予防剤。
項８Ａ
　ＸＫ発現調節剤、ＸＫ機能調節剤、ＶＰＳ１３Ａ発現調節剤及びＶＰＳ１３Ａ機能調節剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、Ｐ２Ｘ７受容体を介した細胞機能の調節、抑制、又は促進剤。
項９Ａ
　ＸＫ発現抑制剤、ＸＫ機能抑制剤、ＶＰＳ１３Ａ発現抑制剤及びＶＰＳ１３Ａ機能抑制剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、Ｐ２Ｘ７受容体を介した細胞機能の抑制剤。
項１０Ａ
　ＸＫ発現促進剤、ＸＫ機能促進剤、ＶＰＳ１３Ａ発現促進剤及びＶＰＳ１３Ａ機能促進剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、Ｐ２Ｘ７受容体を介した細胞機能の促進剤。
項１１Ａ
　前記少なくとも１種がＸＫ発現抑制剤、ＸＫ機能抑制剤、ＶＰＳ１３Ａ発現抑制剤及びＶＰＳ１３Ａ機能抑制剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、項１Ａ～４Ａ及び６Ａ～９Ａのいずれか一項に記載の剤。
項１２Ａ
　前記少なくとも１種がＸＫ発現促進剤、ＸＫ機能促進剤、ＶＰＳ１３Ａ発現促進剤及びＶＰＳ１３Ａ機能促進剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、項１Ａ～３Ａ、５Ａ～８Ａ及び１０Ａのいずれか一項に記載の剤。
項１３Ａ
　ＸＫ発現抑制剤又はＶＰＳ１３Ａ発現抑制剤を含む、項１Ａ～４Ａ、６Ａ～９Ａ及び１１Ａのいずれか一項に記載の剤。
項１４Ａ
　前記ＸＫ発現抑制剤又はＶＰＳ１３Ａ発現抑制剤がポリヌクレオチドを含む、項１３Ａに記載の剤。
項１５Ａ
　前記ＸＫ発現抑制剤又はＶＰＳ１３Ａ発現抑制剤がＸＫ特異的ｓｉＲＮＡ又はＶＰＳ１３Ａ特異的ｓｉＲＮＡ、ＸＫ特異的ｍｉＲＮＡ又はＶＰＳ１３Ａ特異的ｍｉＲＮＡ、ＸＫ特異的アンチセンス核酸又はＶＰＳ１３Ａ特異的アンチセンス核酸、及びそれらの発現カセット、並びにＸＫ遺伝子編集剤又はＶＰＳ１３Ａ遺伝子編集剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、項１３Ａ又は１４Ａに記載の剤。
項１６Ａ
　細胞死（例えば、細胞外ＡＴＰ依存性細胞死）を抑制するための、項１Ａ、６Ａ～９Ａ、１１Ａ及び１３Ａ～１５Ａのいずれか一項に記載の剤。
項１７Ａ
　細胞膜スクランブリング（例えば、細胞外ＡＴＰによる刺激に起因する細胞膜スクランブリング）を抑制するための、項１Ａ、３Ａ、４Ａ、６Ａ～９Ａ、１１Ａ及び１３Ａ～１５Ａのいずれか一項に記載の剤。
項１８Ａ
　ＸＫ発現促進剤又はＶＰＳ１３Ａ発現促進剤を含む、項１Ａ～３Ａ、５Ａ～８Ａ、１０Ａ及び１２Ａのいずれか一項に記載の剤。
項１９Ａ
　前記ＸＫ発現促進剤又はＶＰＳ１３Ａ発現促進剤がＸＫ発現カセット又はＶＰＳ１３Ａ発現カセットを含む、項１８Ａに記載の剤。
項２０Ａ
　細胞死（例えば、細胞外ＡＴＰ依存性細胞死）を促進するための、項１Ａ、２Ａ、６Ａ～８Ａ、１０Ａ、１３Ａ、１８Ａ及び１９Ａのいずれか一項に記載の剤。
項２１Ａ
　細胞膜スクランブリング（例えば、細胞外ＡＴＰによる刺激に起因する細胞膜スクランブリング）を促進するための、項１Ａ、３Ａ、５Ａ～８Ａ、１０Ａ、１２Ａ、１８Ａ及び１９Ａのいずれか一項に記載の剤。
項２２Ａ
　前記細胞が免疫細胞及び遺伝子組換え細胞から選択される、項１Ａ～５Ａ及び８Ａ～２１Ａのいずれか一項に記載の剤。
項２３Ａ
　前記免疫細胞がＴ細胞（例えば、制御性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、ｉＮＫＴ細胞、及びγδ（ガンマ・デルタ）Ｔ細胞）、マクロファージ（例えば、ミクログリア）、樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞及びＢ細胞から選択されるか、又は前記遺伝子組換え細胞が遺伝子組換え造血幹細胞、遺伝子組換え造血前駆細胞（例えば、巨核球）、遺伝子組換え分化血液細胞（例えば、血小板、赤血球）、及び遺伝子組換え免疫細胞（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞、がん抗原認識Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を導入したＴ細胞）から選択される、項２２Ａに記載の剤。
項２４Ａ
　前記細胞がＴ細胞である、項１Ａ～５Ａ及び８Ａ～２１Ａのいずれか一項に記載の剤。
項２５Ａ
　記憶Ｔ細胞への分化及び／又は維持促進用である、項１Ａ～５Ａ及び８Ａ～２１Ａのいずれか一項に記載の剤。
項２６Ａ
　前記細胞が血小板又は赤血球である、項１Ａ～５Ａ及び８Ａ～２１Ａのいずれか一項に記載の剤。
項２７Ａ
　医薬、試薬又は食品組成物である、項１Ａ～２６Ａのいずれか一項に記載の剤。
項２８Ａ
　項１Ａ～２７Ａのいずれか一項に記載の剤が導入されている細胞。
項２９Ａ
　項５Ａ、１０Ａ及び１８Ａ～２１Ａのいずれか一項に記載の剤が導入されているＴ細胞。
項３０Ａ
　ＸＫ若しくはＶＰＳ１３Ａの発現及び／又はＸＫ若しくはＶＰＳ１３Ａの機能を一時的に冗進させるように調節できる、項２９Ａに記載のＴ細胞。
項３１Ａ
　項４Ａ、９Ａ及び１３Ａ～１７Ａのいずれか一項に記載の剤が更に導入されている、項２９Ａ又は３０Ａに記載のＴ細胞。
項３２Ａ
　ＸＫ若しくはＶＰＳ１３Ａの発現及び／又はＸＫ若しくはＶＰＳ１３Ａの機能を一時的に冗進させた後、ＸＫ若しくはＶＰＳ１３Ａの発現及び／又はＸＫ若しくはＶＰＳ１３Ａの機能を抑制できる、項３１Ａに記載のＴ細胞。
項１Ｂ
　細胞のＸＫ及び／又はＶＰＳ１３Ａを欠失させること、並びに／或いは、細胞におけるＸＫ及び／又はＶＰＳ１３Ａの発現及び／又は機能を抑制することを含む、
　細胞死が抑制された細胞を製造する方法。
項２Ｂ
　細胞にＸＫ及び／又はＶＰＳ１３Ａを導入すること、並びに／或いは、細胞におけるＸＫ及び／又はＶＰＳ１３Ａの発現及び／又は機能を促進させることを含む、
　高ＡＴＰ濃度依存性細胞死を生じやすい細胞を製造する方法。
項３Ｂ
　薬剤の送達のための細胞を製造するための、項１Ｂ又は２Ｂに記載の方法。
項４Ｂ
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｅｘ　ｖｉｖｏで行われる、項１Ｂ～３Ｂのいずれか一項に記載の方法。
　細胞死の調節又はP2X7受容体発現を調節する手段が提供される。
Ｐ２Ｘ７媒介ＰｔｄＳｅｒ露出に関与する遺伝子のゲノムワイドＣＲＩＳＰＲスクリーニングを示す図である。（Ａ）ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲスクリーニングのスキームを示す。（Ｂ）濃縮されたｓｇＲＮＡが標的とする遺伝子；ディープシークエンシングにおいて４つ、５つ又は６つの独自のｓｇＲＮＡが検出された遺伝子を存在度（リードの総数に対するパーセンテージ）でプロットした。（Ｃ）Ｈ２Ａ－Ｌ１ヒストンファミリーメンバーのｓｇＲＮＡによるＸｋ遺伝子のエクソン３の欠失を示す。１１個のよく保存されたヒストンＨ２Ａ－Ｌ１ファミリー遺伝子がＸｋ遺伝子のエクソン３の隣接領域に存在する。 Ｐ２Ｘ７、Ｘｋ又はＶｐｓ１３ａ欠損細胞株の樹立に関する図である。（Ａ）ウエスタンブロット分析結果を示す。レーン１は、ＴＭＥＭ１６Ｆ－／－ＷＲ１９Ｌをノックアウトし、生成した「Ｐ２Ｘ７－／－１６Ｆ－／－（ＤＫＯ）」細胞に関する。レーン２は、ＤＫＯをマウスＰ２Ｘ７で形質転換し、樹立した「ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７」に関する。レーン３は、Ｘｋ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７においてＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７のＸｋ遺伝子をノックアウトしたもの「Ｘｋ－／－」に関する。レーン４は、Ｘｋ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７をＦＬＡＧタグ付きマウスＸｋで形質転換して、生成したＸｋ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７／Ｘｋ「Ｘｋ－／－－Ｘｋ」に関する。レーン５は、Ｖｐｓ１３ａ遺伝子をＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７においてノックアウトした「Ｖｐｓ１３ａ－／－」に関する。レーン６は、Ｖｐｓ１３ａ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７／Ｖｐｓ１３ａにおいてＶｐｓ１３ａ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７をマウスＶｐｓ１３ａで形質転換した「Ｖｐｓ１３ａ－／－－Ｖｐｓ１３ａ」に関する。レーン７は、Ｘｋ及びＶｐｓ１３ａ遺伝子をＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７においてノックアウトした「Ｘｋ－／－Ｖｐｓ１３ａ－／－」に関する。全細胞溶解物の１レーン当たりおよそ４．７μｇのタンパク質（タンパク質４７０ｎｇである中央パネルのレーン４を除く）をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。Ｐ２Ｘ７、Ｘｋ又はＶｐｓ１３ａに対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行い、膜をＣＢＢで染色した。（Ｂ）Ｐ２Ｘ７ｋの細胞表面発現に関する。ＤＫＯ、ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７、Ｘｋ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７（Ｘｋ－／－）、Ｘｋ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７／Ｘｋ（Ｘｋ－／－－Ｘｋ）、Ｖｐｓ１３ａ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７（Ｖｐｓ１３ａ－／－）、Ｖｐｓ１３ａ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７／Ｖｐｓ１３ａ（Ｖｐｓ１３ａ－／－－Ｖｐｓ１３ａ）及びＸｋ－／－Ｖｐｓ１３ａ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７／Ｖｐｓ１３ａ（Ｘｋ－／－Ｖｐｓ１３ａ－／－）細胞をＡｌｅｘａ　６４７－抗ｍＰ２Ｘ７　Ａｂで染色した。ＳＹＴＯＸ　Ｂｌｕｅ陰性集団におけるＡｌｅｘａ　６４７染色プロファイルを示す。 ＡＴＰ誘導リン脂質スクランブリング及び細胞溶解へのＸｋ及びＶｐｓ１３ａの必要性を示す図である。ＤＫＯ、ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７、Ｘｋ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７（Ｘｋ－／－）、Ｘｋ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７／Ｘｋ（Ｘｋ－／－－Ｘｋ）、Ｖｐｓ１３ａ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７（Ｖｐｓ１３ａ－／－）、Ｖｐｓ１３ａ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７／Ｖｐｓ１３ａ（Ｖｐｓ１３ａ－／－－Ｖｐｓ１３ａ）及びＸｋ－／－Ｖｐｓ１３ａ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７（Ｘｋ－／－Ｖｐｓ１３ａ－／－）細胞を刺激しないままにするか、又は４℃にて５分間、５００μＭ　ＡＴＰで刺激し、２．５μｇ／ｍｌ　ＰＩの存在下にてアネキシンＶで染色し、フローサイトメトリーによって分析した（Ａ）。ＰＩ陰性集団におけるアネキシンＶ染色プロファイルを左側に示す。（Ｂ）においては、細胞を２５０ｎＭ　ＮＢＤ－ＰＣの存在下にて５００μＭ　ＡＴＰとともに指定の時間にわたって４℃でインキュベートし、ＢＳＡ抽出不可能なＮＢＤ－ＰＣをフローサイトメトリーによって検出した。（Ｃ）においては、細胞を５００μＭ　ＡＴＰ及び２．５μｇ／ｍｌ　ＰＩを含有するアネキシンバッファー中にて４℃で５分間及び室温で１０分間連続してインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。ＰＩ陽性とみなされた細胞集団は、一番上のレーンにバーで示す。実験は３回行った。平均蛍光強度（ＭＦＩ）の値を（Ａ）及び（Ｂ）の右側にＳＥ（バー）とともに示す。一方、ＰＩ陽性細胞のパーセンテージを（Ｃ）にプロットする。 ＷＲ１９Ｌ細胞におけるＸｋとＶｐｓ１３ａとの間の複合体形成を示す図である。（Ａ）ＷＲ１９ＬにおけるＸｋ及びＶｐｓ１３ａのＢＮ－ＰＡＧＥ分析。ＤＫＯ（レーン１）、ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７（レーン２）、Ｘｋ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７（レーン３）及びＶｐｓ１３ａ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７（レーン４）からの可溶化粗膜画分（４．２μｇのタンパク質）をＢＮ－ＰＡＧＥによって分離し、抗Ｘｋ　Ａｂ（左パネル）又は抗Ｖｐｓ１３ａ　Ａｂ（右パネル）を用いたウエスタンブロッティングによって分析した。各膜をＣＢＢで染色し、下パネルに示す。（Ｂ）Ｘｋの細胞局所化を示す。Ｘｋ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７（Ｘｋ－／－）及びＸｋ－／－Ｖｐｓ１３ａ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７（Ｘｋ－／－Ｖｐｓ１３ａ－／－）細胞をＸｋ－ＥＧＦＰで形質転換し、５μｇ／ｍｌ　Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２の存在下で共焦点顕微鏡法によって観察した。核の蛍光はＨｏｅｃｈｓｔ、それ以外の蛍光はＥＧＦＰのシグナルをそれぞれ示す。スケールバーは１０μｍ。 マウス脾臓Ｔ細胞におけるＰ２Ｘ７、Ｘｋ及びＶｐｓ１３ａの発現を示す図である。（Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５＋集団。Ｘｋ＋／ｙ及びＸｋ－／ｙマウスに由来するＣＤ４＋Ｔ細胞をＰＥ－抗ＣＤ４　ｍＡｂ及びＦＩＴＣ－抗ＣＤ２５　ｍＡｂで染色した。ＳＹＴＯＸ　Ｂｌｕｅ陰性集団における染色プロファイルを示す。３匹の異なるマウスに由来するＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞におけるＣＤ２５＋集団のパーセンテージを平均±ＳＥとして示す。（Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＰ２Ｘ７、Ｘｋ及びＶｐｓ１３ａの発現を示す。ＣＤ２５－ＣＤ４＋及びＣＤ２５＋ＣＤ４＋集団をＸｋ＋／ｙ及びＸｋ－／ｙマウスの脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞からＦＡＣＳＡｒｉａ　ＩＩによって回収した。全細胞溶解物を細胞から調製し、１レーン当たり２．２μｇのタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。Ｐ２Ｘ７、Ｘｋ又はＶｐｓ１３ａに対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行い、膜をＣＢＢで染色した。（Ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＸｋとＶｐｓ１３ａとの間の複合体形成。８週齢～１０週齢のＸｋ＋／ｙ（レーン１）及びＸｋ－／ｙ（レーン２）同腹仔雄性マウスに由来するＣＤ４＋Ｔ細胞の可溶化膜画分（８５０ｎｇのタンパク質）をＢＮ－ＰＡＧＥによって分離し、続いて抗Ｘｋ　Ａｂ（左パネル）又は抗Ｖｐｓ１３ａ　Ａｂ（右パネル）を用いたウエスタンブロッティングを行った。