JP2022546493A - 細胞の老化を調節するための方法および組成物 - Google Patents

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Abstract

本開示は、細胞をＵＳＰ１６の阻害剤と接触させることを含む、細胞の老化を調節するための方法および組成物を提供する。開示される方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞療法、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）療法、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞療法、造血幹細胞ベースの療法、および他の養子細胞療法を含む、細胞ベースの療法の有効性を改善するために使用され得る。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／８９３，６１８号の優先権を主張し、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の参照による組み込み
本出願は、ＥＦＳ－ＷＥＢによりＡＳＣＩＩ形式で提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年８月２８日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、ＤＯＴＨ＿００１＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿２５という名前であり、サイズは３７ＫＢである。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞療法および操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）療法などの細胞ベースの療法は、クリニックで大きな期待を示しているが、常に効果的なわけではない。例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞で治療された患者の約２０％は、治療に反応しない。さらに、固形腫瘍は、腫瘍抗原とは無関係に、リダイレクトされたＴ細胞に対してほとんど応答を示さない。
細胞ベースの療法は、例えば、細胞が対象に投与される前または直後に老化、細胞老化、または疲弊した場合、効果がない可能性がある。細胞の老化は、例えば、細胞ベースの療法で使用される細胞が対象への投与前にインビトロで拡大される場合、照射、ＲＡＳ、化学療法薬によって、活発に分裂している細胞おいて時期尚早に誘発され得る。細胞の老化は、典型的には、クロマチンのリモデリング、代謝のリプログラミング、オートファジーの増加、および複雑な炎症性セクレトームの実施を含む、明確な表現型の変化を伴うプロセスである。それは、細胞拡大の減少、インビトロでの呼気時間の短縮、インビボでの持続性の減少、自己複製能力の減少、自己複製表現型の減少、細胞疲弊の増加、遊走能の減少、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生の増加、ミトコンドリア膜電位および／もしくはグルタチオン含有量の低下、エフェクター機能の減少、インビボ生着の減少、インビボでの腫瘍死滅の減少、細胞老化マーカーの発現の増加、ＣＤＫＮ２Ａ発現の増加、ＣＤＫＮ２Ｄ発現の増加、ＣＤＫＮ１Ａ発現の増加、ＣＤＫＮ１Ｂの増加、Ｈ２ＡもしくはＨ２Ｂユビキチン化の減少、ＳＡ－β－Ｇａｌ発現の増加、テロメア短縮の増加、老化関連マーカーおよび／もしくは機能の増加、老化関連マーカーおよび／もしくは機能の増加、老化細胞除去薬に対する感受性の増加、ＳＡＳＰ（細胞老化関連分泌表現型）の増加、細胞の健康の低下、ならびに／または壊死／アポプト（細胞死）の増加、のうちの１つ以上と関連し得る。
例えば、細胞ベースの療法のための細胞産生を改善するために、細胞の老化を調節することができる必要性が存在する。
本明細書で提供されるのは、細胞ベースの療法で使用される細胞を最適化するのに有用である組成物および方法である。本明細書に記載の組成物および方法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法、ＣＡＲ－ＮＫ細胞療法、操作されたＴＣＲ受容体療法、リダイレクトされたＴ細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）療法、ならびに腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ細胞、および制御性Ｔ細胞の使用などの他の養子細胞療法を含む、細胞ベースの療法の有効性を改善するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞をＵＳＰ１６の阻害剤と接触させることを含む、細胞の老化を調節する方法を提供し、細胞は、血液細胞である。いくつかの実施形態において、血液細胞は、遺伝子改変された血液細胞である。
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞をＵＳＰ１６の阻害剤と接触させることを含む、細胞の老化を調節する方法を提供し、細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、遺伝子改変されたＴ細胞である。
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞をＵＳＰ１６の阻害剤と接触させることを含む、細胞の老化を調節する方法を提供し、細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞は、遺伝子改変されたＮＫ細胞である。
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞をＵＳＰ１６の阻害剤と接触させることを含む、細胞の老化を調節する方法を提供し、細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態において、造血幹細胞は、遺伝子改変された造血幹細胞である。
本明細書に記載の方法は、以下：（ａ）細胞拡大を維持もしくは増加させること、（ｂ）インビトロでの呼気時間を延長させること、（ｃ）インビボでの持続性を増加させること、（ｄ）細胞老化の開始を予防、遅延、もしくは逆転させること、（ｅ）自己複製能力を増加もしくは維持すること、（ｆ）自己複製表現型を増加もしくは維持すること、（ｇ）細胞疲弊を低下させること、（ｈ）遊走能を維持すること、（ｉ）活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を低下させること、（ｊ）エフェクター機能を増加させること、（ｋ）インビボでの生着を増加させること、（ｌ）インビボでの腫瘍死滅を増加させること、（ｍ）細胞老化マーカーもしくは老化関連マーカーの発現を調節すること、（ｎ）ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ｄ、および／もしくはγ－Ｈ２ＡＸ発現を低下させること、（ｏ）細胞増殖を増加させること、（ｐ）Ｈ２ＡもしくはＨ２Ｂのユビキチン化を増加させること、（ｑ）ＳＡ－β－Ｇａｌ発現を減少させること、（ｒ）テロメアの短縮を低下させること、（ｓ）ＷＮＴ経路を介したシグナル伝達を増強させること、（ｔ）インビトロ細胞毒性を維持もしくは増加させること、（ｕ）ナイーブもしくはセントラルメモリー表現型を維持もしくは増加させること、（ｖ）放出されたサイトカインの種類および量を改変すること、（ｗ）幹細胞マーカーの発現を増加させること、（ｘ）老化細胞除去薬に対する感受性を低下させること、（ｙ）ＳＡＳＰ（細胞老化関連分泌表現型）を低下させること、（ｚ）アポトーシスを低下させること、（ａａ）壊死を低下させること、（ｂｂ）ミトコンドリア膜電位を増加させること、ならびに／または（ｃｃ）細胞のグルタチオン含有量を増加させること、のうちの１つ以上の効果を有し得る。細胞をＵＳＰ１６の阻害剤と接触させることを含む、遺伝子改変された血液細胞におけるＵＳＰ１６の発現を減少させる方法も提供される。
免疫細胞をＵＳＰ１６の阻害剤と接触させることを含む、免疫療法の適用で使用するための免疫細胞を調製する方法も提供される。そのような免疫療法には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ベースの療法、操作されたＴ細胞ベースの療法、造血幹細胞ベースの療法、および他の養子細胞療法が含まれる。
ＵＳＰ１６の発現を下方制御するように改変された血液細胞も提供される。
治療有効量の本開示の細胞（例えば、ＵＳＰ１６を下方制御するように改変された細胞）を必要とする対象に投与することを含む、疾患または障害を治療する方法も提供される。いくつかの実施形態において、治療は、自家である。いくつかの実施形態において、治療は、同種異系である。
これらおよび他の態様は、以下に記載される詳細な説明においてより詳細に扱われる。
図１Ａは、分化の異なる段階にあるＴ細胞、および各段階に関連する細胞マーカー（ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ）の発現を示す。図１Ｂは、細胞が最も幹様（ＴＮ：Ｔナイーブ）から最も幹様ではない（ＴＴＥ：Ｔ末端エフェクター）に進行するときの、分化の各段階に関連する表現型を示す。 Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ Ｌ．，ｅｔ ａｌ，“Ａ ｈｕｍａｎ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔ ｗｉｔｈ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１１）で公開されたデータのインシリコ分析によって測定された、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）、メモリー幹細胞（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリー（ＴＣＭ）、およびエフェクターメモリーセル（ＴＥＭ）におけるＣＤＫＮ２Ａの相対的発現を示すグラフである。 図３Ａ～３Ｅは、Ｔ細胞サブセットにおける、細胞老化マーカー、ＢＭＩ－１（図３Ａ）、ＣＤＫＮ２Ａ（図３Ｂ）、ＣＤＫＮ２Ｄ（図３Ｃ）、ならびに疲弊マーカー、ＣＴＬＡ－４（図３Ｄ）およびＰＤ－１（図３Ｅ）の相対的発現を示すグラフである。 図４Ａは、ｓｈＵＳＰ１６または非ターゲティングｓｈＲＮＡ（対照）のいずれかをコードするレンチウイルスによる形質導入後１０、２０、および３０日目のＴ細胞活性化時のＴ細胞拡大を示す。図４Ｂは、Ｓｙｔｏｘ染色アッセイを使用して決定された、ｓｈＵＳＰ１６処理後の細胞の生存率を示す。図４Ｃは、Ｔ細胞呼気アッセイの結果を示す。ｓｈＵＳＰ１６で処理された細胞では、統計的に有意な持続性の増加が観察された。 ＵＳＰ１６発現の特定の下方制御後２０日目のＣＤ４／ＣＤ８比を示す。ＵＳＰ１６発現の下方制御は、ＣＤ４／ＣＤ８比に著しい影響を及ぼさなかった。 図６Ａ～６Ｃは、３つの異なる実験で細胞の生存を示し、幼若（活性化後０日目～１５日目）および経時（活性化後２０日目～４０日目）細胞は、指定量の老化細胞除去薬ナビトクラックスで処理された。 図７Ａ～７Ｃは、細胞が指定量のナビトクラックスで処理された後１２日目（図７Ａ）および２２日目（図７Ｂ～７Ｃ）での死細胞の割合を示す。 活性化後１０日目のインビトロ限界希釈アッセイの結果を示す。灰色の実線は、幼若細胞を表し、黒い実線は、経時細胞を表す。対応する点線は、標準偏差を示す。 活性化後２０日目のインビトロ限界希釈アッセイの結果を示す。灰色の実線は、ｓｈＵＳＰ１６群を表し、黒い実線は、対照群を表す。対応する点線は、標準偏差を示す。 活性化後３１日目のインビトロ限界希釈アッセイの結果を示す。灰色の実線は、ｓｈＵＳＰ１６群を表し、黒い実線は、対照群を表す。対応する点線は、標準偏差を示す。 図１１Ａ～１１Ｂは、ＵＳＰ１６発現の下方制御が培養物中のＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋（図１１Ａ）およびＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋（図１１Ｂ）細胞の数を増加させることを実証する。 図１２Ａは、異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比での死滅率を示す。対照細胞（対照）とＵＳＰ１６下方制御細胞との間に差異は観察されなかった。図１２Ｂは、抗原曝露時のＩＬ－２産生を示す。ＵＳＰ１６発現の下方制御後、ＩＬ－２産生への影響は観察されなかった。 図１３Ａは、ＣＤ１９．４１ＢＢ ＣＡＲを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＤＫＮ２Ａの発現を示すグラフである。ＣＤＫＮ２Ａの場合、値は、ＣＤ１９．ＣＤ２８ＣＡＲ－Ｔ細胞に正規化される。図１３Ｂは、異なる共刺激ドメインを有するＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＢＭＩ－１の発現を示すグラフである。 図１４Ａ～１４Ｂは、ＵＳＰ１６を標的とする他のｓｈＲＮＡは、細胞増殖を増加させながら、ＵＳＰ１６の発現を効果的に下方制御し、細胞老化マーカーを阻害することを示す。 ＵＳＰ１６発現の下方制御がＣＤＫＮ１Ａの発現の減少をもたらすことを示す。 図１６Ａ～１６Ｂは、ＵＳＰ１６発現の下方制御がＷＮＴ経路の活性化を増強させることを示す。 図１７Ａ～１７Ｂは、ＵＳＰ１６の下方制御が幹細胞メモリーＴ細胞の周波数および細胞の機能を増加させることを示す。 ＵＳＰ１６の下方制御が幹細胞の活性および機能を増加させることを示す。 ＵＳＰ１６発現の下方制御が疲弊マーカーＣＤ６９の発現を減少させることを示す。 ＵＳＰ１６発現を下方制御するＴ細胞が腫瘍細胞を死滅させる能力を維持していることを示す。 図２１Ａ～２１Ｂは、ＣＲＩＳＰＲを介したＵＳＰ１６発現のノックアウトがｑＰＣＲ発現解析によって達成されたことを示す。 ＣＲＩＳＰＲを介したＵＳＰ１６発現のノックアウトが幹細胞メモリーＴ細胞を増加させることを示す。 ＣＲＩＳＰＲを介したＵＳＰ１６発現のノックアウトがＴ細胞を介した死滅を損なわないことを示す。 ＣＡＲ構築物がＵＳＰ１６を標的とするｓｈＲＮＡを共発現した場合、ＵＳＰ１６の発現がＣＡＲ－Ｔ細胞で下方制御されたことを示す。 ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６発現の下方制御がＣＡＲ－Ｔ細胞拡大を増強させることを示す。 図２６Ａ～２６Ｂは、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６発現の下方制御が、細胞老化マーカーＣＤＫＮ１ＡおよびＣＤＫＮ２Ａの発現の減少をもたらすことを示す。 図２７Ａ～２７Ｂは、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６発現の下方制御がＷＮＴ経路を介したシグナル伝達を増強することを示す。 図２８Ａ～２８Ｂは、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６発現の下方制御が幹細胞メモリーＴ細胞の周波数を増加させることを示す。 ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６発現の下方制御が幹細胞の数および活性を増加させることを示す。 図３０Ａ～３０Ｂは、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６発現の下方制御が細胞毒性アッセイにおいて死滅およびＴ細胞拡大を増加させることを示す。 図３１Ａ～３１Ｂは、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６発現の下方制御が細胞の健康を増進させ、細胞およびミトコンドリアのストレスを軽減することを示す。 ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６発現の下方制御が疲弊マーカーＣＤ６９の発現を低下させることを示す。 実施例で説明されている再チャレンジ実験のレイアウトを示す。 ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６発現の下方制御が疲弊関連マーカーの発現を低下させることを示す。 図３５Ａ～３５Ｂは、ＵＳＰ１６発現の下方制御が、複数の腫瘍チャレンジ時にＴ細胞死滅能力を大幅に増加させることを示す。 ＧＤ２．ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６発現の下方制御がインビボでの死滅に及ぼす影響を評価するためのインビボ実験計画を示す。 図３７Ａ～３７Ｂは、ＧＤ２．ＣＡＲ－Ｔ細胞がＵＳＰ１６を下方制御するときの、インビボでの腫瘍死滅の著しい増加を示す。 ＣＤ１９．ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６発現の下方制御がインビボでの死滅に及ぼす影響を評価するためのインビボ実験計画を示す。 図３９Ａ～３９Ｂは、ＣＤ１９．ＣＡＲ－Ｔ細胞がＵＳＰ１６を下方制御するときの、インビボでの腫瘍死滅の有意な増加を示す。
本開示は、細胞の老化を調節する（例えば、抑制または元に戻す）ための組成物および方法を提供する。具体的には、本明細書では、細胞内のＵＳＰ１６脱ユビキチン化酵素（ユビキチン特異的ペプチダーゼ１６、脱ユビキチン化酵素１６、Ｕｂｐ－Ｍ、ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素１６としても知られる）の発現または活性を低下させることにより、以下の効果：（ａ）細胞拡大を維持もしくは増加させること、（ｂ）インビトロでの呼気時間を延長させること、（ｃ）インビボでの持続性を増加させること、（ｄ）細胞老化の開始を予防、遅延、もしくは逆転させること、（ｅ）自己複製能力を増加もしくは維持すること、（ｆ）自己複製表現型を増加もしくは維持すること、（ｇ）細胞疲弊を低下させること、（ｈ）遊走能を維持すること、（ｉ）活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を低下させること、（ｊ）エフェクター機能を増加させること、（ｋ）インビボでの生着を増加させること、（ｌ）インビボでの腫瘍死滅を増加させること、（ｍ）細胞老化マーカーもしくは老化関連マーカーの発現を調節すること、（ｎ）ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ｄ、および／もしくはγ－Ｈ２ＡＸ発現を低下させる。（ｏ）細胞増殖を増加させること、（ｐ）Ｈ２ＡもしくはＨ２Ｂのユビキチン化を増加させること、（ｑ）ＳＡ－β－Ｇａｌ発現を低下させること、（ｒ）テロメアの短縮を低下させること、（ｓ）ＷＮＴ経路を介したシグナル伝達を増強させること、（ｔ）インビトロ細胞毒性を維持もしくは増加させること、（ｕ）ナイーブもしくはセントラルメモリー表現型を維持もしくは増加させること、（ｖ）放出されたサイトカインの種類および量を改変すること、（ｗ）幹細胞マーカーの発現を増加させること、（ｘ）老化細胞除去薬に対する感受性を低下させること、（ｙ）ＳＡＳＰ（細胞老化関連分泌表現型）を低下させること、（ｚ）アポトーシスを低下させること、（ａａ）壊死を低下させること、（ｂｂ）ミトコンドリア膜電位を増加させること、ならびに／または（ｃｃ）細胞のグルタチオン含有量を増加させること、のうちの１つ以上が達成され得る。
したがって、本開示の組成物および方法は、ＣＡＲ－Ｔ、ＣＡＲ－ＮＫ、またはＣＡＲ－マクロファージ細胞療法、および他の養子細胞療法（例えば、ＴＣＲ－Ｔ細胞療法）、幹細胞療法（例えば、造血幹細胞療法）、および遺伝子療法を含むがこれらに限定されない細胞ベースの療法で使用される細胞における細胞の老化を抑制または元に戻すために使用され得、それにより、そのような療法の有効性を高める。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書の詳細な説明で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していない。
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の受入番号、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
定義
以下の用語が本開示で使用される。
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別段で明記しない限り、複数形も含むことが意図される。
さらに、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さの量、用量、時間、温度などの測定可能な値を指す場合に本明細書で使用される「約」という用語は、特定の値の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、さらには±０．１％の変動を包含することを意味する。
本明細書および実施形態において本明細書で使用される「および／または」という句は、そのように結合された要素、すなわち、ある場合には結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」でリストされた複数の要素は、同じ方式で解釈されるべきであり、つまり、そのように結合された要素のうちの「１つ以上」である。「および／または」節によって具体的に特定される要素以外の他の要素が、具体的に特定される要素に関連するかどうかにかかわらず、任意選択で存在することができる。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む」などの制限のない言語と組み合わせて使用される場合、一実施形態では、Ａのみ（任意選択で、Ｂ以外の要素を含む）、別の実施形態では、Ｂのみ（任意選択で、Ａ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、ＡとＢの両方（任意選択で、他の要素を含む）などを指すことができる。
本明細書で使用される場合、「低下する」、「減少する」、「軽減する」という用語、および同様の用語は、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３５％、約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、またはそれ超の減少を意味する。
本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加する」、「増強する」という用語、および同様の用語は、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約５０％、約７５％、約１００％、約１５０％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、またはそれ超の増加を示す。
本明細書で使用される場合、「老化細胞除去薬」は、細胞老化細胞の死を選択的に誘発する薬剤を指す。
文脈が別段で示していない限り、本明細書に記載の様々な特徴を任意の組み合わせで使用することができることが特に意図される。
脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）、およびその阻害剤
ユビキチンは、プロテアソームおよびリソソームを介してタンパク質の分解を制御し、タンパク質の細胞内局在を調整し、タンパク質を活性化および不活性化し、タンパク質間相互作用を調節する。特に、ヒストンのモノユビキチン化は、クロマチンリモデリングにおいて役割を果たし、後成的な抑制因子として機能する。ＵＳＰ１６などの脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）は、タンパク質およびその他の分子からユビキチンを切断する。
ＵＳＰ１６遺伝子によってコードされるＵＳＰ１６は、ヒストンＨ２Ａ／Ｈ２Ｂデブイキチナーゼである。全長ヒトＵＳＰ１６（ＵＮＩＰＲＯＴ受入番号Ｑ９Ｙ５Ｔ５）の例示的なアミノ酸配列を以下に提供する（配列番号１）。
Figure 2022546493000002
いくつかの追加のＵＳＰ１６アイソフォームも知られている。ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００６４４７．２（配列番号３）、ＮＭ＿００６４４７．３（配列番号４）、ＮＭ＿００１００１９９２．１（配列番号５）、およびＮＭ＿００１０３２４１０．１（配列番号６）を参照されたい。Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｈ９ＫＶＢ６（配列番号７）も参照されたい。
配列番号３：ＵＳＰ１６タンパク質変異体
ＭＧＫＫＲＴＫＧＫＴＶＰＩＤＤＳＳＥＴＬＥＰＶＣＲＨＩＲＫＧＬＥＱＧＮＬＫＫＡＬＶＮＶＥＷＮＩＣＱＤＣＫＴＤＮＫＶＫＤＫＡＥＥＥＴＥＥＫＰＳＶＷＬＣＬＫＣＧＨＱＧＣＧＲＮＳＱＥＱＨＡＬＫＨＹＬＴＰＲＳＥＰＨＣＬＶＬＳＬＤＮＷＳＶＷＣＹＶＣＤＮＥＶＱＹＣＳＳＮＱＬＧＱＶＶＤＹＶＲＫＱＡＳＩＴＴＰＫＰＡＥＫＤＮＧＮＩＥＬＥＮＫＫＬＥＫＥＳＫＮＥＱＥＲＥＫＫＥＮＭＡＫＥＮＰＰＭＮＳＰＣＱＩＴＶＫＧＬＳＮＬＧＮＴＣＦＦＮＡＶＭＱＮＬＳＱＴＰＶＬＲＥＬＬＫＥＶＫＭＳＧＴＩＶＫＩＥＰＰＤＬＡＬＴＥＰＬＥＩＮＬＥＰＰＧＰＬＴＬＡＭＳＱＦＬＮＥＭＱＥＴＫＫＧＶＶＴＰＫＥＬＦＳＱＶＣＫＫＡＶＲＦＫＧＹＱＱＱＤＳＱＥＬＬＲＹＬＬＤＧＭＲＡＥＥＨＱＲＶＳＫＧＩＬＫＡＦＧＮＳＴＥＫＬＤＥＥＬＫＮＫＶＫＤＹＥＫＫＫＳＭＰＳＦＶＤＲＩＦＧＧＥＬＴＳＭＩＭＣＤＱＣＲＴＶＳＬＶＨＥＳＦＬＤＬＳＬＰＶＬＤＤＱＳＧＫＫＳＶＮＤＫＮＬＫＫＴＶＥＤＥＤＱＤＳＥＥＥＫＤＮＤＳＹＩＫＥＲＳＤＩＰＳＧＴＳＫＨＬＱＫＫＡＫＫＱＡＫＫＱＡＫＮＱＲＲＱＱＫＩＱＧＫＶＬＨＬＮＤＩＣＴＩＤＨＰＥＤＳＥＹＥＡＥＭＳＬＱＧＥＶＮＩＫＳＮＨＩＳＱＥＧＶＭＨＫＥＹＣＶＮＱＫＤＬＮＧＱＡＫＭＩＥＳＶＴＤＮＱＫＳＴＥＥＶＤＭＫＮＩＮＭＤＮＤＬＥＶＬＴＳＳＰＴＲＮＬＮＧＡＹＬＴＥＧＳＮＧＥＶＤＩＳＮＧＦＫＮＬＮＬＮＡＡＬＨＰＤＥＩＮＩＥＩＬＮＤＳＨＴＰＧＴＫＶＹＥＶＶＮＥＤＰＥＴＡＦＣＴＬＡＮＲＥＶＦＮＴＤＥＣＳＩＱＨＣＬＹＱＦＴＲＮＥＫＬＲＤＡＮＫＬＬＣＥＶＣＴＲＲＱＣＮＧＰＫＡＮＩＫＧＥＲＫＨＶＹＴＮＡＫＫＱＭＬＩＳＬＡＰＰＶＬＴＬＨＬＫＲＦＱＱＡＧＦＮＬＲＫＶＮＫＨＩＫＦＰＥＩＬＤＬＡＰＦＣＴＬＫＣＫＮＶＡＥＥＮＴＲＶＬＹＳＬＹＧＶＶＥＨＳＧＴＭＲＳＧＨＹＴＡＹＡＫＡＲＴＡＮＳＨＬＳＮＬＶＬＨＧＤＩＰＱＤＦＥＭＥＳＫＧＱＷＦＨＩＳＤＴＨＶＱＡＶＰＴＴＫＶＬＮＳＱＡＹＬＬＦＹＥＲＩＬ
配列番号４：ＵＳＰ１６タンパク質変異体
ＭＧＫＫＲＴＫＧＫＴＶＰＩＤＤＳＳＥＴＬＥＰＶＣＲＨＩＲＫＧＬＥＱＧＮＬＫＫＡＬＶＮＶＥＷＮＩＣＱＤＣＫＴＤＮＫＶＫＤＫＡＥＥＥＴＥＥＫＰＳＶＷＬＣＬＫＣＧＨＱＧＣＧＲＮＳＱＥＱＨＡＬＫＨＹＬＴＰＲＳＥＰＨＣＬＶＬＳＬＤＮＷＳＶＷＣＹＶＣＤＮＥＶＱＹＣＳＳＮＱＬＧＱＶＶＤＹＶＲＫＱＡＳＩＴＴＰＫＰＡＥＫＤＮＧＮＩＥＬＥＮＫＫＬＥＫＥＳＫＮＥＱＥＲＥＫＫＥＮＭＡＫＥＮＰＰＭＮＳＰＣＱＩＴＶＫＧＬＳＮＬＧＮＴＣＦＦＮＡＶＭＱＮＬＳＱＴＰＶＬＲＥＬＬＫＥＶＫＭＳＧＴＩＶＫＩＥＰＰＤＬＡＬＴＥＰＬＥＩＮＬＥＰＰＧＰＬＴＬＡＭＳＱＦＬＮＥＭＱＥＴＫＫＧＶＶＴＰＫＥＬＦＳＱＶＣＫＫＡＶＲＦＫＧＹＱＱＱＤＳＱＥＬＬＲＹＬＬＤＧＭＲＡＥＥＨＱＲＶＳＫＧＩＬＫＡＦＧＮＳＴＥＫＬＤＥＥＬＫＮＫＶＫＤＹＥＫＫＫＳＭＰＳＦＶＤＲＩＦＧＧＥＬＴＳＭＩＭＣＤＱＣＲＴＶＳＬＶＨＥＳＦＬＤＬＳＬＰＶＬＤＤＱＳＧＫＫＳＶＮＤＫＮＬＫＫＴＶＥＤＥＤＱＤＳＥＥＥＫＤＮＤＳＹＩＫＥＲＳＤＩＰＳＧＴＳＫＨＬＱＫＫＡＫＫＱＡＫＫＱＡＫＮＱＲＲＱＱＫＩＱＧＫＶＬＨＬＮＤＩＣＴＩＤＨＰＥＤＳＥＹＥＡＥＭＳＬＱＧＥＶＮＩＫＳＮＨＩＳＱＥＧＶＭＨＫＥＹＣＶＮＱＫＤＬＮＧＱＡＫＭＩＥＳＶＴＤＮＱＫＳＴＥＥＶＤＭＫＮＩＮＭＤＮＤＬＥＶＬＴＳＳＰＴＲＮＬＮＧＡＹＬＴＥＧＳＮＧＥＶＤＩＳＮＧＦＫＮＬＮＬＮＡＡＬＨＰＤＥＩＮＩＥＩＬＮＤＳＨＴＰＧＴＫＶＹＥＶＶＮＥＤＰＥＴＡＦＣＴＬＡＮＲＥＶＦＮＴＤＥＣＳＩＱＨＣＬＹＱＦＴＲＮＥＫＬＲＤＡＮＫＬＬＣＥＶＣＴＲＲＱＣＮＧＰＫＡＮＩＫＧＥＲＫＨＶＹＴＮＡＫＫＱＭＬＩＳＬＡＰＰＶＬＴＬＨＬＫＲＦＱＱＡＧＦＮＬＲＫＶＮＫＨＩＫＦＰＥＩＬＤＬＡＰＦＣＴＬＫＣＫＮＶＡＥＥＮＴＲＶＬＹＳＬＹＧＶＶＥＨＳＧＴＭＲＳＧＨＹＴＡＹＡＫＡＲＴＡＮＳＨＬＳＮＬＶＬＨＧＤＩＰＱＤＦＥＭＥＳＫＧＱＷＦＨＩＳＤＴＨＶＱＡＶＰＴＴＫＶＬＮＳＱＡＹＬＬＦＹＥＲＩＬ
配列番号５：ＵＳＰ１６タンパク質変異体
ＭＧＫＫＲＴＫＧＫＴＶＰＩＤＤＳＳＥＴＬＥＰＶＣＲＨＩＲＫＧＬＥＱＧＮＬＫＫＡＬＶＮＶＥＷＮＩＣＱＤＣＫＴＤＮＫＶＫＤＫＡＥＥＥＴＥＥＫＰＳＶＷＬＣＬＫＣＧＨＱＧＣＧＲＮＳＱＥＱＨＡＬＫＨＹＬＴＰＲＳＥＰＨＣＬＶＬＳＬＤＮＷＳＶＷＣＹＶＣＤＮＥＶＱＹＣＳＳＮＱＬＧＱＶＶＤＹＶＲＫＱＡＳＩＴＴＰＫＰＥＫＤＮＧＮＩＥＬＥＮＫＫＬＥＫＥＳＫＮＥＱＥＲＥＫＫＥＮＭＡＫＥＮＰＰＭＮＳＰＣＱＩＴＶＫＧＬＳＮＬＧＮＴＣＦＦＮＡＶＭＱＮＬＳＱＴＰＶＬＲＥＬＬＫＥＶＫＭＳＧＴＩＶＫＩＥＰＰＤＬＡＬＴＥＰＬＥＩＮＬＥＰＰＧＰＬＴＬＡＭＳＱＦＬＮＥＭＱＥＴＫＫＧＶＶＴＰＫＥＬＦＳＱＶＣＫＫＡＶＲＦＫＧＹＱＱＱＤＳＱＥＬＬＲＹＬＬＤＧＭＲＡＥＥＨＱＲＶＳＫＧＩＬＫＡＦＧＮＳＴＥＫＬＤＥＥＬＫＮＫＶＫＤＹＥＫＫＫＳＭＰＳＦＶＤＲＩＦＧＧＥＬＴＳＭＩＭＣＤＱＣＲＴＶＳＬＶＨＥＳＦＬＤＬＳＬＰＶＬＤＤＱＳＧＫＫＳＶＮＤＫＮＬＫＫＴＶＥＤＥＤＱＤＳＥＥＥＫＤＮＤＳＹＩＫＥＲＳＤＩＰＳＧＴＳＫＨＬＱＫＫＡＫＫＱＡＫＫＱＡＫＮＱＲＲＱＱＫＩＱＧＫＶＬＨＬＮＤＩＣＴＩＤＨＰＥＤＳＥＹＥＡＥＭＳＬＱＧＥＶＮＩＫＳＮＨＩＳＱＥＧＶＭＨＫＥＹＣＶＮＱＫＤＬＮＧＱＡＫＭＩＥＳＶＴＤＮＱＫＳＴＥＥＶＤＭＫＮＩＮＭＤＮＤＬＥＶＬＴＳＳＰＴＲＮＬＮＧＡＹＬＴＥＧＳＮＧＥＶＤＩＳＮＧＦＫＮＬＮＬＮＡＡＬＨＰＤＥＩＮＩＥＩＬＮＤＳＨＴＰＧＴＫＶＹＥＶＶＮＥＤＰＥＴＡＦＣＴＬＡＮＲＥＶＦＮＴＤＥＣＳＩＱＨＣＬＹＱＦＴＲＮＥＫＬＲＤＡＮＫＬＬＣＥＶＣＴＲＲＱＣＮＧＰＫＡＮＩＫＧＥＲＫＨＶＹＴＮＡＫＫＱＭＬＩＳＬＡＰＰＶＬＴＬＨＬＫＲＦＱＱＡＧＦＮＬＲＫＶＮＫＨＩＫＦＰＥＩＬＤＬＡＰＦＣＴＬＫＣＫＮＶＡＥＥＮＴＲＶＬＹＳＬＹＧＶＶＥＨＳＧＴＭＲＳＧＨＹＴＡＹＡＫＡＲＴＡＮＳＨＬＳＮＬＶＬＨＧＤＩＰＱＤＦＥＭＥＳＫＧＱＷＦＨＩＳＤＴＨＶＱＡＶＰＴＴＫＶＬＮＳＱＡＹＬＬＦＹＥＲＩＬ
配列番号６：ＵＳＰ１６タンパク質変異体
ＭＧＫＫＲＴＫＧＫＴＶＰＩＤＤＳＳＥＴＬＥＰＶＣＲＨＩＲＫＧＬＥＱＧＮＬＫＫＡＬＶＮＶＥＷＮＩＣＱＤＣＫＴＤＮＫＶＫＤＫＡＥＥＥＴＥＥＫＰＳＶＷＬＣＬＫＣＧＨＱＧＣＧＲＮＳＱＥＱＨＡＬＫＨＹＬＴＰＲＳＥＰＨＣＬＶＬＳＬＤＮＷＳＶＷＣＹＶＣＤＮＥＶＱＹＣＳＳＮＱＬＧＱＶＶＤＹＶＲＫＱＡＳＩＴＴＰＫＰＡＥＫＤＮＧＮＩＥＬＥＮＫＫＬＥＫＥＳＫＮＥＱＥＲＥＫＫＥＮＭＡＫＥＮＰＰＭＮＳＰＣＱＩＴＶＫＧＬＳＮＬＧＮＴＣＦＦＮＡＶＭＱＮＬＳＱＴＰＶＬＲＥＬＬＫＥＶＫＭＳＧＴＩＶＫＩＥＰＰＤＬＡＬＴＥＰＬＥＩＮＬＥＰＰＧＰＬＴＬＡＭＳＱＦＬＮＥＭＱＥＴＫＫＧＶＶＴＰＫＥＬＦＳＱＶＣＫＫＡＶＲＦＫＧＹＱＱＱＤＳＱＥＬＬＲＹＬＬＤＧＭＲＡＥＥＨＱＲＶＳＫＧＩＬＫＡＦＧＮＳＴＥＫＬＤＥＥＬＫＮＫＶＫＤＹＥＫＫＫＳＭＰＳＦＶＤＲＩＦＧＧＥＬＴＳＭＩＭＣＤＱＣＲＴＶＳＬＶＨＥＳＦＬＤＬＳＬＰＶＬＤＤＱＳＧＫＫＳＶＮＤＫＮＬＫＫＴＶＥＤＥＤＱＤＳＥＥＥＫＤＮＤＳＹＩＫＥＲＳＤＩＰＳＧＴＳＫＨＬＱＫＫＡＫＫＱＡＫＫＱＡＫＮＱＲＲＱＱＫＩＱＧＫＶＬＨＬＮＤＩＣＴＩＤＨＰＥＤＳＥＹＥＡＥＭＳＬＱＧＥＶＮＩＫＳＮＨＩＳＱＥＧＶＭＨＫＥＹＣＶＮＱＫＤＬＮＧＱＡＫＭＩＥＳＶＴＤＮＱＫＳＴＥＥＶＤＭＫＮＩＮＭＤＮＤＬＥＶＬＴＳＳＰＴＲＮＬＮＧＡＹＬＴＥＧＳＮＧＥＶＤＩＳＮＧＦＫＮＬＮＬＮＡＡＬＨＰＤＥＩＮＩＥＩＬＮＤＳＨＴＰＧＴＫＶＹＥＶＶＮＥＤＰＥＴＡＦＣＴＬＡＮＲＥＶＦＮＴＤＥＣＳＩＱＨＣＬＹＱＦＴＲＮＥＫＬＲＤＡＮＫＬＬＣＥＶＣＴＲＲＱＣＮＧＰＫＡＮＩＫＧＥＲＫＨＶＹＴＮＡＫＫＱＭＬＩＳＬＡＰＰＶＬＴＬＨＬＫＲＦＱＱＡＧＦＮＬＲＫＶＮＫＨＩＫＦＰＥＩＬＤＬＡＰＦＣＴＬＫＣＫＮＶＡＥＥＮＴＲＶＬＹＳＬＹＧＶＶＥＨＳＧＴＭＲＳＧＨＹＴＡＹＡＫＡＲＴＡＮＳＨＬＳＮＬＶＬＨＧＤＩＰＱＤＦＥＭＥＳＫＧＱＷＦＨＩＳＤＴＨＶＱＡＶＰＴＴＫＶＬＮＳＱＡＹＬＬＦＹＥＲＩＬ
配列番号７：ＵＳＰ１６タンパク質変異体
ＭＧＫＫＲＴＫＧＫＴＶＰＩＤＤＳＳＥＴＬＥＰＶＣＲＨＩＲＫＧＬＥＱＧＮＬＫＫＡＬＶＮＶＥＷＮＩＣＱＤＣＫＴＤＮＫＶＫＤＫＡＥＥＥＴＥＥＫＰＳＶＷＬＣＬＫＣＧＨＱＧＣＧＲＮＳＱＥＱＨＡＬＫＨＹＬＴＰＲＳＥＰＨＣＬＶＬ
本明細書で提供されるのは、ＵＳＰ１６の阻害剤である。そのような阻害剤は、細胞内のＵＳＰ１６の発現および／または活性を低下させる可能性がある。ＵＳＰ１６の例示的な阻害剤には、例えば、核酸、タンパク質、小分子、または高分子が含まれる。
いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６の阻害剤は、ＣａｓヌクレアーゼなどのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、またはそれをコードする核酸である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２（ａ）ヌクレアーゼ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃヌクレアーゼ、ＴｒｐＢ様ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａヌクレアーゼ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４ヌクレアーゼ、ＣａｓＸヌクレアーゼ、ＣａｓＹヌクレアーゼ、またはそれらの改変もしくは短縮型変異体である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ａｕｒｅｕｓから単離またはそれに由来する。Ｃａｓヌクレアーゼは、標的核酸配列に結合すること、ガイドＲＮＡ（例えば、単一分子または二重分子ｇＲＮＡ）に結合する。単一分子ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、典型的には、目的の標的ＤＮＡ配列に相補的であるスペーサー配列、およびＣａｓヌクレアーゼに結合する足場配列を含む。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、ＵＳＰ１６遺伝子のイントロンまたはエキソンなどのＵＳＰ１６遺伝子の特定の部位を標的とする。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、ＵＳＰ１６遺伝子のプロモーター、エンハンサー、または他の非翻訳領域（例えば、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ）を含むがこれらに限定されない非コード領域を標的とする。
いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６の阻害剤は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬヌクレアーゼ）、またはそれをコードする１つ以上の核酸である。ＴＡＬヌクレアーゼは、ＤＮＡ切断ドメインに融合されたＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含み得る。ＴＡＬヌクレアーゼは、ＵＳＰ１６遺伝子のイントロンまたはエキソンなどのＵＳＰ１６遺伝子を標的とし得る。いくつかの実施形態において、ＴＡＬヌクレアーゼは、ＵＳＰ１６遺伝子のプロモーター、エンハンサー、または他の非翻訳領域（例えば、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ）を含むがこれらに限定されない非コード領域を標的とする。
いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６の阻害剤は、亜鉛（Ｚｎ）フィンガーヌクレアーゼ、またはそれをコードする１つ以上の核酸である。Ｚｎフィンガーヌクレアーゼは、ＤＮＡ切断ドメインに融合された亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＦｏｋＩまたはその変異体）を含み得る。Ｚｎフィンガーヌクレアーゼは、ＵＳＰ１６遺伝子のイントロンまたはエキソンなどのＵＳＰ１６遺伝子を標的とし得る。いくつかの実施形態において、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼは、ＵＳＰ１６遺伝子のプロモーター、エンハンサー、または他の非翻訳領域（例えば、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ）を含むがこれらに限定されない非コード領域を標的とする。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＲＮＡｉ分子である。例えば、阻害剤は、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、または非対称干渉ＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＵＳＰ１６遺伝子の配列を標的とするｓｈＲＮＡである。いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＵＳＰ１６遺伝子の次の配列、５’－ＴＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＴＡＴＣＡＣＴＴ－３’（配列番号２）、５’－ＧＡＣＴＧＴＡＡＧＡＣＴＧＡＣＡＡＴＡＡＡ－３’（配列番号８）、および５’－ＴＡＴＡＴＣＡＧＴＴＣＡＣＣＣＧＴＡＡＴ－３’（配列番号９）、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を標的とするｓｈＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６の阻害剤は、アンチセンス分子、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ－ＲＮＡキメラ、モルフォリノオリゴ、ｌｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡに埋め込まれたｓｈＲＮＡ、低分子内部セグメント化されたＲＮＡ、抗体、およびエキソソームから選択される。
いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６の阻害剤（例えば、ＵＳＰ１６の小分子阻害剤）は、１つ以上の他の薬剤と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６の第１の阻害剤は、ＵＳＰ１６の第２の阻害剤と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６の阻害剤は、１つ以上のＷＮＴアゴニストと組み合わせて使用される。いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６の阻害剤は、１つ以上のＲ－スポンジン（Ｒｓｐｏ）アゴニストと組み合わせて使用される。いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６の阻害剤は、抗疲弊療法（例えば、ＰＤ１阻害療法（例えば、抗ＰＤ１療法））、例えば、ＣＴＬＡ４阻害療法（例えば、抗ＣＴＬＡ４療法）と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６の阻害剤および第２の薬剤は、同時に使用される。いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６の阻害剤および第２の薬剤は、連続して使用される。
いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６阻害は、ＵＳＰ１６発現のノックダウン（本明細書では、発現の下方制御、減少、サイレンシングなどとも交換可能に称される）を指す。ノックダウンは、発現の完全なノックアウトである必要はないので、いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６の阻害剤は、ＵＳＰ１６の発現を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低下させ得る。いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６の阻害剤は、ＵＳＰ１６の発現を完全に排除し得る（例えば、ノックアウト）。
いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６阻害は、ＵＳＰ１６活性のノックダウン（本明細書では、活性の下方制御、減少、サイレンシングなどとも交換可能に称される）を指す。いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６の阻害剤は、ＵＳＰ１６の活性を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低下させ得る。いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６の阻害剤は、ＵＳＰ１６の活性を完全に排除し得る。
いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６阻害は、ＵＳＰ１６遺伝子の改変を指し、これは、それを機能不能にする（例えば、ＵＳＰ１６遺伝子のノックアウトまたは特定の塩基変異（触媒部位における変異））。
いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６の阻害剤が細胞に接触した後、ＵＳＰ１６発現および／または活性は、細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％において阻害される。
細胞
細胞に接触する方法およびＵＳＰ１６の発現を下方制御するために細胞を改変する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、細胞は、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳動物、または魚類から単離またはそれらに由来する。いくつかの実施形態において、細胞は、霊長類細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞である。
本開示の細胞は、インビボまたはインビトロで接触および改変され得る。細胞がインビトロである実施形態において、細胞は、一次細胞または不死化細胞であり得る。細胞は、野生型であるか、遺伝子改変されているか、または１つ以上の遺伝子変異を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞のゲノムは、ＵＳＰ１６遺伝子の１つのコピー、２つのコピー、または３つのコピーを有する。いくつかの実施形態において、細胞は、高レベルのＵＳＰ１６を発現し得るか、または低レベルのＵＳＰ１６を発現し得る。本明細書で使用される場合、「高」レベルのＵＳＰ１６は、野生型レベルと比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％増加したＵＳＰ１６のレベルを指す。「低」レベルのＵＳＰは、野生型レベルと比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％減少したＵＳＰ１６のレベルを指す。低レベルまたは高レベルのＵＳＰ１６発現は、遺伝子組み換え、老化などによって誘発され得る。
細胞は、細胞ベースの療法（例えば、キメラ抗原受容体ベースの細胞療法、ＨＳＣ療法、または操作されたＴＣＲ療法）に使用される野生型細胞または操作された（例えば、遺伝子改変された）細胞であり得る。
いくつかの実施形態において、細胞は、血液細胞である。血液細胞は、造血幹細胞、一般的な骨髄もしくはリンパ球の前駆細胞、または赤血液細胞、白血液細胞、もしくは血小板を含む、それらから分化する細胞であり得る。いくつかの実施形態において、血液細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、好中球、またはナチュラルキラー細胞（下記のナチュラルキラーＴ細胞とは異なるＮＫ細胞）などの免疫細胞である。
細胞がＴ細胞である実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。例えば、Ｔ細胞は、細胞毒性Ｔ細胞、末端エフェクターＴ細胞、メモリーもしくはセントラルメモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、サイトカイン誘発性キラー（ＣＩＫ）Ｔ細胞、または腫瘍浸潤リンパ球であり得る。
細胞がＮＫ（ナチュラルキラー）細胞である実施形態では、ＮＫ細胞は、ＮＫ耐性（例えば、ＣＤ５６明るいまたはＣＤ２７－ＣＤ１１ｂ－ＮＫ細胞）、ＮＫ細胞毒性（例えば、ＣＤ５６薄暗いまたはＣＤ２７－ＣＤ１１ｂ＋ＮＫ細胞）、ＮＫ制御性（例えば、ＣＤ５６明るいまたはＣＤ２７＋ＮＫ細胞）、またはＮＫＴ（ＣＤ５６－またはＣＤ３＋ＣＤ５６－）であり得る。
いくつかの実施形態において、細胞は、ｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、幹細胞である。幹細胞は、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は、造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＳＣ療法に使用されるＨＳＣである。例えば、ＨＳＣは、１つ以上の治療遺伝子、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）もしくはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように改変され得る。
いくつかの実施形態において、細胞は、幹細胞ではない。いくつかの実施形態において、細胞は、血液幹細胞ではない。いくつかの実施形態において、細胞は、リンパ系または骨髄系の前駆細胞ではない。いくつかの実施形態において、細胞は、造血幹細胞ではない。
上記の細胞のうちのいずれも、本開示のいくつかの実施形態において遺伝子改変され得る。本明細書で使用される場合、「遺伝子改変細胞」という用語は、タンパク質またはＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡセグメントを安定的または一時的に発現するように遺伝子操作された細胞を指す。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された細胞は、ＵＳＰ１６を過剰発現するように改変されていない。いくつかの実施形態において、細胞は、目的のタンパク質を発現または過剰発現するように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、細胞は、目的のタンパク質の発現を下方制御（ノックダウンまたはノックアウト）するように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、細胞は、細胞内ですでに発現されている目的のタンパク質を過剰発現するように、または典型的には、発現されない時間／状況でそれを発現するように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、細胞は、外因性タンパク質、例えば、通常は細胞によって発現されないタンパク質を発現するように遺伝子改変されている。
上記の細胞のうちのいずれも、細胞療法のためにインビトロで拡大される細胞であり得る。例えば、細胞は、対象に投与される前に、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約２５０倍、約５００倍、約７５０倍、約１０００倍以上に拡大され得る。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された細胞は、それを必要とする対象に投与される前に、インビトロで拡大され得る。
いくつかの実施形態において、細胞は、遺伝子改変された血液細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された血液細胞は、その表面上にキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝的に改変されている。いくつかの実施形態において、細胞は、同種異系である養子細胞療法の適用のために調製される。いくつかの実施形態において、細胞は、自家である養子細胞療法の適用のために調製される。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された血液細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－マクロファージ、またはＣＡＲ－ＮＫ細胞）を発現するように改変された細胞であり得る。ＣＡＲ改変細胞は、標的細胞の表面上の１つ以上の抗原を認識するキメラ抗原受容体を発現し得る。例えば、ＣＡＲ改変細胞は、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、グリピカン－３、カッパ免疫グロブリン、ＲＯＲ１、ＧＤ２、ＣＤ４４ｖ６、ＨＥＲ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＢＣＭＡ、ＣＤ２２、ＭＳＬＮ、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＥＧＦＲ２、ＩＬ－１３、ＩＬ１３Ｒα２、ルイスＹ抗原、メソセリン、ＦＡＰ、および／またはＰＳＭＡを認識するキメラ抗原受容体を発現し得る。 いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、二重標的化ＣＡＲ、阻害性ＣＡＲ、誘発性ＣＡＲ、ｓｙｎＮｏｔｃｈ ＣＡＲ、ｉＣＡＲ、薬物誘発性ＣＡＲ、またはアダプターＣＡＲである。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、サイトカインまたはサイトカイン受容体（例えば、ＩＬ１５またはＩＬ１５Ｒ）、または自殺遺伝子を共発現することができる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、抗疲弊タンパク質（例えば、ＰＤ－１／ＰＤＬ－１ Ｆａｂ）またはｓｈＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ／ｇＲＮＡを発現して、疲弊マーカー（例えば、ＰＤ－１ ｓｈＲＮＡ）を制御し、阻害性受容体の発現を低下させることができる。
他の実施形態において、細胞は、遺伝子改変された血液細胞であり、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ－Ｔ細胞）療法で使用するために、Ｔ細胞受容体を発現するように改変されている。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ編集は、完全または部分的な編集であり得る。
いくつかの実施形態において、細胞は、自家細胞であり、他の実施形態では、細胞は、同種異系細胞である。いくつかの実施形態において、自家療法または同種療法のために細胞を調製する場合、追加の遺伝子改変を実施することができる。
細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御するための方法
本明細書で提供されるのは、細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を減少させる（本明細書では下方制御、ノックダウン、サイレンシング、阻害と交換可能に称される）方法であり、この方法は、ＵＳＰ１６の阻害剤を細胞と接触させることを含む。発現および／または活性の下方制御は、一過性または安定している可能性があることに留意されたい。これらの方法は、インビトロまたはインビボで行われ得る。
細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を減少させることは、以下の効果：（ａ）細胞拡大を維持もしくは増加させること、（ｂ）インビトロでの呼気時間を延長させること、（ｃ）インビボでの持続性を増加させること、（ｄ）細胞老化の開始を予防、遅延、もしくは逆転させること、（ｅ）自己複製能力を増加もしくは維持すること、（ｆ）自己複製表現型を増加もしくは維持すること、（ｇ）細胞疲弊を低下させること、（ｈ）遊走能を維持すること、（ｉ）活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を低下させること、（ｊ）エフェクター機能を増加させること、（ｋ）インビボでの生着を増加させること、（ｌ）インビボでの腫瘍死滅を増加させること、（ｍ）細胞老化マーカーもしくは老化関連マーカーの発現を調節すること、（ｎ）ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ｄ、および／もしくはγ－Ｈ２ＡＸ発現を低下させること、（ｏ）細胞増殖を増加させること、（ｐ）Ｈ２ＡもしくはＨ２Ｂのユビキチン化を増加させること、（ｑ）ＳＡ－β－Ｇａｌ発現を低下させること、（ｒ）テロメアの短縮を低下させること、（ｓ）ＷＮＴ経路を介したシグナル伝達を増強させること、（ｔ）インビトロ細胞毒性を維持もしくは増加させること、（ｕ）ナイーブもしくはセントラルメモリー表現型を維持もしくは増加させること、（ｖ）放出されたサイトカインの種類および量を改変すること、（ｗ）幹細胞マーカーの発現を増加させること、（ｘ）老化細胞除去薬に対する感受性を低下させること、（ｙ）ＳＡＳＰ（細胞老化関連分泌表現型）を低下させること、（ｚ）アポトーシスを低下させること、（ａａ）壊死を低下させること、（ｂｂ）ミトコンドリア膜電位を増加させること、ならびに／または（ｃｃ）細胞のグルタチオン含有量を増加させること、のうちの１つ以上を有し得る。
細胞がＴ細胞であるいくつかの実施形態において、細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を低下させることは、Ｔ細胞の疲弊を低下させ得る。したがって、本明細書に記載の組成物および方法を使用して、ＣＡＲ－Ｔ療法および操作されたＴＣＲ－Ｔ細胞療法を含む、細胞ベースの療法の有効性を改善することができる。
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞をＵＳＰ１６の阻害剤と接触させることを含む、細胞の老化を調節する方法を提供する。方法は、以下：（ａ）細胞拡大を維持もしくは増加させること、（ｂ）インビトロでの呼気時間を延長させること、（ｃ）インビボでの持続性を増加させること、（ｄ）細胞老化の開始を防止、遅延、もしくは逆転させること、（ｅ）自己複製能力を増加させること、（ｆ）自己複製表現型を増加もしくは維持すること、（ｇ）細胞疲弊を低下させること、（ｈ）遊走能を維持すること、（ｉ）活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を低下させること、（ｊ）エフェクター機能を増加させること、（ｋ）インビボでの生着を増加させること、（ｌ）インビボでの腫瘍死滅を増加させること、（ｍ）細胞老化マーカーもしくは老化関連マーカーの発現を調節すること、（ｎ）ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ｄ、および／もしくはγ－Ｈ２ＡＸ発現を低下させること、（ｏ）細胞増殖を増加させること、（ｐ）Ｈ２ＡもしくはＨ２Ｂのユビキチン化を増加させること、（ｑ）ＳＡ－β－Ｇａｌ発現を低下させること、（ｒ）テロメアの短縮を低下させること、（ｓ）ＷＮＴ経路を介したシグナル伝達を増強させること、（ｔ）インビトロ細胞毒性を維持もしくは増加させること、（ｕ）ナイーブもしくはセントラルメモリー表現型を維持もしくは増加させること、（ｖ）放出されたサイトカインの種類および量を改変すること、（ｗ）幹細胞マーカーの発現を増加させること、（ｘ）老化細胞除去薬に対する感受性を低下させること、（ｙ）ＳＡＳＰ（細胞老化関連分泌表現型）を低下させること、（ｚ）アポトーシスを低下させること、（ａａ）壊死を低下させること、（ｂｂ）ミトコンドリア膜電位を増加させること、ならびに／または（ｃｃ）細胞のグルタチオン含有量を増加させること、のうちの１つ以上をもたらし得る。
いくつかの実施形態において、細胞は、血液細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＳＣである。いくつかの実施形態において、細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、遺伝子改変されたＴ細胞、遺伝子改変されたＮＫ細胞、または遺伝的に改変されたＨＳＣなどの遺伝子改変された細胞である。細胞がＴ細胞（例えば、遺伝子改変されたＴ細胞）であるいくつかの実施形態において、細胞におけるＵＳＰ１６の活性を低下させることは、Ｔ細胞の疲弊を低下させ得る。
いくつかの実施形態において、免疫療法の適用で使用するための免疫細胞を調製するための方法が提供され、この方法は、免疫細胞をＵＳＰ１６の阻害剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、免疫療法の適用は、ＣＡＲベースの療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－マクロファージ、もしくはＣＡＲ－ＮＫ細胞療法）、操作されたＴＣＲ療法、または腫瘍浸潤リンパ球、制御性Ｔ細胞、およびリダイレクトされたＴ細胞の使用などの他の養子細胞療法、幹細胞療法（例えば、ＨＳＣ療法）、または遺伝子療法である。いくつかの実施形態において、免疫療法は、自家である。いくつかの実施形態において、免疫療法は、同種異系である。
いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６の阻害剤は、免疫細胞を含む細胞集団のインビトロでの拡大中に免疫細胞と接触させられる。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、細胞が対象に投与される前、例えば、細胞が対象に投与される約４時間、約１２時間、約２４時間、約２６時間、または約４８時間前に、ＵＳＰ１６の阻害剤と接触させられる。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、細胞が対象に投与される約３～約２１日、約７～約２１日、または約７～約１４日前に、ＵＳＰ１６の阻害剤と接触させられる。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、細胞が対象に投与される３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、または２１日前に、ＵＳＰ１６の阻害剤と接触させられる。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、細胞が対象に投与された後、例えば、細胞が対象に投与された約４時間、約１２時間、約２４時間、約２６時間、または約４８時間後に、ＵＳＰ１６の阻害剤と接触させられる。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＵＳＰ１６の阻害剤と同時に対象に投与される。
細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性の下方制御の効果
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、細胞拡大における関連する維持または増加である。本明細書で言及されるように、細胞拡大は、一般に、細胞増殖のインビトロでのプロセスを指し、典型的には、細胞は、拡大の前に生物または組織から採取される。いくつかの実施形態において、そのような増加は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の増加であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、細胞増殖における関連する増加である。本明細書で言及されるように、細胞増殖は、細胞数の増加をもたらすプロセスであり、細胞分裂と、細胞死または分化による細胞喪失との間のバランスを示す。細胞増殖は、インビトロまたはインビボで測定することができる。いくつかの実施形態において、そのような増加は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の増加であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、インビトロでの呼気時間における関連する増加である。いくつかの実施形態において、そのような増加は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の増加であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察されたまたは予想される結果は、インビボでの持続性における関連する増加である。いくつかの実施形態において、そのような増加は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の増加であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、細胞老化の開始における関連する予防、遅延、または逆転である。いくつかの実施形態において、そのような予防、遅延、または逆転は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、自己複製能力における関連する増加またはその維持である。いくつかの実施形態において、そのような増加は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の増加であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、自己複製表現型における関連する増加またはその維持である。いくつかの実施形態において、そのような増加は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の増加であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの予想される結果は、細胞疲弊における関連する低下である。細胞疲弊は、いくつかの方法で評価することができ、いくつかの実施形態において、疲弊マーカーの発現レベルを評価することができる。疲弊マーカーには、ＰＤ－１、Ｌａｇ３、ＣＴＬＡ４、ＣＤ６９、ＣＤ３９、ＴＩＭ－３、ＴＯＸ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、２Ｂ４、およびＢＴＬＡが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、そのような疲弊の低下、または疲弊マーカーの発現レベルは、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の減少であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、関連する遊走能を維持することである。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生における関連する低下である。いくつかの実施形態において、そのような低下は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の低下であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、エフェクター機能、例えば、Ｔ細胞エフェクター機能における関連する増加である。いくつかの実施形態において、そのような増加は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の増加であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、インビボでの生着における関連する増加である。いくつかの実施形態において、そのような増加は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の増加であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、インビボでの腫瘍死滅における関連する増加である。いくつかの実施形態において、そのような増加は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の増加であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、細胞老化マーカーの発現における関連する調節である。本明細書で使用される場合、細胞老化マーカーは、細胞の老化中に増加または減少し得る遺伝子、タンパク質、代謝産物、または後成的マーカーである。細胞老化マーカーには、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｄ、ｐ２７、ｐ５３、ＬａｍｉｎＢ１、ＢＭＩ－１、γ－Ｈ２ＡＸ、ＦＯＸＯ３、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＭ１、ＣＣＮＤ１、ＩＬ６、ＩＬ８、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ＣＤＫ６、および糖分解に関連する遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。Ｔ細胞は、細胞の老化および細胞老化の間に追加の遺伝子（前述の遺伝子に加えて）の遺伝的プロファイルの変化を示し、したがって、Ｔ細胞における細胞老化マーカーに関して、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５７、ＣＤ１６０、ＣＤ２７、ＫＬＲＧ１、およびＣＤ１３８も含まれることに留意されたい。いくつかの実施形態において、そのような調節は、発現のレベルにおいて、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の増加または減少であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ｄ、および／またはγ－Ｈ２ＡＸ発現の関連する低下である。いくつかの実施形態において、そのような低下は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の低下であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、Ｈ２ＡまたはＨ２Ｂユビキチン化における関連する増加である。いくつかの実施形態において、そのような増加は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の増加であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、ＳＡ－β－Ｇａｌ発現における関連する低下である。いくつかの実施形態において、そのような低下は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の低下であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、テロメア短縮における関連する低下である。いくつかの実施形態において、そのような低下は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の低下であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、ＷＮＴ経路を介したシグナル伝達における関連する増強（増加）である。ＷＮＴ経路を介したシグナル伝達の増強は、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ１０、ＷＮＴ５ａ、ＴＣＦ７、ＬＥＦ１、ＡＸＩＮ２、ＣＴＮＢＢ１、ＮＯＴＣＨ、Ｆｚｄ、ＬＰＲ５／６、ＬＧＲ４／５／６、ＡＰＣ、ＧＳＫ３、ｃ－ｍｙｃ、ｃ－ｊｕｎ、およびＣｙｃｌｉｎ Ｄ１（ＣＣＮＤ１）を含むがこれらに限定されない、いくつかの遺伝子の発現レベルによって検出することができる。したがって、本明細書で使用される場合、Ｗｎｔ経路を介したシグナル伝達の増強は、いくつかの実施形態において、前述の遺伝子のうちの１つ以上の発現レベルを評価することによって検出され得る。いくつかの実施形態において、マーカーのシグナル伝達／発現におけるそのような増加は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の増加で得あり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、インビトロ細胞毒性における関連する維持または増加である。いくつかの実施形態において、そのような増加は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の増加であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、ナイーブまたはセントラルメモリー表現型における関連する維持または増加である。いくつかの実施形態において、そのような増加は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の増加であり得る。
このセクションで述べるように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、放出されるサイトカインの種類および量における関連する改変である。したがって、いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＭＩＰ－１、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－１ａ、エオタキシン、およびＩＦＮｇを含むがこれらに限定されない、細胞老化および炎症に関連するサイトカインの産生を低下させ得る。いくつかの実施形態において、そのような低下は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の低下であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの予想される結果は、幹細胞マーカーの発現における関連する増加である。そのような幹細胞マーカーには、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＴＢＸ２１、ＬＥＦ１、ＴＣＦ７、ＥＯＳＯＭＥＳ、ＩＬ７Ｒ、ＦＯＸＰ１、ＺＥＢ２、ＢＣＬ６、ＣＤ１２７、およびＣＸＣＲ３が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、そのような増加は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の増加であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、老化細胞除去薬に対する感受性における関連する低下である。いくつかの実施形態において、そのような低下は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の低下であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、細胞老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）の観察における関連する低下である。いくつかの実施形態において、そのような低下は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の低下であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、関連するアポトーシスの低下である。いくつかの実施形態において、そのような低下は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の低下であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、関連する壊死の低下である。いくつかの実施形態において、そのような低下は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の低下であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、ミトコンドリア膜電位における関連する増加である。いくつかの実施形態において、そのような増加は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の増加であり得る。
上記のセクションで述べたように、本開示の細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を下方制御することの観察または予想される結果は、細胞のグルタチオン含有量における関連する増加である。いくつかの実施形態において、そのような増加は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、またはさらに少なくとも約３００％の増加であり得る。
送達方法
ＵＳＰ１６阻害剤は、数多くの異なる方法で細胞に送達され得る。例えば、阻害剤（例えば、小分子）は、培養物中の細胞の培地に直接添加され得る。いくつかの実施形態において、阻害剤は、ベクターを使用して細胞に送達され得る。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、非ウイルスベクターを使用して細胞に送達され得る。例示的な非ウイルスベクターには、ナノ粒子（例えば、ポリマーナノ粒子）、リポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）、カチオン性脂質－ＤＮＡ複合体、脂質エマルジョン、リン酸カルシウム、ポリマー複合体、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。非ウイルスベクターは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）（例えば、プラスミド）、または一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）をパッケージングするために使用され得る。いくつかの実施形態において、非ウイルスベクターは、ＵＳＰ１６の阻害剤をコードする配列を含むプラスミドを含み得る。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、ウイルスベクターを使用して細胞に送達され得る。例えば、阻害剤をコードする核酸配列は、ウイルスベクターにパッケージ化され得、ウイルスベクターは、その後、細胞を形質導入するために使用され得る。いくつかの実施形態において、本開示のウイルスベクターは、複製欠陥であるか、または少なくとも条件付きで複製欠陥である。本開示の組成物および方法で使用するのに好適なウイルスベクターには、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、ウシＡＡＶ、およびトリＡＡＶから選択される血清型を有するＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１９／０２８３０６の表１に開示されるＡＡＶベクターのうちのいずれかから選択される。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、トランスポゾンシステムを使用して送達され得る。トランスポゾンシステムは、ヒト細胞を含む細胞における安定したゲノム統合および導入遺伝子構築物の長期的な発現の能力を有する。いくつかの実施形態において、トランスポゾンシステムは、スリーピングビューティーシステムである。スリーピングビューティーシステムは、スリーピングビューティー（ＳＢ）トランスポザーゼ、および脊椎動物のゲノムにＤＮＡの特定の配列を挿入するように設計されたトランスポゾンで構成されている。他のＴｃ１／マリナー型トランスポザーゼと同様に、ＳＢトランスポザーゼは、トランスポゾンをレシピエントＤＮＡ配列におけるＴＡジヌクレオチド塩基対に挿入する。
阻害剤はまた、エレクトロポレーションを使用して細胞に送達され得る。エレクトロポレーションは、細胞膜の細孔を短時間開き、例えば、ＤＮＡベクターの細胞への通過を可能にする。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、単独で、または１つ以上の追加の薬剤と組み合わせて送達される。いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の薬剤は、ＵＳＰ１６の第２の阻害剤を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の薬剤は、Ｗｎｔアゴニストを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の薬剤は、Ｒ－スポンジン（Ｒｓｐｏ）アゴニストを含む。いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６の阻害剤および第２の薬剤は、同時に送達される。いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６の阻害剤および第２の薬剤は、連続して送達される。
薬学的組成物
ＵＳＰ１６の阻害剤を含む薬学的組成物も提供される。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される組成物は、ＵＳＰ１６の阻害剤、および１つ以上の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」または「薬学的な許容される賦形剤」は、ＵＳＰ１６の阻害剤と組み合わされたときに、ＵＳＰ１６の阻害剤が生物学的活性を保持することを可能にする任意の材料を含む。賦形剤は、形態または粘稠度を与えるか、または希釈剤として作用することができる。好適な賦形剤には、安定剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、封入剤、緩衝液、ならびに皮膚浸透促進剤が含まれるが、これらに限定されない。例には、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および様々な種類の湿潤剤などの標準的な薬学的な担体／賦形剤のいずれかが含まれるが、これらに限定されない。エアロゾルまたは非経口投与に好ましい希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または通常（０．９％）生理食塩水である。そのような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２００５を参照されたい）。
治療の方法
いくつかの実施形態において、治療を必要とする対象にそれを行う方法は、治療有効量のＵＳＰ１６の阻害剤を対象に投与することを含み得る。本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、対象または細胞におけるＵＳＰ１６の発現および／または活性を低下させるのに十分である阻害剤の量を意味する。
いくつかの実施形態において、治療を必要とする対象にそれを行う方法は、以前にＵＳＰ１６の阻害剤と接触させられている治療上有効な数の細胞を対象に投与することを含み得る。いくつかの実施形態において、治療を必要とする対象にそれを行う方法は、ＵＳＰ１６を下方制御するように改変されている治療上有効な数の細胞を対象に投与することを含み得る。本明細書で使用される場合、「治療上有効な数」という用語は、対象における疾患または障害の症状を改善または排除するために必要な細胞の数を意味する。治療上有効な数の細胞は、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、または約１０１２個以上の細胞であり得る。
いくつかの実施形態において、治療は、同種異系である。他の実施形態において、治療は、自家である。治療のために細胞を調製するため、拒絶の可能性を最小限にするためなどに、追加の遺伝子改変が導入され得ることに留意されたい。
いくつかの実施形態において、治療を必要とする対象にそれを行う方法は、ＵＳＰ１６の阻害剤をコードする配列を含むベクター（例えば、ウイルスベクター）を対象に投与することを含み得る。ウイルスベクターは、インビボで対象の１つ以上の細胞型においてＵＳＰ１６を阻害し得る。
ＵＳＰ１６阻害剤またはＵＳＰ１６を下方制御するように改変された細胞は、経口、直腸、経粘膜、局所、経皮、吸入、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、関節内、髄腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内投与経路を含む、様々な異なる投与経路を使用して対象に投与され得る。
阻害剤または細胞は、対象に１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ超投与され得る。いくつかの実施形態において、阻害剤または細胞は、治療上有効な間隔、例えば、１日１回、１週間に１回、１ヶ月に１回、３ヶ月に１回、５ヶ月に１回、毎年１回などで対象に投与され得る。
対象は、例えば、ラット、イヌ、マウス、ウマ、ネコ、ニワトリ、非ヒト霊長類、またはヒトであり得る。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。ヒトは、例えば、約５歳未満、約１０歳未満、約２０歳未満、約３０歳未満、約４０歳未満、約５０歳未満、約６０歳未満、または６０歳超であり得る。対象は、男性であり得るか、または対象は、女性であり得る。
対象は、１つ以上の疾患または障害を有し得るか、または有していると疑われ得る。いくつかの実施形態において、対象は、がんを有する。がんは、例えば、白血病、リンパ腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、膵臓がん、乳がん、結腸がん、肺がん、結腸直腸がん、または脳がんであり得る。いくつかの実施形態において、がんは、固形腫瘍であり得る。いくつかの実施形態において、がんは、血液学的悪性腫瘍であり得る。いくつかの実施形態において、がんは、転移性がんであり得る。
いくつかの実施形態において、対象は、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん（例えば、骨肉腫／悪性線維性組織球腫）、脳幹神経膠腫、小脳星状細胞腫、脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚経路および視床下部神経膠腫、乳がん、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カルチノイド腫瘍、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頸がん、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん（例えば、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫）、胆嚢がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍（頭蓋外、性腺外、または卵巣）、妊娠性絨毛腫瘍、脳幹の神経膠腫、小児脳星状細胞腫、胃カルチノイド、有毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、視床下部および視覚経路神経膠腫、眼内黒色腫、膵島細胞がん、カポシ肉腫、腎臓がん（腎細胞がん）、喉頭がん、唇および口腔がん、脂肪肉腫、原発性肝がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、ウォルデンストロムマクログロブリン血症、メルケル細胞がん、中皮腫、口がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、真菌性真菌症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、慢性骨髄増殖性障害、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非小細胞肺がん、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん（表面上皮間質腫瘍）、卵巣胚芽細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓がん（例えば、膵島細胞膵臓がん）、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、フェオクロモサイトーマ、松果体星状細胞腫、松果体胚芽腫、松果体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腺腫、形質細胞新生物、胸膜肺芽細胞腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎骨盤および尿管がん、移行細胞がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、軟組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、非黒色腫皮膚がん、黒色腫、小細胞肺がん、小腸がん、軟組織肉腫、扁平上皮がん、潜在性原発を伴う扁平上皮がん、胃がん、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫（皮膚）、精巣がん、喉がん、胸腺腫または胸腺がん、甲状腺がん、腎骨盤および尿管の移行細胞がん、絨毛性腫瘍、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、視覚経路および視床下部神経膠腫、小児期、外陰がん、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍から選択されるがんを有し得るか、または有していると疑われ得る。
いくつかの実施形態において、対象は、血友病Ａ、血友病Ｂ、サラセミア、または貧血などの血液障害を有する。
疾患または障害に苦しむ対象を治療するための薬学的キットも提供され、そのキットは、ＵＳＰ１６の発現を下方制御またはノックアウトするように改変された細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｔ細胞などの免疫細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、遺伝子改変された細胞である。いくつかの実施形態において、キットは、細胞を対象に投与するための書面による説明書をさらに含む。
細胞ベースの療法に使用される細胞を製造するためのキットも提供され、そのキットは、ＵＳＰ１６の阻害剤を含む。いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６の阻害剤は、核酸、タンパク質、小分子、または高分子である。いくつかの実施形態において、ＵＳＰ１６の阻害剤は、Ｃａｓヌクレアーゼ、ＴＡＬヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ、ＲＮＡｉ分子（例えば、低ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、非対称干渉ＲＮＡ）、アンチセンス分子、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ－ＲＮＡキメラ、モルフォリノオリゴ、ｌｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ埋め込みｓｈＲＮＡ、低分子内部セグメント化ＲＮＡ、抗体、またはエキソソームである。いくつかの実施形態において、キットは、細胞をＵＳＰ１６の阻害剤と接触させるための書面による説明書をさらに含む。
方法を実行するための製造品も提供される。いくつかの実施形態において、製造品は、複数の容器、例えば、密封可能な容器を含み、各々が、対象に投与するための単位用量の細胞、包装材料、および／またはラベルもしくは添付文書を個別に含む。
上記は、本開示の例示であり、これを限定するものとして解釈されるべきではない。本開示は、以下の特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲の同等物がこれに含まれる。
以下の実施例は、例示の目的で含まれ、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１：ＣＤＫＮ２Ａレベルは、Ｔ細胞分化中に増加する。
インシリコ分析を以前に公開されたマイクロアレイデータを使用して実施した（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ Ｌ．，ｅｔ ａｌ，“Ａ ｈｕｍａｎ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔ ｗｉｔｈ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１１）を参照されたく、また“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｎａｉｖｅ（ＴＮ），ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｅｍｏｒｙ（ＴＳＣＭ），ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ（ＴＣＭ）ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ（ＴＥＭ）ＣＤ８＋Ｔｃｅｌｌｓ，”Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）：ＧＳＥ２３３２１（２０１１）も参照されたい）。この研究では、３人の健康な献血者がインフォームドコンセントの後にリンパ球に富むアフェレーシス血液を提供した。
分化の様々な段階でのＴ細胞におけるＣＤＫＮ２Ａ（プローブ：８１６０４４１）の発現レベル（図１）を、ＧＰＬ６２４４プラットフォームを使用して分析した。分析を、ＧＥＯ２Ｒを使用して実施した。
インシリコ分析の結果を図２に示す。ＣＤＫＮ２Ａの相対的な発現は、セントラルメモリー（ＴＣＭ）およびエフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）と比較して、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）およびメモリー幹細胞（ＴＳＣＭ）で低かった。このデータは、ＣＤＫＮ２ＡレベルがＴ細胞分化中に増加することを実証する。
実施例２：インビトロでのＴ細胞の活性化は、細胞の老化を誘発し、幹細胞マーカーを低下させる。
インシリコ分析を、オンラインツールＧＥＯ２Ｒ（ＮＣＢＩ）を使用して、以前に公開された、公的に入手可能なマイクロアレイデータを分析することによって実施した（Ｃｉｅｒｉ，ｅｔ ａｌ，“ＩＬ－７ ａｎｄ ＩＬ－１５ ｉｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｎａｉｖｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，”Ｂｌｏｏｄ（２０１３）を参照されたく、またＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）：ＧＳＥ４１９０９（２０１２）も参照されたい）。この研究では、ＲＮＡは、ナイーブおよびセントラルメモリー（ＣＭ）表現型に対して選別された操作されていない精製Ｔ細胞から（前）か、またはインビトロで活性化および形質導入されたＴ細胞サブセット（後）から収集した。インビトロで生成されたサブセットは、活性化の後、ＩＬ－７／ＩＬ－１５の存在下で１５日間培養物に保持した。
インシリコ分析の結果を図３Ａ～３Ｅに示す。Ｔ細胞のインビトロでの活性化は、幹細胞マーカーＢＭＩ１（図３Ａ）を抑制しながら、細胞老化マーカーＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６）（図３Ｃ）およびＣＤＫＮ２Ｄ（ｐ１９）（図３Ｂ）の発現を誘発した。興味深いことに、この事象は、特定のＴ細胞サブタイプに特異的なものではなく、ナイーブおよびセントラルメモリーＴ細胞で維持された。特に、これらの細胞老化マーカーの発現は、疲弊マーカーＣＴＬＡ－４（図３Ｄ）およびＰＤ－１（図３Ｅ）が発現され始めるかなり前に観察された。
したがって、これらのデータは、幹細胞性の低下および細胞老化の誘発が、遺伝子組み換えＴ細胞の製造に関与するプロセスにおいて非常に初期の事象であることを示す。
実施例３：インビトロでのＴ細胞培養条件。
以下に、インビトロでＴ細胞を培養および活性化するために使用される条件を提供する。この方法に従って調製されたＴ細胞を以下の様々な実施例で使用した。
０日目に、バフィーコートを臨床施設で入手し、ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）を使用した密度遠心分離によって単離した。ＣＤ３濃縮を磁気ビーズ、Ｍｙｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃからのＰａｎＴ細胞分離を使用して実施した。Ｔ細胞をａＣＤ３／ａＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（３：１の比率）で活性化させた。
２日目に、レンチウイルスを用いて初回の形質導入を実施した。３日目に、レンチウイルスを用いて２回目の形質導入を実施した。
６日目に、ビーズを取り除いた。６～８日目に、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（ＢＤ）を使用してフローサイトメトリー選別を実施した。
細胞を、ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン、および１００ＩＵのＩＬ－２で培養した。細胞を、１５日目まで０．３×１０６個の細胞／ｍｌの密度で、次に０．５×１０６個の細胞／ｍｌで、２５日目後に１×１０６個の細胞／ｍｌでプレーティングした。
実施例４：初代Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６発現の下方制御は、増殖を増加させ、細胞の呼気を低下させる。
ＳＰ１６（ｓｈＵＳＰ１６）に対して向けられた短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をＤｈａｒｍａｃｏｎから購入した。初代Ｔ細胞を実施例３に記載されているように活性化させ、ｓｈＵＳＰ１６または非ターゲティングｓｈＲＮＡ（対照）のいずれかをコードするレンチウイルスで形質導入し、８日目にＧＦＰを選別した。同数の細胞を両方の群で選別した。０．１５～０．５×１０６個の細胞を、９０％を超える純度で選別後にプレーティングし、Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＸＲセルカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してトリパンブルー排除によって２～４日ごとに数えた。増殖を最初の細胞播種と比較した増殖率として測定した。総Ｔ細胞数が５０，０００個の細胞を下回るとき、細胞を期限切れとみなした。
実験は、８人の異なる健康なドナーのバフィーコートから得られた初代Ｔ細胞を使用して繰り返した。図４Ａ～４Ｃに示されるグラフは、平均値およびＳＥＭ値を示し、ｔ検定を使用して、２つの群を比較した。
Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６の下方制御は、２０日目（４．４２対８．１７、ｐ＝０．０２８６、ｎ＝８）および３０日目（２．３８５対４．０１４、ｐ＝０．０３７、ｎ＝８）のＴ細胞活性化時に増殖の増加をもたらした（図４Ａ）。Ｓｙｔｏｘ染色を使用するフローサイトメトリー分析では、３０日目にＵＳＰ１６を下方制御するＴ細胞の数が多いだけではなく、生存率も高いことが示された（１３．９６対２５．９３、ｐ＝０．０２０、ｎ＝７）（図４Ｂ）。
Ｔ細胞呼気アッセイ（図４Ｃ）は、インビトロでのＴ細胞持続性の増加におけるＵＳＰ１６発現の下方制御の強い効果を示した（生存期間中央値４１対６０．５日、ｐ＝０．０００５、ｎ＝６）。
実施例５：初代Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６発現の下方制御は、ＣＤ４／ＣＤ８比を損なわない。
２０日目にフローサイトメトリー分析を行い、ＣＤ４とＣＤ８の比率を計算した。図５に示されるように、ＵＳＰ１６発現の特異的な下方制御は、ＣＤ４／ＣＤ８比に影響を及ぼさなかった（ｎ＝６；ＣＤ４およびＣＤ８の割合は、Ｓｙｔｏｘ陰性ＧＦＰ＋Ｔ細胞で計算した）。
実施例６：ナビトクラックス誘発性細胞死は、インビトロでの培養中にＴ細胞において増加する。
活性化された初代Ｔ細胞を指定量のナビトクラックスで処理した。ナビトクラックスは、細胞老化細胞を選択的に標的とする老化細胞除去薬である（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ，２０１６）。７２時間後、Ｓｙｔｏｘ陰性Ｔ細胞をＭＡＣＳＱｕａｎｔ（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用したフローサイトメトリーで数えた。
「幼若」Ｔ細胞（１２日目）は、「経時」Ｔ細胞（２４日目）よりもナビトクラックス誘発性細胞死に対する感受性が低い。各実験では、２つの異なる初代Ｔ細胞培養を各条件で試験した（各条件に対して４つの複製）。異なるナビトクラックス濃度を試験する３つの実験を図６Ａ～６Ｃに示す。ＤＭＳＯは、陰性対照である。ナビトクラックス（ｃａｔ＃ＨＹ－１００８７）は、ＭＣＥから購入した。
実施例７：ＵＳＰ１６を下方制御するＴ細胞は、ナビトクラックス処理の影響を受けにくい。
初代Ｔ細胞を記載されているように活性化させ（実施例３）、ｓｈＵＳＰ１６または非ターゲティングｓｈＲＮＡ（ｓｈＣ）のいずれかをコードするレンチウイルスで形質導入した。次に、Ｔ細胞を指定量のナビトクラックスで処理した。７２時間後、Ｓｙｔｏｘ陰性ＧＦＰ＋細胞を数え、死細胞の数を１００％－（処理済みの細胞数／未処理の細胞数）として計算した。２つの異なる時点（１２日目、２２日目）を２つの異なる初代Ｔ細胞培養物で試験した（各条件に対して４つの複製）。図７Ａ～７Ｃに示されるように、ｓｈＵＳＰ１６のＴ細胞は、それらの対応する対照よりもナビトクラックス誘発性細胞死に対して感受性が低い。
実施例８：Ｔ細胞の自己複製は、インビトロ培養中に低下する。
特定の集団における幹細胞の周波数を決定するために、インビトロでの限界希釈アッセイを使用した。Ｔ細胞の自己複製能力の差異を検出するには、１ウェル当たり１０００～４個の細胞の範囲の細胞濃度（１：４希釈）で十分であると判断した。ここでは、インビトロでのＴ細胞の老化が自己複製の低下を引き起こすことが実証される。
幼若Ｔ細胞（８日目）を経時Ｔ細胞（３５日目）と比較した。細胞を特定された濃度で播種し、２週間後にコロニー形成を評価した。新鮮なＩＬ－２を３～４日ごとに添加した。健康なドナーから得られた２つの初代Ｔ細胞を、すべての時点で試験した（１つの細胞濃度ごとに８つの複製）。データは、極限希釈分析（ＥＬＤＡ）ソフトウェア（ｂｉｏｉｎｆ．ｗｅｈｉ．ｅｄｕ．ａｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｅｌｄａ／）を使用して分析した。図８に示されるように、経時Ｔ細胞は、幼若細胞（１／１４．１、ｐ＝２．３７ｅ－１３）と比較して幹細胞の周波数が低下している（１／１３７．９）。
実証例９：ＵＳＰ１６発現の下方制御は、インビトロでのＴ細胞の自己複製を増強させる。
初代Ｔ細胞を、記載されているように活性化させ（実証例３）、ｓｈＵＳＰ１６または非ターゲティングｓｈＲＮＡ（対照）のいずれかをコードするレンチウイルスで形質導入し、８日目にＧＦＰを選別した。１ウェル当たり１０００～４個の細胞の細胞濃度の範囲（１：３希釈）での限界希釈アッセイを２０日目（図９）および３０日目（図１０）に実施し、コロニーをプレーティングの２週間後に数えた。それぞれ、４つおよび５つの初代Ｔ細胞培養物を試験した（１つの細胞濃度ごとに８つの複製）。新鮮なＩＬ－２を３～４日ごとに添加した。ＥＬＤＡソフトウェアを使用してデータを分析した。
ＵＳＰ１６発現の下方制御は、幹細胞の周波数を大幅に増加させる（ｓｈ対照対ｓｈＵＳＰ ２０日目：１／５６，９対１／２１，８、ｐ＝１．３７ｅ－６および３０日目：１／１２９．５対７８．８、ｐ＝０．００６７６）。
実証例１０：ＵＳＰ１６発現の下方制御は、幹細胞メモリーＴ細胞を増加させる。
初代Ｔ細胞を、記載されているように活性化させ（実証例３）、ｓｈＵＳＰ１６または非ターゲティングｓｈＲＮＡ（対照）のいずれかをコードするレンチウイルスで形質導入し、８日目にＧＦＰを選別した。細胞をＩＬ－２の存在下で培養し、それらの表現型を２０日目に分析した。細胞をＣＤ４－ＰｅｒＣＰ－５．５もしくはＣＤ８－ＢＶ５１０、ＣＤ６２Ｌ－アロフィコシアニン、ＣＤ４５ＲＡ－ＢＶ５１０、またはＰＥ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。ナイーブまたは幹細胞メモリーＴ細胞（ＴＮａ／ＳＣＭ）をＳｙｔｏｘ－ＧＦＰ＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋として同定した。ＴＮａ／ＳＣＭの数を、（ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞の数＊ＴＮａ／ＳＣＭ割合）／１００として計算した。フローサイトメトリーをＭＡＣＱｕａｎｔ（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で行い、データをＦｌｏｗＪｏで分析した（ｓｈ対照対ｓｈＵＳＰ ＣＤ４：０．４９７８対０．７９１５、ｐ＝０．０６７３およびＣＤ８：２．４６９対４．９８４、ｐ＝０．００３９２、ｎ＝７）。ＵＳＰ１６発現の下方制御は、培養中のＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋（図１１Ａ）およびＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋（図１１Ｂ）細胞の数をそれぞれ１．７（ｐ＝０．０２０５）および１．９（ｐ＝０．００９７）倍増加させる。
実施例１１：下方制御されたＵＳＰ１６発現を有するＴ細胞は、インビトロで腫瘍細胞を死滅させる能力を維持する。
細胞毒性アッセイを実施した。簡単に説明すると、２０日齢のＴ細胞を腫瘍細胞と一緒に異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でプレーティングし、７２時間後にフローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ、Ｍｙｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して細胞数によって死滅効率を測定した。死滅の割合は、（標的の数－残りの標的の数）＊１００／標的の数として測定した。ＮＡＬＭ細胞を標的細胞として使用し、フローサイトメトリーによる同定のためにｍＲｕｂｙに感染させた。５つの異なる初代Ｔ細胞培養物を試験した（図１２Ａ）。細胞毒性は３１日目でも試験し、差異は観察されなかった（データは示さず）。
細胞播種の２４時間後にＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によりＩＬ－２を測定した。図１２Ｂに示されるように、ＵＳＰ１６発現の下方制御は、抗原曝露時にＩＬ－２産生の影響を有しなかった。
実施例１２：ＢＭＩ－１／ＵＳＰ１６／ＣＤＫＮ２Ａ経路は、ヒトのＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性に関与する。
以前に公開されたマイクロアレイデータを使用してインシリコ分析を行った（Ｌｏｎｇ，Ａ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ，“４－１ＢＢ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｏｎｉｃ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１５）を参照されたく、また“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ，”Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）：ＧＳＥ６５８５６（２０１５）も参照されたい）。健康なドナーから単離されたヒトＴ細胞は、各々ＣＤ２８ｚまたは４－１ＢＢ共刺激ドメインを有する非緊張性シグナル伝達ＣＡＲ（ＣＤ１９）または緊張性シグナル伝達ＣＡＲで形質導入した。ＣＤＫＮ２ＡおよびＢＭＩ－１の発現レベルを、ＧＰＬ５７０プラットフォームを使用して分析した。ＣＤＫＮ２Ａの場合、２つのプローブを分析し、ＣＤ２８共刺激で発現レベルを正規化した。分析を、ＧＥＯ２Ｒを使用して実施した。
４－１ＢＢ刺激は、ＣＤ２８と比較してＣＤ１９．ＣＡＲ臨床試験でより高い持続性を実証することが示されている。この分析において、より持続性のある細胞は、低下したレベルのＣＤＫＮ２Ａ（図１３Ａ）およびより高いレベルのＢＭＩ－１（図１３Ｂ）を発現し、ＣＡＲ－Ｔ設定においてもＴ細胞におけるこの経路の重要性を実証する。
実施例１３：ＵＳＰ１６を標的とする代替的なセットのｓｈＲＮＡは、細胞増殖を増加させながら、ＵＳＰ１６を効果的に下方制御し、細胞老化マーカーを阻害する
新しいセットのｓｈＲＮＡをｐＳＩＨバックボーンにクローン化し、ｓｈＲＮＡの発現をＨ１プロモーターによって駆動させる。ベクターも、Ｔ２Ａ配列を介してＧＦＰおよびピューロマイシン耐性を共発現するように設計した。新しいｓｈＲＮＡ配列は、ｓｈＵＳＰ１６＃１ ５’－ＧＡＣＴＧＴＡＡＧＡＣＴＧＡＣＡＡＴＡＡＡ－３’（配列番号８）およびｓｈＵＳＰ１６＃２ ５’－ＴＡＴＡＴＣＡＧＴＴＣＡＣＣＣＧＴＡＡＴ－３’（配列番号９）であった。初代Ｔ細胞を、記載されているように活性化させ（実施例３）、ｓｈＵＳＰ１６＃１、ｓｈＵＳＰ１６＃２、またはスクランブルｓｈＲＮＡ（対照）のいずれかをコードするレンチウイルスで形質導入し、細胞を６日目にピューロマイシンで選択した。１～１．２５×１０６個の細胞をピューロマイシン選択後に９０％を超える純度でプレーティングし、Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＸＲセルカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してトリパンブルー排除により２～４日ごとに数えた。ｑＰＣＲを実施して、ＵＳＰ１６発現の下方制御（図１４Ａ）および細胞老化マーカーＣＤＫＮ１Ａ（図１４Ｂ）の発現を１５日目に検証した。増殖を活性化後１５日目にｓｈ対照と比較した倍増として測定した。実験は、３人の異なる健康なドナーのバフィーコートから得られた初代Ｔ細胞を使用して繰り返した。
Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６の下方制御（対照対ｓｈＵＳＰ＃１：５６％、ｐ＜０．０００１および対照対ｓｈＵＳＰ１６＃２：５３％、ｐ＜０．０００１）は、細胞老化マーカーＣＤＫＮ１Ａ（対照対ｓｈＵＳＰ＃１：２３％、ｐ＝０．０００９および対照対ｓｈＵＳＰ１６＃２：３７％、ｐ＝０．００１４）を著しく現象させ、増殖を約１．３１倍および２．３３倍（それぞれｓｈＵＳＰ＃１およびｓｈＵＳＰ＃２）増加させる。図１５は、ＵＳＰ１６発現の下方制御が細胞増殖の増加をもたらすことを示す。
実施例１４：ＵＳＰ１６発現の下方制御は、ＷＮＴ経路を介したシグナル伝達を増加させ、幹細胞メモリーＴ細胞数およびインビトロでの活性を増加させる
初代Ｔ細胞を、記載されているように活性化させ（実施例３）、ｓｈＵＳＰ１６＃１、ｓｈＵＳＰ１６＃２、または非ターゲティングｓｈＲＮＡ（ｓｈ対照）のいずれかをコードするレンチウイルスで形質導入し、細胞を６日目にピューロマイシンで選択した。１５日目に、細胞を収集し、ＷＮＴ経路の下流調節因子であるＬＥＦ１（図１６Ａ）およびＴＣＦ７（図１６Ｂ）の発現についてｑＰＣＲによって分析した。２０日目に、細胞をＣＤ４－ＰＥ、ＣＤ８－ＢＶ５１０、ＣＤ６２Ｌ－アロフィコシアニン、およびＣＤ４５ＲＡ－ＡＰＣ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対して染色した。幹細胞メモリーＴ細胞（Ｔｓｃｍ）をＳｙｔｏｘ－ＧＦＰ＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）をＳｙｔｏｘ－ＧＦＰ＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ＋、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）をＳｙｔｏｘ－ＧＦＰ＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ－、およびエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）をＳｙｔｏｘ－ＧＦＰ＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ－（図１７Ａ）として同定した。細胞をＣＤ８集団でゲートした。Ｔｓｃｍの特異的増加を表現型比として示した（図１７Ｂ）。
１ウェル当たり１０００～４個の細胞の細胞濃度の範囲（１：３希釈）での限界希釈アッセイを２０日目に実施し（図１８）、コロニーをプレーティングの２週間後に数えた。４つの初代Ｔ細胞培養物を試験した（１つの細胞濃度ごとに８つの複製）。新鮮なＩＬ－２を３～４日ごとに添加した。ＥＬＤＡソフトウェアを使用してデータを分析した。
ＵＳＰ１６発現の下方制御は、ＬＥＦ１（対照に対する倍増、ｓｈＵＳＰ１６＃１：１．６５０、ｐ＝０．００５６、ｓｈＵＳＰ１６＃２は、同様の傾向を示す）およびＴＣＦ７（対照に対する倍増、ｓｈＵＳＰ１６＃１：２．８０４、ｐ＝０．０８６、ｓｈＵＳＰ１６＃２：１．４２８、ｐ＝０．０４６７）の発現を大幅に増加させ、ＷＮＴ経路のより高い活性化を実証する。ＵＳＰ１６発現の下方制御はまた、幹細胞周波数（対照に対する倍増、ｓｈＵＳＰ１６＃１：２．０２２、ｐ＝０．００８２、ｓｈＵＳＰ１６＃２：２．６３、ｐ＝０．０００１）、ならびに最も重要なことに、幹細胞活性および自己複製能力（ｓｈ対照対ｓｈＵＳＰ＃１対ｓｈＵＳＰ１６＃２：１／５１，９対１／２５，１対１／２２．９、ｐ＝０．０００４９４およびｐ＝８．６２ｅ－０５）を大幅に増加させる。データは、平均±ＳＥＭとして示される。
実施例１５：ＵＳＰ１６発現の下方制御は、疲弊マーカーＣＤ６９の発現を減少させる
初代Ｔ細胞を、記載されているように活性化させ（実施例３）、ｓｈＵＳＰ１６＃１、ｓｈＵＳＰ１６＃２、または非ターゲティングｓｈＲＮＡ（ｓｈ対照）のいずれかをコードするレンチウイルスで形質導入し、細胞を６日目にピューロマイシンで選択した。２０日目に、Ｔ細胞をＣＤ６９－アロフィコシアニン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対して染色し、Ｔ細胞をＭＡＣＳＱｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で分析した（図１９）。３つの初代Ｔ細胞培養物を分析した。
ＵＳＰ１６の下方制御により、疲弊マーカーＣＤ６９の発現が低下した（ｓｈ対照対ｓｈＵＳＰ＃１：４１％、ｐ＝０．０４４３およびｓｈ対照対ｓｈＵＳＰ１６＃２：４０％、ｐ＝０．０５６９）。
実施例１６：ＵＳＰ１６発現を下方制御するＴ細胞は、インビトロで腫瘍細胞を死滅させる能力を維持する。
細胞毒性アッセイを実施した。簡単に説明すると、２０日齢のＴ細胞を腫瘍細胞と一緒に異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でプレーティングし、７２時間後にフローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して細胞数によって死滅効率を測定した。死滅の割合は、（標的の数－残りの標的の数）＊１００／標的の数として測定した。ＮＡＬＭ細胞を標的細胞として使用し、フローサイトメトリーによる同定のためにｍＲｕｂｙに感染させた。４つの異なる初代Ｔ細胞共培養物を試験した（図２０）。ＵＳＰ１６発現の下方制御は、Ｔ細胞が標的細胞を死滅させる能力を低下させない。
実施例１７：ＣＲＩＳＰＲを介したＵＳＰ１６発現のノックアウトは、幹細胞メモリーＴ細胞を増加させる
初代Ｔ細胞を、記載されているように活性化させた（実施例３）。活性化後６日目に、ダイナビーズを除去し、２．５：１の比率のｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９でネオントランスフェクションシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、Ｔ細胞をエレクトロポレーションした。実験は、Ｓｙｎｔｈｅｇｏによって初代Ｔ細胞用に最適化されたプロトコル（Ｎｅｏｎエレクトロポレーションプロトコル、２０１８バージョンを使用したＲＮＰを有するＣＲＩＳＰＲ編集ヒト初代ＣＤ４＋Ｔ細胞）に従って実施した。使用したｓｇＲＮＡは、次のとおりである：ｇＵＳＰ１６＃１ ５’－ＵＧＧＣＧＵＣＡＧＡＵＡＧＵＧＣＵＵＣＡ－３’（配列番号１０）および３つの異なるｓｇＲＮＡを含むｇＳｙｎｔｈｅｇｏ（ｇＲＮＡ－Ａ：５’－ＧＵＧＵＧＣＡＧＡＣＡＣＡＵＵＡＧＡＡＡ－３’（配列番号１１）、ｇＲＮＡ－Ｂ：５’－ＵＡＵＵＧＵＣＡＧＵＣＵＵＡＣＡＧＵＣＵ－３’（配列番号１２）、ｇＲＮＡ－Ｃ：５’－ＧＵＵＵＧＧＣＵＧＵＧＵＣＵＵＡＡＡＵＧ－３’（配列番号１３））。モックとして識別された対照Ｔ細胞をエレクトロポレーションしたが、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ混合物は、添加しなかった。次に、細胞を９日目（図２１Ａ）および１４日目（図２１Ｂ）にｑＰＣＲによってＵＳＰ１６発現について評価し、集団の一部で効率的なノックアウトが観察された。活性化後１５日目に、細胞をＣＤ４－ＰＥ、ＣＤ８－ＢＶ５１０、ＣＤ６２Ｌ－アロフィコシアニン、およびＣＤ４５ＲＡ－ＡＰＣ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対して染色した。幹細胞メモリーＴ細胞（Ｔｓｃｍ）をＳｙｔｏｘ－ＧＦＰ＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋として同定し、モック細胞と比較した比率としてグラフ化した（図２２）。実験は、２人の異なる健康なドナーのバフィーコートから得られた初代Ｔ細胞を使用して繰り返した。
ＣＲＩＳＰＲテクノロジーを使用するＵＳＰ１６発現の下方制御は、幹細胞メモリーＴ細胞を１．１７８および１．４９（それぞれ、ｇＵＳＰ１６＃およびｇＳｙｎｔｈｅｇｏ）増加させる。
実施例１８：ＣＲＩＳＰＲを介したＵＳＰ１６発現の下方制御は、Ｔ細胞を介した死滅を損なわない
細胞毒性アッセイを実施した。簡単に説明すると、２０日齢のＴ細胞を腫瘍細胞一緒に１：１および１：２のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でプレーティングし、７２時間後にフローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ、Ｍｙｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して細胞数によって死滅効率を測定した。残存生細胞の割合は、（残存標的の数）＊１００／標的の数として測定した。ＮＡＬＭ細胞を標的細胞として使用し、フローサイトメトリーによる同定のためにｍＲｕｂｙに感染させた。２つの異なる初代Ｔ細胞培養物を試験した（図２３）。ＣＲＩＳＰＲを介したＵＳＰ１６発現の下方制御は、インビトロで腫瘍細胞を死滅させるＴ細胞の能力を変化させない。
実施例１９：ＵＳＰ１６を調節するように設計された新しいＣＡＲ構築物
ＣＤ１９（Ｌｅｎｔｉ－ＥＦ１ａ－ＣＤ１９（ＦＭＣ６３）－２ｎｄ－ＣＡＲ（ＣＤ２８）－ＥＧＦＲｔ）またはＧＤ２（Ｌｅｎｔｉ－ＥＦ１ａ－ＧＤ２（１４Ｇ２ａ）－２ｎｄ－ＣＡＲ（ＣＤ２８）－ＥＧＦＲｔ）に特異的な第２世代ＣＡＲをコードするプラスミドは、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。ＣＡＲを含有するプラスミドを、ＵＳＰ１６を標的とするｓｈＲＮＡを共発現するように設計した。ｓｈＲＮＡ配列は、ｓｈＵＳＰ１６＃１ ５’－ＧＡＣＴＧＴＡＡＧＡＣＴＧＡＣＡＡＴＡＡＡ－３’（配列番号８）およびｓｈＵＳＰ１６＃２ ５’－ＴＡＴＡＴＣＡＧＴＴＣＡＣＣＣＧＴＡＡＴ－３’（配列番号９）である。初代Ｔ細胞を記載されているように活性化させ（実施例３）、ｓｈＵＳＰ１６＃１、ｓｈＵＳＰ１６＃２、またはスクランブルｓｈＲＮＡ（対照）を共発現するＣＤ１９．ＣＡＲまたはＧＤ２．ＣＡＲのいずれかをコードするレンチウイルスで形質導入した。細胞をＩＬ－２で培養し、ＥＧＦＲｔについて６～１３日目に選別した。簡単に説明すると、細胞をビオチンＥＧＦＲ抗体（Ｒ＆Ｄ）で染色し、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して抗ビオチンまたはストレプトアビジン結合ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で磁気的に選別した。陽性集団を単離し、通常のＴＣ処理プレートまたはＧ－Ｒｅｘ ６ウェル培養プレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）で拡大した。Ｇ－Ｒｅｘプラットフォームを使用して、インビトロおよびインビボでの適用ためのＴ細胞の急速な拡大を達成した。
実施例２０：ＵＳＰ１６を標的とするｓｈＲＮＡを共発現するＣＡＲ－Ｔ細胞には増殖の利点がある
初代Ｔ細胞を記載されているように活性化させ（実施例３）、ｓｈＵＳＰ１６＃１、ｓｈＵＳＰ１６＃２、またはスクランブルｓｈＲＮＡ（対照）を共発現するＣＤ１９．ＣＡＲまたはＧＤ２．ＣＡＲのいずれかをコードするレンチウイルスで形質導入した。細胞をＩＬ－２で培養し、ＥＧＦＲｔについて６～１３日目に選別した。細胞を、８５％を超える純度で選別後にプレーティングし、Ｖｉ－ＣＥＬＬＸＲセルカウンターを使用してトリパンブルー排除によって２～４日ごとに数えた。活性化の１５日後、ＣＤ１９．ＣＡＲとＧＤ２．ＣＡＲの両方のＴ細胞を収集し、ｑＰＣＲを実施して、ＵＳＰ１６発現の下方制御を検証した（図２４）（倍数変化ＧＤ２．ＣＡＲ（ｎ＝３）：対照対ｓｈＵＳＰ＃１：０．３５、ｐ＜０．０００１、および対照対ｓｈＵＳＰ１６＃２：０．２４５２、ｐ＜０．０００１、倍率変化ＣＤ１９．ＣＡＲ（ｎ＝４）：対照対ｓｈＵＳＰ＃１：０．２８９１、ｐ＜０．０００１、および対照対ｓｈＵＳＰ１６＃２：０．２５６６、ｐ＜０．０００１）。増殖を１５日目の対照細胞と比較した倍増として測定した（図２５）。
ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６発現の下方制御は、Ｔ細胞の増殖を増強させる（倍数変化ＧＤ２．ＣＡＲ（ｎ＝３）：対照対ｓｈＵＳＰ＃１：２．１４７、ｐ＝０．０２６７、および対照対ｓｈＵＳＰ１６＃２：３．０３６、ｐ＝０．００４、倍数変化ＣＤ１９．ＣＡＲ（ｎ＝４）：対照対ｓｈＵＳＰ＃１：２．２５９、ｐ＝０．０２６７、および対照対ｓｈＵＳＰ１６＃２：３．０３６、ｐ＝０．００４）。
実施例２１：ＵＳＰ１６発現の下方制御を伴うＣＡＲ－Ｔ細胞は、細胞老化の開始の遅延、およびＷＮＴ経路を介したシグナル伝達の増加を示す
初代Ｔ細胞を記載されているように活性化させ（実施例３）、ｓｈＵＳＰ１６＃１、ｓｈＵＳＰ１６＃２、またはスクランブルｓｈＲＮＡ（対照）を共発現するＣＤ１９．ＣＡＲまたはＧＤ２．ＣＡＲのいずれかをコードするレンチウイルスで形質導入した。活性化の１５日後、Ｔ細胞を収集し、ｑＰＣＲを実施した。ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａを検出するＴａｑＭａｎプローブ（図２６Ａおよび２６Ｂ）（倍率変化ＧＤ２．ＣＡＲ（ｎ＝４）、それぞれ、ＣＤＫＮ１Ａ対照対ｓｈＵＳＰ＃１：０．４３６０、ｐ＜０．０００１、および対照対ｓｈＵＳＰ１６＃２：３．０３６、ｐ＝０．００４。）倍数変化ＣＤ１９．ＣＡＲ（ｎ＝４）、ＣＤＫＮ２ａ、ＣＤＫＮ１Ａ対照対ｓｈＵＳＰ＃１：０．６９０６、ｐ＝０．００２６；０．７２２８、ｐ＝０．０２９７、および対照対ｓｈＵＳＰ１６＃２：０．８３８５、ｐ＝０．２３２５；０．７０１７、ｐ＝０．００２１）、ＴＣＦ７、ＬＥＦ１、およびＡｘｉｎ－２（図２７ＡおよびＢ）を、それぞれＧＤ２．ＣＡＲおよびＣＤ１９．ＣＡＲ発現細胞で分析した。内部対照としてＡＣＴＢを使用した。（ＧＤ２．ＣＡＲ（ｎ＝４）ＴＣＦ７、ＬＥＦ１、およびＡｘｉｎ－２：それぞれ、対照対ｓｈＵＳＰ＃１：１．９１４ ｐ＝０．０５１２；１．７９５ ｐ＝０．０３２３；３．２６９ ｐ＝０．１５、および対照対ｓｈＵＳＰ１６＃２：１．２８４ ｐ＝０．０４９４；１．７１８ ｐ＝０．０５８６；２．０３５ｐ＝０．２３５。倍数変化ＣＤ１９．ＣＡＲ（ｎ＝４）：ＴＣＦ７、ＬＥＦ１、およびＡｘｉｎ－２：対照対ｓｈＵＳＰ＃１：１．５２８、ｐ＝０．０２７７；１．８２、ｐ＝０．０４４９；１．９９８、ｐ＝０．０３１、および対照対ｓｈＵＳＰ１６＃２：１．１８、ｐ＝０．２００２；１．５７９、ｐ＝０．０６３２；１．２６１、ｐ＝０．２３８２）。ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６の下方制御は、細胞老化マーカーの発現の減少およびＷＮＴ経路の活性化／シグナル伝達の増加に関連する遺伝子の発現の増加をもたらし、細胞の細胞老化の遅延および自己複製の増加におけるその重要性を示す。
実施例２２：ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６発現の下方制御は、幹細胞メモリーＴ細胞の数および機能性を増加させる
初代Ｔ細胞を、記載されるように活性化させ（実施例３）、ｓｈＵＳＰ１６＃１、ｓｈＵＳＰ１６＃２、またはスクランブルｓｈＲＮＡ（対照）を共発現するＣＤ１９．ＣＡＲまたはＧＤ２．ＣＡＲのいずれかをコードするレンチウイルスで形質導入した。１５日目に、ＧＤ２．ＣＡＲおよびＣＤ１９．ＣＡＲ Ｔ細胞をＥＧＦＲ－ＡＦ４８８（Ｒ＆Ｄ）、ＣＤ３－ＰＥ、ＣＤ８－ＢＶ５１０、ＣＤ６２Ｌ－アロフィコシアニン、およびＣＤ４５ＲＡ－ＡＰＣ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対して染色した。幹細胞メモリーＴ細胞（Ｔｓｃｍ）は、ＦＩＴＣ＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）は、ＦＩＴＣ＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ＋、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）は、ＦＩＴＣ＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ－、およびターミナルエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）は、ＦＩＴＣ＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ－として同定した。細胞をＣＤ８集団でゲートした。Ｔｓｃｍの特異的増加を表現型比として示した（図２８Ａおよび２８Ｂ）。
１ウェル当たり１０００～４細胞の細胞濃度の範囲（１：３希釈）での限界希釈アッセイを２０日目に実施し（図２９）、コロニーをプレーティングの２週間後に数えた。３つのＣＤ１９．ＣＡＲおよび２つのＧＤ２．ＣＡＲ初代Ｔ細胞培養物を試験し（１細胞濃度ごとに８つの複製）、一緒に分析した。新鮮なＩＬ－２を３～４日ごとに添加した。ＥＬＤＡソフトウェアを使用してデータを分析した。
ＵＳＰ１６発現の下方制御は、幹細胞周波数（倍率変化ＣＤ１９．ＣＡＲ（ｎ＝５）：対照対ｓｈＵＳＰ＃１：１．９９４、ｐ＝０．０３２、および対照対ｓｈＵＳＰ１６＃２：２．２７３、ｐ＝０．０２１４、倍率変化ＧＤ２．ＣＡＲ（ｎ＝４）：対照対ｓｈＵＳＰ＃１：１．３４７、ｐ＝０．０４５、および対照対ｓｈＵＳＰ１６＃２：１．３８３、ｐ＝０．００３７）、ならびに最も重要なことに、幹細胞活性および自己複製能力（ＣＡＲ．対照対ＣＡＲ．ｓｈＵＳＰ＃１対ＣＡＲ．ｓｈＵＳＰ１６＃２：１／５３対１／３３対１／３０．７、ｐ＝０．００９３５およびｐ＝０．００３１）を大幅に増加させる。
実施例２３：ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６発現の下方制御は、インビトロ細胞での毒性アッセイにおいて死滅およびＴ細胞増殖を増加させる
初代Ｔ細胞を記載されているように活性化させ（実施例３）、ｓｈＵＳＰ１６＃１、ｓｈＵＳＰ１６＃２、またはスクランブルｓｈＲＮＡ（対照）を共発現するＣＤ１９．ＣＡＲまたはＧＤ２．ＣＡＲのいずれかをコードするレンチウイルスで形質導入した。細胞をＩＬ－２で培養し、ＥＧＦＲｔについて６～１３日目に選別した。１６日目に細胞毒性アッセイを実施した。簡単に説明すると、細胞を数え、１００，０００個のＴ細胞（ＥＧＦＲ発現用に調整）を１：５のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でプレーティングした。７２時間後、腫瘍細胞とＴ細胞との混合物を収集し、ＣＤ３－ＰＥ、ＣＤ８－ＢＶ５１０、ＣＤ１９－またはＧＤ２－ＡＰＣ、ＥＧＦＲ－ＡＦ４８８、およびＳｙｔｏｘに対して染色し、フローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって数えた（図３０Ａおよび３０Ｂ）。カウントビーズ（ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ絶対数カウントビーズ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を取得前に添加し、絶対数を次のように計算した（細胞事象の数／ビーズ事象の数）×（ロットの割り当てられたビーズ数（ビーズ／５０ｕｌ）／試料の量（ｕｌ））＝細胞／ｕｌとしての試料の濃度）。ＮＡＬＭ細胞をＣＤ１９．ＣＡＲＴ細胞の標的細胞として使用し、ＣＨＬＡ－５５細胞をＧＤ２．ＣＡＲＴ細胞の標的として使用した。ＣＤ１９およびＧＤ２ＣＡＲについて、３つの異なる初代Ｔ細胞培養物を試験した。
ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６発現の下方制御は、抗原刺激時のそれらの機能を改善する。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、対照と比較して、より多くのＣＨＬＡ－５５およびＮＡＬＭ－６細胞を死滅させることができた。ＵＳＰ１６調節はまた、抗原刺激時にＴ細胞拡大の大幅な増加をもたらす（ＧＤ２．ＣＡＲ（ｎ＝３）ＣＨＬＡ－５５残存細胞およびＴ細胞数：対照対ｓｈＵＳＰ＃１対ＵＳＰ＃２：２０５３１７対１５９５３１対１２９１８６、ｐ＜０．０９４１；ｐ＝０．０２６５、および５３４２７対７９５６６対１９４０２５、ｐ＝０．１４６２；ｐ＝０．０００３、ＣＤ１９．ＣＡＲ（ｎ＝３）：対照対ｓｈＵＳＰ＃１対ＵＳＰ＃２：９１８７８６対２９６８８対２８４６２、ｐ＜０．０００１、および１２２４２対４６６７４対５８７３２、ｐ＝０．０５；ｐ＝０．０４０４）。
実施例２４：ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６発現の下方制御は、細胞の健康を増進させ、細胞およびミトコンドリアのストレスを軽減する
初代Ｔ細胞を記載されるように活性化させ（実施例３）、ｓｈＵＳＰ１６＃１、ｓｈＵＳＰ１６＃２、またはスクランブルｓｈＲＮＡ（対照）を共発現するＣＤ１９．ＣＡＲをコードするレンチウイルスで形質導入した。細胞をＩＬ－２で培養し、ＥＧＦＲｔについて６～１３日目に選別した。１５日目に、細胞を染色し、アポトーシス、壊死、ミトコンドリア膜電位、およびグルタチオン含有量（ＧＳＨ）についてＭＡＣＳＱｕａｎｔによって分析した。データ生成は、９６ウェルプレート上の試薬の脱水パネルの形態でＭｏｊａｖｅ Ｂｉｏによって利用可能にされたＡｍｂｅｒｇｌａｓｓテクノロジーによって行った。
図３１Ａのプロットは、ＵＳＰ１６発現の下方制御がアポトーシス（左上：対照対ｓｈＵＳＰ１６＃１対ｓｈＵＳＰ１６＃２：１３．４対９．４０対８．２５）および壊死（右上：対照対ｓｈＵＳＰ１６＃１対ｓｈＵＳＰ１６＃２：１４．４対４．７５対３．９６）を減少させることを示す。
図３１Ｂのプロットは、細胞の活性酸素種およびストレスに対するＵＳＰ１６発現の下方制御の影響を示す。この図は、（ａ）細胞の健康の増進（ミトコンドリア膜電位が高く、ＧＳＨ含有量が高い、Ｑ２：対照対ｓｈＵＳＰ１６＃１対ｓｈＵＳＰ１６＃２：７９．９対８９．９対８５．７）、および（ｂ）ミトコンドリア膜電位が低い細胞の割合の低下（Ｑ１：対照対ｓｈＵＳＰ１６＃１対ｓｈＵＳＰ１６＃２：１７．２対７．６２対９．８７）を表示する。
実施例２５：ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６発現の下方制御は、疲弊を低下させ、複数のチャレンジ時にＴ細胞の死滅を増加させる
初代Ｔ細胞を記載されているように活性化させ（実施例３）、ｓｈＵＳＰ１６＃１、ｓｈＵＳＰ１６＃２、またはスクランブルｓｈＲＮＡ（対照）を共発現するＣＤ１９．ＣＡＲまたはＧＤ２．ＣＡＲのいずれかをコードするレンチウイルスで形質導入した。細胞をＩＬ－２で培養し、ＥＧＦＲｔについて６～１３日目に選別した。１６日目に、ＣＤ６９を含む疲弊マーカーに対してＴ細胞を染色した。ＣＤ６９は、ＵＳＰ１６のｓｈＲＮＡを発現するＣＡＲ．Ｔ細胞での発現の低下を示し（図３２）、ＵＰＳ１６調節が機能を高め、Ｔ細胞疲弊を部分的に低下させることをさらに裏付ける（ＧＤ２．ＣＡＲ（ｎ＝３）ＣＤ６９％：対照対ｓｈＵＳＰ＃１対ＵＳＰ＃２：３７．８対２３．０５対２７．８、ｐ＝０．００５１；ｐ＝０．０２１６、ＣＤ１９．ＣＡＲ（ｎ＝３）ＣＤ６９％：対照対ｓｈＵＳＰ＃１対ＵＳＰ＃２：３７．６０対１３．７０対２７．１７、ｐ＝０．００１５；ｐ＝０．０４６５）。
１６日目に、通常の細胞毒性アッセイも実施した（実施例２２）。抗原刺激の３日後、ＣＤ１９．ＣＡＲ Ｔ細胞をＥＧＦＲ－ＡＦ４８８（Ｒ＆Ｄ）、ＣＤ３－ＰＥ、ＣＤ８－ＢＶ５１０、ＰＤ－１－アロフィコシアニン、Ｌａｇ－３、およびＣＴＬＡ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対して染色し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって取得した。共培養物はまた、新鮮な腫瘍細胞の添加により再チャレンジした。二重腫瘍チャレンジ時のＴ細胞の死滅および拡大を３日後に評価した。
連続的な抗原刺激は、疲弊を引き起こし、腫瘍の死滅およびＴ細胞拡大を低下させる。ＣＡＲ．Ｔ細胞におけるＵＳＰ１６発現の下方制御は、疲弊を部分的に救うことができる（図３３）。データをＦｌｏｗＪｏによって分析した。ＣＡＲ．ＣＤ１９を発現する３つの異なる初代Ｔ細胞共培養物を分析し、データを下の表および図３４に示す。
Figure 2022546493000003
ＵＳＰ１６発現の下方制御は、複数の腫瘍チャレンジ時にＴ細胞死滅能力を大幅に増加させる（図３５Ａおよび３５Ｂ）。死滅機能の増加に加えて、ＵＳＰ１６発現の下方制御は、複数の腫瘍チャレンジ後のＴ細胞拡大を大幅に増大させ、幼若かつ健康なＴ細胞の維持におけるその重要な役割を強く実証する（ＧＤ２．ＣＡＲ（ｎ＝３）ＣＨＬＡ－５５残存細胞およびＴ細胞数：対照対ｓｈＵＳＰ＃１対ＵＳＰ＃２：４８６６９９対４３６５００対３３０６１０、ｐ＜０．２８３９；ｐ＝０．００２１および２２３２８１対４０４７０９対７２２６３４、ｐ＝０．０００４；ｐ＜０．０００１、ＣＤ１９．ＣＡＲ（ｎ＝３）：対照対ｓｈＵＳＰ＃１対ＵＳＰ＃２：１７４９３６３対２８２７６１対１６０８７４、ｐ＝０．０２４２および５５２６対１９２６４３対２０４２９１、ｐ＝０．０３８５；ｐ＝０．１７１）。
実施例２６：ＵＳＰ１６を標的とするｓｈＲＮＡの共発現は、インビボでＧＤ２．ＣＡＲ－Ｔ抗腫瘍活性を増強する。
初代Ｔ細胞を記載されるように活性化させ（実施例３）、ｓｈＵＳＰ１６＃１、ｓｈＵＳＰ１６＃２、またはスクランブルｓｈＲＮＡ（対照）を共発現するＣＤ１９．ＣＡＲまたはＧＤ２．ＣＡＲのいずれかをコードするレンチウイルスで形質導入した。細胞をＩＬ－２で培養し、ＥＧＦＲｔについて６～１３日目に選別した。１５日目に細胞を凍結し（診療所の設定を模倣するため）、免疫無防備状態のマウスに注射する１日前に解凍した。免疫無防備状態のマウス（ＮＣＧ（ＮＯＤ ＣＲＩＳＰＲ Ｐｒｋｄｃ Ｉｌ２ｒ Ｇａｍｍａ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから提供され、ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ＜ｓｃｉｄ＞ＩＬ２ｒｇ＜ｔｍ１Ｗｊｌ＞／ＳｚＪ）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した）。ＣＨＬＡ－５５神経芽細胞腫細胞株にガウシアルシフェラーゼを形質導入し、ｄ－７（７日前）に１００万個の細胞を尾静脈から注入した。
１００万個のＧＤ２．ＣＡＲＴ細胞を、０日目に尾静脈を介して与え、マウスの体重を測定し、毎週採血した（図３６）。腫瘍成長は、循環するルシフェラーゼを毎週評価することよって監視した。簡単に説明すると、血液を採取し、続いてＮａｎｏｌｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓルシフェラーゼ検出キットを使用してルシフェラーゼ発現を分析した。血液中のルシフェラーゼ発現（ＧＬｕｃ、ＲＬＵ（相対発光単位）として計算される）は、腫瘍の生着と相関している。経時的なＣＨＬＡ－５５腫瘍成長を図３７Ａに示し、犠牲時のＣＨＬＡ－５５の生着を図３７Ｂに示す。
ＵＳＰ１６発現の下方制御は、インビボでＣＡＲＴ細胞死滅機能を大幅に増加させた。実験を別のＴ細胞共培養物を用いて繰り返し、同様の結果が得られた（ｎ＝４～６、対照対ｓｈＵＳＰ＃１対ＵＳＰ＃２：１５６００９対５３２７９対３８９６８、ｐ＝０．００１５；ｐ＝０．０００３）。
実施例２７：ＵＳＰ１６を標的とするｓｈＲＮＡの共発現は、インビボでのＣＤ１９．ＣＡＲ－Ｔ抗腫瘍活性を増強する。
実施例２６のように、初代Ｔ細胞を活性化させ、調製した。ＮＡＬＭ白血病細胞株にガウシアルシフェラーゼを形質導入し、ｄ－４で１００万個の細胞を尾静脈から注入した。次に、１００万個のＣＤ１９．ＣＡＲ Ｔ細胞をｄ＝０で尾静脈を介して与え、マウスの体重を測定し、毎週採血した（図３８）。腫瘍成長は、循環するルシフェラーゼの毎週の評価によって監視した。簡単に説明すると、血液を採取し、続いてＮａｎｏｌｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓルシフェラーゼ検出キットを使用してルシフェラーゼ発現を分析した。血液中のルシフェラーゼ発現（ＧＬｕｃ、ＲＬＵ（相対発光単位）として計算される）は、腫瘍の生着と相関している。ＮＡＬＭ生着を図３９Ａに示す。ＮＡＬＭ細胞は、主に脾臓に生着するため、屠殺時に脾臓を収集し、写真を撮り（図３９Ｂ）、脾臓のサイズは、臓器に浸潤した腫瘍の量と直接相関する。
ＵＳＰ１６発現の下方制御は、インビボでＣＡＲＴ細胞死滅機能を大幅に増加させる（ｎ＝４～６、対照対ｓｈＵＳＰ＃１対ＵＳＰ＃２：８１５０７対３８６０３対５１６９、ｐ＝０．０１３２；ｐ＝０．０００３）。
実施例２８：ＵＳＰ１６発現の一過性の下方制御。
初代Ｔ細胞を記載されているように活性化させる（実施例３）。活性化の６日目後（±４日）に、ダイナビーズを除去し、ネオントランスフェクションシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＴ細胞をエレクトロポレーションする。８０ｎＭの希釈標準溶液を使用し、ＮＥＯＮ設定を実施例１７で指定する。エレクトロポレーションされた細胞をＩＬ－２で培養し、１０日目（±４日）に２回目のエレクトロポレーションを行う。１５日目に細胞を収集し、ＲＮＡを抽出し、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２ａ、ＣＤＫＮ２Ｄ、および自己複製遺伝子を含む細胞老化遺伝子の発現について細胞を分析する。細胞はまた、ＣＤ４－ＰｅｒＣＰ－５．５もしくはＣＤ８－ＢＶ５１０、ＣＤ６２Ｌ－アロフィコシアニン、ＣＤ４５ＲＡ－ＢＶ５１０、またはＰＥ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対して染色する。幹細胞メモリーＴ細胞（Ｔｓｃｍ）は、Ｓｙｔｏｘ－ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋として同定する。細胞はまた、ＣＤ６９を含む疲弊マーカーについて分析し、単一および複数の刺激時の死滅および拡大能力について試験する。２０日目に限界希釈アッセイを実施する。
予想される結果：一過性のｓｉＲＮＡ送達によってＵＳＰ１６を下方制御するＴ細胞は、細胞の細胞老化の開始を遅らせ、Ｔｓｃｍ細胞の数および／または割合を高めると予想される。さらに、これらのＴｓｃｍ細胞は、限界希釈アッセイでより優れた性能を発揮することが予想される。ｓｉＲＮＡによってＵＳＰ１６を下方制御するＴ細胞は、インビトロおよびインビボ（免疫無防備状態のマウス、腫瘍を注射したＮＣＧまたはＮＳＧ）でより高い細胞毒性能力、およびより高い抗原誘発時の増殖能を有すると予想される。また、Ｔ細胞の疲弊が遅れる可能性があると予想される。編集または改変されている細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＣＲ細胞、および遺伝子編集された細胞（例えば、ＣＲＩＳＰＲを使用）で、同様の結果が得られると予想される。
実施例２９：ＵＳＰ１６発現の下方制御および免疫抑制微小環境に対するＴ細胞耐性へのその効果。
バフィーコートから単離されたＰＭＳＣ（実施例３）は、ＣＤ８Ｔ細胞および単球の供給源として使用する。簡単に説明すると、ＣＤ８ Ｔ細胞を磁気的に単離し、ＣＤ３／ＣＤ２８で６日間活性化させ、スクランブル（対照）またはｓｈＲＮＡを標的とするＵＳＰ１６をコードするレンチウイルスで形質導入し、ＩＬ－２の存在下で培養する。自家ＭＤＣＳを、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－６（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で７日間培養されたＣＤ１４＋細胞（ＰＢＭＣから磁気的に単離された）から開始して分化させる。このとき、ＭＤＳＣをＣＦＳＥ標識された自家ＣＤ８Ｔ細胞と３日間共培養する。ＣＳＦＥ希釈、サイトカイン、および表現型をこの時点で評価する。
予想される結果：ＭＤＳＣは、Ｔ細胞の増殖を強力に抑制するが、ＵＳＰ１６の発現がＴ細胞で下方制御されると、ＭＤＳＣを介した抑制の効果が低下し、つまり、ＵＳＰ１６の発現が下方制御されるＴ細胞は、免疫抑制環境に対する感受性が低下するであろう。
Ｔｒｅｇｓとの共培養によってＴ細胞の増殖が抑制された場合にも同様の結果が予想される。これを試験するために、簡単に言うと、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７低いとして同定される自家ＴｒｅｇをＦＡＣＳ選別または磁気単離によってＰＢＭＣから単離し、異なる比率（１：１、１：０．５、１：０．２５、エフェクター対ＴＲｅｇなど）でＣＤ８Ｔ細胞（上記を参照）に添加する。６日間の共培養後、分割された前駆体の割合を、例えば、フローサイトメトリーによって評価する。抑制は、Ｔｒｅｇ細胞またはＭＤＳＣ（骨髄由来の抑制細胞）の不在下または存在下での分割された細胞の割合を比較することによって計算する。編集または改変されている細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＣＲ細胞、および遺伝子編集された細胞（例えば、ＣＲＩＳＰＲを用いて）で同様の結果が得られると予想される。
実施例３０：ＵＳＰ１６発現の下方制御および腫瘍誘発性細胞老化に対するＴ細胞の影響の受けやすさに対するその効果。
初代Ｔ細胞を、記載されているように活性化させ（実施例３）、ＵＳＰ１６を標的とするｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルスで、またはｓｈＵＳＰ１６＃１、ｓｈＵＳＰ１６＃２、もしくはスクランブルｓｈＲＮＡ（対照）を共発現するＣＤ１９．ＣＡＲもしくはＧＤ２．ＣＡＲのいずれかで形質導入する。細胞をＥＧＦＲｔに対して選別するか、またはピューロマイシンによって選択する。細胞老化Ｔ細胞を誘発するために、腫瘍細胞株（例えば、０１２ＳＣＣ、ＣＨＬＡ－４、ＭＧ－６３．３ ＭＣＦ－７、ＨＣＴ－１１６、およびＭＥＬ－６２４）を２４時間培養し、次に、Ｔリンパ球（対照、またはＵＳＰ１６に対してノックダウンされている）を異なる腫瘍：Ｔ細胞比で添加する。細胞を６時間から最長５日培養することができる。次に、Ｔ細胞を収集し、洗浄し、直接分析するか、または完全培地でさらに７日間培養し、追加のサイトカインは添加しない。次に、細胞を収集し、疲弊およびメモリーマーカー（フローサイトメトリー）、細胞老化および自己複製遺伝子またはタンパク質（ＣＤＫＮ２ａ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２ａ、ＬＥＦ－１、ＴＣＦ７、Ａｘｉｎ２、ｐ２７、ｐ５３を含む）の差次的発現、細胞数および生存率、ならびにＳＡ－β－Ｇａｌ染色について分析する。
予想される結果：ＵＳＰ１６の下方制御により、Ｔ細胞は、腫瘍誘発性細胞老化の影響を受けにくくなると予想され、それは、ＵＳＰ１６サイレンスされたＴ細胞は、生存率が高く、細胞老化が少なく、自己複製が増加し、効率的に拡大し、腫瘍細胞を死滅させる能力が増強されているためである。
本発明は、その詳細な説明と併せて説明されてきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を説明することを意図しており、限定するものではない。他の態様、利点、および変更は、以下の範囲内である。

Claims (161)

  1. 細胞をＵＳＰ１６の阻害剤と接触させることを含む、細胞の老化を調節する方法であって、前記細胞が、血液細胞である、方法。
  2. 前記方法が、以下：
    （ａ）細胞拡大を維持もしくは増加させること、
    （ｂ）インビトロでの呼気時間を延長させること、
    （ｃ）インビボでの持続性を増加させること、
    （ｄ）細胞老化の開始を予防、遅延、もしくは逆転させること、
    （ｅ）自己複製能力を増加もしくは維持すること、
    （ｆ）自己複製表現型を増加もしくは維持すること、
    （ｇ）細胞疲弊を低下させること、
    （ｈ）遊走能を維持すること、
    （ｉ）活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を低下させること、
    （ｊ）エフェクター機能を増加させること、
    （ｋ）インビボでの生着を増加させること、
    （ｌ）インビボでの腫瘍死滅を増加させること、
    （ｍ）細胞老化マーカーもしくは老化関連マーカーの発現を調節すること、
    （ｎ）ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ｄ、および／もしくはγ－Ｈ２ＡＸ発現を低下させること、
    （ｏ）細胞増殖を増加させること、
    （ｐ）Ｈ２ＡもしくはＨ２Ｂのユビキチン化を増加させること、
    （ｑ）ＳＡ－β－Ｇａｌ発現を低下させること、
    （ｒ）ＷＮＴ経路を介したシグナル伝達を増強させること、
    （ｓ）テロメア短縮を低下させること、
    （ｔ）幹細胞マーカーの発現を増加させること、
    （ｕ）老化細胞除去薬に対する感受性を低下させること、
    （ｖ）ＳＡＳＰ（細胞老化関連分泌表現型）を低下させること、
    （ｗ）アポトーシスを低下させること、
    （ｘ）壊死を低下させること、
    （ｙ）ミトコンドリア膜電位を増加させること、ならびに／または
    （ｚ）細胞のグルタチオン含有量を増加させること、のうちの１つ以上をもたらす、請求項１に記載の方法。
  3. 前記方法が、以下：
    （ａ）細胞拡大を維持もしくは増加させること、
    （ｂ）インビトロでの呼気時間を延長させること、
    （ｃ）細胞老化の開始を予防、遅延、もしくは逆転させること、
    （ｄ）自己複製能力を増加もしくは維持すること、
    （ｅ）自己複製表現型を増加もしくは維持すること、
    （ｆ）エフェクター機能を増加させること、
    （ｇ）インビボでの腫瘍死滅を増加させること、
    （ｈ）細胞老化マーカーの発現を調節すること、および／もしくは幹細胞マーカーの発現を増加させること、
    （ｉ）ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ｄ、および／もしくはγ－Ｈ２ＡＸ発現を低下させること、
    （ｊ）細胞増殖を増加させること、
    （ｋ）ＷＮＴ経路を介したシグナル伝達を増強させること、
    （ｌ）幹細胞マーカーの発現を増加させること、
    （ｍ）老化細胞除去薬に対する感受性を低下させること、
    （ｎ）アポトーシスを低下させること、
    （ｏ）壊死を低下させること、
    （ｐ）ミトコンドリア膜電位を増加させること、ならびに／または
    （ｑ）細胞のグルタチオン含有量を増加させること、のうちの１つ以上をもたらす、請求項１に記載の方法。
  4. 前記方法が、以下：
    （ａ）インビボでの持続性を増加させること、
    （ｂ）細胞疲弊を低下させること、
    （ｃ）活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を低下させること、および／または
    （ｄ）インビボでの生着を増加させること、のうちの１つ以上をもたらす、請求項１に記載の方法。
  5. 前記血液細胞が、遺伝子改変された血液細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記血液細胞が、遺伝子改変された血液細胞である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記細胞が、目的のタンパク質を過剰発現するように遺伝子改変されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記細胞が、目的のタンパク質の発現をノックダウンまたはノックアウトするように遺伝子改変されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記細胞が、外因性タンパク質を発現するように遺伝子改変されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記血液細胞が、免疫細胞である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、および好中球からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記細胞が、Ｔ細胞であり、任意選択で、前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記細胞が、細胞毒性Ｔ細胞、末端エフェクターＴ細胞、エフェクターＴ細胞、メモリーまたはセントラルメモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、サイトカイン誘発性キラー（ＣＩＫ）Ｔ細胞、および腫瘍浸潤リンパ球から選択されるＴ細胞である、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 前記血液細胞が、造血幹細胞である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記血液細胞が、その表面上にキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝子改変されている、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記方法が、インビトロ法である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記方法が、インビボ法である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記阻害剤が、核酸である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記阻害剤が、タンパク質である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記阻害剤が、小分子である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記阻害剤が、高分子である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記阻害剤が、Ｃａｓヌクレアーゼ、またはＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記阻害剤が、ＴＡＬヌクレアーゼである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記阻害剤が、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記阻害剤が、ＲＮＡｉ分子である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記ＲＮＡｉ分子が、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および非対称干渉ＲＮＡから選択される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記阻害剤が、アンチセンス分子、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ－ＲＮＡキメラ、モルフォリノオリゴ、ｌｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡに埋め込まれたｓｈＲＮＡ、低分子内部セグメント化されたＲＮＡ、抗体、およびエキソソームから選択される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記阻害剤が、エレクトロポレーションを使用して前記細胞に送達される、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記阻害剤が、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用して前記細胞に送達される、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターから選択される、請求項２８に記載の方法。
  31. 前記レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記非ウイルスベクターが、リポソームまたはナノ粒子から選択される、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記阻害剤が、トランスポゾンシステムを使用して前記細胞に送達される、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記トランスポゾンシステムが、スリーピングビューティートランスポゾンシステムである、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記ＵＳＰ１６の阻害剤が、ＵＳＰ１６の発現の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の阻害をもたらす、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記ＵＳＰ１６の阻害剤が、ＵＳＰ１６の活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の阻害をもたらす、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
  37. 細胞をＵＳＰ１６の阻害剤と接触させることを含む、細胞の老化を調節する方法であって、前記細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、方法。
  38. 前記方法が、以下：
    （ａ）細胞拡大を維持もしくは増加させること、
    （ｂ）インビトロでの呼気時間を延長させること、
    （ｃ）インビボでの持続性を増加させること、
    （ｄ）細胞老化の開始を予防、遅延、もしくは逆転させること、
    （ｅ）自己複製能力を増加もしくは維持すること、
    （ｆ）自己複製表現型を増加もしくは維持すること、
    （ｇ）細胞疲弊を低下させること、
    （ｈ）遊走能を維持すること、
    （ｉ）活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を低下させること、
    （ｊ）エフェクター機能を増加させること、
    （ｋ）インビボでの生着を増加させること、
    （ｌ）インビボでの腫瘍死滅を増加させること、
    （ｍ）細胞老化マーカーもしくは老化関連マーカーの発現を調節すること、
    （ｎ）ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ｄ、および／もしくはγ－Ｈ２ＡＸ発現を低下させること、
    （ｏ）細胞増殖を増加させること、
    （ｐ）Ｈ２ＡまたはＨ２Ｂのユビキチン化を増加させること、
    （ｑ）ＳＡ－β－Ｇａｌ発現を低下させること、
    （ｒ）テロメアの短縮を低下させること、
    （ｓ）ＷＮＴ経路を介したシグナル伝達を増強させること、
    （ｔ）インビトロ細胞毒性を維持もしくは増加させること、
    （ｕ）ナイーブもしくはセントラルメモリー表現型を維持もしくは増加させること、
    （ｖ）放出されたサイトカインの種類および量を改変すること、
    （ｗ）幹細胞マーカーの発現を増加させること、
    （ｘ）老化細胞除去薬に対する感受性を低下させること、
    （ｙ）ＳＡＳＰ（細胞老化関連分泌表現型）を低下させること、
    （ｚ）アポトーシスを低下させること、
    （ａａ）壊死を低下させること、
    （ｂｂ）ミトコンドリア膜電位を増加させること、ならびに／または
    （ｃｃ）細胞のグルタチオン含有量を増加させること、のうちの１つ以上をもたらす、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記方法が、以下：
    （ａ）細胞拡大を維持もしくは増加させること、
    （ｂ）インビトロでの呼気時間を延長させること、
    （ｃ）細胞老化の開始を予防、遅延、もしくは逆転させること、
    （ｄ）自己複製能力を増加もしくは維持すること、
    （ｅ）自己複製表現型を増加もしくは維持すること、
    （ｆ）エフェクター機能を増加させること、
    （ｇ）インビボでの腫瘍死滅を増加させること、
    （ｈ）細胞老化マーカーもしくは老化関連マーカーの発現を調節すること、
    （ｉ）ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ｄ、および／もしくはγ－Ｈ２ＡＸ発現を低下させること、
    （ｊ）細胞増殖を増加させること、
    （ｋ）ＷＮＴ経路を介したシグナル伝達を増強させること、
    （ｌ）インビトロ細胞毒性を維持もしくは増加させること、
    （ｍ）ナイーブもしくはセントラルメモリー表現型を維持もしくは増加させること、
    （ｎ）幹細胞マーカーの発現を増加させること、
    （ｏ）老化細胞除去薬に対する感受性を低下させること、
    （ｐ）アポトーシスを低下させること、
    （ｑ）壊死を低下させること、
    （ｒ）ミトコンドリア膜電位を増加させること、ならびに／または
    （ｓ）細胞のグルタチオン含有量を増加させること、のうちの１つ以上をもたらす、請求項３７に記載の方法。
  40. 前記方法が、以下：
    （ａ）インビボでの持続性を増加させること、
    （ｂ）細胞疲弊を低下させること、
    （ｃ）活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を低下させること、および／または
    （ｄ）インビボでの生着を増加させること、のうちの１つ以上をもたらす、請求項３７に記載の方法。
  41. 前記細胞が、遺伝子改変されている、請求項３７～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記細胞が、目的のタンパク質を過剰発現するように遺伝子改変されている、請求項３７～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記細胞が、目的のタンパク質の発現をノックダウンまたはノックアウトするように遺伝子改変されている、請求項３７～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記細胞が、外因性タンパク質を発現するように遺伝子改変されている、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記細胞がＴ細胞であり、任意選択で、前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項３７～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記Ｔ細胞が、細胞毒性Ｔ細胞、末端エフェクターＴ細胞、エフェクターＴ細胞、メモリーまたはセントラルメモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、ＣＩＫ Ｔ細胞、および腫瘍浸潤リンパ球から選択される、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記細胞が、その表面上にキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝子改変されている、請求項３７～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記方法が、インビトロ法である、請求項３７～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記方法が、インビボ法である、請求項３７～４７のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記阻害剤が、核酸である、請求項３７～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記阻害剤が、タンパク質である、請求項３７～４９のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記阻害剤が、小分子である、請求項３７～４９のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記阻害剤が、高分子である、請求項３７～４９のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記阻害剤が、Ｃａｓヌクレアーゼ、またはＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸である、請求項３７～４９のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記阻害剤が、ＴＡＬヌクレアーゼである、請求項３７～４９のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記阻害剤が、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼである、請求項３７～４９のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記阻害剤が、ＲＮＡｉ分子である、請求項３７～４９のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記ＲＮＡｉ分子が、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および非対称干渉ＲＮＡから選択される、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記阻害剤が、アンチセンス分子、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ－ＲＮＡキメラ、モルフォリノオリゴ、ｌｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡに埋め込まれたｓｈＲＮＡ、低分子内部セグメント化されたＲＮＡ、抗体、またはエキソソームから選択される、請求項３７～４９のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記阻害剤が、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用して前記細胞に送達される、請求項３７～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターから選択される、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記非ウイルスベクターが、リポソームまたはナノ粒子から選択される、請求項６０に記載の方法。
  64. 前記阻害剤が、トランスポゾンシステムを使用して前記細胞に送達される、請求項３７～５９のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記トランスポゾンシステムが、スリーピングビューティートランスポゾンシステムである、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記阻害剤が、エレクトロポレーションを使用して前記細胞に送達される、請求項３７～５９のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記細胞が、Ｔ細胞であり、任意選択で、前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項３７～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記細胞が、ＮＫ細胞であり、任意選択で、前記ＮＫ細胞が、ＣＤ５６明るい、ＣＤ５６薄暗い、ＣＤ５６低い、またはＣＤ５６－である、請求項３７～４４または４７～６６のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記ＵＳＰ１６の阻害剤が、ＵＳＰ１６の発現の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の阻害をもたらす、請求項３７～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記ＵＳＰ１６の阻害剤が、ＵＳＰ１６の活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の阻害をもたらす、請求項３７～６８のいずれか一項に記載の方法。
  71. 遺伝子改変された血液細胞におけるＵＳＰ１６の発現を減少させる方法であって、前記細胞をＵＳＰ１６の阻害剤と接触させることを含む、方法。
  72. 前記遺伝子改変された血液細胞が、免疫細胞である、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記細胞が、目的のタンパク質を過剰発現するように遺伝子改変されている、請求項７１または７２に記載の方法。
  74. 前記細胞が、目的のタンパク質の発現をノックダウンまたはノックアウトするように遺伝子改変されている、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記細胞が、外因性タンパク質を発現するように遺伝子改変されている、請求項７１～７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、ＮＫ細胞、および好中球からなる群から選択される、請求項７１～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記細胞が、Ｔ細胞であり、任意選択で、前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記細胞が、Ｔ細胞であり、前記Ｔ細胞が、細胞毒性Ｔ細胞、末端エフェクターＴ細胞、エフェクターＴ細胞、メモリーまたはセントラルメモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、ＣＩＫ Ｔ細胞、および腫瘍浸潤リンパ球から選択される、請求項７６または７７に記載の方法。
  79. 前記遺伝子改変された血液細胞が、ＮＫ細胞であり、任意選択で、前記ＮＫ細胞が、ＣＤ５６明るい、ＣＤ５６薄暗い、ＣＤ５６低い、またはＣＤ５６－である、請求項７１～７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記遺伝子改変された血液細胞が、造血幹細胞である、請求項７１～７８のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記遺伝子改変された血液細胞が、その表面上にキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝的に改変されている、請求項７１～８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記方法が、インビトロ法である、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記方法が、インビボ法である、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記阻害剤が、核酸である、請求項７１～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記阻害剤が、タンパク質である、請求項７１～８３のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記阻害剤が、小分子である、請求項７１～８３のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記阻害剤が、高分子である、請求項７１～８３のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記阻害剤が、Ｃａｓヌクレアーゼ、またはＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸である、請求項７１～８３のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記阻害剤が、ＴＡＬヌクレアーゼである、請求項７１～８３のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記阻害剤が、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼである、請求項７１～８３のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記阻害剤が、ＲＮＡｉ分子である、請求項７１～８３のいずれか一項に記載の方法。
  92. 前記ＲＮＡｉ分子が、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および非対称干渉ＲＮＡから選択される、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記阻害剤が、アンチセンス分子、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ－ＲＮＡキメラ、モルフォリノオリゴ、ｌｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡに埋め込まれたｓｈＲＮＡ、低分子内部セグメント化されたＲＮＡ、抗体、およびエキソソームから選択される、請求項７１～８３のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記阻害剤が、エレクトロポレーションを使用して前記細胞に送達される、請求項７１～９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記阻害剤が、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用して前記細胞に送達される、請求項７１～９３のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターから選択される、請求項９４に記載の方法。
  97. 前記非ウイルスベクターが、リポソームまたはナノ粒子から選択される、請求項９４に記載の方法。
  98. 前記阻害剤が、トランスポゾンシステムを使用して前記細胞に送達される、請求項７１～９３のいずれか一項に記載の方法。
  99. 前記トランスポゾンシステムが、スリーピングビューティートランスポゾンシステムである、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記ＵＳＰ１６の阻害剤が、ＵＳＰ１６の発現の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の阻害をもたらす、請求項７１～９９のいずれか一項に記載の方法。
  101. 前記ＵＳＰ１６の阻害剤が、ＵＳＰ１６の活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の阻害をもたらす、請求項７１～９９のいずれか一項に記載の方法。
  102. 免疫療法の適用で使用するための免疫細胞を調製する方法であって、前記免疫細胞をＵＳＰ１６の阻害剤と接触させることを含む、方法。
  103. 前記免疫細胞をＵＳＰ１６の阻害剤と接触させることが、以下：
    （ａ）細胞拡大を維持もしくは増加させること、
    （ｂ）インビトロでの呼気時間を延長させること、
    （ｃ）インビボでの持続性を増加させること、
    （ｄ）細胞老化の開始を予防、遅延、もしくは逆転させること、
    （ｅ）自己複製能力を増加もしくは維持すること、
    （ｆ）自己複製表現型を増加もしくは維持すること、
    （ｇ）細胞疲弊を低下させること、
    （ｈ）遊走能を維持すること、
    （ｉ）活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を低下させること、
    （ｊ）エフェクター機能を増加させること、
    （ｋ）インビボでの生着を増加させること、
    （ｌ）インビボでの腫瘍死滅を増加させること、
    （ｍ）細胞老化マーカーもしくは老化関連マーカーの発現を調節すること、
    （ｎ）ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ｄ、および／もしくはγ－Ｈ２ＡＸ発現を低下させること、
    （ｏ）細胞増殖を増加させること、
    （ｐ）Ｈ２ＡまたはＨ２Ｂのユビキチン化を増加させること、
    （ｑ）ＳＡ－β－Ｇａｌ発現を低下させること、
    （ｒ）テロメアの短縮を低下させること、
    （ｓ）ＷＮＴ経路を介したシグナル伝達を増強させること、
    （ｔ）インビトロ細胞毒性を維持もしくは増加させること、
    （ｕ）ナイーブもしくはセントラルメモリー表現型を維持もしくは増加させること、
    （ｖ）放出されたサイトカインの種類および量を改変すること、
    （ｗ）幹細胞マーカーの発現を増加させること、
    （ｘ）老化細胞除去薬に対する感受性を低下させること、
    （ｙ）ＳＡＳＰ（細胞老化関連分泌表現型）を低下させること、
    （ｚ）アポトーシスを低下させること、
    （ａａ）壊死を低下させること、
    （ｂｂ）ミトコンドリア膜電位を増加させること、ならびに／または
    （ｃｃ）細胞のグルタチオン含有量を増加させること、のうちの１つ以上をもたらす、請求項１０２に記載の方法。
  104. 前記方法が、以下：
    （ａ）細胞拡大を維持もしくは増加させること、
    （ｂ）インビトロでの呼気時間を延長させること、
    （ｃ）細胞老化の開始を予防、遅延、もしくは逆転させること、
    （ｄ）自己複製能力を増加もしくは維持すること、
    （ｅ）自己複製表現型を増加もしくは維持すること、
    （ｆ）エフェクター機能を増加させること、
    （ｇ）インビボでの腫瘍死滅を増加させること、
    （ｈ）細胞老化マーカーもしくは老化関連マーカーの発現を調節すること、
    （ｉ）ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ｄ、および／もしくはγ－Ｈ２ＡＸ発現を低下させること、
    （ｊ）細胞増殖を増加させること、
    （ｋ）ＷＮＴ経路を介したシグナル伝達を増強させること、
    （ｌ）インビトロ細胞毒性を維持もしくは増加させること、
    （ｍ）ナイーブもしくはセントラルメモリー表現型を維持もしくは増加させること、
    （ｎ）幹細胞マーカーの発現を増加させること、
    （ｏ）老化細胞除去薬に対する感受性を低下させること、
    （ｐ）アポトーシスを低下させること、
    （ｑ）壊死を低下させること、
    （ｒ）ミトコンドリア膜電位を増加させること、ならびに／または
    （ｓ）細胞のグルタチオン含有量を増加させること、のうちの１つ以上をもたらす、請求項１０２に記載の方法。
  105. 前記方法が、以下：
    （ａ）インビボでの持続性を増加させること、
    （ｂ）細胞疲弊を低下させること、
    （ｃ）活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を低下させること、および／または
    （ｄ）インビボでの生着を増加させること、のうちの１つ以上をもたらす、請求項１０２に記載の方法。
  106. 前記免疫細胞が、遺伝子改変された免疫細胞である、請求項１０２～１０５のいずれか一項に記載の方法。
  107. 前記細胞が、目的のタンパク質を過剰発現するように遺伝子改変されている、請求項１０２～１０６のいずれか一項に記載の方法。
  108. 前記細胞が、目的のタンパク質の発現をノックダウンまたはノックアウトするように遺伝子改変されている、請求項１０２～１０７のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記細胞が、外因性タンパク質を発現するように遺伝子改変されている、請求項１０２～１０８のいずれか一項に記載の方法。
  110. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、および好中球からなる群から選択される、請求項１０２～１０９のいずれか一項に記載の方法。
  111. 前記細胞が、Ｔ細胞であり、任意選択で、前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１１０に記載の方法。
  112. 前記細胞が、Ｔ細胞であり、前記Ｔ細胞が、細胞毒性Ｔ細胞、末端エフェクターＴ細胞、エフェクターＴ細胞、メモリーまたはセントラルメモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、ＣＩＫ Ｔ細胞、および腫瘍浸潤リンパ球から選択される、請求項１１０または１１１に記載の方法。
  113. 前記細胞が、ＮＫ細胞であり、任意選択で、前記ＮＫ細胞が、ＣＤ５６明るい、ＣＤ５６薄暗い、ＣＤ５６低い、またはＣＤ５６－である、請求項１１０に記載の方法。
  114. 前記免疫細胞が、幹細胞ではない、請求項１０２～１１２のいずれか一項に記載の方法。
  115. 前記免疫細胞が、その表面上にキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝子改変されている、請求項１０２～１１４のいずれか一項に記載の方法。
  116. 前記方法が、インビトロ法である、請求項１０２～１１５のいずれか一項に記載の方法。
  117. 前記方法が、インビボ法である、請求項１０２～１１５のいずれか一項に記載の方法。
  118. 前記阻害剤が、核酸である、請求項１０２～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  119. 前記阻害剤が、タンパク質である、請求項１０２～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  120. 前記阻害剤が、小分子である、請求項１０２～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  121. 前記阻害剤が、高分子である、請求項１０２～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  122. 前記阻害剤が、Ｃａｓヌクレアーゼ、またはＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸である、請求項１０２～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  123. 前記阻害剤が、ＴＡＬヌクレアーゼである、請求項１０２～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  124. 前記阻害剤が、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼである、請求項１０２～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  125. 前記阻害剤が、ＲＮＡｉ分子である、請求項１０２～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  126. 前記ＲＮＡｉ分子が、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および非対称干渉ＲＮＡから選択される、請求項１２５に記載の方法。
  127. 前記阻害剤が、アンチセンス分子、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ－ＲＮＡキメラ、モルフォリノオリゴ、ｌｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡに埋め込まれたｓｈＲＮＡ、低分子内部セグメント化されたＲＮＡ、抗体、エキソソーム、およびヒストン修飾因子から選択される、請求項１０２～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  128. 前記阻害剤が、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用して前記細胞に送達される、請求項１０２～１２７のいずれか一項に記載の方法。
  129. 前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターから選択される、請求項１２８に記載の方法。
  130. 前記レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項１２９に記載の方法。
  131. 前記非ウイルスベクターが、リポソームまたはナノ粒子から選択される、請求項１２８に記載の方法。
  132. 前記阻害剤が、トランスポゾンシステムを使用して前記細胞に送達される、請求項１０２～１２７のいずれか一項に記載の方法。
  133. 前記トランスポゾンシステムが、スリーピングビューティートランスポゾンシステムである、請求項１３２に記載の方法。
  134. 前記ＵＳＰ１６の阻害剤が、ＵＳＰ１６の発現の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の阻害をもたらす、請求項１０２～１３３のいずれか一項に記載の方法。
  135. 前記ＵＳＰ１６の阻害剤が、ＵＳＰ１６の活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の阻害をもたらす、請求項１０２～１３３のいずれか一項に記載の方法。
  136. 前記免疫療法の適用が、自家適用である、請求項１０２～１３５のいずれか一項に記載の方法。
  137. 前記免疫療法の適用が、自家適用である、請求項１０２～１３５のいずれか一項に記載の方法。
  138. ＵＳＰ１６の発現を下方制御するように改変された、血液細胞。
  139. 前記ＵＳＰ１６の発現の下方制御が、以下：
    （ａ）細胞拡大を維持もしくは増加させること、
    （ｂ）インビトロでの呼気時間を延長させること、
    （ｃ）インビボでの持続性を増加させること、
    （ｄ）細胞老化の開始を予防、遅延、もしくは逆転させること、
    （ｅ）自己複製能力を増加もしくは維持すること、
    （ｆ）自己複製表現型を増加もしくは維持すること、
    （ｇ）細胞疲弊を低下させること、
    （ｈ）遊走能を維持すること、
    （ｉ）活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を低下させること、
    （ｊ）エフェクター機能を増加させること、
    （ｋ）インビボでの生着を増加させること、
    （ｌ）インビボでの腫瘍死滅を増加させること、
    （ｍ）細胞老化マーカーもしくは老化関連マーカーの発現を調節すること、
    （ｎ）ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ｄ、および／もしくはγ－Ｈ２ＡＸ発現を低下させること、
    （ｏ）細胞増殖を増加させること、
    （ｐ）Ｈ２ＡまたはＨ２Ｂのユビキチン化を増加させること、
    （ｑ）ＳＡ－β－Ｇａｌ発現を低下させること、
    （ｒ）テロメアの短縮を低下させること、
    （ｓ）ＷＮＴ経路を介したシグナル伝達を増強させること、
    （ｔ）インビトロ細胞毒性を維持もしくは増加させること、
    （ｕ）ナイーブもしくはセントラルメモリー表現型を維持もしくは増加させること、
    （ｖ）放出されたサイトカインの種類および量を改変すること、
    （ｗ）幹細胞マーカーの発現を増加させること、
    （ｘ）老化細胞除去薬に対する感受性を低下させること、
    （ｙ）ＳＡＳＰ（細胞老化関連分泌表現型）を低下させること、
    （ｚ）アポトーシスを低下させること、
    （ａａ）壊死を低下させること、
    （ｂｂ）ミトコンドリア膜電位を増加させること、ならびに／または
    （ｃｃ）細胞のグルタチオン含有量を増加させること、のうちの１つ以上を示す前記細胞をもたらす、請求項１３８に記載の血液細胞。
  140. 前記方法が、以下：
    （ａ）細胞拡大を維持もしくは増加させること、
    （ｂ）インビトロでの呼気時間を延長させること、
    （ｃ）細胞老化の開始を予防、遅延、もしくは逆転させること、
    （ｄ）自己複製能力を増加もしくは維持すること、
    （ｅ）自己複製表現型を増加もしくは維持すること、
    （ｆ）エフェクター機能を増加させること、
    （ｇ）インビボでの腫瘍死滅を増加させること、
    （ｈ）細胞老化マーカーもしくは老化関連マーカーの発現を調節すること、
    （ｉ）ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ｄ、および／もしくはγ－Ｈ２ＡＸ発現を低下させること、
    （ｊ）細胞増殖を増加させること、
    （ｋ）ＷＮＴ経路を介したシグナル伝達を増強させること、
    （ｌ）インビトロ細胞毒性を維持もしくは増加させること、
    （ｍ）ナイーブもしくはセントラルメモリー表現型を維持もしくは増加させること、
    （ｎ）幹細胞マーカーの発現を増加させること、
    （ｏ）老化細胞除去薬に対する感受性を低下させること、
    （ｐ）アポトーシスを低下させること、
    （ｑ）壊死を低下させること、
    （ｒ）ミトコンドリア膜電位を増加させること、ならびに／または
    （ｓ）細胞のグルタチオン含有量を増加させること、のうちの１つ以上をもたらす、請求項１３８に記載の血液細胞。
  141. 前記方法が、以下：
    （ａ）インビボでの持続性を増加させること、
    （ｂ）細胞疲弊を低下させること、
    （ｃ）活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を低下させること、および／または
    （ｄ）インビボでの生着を増加させること、のうちの１つ以上をもたらす、請求項１３８に記載の血液細胞。
  142. 前記血液細胞が、遺伝子改変された血液細胞である、請求項１３８～１４１のいずれか一項に記載の血液細胞。
  143. 前記血液細胞が、目的のタンパク質を過剰発現するように遺伝子改変されている、請求項１３８～１４１のいずれか一項に記載の血液細胞。
  144. 前記血液細胞が、目的のタンパク質の発現をノックダウンまたはノックアウトするように遺伝子改変されている、請求項１３８～１４１のいずれか一項に記載の血液細胞。
  145. 前記血液細胞が、外因性タンパク質を発現するように遺伝子改変されている、請求項１３８～１４４のいずれか一項に記載の血液細胞。
  146. 前記血液細胞が、免疫細胞である、請求項１３８～１４５のいずれか一項に記載の血液細胞。
  147. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、および好中球からなる群から選択される、請求項１４６に記載の血液細胞。
  148. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞であり、任意選択で、前記Ｔ細胞がＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１４７に記載の血液細胞。
  149. 前記Ｔ細胞が、細胞毒性Ｔ細胞、末端エフェクターＴ細胞、エフェクターＴ細胞、メモリーまたはセントラルメモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、ＣＩＫ Ｔ細胞、および腫瘍浸潤リンパ球から選択される、請求項１４７または１４８に記載の血液細胞、
  150. 前記免疫細胞が、ＮＫ細胞であり、任意選択で、前記ＮＫ細胞が、ＣＤ５６明るい、ＣＤ５６薄暗い、ＣＤ５６低い、またはＣＤ５６－である、請求項１４７に記載の血液細胞。
  151. 前記血液細胞が、造血幹細胞である、請求項１３８～１４９のいずれか一項に記載の血液細胞。
  152. 前記血液細胞が、幹細胞ではない、請求項１３８～１４９のいずれか一項に記載の血液細胞。
  153. 前記血液細胞が、その表面上にキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝子改変されている、請求項１３８～１５２のいずれか一項に記載の血液細胞。
  154. 前記ＵＳＰ１６の発現が、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低下している、請求項１３８～１５３のいずれか一項に記載の血液細胞。
  155. 前記ＵＳＰ１６の活性が、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低下している、請求項１３８～１５３のいずれか一項に記載の血液細胞。
  156. 疾患または障害を治療する方法であって、必要とする対象に、治療有効量の請求項１３８～１５５のいずれか一項に記載の細胞を投与することを含む、方法。
  157. 前記疾患または障害が、白血病、リンパ腫、黒色腫、膵臓がん、乳がん、結腸がん、肺がん、結腸直腸がん、および脳がんから選択されるがんである、請求項１５６に記載の方法。
  158. 疾患または障害を治療する方法であって、必要とする対象に、治療有効量の請求項１０２～１３３のいずれか一項に記載の方法を使用して産生される細胞を投与することを含む、方法。
  159. 前記疾患または障害が、白血病、リンパ腫、黒色腫、多発性骨髄腫、膵臓がん、乳がん、結腸がん、肺がん、結腸直腸がん、および脳がんから選択されるがんである、請求項１５８に記載の方法。
  160. 前記治療が、同種異系である、請求項１５６～１５９のいずれか一項に記載の方法。
  161. 前記治療が、自家である、請求項１５６～１５９のいずれか一項に記載の方法。
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