WO2023027088A1 - メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｒｓａ）に対する抗菌薬の薬剤感受性を向上させるための組成物、ｍｒｓａ感染症を治療又は予防するための組成物及びｍｒｓａの病原性を低下させるための組成物 - Google Patents

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｒｓａ）に対する抗菌薬の薬剤感受性を向上させるための組成物、ｍｒｓａ感染症を治療又は予防するための組成物及びｍｒｓａの病原性を低下させるための組成物 Download PDF

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mrsa
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bacteriophage
drug
phage
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PCT/JP2022/031783
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英知 岩野
純平 藤木
豪紀 樋口
智 権平
優 臼井
亮 村田
暢宏 中村
啓汰 西田
博紀 井上
豊 田村
直美 岩野
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学校法人酪農学園
Ｎｄｔｓ株式会社
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Definitions

  • the present invention provides compositions for improving the drug susceptibility of antibacterial agents against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), compositions for treating or preventing MRSA infections, and compositions for reducing the pathogenicity of MRSA. Regarding.
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • Bacteriophage is a general term for viruses that infect bacteria, and after infecting a host bacterium, it proliferates inside the bacterium. The proliferated daughter phages are released from the cell wall of the bacterium to the outside of the bacterium, and the bacterium is killed by bacteriolysis.
  • bacteriophages have advantages such as that they do not affect bacterial flora other than the host pathogenic bacteria, that they are easy to grow, and that large amounts of bacteriophages can be prepared at low cost.
  • Patent Document 1 S. Bacteriophages identified by Accession Nos. NITE BP-693 and NITE BP-694, respectively, have been found and reported by the present inventors as bacteriophages having the property of lysing C. aureus.
  • Non-Patent Document 1 S. It has been suggested that the application of the phage PYO Sa followed by antibiotics may be more effective against C. aureus than the antibiotics alone.
  • MRSA infections are diversifying. Under such circumstances, a therapeutic strategy suitable for each individual case of MRSA infection is strongly demanded, and the development of a new method for dealing with MRSA has been awaited.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances. and compositions for reducing the virulence of MRSA.
  • a composition for improving drug susceptibility of an antibacterial drug against methicillin-resistant Staphylococcus aureus comprises It contains at least one bacteriophage selected from the group consisting of the bacteriophage identified by Accession No. NITE BP-693 and the bacteriophage identified by Accession No. NITE BP-694.
  • the drug sensitivity is improved.
  • the antibacterial agent is a ⁇ -lactam antibacterial agent.
  • composition for treating or preventing MRSA infection comprises It contains at least one bacteriophage selected from the group consisting of the bacteriophage identified by accession number NITE BP-693 and the bacteriophage identified by accession number NITE BP-694, and an antibacterial agent.
  • MRSA acquires resistance to the bacteriophage.
  • the antibacterial agent is a ⁇ -lactam antibacterial agent.
  • a composition for reducing the pathogenicity of MRSA according to the third aspect of the present invention comprises It contains at least one bacteriophage selected from the group consisting of the bacteriophage identified by Accession No. NITE BP-693 and the bacteriophage identified by Accession No. NITE BP-694.
  • a composition capable of improving the drug susceptibility of an antibacterial drug to MRSA, a composition for treating or preventing MRSA infection, and a pathogenicity of MRSA Compositions can be provided for lowering.
  • FIG. 10 is a graph showing verification of the growth inhibitory effect of phage ( ⁇ SA012) in MRSA wild strain.
  • FIG. 10 is a graph showing verification of the growth inhibitory effect of phage ( ⁇ SA012) on ⁇ SA012-resistant MRSA (mutant: SAm1-106).
  • FIG. 10 is a graph showing verification of the growth inhibitory effect of phage ( ⁇ SA012) on ⁇ SA012-resistant MRSA (mutant: SAm1-201).
  • FIG. 10 is a graph showing verification of the growth inhibitory effect of phage ( ⁇ SA012) on ⁇ SA012-resistant MRSA (mutant: SAm1-201).
  • FIG. 2 is a graph showing the growth inhibitory effect of adding both phages and an antibacterial drug (oxacillin) to a wild strain of MRSA from the start of the test.
  • FIG. 10 is a graph showing verification of changes in expression of pathogenicity-related genes in MRSA mutants.
  • FIG. 10 is a graph showing verification of changes in expression of genes related to drug efflux pumps in MRSA mutants.
  • (a) is a graph showing the survival rate when a wild strain (MRSA2007-13 strain) or a phage mutant (phage-resistant strain MRSA2007-13 SAm1-201) was intraperitoneally administered to 8-week-old female BALB/c mice.
  • (b) is a photographic diagram showing the macroscopic findings of lesions 7 days after subcutaneous administration of a wild strain (MRSA2007-13 strain) to an 8-week-old female BALB/c mouse, and (c) is a phage.
  • Subcutaneous administration of mutant (SAm1-201), 7 days after subcutaneous administration is a photographic diagram showing the macroscopic findings of the lesion
  • (d) is a graph showing the change in abscess size over 7 days after administration (mean ⁇ SE).
  • composition for improving antimicrobial drug susceptibility to MRSA is a composition for improving the drug susceptibility of an antibacterial drug to methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA).
  • the composition contains at least one bacteriophage selected from the group consisting of the bacteriophage identified by Accession No. NITE BP-693 and the bacteriophage identified by Accession No. NITE BP-694.
  • bacteriophages which is the active ingredient of the composition of the present invention, was registered on December 25, 2008 by the Patent Microorganism Depositary Center, National Institute of Technology and Evaluation, Biotechnology Headquarters, Japan (zip code 292-0818, Chiba Prefecture, Japan). It is a bacteriophage deposited at 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City under the accession number NITE BP-693. The inventors named this bacteriophage " ⁇ SA012".
  • the other bacteriophage which is the active ingredient of the composition of the present invention, was registered on December 25, 2008 by the National Institute of Technology and Evaluation, National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary Center, Biotechnology Headquarters (zip code 292-0818, Chiba Prefecture, Japan). It is a bacteriophage deposited at 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City under the accession number NITE BP-694. The inventors named this bacteriophage " ⁇ SA039".
  • ⁇ SA012 and ⁇ SA039 were both about the same size as T4 phage and slightly longer. ⁇ SA012 and ⁇ SA039 are presumed to belong to the Myoviridae family, since they have a contractile sheath. For other structures and properties of the bacteriophage according to the present invention, see JP-A-2011-50373.
  • the bacteriophage according to the present invention can be obtained by making a request for distribution to the above-mentioned depositary institution where they are deposited.
  • sewage running water from general households, wastewater collected from sewage treatment facilities, etc., or S.I.
  • biological samples such as blood, nasal cavities, pharynx, skin, and intestinal tracts derived from animals infected with aureus, for example, the plaque assay/separation method described in JP-A-2011-50373 is used to separate and purify by a conventional method. You can also get it by
  • the bacteriophage according to the present invention can be grown by a general bacteriophage growth method such as the plate lysate method described in JP-A-2011-50373.
  • composition of the present invention only needs to contain the bacteriophage described above.
  • examples thereof include a bacteriophage solution obtained by the proliferation method described above, and a bacteriophage solution separated from culture residue by centrifugation or the like.
  • the details of the bacteriophage contained in the composition of the present invention are as described above.
  • the bacteriophage contained in the composition of the present invention may be of one type (strain, strain) or may be a bacteriophage mixture (phage cocktail) of ⁇ SA012 and ⁇ SA039. It may also contain other bacteriophages.
  • Other bacteriophages are not particularly limited, and include bacteriophages against bacteria different from MRSA according to the present invention (e.g., S. aureus). good.
  • the concentration of the bacteriophage in the composition of the present invention is not particularly limited, and a person skilled in the art can appropriately adjust it according to the form of use. 10 3 to 1 ⁇ 10 13 PFU/mL (PFU: plaque forming unit plaque forming unit) is preferable, 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 11 PFU/mL is more preferable, and 1 ⁇ 10 8 to More preferably 1 ⁇ 10 10 PFU/mL.
  • the method for determining that the antibacterial drug susceptibility has been improved is, for example, (i) compared to the diameter of the inhibition circle when the antibacterial drug susceptibility in MRSA is measured by the disc method (drug susceptibility test). Therefore, when the same diameter of the antibacterial drug in MRSA to which the bacteriophage according to the present invention is applied is large, it can be determined that the antibacterial drug susceptibility has been improved.
  • Inhibitory Concentration MIC, when the MIC value of the antimicrobial agent in MRSA to which the bacteriophage according to the present invention is applied is smaller than the MIC value when measured by (drug susceptibility test), It can be determined that the drug sensitivity to antibacterial drugs has improved.
  • MRSA may be made to acquire resistance to the bacteriophage according to the present invention, thereby improving its susceptibility to antibacterial drugs.
  • "acquiring resistance” means that MRSA has resistance to the bacteriophage according to the present invention, and the bacteriophage is ineffective against MRSA (e.g., proliferation of MRSA by the bacteriophage is no longer suppressed), or the bacteriophage becomes less effective (for example, the bacteriophage suppresses the growth of MRSA to a lesser degree).
  • Acquisition of resistance to bacteriophage is determined, for example, by measuring proliferation activity by EOP (plaque formation rate) or turbidity measurement method described later for MRSA to which the bacteriophage according to the present invention is applied, and applying the bacteriophage "Acquired resistance" can be determined by comparison with previous proliferative activity. Also, for example, when mutations of mgrA, femA, or both are detected by genetic analysis, it can be determined that "resistance has been acquired.”
  • antibacterial agents include ⁇ -lactams, aminoglycosides, lincomycins, fosfomycins, tetracyclines, chloramphenicols, macrolides, ketolides, polypeptides, glycopeptides, streptogramins, Examples include, but are not limited to, quinolones, oxazolidinones.
  • the antibacterial agent is preferably a ⁇ -lactam antibacterial agent.
  • ⁇ -lactam antibacterial agents include penicillins (penicillin G, ampicillin, bacampicillin, renampicillin, cyclacillin, amoxicillin, pibmecillin, aspoxicillin, cloxacillin, piperacillin, methicillin); compound penicillin drugs (ampicillin, cloxacillin); ⁇ -lactamase inhibitors compounded penicillins (ampicillin, sulbactam, clavulanic acid, amoxicillin, piperacillin, tazobactam); cephems (cefazolin, cephalontin, cefalexin, cefatrizine, cefloxazine, cefaclor, cefadroxil, cefotiam, cefmetazole, flomoxef, cefminox, cefbuperazone, cefuroxime, axetil, cefdinir, cef
  • compositions of the present invention can be used, for example, in subjects suffering from MRSA infection, such as rodents including mice, rats, hamsters and guinea pigs, primates including humans, chimpanzees and rhesus monkeys, pigs, cattle, goats, horses, It is administered to mammals such as domestic animals including sheep and birds, and pets including dogs and cats.
  • MRSA infection such as rodents including mice, rats, hamsters and guinea pigs, primates including humans, chimpanzees and rhesus monkeys, pigs, cattle, goats, horses.
  • mammals such as domestic animals including sheep and birds, and pets including dogs and cats.
  • a preferred subject is a human.
  • composition of the present invention can be prepared into dosage forms such as tablets, granules, powders, capsules, syrups, injections, etc., using an appropriate drug delivery system (DDS).
  • DDS drug delivery system
  • excipients, binders, lubricants, colorants, disintegrants, thickeners, preservatives, stabilizers, pH adjusters and the like that are used in ordinary pharmaceuticals can be added.
  • the dosage of the composition can be appropriately set according to the subject's age, body weight, indication symptoms, and the like.
  • composition for treating or preventing MRSA infection comprises at least 1 bacteriophage and an antibacterial agent.
  • composition of the present invention improves the susceptibility of MRSA to antibacterial agents by the bacteriophage (same as described above) of the present invention, thereby obtaining the therapeutic or preventive effect of the antibacterial agent on MRSA infections.
  • MRSA infection refers to an infection caused by MRSA, such as respiratory infection, bacteremia, infectious endocarditis, skin/soft tissue infection, intra-abdominal infection, bone ⁇ Indicates joint infections, central nervous system infections, urinary tract infections, pediatric infections, etc.
  • the composition of the present invention can be used to treat or prevent these MRSA infections, and can also be used to prevent postoperative infections.
  • treatment of MRSA infection refers to delay or arrest of progression of MRSA infection, remission or temporary remission of MRSA infection, recurrence of MRSA infection such as sterilization/eradication/suppression of proliferation of MRSA. It encompasses medically acceptable therapeutic interventions for various purposes, including the prevention, etc. of As used herein, “prevention of MRSA infection” includes medically acceptable prophylactic interventions for various purposes, including prevention of onset or contraction of MRSA infection, prevention of MRSA infection, and the like. .
  • MRSA acquire resistance to the bacteriophage, which is the active ingredient of the composition of the present invention
  • the drug susceptibility to antibacterial agents is improved, and the antibacterial agent is effective in preventing or treating MRSA infections. good too.
  • the method for determining that "tolerance has been acquired" is the same as described above.
  • the antibacterial agent is as described above, but it may be, for example, a ⁇ -lactam antibacterial agent.
  • the details of the ⁇ -lactam antibiotics are as described above.
  • compositions of the present invention can be used in subjects suffering from MRSA infection, e.g., rodents including mice, rats, hamsters and guinea pigs, primates including humans, chimpanzees and rhesus monkeys, pigs, cattle, goats, horses, sheep, It is administered to mammals such as domestic animals including birds, and pets including dogs and cats.
  • MRSA infection e.g., rodents including mice, rats, hamsters and guinea pigs, primates including humans, chimpanzees and rhesus monkeys, pigs, cattle, goats, horses, sheep.
  • mammals such as domestic animals including birds, and pets including dogs and cats.
  • a preferred subject is a human.
  • composition of the present invention can be prepared into dosage forms such as tablets, granules, powders, capsules, syrups, injections, etc., using an appropriate drug delivery system (DDS).
  • DDS drug delivery system
  • excipients, binders, lubricants, colorants, disintegrants, thickeners, preservatives, stabilizers, pH adjusters and the like that are used in ordinary pharmaceuticals can be added.
  • the dosage of the composition can be appropriately set according to the subject's age, body weight, indication symptoms, and the like.
  • Methods for administering the composition of the present invention include, for example, (i) a method of using the bacteriophage of the present invention in combination with an antibacterial agent (which may be a cocktail therapy or a combination drug), and (ii) Examples include a method of administering an antibacterial drug after administering the bacteriophage according to the present invention.
  • an antibacterial agent which may be a cocktail therapy or a combination drug
  • Examples include a method of administering an antibacterial drug after administering the bacteriophage according to the present invention.
  • administration during meals, administration after meals, administration before meals, administration between meals, administration before bedtime, and the like are all possible.
  • composition of the present invention may further contain other drugs, or may be used in combination. When used in combination, they may be administered at the same time, or may be administered one after the other.
  • the "other drug” is not particularly limited as long as it does not lose the effect of improving the drug susceptibility of the bacteriophage of the present invention to the antibacterial drug, and includes anti-inflammatory agents, immunosuppressive agents, Commonly used agents for each use, such as prophylactic agents for infectious diseases, therapeutic agents for infectious diseases, insecticides, anthelmintic agents, antifungal agents, antiviral agents, etc., can be appropriately selected and used according to the mode of use. can.
  • composition for reducing pathogenicity of MRSA comprises at least one selected from the group consisting of the bacteriophage identified by Accession No. NITE BP-693 and the bacteriophage identified by Accession No. NITE BP-694. of bacteriophage.
  • composition of the present invention is for reducing the pathogenicity of MRSA by the bacteriophage (as described above) of the present invention.
  • to reduce the pathogenicity of MRSA means to reduce the nature and ability of MRSA to infect other organisms and cause infections in the host.
  • genes related to pathogenicity of MRSA for example, ⁇ EsaA ⁇ EsaB ⁇ EsaC ⁇ EssA ⁇ EssB ⁇ EssC ⁇ EsxA ⁇ EsxB ⁇ RNAIII ⁇ LukGH subunit H ⁇ LukGH subunit G ⁇ thermonuclease ⁇ Staphylococcus superantigen-like protein 11(SSL11) ⁇ Staphylokinase ⁇ staphylococcal enterotoxin type O) ⁇ is reduced, it can be determined that "the pathogenicity of MRSA is reduced.”
  • the pathogenicity may be reduced by making MRSA acquire resistance to the bacteriophage. Acquisition of resistance to bacteriophage can be confirmed by the same method as described above.
  • compositions of the present invention may be used, for example, in rodents including mice, rats, hamsters and guinea pigs, primates including humans, chimpanzees and rhesus monkeys, domestic animals including pigs, cattle, goats, horses, sheep and birds, dogs and cats.
  • rodents including mice, rats, hamsters and guinea pigs, primates including humans, chimpanzees and rhesus monkeys, domestic animals including pigs, cattle, goats, horses, sheep and birds, dogs and cats.
  • a mammal such as a companion animal, including A preferred subject is a human.
  • composition of the present invention can be prepared into dosage forms such as tablets, granules, powders, capsules, syrups, injections, etc., using an appropriate drug delivery system (DDS).
  • DDS drug delivery system
  • excipients, binders, lubricants, colorants, disintegrants, thickeners, preservatives, stabilizers, pH adjusters and the like that are used in ordinary pharmaceuticals can be added.
  • the dosage of the composition can be appropriately set according to the subject's age, body weight, indication symptoms, and the like.
  • compositions containing the bacteriophage according to the present invention and improving the drug sensitivity of antimicrobial agents against MRSA.
  • the drug sensitivity of the antibacterial agent is improved against MRSA, for which conventional agents did not have effects such as sterilization, eradication, and growth inhibition, and as a result, the antibacterial agent It is possible to exhibit effects such as sterilization, eradication, and suppression of proliferation against MRSA by.
  • composition for treating or preventing MRSA infection according to the present invention enhances the susceptibility of MRSA to antibacterial agents by the bacteriophage of the present invention, thereby enhancing the therapeutic or preventive effect of the antibacterial agent on MRSA infection.
  • the composition for reducing the pathogenicity of MRSA according to the present invention can reduce the pathogenicity of MRSA itself by the bacteriophage of the present invention, and is expected to have therapeutic or preventive effects on MRSA infections.
  • the present invention also includes methods for improving drug susceptibility of antibacterial drugs to MRSA, methods for treating or preventing MRSA infections, and methods for reducing pathogenicity of MRSA, and these methods may each comprise the step of conferring MRSA resistance to the bacteriophage of the invention.
  • the present inventors have previously Bacteriophages ( ⁇ SA012 and ⁇ SA039) identified by accession numbers NITE BP-693 and NITE BP-694, respectively, have been successfully isolated as bacteriophages having the property of lysing C. aureus.
  • Example 1 It is known that phage-resistant bacteria change (disappear) their original functions due to resistance accompanied by genetic mutation (trade-off). Therefore, gene mutations in phage-resistant ( ⁇ SA012-resistant) MRSA were investigated.
  • ⁇ SA012-resistant MRSA ( ⁇ SA012mts) was obtained as follows. 40 ⁇ L of MRSA2007-13 strain (GCA — 018409145.1) bacterial solution and 40 ⁇ L of ⁇ SA012 (10 9 PFU/mL) were mixed with 4 mL of LB liquid medium and cultured with shaking at 37° C. for 6 days. Then, the cells were collected by centrifugation, washed with 1 mL of PBS, and smeared on an LB agar medium. After overnight culture at 37°C, a single colony formed on the medium was collected, added to 3 mL of LB-Broth and cultured with shaking at 37°C overnight for cloning. The cloned strains were verified by a spot test using a soft agar LB medium and a time-lapse turbidity measurement method using a plate reader, and strains that showed no ⁇ SA012 lytic activity were used as mutants.
  • mutant SAm1-201 was extracted and genomic analysis was performed using a next-generation sequencer.
  • SAm1-201 was pre-cultured in LB-Broth and genome extraction was performed using the GenElute® Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich) (performed according to manufacturer's instructions). Genome analysis was entrusted to Biotechnology Research Institute, Inc., and sequencing analysis was performed under the conditions of 2 ⁇ 200 bp using a next-generation sequencer DNBSEQ-G400. After removal of adapter sequences and low-quality reads using Trimmomatic (ver. 0.39), CLC Genomics Workbench 20 was used to perform mapping to reference sequences and mutation detection.
  • FIG. 1(a) shows photographic diagrams of the bacteriolysis of the wild strain (“WT” in FIG. 1(b)) and mutant strains (SAm1-201 and SAm1-106).
  • the test method is shown below. This test was performed by the turbidimetric method. Turbidimetry allows real-time measurement of the relationship between phage infectivity and bacterial growth. A specific method of turbidity measurement will be explained. Using a 96-well plate, the proliferative activity of the wild strain (MRSA2007-13 strain) or mutants (SAm1-201, SAm1-106) in the absence (control) or presence of ⁇ SA012 was measured using a turbidity measurement method over time. Measured by The overnight pre-cultured bacterial solution (wild strain (MRSA2007-13 strain) or mutants (SAm1-201, SAm1-106)) was diluted with LB-Broth so that OD 600 ⁇ 1.0, and Diluted 10 times.
  • FIGS. 2 to 4 The results are shown in Figures 2-4.
  • the vertical axis represents turbidity
  • the horizontal axis represents time (h)
  • gray graph lines indicate bacterial growth without phages
  • black graph lines indicate bacterial growth with phages.
  • the wild strain MRSA2007-13 strain
  • ⁇ SA012 The wild strain (MRSA2007-13 strain) was immediately lysed by ⁇ SA012, and no increase in turbidity indicating bacterial growth was observed, confirming that phage inhibited bacterial growth (Fig. 2).
  • the mutant (SAm1-106) having one mgrA mutation the degree of suppression of bacterial growth by ⁇ SA012 was weakened, and an increase in turbidity was observed at an early stage (Fig. 3).
  • a mutant (SAm1-201) having mutations in both mgrA and femA showed growth similar to that of the wild type, and there was no suppression of bacterial growth by phages, confirming that the bacteria had become resistant to phages. (Fig. 4). From the above, it was confirmed that the phage ( ⁇ SA012) did not have the effect of suppressing bacterial growth in the mutant, and in particular, the mutant strain having both mgrA and femA mutations was strongly phage-resistant to MRSA. became clear.
  • Example 2 In phage-resistant MRSA, it was expected that the drug sensitivity would change due to a trade-off. Therefore, we examined changes in drug sensitivity associated with phage resistance.
  • the drug susceptibility of the wild type (MRSA2007-13 strain) and the mutant (SAm1-201) to ⁇ -lactam antibacterial drugs was measured by the drug susceptibility test (disk method).
  • Disk method The drug susceptibility test (disk method).
  • Wild type (MRSA strain 2007-13) or mutant (SAm1-201) was streaked onto LB-Agar and incubated overnight at 37°C. The next day, a single colony was picked, added to 5 mL trypticase soy broth, and cultured overnight at 37°C with shaking. After incubation, a McFarland turbidity No.
  • a bacterial solution was prepared at 0.5 and spread evenly on Mueller-Hinton II agar medium using a sterile cotton swab. After placing the sensitive discs on this agar medium, they were incubated at 37° C. for 24 hours, and the diameter of the inhibition circle formed around the discs was measured in millimeters.
  • the results are shown in Table 2.
  • the wild strain (“WT” in Table 2) showed resistance (R) to any ⁇ -lactam antibacterial drug.
  • the mutant (SAm1-201) was shown to have susceptibility (S) to ⁇ -lactam antibiotics.
  • the drug susceptibility of the antibacterial drug in the wild strain (MRSA2007-13 strain) and mutant strains with both mgrA and femA mutations (SAm1-201, SAm1-206, SAm1-210) was tested by drug susceptibility test (MIC method ) was measured.
  • MIC method drug susceptibility test
  • the bacteriophage acquires phage resistance to MRSA, thereby improving drug sensitivity to antibacterial agents including ⁇ -lactams.
  • the test method is shown below. This test was performed by the turbidimetric method.
  • the bacterial solution wild strain (MRSA2007-13 strain) pre-cultured overnight was diluted with LB-Broth so that OD 600 ⁇ 1.0, and it was further diluted 10-fold ( ⁇ 1.0 ⁇ 10 8 cfu /mL).Each group was set up as follows.
  • Example 4 Since mgrA is 100% mutated in the phage-resistant ( ⁇ SA012-resistant) MRSA strain, gene expression changes due to mgrA mutation were verified by RNA-seq analysis.
  • RNA extraction and RNA-seq analysis are shown below. Wild strain (MRSA2007-13 strain) and phage mutant (SAm1-201) are cultured in LB-Broth until OD 600 ⁇ 1.0. After centrifuging 1 mL of the bacterial solution to obtain a pellet, the suspension is suspended in 1 mL of TRIzol Reagent (Thermo Fisher Scientific), 500 ⁇ L of Zirconia beads are added, and the bacterial cells are disrupted with a crusher. After crushing, the cells are centrifuged, the supernatant is collected, and the RNA fraction is extracted using chloroform and ethanol. Library preparation and RNA-seq analysis were entrusted to Rhelixa Corporation.
  • a library was prepared using the Ribo-Zero Plus rRNA Depletion Kit and the NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina, and sequencing analysis was performed using an Illumina NovaSeq 6000 at 150 bp ⁇ 2. After removing adapter sequences and low-quality reads using Trimmomatic (ver.0.39), they were mapped against reference sequences using HISAT2 (ver.2.1.0). After counting reads for each gene using featureCounts (ver.2.0.1), TMM normalization was performed using TCC-GUI to detect genes with altered expression.
  • mgrA is said to regulate about 350 genes as a transcriptional regulatory factor, including genes related to pathogenicity and genes related to drug efflux pumps. Therefore, gene expression changes due to mgrA mutations that occur as a result of phage resistance were verified.
  • T7SS consists of 4 membrane proteins (EsaA, EssA, EssB, EssC), 2 intracellular proteins (EsaB, EsaG), 5 secretory substrates (EsxA, EsxB, EsxC, EsxD, EsaD), EsaE interacting with secretory substrates.
  • T7SS has an important role in the virulence of Staphylococcus aureus. It has been reported that deletion of all or specific factors (EsxA, EssB, EssC, EsxC, EsxB, EsaB, EsaD, EsaE) of T7SS reduces virulence in a mouse infection model.
  • Quorum sensing is a mechanism that senses the population density of bacteria of the same species and controls the production of substances accordingly.
  • Some of the virulence factors of Staphylococcus aureus are controlled by quorum sensing called the Accessory gene regulator (Agr) control system.
  • Agr Accessory gene regulator
  • RNAIII is transcribed, and this RNAIII directly or indirectly regulates the transcription and expression of virulence factors.
  • LukGH is one of the leukocidins, also called LukAB.
  • Leukocidin is a toxin component that forms pores in and destroys white blood cells such as neutrophils.
  • Thermonuclease (nuc) is extracellularly secreted and can degrade extracellular DNA.
  • neutrophils are known to self-destruct against Staphylococcus aureus and release their own DNA to capture the cells (NETs: neutrophil extracellular traps).
  • Thermonuclease acts on NETs to help escape their capture.
  • SSL Staphylococcus superantigen-like protein 11
  • SSL11 suppresses immunity by suppressing the activation of neutrophils and their rolling to the vascular wall. It is also known to inhibit cell adhesion and motility.
  • Staphylokinase is known to bind to plasminogen and ⁇ -defencin secreted from neutrophils.
  • Sak binds to plasminogen, it becomes plasmin and is activated.
  • Plasmin acts as a broad-spectrum proteolytic enzyme and contributes to the invasion of S. aureus into surrounding tissues.
  • ⁇ -defensin which is an antibacterial peptide, is inactivated when it binds to sak, allowing Staphylococcus aureus to survive.
  • sak gene expression is positively regulated by the Agr system, which is quorum sensing.
  • ⁇ staphylococcal enterotoxin type O> SEO is an entrotoxin secreted by Staphylococcus aureus and is known to cause vomiting upon inoculation. It is also known to induce IL-1 ⁇ secretion from neutrophils via the inflammasome pathway.
  • NorB and Tet are genes related to drug efflux pumps, which are genes related to drug efflux pumps, were verified by the same RNA-seq analysis as above.
  • NorB and Tet are genes involved in drug efflux pumps and causative genes that cause multidrug resistance. Decreased expression of these genes increases antimicrobial susceptibility by inhibiting antimicrobial drug efflux in the bacterium.
  • Example 5 From the results of RNA-seq analysis of the phage-resistant strain MRSA2007-13 SAm1-201 strain with mgrA mutation, a decrease in the expression level of various pathogenic genes was observed (Example 4). to assess the pathogenicity of phage-resistant bacteria.
  • the hair from both flanks to the thigh was shaved with a hair clipper, and the skin surface was disinfected with 70% alcohol.
  • 50 ⁇ L of the bacterial solution was subcutaneously administered (1.0 ⁇ 10 8 CFU/site) from both flanks to the vicinity of the thigh, and then awakened with 0.75 mg/kg atipamezole.
  • the lesion was collected and minced, 200 ⁇ L of PBS and a ⁇ 5 mm zirconia ball were added, the tissue was crushed to prepare a lysate, and the number of bacteria was counted using the plate dilution method. It was measured. This animal experiment was approved by the University Animal Care and Use Committee (approval number: VH21A13).
  • Figure 8(a) shows the results of pathogenicity evaluation using a mouse peritonitis model. All mice intraperitoneally administered with the wild strain (MRSA2007-13 strain) died within 24 hours (FIG. 8(a): black line). On the other hand, the 48-hour survival rate of mice administered with the phage mutant (SAm1-201) was 50% (Fig. 8(a): gray line). These results indicate that phage-resistant MRSA has reduced pathogenicity and greatly increases the survival rate of mice.
  • Figures 8 (b) to (e) show the results of pathogenicity evaluation using a mouse skin abscess model.
  • MRSA 2007-13 strain the wild strain
  • 1 died due to sepsis-like symptoms 2 days after administration, and the left and right lesions were commissural throughout the observation period.
  • the respective abscess size could not be measured.
  • Mice treated with the wild-type strain (MRSA strain 2007-13) exhibited extensive tumors (FIG. 8(b)), whereas mice treated with the phage mutant (SAm1-201) exhibited limited tumor coverage. and the tumor size was remarkably small (Fig. 8(c)).
  • the phage mutant (SAm1-201) was higher than the mice (Fig. 8(d): solid line) administered with the wild strain (MRSA2007-13 strain).
  • the treated mice (FIG. 8(d): dashed line) showed significantly smaller tumor sizes (FIG. 8(d)).
  • 7 days after administration the lesion tissue was excised, and the number of bacteria in the tissue was measured. The number of bacteria was remarkably low in the mice treated with this method, and the number of bacteria detected was about 1/50 (Fig. 8(e)).
  • the phage mutant (SAm1-201) has reduced pathogenicity to mice compared to the wild type (MRSA2007-13 strain). It turns out that there is In other words, it was shown that the pathogenicity of MRSA is reduced by acquiring phage resistance of MRSA by bacteriophage ( ⁇ SA012).

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Abstract

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対する抗菌薬の薬剤感受性を向上させるための組成物は、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３で特定されるバクテリオファージ及び受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４で特定されるバクテリオファージからなる群から選択される少なくとも１のバクテリオファージを含有する。

Description

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対する抗菌薬の薬剤感受性を向上させるための組成物、ＭＲＳＡ感染症を治療又は予防するための組成物及びＭＲＳＡの病原性を低下させるための組成物
　本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対する抗菌薬の薬剤感受性を向上させるための組成物、ＭＲＳＡ感染症を治療又は予防するための組成物及びＭＲＳＡの病原性を低下させるための組成物に関する。
　近年、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）による感染症例は国内外を問わず急速に増加し、ＭＲＳＡは臨床上、重篤な感染症の起因菌として問題になっており、その治療剤の検討がなされている。
　バクテリオファージは、細菌に感染するウイルスの総称であり、宿主である細菌に感染すると細菌内で増殖する。増殖した娘ファージは、細菌の細胞壁から菌体外に放出され、細菌は溶菌により死滅する。また、バクテリオファージは、宿主となる病原菌以外の細菌叢に影響を与えないこと、増殖が簡単であり大量のバクテリオファージを安価に調製できる等の利点がある。
　そこで、バクテリオファージを細菌の殺菌剤等に利用するという取り組みもなされており、バクテリオファージを利用したスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の殺菌に関する研究結果もいくつか報告されている。
　特許文献１において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを溶菌させる性質を有するバクテリオファージとして、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３及び受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４にて各々特定されるバクテリオファージが、本発明者らによって見出され、報告されている。
　また、非特許文献１において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対して、抗菌薬単独よりも、ファージであるＰＹＯＳａに続く抗菌薬の適用が有効である可能性が示唆されている。
特開２０１１－５０３７３号公報
Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．２０２１　Ｍａｒ　９；１１８（１０）：ｅ２００８００７１１８．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．２００８００７１１８．Ｂｒａｎｄｏｎ　Ａ　Ｂｅｒｒｙｈｉｌｌ　ｅｔ　ａｌ，Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｅｆｆｉｃａｃｙ　ａｎｄ　ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ａ　ｐｈａｇｅ　ｆｏｒ　ｊｏｉｎｔ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ａｎｄ　ｐｈａｇｅ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｏｆ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ
　ＭＲＳＡ感染症の治療方法の模索が続く中、市中感染型のＭＲＳＡが増加傾向を示し、海外では家畜関連型のＭＲＳＡが問題となるなど、ＭＲＳＡ感染症の多様化が進んでいる。このような状況下、ＭＲＳＡ感染症の個々の症例に適した治療ストラテジーがより強く求められるようになっており、ＭＲＳＡに対する新たな対応方法の開発が待たれている状況にあった。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、特定のバクテリオファージを含有することで、ＭＲＳＡに対する抗菌薬の薬剤感受性を向上させることのできる組成物、ＭＲＳＡ感染症を治療又は予防するための組成物及びＭＲＳＡの病原性を低下させるための組成物を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対する抗菌薬の薬剤感受性を向上させるための組成物は、
　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３で特定されるバクテリオファージ及び受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４で特定されるバクテリオファージからなる群から選択される少なくとも１のバクテリオファージを含有する。
　例えば、ＭＲＳＡに、前記バクテリオファージに対する耐性を獲得させることにより、前記薬剤感受性を向上させる。
　例えば、前記抗菌薬は、βラクタム系抗菌薬である。
　本発明の第２の観点に係るＭＲＳＡ感染症を治療又は予防するための組成物は、
　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３で特定されるバクテリオファージ及び受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４で特定されるバクテリオファージからなる群から選択される少なくとも１のバクテリオファージと、抗菌薬と、を含有する。
　例えば、ＭＲＳＡに、前記バクテリオファージに対する耐性を獲得させる。
　例えば、前記抗菌薬は、βラクタム系抗菌薬である。
　本発明の第３の観点に係るＭＲＳＡの病原性を低下させるための組成物は、
　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３で特定されるバクテリオファージ及び受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４で特定されるバクテリオファージからなる群から選択される少なくとも１のバクテリオファージを含有する。
　例えば、ＭＲＳＡに、前記バクテリオファージに対する耐性を獲得させることにより、前記病原性を低下させる。
　本発明によれば、特定のバクテリオファージを含有することで、ＭＲＳＡに対する抗菌薬の薬剤感受性を向上させることのできる組成物、ＭＲＳＡ感染症を治療又は予防するための組成物及びＭＲＳＡの病原性を低下させるための組成物を提供することができる。
（ａ）はφＳＡ０１２耐性ＭＲＳＡ（変異体：ＳＡｍ１－２０１、ＳＡｍ１－１０６）におけるファージの感染性を検証したグラフ図であり、（ｂ）は上記について示した写真図である。 ＭＲＳＡ野生株におけるファージ（φＳＡ０１２）による増殖抑制効果を検証したグラフ図である。 φＳＡ０１２耐性ＭＲＳＡ（変異体：ＳＡｍ１－１０６）におけるファージ（φＳＡ０１２）による増殖抑制効果を検証したグラフ図である。 φＳＡ０１２耐性ＭＲＳＡ（変異体：ＳＡｍ１－２０１）におけるファージ（φＳＡ０１２）による増殖抑制効果を検証したグラフ図である。 ＭＲＳＡの野生株にファージ及び抗菌薬（オキサシリン）の両方を試験開始時から添加して、増殖抑制効果を検証したグラフ図である。 ＭＲＳＡ変異体において、病原性に関連する遺伝子の発現変動について検証したグラフ図である。 ＭＲＳＡ変異体において、薬剤排出ポンプに関連する遺伝子の発現変動について検証したグラフ図である。 （ａ）はメス８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに野生株（ＭＲＳＡ２００７－１３株）又はファージ変異体（ファージ耐性菌ＭＲＳＡ２００７－１３　ＳＡｍ１－２０１）を腹腔内投与したときの生存率を示すグラフ図であり、（ｂ）はメス８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに野生株（ＭＲＳＡ２００７－１３株）を皮下投与し、７日後の病変部の肉眼所見を示す写真図であり、（ｃ）はファージ変異体（ＳＡｍ１－２０１）を皮下投与し、７日後の病変部の肉眼所見を示す写真図であり、（ｄ）は投与後７日間にわたる膿瘍サイズの推移（平均値±ＳＥ）を示すグラフ図であり、（ｅ）は投与７日後のマウスの病変部組織中の菌数をＬＢ　ａｇａｒを用いて評価したグラフ図（各群１頭（ｎ＝１））である。
（１．ＭＲＳＡに対する抗菌薬の薬剤感受性を向上させるための組成物）
　本発明の組成物は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ：ＭＲＳＡ）に対する抗菌薬の薬剤感受性を向上させるための組成物である。該組成物は、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３で特定されるバクテリオファージ及び受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４で特定されるバクテリオファージからなる群から選択される少なくとも１のバクテリオファージを含有する。
　本発明の組成物の有効成分となるバクテリオファージの一方は、２００８年１２月２５日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジー本部　特許微生物寄託センター（郵便番号　２９２－０８１８、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に、受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３として寄託してあるバクテリオファージである。なお、本発明者等は、このバクテリオファージを「φＳＡ０１２」と命名した。
　本発明の組成物の有効成分となるバクテリオファージの他方は、２００８年１２月２５日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジー本部　特許微生物寄託センター（郵便番号　２９２－０８１８、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に、受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４として寄託してあるバクテリオファージである。本発明者等は、このバクテリオファージを「φＳＡ０３９」と命名した。
　透過型電子顕微鏡を用いた観察で、φＳＡ０１２及びφＳＡ０３９は、ともにＴ４ファージと同程度の大きさで、かつ若干長いことが知られた。また、φＳＡ０１２及びφＳＡ０３９は、収縮性のシース（ｓｈｅａｔｈ）を持つことから、ミオビリデ科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ　ｆａｍｉｌｙ）に属するものと推察される。本発明に係るバクテリオファージのその他の構造及び性質については、特開２０１１－５０３７３号公報の記載が参照される。
　本発明に係るバクテリオファージは、これらが寄託されている上記寄託機関に分譲請求を行なうことにより、入手することができる。また、一般家庭の下水流水や下水処理施設から採取した排水等、あるいはＳ．ａｕｒｅｕｓに感染した動物由来の血液、鼻腔、咽頭、皮膚、腸管等の生体試料から、例えば、特開２０１１－５０３７３号公報に記載されているプラークアッセイ・分離方法等の常法により分離・精製することにより、入手することもできる。また、本発明に係るバクテリオファージは、例えば、特開２０１１－５０３７３号公報に記載されているプレートライセート法等の一般的なバクテリオファージの増殖法で増殖させることができる。
　本発明の組成物は、上述のバクテリオファージを含有するものであればよい。例えば、上述した増殖法によって得られるバクテリオファージ溶液、バクテリオファージ溶液を遠心分離等によって培養残渣と分離したもの等が挙げられる。
　本発明の組成物に含有されるバクテリオファージの詳細は、上記したとおりである。また、本発明の組成物に含有されるバクテリオファージは、それぞれ一種類（株、ｓｔｒａｉｎ）でも、φＳＡ０１２とφＳＡ０３９とのバクテリオファージ混合液（ファージカクテル）であってもよい。また、さらに他のバクテリオファージを含んでいてもよい。他のバクテリオファージとしては、特に制限はなく、本発明に係るＭＲＳＡとは異なる細菌（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対するバクテリオファージが挙げられ、溶菌性のみならず、溶原性バクテリオファージであってもよい。
　本発明の組成物中のバクテリオファージの濃度は、特に制限はなく、当業者であればその使用形態により適宜調整することができるが、例えば、液状の剤形にて使用する場合は、１×１０３～１×１０１３ＰＦＵ／ｍＬ（ＰＦＵ：ｐｌａｑｕｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ　プラーク形成単位）とするのが好ましく、１×１０５～１×１０１１ＰＦＵ／ｍＬとするのがより好ましく、１×１０８～１×１０１０ＰＦＵ／ｍＬとするのがさらに好ましい。
　本明細書において、抗菌薬の薬剤感受性が向上したことの判定方法は、例えば、（ｉ）ＭＲＳＡにおける抗菌薬の感受性をディスク法（薬剤感受性試験）で測定した場合の阻止円の直径に比して、本発明に係るバクテリオファージを適用したＭＲＳＡにおける同抗菌薬の同直径が大きい場合に、抗菌薬の薬剤感受性が向上したと判定でき、（ｉｉ）ＭＲＳＡにおける抗菌薬の感受性をＭＩＣ法（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ＭＩＣ、最小発育阻止濃度）（薬剤感受性試験）で測定した場合のＭＩＣ値に比して、本発明に係るバクテリオファージを適用したＭＲＳＡにおける同抗菌薬の同ＭＩＣ値が小さい場合に、抗菌薬の薬剤感受性が向上したと判定できる。
　例えば、ＭＲＳＡに、本発明に係るバクテリオファージに対する耐性を獲得させることにより、抗菌薬の薬剤感受性を向上させてもよい。本明細書において、「耐性を獲得する」とは、ＭＲＳＡが本発明に係るバクテリオファージに対して抵抗性を持ち、ＭＲＳＡに対して該バクテリオファージが効かない（例えば、該バクテリオファージによってＭＲＳＡの増殖が抑制されなくなる）、又は該バクテリオファージが効きにくくなる（例えば、該バクテリオファージによるＭＲＳＡの増殖抑制の程度が低くなる）ことを意味する。バクテリオファージに対する耐性を獲得したことは、例えば、本発明に係るバクテリオファージを適用したＭＲＳＡについて、後述するＥＯＰ（プラーク形成率）又は濁度測定法による増殖活性を測定し、該バクテリオファージを適用する前の増殖活性と比較することで、「耐性を獲得した」ことを判定することができる。また、例えば、遺伝子解析によりｍｇｒＡ、ｆｅｍＡ又はその両方の変異を検出した場合に、「耐性を獲得した」と判定することができる。
　抗菌薬としては、例えば、β―ラクタム系、アミノグリコシド系、リンコマイシン系、ホスホマイシン系、テトラサイクリン系、クロラムフェニコール系、マクロライド系、ケトライド系、ポリペプチド系、グリコペプチド系、ストレプトグラミン系、キノロン系、オキサゾリジノンが挙げられるが、これらに限定されない。
　抗菌薬は、好ましくは、β―ラクタム系抗菌薬である。β―ラクタム系抗菌薬として、例えば、ペニシリン系（ペニシリンＧ、アンピシリン、バカンピシリン、レナンピシリン、シクラシリン、アモキシシリン、ピブメシリン、アスポキシシリン、クロキサシリン、ピペラシリン、メチシリン）；複合ペニシリン系薬（アンピシリン、クロキサシリン）；βラクタマーゼ阻害剤配合ペニシリン系薬（アンピシリン、スルバクタム、クラブラン酸、アモキシシリン、ピペラシリン、タゾバクタム）；セフェム系（セファゾリン、セファロンチン、セファレキシン、セファトリジン、セフロキサジン、セファクロル、セファドロキシル、セフォチアム、セフメタゾール、フロモキセフ、セフミノックス、セフブペラゾン、セフロキシム、アキセチル、セフジニル、セフジトレン、ピボキシル、セフテラム、ピボキシル、セフポドキシム、プロキセチル、セフカペン、ピボキシル、セフォタキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフメノキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフィキシム、セフォジジム、ラタモキセフ、セフチゾキシム、セフピロム、セフォゾプラン、セフェピム）；βラクタマーゼ阻害剤配合セフェム系（セフォペラゾン、スルバクタム）；カルバペネム系（イミペネム、シラスタチン、パニペネム、ベタミプロン、メロペネム、ビアペネム、ドリペネム、テビペネム）；モノバクタム系（アズトレオナム、スルバクタム、タゾバクタム、カルモナム）；ペネム系（ファロペネム）等を挙げることができる。
　本発明の組成物は、例えば、ＭＲＳＡ感染症に罹患した対象、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットを含むげっ歯類、ヒト、チンパンジー、アカゲザルを含む霊長類、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、トリを含む家畜、イヌ、ネコを含む愛玩動物といった哺乳動物に投与される。好ましい対象は、ヒトである。
　本発明の組成物は、常法により、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤等の剤型に調製することができ、適切なドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）が使用されてもよい。また、通常の医薬品中に用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、増粘剤、保存剤、安定化剤、ｐＨ調整剤等を添加することができる。また、該組成物の投与量は、対象者の年齢、体重、適応症状等によって適宜設定することができる。
（２．ＭＲＳＡ感染症を治療又は予防するための組成物）
　本発明によるＭＲＳＡ感染症を治療又は予防するための組成物は、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３で特定されるバクテリオファージ及び受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４で特定されるバクテリオファージからなる群から選択される少なくとも１のバクテリオファージと、抗菌薬と、を含有する。
　本発明の組成物は、本発明に係るバクテリオファージ（前述同様）によってＭＲＳＡの抗菌薬に対する薬剤感受性を向上させることで、該抗菌薬によるＭＲＳＡ感染症の治療又は予防効果を得るものである。
　本明細書において「ＭＲＳＡ感染症」とは、ＭＲＳＡに起因する感染症、例えば、呼吸器感染症、菌血症、感染性心内膜炎、皮膚・軟部組織感染症、腹腔内感染症、骨・関節感染症、中枢神経系感染症、尿路感染症、小児領域感染症等を指す。本発明の組成物は、これらのＭＲＳＡ感染症を治療又は予防するために用いることができ、また、術後感染予防のために用いることもできる。
　本明細書において「ＭＲＳＡ感染症の治療」は、ＭＲＳＡ感染症の進行の遅延又は停止、ＭＲＳＡ感染症の寛解又は一時的寛解、ＭＲＳＡの殺菌・除菌・増殖の抑制等、ＭＲＳＡ感染症の再発の防止等を含む、種々の目的の医学的に許容される治療的介入を包含する。また、本明細書において「ＭＲＳＡ感染症の予防」は、ＭＲＳＡ感染症の発症又は罹患の予防、ＭＲＳＡの感染の予防等を含む、種々の目的の医学的に許容される予防的介入を包含する。
　例えば、ＭＲＳＡに、本発明の組成物の有効成分となるバクテリオファージに対する耐性を獲得させることにより、抗菌薬の薬剤感受性を向上させて、該抗菌薬によるＭＲＳＡ感染症の予防又は治療効果を得てもよい。「耐性を獲得した」との判定方法については、前述同様である。
　抗菌薬については、前述のとおりであるが、例えば、βラクタム系抗菌薬であってもよい。βラクタム系抗菌薬の詳細については前述のとおりである。
　本発明の組成物は、ＭＲＳＡ感染症に罹患した対象、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットを含むげっ歯類、ヒト、チンパンジー、アカゲザルを含む霊長類、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、トリを含む家畜、イヌ、ネコを含む愛玩動物といった哺乳動物に投与される。好ましい対象は、ヒトである。
　本発明の組成物は、常法により、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤等の剤型に調製することができ、適切なドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）が使用されてもよい。また、通常の医薬品中に用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、増粘剤、保存剤、安定化剤、ｐＨ調整剤等を添加することができる。また、該組成物の投与量は、対象者の年齢、体重、適応症状等によって適宜設定することができる。
　本発明の組成物の投与方法について、例えば、（ｉ）本発明に係るバクテリオファージと抗菌薬とを併用する方法（カクテル療法であってもよく、合剤であってもよい）、（ｉｉ）本発明に係るバクテリオファージを投与した後に、抗菌薬を投与する方法等が挙げられる。また、食事中投与、食後投与、食前投与、食間投与、就寝前投与等のいずれも可能である。
　本発明の組成物は、他の薬剤をさらに含んでいてもよく、また併用してもよい。併用する場合、同時に投与してもよく、前後して投与してもよい。「他の薬剤」としては、本発明に係るバクテリオファージの抗菌薬の薬剤感受性を向上させる効果を失わせないようなものであれば特に限定されるものではなく、抗炎症剤、免疫抑制剤、感染症の予防剤、感染症の治療剤、殺虫剤、駆虫剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤等、それぞれの用途に慣用の薬剤を、それぞれ使用する態様に応じて適宜選択して用いることができる。
（３．ＭＲＳＡの病原性を低下させるための組成物）
　本発明によるＭＲＳＡの病原性を低下させるための組成物は、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３で特定されるバクテリオファージ及び受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４で特定されるバクテリオファージからなる群から選択される少なくとも１のバクテリオファージを含有する。
　本発明の組成物は、本発明に係るバクテリオファージ（前述同様）によってＭＲＳＡの病原性を低下させるためのものである。
　本明細書において「ＭＲＳＡの病原性を低下させる」とは、ＭＲＳＡが他の生物に感染して宿主に感染症を起こす性質及び能力を低下させることをいう。病原性の低下については、例えば、本発明に係るバクテリオファージを適用していないＭＲＳＡに比して、該バクテリオファージを適用したＭＲＳＡでは、ＭＲＳＡの病原性に関連する遺伝子（例えば、実施例にて後述するＥｓａＡ、ＥｓａＢ、ＥｓａＣ、ＥｓｓＡ、ＥｓｓＢ、ＥｓｓＣ、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＲＮＡＩＩＩ、ＬｕｋＧＨ　ｓｕｂｕｎｉｔ　Ｈ、ＬｕｋＧＨ　ｓｕｂｕｎｉｔ　Ｇ、ｔｈｅｒｍｏｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１１（ＳＳＬ１１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｋｉｎａｓｅ、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ　ｔｙｐｅ　Ｏ）の発現量が低下した場合に、「ＭＲＳＡの病原性が低下した」と判定することができる。
　例えば、ＭＲＳＡに、前記バクテリオファージに対する耐性を獲得させることにより、前記病原性を低下させてもよい。バクテリオファージに対する耐性を獲得したことは、前述同様の方法で確認することができる。
　本発明の組成物は、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットを含むげっ歯類、ヒト、チンパンジー、アカゲザルを含む霊長類、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、トリを含む家畜、イヌ、ネコを含む愛玩動物といった哺乳動物に投与される。好ましい対象は、ヒトである。
　本発明の組成物は、常法により、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤等の剤型に調製することができ、適切なドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）が使用されてもよい。また、通常の医薬品中に用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、増粘剤、保存剤、安定化剤、ｐＨ調整剤等を添加することができる。また、該組成物の投与量は、対象者の年齢、体重、適応症状等によって適宜設定することができる。
（４．小括）
　以上説明したように、本発明に係るバクテリオファージを含有する、ＭＲＳＡに対する抗菌薬の薬剤感受性を向上させる組成物を提供することができる。従前の薬剤では殺菌・除菌・増殖の抑制等の効果が得られなかったＭＲＳＡに対して、本発明の組成物を用いることで、抗菌薬の薬剤感受性を向上させ、その結果、該抗菌薬によるＭＲＳＡに対する殺菌・除菌・増殖の抑制等の効果を発揮させることができる。
　本発明によるＭＲＳＡ感染症を治療又は予防するための組成物は、本発明に係るバクテリオファージによってＭＲＳＡの抗菌薬に対する薬剤感受性を向上させることで、該抗菌薬によるＭＲＳＡ感染症の治療又は予防効果を得ることができる。従前の薬剤では効果の得られなかったＭＲＳＡ感染症に対しても、本発明に係るバクテリオファージによって抗菌薬に対する薬剤感受性を向上させることで、有効な治療又は予防効果を得ることが可能である。
　本発明によるＭＲＳＡの病原性を低下させるための組成物は、本発明に係るバクテリオファージによってＭＲＳＡ自体の病原性を低下させることができ、ひいてはＭＲＳＡ感染症の治療又は予防効果が期待できる。
　なお、本発明は、ＭＲＳＡに対する抗菌薬の薬剤感受性を向上させるための方法、ＭＲＳＡ感染症を治療又は予防するための方法及びＭＲＳＡの病原性を低下させるための方法をも包含し、これらの方法は、各々、ＭＲＳＡに、本発明に係るバクテリオファージに対する耐性を獲得させる工程を含んでいてもよい。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　本発明者らは、従前、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを溶菌させる性質を有するバクテリオファージとして、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３及び受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４にて各々特定されるバクテリオファージ（φＳＡ０１２及びφＳＡ０３９）を単離することに成功している。
　本実施例においては、φＳＡ０１２に関し、以下に示す試験にて、ＭＲＳＡに対する抗菌薬の薬剤感受性向上能及びＭＲＳＡの毒性に関連する遺伝子発現変動について評価した。
（実施例１）
　ファージ耐性化した細菌は、その遺伝子変異を伴う耐性化により本来の機能が変化（消失）することが知られている（トレードオフ）。そこで、ファージ耐性（φＳＡ０１２耐性）ＭＲＳＡにおける遺伝子変異を調査した。
　以下のとおりφＳＡ０１２耐性ＭＲＳＡ（φＳＡ０１２ｍｔｓ）を得た。ＬＢ液体培地４ｍＬにＭＲＳＡ２００７－１３株（ＧＣＡ＿０１８４０９１４５．１）菌液４０μＬ及びφＳＡ０１２（１０９ＰＦＵ／ｍＬ）４０μＬを混合し、３７℃で６日間振盪培養した。その後、遠心分離して菌体を回収し、ＰＢＳ　１ｍＬで洗浄を行い、ＬＢ寒天培地に画線塗抹した。３７℃で一晩培養後、培地上に形成された単一コロニーを採取し、３ｍＬのＬＢ－Ｂｒｏｔｈに加えて３７℃で一晩振盪培養し、クローニングを行った。クローニングされた菌株を、軟寒天ＬＢ培地を用いたスポットテスト及びプレートリーダーを用いた経時的濁度測定法にて検証し、φＳＡ０１２の溶菌活性が見られなかった菌株を変異株として使用した。
　以下に変異体における変異解析手法について示す。変異体ＳＡｍ１－２０１をゲノム抽出し、次世代シーケンサーを用いてゲノム解析を実施した。ＳＡｍ１－２０１をＬＢ－Ｂｒｏｔｈ中で前培養し、ＧｅｎＥｌｕｔｅ（登録商標）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてゲノム抽出を行った（製品説明書に従って実施）。ゲノム解析は株式会社生物技研に委託し、次世代シーケンサーＤＮＢＳＥＱ－Ｇ４００を用いて２×２００ｂｐの条件でシーケンシング解析を実施した。Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（ｖｅｒ．０．３９）を用いてアダプター配列及び低品質リードを除去した後、ＣＬＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ　２０を用いてリファレンス配列へのマッピング及び変異検出を実施した。その結果、一塩基多型としてｍｇｒＡとｆｅｍＡの変異が検出されたため、この２遺伝子の変異について、さらに調査する変異体を拡大し、コロニーＰＣＲを実施し、その後サンガー法シーケンシングにより複数の変異体のｍｇｒＡ及びｆｅｍＡの塩基配列を決定した。ＬＢ寒天培地に変異体菌液を画線塗抹して３７℃一晩培養後、単一コロニーを採取しＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応に用いたプライマーを以下に示す。
・ｆｅｍＡ（Ｆｏｒｗａｒｄ）：ＣＡＡＡＧＣＣＡＴＣＡＴＴＣＴＣＡＣＧＧＧ（配列番号１）
・ｆｅｍＡ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：ＣＡＧＡＧＧＧＧＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＧＣ（配列番号２）
・ｍｇｒＡ（Ｆｏｒｗａｒｄ）：ＧＣＴＣＡＡＡＧＡＣＡＡＧＴＴＡＡＴＣＧＣＴ（配列番号３）
・ｍｇｒＡ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：ＡＴＣＡＡＡＴＧＣＡＴＧＡＡＴＧＡＣＴＴＴＡＣＣＴ（配列番号４）
　得られたＰＣＲ産物はＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（日本ジェネティクス株式会社）を用いて精製した（製品説明書に従って実施）。サンガー法シーケンシングは北海道システム・サイエンス株式会社に委託した
　以下に得られた変異体の情報を示す。全ての変異体においてｍｇｒＡの変異がみられ（２２／２２：１００％）、また併せてｆｅｍＡの変異を持つものが約７割でみられた（１６／２２：７３％）（表１）。ｍｇｒＡは、約３５０もの数の遺伝子発現を調節することが知られている。また、ｆｅｍＡは細菌の外壁であるペプチドグリカンを合成する酵素で、この変異によりペプチドグリカンの構造が大きく変化することが予測される。なお、表１の変異体名の下３桁の番号について、１００番台はｍｇｒＡのみの変異を持つものを表し、２００番台はｍｇｒＡ及びｆｅｍＡの２つの変異を同時に持つことを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　次に、上記で得られたφＳＡ０１２耐性ＭＲＳＡ（変異体：ＳＡｍ１－２０１、ＳＡｍ１－１０６）におけるファージの感染性を確認した。
　試験方法を以下に示す。前培養していた各被験菌液（ＳＡｍ１－２０１、ＳＡｍ１－１０６）１００μＬを３ｍＬのＬＢ－Ｔｏｐ　Ａｇａｒに加え、ＬＢ－Ａｇａｒ上に播種した。その上に１×１０２ｐｆｕ／ｍＬから１×１０８ｐｆｕ／ｍＬに段階希釈したファージ液（φＳＡ０１２）及びＳＭ－Ｂｕｆｆｅｒ（ネガティブコントロール）を４μＬずつ滴下し、３７℃で一晩培養した。翌日、ファージの溶菌活性により形成されるプラーク数について、変異株（ＳＡｍ１－２０１、ＳＡｍ１－１０６）と、基準となる菌株（野生株：ＭＲＳＡ２００７－１３株）と、でそれぞれカウントし、以下の計算式に基づいてＥＯＰ（Ｅｆｆｉｃａｃｙ　ｏｆ　ｐｌａｔｉｎｇ：プラーク形成率）を算出した。
　ＥＯＰ＝被検菌株のファージ力価／基準菌株のファージ力価
　結果を図１に示す。野生株（図１において「ｗｔ」）ではφＳＡ０１２の添加によりプラークが形成され、φＳＡ０１２の感染が確認された。一方で、変異株（ＳＡｍ１－２０１、ＳＡｍ１－１０６）ではφＳＡ０１２によるプラーク形成能は観察されず、φＳＡ０１２が感染しないことが示された（図１（ａ））。なお、図１（ｂ）に野生株（図１（ｂ）において「ＷＴ」）及び変異株（ＳＡｍ１－２０１、ＳＡｍ１－１０６）の溶菌の様子を写真図で示す。ＳＡｍ１－２０１では全く溶菌が見られず、ＳＡｍ１－１０６では１０８ｐｆｕ／ｍＬ（又は１０７ｐｆｕ／ｍＬ）においてｔｕｒｂｉｄと呼ばれるレベルの溶菌斑が観察されたが、明瞭なプラークは確認できなかった（図１（ｂ））。したがって、いずれの変異株においても、φＳＡ０１２による溶菌は見られず、変異株ではたしかにφＳＡ０１２が感染しないことを確認した。
　次に、上記で得られたφＳＡ０１２耐性ＭＲＳＡ（変異体：ＳＡｍ１－２０１、ＳＡｍ１－１０６）におけるファージ（φＳＡ０１２）による増殖抑制効果を検証した。
　試験方法を以下に示す。本試験は、濁度測定法により行った。濁度測定法によって、ファージの感染性と細菌増殖との関係をリアルタイムに測定することが可能である。濁度測定法の具体的方法を説明する。９６ウェルプレートを用いて、φＳＡ０１２非存在下（ｃｏｎｔｒｏｌ）又はφＳＡ０１２存在下における野生株（ＭＲＳＡ２００７－１３株）又は変異体（ＳＡｍ１－２０１、ＳＡｍ１－１０６）の増殖活性を、経時的濁度測定方法により測定した。一晩前培養した菌液（野生株（ＭＲＳＡ２００７－１３株）又は変異体（ＳＡｍ１－２０１、ＳＡｍ１－１０６））をＯＤ６００≒１．０になるようにＬＢ－Ｂｒｏｔｈで希釈し、それをさらに１０倍希釈した。１ウェルにつき、該菌液９０μＬとφＳＡ０１２（１×１０８ｐｆｕ／ｍＬ）１０μＬを加えた。プレートをサンライズレインボーサーモＲＣ（テカンジャパン社）にセットし、波長５９０ｎｍでの吸光値を１５分毎に測定しながら３７℃で２４時間振とう培養し、増殖活性を評価した。
　結果を図２～４に示す。図２～４において、縦軸は濁度、横軸は時間（ｈ）を表し、グレーのグラフ線がファージ無し、黒色のグラフ線がファージ有りの細菌増殖を示す。野生株（ＭＲＳＡ２００７－１３株）では、φＳＡ０１２によりすぐに溶菌され、細菌増殖を示す濁度の上昇が見られず、ファージにより細菌増殖が抑制されていることが確認された（図２）。一方、ｍｇｒＡに変異が１つある変異体（ＳＡｍ１－１０６）では、φＳＡ０１２による細菌増殖の抑制の程度が弱まり、濁度の上昇が初期に見られた（図３）。さらにｍｇｒＡとｆｅｍＡの両方に変異を持つ変異体（ＳＡｍ１－２０１）においては、野生株と同様の増殖を示し、ファージによる細菌増殖抑制がなく、細菌がファージに耐性化していることが確認された（図４）。以上より、変異体ではたしかにファージ（φＳＡ０１２）による細菌増殖抑制効果が得られないことが確認され、特に、ｍｇｒＡとｆｅｍＡの両方の変異を持つ変異株では、ＭＲＳＡのファージ耐性化が強くなったことが明らかとなった。
（実施例２）
　ファージ耐性化したＭＲＳＡにおいて、トレードオフにより薬剤感受性が変化することが予想された。そこで、ファージ耐性化に伴う薬剤感受性の変化について検証した。
　野生株（ＭＲＳＡ２００７－１３株）及び変異体（ＳＡｍ１－２０１）におけるβラクタム系抗菌薬の薬剤感受性を、薬剤感受性試験（ディスク法）によって測定した。試験方法を説明する。野生株（ＭＲＳＡ２００７－１３株）又は変異体（ＳＡｍ１－２０１）をＬＢ－Ａｇａｒに画線塗抹し、３７℃で一晩培養した。翌日、単一コロニーを採取し、５ｍＬのトリプチケースソイブイヨンに加え、３７℃で一晩振とう培養した。培養後、マクファーランド濁度Ｎｏ．０．５に菌液を調製し、滅菌綿棒を用いてミューラー・ヒントンＩＩ寒天培地に均等に塗抹した。この寒天培地上に感受性ディスクを配置した後、３７℃で２４時間培養し、ディスク周辺に形成される阻止円直径をミリメートル単位で測定した。
　表２において、βラクタム系抗菌薬の表記は、以下のとおりである。
　ＭＰＩＰＣ：オキサシリン
　ＡＭＰＣ：アモキシリン
　ＣＥＸ：セファレキシン
　ＣＰＤＸ：セフポドキシム
　ＦＲＰＭ：ファロペネム
　ＩＰＭ：イミペネム
　ＭＥＰＭ：メロペネム
　結果を表２に示す。野生株（表２において「ＷＴ」）では、いずれのβラクタム系抗菌薬に対しても耐性（Ｒ）を示した。一方で、変異体（ＳＡｍ１－２０１）では、βラクタム系抗菌薬に対して感受性（Ｓ）を有することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　次に、野生株（ＭＲＳＡ２００７－１３株）及びｍｇｒＡとｆｅｍＡの両方の変異を持つ変異株（ＳＡｍ１－２０１、ＳＡｍ１－２０６、ＳＡｍ１－２１０）における抗菌薬の薬剤感受性を、薬剤感受性試験（ＭＩＣ法）にて測定した。試験方法を説明する。一晩前培養した菌液（野生株又は変異体）をＯＤ６００≒０．２６になるように滅菌生理食塩水で希釈したのち、１２ｍＬのミューラー・ヒントン液体培地（栄研化学社）に２５μＬ加えた。ドライプレート（栄研化学社）を用いて、１ウェルにつき菌液１００μＬを加え、２０時間培養した。培養後、ドライプレートの判定基準に基づき、ＭＩＣを判定した。
　表３において、抗菌薬の表記は、以下のとおりである。
　ＡＭＰＣ：アモキシリン
　ＣＥＺ：セファゾリン
　ＭＰＩＰＣ：オキサシリン
　ＰＣＧ：ペニシリン
　Ｓ／Ａ：スルバクタム／アンピシリン
　ＣＤＴＲ：セフジトレン
　ＣＦＰＮ：セフカペン
　ＦＲＰＭ：ファロペネム
　ＭＥＰＭ：メロペネム
　ＩＰＭ：イミペネム
　ＯＴＣ：オキシテトラサイクリン
　ＤＯＸＹ：ドキシサイクリン
　ＥＲＦＸ：エンロフロキサシン
　結果を表３に示す。ＭＩＣ法では、薬剤の必要量が少なくなる（ＭＩＣ値が低くなる）ほど、薬剤感受性が高くなると評価される。野生株（表３において「ＷＴ」）に比してｍｇｒＡの変異とｆｅｍＡの両方の変異を持つ変異体では、抗菌薬の薬剤感受性が４倍～１０００倍以上高くなった。特に、ＣＥＺ（セファゾリン）では、「ＷＴ：＞１２８」に対して「ＳＡｍ１－２０１：０．１２５」となり、野生株に比して変異株で飛躍的に抗菌薬の薬剤感受性が向上していることが確認された。既報では、メチシリン感受性の黄色ブドウ球菌において、ｆｅｍＡ変異によってオキサシリンに対する感受性が高くなる報告があるが（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．２０２１　Ｍａｒ　９；１１８（１０）：ｅ２００８００７１１８．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．２００８００７１１８．）、ＭＲＳＡにおいて抗菌薬の感受性が大幅に改善される報告は、本結果が初めてである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　以上より、バクテリオファージ（φＳＡ０１２）によってＭＲＳＡのファージ耐性を獲得させることにより、βラクタム系を始めとする抗菌薬の薬剤感受性を向上させることが示された。
（実施例３）
　ファージの耐性化によって抗菌薬の感受性の変化を引き起こすことが明らかとなったため、次に、ＭＲＳＡの野生株にファージ及び抗菌薬（オキサシリン）の両方を試験開始時から添加して、増殖抑制効果を検証した。
　試験方法を以下に示す。本試験は、濁度測定法により行った。一晩前培養した菌液（野生株（ＭＲＳＡ２００７－１３株）をＯＤ６００≒１．０になるようにＬＢ－Ｂｒｏｔｈで希釈し、それをさらに１０倍希釈した（≒１．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬ）。各群を、以下のように設定した。
　・Ｃｏｎｔｒｏｌ：菌９０μＬ＋ＳＭ　ｂｕｆｆｅｒ　１０μＬ
　・ｐｈｉ：菌９０μＬ＋φＳＡ０１２　１０μＬ（終濃度≒１．０×１０７ｐｆｕ／ｍ（ＭＯＩ≒０．１））
　・Ａｂｘ：菌９９μＬ＋オキサシリンナトリウム１ｍＬ（終濃度１６μｇ／ｍＬ）
　・ｐｈｉ＋Ａｂｘ：菌８９μＬ＋ｐｈａｇｅ　１０μＬ（終濃度≒１．０×１０７ｐｆｕ／ｍ（ＭＯＩ≒０．１））＋オキサシリンナトリウム１μＬ（終濃度１６μｇ／ｍＬ）
　プレートをサンライズレインボーサーモＲＣ（テカンジャパン社）にセットし、３７℃で９０時間振とう培養しながら波長５９０ｎｍでの吸光値を１５分毎に測定した。
　結果を図５に示す。抗菌薬のみ（Ａｂｘ：グレーの実線）では、細菌増殖を抑制はできなかった。また、ファージ（φＳＡ０１２）のみ（ｐｈｉ：グレーの波線）では、細菌増殖はある程度抑えられたが、培養開始後４０時間以降で細菌の再増殖が確認された。一方で、ファージ（φＳＡ０１２）とオキサシリンとを加えた群（ｐｈｉ＋Ａｂｘ：黒色の破線）では、細菌増殖を培養開始後９０時間まで抑制できており、細菌の再増殖は９０時間の間観察されなかった。
　以上より、ファージ（φＳＡ０１２）と抗菌薬のカクテル化によって、ＭＲＳＡの抗菌薬への感受性が向上し、ＭＲＳＡの増殖を確実に抑制できることが示された。
（実施例４）
　ファージ耐性（φＳＡ０１２耐性）ＭＲＳＡ株においてｍｇｒＡに１００％変異が入ることから、ｍｇｒＡ変異による遺伝子発現変動をＲＮＡ－ｓｅｑ解析により検証した。
　以下にＲＮＡ抽出及びＲＮＡ－ｓｅｑ解析の方法について示す。ＬＢ－Ｂｒｏｔｈにて野生株（ＭＲＳＡ２００７－１３株）及びファージ変異体（ＳＡｍ１－２０１）をＯＤ６００≒１．０になるまで培養する。菌液１ｍＬを遠心分離してペレットとしたのち、ＴＲＩｚｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１ｍＬで懸濁し、Ｚｉｒｃｏｎｉａ　ｂｅａｄｓ　５００μＬを加えて破砕機にて菌体を破壊する。破砕後、遠心分離して上清を回収し、クロロホルム及びエタノールを用いてＲＮＡ分画を抽出する。ライブラリー調整及びＲＮＡ－ｓｅｑ解析は株式会社Ｒｈｅｌｉｘａに委託した。Ｒｉｂｏ－Ｚｅｒｏ　Ｐｌｕｓ　ｒＲＮＡ　Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ　Ｋｉｔ及びＮＥＢＮｅｘｔ　Ｕｌｔｒａ　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ＲＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｉｌｌｕｍｉｎａを用いてライブラリーを作成し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ　ＮｏｖａＳｅｑ　６０００を用いて１５０ｂｐ×２の条件でシーケンシング解析を行なった。Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（ｖｅｒ．０．３９）を用いてアダプター配列及び低品質リードを除去したのち、ＨＩＳＡＴ２（ｖｅｒ．２．１．０）を用いてリファレンス配列に対してマッピングした。ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ（ｖｅｒ．２．０．１）を用いて遺伝子ごとにリードカウントした後、ＴＣＣ－ＧＵＩを用いてＴＭＭ正規化し、発現変動遺伝子を検出した。
　既報によるとｍｇｒＡは転写調節因子として病原性に関わる遺伝子や薬剤排出ポンプに関わる遺伝子など３５０程度の遺伝子を調節していると言われている。そこで、ファージ耐性化の結果として起こるｍｇｒＡ変異による遺伝子発現変動について検証した。
　結果を図６に示す。φＳＡ０１２耐性ＭＲＳＡ（ＳＡｍ１－２０１）では、野生株（ＭＲＳＡ２００７－１３株）に比して、病原性に関わる１５種類の遺伝子発現量が、２分の１～１０分の１程度まで低下していることが示された。以下、各遺伝子について説明する。本結果により、ファージ耐性化したＭＲＳＡでは、病原性が低下することが示唆された。つまり、バクテリオファージ（φＳＡ０１２）によってＭＲＳＡのファージ耐性を獲得させることにより、ＭＲＳＡの病原性を低下させることが示された。
＜ＥｓａＡ、ＥｓａＢ、ＥｓａＣ、ＥｓｓＡ、ＥｓｓＢ、ＥｓｓＣ、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ＞
　Ｔ７ＳＳは４つの膜タンパク質（ＥｓａＡ、ＥｓｓＡ、ＥｓｓＢ、ＥｓｓＣ）、２つの細胞内タンパク質（ＥｓａＢ、ＥｓａＧ）、５つの分泌基質（ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＥｓｘＣ、ＥｓｘＤ、ＥｓａＤ）、分泌基質と相互作用するＥｓａＥから構成される。Ｔ７ＳＳは黄色ブドウ球菌の病原性を担う重要な役割を持つ。Ｔ７ＳＳの全てまたは特定の因子（ＥｓｘＡ、ＥｓｓＢ、ＥｓｓＣ、ＥｓｘＣ、ＥｓｘＢ、ＥｓａＢ、ＥｓａＤ、ＥｓａＥ）を欠損させると、マウス感染モデルにおいて病原性が低下するとの報告がある。
＜ＲＮＡＩＩＩ＞
　自分と同種の菌の生息密度を感知して、それに応じて物質の産生をコントロールする機構をクオラムセンシングという。黄色ブドウ球菌の病原性因子のうちいくつかはＡｃｃｅｓｓｏｒｙ　ｇｅｎｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ（Ａｇｒ）制御系と呼ばれるクオラムセンシングによって制御されている。クオラムセンシングによってＡｇｒ系が活性化されるとＲＮＡＩＩＩが転写され、このＲＮＡＩＩＩが直接または間接的に病原性因子の転写・発現を調節している。
＜ＬｕｋＧＨ　ｓｕｂｕｎｉｔ　Ｈ、ＬｕｋＧＨ　ｓｕｂｕｎｉｔ　Ｇ＞
　ＬｕｋＧＨはＬｕｋＡＢとも呼ばれるロイコシジンの１種である。ロイコシジンは好中球などの白血球に孔を形成し破壊する毒素成分である。
＜ｔｈｅｒｍｏｎｕｃｌｅａｓｅ＞
　Ｔｈｅｒｍｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ｎｕｃ）は細胞外に分泌され、細胞外に存在するＤＮＡを分解することができる。特に黄色ブドウ球菌に対して好中球は自滅し、自身のＤＮＡを放出することで菌体を捕捉することが知られている（ＮＥＴｓ：ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｔｒａｐｓ）。ＴｈｅｒｍｏｎｕｃｌｅａｓｅはＮＥＴｓ対して作用し、その補足から逃れることを助ける。
＜Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１１（ＳＳＬ１１）＞
　ＳＳＬは黄色ブドウ球菌のスーパー抗原に構造が類似しているタンパク質である。ＳＳＬ１１は好中球の活性化や血管壁へのローリングを抑制することで免疫を抑制する。さらに細胞接着や運動性を阻害することも知られている。
＜Ｓｔａｐｈｙｌｏｋｉｎａｓｅ＞
　Ｓｔａｐｈｙｌｏｋｉｎａｓｅ（ｓａｋ）はプラスミノーゲン、及び好中球から分泌されるα－ディフェンシン（α－ｄｅｆｅｎｃｉｎ）と結合することが知られている。Ｓａｋがプラスミノーゲンと結合するとプラスミンとなり活性化する。プラスミンは広域のタンパク分解酵素として働き、黄色ブドウ球菌が周囲組織に侵入するのに寄与する。また、抗菌ペプチドであるα－ディフェンシンはｓａｋと結合するとその作用が不活化され、黄色ブドウ球菌は生存することができる。また、ｓａｋの遺伝子発現はクオラムセンシングであるＡｇｒ系によって正に制御されていることが知られている。
＜ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ　ｔｙｐｅ　Ｏ＞
　ＳＥＯは黄色ブドウ球菌が分泌するエントロトキシンの１種で接種すると嘔吐を引き起こすことが知られている。またインフラマソーム経路を介して好中球からのＩＬ－１βの分泌を誘導することが知られている。
　また、薬剤排出ポンプに関連する遺伝子であるＮｏｒＢ及びＴｅｔの発現変動について、上記同様のＲＮＡ－ｓｅｑ解析により検証した。ＮｏｒＢ及びＴｅｔは、薬剤排出ポンプに関与する遺伝子であり、多剤耐性化を引き起こす原因遺伝子である。これらの遺伝子の発現が低下すると、細菌における抗菌薬の排出が阻害されるため、抗菌薬の感受性が向上する。
　結果を図７に示す。φＳＡ０１２耐性ＭＲＳＡ（ＳＡｍ１－２０１）では、野生株（ＭＲＳＡ２００７－１３ＷＴ）に比して、薬剤排出ポンプに関与するＮｏｒＢ及びＴｅｔの発現量が５分の１以下に低下することが明らかとなった。したがって、ファージ（φＳＡ０１２）によるＭＲＳＡに対する抗菌薬の薬剤感受性向上の作用機序の一つとして、薬剤排出ポンプに関与する遺伝子の発現低下が考えられた。特に、ＮｏｒＢの発現低下によりニューキノロン系抗菌薬（ＥＲＦＸ等）の感受性が向上し、Ｔｅｔの発現低下によりテトラサイクリン系抗菌薬（ＯＴＣ等）の感受性が向上する可能性が示唆された。つまり、バクテリオファージ（φＳＡ０１２）によってＭＲＳＡのファージ耐性を獲得させることにより、抗菌薬の薬剤感受性を向上させることが示された。
（実施例５）
　ｍｇｒＡ変異を有するファージ耐性菌ＭＲＳＡ２００７－１３　ＳＡｍ１－２０１株のＲＮＡ－ｓｅｑ解析の結果より、様々な病原性遺伝子の発現量低下が認められた（実施例４）ため、ＭＲＳＡ感染症モデルマウスを用いてファージ耐性菌の病原性を評価した。
（マウス腹膜炎モデルを用いた病原性評価）
　野生株（ＭＲＳＡ２００７－１３株）及びファージ変異体（ファージ耐性菌ＭＲＳＡ２００７－１３　ＳＡｍ１－２０１）を一晩、前培養した菌液を、新しいＬＢ　ｂｒｏｔｈに加え、ＯＤ６００≒１．０になるまで３７℃で振とう培養した。菌液を遠心分離（８，０００×ｇ、４℃、５分）して、１．０×１０１０ＣＦＵ／ｍＬとなるようにＰＢＳでペレットを懸濁した。８週齢メスＢＡＬＢ／ｃマウス（三協ラボサービス、東京、日本）に、菌液１００μＬを腹腔内投与し（１．０×１０９ＣＦＵ／ｈｅａｄ）、投与後４８時間まで１２時間おきに生存確認を行った。本動物実験は本学動物実験委員会の承認を受け、実施した（承認番号：ＶＨ２１Ａ１３）。各群８頭（ｎ＝８）で試験を実施し、ログランク検定にてｐ＜０．０５の時に有意差ありとした。
（マウス皮膚膿瘍モデルによる病原性評価）
　野生株（ＭＲＳＡ２００７－１３株）及びファージ変異体（ファージ耐性菌ＭＲＳＡ２００７－１３　ＳＡｍ１－２０１）を一晩、前培養した菌液を、新しいＬＢ　ｂｒｏｔｈに加え、ＯＤ６００≒１．０になるまで３７℃で振とう培養した。菌液を遠心分離（８，０００×ｇ、４℃、５分）して、２．０×１０９ＣＦＵ／ｍＬとなるようにＰＢＳでペレットを懸濁した。８週齢メスＢＡＬＢ／ｃマウス（三協ラボサービス、東京、日本）に、３種混合麻酔（０．７５ｍｇ／ｋｇ　メデトミジン、４ｍｇ／ｋｇ　ミダゾラム、５ｍｇ／ｋｇ　ブトルファノール）を腹腔内投与し、麻酔下にて両脇腹から大腿部分をバリカンにて剃毛し、７０％アルコールで皮膚表面を消毒した。その後、菌液５０μＬを両脇腹～大腿部付近に皮下投与（１．０×１０８ＣＦＵ／ｓｉｔｅ）した後、０．７５ｍｇ／ｋｇアチパメゾールで覚醒させた。投与後は１日１回、膿瘍サイズを測定（長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）＝ｍｍ２）した。投与後７日目に麻酔処置をしてマウスを安楽殺し、膿瘍サイズを測定するとともに、病変部を写真撮影した。また、病変部の菌数を測定するため、病変部を採取して細切し、ＰＢＳ　２００μＬとφ５ｍｍ　ジルコニアボールを入れ、組織を破砕してライセートを作製し、平板希釈法を用いて菌数を測定した。本動物実験は本学動物実験委員会の承認を受け、実施した（承認番号：ＶＨ２１Ａ１３）。
　マウス腹膜炎モデルを用いた病原性評価の結果を図８（ａ）に示す。野生株（ＭＲＳＡ２００７－１３株）を腹腔内投与したマウスは、２４時間以内に全頭死亡した（図８（ａ）：黒線）。一方で、ファージ変異体（ＳＡｍ１－２０１）を投与したマウスの４８時間生存率は、５０％であった（図８（ａ）：グレー線）。本結果により、ファージ耐性化したＭＲＳＡでは、病原性が低下し、マウスの生存率が大幅に上がることが示された。
　マウス皮膚膿瘍モデルを用いた病原性評価の結果を図８（ｂ）～（ｅ）に示す。なお、野生株（ＭＲＳＡ２００７－１３株）を投与したマウス３頭のうち、１頭は投与２日後に敗血症様症状のため死亡し、もう１頭は観察期間中を通し左右の病変部が交連し、それぞれの膿瘍サイズの測定ができなかった。野生株（ＭＲＳＡ２００７－１３株）を投与したマウスでは、広範囲にわたって腫瘍が認められた（図８（ｂ））一方で、ファージ変異体（ＳＡｍ１－２０１）を投与したマウスでは、腫瘍の範囲は限定的で腫瘍サイズが顕著に小さかった（図８（ｃ））。また、投与後７日間にわたる腫瘍サイズの推移をみると、野生株（ＭＲＳＡ２００７－１３株）を投与したマウス（図８（ｄ）：実線）に比して、ファージ変異体（ＳＡｍ１－２０１）を投与したマウス（図８（ｄ）：破線）では腫瘍サイズが顕著に小さいことが示された（図８（ｄ））。また、投与７日後の病変部組織を摘出し、組織中の菌数を測定したところ、野生株（ＭＲＳＡ２００７－１３株）を投与したマウスに比して、ファージ変異体（ＳＡｍ１－２０１）を投与したマウスでは菌数が顕著に少なく、検出された菌数は約１／５０程度であった（図８（ｅ））。
　以上のことより、マウス腹膜炎モデル及びマウス皮膚膿瘍モデルマウスの両方において、ファージ変異体（ＳＡｍ１－２０１）は、野生株（ＭＲＳＡ２００７－１３株）に比較して、マウスへの病原性が低下していることがわかった。つまり、バクテリオファージ（φＳＡ０１２）によってＭＲＳＡのファージ耐性を獲得させることにより、ＭＲＳＡの病原性を低下させることが示された。
　なお、本発明は、本発明の広義の精神及び範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。つまり、本発明の範囲は、実施形態ではなく、請求の範囲によって示される。そして、請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
　本発明は、２０２１年８月２５日に出願された日本国特許出願２０２１－１３７２５２号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０２１－１３７２５２号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
（１）識別の表示：００３＋φＳＡ０１２
（２）受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３
（３）受託日：２００８年１２月２５日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構
（１）識別の表示：００３１＋φＳＡ０３９
（２）受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４
（３）受託日：２００８年１２月２５日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構

Claims (8)

  1. 　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３で特定されるバクテリオファージ及び受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４で特定されるバクテリオファージからなる群から選択される少なくとも１のバクテリオファージを含有する、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対する抗菌薬の薬剤感受性を向上させるための組成物。
  2. 　ＭＲＳＡに、前記バクテリオファージに対する耐性を獲得させることにより、前記薬剤感受性を向上させる、
    　ことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  3. 　前記抗菌薬は、βラクタム系抗菌薬である、
    　ことを特徴とする請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３で特定されるバクテリオファージ及び受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４で特定されるバクテリオファージからなる群から選択される少なくとも１のバクテリオファージと、抗菌薬と、を含有する、ＭＲＳＡ感染症を治療又は予防するための組成物。
  5. 　ＭＲＳＡに、前記バクテリオファージに対する耐性を獲得させる、
    　ことを特徴とする請求項４に記載の組成物。
  6. 　前記抗菌薬は、βラクタム系抗菌薬である、
    　ことを特徴とする請求項４又は５に記載の組成物。
  7. 　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３で特定されるバクテリオファージ及び受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４で特定されるバクテリオファージからなる群から選択される少なくとも１のバクテリオファージを含有する、ＭＲＳＡの病原性を低下させるための組成物。
  8. 　ＭＲＳＡに、前記バクテリオファージに対する耐性を獲得させることにより、前記病原性を低下させる、
    　ことを特徴とする請求項７に記載の組成物。
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