下のパネルにおいては膜を抗Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰアーゼｍＡｂで再プロービングした。 ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＡＴＰ誘導ＰｔｄＳｅｒ露出及び細胞溶解へのＸｋの関与を示す図である。（Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＡＴＰ誘導ＰｔｄＳｅｒ露出に対するＸｋの影響を示す。Ｘｋ＋／ｙ及びＸｋ－／ｙマウスに由来するＣＤ４＋Ｔ細胞をＰＥ－抗ＣＤ４　ｍＡｂ及びＦＩＴＣ－抗ＣＤ２５　ｍＡｂと混合し、アネキシンＶ及びＳＹＴＯＸ　Ｂｌｕｅの存在下において１０℃にて指定の時間にわたって５００μＭ　ＡＴＰで刺激し、フローサイトメトリーによって分析した。ＳＹＴＯＸ　Ｂｌｕｅ陰性ＣＤ２５－ＣＤ４＋（左カラム）及びＣＤ２５＋ＣＤ４＋（右カラム）集団におけるアネキシンＶ染色プロファイルを示す。実験は３匹の異なるマウスで行い、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋集団におけるアネキシンＶ染色の平均ＭＦＩを（Ｂ）にＳＥ（バー）とともにプロットした。（Ｃ）ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＡＴＰ誘導細胞溶解に対するＸｋの影響を示す。野生型及びＸｋ欠損マウスに由来するＣＤ４＋Ｔ細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　ｖｉｏｌｅｔ蛍光色素、並びにＡＰＣ－抗ＣＤ４　ｍＡｂ及びＡＰＣ－Ｃｙ７－抗ＣＤ２５　ｍＡｂで順次染色した。次いで、細胞を２．５μｇ／ｍｌ　ＰＩの存在下において３７℃にて指定の時間にわたって５００μＭ　ＡＴＰで刺激し、フローサイトメトリーによって分析した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ陰性ＣＤ２５＋ＣＤ４＋集団におけるＰＩ染色プロファイルを示す。実験は３匹の異なるマウスで行った。指定の時点でのＰＩ陽性細胞の平均パーセンテージを（Ｄ）にＳＥ（バー）とともにプロットする。バーで示される細胞集団は、ＰＩ陽性とみなした。 Ｘｋｒ８とＸｋとの間の保存された構造を示す図である。（Ａ）マウスＸｋ及びＸｋｒ８のアミノ酸配列を最大の相同性が得られるようにアラインメントした。α－ヘリックスに番号を付け、領域を網掛けした。ヘリックスα１～α１０は膜内にある。膜貫通部の荷電残基を太字で強調し、リン脂質のための裂け目を形成する疎水性残基を太字とアスターリスク（＊）で強調する。マウスＸｋｒ８におけるカスパーゼ認識部位を太字下線で示し、Ｘｋにおける逆平行β－シートを太字イタリックで強調する。（Ｂ）ＡｌｐｈａＦｏｌｄ２によって予測されたマウスＸｋの構造をヒトＸＫＲ８構造（ＰＤＢ：７ＤＣＥ）に重ね合わせた図である。 Ｈ２ａｌ１変異体遺伝子の配列アラインメントを示す図である。１１個のマウスＨ２ａｌ１変異体遺伝子のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ　ＮＭ＿００１１１１０３７、００１２４２９４７、００１２４２９４９、００１２４２９５０、００１０２５２６０、００１２４２９５１、００１２４２９５２、００１２４２９５３、００１２４２９５４、００１０８５５３７、０２９５８８）をアラインメントした。イタリックで表記されない塩基は１１個全ての変異体において保存されたヌクレオチドであり、７個以上１０個以下の変異体において保存されたヌクレオチドは太字イタリックで示される。下線はプロトスペーサー配列を示し、二重下線はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を示す。開始（ＡＴＧ）及び終止（ＴＧＡ）コドンには灰色で網掛けで示される。Ｈ２ａｌ１ａの配列は配列番号９であり、Ｈ２ａｌ１ｂの配列は配列番号１０であり、Ｈ２ａｌ１ｃの配列は配列番号１１であり、Ｈ２ａｌ１ｄの配列は配列番号１２であり、Ｈ２ａｌ１ｅの配列は配列番号１３であり、Ｈ２ａｌ１ｆの配列は配列番号１４であり、Ｈ２ａｌ１ｇの配列は配列番号１５であり、Ｈ２ａｌ１ｈの配列は配列番号１６であり、Ｈ２ａｌ１ｉの配列は配列番号１７であり、Ｈ２ａｌ１ｋの配列は配列番号１８であり、Ｈ２ａｌ１ｍの配列は配列番号１９である。 マウスＷＲ１９Ｌ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムによる遺伝子ノックアウトを示す図である。（Ａ）Ｘｋ－／－及びＸｋ－／－Ｖｐｓ１３ａ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７におけるＸｋ遺伝子の野生型及び突然変異対立遺伝子（対立遺伝子１）及びＷＲ１９Ｌ細胞におけるＸｋ遺伝子の１つの対立遺伝子（対立遺伝子２）を示す。（Ｂ）Ｖｐｓ１３ａの２つの対立遺伝子は、Ｖｐｓ１３ａ－／－及びＸｋ－／－Ｖｐｓ１３ａ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７において同じ４ｂｐ挿入を有していた。プロトスペーサー配列を網掛けで強調し、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）には下線を引き、矢印は切断部位を指す。
　本書において、「含有」及び「含む」という表現は、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある２つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータで決定することができる。Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLASTを用いて決定することもできる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の『同一性』も上記に準じて定義される。
　本書において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
　本書において、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、特に制限されず、天然、人工のいずれのものも包含する。具体的には、DNA、RNA等の他にも、次に例示するように、公知の化学修飾が施されたものであってもよい。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、ヌクレオチドの糖部の2´酸素と4´炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したものであるBNA（LNA）等もまた、用いられ得る。
　細胞膜スクランブリング、細胞死、及び／又はＰ２Ｘ７受容体活性を調節する方法、或いは、疾患を治療又は予防する方法は、それを必要とする細胞とXK発現調節剤、XK機能調節剤、VPS13A発現調節剤及びVPS13A機能調節剤からなる群から選択される少なくとも１種とを接触させることを含むことが好ましい。細胞膜スクランブリング、細胞死、及び／又はＰ２Ｘ７受容体活性の調節剤、或いは、疾患の治療又は予防剤は、XK発現調節剤、XK機能調節剤、VPS13A発現調節剤及びVPS13A機能調節剤からなる群から選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。本書では、XK発現調節剤、XK機能調節剤、VPS13A発現調節剤及びVPS13A機能調節剤を総称して単に「調節剤」ということがある。
　XK発現調節剤とは、XK（X-linked Kx blood group antigen）遺伝子の発現を調節するものである。XK機能調節剤とは、XKの機能を調節するものである。VPS13A発現調節剤とは、VPS13A（vacuolar protein sorting 13 homolog A）遺伝子の発現を調節するものである。VPS13A機能調節剤とは、VPS13Aの機能を調節するものである。XK及びVPS13A並びにこれらをコードする遺伝子の分子構造は、その起源によって異なり得るところ、それらが由来する（又は存在する）細胞（又は、それを含む被検体）の種類は特に制限されない。例えば、被検体（又は細胞の由来）としては、動物、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカなどの種々の哺乳類が挙げられる。
　種々の生物種由来XK及びVPS13Aのアミノ酸配列並びにXK mRNA及びVPS13A mRNAの塩基配列は公知である。例えば、ヒトXKタンパク質としては、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NM 021083.3）が挙げられ、ヒトVPS13Aタンパク質としては、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NM_033305.3）が挙げられ、マウスXKタンパク質としては、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NM 023500.2）などが挙げられ、マウスVPS13Aタンパク質としては、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NM_173028.4）などが挙げられ、ヒトXK mRNAとしては、配列番号５の塩基配列から示されるmRNAが挙げられ、ヒトVPS13A mRNAとしては、配列番号６の塩基配列から示されるmRNAが挙げられ、マウスXk mRNAとしては配列番号７の塩基配列から示されるmRNAが挙げられ、マウスVps13a mRNAとしては配列番号８の塩基配列から示されるmRNAなどが挙げられる。また、XKタンパク質、VPS13Aタンパク質、XK mRNA、及びVPS13A mRNAには、これらのスプライシングバリアントも包含され得る。なお、本書において「XK」には、ヒトのXKだけでなく他の種のオーソログも包含される。「VPS13A」には、ヒトのVPS13Aだけでなく他の種のオーソログも包含される。
　調節対象であるXK及びVPS13Aは、その本来の機能、すなわち、XKはリン脂質スクランブラーゼとして機能、VPS13Aは脂質トランスポーターとしての機能を有する限りにおいて、置換、欠失、付加、挿入などのアミノ酸変異を有していてもよい。変異としては、活性がより損なわれ難いという観点から、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換が挙げられる。
　調節対象であるXK mRNA及びVPS13A mRNAも、該mRNAから翻訳されるタンパク質が、その本来の機能を有する限りにおいて、置換、欠失、付加、挿入などの塩基変異を有していてもよい。変異としては、該mRNAから翻訳されるタンパク質においてアミノ酸置換が生じない変異やアミノ酸の保存的置換が生じる変異が好ましい。
　調節対象であるXKタンパク質の好ましい具体例としては、下記（a）に記載するタンパク質及び下記（b）に記載するタンパク質：
　（a）配列番号１及び３のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
　（b）配列番号１及び３のいずれかに示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つリン脂質スクランブラーゼとしての機能を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
　上記（b）において、同一性は、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは98％以上である。
　上記（b）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（b’）配列番号１及び３のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つリン脂質スクランブラーゼとしての機能を有するタンパク質
が挙げられる。
　上記（b’）において、複数個とは、例えば2～20個であり、好ましくは2～10個であり、より好ましくは2～5個であり、よりさらに好ましくは2又は3個である。
　調節対象であるXK mRNAの好ましい具体例としては、下記（c）に記載するmRNA及び下記（d）に記載するmRNA：
　（c）配列番号５及び７のいずれかに示される塩基配列からなるmRNA、及び
　（d）配列番号５及び７のいずれかに示される塩基配列と85％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つリン脂質スクランブラーゼとしての機能を有するタンパク質をコードするmRNA
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
　上記（d）において、同一性は、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは98％以上である。
　上記（d）に記載するmRNAの一例としては、例えば
（d’）配列番号５及び７のいずれかに示される塩基配列に対して1若しくは複数個の塩基が置換、欠失、付加、又は挿入された塩基配列からなり、且つリン脂質スクランブラーゼとしての機能を有するタンパク質をコードするmRNA
が挙げられる。
　上記（d’）において、複数個とは、例えば2～200個であり、好ましくは2～100個であり、より好ましくは2～50個であり、よりさらに好ましくは2～10個である。
　調節対象であるVPS13Aタンパク質の好ましい具体例としては、下記（e）に記載するタンパク質及び下記（f）に記載するタンパク質：
　（e）配列番号２及び４のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
　（f）配列番号２及び４のいずれかに示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ脂質トランスポーターとしての機能を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
　上記（e）において、同一性は、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは98％以上である。
　上記（f）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（f’）配列番号２及び４のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ脂質トランスポーターとしての機能を有するタンパク質
が挙げられる。
　上記（f’）において、複数個とは、例えば2～20個であり、好ましくは2～10個であり、より好ましくは2～5個であり、よりさらに好ましくは2又は3個である。
　調節対象であるVPS13A mRNAの好ましい具体例としては、下記（g）に記載するmRNA及び下記（h）に記載するmRNA：
　（g）配列番号６及び８のいずれかに示される塩基配列からなるmRNA、及び
　（h）配列番号６及び８のいずれかに示される塩基配列と85％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ脂質トランスポーターとしての機能を有するタンパク質をコードするmRNA
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
　上記（g）において、同一性は、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは98％以上である。
　上記（h）に記載するmRNAの一例としては、例えば
（h’）配列番号６及び８のいずれかに示される塩基配列に対して1若しくは複数個の塩基が置換、欠失、付加、又は挿入された塩基配列からなり、且つ脂質トランスポーターとしての機能を有するタンパク質をコードするmRNA
が挙げられる。
　上記（h’）において、複数個とは、例えば2～200個であり、好ましくは2～100個であり、より好ましくは2～50個であり、よりさらに好ましくは2～10個である。
発現調節剤
　XK発現調節剤は、発現調節対象の生物又は細胞内で発現しているXKタンパク質又はXK mRNAの発現を調節可能なものである限り、特に制限されず、例えばXK発現抑制剤、XK発現促進剤等を包含する。VPS13A発現調節剤は、発現調節対象の生物又は細胞内で発現しているVPS13Aタンパク質又はVPS13A mRNAの発現を調節可能なものである限り、特に制限されず、例えばVPS13A発現抑制剤、VPS13A発現促進剤等を包含する。XK発現調節剤及び／又はVPS13A発現調節剤は、1種単独で用いることもできるし、2種以上を組み合わせて用いることもできる。
発現抑制剤
　XK発現抑制剤としては、XKタンパク質、XK mRNAなどの発現量を抑制し得るものである限り特に制限されず、例えば、XK特異的small interfering RNA（siRNA）、XK特異的microRNA（miRNA）、XK特異的アンチセンス核酸、これらの発現ベクター；　XK特異的リボザイム；　CRISPR/CasシステムによるXK遺伝子編集剤などが挙げられる。
　VPS13A発現抑制剤としては、VPS13Aタンパク質、VPS13A mRNAなどの発現量を抑制し得るものである限り特に制限されず、例えば、VPS13A特異的small interfering RNA（siRNA）、VPS13A特異的microRNA（miRNA）、VPS13A特異的アンチセンス核酸、これらの発現ベクター、XK特異的リボザイム、CRISPR/CasシステムによるXK遺伝子編集剤などが挙げられる。
　なお、発現抑制とは、XKタンパク質、VPS13Aタンパク質、XK mRNA、又はVPS13A mRNAなどの発現量を、例えば1/2、1/3、1/5、1/10、1/20、1/30、1/50、1/100、1/200、1/300、1/500、1/1000、1/10000以下に抑制することを意味し、これらの発現量を0とすることをも包含する。
siRNA、miRNA、アンチセンス核酸、リボザイム
　XK特異的siRNAは、XKをコードする遺伝子の発現を特異的に抑制する二本鎖RNA分子である限り特に制限されない。VPS13A特異的siRNAは、VPS13Aをコードする遺伝子の発現を特異的に抑制する二本鎖RNA分子である限り特に制限されない。一実施形態において、siRNAは、例えば、18塩基以上、19塩基以上、20塩基以上、又は21塩基以上の長さであることが好ましい。また、siRNAは、例えば、25塩基以下、24塩基以下、23塩基以下、又は22塩基以下の長さであることが好ましい。ここに記載するsiRNAの長さの上限値及び下限値は任意に組み合わせることが想定される。例えば、下限が18塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が19塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が20塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が21塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さの組み合わせが想定される。
　siRNAは、shRNA(small hairpin RNA)であっても良い。shRNAは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、shRNAは、ある領域の配列を配列aとし、配列aに対する相補鎖を配列bとすると、配列a、スペーサー、配列bの順になるようにこれらの配列が一本のRNA鎖に存在するようにし、全体で45～60塩基の長さとなるように設計することができる。配列aは、標的となるXKをコードする塩基配列の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されず、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列aの長さは19～25塩基、好ましくは19～21塩基である。
　XK特異的siRNA及びVPS13A特異的siRNAは、上記の配列長のものの5’又は3’末端に、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、通常2～4塩基程度である。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いると核酸の安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　siRNAは、3'末端に突出部配列（オーバーハング）を有していてもよく、具体的には、dTdT（dTはデオキシチミジンを表わす）を付加したものが挙げられる。また、末端付加がない平滑末端（ブラントエンド）であってもよい。siRNAは、センス鎖とアンチセンス鎖が異なる塩基数であってもよく、例えば、アンチセンス鎖が3'末端及び5'末端に突出部配列（オーバーハング）を有している「asymmetrical interfering RNA（aiRNA）」を挙げることができる。典型的なaiRNAの一例としては、アンチセンス鎖が21塩基からなり、センス鎖が15塩基からなり、アンチセンス鎖の両端で各々3塩基のオーバーハング構造をとる。
　XK特異的siRNA及びVPS13A特異的siRNAの標的配列の位置は特に制限されるわけではないが、一実施形態において、5’-UTR及び開始コドンから約50塩基まで、並びに3’-UTR以外の領域から標的配列を選択することが望ましい。選択された標的配列の候補群について、標的以外のmRNAにおいて16-17塩基の連続した配列に相同性がないかどうかを、BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）などのホモロジー検索ソフトを用いて調べ、選択した標的配列の特異性を確認することが好ましい。特異性が確認された標的配列について、AA（もしくはNA）以降の19－21塩基にTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するセンス鎖と、該19－21塩基に相補的な配列及びTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するアンチセンス鎖とからなる2本鎖RNAをsiRNAとして設計してもよい。また、siRNAの前駆体であるshRNAは、ループ構造を形成しうる任意のリンカー配列（例えば、5-25塩基程度）を適宜選択し、上記センス鎖とアンチセンス鎖とを該リンカー配列を介して連結することにより設計することができる。
　siRNA及び／又はshRNAの配列は、種々のwebサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、以下を挙げることができる。
Ambionが提供するsiRNA Target Finder（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html）pSilencer（登録商標）Expression Vector用インサートデザインツール（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html）RNAi Codexが提供するGeneSeer（http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi）。
　siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90～約95℃で約1分程度変性させた後、約30～約70℃で約1～約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるshRNAを合成し、これを、RNA切断タンパク質ダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。このようなXK特異的siRNAは、市販されるものであってもよい。
　XK特異的miRNAは、XKをコードする遺伝子の翻訳を阻害する限り任意である。VPS13A特異的miRNAは、VPS13Aをコードする遺伝子の翻訳を阻害する限り任意である。例えば、miRNAは、siRNAのように標的mRNAを切断するのではなく、標的の3’非翻訳領域（UTR）に対合してその翻訳を阻害してもよい。miRNAは、pri-miRNA（primary miRNA）、pre-miRNA（precursor miRNA）、及び成熟miRNAのいずれでもよい。miRNAの長さは特に制限されず、pri-miRNAの長さは通常数百～数千塩基であり、pre-miRNAの長さは通常50～80塩基であり、成熟miRNAの長さは通常18～30塩基である。一実施形態において、XK特異的miRNAは、好ましくはpre-miRNA又は成熟miRNAであり、より好ましくは成熟miRNAである。このようなXK特異的miRNA及びVPS13A特異的miRNAは、公知の手法で合成してもよく、合成RNAを提供する会社から購入してもよい。
　XK特異的アンチセンス核酸とは、XKをコードする遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸であって、該mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、XKタンパク質合成を抑制する機能を有する核酸である。VPS13A特異的アンチセンス核酸とは、VPS13Aをコードする遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸であって、該mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、VPS13Aタンパク質合成を抑制する機能を有する核酸である。アンチセンス核酸はDNA、RNA、DNA/RNAキメラのいずれでもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性リボヌクレアーゼH（RNase H）に認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こす。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、mRNA中の配列だけでなく、XK遺伝子又はVPS13A遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。イントロン配列は、ゲノム配列と、XK遺伝子のcDNA塩基配列とをBLAST、FASTAなどのホモロジー検索プログラムを用いて比較することにより、決定することができる。
　XK特異的アンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてXKタンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さは制限されない。VPS13A特異的アンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてVPS13Aタンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さは制限されない。特異的アンチセンス核酸は、XK又はVPS13AをコードするmRNAの全配列であっても部分配列であってもよい。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題などを考慮すれば、約10～約40塩基、特に約15～約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、これらに限定されるものではない。より具体的には、XK遺伝子の5’端ヘアピンループ、5’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ORF翻訳終止コドン、3’端非翻訳領域、3’端パリンドローム領域又は3’端ヘアピンループなどをアンチセンス核酸の好ましい標的領域として選択しうるが、それらに限定されるものではない。
　XK特異的アンチセンス核酸及びVPS13A特異的アンチセンス核酸は、XK遺伝子又はVPS13A遺伝子のmRNAや初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン（antigene））であってもよい。
　XK特異的siRNA、XK特異的miRNA、及びXK特異的アンチセンス核酸などは、XK遺伝子のcDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。VPS13A特異的siRNA、VPS13A特異的miRNA、及びVPS13A特異的アンチセンス核酸などは、VPS13A遺伝子のcDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。また、各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも公知の手法により、化学的に合成することができる。
　XK特異的siRNA、XK特異的miRNA、又はXK特異的アンチセンス核酸の発現カセットについては、XK特異的siRNA、XK特異的miRNA、又はXK特異的アンチセンス核酸が発現可能な状態で組み込まれているポリヌクレオチドである限りにおいて特に限定されない。典型的には、該発現カセットは、プロモーター配列、及びXK特異的siRNA、XK特異的miRNA、又はXK特異的アンチセンス核酸のコード配列（必要に応じて、さらに転写終結シグナル配列）を含むポリヌクレオチド、必要に応じて他の配列を含む。VPS13A特異的siRNA、VPS13A特異的miRNA、又はVPS13A特異的アンチセンス核酸の発現カセットについては、VPS13A特異的siRNA、VPS13A特異的miRNA、又はVPS13A特異的アンチセンス核酸が発現可能な状態で組み込まれているポリヌクレオチドである限りにおいて特に限定されない。典型的には、該発現カセットは、プロモーター配列、及びVPS13A特異的siRNA、VPS13A特異的miRNA、又はVPS13A特異的アンチセンス核酸のコード配列（必要に応じて、さらに転写終結シグナル配列）を含むポリヌクレオチド、必要に応じて他の配列を含む。プロモーターは、特に制限されず、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーターなどのRNA polymerase II（polII）系プロモーター；　マウス及びヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーターなどのRNA polymerase III（polIII）系プロモーターなどが挙げられ、これらの中でも、短いRNAの転写を正確に行うことができるという観点から、polIII系プロモーターが好ましい。また、薬剤により誘導可能な各種プロモーターも使用することができる。他の配列としては、特に制限されず、発現ベクターが含み得る公知の配列を各種採用することができる。このような配列の一例としては、例えば複製起点、薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。
　XK発現抑制剤の別の例としては、XK特異的リボザイムなどが挙げられる。VPS13A発現抑制剤の別の例としては、VPS13A特異的リボザイムなどが挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAを意味するが、ここでは配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する。リボザイム核酸として最も汎用性の高いものは、ウイロイドやウイルソイドなどの感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型などが知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイム核酸は、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないという利点を有する。XK遺伝子又はVPS13A遺伝子のmRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる。
遺伝子編集剤
　XK遺伝子編集剤は、標的配列特異的ヌクレアーゼシステム（例えばCRISPR/Casシステム）により、XK遺伝子の発現を抑制可能なものである限り特に制限されない。XK遺伝子の発現抑制は、例えばXK遺伝子の破壊、XK遺伝子のプロモーターの改変による該プロモーターの活性抑制により可能である。VPS13A遺伝子編集剤は、標的配列特異的ヌクレアーゼシステム（例えばCRISPR/Casシステム）により、VPS13A遺伝子の発現を抑制可能なものである限り特に制限されない。VPS13A遺伝子の発現抑制は、例えばVPS13A遺伝子の破壊、VPS13A遺伝子のプロモーターの改変による該プロモーターの活性抑制により可能である。
　XK遺伝子編集剤としては、例えばCRISPR/Casシステムを採用する場合は、典型的には、XK遺伝子又はそのプロモーターを標的とするガイドRNA発現カセット、及びCasタンパク質発現カセットを含むベクター（XK遺伝子編集用ベクター）を用いることができるが、これに限定されない。この典型例以外にも、例えばXK遺伝子又はそのプロモーターを標的とするガイドRNA及び／又はその発現カセットを含むベクターと、Casタンパク質発現カセット及び／又はその発現カセットを含むベクターとの組み合わせを、XK遺伝子編集剤として用いることが可能である。VPS13A遺伝子編集剤としては、例えばCRISPR/Casシステムを採用する場合は、典型的には、VPS13A遺伝子又はそのプロモーターを標的とするガイドRNA発現カセット、及びCasタンパク質発現カセットを含むベクター（XK遺伝子編集用ベクター）を用いることができるが、これに限定されない。この典型例以外にも、例えばVPS13A遺伝子又はそのプロモーターを標的とするガイドRNA及び／又はその発現カセットを含むベクターと、Casタンパク質発現カセット及び／又はその発現カセットを含むベクターとの組み合わせを、VPS13A遺伝子編集剤として用いることが可能である。
　ガイドRNA発現カセットは、代謝改善対象の生物内でガイドRNAを発現させる目的で用いられるポリヌクレオチドである限り特に制限されない。該発現カセットの典型例としては、プロモーター、及び該プロモーターの制御下に配置されたガイドRNA全体又は一部のコード配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。なお「プロモーターの制御下に配置」とは、換言すれば、ガイドRNAコード配列が、該配列の転写がプロモーターによって制御されるように配置されていることを意味する。具体的な配置の態様としては、例えばプロモーターの3´側直下にガイドRNAコード配列が配置されている態様（例えば、プロモーター3´末端の塩基からガイドRNAコード配列の5´末端の塩基までの間の塩基対数（bp）が、例えば100 bp以下、好ましくは50 bp以下である態様）が挙げられる。
　ガイドRNA発現カセットのプロモーターとしては、特に制限されず、pol II系プロモーターを使用することもできるが、比較的短いRNAの転写をより正確に行わせるという観点から、pol III系プロモーターが好ましい。pol III系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えばマウス及びヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーターなどが挙げられる。また、薬剤により誘導可能な各種プロモーターも使用することができる。
　ガイドRNAコード配列は、ガイドRNAをコードする塩基配列である限り特に制限されない。
　ガイドRNAは、CRISPR/Casシステムにおいて用いられるものであれば特に制限されず、例えばゲノムDNAの標的部位（例えばXK遺伝子、そのプロモーターなど）に結合し、且つCasタンパク質と結合することにより、Casタンパク質をゲノムDNAの標的部位に誘導可能なものを各種使用することができる。
　本明細書において、標的部位とは、PAM（Proto-spacer Adjacent Motif）配列及びその5´側に隣接する17～30塩基長（好ましくは18～25塩基長、より好ましくは19～22塩基長、特に好ましくは20塩基長）程度の配列からなるDNA鎖（標的鎖）とその相補DNA鎖（非標的鎖）からなる、ゲノムDNA上の部位である。
　ガイドRNAはゲノムDNAの標的部位への結合に関与する配列（crRNA（CRISPR RNA）配列といわれることもある）を有しており、このcrRNA配列が、非標的鎖のPAM配列相補配列を除いてなる配列に相補的（好ましくは、相補的且つ特異的）に結合することにより、ガイドRNAはゲノムDNAの標的部位に結合することができる。
　なお、「相補的」に結合とは、完全な相補関係（AとT、及びGとC）に基づいて結合する場合のみならず、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係に基づいて結合する場合も包含される。ストリンジェントな条件は、周知であり、例えば、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1% SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。かかる条件で洗浄してもハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。
　具体的には、crRNA配列の内、標的配列に結合する配列は、標的鎖と例えば90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上、特に好ましくは100％の同一性を有する。なお、ガイドRNAの標的部位への結合には、crRNA配列の内、標的配列に結合する配列の3´側の12塩基が重要であるといわれている。このため、crRNA配列の内、標的配列に結合する配列が、標的鎖と完全同一ではない場合、標的鎖と異なる塩基は、crRNA配列の内、標的配列に結合する配列の3´側の12塩基以外に存在することが好ましい。
　ガイドRNAは、Casタンパク質との結合に関与する配列（tracrRNA（trans-activating crRNA）配列といわれることもある）を有しており、このtracrRNA配列が、Casタンパク質に結合することにより、Casタンパク質をゲノムDNAの標的部位に誘導することができる。
　tracrRNA配列は、特に制限されない。tracrRNA配列は、典型的には、複数（通常、3つ）のステムループを形成可能な50～100塩基長程度の配列からなるRNAであり、利用するCasタンパク質の種類に応じてその配列は異なる。tracrRNA配列としては、利用するCasタンパク質の種類に応じて、公知の配列を各種採用することができる。
　ガイドRNAは、通常、上記したcrRNA配列とtracr RNA配列を含む。ガイドRNAの態様は、crRNA配列とtracr RNA配列を含む一本鎖RNA（sgRNA）であってもよいし、crRNA配列を含むRNAとtracrRNA配列を含むRNAとが相補的に結合してなるRNA複合体であってもよい。
　Casタンパク質発現カセットは、代謝改善対象の生物内でCasタンパク質を発現させる目的で用いられるポリヌクレオチドである限り特に制限されない。該発現カセットの典型例としては、プロモーター、及び該プロモーターの制御下に配置されたCasタンパク質コード配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。なお「プロモーターの制御下に配置」とは、ガイドRNA発現カセットにおける定義と同様である。
　Casタンパク質発現カセットのプロモーターとしては、特に制限されず、例えばpol II系プロモーターを各種使用することができる、pol II系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えば例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーターなどが挙げられる。また、薬剤により誘導可能な各種プロモーターも使用することができる。
　Casタンパク質コード配列は、Casタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列である限り特に制限されない。
　Casタンパク質は、CRISPR/Casシステムにおいて用いられるものであれば特に制限されず、例えばガイドRNAと複合体を形成した状態でゲノムDNAの標的部位に結合し、該標的部位を切断できるものを各種使用することができる。Casタンパク質としては、各種生物由来のものが知られており、例えばS. pyogenes由来のCas9タンパク質（II型）、S. solfataricus由来のCas9タンパク質（I-A1型）、S. solfataricus由来のCas9タンパク質（I-A2型）、H. walsbyl由来のCas9タンパク質（I-B型）、E. coli由来のCas9タンパク質（I-E型）、E. coli由来のCas9タンパク質（I-F型）、P. aeruginosa由来のCas9タンパク質（I-F型）、S. Thermophilus由来のCas9タンパク質（II-A型）、S. agalactiae由来のCas9タンパク質（II-A型）、S. aureus由来のCas9タンパク質、N. meningitidis由来のCas9タンパク質、T. denticola由来のCas9タンパク質、F. novicida由来のCpf1タンパク質（V型）などが挙げられる。これらの中でも、好ましくはCas9タンパク質が挙げられ、より好ましくはストレプトコッカス属に属する細菌が内在的に有するCas9タンパク質が挙げられる。各種Casタンパク質のアミノ酸配列、及びそのコード配列の情報は、NCBIなどの各種データベース上で容易に得ることができる。
　Casタンパク質は、野生型の2本鎖切断型Casタンパク質であってもよいし、ニッカーゼ型Casタンパク質であってもよい。また、Casタンパク質は、その活性を損なわない限りにおいて、アミノ酸配列の変異（例えば、置換、欠失、挿入、付加など）を有していてもよいし、公知のタンパク質タグ、シグナル配列、酵素タンパク質などのタンパク質が付加されたものであってもよい。タンパク質タグとしては、例えばビオチン、Hisタグ、FLAGタグ、Haloタグ、MBPタグ、HAタグ、Mycタグ、V5タグ、PAタグなどが挙げられる。シグナル配列としては、例えば細胞質移行シグナルなどが挙げられる。
　XK遺伝子編集用ベクター及びVPS13A遺伝子編集用ベクターは、他の配列を有していてもよい。他の配列としては、特に制限されず、発現ベクターが含み得る公知の配列を各種採用することができる。このような配列の一例としては、例えば複製起点、薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。
　薬剤耐性遺伝子としては、例えばクロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
　ベクターの種類は、特に制限されず、例えば動物細胞発現プラスミドなどのプラスミドベクター；　レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクター；　アグロバクテリウムベクターなどが挙げられる。
　XK遺伝子編集剤及びVPS13A遺伝子編集剤は、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に作製することができる。例えば、PCR、制限酵素切断、DNA連結技術、in vitro転写・翻訳技術、リコンビナントタンパク質作製技術などを利用して作製することができる。
発現促進剤
　XK発現促進剤は、細胞中のXK量を増加させることができる限りにおいて特に制限されない。VPS13A発現促進剤は、細胞中のVPS13A量を増加させることができる限りにおいて特に制限されない。
　XK発現促進剤としては、例えばXKの発現カセットが挙げられる。XKの発現カセットは、XKが発現可能な状態で組み込まれている限りにおいて特に限定されない。典型的には、XKの発現カセットは、プロモーター配列、及びXKコード配列（必要に応じて、さらに転写終結シグナル配列）を含むポリヌクレオチドを含む。VPS13A発現促進剤としては、例えばVPS13Aの発現カセットが挙げられる。VPS13Aの発現カセットは、VPS13Aが発現可能な状態で組み込まれている限りにおいて特に限定されない。典型的には、VPS13Aの発現カセットは、プロモーター配列、及びVPS13Aコード配列（必要に応じて、さらに転写終結シグナル配列）を含むポリヌクレオチドを含む。発現カセットは、ベクターの形態であることもできる。
　発現ベクターは、特に制限されず、例えば動物細胞発現プラスミド等のプラスミドベクター；　レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクター等が挙げられる。
　プロモーターは、特に制限されず、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーター等が挙げられる。また、薬剤により誘導可能な各種プロモーターも使用することができる。
　発現ベクターは、上記以外にも、発現ベクターが含み得る他のエレメントを含んでいてもよい。他のエレメントとしては、例えば複製基点や薬剤耐性遺伝子等が挙げられる。薬剤耐性遺伝子は、特に制限されないが、例えばクロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
　XK及びVPS13Aの発現ベクターは、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に得ることができる。例えば、PCR、制限酵素切断、DNA連結技術等を利用して作製することができる。
　XK発現促進剤の別の例としては、XKの転写活性化因子及びその発現ベクター、XKの転写を活性化できる低分子化合物等が挙げられる。VPS13A発現促進剤の別の例としては、VPS13Aの転写活性化因子及びその発現ベクター、VPS13Aの転写を活性化できる低分子化合物等が挙げられる。発現ベクターの態様については、上記XKの発現ベクターと同様である。
機能調節剤
　XK機能調節剤は、発現調節対象の生物又は細胞内で発現しているXKタンパク質又はXK mRNAの機能を調節可能なものである限り、特に制限されず、例えばXK機能抑制剤、XK機能促進剤等を包含する。VPS13A機能調節剤は、発現調節対象の生物又は細胞内で発現しているVPS13Aタンパク質又はVPS13A mRNAの機能を調節可能なものである限り、特に制限されず、例えばVPS13A機能抑制剤、VPS13A機能促進剤等を包含する。XK機能調節剤及びVPS13A機能調節剤は、1種単独で用いることもできるし、2種以上を組み合わせて用いることもできる。
　XK機能調節剤としては、例えばXK中和抗体等が挙げられる。XK中和抗体は、XKに結合することによりXKの機能を阻害する性質を有する抗体を言う。VPS13A機能調節剤としては、例えばVPS13A中和抗体等が挙げられる。VPS13A中和抗体は、VPS13Aに結合することによりVPS13Aの機能を阻害する性質を有する抗体を言う。
　抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。抗体は、XK又はVPS13Aのアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体であってもよい。
 
　抗体の製造方法は、周知であり、本発明で使用される抗体もそれらに従って製造することができる。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したXK又はVPS13Aを用いて、あるいは常法に従ってXK又はVPS13Aの部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したXK又はVPS13A、あるいはXK又はVPS13Aの部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる。また、複数の抗体が入手可能であり、例えば、Atlas Antibodies社のPolyclonal Anti-XK Antibody（Cat. No. HPA019036）、Novus Biologicals社のChorein Antibody(Cat. No. NBP1-85641)等の市販の抗体を使用することもできる。
　抗体の作製に免疫抗原として使用されるXK又はVPS13Aは、公知の遺伝子配列情報に基づいて、DNAクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法に準じて行うことができる。
