WO2023014245A1 - Состав вакцины против covid-19 vaccine composition against covid-19 - Google Patents

Состав вакцины против covid-19 vaccine composition against covid-19 Download PDF

Info

Publication number
WO2023014245A1
WO2023014245A1 PCT/RU2022/050154 RU2022050154W WO2023014245A1 WO 2023014245 A1 WO2023014245 A1 WO 2023014245A1 RU 2022050154 W RU2022050154 W RU 2022050154W WO 2023014245 A1 WO2023014245 A1 WO 2023014245A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
composition
cov
sars
protein
composition according
Prior art date
Application number
PCT/RU2022/050154
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Наталья Сергеевна БЕЛОЗЕРОВА
Юлия Владимировна ПЛЕТЮХИНА
Севастьян Олегович РАБДАНО
Никита Сергеевич САВЕЛЬЕВ
Лилия Ниязовна ФАХРЕТДИНОВА
Наталья Николаевна САВИНА
Алексей Александрович ЕКИМОВ
Виктор Павлович ТРУХИН
Анатолий Эдуардович ЕВТУШЕНКО
Вероника Игоревна СКВОРЦОВА
Муса Рахимович ХАИТОВ
Original Assignee
Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства filed Critical Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства
Publication of WO2023014245A1 publication Critical patent/WO2023014245A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof

Definitions

  • the invention relates to biotechnology, immunology and virology.
  • a pharmaceutical composition for induction of specific immunity against the SARS-CoV-2 acute respiratory syndrome virus has been created, containing the SARS-CoV-2 nucleocapsid protein N, having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, in an amount of 20 to 100 ⁇ g/ml and pharmaceutically acceptable excipients.
  • the main prophylactic in the case of viral infections is a vaccine - a tool that includes an antigen that causes an immune response of the body and leads to the induction of a stronger secondary immune response.
  • the vaccinated patient either does not contract the infection either in the body there is a reaction of rapid elimination of the virus, which in this case allows the disease to be transferred in a milder form.
  • compositions are known for inducing an immune response in the case of novel coronavirus infections.
  • an immunobiological agent based on recombinant human adenovirus serotype 5 or recombinant human adenovirus serotype 26 is known, containing a consensus sequence of the full protective antigen S of coronavirus optimized for expression in mammalian cells based on the sequences of the genes of the S protein of modern strains of the virus 2015-2017 with a certain sequence.
  • a vaccine that includes nanoparticles with glycoprotein S of the SARS-CoV-2 coronavirus and a core of non-ionic surfactant, as well as a buffer and a saponin-based adjuvant.
  • the proposed particles have stability and better presentation of the antigen epitope.
  • Patent CN111944064 describes a vaccine comprising S-S-RBD protein, assembly domain protein, signal proteins, and a squalene-based adjuvant.
  • the resulting composition is a water-in-oil nanoemulsion.
  • the technical challenge is to develop and obtain a stable composition capable of inducing an immune response and inducing specific immunity against SARS-CoV-2 when administered to the body.
  • the problem is solved by obtaining a composition containing the SARS-CoV-2 nucleocapsid protein N having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, in an amount of 20 to 100 ⁇ g/ml and pharmaceutically acceptable excipients selected from the group including buffer agents, surface- active substances, adjuvant, isotonic agents in pharmaceutically acceptable amounts.
  • the resulting composition has stability, the ability to induce a stable and long-term immune response, with a high titer of antibodies to infection with SARS-CoV-2 coronavirus, as well as the composition can be obtained quite simply from a technological point of view.
  • FIG. 1 shows examples of detected changes in the lung: the development of severe interstitial pneumonia and epithelial necrosis are shown, in the study according to example 7, group 8.
  • FIG. Figure 2 shows examples of detected changes in the lungs: marked hyperplasia of type II alveolar epithelial cells, as well as mixed expressed mixed cell inflammatory infiltration, are shown, in the study according to example 7, group 8.
  • FIG. 3 shows the normal structure of the lung, 2 weeks after the recovery of the animals, in the study according to example 7, group 7.
  • Vaccines are a composition that includes an antigen in the form of a protein or a mixture of proteins, as well as excipients.
  • An antigen is a pharmaceutically active substance responsible for the development of an immune response in a patient's body.
  • the injected antigen may be unstable, for example, it cannot be stored and processed without loss of activity for a certain time, under the influence of the environment.
  • the antigen when introduced into the body, the antigen can be destroyed by the action of enzymes or other substances of the body (for example, the bloodstream environment).
  • a pharmaceutical composition for inducing a specific immune response against SARS-CoV-2 acute respiratory syndrome virus, containing SARS-CoV-2 nucleocapsid protein N having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, in an amount of 20 to 100 mcg/ml and pharmaceutically acceptable excipients, selected from the group consisting of buffering agents, surfactants, adjuvants, isotonic agents. These excipients are generally contained in the composition in pharmaceutically acceptable amounts.
  • the composition of the invention comprises the SARS-CoV-2 nucleocapsid protein N having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in an amount of 20 to 50 ⁇ g/ml.
  • the composition according to the invention contains tocopherol, squalane, or a combination thereof as an adjuvant.
  • the composition according to the invention may contain as buffering agents any pharmaceutically acceptable buffer that can be used to maintain a pH of about 7, for example, phosphate-buffered saline, maleate buffer, tetrabutylammonium buffer solution, borate buffer, HEPES buffer, tris( hydroxymethyl) aminomethane buffer solution, or any other physiologically acceptable buffer used to maintain the pH in the range of 7-8, preferably in the range of 7.2-7.6.
  • composition according to the invention may contain pharmaceutically acceptable surfactants (surfactants), for example, polysorbates, tweens, sorbitans and other suitable surfactants, for example, sodium lauryl sulfate, sodium dioctylsulfosuccinate, sodium dioctylsulfonate, chenodeoxycholic acid, N-laurylsarcosine sodium salt, lithium dodecyl sulfate , sodium salt of 1-octane sulfonic acid, sodium cholate hydrate, sodium deoxycholate, sodium salt of glycodeoxycholic acid, benzalkonium chloride or benzethonium chloride, cetylpyridinium chloride monohydrate, hexadecyltrimethylammonium bromide, CHAPS, CHAPSO, SB3-10, SB3-12, digitonin, Triton X-100, Triton X -114, lauromacrogol 400, polyoxyl-40
  • the preferred concentration of surfactant may be from 0.005 to 5 wt%, or, for example, 1-10 mt per 1 ml.
  • the composition may also contain isotonic agents, for example, potassium chloride, sodium chloride.
  • the isotonic agent acts not only to maintain a suitable osmotic pressure, but can also act as an auxiliary protein stabilizer in liquid or lyophilisate form.
  • examples of an isotonic agent include water-soluble inorganic salts such as sodium chloride, sodium sulfate, sodium citrate, calcium chloride, and combinations thereof. Most preferred is sodium chloride.
  • the concentration of the isotonic agent is on the order of 5 to 200 mM, or, for example, 0.1 to 8.5 mg per ml. Within this range, the concentration of the isotonic agent can be adjusted according to the kinds and amounts of components contained so that the liquid composition is isotonic.
  • Adjuvants are components used in vaccine compositions that potentiate and/or modulate the immune response to an antigen in order to obtain the desired immune response.
  • Mineral salts can be used as adjuvants, for example gels of aluminum hydroxide and aluminum or calcium phosphate; formulations based on oil emulsions and surfactants, e.g. MF59 (microfluidized detergent stabilized in oil-in-water emulsion), QS21 (purified saponin), AS02 [SBAS2] (oil-in-water emulsion + MPL + QS-21), montanide ISA-51 and ISA-720 (stabilized water-in-oil emulsion), particulate adjuvants, e.g.
  • polylactide co-glycolide PLG
  • microbial derivatives naturally and synthetic
  • MPL monophosphoryl lipid A
  • detox MPL + cellular walls of M. phlei
  • AGP [RC-529] synthetic acylated monosaccharide
  • DC Chol lipoid immunostimulants capable of self-assembly into liposomes
  • OM-174 lipid A derivative
  • CpG sequences synthetic oligonucleotides containing CpG- sequences with immunostimulatory activity
  • tocopherol squalene and squalane and their derivatives
  • LT and CT genetically modified bacterial toxins to provide a non-toxic effect of adjuvants
  • endogenous human immunomodulators for example, human GM-CSF and human IL-12 (cytokines that can be administered as a protein or encoded by plasmids), immudaptin (C3d tandem repeat),
  • the composition according to the invention has the following composition per 1 ml:
  • SARS-CoV-2 nucleocapsid protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 20-100 ⁇ g
  • composition according to the invention has the following composition per 1 ml:
  • SARS-CoV-2 nucleocapsid protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 50-100 ⁇ g Squalane 24-36 mg; a-tocopherol 8-12 mg;
  • compositions according to the invention may be a solution, emulsion or lyophilisate.
  • the lyophilizate can be obtained from a solution or an emulsion by standard methods for this, for example, from a solution during lyophilization.
  • composition according to the invention can be used to prevent or induce specific immunity against the acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2, i. be used as a vaccine.
  • the content of protein N in the composition according to the invention may vary depending on the required dose for vaccination, the age of the patient and other clinical factors.
  • compositions for prophylaxis against SARS-CoV-2 acute respiratory syndrome virus includes single or double administration of the composition.
  • the decision on a single or double administration is made by the therapist, taking into account the age, patient history, the presence of chronic diseases and other clinical factors.
  • the composition may be administered 2 times consecutively with an interval of at least 2 weeks, with the same or different content of nucleocapsid protein N in the composition.
  • the invention also provides a process for preparing a composition containing protein N, which includes: 1) providing a SARS-CoV-2 nucleocapsid protein N having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in an amount of 20 to 100 ⁇ g/ml;
  • the implementation of the method of obtaining the composition may further include lyophilization of the resulting composition with obtaining lyophilisate used for reconstitution with a solvent before administration to the patient.
  • the resulting composition is an emulsion, such as a water-in-oil or oil-in-water emulsion.
  • composition according to the invention will be described in examples, which are not intended to limit the scope of the present invention.
  • a plasmid containing the N protein gene (Genbank YP 009724397.2) was used to obtain a modified codon-optimized nucleotide sequence using the Codon Adaptation Index (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/).
  • the codons are chosen so that the most common codons found in E. coli are used whenever possible, and the content of nucleotides guanine and cytosine is in the range of 50-55%. Sequence at 5' and 3' ends flanked sequences for recognition by endonucleases Ncol (CCATGG) and Xhol (CTCGAG), respectively.
  • the nucleotide sequence corresponded to the sequence of SEQ ID N0:2.
  • the E. coli cell line was transformed according to the following protocol.
  • the tube with competent cells was removed from the freezer storage at -80°C.
  • the ice was allowed to thaw for 10 min.
  • 1 ⁇ l containing 1 pg-100 ig of the plasmid was added.
  • the tube was gently mixed 4-5 times.
  • the resulting mixture was placed on ice for 30 min.
  • the mixture was subjected to heat shock at 42°C for 30–60 s.
  • the resulting treated mixture was placed on ice for 5 minutes.
  • 950 ⁇ l of SOC medium was added at room temperature. Incubated at 30°C-37°C for 1 - 2 h with stirring 250 rpm.
  • E. coli cell line was obtained incorporating the artificial gene according to the invention.
  • This cell line was deposited at the All-Russian Research Institute of Agricultural Microbiology (FGBNU VNIISHM) under the number RCAM05390 (dated May 14, 2021).
