KR20220061148A - 세포 노화 조절 방법 및 조성물 - Google Patents

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KR20220061148A
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cell
increasing
cells
inhibitor
expression
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디 로빌런트 베나데타 니콜리스
막달레나 아도르노
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도리안 테라퓨틱스 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은 USP16 억제제와 세포의 접촉을 포함하는 세포 노화 조절 방법과 이를 위한 조성물을 제공한다. 개시된 방법은 키메릭 항원 수용체(CAR)-T 세포 요법, 조작된 T 세포 수용체(TCR) 요법, 자연 살해(NK) 세포 요법, 조혈 줄기 세포 기반 요법, 및 기타 입양 세포 요법을 포함하는 세포 기반 요법의 효능을 개선하기 위해 사용될 수 있다.

Description

세포 노화 조절 방법 및 조성물
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2019년 8월 29일에 출원된 미국 임시 특허 출원 번호 제62/893,618호를 우선권으로 주장하며, 이들 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
서열목록의 참조에 의한 통합
본 출원은 EFS-WEB을 통해 ASCII 형식으로 제출되었던 서열 목록을 포함하고, 그 전문은 본원에 참조로서 포함된다. 2020년 8월 28일에 생성된 상기 ASCII 복사본은 DOTH_001_01WO_SeqList_25로 명명되고 크기가 37KB이다.
키메릭 항원 수용체(CAR)-T 세포 요법과 조작된 T 세포 수용체(TCR) 요법과 같은 세포 기반 요법이 임상에서 큰 가능성을 보여 왔지만, 이들은 항상 효과적이지 않다. 예를 들어, CD19 CAR-T 세포로 치료된 대략 20%의 환자들은 요법에 반응하지 않는다. 부가적으로, 고형 종양은 종양 항원과 무관하게, 재유도된 T 세포에 거의 반응을 보이지 않는다.
세포 기반 요법은 예를 들어 세포가 대상에 투여되기 전 또는 직후에 에이징, 노화 또는 소진되는 경우 비효과적일 수 있다. 세포 에이징은 방사선 조사, RAS, 화학 요법 약물 및 활발히 분열하는 세포에 의해 조기 유도될 수 있으며, 예를 들어 세포 기반 요법에 사용하고자 하는 세포가 대상에 투여되기 전에 인 비트로(in vitro) 확장될 때 유도될 수 있다. 세포 에이징은 전형적으로 염색질 리모델링, 대사 재프로그래밍, 자가포식 증가, 및 복합 전염증성 분비체의 구현을 포함하는 명백한 표현형 변경을 동반하는 과정이다. 이는 하기 중 하나 이상과 관련이 있을 수 있다: 감소된 세포 확장, 감소된 인 비트로 종료 시간, 감소된 인 비보(in vivo) 지속성, 감소된 자가재생력, 감소된 자가 재생 표현형, 증가된 세포 소진(cell exhaustion), 감소된 이동 능력, 증가된 반응성 산소 종(ROS)의 생성, 감소된 미토콘드리아 막 전위 및/또는 글루타티온 함량, 감소된 효과기 기능, 감소된 인 비보 생착, 감소된 인 비보 종양 살해, 증가된 노화 마커 발현, 증가된 CDKN2A 발현, 증가된 CDKN2D 발현, 증가된 CDKN1A 발현, 증가된 CDKN1B, 감소된 H2A 또는 H2B 유비퀴틴화, 증가된 SA-β-Gal 발현, 증가된 텔로미어 단축화, 증가된 노화 관련 마커 및/또는 기능, 증가된 노화 관련 마커 및/또는 기능, 증가된 세놀리틱에 대한 감응성, 증가된 SASP(노화 관련 분비 표현형), 감소된 세포 건강, 및/또는 증가된 괴사/아폽토시스(세포 사멸).
예를 들어, 세포 기반 요법을 위한 세포 생성을 개선하기 위해, 세포 노화를 조절할 수 있는 것에 대한 요구가 존재한다.
본원에 제공된 것은 세포 기반 요법에서 사용된 세포를 최적화하기에 유용한 조성물 및 방법이다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 CAR-T 세포 요법, CAR-NK 세포 요법, 조작된 TCR 수용체 요법, 재유도된 T 세포, 조혈 줄기 세포(HSC) 요법, 및 종양 침윤 림프구, NK 세포 및 조절 T 세포의 사용과 같은 기타 입양 세포 요법을 포함하는 세포 기반 요법의 효능을 개선하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 USP16 억제제와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 세포 노화 조절 방법을 제공하고, 상기 세포는 혈액 세포이다. 일부 실시형태에서, 혈액 세포는 유전적으로 변형된 혈액 세포이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 USP16 억제제와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 세포 노화 조절 방법을 제공하고, 상기 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 유전적으로 변형된 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 USP16 억제제와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 세포 노화 조절 방법을 제공하고, 상기 세포는 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, NK 세포는 유전적으로 변형된 NK 세포이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 USP16 억제제와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 세포 노화 조절 방법을 제공하고, 상기 세포는 조혈 줄기 세포(HSC)이다. 일부 실시형태에서, 조혈 줄기 세포는 유전적으로 변형된 조혈 줄기 세포이다.
본원에 기재된 방법은 (a) 세포 확장을 유지 또는 증가시키는 것; (b) 인 비트로 종료 시간을 증가시키는 것; (c) 인 비보 지속성을 증가시키는 것; (d) 노화 개시를 예방, 지연 또는 역전시키는 것; (e) 자가재생력을 증가 또는 유지시키는 것; (f) 자가재생 표현형을 증가 또는 유지시키는 것; (g) 세포 소진을 감소시키는 것; (h) 이동 능력을 유지시키는 것; (i) 반응성 산소 종(ROS) 생성을 감소시키는 것; (j) 효과기 기능을 증가시키는 것; (k) 인 비보 생착을 증가시키는 것; (l) 인 비보 종양 사멸을 증가시키는 것; (m) 노화 마커 또는 노화 연관 마커 발현을 조절하는 것; (n) CDKN2A, CDKN1A, CDKN2D, 및/또는 γ-H2AX 발현을 감소시키는 것; (o) 세포 증식을 증가시키는 것; (p) H2A 또는 H2B 유비퀴틴화를 증가시키는 것; (q) SA-β-Gal 발현을 감소시키는 것; (r) 텔로미어 단축화를 감소시키는 것; (s) WNT 경로를 통한 신호전달을 향상시키는 것; (t) 인 비트로 세포독성을 유지 또는 증가시키는 것; (u) 미접촉 또는 중추 기억 표현형을 유지 또는 증가시키는 것; (v) 방출된 사이토카인의 유형과 양을 변경하는 것; (w) 줄기 세포 마커의 발현을 증가시키는 것; (x) 세놀리틱에 대한 감응성을 감소시키는 것; (y) SASP(노화 관련 분비 표현형)를 감소시키는 것; (z) 아폽토시스를 감소시키는 것; (aa) 괴사를 감소시키는 것; (bb) 미토콘드리아 막 전위를 증가시키는 것; 및/또는 (cc) 세포 글루타티온 함량을 증가시키는 것 중 하나 이상의 효과를 가질 수 있다. 또한 USP16 억제제와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 유전적으로 변형된 혈액 세포에서의 USP16 발현을 감소시키는 방법이 제공된다.
또한 USP16 억제제와 면역 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 면역요법 적용에서 사용하기 위한 면역 세포 제조 방법이 제공된다. 상기 면역요법은 키메릭 항원 수용체(CAR) 기반 요법, 조작된 T 세포 기반 요법, 조혈 줄기 세포 기반 요법, 및 기타 입양 세포 요법을 포함한다.
또한 USP16 발현을 하향조절하도록 변형된 혈액 세포가 제공된다.
또한 본 개시내용의 치료적 유효량의 세포(USP16를 하향조절하도록 변형된 세포)를 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는 질환 또는 장애 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 치료는 자가유래성이다. 일부 실시형태에서, 치료는 동종이계성이다.
이들 양태와 기타 양태는 하기 제시된 상세한 설명에서 보다 자세히 논의된다.
도 1a 내지 1b. 도 1a는 상이한 분화 단계에서의 T 세포, 및 각 단계와 연관된 세포 마커(CD45RA, CD45RO, CCR7, CD62L) 발현을 도시한다. 도 1B는 세포가 최대 줄기 유사(TN: T 미접촉)에서 최소 줄기 유사(TTE: T 말단 효과기)로 진행함에 따라 분화의 각 단계와 관련된 표현형을 예시한다.
도 2는 문헌[Gattinoni L., et al, "A human memory T cell subset with stem cell-like properties," Nature Medicine (2011)]에 공개된 데이터의 인 실리코 분석에 의해 측정할 때, 미접촉 T 세포(TN), 기억 줄기 세포(TSCM), 중추 기억(TCM), 및 효과기 기억 세포(TEM)에서 CDKN2A의 상대적 발현을 보여주는 그래프이다.
도 3a 내지 3e는 T 세포 하위세트에서 노화 마커 BMI-1(도 3a), CDKN2A(도 3b), CDKN2D(도 3c) 및 소진 마커 CTLA-4(도 3d) 및 PD-1(도 3e)의 상대적 발현을 보여주는 그래프이다.
도 4a 내지 4c. 도 4a는 shUSP16 또는 비-표적화 shRNA(대조군)를 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입 후 10, 20 및 30일째에 T 세포 활성화 시 T 세포 확장을 보여준다. 도 4b는 Sytox 염색 어세이를 사용하여 결정될 때, shUSP16 처리 후 세포의 생존능력을 보여준다. 도 4c는 T 세포 종료 어세이 결과를 보여준다. shUSP16으로 처리된 세포에서 지속성의 통계적으로 유의한 증가가 관찰되었다.
도 5는 USP16 발현의 특정 하향조절 후 20일째에 CD4/CD8 비를 보여준다. USP16 발현의 하향조절은 CD4/CD8 비에 대해 유의한 영향을 갖지 않았다.
도 6a 내지 6c는 보다 어린 세포(활성화 후 0일에서 15일) 및 보다 늙은 세포(활성화 후 20일에서 40일)가 지시된 양의 세놀리틱 약물 Navitoclax로 처리된 3가지 상이한 실험에서 세포 생존율을 보여준다.
도 7a 내지 7c는 세포가 지시된 양의 Navitoclax로 처리된 후 12일째(도 7a) 및 22일째(도 7b 내지 7c)에 죽은 세포의 백분율을 보여준다.
도 8은 활성화 후 10일째에 인 비트로 한계 희석 어세이 결과를 보여준다. 회색 실선은 보다 어린 세포를 나타내고, 검정색 실선은 보다 늙은 세포를 나타낸다. 상응하는 점선은 표준 편차를 나타낸다.
도 9는 활성화 후 20일째에 인 비트로 한계 희석 어세이 결과를 보여준다. 회색 실선은 shUSP16군을 나타내고, 검정색 실선은 대조군을 나타낸다. 상응하는 점선은 표준 편차를 나타낸다.
도 10은 활성화 후 31일째에 인 비트로 한계 희석 어세이 결과를 보여준다. 회색 실선은 shUSP16군을 나타내고, 검정색 실선은 대조군을 나타낸다. 상응하는 점선은 표준 편차를 나타낸다.
도 11a 내지 11b는 USP16 발현의 하향조절이 배양액에서 CD4+CD45RA+CD62L+ 세포(도 11a) 및 CD8+CD45RA+CD62L+ 세포(도 11b)의 수를 증가시키는 것을 입증한다.
도 12a 내지 12b. 도 12a는 상이한 효과기:표적(E:T) 비에서 살해율을 보여준다. 대조군 세포(Ctrl) 및 USP16 하향조절된 세포 사이에 차이점은 관찰되지 않았다. 도 12b는 항원 노출 시 IL-2 생성을 보여준다. USP16 발현 하향조절 후 IL-2 생성에 대한 효과는 관찰되지 않았다.
도 13a 내지 13b. 도 13a는 CD19.41BB CAR을 발현하는 CAR-T 세포에서 CDKN2A 발현을 보여주는 그래프이다. CDKN2A의 경우에, 값은 CD19.CD28 CAR-T 세포에 대해 정규화된다. 도 13b는 상이한 공동자극 도메인을 갖는 CAR-T 세포에서 BMI-1 발현을 보여주는 그래프이다.
도 14a 내지 14b는 USP16을 표적화하는 다른 shRNA가 세포 증식을 증가시키면서, USP16 발현을 효과적으로 하향조절하고, 노화 마커를 억제하는 것을 보여준다.
도 15는 USP16 발현의 하향조절이 CDKN1A 발현을 감소시킴을 보여준다.
도 16a 내지 16b는 USP16 발현의 하향조절이 WNT 경로 활성화를 향상시킴을 보여준다.
도 17a 내지 17b는 USP16 하향조절이 줄기 세포 기억 T 세포의 빈도 및 세포 기능을 증가시킴을 보여준다.
도 18은 USP16의 하향조절이 줄기 세포 활성과 기능성을 증가시킴을 보여준다.
도 19는 USP16 발현의 하향조절이 소진 마커 CD69 발현을 감소시킴을 보여준다.
도 20은 USP16 발현을 하향조절하는 T 세포가 종양 세포 살해 능력을 유지함을 보여준다.
도 21a 내지 21b는 USP16의 CRISPR-매개 녹아웃이 qPCR 발현 분석에 의해 달성되었음을 보여준다.
도 22는 USP16 발현의 CRISPR-매개 녹아웃이 줄기 세포 기억 T 세포를 증가시킴을 보여준다.
도 23은 USP16 발현의 CRISPR-매개 녹아웃이 T 세포-매개 살해를 손상시키지 않음을 보여준다.
도 24는 CAR 구축물이 USP16를 표적화하는 shRNA를 공동발현하는 경우, CAR-T 세포에서 USP16 발현이 하향조절되었음을 보여준다.
도 25는 CAR-T 세포에서 USP16 발현 하향조절이 CAR-T 세포 확장을 향상시킴을 보여준다.
도 26a 내지 26b는 CAR-T 세포에서 USP16 발현의 하향조절이 노화 마커 CDKN1A와 CDKN2A의 발현을 감소시킴을 보여준다.
도 27a 내지 27b는 CAR-T 세포에서 USP16 발현의 하향조절이 WNT 경로를 통한 신호전달을 향상시킴을 보여준다.
도 28a 내지 28b는 CAR-T 세포에서 USP16 발현의 하향조절이 줄기 세포 기억 T 세포 빈도를 증가시킴을 보여준다.
도 29는 CAR-T 세포에서 USP16 발현의 하향조절이 줄기 세포 수와 활성을 증가시킴을 보여준다.
도 30a 내지 30b는 CAR-T 세포에서 USP16 발현의 하향조절이 세포독성 어세이에서 살해 및 T 세포 확장을 증가시킴을 보여준다.
도 31a 내지 31b는 CAR-T 세포에서 USP16 발현의 하향조절이 세포 건강을 증가시키고, 세포 및 미토콘드리아 스트레스를 감소시킴을 보여준다.
도 32는 CAR-T 세포에서 USP16 발현의 하향조절이 소진 마커 CD69 발현을 감소시킴을 보여준다.
도 33은 실시예에서 기재된 재챌린지 실험 레이아웃을 도시한다.
도 34는 CAR-T 세포에서 USP16 발현의 하향조절이 소진 관련 마커의 발현을 감소시킴을 보여준다.
도 35a 내지 35b는 USP16 발현의 하향조절이 다중 종양 챌린지 시 T 세포 살해 능력을 유의하게 증가시킴을 보여준다.
도 36은 인 비보 살해에 대한 GD2.CAR-T 세포에서의 USP16 발현의 하향조절의 효과를 평가하기 위한 인 비보 실험 디자인을 보여준다.
도 37a 내지 37b는 GD2.CAR-T 세포가 USP16를 하향조절할 때 인 비보 종양 살해의 유의한 증가를 보여준다.
도 38은 인 비보 살해에 대한 CD19.CAR-T 세포에서의 USP16 발현의 하향조절의 효과를 평가하기 위한 인 비보 실험 디자인을 보여준다.
도 39a 내지 39b는 CD19.CAR-T 세포가 USP16를 하향조절할 때 인 비보 종양 살해의 유의한 증가를 보여준다.
본 개시내용은 세포 노화를 조절(예를 들어, 억제 또는 돌이킴)하는 조성물과 방법을 제공한다. 구체적으로, 본원에서 USP16 디유비퀴틴화(deubiquitinating) 효소(유비퀴틴 특이적 펩티다아제 16, 디유비퀴틴화 효소 16, Ubp-M, 유비퀴틴 카르복실-말단 히드롤라아제 16으로도 알려짐)의 발현 또는 활성을 감소시킴으로써, 하기 중 하나 이상의 효과가 달성될 수 있음을 보여준다: (a) 세포 확장을 유지 또는 증가시키는 것; (b) 인 비트로 종료 시간을 증가시키는 것; (c) 인 비보 지속성을 증가시키는 것; (d) 노화 개시를 예방, 지연 또는 역전시키는 것; (e) 자가재생력을 증가 또는 유지시키는 것; (f) 자가재생 표현형을 증가 또는 유지시키는 것; (g) 세포 소진을 감소시키는 것; (h) 이동 능력을 유지시키는 것; (i) 반응성 산소 종(ROS) 생성을 감소시키는 것; (j) 효과기 기능을 증가시키는 것; (k) 인 비보 생착을 증가시키는 것; (l) 인 비보 종양 사멸을 증가시키는 것; (m) 노화 마커 또는 노화 연관 마커 발현을 조절하는 것; (n) CDKN2A, CDKN1A, CDKN2D, 및/또는 γ-H2AX 발현을 감소시키는 것; (o) 세포 증식을 증가시키는 것; (p) H2A 또는 H2B 유비퀴틴화를 증가시키는 것; (q) SA-β-Gal 발현을 감소시키는 것; (r) 텔로미어 단축화를 감소시키는 것; (s) WNT 경로를 통한 신호전달을 향상시키는 것; (t) 인 비트로 세포독성을 유지 또는 증가시키는 것; (u) 미접촉 또는 중추 기억 표현형을 유지 또는 증가시키는 것; (v) 방출된 사이토카인의 유형과 양을 변경하는 것; (w) 줄기 세포 마커의 발현을 증가시키는 것; (x) 세놀리틱에 대한 감응성을 감소시키는 것; (y) SASP(노화 관련 분비 표현형)를 감소시키는 것; (z) 아폽토시스를 감소시키는 것; (aa) 괴사를 감소시키는 것; (bb) 미토콘드리아 막 전위를 증가시키는 것; 및/또는 (cc) 세포 글루타티온 함량을 증가시키는 것.
본 개시내용의 조성물과 방법은 따라서 CAR-T, CAR-NK, 또는 CAR-대식 세포 요법과 다른 입양 세포 요법(예를 들어, TCR-T 세포 요법), 줄기 세포 요법(예를 들어, 조혈 줄기 세포 요법), 및 유전자 요법을 비제한적으로 포함하는 세포-기반 요법에서 사용된 세포의 노화를 억제하거나 돌이키기 위해 사용되어, 상기 요법의 효과를 증가시킬 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 업계의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원의 상세한 설명에서 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 기술하기 위함이며, 이를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허, GenBank 또는 다른 수탁 번호 및 다른 참조문헌은 그 전체가 참조로 포함된다. 본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 기타 참조문헌은 본원에서 그 전체가 참고로 포함된다.
정의
하기 용어가 본 개시내용에서 사용된다.
단수의 형태는 문맥상 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 복수의 형태도 마찬가지로 포함하는 것으로 의도된다.
추가로, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 길이의 양, 용량, 시간, 온도 등과 같은 측정가능한 값을 지칭할 때 본원에서 사용된 용어 "약"은 특정 값의 ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, 또는 심지어 ± 0.1%의 변형을 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서 및 실시형태에서 사용된 어구 "및/또는"은 연결된 요소, 즉 일부 경우에 결합적으로 존재하고 다른 경우에는 분리되어 존재하는 요소 중 "어느 하나 또는 둘 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"으로 열거된 다중 요소들은 동일한 방식, 즉 연결된 요소 중 "하나 이상"으로 해석되어야 한다. 구체적으로 식별된 요소와 관련이 있든지 없든지, "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별된 요소 이외의 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적 예로서, "~를 포함하는"과 같은 포괄형 언어와 함께 사용될 때, "A 및/또는 B"는, 일 실시형태에서, A만(선택적으로 B 이외의 요소 포함)을 지칭할 수 있고; 다른 실시형태에서, B만(선택적으로 A 이외의 요소 포함)을 지칭할 수 있고; 또 다른 실시형태에서, A 및 B 둘 모두(선택적으로 다른 요소들 포함) 등을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "감소하다", "낮아지다", "줄다" 및 유사 용어는 적어도 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 35%, 약 50%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97% 이상의 감소를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "개선하다", "증가하다", "향상시키다" 및 유사 용어는 적어도 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 50%, 약 75%, 약 100%, 약 150%, 약 200%, 약 300%, 약 400%, 약 500% 이상의 증가를 의미한다.
본원에서 사용된 "세놀리틱"은 선택적으로 노화 세포의 사멸을 유도하는 작용제를 지칭한다.
문맥이 달리 나타내지 않는 한, 본원에 기술된 다양한 특징이 임의의 조합으로 사용될 수 있다는 것이 구체적으로 의도된다.
디유비퀴틴화 효소(DUB) 및 이의 억제제
유비퀴틴은 프로테아좀과 리소좀을 통해 단백질 분해를 조절하고, 단백질의 세포 위치를 조정하고, 단백질을 활성화 및 비활성화하고, 단백질-단백질 상호작용을 조절한다. 특히 히스톤의 모노유비퀴틴화는 염색질 리모델링에 역할을 하여 후성유전적 조절자(epigenetic regulator)로 작용한다. USP16과 같은 디유비퀴틴화 효소(DUB)는 단백질과 다른 분자로부터 유비퀴틴을 절단한다.
USP16 유전자에 의해 인코딩된 USP16은 히스톤 H2A/H2B 디유비퀴티나아제이다. 전장 인간 USP16(UNIPROT 수탁 번호 Q9Y5T5)의 예시 아미노산 서열은 하기(서열 번호 1)에 제공된다.
서열 번호: 1: 인간 USP16 아미노산 서열
Figure pct00001
여러 추가적인 USP16 동형단백질이 또한 알려져 있다. GenBank 수탁 번호 NM_006447.2(서열 번호: 3), NM_006447.3(서열 번호: 4), NM_001001992.1(서열 번호: 5), 및 NM_001032410.1(서열 번호: 6) 참조. Uniprot 수탁 번호 H9KVB6(서열 번호: 7)도 참조.
서열 번호: 3: USP16 단백질 변이체
Figure pct00002
Figure pct00003
서열 번호: 4: USP16 단백질 변이체
Figure pct00004
서열 번호: 5: USP16 단백질 변이체
Figure pct00005
Figure pct00006
서열 번호: 6: USP16 단백질 변이체
Figure pct00007
서열 번호: 7: USP16 단백질 변이체
Figure pct00008
USP16 억제제가 본원에 제공된다. 상기 억제제는 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다. USP16의 예시적 억제제는 예를 들어 핵산, 단백질, 소분자, 또는 대분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, USP16의 억제제는 Cas 뉴클레아제와 같은 RNA-유도 뉴클레아제이거나, 또는 이를 인코딩하는 핵산이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제, Cas12(a) 뉴클레아제 (Cpf1), Cas12b 뉴클레아제, Cas12c 뉴클레아제, TrpB-유사 뉴클레아제, Cas13a 뉴클레아제 (C2c2), Cas13b 뉴클레아제, Cas14 뉴클레아제, CasX 뉴클레아제, CasY 뉴클레아제, 또는 이들의 변형되거나 절단된 변이체이다. 일부 실시형태에서, Cas9 뉴클레아제는 S.피오게네스 또는 S.아우레스로부터 단리되거나 유래된다. Cas 뉴클레아제는 가이드 RNA(예를 들어, 단일 분자 또는 이중 분자 gRNA)에 결합하고, 이는 표적 핵산 서열에 결합한다. 단일 분자 gRNA(예를 들어, sgRNA)는 전형적으로 관심 표적 DNA 서열에 상보적인 스페이서 서열, 및 Cas 뉴클레아제에 결합하는 스캐폴드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서 서열은 USP16 유전자에서 특정 부위, 예컨대 USP16 유전자의 인트론 또는 엑손을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 스페이서 서열은 USP16 유전자의 프로모터, 인핸서, 또는 다른 미번역 영역(예를 들어, 5'UTR 또는 3'UTR)을 비제한적으로 포함하는 비코딩 영역을 표적으로 한다.
일부 실시형태에서, USP16의 억제제는 번역 액티베이터-유사 효과기 뉴클레아제(TAL 뉴클레아제), 또는 이를 인코딩하는 하나 이상의 핵산이다. TAL 뉴클레아제는 DNA 절단 도메인에 융합된 TAL 효과기 DNA-결합 도메인을 포함할 수 있다. TAL 뉴클레아제는 USP16 유전자의 인트론 또는 엑손과 같은 USP16 유전자를 표적으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, TAL 뉴클레아제는 USP16 유전자의 프로모터, 인핸서, 또는 다른 미번역 영역(예를 들어, 5'UTR 또는 3'UTR)을 비제한적으로 포함하는 비코딩 영역을 표적으로 한다.
일부 실시형태에서, USP16의 억제제는 아연(Zn) 핑거 뉴클레아제, 또는 이를 인코딩하는 하나 이상의 핵산이다. Zn 핑거(Zn Finger) 뉴클레아제는 DNA 절단 도메인(예를 들어, FokI 또는 이의 변이체)에 융합된 아연 핑거 DNA-결합 도메인을 포함할 수 있다. Zn 핑거 뉴클레아제는 USP16 유전자의 인트론 또는 엑손과 같은 USP16 유전자를 표적으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, Zn 핑거 뉴클레아제는 USP16 유전자의 프로모터, 인핸서, 또는 다른 미번역 영역(예를 들어, 5'UTR 또는 3'UTR)을 비제한적으로 포함하는 비코딩 영역을 표적으로 한다.
일부 실시형태에서, 억제제는 RNAi 분자이다. 예를 들어, 억제제는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 소간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA, 또는 비대칭 간섭 RNA일 수 있다. 일부 실시형태에서, 억제제는 USP16 유전자의 서열을 표적으로 하는 shRNA이다. 일부 실시형태에서, 억제제는 USP16 유전자의 하기 서열을 표적으로 하는 shRNA이다: 5'-TCCAGAAGGAATATCACTT-3'(서열 번호: 2), 5'- GACTGTAAGACTGACAATAAA-3'(서열 번호: 8) 및 5'-TATATCAGTTCACCCGTAAT-3'(서열 번호: 9) 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열.
일부 실시형태에서, USP16의 억제제는 안티센스 분자, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드, DNA-RNA 키메라, 모르폴리노 올리고, lhRNA, miRNA 내장 shRNA, 소형의 내부 분절된 RNA, 항체, 및 엑소좀으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, USP16의 억제제(예를 들어, USP16의 소분자 억제제)는 하나 이상의 다른 작용제와 함께 사용된다. 일부 실시형태에서, USP16의 제1 억제제는 USP16의 제2 억제제와 함께 사용된다. 일부 실시형태에서, USP16의 억제제는 하나 이상의 WNT 아고니스트와 함께 사용된다. 일부 실시형태에서, USP16의 억제제는 하나 이상의 R-스폰딘(Rspo) 아고니스트와 함께 사용된다. 일부 실시형태에서, USP16의 억제제는 항-소진 요법(예를 들어, PD1 억제 요법(예를 들어, 항-PD1 요법), 예를 들어 CTLA4 억제 요법(예를 들어, 항-CTLA4 요법))과 함께 사용된다. 일부 실시형태에서, USP16의 억제제 및 제2 작용제는 동시에 사용된다. 일부 실시형태에서, USP16의 억제제 및 제2 작용제는 순차적으로 사용된다.
일부 실시형태에서, USP16 억제는 USP16 발현의 녹다운(본원에서, 발현의 하향조절, 감소, 사일런싱 등으로도 상호교환적으로 지칭됨)을 지칭한다. 녹다운은 발현의 전체 녹아웃일 필요는 없고, 이에 일부 실시형태에서, USP16 억제제는 USP16 발현을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, USP16의 억제제는 완전히 USP16의 발현을 제거할 수 있다(예를 들어, 녹아웃).
일부 실시형태에서, USP16 억제는 USP16 활성의 녹다운(본원에서, 활성의 하향조절, 감소, 사일런싱 등으로도 상호교환적으로 지칭됨)을 지칭한다. 일부 실시형태에서, USP16 억제제는 USP16 활성을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, USP16의 억제제는 완전히 USP16의 활성을 제거할 수 있다.
일부 실시형태에서, USP16 억제는 USP16 유전자를 작동하지 않도록 만드는 USP16 유전자의 변형을 지칭한다(예를 들어, USP16 유전자의 녹아웃 또는 특정 염기 돌연변이(예를 들어, 촉매 부위에서의 돌연변이)).
일부 실시형태에서, USP16 억제제가 세포와 접촉된 후, USP16 발현 및/또는 활성은 세포의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100%에서 억제된다.
세포
본원에서 USP16 발현을 하향조절하기 위한 세포의 접촉 방법과 세포의 변형 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 세포는 파충류, 양서류, 새, 포유동물 또는 어류로부터 분리되거나 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포는 영장류 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 비인간 영장류 세포, 예를 들어 원숭이 세포이다.
본 개시내용의 세포는 인 비보 또는 인 비트로에서 접촉되고 변형될 수 있다. 세포가 인 비트로인 실시형태에서, 세포는 영장류 세포 또는 불멸화 세포일 수 있다. 세포는 야생형일 수 있고, 유전적으로 변형될 수 있거나, 하나 이상의 유전자 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포의 게놈은 USP16 유전자의 1개의 카피, 2개의 카피, 또는 3개의 카피를 갖는다. 일부 실시형태에서, 세포는 높은 수준의 USP16을 발현할 수 있거나, 낮은 수준의 USP16을 발현할 수 있다. 본원에서 사용된 USP16의 "높은" 수준은 야생형 수준에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 100% 증가하는 USP16의 수준을 지칭한다. 본원에서 사용된 USP16의 "낮은" 수준은 야생형 수준에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 100% 감소하는 USP16의 수준을 지칭한다. 낮은 또는 높은 수준의 USP16 발현은 유전자 변형, 노화 등에 의해 유도될 수 있다.
세포는 야생형 세포 또는 세포 기반 요법(예를 들어, 키메릭 항원 수용체 기반 세포 요법, HSC 요법 또는 조작된 TCR 요법)에 사용될 조작된(예를 들어, 유전적으로 변형된) 세포일 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 혈액 세포이다. 혈액 세포는 조혈 줄기 세포, 공통 골수 또는 림프구 전구체 또는 적혈구, 백혈구 또는 혈소판을 포함하는 이들로부터 분화되는 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 혈액 세포는 면역 세포, 예컨대 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 단핵구, 대식 세포, 호산구, 호염기구, 호중구, 또는 자연 살해 세포(NK 세포; 이는 하기 언급된 자연 살해 T 세포와 상이함)이다.
세포가 T 세포인 실시형태에서, T 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포일 수 있다. 예를 들어, T 세포는 세포독성 T 세포, 말단 효과기 T 세포, 효과기 T 세포, 기억 또는 중추 기억 T 세포, 미접촉 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, 사이토카인-유도 살해(CIK) T 세포, 또는 종양 침윤성 림프구일 수 있다.
세포가 NK(자연 살해) 세포인 실시형태에서, NK 세포는 NKtolerant(예를 들어, CD56bright 또는 CD27-CD11b- NK 세포), NKcytotoxic(예를 들어, CD56dim 또는 CD27-CD11b+ NK 세포), NKregulatory(예를 들어, CD56bright 또는 CD27+ NK 세포) 또는 NKT(CD56- 또는 CD3+CD56-)일 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 iPSC 유래 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 줄기 세포이다. 줄기 세포는 예를 들어 유도 만능 줄기 세포(iPSC: induced pluripotent stem cell)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 조혈 줄기 세포(HSC)이다. 일부 실시형태에서, 세포는 HSC 요법에 사용될 HSC이다. 예를 들어, HSC는 하나 이상의 치료 유전자 또는 키메릭 항원 수용체(CAR) 또는 T-세포 수용체(TCR)를 발현하도록 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 줄기 세포가 아니다. 일부 실시형태에서, 세포는 혈액 줄기 세포가 아니다. 일부 실시형태에서, 세포는 림프구 또는 골수 전구 세포가 아니다. 일부 실시형태에서, 세포는 조혈 줄기 세포가 아니다.
상기 기재된 임의의 세포는 본 개시내용의 일부 실시형태에서 유전적으로 변형될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "유전적으로 변형된 세포"는 단백질 또는 RNA 전사체를 인코딩하는 DNA 단편을 안정적으로 또는 일시적으로 발현하도록 유전적으로 조작되는 세포를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유전적으로 변형된 세포는 USP16를 과발현하도록 변형되지 않는다. 일부 실시형태에서, 세포는 관심 단백질을 발현 또는 과발현하도록 유전적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, 세포는 관심 단백질의 발현을 하향조절(녹다운 또는 녹아웃)하도록 유전적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, 세포는 이미 세포에서 발현된 관심 단백질을 과발현하거나, 전형적으로 발현되지 않는 시간/상황에서 이를 발현하도록 유전적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, 세포는 외인성 단백질, 예를 들어 세포에 의해 일반적으로 발현되지 않는 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형된다.
상기 기재된 임의의 세포는 세포 요법을 위해 인 비트로에서 확장될 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 대상에게 투여되기 전에 약 20-배, 약 50-배, 약 100-배, 약 250-배, 약 500-배, 약 750-배, 약 1000-배 이상 확장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전적으로 변형된 세포는 이를 필요로 하는 대상에 투여되기 전에 인 비트로에서 확장될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 유전적으로 변형된 혈액 세포이다. 일부 실시형태에서, 유전적으로 변형된 혈액 세포는 유전적으로 변형되어 이의 표면 상에 키메릭 항원 수용체 또는 T-세포 수용체(TCR)를 발현한다. 일부 실시형태에서, 세포는 동종이계성인 입양 세포 요법 적용을 위해 준비된다. 일부 실시형태에서, 세포는 자가유래성인 입양 세포 요법 적용을 위해 준비된다.
일부 실시형태에서, 유전적으로 변형된 혈액 세포는 키메릭 항원 수용체를 발현하도록 변형된 세포(CAR, 예를 들어 CAR-T 세포, CAR-대식 세포, 또는 CAR-NK 세포)일 수 있다. CAR-변형 세포는 표적 세포의 표면 상에 하나 이상의 항원을 인식하는 키메릭 항원 수용체를 발현할 수 있다. 예를 들어, CAR-변형 세포는 예를 들어 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD70, CD123, CD138, CD171, 글리피칸-3, 카파 면역글로불린, ROR1, GD2, CD44v6, HER2, NY-ESO-1, BCMA, CD22, MSLN, CEA, EGFR, EGFRvIII, VEGFR2, IL-13, IL13Rα2, 루이스 Y 항원, 메소텔린, FAP, 및/또는 PSMA를 인식하는 키메릭 항원 수용체를 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR은 이중 표적화 CAR, 억제 CAR, 유도성 CAR, synNotch CAR, iCAR, 약물 유도성 CAR, 또는 어댑터 CAR이다. 일부 실시형태에서, CAR은 사이토카인 또는 사이토카인 수용체(예를 들어, IL15 또는 IL15R), 또는 자살 유전자를 공동 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR은 소진 마커(예를 들어, PD-1 shRNA)를 조절하고, 억제 수용체의 발현을 감소시키기 위해 항-소진 단백질(예를 들어, PD-1/PDL-1 Fab) 또는 shRNA/siRNA/gRNA를 발현할 수 있다.
다른 실시형태에서, 세포는 유전적으로 변형된 혈액 세포이고, 예를 들어 T-세포 수용체(TCR-T 세포) 요법에서 사용하기 위한 T-세포 수용체를 발현하도록 변형된다. 일부 실시형태에서, TCR 편집은 완전 또는 부분 편집일 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 자가유래성 세포이고; 다른 실시형태에서, 세포는 동종이계성 세포이다. 일부 실시형태에서, 자가유래성 또는 동종이계성 요법을 위한 세포를 준비하는 경우, 추가적인 유전자 변형이 수행될 수 있다.
세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 방법
본원에서, 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 감소시키는(본원에서 상호교환적으로 하향조절, 녹다운, 사일런싱, 억제로 지칭됨) 방법이 제공되고, 상기 방법은 세포와 USP16의 억제제를 접촉시키는 것을 포함한다. 발현 및/또는 활성의 하향조절은 일시적 또는 안정할 수 있다는 것을 유의한다. 이들 방법은 인 비트로, 또는 인 비보에서 수행될 수 있다.
세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 것은 하기 효과 중 하나 이상을 가질 수 있다: (a) 세포 확장을 유지 또는 증가시키는 것; (b) 인 비트로 종료 시간을 증가시키는 것; (c) 인 비보 지속성을 증가시키는 것; (d) 노화 개시를 예방, 지연 또는 역전시키는 것; (e) 자가재생력을 증가 또는 유지시키는 것; (f) 자가재생 표현형을 증가 또는 유지시키는 것; (g) 세포 소진을 감소시키는 것; (h) 이동 능력을 유지시키는 것; (i) 반응성 산소 종(ROS) 생성을 감소시키는 것; (j) 효과기 기능을 증가시키는 것; (k) 인 비보 생착을 증가시키는 것; (l) 인 비보 종양 사멸을 증가시키는 것; (m) 노화 마커 또는 노화 연관 마커 발현을 조절하는 것; (n) CDKN2A, CDKN1A, CDKN2D, 및/또는 γ-H2AX 발현을 감소시키는 것; (o) 세포 증식을 증가시키는 것; (p) H2A 또는 H2B 유비퀴틴화를 증가시키는 것; (q) SA-β-Gal 발현을 감소시키는 것; (r) 텔로미어 단축화를 감소시키는 것; (s) WNT 경로를 통한 신호전달을 향상시키는 것; (t) 인 비트로 세포독성을 유지 또는 증가시키는 것; (u) 미접촉 또는 중추 기억 표현형을 유지 또는 증가시키는 것; (v) 방출된 사이토카인의 유형과 양을 변경하는 것; (w) 줄기 세포 마커의 발현을 증가시키는 것; (x) 세놀리틱에 대한 감응성을 감소시키는 것; (y) SASP(노화 관련 분비 표현형)를 감소시키는 것; (z) 아폽토시스를 감소시키는 것; (aa) 괴사를 감소시키는 것; (bb) 미토콘드리아 막 전위를 증가시키는 것; 및/또는 (cc) 세포 글루타티온 함량을 증가시키는 것.
세포가 T 세포인 일부 실시형태에서, 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 것은 T 세포 소진을 감소시킬 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 CAR-T 요법 및 조작된 TCR-T 세포 요법을 포함하는 세포-기반 요법의 효능을 개선하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 USP16 억제제와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 세포 노화 조절 방법을 제공한다. 방법은 (a) 세포 확장을 유지 또는 증가시키는 것; (b) 인 비트로 종료 시간을 증가시키는 것; (c) 인 비보 지속성을 증가시키는 것; (d) 노화 개시를 예방, 지연 또는 역전시키는 것; (e) 자가재생력을 증가 또는 유지시키는 것; (f) 자가재생 표현형을 증가 또는 유지시키는 것; (g) 세포 소진을 감소시키는 것; (h) 이동 능력을 유지시키는 것; (i) 반응성 산소 종(ROS) 생성을 감소시키는 것; (j) 효과기 기능을 증가시키는 것; (k) 인 비보 생착을 증가시키는 것; (l) 인 비보 종양 사멸을 증가시키는 것; (m) 노화 마커 또는 노화 연관 마커 발현을 조절하는 것; (n) CDKN2A, CDKN1A, CDKN2D, 및/또는 γ-H2AX 발현을 감소시키는 것; (o) 세포 증식을 증가시키는 것; (p) H2A 또는 H2B 유비퀴틴화를 증가시키는 것; (q) SA-β-Gal 발현을 감소시키는 것; (r) 텔로미어 단축화를 감소시키는 것; (s) WNT 경로를 통한 신호전달을 향상시키는 것; (t) 인 비트로 세포독성을 유지 또는 증가시키는 것; (u) 미접촉 또는 중추 기억 표현형을 유지 또는 증가시키는 것; (v) 방출된 사이토카인의 유형과 양을 변경하는 것; (w) 줄기 세포 마커의 발현을 증가시키는 것; (x) 세놀리틱에 대한 감응성을 감소시키는 것; (y) SASP(노화 관련 분비 표현형)를 감소시키는 것; (z) 아폽토시스를 감소시키는 것; (aa) 괴사를 감소시키는 것; (bb) 미토콘드리아 막 전위를 증가시키는 것; 및/또는 (cc) 세포 글루타티온 함량을 증가시키는 것 중 하나 이상을 유도할 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 혈액 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 HSC이다. 일부 실시형태에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 T-세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 유전적으로 변형된 세포, 예컨대 유전적으로 변형된 T 세포, 유전적으로 변형된 NK 세포, 또는 유전적으로 변형된 HSC이다. 세포가 T 세포(예를 들어, 유전적으로 변형된 T 세포)인 일부 실시형태에서, 세포에서 USP16의 활성을 감소시키는 것은 T 세포 소진을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역요법 적용에서 사용하기 위한 면역 세포 제조 방법이 제공되고, 상기 방법은 USP16 억제제와 면역 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역요법 적용은 CAR-기반 요법(예를 들어, CAR-T 세포, CAR-대식 세포, 또는 CAR-NK 세포 요법), 조작된 TCR 요법, 또는 종양 침윤성 림프구, 조절 T 세포, 및 재유도 T 세포를 사용하는 것과 같은 다른 입양 세포 요법, 줄기 세포 요법(예를 들어, HSC 요법), 또는 유전자 요법이다. 일부 실시형태에서, 면역 요법은 자가유래성이다. 일부 실시형태에서, 면역 요법은 동종이계성이다.
일부 실시형태에서, USP16의 억제제는 면역 세포를 포함하는 세포의 집단의 인 비트로 확장 중 면역 세포와 접촉한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 세포가 대상에 투여되기 전, 예를 들어 세포가 대상에게 투여되기 약 4시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 26시간, 또는 약 48시간 전에 USP16의 억제제와 접촉된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 세포가 대상에게 투여되기 약 3 내지 약 21일, 약 7 내지 약 21일, 또는 약 7 내지 약 14일 전에 USP16의 억제제와 접촉된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 세포가 대상에게 투여되기 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 또는 21일 전에 USP16의 억제제와 접촉된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 세포가 대상에 투여된 후, 예를 들어 세포가 대상에게 투여되고 약 4시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 26시간, 또는 약 48시간 후에 USP16의 억제제와 접촉된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 USP16의 억제제와 동시에 대상에 투여된다.
세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성의 하향조절 효과
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 세포 확장에서의 관련된 증가 또는 유지이다. 본원에서 언급된 바, 세포 확장은 일반적으로 세포 증식의 인 비트로 방법을 지칭하고, 전형적으로 세포는 확장 전 유기체 또는 조직으로부터 취해진다. 일부 실시형태에서, 상기 증가는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 증가일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 세포 증식에서의 관련된 증가이다. 본원에서 언급된 바, 세포 증식은 세포의 수를 증가를 유도하는 방법이고, 이는 세포 사멸 또는 분화를 통한 세포 손실 및 세포 분열 사이의 균형을 나타낸다. 세포 증식은 인 비트로, 또는 인 비보에서 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 증가는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 증가일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 인 비트로 종료 시간에서의 관련된 증가이다. 일부 실시형태에서, 상기 증가는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 증가일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 인 비보 지속성에서의 관련된 증가이다. 일부 실시형태에서, 상기 증가는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 증가일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 노화 발병의 관련된 예방, 지연 또는 역전이다. 일부 실시형태에서, 상기 예방, 지연 또는 역전은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 증가일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 자가 재생력의 관련된 증가 또는 유지이다. 일부 실시형태에서, 상기 증가는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 증가일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 자가 재생 표현형의 관련된 증가 또는 유지이다. 일부 실시형태에서, 상기 증가는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 증가일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 예측된 결과는 세포 소진에서의 관련된 감소이다. 세포 소진은 여러 방식으로 평가될 수 있고, 일부 실시형태에서, 소진 마커의 발현 수준이 평가될 수 있다. 소진 마커는 PD-1, Lag3, CTLA4, CD69, CD39, TIM-3, TOX2, TIGIT, CD160, 2B4, 및 BTLA를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 상기 소진의 감소, 또는 소진 마커의 발현 수준은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 감소일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 관련된 이동 능력의 유지이다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 반응성 산소 종(ROS)의 생성에서의 관련된 감소이다. 일부 실시형태에서, 상기 감소는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 감소일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 효과기 기능, 예를 들어 T-세포 효과기 기능에서의 관련된 증가이다. 일부 실시형태에서, 상기 증가는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 증가일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 인 비보 생착에서의 관련된 증가이다. 일부 실시형태에서, 상기 증가는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 증가일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 인 비보 종양 살해에서의 관련된 증가이다. 일부 실시형태에서, 상기 증가는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 증가일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 노화 마커의 발현에서의 관련된 조절이다. 본원에서 사용된 노화 마커는 세포 노화 중 증가 또는 감소할 수 있는 유전자, 단백질, 대사산물 또는 후성적 마커다. 노화 마커는 CDKN2A, CDKN1A, CDKN2B, CDKN2D, p27, p53, LaminB1, BMI-1, γ-H2AX, FOXO3, FOXO1, FOXM1, CCND1, IL6, IL8, STAT3, STAT6, CDK6 및 해당과 관련된 유전자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. T 세포는 세포 에이징 및 노화 동안 추가 유전자(상기 언급한 것 외에)의 유전적 프로파일의 변화를 나타내므로, T 세포에서의 노화 마커와 관련하여 CD27, CD28, CD57, CD160, CD27, KLRG1 및 CD138도 포함된다는 점을 유의한다. 일부 실시형태에서, 상기 조절은 발현 수준에서 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 증가 또는 감소일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 CDKN2A, CDKN1A, CDKN2D, 및/또는 γ-H2AX 발현의 관련된 감소이다. 일부 실시형태에서, 상기 감소는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 감소일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 H2A 또는 H2B 유비퀴틴화에서의 관련된 증가이다. 일부 실시형태에서, 상기 증가는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 증가일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 SA-β-Gal 발현의 관련된 감소이다. 일부 실시형태에서, 상기 감소는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 감소일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 텔로미어 단축화의 관련된 감소이다. 일부 실시형태에서, 상기 감소는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 감소일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 WNT 경로를 통한 신호전달에서의 관련된 향상(증가)이다. WNT 경로를 통한 신호전달의 향상은 WNT3A, WNT11, WNT10, WNT5a, TCF7, LEF1, AXIN2, CTNBB1, NOTCH, Fzd, LPR5/6, LGR4/5/6, APC, GSK3, c-myc, c-jun, 및 사이클린 D1(CCND1)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 유전자의 발현 수준에 의해 검출될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 Wnt 경로를 통한 신호전달의 향상은, 일부 실시형태에서, 상기 언급된 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 평가함으로써 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 마커의 신호전달/발현에서의 상기 증가는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 증가일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 인 비트로 세포독성에서의 관련된 증가 또는 유지이다. 일부 실시형태에서, 상기 증가는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 증가일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 미접촉 또는 중추 기억 표현형에서의 관련된 증가 또는 유지이다. 일부 실시형태에서, 상기 증가는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 증가일 수 있다.
본 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 방출된 사이토카인의 유형 및 양에서 관련된 변형이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 세포는 IL-6, IL-8, MIP-1, IL-1b, IL-1a, 에오탁신 및 IFNg를 포함하지만 이에 제한되지 않는 노화 및 염증에 관련된 사이토카인의 생성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 감소는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 감소일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 예측된 결과는 줄기 세포 마커의 발현에서의 관련된 증가이다. 상기 줄기 세포 마커는 CD45RA, CD62L, CCR7, TBX21, LEF1, TCF7, EOSOMES, IL7R, FOXP1, ZEB2, BCL6, CD127, 및 CXCR3를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 상기 증가는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 증가일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 세놀리틱에 대한 감응성의 관련된 감소이다. 일부 실시형태에서, 상기 감소는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 감소일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 노화 관련 분비 표현형(SASP)의 관찰에서의 관련된 감소이다. 일부 실시형태에서, 상기 감소는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 감소일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 아폽토시스의 관련된 감소이다. 일부 실시형태에서, 상기 감소는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 감소일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 괴사의 관련된 감소이다. 일부 실시형태에서, 상기 감소는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 감소일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 미토콘드리아 막 전위에서의 관련된 증가이다. 일부 실시형태에서, 상기 증가는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 증가일 수 있다.
상기 섹션에 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 하향조절하는 것의 관찰된 또는 예측된 결과는 세포 글루타티온 함량에서의 관련된 증가이다. 일부 실시형태에서, 상기 증가는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 심지어 적어도 약 300%의 증가일 수 있다.
전달 방법
USP16 억제제는 다양한 상이한 방식으로 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, 억제제(예를 들어, 소분자)는 배양액 중 세포의 배지에 직접 첨가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 억제제는 벡터를 사용하여 세포에 전달될 수 있다.
일부 실시형태에서, 억제제는 비-바이러스 벡터를 사용하여 세포에 전달될 수 있다. 예시적인 비-바이러스 벡터는 나노입자(예를 들어, 중합체성 나노입자), 리포좀(예를 들어, 양이온성 리포좀), 양이온성 지질-DNA 복합체, 지질 에멀젼, 칼슘 포스페이트, 중합체 복합체, 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 비-바이러스 벡터는 이중 가닥 DNA(dsDNA)(예를 들어, 플라스미드), 또는 단일 가닥 DNA(ssDNA)를 패키징하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-바이러스 벡터는 USP16의 억제제를 인코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 억제제는 바이러스 벡터를 사용하여 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, 억제제를 인코딩하는 핵산 서열은 바이러스 벡터로 패키징될 수 있고, 바이러스 벡터는 이후 세포를 형질도입하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 복제 결함, 또는 적어도 조건부 복제 결함이다. 본 개시내용의 조성물 및 방법에서 사용하기에 적합한 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터), 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-관련 바이러스 벡터(AAV)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVrh32.33, AAVrh74, 소 AAV, 및 조류 AAV로부터 선택된 혈청형을 갖는 AAV 벡터이다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터는 본원에 이의 전체가 포함되어 있는 국제공개 WO 2019/028306호의 표 1에 개시된 임의의 AAV 벡터로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 억제제는 트랜스포존 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 트랜스포존 시스템은 인간 세포를 포함한 세포에서의 트랜스 유전자 구축물의 장기적 발현 및 안정한 게놈 통합 능력을 갖는다. 일부 실시형태에서, 트랜스포존 시스템은 슬리핑 뷰티 시스템이다. 슬리핑 뷰티 시스템은 척추 동물의 게놈으로 DNA의 특정 서열을 삽입하도록 고안된 슬리핑 뷰티(SB: Sleeping Beauty) 트랜스포사아제 및 트랜스포존으로 구성된다. 다른 Tc1/마리너-유형 트랜스포사아제와 마찬가지로, SB 트랜스포사아제는 수용 DNA 서열의 TA 디뉴클레오티드 염기쌍에 트랜스포존을 삽입한다.
억제제는 또한 전기천공을 사용하여 세포에 전달될 수 있다. 전기천공은 간략하게 세포막의 기공을 개방하여, 예를 들어 DNA 벡터를 세포로 이동시킨다.
일부 실시형태에서, 억제제는 단독으로 전달되거나, 하나 이상의 첨가제와 함께 전달된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 첨가제는 USP16의 제2 억제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 첨가제는 Wnt 아고니스트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 첨가제는 R-스폰딘(Rspo) 아고니스트를 포함한다. 일부 실시형태에서, USP16의 억제제 및 제2 작용제는 동시에 전달된다. 일부 실시형태에서, USP16의 억제제 및 제2 작용제는 순차적으로 전달된다.
약학 조성물
또한 USP16의 억제제를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 약학적으로 허용가능한 조성물은 USP16의 억제제와 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다.
본원에서 사용된 "약학적으로 허용가능한 담체" 또는 "약학적으로 허용가능한 부형제"는, USP16의 억제제와 조합된 경우, USP16의 억제제가 생물학적 활성을 갖도록 하는 임의의 물질을 포함한다. 부형제는 형태 또는 점조도를 제공할 수 있거나, 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제는 안정화제, 습윤제 및 에멀젼화제, 다양한 삼투압 농도의 염, 캡슐화제, 완충제 및 피부 침투 향상제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예는 임의의 표준 약학적 담체/부형제, 예컨대 포스페이트 완충 식염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 유/수 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여를 위한 바람직한 희석제는 포스페이트 완충 식염수(PBS) 또는 표준(0.9%) 식염수이다. 상기 담체를 포함하는 조성물은 종래의 잘 알려진 방법(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990]; 및 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005] 참조)에 의해 제형화된다.
치료 방법
일부 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상에서 치료 방법은 치료적 유효량의 USP16의 억제제를 대상에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "치료적 유효량"은 대상 또는 세포에서 USP16의 발현 및/또는 활성을 감소시키기에 충분한 억제제의 양을 의미한다.
일부 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상에서 치료 방법은 USP16의 억제제와 이전에 접촉되었던 세포의 치료적 유효 개수를 대상에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상에서 치료 방법은 USP16를 하향조절하도록 변형되었던 세포의 치료적 유효 개수를 대상에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "치료적 유효 개수"는 대상에서 질환 또는 장애의 증상을 완화 또는 제거하기 위해 필요한 세포의 개수를 의미한다. 세포의 치료적 유효 개수는 약 102개, 약 103개, 약 104개, 약 105개, 약 106개, 약 107개, 약 108개, 약 109개, 약 1010개, 약 1011개, 또는 약 1012개 세포 이상일 수 있다.
일부 실시형태에서, 치료는 동종이계성이다. 다른 실시형태에서, 치료는 자가유래성이다. 거부 가능성 등을 최소화하도록, 치료를 위한 세포를 준비하기 위해 부가적인 유전자 변형이 도입될 수 있음을 유의한다.
일부 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상에서 치료 방법은 USP16의 억제제를 인코딩하는 서열을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)를 대상에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 인 비보 대상에서 하나 이상의 세포 유형에서 USP16를 억제할 수 있다.
USP16 억제제 또는 USP16를 하향조절하도록 변형된 세포는 경구, 직장, 점막, 국소, 경피, 흡입, 정맥내, 피하, 피내, 근내, 관절내, 척추강내, 심실내, 정맥내, 복강내, 비강내, 또는 안내(intraocular) 투여 경로를 포함하여 다양한 상이한 투여 경로를 사용하여 대상에 투여될 수 있다.
세포의 억제제는 대상에 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 이상 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 억제제 또는 세포는 예를 들어 1일 1회, 1주에 1회, 1개월에 1회, 3개월에 1회, 6개월에 1회, 1년에 1회 등 치료적으로 유효한 간격으로 대상에 투여될 수 있다.
대상은 예를 들어 래트, 개, 마우스, 말, 고양이, 닭, 비인간 영장류, 또는 인간일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상은 인간이다. 인간은 예를 들어 약 5세 미만, 약 10세 미만, 약 20세 미만, 약 30세 미만, 약 40세 미만, 약 50세 미만, 약 60세 미만, 또는 60세 초과일 수 있다. 대상은 남성일 수 있거나, 대상은 여성일 수 있다.
대상은 하나 이상의 질환 또는 장애를 가질 수 있거나, 갖는 것으로 의심될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상은 암을 갖는다. 암은 예를 들어 백혈병, 림프종, 흑색종, 다발성 골수종, 췌장암, 유방암, 결장암, 폐암, 결장직장암, 또는 뇌암일 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 고형 종양일 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 혈액암일 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 전이성 암일 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상은 하기로부터 선택된 암을 가질 수 있거나 이를 갖는 것으로 의심될 수 있다: 급성 골수성 백혈병, 부신피질암, AIDS 관련 암, AIDS 관련 림프종, 항문암, 맹장암, 성상세포종, 기저세포암, 담관암, 방광암, 골암(예를 들어, 골육종/악성 섬유성 조직구종), 뇌간 신경교종, 소뇌 성상세포종, 대뇌 성상세포종/악성 신경교종, 뇌실막종, 수모세포종, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 시각 경로 및 시상하부 신경아교종, 유방암, 기관지 선종/유암종, 버킷 림프종, 피부 T 세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 원발성 중추신경계 림프종, 카르시노이드 종양, 카르시노이드 종양, 중추신경계 림프종, 소뇌 성상세포종, 대뇌 성상세포종/악성 신경교종, 자궁경부암, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 모세포 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 결장암, 피부 T 세포 림프종, 결합조직성 소원형 세포종, 자궁내막암, 뇌실막종, 식도 암, 유잉 육종, 두개외 생식세포종양, 성선외 생식세포종양, 간외담관암, 안구암(예를 들어, 안내 흑색종, 망막모세포종), 담낭암, 위암(gastric/stomach cancer), 위장관 카르시노이드 종양, 위장관기질종양(GIST), 생식 세포 종양(두개외, 생식선 외 또는 난소), 임신성 융모성 종양, 뇌간 신경교종, 소아 대뇌 성상세포종, 위 카르시노이드, 헤어리(hairy) 세포 백혈병, 두경부암, 심장암, 간세포(간)암, 호지킨 림프종, 인두암, 시상하부 및 시각경로신경교종, 안내흑색종, 섬세포암종, 카포시육종, 신장암(신장세포 암), 후두암, 입술 및 구강암, 지방육종, 원발성 간암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 메르켈 세포 암종, 중피종, 구강(mouth)암, 다발성 내분비 종양 증후군, 다발성 골수종/형질 세포 종양 , 균상식육종, 골수이형성 증후군, 골수이형성/골수증식성 질환, 만성 골수증식성 장애, 비강 및 부비동암, 비인두암, 신경모세포종, 비소세포폐암, 구강(oral)암, 구강인두암, 골육종/악성 섬유성 조직구종 암, 난소 상피암(표면 상피-기질 종양), 난소 생식 세포 종양, 난소 저악성 잠재성 종양, 췌장암(예를 들어, 섬세포 췌장암), 부비동 및 비강암, 부갑상선암, 음경암, 인두암 , 갈색세포종, 송과체 성상세포종, 송과체 생식세포종, 송과체모세포종 및 천막상피 원시신경외배엽종양, 뇌하수체선종, 형질세포종양, 흉막폐모세포종, 원발성중추신경계림프종, 전립선암, 직장암, 신우 및 요관암, 이행세포암, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 연조직육종, 자궁육종, 세자리(Sezary) 증후군, 비흑색종 피부암, 흑색종, 소세포폐암, 소장암, 연조직육종, 편평상피세포암 세포 암종, 잠복 원발성 편평 경부암, 위암, 천막상 원시 신경외배엽 종양, T 세포 림프종(피부), 고환암, 인후암, 흉선종 또는 흉선 암종, 갑상선암, 신우 및 요관의 이행 세포암, 영양막 종양, 요도암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 시각 경로 및 시상하부 신경교종, 소아기, 외음부암, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 및 빌름스 종양.
일부 실시형태에서, 대상은 혈액 장애, 예컨대 혈우병 A, 혈우병 B, 지중해 빈혈, 또는 빈혈 등을 갖는다.
또한, 질환 또는 장애를 앓는 대상의 치료를 위한 약학적 키트가 제공되고, 키트는, USP16의 발현을 하향조절하거나 녹아웃하도록 변형된 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 T세포와 같은 면역 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 유전적으로 변형된 세포이다. 일부 실시형태에서, 키트는 대상에게 세포를 투여하기 위한 지침서를 추가로 포함한다.
또한, 세포 기반 요법을 위해 사용하기 위한 세포의 제조를 위한 키트가 제공되고, 키트는 USP16의 억제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, USP16의 억제제는 핵산, 단백질, 소분자, 또는 대분자이다. 일부 실시형태에서, USP16의 억제제는 Cas 뉴클레아제, TAL 뉴클레아제, Zn 핑거 뉴클레아제, RNAi 분자(예를 들어, 소헤어핀 RNA(shRNA), 소간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA, 비대칭 간섭 RNA), 안티센스 분자, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드, DNA-RNA 키메라, 모르폴리노 올리고, lhRNA, miRNA 내장 shRNA, 소형의 내부 분절된 RNA, 항체 또는 엑소좀이다. 일부 실시형태에서, 키트는 USP16의 억제제와 세포를 접촉시키기 위한 지침서를 추가로 포함한다.
또한, 상기 방법을 수행하기 위한 제조품이 제공된다. 일부 실시형태에서, 제조품은 복수의 용기, 예를 들어 밀봉가능 용기를 포함하고, 각각은 개별적으로 대상에게 투여하기 위한 단위 용량의 세포, 패키징 재료, 및/또는 라벨 또는 패키징 삽입물을 포함한다.
상기는 본 발명의 예시이고 이를 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명은 하기의 청구범위에 의해 정의되며, 이에 포함되는 청구범위의 균등물을 포함한다.
실시예
하기 실시예는 예시를 위해 포함되며 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예 1: CDKN2A 수준이 T 세포 분화 중 증가함.
이전에 공개된 마이크로어레이 데이터를 사용하여 인 실리코 분석을 수행하였다(문헌[Gattinoni L., et al, "A human memory T cell subset with stem cell-like properties," Nature Medicine (2011)] 참조; 또한, 문헌["Expression data from human naive (TN), stem cell memory (TSCM), central memory (TCM) and effector memory (TEM) CD8+ T cells," Gene Expression Omnibus (GEO): GSE23321 (2011)] 참조). 본 연구에서, 3명의 건강한 인간 혈액 기증자는 사전 동의 후 림프구가 풍부한 성분채집 혈액을 제공했다.
다양한 분화 단계에서 T 세포 중 CDKN2A(프로브: 8160441)의 발현 수준(도 1)을 GPL6244 플랫폼을 사용하여 분석하였다. GEO2R을 사용하여 분석을 수행하였다.
인 실리코 분석 결과를 도 2에 제공한다. 중추 기억(TCM) 및 효과기 기억 세포(TEM)에 비해, 미접촉 T 세포(TN) 및 기억 줄기 세포(TSCM)에서 CDKN2A의 상대적 발현은 낮았다. 이러한 데이터는 T 세포 분화 중 CDKN2A 수준이 증가함을 입증한다.
실시예 2: 인 비트로 T 세포 활성화는 세포 에이징을 유도하고, 줄기 세포 마커를 감소시킴.
이전 공개된, 공개적으로 입수가능한 마이크로어레이 데이터를 분석하기 위해, 온라인 툴 GEO2R(NCBI)을 사용하여 인 실리코 분석을 수행하였다(문헌[Cieri, et al, "IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors," Blood (2013)] 참조; 또한, 문헌[Gene Expression Omnibus (GEO): GSE41909 (2012)] 참조). 본 연구에서, 미접촉 및 중추 기억(CM) 표현형에 대해 분류된 조작되지 않은 정제된 T 세포(이전) 또는 인 비트로에서 활성화되고 형질도입된 T 세포 하위세트(이후)에서 RNA가 수집되었다. 인 비트로 생성된 하위세트는 활성화 후 IL-7/IL-15의 존재 하에서 15일 동안 배양액에서 유지되었다.
인 실리코 분석 결과를 도 3a 내지 3e에 제공한다. T 세포의 인 비트로 활성화는 줄기 세포 마커 BMI1을 억제하면서(도 3a), 노화 마커CDKN2A(p16)(도 3c) 및 CDKN2D(p19)(도 3b)의 발현을 유도하였다. 흥미롭게도, 이러한 이벤트는 특정 T 세포 하위유형에 특이적이지 않았고, 미접촉 및 중추 기억 T 세포에서 유지되었다. 특히, 이러한 노화 마커의 발현은 소진 마커 CTLA-4(도 3d) 및 PD-1(도 3e)이 발현되기 시작하기 훨씬 전에 관찰되었다.
따라서, 이러한 데이터는 줄기세포 특성의 감소와 노화의 유도가 유전적으로 변형된 T 세포의 제조와 관련된 과정에서 매우 초기의 이벤트임을 보여준다.
실시예 3: 인 비트로 T 세포 배양 조건.
하기 제공된 것은 인 비트로에서 T 세포를 배양하고 활성화시키기 위해 사용된 조건이다. 이러한 방법에 따라 제조된 T 세포는 하기 다양한 실시예에서 사용되었다.
0일에, 버피코트를 임상 시설에서 얻었고, PBMC를 FicollTM을 사용하여 밀도 원심분리에 의해 단리하였다. 마그네틱 비드를 사용하여 CD3 농축을 수행하고, Myltenyi Biotec을 사용하여 PanT 세포 단리를 수행하였다. T 세포를 aCD3/aCD28 Dynabeads(3:1 비)로 활성화하였다.
2일에, 형질도입 첫번째 라운드를 렌티바이러스로 수행하였다. 3일에, 형질도입 두번째 라운드를 렌티바이러스로 수행하였다.
6일에, 비드를 제거하였다. 6 내지 8일에, FACSAria II(BD)로 유세포 분석 분류를 수행하였다.
세포를 RPMI, 10% FBS, 페니실린-스트렙토마이신, 및 100IU의 IL-2에서 배양하였다. 15일까지 0.3 x 106개의 세포/ml의 밀도로 세포를 플레이팅한 후, 0.5 x 106개의 세포/ml의 밀도로 세포를 플레이팅하고, 25일 후 1 x 106개의 세포/ml의 밀도로 세포를 플레이팅하였다.
실시예 4: 1차 T 세포에서 USP16 발현의 하향조절은 증식을 증가시키고, 세포 종료를 감소시킴.
USP16(shUSP16)에 대해 유도된 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 Dharmacon에서 구입하였다. 1차 T 세포를 실시예 3에 기재된 것처럼 활성화하고, shUSP16 또는 비-표적화 shRNA(대조군)를 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입하고, 8일에 GFP에 대해 분류하였다. 동일한 개수의 세포를 두 군 모두에서 분류하였다. 0.15 내지 0.5 x 106개의 세포를 분류 후 90% 초과의 순도로 플레이팅하고, Vi-CELL XR 세포 카운터(Beckman Coulter)를 사용하여 트립판 블루 배제에 의해 2 내지 4일 마다 계수하였다. 초기 세포 씨딩과 비교한 확장 비로서 증식을 측정하였다. 총 T 세포 수가 50,000개 미만인 경우 세포를 종료된 것으로 간주했다.
8개의 상이한 건강한 기증자의 버피코트로부터 수득된 1차 T 세포를 사용하여 실험을 반복하였다. 도 4a 내지 4c에 도시된 그래프는 평균과 SEM 값을 보여주고, t-테스트는 두 군을 비교하기 위해 사용되었다.
T 세포에서 USP16의 하향조절은 20일에 T 세포 활성화(4.42 vs 8.17, p=0.0286, n=8) 및 30일에 T 세포 활성화(2.385 vs 4.014, p=0.037, n=8) 시 증가된 확장을 유도했다(도 4a). Sytox 염색을 사용한 유세포 분류 분석은 또한 30일에 USP16를 하향조절하는 T 세포가 개수도 많을 뿐 아니라 보다 생존력도 더 높음을 보였다(13.96 vs 25.93, p=0.020, n=7)(도 4b).
T 세포 종료 어세이(도 4c)는 인 비트로에서 T 세포 지속성을 증가시키는 데 있어 USP16 발현의 하향조절의 강력한 효과를 보였다(생존 중앙값 41 vs 60.5일, p=0.0005, n=6).
실시예 5: 1차 T 세포에서 USP16 발현의 하향조절은 CD4/CD8 비를 손상시키지 않음.
유세포 분류 분석을 20일에 수행하고, CD4 및 CD8의 비를 계산하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, USP16 발현의 특정 하향조절은 CD4/CD8 비에 대해 영향이 없었다(n=6; CD4 및 CD8 백분율은 Sytox-음성 GFP+ T 세포에 대해 계산되었음).
실시예 6: Navitoclax-유도된 세포 사멸은 인 비트로 배양 중 T 세포를 증가시킴.
활성화된 1차 T 세포를 지시된 양의 Navitoclax로 처리하였다. Navitoclax는 선택적으로 노화 세포를 표적으로 하는 세놀리틱 약물이다(문헌[Zhu et al., Aging Cell, 2016]). 72시간 후, Sytox-음성 T 세포를 MACSQuant(Myltenyi Biotec)를 사용하여 유세포 분석에 의해 계수하였다.
"보다 어린" T 세포(12일)는 "보다 늙은" T 세포(24일)에 비해 Navitoclax-유도된 세포 사멸에 대해 덜 민감하다. 각각의 실험에서, 2개의 상이한 1차 T 세포 배양액을 각각의 조건에 대해 시험하였다(각각의 조건에 대해 4회 반복). 상이한 Navitoclax 농도를 시험하는 세 가지 실험은 도 6A 내지 6C에 도시되어 있다. DMSO는 음성 대조군이다. Navitoclax(효소 번호 HY-10087)는 MCE에서 구입하였다.
실시예 7: USP16를 하향조절하는 T 세포는 Navitoclax 처리에 덜 민감함.
1차 T 세포를 기재된 것(실시예 3)처럼 활성화하고, shUSP16 또는 비-표적화 shRNA(shC)를 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입하였다. 이후, T 세포를 지시된 양의 Navitoclax로 처리하였다. 72시간 후, Sytox-음성 GFP+ 세포를 계수하고, 죽은 세포의 개수를 100%-(처리된 개수/미처리된 개수) 세포로서 계산하였다. 2개의 상이한 1차 T 세포 배양액으로 2개의 상이한 시점(12일, 22일)을 시험하였다(각각의 조건에 대해 4회 반복). 도 7a 내지 7c에 도시된 바와 같이, shUSP16 T 세포는 이들의 일치하는 대조군보다 Navitoclax-유도된 세포 사멸에 덜 민감하다.
실시예 8: T 세포 자가 재생은 인 비트로 배양 중 감소됨.
인 비트로 한계 희석 어세이를 사용하여 특정 집단에서 줄기 세포의 빈도를 결정하였다. 웰 당 1000 내지 4개의 세포의 세포 농도 범위(1:4 희석)는 T 세포 자가 재생력의 차이점을 감지하기에 충분한 것으로 결정되었다. 여기서, 인 비트로 T 세포 에이징은 감소된 자가 재생을 유발한다고 입증된다.
보다 어린 T 세포(8일)를 보다 늙은 T 세포(35일)와 비교하였다. 세포를 특정 농도에서 씨딩하고, 군집 형성을 2주 후에 평가하였다. 신선한 IL-2를 3 내지 4일마다 첨가하였다. 건강한 기증자로부터 얻은 2개의 1차 T 세포를 매 시점마다 시험하였다(세포 농도 당 8회 반복). 극한 희석 분석(ELDA: extreme limiting dilution analysis) 소프트웨어(bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, 보다 늙은 T 세포는 보다 어린 세포(1/14.1, p=2.37e-13)에 비해 감소된 줄기 세포 빈도(1/137.9)를 갖는다.
실시예 9: USP16 발현의 하향조절은 인 비트로 T 세포 자가 재생을 향상시킴.
1차 T 세포를 기재된 것(실시예 3)처럼 활성화하고, shUSP16 또는 비-표적화 shRNA(대조군)를 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입하고, 8일에 GFP에 대해 분류하였다. 웰 당 1000 내지 4개의 세포 농도 범위(1:3 희석)로 한계 희석 어세이를 20일(도 9) 및 30일(도 10)에 수행하고, 군집을 플레이팅 2주 후에 계수하였다. 각각, 4 및 5개의 1차 T 세포 배양액을 시험하였다(세포 농도 당 8회 반복). 신선한 IL-2를 3 내지 4일마다 첨가하였다. ELDA 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
USP16 발현의 하향조절은 줄기 세포 빈도를 유의하게 증가시킨다(sh대조군 vs shUSP 20일: 1/56,9 vs 1/21,8, p=1.37e-6 및 30일: 1/129.5 vs 78.8, p=0.00676).
실시예 10: USP16 발현의 하향조절은 줄기 세포 기억 T 세포를 증가시킴.
1차 T 세포를 기재된 것(실시예 3)처럼 활성화하고, shUSP16 또는 비-표적화 shRNA(대조군)를 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입하고, 8일에 GFP에 대해 분류하였다. IL-2의 존재 하에서 세포를 배양하고, 이들의 표현형을 20일에 분석하였다. CD4-PerCP-5.5 또는 CD8-BV510, CD62L-알로파이코시아닌, CD45RA-BV510 또는 PE-Cy7(Biolegend)에 대해 세포를 염색하였다. 미접촉 또는 줄기 세포 기억 T 세포(TNa/SCM)를 Sytox-GFP+CD45RA+CD62L+로서 확인하였다. TNa/SCM의 개수를 (#CD4 또는 CD8 T세포* TNa/SCM백분율)/100로서 계산하였다. 유세포 분석을 MACQuant(Myltenyi Biotec)에 대해 수행하였고, 데이터를 FlowJo(shCtrl vs shUSP CD4: 0.4978 vs 0.7915, p=0.0673 및 CD8: 2.469 vs 4.984, p=0.00392, n=7)로 분석하였다. USP16 발현의 하향조절은 배양액에서 CD4+CD45RA+CD62L+ 세포(도 11a) 및 CD8+CD45RA+CD62L+ 세포(도 11b)의 수를 각각 1.7 (p=0.0205) 및 1.9 (p=0.0097)만큼 증가시킨다.
실시예 11: 하향조절된 USP16 발현을 갖는 T 세포는 인 비트로에서 종양 세포 살해 능력을 유지시킴.
세포독성 어세이를 수행하였다. 간략하게, 20일된 T 세포를 상이한 효과기:표적(E:T) 비에서 종양 세포와 함께 플레이팅하고, 유세포 분석(MACSQuant, Myltenyi Biotec)을 사용하여 세포 계수에 의해 72시간 후 살해 효율을 측정하였다. 살해 백분율은 (표적 수-잔류 표적 수)*100/표적 수로서 측정되었다. NALM 세포는 표적 세포로서 사용되었고, 유세포 분석에 의한 확인을 위해 mRuby로 감염되었다. 5개의 상이한 1차 T 세포 배양액을 시험하였다(도 12a). 31일에 또한 세포독성을 시험하고, 차이점은 관찰되지 않았다(데이터는 도시되지 않음).
IL-2는 세포 씨딩 24시간 후 ELISA(Biolegend)에 의해 측정하였다. 도 12b에 나타난 바와 같이, USP16 발현의 하향조절은 항원 노출 시 IL-2 생성 효과를 갖지 않았다.
실시예 12: BMI-1/USP16/CDKN2A 경로는 인간에서 CAR-T 세포 지속성에 수반됨.
이전에 공개된 마이크로어레이 데이터를 사용하여 인 실리코 분석을 수행하였다(문헌[Long, A.H., et al, "4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors," Nature Medicine (2015)] 참조; 또한, 문헌["Expression data from Chimeric Antigen Receptor (CAR) Expressing T cells," Gene Expression Omnibus (GEO): GSE65856 (2015)] 참조). 건강한 기증자로부터 분리된 인간 T 세포는 각각 CD28z 또는 4-1BB 공동자극 도메인을 갖는 비긴장성 신호전달 CAR(CD19) 또는 긴장성 신호전달 CAR로 형질도입되었다. CDKN2A 및 BMI-1의 발현 수준을 GPL570 플랫폼을 사용하여 분석하였다. CDKN2A의 경우, 2개의 프로브를 분석하고, CD28 공동자극에 대해 발현 수준을 정규화하였다. 분석을 GEO2R을 사용하여 수행하였다.
4-1BB 자극은 CD28에 비해 CD19.CAR 임상 시험에서 더 높은 지속성을 입증하기 위해 나타났다. 이러한 분석에서, 보다 지속성 세포는 감소된 수준의 CDKN2A(도 13a) 및 보다 높은 수준의 BMI-1(도 13b)을 발현하고, 이는 CAR-T 설정에서도 T 세포에서의 이러한 경로의 중요성을 입증한다.
실시예 13: USP16을 표적화하는 shRNA의 대안의 세트는 세포 증식을 증가시키면서, USP16을 효과적으로 하향조절하고, 노화 마커를 억제함.
새로운 세트의 shRNA를 pSIH 백본으로 클로닝하였으며, 여기서 shRNA 발현은 H1 프로모터에 의해 구동된다. 벡터는 또한 T2A 서열을 통해 GFP와 퓨로마이신 내성을 공동 발현하도록 조작되었다. 새로운 shRNA 서열은 shUSP16#1 5'-GACTGTAAGACTGACAATAAA-3'(서열 번호: 8) 및 shUSP16#2 5'-TATATCAGTTCACCCGTAAT-3'(서열 번호: 9)이었다. 1차 T 세포를 기재된 것(실시예 3)처럼 활성화하고, shUSP16#1, shUSP16#2 또는 스크램블된 shRNA(대조군)를 공동발현하는 렌티바이러스로 형질도입하고, 세포를 6일에 퓨로마이신으로 선택하였다. 1 내지 1.25 x 106개의 세포를 퓨로마이신 선별 후 90% 초과의 순도로 플레이팅하고, Vi-CELL XR 세포 카운터(Beckman Coulter)를 사용하여 트립판 블루 배제로 2 내지 4일 마다 계수하였다. qPCR을 수행하여 15일에 USP16 발현의 하향조절(도 14a) 및 노화 마커 CDKN1A의 발현(도 14b)을 입증하였다. 활성화 후 15일에 sh대조군에 비해 증가된 배수로 증식을 측정하였다. 3개의 상이한 건강한 기증자의 버피코트로부터 얻은 1차 T 세포를 사용하여 실험을 반복하였다.
T 세포에서 USP16의 하향조절(대조군 vs shUSP#1: 56%, p<0.0001 및 대조군 vs shUSP16#2: 53%, p<0.0001)은 노화 마커 CDKN1A를 유의하게 감소시키고(대조군 vs shUSP#1: 23%, p=0.0009 및 대조군 vs shUSP16#2: 37%, p=0.0014), 약 1.31 및 2.33배로 증식을 증가시킨다(각각, shUSP#1 및 shUSP#2). 도 15는 USP16 발현 하향조절이 증가된 세포 증식을 유도함을 보여준다.
실시예 14: USP16 발현의 하향조절은 WNT 경로를 통한 신호전달을 증가시키고, 줄기 세포 기억 T 세포 개수와 인 비트로 활성을 증가시킴.
1차 T 세포를 기재된 것(실시예 3)처럼 활성화하고, shUSP16#1, shUSP16#2 또는 비표적화 shRNA(sh대조군)를 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입하고, 세포를 6일에 퓨로마이신으로 선택하였다. 15일에 세포를 수집하고, WNT 경로의 다운스트림 조절자인 LEF1(도 16a) 및 TCF7(도 16b)의 발현에 대해 qPCR로 분석하였다. 20일에, 세포를 CD4-PE, CD8-BV510, CD62L-알로파이코시아닌 및 CD45RA-APC-Cy7(Biolegend)에 대해 염색하였다. 줄기 세포 기억 T 세포(Tscm)를 Sytox-GFP+CD45RA+CD62L+로, 중추 기억 T 세포(Tcm)를 Sytox-GFP+CD45RA-CD62L+로, 효과기 기억 T 세포(Tem)를 Sytox-GFP+CD45RA-CD62L-로, 말단 효과기 T 세포(Teff)를 Sytox-GFP+CD45RA+CD62L- 로(도 17a) 확인하였다. 세포를 CD8 집단에 대해 게이팅하였다. Tscm의 특정 증가를 표현형 비로서 도시하였다(도 17b).
웰 당 1000 내지 4개의 세포 농도 범위(1:3 희석)로 한계 희석 어세이를 20일(도 18)에 수행하고, 군집을 플레이팅 2주 후에 계수하였다. 4개의 1차 T 세포 배양액을 시험하였다(세포 농도 당 8회 반복). 신선한 IL-2를 3 내지 4일마다 첨가하였다. ELDA 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
USP16 발현의 하향조절은 LEF1의 발현을 유의하게 증가시키고(대조군에 비해 배수 증가, shUSP16#1: 1.650, p=0.0056; shUSP16#2는 유사한 경향을 보임), TCF7의 발현을 유의하게 증가시켜(대조군에 비해 배수 증가, shUSP16#1: 2.804, p=0.086; shUSP16#2: 1.428, p=0.0467), WNT 경로의 보다 높은 활성화를 입증한다. USP16 발현의 하향조절은 또한 줄기 세포 빈도를 유의하게 증가시키고(대조군에 비해 배수 증가, shUSP16#1: 2.022, p=0.0082; shUSP16#2: 2.63, p=0.0001), 보다 중요하게는, 줄기 세포 활성과 자가 재생력을 유의하게 증가시킨다(sh대조군 vs shUSP#1 vs shUSP16#2: 1/51,9 vs 1/25,1 vs 1/22.9, p=0.000494 및 p=8.62e-05). 데이터를 평균 +/- SEM으로 도시한다.
실시예 15: USP16 발현의 하향조절은 소진 마커 CD69 발현을 감소시킴.
1차 T 세포를 기재된 것(실시예 3)처럼 활성화하고, shUSP16#1, shUSP16#2 또는 비표적화 shRNA(sh대조군)를 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입하고, 세포를 6일에 퓨로마이신으로 선택하였다. 20일에, T 세포를 CD69-알로파이코시아닌(Biolegend)에 대해 염색하고, T 세포를 MACSQuant(Miltenyi Biotec)로 분석하였다(도 19). 3개의 1차 T 세포 배양액을 분석하였다.
USP16 하향조절은 소진 마커 CD69의 발현을 감소시켰다(sh대조군 vs shUSP#1: 41%, p=0.0443 및 sh대조군 vs shUSP16#2: 40%, p=0.0569).
실시예 16: USP16 발현을 하향조절하는 T 세포는 인 비트로에서 종양 세포 살해 능력을 유지시킴.
세포독성 어세이를 수행하였다. 간략하게, 20일된 T 세포를 상이한 효과기:표적(E:T) 비에서 종양 세포와 함께 플레이팅하고, 유세포 분석(MACSQuant, Miltenyi Biotec)을 사용하여 세포 계수에 의해 72시간 후 살해 효율을 측정하였다. 살해 백분율은 (표적 수-잔류 표적 수)*100/표적 수로서 측정되었다. NALM 세포는 표적 세포로서 사용되었고, 유세포 분석에 의한 확인을 위해 mRuby로 감염되었다. 4개의 상이한 1차 T 세포 공동배양액을 시험하였다(도 20). USP16 발현의 하향조절은 표적 세포를 살해하기 위한 T 세포의 능력을 감소시키지 않는다.
실시예 17: USP16 발현의 CRISPR-매개 녹아웃은 줄기 세포 기억 T 세포를 증가시킴.
1차 T 세포를 기재된 것(실시예 3)처럼 활성화하였다. 활성화 후 6일에서, dynabead를 제거하고, 2.5:1 비의 sgRNA:Cas9로 Neon 형질감염 시스템(ThermoFisher)을 사용하여 T 세포를 전기천공하였다. 실험은 Synthego에 의해 1차 T 세포에 최적화된 프로토콜에 따라 수행되었다(CRISPR는 네온 전기천공 프로토콜, 2018 버전을 사용하여 RNP를 갖는 인간 1차 CD4+ T 세포를 편집함). 사용된 sgRNA는 하기와 같다: gUSP16#1 5' - UGGCGUCAGAUAGUGCUUCA - 3'(서열 번호: 10) 및 3개의 상이한 sgRNA를 포함하는 gSynthego(gRNA-A: 5' - GUGUGCAGACACAUUAGAAA - 3' (서열 번호: 11); gRNA-B: 5' - UAUUGUCAGUCUUACAGUCU - 3' (서열 번호: 12); gRNA-C: 5' - GUUUGGCUGUGUCUUAAAUG - 3' (서열 번호: 13)). Mock으로서 확인된 대조군 T 세포를 전기천공하였지만 Cas9:sgRNA 혼합물은 첨가하지 않았다. 이후, 9일(도 21a) 및 14일(도 21b)에서 qPCR에 의해 USP16 발현에 대해 세포를 평가하고, 효율적인 녹아웃을 일부 집단에서 관찰하였다. 활성화 후 15일에, 세포를 CD4-PE, CD8-BV510, CD62L-알로파이코시아닌 및 CD45RA-APC-Cy7(Biolegend)에 대해 염색하였다. 줄기 세포 기억 T 세포(Tscm)를 Sytox-GFP+CD45RA+CD62L+로서 확인하고, mock 세포와 비교한 비로 그래프로 표현되었다(도 22). 2개의 상이한 건강한 기증자의 버피코트로부터 얻은 1차 T 세포를 사용하여 실험을 반복하였다.
CRISPR 기술을 사용한 USP16 발현의 하향조절은 줄기 세포 기억 T 세포를 1.178 및 1.49(각각 gUSP16# 및 gSynthego)로 증가시킨다.
실시예 18: USP16 발현의 CRISPR-매개 하향조절은 T 세포-매개 살해를 손상시키지 않음.
세포독성 어세이를 수행하였다. 간략하게, 20일된 T 세포를 1:1 및 1:2 효과기:표적(E:T) 비에서 종양 세포와 함께 플레이팅하고, 유세포 분석(MACSQuant, Myltenyi Biotec)을 사용하여 세포 계수에 의해 72시간 후 살해 효율을 측정하였다. 잔류 생존 세포의 백분율을 (잔류 표적 수)*100/표적 수로 측정하였다. NALM 세포는 표적 세포로서 사용되었고, 유세포 분석에 의한 확인을 위해 mRuby로 감염되었다. 2개의 상이한 1차 T 세포 배양액을 시험하였다(도 23). USP16 발현의 CRISPR-매개 하향조절은 인 비트로에서 종양 세포를 살해하기 위한 T 세포 능력을 변경하지 않는다.
실시예 19: USP16를 조절하도록 조작된 신규한 CAR 구축물
CD19 또는 GD2에 특이적인 2세대 CAR을 인코딩하는 플라스미드(렌티-EF1a-CD19(FMC63)-2nd-CAR(CD28)-EGFRt) 또는 GD2(렌티-EF1a-GD2(14G2a)-2nd-CAR(CD28)-EGFRt)를 Creative Biolabs에서 구입하였다. CAR 함유 플라스미드를 조작하여 USP16를 표적화하는 shRNA를 공동발현하였다. shRNA 서열은 shUSP16#1 5'-GACTGTAAGACTGACAATAAA-3'(서열 번호: 8) 및 shUSP16#2 5'-TATATCAGTTCACCCGTAAT-3'(서열 번호: 9)이다. 1차 T 세포를 기재된 것(실시예 3)처럼 활성화하고, shUSP16#1, shUSP16#2 또는 스크램블된 shRNA(대조군)를 공동발현하는 CD19.CAR 또는 GD2.CAR을 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입하였다. 세포를 IL-2에서 배양하고, EGFRt에 대해 6 내지 13일에 분류하였다. 간략하게, 세포를 비오틴 EGFR 항체(R&D)로 염색하고, LS 컬럼(Miltenyi Biotec)을 사용하여 비드와 콘쥬게이트된 항-비오틴 또는 스트렙타비딘(Miltenyi Biotec)으로 자기 분류하였다. 양성 집단을 일반 TC 처리 플레이트 또는 G-Rex 6 웰 배양 플레이트(Wilson Wolf)에서 분리 및 확장하였다. G-Rex 플랫폼을 사용하여 인 비트로 및 인 비보 적용을 위해 T 세포의 신속한 확장을 달성하였다.
실시예 20: USP16를 표적화하는 CAR-T 세포 공동발현 shRNA는 증식 이점을 가짐.
1차 T 세포를 기재된 것(실시예 3)처럼 활성화하고, shUSP16#1, shUSP16#2 또는 스크램블된 shRNA(대조군)를 공동발현하는 CD19.CAR 또는 GD2.CAR을 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입하였다. 세포를 IL-2에서 배양하고, EGFRt에 대해 6 내지 13일에 분류하였다. 세포를 분류 후 85% 초과의 순도로 플레이팅하고, Vi-CELL XR 세포 카운터를 사용하여 트립판 블루 배제로 2 내지 4일 마다 계수하였다. CD19.CAR 및 GD2.CAR 둘 모두의 활성화 15일 후, T 세포를 수집하고, USP16 발현의 하향조절을 입증하기 위해 qPCR을 수행하였다(도 24)(배수 변화 GD2.CAR (n=3): 대조군 vs shUSP#1: 0.35, p<0.0001, 및 대조군 vs shUSP16#2: 0.2452, p<0.0001, 배수 변화 CD19.CAR (n=4): 대조군 vs shUSP#1: 0.2891, p<0.0001, 및 대조군 vs shUSP16#2: 0.2566, p<0.0001). 15일에 대조군 세포에 비해 배수 증가로 증식을 측정하였다(도 25).
CAR-T 세포에서 USP16 발현 하향조절은 T 세포 확장을 향상시킨다(배수 변화 GD2.CAR (n=3): 대조군 vs shUSP#1: 2.147, p=0.0267, 및 대조군 vs shUSP16#2: 3.036, p=0.004, 배수 변화 CD19.CAR (n=4): 대조군 vs shUSP#1: 2.259, p=0.0267, 및 대조군 vs shUSP16#2: 3.036, p=0.004).
실시예 21: USP16 발현이 하향조절된 CAR-T 세포는 노화 발병 지연과 WNT 경로를 통한 신호전달의 증가를 보임.
1차 T 세포를 기재된 것(실시예 3)처럼 활성화하고, shUSP16#1, shUSP16#2 또는 스크램블된 shRNA(대조군)를 공동발현하는 CD19.CAR 또는 GD2.CAR을 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입하였다. 활성화 15일 후, T 세포를 수집하고, qPCR을 수행하였다. 각각 GD2.CAR 및 CD19.CAR-발현 세포에서 CDKN1A, CDKN2A(도 26a 및 26b)(배수 변화 GD2.CAR (n=4): 각각 CDKN1A 대조군 vs shUSP#1: 0.4360, p<0.0001, 및 대조군 vs shUSP16#2: 3.036, p=0.004. 배수 변화 CD19.CAR (n=4): CDKN2a, CDKN1A 대조군 vs shUSP#1: 0.6906, p=0.0026; 0.7228, p=0.0297 및 대조군 vs shUSP16#2: 0.8385, p=0.2325; 0.7017, p=0.0021), TCF7, LEF1, 및 Axin-2(도 27a 및 b)를 검출하는 TaqMan 프로브를 분석하였다. ACTB를 내부 대조군으로서 사용하였다(GD2.CAR (n=4) TCF7, LEF1 및 Axin-2: 각각 대조군 vs shUSP#1: 1.914 p=0.0512; 1.795 p=0.0323; 3.269 p=0.15 및 대조군 vs shUSP16#2: 1.284 p=0.0494; 1.718 p=0.0586; 2.035p=0.235. 배수 변화 CD19.CAR (n=4): TCF7, LEF1 및 Axin-2: 대조군 vs shUSP#1: 1.528, p=0.0277; 1.82, p=0.0449; 1.998, p=0.031 및 대조군 vs shUSP16#2: 1.18, p=0.2002; 1.579, p=0.0632; 1.261, p=0.2382). CAR-T 세포에서 USP16 하향조절은 노화 마커 발현의 감소와 WNT 경로의 증가된 신호전달/활성화와 관련된 유전자의 발현을 증가시켜, 세포 노화를 지연시키고, 자가 재생을 증가시킨다.
실시예 22: CAR-T 세포에서 USP16 발현의 하향조절이 줄기 세포 기억 T 세포 수 및 기능성을 증가시킴.
1차 T 세포를 기재된 것(실시예 3)처럼 활성화하고, shUSP16#1, shUSP16#2 또는 스크램블된 shRNA(대조군)를 공동발현하는 CD19.CAR 또는 GD2.CAR을 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입하였다. 15일에, GD2.CAR 및 CD19.CAR T 세포를 EGFR-AF488(R&D), CD3-PE, CD8-BV510, CD62L-알로파이코시아닌 및 CD45RA-APC-Cy7(Biolegend)에 대해 염색하였다. 줄기 세포 기억 T 세포(Tscm)를 FITC+CD45RA+CD62L+로, 중추 기억 T 세포(Tcm)를 FITC+CD45RA-CD62L+로, 효과기 기억 T 세포(Tem)를 FITC+CD45RA-CD62L-로, 말단 효과기 T 세포(Teff)를 FITC+CD45RA+CD62L-로 확인하였다. 세포를 CD8 집단에 대해 게이팅하였다. Tscm의 특정 증가를 표현형 비로서 도시하였다(도 28a 및 28b).
웰 당 1000 내지 4개의 세포 농도 범위(1:3 희석)로 한계 희석 어세이를 20일(도 29)에 수행하고, 군집을 플레이팅 2주 후에 계수하였다. 3개의 CD19.CAR 및 2개의 GD2.CAR 1차 T 세포 배양액을 시험하고(세포 농도 당 8회 반복), 함께 분석하였다. 신선한 IL-2를 3 내지 4일마다 첨가하였다. ELDA 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
USP16 발현의 하향조절은 줄기 세포 빈도를 유의하게 증가시키고(배수 변화 CD19.CAR (n=5): 대조군 vs shUSP#1: 1.994, p=0.032, 및 대조군 vs shUSP16#2: 2.273, p=0.0214, 배수 변화 GD2.CAR (n=4): 대조군 vs shUSP#1: 1.347, p=0.045, 및 대조군 vs shUSP16#2: 1.383, p=0.0037), 가장 중요하게는 줄기 세포 활성 및 자가 재생력을 유의하게 증가시킨다(CAR.대조군 vs CAR.shUSP#1 vs CAR.shUSP16#2: 1/53 vs 1/33 vs 1/30.7, p=0.00935 및 p=0.0031).
실시예 23: CAR-T 세포에서 USP16 발현 하향조절은 인 비트로 세포독성 어세이에서 살해 및 T 세포 확장을 증가시킴.
1차 T 세포를 기재된 것(실시예 3)처럼 활성화하고, shUSP16#1, shUSP16#2 또는 스크램블된 shRNA(대조군)를 공동발현하는 CD19.CAR 또는 GD2.CAR을 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입하였다. 세포를 IL-2에서 배양하고, EGFRt에 대해 6 내지 13일에 분류하였다. 16일에, 세포독성 어세이를 수행하였다. 간략하게, 세포를 계수하고, 100,000개의 T 세포(EGFR 발현에 조정됨)를 1:5 효과기:표적(E:T) 비로 플레이팅하였다. 72시간 후, 종양 세포 및 T 세포의 혼합물을 수집하고, CD3-PE, CD8-BV510, CD19- 또는 GD2-APC, EGFR-AF488 및 Sytox에 대해 염색하고, 유세포 분석(MACSQuant, Miltenyi Biotec)으로 계수하였다(도 30a 및 30b). 계수 비드(CountBright Absolute Counting beads, Invitrogen)를 획득 전에 첨가하고, 절대수를 하기와 같이 계산하였다(세포 이벤트 개수/비드 이벤트 개수)x(로트의 할당된 비드 계수(비드/50 ul)/샘플의 부피(ul)) = 세포/ul로서의 샘플의 농도). NALM 세포를 CD19.CAR T 세포에 대한 표적 세포로서 사용하고, CHLA-55 세포를 GD2.CAR T 세포에 대한 표적으로서 사용하였다. 3개의 상이한 1차 T 세포 배양액을 CD19 및 GD2 CAR에 대해 시험하였다.
CAR-T 세포에서 USP16 발현의 하향조절은 항원 자극 시 이들의 기능성을 개선한다. CAR-T 세포는 대조군에 비해 보다 많은 수의 CHLA-55 및 NALM-6 세포를 살해할 수 있었다. 또한, USP16 조절은 항원 자극 시 T 세포 확장의 유의한 증가를 유도한다(GD2.CAR (n=3) CHLA-55 잔류 세포 및 T 세포 개수: 대조군 vs shUSP#1 vs USP#2: 205317 vs 159531 vs 129186, p<0.0941; p=0.0265 및 53427 vs 79566 vs 194025, p=0.1462; p=0.0003. CD19.CAR (n=3): 대조군 vs shUSP#1 vs USP#2: 918786 vs 29688 vs 28462, p<0.0001 및 12242 vs 46674 vs 58732, p=0.05; p=0.0404).
실시예 24: CAR-T 세포에서 USP16 발현의 하향조절은 세포 건강을 증가시키고, 세포 및 미토콘드리아 스트레스를 감소시킴.
1차 T 세포를 기재된 것(실시예 3)처럼 활성화하고, shUSP16#1, shUSP16#2 또는 스크램블된 shRNA(대조군)를 공동발현하는 CD19.CAR을 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입하였다. 세포를 IL-2에서 배양하고, EGFRt에 대해 6 내지 13일에 분류하였다. 15일에 세포를 염색하고, 아폽토시스, 괴사, 미트콘드리아 막 전위 및 글루타티온 함량(GSH)에 대해 MACSQuant에 의해 분석하였다. 데이터 생성은 96 웰 플레이트에서 시약의 탈수된 패널 형태로 Mojave Bio에서 입수가능한 Amberglass 기술로 구동되었다.
도 31a에서의 플롯은 USP16 발현의 하향조절이 아폽토시스(상부 좌측: 대조군 vs shUSP16#1 vs shUSP16#2: 13.4 vs 9.40 vs 8.25) 및 괴사(상부 우측: 대조군 vs shUSP16#1 vs shUSP16#2: 14.4 vs 4.75 vs 3.96)를 감소시킴을 보여준다.
도 31b에서의 플롯은 세포 반응성 산소 종 및 스트레스에 대한 USP16 발현의 하향조절의 영향을 보여준다. 도면은 (a) 증가된 세포 건강(높은 미토콘드리아 막 전위 및 높은 GSH 함량, Q2: 대조군 vs shUSP16#1 vs shUSP16#2: 79.9 vs 89.9 vs 85.7); 및 (b) 낮은 미토콘드리아 막 전위를 갖는 세포의 감소된 백분율(Q1: 대조군 vs shUSP16#1 vs shUSP16#2: 17.2 vs 7.62 vs 9.87)을 보여준다.
실시예 25: CAR-T 세포에서 USP16 발현의 하향조절은 소진을 감소시키고, 다중의 챌린지 시 T 세포 살해를 증가시킴.
1차 T 세포를 기재된 것(실시예 3)처럼 활성화하고, shUSP16#1, shUSP16#2 또는 스크램블된 shRNA(대조군)를 공동발현하는 CD19.CAR 또는 GD2.CAR을 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입하였다. 세포를 IL-2에서 배양하고, EGFRt에 대해 6 내지 13일에 분류하였다. 16일에, T 세포를 CD69를 포함하는 소진 마커에 대해 염색하였다. CD69는 USP16에 대해 shRNA를 발현하는 CAR.T 세포에 대한 감소된 발현을 보임으로, 추가로 UPS16 조절이 기능성을 증가시키고 부분적으로 T 세포 소진을 감소시킴을 지지하였다(도 32)(GD2.CAR (n=3) CD69 %: 대조군 vs shUSP#1 vs USP#2: 37.8 vs 23.05 vs 27.8, p=0.0051; p=0.0216, CD19.CAR (n=3) CD69 %: 대조군 vs shUSP#1 vs USP#2: 37.60 vs 13.70 vs 27.17, p=0.0015; p=0.0465).
16일에, 일반 세포독성 어세이를 또한 수행하였다(실시예 22). 항원 자극 3일 후, CD19.CAR T 세포를 EGFR-AF488(R&D), CD3-PE, CD8-BV510, PD-1-알로파이코시아닌 및 Lag-3 및 CTLA4(Biolegend)에 대해 염색하였고, MACSQuant(Miltenyi Biotec)로 획득하였다. 공동배양액을 또한 신선한 종양 세포를 첨가하여 다시 챌린지하였다. 이중 종양 챌린지 시 T 세포 살해 및 확장을 3일 후 평가하였다.
순차적인 항원 자극은 소진을 유발하고, 감소된 종양 살해 및 T 세포 확장을 유도한다. CAR.T 세포에서 USP16 발현의 하향조절은 부분적으로 소진을 완화할 수 있다(도 33). 데이터를 FlowJo에 의해 분석하였다. CAR.CD19를 발현하는 3개의 상이한 1차 T 세포 공동배양액을 분석하고, 데이터를 하기 표 및 도 34에 도시한다.
Figure pct00009
USP16 발현의 하향조절은 다중 종양 챌린지 시 T 세포 살해 능력을 유의하게 증가시킨다(도 35a 및 35b). 증가된 살해 기능 외에도, USP16 발현의 하향조절은 여러 종양 챌린지 후 T 세포 확장을 유의하게 증가시켜, 어리고 건강한 T 세포를 유지하는 데 있어서 이의 중요한 역할을 강하게 입증한다(GD2.CAR (n=3) CHLA-55 잔류 세포 및 T 세포수: 대조군 vs shUSP#1 vs USP#2: 486699 vs 436500 vs 330610, p<0.2839; p=0.0021 및 223281 vs 404709 vs 722634, p=0.0004; p<0.0001. CD19.CAR (n=3): 대조군 vs shUSP#1 vs USP#2: 1749363 vs 282761 vs 160874, p=0.0242 및 5526 vs 192643 vs 204291, p=0.0385; p=0.171).
실시예 26: USP16을 표적화하는 shRNA의 공동발현은 인 비보 GD2.CAR-T 항종양 활성을 향상시킴.
1차 T 세포를 기재된 것(실시예 3)처럼 활성화하고, shUSP16#1, shUSP16#2 또는 스크램블된 shRNA(대조군)를 공동발현하는 CD19.CAR 또는 GD2.CAR을 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입하였다. 세포를 IL-2에서 배양하고, EGFRt에 대해 6 내지 13일에 분류하였다. 15일에, 세포를 냉각시키고(임상 설정을 모방하기 위해), 면역손상된 마우스에 주사하기 d-1에 해동하였다. 면역손상된 마우스(NCG(NOD CRISPR Prkdc Il2r Gamma)는 Charles River에 의해 제공되었고, NSG(NOD.Cg-Prkdc<scid>IL2rg<tm1Wjl>/SzJ)는 Jackson Laboratory에서 구입하였음). CHLA-55 신경모세포종 세포주를 Gaussia 루시퍼라아제로 형질도입하고, 백만 개의 세포를 d-7(7일 전)에 꼬리 정맥을 통해 주입하였다.
백만 개의 GD2.CAR T 세포를 0일에 꼬리 정맥을 통해 주사하고, 마우스를 칭량하고, 매주 혈액을 수집하였다(도 36). 종양 성장은 루시퍼라아제 순환을 매주 평가함으로써 모니터링되었다. 간략하게, 혈액을 수집한 후, Nanolight Technologies 루시퍼라아제 검출 키트를 사용하여 루시퍼라아제 발현에 대해 분석하였다. 혈액에서의 루시퍼라아제 발현(GLuc로 계산, RLU(상대적 발광 단위))은 종양 생착과 상관관계가 있다. 시간에 따른 CHLA-55 종양 성장이 도 37a에 도시되어 있고, 희생 시 CHLA-55 생착은 도 37b에 도시되어 있다.
USP16 발현의 하향조절은 인 비보에서 CAR T 세포 살해 기능을 유의하게 증가시켰다. 실험을 또 다른 T 세포 공동배양액으로 반복하고, 유사한 결과를 얻었다(n=4 내지 6, 대조군 vs shUSP#1 vs USP#2: 156009 vs 53279 vs 38968, p=0.0015; p=0.0003).
실시예 27: USP16을 표적화하는 shRNA의 공동발현은 인 비보 CD19.CAR-T 항종양 활성을 향상시킴.
1차 T 세포를 실시예 26에서처럼 활성화하고, 제조하였다. NALM 백혈병 세포주를 Gaussia 루시퍼라아제로 형질도입하고, 백만 개의 세포를 d-4에 꼬리 정맥을 통해 주입하였다. 이후 백만 개의 CD19.CAR T 세포를 d=0에 꼬리 정맥을 통해 주사하고, 마우스를 칭량하고, 매주 혈액을 수집하였다(도 38). 종양 성장은 루시퍼라아제 순환을 매주 평가함으로써 모니터링되었다. 간략하게, 혈액을 수집한 후, Nanolight Technologies 루시퍼라아제 검출 키트를 사용하여 루시퍼라아제 발현에 대해 분석하였다. 혈액에서의 루시퍼라아제 발현(GLuc로 계산, RLU(상대적 발광 단위))은 종양 생착과 상관관계가 있다. NALM 생착은 도 39a에 도시되어 있다. NALM 세포가 비장에서 먼저 생착됨에 따라, 희생 시점에서, 비장을 수집하고, 사진을 찍었고(도 39b), 비장의 크기는 장기에 침투된 종양의 양과 직접 상관관계가 있다.
USP16 발현 하향조절은 인 비보에서 CAR T 세포 살해 기능을 유의하게 증가시킨다(n=4 내지 6, 대조군 vs shUSP#1 vs USP#2: 81507 vs 38603 vs 5169, p=0.0132; p=0.0003).
실시예 28: USP16 발현의 일시적 하향조절.
1차 T 세포를 기재된 것(실시예 3)처럼 활성화한다. 활성화 후 6일(+/- 4일)에서, dynabead를 제거하고, Neon 형질감염 시스템(ThermoFisher)을 사용하여 T 세포를 전기천공한다. 80 nM의 작동 용액을 사용하고, NEON 설정을 실시예 17에 구체화한다. 전기천공된 세포를 IL-2에서 배양하고, 10일(+/- 4일)에서 두 번째 시간 동안 전기천공한다. 15일에, 세포를 수집하고, RNA를 추출하고, 세포를 CDKN1A, CDKN2a, CDKN2D 및 자가 재생 유전자를 비롯한 노화 유전자의 발현에 대해 분석한다. 또한 CD4-PerCP-5.5 또는 CD8-BV510, CD62L-알로파이코시아닌, CD45RA-BV510 또는 PE-Cy7(Biolegend)에 대해 세포를 염색한다. 줄기 세포 기억 T 세포(Tscm)를 Sytox-CD45RA+CD62L+로서 확인하였다. 또한 세포를 CD69을 비롯한 소진 마커에 대해 분석하고, 단일 및 다중 자극 시 살해 및 확장 능력에 대해 시험한다. 20일에, 한계 희석 어세이를 수행한다.
예측된 결과: 일시적인 siRNA 딜리버리를 이용한 USP16를 하향조절하는 T 세포는 세포 노화의 지연된 발병과 보다 많은 Tscm 세포의 개수 및/또는 백분율을 유도하는 것으로 예측된다. 추가로 이들 Tscm 세포가 한계 희석 어세이에서 더 나은 수행성을 보일 것이라고 예측된다. siRNA를 이용하여 USP16를 하향조절하는 T 세포는 또한 인 비트로 및 인 비보에서 더 높은 세포독성 능력(종양으로 NCG 또는 NSG 주사된 면역손상된 마우스에서), 및 항원 트리거링 시 보다 높은 증식 잠재력을 갖는 것으로 예측된다. 또한, T 세포 소진이 지연될 수 있다고 예측된다. 유사한 결과가 편집되거나 개질된 세포, 예를 들어 CAR-T 세포, TCR 세포, 및 유전자 편집된 세포(예를 들어, CRISPR를 이용함)에서 수득될 것으로 예측된다.
실시예 29: USP16 발현의 하향조절 및 면역억제 마이크로환경에 대한 T 세포 내성에 대한 이의 효과.
버피코트로부터 단리된 PMSC(실시예 3)를 CD8 T 세포 및 단핵구의 공급원으로서 사용한다. 간략하게, CD8 T 세포를 자기적으로 단리하고, CD3/CD28로 6일 동안 활성화하고, 스크램블된(대조군) 또는 USP16 표적화 shRNA를 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입하고, IL-2의 존재 하에서 배양한다. 자가유래성 MDCS는 7일 동안 GM-CSF 및 IL-6(10 ng/ml)의 존재 하에서 배양된 CD14+ 세포(PBMC로부터 자기적으로 단리됨)에서 개시하여 분화된다. 이 시점에서, MDSC는 3일 동안 CFSE 표지된 자가유래성 CD8 T 세포로 공동배양된다. CSFE 희석, 사이토카인 및 표현형을 이 시점에서 평가한다.
예측된 결과: MDSC가 강하게 T 세포 증식을 억제하는 동안, USP16 발현이 T 세포에서 하향조절되는 경우, MDSC-매개 억제가 덜 효과적일 것으로 예측되고, 즉 USP16 발현이 하향조절되는 T 세포는 면역억제 환경에 덜 민감할 것이다.
T 세포 증식이 Treg를 갖는 공동배양액에 의해 억제되는 경우 유사한 결과가 예측된다. 이를 시험하기 위해, 간략하게, CD4+CD25+CD127low로 확인된 자가유래성 Treg는 FACS-분류 또는 자기 단리를 통해 단리되고, CD8 T 세포에 상이한 비(1:1, 1:0.5, 1:0.25, 효과기-대-TReg 등)로 첨가된다(상기 참조). 공동배양 6일 후, 나눠진 전구체의 백분율을 예를 들어 유세포 분석에 의해 평가한다. Treg 세포 또는 MDSC(골수 유래 억제자 세포)의 존재 또는 부재 하에서 나눠진 세포의 백분율을 비교함으로써 억제를 계산한다. 유사한 결과가 편집되거나 개질된 세포, 예를 들어 CAR-T 세포, TCR 세포, 및 유전자 편집된 세포(예를 들어, CRISPR를 이용)에서 수득될 것으로 예측된다.
실시예 30: USP16 발현의 하향조절 및 종양 유도된 노화에 대한 T 세포의 민감성에 대한 이의 효과.
1차 T 세포를 기재된 것(실시예 3)처럼 활성화하고, USP16를 표적화하는 shRNA 또는 shUSP16#1, shUSP16#2 또는 스크램블된 shRNA(대조군)를 공동발현하는 CD19.CAR 또는 GD2.CAR을 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입한다. 세포를 EGFRt에 대해 분류하고, 퓨로마이신으로 선별한다. 노화 T 세포를 유도하기 위해, 종양 세포주(예를 들어, 012SCC, CHLA-4, MG-63.3 MCF-7, HCT-116, 및 MEL-624)를 24시간 동안 배양한 후, T 림프구(대조군 또는 USP16에 대해 녹다운됨)를 상이한 종양:T 세포 비로 첨가한다. 세포는 6시간에서 최대 5일 동안 배양될 수 있다. 이후 T 세포를 수집하고, 세척하고, 바로 분석하고, 완전 배지에서 추가 7일 동안 배양하며; 추가적인 사이토카인은 첨가하지 않는다. 이후 세포를 수집하고 하기에 대해 분석한다: 소진 및 기억 마커(유세포 분석), 노화 및 자가 재생 유전자 또는 단백질(CDKN2a, CDKN1A, CDKN2a, LEF-1, TCF7, Axin2, p27, p53 포함)의 분화 발현, 세포 개수 및 생존력, 및 SA-β-Gal 염색.
예측된 결과: USP16 하향조절은, USP16 사일런싱된 T 세포가 보다 높은 생존력, 낮은 노화율을 갖고, 자가 재생을 증가시키고, 효율적으로 확장하고 종양 세포를 살해하는 향상된 능력을 갖기 때문에 T 세포가 종양 유도된 노화에 덜 민감하도록 만들 것으로 예측된다.
본 발명은 본 발명의 상세한 설명과 함께 설명되었지만, 상기 설명은 예시를 위한 것이며 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 다른 양태, 이점, 및 변형은 하기 범위 내에 속한다.
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Lys Leu Asp Glu Glu 325 330 335 Leu Lys Asn Lys Val Lys Asp Tyr Glu Lys Lys Lys Ser Met Pro Ser 340 345 350 Phe Val Asp Arg Ile Phe Gly Gly Glu Leu Thr Ser Met Ile Met Cys 355 360 365 Asp Gln Cys Arg Thr Val Ser Leu Val His Glu Ser Phe Leu Asp Leu 370 375 380 Ser Leu Pro Val Leu Asp Asp Gln Ser Gly Lys Lys Ser Val Asn Asp 385 390 395 400 Lys Asn Leu Lys Lys Thr Val Glu Asp Glu Asp Gln Asp Ser Glu Glu 405 410 415 Glu Lys Asp Asn Asp Ser Tyr Ile Lys Glu Arg Ser Asp Ile Pro Ser 420 425 430 Gly Thr Ser Lys His Leu Gln Lys Lys Ala Lys Lys Gln Ala Lys Lys 435 440 445 Gln Ala Lys Asn Gln Arg Arg Gln Gln Lys Ile Gln Gly Lys Val Leu 450 455 460 His Leu Asn Asp Ile Cys Thr Ile Asp His Pro Glu Asp Ser Glu Tyr 465 470 475 480 Glu Ala Glu Met Ser Leu Gln Gly Glu Val Asn Ile Lys Ser Asn His 485 490 495 Ile Ser Gln Glu Gly Val Met His Lys Glu Tyr Cys Val Asn Gln Lys 500 505 510 Asp Leu Asn Gly Gln Ala Lys Met Ile Glu Ser Val Thr Asp Asn Gln 515 520 525 Lys Ser Thr Glu Glu Val Asp Met Lys Asn Ile Asn Met Asp Asn Asp 530 535 540 Leu Glu Val Leu Thr Ser Ser Pro Thr Arg Asn Leu Asn Gly Ala Tyr 545 550 555 560 Leu Thr Glu Gly Ser Asn Gly Glu Val Asp Ile Ser Asn Gly Phe Lys 565 570 575 Asn Leu Asn Leu Asn Ala Ala Leu His Pro Asp Glu Ile Asn Ile Glu 580 585 590 Ile Leu Asn Asp Ser His Thr Pro Gly Thr Lys Val Tyr Glu Val Val 595 600 605 Asn Glu Asp Pro Glu Thr Ala Phe Cys Thr Leu Ala Asn Arg Glu Val 610 615 620 Phe Asn Thr Asp Glu Cys Ser Ile Gln His Cys Leu Tyr Gln Phe Thr 625 630 635 640 Arg Asn Glu Lys Leu Arg Asp Ala Asn Lys Leu Leu Cys Glu Val Cys 645 650 655 Thr Arg Arg Gln Cys Asn Gly Pro Lys Ala Asn Ile Lys Gly Glu Arg 660 665 670 Lys His Val Tyr Thr Asn Ala Lys Lys Gln Met Leu Ile Ser Leu Ala 675 680 685 Pro Pro Val Leu Thr Leu His Leu Lys Arg Phe Gln Gln Ala Gly Phe 690 695 700 Asn Leu Arg Lys Val Asn Lys His Ile Lys Phe Pro Glu Ile Leu Asp 705 710 715 720 Leu Ala Pro Phe Cys Thr Leu Lys Cys Lys Asn Val Ala Glu Glu Asn 725 730 735 Thr Arg Val Leu Tyr Ser Leu Tyr Gly Val Val Glu His Ser Gly Thr 740 745 750 Met Arg Ser Gly His Tyr Thr Ala Tyr Ala Lys Ala Arg Thr Ala Asn 755 760 765 Ser His Leu Ser Asn Leu Val Leu His Gly Asp Ile Pro Gln Asp Phe 770 775 780 Glu Met Glu Ser Lys Gly Gln Trp Phe His Ile Ser Asp Thr His Val 785 790 795 800 Gln Ala Val Pro Thr Thr Lys Val Leu Asn Ser Gln Ala Tyr Leu Leu 805 810 815 Phe Tyr Glu Arg Ile Leu 820 <210> 6 <211> 823 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> USP16 protein variant <400> 6 Met Gly Lys Lys Arg Thr Lys Gly Lys Thr Val Pro Ile Asp Asp Ser 1 5 10 15 Ser Glu Thr Leu Glu Pro Val Cys Arg His Ile Arg Lys Gly Leu Glu 20 25 30 Gln Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Val Asn Val Glu Trp Asn Ile Cys 35 40 45 Gln Asp Cys Lys Thr Asp Asn Lys Val Lys Asp Lys Ala Glu Glu Glu 50 55 60 Thr Glu Glu Lys Pro Ser Val Trp Leu Cys Leu Lys Cys Gly His Gln 65 70 75 80 Gly Cys Gly Arg Asn Ser Gln Glu Gln His Ala Leu Lys His Tyr Leu 85 90 95 Thr Pro Arg Ser Glu Pro His Cys Leu Val Leu Ser Leu Asp Asn Trp 100 105 110 Ser Val Trp Cys Tyr 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Ala Phe Gly Asn Ser Thr Glu Lys Leu Asp Glu 325 330 335 Glu Leu Lys Asn Lys Val Lys Asp Tyr Glu Lys Lys Lys Ser Met Pro 340 345 350 Ser Phe Val Asp Arg Ile Phe Gly Gly Glu Leu Thr Ser Met Ile Met 355 360 365 Cys Asp Gln Cys Arg Thr Val Ser Leu Val His Glu Ser Phe Leu Asp 370 375 380 Leu Ser Leu Pro Val Leu Asp Asp Gln Ser Gly Lys Lys Ser Val Asn 385 390 395 400 Asp Lys Asn Leu Lys Lys Thr Val Glu Asp Glu Asp Gln Asp Ser Glu 405 410 415 Glu Glu Lys Asp Asn Asp Ser Tyr Ile Lys Glu Arg Ser Asp Ile Pro 420 425 430 Ser Gly Thr Ser Lys His Leu Gln Lys Lys Ala Lys Lys Gln Ala Lys 435 440 445 Lys Gln Ala Lys Asn Gln Arg Arg Gln Gln Lys Ile Gln Gly Lys Val 450 455 460 Leu His Leu Asn Asp Ile Cys Thr Ile Asp His Pro Glu Asp Ser Glu 465 470 475 480 Tyr Glu Ala Glu Met Ser Leu Gln Gly Glu Val Asn Ile Lys Ser Asn 485 490 495 His Ile Ser Gln Glu Gly Val Met His Lys Glu Tyr Cys Val Asn Gln 500 505 510 Lys Asp Leu Asn Gly Gln Ala Lys Met Ile Glu Ser Val Thr Asp Asn 515 520 525 Gln Lys Ser Thr Glu Glu Val Asp Met Lys Asn Ile Asn Met Asp Asn 530 535 540 Asp Leu Glu Val Leu Thr Ser Ser Pro Thr Arg Asn Leu Asn Gly Ala 545 550 555 560 Tyr Leu Thr Glu Gly Ser Asn Gly Glu Val Asp Ile Ser Asn Gly Phe 565 570 575 Lys Asn Leu Asn Leu Asn Ala Ala Leu His Pro Asp Glu Ile Asn Ile 580 585 590 Glu Ile Leu Asn Asp Ser His Thr Pro Gly Thr Lys Val Tyr Glu Val 595 600 605 Val Asn Glu Asp Pro Glu Thr Ala Phe Cys Thr Leu Ala Asn Arg Glu 610 615 620 Val Phe Asn Thr Asp Glu Cys Ser Ile Gln His Cys Leu Tyr Gln Phe 625 630 635 640 Thr Arg Asn Glu Lys Leu Arg Asp Ala Asn Lys Leu Leu Cys Glu Val 645 650 655 Cys Thr Arg Arg Gln Cys Asn Gly Pro Lys Ala Asn Ile Lys Gly Glu 660 665 670 Arg Lys His Val Tyr Thr Asn Ala Lys Lys Gln Met Leu Ile Ser Leu 675 680 685 Ala Pro Pro Val Leu Thr Leu His Leu Lys Arg Phe Gln Gln Ala Gly 690 695 700 Phe Asn Leu Arg Lys Val Asn Lys His Ile Lys Phe Pro Glu Ile Leu 705 710 715 720 Asp Leu Ala Pro Phe Cys Thr Leu Lys Cys Lys Asn Val Ala Glu Glu 725 730 735 Asn Thr Arg Val Leu Tyr Ser Leu Tyr Gly Val Val Glu His Ser Gly 740 745 750 Thr Met Arg Ser Gly His Tyr Thr Ala Tyr Ala Lys Ala Arg Thr Ala 755 760 765 Asn Ser His Leu Ser Asn Leu Val Leu His Gly Asp Ile Pro Gln Asp 770 775 780 Phe Glu Met Glu Ser Lys Gly Gln Trp Phe His Ile Ser Asp Thr His 785 790 795 800 Val Gln Ala Val Pro Thr Thr Lys Val Leu Asn Ser Gln Ala Tyr Leu 805 810 815 Leu Phe Tyr Glu Arg Ile Leu 820 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> USP16 protein variant <400> 7 Met Gly Lys Lys Arg Thr Lys Gly Lys Thr Val Pro Ile Asp Asp Ser 1 5 10 15 Ser Glu Thr Leu Glu Pro Val Cys Arg His Ile Arg Lys Gly Leu Glu 20 25 30 Gln Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Val Asn Val Glu Trp Asn Ile Cys 35 40 45 Gln Asp Cys Lys Thr Asp Asn Lys Val Lys Asp Lys Ala Glu Glu Glu 50 55 60 Thr Glu Glu Lys Pro Ser Val Trp Leu Cys Leu Lys Cys Gly His Gln 65 70 75 80 Gly Cys Gly Arg Asn Ser Gln Glu Gln His Ala Leu Lys His Tyr Leu 85 90 95 Thr Pro Arg Ser Glu Pro His Cys Leu Val Leu 100 105 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> shRNA sequence shUSP16 1 <400> 8 gactgtaaga ctgacaataa a 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> shRNA sequence shUSP16 2 <400> 9 tatatcagtt cacccgtaat 20 <210> 10 <211> 20 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> sgRNA gUSP16 1 <400> 10 uggcgucaga uagugcuuca 20 <210> 11 <211> 20 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> sgRNA gRNA-A <400> 11 gugugcagac acauuagaaa 20 <210> 12 <211> 20 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> sgRNA gRNA-B <400> 12 uauugucagu cuuacagucu 20 <210> 13 <211> 20 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> sgRNA gRNA-C <400> 13 guuuggcugu gucuuaaaug 20

Claims (161)

  1. USP16 억제제와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 세포 노화의 조절 방법으로서,
    상기 세포는 혈액 세포인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 방법은
    (a) 세포 확장을 유지 또는 증가시키는 것;
    (b) 인 비트로(in vitro) 종료 시간을 증가시키는 것;
    (c) 인 비보(in vivo) 지속성을 증가시키는 것;
    (d) 노화 개시를 예방, 지연 또는 역전시키는 것;
    (e) 자가재생력을 증가 또는 유지시키는 것;
    (f) 자가재생 표현형을 증가 또는 유지시키는 것;
    (g) 세포 소진(cell exhaustion)을 감소시키는 것;
    (h) 이동 능력을 유지시키는 것;
    (i) 반응성 산소 종(ROS)의 생산을 감소시키는 것;
    (j) 효과기 기능을 증가시키는 것;
    (k) 인 비보 생착을 증가시키는 것;
    (l) 인 비보 종양 사멸을 증가시키는 것;
    (m) 노화 마커 또는 노화 연관 마커 발현을 조절하는 것;
    (n) CDKN2A, CDKN1A, CDKN2D, 및/또는 γ-H2AX 발현을 감소시키는 것;
    (o) 세포 증식을 증가시키는 것;
    (p) H2A 또는 H2B 유비퀴틴화를 증가시키는 것;
    (q) SA-β-Gal 발현을 감소시키는 것;
    (r) WNT 경로를 통한 신호전달을 향상시키는 것;
    (s) 텔로미어 단축화를 감소시키는 것;
    (t) 줄기 세포 마커 발현을 증가시키는 것;
    (u) 세놀리틱(senolytic)에 대한 감응성을 감소시키는 것;
    (v) SASP(노화 관련 분비 표현형)를 감소시키는 것;
    (w) 아폽토시스를 감소시키는 것;
    (x) 괴사를 감소시키는 것;
    (y) 미토콘드리아 막 전위를 증가키는 것; 및/또는
    (z) 세포 글루타티온 함량을 증가시키는 것; 중 하나 이상을 유도하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 방법은
    (a) 세포 확장을 유지 또는 증가시키는 것;
    (b) 인 비트로 종료 시간을 증가시키는 것;
    (c) 노화 개시를 예방, 지연 또는 역전시키는 것;
    (d) 자가재생력을 증가 또는 유지시키는 것;
    (e) 자가재생 표현형을 증가 또는 유지시키는 것;
    (f) 효과기 기능을 증가시키는 것;
    (g) 인 비보 종양 사멸을 증가시키는 것;
    (h) 노화 마커 발현을 조절하고/하거나 줄기 세포 마커 발현을 증가시키는 것;
    (i) CDKN2A, CDKN1A, CDKN2D, 및/또는 γ-H2AX 발현을 감소시키는 것;
    (j) 세포 증식을 증가시키는 것;
    (k) WNT 경로를 통한 신호전달을 향상시키는 것;
    (l) 줄기 세포 마커 발현을 증가시키는 것;
    (m) 세놀리틱에 대한 감응성을 감소시키는 것;
    (n) 아폽토시스를 감소시키는 것;
    (o) 괴사를 감소시키는 것;
    (p) 미토콘드리아 막 전위를 증가키는 것; 및/또는
    (q) 세포 글루타티온 함량을 증가시키는 것; 중 하나 이상을 유도하는 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 방법은
    (a) 인 비보 지속성을 증가시키는 것;
    (b) 세포 소진을 감소시키는 것;
    (c) 반응성 산소 종(ROS)의 생산을 감소키는 것; 및/또는
    (d) 인 비보 생착을 증가시키는 것; 중 하나 이상을 유도하는 방법.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액 세포는 유전적으로 변형된 혈액 세포인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 혈액 세포는 유전적으로 변형된 혈액 세포인 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 관심 단백질을 과발현하도록 유전적으로 변형된 것인 방법.
  8. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 관심 단백질의 발현을 녹다운 또는 녹아웃하도록 유전적으로 변형된 것인 방법.
  9. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 외인성 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형된 것인 방법.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액 세포는 면역 세포인 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 면역 세포는 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 단핵구, 마크로파지, 호산구, 호염기구, 및 호중구로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 세포는 T 세포이고, 선택적으로 상기 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포인 방법.
  13. 청구항 11 또는 청구항 12에 있어서,
    상기 세포는 세포독성 T 세포, 말단 효과기 T 세포, 효과기 T 세포, 기억 또는 중추 기억 T 세포, 미접촉(Naive) T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, 사이토카인 유도 살해(CIK) T 세포, 및 종양 침윤성 림프구로부터 선택되는 T 세포인 방법.
  14. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액 세포는 조혈 줄기 세포인 방법.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액 세포는 유전적으로 변형되어 그 표면 상에 키메릭 항원 수용체 또는 T-세포 수용체(TCR)를 발현하는 방법.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 인 비트로 방법인 방법.
  17. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 인 비보 방법인 방법.
  18. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 핵산인 방법.
  19. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 단백질인 방법.
  20. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 소분자인 방법.
  21. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 대분자인 방법.
  22. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 Cas 뉴클레아제, 또는 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산인 방법.
  23. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 TAL 뉴클레아제인 방법.
  24. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 Zn 핑거 뉴클레아제인 방법.
  25. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 RNAi 분자인 방법.
  26. 청구항 25에 있어서,
    상기 RNAi 분자는 shRNA, siRNA, 마이크로RNA, 및 비대칭 간섭 RNA로부터 선택되는 방법.
  27. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 안티센스 분자, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드, DNA-RNA 키메라, 모르폴리노 올리고, lhRNA, miRNA 내장 shRNA, 소형의 내부 분절된 RNA, 항체, 및 엑소좀으로부터 선택되는 방법.
  28. 청구항 1 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 전기천공을 사용하여 상기 세포에 전달되는 방법.
  29. 청구항 1 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터를 사용하여 상기 세포에 전달되는 방법.
  30. 청구항 28에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노 관련 바이러스 벡터로부터 선택되는 방법.
  31. 청구항 30에 있어서,
    상기 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인 방법.
  32. 청구항 30에 있어서,
    상기 비바이러스 벡터는 리포좀 또는 나노입자로부터 선택되는 방법.
  33. 청구항 1 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 트랜스포존 시스템을 사용하여 상기 세포에 전달되는 방법.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 트랜스포존 시스템은 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템인 방법.
  35. 청구항 1 내지 청구항 34 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 USP16 억제제는 USP16 발현의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 억제를 유도하는 방법.
  36. 청구항 1 내지 청구항 34 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 USP16 억제제는 USP16 활성의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 억제를 유도하는 방법.
  37. USP16 억제제와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 세포 노화의 조절 방법으로서,
    상기 세포는 T 세포, 또는 NK 세포인 방법.
  38. 청구항 37에 있어서,
    상기 방법은
    (a) 세포 확장을 유지 또는 증가시키는 것;
    (b) 인 비트로 종료 시간을 증가시키는 것;
    (c) 인 비보 지속성을 증가시키는 것;
    (d) 노화 개시를 예방, 지연 또는 역전시키는 것;
    (e) 자가재생력을 증가 또는 유지시키는 것;
    (f) 자가재생 표현형을 증가 또는 유지시키는 것;
    (g) 세포 소진을 감소시키는 것;
    (h) 이동 능력을 유지시키는 것;
    (i) 반응성 산소 종(ROS)의 생산을 감소시키는 것;
    (j) 효과기 기능을 증가시키는 것;
    (k) 인 비보 생착을 증가시키는 것;
    (l) 인 비보 종양 사멸을 증가시키는 것;
    (m) 노화 마커 또는 노화 연관 마커 발현을 조절하는 것;
    (n) CDKN2A, CDKN1A, CDKN2D, 및/또는 γ-H2AX 발현을 감소시키는 것;
    (o) 세포 증식을 증가시키는 것;
    (p) H2A 또는 H2B 유비퀴틴화를 증가시키는 것;
    (q) SA-β-Gal 발현을 감소시키는 것;
    (r) 텔로미어 단축화를 감소시키는 것;
    (s) WNT 경로를 통한 신호전달을 향상시키는 것;
    (t) 인 비트로 세포독성을 유지 또는 증가시키는 것;
    (u) 미접촉 또는 중추 기억 표현형을 유지 또는 증가시키는 것;
    (v) 방출된 사이토카인의 유형과 양을 변경하는 것;
    (w) 줄기 세포 마커 발현을 증가시키는 것;
    (x) 세놀리틱에 대한 감응성을 감소시키는 것;
    (y) SASP(노화 관련 분비 표현형)를 감소시키는 것;
    (z) 아폽토시스를 감소시키는 것;
    (aa) 괴사를 감소시키는 것;
    (bb) 미토콘드리아 막 전위를 증가키는 것; 및/또는
    (cc) 세포 글루타티온 함량을 증가시키는 것; 중 하나 이상을 유도하는 방법.
  39. 청구항 37에 있어서,
    상기 방법은
    (a) 세포 확장을 유지 또는 증가시키는 것;
    (b) 인 비트로 종료 시간을 증가시키는 것;
    (c) 노화 개시를 예방, 지연 또는 역전시키는 것;
    (d) 자가재생력을 증가 또는 유지시키는 것;
    (e) 자가재생 표현형을 증가 또는 유지시키는 것;
    (f) 효과기 기능을 증가시키는 것;
    (g) 인 비보 종양 사멸을 증가시키는 것;
    (h) 노화 마커 또는 노화 연관 마커 발현을 조절하는 것;
    (i) CDKN2A, CDKN1A, CDKN2D, 및/또는 γ-H2AX 발현을 감소시키는 것;
    (j) 세포 증식을 증가시키는 것;
    (k) WNT 경로를 통한 신호전달을 향상시키는 것;
    (l) 인 비트로 세포독성을 유지 또는 증가시키는 것;
    (m) 미접촉 또는 중추 기억 표현형을 유지 또는 증가시키는 것;
    (n) 줄기 세포 마커 발현을 증가시키는 것;
    (o) 세놀리틱에 대한 감응성을 감소시키는 것;
    (p) 아폽토시스를 감소시키는 것;
    (q) 괴사를 감소시키는 것;
    (r) 미토콘드리아 막 전위를 증가키는 것; 및/또는
    (s) 세포 글루타티온 함량을 증가시키는 것; 중 하나 이상을 유도하는 방법.
  40. 청구항 37에 있어서,
    상기 방법은
    (a) 인 비보 지속성을 증가시키는 것;
    (b) 세포 소진을 감소시키는 것;
    (c) 반응성 산소 종(ROS)의 생산을 감소키는 것; 및/또는
    (d) 인 비보 생착을 증가시키는 것; 중 하나 이상을 유도하는 방법.
  41. 청구항 37 내지 청구항 40 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 유전적으로 변형된 것인 방법.
  42. 청구항 37 내지 청구항 41 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 관심 단백질을 과발현하도록 유전적으로 변형된 것인 방법.
  43. 청구항 37 내지 청구항 42 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 관심 단백질의 발현을 녹다운 또는 녹아웃하도록 유전적으로 변형된 것인 방법.
  44. 청구항 37 내지 청구항 43 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 외인성 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형된 것인 방법.
  45. 청구항 37 내지 청구항 44 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 T 세포이고, 선택적으로 상기 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포인 방법.
  46. 청구항 45에 있어서,
    상기 T 세포는 세포독성 T 세포, 말단 효과기 T 세포, 효과기 T 세포, 기억 또는 중추 기억 T 세포, 미접촉 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, CIK T 세포, 및 종양 침윤성 림프구로부터 선택되는 방법.
  47. 청구항 37 내지 청구항 46 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 유전적으로 변형되어 그 표면 상에 키메릭 항원 수용체 또는 T-세포 수용체(TCR)를 발현하는 방법.
  48. 청구항 37 내지 청구항 47 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 인 비트로 방법인 방법.
  49. 청구항 37 내지 청구항 47 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 인 비보 방법인 방법.
  50. 청구항 37 내지 청구항 49 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 핵산인 방법.
  51. 청구항 37 내지 청구항 49 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 단백질인 방법.
  52. 청구항 37 내지 청구항 49 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 소분자인 방법.
  53. 청구항 37 내지 청구항 49 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 대분자인 방법.
  54. 청구항 37 내지 청구항 49 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 Cas 뉴클레아제, 또는 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산인 방법.
  55. 청구항 37 내지 청구항 49 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 TAL 뉴클레아제인 방법.
  56. 청구항 37 내지 청구항 49 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 Zn 핑거 뉴클레아제인 방법.
  57. 청구항 37 내지 청구항 49 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 RNAi 분자인 방법.
  58. 청구항 57에 있어서,
    상기 RNAi 분자는 shRNA, siRNA, 마이크로RNA, 및 비대칭 간섭 RNA로부터 선택되는 방법.
  59. 청구항 37 내지 청구항 49 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 안티센스 분자, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드, DNA-RNA 키메라, 모르폴리노 올리고, lhRNA, miRNA 내장 shRNA, 소형의 내부 분절된 RNA, 항체 또는 엑소좀으로부터 선택되는 방법.
  60. 청구항 37 내지 청구항 59 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터를 사용하여 상기 세포에 전달되는 방법.
  61. 청구항 60에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노 관련 바이러스 벡터로부터 선택되는 방법.
  62. 청구항 61에 있어서,
    상기 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인 방법.
  63. 청구항 60에 있어서,
    상기 비바이러스 벡터는 리포좀 또는 나노입자로부터 선택되는 방법.
  64. 청구항 37 내지 청구항 59 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 트랜스포존 시스템을 사용하여 상기 세포에 전달되는 방법.
  65. 청구항 64에 있어서,
    상기 트랜스포존 시스템은 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템인 방법.
  66. 청구항 37 내지 청구항 59 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 전기천공을 사용하여 상기 세포에 전달되는 방법.
  67. 청구항 37 내지 청구항 66 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 T 세포이고, 선택적으로 상기 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포인 방법.
  68. 청구항 37 내지 청구항 44 또는 청구항 47 내지 청구항 66 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 NK 세포이고, 선택적으로 상기 NK 세포는 CD56bright, CD56dim, CD56low, 또는 CD56-인 방법.
  69. 청구항 37 내지 청구항 68 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 USP16 억제제는 USP16 발현의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 억제를 유도하는 방법.
  70. 청구항 37 내지 청구항 68 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 USP16 억제제는 USP16 활성의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 억제를 유도하는 방법.
  71. USP16 억제제와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 유전적으로 변형된 혈액 세포에서 USP16의 발현을 감소시키는 방법.
  72. 청구항 71에 있어서,
    상기 유전적으로 변형된 혈액 세포는 면역 세포인 방법.
  73. 청구항 71 또는 청구항 72에 있어서,
    상기 세포는 관심 단백질을 과발현하도록 유전적으로 변형된 것인 방법.
  74. 청구항 71 내지 청구항 73 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 관심 단백질의 발현을 녹다운 또는 녹아웃하도록 유전적으로 변형된 것인 방법.
  75. 청구항 71 내지 청구항 74 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 외인성 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형된 것인 방법.
  76. 청구항 71 내지 청구항 75 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포는 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 단핵구, 마크로파지, 호산구, 호염기구, NK 세포, 및 호중구로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  77. 청구항 76에 있어서,
    상기 세포는 T 세포이고, 선택적으로 상기 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포인 방법.
  78. 청구항 76 또는 청구항 77에 있어서,
    상기 세포는 T 세포이고, 상기 T 세포는 세포독성 T 세포, 말단 효과기 T 세포, 효과기 T 세포, 기억 또는 중추 기억 T 세포, 미접촉 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, CIK T 세포, 및 종양 침윤성 림프구로부터 선택되는 방법.
  79. 청구항 71 내지 청구항 78 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유전적으로 변형된 혈액 세포는 NK 세포이고, 선택적으로 상기 NK 세포는 CD56bright, CD56dim, CD56low, 또는 CD56-인 방법.
  80. 청구항 71 내지 청구항 78 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유전적으로 변형된 혈액 세포는 조혈 줄기 세포인 방법.
  81. 청구항 71 내지 청구항 80 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유전적으로 변형된 혈액 세포는 유전적으로 변형되어 그 표면 상에 키메릭 항원 수용체 또는 T-세포 수용체(TCR)를 발현하는 방법.
  82. 청구항 71 내지 청구항 81 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 인 비트로 방법인 방법.
  83. 청구항 71 내지 청구항 81 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 인 비보 방법인 방법.
  84. 청구항 71 내지 청구항 83 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 핵산인 방법.
  85. 청구항 71 내지 청구항 83 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 단백질인 방법.
  86. 청구항 71 내지 청구항 83 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 소분자인 방법.
  87. 청구항 71 내지 청구항 83 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 대분자인 방법.
  88. 청구항 71 내지 청구항 83 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 Cas 뉴클레아제, 또는 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산인 방법.
  89. 청구항 71 내지 청구항 83 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 TAL 뉴클레아제인 방법.
  90. 청구항 71 내지 청구항 83 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 Zn 핑거 뉴클레아제인 방법.
  91. 청구항 71 내지 청구항 83 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 RNAi 분자인 방법.
  92. 청구항 91에 있어서,
    상기 RNAi 분자는 shRNA, siRNA, 마이크로RNA, 및 비대칭 간섭 RNA로부터 선택되는 방법.
  93. 청구항 71 내지 청구항 83 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 안티센스 분자, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드, DNA-RNA 키메라, 모르폴리노 올리고, lhRNA, miRNA 내장 shRNA, 소형의 내부 분절된 RNA, 항체, 및 엑소좀으로부터 선택되는 방법.
  94. 청구항 71 내지 청구항 93 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 전기천공을 사용하여 상기 세포에 전달되는 방법.
  95. 청구항 71 내지 청구항 93 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터를 사용하여 상기 세포에 전달되는 방법.
  96. 청구항 94에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노 관련 바이러스 벡터로부터 선택되는 방법.
  97. 청구항 94에 있어서,
    상기 비바이러스 벡터는 리포좀 또는 나노입자로부터 선택되는 방법.
  98. 청구항 71 내지 청구항 93 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 트랜스포존 시스템을 사용하여 상기 세포에 전달되는 방법.
  99. 청구항 98에 있어서,
    상기 트랜스포존 시스템은 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템인 방법.
  100. 청구항 71 내지 청구항 99 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 USP16 억제제는 USP16 발현의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 억제를 유도하는 방법.
  101. 청구항 71 내지 청구항 99 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 USP16 억제제는 USP16 활성의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 억제를 유도하는 방법.
  102. USP16 억제제와 면역 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 면역요법 적용에서 사용하기 위한 면역 세포의 제조 방법.
  103. 청구항 102에 있어서,
    USP16 억제제와 면역 세포를 접촉시키는 것은
    (a) 세포 확장을 유지 또는 증가시키는 것;
    (b) 인 비트로 종료 시간을 증가시키는 것;
    (c) 인 비보 지속성을 증가시키는 것;
    (d) 노화 개시를 예방, 지연 또는 역전시키는 것;
    (e) 자가재생력을 증가 또는 유지시키는 것;
    (f) 자가재생 표현형을 증가 또는 유지시키는 것;
    (g) 세포 소진을 감소시키는 것;
    (h) 이동 능력을 유지시키는 것;
    (i) 반응성 산소 종(ROS)의 생산을 감소시키는 것;
    (j) 효과기 기능을 증가시키는 것;
    (k) 인 비보 생착을 증가시키는 것;
    (l) 인 비보 종양 사멸을 증가시키는 것;
    (m) 노화 마커 또는 노화 연관 마커 발현을 조절하는 것;
    (n) CDKN2A, CDKN1A, CDKN2D, 및/또는 γ-H2AX 발현을 감소시키는 것;
    (o) 세포 증식을 증가시키는 것;
    (p) H2A 또는 H2B 유비퀴틴화를 증가시키는 것;
    (q) SA-β-Gal 발현을 감소시키는 것;
    (r) 텔로미어 단축화를 감소시키는 것;
    (s) WNT 경로를 통한 신호전달을 향상시키는 것;
    (t) 인 비트로 세포독성을 유지 또는 증가시키는 것;
    (u) 미접촉 또는 중추 기억 표현형을 유지 또는 증가시키는 것;
    (v) 방출된 사이토카인의 유형과 양을 변경하는 것;
    (w) 줄기 세포 마커 발현을 증가시키는 것;
    (x) 세놀리틱에 대한 감응성을 감소시키는 것;
    (y) SASP(노화 관련 분비 표현형)를 감소시키는 것;
    (z) 아폽토시스를 감소시키는 것;
    (aa) 괴사를 감소시키는 것;
    (bb) 미토콘드리아 막 전위를 증가키는 것; 및/또는
    (cc) 세포 글루타티온 함량을 증가시키는 것; 중 하나 이상을 유도하는 방법.
  104. 청구항 102에 있어서,
    상기 방법은
    (a) 세포 확장을 유지 또는 증가시키는 것;
    (b) 인 비트로 종료 시간을 증가시키는 것;
    (c) 노화 개시를 예방, 지연 또는 역전시키는 것;
    (d) 자가재생력을 증가 또는 유지시키는 것;
    (e) 자가재생 표현형을 증가 또는 유지시키는 것;
    (f) 효과기 기능을 증가시키는 것;
    (g) 인 비보 종양 사멸을 증가시키는 것;
    (h) 노화 마커 또는 노화 연관 마커 발현을 조절하는 것;
    (i) CDKN2A, CDKN1A, CDKN2D, 및/또는 γ-H2AX 발현을 감소시키는 것;
    (j) 세포 증식을 증가시키는 것;
    (k) WNT 경로를 통한 신호전달을 향상시키는 것;
    (l) 인 비트로 세포독성을 유지 또는 증가시키는 것;
    (m) 미접촉 또는 중추 기억 표현형을 유지 또는 증가시키는 것;
    (n) 줄기 세포 마커 발현을 증가시키는 것;
    (o) 세놀리틱에 대한 감응성을 감소시키는 것;
    (p) 아폽토시스를 감소시키는 것;
    (q) 괴사를 감소시키는 것;
    (r) 미토콘드리아 막 전위를 증가키는 것; 및/또는
    (s) 세포 글루타티온 함량을 증가시키는 것; 중 하나 이상을 유도하는 방법.
  105. 청구항 102에 있어서,
    상기 방법은
    (a) 인 비보 지속성을 증가시키는 것;
    (b) 세포 소진을 감소시키는 것;
    (c) 반응성 산소 종(ROS)의 생산을 감소키는 것; 및/또는
    (d) 인 비보 생착을 증가시키는 것; 중 하나 이상을 유도하는 방법.
  106. 청구항 102 내지 청구항 105 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포는 유전적으로 변형된 면역 세포인 방법.
  107. 청구항 102 내지 청구항 106 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 관심 단백질을 과발현하도록 유전적으로 변형된 것인 방법.
  108. 청구항 102 내지 청구항 107 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 관심 단백질의 발현을 녹다운 또는 녹아웃하도록 유전적으로 변형된 것인 방법.
  109. 청구항 102 내지 청구항 108 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 외인성 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형된 것인 방법.
  110. 청구항 102 내지 청구항 109 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 마크로파지, 호산구, 호염기구, 및 호중구로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  111. 청구항 110에 있어서,
    상기 세포는 T 세포이고, 선택적으로 상기 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포인 방법.
  112. 청구항 110 또는 청구항 111에 있어서,
    상기 세포는 T 세포이고, 상기 T 세포는 세포독성 T 세포, 말단 효과기 T 세포, 효과기 T 세포, 기억 또는 중추 기억 T 세포, 미접촉 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, CIK T 세포, 및 종양 침윤성 림프구로부터 선택되는 방법.
  113. 청구항 110에 있어서,
    상기 세포는 NK 세포이고, 선택적으로 상기 NK 세포는 CD56bright, CD56dim, CD56low, 또는 CD56-인 방법.
  114. 청구항 102 내지 청구항 112 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포는 줄기 세포가 아닌 방법.
  115. 청구항 102 내지 청구항 114 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포는 유전적으로 변형되어 그 표면 상에 키메릭 항원 수용체 또는 T-세포 수용체(TCR)를 발현하는 방법.
  116. 청구항 102 내지 청구항 115 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 인 비트로 방법인 방법.
  117. 청구항 102 내지 청구항 115 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 인 비보 방법인 방법.
  118. 청구항 102 내지 청구항 117 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 핵산인 방법.
  119. 청구항 102 내지 청구항 117 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 단백질인 방법.
  120. 청구항 102 내지 청구항 117 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 소분자인 방법.
  121. 청구항 102 내지 청구항 117 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 대분자인 방법.
  122. 청구항 102 내지 청구항 117 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 Cas 뉴클레아제, 또는 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산인 방법.
  123. 청구항 102 내지 청구항 117 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 TAL 뉴클레아제인 방법.
  124. 청구항 102 내지 청구항 117 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 Zn 핑거 뉴클레아제인 방법.
  125. 청구항 102 내지 청구항 117 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 RNAi 분자인 방법.
  126. 청구항 125에 있어서,
    상기 RNAi 분자는 shRNA, siRNA, 마이크로RNA, 및 비대칭 간섭 RNA로부터 선택되는 방법.
  127. 청구항 102 내지 청구항 117 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 안티센스 분자, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드, DNA-RNA 키메라, 모르폴리노 올리고, lhRNA, miRNA 내장 shRNA, 소형의 내부 분절된 RNA, 항체, 엑소좀, 및 히스톤 변형제로부터 선택되는 방법.
  128. 청구항 102 내지 청구항 127 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터를 사용하여 상기 세포에 전달되는 방법.
  129. 청구항 128에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 및 아데노 관련 바이러스 벡터로부터 선택되는 방법.
  130. 청구항 129에 있어서,
    상기 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인 방법.
  131. 청구항 128에 있어서,
    상기 비바이러스 벡터는 리포좀 또는 나노입자로부터 선택되는 방법.
  132. 청구항 102 내지 청구항 127 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 트랜스포존 시스템을 사용하여 상기 세포에 전달되는 방법.
  133. 청구항 132에 있어서,
    상기 트랜스포존 시스템은 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템인 방법.
  134. 청구항 102 내지 청구항 133 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 USP16 억제제는 USP16 발현의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 억제를 유도하는 방법.
  135. 청구항 102 내지 청구항 133 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 USP16 억제제는 USP16 활성의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 억제를 유도하는 방법.
  136. 청구항 102 내지 청구항 135 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역요법 적용은 자가유래 적용인 방법.
  137. 청구항 102 내지 청구항 135 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역요법 적용은 자가유래 적용인 방법.
  138. USP16 발현을 하향조절하도록 변형된 혈액 세포.
  139. 청구항 138에 있어서,
    USP16 발현의 하향조절은
    (a) 세포 확장을 유지 또는 증가시키는 것;
    (b) 인 비트로 종료 시간을 증가시키는 것;
    (c) 인 비보 지속성을 증가시키는 것;
    (d) 노화 개시를 예방, 지연 또는 역전시키는 것;
    (e) 자가재생력을 증가 또는 유지시키는 것;
    (f) 자가재생 표현형을 증가 또는 유지시키는 것;
    (g) 세포 소진을 감소시키는 것;
    (h) 이동 능력을 유지시키는 것;
    (i) 반응성 산소 종(ROS)의 생산을 감소시키는 것;
    (j) 효과기 기능을 증가시키는 것;
    (k) 인 비보 생착을 증가시키는 것;
    (l) 인 비보 종양 사멸을 증가시키는 것;
    (m) 노화 마커 또는 노화 연관 마커 발현을 조절하는 것;
    (n) CDKN2A, CDKN1A, CDKN2D, 및/또는 γ-H2AX 발현을 감소시키는 것;
    (o) 세포 증식을 증가시키는 것;
    (p) H2A 또는 H2B 유비퀴틴화를 증가시키는 것;
    (q) SA-β-Gal 발현을 감소시키는 것;
    (r) 텔로미어 단축화를 감소시키는 것;
    (s) WNT 경로를 통한 신호전달을 향상시키는 것;
    (t) 인 비트로 세포독성을 유지 또는 증가시키는 것;
    (u) 미접촉 또는 중추 기억 표현형을 유지 또는 증가시키는 것;
    (v) 방출된 사이토카인의 유형과 양을 변경하는 것;
    (w) 줄기 세포 마커 발현을 증가시키는 것;
    (x) 세놀리틱에 대한 감응성을 감소시키는 것;
    (y) SASP(노화 관련 분비 표현형)를 감소시키는 것;
    (z) 아폽토시스를 감소시키는 것;
    (aa) 괴사를 감소시키는 것;
    (bb) 미토콘드리아 막 전위를 증가키는 것; 및/또는
    (cc) 세포 글루타티온 함량을 증가시키는 것; 중 하나 이상을 나타내는 세포를 유도하는 혈액 세포.
  140. 청구항 138에 있어서,
    상기 방법은
    (a) 세포 확장을 유지 또는 증가시키는 것;
    (b) 인 비트로 종료 시간을 증가시키는 것;
    (c) 노화 개시를 예방, 지연 또는 역전시키는 것;
    (d) 자가재생력을 증가 또는 유지시키는 것;
    (e) 자가재생 표현형을 증가 또는 유지시키는 것;
    (f) 효과기 기능을 증가시키는 것;
    (g) 인 비보 종양 사멸을 증가시키는 것;
    (h) 노화 마커 또는 노화 연관 마커 발현을 조절하는 것;
    (i) CDKN2A, CDKN1A, CDKN2D, 및/또는 γ-H2AX 발현을 감소시키는 것;
    (j) 세포 증식을 증가시키는 것;
    (k) WNT 경로를 통한 신호전달을 향상시키는 것;
    (l) 인 비트로 세포독성을 유지 또는 증가시키는 것;
    (m) 미접촉 또는 중추 기억 표현형을 유지 또는 증가시키는 것;
    (n) 줄기 세포 마커 발현을 증가시키는 것;
    (o) 세놀리틱에 대한 감응성을 감소시키는 것;
    (p) 아폽토시스를 감소시키는 것;
    (q) 괴사를 감소시키는 것;
    (r) 미토콘드리아 막 전위를 증가키는 것; 및/또는
    (s) 세포 글루타티온 함량을 증가시키는 것; 중 하나 이상을 유도하는 혈액 세포.
  141. 청구항 138에 있어서,
    상기 방법은
    (a) 인 비보 지속성을 증가시키는 것;
    (b) 세포 소진을 감소시키는 것;
    (c) 반응성 산소 종(ROS)의 생산을 감소키는 것; 및/또는
    (d) 인 비보 생착을 증가시키는 것; 중 하나 이상을 유도하는 혈액 세포.
  142. 청구항 138 내지 청구항 141 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액 세포는 유전적으로 변형된 혈액 세포인 혈액 세포.
  143. 청구항 138 내지 청구항 141 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액 세포는 관심 단백질을 과발현하도록 유전적으로 변형되는 혈액 세포.
  144. 청구항 138 내지 청구항 141 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액 세포는 관심 단백질의 발현을 녹다운 또는 녹아웃하도록 유전적으로 변형되는 혈액 세포.
  145. 청구항 138 내지 청구항 144 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액 세포는 외인성 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형되는 혈액 세포.
  146. 청구항 138 내지 청구항 145 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액 세포는 면역 세포인 혈액 세포.
  147. 청구항 146에 있어서,
    상기 면역 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 마크로파지, 호산구, 호염기구, 및 호중구로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈액 세포.
  148. 청구항 147에 있어서,
    상기 면역 세포는 T 세포이고, 선택적으로 상기 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포인 혈액 세포.
  149. 청구항 147 또는 청구항 148에 있어서,
    상기 T 세포는 세포독성 T 세포, 말단 효과기 T 세포, 효과기 T 세포, 기억 또는 중추 기억 T 세포, 미접촉 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, CIK T 세포, 및 종양 침윤성 림프구로부터 선택되는 혈액 세포.
  150. 청구항 147에 있어서,
    상기 면역 세포는 NK 세포이고, 선택적으로 상기 NK 세포는 CD56bright, CD56dim, CD56low, 또는 CD56-인 혈액 세포.
  151. 청구항 138 내지 청구항 149 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액 세포는 조혈 줄기 세포인 혈액 세포.
  152. 청구항 138 내지 청구항 149 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액 세포는 줄기 세포가 아닌 혈액 세포.
  153. 청구항 138 내지 청구항 152 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액 세포는 유전적으로 변형되어 그 표면 상에 키메릭 항원 수용체 또는 T-세포 수용체(TCR)를 발현하는 혈액 세포.
  154. 청구항 138 내지 청구항 153 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 USP16 발현은 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 감소하는 혈액 세포.
  155. 청구항 138 내지 청구항 153 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 USP16 활성은 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 감소하는 혈액 세포.
  156. 질환 또는 장애의 치료 방법으로서,
    상기 방법은 청구항 138 내지 청구항 155 중 어느 한 항의 치료적 유효량의 세포를 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  157. 청구항 156에 있어서,
    상기 질환 또는 장애는 백혈병, 림프종, 흑색종, 췌장암, 유방암, 결장암, 폐암, 결장직장암, 및 뇌암으로부터 선택되는 암인 방법.
  158. 질환 또는 장애의 치료 방법으로서,
    상기 방법은 청구항 102 내지 청구항 133 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 생성된 치료적 유효량의 세포를 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  159. 청구항 158에 있어서,
    상기 질환 또는 장애는 백혈병, 림프종, 흑색종, 다발성 골수종, 췌장암, 유방암, 결장암, 폐암, 결장직장암, 및 뇌암으로부터 선택된 암인 방법.
  160. 청구항 156 내지 청구항 159 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료는 동종이계성인 방법.
  161. 청구항 156 내지 청구항 159 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료는 자가유래성인 방법.
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