　具体的には、XK又はVPS13Aをコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組換えDNA（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。またXK又はVPS13Aの部分ペプチドは、公知の遺伝子配列情報に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
　抗体は、XK又はVPS13Aの部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってもよい。かかる抗体の製造のために用いられるオリゴ（ポリ）ペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、XK又はVPS13Aと同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはこの免疫原特性を有し、且つXK又はVPS13Aのアミノ酸配列において少なくとも連続する8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるオリゴ（ポリ）ペプチドを例示することができる。
　かかるオリゴ（ポリ）ペプチドに対する抗体の製造は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、BCG（カルメット－ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントが含まれる。
　XK機能調節剤及びVPS13A機能調節剤としては、上記中和抗体以外にも、XK又はVPS13Aのアンタゴニスト、アゴニスト、ドミナントネガティブ変異体等を使用することが可能である。また、機能調節剤として中和抗体等のタンパク質を採用する場合は、それに代えて、その発現カセットを採用することもできる。発現カセットについては、上記「発現調節剤」における説明したものを利用できる。
用途、その他の成分
　後述の実施例に示されるように、XK及びVPS13Aは、P2X7へのATPの結合によって誘導される細胞膜スクランブリング及びネクローシスに重要である。このため、XK発現調節剤、XK機能調節剤、VPS13A発現調節剤及びVPS13A機能調節剤からなる群より選択される少なくとも1種（有効成分）は、細胞膜スクランブリング及びネクローシスを利用した用途（例えば医薬、試薬の他、食品組成物、口腔用組成物、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）など）の有効成分としての利用できる。有効成分は、これをそのまま、あるいは慣用の成分とともに各種組成物となし、動物、ヒト、及び各種細胞に適用（例えば、投与、摂取、接種、接触など）することができる。
　調節剤の細胞への接触の手法は任意であり、目的に応じて適宜選択することができる。接触はin vivo、in vitro、ex vivoのいずれで行ってもよい。調節剤を動物（例えば、ヒト）に投与する手法は任意であり、目的及び調節剤の種類等に応じて適宜選択することができる。
　XK調節剤及び／又はVPS13A調節剤は、P2X7へのATPの結合によって誘導される細胞膜スクランブリング及びネクローシスに関連する各種現象の調節に利用することができる。例えば、XK調節剤及び／又はVPS13A調節剤は、炎症（特に制限されないが、一態様において、一酸化窒素非依存的炎症）、疼痛、及び中枢神経系障害、癌等の治療又は予防に利用できる。より具体的には、関節リウマチ、変形性関節炎、間質性膀胱炎、間質性線維症、乾癬、敗血症性ショック、敗血症、アレルギー性皮膚炎、喘息、アレルギー性喘息、軽度～重度の喘息、ステロイド抵抗性喘息、特発性肺線維症、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、気道過敏症、急性及び慢性の疼痛、神経因性疼痛、炎症痛、偏頭痛、自発痛、オピオイド誘発疼痛、糖尿病性ニューロパシー、ヘルペス後神経痛、腰痛、化学療法誘導神経因性疼痛、線維筋痛、神経因性疼痛、気分障害、抑うつ、大うつ病、大うつ病性障害、治療抵抗性うつ病、双極性障害、不安うつ病、不安症、認知、睡眠障害、多発性硬化症、てんかん発作、パーキンソン病、統合失調症、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、自閉症、脊髄損傷、脳虚血／外傷性脳損傷、ストレス関連障害、糖尿病、真性糖尿病、血栓症、炎症性腸疾患、過敏性腸疾患、過敏性腸症候群、クローン病、心血管疾患（心血管疾患の例として、高血圧、心筋梗塞、虚血性心疾患、虚血等）、尿管閉塞、下部尿路症候群、下部尿路機能異常（例えば、失禁等）、心移植後疾患、骨粗鬆症／大理石骨病、外分泌腺の分泌機能に関与する疾患、緑内障、腎炎、糸球体腎炎、シャーガス病、クラミジア感染症、神経芽細胞腫、結核、多発性嚢胞腎疾患、がん、挫瘡等を予防又は改善することが可能である。
　XK調節剤及び／又はVPS13A調節剤の対象細胞の細胞種は、特に限定されず、例えば免疫細胞（T細胞（例えば、CD25+CD4+制御性T細胞）等）、血管内皮細胞、内皮前駆細胞、幹細胞（例えば、骨髄由来幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞（iPS細胞、ES細胞等）等）、筋細胞（骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞）、筋前駆細胞（例えば、心筋前駆細胞、筋芽細胞等）、神経細胞等が挙げられる。一実施形態において細胞は、細胞膜スクランブリング（例えば、細胞外ATPによる刺激に起因する細胞膜スクランブリング）を必要とする細胞であることが好ましい。一実施形態において、細胞は免疫細胞であることが好ましい。免疫細胞としては、例えば、Ｔ細胞（例えば、制御性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、ｉＮＫＴ細胞、及びγδ（ガンマ・デルタ）Ｔ細胞）、マクロファージ（例えば、ミクログリア）、樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞及びＢ細胞等を挙げることができる。一実施形態において、細胞は、Ｔ細胞であることが好ましい。一実施形態において、細胞は、記憶Ｔ細胞への分化及び／又は維持の促進を必要とする細胞であることが好ましい。一実施形態において、細胞は、血小板又は赤血球であることが好ましい。また、一実施形態において、細胞は、遺伝子組換え細胞であることが好ましい。遺伝子組換え細胞は、特に制限されないが、上述の細胞を用いて作製することができ、例えば、遺伝子組換え幹細胞（例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞））及びそこから分化した細胞（例えば、ｉＰＳ細胞由来Ｔ細胞）、遺伝子組換え造血幹細胞、遺伝子組換え造血前駆細胞（例えば、巨核球）、遺伝子組換え分化血液細胞（例えば、血小板、赤血球）、及び遺伝子組換え免疫細胞（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞、がん抗原認識Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を導入したＴ細胞）を挙げることができる。
　XK調節剤及び／又はVPS13A調節剤は、対象生物又は対象細胞において、Ｐ２Ｘ７受容体活性若しくはＰ２Ｘ７受容体発現を調節（例えば、抑制又は促進）するために使用することができる。XK調節剤及び／又はVPS13A調節剤は、対象生物又は対象細胞において、Ｐ２Ｘ７受容体を介した細胞機能を調節するために使用することができる。Ｐ２Ｘ７受容体を介した細胞機能とは、Ｐ２Ｘ７受容体を介して細胞の機能、特性に影響を与えるものであれば、特に限定されるものではないが、例えば細胞膜スクランブリング（ＰｔｄＳｅｒ露出）、細胞死の誘導などが挙げられ、またDi Virgilio et al.（2017, Immunity. 47:15-31）にも例示される。
　XK調節剤及び／又はVPS13A調節剤の対象生物は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカなどの種々の哺乳類動物などが挙げられる。一実施形態において、好ましい対象生物はヒトである。
　XK調節剤及び／又はVPS13A調節剤の形態は、特に限定されず、その用途等に応じて、適宜設計することができる。
　用途が医薬、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）などである場合の形態としては、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口摂取に適した製剤形態（経口製剤形態）、点鼻剤、吸入剤、肛門坐剤、挿入剤、浣腸剤、ゼリー剤、注射剤、貼付剤、ローション剤、クリーム剤などの非経口摂取に適した製剤形態（非経口製剤形態）が挙げられる。
　用途が食品組成物の場合の形態としては、液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキーなどが挙げられる。
　用途が口腔用組成物である場合の形態としては、例えば液体（溶液、乳液、懸濁液など）、半固体（ゲル、クリーム、ペーストなど）、固体（錠剤、粒子状剤、カプセル剤、フィルム剤、混練物、溶融固体、ロウ状固体、弾性固体など）などの任意の形態、より具体的には、歯磨剤（練歯磨、液体歯磨、液状歯磨、粉歯磨など）、洗口剤、塗布剤、貼付剤、口中清涼剤、食品（例えば、チューインガム、錠菓、キャンディ、グミ、フィルム、トローチなど）などが挙げられる。
　XK調節剤及び／又はVPS13A調節剤は、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば医薬、食品組成物、口腔用組成物、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）などに配合され得る成分である限り特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤などが挙げられる。
　XK調節剤及び／又はVPS13A調節剤の有効成分の含有量は、有効成分の種類、用途、使用態様、適用対象、適用対象の状態などに左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001～100重量％、好ましくは0.001～50重量％とすることができる。
　XK調節剤及び／又はVPS13A調節剤の適用（例えば、投与、摂取、接種、接触など）量は、薬効を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分の重量として、一般に一日あたり0.1～1000 mg/kg体重である。上記投与量は1日1回又は2～3回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
細胞
　一実施態様において、XK調節剤が導入された細胞に関する。XK発現促進剤及びXK機能促進剤からなる群より選択される少なくとも1種を含有する細胞がT細胞（本発明のT細胞）である場合は、CAR－T療法において使用するT細胞として好適に利用することができる。
　治療後CAR-T細胞が患者体内に長期間残存しないようにするという観点から、本発明のT細胞は、XK発現及び／又はXK機能を一過的に亢進させるように調節できる細胞であることが好ましい。このような調節方法としては、例えばXK発現及び／又はXK機能の促進剤として、薬剤応答性プロモーターで発現調節される発現カセットを使用することにより、その薬剤の添加によりXK発現及び／又はXK機能を一過的に亢進させることが可能である。
　また、同様の観点から、T細胞は、さらに、XK発現抑制剤及びXK機能抑制剤からなる群より選択される少なくとも1種を含有する本発明の調節剤が導入されてなることが好ましい。これにより、例えば薬剤応答性プロモーターを利用することにより、XK発現及び／又はXK機能を一過的に亢進させた後、XK発現及び／又はXK機能を抑制するように調節することができる。
製造方法
　細胞のＸＫ及び／又はＶＰＳ１３Ａを欠失させること、並びに／或いは細胞におけるＸＫ及び／又はＶＰＳ１３Ａの発現及び／又は機能を抑制することにより、細胞死（好ましくは、高ＡＴＰ濃度刺激に起因した細胞死）を抑制することができる。よって、細胞のＸＫ及び／又はＶＰＳ１３Ａを欠失させること、並びに／或いは細胞におけるＸＫ及び／又はＶＰＳ１３Ａの発現及び／又は機能を抑制することを含む、細胞死（好ましくは、高ＡＴＰ濃度刺激に起因した細胞死）が抑制された（細胞死が生じ難い）細胞を製造する方法が提供される。細胞のＸＫ及び／又はＶＰＳ１３Ａを欠失させること、並びに／或いは細胞におけるＸＫ及び／又はＶＰＳ１３Ａの発現及び／又は機能を抑制することは、上述の調節剤を用いて行うことができる。細胞の製造は、in vivo、in vitro、及びex vivoのいずれで行ってもよい。
　細胞にＸＫ及び／又はＶＰＳ１３Ａを導入すること、並びに／或いは、細胞におけるＸＫ及び／又はＶＰＳ１３Ａの発現及び／又は機能を促進させることにより、高ＡＴＰ濃度刺激に起因する細胞死を生じやすい性質を細胞に付与することができる。よって、細胞にＸＫ及び／又はＶＰＳ１３Ａを導入すること、並びに／或いは、細胞におけるＸＫ及び／又はＶＰＳ１３Ａの発現及び／又は機能を促進させることにより、高ＡＴＰ濃度刺激に起因する細胞死を生じやすい性質を細胞に付与することを含む、高ＡＴＰ濃度刺激に起因する細胞死を生じやすい性質を有する細胞を製造する方法が提供される。これにより、高ＡＴＰ濃度下において、必要なプログラム細胞死を引き起こさせることのできる細胞を提供することを可能とする。細胞にＸＫ及び／又はＶＰＳ１３Ａを導入すること、並びに／或いは、細胞におけるＸＫ及び／又はＶＰＳ１３Ａの発現及び／又は機能を促進させることは、上述の調節剤を用いて行うことができる。細胞の製造は、in vivo、in vitro、及びex vivoのいずれで行ってもよい。
　以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
１．材料及び方法
１－１．細胞株、プラスミド、抗体及び試薬
　マウスＷＲ１９Ｌ細胞（ＡＴＣＣ；ＴＩＢ－５２）の誘導体であるＴＭＥＭ１６Ｆ－／－Ｐ２Ｘ７－／－　ＷＲ１９Ｌ細胞（ＤＫＯ）は、Ryoden, et al., (2020, J. Immunol. 204:559-568)に記載されており、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ　１６４０中で生育させた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ－１５７３）は、ＤＭＥＭ－１０％ＦＣＳ中で生育させた。
　ｐＰＥＦ－ＢＯＳは、ｐＥＦ－ＢＯＳ（Mizushima and Nagata, 1990, Nucleic Acids Res. 18:5322）に由来し、これにｐＰＵＲ（Clontech）からＳＶ４０初期プロモーター駆動ピューロマイシン耐性遺伝子を導入した。ｐＸ４５９ｖ２プラスミド（Ran et al., 2013, Nat. Protoc. 8:2281-2308）は、Addgeneから得た。ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ（Miyoshi et al., 1998, J. Virol. 72:8150-8157）は、H. Miyoshi（理化学研究所バイオリソース研究センター）によって提供された。ｐＭＸｓ－ｐｕｒｏレトロウイルスベクター（Kitamura et al., 2003, Exp. Hematol. 31:1007-1014）及びｐＧａｇ－ｐｏｌ－ＩＲＥＳ－ｂｓｒパッケージングプラスミド（Morita et al., 2000, Gene Ther. 7:1063-1066）は、T. Kitamura（東京大学医科学研究所）から得た。ｐＡｄＶＡｎｔａｇｅは、Promegaから購入した。
　Ａｌｅｘａ　６４７コンジュゲートラット抗マウスＰ２Ｘ７　ｍＡｂ（クローンＨａｎｏ４３）は、Bio-Rad Laboratoriesから得た。ＰＥ又はＡＰＣコンジュゲートラット抗マウスＣＤ４　ｍＡｂ（クローンＲＭ４－５）は、BD Biosciencesから得た。ＦＩＴＣ－又はＡＰＣ－Ｃｙ７－ラット抗マウスＣＤ２５　ｍＡｂ（クローンＰＣ６１）は、BioLegendから得た。ウサギ抗Ｐ２Ｘ７　Ａｂは、Alomone Labsから得た（ＡＰＲ－００４）。ウサギ抗ＸＫ　Ａｂ（ＨＰＡ０１９０３６）及びウサギ抗Ｃｈｏｒｅｉｎ　Ａｂ（ＮＢＰ１－８５６４１）は、それぞれAtlas Antibodies及びNovus biologicalsから得た。マウス抗Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰアーゼｍＡｂ（クローン４６４．６）は、Abcamから得た。ウサギＩｇ（Ｐ０４４８）又はマウスＩｇ（Ｐ０４４７）に対するＨＲＰ－ヤギ抗体は、Agilent Technologiesから得た。Ｃｙ５－アネキシンＶは、BD Biosciencesから得た。ＳＹＴＯＸ　Ｂｌｕｅ及びＨｏｅｃｈｓｔ　３３３４２は、Thermo Fisher Scientificから得た。１－オレオイル－２－｛６－［（７－ニトロ－２－１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル）アミノ］ヘキサノイル｝－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＮＢＤ－ＰＣ）は、Avanti Polar Lipidsから得た。ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド（ＤＤＭ）及びヘミコハク酸コレステリル（ＣＨＳ）は、それぞれDojindo Molecular Technologies及びMerckから得た。
１－２．ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲスクリーニング
　マウスＣＲＩＳＰＲ　Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｐｏｏｌｅｄ　Ｌｉｂｒａｒｙ（ゲノム規模ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウト［ＧｅＣＫＯ］　ｖ２）（Joung et al., 2017, Nat. Protoc. 12:828-863、Shalem et al., 2014, Science. 343:84-87）を用いたスクリーニングは、Ryoden et al., (2020, J. Immunol.）の記載にしたがって行った。簡潔に述べると、マウスＰ２Ｘ７及びＣａｓ９を発現する２×１０７個のＤＫＯ形質転換体に、ＧｅＣＫＯ　ｖ２　ｓｇＲＮＡライブラリーを有するレンチウイルスを０．３の感染多重度で感染させ、１μｇ／ｍｌピューロマイシンの存在下で培養した。得られた細胞（３×１０７個）を４℃で冷却し、３ｍｌのアネキシンバッファー（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、１４０ｍＭ　ＮａＣｌ及び２．５ｍＭ　ＣａＣｌ２）中、６０μＭ　ＢｚＡＴＰで５分間刺激した。細胞を冷却したバッファーで１５倍希釈し、３００ｇで３分間遠心し、Ｃｙ５－アネキシンＶを含有する３ｍｌのアネキシンバッファーに懸濁した。アネキシンＶに結合する能力が最も低い細胞のおよそ０．８％をＦＡＣＳＡｒｉａ　ＩＩ（BD Biosciences）によって回収し、増殖させた。この手順（ＢｚＡＴＰによる刺激、アネキシン結合及び増殖の減少について選別）を更に２回繰り返した。選別した細胞からのゲノムＤＮＡを用いて、ｓｇＲＮＡ配列を有するＤＮＡフラグメントを、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社）及びｓｇＲＮＡライブラリー用のベクター上の配列を有するプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をフォワードプライマー（ＮＧＳ－Ｌｉｂ－Ｆｗｄ－１－１０）（Joung et al., 2017, Nat. Protoc. 12:828-863）と共通リバースプライマーとの混合物による次世代シークエンシング（ＮＧＳ）用のＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社）を用いるＰＣＲに供した。ＰＣＲ産物を精製し、ＭｉＳｅｑ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ　ｖ３（Illumina）を用いるＭｉＳｅｑ（Illumina）によって分析した。ＮＧＳリードをライブラリー中の参照ｓｇＲＮＡ配列と関連付け、各ｓｇＲＮＡの数を計数した。
１－３．遺伝子編集及び細胞株の形質転換
　ＷＲ１９Ｌ細胞におけるＸｋ及びＶｐｓ１３ａ遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いてノックアウトした。ｓｇＲＮＡ標的配列を有するそれぞれの相補的オリゴヌクレオチド（Ｘｋ、５’－ＣＴＴＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＡ－３’；ＶＰＳ１３Ａ、５’－ＴＧＡＣＣＡＡＣＴＴＴＡＡＣＴＴＴＧＡＡ－３’）をアニーリングし、ｐＸ４５９ｖ２プラスミドにライゲートし、ＮＥＰＡ２１スーパーエレクトロポレーター（ネッパジーン株式会社）を用いたエレクトロポレーションによってＷＲ１９Ｌ細胞に導入した。必要に応じて、トランスフェクションを３日間隔で２回行った。２０時間～３０時間後に、細胞を１μｇ／ｍｌピューロマイシンで３４時間処理した。限界希釈によって単離した単一クローンを、Ｘｋ及びＶＰＳ１３ａ遺伝子の標的領域のシークエンシングによってスクリーニングした。アウトオブフレーム欠失を有する細胞をＸｋ－／－、ＶＰＳ１３ａ－／－及びＸｋ－／－ＶＰＳ１３ａ－／－細胞と特定した。
　マウスＸｋ　ｃＤＮＡ（ＮＭ＿０２３５００）は、Suzuki et al.,（2014, J. Biol. Chem. 289:30257-30267）の記載にしたがって、Ｃ末端にＦＬＡＧ又は強化ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）でタグ付けし、ｐＭＸｓ－ｐｕｒｏベクターに挿入した。マウスＶｐｓ１３ａ　ｃＤＮＡ（ＮＭ＿１７３０２８）をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの骨髄からＲＴ－ＰＣＲによって作製し、ｐＰＥＦ－ＢＯＳに挿入した。ｃＤＮＡの真正性をＤＮＡシークエンシングによって確認した。形質転換のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＸｋ　ｃＤＮＡを有するｐＭＸｓ－ｐｕｒｏをｐＧａｇ－ｐｏｌ－ＩＲＥＳ－ｂｓｒ、ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ及びｐＡｄＶＡｎｔａｇｅとともにＦｕｇｅｎｅ　６（Promega）を用いてトランスフェクトし、４８時間培養した。上清中のレトロウイルスを４℃にて１６時間、６０００ｇの遠心分離によって回収し、ＷＲ１９Ｌ細胞の感染に使用した。Ｖｐｓ１３ａ　ｃＤＮＡを有するｐＰＥＦ－ＢＯＳを、ＮＥＰＡ２１を用いたエレクトロポレーションによってＷＲ１９Ｌ細胞に導入した。１μｇ／ｍｌピューロマイシンの存在下で培養することによって安定な形質転換体を選択した。
１－４．マウス
　Ｘｋ標的化マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ－Ａｔｍ１ＢｒｄＸｋｔｍ１ａ（ＫＯＭＰ）Ｍｂｐ／ＭｂｐＭｍｕｃｄ）をMutant Mouse Resource and Research Centers（MMRRC）から入手し、ＣＡＧ－Ｃｒｅトランスジェニックマウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（ＣＡＧ－Ｃｒｅ）ＣＺ－ＭＯ２Ｏｓｂ）（理化学研究所バイオリソース研究センター）と交雑して、Ｘｋ遺伝子のエクソン３の一部が失われたマウスを生成した。ノックアウトマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｎ遺伝的背景で維持した。
１－５．脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞の作製
　マウス脾臓からＴ細胞を作製するために、８週齢～１０週齢の雄性マウスの脾臓を、２％ＦＣＳを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／ＦＣＳ）中ですりガラススライドを用いてすり潰し、分散させた細胞を７０μｍセルストレーナーに通した。ＥａｓｙＳｅｐ　Ｍｏｕｓｅ　ＣＤ４＋　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（STEMCELL Technologies）を用い、製造業者の説明書に従ってＣＤ４＋Ｔ細胞を選択した。簡潔に述べると、脾臓の細胞を、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ／ＦＣＳに１×１０８細胞／ｍｌの密度で懸濁し、ラット血清１／２０容量及びＣＤ４＋Ｔ細胞以外のマウス脾細胞に対するビオチン化抗体のカクテル１／２０容量と混合した。混合物を室温で１０分間インキュベートし、ストレプトアビジン磁性ビーズによって抗体標識細胞を除去した。単離したＣＤ４＋Ｔ細胞を氷上にてＰＢＳ／ＦＣＳ中の１μｇ／ｍｌ　ＰＥ標識抗ＣＤ４　ｍＡｂ又はＡＰＣ標識抗ＣＤ４　ｍＡｂ及び１μｇ／ｍｌ　ＦＩＴＣ－抗ＣＤ２５　ｍＡｂで３０分間染色し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ　ＩＩを用いたフローサイトメトリーによって分析するか、又はＦＡＣＳＡｒｉａ　ＩＩ（BD Biosciences）によって回収した。
１－６．Ｐ２Ｘ７についてのフローサイトメトリー
　細胞表面上のＰ２Ｘ７をRyoden et al., (2020, J. Immunol.）の記載にしたがってフローサイトメトリーによって検出した。簡潔には、５×１０５個の細胞をＰＢＳ／ＦＣＳで洗浄し、４０倍希釈したＡｌｅｘａ　６４７－抗Ｐ２Ｘ７　ｍＡｂを含有する１００μｌのＰＢＳ／ＦＣＳ中にて氷上で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／ＦＣＳで洗浄し、２５０ｎＭ　ＳＹＴＯＸ　Ｂｌｕｅを含有する２５０μｌのＰＢＳ／ＦＣＳに懸濁し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ　ＩＩ（BD Biosciences）を用いたフローサイトメトリーによって分析した。データをＦｌｏｗＪｏ（BD Biosciences）によって分析した。
１－７．ＡＴＰ誘導ＰｔｄＳｅｒ露出及び細胞死
　ＡＴＰ誘導ＰｔｄＳｅｒ露出をアネキシンＶ結合によってアッセイし、Ryoden et al.,（2020, J. Immunol.）及びSuzuki et al.,（2010, Nature. 468:834-838）の記載に準じて、死細胞をＰＩ染色によって基本的に記載されているように検出した。簡潔には、ＲＰＭＩ１６４０－１０％ＦＣＳ中のＤＫＯ由来の細胞を４℃で１０分間プレインキュベートし、遠心分離によって回収し、３００倍～４００倍希釈したＣｙ５－アネキシンＶ及び２．５μｇ／ｍｌ　ＰＩを含有する冷却アネキシンバッファーに再懸濁した。細胞を４℃にて５００μＭ　ＡＴＰで５分間刺激し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ　ＩＩを用いたフローサイトメトリーによって細胞のアリコートを分析した。残りの細胞を更に１０分間、室温で維持し、フローサイトメトリーによって分析した。
　脾臓Ｔ細胞におけるＰｔｄＳｅｒ露出を検出するために、１×１０６個のＣＤ４＋Ｔ細胞を初めに氷上にて３０分間、１μｇ／ｍｌ　ＰＥ－抗ＣＤ４　ｍＡｂ及び１μｇ／ｍｌ　ＦＩＴＣ－抗ＣＤ２５　ｍＡｂで染色し、ＰＢＳ中にて１０℃で１０分間プレインキュベートし、Ｃｙ５－アネキシンＶ及び２５０ｎＭ　ＳＹＴＯＸ　Ｂｌｕｅを含有するアネキシンバッファー中にて１０℃でＡＴＰとのインキュベーションを行った。ＡＴＰ依存性細胞死をアッセイするために、１×１０６個のＣＤ４＋Ｔ細胞を、１０００倍希釈したＶｉｏｌｅｔ　Ｄｅａｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｔａｉｎ（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　Ｆｉｘａｂｌｅ　Ｄｅａｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｔａｉｎ　Ｋｉｔ、Thermo Fisher Scientific）とともにＰＢＳ中にて氷上で３０分間インキュベートし、冷却ＰＢＳ／ＦＣＳ中の１μｇ／ｍｌ　ＡＰＣ－抗ＣＤ４　ｍＡｂ及び１μｇ／ｍｌ　ＡＰＣ－Ｃｙ７－抗ＣＤ２５　ｍＡｂで３０分間染色し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、２．５μｇ／ｍｌ　ＰＩを含有する１ｍｌのアネキシンバッファー中にて細胞を３７℃で１０分間プレインキュベートした。ＡＴＰを混合物に５００μＭの最終濃度で添加し、３７℃でインキュベートした。細胞懸濁液のアリコートをＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性集団におけるＰＩ＋についてフローサイトメトリーによって分析した。
１－８．ＰｔｄＣｈｏのＡＴＰ誘導内在化
　細胞膜の内葉へのホスファチジルコリン（ＰｔｄＣｈｏ）の内在化をSuzuki et al.,（2010, Nature. 468:834-838）の記載に準じてアッセイした。簡潔には、ＲＰＭＩ　１６４０－１０％ＦＣＳ中の３×１０５個の細胞を４℃で１０分間プレインキュベートし、遠心分離によって回収し、２５０ｎＭ　ＮＢＤ－ＰＣ及び５００μＭ　ＡＴＰを含有する３００μｌの冷却アネキシンバッファー中にて４℃でインキュベートした。インキュベーション後に、９０μｌアリコートを、５ｍｇ／ｍｌ脂肪酸フリーＢＳＡを含有する１５０μｌのアネキシンバッファーと混合し、氷上で１分間インキュベートし、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ　ＩＩによって分析した。
１－９．共焦点顕微鏡法
　Ｘｋ－ＥＧＦＰを発現するＷＲ１９Ｌ細胞形質転換体を、２％ＦＣＳを添加したＨＢＳＳ（ＨＢＳＳ／ＦＣＳ）で洗浄し、５μｇ／ｍｌ　Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２を含有するＨＢＳＳ／ＦＣＳに懸濁した。次いで、細胞をガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業株式会社）に播種し、共焦点蛍光顕微鏡（ＦＶ１０００－Ｄ、オリンパス株式会社）によって観察した。
１－１０．全細胞溶解物及び膜画分の調製
　全細胞溶解物を調製するために、細胞を溶解バッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１％ＤＤＭ、０．１％ＣＨＳ、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、１ｍＭ（ｐ－アミジノフェニル）メタンスルホニルフルオリド塩酸塩（ｐ－ＡＰＭＳＦ）及びプロテアーゼ阻害剤混合物（ｃＯｍｐｌｅｔｅ、ＥＤＴＡフリー；Roche Diagnostics））中にて４℃で１時間インキュベートした。不溶性物質を４℃、２００００ｇで２０分間の遠心分離によって除去した後、上清を全細胞溶解物として使用した。
　膜画分については、１．８～３．２×１０７個の細胞をＰＢＳで洗浄し、２．５ｍｌの溶液Ａ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１ｍＭ　ｐ－ＡＰＭＳＦ）中にてダウンス型ホモジナイザーを用いて４℃でホモジナイズした。ホモジネートを２．５ｍｌの溶液Ｂ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭスクロース、１００ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び１ｍＭ　ｐ－ＡＰＭＳＦ）で希釈し、４℃、８００ｇで１０分間及び８０００ｇで１０分間順次遠心して、核及びミトコンドリアを除去した。次いで、サンプルを１０００００ｇで６０分間遠心し、沈殿物を１２０μｌ～２００μｌの溶解バッファーに懸濁し、２９Ｇ針に通し、回転させながら４℃で２時間インキュベートした。不溶性物質を上記のように除去し、上清を粗膜画分として使用した。
１－１１．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ブルーネイティブＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティング
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、全細胞溶解物をＳＤＳサンプルバッファー（６２．５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、２．５％２－メルカプトエタノール及び０．００５％ブロモフェノールブルー）中にて室温で２時間インキュベートし、７．５％又は１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ナカライテスク株式会社）によって分離して行った。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌｕｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｕａｌ　Ｃｏｌｏｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Bio-Rad Laboratories）及びＨｉＭａｒｋ　Ｐｒｅ－ｓｔａｉｎｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔａｎｄａｒｄ（Thermo Fisher Scientific）を分子量マーカーとして使用した。ブルーネイティブＰＡＧＥ（ＢＮ－ＰＡＧＥ）については、サンプルを１／４容量のＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（４×）及び１／２０容量のＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ　５％　Ｇ－２５０　Ｓａｍｐｌｅ　Ａｄｄｉｔｉｖｅ（２０×）と混合し、ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ　Ｎｏｖｅｘ　４％～１６％　ＢｉｓＴｒｉｓゲル（Thermo Fisher Scientific）上にロードした。４℃にて１５０Ｖで３５分間の電気泳動後に、ランニングバッファー中のクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）Ｇ－２５０の濃度を０．０２％から０．００２％に変更し、サンプルを１５０Ｖで２５分間、２５０Ｖで３０分間及び３５０Ｖで２０分間の更なる連続電気泳動に供した。ＮａｔｉｖｅＭａｒｋ　Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔａｎｄａｒｄ（Thermo Fisher Scientific）を分子量マーカーとして使用した。
　ウエスタンブロッティングは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの直後又はＢＮ－ＰＡＧＥゲルをＳＤＳ－ＰＡＧＥランニングバッファー（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１９２ｍＭグリシン及び０．１％ＳＤＳ）中にて室温で１５分間インキュベートした後に、ゲルのタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ、Merck）に転写した。５％スキムミルクとともにインキュベートすることで膜上の非特異的結合部位をブロッキングし、ＨＲＰ標識Ａｂでプロービングし、続いてＩｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ＨＲＰ基質（Merck）又はＷｅｓｔｅｒｎ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　Ｐｌｕｓ－ＥＣＬ（PerkinElmer）で検出した。ローディングコントロールとして、膜上のタンパク質をＣＢＢ　Ｒ－２５０で染色するか、又はＰＢＳ中の１５％Ｈ２Ｏ２によってＨＲＰを消光した後に抗Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰアーゼｍＡｂで再プロービングした。
２．結果
２－１．Ｐ２Ｘ７媒介ＰｔｄＳｅｒ露出に関与する分子のゲノム規模ＣＲＩＳＰＲスクリーニング
　Ryoden et al.,（2020, J. Immunol.）の記載に準じてＣＲＩＳＰＲスクリーニングを行い、Ｐ２Ｘ７媒介ＰｔｄＳｅｒ露出を媒介する分子を特定した。マウスＴ細胞リンパ腫ＷＲ１９Ｌは、Ｃａ２＋依存性スクランブリング又はＰｔｄＳｅｒ露出に関与するＴＭＥＭ１６Ｆを細胞膜で発現する。マウスＰ２ｒｘ遺伝子ファミリーは、ＡＴＰ誘導カチオン特異的イオンチャネルとして機能する７つのメンバーから構成される。Ｐ２ｒｘファミリーメンバーには、普遍的に発現されるものもあれば、組織特異的に発現されるものもある。ＡＴＰアナログであるＢｚＡＴＰ（２’（３’）－Ｏ－（４－ベンゾイルベンゾイル）ＡＴＰ）は、Ｐ２Ｘ７を活性化するが、他のＰ２ｒｘファミリーメンバーを活性化しない。このため、ＴＭＥＭ１６Ｆ及びＰ２ｒｘ７を欠損したＷＲ１９Ｌ細胞（ＤＫＯ）は、ＰｔｄＳｅｒ露出についてＣａ２＋イオノフォア又はＢｚＡＴＰに応答しない。
　ＤＫＯを高発現レベルのマウスＰ２Ｘ７で形質転換した場合、形質転換体（ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７）は、ＢｚＡＴＰに応答してＰｔｄＳｅｒを可逆的に露出させる。すなわち、ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７細胞を４℃にてＢｚＡＴＰで処理すると、細胞はＰｔｄＳｅｒを５分以内に露出させる。ＢｚＡＴＰをバッファーから除去すると、露出したＰｔｄＳｅｒは、４℃では少なくとも３０分間細胞表面に留まるが、３７℃では急速に内在化した。Ｐ２Ｘ７媒介ＰｔｄＳｅｒ露出に関与する分子についてのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニングにおいて、この特性を利用した。すなわち、ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７細胞をＣａｓ９で形質転換し、続いてＧｅＣＫＯライブラリー（Shalem et al., 2014, Science. 343:84-87）で０．３の感染多重度にて形質転換した（図１Ａ）。細胞をＢｚＡＴＰで刺激し、アネキシンＶにより低レベルで染色された集団を選別した。ＢｚＡＴＰによる刺激、選別及び増殖のこの手順を３回繰り返した。選別された細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれたｓｇＲＮＡ配列を、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって分析した。
　本発明者らは、Ｅｒｏｓ（ＣＹＢＣ１）を標的とするｓｇＲＮＡが最も濃縮され、全リードの８．２％を占めることを報告している（図１Ｂ）。Ｅｒｏｓは、シャペロンとして、Ｐ２Ｘ７が細胞膜において安定に発現されるために必要であった。ＮＧＳリードの更なる分析により、４つ～６つの独自のｓｇＲＮＡ配列が存在する３４個の遺伝子が特定された（図１Ｂ）。それらの中でも、７．３％のｓｇＲＮＡがＸｋに対するものであった。加えて、遺伝子がＸ染色体のＸｋ遺伝子のイントロン２、及びエクソン３の下流に位置する（図１Ｃ）、１１個のＨ２ａｌ１ヒストンファミリーメンバーについてのｓｇＲＮＡの濃縮に注目した。Ｈ２ａｌ１がＰ２Ｘ７媒介ＰｔｄＳｅｒ露出に何らかの役割を担う可能性を否定することはできないが、全てのＨ２ａｌ１変異体がコード領域に９９％同一の配列を有するため、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体がＨ２ａｌ１変異体遺伝子を同時に切断することでＸｋ遺伝子のエクソン３を欠失させたというのが最も説得力のある説明である（図８）。これらの結果から、ＸｋがＰ２Ｘ７媒介ＰｔｄＳｅｒ露出に関与することが示唆された。
　Ｘｋは、未知の機能を有する膜タンパク質であるが、その突然変異は、神経有棘赤血球症候群であるマクラウド症候群（ＭＬＳ）に関与することが知られている。また、同様の表現型（神経有棘赤血球症候群）を有する有棘赤血球舞踏病（ＣｈＡｃ）と呼ばれる別の症候群は、Ｖｐｓ１３ａ遺伝子の機能喪失突然変異によって引き起こされることが知られている。Ｖｐｓ１３ａに対する５つの異なるｓｇＲＮＡが、ＢｚＡＴＰに応答してＰｔｄＳｅｒを露出させる能力の低下を示す細胞集団において濃縮された。Ｖｐｓ１３ａ遺伝子は、順位がＨ２ａｌ１又はＸｋの次であり、全リードのおよそ１％を占めていた（図１Ｂ）。
２－２．Ｐ２Ｘ７媒介ＰｔｄＳｅｒ露出へのＸｋ及びＶｐｓ１３ａの必要性
　本発明者らは、Ｐ２Ｘ７媒介ＰｔｄＳｅｒ露出にＸｋ及びＶｐｓ１３Ａが必要とされるかを調べるために、ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いてＸｋ、Ｖｐｓ１３ａ又はそれらの両方の遺伝子をノックアウトした（Ran et al., 2013）（図９）。図２Ａ及び図２Ｂに示されるように、ＸｋとＶｐｓ１３ａとのいずれのヌル突然変異も、全細胞溶解物又は細胞表面におけるＰ２Ｘ７の発現レベルに影響を及ぼさなかった。それぞれの遺伝子（Ｘｋ又はＶｐｓ１３ａ）によるＸｋ－／－又はＶｐｓ１３ａ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７の形質転換は、Ｐ２Ｘ７の全発現レベル又は細胞表面発現レベルを変化させなかった。これらの結果から、Ｅｒｏｓ（Ryoden et al., 2020, J. Immunol.）とは異なり、Ｘｋ及びＶｐｓ１３ａが細胞表面でのＰ２Ｘ７の発現にとって不要であることが示唆された。Ｘｋのヌル突然変異又は外的発現がＶｐｓ１３ａの発現レベルに影響を及ぼさず、逆もまた同様であることも示された。
　４℃にて高濃度のＡＴＰ（５００μＭ）で刺激すると、ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７細胞は、ＰｔｄＳｅｒを５分以内に強固に露出した（図３Ａ）。ＤＫＯ細胞は、ＰｔｄＳｅｒ露出についてＡＴＰには応答せず、Ｐ２Ｘ７がＡＴＰ誘導ＰｔｄＳｅｒ露出を媒介することが確認された。Ｘｋ又はＶｐｓ１３ａのいずれかの欠損は、ＡＴＰ誘導ＰｔｄＳｅｒ露出を同様のレベルまで著しく低下させた（図３Ａ）。それぞれの遺伝子によるＸｋ－／－又はＶｐｓ１３ａ－／－細胞の形質転換は、ＡＴＰ刺激によりＰｔｄＳｅｒを露出させる細胞の能力をレスキューし、ＰｔｄＳｅｒ露出の減少がＸｋ又はＶｐｓ１３ａの欠如によるものであると確認された。Ｘｋ及びＶｐｓ１３ａの二重欠損は、ＰｔｄＳｅｒ露出に対して付加的な影響を有さず、Ｘｋ及びＶｐｓ１３ａが同じ経路で機能することが示唆された。
２－３．リン脂質スクランブリング及び細胞溶解へのＸｋ及びＶｐｓ１３ａの必要性
　Ｘｋは、カスパーゼ依存性スクランブラーゼである。スクランブラーゼが脂質二重層間で双方向かつ非特異的にリン脂質を輸送することから、本発明者らは、Ｐ２Ｘ７の刺激がリン脂質の双方向の非特異的な輸送に及ぼす影響について、検討した。その結果、ＡＴＰで刺激したＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７細胞は、蛍光標識ホスファチジルコリン（ＮＢＤ－ＰＣ）を４℃でＰ２Ｘ７依存的に取り込んだ（図３Ｂ）。ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７におけるＸｋ又はＶｐｓ１３ａのヌル突然変異は、このＮＢＤ－ＰＣを取り込む活性を著しく低下させた。これらの結果から、Ｐ２Ｘ７へのＡＴＰの結合が、Ｘｋ及びＶｐｓ１３ａを必要とするリン脂質スクランブリングを活性化することが示された。
　ＡＴＰによるＰ２Ｘ７の持続的な刺激は、溶解細胞死を誘導する。ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７細胞を４℃で５分間のインキュベーション後に室温で１０分間インキュベートすると、５０％超の細胞がＰＩ染色され、ネクローシスを起こすことが示された（図３Ｃ）。Ｘｋ又はＶｐｓ１３ａのいずれかの欠損は、このプロセスを妨げ、対応する遺伝子によるＸｋ－／－又はＶｐｓ１３ａ－／－細胞の形質転換は、このプロセスをレスキューした。これらの結果から、Ｐ２Ｘ７媒介ＡＴＰ誘導ネクローシスもＸｋ及びＶｐｓ１３ａに依存することが示され、Ｘｋ及びＶｐｓ１３ａによって行われるリン脂質スクランブリングがＰ２Ｘ７媒介細胞溶解の必要条件であり得ることが示唆された。
２－４．ＸｋとＶｐｓ１３ａとの間の複合体形成
　Ｍｒが約３６０ｋＤａのタンパク質である哺乳動物Ｖｐｓ１３ａは、ＶＰＳ１３ファミリーに属し、膜接触部位に存在する（Leonzino et al., 2021, Biochim. Biophys. Acta.）。幾つかのヒトＶＰＳ１３ファミリーメンバー及び酵母Ｖｐｓ１３は、リン脂質をＥＲから細胞内オルガネラ、特にミトコンドリアへと輸送することが示されている（Kumar et al., 2018, J. Cell Biol. 217:3625-3639、Yeshaw et al., 2019, eLife. 8:e43561）。本発明者らは、ＸｋがＶｐｓ１３ａと相互作用することを確認する目的で、Ｘｋ及びＶｐｓ１３ａが膜において複合体を形成するか検討した。膜画分をＤＫＯ、ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７、Ｘｋ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７及びＶｐｓ１３ａ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７から調製し、中性洗剤である１．０％ＤＤＭ（ｎ－ドデシル－β－マルトピラノシド）及び０．１％ＣＨＳ（ヘミコハク酸コレステリル）で可溶化し、ブルーネイティブＰＡＧＥ（ＢＮ－ＰＡＧＥ）によって分離した（図４Ａ）。抗Ｘｋ　Ａｂを用いた分離タンパク質のウエスタンブロッティングにより、ＤＫＯ及びＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７細胞においてＭｒが約７６０ｋＤａ及び２７０ｋＤａのバンドが検出された。どちらのバンドもＸｋ－／－細胞では検出されず、Ｘｋを含むことが示された。７６０ｋＤａのバンドは、Ｖｐｓ１３ａ－／－細胞では見られず、２７０ｋＤａのバンドの強度は、ＤＫＯ及びＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７細胞における強度と比較して増大した。膜タンパク質がしばしばＢＮ－ＰＡＧＥにおいて特異に挙動し、又は算出されたＭｒから予想されるよりも２倍大きな分子のように移動することを考えると（Reisinger and Eichacker, 2006, Proteomics. 6:6-15）、２７０ｋＤａのバンドは、算出されるＭｒが５１１１４のＸｋの二量体であり、７６０ｋＤａのバンドは、ＸｋとＶｐｓ１３ａとの複合体であり得る。この裏付けとして、抗Ｖｐｓ１３ａ　Ａｂを用いたウエスタンブロッティングでは、ＤＫＯ及びＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７細胞において７６０ｋＤａのバンドが検出された。Ｘｋのヌル突然変異は、抗Ｖｐｓ１３ａでは検出不能な７６０ｋＤａバンドを生じ（図４Ａ）、膜中のＶｐｓ１３ａの殆どがＸｋと結合していることが示唆された。ＤＫＯ、ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７及びＸｋ－／－ＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７細胞において抗Ｖｐｓ１３ａ　Ａｂで検出されたＭｒが約６７０ｋＤａの薄いバンドにより、Ｖｐｓ１３ａの小さな集団が膜中のＸｋ以外の分子と相互作用し得ることが示唆された。
　膜画分による結果とは対照的に、全細胞溶解物中のＶｐｓ１３ａタンパク質の量は、Ｘｋヌル突然変異によって減少せず（図２Ａ）、Ｖｐｓ１３ａがＸｋによって膜に係留又は動員されることが示された。ＧＦＰタグ付きＸｋタンパク質をＤＫＯ－Ｐ２Ｘ７細胞において発現させると、殆どのＧＦＰは細胞膜に存在し（図４Ｂ）、Ｘｋ及びＶｐｓ１３ａが細胞膜で機能することが示唆された。Ｖｐｓ１３ヌル突然変異は、細胞膜でのＸｋの局所化に悪影響を与えず、Ｖｐｓ１３ａが細胞膜でのＸｋの局在化に必要でないことが示された。
２－５．ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡＴＰ誘導細胞溶解に対するＸｋの影響
　ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＰｔｄＳｅｒ露出及び細胞死について高濃度のＡＴＰの影響を受けやすい。本発明者らは、このプロセスにおけるＸｋ及びＶｐｓ１３ａの関与を調べるために、野生型及びＸｋ－／ｙマウスの脾臓からＣＤ２５＋又はＣＤ２５－ＣＤ４＋Ｔ細胞を調製し（図５Ａ）、Ｐ２Ｘ７、Ｘｋ及びＶｐｓ１３ａの発現を調べた。これまでの報告と一致して、抗Ｐ２Ｘ７　Ａｂを用いたウエスタンブロッティングにより、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＰ２Ｘ７の発現は、ＣＤ２５－ＣＤ４＋Ｔ細胞における発現よりもおよそ３倍高いことが示された（図５Ｂ）。一方、Ｘｋ及びＶｐｓ１３ａは、ＣＤ２５＋又はＣＤ２５－ＣＤ４＋Ｔ細胞の間で同様のレベルで発現された。ＢＮ－ＰＡＧＥによるＣＤ４＋脾細胞の膜タンパク質の分析から、ＷＲ１９Ｌ細胞に見られるようにＸｋが７６０ｋＤａ及び２７０ｋＤａのバンドに存在することが示された（図５Ｃ）。抗Ｖｐｓ１３ａ　Ａｂは、７６０ｋＤａのバンドを認識し、その強度は、ＸｋヌルＣＤ４＋Ｔ細胞において完全にではないが強く低下し、Ｖｐｓ１３ａが主にＸｋと複合して７６０ｋＤａの複合体を形成することが示された。約６７０ｋＤａの僅かなバンドは、上記のＷＲ１９Ｌ細胞において論考したように、Ｖｐｓ１３ａが膜中の他のタンパク質と形成する複合体を表す可能性がある。
　ＰｔｄＳｅｒ露出及びネクローシス性細胞死（ＰＩ陽性）を、それぞれ１０℃又は３７℃にてＣＤ４＋Ｔ細胞を５００μＭ　ＡＴＰで処理することによって追跡した。図６Ａ及び図６Ｂに示されるように、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、そのＰ２Ｘ７発現レベルと一致して、ＡＴＰに応答し、徐々にＰｔｄＳｅｒを露出させたが、ＣＤ２５－ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＡＴＰに応答しなかった。ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＸｋの欠損は、ＰｔｄＳｅｒ露出の動態を野生型細胞の約４０％にまで遅延させた。ＰＩ陽性ネクローシス細胞の生成もＸｋがない場合に、特にＡＴＰによる刺激後の初期段階又は１５分以内に遅滞した（図６Ｃ及び図６Ｄ）。これらの結果から、Ｘｋ－Ｖｐｓ１３ａ複合体がＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡＴＰ誘導Ｐ２Ｘ７媒介ＰｔｄＳｅｒ露出及び細胞死に関与することが示された。
　本発明者らは、Ｐ２Ｘ７媒介ＰｔｄＳｅｒ露出及び細胞溶解がＸＫ及びＶＰＳ１３ａを必要とし、その遺伝子がそれぞれマクラウド症候群及び有棘赤血球舞踏病に関与することを示した。Ｘｋ及びＶｐｓ１３ａが免疫共沈降し得るという近年の報告（Park et al., 2020, Mol. Biol. Cell. 31:2425-2436）と一致して、Ｘｋ及びＶｐｓ１３ａは細胞膜で複合した。Ｘｋは、リン脂質を細胞膜でカスパーゼ又はキナーゼ依存的に双方向かつ非特異的にスクランブルするＸｋｒ８のパラログである。
　Ｐ２Ｘ７へのＡＴＰの結合により、Ｘｋ－Ｖｐｓ１３複合体が活性化し、リン脂質をスクランブルする。ＡＴＰ係合Ｐ２Ｘ７は、ＰｔｄＳｅｒ露出、非特異的カチオンチャネルの形成、巨大分子透過化、ＡＴＰ放出、膜ブレビング及びアクチン再構成、サイトカイン分泌、細胞死、並びに細胞成長を含む様々な生物学的プロセスを惹起する。
　Ｘｋｒ８のリン脂質をスクランブルする固有の能力は、その構造によっても裏付けられる。一方、酵母及びヒトのＶｐｓ１３ａは、小胞体、ミトコンドリア及び脂肪滴と結合することが報告されている。マウスＸｋは、細胞膜に局在することが報告されている。本発明者らは、Ｖｐｓ１３ａ－／－細胞においてＶｐｓ１３ａから解離したＸｋは、膜画分に留まったが、Ｘｋから放出されたＶｐｓ１３ａは、膜画分には殆ど見られず、ＸｋがＶｐｓ１３ａを細胞膜に動員することを示した。Ｖｐｓ１３ａ欠損細胞にＰｔｄＳｅｒ露出が見られないことから、Ｐ２Ｘ７からのシグナルがＶｐｓ１３ａ係合Ｘｋを活性化してリン脂質をスクランブルするが、その非係合形態は活性化されないことが示された。
　ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞はＰ２Ｘ７を発現するが、ＣＤ２５－ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞では発現されないため、炎症組織及び腫瘍環境における高濃度のＡＴＰは、感染細胞又は腫瘍細胞に対抗するために制御性Ｔ細胞を下方調節することで免疫系を増強すると考えられている。しかしながら、この系が過度になると、自己免疫疾患を引き起こす恐れがある。内皮細胞への接着及び抗原認識時の活性化等の様々な場合で、Ｔ細胞はＰｔｄＳｅｒを露出させる。これらの結果は、この系が神経細胞、赤血球及び筋細胞の恒常性などに関与することから、それを生体内または生体外でその発現、機能性、複合体形成等を促進、抑制といった調節を行うことで、本明細書中に示される、医薬品におけるＤＤＳ、タンパクの発現・機能をON/OFFするためのスイッチ技術、細胞の恒常性において、利用可能なものであることを示している。

Claims (15)

  1. 　ＸＫ発現調節剤及びＸＫ機能調節剤、並びにＶＰＳ１３Ａ発現調節剤及びＶＰＳ１３Ａ機能調節剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、細胞機能調節剤。
  2. 　細胞死の抑制のための剤であり、前記少なくとも１種が、ＸＫ発現抑制剤、ＸＫ機能抑制剤、ＶＰＳ１３Ａ発現抑制剤及びＶＰＳ１３Ａ機能抑制剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１に記載の剤。
  3. 　細胞死の促進のための剤であり、前記少なくとも１種が、ＸＫ発現促進剤、ＸＫ機能促進剤、ＶＰＳ１３Ａ発現促進剤及びＶＰＳ１３Ａ機能促進剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１に記載の剤。
  4. 　疼痛、炎症性疾患及び中枢神経系疾患からなる群から選択される少なくとも１つの症状又は疾患の予防、改善又は治療のための、請求項１に記載の剤。
  5. 　癌の治療又は予防のための、請求項１に記載の剤。
  6. 　Ｐ２Ｘ７受容体を介した細胞機能を調節する、請求項１～５のいずれか一項に記載の剤。
  7. 　医薬、試薬又は食品組成物である、請求項１～６のいずれか一項に記載の剤。
  8. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の剤が導入されている細胞。
  9. 　細胞機能を調節する方法であって、それを必要とする細胞と、請求項１～７のいずれか一項に記載の剤とを接触させることを含む、方法。
  10. 　細胞死を調節するための、請求項９に記載の方法。
  11. 　Ｐ２Ｘ７受容体を介した細胞機能を調節するための、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 　細胞のＸＫ及び／又はＶＰＳ１３Ａを欠失させること、並びに／或いは、細胞におけるＸＫ及び／又はＶＰＳ１３Ａの発現及び／又は機能を抑制することを含む、
    　細胞死が抑制された細胞を製造する方法。
  13. 　細胞にＸＫ及び／又はＶＰＳ１３Ａを導入すること、並びに／或いは、細胞におけるＸＫ及び／又はＶＰＳ１３Ａの発現及び／又は機能を促進させることを含む、
    　高ＡＴＰ濃度依存性細胞死を生じやすい細胞を製造する方法。
  14. 　薬剤の送達のための細胞を製造するための、請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. 　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｅｘ　ｖｉｖｏで行われる、請求項９～１４のいずれか一項に記載の方法。
PCT/JP2022/036003 2021-09-27 2022-09-27 Ｘｋ及び／又はｖｐｓ１３ａの利用 WO2023048299A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163248709P 2021-09-27 2021-09-27
US63/248,709 2021-09-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023048299A1 true WO2023048299A1 (ja) 2023-03-30

Family

ID=85719518

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/036003 WO2023048299A1 (ja) 2021-09-27 2022-09-27 Ｘｋ及び／又はｖｐｓ１３ａの利用

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023048299A1 (ja)

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RYODEN YUTA, SEGAWA KATSUMORI, NAGATA SHIGEKAZU: "Requirement of Xk and Vps13a for the P2X7-mediated phospholipid scrambling and cell lysis in mouse T cells", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 119, no. 7, 15 February 2022 (2022-02-15), pages 1 - 9, XP093052399, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas.2119286119 *
SASSENBACH LUKAS: "Identification of novel proteins involved in P2X7-mediated signaling cascades", PURINERGIC SIGNALLING, vol. 18, no. 4, 1 December 2022 (2022-12-01), DE , pages 495 - 498, XP093052404, ISSN: 1573-9538, DOI: 10.1007/s11302-022-09893-z *
ZHU XIANG, CHO EUN-SOOK, SHA QUAN, PENG JIANBIN, OKSOV YELENA, KAM SIOK YUEN, HO MENGFATT, WALKER RUTH H., LEE SOOHEE: "Giant Axon Formation in Mice Lacking Kell, XK, or Kell and XK", THE AMERICAN JOURNAL OF PATHOLOGY, vol. 184, no. 3, 1 March 2014 (2014-03-01), US , pages 800 - 807, XP093052396, ISSN: 0002-9440, DOI: 10.1016/j.ajpath.2013.11.013 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6924495B2 (ja) 自己免疫疾患およびがんを処置するための組成物および方法
US11311543B2 (en) Compositions and methods for inhibiting PTPN22
Guha et al. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 is a common transcriptional coactivator in the nuclear transcription response to mitochondrial respiratory stress
JP2022519070A (ja) 免疫療法の改善のための遺伝子調節組成物及び遺伝子調節方法
KR20220061148A (ko) 세포 노화 조절 방법 및 조성물
US20180117084A1 (en) Methods for enhancing an immune response with a ctla-4 antagonist
JP6078633B2 (ja) 治療用のチオレドキシン相互作用タンパク質（ｔｘｎｉｐ）のインヒビター
US20190185820A1 (en) Compositions and Methods for Inhibiting Stem Cell Aging
WO2023048299A1 (ja) Ｘｋ及び／又はｖｐｓ１３ａの利用
US20230357388A1 (en) Immunotherapy
JP2021515574A (ja) 誘導性ｔ細胞レセプター及びその使用
WO2020241499A1 (ja) Ｐ２ｘ７受容体発現調節剤
US20190263906A1 (en) Immune modulators for reducing immune-resistance in melanoma and other proliferative diseases
KR20150034684A (ko) B-림프성 악성 종양을 치료하기 위한 조성물 및 방법
WO2023234410A1 (ja) 心筋細胞死の抑制剤及び心筋障害又は心不全の予防又は治療剤
US10724037B2 (en) Method for improving memory using CCNY inhibitor
US20220370605A1 (en) Inhibitor of DJ-1 for Use in Treating Immunoaging
Turotszy The role of NARF and other novel progeria-associated genes/proteins in ageing processes.
Diekmann Influence of MARCKS on physiological functions of monocytic cells
EP3321280A1 (en) Immune modulators for reducing immune-resistance in melanoma and other proliferative diseases
EP2107068A1 (en) MZB1, a novel B cell factor, and uses thereof
WO2023183822A1 (en) Hematopoietic loss of y chromosome leads to cardiac fibrosis and dysfunction and is associated with death due to heart failure
CA3181166A1 (en) Targeting the palmotylation/depalmotylation cycle to treat inflammatory diseases
Cremer Generation and characterization of angiogenin mutants as improved effector domains for H22 (scFv)-based cytolytic fusion proteins
Palmer Regulation of C5aR expression and function: potential modulation by lipid-lowering drugs

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22873050

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE