KR20150034684A - B-림프성 악성 종양을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

B-림프성 악성 종양을 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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티크호넨코 안드레이 토마스
일레인 청
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더 칠드런스 호스피탈 오브 필라델피아
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Abstract

본 발명에서는 B-세포 신생물을 억제, 치료 및/또는 예방하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 본 발명에 따르면, 피험체의 암을 억제, 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 CD19-PI3K 상호작용의 하나 이상의 억제제를 치료적 유효량으로 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 하나 이상의 다른 항암 처리법의 적용, 예를 들어 하나 이상의 다른 화학치료제 투여 및/또는 방사선 치료법을 적용하는 단계를 더 포함한다.

Description

B-림프성 악성 종양을 치료하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING B-LYMPHOID MALIGNANCIES}
우선권 주장
본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에 2012년 5월 1일자 출원된 미국 특허 가출원 제61/640,987호에 대한 우선권을 주장한다. 상기 가출원은 본원에 참고로 포함된다.
정부 지원에 관한 선언
본 발명은 미국 국립 보건원에서 수여하는 보조금 R01 CA102709, T32 HL007439, 및 T32 CA115299을 정부로부터 지원받아 수행되었다. 미국 정부는 본 발명에 일정 권리를 가진다.
기술분야
본 발명은 암 치료법의 분야에 관한 것이다. 상세하게는, 암을 억제, 치료 및/또는 예방하기 위한 조성물 및 방법이 개시되어 있다.
본 발명이 속하는 최근 기술을 설명하기 위하여 명세서 전반에 걸쳐 여러 간행물 및 특허 문헌들이 인용되어 있다. 상기 인용문헌들 각각은 전체로 기재된 것처럼 본원에서 참고로 포함된다.
종양 유전자 중독의 개념은 혈액 악성 종양에서 특히 잘 입증되어 있다(문헌[Felsher, D. W. (2003) Nat. Rev. Cancer 3:375-380]). "액형" 종양은 더 적은 수의 유전자 변이(alteration)에 의존하기 때문에 비정상적으로 발현된 종양단백질들을 표적하는 약물들에 더 민감하다고 생각되어지며, 좋은 예로서 Gleevec vs. Bcr-Abl을 들 수 있다(문헌[Rowley, J. D. (2001) Nat. Rev. Cancer 1:245-250; Druker, B.J. (2002) Cancer Cell 1:31-36]). 또한, 많은 림프종 및 백혈병에서 종양유전자 개시가 반복 염색체 전위(translocation)의 결과로서 쉽게 확인된다. 예를 들어, 인간 버킷 림프종(BL:Burkitt's lymphoma) 및 일부 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL:diffuse large B-cell lymphoma)에서, t(8;14) 전위로 인해 c-Myc은 면역글로불린 중쇄(IgH) 유전자 인핸서(enhancer)의 조절 하에 놓이게 된다(문헌[Taub et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci., 79:7837-7841]; [Dalla-Favera et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci., 79:7824-7827]). 유사한 전위가 마우스 형질세포종에서 확인되었다(문헌[Shen-Ong et al. (1982) Cell 31:443-452]).
B-세포 신생물(neoplasm) 내의 연관된 다른 단백질은 페어드 박스 전사 인자 5(paired box transcription factor 5) 또는 Pax5이다. Pax5는 pro-B로부터 성숙 B 세포 단계로의 B-세포 분화를 조절하고, B-세포 수용체(BCR) 복합체의 발현에 주된 역할을 한다(문헌[Busslinger, M. (2004) Annu. Rev. Immunol., 22:55-79]; [Monroe, J. G. (2006) Nat. Rev. Immunol., 6:283-294]). 이것은 CD79a를 코딩하는 유전자의 직접적인 전사 활성화를 통해 달성되며(Ig-α로 또한 공지됨; Maier et al. (2003) Nucleic Acids Res., 31:5483-5489), CD79a는 세포 표면에서 Ig-β(문헌[Schamel et al. (2000) Immunity 13:5-14]) 및 CD19 공수용체(문헌[Nutt et al. (1998) EMBO J., 17:2319-2333]; [Kozmik et al (1992) Mol.Cell Biol., 12:2662-2672])와 이형이합체를 형성한다. 또한, PAX5는 B 세포 림프종의 부분집합에서는 염색체 전위를 통해 과다발현된다. Pax5 유전자는 비교적 드물지만 지속적인 공격성 B 세포 비-호지킨 림프종(NHL:non-Hodgkin lymphoma)과 연관된 t(9; 14)(p13; q32) 전위에 의해 영향을 받는다(문헌[Offit et al. (1992) Blood 80:2594-2599]; [Cook et al. (2004) Hum. Pathol., 35: 447-454]; [Busslinger et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci., 93:6129-6134]; [Iida et al. (1996) Blood 88:4110-4117]; [Morrison et al. (1998) Blood 92:3865-3878]; [Poppe et al. (2005) Genes Chromosomes Cancer 44:218-223]). 염색체 재배열 외에, Pax5 유전자는 또한 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL) 환자에서 체세포 과돌연변이(hypermutation)에 의해 영향을 받는다(문헌[Pasqualucci et al. (2001) Nature 412:341-346]). Pax5와 관련하여 다른 여러가지 반복 전위(예를 들어, t(7;9)(q11;p13) 및 t(9;12)(q11;p13))가 있으며, 이들은 B-세포 급성 림프성 백혈병(B-ALL)에서 발견되었다. 이들 전위는 Pax5와 ELN 및 ETV6/TEL 유전자의 융합을 일으키고, Pax5 전사 활동의 우성 음성(dominant-negative) 억제제로 생각된다(문헌[Bousquet et al. (2007) Blood 109:3417-3423]; [Cazzaniga et al. (2001) Cancer Res., 61:4666-4670]). 또한, 고해상도 SNP 배열 및 직접적인 염색체 서열분석을 이용하여 B-ALL을 광범위하게 게놈 분석하여 Pax5에서 여러가지 기능 상실 돌연변이를 발견하였다(문헌[Mullighan et al. (2007) Nature 446:758-764]). 그러나, 다른 종양유발 전사 인자-조절 경로에 대한 PAX5 효과는 알려지 있지 않다.
본 발명에 따르면, 피험체의 암을 억제, 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 CD19-PI3K 상호작용의 하나 이상의 억제제를 치료적 유효량으로 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 하나 이상의 다른 항암 처리법의 적용, 예를 들어 하나 이상의 다른 화학치료제 투여 및/또는 방사선 치료법을 적용하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 화학치료제(예를 들어, CD19-PI3K 상호작용 억제제)를 스크리닝하는 방법이 또한 제공된다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 하나 이상의 시험 화합물의 존재 하에서 결합 분석법(binding assay)을 수행하는 단계 및 CD19-PI3K 결합량을 시험 화합물의 부존재 하에서의 결합량과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 결합의 감소는 시험 화합물이 억제제임을 나타낸다.
본 발명에 따르면, 암이 CD19-PI3K 상호작용 억제제에 민감하거나 내성적인지를 결정하는 방법이 제공된다.
도 1은 Pax5가 c-Myc 단백질 수준을 조절한다는 것을 증명한다. 모든 패널은 왼쪽에 표시된 단백질의 면역블로팅(immunoblotting) 분석을 나타낸다. 액틴을 로딩 대조군(loading control)으로 사용하였다. 도 1A는 미처리(0시간)되거나 회수 전에 표시된 시간 동안 Dox로 처리된 P493-6 세포를 나타낸다. 도 1B는 MIGR1 공벡터(empty MIGR1 vector, "GFP") 또는 Pax5-MIGR1("Pax5")로 감염된 Myc5 세포를 나타낸다. 단백질 용해물(lysate)을 감염 후 24 및 48시간으로 준비하였다. 도 1C는 Myc 종양 시료에서 얻은 단백질 용해물을 나타낸다. 이식하기 전에, Myc5 세포를 MIGR1 공벡터("GFP") 또는 Pax5ERMIGR1 ("Pax5ER")로 감염시켰다. 도 1D는 여러가지 항-Pax5("Pax5") 또는 대조군("Ctrl") siRNA를 사용하여 전기천공된(electroporated) P493-6 세포를 나타낸다. 도 1E는 1μM의 대조군 또는 항-Pax5 siRNA로 전기천공된 P493-6 세포를 나타낸다. 용해물은 전기천공 후 24 및 48시간 후에 회수하였다.
도 2는 P493-6 세포로의 RNA 전기천공률을 나타낸다. P493-6 세포를 10nM, 0.1μM 또는 1μM의 Amaxa® BLOCK-IT®FITC-표지된 이중가닥 RNA 올리고로 전기천공하였다. 천공 후 24시간에 유세포분석(Flow cytometry)을 실시하여 FITC-양성 세포 백분율을 결정하였다.
도 3은 Pax5가 CD19를 통하여 c-Myc 단백질 수준을 조절한다는 것을 나타낸다. 도 3E 및 3H를 제외한 모든 도면은 왼쪽에 표시된 단백질의 면역블로팅 분석을 나타낸다. 액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. 도 3A의 괄호 내의 패널에서는, HA-태그된 야생형 또는 변이형("mut") ITAM을 발현하는 Myc5 세포의 전세포 용해물을 α-HA 항체와 면역침전한 후, 전체 Lyn, Tyr396-포스포-Lyn, 또는 또다른 α-HA 항체에 대한 항체로 면역블로팅 하였다. 아래 패널에서는, 동일한 세포의 용해물을 c-Myc 및 β-액틴에 대한 항체로 면역블로팅하였다. 도 3B는 공("GFP") 또는 CD19-코딩 레트로바이러스("CD19")로 형질도입된(transduced) Myc5 세포 내 CD19 및 Myc 수준을 나타낸다. 도 3C는 증가하는 농도의 대조군 또는 α-CD19 siRNA로 전기천공된 P-493-6 세포 내 Pax5, CD19 및 Myc 수준을 나타낸다. 도 3D는 야생형("WT") 및 CD19-null("KO") 마우스의 골수 유래된 B-세포 내 CD19 및 Myc 수준을 나타낸다. 도 3E는 Pax5 또는 낮은(low)/높은(high) 수준의 CD19를 발현하는 Myc5 세포 표면에서 CD19 발현의 유세포분석적 검출을 나타낸다. 평균 형광도(MFI)를 각 플롯(plot)에 나타낸다. 도 3F는 동일 배양에서 CD19 및 Myc 단백질 발현을 나타낸다. 도 3G는 시클로헥시미드(CHX)로 후속 처리된 Pax5- 및 CD19-재구성된 세포주 내 Myc 수준을 나타낸다. CHX는 1μg/ml의 농도로 7.5 내지 30분 동안 첨가되었다. 아래 패널에는, Myc-특이적 밴드를 농도 측정법(densitometry)으로 정량하고, 액틴으로 정규화(normalised)하여, 처리 후 시간에 대해 플롯팅하였다. 정확한 밴드 정량을 위해 부모세포와 Pax5/CD19-형질도입된 세포에서 상이한 노출을 나타낸 것에 유의해야 한다. 도 3H는 동일한 배양에서 방사선면역침전법으로 검출된 정상상태(steady-state)의 Myc 수준을 나타낸다. 세포는 30분 동안 35S-메티오닌으로 펄스 표지(pulse-labeled)한 후 "콜드(cold)" 아미노산으로 0 내지 30분간 추적하였다.
도 4는 야생형 및 CD19-null 마우스의 1차 B-세포의 단기간 배양의 분석을 나타낸다. 도 4A는 9일간 배양된 골수 세포의 유세포분석, 및 B220- 및 CD19-양성 세포의 백분율을 나타낸다. 숫자는 우성 세포 분획의 상대 빈도를 나타낸다. 도 4B는 3일간 배양된 야생형 마우스 비장세포의 유세포분석을 나타낸다.
도 5는 CD19가 PI3K-AKT 경로를 통해 Myc 단백질 발현을 조절한다는 것을 보여준다. 모든 패널은 CD19-PI3K 경로에 속하는 단백질의 면역블로팅 분석을 나타낸다. 액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. 도 5A는 회수 전 1μM의 대조군 또는 항-CD19 siRNA로 24시간 전기천공된 P493-6 세포를 나타낸다. 도 5B는 10μM의 PI3K 억제제 LY29004 또는 비히클(에탄올) 단독으로 1시간 동안 처리된 동일 세포를 나타낸다. 도 5C는 동일 시약으로 0.5시간 동안 전처리한 비장 B-세포를 나타낸다. 도 5D는 레트로바이러스 공벡터(neo) 또는 구성적으로 활성인(constitutively active) 형태의 Akt1/2(AKTmyr)를 발현하는 레트로바이러스로 형질도입된 Myc 세포를 나타낸다. 단백질 용해물을 Myc 잔기 Thr-58 및 Ser-62에 대한 항체로 추가적으로 탐지(probe)하였다. 도 5E는 회수 전에 증가하는 농도의 대조군 또는 항-GSK3β siRNA로 48시간 동안 전기천공된 P493-6 세포를 나타낸다. 도 5F는 공벡터, WT Myc 또는 T58A 변이체로 추가적으로 형질도입되어, GFP 또는 Pax5를 발현하는 Myc5 세포를 나타낸다. 형질도입된 세포를 Myc에 대해 면역블로팅하고(위), Pax5-형질도입된 세포 내 Myc 단백질 수준을 GFP-형질도입된 세포와 비교하였다. T58A 변이체는 Pyo-태그를 가지고 있어서 SDS-PAGE 겔에서 더 느리게 이동한다는 것에 유의해야 한다. 도 5G는 공벡터 또는 PTEN을 코딩하는 레트로바이러스("PTEN")로 추가적으로 형질도입되는 도 3B에서의 GFP 또는 CD19를 발현하는 Myc5 세포를 나타낸다.
도 6은 CD19가 시험관 내(in vitro) 세포 증대(expansion) 및 생체 내(in vivo) 종양 성장을 촉진한다는 것을 나타낸다. 이들 실험에 사용된 세포주는 MYC5(도 6A-6C) 또는 그의 단일 세포 서브클론 Myc5-M5(도 6D-6G)였다. 도 6A는 대조군- 및 항-Myc siRNA 처리된 GFP- 및 CD19-재구성된 MYC5 배양의 성장률의 비교 분석을 나타낸다. 도 6B는 동일한 배양에서 Myc 단백질 수준을 나타낸다. 도 6C는 Pax5-, CD19- 및 Myc-재구성된 MYC5 배양의 성장률의 비교 분석을 나타낸다. 도6D는 CD19-재구성된 MYC5-M5 내 CD19-Myc 축 구성성분의 발현 수준을 나타낸다. 도 6E는 도 6D의 배양 내에 공지된 Myc 표적 유전자의 수준을 나타낸다. 도 6F는 SCID 마우스에 피하 이식 후 CD19-재구성된 MYC5-M5 종양 내 CD19-Myc 축 구성성분의 발현 수준을 나타낸다. 각 집단에서 3가지 각각의 종양은 본 분석을 위해 무작위로 선택되었다. 도 6G는 도 6F의 종양 이종이식편(xenograft)의 성장률을 나타낸다. 각 그룹에서 5마리 이상의 마우스를 분석하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 7은 CD19-발현 Myc5-M5 세포의 생성 및 분석을 나타낸다. Myc5-M5 세포는 공벡터(GFP) 또는 CD19-레트로바이러스로 형질도입되었다. 감염 후 24시간에 유세포분석을 실시하여 GFP-양성 세포의 백분율을 결정하였다(도 7A). 이어서 이들 세포를 분류하고, 시험관 내에서 증대시켜, 도 6에 도식된 실험에 사용하였다. 대조군(GFP) 및 CD19-재구성된 Myc5-M5 세포에서 중요한 Myc-억제된 마이크로RNA(microRNA)의 상대적인 수준은 도 7B에 나타나 있다.
도 8은 CD19가 인간 B-림프종에서 Myc 기능에 기여한다는 것을 보여준다. 도 8A는 CD19가 BCR-비의존적 방식으로 Myc 안정화를 촉진하고 있는 전체 모델을 제공한다. 도 8B는 CD19HIGH 종양을 CD19LOW 종양과 비교하는 DANG_MYC_TARGETS_UP 세트에 대한 GSEA 농축도 플롯(enrichment plot)을 나타낸다. 정규화된 농축도 스코어(Normalized Enrichment Score), p-값(p-value), 및 FDR q-값(q-value)은 플롯의 아래에 표시되어 있다. 도 8C은 GSEA시 생성된 히트맵(heatmap)을 제공하고 있으며, 이는 Myc 표적 유전자를 도식화하여 CD19HIGH 종양과 CD19LOW 종양을 비교한다. 도 8D는 험멜(Hummel)(왼쪽 패널) 및 렌츠(Lenz)(오른쪽 패널)의 연구에서 MYCHIGH 환자와 MYCLOW 환자의 생존을 비교하는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 곡선을 제공한다. 도 8E는 험멜(왼쪽 패널) 및 렌츠(오른쪽 패널)의 연구에서 CD19HIGH 환자와 CD19LOW환자의 생존을 비교하는 카플란-마이어 곡선을 제공한다.
도 9A 및 9B는 표시된 환자의 시간 경과에 따른 생존율(percent survival overtime)을 나타낸다. 도 9C는 miR-17~92 과다(abundance)와 mir17hg 신호 사이의 상관관계를 나타내는 그래프를 제공한다. 도 9D는 BCR 시그니쳐(signature)와 mir17hg 발현 사이의 상관관계를 나타낸다. 도 9E, 9F 및 9G는 표시된 피험체의 시간 경과에 따른 생존율을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 10A 및 10B는 miR-17~92 억제제의 존재 또는 부존재 하에서 다양한 세포유형 내 BLNK 인산화를 나타낸다. 도 10C는 다양한 세포 내 CD22의 발현을 나타낸다. 도 10D 및 10E는 표시된 miRNA의 존재 또는 부존재 하에서 루시퍼라제의 발현 그래프를 제공한다. 도 10F는 miR17-92 모방체(mimic)의 존재 또는 부존재 하에서 Akt 및 GSK3β의 인산화를 나타낸다. 도 10G는 BCR 반응의 개략도를 제공한다.
도 11에서는, PI3K-불능화된 CD19가 JNK를 활성화하고 시험관 내 및 생체 내에서 종양 성장을 촉진한다는 것을 나타낸다. 도 11A는 야생형 또는 변이형 CD19를 발현하는 MYC5 종양의 성장률을 제공한다. 도 11B는, 23일째 도 11A의 각각의 종양으로부터 얻은 단백질 용해물의 면역블롯(immunoblot)을 제공한다. 도 11C는 MYC5-M5 세포 내 야생형 또는 변이형 CD19 재발현에 따른 MAPK 신호전달 분자 및 이들의 표적의 인산화를 나타낸다. 도 11D는 PI3K 억제제 LY294002 또는 비히클(EtOH)로 처리된 마우스 1차 B 세포를 나타낸다. 도 11E는 표시된 기간 동안 SU6656 또는 비히클(DMSO) 단독으로 처리된, WT 또는 MUTCD19를 발현하는 MYC5 세포를 나타낸다. 인산화는 인-특이적 항체로 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 이용하여 평가하였다. 도 11F는 SU6656에 의한 MYC5/CD19 세포 성장의 억제를 나타낸다. GFP-단독-발현하는 MYC5 세포를 대조군으로 사용하였다. 세포 증식(proliferation)은 표시된 시점에서 WST 분석법을 이용하여 측정하였다. 도 11G는 열거된 항체로 면역블로팅된 WT 또는 MutCD19를 복구된 Myc_M5(CD19-/BCR-) 세포의 단백질 용해물을 나타낸다.
도 12에서는 B-ALL 세포(BCR-CD19+)가 Src 패밀리 티로신 키나아제(SFTK) Lyn을 동원하고 LYN 억제에 민감하다는 것을 나타낸다. B-ALL 세포 697 및 버킷 림프종 세포 P-4936의 용해물을 항-CD19 항체 또는 토끼 IgG(음성 대조군)로 면역 침전하였다. 이어서, 면역침전된 단백질을 PI3K 또는 Lyn에 대해 면역블로팅하였다 (도 12A, 위). B-ALL 세포 697의 용해물을 항-CD19 또는 Lyn 항체로 면역침전한 후 CD19에 대해 면역블로팅하였다(도 12A, 아래). CD19 shRNA 처리는 Lyn 인산화 및 Myc 발현을 약화시키고, Lyn shRNA 처리는 전체 및 p-Lyn 수준을 감소시킨다. 또한, Myc의 억제가 확인된다(도 12B, 위). 도 12B, 아래는 CD19 (왼쪽) 또는 Lyn (오른쪽) shRNA-처리된 세포 내 성장을 모니터링하는 WST 분석 그래프를 제공한다. 도 12C는 CD19 또는 Lyn shRNA 및 100nM 농도의 다사티닙(Dasatinib) 또는 비히클(DMSO)로 처리된 세포를 아넥신(annexin) V/프로피디움 아이오다이드(PI)로 염색한 것을 나타낸다. 도 12D는 Lyn 대한 다사티닙의 효능을 나타낸다. 단백질 용해물을 처리 후 0.5, 1.0, 2.0 및 4.0시간에 웨스턴 블롯 분석을 위해 회수하였다(도 12D, 위). 또한, 도 12D에서는 약물 처리 후 세포를 세포 성장을 모니터링하는 WST 분석 그래프를 제공한다. 또한, 세포는 세포주기 분석을 위해 처리 후 48시간에 회수하였다. 다사티닙은 세포주기를 G1기에 정지시키고 이와 비례하여 S 및 G2/M 기를 감소시킨다(도 12D).
Pax5의 종양 유발 및 종양 억제제 활성을 조화시키기 위해 가능한 방법은 Pax5가 단계 분화에, 특히 BCR 발현에 의존하는 방법으로 신생물 성장에 영향을 주는 것이다. 대부분의 NHL은 성숙, 및 전- 및 후-배 중심(germinal center) B-세포에서 유래되기 때문에, 이러한 성장 촉진 복합체를 발현한다(문헌[Shaffer et al. (2002) Nat. Rev. Immunol., 2:920-932]; [Gururajan et al. (2006) J. Immunol., 176:5715-5719]). 반면, 대다수의 B-ALL(A1 및 A2 형)은 BCR이 결여된 미성숙 프로(pro-) 또는 프리(pre)-B 세포에서 유래된다(문헌[Staudt, L.M. (2002) Cancer Cell1:109-110)]). Pax5의 형질전환 활성이 BCR 신호전달에 의존적이었다면, Pxa5는 B-ALL 세포에서가 아니라 NHL에서만 자신을 나타냈어야 하는데, B-ALL 세포에서 Pax5의 내재의 성장 억제 효과가 밝혀졌다(문헌[(Thomas-Tikhonenko et al. (2008) Future Oncol 4:5-9]).
실제로, BCR 신호전달의 유도는 Myc-유도된 Pax5-매개된 림프종형성에 중요하다(문헌[(Cozma et al. (2007) J. Clin. Inv., 117:2602-2610]). 구체적으로는, Pax5 의존적 신생물 성장은 ITAM-특이적 CD22 포스파타제의 과다발현, 또는 Syk 억제제의 처리에 의해 감소되거나, 또는 구성적으로 활성인 ITAM 구조물(construct)의 강제 발현에 의해 모방될 수 있다(문헌[Grande et al. (2006) Oncogene 25:2748-2757]). 트랜스제닉(transgenic) 마우스 모델을 이용한 후속 자료들은 Myc과 BCR 신호전달 경로가 B 림프종 형성 과정에서 협조한다는 견해를 입증해 주었다(문헌[Refaeli et al. (2008) PLoS Biol 6:e152]). 그러나, 두가지 중요한 전사 인자, Myc 자신과 Pax5 사이에 직접적으로 기능적 상호작용이 있는지는 아직 명확하지 않다. 이러한 문제로 두가지 세포 모델을 이용하게 되었다. 하나는 p53-null/Myc-유도된 마우스 림프종 세포에서 유래된 Myc5 세포주이며, 이들 세포는 시험관 내 배양시 자발적인 Pax5의 사일런싱(silencing)을 겪는다(문헌[Cozma et al. (2007) J. Clin. Inv., 117:2602-2610]; [Yu et al. (2003) Blood 101:1950-1955]; [Johnson et al. (2004) Nat. Immunol., 5:853-861]; [Hodawadekar et al. (2006) J. Immunol., 177:6165-6171]; [Hodawadekar et al. (2007) Exp. Cell Res., 313:331-340]). 다른 하나는 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스에 의해 불멸화되고 tet-조절 프로모터로부터 Myc 이식유전자(transgene)를 발현하는 P493-6 인간 B-림프아구성(lymphoblastoid) 세포이다(문헌[Pajic et al. (2000) Int. J. Cancer 87:787-793]; [Clark et al. (1992) Science 258:123-126]). 상기 세포주, 및 마우스 1차 B-세포 및 인간 비-호지킨 림프종을 이용하여 얻은 생체 내 및 시험관 내 자료는 B-세포 내 Pax5 및 그의 하류 작용인자(downstream effector) CD19가 Myc 단백질 수준의 중요한 전사후 조절인자라는 놀라운 결론를 가져왔다. 본 발견은 B-림프종형성에 중요한 의미를 갖는다.
보다 구체적으로, MYC-형질전환된(transformed) B 세포주뿐만 아니라 MYC-유도된 마우스 림프종 모델을 이용하여, 본원에서는 PAX5가 c-MYC 단백질 안정성 및 정상상태 수준을 조절한다는 것을 보여준다. 이러한 프로모터-비의존적 번역 후 c-Myc 조절기전은 ITAM/BCR 활성에 비의존적이다. 대신에, PI3K-Akt-GSK3β 축을 통하여 또다른 Pax5 표적인 CD19에 의하여 조절되었다. 결과적으로, CD19-결여 마우스의 B 세포 내 MYC 수준은 급격하게 감소되었다. 반면, PAX5의 자발적 사일런싱을 갖는 마우스 림프종에서 CD19의 재발현은 MYC 수준, 그의 중요한 표적유전자의 발현, 시험관 내 세포 증식 및 생체 내 전체 종양 성장을 급증시켰다. 인간 B-림프종에서, CD19 mRNA 수준은 MYC-활성화된 유전자의 mRNA수준과 상관관계가 있다는 것이 확인되었다. 또한, 이들은 MYC 수준이 관계하는 동일한 방법으로 림프종 환자의 전체 생존률과 음성적 상관관계가 있었다. 따라서, CD19는 B 세포 신생물에서 MYC-주도된 신생물 성장의 주요한 BCR-비의존적 조절인자이다.
Pax5는 B-림프종형성을 촉진한다(문헌[Thomas-Tikhonenko et al. (2008) Future Oncol., 4:5-9]). 실제로, 증거로 상대적으로 드물지만 지속적으로 발생하는 PAX5 및 IgH 유전좌위를 병치시키는 t(9; 14) (p13; q32) 전위; Pax5 발현을 향상시키는 것으로 추정되는 DLBCL내 PAX5의 체세포 과돌연변이; 및 유전자 녹다운/과다발현 연구가 포함된다(문헌[Cozma et al. (2007) J. Clin. Inv., 117:2602-2610]; [Cook et al. (2004) Hum. Pathol., 35:447-454]; [Busslinger et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci., 93:6129-6134]; [Iida et al. (1996) Blood 88:4110-4117]; [Morrison et al. (1998) Blood 92:3865-3878]; [Poppe et al. (2005) Genes Chromosomes Cancer 44:218-223]; [Pasqualucci et al. (2001) Nature 412:341-346). 또한, B-세포 증대에 대한 음성적 효과가 DLBCL 세포주 내 Pax5 작용인자 CD79a(Ig-α)의 녹다운 후에 관찰되었다(문헌[Gururajan et al. (2006) J. Immunol., 176:5715-5719]). CD79a는 B-세포 수용체의 중요한 구조 성분이기 때문에(문헌[Monroe, J.G. (2006) Nat. Rev. Immunol., 6:283-294)], 이러한 결과는 Pax5에 의한 Ig-α/BCR 신호전달의 자극이 그의 형질전환 활성의 바탕을 이룬다는것을 암시하였다. 실제로, 구성적으로 활성인 CD79a/b 이형이합체(ITAM)가 또한 B-림프종생성을 촉진한다(문헌[Cozma et al. (2007) J. Clin. Inv., 117:2602-2610]; [Refaeli et al. (2008) PLoS Biol 6:e152]). 또한, BCR과 Myc 사이에 협조가 관찰되었으며, 이는 그들이 공직선(colinear) 경로가 아닌 평행(parellel) 경로로 작용할 수 있다는 것을 암시한다. 본원에서, Pax5 발현의 복구는 Myc 수준을 강하게 증가시키지만, ITAM은 Myc 수준에는 현저한 효과를 갖지 않는다는 것을 보여준다. 대신에, 이러한 역할은 CD19-매개된 신호전달에 의한 것이라고 할 수 있다.
CD19는 잘 알려진 B 세포 표면 분자이며, BCR 활성화시 B-세포 항원 수용체-유도 신호전달을 향상시키며, 이 신호전달은 B-세포군의 증대에 중요하다(문헌[Tedder,T.F. (2009) Nat. Rev. Rheumatol., 5:572-577]). CD19의 공지된 활동 기전은 PI3 및 후속적으로 Akt 키나아제의 동원 및 활성화이다(문헌[Tuveson et al. (1993) Science 260:986-989]; [Buhl et al. (1999) J. Immunol., 162:4438-4446]; [Otero et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:1474-1478]; [Fujimoto et al. (2002) J. Immunol., 168:5465-5476]; [Aiba et al. (2008) Blood 111:1497-1503]). 이것은 CD19의 세포질 부분 내 2개의 티로신 잔기, Y482 및 Y513의 도킹(docking) 기능을 통해 달성된다(문헌[Wang et al. (2002) Immunity 17:501-514]). 또한, Akt에 의한 GSK3β Ser-9의 억제성 인산화는 상기 경로의 중요한 기능 중 하나이다(문헌[Cross et al. (1995) Nature 378:785-789]). 결과적으로, GSK3β에 의한 Myc Thr-58의 인산화는 Fbw7 E3 유비퀴틴 리가아제에 의한 인식을 증가시키고 단백질 분해를 가속화한다(문헌[Hann, S.R. (2006) Semin. Cancer Biol., 16:288-302]; [Welcker et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci., 101:9085-9090]; [Pulverer et al. (1994) Oncogene 9:59-70]). 그러나, Myc 단백질 안정성은 다른 인산화 부위 및 다른 유비퀴틴 리가아제에 의해 광범위하게 조절된다(문헌[Hann, S.R. (2006) Semin. Cancer Biol., 16:288-302]; [Sears, R.C. (2004) Cell Cycle 3:1133-1137]). 따라서, 놀랍게도 본원에서는 B-세포 내에서 GSK3β의 불활성화가 Myc 단백질 수준에 매우 큰 영향을 갖는다는 것을 발견하였다(도 5E 참조). 다른 의외의 결과는 CD19에 의한 Akt 신호전달의 자극(도 5G 참조)이 BCR 핵심 구성성분 CD79a (Ig-α) 결여 세포에서 확인되었다는 것과, 이에 따라 성숙 B-림프구의 생존을 조절한다고 알려진 B-세포 수용체 신호전달에 완전히 비의존적이라는 것이다(문헌[Srinivasan et al. (2009) Cell 139:573-586]; [Patterson et al. (2006) Immunity 25:55-65]; [Kraus et al. (2004) Cell 117:787-800]).
CD19는 Myc 수준을 증가시킬 뿐만 아니라, 명백하게 Myc 기능에 양성적 효과를 갖는다. 예를 들어, CD19로 재구성된 Myc5-M5 세포는 Myc 표적인 ODC1, CDK4, 및 LDHA의 증가된 수준을 보인다(도 6E 참조). 게다가, 인간 DLBCL에서 CD19 mRNA 수준과, ODC1, CDK4 및 LDHA를 포함한 Myc-활성화된 유전자의 mRNA 사이에 통계적으로 매우 유의한 상관관계가 있다(도 8B, 8C 참조). 따라서, DLBCL 내 CD19 수준은 MYC 수준과 같이 환자의 생존과 음성적 상관관계를 갖는다(도 8D, 8E 참조).
CD19(분화 클러스터 19; Gene ID: 930; UniProtKB/Swiss-Prot: P15391.6; GenBank Accession No. P15391)는 정상 및 신생물 B-세포에서 광범위하게 발현된다. B-세포 신생물은 빈번하게 Pax5 및 CD19 발현을 유지하기 때문에, (CD20과 함께) 이는 면역독소를 포함하는 다양한 면역 치료제를 위해 선택되는 표적으로 생각된다(문헌[Scheuermann et al. (1995) Leuk. Lymphoma 18:385-397]; [Tedder, T.F. (2009) Nat. Rev. Rheumatol., 5:572-577]). 특히, 인간화 항-CD19 mAb, 및 CD19에 대한 키메라 항체 수용체를 발현하는 동종이계(allogenic)의 T-세포는 임상시험에 들어갔다. 이들은 CD19-발현 신생물의 B-세포를 인식하고 감소시킴으로써 작용하리라고 추정된다(문헌[Davies et al. (2010) Cancer Res., 70:3915-3924]; [Awan et al. (2010) Blood 115:1204-1213)]). 특히, 항-CD19 항체 처리는 전형적으로 CD19의 내재화(internalization) 및 간섭에 의한 기능 상실을 가져온다(문헌[Sapra et al. (2004) Clin. Cancer Res., 10:2530-2537]. 따라서, 결합된 항-CD19 항체는 항암제 또는 T-세포를 운반하는 것 외에도 PI3K 신호전달을 감소시키고 그 결과로 Myc 발현을 약화시킬 것이다.
특히, CD19-음성의 B-세포 신생물, 예를 들어 형질세포로부터 유래된 다발성 골수종(MM)에서 세포증식을 유도하는 것이 무엇인지는 분명하지 않다. 흥미롭게도, Myc 재배열이 상기 질환에서 매우 일반적이며, 최근 기재된 Myc 유전자 전사 억제제(JQ1)가 MM 발병기전에서 Myc의 필수적인 역할을 증명하는 데 사용되었다(문헌[Chng et al. (2011) Leukemia 25:1026-1035]; [Shou et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci., 97:228-233]; [Delmore et al. (2011) Cell 146:904-917]). 1) PI3K 신호전달의 부존재 하에서도 Myc 단백질이 충분한 양으로 축적될 수 있도록 매우 강한 전사를 유도하는 재배열 대립 유전자에 의해, 또는 2) CD19외에 표면 수용체가 MM(및 다른 CD19-음성 신생물,예를 들어 호지킨 림프종)에서 PI3K 활성화에 역할을 함으로써, Myc 수준은 CD19 부존재 하에서 MM에서 유지될 수 있다. 두 번째 옵션은 적어도 시험관 내 MM 세포가 PI3K 억제제에 매우 민감하다는 발견에 의해 뒷받침되며(Khwaja, A. (2010) Curr. Top. Microbiol. Immunol., 347:169-188), 이는 B-세포 기원의 신생물 내 중요한 종양단백질인 Myc의 불안정화를 통해서 일어날 수 있다.
본 발명에 따르면, 화학치료제(예를 들어, CD19-PI3K 상호작용 억제제)를 확인하는 방법이 제공된다. CD19 세포질 테일(cytoplasmic tail)은 인산화 가능한 잔기를 다수 포함한다(문헌[Brooks et al. (2000) J. Immunol., 164:3123-3131]). PI3K의 p85 서브유닛(subunit)은 CD19 세포질 테일의 티로신 482 및 513과 상호작용한다고 밝혀졌다(문헌[Brooks et al. (2004) J. Immunol., 172:7556-7564]; [Chen et al. (2007) Mol. Cell Biol., 27:3109-3122]; [Fujimoto et al. (2000) Immunity 13:47-57]; [O'Rourke et al. (1998) Immunity 8:635-645]; [Tuveson et al. (1993) Science 260:986-989]). 특정 실시예에서, 본 발명의 스크리닝 방법은 CD19, 특히 세포질 테일과 PI3K 사이의 상호작용을 파괴하고/하거나 방지하는 억제제를 확인하기 위해, 하나 이상의 시험 화합물의 존재 하에서 결합 분석법을 실시하는 단계를 포함한다. 결합 분석법은 세포 기반(예를 들어, 이스트 투 하이브리드 분석법(yeast two hybrid assay))일 수 있다. 또한, 결합 분석법은 적합한 대조군, 예를 들어 시험 화합물의 부존재 및/또는 공지된 억제제의 존재 하에서 분석법을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 결합 분석법은 세포 표면 수용체 결합 분석법, 형광 에너지 전달 분석법, 액체 크로마토그래피, 막 여과 분석법, 리간드 결합 분석법, 방사선 결합 분석법, 면역침전법, 방사선면역분석법, 효소 면역 분석법(enzyme-linked immunosorbent assays: ELISA), 면역조직화학적 분석법, 웨스턴 블롯, 및 표면 플라즈몬 공명법을 비제한적으로 포함한다. 특정 실시예에서, CD19 또는 PI3K는 결합 분석법에서 고정화(예를 들어, 고형 지지체에)될 수 있으며, 고정화된 단백질에 결합된 다른 단백질의 양은 시험 화합물 존재 하에서, 특히 임의의 결합되지 못한 단백질을 세척한 후에 측정된다. 특정 실시예에서, 분석법은 세포 기반 스크리닝 분석법이다. 예를 들어, 화합물은 CD19 리간드(예를 들어, CD19-L (문헌[Uckun et al. (2011) Br. J. Haematol., 153:15-23]), BCR을 포함하는 IgM에 대한 항체) 존재 하에서, B-세포 상에서 스크리닝될 수 있다. 화합물이 PI3K 또는 하류 단백질과 상호작용거나 이들을 활성화시키는 CD19를 억제할 수 있는 능력(예를 들어, 도 8A 참조; 예를 들어 Myc 단백질 수준의 감소; Akt 인산화의 감소, GSK3β인산화의 감소 등)이 스크리닝될 수 있다.
특정 실시예에서, 시험 화합물은 항체, 소분자 또는 펩티드, 특히 CD19 또는 PI3K의 결합 도메인을 모방하는 펩티드이다. 펩티드는 단백질들 중 하나와 서열 동일성(예를 들어, 90%, 95%, 또는 100% 이상의 동일성)을 갖는, 5 내지 약 50 개 길이의 아미노산, 특히 약 5 내지 약 10, 15, 또는 20개 길이의 아미노산일 수 있다. 예를 들면, 펩티드는 CD19 세포질 테일의 티로신 482 및/또는 513을 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 암을 억제(예를 들어, 감소), 예방 및/또는 치료하는 방법이 제공된다. 특정 실시예에서, 암은 CD19 양성이다. 특정 실시예에서, 암은 CD19 양성의 다발성 골수종이다. 특정 실시예에서, 암은 B-세포 신생물이다. B-세포 신생물은 림프종, 비-호지킨 림프종, B-세포 급성 림프아구성 백혈병 및 만성 림프성 백혈병을 비제한적으로 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 CD19-PI3K 상호작용의 하나 이상의 억제제를 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 하나 이상의 Src 패밀리 티로신 키나제 억제제, 특히 Lyn 억제제(예를 들어,다사티닙(dasatinib), PP2)를 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다. CD19-PI3K 억제제는 본원에서 상기에 기술된 방법으로 확인될 수 있다. 특정 실시예에서, CD19-PI3K 상호작용 억제제는 소분자, 펩티드 또는 항체이다. 특정 실시예에서, 항체는 특히 CD19-양성 세포의 제거없이 CD19 내재화(internalization)를 일으킨다. 특정 실시예에서, 항체는 세포 내(intracellular) 항체(인트라보디(intrabody); Lo et al. (2008) Handb. Exp. Pharmacol., 181:343-73), 특히 PI3K 또는 CD19의 결합 도메인(예를 들어, 세포질 도메인; 예를 들어, 티로신 482 및/또는 513을 포함하는 에피토프)에 면역학적으로 특이적인 항체(예를 들어, scFV)이다.
상기 방법은 하나 이상의 다른 암 치료법(동시 및/또는 순차적(전 및/또는 후)), 예를 들어 방사선 치료법의 적용 및/또는 하나 이상의 다른 화학치료제의 투여를 더 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 항-CD20 항체(예를 들어, 리툭시맙(rituximab))의 추가적인 투여를 더 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 하나 이상의 PI3K 억제제(예를 들어, 워트만닌(wortmannin), PX-866, LY294002)의 추가적인 투여를 더 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 항-CD19 항체(예를 들어, MEDI-551 (MedImmune사) 또는 XmAb5574 (MorphoSys사)) 또는 키메라 항원 수용체 및/또는 CD19를 표적화하는 세포의 추가적인 투여를 더 포함한다. 키메라 항원 수용체는 전형적으로 하나 이상의 항체의 항원 인식 도메인 및 세포 내 도메인(예를 들어, T-세포 활성화 도메인)을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 하나 이상의 면역수용체 티로신 억제 모티프(ITIM) 단백질(예를 들어, CD22 또는 FCGR2B)의 발현 및/또는 기능을 향상시키는 단계(예를 들어,ITIM 단백질을 코딩하는 핵산 분자(예를 들어, 벡터, 특히 바이러스 벡터로서)을 운반함으로써(예를 들어, 유전자 치료법))를 더 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 miR-17~92 및/또는 그의 하류 작용인자, 예를 들어 BLNK 및 SYK(예를 들어, 억제성 핵산 분자(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA 등)를 통해)를 표적화하거나 억제하는 단계를 더 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 하나 이상의 Src 패밀리 티로신 키나제 억제제, 특히 PI3K 억제제, 특히 Lyn 억제제 (예를 들어,다사티닙, PP2)의 투여를, 특히 PI3K 억제제와 함께 투여될 때, 더 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 하나 이상의 Myc 억제제(예를 들어, 브로모도메인 억제제(예를 들어, JQ1); 10058-F4)의 투여를, 특히 Lyn 억제제 및/또는 PI3K 억제제와 함께 투여될 때, 더 포함한다.
본 발명은 1) 하나 이상의 CD19-PI3K 억제제 및 2) 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 운반체를 포함하는 조성물을 포함한다. 상기 조성물은 암 치료를 위해 이를 필요로 하는 환자에게 치료적 유효량으로 투여될 수 있다. 조성물은 하나의 다른 화학치료제를 더 포함할 수 있다. 선택적으로, 다른 화학치료제는 순차적 투여 및/또는 동시 투여를 위해 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 운반체와 함께 별개의 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물(들)은 키트에 포함될 수 있다.
화학치료제는 항암 활성을 보이고/보이거나 세포에 유해한 화합물이다(예를 들어, 독소). 적합한 화학치료제는 독소(예를 들어, 사포린, 리신, 아브린, 에티디움 브로마이드, 디프테리아 독소, 슈도모나스 엑소톡신 및 상기에 열거된 그밖의 것; 항체에 결합되거나 융합되는 경우 면역독소를 생성; 단일클론 항체 약물(예를 들어, 리툭시맙, 세툭시맙); 알킬화제(예를 들어, 클로르암부실,시클로포스파미드,이소파미드, 메클로르에타민, 멜팔란, 및 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 아지리딘, 예를 들어 티오테파; 메탄설포네이트 에스테르, 예를 들어 부설판; 니트로소 우레아, 예를 들어 카르무스틴, 로무스틴 및 스트렙토조신; 플래티늄 복합체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 생환원 알킬화제, 예를 들어 마이토마이신, 프로카르바진, 다카르바진 및 알트레타민); DNA 가닥 절단제(예를 들어,블레오마이신); 토포이소머라제 II 억제제 (예를 들어, 암사크린, 닥티노마이신, 다우노루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 독소루비신, 에토포시드 및 테니포시드); DNA 작은 홈(minor groove) 결합제(예를 들어, 플리카마이딘), 대사길항물질(예를 들어, 메토트렉세이트 및 트리메트렉세이트와 같은 폴레이트 길항제; 플루오로우라실, 플루오로데옥시유리딘, CB3717, 아자시티딘, 시타라빈, 및 플루옥수리딘과 같은 피리미딘 길항제; 머캡토퓨린, 6-티오구아닌, 플루다라빈, 펜토사타틴과 같은 퓨린 길항제;아스파라기나아제; 및 히드록시우레아와 같은 리보뉴클레오티드 리덕타제 억제제); 튜불린 상호작용제(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 파클리탁셀(Taxol); 호르몬제(예를 들어, 에스트로겐; 결합 에스트로겐;에티닐 에스트라디올; 디에틸스틸베스테롤; 클로르트리아니센; 이데네스트롤; 프로게스틴, 예를 들어 히드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 및 메게스트롤; 및 안드로겐 예를 들어 테스토트로겐, 테스토스테론 프로피오네이트, 플루옥시메스테론, 및 메틸테스토스테론); 부신 코르티코스테로이드(예를 들어, 프레드니손, 덱사메타손, 메틸프레드니솔론 및 프레드니솔론); 루틴화 호르몬 방출제 또는 고나도트로핀 분비 호르몬 길항제(예를 들어, 루프롤리드 아세테이트 및 고세렐린 아세테이트); 및 항호르몬 항원(예를 들어, 타목시펜, 플루타미드와 같은 항 안드로겐제; 및 항아드레날제, 예를 들어, 마이토탄 및 아미노글루테티미드)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사(예를 들어, 국부(종양에 또는 종양내에 직접) 또는 계통 투여), 경구, 폐, 국소, 비강 또는 그 밖의 투여 방식으로 투여될 수 있다. 조성물은 비경구, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피하, 국소, 흡입, 경피, 폐내, 직장내 및 비강내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법으로 투여될 수있다. 특정 실시예에서, 조성물은 정맥 내에 투여 된다. 일반적으로, 조성물의 약제학적으로 허용가능한 운반체는 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 보강제 및/또는 운반체로부터 선택된다. 조성물은 다양한 완충 내용물(예를 들어, Tris HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 세기의 희석제; 첨가제, 예를 들어 계면활성제 및 가용화제(예를 들어, Tween® 80, 폴리소르베이트 80), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 소디움 메타비설파이트), 보존제(예를 들어, 티머졸, 벤질 알콜) 및 증량제(예를 들어, 락토오스, 만니톨)를 포함할 수 있다. 또한, 조성물은 중합화합물, 예를 들어 폴리에스테르, 폴리아미노산, 하이드로겔, 폴리락타이드/글리코라이드 공중합체, 에틸렌비닐아세테이트 공중합체, 폴리락틱산, 폴리글리콜산 등의 입자형 제제, 또는 리포솜에 포함될 수 있다. 상기 조성물은 본 발명의 약제학적 조성물의 구성성분의 물리적 상태, 안정성, 생체 내 분비율, 생체 내 제거율에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st edition, Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins. 2005]을 참조할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 예를 들어 액상 형태로 제조될 수 있으며, 또는 건조 분말 형태(예를 들어, 나중에 재구성을 위해 동결건조된 형태)로 제조될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 운반체"는 앞서 예시된 바와 같이 약제학적 제제의 바람직한 투여 경로에 적합할 수 있는 임의의 모든 용매, 분산 매체 등을 포함할 수 있다. 약제학적 활성 성분을 위한 상기 매체의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 통상적인 매체 또는 물질이 투여될 분자와 적합하지 않는 경우를 제외하고, 약제학적 제제에 이들의 사용은 고려되어진다.
특정 환자에게 투여하기에 적합한, 본 발명의 분자의 투여량 및 투여 계획은 환자의 나이, 성별, 체중, 일반 의학적 상태, 및 특이 질환 및 그의 중증도(억제제가 투여되고 있는 경우)를 고려하여 의사에 의해 결정될 수있다. 또한, 의사는 투여 경로, 약제학적 운반체 및 분자의 생물학적 활성을 고려할 수 있다.
적합한 약제학적 제제의 선정은 선택된 투여 방법에 따른다. 예를 들면, 본 발명의 분자는 임의의 암 조직 또는 암 인근 부위에 직접 주사함으로써 투여될 수 있다. 이러한 경우, 약제학적 제제는 암조직에 적합한 매체에 분산된 분자를 포함한다.
또한, 본 발명의 분자는 혈류에 정맥주사되거나 피하, 근육내 또는 척추강내, 또는 복강내 주사에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구 주사용 약제학적 제제는 당업계에 공지되어있다. 분자 투여 방법으로 비경구 주사가 선택되는 경우, 충분한 양의 분자가 그들의 표적 세포에 도달하여 생물학적 효과를 줄 수 있도록 조치를 취해야한다. 분자, 또는 이들이 운반되는 약제학적 제제의 친유성은 분자가 표적 위치에 도달할 수 있도록 증가되어야만 할 수도 있다. 분자의 친유성을 증가시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
약제학적 운반체와 혼화물 내에 활성 성분으로서 본 발명의 화합물을 함유하는 약제학적 조성물은 통상적인 약제학적 혼합 기술에 따라 제조될 수 있다. 운반체는 투여법(예를 들어, 정맥, 경구, 국소 또는 비경구)에 바람직한 제제의 형태에 따라 매우 다양한 제형을 가질 수 있다. 경구 투여 제형으로 분자를 제조하는 데에는, 통상의 약제학적 매체, 예를 들어 경구용 액상 제제(예를 들어, 현탁액, 엘릭시르제 및 용액)인 경우 물, 글리콜, 오일, 알코올, 향미제, 보존제, 착색제 등; 경구용 고형 제제(예를 들어, 분말, 캡슐 및 정제)인 경우 운반체, 예를 들어 전분, 당, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 분해제 등이 이용될 수 있다. 투여의 편리성 때문에, 정제 및 캡슐은 고형의 약제학적 운반체가 확실히 사용되는 유리한 경구 투여 단위 형태를 대표한다. 바람직한 경우, 정제는 표준 기술에 의해 당으로 코팅되거나 장용성 코팅될 수 있다. 비경구용의 경우, 운반체는 통상 멸균수를 포함하지만, 예를 들어 용해성을 돕거나 보존 목적을 위해 다른 성분이 포함될 수 있다. 또한, 주사현탁액도 제조될 수 있는데, 이 경우 적절한 액형 운반체, 현탁화제 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 제제는 투여의 편리성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제조될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 투여 단위 형태는 치료를 받는 환자에게 적합하게 물리적으로 분리된 약제학적 제제를 지칭한다. 각 투여는 선택된 약제학적 운반체와 함께 바람직한 효과를 내도록 계산된 양의 활성 성분을 포함해야만 한다. 적합한 투여 단위를 결정하는 과정은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 투여 단위는 환자의 체중에 따라 비례적으로 증가되거나 감소될 수 있다. 특정 병리 상태를 완화시키는 적합한 농도는 당업계에 공지된 바와 같이 투여 농도 곡선 계산법으로 결정될 수 있다. 본 발명의 분자를 투여하기 위한 적절한 투여 단위는 동물 모델에서 분자의 독성을 평가함으로써 결정될 수 있다. 다양한 농도의 약제학 제제를 인간 종양이 이식된 마우스에 투여할 수 있으며, 최소 및 최대 투여량은 종양 크기의 유의한 감소 및 치료 결과로서의 부작용에 기초하여 결정될 수 있다. 또한, 적절한 투여 단위는 다른 표준 화합치료법과 조합하여 치료 효능을 평가함으로써 결정될 수 있다. 분자의 투여 단위는 종양의 커진 수축률 및/또는 감소된 성장률에 따라 개별적으로 또는 각 화학치료법과 조합하여 결정될 수 있다.
본 발명을 포함하는 약제학적 제제는 병리학적 증상이 감소되거나 완화될 때까지 적절한 간격, 예를 들어 1일 2회 이상 투여 될 수 있으며, 그 이후에 투여량을 유지 수준으로 감소시킬 수 있다. 특정한 경우에 적절한 간격은 보통은 환자의 상태에 따른다.
본 발명의 또다른 측면에 따르면, 암이 본 발명의 CD19-PI3K 억제제에 민감한지를 결정하기 위한 방법이 제공된다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 세포(피험체로부터 얻은 암세포 또는 B-세포(예를 들어, 피험체로부터 얻은 생물학적 시료의 일부분으로서)) 내 Myc의 기능 획득 변이(예를 들어,아미노산 트레오닌 58)의 존재를 결정하는 단계를 포함하며, 상기에서 Myc의 기능 획득 변이의 존재는 세포가 PI3K 억제제 및 CD19-PI3K 억제제에 내성을 가진다는 것을 나타낸다. 또다른 실시예에서, 상기 방법은 세포 내 Pax5의 기능 상실 변이의 존재(예를 들어, 문헌[Mullighan et al. (2007) Nature 446:758-761])를 결정하는 단계를 포함하며, 상기에서 Pax5의 기능상실 변이는 세포가 PI3K 억제제 및 CD19-PI3K 억제제에 내성을 가진다는 것을 나타낸다. 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 세포 내 CD19의 수준을 결정하는 단계를 포함하며, 상기에서 야생형 또는 정상 B-세포에 비해 CD19의 수준이 증가했다는 것은 세포가 CD19-PI3K 억제제에 내성을 가진다는것을 나타낸다.
정의
다음 정의는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공한다.
단수 형태는 문맥에 명백하게 지시되어 있지 않는 경우 복수 지시대상물을 포함한다.
"약제학적으로 허용가능한"은 동물, 보다 상세하게 인간에 사용을 목적으로연방 정부 또는 주 정부의 관리 기관의 승인을 받았다거나, 미국 약전, 또는 그밖에 통상적으로 인정되어지는 약전에 열거된 것을 나타낸다.
"운반체"는 본 발명의 활성제제와 함께 투여되는 희석제, 보강제, 보존제(예를 들어, 티머졸, 벤질알콜), 항산화제(예를 들어,아스코르브산, 소디움 메타비설제파이트), 가용화제(예를 들어, TWEEN® 80, 폴리소르베이트 80), 유화제, 완충제(예를 들어, Tris-HCl, 아세테이트, 포스페이트), 항균제, 증량제(예를 들어, 락토오스, 만니톨), 부형제, 보조제 또는 비히클을 지칭한다. 약제학적으로 허용가능한 운반체는 물 및 오일과 같은 멸균액일 수 있으며, 이들은 석유, 동물, 식물 또는 합성 유래된 것을 포함한다. 물 또는 식염수, 및 덱스트로스 및 글리세롤 수용액이 운반체, 특히 주사액으로 바람직하게 사용된다. 적합한 약제학적 운반체는 문헌[Remington:The Science and Practice, 21st Edition,(Lippincott, Williams and Wilkins; 2005)]; [Liberman, et al., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980]; 및 [Rowe, et al., Eds., Handbook of Pharmaceutical Excipients (6th Ed.), Pharmaceutical Pr, 2009])에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료"는 질병을 앓고 있는 환자에게 이익을 주는 임의 형태의 처치를 지칭하며, 환자의 상태(예를 들어, 하나 이상의 증상이 있는)를 호전시키고, 상태의 진행을 지연시키는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "예방하다"는 질환(예를 들어, 암)에 걸릴 위험에 있는 피험체를 예방적으로 처치하여 피험자가 질환을 진전시킬 가능성을 감소시키는 것을 지칭한다.
화합물 또는 약제학적 조성물 "치료적 유효량"은 특히 질환 또는 질병 및/또는 그의 증상을 예방, 억제 또는 치료하는데 유효한 양을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "피험체"는 동물, 특히 포유류, 특히 인간을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "소분자"는 비교적 낮은 분자량의 물질 또는 화합물(예를 들어, 4000 미만, 특히 2000 미만)을 지칭한다. 전형적으로, 소분자는 단백질이 아닌 유기 폴리펩티드 또는 핵산이지만, 아미노산, 디펩티드일 수 있다.
"항체" 또는 "항체 분자"는 특이적 항원에 결합하는 항체 및 그의 단편을 포함하는 임의의 면역글로불린이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 항체 또는 항체 분자는 완전(intact) 면역글로불린 분자, 면역글로불린의 면역적 활성 부분 및 면역글로불린 분자의 면역적 활성 부분의 융합체를 고려한다. 용어는 다중클론, 단일클론, 키메라, 단일 도메인(Dab) 및 이중특이성 항체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 항체 또는 항체 분자는 재조합 생성된 완전 면역글로불린 분자 및 면역글루불린의 면역적 활성 부분, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, F(v), scFv, scFv2, scFv-Fc, 미니바디, 다이아바디, 테트라바디, 및 단일 가변 도메인 (예를 들어, 중쇄 가변 도메인, 경쇄 가변 도메인)을 포함하는 분자를 비제한적으로 고려한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역학적으로 특이적인"은 단백질 또는 관심 화합물의 하나 이상의 에피토프에 결합하지만, 혼합된 생물학적 항원 분자를 함유하는 시료 내 다른 분자를 실질적으로 인지하고 못하고 결합하지 못하는 단백질/폴리펩티드, 특히 항체를 지칭한다.
용어 "작은 간섭 RNA(siRNA)"는 짧은 이중가닥 RNA 분자(전형적으로, 30개 미만, 특히 12 내지 30 또는 20 내지 25개 길이의 뉴클레오티드)이다. 전형적으로, siRNA는 siRNA의 표적이 되는 유전자 발현을 조절한다. siRNA 분자를 확인하고 합성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어 문헌[Ausubel et al. (2006) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc] 참조). 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 siRNA는 짧은 헤어핀 RNA 분자 (shRNA)를 포함한다. 전형적으로, shRNA 분자는 작은 고리 서열에 의해 분리되어진 상보적인 짧은 서열로 구성되어 있어 있으며, 상기의 서열 중 하나는 유전자 표적에 상보적이다. shRNA 분자는 전형적으로 세포 내 엔도뉴클레아제에 의해 siRNA로 프로세스된다(processed). siRNA 분자로의 예시적인 변형(modification)은 미국 특허 출원 공개 번호 20050032733에 제공된다. siRNA 발현을 위한 발현 벡터는 바람직하게는 구성적이거나 조절될 수 있는 강한 프로모터를 이용한다. 이러한 프로모터는 당업계에 잘 알려져 있으며, RNA 폴리머라제 II 프로모터, T7 RNA 폴리머라제 프로모터, 및 RNA 폴리머라제 III 프로모터 U6 및 H1 (예를 들어, 문헌[Myslinski et al. (2001) Nucl. Acids Res., 29:2502 09] 참조)을 포함하나 이에 한정된 것은 아니다.
"안티센스 핵산 분자" 또는 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 선택된 서열 (예를 들어, 번역 개시 부위 및/또는 슬라이스 부위)에 표적화되어(상보적) 관심 단백질의 발현을 억제하는 핵산 분자(예를 들어, 단일가닥 분자)를 포함한다. 상기 안티센스 분자는 전형적으로 약 15 내지 약 50 뉴클레오티드, 보다 구체적으로 약 15 내지 약 30 뉴클레오티드 길이이며, 흔히 mRNA 번역 개시 부위를 포함한다. 안티센스 구조물은 표적 핵산 분자의 전체 서열을 역방향으로 포함하도록 만들어질 수 있다. 공지된 임의의 뉴클레오티드 서열에 표적화되는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표준 방법에 따라 올리고뉴클레오티드 합성법으로 제조될 수 있다.
용어 "고형 지지체"는 임의의 칩(예를 들어, 실리카계, 유리, 또는 골드 칩), 유리 슬라이드, 막, 플레이트, 비드, 고형입자(예를 들어, 아가로스, 세파로스, 폴리스티렌 또는 마그네틱 비드), 컬럼(또는 컬럼 물질), 시험관, 또는 마이크로티터 디쉬를 비제한적으로 포함하는 임의의 고체 표면을 지칭한다.
다음 실시예는 본 발명을 수행하는 예시적인 방법을 제공하며, 어떤 경우에도 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예 1
재료 및 방법
세포 배양 및 PI3K 억제제 처리
Myc5 및 Myc5-M5 마우스 B-림프종 세포는 문헌[Cozma et al. (2007) J. Clin. Inv., 117:2602-2610]; [Yu et al. (2003) Blood 101:1950-1955]; [Johnson et al. (2004) Nat. Immunol., 5:853-861]; [Chung et al. (2008) Cancer Biol. Ther., 7:1758-1764])에 기재되어 있는 바와 같이 배양하였다. 인간 B-림프아구성 세포주 P493-6는 합성 tetO7-TP 프로모터에 의해 c-Myc5가 전사되는 유도가능한 c-Myc 억제 시스템을 가지고 있다(문헌[Pajic et al. (2000) Int. J. Cancer 87:787-793)]. 이들 세포는 10% 열불활성화된 tet-free FBS(Clonetech사), 100 U/mL 페니실린, 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신(Gibco사)이 보충된 RPMI-1640(Bio Wittaker사)에서 배양하였다. 독시사이클린 첨가시 P493-6내 cMyc 발현이 억제되었다. 일부 실험에서는, P493-6 세포를 10 μM 농도의 PI3K 억제제 LY294002(#9901; Cell Sinaling사)로 처리하였다.
1차 B 세포 배양
전체 비장은 8 내지 12 주령의 C57BL/6 암컷 마우스에서 얻어 1 ml 시린지의 끝이 둥근 플런저로 부드럽게 간 후 70 마이크론 세포 여과기에 세포를 통과시켰다. 비장세포의 적혈구 세포를 적혈구 용해 완충액(Sigma사)으로 실온(RT)에서 2 분간 용해시켰다. 이어서 세포 수를 측정하고, 50 μM β-ME 보충 완전 RPMI 배지에 1×106세포/㎖로 접종하였다. 37℃, 5% CO2로 세팅된 배양기에서 2시간 동안 배양한 후 부유 세포를 회수하였다. 이들을 1:1000 희석율로 사용되는 LPS(저장용액 농도 10 ㎍/ml) 보충된 상기 배지에 1×106 세포/㎖로 접종하였다. 비장세포는 LPS에서 3일동안 배양하였다. 배지 및 LPS는 매일 보충하였고, 세포 수를 매일 측정하여 성장을 확인하였다. 3일째, 세포는 유세포분석법으로 측정한 결과 >90% CD19+B220+ 이었다. 8 내주 12 주령의 WT 또는 CD19 녹아웃(knockout) 암컷 마우스(C57BL/6 background; Rickert et al. (1995) Nature 376:352-355)의 골수는 대퇴골 및 경골을 완전 DMEM로 씻어내어 얻었다. 골수 적혈구를 적혈구 용해 완충액(Sigma사)으로 실온에서 2 분간 용해시켰다. 이어서 세포를 계수하고, IL-7 함유 MethoCultTM 배지에 0.5 x 106 세포/35mm 디쉬(dish)로 접종하였다. 9 일째, 세포는 유세포분석으로 측정한 결과 >90% CD19+B220+이었다. 유세포분석에 사용된 BD Pharmingen 항체는 PE 랫트 항-마우스 CD19(cat# 557399;), FITC 랫트 항-마우스 CD45R/B220(cat# 553088) 였다. 대조군 항체는 FITC 랫트 IgGa (cat# 553929) 및 PE rat IgGa (cat# 553930)를 포함한다.
레트로바이러스 생산 및 형질도입
Myc 세포 내에서 Pax5 또는 CD19를 과다발현하기 위해서, 세포를 레트로바이러스 구조물 Pax5-MIGR1(문헌[Cozma et al. (2007) J. Clin. Inv., 117:2602-2610]; [Yu et al. (2003) Blood 101:1950-1955]) 또는 CD19-pMx-ires-GFP(문헌[Dr. Tomohiro Kurosaki at RIKEN Research Institute, Yokohama, Japan])로 형질도입하였다. 공벡터로 형질도입된 것을 대조군으로 사용하였다. Myc5 세포 내 ITAM 매개된 신호전달의 영향을 설명하기 위하여, 세포를 WT 또는 변이형 ITAM을 코딩하는 레트로바이러스 MIGR1로 형질도입하였으며, 상기 변이형은 2개의 티로신Yxx(L/I)x6-8Yxx(L/I)이 모두 알라딘으로 대체되어 있었다. ITAM 구조물은 제넨테크(Genentech (San Francisco, CA))사 제품이었다. 형질도입된 세포는 형질도입 후 24시간에 GFP 발현을 분석하여 형질감염율을 결정하였다. 형질도입된 세포는 GFP 발현에 기반한 동일한 게이트를 이용하여 GFP 발현에 따라 분리하고, 단백질 분석을 위해 수거하였다. 구성적으로 활성인 형태의 AKT를 과다 발현하기 위해 HA 태그된 미리스톨레이티드 ATK1 또는 ATK2 를 코딩하는 레트로바이러스 구조물, pLNCX1을 Myc5 세포로 형질도입하였다(Dr. Morris Bimbaum, University of Pennsylvania Philadelphia PA). 형질도입된 세포를 2 주간 G418(Sigma사)로 선별하고, 레트로바이러스 구조물의 과다 발현은 HA 발현에 대해 웨스턴 블로팅하여 분석하고, 마우스 PTEN의 cDNA, WT 인간 Myc 및 T58A Myc 변이체 (Dr. Michael Cole, Dartmouth Medical School, Hanover, NH)는 레트로바이러스 벡터 MSCV-ires-NGFR에 클로닝하였다. 형질감염율은 이소형 대조군 항체 PE 마우스 IgG1(555749; BD PharmingenTM 또는 PE 마우스 항-인간 CD271/NGFR(560927; BD PharmingenTM)로 유세포분석법으로 결정하여 세포 표면의 NGFR의 발현을 확인하였다. 모든 레트로 바이러스는 LipofectamineTM 2000(Invitrogen사)로 GP293 세포로 형질감염하여 만들었다. 감염은 폴리브렌(4 ㎍/ml) 존재 하에서 30시간 과정으로 실행하였다.
웨스턴블로팅과 면역침전법
문헌[Chung et al. (2008) Cancer Biol. Ther., 7:1758-1764]에 기재된 바와 같이, 전체 세포 용해물을 제조하고 웨스턴 블로팅을 실시하였다. Pax5에 대한 항체는 미카엘 엘. 아치슨 박사(Dr. Michael L. Atchison, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA)로부터 얻었다. 본 연구에 사용된 다른 1차 항체에는 항-CD19 (#3574; Cell Sinaling사), 항-PAN AKT(#4691; Cell Sinaling사), 항-포스포-AKT (ser473; #4060; Cell Sinaling사), 항-Total GSK3β(#9315; Cell Sinaling사), 항-포스포-GSK3β(ser9, #9336; Cell Signaling사), P493 및 Myc5 세포에서 레트로바러스 c-Myc를 확인하기 위한 항-Total c-Myc(OP-10; Calbiochem사), 비장 B 및 골수 유래 B 세포에서 c-Myc을 확인하기 위한 항-Total c-Myc(#5605; Cell Sinaling사), 항-p-c-Myc Thr58 (A00242; Genscript사), 항-p-c-Myc Ser62(ab78318; abcam사), 항-Total Lyn (#2732; Cell Sinaling사), 항-포스포-Lyn(tyr396; ab40660; Abcam사), 토끼 항-HA 클론(Cat#H6908; Sigma사), 항-CD22 (sc-7932; Santa Cruz사), 및 항-β-액틴(A3853; Sigma사)을 포함한다. 면역침전법을 위해, HA-태그된 WT 또는 변이형 ITAM 형질도입된 Myc5 세포는 차가운 PBS로 1회 세척하여 회수 한 후 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 차가운 수동 용해 완충액으로 용해시켰다. HA 태그된 ITAM은 마우스 단일클론 항 HA 클론 12CA5(Cat# 11583 816 001; Roche사)를 1:1000 희석하여, 세포와 수동 완충액 비율이 1×106 세포/ml인 각 시료의 동일한 수의 세포로 부터 면역침전하였다. 항체 인큐베이션은 4oC에서 14 내지 18시간 수행하고 단백질-A 비즈(Invitrogen사)로 면역침전하고 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 차가운 수동 용해 완충액으로 세척하였다.
시클로 헥시미드 실험
PAX5 또는 CD19 레트로바이러스 구조물로 안정적으로 형질도입된 Myc5를 50 ml 코니칼 튜브에 1 x 106/ml로 접종하고 시클로헥시미드(Sigma사)를 1㎍/ml 농도로 처리하는 한편, 95% 에탄올(sigma사)로 자극시켜 대조군으로 사용하였다. 세포는 0, 7.5, 15, 및 30 분 동안 자극하고, 1700rpm에서 1분간 회전시킨 후 단백질 용해 완충액(Bio-rad사)로 즉시 용해시켰다. 단백질 시료를 웨스턴 블롯 분석을 위해 10% SDS-PAGE 상에서 분리하였다. c-Myc 단백질 수준은 ImageJ 1.43 (National Institutes of Health)를 사용하여 농도측정법에 정량하였으며, β-액틴으로 정규화된 정량화값을 사용하였다.
펄스 추적(Pulse Chase) 실험
PAX5 또는 CD19 레트로바이러스 구조물로 안정적으로 형질도입된 Myc5는 배양배지를 L-메티오닌 결여 RPMI로 대체하여 1시간 동안 메티오닌을 사전에 고갈시켰다. 세포는 0.2mCi/ml를 사용하는 35S-메티오닌으로 107세포/ml 농도에서 30분간 생체 내 표지하였다. 표지 후, 세포를 5mM L-메티오닌 함유 RPMI로 즉시 1회 세척한 후, 동일 배지에서 표시된 추적 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 회수하고 c-Myc 단백질을 면역침전하였다. 표지된 c-Myc은 자가방사선 촬영법(autoradiography)으로 가시화하고 포스포이미저(phosphorimager)로 정량하였다.
종양 부하 연구(tumor load stuies)
모든 동물 실험은 필라델피아 IACUC (Philadelphia Institutional Animal Care and Use Committee)의 아동 병원에서 검토하고 인정하였다(protocol number 2009-12-902).
생체 내 실험을 위해, 1.5 x 107 Myc5-M5 세포는 레트로바이러스 공벡터 pMx-ires-GFP 또는 CD19를 코딩하는 레트로바이러스 벡터로 안정적으로 형질도입되었다. 최고의 GFP+ 발현율로 분류된 형질도입 세포를 SCID 마우스(National Cancer Institute)에 피하주사 하였다. 종양 크기는 2일마다 캘리퍼로 측정하였고, 종양 질량은 종양 절제한 날에 기록하였다. 종양을 40mg 종양/용해 완충액 ml 비율로 용해시켜, 웨스턴 블롯을 위한 단백질 용해물을 종양으로부터 얻었다. Pax5ERTAM(+4OHT)를 코딩하는 레트로바이러스 또는 그의 대조군 벡터(+4OHT) 감염된 Myc5-M5 세포로부터 종양을 얻었으며(문헌[Cozma et al. (2007) J. Clin. Inv., 117:2602-2610)], 단백질 용해물은 웨스턴 블롯 분석을 위해 얻었다.
증식(proliferation) 분석법
시험관 내 형질도입된 Myc5-M5 CD19의 증식은 세포 증식 시약 WST-1 (Roche Molecular Biochemicals사)을 이용하여 측정하였다. 세포는 100㎕ 배양배지에 1 x 103/well 로 접종하고 총 72시간 동안 인큐에이션하였다. 증식 상태는 매 24시간마다 10㎕의 증식시약 WST-1와 4시간 동안 인큐베이팅하여 결정하였다. 처리 시료의 흡광도를 블랭크 대조군에 대하여 3차례 측정하였으며, SynergyTM 2 마이크론 리더(BioTek Instruments사)을 사용하여 440nM에서 측정하였다.
siRNA 녹다운(knock down) 실험
P493-6은 인간 Pax5 (L-012241-00; Dharmacon사), 인간 전체 GSK3β(L-003010-00; Dharmacon사) 또는 인간 CD19(sc-29968; Santa Cruz사)에 대한 이중가닥 ON-TARGET plusTM SMARTpool® siRNA로 처리하였다. 비표적 풀의 siRNA(D-001810-10)를 siRNA 실험의 음성 대조군(Dharmacon사)으로 사용하였다. Pax5, CD19 또는 GSK3β에 대한 4 가지 각각의 siRNA는 ON-TARGET 세트를 사용하였다. siRNA를 Amaxa®Nucleofactor® 제조사(Lonza AG사)의 지시에 따라 P493-6 세포에 전기천공하였다. siRNA 운반 효율은 비특이성 이중 가닥 BLOCK-iTTM 형광 올리고(#2013; Invitrogen사)로 확인하였다. 사일런싱 효과는 웨스턴블로팅으로 확인하였다. CD19 레트로바이러스 구조물 또는 대조군 벡터로 안정적으로 형질도입된 Myc5는 10nM의 대조군 또는 항-인간 Myc siRNA(L-003282; Dharmacon사)로 전기천공하였다. 세포는 천공 후 24시간에 회수하여 세포 성장을 확인하였다.
실시간 q-PCR
실시간 q-PCR을 Applied Biosystems® 7500 시스템으로 수행하였다. 마우스 Myc5_M5 유래 종양 내 증폭에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다: CDK4 센스 5'caatgttgtacggctgatgg-3'(서열 번호 1); CDK4 안티센스 5'-caggccgcttagaaactgac-3'(서열 번호 2); ODC1 센스 5'-gtggcaactcatgaagcaga-3'(서열 번호 3); ODC1 안티센스 5'-tgcaggcaagagctacaaga-3'(서열 번호 4); LDHA 센스 5'-tccgttacctgatgggagag-3'(서열 번호 5); LDHA 안티센스 5'-gtaggcactgtccaccacct-3'(서열 번호 6).
세포 및 종양 성장의 통계학적 분석
세포 증식 연구는 3회 실시하였다. CD19 종양 연구는 그룹당 5마리의 마우스로 실시하였다. 통계학적 유의성은 단측 언페어드 스튜던트 t-검정(one-tailed unpaired Student's t-test)으로 평가하였다.
유전자 집합 농축도 분석 (GSEA: Gene Set Enrichment Analyses) 및 생존 분석
험멜 및 렌츠 연구 자료를 각각 GEO 고유 접근 번호(accession numbers) GSE4475 및 GSE10846를 사용하여 Gene Expression Omnibus gateway (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)로부터 다운로드 받았다. 험멜 연구의 환자들을 우선 Ig-MYC 전위-양성 및 전위-음성으로 분류하였다. 전위-음성 신생물을 CD19 high, intermediate 또는 low로 더 분류하였다. 유전자 집합 농축도 분석은 CD19HIGH 및 CD19LOW 종양의 발현 자료를 비교하여 수행하였다. 렌츠 및 험멜의 연구는 유사한 의도를 가지며, 조합될 있기때문에, 두 연구의 자료는 또한 환자 생존에 대한 CD19 및 MYC의 발현 효과를 평가하는 데 사용되었다. 수집된 자료를 이용하여, CD19 및 MYC의 정규화된 값의 삼분위를 계산하고 환자를 세 그룹, CD19 (또는 MYC) low, CD19 (또는 MYC) intermediate, 및 CD19 (또는 MYC) high로 분류하였다. CD19 (또는 MYC) high 그룹 및 CD19 (또는 MYC) low 그룹의 카플란-마이어(KM) 곡선을 비교하였다.
통계 개요
생존 분석을 위해, 층화 로그 순위 검정(stratified log-rank test)을 실시하고, 연구 수에 대한 CD19 층화 효과를 검증하였다(문헌[Kalbfleisch et al. (2002). The statistical analysis of failure time data. John Wiley & Sons, Inc. New York]) 두 연구에서의 가능한 차이점을 설명하였다. 양측의 P 값 <0.05은 통계학적으로 유의하며 SAS 9.2을사용하여 분석을 수행하였다. GSEA 경우, FDR q-값 <0.25과 조합하여 공칭(nominal) P 값 <0.05는 통계적으로 유의하다고 간주하였다.
결과
Pax5는 c-Myc 단백질 수준을 유지한다.
우선, Myc 발현 정지가 Pax5 단백질 수준을 감소시키는지를 결정하였다. P493-6 세포를 독시클린(Dox)으로 2 내지 12시간 처리하였다. 웨스턴 블로팅에 의해 판단해보면, Dox 처리 후 2시간에 Myc 단백질 수준이 급격히 떨어졌지만 Pax5 수준에는 주목할 만한 변화가 없었다(도 1A, 왼쪽 패널)). Dox (24 내지 48시간)에 노출시간을 연장시키더라도 Pax5 발현은 영향받지 않았다(도 1A, 오른쪽 패널). Pax5 발현에 있어서 변화가 Myc 단백질 수준에 영향을 주는지를 확인하기 위해, Pax5 코딩 레트로바이러스 벡터(MIGR1)를 사용하여 MYC5에서 Pax5 발현을 복구시켰다. 세포 용해물을 감염 후 24 및 28시간에 회수하여 웨스턴 블로팅으로 분석하였다. 두가지 시점에서 모두 Myc 수준이 명백히 증가함이 관찰되었다(도 1B). Myc 수준이 생체 내에서 Pax5에 의해 유도되는 지 확인하기 위해서, 조건부 활성인 Pax5-에스트로겐 수용체(ER) 융합체로 재구성된 Myc5 종양을 분석하였다(문헌[Cozma et al. (2007) J. Clin. Inv., 117:2602-2610]). Pax5 활성을 확실히 하기 위해, 모든 종양을 보유하는 마우스를 ER 리간드 4-히드록시타녹시펜(4-OHT)으로 처리하였다. 이들 시료에서도, Myc 및 Pax5ER 수준 사이에 강한 양성적 상호관계가 있었다(도 1C). 반면, CD22 수준은 Pax5에 의해 하향 조절되었다.
기능 상실 연구를 이용하여 다른 세포 시스템에서도 상기 결과를 재현하기 위하여, P493-6 세포 내 Pax5를 siRNA로 녹다운하였다. 형질감염 조건을 최적화하기 위해, FITC-표지된 이중가닥 RNA 이중체를 P493-6 세포로 각각 전기천공하고, 유세포분석을 실시하여 siRNA 운반율을 결정하였다. 0.1μM 및 1 μM에서, 형질감염율은 62 내지 96% 사이였다(도 2A). 이어서 증가하는 양의 α-Pax5 SMARTpool®siRNA (10nM, 0.1μM 및 1μM)를 P493-6 세포에 형질도입하고, 웨스턴 블로팅 분석을 위해 전기천공 후 24시간에 단백질 용해물을 회수하였다. Pax5 단백질 수준이 서열특이적, 투여량 의존적으로 감소한다는 것을 확인하였으며, 이는 직접적인 Pax5의 표적인 CD19에서 1μM에서 달성된 두 단백질의 최대 억제에 상응하는 감소를 가져왔다(도 2B). 또한, 부정확한 효과를 배제하기 위해 Smartpool®을 포함하는 4가지 특성의 siRNA를 분석하였다. 예상했던 바와 같이 4가지 중 3가지의 siRNA가 Pax5 발현을 억제하였고, 3가지 모두 Myc 수준에도 재현가능한 감소를 가져왔다(도 1D). 다음으로, 세포를 1 μM의 α-Pax5 siRNA로 처리하고, 전기천공 후 24시간 및 48시간에 Myc 수준을 측정하였다. 24시간에는 Myc 수준에서 변화가 나타나지 않았지만, 48시간에는 크게 감소하였다(도 1E). 이것은 아마도 Pax5 표적에 의해 매개되어지는 간접적인 조절기전을 나타낸다.
D19는 c-Myc 단백질 안정성을 증가시키나 B-세포 수용체 신호전달은 증가시키지 못한다.
Pax5가 존재하지 않는 경우, Myc5 세포는 Pax5 표적 유전자, 가장 현저하게는 CD79a (Ig-α)를 발현하지 못한다. 그러나, 이것은 Pax5 재발현 시 강하게 유도되어지고(문헌[Cozma et al. (2007) J. Clin. Inv., 117:2602-2610]) 구성적으로 발현되는 CD79b (Ig-β)와 복합체를 형성하여 그들의 ITAM 모티프를 인산화하고 BCR 신호전달을 일으킨다. 이러한 일련의 사건이 Myc 수준을 증가시킨다는 것을 확인하기 위하여, 구성적으로 활성 또는 변이 배열인 HA-태그된 ITAM을 코딩하는 MIGR1 레트로바이러스로 형질도입된 Myc5를 사용하였으며, 상기로신이 알라닌으로 대체되어 있다(문헌[Grande et al. (2006) Oncogene 25:2748-2757]). 감염률은 유세포분석으로 결정하였으며 형질도입된 세포는 >97% GFP+임이 확인되었다. MYC5-ITAMwt 및 MYC5-ITAMmut 세포의 단백질 용해물은 우선 마우스 항-HA 항체로 면역침전하였다. 이어서, 면역침전물을 B 세포 내 Ig-α의 ITAM에 특이적으로 결합하는 Src 패밀리 키나제 Lyn에 대해 면역블로팅하였다(문헌[Clark et al. (1992) Science 258:123-126]). 토끼 항-HA 항체-반응성의 ITAM을 로딩 콘 변이는 두개의 티 트롤로 사용하였다. 예상한 바와 같이 야생형 ITAM의 과다발현은 부모 및 ITAMmut-형질도입된 세포에 비해 Lyn 결합을 증가시켰다(도 3A, 위 패널). 추가적으로, Tyr396 인산화에 의해 활성화된 ITAM 결합된 Lyn의 양은 ITAMwt 세포에서도 증가되었다. 중요한 것은, ITAMmut가 약간의 포스포-Lyn 동원을 유도하지만 ITAMwt에 의한 Lyn 동원만큼 강하지는 않았다는 것이고, 이것은 ITAM 구조물의 기능성을 입증해준다(도 3A,중간 패널). 여전히, Myc 단백질 수준에는 변화가 없었으며(도 3A, 아래 패널), 이것은 BCR 경로의 중요한 구성성분인 ITAM 활성화가 Myc 단백질 발현을 촉진하기에 불충분하다는 것을 나타낸다.
Pax5의 또다른 주요 표적은 CD19 이다(문헌[Nutt et al. (1998) EMBO J 17:2319-2333]; [Kozmik et al. (1992) Mol. Cell Biol., 12:2662-2672). CD19는 BCR의 관련 경로 내에서 기능을 하지만, BCR 비의존적 기능, 예를 들면 Myc 조절 기능을 가질 수도 있다. 따라서, Ig-α음성 Myc5 세포는 CD19 레트로바이러스로 형질도입하고 정상 상태의 Myc 수준을 측정하였다. 놀랍게도, Myc 발현은 여러배 증가되었다(도 3B). 기능손실 접근법을 이용하여 다른 세포 시스템에서 상기 결과를 재현하기위해, CD19를 SMARTpool®siRNA를 이용하여 P492-6 세포에서 녹다운 시켰다. 단지 CD19의 부분적인 녹다운에도, Myc 수준은 현저히 지속적으로 감소되는 반면, Pax5 수준은 영향받지 않았다(도 2C). 또한, SMARTpool®을 포함하는 각각의 siRNA를 분석하였다. CD19의 대부분의 강한 하향 조절에 역할을 하는 올리고펩티드는 서열 특이적이고 용량 의존적인 방식으로 Myc을 하향조절하였다(도 3C). 마지막으로, CD19 결핍 마우스의 골수 유래 B 세포 내 Myc 수준을 측정하였다(문헌[Rickert et al. (1995) Nature 376:352-355]). 상기 목적으로, 1차 B 세포의 단기 배양을 확립하였다. 이들 배양에서 B220에 의해 양성적으로 확인된 것과 같이, 95%를 초과하는 세포가 B-세포 계통이었다(도 4A). 다시 한번, CD19 결핍 B-세포는 CD19 풍부 B-세포보다 낮은 수준의 Myc을 함유하였다(도 3D). 중요한 것은, 시험된 3가지 모델 (MYC5, P493-6, 및 마우스 1차 B-세포)에서, Myc 발현은 3가지 상이한 조절 인자(각각, 레트로바이러스 LTR, CMV IE 부위, 및 내재 myc 유전자 프로모터)에 의해 주도되었다. 따라서, CD19 사이런싱시 Myc이 균일하게 하향 조절된다는 것은 프로모터 비의존적, 전사후 조절임을 나타내었다.
Myc 단백질 반감기를 부모 Myc 세포 vs Pax5- 및 CD19-형질도입된 Myc5 세포에서 측정하였다. 본 실험을 위해, CD19-양성 세포는 추가적으로 CD19low 및 CD19high 부분모집단으로 분획화하였다. 본 배양에서 CD19 과다발현의 수준은 Pax5 주도된 발현 수준과 비교하여 각각 2.5 배 및 4.0 배였다(도 3E의 평균 형광도 참조). 이들 계산값은 웨스턴 블로팅으로 확인되었다. 그렇지만, Myc 수준은 CD19low 와 CD19high 배양사이에 비교할 만하며, 이것은 4 배의 CD19 과다발현은 Myc 활성화에 요구되지 않는다는 것을 나타낸다(도 3F).
이어서, Pax5- 및 CD19-재구성된 세포주를 단백질 합성 억제제 시클로헥시미드(문헌[CHX; Schneider-Poetsch et al. (2010) Nat. Chem. Biol., 6:209-217)]로 처리하고 정상 상태의 Myc 수준은 웨스턴 블로팅으로 측정하였다. 30분 과정에 걸친 CHX 처리로 레트로바이러스 형질도입된 Pax5 또는 CD19 단백질 발현에 눈에 띌만한 효과를 보이지는 않았지만, Myc 수준은 명백하게 하향 조절되었다(도 3G). 그러나, 벡터로 형질도입된 Myc5 세포 내 Myc 반감기는 ~17분이었지만 Pax5 또는 CD19로 형질도입된 세포에서 Myc 반감기는 각각 ~90 및 ~40 분으로 강하게 증가하였다(도 3G, 아래 패널).
시클로헤시미드 처리는 mRNA 안정성 또는 단백질 번역에서의 변화를 통해 간접적으로 유전자 발현을 억제할 가능성을 갖는다. 따라서, Myc의 반감기는 펄스 표지 후 추적 및 방사선면역침전법을 이용하여 측정하였다. CHX 실험 결과에 완전히 일관되게, 부모 세포에서는 추적 30분 후에 Myc은 거의 검출할 수 없었지만 Pax5 또는 CD19의 존재 하에서 강하게 안정화되었다(도 3H). 따라서, 이들 두 단백질은 실제로 Myc 단백질 수준의 양성 전사후 조절인자이다.
BCR 비의존적 AKT 활성화는 CD19에 의한 Myc 유도에 필요 충분 요건이다.
CD19 신호전달의 공지된 기능 중 한 가지는 BCR 신호전달 과정 모두에서 PI3K의 동원 및 활성화, 및 뒤이어 일어나는 Akt의 활성화이다(문헌[Tuveson et al. (1993) Science 260:986-989]; [Buhl et al. (1999) J. Immunol., 162:4438-4446]; [Otero et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:1474-1478]; [Fujimoto et al. (2002) J. Immunol., 168:5465-5476]; [Aiba et al. (2008) Blood 111:1497-1503; Gold et al. (2000) Immunol. Rev., 176:47-68). Akt 활성화가 CD19에 의한 Myc의 안정화를 수반하는지를 결정하기 위해서, P493-6 세포를 항-CD19 siRNA로 전기천공하고 Akt 신호전달 구성성분의 발현수준을 측정하였다. 도 5A에서 보는 바와같이, CD19 녹다운은 Myc 단백질 수준뿐 아니라 Akt의 포스포세린-473 및 Akt 표적 GSK3β의 포스포세린-9 수준도 감소시켰다. 전체 Akt 및 GSK3β의 수준은 변하지 않았다. Akt 인산화가 Myc 안정화에 필수적인지를 결정하기 위해 P493-6 세포를 PI3K 억제제 LY294002로 처리하였다. LY294002 1시간 처리시 pAkt 및 pGSK3β 수준이 감소되었을 뿐 아니라 Myc 수준도 감소되었다(도 5B). Myc 수준이 상대적으로 크게 감소하지 않았기 때문에, 본 실험을 비장 B 세포에서 반복하고 흐름 세포분석법으로 순도를 분석하였다(도 4B). 매우 낮은 수준의 pAkt 및 pGSK3 및 급격하게 하향 조절된 Myc에 의해 단기간 배양은 LY294002에 강하게 반응한다는 것이 증명되었다(도 5C).
Myc 유도에 있어 Akt의 역할을 추가적으로 밝히기 위하여, Myc5 세포를 구성적으로 활성인 Akt 1 및 2를 코딩하는 레트로바이러스로 형질도입하였다. 두 경우에, 특히 Akt-2로 형질도입된 세포에서, 억제성 GSK3β인산화 및 Myc 정상 상태 수준이 상응하여 증가된다는 것이 확인되었다(도 5D). Akt 표적이 된다는 것 외에도, GSK3β는 Ser-62이 이미 인산화되어 있는 경우 또다른 키나제에 의해 Thr-58을 인산화시킴으로 Myc 수준을 음성적으로 억제한다(문헌[Hann, S.R. (2006) Semin. Cancer Biol., 16:288-302]; [Sears, R.C. (2004) Cell Cycle 3:1133-1137]). 이것은 Myc 분해에 기여하는 Fbw7 유비키틴 리가아제의 결합을 가능하게 한다(문헌[Welcker et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci., 101:9085-9090). 따라서, 동일한 단백질 용해물을 Myc 잔기 Thr-58 및 Ser-62에 대한 항체로 탐지하였다. Thr-58 인산화는 Akt 발현 세포에서는 감소했지만, GSK3β 비의존적 Ser-62의 인산화는 증가하였다(문헌[Lutterbach et al. (1994) Mol. Cell Biol., 14:5510-5522]).
GSK3β가 Myc 단백질 수준을 조절하는지를 확인하기 위하여, 증가하는 농도의 항-GSK3βsiRNA(10 nM, 0.1μM 및 1 μM)를 P493-6 세포로 전기천공하였다. 도 5E의 자료에서 입증된 바와 같이 GSK3β 녹다운은 Myc을 강하게 상향조절하여 B 세포 내 Myc 단백질 생산을 조절하는 BI3K-Akt-GSK3β 경로의 중요한 역할을 증명하였다. SMARTpool®을 포함하는 각각의 siRNA에서 유사한 결과가 확인되었다(도 2D). 상기 발견을 추가적으로 입증하기 위하여 Myc 내의 GSK3β 공통 부위(consensus site)(Thr58Ala)를 변이시켜 효과를 분석하였다. 추가로, GFP- 및 Pax5-과다발현 MYC5 세포를 야생형 또는 T58A Myc 구조물로 형질도입하였다. Pax5는 내재 Myc 및 레트로바이러스에 의해 코딩되는 야생형 Myc의 발현 수준은 증가시켰으나 T58 A 변이체는 증가시키지 못하였다(도 5F).
마지막으로, Akt-GSK3β 축이 BCR 음성 세포 내 CD19에 의한 Myc의 활성화에 필요한지를 확인하였다. 대조군 벡터(MSCV-ires-NGFR)- 및 CD19-형질도입된 Myc5 세포는 BCR-충분한 B 세포에서와 같이 Akt의 인산화 및 GSK3β의 억제성 인산화를 활성화시키는데 동일한 증가를 보여주었다(도 5G, 왼쪽 두 컬럼). 이어서, PI3K 경로의 중요한 음성 조절인자인 PTEN을 과다발현하도록 조작된 세포에서 동일한 실험을 반복하였다. 예상했던 바와 같이, PTEN은 CD19에 의한 Akt 활성화를 완전히 제거하였으며, Myc 상향 조절도 억제하였다(도 5G, 오른쪽 두 컬럼). 이 것은 이들 두 현상 사이의 인과관계를 확립해주었다.
CD19-Myc 축은 시험관 내 및 생체 내에서 세포 증대를 촉진한다.
세포 분열에서 Myc이 중요한 역할을 하기 때문에, CD19가 Myc 의존적 방식으로 세포 성장을 촉진하는지를 확인하였다. 상기 목적을 위해, 부모 및 CD19 발현하는 Myc5 세포를 Myc에 대한 siRNA로 처리하여, 기저 및 CD19 유도된 Myc 수준을 낮추었다. 대조군 siRNA 존재 하에서보다 α-Myc siRNA 존재 하에서 CD19의 세포 성장에 대한 효과가 훨씬 작았다(도e 6A). 그러나, CD19가 존재 하에서는, 항-Myc siRNA는 Myc 수준을 감소시키는 데에는 대조군 세포에 비해 효과적이지 않았는데(도 6B), 이것은 결과의 해석을 복잡하게 만들었다. 따라서, Pax5-, CD19-, 및 Myc-형질도입된 MYC5 세포 성장률을 또한 비교하였다(각각, 도 3F에서 5F). Pax5-형질도입된 세포는 CD19 또는 Myc으로 형질도입된 세포에 비해 상당히 빠르게 성장하였는데(도 6C), 왜냐하면 아마도 CD19외에도 Pax5가 Igα 및 성장 촉진 BCR 신호전달을 재활성화시키기 때문이다(문헌[Cozma et al. (2007) J. Clin. Inv., 117:2602-2610]). 그러나, CD19- 및 Myc-형질도입된 세포는 대략 동일한 속도로 성장하였는데, 이는 CD19-유도된 증식이 Myc-비의존적 구성성분을 갖지 않는다는 것을 나타낸다(도 6C).
CD19가 생체 내 세포 성장을 촉진하는지를 확인하기 위해, 마우스에 감염시 Pax5 및 CD19를 재활성화시키지 않는 MYC5 M5 서브클론을 이용하였다(문헌[Cozma et al. (2007) J. Clin. Inv., 117:2602-2610]; [Yu et al. (2003) Blood 101:1950-1955). GFP에 따른 분류를 이용하여 부모 Myc5 세포에 기재된 바와 같이 CD19로 Myc5-M5를 재구성을 수행하였다(도 7A). MYC5-M5/CD19 세포는 유사 골수 계통을 유지하여 여전히 Mac1에 대해 양성이고 B220에 대해 음성이었다(도 7B). 그들은 또한 포스포-Akt 및 Myc을 강하게 상향 조절하였다.(도 6D). 세포 주기 진행에 역할을 하는 Myc 표적 유전자가 CD19-재구성된 세포에서 상향조절되는 지 확인하기 위하여, 3가지 중요한 Myc 활성화된 유전자, ODC1, LDHA 및 CDK4의 mRNA수준을 측정하였다(문헌[Bello-Fernandez et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., 90:7804-7808]; [Schuhmacher et al. (2001) Nucl. Acids Res., 29:397-406]; [Elkon et al. (2004) Nucl. Acids Res., 32:4955-4961]; [Hermeking et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci., 97:2229-2234]). 세 경우 모두에서 CD19-충분 vs. CD19-결핍 배양에서 mRNA 수준 상승이 확인되었다(도 6E). 또한, Myc에 의한 마이크로RNA의 광범위한 하향 조절은 신생물 성장에 기여한다는 것이 증명되었다(문헌[Chang et al. (2008) Nat. Genet., 40:43-50]). 따라서, CD19-음성 및 -재구성된 Myc5 세포 주내 Myc-억제되는 5가지 주요 마이크로RNA의 수준을 비교하였다. 검사한 5가지 성장-억제성 마이크로RNA(miR-16, miR-34a, miR-150, miR-195, 및 let-7e) 모두가 CD19-재구성된 세포에서 수준을 감소되었음이 확인 되었다(도 7C).
대조군 및 CD19-재구성된 MYC5-M5 세포를 면역손상된 마우스에 주입하였다. 생성된 종양에서 CD19-Myc 축의 구성 성분에 대해 분석하였다. 포스포-Akt 및 포스포-GSK3β의 수준 증가와 함께 Myc 수준이 증가된 반면(도 6F), 변이형 CD19를 발현하는 종양 세포는 Akt를 활성화시키지 못하고 Myc 단백질 발현도 상승조절하지 못하였다. 이것은 Myc-의존적 신생물 성장에 본 경로의 중요성을 강조한다. 중요한 것은, CD19-재구성된 세포가 대조군 GFP-유일 세포에 비해 상당히 빠르게 성장하고 결국은 상당히 큰 신생물을 형성했다는 것이다(도 6G). 이것은 CD19가 BCR이 아닌 PI3K의 의존적 방식으로 Myc 수준을 조절한다는 분자 모델을 이끌었다(도 8A).
마지막으로, CD19가 인간 B 림프종에서 Myc 기능에 기여하는지를 결정하였다. CD19 발현의 증가를 나타내는 종양은 Myc 표적의 발현을 차례로 증가시킨다는 가설을 세웠다. 상기 목적을 위해, 험멜 연구에서 프로파일된 수많은 종양 시료에 대응하는, 공개적으로 이용가능한 자료를 분석하였다(문헌[Hummel et al. (2006) N. Engl. J. Med., 354:2419-2430]). Thr-58 변이가 빈번하게 발생되는 버킷 림프종(문헌[Hoang et al. (1995) Mol Cell Biol., 15:4031-4042])의 케이스를 피하기 위해, Ig-MYC 전위가 없는 142 미만성 거대 B-세포 림프종에 중점을 두었다. 이렇게 걸러진 케이스를 이용하여, 환자 시료를 세 그룹(CD19 high, intermediate, 및 low)로 분류하고 유전자 집합 농축도 분석법(GSEA; 문헌[Subramanian et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci., 102:15545-15550])으로 CD19HIGH 와 CD19LOW 종양을 비교하였다. CD19HIGH 종양은 큐레이트된(curated) 유전자 세트 DANG_MYC_TARGETS_UP (문헌[Zeller et al. (2003) Genome Biol., 4:R69.1-R69.10])에 농축도를 보인다는 것이 확인되었다(도 8B). 상기 농축도는 정규화된 농축도 스코어 1.510677, p-값 <0.026476579, 및 FDR q-값 <0.17252263으로 매우 유의적이다. 중요하게도, 도 8C의 히트맵에서 증명된 바와 같이 농축된 세트는 잘 입증된 3가지 Myc 표적인 ODC1, CDK4, 및 LDHA를 포함하였다.
상기 분석은 CD19 발현과 Myc 표적의 발현을 강하게 연결시켜 주기때문에, CD19 와 Myc이 환자 생존에 유사한 영향을 줄 것이라고 가정하였다. 험멜의 분석 외에도 수많은 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL) 환자의 생존자료와 연관하여 mRNA 발현을 프로파일하였던 렌츠 연구가 포함되었다(문헌[Lenz et al. (2008) N. Engl. J. Med., 359:2313-2323]). 두가지 연구로부터 통계학적 이해를 얻어면서 각 개별 연구의 정확도를 유지하기 위해, 층화 로그 순위 검정법을 이용하여 전체 생존에 대한 유전자 발현 수준의 유의성을 결정하였다. 중요하게도, 정규화된 MYC 및 CD19 값의 분포와 두 연구의 KM 예상 곡선이 유사하였으며, 이는 두 연구를 결합하는 것이 적절함을 확인해 주는 것이다. 우선 MYC 수준이 환자 생존에 어떻게 영향을 주는 지 조사하였다. 각 연구에서, MYC의 발현값이 높은 환자에 비해 낮은 환자가 더 나은 생존율을 보였다(도 8D). 층화 로그 순위 검정법은 카이-스퀘어(chi-square) 값 15.17 및 p-값 <0.0001을 산출해 냈으며, 이것은 생존에 대한 MYC의 유의한 음성적 효과를 나타낸다. 이어서, CD19가 환자 생존에 영향을 주는 방법을 조사하였다. 가설을 입증하였더니, CD19 발현이 환자 생존에 MYC 발현과 유사한 영향을 주었다(도 8D 및 8E 비교). 다시, 층화 로그 순위 검정법(문헌[Kalbfleisch et al. (2002) The statistical analysis of failure time data. John Wiley & Sons, Inc. New York])은 카이-스퀘어 값 5.39 및 p-값 0.0203을 산출했으며, 이는 CD19 수준이 유의적 환자 생존에 유의적 음성 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 따라서,GSEA 및 생존 분석 모두 CD19가 인간 B-림프종에서 Myc 기능을 양성적으로 조절한다는 것을 보여준다.
실시예 2
B-세포의 대부분 형태에서 CD19는 B-세포 수용체 (BCR)의 공수용체로서 기능을 한다고 공지되어 있다. CD19와 BCR이 전체로서 림프종 환자 생존에 어떻게 영향을 주는지를 잘 이해하기 위하여, 공개되어 이용가능한 두 가지 데이타 세트를 이용하였다. 첫번째 연구에서는, 만성적으로 활성인 BCR 신호전달을 보이는 HBL-1 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL) 세포주 내에서 BCR 구성성분 cd79a를 짧은 헤어핀을 사용하여 녹다운하였다. mRNA 프로파일링으로부터, 녹다운 과정에서 발생하는 변화, "BCR 시그니쳐", 즉 기능성 BCR에 의존적으로 발현되는 유전자 세트를 확인하였다. 이어서, 420 인간 DLBCL 종양이 프로파일링된 두번째 자료를 이용하였다. BCR 시그니쳐 내 유전자의 평균 발현도에 기초한 BCR 시그니쳐 스코어를 각 종양에 부여하였다. DLBCL 환자들 중에서, 활성화된 B-세포 (ABC-) 서브형이 더 공격적인 이라고 생각되고, 환자 사망율은 배중심 B 세포 (GCB-) 서브형(및 덜 일반적인 암 종격 림프종)에서 확인된 것보다 상당히 높다. 상기 이유에서, 종양을 서브형 분류법에 근거하여 두 그룹으로 분리하였다. 고 BCR 시크니쳐 환자를 저 시그니쳐 환자와 비교하였을 때, 고 BCR 시그니쳐는 ABC-DLBCL 환자 생존에게 음성적으로 영향을 주었으나 GCB-DLBCL 환자에게는 그렇지 않았다(도 9A 및 9B). 이것은 ABC-DLBCL의 병리기전이 BCR 신호전달에 의존한다는 것을 의미한다. 따라서, BCR 표적하는 것은 치료의 유익성을 제공할 것이다.
miR-17~92 마이크로RNA 클러스터(문헌[Olive et al. (2010) Intl. J. Biochem. Cell Biol., 42:1348-54]; [Inomata et al. (2009) Blood 113:396-402])는 BCR 조절에 연관되어 있다. 그래서, miR-17~92와 BCR 신호전달 사이의 관계가 인간 B 림프종생성에 연관되어 있는지를 결정하였다. 상기 목적을 위해, BCR 메타유전자(metagene)를 miR-17~92 1차 전사체 mir17hg의 발현과 연관시켰다(도 9D). ABC-DLBCL에서 BCR 시그니쳐와 mir17hg 발현사이에 유의한 상관관계가 있었다(도 9D). 이어서, mir17hg 고발현 환자를 mir17hg 저발현 환자와 비교하였다(도 9E). 인간 및 마우스에서 종양유전자로 확인되었지만, mir17hg 고발현 단독으로 환자 생존을 유의하게 변화시키지 못하였다. ABC-DLBCL 환자 생존에 대한 miR-17~92와 BCR 신호전달 사이의 상호 작용을 더 분석하기 위하여, 환자를 다음과 같이 4 그룹으로 나누었다: 고 BCR 시그니쳐/고 MIR17HG, 고 BCR 시그니쳐/저 MIR17HG, 저 BCR 시그니쳐/고 MIR17HG, 및 저 BCR 시그니쳐/저 MIR17HG. mir17hg 발현이 낮을 때, 고수준의 BCR 신호전달(고 BCR 시그니쳐/저 MIR17HG)은 저수준의 BCR 신호전달(저 BCR 시그니쳐/저 MIR17HG) 환자에 비해 환자 생존에 영향을 주지 않는다(도 9G). 그러나, 놀랍게도, 고 BCR 시그니쳐/고 MIR17HG 환자 생존은 저 BCR 시그니쳐/고 MIR17HG 환자에 비해 상당히 감소된다(도 9F). mir17hg 그 자체가 사망률에 영향을 주지 않더라도(도 9E), BCR 신호전달이 환자 사망률에 주는 영향은 mir17hg 고발현에 의해 악화된다(도 9F 내지 9G 비교). 따라서, miR-17~92는 ABC-DLBCL 환자 생존에 음성적으로 영향을 주는 BCR 신호전달과 협조한다.
BCR 신호전달을 양성적으로 조절하기 위해서, miR-17~92 클러스터 멤버는 BCR 신호전달의 음성 조절인자를 표적으로 삼을 수 있으며 이들 표적은 B-세포 링커 프로테인(BLNK) 인산화의 상류에서 작용을 할 것이다. 3'UTR 내 miR-17~92 예상 결합부위를 이용하여 타겟스캔(TargetScan)(www.targetscan.org/)을 음성조절인자에 대해 조사하여, cd22 및 fcgr2b를 확인하였으며, 이들 모두 면역 수용체 억제 모티프(ITIM)를 코딩한다. 이어서, 상기 조절이 miR-17~92 클러스터 멤버에 의한 직접적인 표적화 또는 간접적인 효과의 결과인 것인지를 확인하였다. miR-19a 및 -18a이 cd22 및 fcgr2b 3'UTR (각각)에 직접 결합한다는 것을 탐지하기 위해, 이중 루시퍼라제 센서 분석법(dual luciferase sensor assay)을 이용하였다. 상세하게는, 각 3'UTR의 100bp 단편을 레닐라(renilla) 루시퍼라제 유전자의 하류에 클로닝하였으며, 반딧불이 루시퍼라제는 내재 대조군으로 제공하였다(도 10D,10E). 야생형 3'UTR을 갖는 단편외에, 예상의 시드(seed) 서열 내 변이를 갖는 구조물을 음성 대조군으로 클로닝 하였다. 각각의 플라스미드 구조물(공벡터, 야생형 3'UTR 및 변이형 3'UTR) 및 대응하는 miRNA 모방체는 HCT116 Dicer 하이포모르프(hypomorph)세포로 함께 형질감염하였으며, 루시퍼라제 활성은 48시간 후에 측정하였다. cd22및 fcgr2b 3'UTR은 mir-19a 및 miR-18a에 의해 직접 표적화된다(도 10D, 10E). 야생형 cd22 3'UTR은 변이형 3'UTR 구조물에 비해 루시퍼라제 활성이 25% (통계적으로 유의한) 감소되었다(도 10D). fcgr2b 실험에서, miR-18a의 형질감염은 모든 구조물에서 루시퍼라제 활성을 감소시켰다(도 10E). 그러나, 야생형 fcgr2b 3'UTR은 변이형 3'UTR 구조물에 비해 루시퍼라제 활성에 있어서 추가적인 감소를 보였으며, 이러한 차이 역시 유의하였다.(도 10E).
BLNK 인산화와 평행한 경로에서, BCR 결찰(ligation) 또한 Akt 인산화를 일으킨다. miR-17~92는 CD22 및 FCGR2B를 억제하여 SHIP를 덜 활성적으로 만듦으로써Akt 인산화를 증가시킨다. 림프종 세포는 대조군 또는 miR-17~92 모방체로 처리한 후 용해성 항-IgM으로 자극하고, 결찰 후 30분 및 90분에 세포를 회수하였다(도 10F). 대조군 및 miR-17~92 모방체 처리된 세포 모두에서, BCR 결찰 후 Akt 인산화의 증가가 확인되었다(도 10F). 그러나, 인산화의 증가는 miR-17~92 모방체 처리 세포에서 더 컸으며, 이것은 miR-17~92 매개된 BCR 신호전달의 증폭이 여러가지 하류 신호전달 경로에 영향을 줄 수 있다는 것을 의미한다(도 10F). Akt1은 인산화를 통해 글리코겐 신타아제 키나아제 3β(GSK3β)를 직접적으로 억제하고, 하류의 GSK3β는 분해를 위해 Myc을 표적으로 삼는다. 따라서, Akt 인산화는 GSK3β를 불활성화하게 만들고 B-세포 내 Myd 수준을 증가시킨다. 실제로, 외래의 miR-17~92 모방체 존재 하에서 GSK3β 인산화가 증가되었음이 확인되었다(도 10F). Myc은 miR-17~92 처리 세포에서 더 강하게 상승 조절된다는 것이 확인되었다(도 10F). 이러한 결과는 miR-17~92를 통해 Myc이 BCR 반응을 자극하고 피드 포워드 조절 루프에 참여한다 것을 밝혀준다(예를 들어, 도 10G의 모델 참조).
실시예 3
PI3K 신호전달 억제 후에 활성화될 수 있는 경로를 확인하기 위하여, MYC5 세포 및 PI3K를 동원할 수 없는 CD19 변이체를 이용하였다. 흥미롭게도, MYC5-CD19mut 신생물은 CD19wt보다 상당히 느리게 성장하는 반면, CD19-음성 신생물보다는 훨씬 빠르게 성장하였다(도 11A,11B). CD19mut에 의해 활성화되는 또다른 성장 경로를 확인하기 위하여, CD19에 연결되어 있다고 보고되어진, MAPK 신호전달의 여러 가지 암(arm)을 프로파일링하였다. 예상밖으로, Erk 및 p38의 인산화에서 큰 변화는 관찰되지 않았지만, CD19mut은 Jun 키나아제 JNK의 인산화를 크게 증가시켰다 (CD19wt는 증가시키지 못함)(도 11C). PI3K 억제제 LY294002로 처리한 CD19-충분 B-세포에서 유사한 결과는 확인되었다(도 11D). 흥미롭게도, JNK은 Src 패밀리 티로신 키나아제(SFTK)에 의해 활성화된다고 공지되어 있고, SFTK Lyn 및 Fyn은 CD19에 의해 원형질막으로 동원되어 활성화된다. 이러한 추정 경로와 일치하여, Sugen 화합물 SU6656을 이용한 SFTK의 억제는 포스포-JNK 수준을 감소시키고 CD19mut/PI3K-불능화된 세포 증식을 선택적으로 억제하였다(도 11E, 11F). 또한, CD19mut/PI3K-불능화된 세포는 SFTK Lyn을 우선적으로 인산화시킨다(도 11G).
JNK가 PI3K 동원/활성화가 없는 경우 CD19/Lyn-매개된 신호전달에 의해 활성화 된다고 가정하였다. 마우스 Myc5 B-림프종 시스템과 인간 B-세포 급성 림프아구성 백혈병(B-ALL) 세포 사이에 흥미로운 평행성(paralle)이 확인되었다. Myc5 세포와 유사하게, CD19+ B-ALL 세포는 표면 (s)-IgM (즉,BCR)을 발현하지 못하고 s-IgM 자극에 반응하지 못한다. 또한, 항-CD19 항체를 이용한 B-ALL 세포 내 면역침전 실험 자료는 CD19가 Lyn과 상호작용 하고 PI3K와는 상호작용하지 않는다는 것을 증명한다. 한편, P493-6 림프종 세포 내에서는 두가지 상호작용 모두가 발생한다(도 12, 위 패널). CD19는 Lyn을 인지하는 항체가 사용되는 경우 B-ALL 세포 내에서 함께 면역침전된다(도 12A, 아래 패널).
shRNA 이용한 CD19의 녹다운은 B-ALL 세포에서 성장을 억제하고 아포토시스(apoptosis)를 억제하기 때문에 CD19가 B-ALL 세포의 성장 및 생존에 중요하다는 것이 발견되었다(도 12B, 왼쪽 위 및 왼쪽 아래 패널). CD19 녹다운 후 성장 및 아포토시스에서의 장애는 대개는 손상된 Lyn-매개 신호전달에 의해 설명된다. 이것은 항-Lyn 헤어핀 처리도 또한 세포 성장을 억제하고 아포토시스를 유발하기 때문이다(도 12, 오른쪽 위 및 오른쪽 아래 패널). 이것은 또한 Myc 수준의 감소 때문일 수 있는데, 왜냐하면 CD19 또는 헤어핀의 처리가 Myc 단백질 발현을 억제하기 때문이다(도 12B, 위 패널). 아포토시스에 대한 CD19 및 Lyn 녹다운의 유사한 효과는 유세포분석을 이용하여 확인하였다(도 12C).
이러한 새로운 발견은 CD19-Lyn 매개된 신호전달이 B-ALL 세포의 생존에 중요하다는 것을 증명해준다. 이것은 SFTK Lyn을 표적화하는 것이 B-ALL 치료를 위해 표적화될 수 있기 때문에 중요하다. 예를 들어, 본원에서는 SFTK 억제제 다사티닙(처음에 재발된 CML을 처리하는 데 사용됨)이 Lyn 인산화를 억제하는 데 효과적이라는 것을 밝힌다(도 12D, 위). 또한, 이것은 세포 주기 정지를 통한 B-ALL 세포 성장을 손상시킨다(도 12D, 아래).
본 발명의 임의의 바람직한 실시예를 상기에 기술하고 상세하게 예시하였지만, 이는 본 발명을 상기 실시예에 제한하고자 하는 것은 아니다. 다음 청구항에 기재된 바와 같이, 본 발명의 범위 및 취지에 벗어나지 않는다면 여러가지 변형이 있을 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Thomas-Tikhonenko, Andrei Chung, Elaine Psathas, James <120> Compositions and Methods for Treating B-Lymphoid Malignancies <130> 3460-P05542WO00 <140> PCT/US2013/039067 <141> 2013-05-01 <150> 61/640,987 <151> 2012-05-01 <160> 7 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDK4 sense primer <400> 1 caatgttgta cggctgatgg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDK4 antisense primer <400> 2 caggccgctt agaaactgac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODC1 sense primer <400> 3 gtggcaactc atgaagcaga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODC1 antisense primer <400> 4 tgcaggcaag agctacaaga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LDHA sense primer <400> 5 tccgttacct gatgggagag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LDHA antisense primer <400> 6 gtaggcactg tccaccacct 20 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITAM motif <220> <221> VARIANT <222> 4, 16 <223> Xaa = Leu or Ile <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 5-10, 14, 15 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 11, 12 <223> Xaa = any amino acid or absent <400> 7 Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15

Claims (9)

  1. 화학치료제를 확인하는 방법으로서, 하나 이상의 시험 화합물 존재 하에서 CD19와 포스파티딜이노시티드 3-키나아제(PI3K) 사이의 결합 분석법(binding assay)을 수행하는 단계를 포함하고, 여기서 시험 화합물의 부존재 하에서 CD19-PI3K 결합과 비교하여 시험 화합물의 존재 하에서 CD19-PI3K 결합량의 감소는 시험 화합물이 화학치료제임을 나타내는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 결합 분석법은 세포 기반 스크리닝 분석법인 방법.
  3. 제1항에 있어서, CD19는 CD19의 세포질 테일(cytoplasmic tail)인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 시험 화합물은 소분자, 펩타이드, 또는 항체인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 B-세포 신생물(neoplasm)의 치료용 화학치료제인 방법.
  6. B-세포 신생물의 억제를 필요로 하는 피험체에서 B-세포 신생물을 억제하는 방법으로서, 피험체에게 CD19-PI3K 상호작용의 하나 이상의 억제제를 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 B-세포 신생물은 림프종 또는 B-세포 급성 림프아구성 백혈병인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 피험체에 하나 이상의 다른 화학치료제 또는 방사선 치료법을 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 억제제는 CD19 세포질 테일의 펩타이드 모방체(mimic) 또는 CD19 세포질 테일에 면역학적으로 특이적인 항체인 방법.
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