  • the E. coli biomass containing the expressed N protein was resuspended in lysis buffer (Tris-HCl 50 mM, pH 9) and homogenized using a laboratory homogenizer, e.g. GEA Panda 1000. contained EDTA and PMSF protease inhibitors. Then, the insoluble fraction of biomolecules was precipitated by centrifugation at 20,000 xg, 4°C, 30 min. The soluble fraction was transferred to a clean dish and 20% (w/v) ammonium sulfate was added to it to precipitate protein N. The precipitated fraction was collected by centrifugation at 20,000 x g, 4°C, 30 min, followed by dissolution in Tris-HCl buffer 50 mM, pH 9.
  • lysis buffer Tris-HCl 50 mM, pH 9
  • the solution was used for chromatographic purification.
  • the first stage of purification on anion-exchange chromatography was carried out in the breakthrough mode (Tris-HC1 buffer 50 mM, pH 9).
  • the second purification step on cation-exchange chromatography was carried out in capture mode eluting with a NaCl gradient from 0 M to 1 M (Tris-HC1 buffer 50 mM, pH 9).
  • the third stage of purification on hydrophobic chromatography was carried out in capture mode with elution with a gradient of ammonium sulfate from 1 M to 0 M (NaH2PO4 buffer 50 mM, pH 7.5).
  • the process of dialysis was carried out in dialysis cassettes in 5 l of phosphate-buffered saline. The process took place at room temperature for 2 hours. Then, the buffer was replaced with 5 L of fresh buffer and the process was carried out at +4°C for 10 hours. After the end of dialysis, the protein was removed from the dialysis cassettes and filtered. The resulting precipitate was dissolved in water for injection to obtain a lyophilisate, or the resulting protein solution was adjusted to the desired protein concentration by adding the previously obtained lyophilisate. The resulting solution was examined for the following parameters: protein content, pH, mechanical inclusions, transparency, sterility, particle size. For this, standard methods of analysis were used.
  • An aqueous solution was obtained containing protein N, obtained according to example 3, with different concentrations of protein: 20 ⁇ g/ml, 30 ⁇ g/ml, 40 ⁇ g/ml, 50 ⁇ g/ml, 60 ⁇ g/ml, 70 ⁇ g/ml, 80 ⁇ g /ml, 90 ⁇ g/ml, 100 ⁇ g/ml.
  • the calculated amount of tocopherol, squalane, and polysorbate 80 was placed in a separate container; phosphate-buffered saline was added in parts, with constant stirring.
  • phosphate-buffered saline was added in parts, with constant stirring.
  • the resulting solution (adjuvant solution) was divided into equal parts and sonicated.
  • the treated solutions were combined into one beaker and mixed.
  • the solution was filtered through a 0.22 ⁇ m membrane.
  • the resulting filtered solution was combined with protein N solutions and stirred until a homogeneous solution.
  • Example 5 In some cases a white or yellowish emulsion was formed.
  • the resulting solution containing protein N and adjuvant was adjusted to pH 7.2-7.6 with sodium hydroxide solution or hydrochloric acid. Further, the resulting solution was poured into sterile vials and sealed. If necessary, a lyophilizate was obtained from the solution by lyophilization in the apparatus. Water for injection or sterile saline was used to reconstitute the vaccination solution.
  • Example 5 Example 5
  • compositions were obtained (shown in the table below)
  • compositions with different protein content were examined for stability before the start of the study and after 6 weeks of storage under stress conditions ("accelerated storage” conditions).
  • pH, protein content were measured, transparency, homogeneity were visually assessed if the composition was an emulsion.
  • Compositions with different contents of nucleocapsid protein N were filled into sterile vials, stoppered and placed in an accelerated storage chamber for stability testing. The chamber was maintained at a temperature of +20°C for 6 weeks. After the time had elapsed, the vials were removed and analyzed for pH and nucleocapsid N protein content. pH measurement was carried out directly in solution using a pH meter. Analysis for protein content was carried out by spectrophotometry, with wavelength 280 nm. Further, the decrease in the concentration of the nucleocapsid protein N in the test solution after storage for 6 weeks was calculated relative to the initial value.
  • compositions containing the nucleocapsid protein N at a concentration of 20 ⁇ g/ml to 100 ⁇ g/ml are stable.
  • compositions were investigated for the possibility of induction of specific immunity (immunogenicity) Animals of the Syrian hamster species (females) in the amount of 240 pcs. randomly divided into the following equal groups:
  • Group No. 1 - a composition containing 20 ⁇ g/ml of protein was administered.
  • Group No. 2 - a composition containing 50 ⁇ g/ml of protein was administered.
  • Group No. 3 - a composition containing 100 ⁇ g/ml of protein was administered.
  • Group No. 4 - a composition containing no protein (placebo) was administered.
  • the age of the animals was 6-8 weeks, the weight range was 56.37-149.28 g.
  • the adaptation period was 5 days, with daily examination of the animals (condition, temperature measurement).
  • the animals were kept under standard conditions in accordance with Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of the European Union of September 22, 2010 on the protection of animals used for scientific purposes.
  • the compositions were administered intramuscularly, at a dose of 0.5 ml per animal, using fractional administration, with a break of 14 days (administration on day 1 and day 15).
  • Table 3 ELISA analysis for specific antibodies was performed according to the following method: After immunization with compositions 1-4 Balb/c mice, aged 6-8 weeks, at a dose of 500 ⁇ l, 250 ⁇ l in each hind thigh.
  • mice were euthanized in a chamber filled with CO2 gas. Further, blood was taken for the content of specific antibodies and internal organs for histological analysis.
  • Blood was placed into Eppendorf tubes containing EDTA at a concentration of 1–2 mg/mL. Tubes with blood and EDTA were centrifuged at +4°C for 20 minutes. The supernatant was transferred into clean tubes in a laminar flow hood. The resulting plasma was frozen.
  • the following reagents were used: seating antigens, 1 ⁇ g/ml, 100 ⁇ l/well; blocking with 0.5% milk in wash buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% polysorbate 20, pH 7.4 ⁇ 0.1), 300 ⁇ l/well.
  • Washing was carried out as follows: the contents of the plate were poured out, the plate was washed 4 times with 300 ⁇ l per well with wash buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% polysorbate 20, pH 7.4 ⁇ 0.1), the wells were thoroughly dried, avoiding the formation of bubbles by tapping the tablet on a tissue.
  • the titer was selected for each individual serum, 100 ⁇ l/well, thermostatically controlled and centrifuged.
  • Washing was carried out as follows: the contents of the plate were poured out, the plate was washed 4 times with 300 ⁇ l per well with wash buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% polysorbate 20, pH 7.4 ⁇ 0.1), the wells were thoroughly dried, avoiding the formation of bubbles by tapping the tablet on a tissue. Chromogen solution, 100 ⁇ l/well, was added for 12 minutes in a place protected from light. Next, a stop solution was added, 50 ⁇ l/well. The reading of the results was carried out at a wavelength of 450 nm, reference 620 nm. The results were considered acceptable if the eligibility and acceptance criteria were met.
  • the limit of detection is calculated from the standard deviation of a blank sample. To do this, measure the value of the analytical signal for a sufficient number of blank samples and calculate the standard deviation of their values.
  • the limit of detection is calculated from the optical density of the blocking buffer using the formula:
  • LOD Average+10*SD, where average is the average value of the optical density of the blocking buffer
  • SD is the standard deviation of the optical density of the blocking buffer
  • the serum titer is considered to be the extreme dilution at which the optical density exceeds the signal of the discrimination level (cut-off), the average optical density is used.
  • the results for determining the titer of specific IgG antibodies are presented in the table below.
  • compositions were investigated for the possibility of induction of specific immunity (protectiveness).
  • compositions The evaluation of the protective properties of the compositions was evaluated after two vaccinations and infection with a culture of coronavirus.
  • compositions and a vaccination scheme were used, as described in example 5.
  • compositions containing N protein in various concentrations were used, as well as a placebo (a composition that did not contain protein and contained only a solvent and excipients).
  • compositions for vaccination are presented in the table below.
  • mice Female Syrian hamsters in the amount of 50 pcs. randomly divided into 5 groups containing 10 individuals. Groups of animals were first immunized on the 1st and 15th day with compositions with different protein content. Next, on On the 29th day, the animals were infected with the SARS-CoV-2 virus and the clinical manifestations of the disease and recovery were recorded.
  • the animals under general anesthesia were intranasally injected once with the SARS-CoV-2 virus (certified strain of the Federal State Budget Scientific Institution "FNTsIRIP named after M.P. Chumakov RAS" No. PIK35 GISAID ID EPI ISL 428852) in a volume of 50 ⁇ l at a dose of 5 lgTCID50 per animal .
  • SARS-CoV-2 virus certified strain of the Federal State Budget Scientific Institution "FNTsIRIP named after M.P. Chumakov RAS" No. PIK35 GISAID ID EPI ISL 428852
  • the animals were monitored for general condition and body weight. Animals were euthanized on the 3rd and 7th days after infection. The lungs were photographed and weighed for further evaluation of the mass factor. Macroscopically, changes in the color and structure of the lung tissue were assessed. The right lung was used to assess microscopic changes.
  • the histological analysis included evaluation of three features: pneumonia, cellular infiltrate, and e
  • FIG. 1-3 Histological studies of the lungs are shown in Fig. 1-3.
  • composition No. 8 did not lead to the development of pharmacological effects on the course of coronavirus infection in Syrian hamsters.
  • the introduction of compositions containing protein, Nos. 5, 6, 7 had a positive effect on the infectious process in the form of a tendency to increase body weight and improve the general well-being of animals on the 5th day of pathology, and a decrease in the severity of histological changes in the lung tissue on the 7th day after infection.
  • compositions containing N protein at various concentrations and an adjuvant have protective properties when infected with SARS-CoV-2 infection.
  • the discovered properties are manifested in the form of a reduction in the period of the disease due to the complete absence of clinical signs of infection by the 5th day after infection, reliable an increase in body weight on days 6-7 of the development of infection with an almost complete recovery to the initial level, a tendency to an increase in Ct in the lung tissue on the 3rd day, a decrease in the severity of macro- and microscopic changes in the lung tissue.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Создано фармацевтическая композиция для индукции специфического иммунитета против вируса острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащая нуклеокапсидный белок N SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в количестве от 20 до 100 мкг/мл и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, выбранные из группы, включающей буферные агенты, поверхностно- активные вещества, адъювант, изотонический агент в фармацевтически приемлемых количествах.

Description

СОСТАВ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ COVID-19
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Создано фармацевтическая композиция для индукции специфического иммунитета против вируса острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащая нуклеокапсидный белок N SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в количестве от 20 до 100 мкг/мл и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, выбранные из группы, включающей буферные агенты, поверхностноактивные вещества, адъювант, изотонический агент в фармацевтически приемлемых количествах.
Предшествующий уровень техники
В 2019 г. в Китае был обнаружен новый одноцепочечный РНК-co держащий вирус, относящимся к семейству Coronaviridae, к линии Beta-CoV В. Новый коронавирус быстро распространился по всем контитентам, вызывая тяжелые состояния: вирусную пневмонию, сосудистые нарушения, усугубление хронических заболеваний. В феврале 2020 г. Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) присвоила новому вирусу официальное название SARS-CoV-2, а болезнь в случае этого вируса - название COVID-19 («Coronavirus disease 2019»),
В настоящее время проблема профилактики инфекции коронавируса SARS- CoV-2 является большой проблемой, т.к. эффективного лекарственного средства до сих пор не разработано. Основным профилактическим средством в случае вирусных инфекцией является вакцина - средство, включающее антиген, который вызывает иммунную реакцию организма и приводит к индукции более сильного вторичного иммунного ответа. Таким образом, вакцинированный пациент либо не заражается инфекцией либо в организме происходит реакция быстрой элиминации вируса, что позволяет в этом случае переносить заболевание в более легкой форме.
Известны различные композиции вакцин для индукции иммунного ответа в случае коронавирусных инфекций нового типа.
Так, например, согласно патенту RU 2709659 известно иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих консенсусную последовательность полного протективного антигена S коронавируса на основании последовательностей генов белка S современных штаммов вируса 2015-2017 гг.с определенной последовательностью.
Также из патента US10953089 известна вакцина, включающая наночастицы с гликопротеином S коронавируса SARS-CoV-2 и ядро из неионогенное ПАВ, а также буфер и адъювант на основе сапонина. Предлагаемые частицы обладают стабильностью и лучшей презентацией эпитопа антигена.
Патент CN111944064 описывает вакцину, включающую белок S-S-RBD, белок домена сборки, сигнальные белки, а также адъювант на основе сквалена. Полученная композиция представляет собой наноэмульсию «вода в масле».
Таким образом, техническая задача состоит в разработке и получении стабильной композиции, способной при ее введении в организм вызывать иммунный ответ и индуцировать специфический иммунитет против SARS- CoV-2. Поставленная задача решается получением композиции, содержащей нуклеокапсидный белок N SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в количестве от 20 до 100 мкг/мл и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, выбранные из группы, включающей буферные агенты, поверхностно-активные вещества, адъювант, изотонические агенты в фармацевтически приемлемых количествах. При этом полученная композиция обладает стабильностью, способностью вызывать стойкий и длительный иммунный ответ, с высоким титром антител к инфекции коронавируса SARS-CoV-2, а также композицию можно достаточно просто получить с технологической точки зрения.
Описание фигур
На Фиг. 1 представлены примеры выявленных изменений в легком: показано развитие тяжелой интерстициальной пневмонии и некроз эпителия, при исследовании согласно примеру 7, группа 8.
На Фиг. 2 представлены примеры выявленных изменений легких: показаны выраженные гиперплазия альвеолярных эпителиальных клеток II типа, а также смешанная выраженная смешанно клеточная воспалительная инфильтрация, при исследовании согласно примеру 7, группа 8.
На Фиг. 3 показано нормальное строение легкого, спустя 2 недели после выздоровления животных, при исследовании согласно примеру 7, группа 7.
Подробное описание изобретения
Вакцины, как правило, представляют собой композицию, включающую антиген в виде белка или смеси белков, а также вспомогательные веществ.
Антиген является фармацевтически активной субстанцией, ответственной за развитие иммунного ответа в организме пациента. Однако, по различным причинам, вводимый антиген может быть нестабильным, например, его невозможно хранить и технологически обрабатывать без потери активности в течение определенного времени, под воздействием окружающей среды. Кроме того, при введении в организм антиген может разрушаться под действием ферментов или иных веществ организма (например, среды кровотока).
Согласно настоящему изобретению, предложена фармацевтическая композиция, предназначенная для индукции специфического иммунного ответа против вируса острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащая нуклеокапсидный белок N SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в количестве от 20 до 100 мкг/мл и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, выбранные из группы, включающей буферные агенты, поверхностноактивные вещества, адъюванты, изотонические агенты. Данные вспомогательные вещества, как правило, содержатся в композиции в фармацевтически приемлемых количествах. В одном из вариантов реализации, композиция согласно изобретению содержит нуклеокапсидный белок N SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в количестве от 20 до 50 мкг/мл.
В еще одном варианте реализации композиция согласно изобретению в качестве адъюванта содержит токоферол, сквалан или их комбинацию. В другом варианте реализации композиция согласно изобретению может содержать в качестве буферных агентов любой фармацевтически приемлемый буфер, который может быть использован для поддержания pH около 7, например, фосфатно-солевой буфер, малеатный буфер, тетрабутиламмония буферный раствор, боратный буфер, HEPES буфер, трис(гидроксиметил)аминометана буферный раствор, или любой другой физиологически приемлемый буфер, используемый для поддержания pH в диапазоне 7-8, предпочтительно, в диапазоне 7, 2-7, 6.
Также композиция согласно изобретению может содержать фармацевтические приемлемые поверхностно-активные вещества (ПАВ), например, полисорбаты, твины, сорбитаны и другие подходящие ПАВ, например, лаурилсульфата натрия, диоктилсульфосукцината натрия, диоктилсульфоната натрия, хенодезоксихолевой кислоты, натриевой соли N-лаурилсаркозина, додецилсульфата лития, натриевой соли 1 -октансульфокислоты, гидрата холата натрия, дезоксихолата натрия, натриевой соли гликодезоксихолевой кислоты, бензалконийхлорида или бензетонийхлорида, моногидрата цетилпиридинийхлорида, гексадецилтриметиламмония бромида, CHAPS, CHAPSO, SB3-10, SB3-12, дигитонина, Тритона Х-100, Тритона Х-114, лауромакрогола 400, полиоксил-40-стеарата, полиоксиэтилен гидрогенизированного касторового масла 10, 40, 50 и 60, моностеарата глицерина, полисорбата 20, 40, 60, 65 и 80, лецитина из сои, DOPC, DMPG, DMPC и DOPG; эфира сахарозы и жирных кислот, метилцеллюлозы и карбоксиметилцеллюлозы. Предпочтительная концентрация ПАВ может составлять от 0,005 до 5% масс, или, например, 1-10 мт на 1 мл. Также в композиции могут содержаться изотонические агенты, например, калия хлорид, натрия хлорид. Изотонический агент действует не только для поддержания подходящего осмотического давления, но и может выполнять функции вспомогательного стабилизатора белка в жидкой форме иди лиофилизате. Примеры изотонического агента включают растворимые в воде неорганические соли, например, хлорид натрия, сульфат натрия, цитрат натрия, хлорид кальция и их комбинация. Наиболее предпочтительным является хлорид натрия. Предпочтительно концентрация изотонического агента составляет порядка от 5 до 200 мМ, или, например, 0,1 -8,5 мг на мл. В пределах данного диапазона концентрация изотонического агента может регулироваться в соответствии с видами и количествами содержащихся компонентов, с тем чтобы жидкая композиция была изотонической.
Адъюванты представляют собой компоненты, используемые в композициях вакцин, которые потенцируют иммунный ответ на антиген, и/или модулирующий его с целью получения требуемого иммунного ответа. В качестве адъювантов могут использоваться минеральные соли, например, гели алюминия гидроксида и алюминия или кальция фосфата; препараты на основе масляных эмульсий и сурфактантов, например, MF59 (микросжиженный детергент, стабилизированный в эмульсии «масло в воде»), QS21 (очищенный сапонин), AS02 [SBAS2] (эмульсия «масло в воде» + MPL + QS-21), монтанид ISA-51 и ISA-720 (стабилизированная эмульсия «вода в масле»), дисперсные адъюванты, например, виросомы (однослойные липосомальные носители, включающие гемагглютинин гриппа), AS04 ([SBAS4] соль Al с MPL), ИСКОМы (структурный комплекс сапонинов и липидов), полилактид ко- гликолид (PLG), микробные производные (естественные и синтетические), например, монофосфориллипид A (MPL), детокс (MPL + скелет клеточной стенки М. phlei), AGP [RC-529] (синтетический ацилированный моносахарид), DC Chol (липоидные иммуностимуляторы, способные к самоорганизации в липосомы), ОМ-174 (производное липида А), CpG-последовательности (синтетические олигонуклеотиды, содержащие CpG-последовательности с иммуностимулирующей активностью), токоферол, сквален и сквалан и их производные, модифицированные LT и СТ (генетически модифицированные бактериальные токсины для обеспечения нетоксичного действия адъювантов), эндогенные иммуномодуляторы человека, например, ГМ-КСФ человека и ИЛ- 12 человека (цитокины, которые можно вводить в виде белка или кодировать плазмидами), иммудаптин (C3d тандемный повтор), инертные носители, такие как частицы золота. В предпочтительном варианте реализации композиция согласно изобретению включает в качестве адъюванта а-токоферол, сквалан и их комбинации.
В предпочтительном варианте реализации композиция согласно изобретению имеет следующий состав на 1 мл:
Нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 20- 100 мкг
Сквалан - 15-40 мг; а-токоферол 5- 15 мг;
Полисорбат 80 1- 10 мг;
Натрий фосфорно-кислый двузамещенный 0,1- 2,0 мг;
Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,01-0,25 мг;
Калия хлорид 0,01-0,2 мг;
Натрия хлорид 0,1- 8,5 мг;
Вода для инъекций до 1 мл.
В более предпочтительном варианте реализации композиция согласно изобретению имеет следующий состав на 1 мл:
Нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 50-100 мкг Сквалан 24-36 мг; а-токоферол 8-12 мг;
Полисорбат 80 10-12 мг;
Натрий фосфорно-кислый двузамещенный 1,5-1, 8 мг;
Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,1-0,122 мг;
Калия хлорид 0,1-0,21 мг;
Натрия хлорид 4-8,1 мг;
Вода для инъекций до 1 мл.
Композиции согласно изобретению могут представлять собой раствор, эмульсию или лиофилизат. Лиофилизат может быть получен из раствора или эмульсии стандартными для этого способами, например, из раствора при лиофилизации.
Композиция согласно изобретению может применяться для профилактики или индукции специфического иммунитета против вируса острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, т.е. использоваться в качестве вакцины. При этом, содержание белка N в композиции согласно изобретению может варьироваться в зависимости от требуемой дозы для вакцинации, возраста пациента и других клинических факторов.
Применение указанной композиции для профилактики против вируса острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 включает однократно или двукратно введение композиции. Решение об однократном или двукратном введении принимает терапевт, с учетом возраста, анамнеза пациента, наличия хронических заболеваний и иных клинических факторов. В случае двукратного введения композиция может вводиться 2 раза последовательно с интервалом не менее 2 недель, с одинаковым или различным содержанием нуклеокапсидного белка N в композиции.
Далее, изобретение также предлагает способ получения композиции, содержащей белок N, который включает: 1) обеспечение нуклеокапсидного белка N SARS-CoV-2, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в количестве от 20 до 100 мкг/мл;
2) растворение белка в водном растворителе и доведение содержания белка N в растворе до требуемой концентрации;
3) приготовление водного раствора адъюванта;
4) смешение водного раствора, содержащего белок N, и водного раствора адъюванта;
5) гомогенизация полученной смеси до получения однородного по цвету раствора;
6) регулирование полученного композиции pH до 7,2 -7,6.
В одном из вариантов реализации способ получения композиции может дополнительно включать лиофилизацию полученной композиции с получением лиофилизата, используемого для восстановления растворителем перед введением пациенту. В некоторых вариантах реализация полученная композиция представляет собой эмульсию, например, типа «вода-в масле», или «масло в воде».
Далее композиция согласно изобретению будет описана в примерах, которые не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1
Получение плазмиды, содержащей ген белка
Плазмиду, содержащую ген белка N (Genbank YP 009724397.2), использовали для получения модифицированной оптимизированной по кодонам нуклеотидной последовательности с использованием Codon Adaptation Index (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/). Кодоны выбраны таким образом, чтобы по возможности использовались наиболее часто встречающиеся у Е. coli кодоны, а также содержание нуклеотидов гуанин и цитозин был в диапазоне 50-55%. Последовательность на 5’ и 3’ концах фланкировалась последовательностями для распознавания эндонуклеазами Ncol (CCATGG) и Xhol (CTCGAG), соответственно. Синтез гена и клонирование по указанным сайтам рестрикции в плазмиду без вставки рЕТ-28а(+) были заказаны на коммерческой основе. Полученную плазмиду секвенировали с помощью праймеров T7_promotor (TAATACGACTCACTATAGGG), fwd_122 (GCCTTATGGTGCAAATAAGG) и fwd_300
(AAACATTGGCCGCAGATTGC) для подтверждения нуклеотидной последовательности и проверки на однонуклеотидные мутации.
Нуклеотидная последовательность соответствовала последовательности SEQ ID N0:2.
Пример 2
Получение клеточной линии Е. сой, модифицированной плазмидой
Клеточную линию Е. coli трансформировали по следующему протоколу. Пробирку с компетентными клетками извлекали из морозильной камеры хранения на -80°С. Давали оттаять льду в течение 10 мин. Далее вносили 1 мкл, содержащий 1 пкг-100 иг плазмиды. Аккуратно перемешивали пробирку 4-5 раз. Полученную смесь помещали на лёд на 30 мин. Далее смесь подвергали тепловому шоку при 42°С на 30-60 с. Полученную обработанную смесь помещали на лёд на 5 мин. Вносили 950 мкл среды SOC при комнатной температуре. Инкубировали при 30°С-37°С в течение 1 - 2 ч при перемешивании 250 оборотов в минуту. Высевали 10-50 мкл на чашку с твердой селективной средой, содержащей антибиотик канамицин. Инкубировали при 30°С - 37°С в течение ночи. Выросшие колонии содержат клетки Е. coli, трансформированные плазмидой, несущей искусственный ген нуклеокапсидного белка N.
Таким образом получали клеточную линию Е. coli с включением искусственного гена согласно изобретению. Данная клеточная линия была депонирована во ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельско-хозяйственной микробиологии (ФГБНУ ВНИИСХМ) под номером RCAM05390 (от 14.05.2021 г.).
Пример 3
Получение рекомбинантного белка N SARS-CoV-2
Биомассу Е. coli, содержащую экспрессированный белок N, ресуспендировали в буфере для лизиса (Трис-НС1 50 мМ, pH 9) и гомогенизировали с помощью лабораторного гомогенизатора, например, GEA Panda 1000. Все буферы, кроме буферов для хроматографии на третьей стадии очистки, содержали ингибиторы протеаз ЭДТА и ФМСФ. Затем нерастворимую фракцию биомолекул осаждали центрифугированием при 20000 х g, 4°С, 30 мин. Растворимую фракцию переносили в чистую посуду, и к ней добавляли 20% (по массе на объем) сульфата аммония для осаждения белка N. Осажденную фракцию собирали центрифугированием при 20000 х g, 4°С, 30 мин, с последующим растворением в буфере Трис-НС1 50 мМ, pH 9. После фильтрации через мембрану с диаметром пор 0,22 мкм раствор использовали для хроматографической очистки. Первую стадию очистки на анион- обменной хроматографии проводили в режиме проскока (буфер Трис-НС1 50 мМ, pH 9). Вторую стадию очистки на катион-обменной хроматографии проводили в режиме захвата с элюцией градиентом NaCl от 0 М до 1 М (буфер Трис-НС1 50 мМ, pH 9). Третью стадию очистки на гидрофобной хроматографии проводили в режиме захвата с элюцией градиентом сульфата аммония от 1 М до 0 М (буфер NaH2PO4 50 мМ, pH 7,5).
Далее, проводили процесс диализа в диализных кассетах в 5 л фосфатносолевом буфере. Процесс проходил при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем проводили замену буфера на 5 л свежего буфера и проводили процесс при +4°С в течение 10 ч. После окончания диализа белок извлекали из диализных кассет и фильтровали. Полученный осадок растворяли в воде для инъекций для получения лиофилизата или полученный раствор белка доводили до нужной концентрации белка путем добавления ранее полученного лиофилизата. Полученный раствор исследовали по следующим показателям: содержание белка, pH, механические включения, прозрачность, стерильность, размер частиц. Для этого использовали стандартные методики анализа.
Пример 4
Приготовление композиции согласно изобретению
Получали водный раствор, содержащий белок N, полученный согласно примеру 3, с различными концентрациями белка: 20 мкг/мл, 30 мкг/мл, 40 мкг/мл, 50 мкг/мл, 60 мкг/мл, 70 мкг/мл, 80 мкг/мл, 90 мкг/мл, 100 мкг/мл.
В отдельную емкость помещали в зависимости от содержания белка рассчитанное количество токоферола, сквалана и полисорбата 80, частями добавляли фосфатно-солевой буфер, при постоянном перемешивании. Например, при содержании 20 мкг/мл использовали 45 г токоферола, 15 г полисорбата 80, и 15 г сквалана и 750 мл буферного раствора. После растворения полученный раствор (раствор адъюванта) разделяли на равные части и обрабатывали ультразвуком. Затем обработанные растворы объединяли в один стакан и перемешивали. Далее проводили фильтрацию раствора через мембрану 0,22 мкм. Полученный отфильтрованный раствор объединяли с растворов белка N и перемешивали до гомогенного раствора.
В некоторых случаях образовывалась эмульсия белого или желтоватого цвета. Полученный раствор, содержащий белок N и адъювант, доводили до pH 7, 2-7, 6 раствором гидроксида натрия или хлороводородной кислотой. Далее, полученный раствор разливали по стерильным флаконам и закупоривали. При необходимости, из раствора получали лиофилизат путем лиофилизации в аппарате. Для восстановления раствора для вакцинирования использовали воду для инъекций или стерильный физиологический раствор. Пример 5
Анализ свойств композиций согласно изобретению
Для исследования свойств композиции согласно изобретению были получены следующие составы (представлены в таблице ниже)
Таблица 1
Figure imgf000014_0001
Композиции с различным содержанием белка, полученные согласно примеру 5, исследовали на стабильность перед началом исследования и по истечении 6 недель хранения в стресс-условиях (условия «ускоренного хранения»). Перед началом исследования измеряли pH, содержание белка, визуально оценивали прозрачность, гомогенность, если композиция представлял собой эмульсию. Композиции с различным содержанием нуклеокапсидного белка N разливали по стерильным флаконам, закупоривали и помещали в камеру ускоренного хранения для испытания на стабильность. В камере поддерживали температуру +20°С в течение 6 недель. По истечении времени флаконы извлекали и проводили анализ на pH и содержание белка нуклеокапсидного N. Измерение pH проводили непосредственно в растворе с помощью pH- метра. Анализ на содержание белка проводили методом спекторофометрии, при длине волны 280 нм. Далее высчитывали снижение концентрации нуклеокапсидного белка N в исследуемом растворе после хранения в течение 6 недель по отношению к первоначальному значению.
Результаты представлены в таблице ниже.
Таблица 2
Figure imgf000015_0001
Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что полученные композиции, содержащие нуклеокапсидный белок N в концентрации от 20 мкг/мл до 100 мкг/мл, являются стабильными.
Пример 6
Исследование иммуногенных свойств полученных композиций
Полученные композиции исследовали на возможность индукции специфического иммунитета (иммуногенность) Животных вида хомячки сирийские (самки) в количестве 240 шт. случайным образом делили на следующие равные группы:
Группа № 1 - вводили композицию, содержащую 20 мкг/ мл белка.
Группа № 2 - вводили композицию, содержащую 50 мкг/ мл белка.
Группа № 3 - вводили композицию, содержащую 100 мкг/ мл белка.
Группа № 4 - вводили композицию, не содержащую белок (плацебо).
Более подробные данные по составу представлены в таблице ниже.
Таблица 2
Figure imgf000016_0001
* - все значения приведены в расчете на 1 мл композиции.
На момент начала эксперимента возраст животных составлял 6-8 недель, диапазон массы - 56,37-149,28 г. Адаптационный период составлял 5 дней, при ежедневном осмотре животных (состояние, измерение температуры). Животных содержали в стандартных условиях в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза от 22.09.2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. Композиции вводили внутримышечно, в дозе по 0,5 мл на животное, при этом использовали дробное введение, с перерывом на 14 дней (введение в 1 день и в 15 день).
Схема эксперимента представлена в таблице ниже:
Таблица 3
Figure imgf000017_0001
Анализ ИФА на специфические антитела проводили по следующей методике: После иммунизации композициями 1-4 мышей типа Balb/c, в возрасте 6-8 недель, дозой в объёме 500 мкл, по 250 мкл в каждое заднее бедро.
Далее, на 42 сутки после введения второй дозы мышей усыпляли в камере, наполненной СОг газом. Далее осуществляли забор крови на содержание специфических антител и внутренних органов на гистологические анализы.
Кровь помещали в пробирки типа Eppendorf, содержащие ЭДТА в концентрации 1-2 мг/мл. Пробирки с кровью и ЭДТА центрифугировали при +4°С, в течение 20 минут. Супернатант переносили в чистые пробирки в ламинарном боксе. Полученную плазму замораживали.
Процедура проведение иммуноферментного анализа (ИФА):
Использовали следующие реагенты: посадочные антигены, 1 мкг/мл, 100 мкл/ лунку; блокировку 0,5 % молоком в отмывочном буфере (20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 0,05 % полисорбат 20, pH 7,4±0,1), 300 мкл/лунку.
Отмывку проводили следующим образом: сливали содержимое планшета, планшет промывали 4 раза по 300 мкл на лунку отмывочным буфером (20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 0,05 % полисорбат 20, pH 7,4±0,1), лунки тщательно осушали, избегая образования пузырей, путем постукивания планшета о салфетку.
При нанесении сывороток подбирали титр для каждой отдельной сыворотки, 100 мкл/лунку, термостатировали и центрифугировали.
Нанесение вторичных антител проводили при исходном разведении 1:64000, 100 мкл/лунку, с термостатированием и перемешиванием.
Отмывку проводили следующим образом: сливали содержимое планшета, планшет промывали 4 раза по 300 мкл на лунку отмывочным буфером (20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 0,05 % полисорбат 20, pH 7,4±0,1), лунки тщательно осушали, избегая образования пузырей, путем постукивания планшета о салфетку. Добавляли раствора хромогена, 100 мкл/лунку, 12 минут в защищенном от света месте. Далее вносили стоп-раствор, 50 мкл/лунку. Съем результатов проводили при длине волны 450 нм, референс 620 нм. Результаты считались приемлемыми, если выполнены критерии пригодности и критерии приемлемости.
Согласно ГОРАС, предел обнаружения рассчитывают по стандартному отклонению холостой пробы. Для этого измеряют величину аналитического сигнала для достаточного количества холостых проб и рассчитывают стандартное отклонение их значений.
Как правило, используется формула (Kaiser Н. Zur definition der nachweisgrenze, der garantie grenze und der dabei benutzten begriffe, Дёрффель К. Статистика в аналитической химии):
LOD = Average+k*SD, где к = 3
Предел обнаружения (LOD) рассчитывают по оптической плотности блокирующего буфера по формуле:
LOD = Average+10*SD, где average - среднее значение оптической плотности блокирующего буфера,
SD - среднеквадратичное отклонение оптической плотности блокирующего буфера,
Принимается, что в образце присутствуют специфичные антитела, если средняя оптическая плотность образца больше, чем Cut-off, при этом Cut-off = LOD + 20% (20% соответствуют критерию пригодности иммуноферментной системы для оптической плотности на уровне поглощения блокирующего буфера (бланка)):
Cut-off = 1,2* LOD = l,2*(Average+10*SD).
Титром сыворотки считается крайнее разведение, при котором оптическая плотность превышает сигнал дискриминационного уровня (cut-off), используется усредненная оптическая плотность. Результаты по определению титра специфических антител IgG представлены в таблице ниже.
Таблица 4
Figure imgf000020_0001
** - обнаружены титры неспецифических антител, характерных для данного вида животных.
Nd- не определено, титр отсутствует.
Выраженный иммунный ответ регистрировали при однократном и двукратном внутримышечном введении композиций в группах №№ 1-3 в дозе 0,5 мл/животное с пиком титра специфических антител на 22-й день эксперимента и с сохранением до 43-го дня в диапазоне 1:32000-1:17800. Появление специфических антител регистрировали через 15 дней после первой вакцинации животных. Пример 7
Исследование иммуногенных свойств полученных композиций (протективность)
Полученные композиции исследовали на возможность индукции специфического иммунитета (протективность).
Оценку протективных свойств композиций оценивали после двухкратной вакцинации и заражения культурой коронавируса.
Для выработки иммунитета использовали композиций и схему вакцинации, как описано в примере 5. Для иммунизации использовали композиции, содержащие белок N в различной концентрации, а также плацебо (композицию, не содержащую белок и содержащую только растворитель и вспомогательные вещества).
Композиции для вакцинации представлены в таблице ниже.
Таблица 5
Figure imgf000021_0001
* - все значения приведены в расчете на 1 мл композиции.
Самок сирийских хомячков в количестве 50 шт. рандомно разделили на 5 групп, содержащих по 10 особей. Группы животных сначала иммунизировали на 1-й и 15-й день композициями с различным содержанием белка. Далее, на 29-й день животных заражали вирусом SARS-CoV-2 и регистрировали клинические проявления заболевания и выздоровления.
Обозначение группы в зависимости от введенной композиции и заражения вирусом приведены в таблице ниже.
Таблица 6
Figure imgf000022_0001
С целью формирования патологии животным под общим наркозом интраназально однократно вводили вирус SARS-CoV-2 (паспортизированный штамм ФГБНУ «ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН» №ПИК35 GISAID ID EPI ISL 428852) в объеме 50 мкл в дозе 5 lgTCID50 на животное. На протяжении эксперимента у животных контролировали общее состояние и массу тела. Эвтаназию животных проводили на 3-й и 7-й дни после заражения. Легкие фотографировали и взвешивали для дальнейшей оценки массового коэффициента. Макроскопически проведена оценка изменений цвета и структуры легочной ткани. Правое легкое использовали для оценки микроскопических изменений. Гистологический анализ включал в себя оценку трех признаков: воспаление легких, клеточный инфильтрат и отек. Левое легкое и ткани носовых раковин использовали для оценки количества РНК вируса SARS-CoV-2 методом ОТ-ПЦР по показателю Ct.
В период иммунизации не отмечено патологических изменений в общем состоянии экспериментальных животных и снижения массы тела. Фотографии патологий представлены на Фиг. 1-2. Общие результаты представлены в таблице ниже.
Таблица 7
Figure imgf000023_0001
После заражения вирусом у животных отмечали: снижение массы на 10-15% в ходе инфекционного процесса, наличие клинической симптоматики, накопление РНК вируса в нижних и верхних дыхательных путях на 3-й день инфекции, макро- и микроскопическими изменения легких, наиболее выраженные на 7-й день развития патологии, увеличением массового коэффициента легких в 1,5 раза.
Гистологические исследования легких представлены на Фиг. 1-3.
В соответствии с полученными данными установлено, что введение композиции №8 не привело к развитию фармакологических эффектов на течение коронавирусной инфекции у сирийских хомячков. Введение композиций, содержащих белок, №№5, 6, 7 оказало положительное влияние на инфекционный процесс в виде тенденции к увеличению массы тела и улучшению общего самочувствия животных на 5-й день патологии, и уменьшения выраженности гистологических изменений легочной ткани на 7-й день после заражения.
В ходе данного исследования было показано, что композиции, содержащие белок N в различных концентрациях и адъювант, обладают протективными свойствами при заражении инфекцией SARS-CoV-2. Обнаруженные свойства проявляются в виде сокращения периода болезни по полному отсутствию клинических признаков инфекции к 5-му дню после заражения, достоверного увеличения массы тела на 6-7-й дни развития инфекции с практически полным восстановлением до исходного уровня, тенденции к увеличению показателя Ct в легочной ткани на 3-й день, снижения выраженности макро- и микроскопических изменений в легочной ткани.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Фармацевтическая композиция, предназначенная для индукции специфического иммунного ответа против вируса острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащая нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в количестве от 20 до 100 мкг/мл и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, выбранные из группы, включающей буферные агенты, поверхностно-активные вещества, адъювант, изотонический агент в фармацевтически приемлемых количествах.
2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что содержит нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в количестве от 50 до 100 мкг/мл.
3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве адъюванта содержит токоферол, сквалан или их комбинацию.
3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве буферных агентов содержит фосфатно-солевой буфер.
4. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве поверхностноактивных веществ содержит полисорбат, например, полисорбат 80.
5. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве изотонического агента содержит натрия хлорид, калия хлорид.
6. Композиция по и. 1, имеющая следующий состав на 1 мл:
Нуклеокапсидный белок N SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность
23 SEQ ID NO: 1 20- 100 мкг
Сквалан - 15-40 мг; а-токоферол 5- 15 мг;
Полисорбат 80 1- 10 мг;
Натрий фосфорно-кислый двузамещенный 0,1- 2,0 мг;
Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,01-0,25 мг;
Калия хлорид 0,01-0,2 мг;
Натрия хлорид 0,1- 8,5 мг;
Вода для инъекций до 1 мл.
7. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что имеет pH от 7,2 до 7,6.
8. Композиция по пи. 1-7, отличающаяся тем, что имеет следующий состав на
1 мл:
Нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 50-100 мг
Сквалан 24-36 мг; а-токоферол 8-12 мг;
Полисорбат 80 10-12 мг;
Натрий фосфорно-кислый двузамещенный 1,5-1, 8 мг;
Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,1-0,122 мг;
Калия хлорид 0,1-0,21 мг;
Натрия хлорид 4-8,1 мг;
Вода для инъекций до 1 мл.
8. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что представляет собой раствор, эмульсию или лиофилизат.
9. Композиция по и. 6, отличающаяся тем, что представляет собой раствор или эмульсию.
10. Применение композиции по и. 1-9 для профилактики или индукции специфического иммунитета против вируса острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.
11. Применение по и. 10, включающее введение композиции 2 раза последовательно в интервалом не менее 2 недель.
12. Способ получения композиции по пи. 1-9, который включает:
1) обеспечение нуклеокапсидного белка N SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в количестве от 20 до 100 мкг/мл;
2) растворение белка в водном растворителе и доведение содержания белка N в растворе до требуемой концентрации;
3) приготовление водного раствора адъюванта;
4) смешение водного раствора, содержащего белок N, и водного раствора адъюванта;
5) гомогенизация полученной смеси до получения однородного по цвету раствора;
6) регулирование полученного композиции pH до 7,2 -7,6.
13. Способ по и. 11, дополнительно включающий лиофилизацию полученного раствора с получением лиофилизата, используемого для восстановления растворителем перед введением пациенту.
14. Способ по п. 12, отличающийся тем, что полученная композиция представляет собой эмульсию.
PCT/RU2022/050154 2021-08-05 2022-05-13 Состав вакцины против covid-19 vaccine composition against covid-19 WO2023014245A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021123376 2021-08-05
RU2021123376A RU2766292C1 (ru) 2021-08-05 2021-08-05 Состав вакцины против covid-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023014245A1 true WO2023014245A1 (ru) 2023-02-09

Family

ID=80736505

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2022/050154 WO2023014245A1 (ru) 2021-08-05 2022-05-13 Состав вакцины против covid-19 vaccine composition against covid-19

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2766292C1 (ru)
WO (1) WO2023014245A1 (ru)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA011419B1 (ru) * 2005-03-23 2009-02-27 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Поливалентная противогриппозная иммуногенная композиция
RU2502520C2 (ru) * 2007-07-30 2013-12-27 Хилор Лтд. Фармацевтическая композиция и относящиеся способы
RU2519051C2 (ru) * 2008-06-25 2014-06-10 Брааш Биотех Ллк Композиции и способы для улучшенной иммуногенности соматостатина в лечении дефицита гормона роста и инсулиноподобного фактора роста
RU2016118518A (ru) * 2016-05-12 2017-11-16 федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации Противохламидийная вакцина и способ ее получения
US10973909B1 (en) * 2020-04-03 2021-04-13 Peptc Vaccines Limited Coronavirus vaccine

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220021670A (ko) * 2020-08-14 2022-02-22 (주)파이어니어백신 저온-적응성 약독화 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 및 이를 포함하는 백신

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA011419B1 (ru) * 2005-03-23 2009-02-27 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Поливалентная противогриппозная иммуногенная композиция
RU2502520C2 (ru) * 2007-07-30 2013-12-27 Хилор Лтд. Фармацевтическая композиция и относящиеся способы
RU2519051C2 (ru) * 2008-06-25 2014-06-10 Брааш Биотех Ллк Композиции и способы для улучшенной иммуногенности соматостатина в лечении дефицита гормона роста и инсулиноподобного фактора роста
RU2016118518A (ru) * 2016-05-12 2017-11-16 федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации Противохламидийная вакцина и способ ее получения
US10973909B1 (en) * 2020-04-03 2021-04-13 Peptc Vaccines Limited Coronavirus vaccine

Also Published As

Publication number Publication date
RU2766292C1 (ru) 2022-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6096839B2 (ja) 単純ヘルペスウイルス２型に対するワクチン：免疫応答を誘発する組成物および方法
KR20190022897A (ko) 미코박테리움 항원성 조성물
KR101763625B1 (ko) 수막염균 조성물 및 이의 사용 방법
BRPI0607840B1 (pt) Uso de uma composição imunogênica, e, kit
JP7339942B2 (ja) サポニンを含むリポソーム製剤および使用方法
JP5647677B2 (ja) 新規組成物
AU2017213501A1 (en) Hendra and Nipah virus G glycoprotein immunogenic compositions
KR101361769B1 (ko) Ｈｐｖ-16 ｌ1 ｖｌｐ 및 ｈｐｖ-18 ｌ1 ｖｌｐ 백신
WO2023092069A1 (en) Sars-cov-2 mrna domain vaccines and methods of use
JP2012529465A (ja) 低塩化ナトリウム濃度を有する免疫原性組成物
US20230114808A1 (en) Therapeutic rna for prostate cancer
US20090233871A1 (en) Complexed polypeptide and adjuvant for improved vaccines
US20160199482A1 (en) Hendra and nipah virus g glycoprotein immunogenic compositions
WO2015095012A1 (en) Hendra and nipah virus g glycoprotein immunogenic compositions
JP2012102132A (ja) Ｈｐｖ１６およびｈｐｖ１８ならびにｈｐｖ３１、４５または５２から選ばれる少なくとも１つの別のｈｐｖ型に対するワクチン
KR20160027019A (ko) 뎅기 바이러스 백신에 대한 방법 및 조성물
JP2006501249A (ja) ワクチン
JP2015528457A (ja) Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓに対する免疫化のための安定化されたタンパク質
JP2006503017A (ja) Ｉｌ−１３要素及びｔ細胞エピトープを含む免疫原組成物並びにその治療上の使用
KR20220070279A (ko) 면역원성 조성물
RU2766292C1 (ru) Состав вакцины против covid-19
JP2024507828A (ja) Ｂ群髄膜炎菌組換えワクチン
US20090221804A1 (en) GBS Toxin Receptor Compositions and Methods of Use
US20240189410A1 (en) Immunogenic compositions and methods for eliciting an immune response against clostridioides (clostridium) difficile
AU2018386128B2 (en) Vaccine compositions and methods of making same

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22853596

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202392961

Country of ref document: EA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE