WO2023011312A1 - 多取代噻唑衍生物及其在疾病治疗中的应用 - Google Patents

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WO2023011312A1
WO2023011312A1 PCT/CN2022/108625 CN2022108625W WO2023011312A1 WO 2023011312 A1 WO2023011312 A1 WO 2023011312A1 CN 2022108625 W CN2022108625 W CN 2022108625W WO 2023011312 A1 WO2023011312 A1 WO 2023011312A1
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alkyl
hydrogen
halogen
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段书东
秦继红
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上海汇伦医药股份有限公司
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    • C07D285/125—1,3,4-Thiadiazoles; Hydrogenated 1,3,4-thiadiazoles with oxygen, sulfur or nitrogen atoms, directly attached to ring carbon atoms, the nitrogen atoms not forming part of a nitro radical
    • C07D285/135—Nitrogen atoms

Definitions

  • the application belongs to the field of medicine and relates to a multi-substituted thiazole derivative and its application in disease treatment. Specifically, it relates to a compound of formula I or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a pharmaceutical composition comprising a compound of formula I or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and its role in the treatment or prevention of dihydroorotate dehydrogenase-mediated Disease applications, including tumors, viral infections, and immune diseases.
  • Dihydroorotate dehydrogenase is an iron-containing flavin-dependent enzyme present in the inner mitochondrial membrane, which can catalyze the fourth step reaction of pyrimidine nucleotide de novo synthesis pathway.
  • Pyrimidine nucleotides are used in DNA, RNA, glycoprotein, and phospholipid biosynthesis, and are essential for cell metabolism and cell proliferation.
  • DHODH is closely related to the occurrence and development of various tumors, so inhibiting or down-regulating DHODH can reduce tumor cell proliferation, induce its apoptosis or increase the anti-tumor effect of other target drugs.
  • the small molecule DHODH inhibitor buquinar is clinically used for breast cancer, head and neck cancer, colon cancer, gastrointestinal cancer, lung cancer, ovarian cancer, etc. It is also reported that DHODH inhibitors can be used for the treatment of acute myeloid leukemia (AML) by inducing the differentiation of leukemia cells. And it is reported that multiple drugs, such as ASLAN003, BAY 2402234, PTC299, RP7214, JNJ-74856665, and WO2018192535A1, are used for the treatment of AML.
  • the demand of lymphocytes for pyrimidine nucleotides can reach more than 8 times that in the resting state.
  • lymphocyte proliferation and various immune functions are completed, it is necessary to start the de novo synthesis pathway to supplement pyrimidine nucleotides.
  • Inhibition of DHODH can block the synthesis of nascent pyrimidines, resulting in DNA synthesis disorders, inhibiting activated T lymphocytes and B lymphocytes, thus playing an important role in immunosuppression.
  • Leflunomide is the first DHODH inhibitor to be marketed for the treatment of rheumatoid arthritis.
  • Teriflunomide the active metabolite of leflunomide, was approved for marketing in 2012 for the treatment of multiple sclerosis.
  • IMU-838 and PP-001 are in the clinical stage for the treatment of ulcerative colitis and non-infectious uveitis, respectively.
  • DHODH inhibitors prevent viral replication. Simplification of the de novo pyrimidine synthesis pathway and its role in viral replication. DHODH inhibitors can prevent the replication of a variety of viruses, including negative-strand RNA viruses (such as influenza A and B viruses), positive-strand RNA viruses (hepatitis C virus and dengue virus), and DNA viruses (vaccinia virus and adenovirus).
  • negative-strand RNA viruses such as influenza A and B viruses
  • positive-strand RNA viruses hepatitis C virus and dengue virus
  • DNA viruses vaccinia virus and adenovirus
  • the currently marketed DHODH inhibitors are only leflunomide and teriflunomide, both of which have obvious toxic side effects, such as diarrhea, abnormal liver enzymes, skin rash, and high blood pressure. Therefore, the development of highly effective and low-toxic DHODH inhibitors has important commercial value and practical significance.
  • the present application provides, on the one hand, a compound of formula I or a pharmaceutically acceptable salt thereof as a new DHODH inhibitor:
  • R 1 or R 2 are independently selected from any one of hydrogen, halogen, C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy and cyano;
  • R 3 is -(NR 7 ) p -OR 5 ;
  • R 5 or R 7 are independently selected from hydrogen or C 1-6 alkyl;
  • R 4 is arbitrarily selected from C 1-6 alkyl or C 3-6 cycloalkyl
  • M is a nitrogen atom or CR 6 ;
  • R 6 is arbitrarily selected from any one of hydrogen, halogen and C 1-6 alkyl;
  • n is any integer of 0-5; and p is 0 or 1.
  • the application provides a compound of formula I or a pharmaceutically acceptable salt thereof,
  • R 1 or R 2 are arbitrarily selected from hydrogen, halogen, C 1-3 alkyl, C 1-3 alkoxy or cyano;
  • R 3 is -(NR 7 )pOR 5 ;
  • R 5 and R 7 are arbitrarily selected from hydrogen or C 1-3 alkyl;
  • R 4 is arbitrarily selected from C 1-4 alkyl or C 3-6 cycloalkyl
  • M is a nitrogen atom or CR 6 ;
  • R 6 is arbitrarily selected from any one of hydrogen, halogen and C 1-3 alkyl;
  • n is any integer of 0-3; and p is 0 or 1;
  • the compound of formula I of the present application has the following structure of formula Ia,
  • X is a halogen
  • R 1 or R 2 are independently selected from any one of hydrogen, halogen, C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy and cyano;
  • R 3 is -(NR 7 ) p -OR 5 ;
  • R 5 or R 7 are independently selected from hydrogen or C 1-6 alkyl;
  • R 4 is arbitrarily selected from C 1-6 alkyl or C 3-6 cycloalkyl
  • M is a nitrogen atom or CR 6 ;
  • R 6 is arbitrarily selected from any one of hydrogen, halogen and C 1-6 alkyl;
  • n is any integer of 0-5; and p is 0 or 1.
  • the compound of formula I of the present application has the following structure of formula Ib,
  • R 1 or R 2 are independently selected from any one of hydrogen, halogen, C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy and cyano;
  • R 3 is -(NR 7 ) p -OR 5 ;
  • R 5 or R 7 are independently selected from hydrogen or C 1-6 alkyl;
  • R 4 is C 3-6 cycloalkyl
  • R is arbitrarily selected from hydrogen or C 1-6 alkyl
  • n is any integer of 0-5; and p is 0 or 1.
  • the compound of formula I of the present application has the following structure Ic,
  • R 1 or R 2 are independently selected from any one of hydrogen, halogen, C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy and cyano;
  • R 3 is -(NR 7 ) p -OR 5 ;
  • R 5 or R 7 are independently selected from hydrogen or C 1-6 alkyl;
  • R Any one selected from hydrogen, C 1-6 alkyl and C 3-6 cycloalkyl;
  • n is any integer of 0-5; and p is 0 or 1.
  • R 1 or R 2 is any one of hydrogen, halogen, methyl, methoxy, trifluoromethyl, trifluoromethoxy and cyano;
  • X is fluorine, chlorine or bromine
  • R 3 is hydroxyl or -NR 7 -OR 5 ;
  • R is hydrogen, methyl, ethyl, n-propyl or isopropyl; preferably, R is hydrogen, methyl or ethyl;
  • R is selected from hydrogen, methyl or ethyl
  • R is methyl, ethyl, propyl , unsubstituted or halogen substituted cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl or cyclohexyl; preferably, R is methyl, ethyl, propyl, 2- Fluorocyclopropyl or 2,2-difluorocyclopropyl; wherein when the cycloalkyl group of R has a chiral center, the application further includes its corresponding stereoisomer;
  • R is hydrogen , fluorine, chlorine, methyl or ethyl; preferably, R is hydrogen, fluorine or methyl;
  • n 0, 1 or 2;
  • p 0 or 1.
  • Preferred formula I compounds of the present application include the following compounds:
  • Another aspect of the present application provides a method for preparing a compound of formula I, the method comprising: preparing the compound of formula I by reacting formula II and formula III.
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , M, m, and n have the same definition range as formula I
  • R 8 is an amino protecting group or hydrogen, and the protecting group includes but not limited to, tert-butoxy Carbonyl, benzyloxycarbonyl, etc.; when R 8 is a protecting group, Formula II reacts with Formula III after removing the protecting group; when R 3 is a hydroxyl group, it can be further combined with NH 2 OH, NH 2 OR 5 and NHR 7 OR 5 or a corresponding salt thereof to prepare a compound of formula I.
  • the compound of formula II can be obtained by coupling reaction of formula IV and formula V under metal catalysis.
  • the metal catalyst preferably uses tris(dibenzylidene indeneacetone) dipalladium, 2-dicyclohexylphosphine-2',6'-diisopropoxy-1,1'-biphenyl as ligand, and alkali metal carbon salt as base.
  • R 2 , R 4 , R 6 , R 8 , and n have the same definition range as the aforementioned structures.
  • formula IV can be prepared by reacting formula VI with formula VII.
  • Formula XX is obtained by reacting R substituted benzonitrile under the catalysis of bistrimethylsilylamide lithium; then reacting with R substituted isocyanate XXI under alkaline conditions to prepare formula XXII, the base is, for example, an organic base, the The organic bases include, but are not limited to, triethylamine, diisopropylethylamine, and the like.
  • Formula XXII is reacted under the catalysis of elemental iodine and inorganic base to obtain formula XXIII.
  • the inorganic base includes but not limited to potassium carbonate, cesium carbonate and the like.
  • Formula XXIII is prepared by reacting with nitrite, such as sodium nitrite, to obtain formula XXIV; and then reduced by a metal reducing agent to obtain formula II.
  • the metal reducing agent includes, but is not limited to, iron powder and zinc powder. The process is expressed as follows:
  • Another aspect of the present application provides a compound of formula II,
  • M is nitrogen or CR 6 , R 6 is arbitrarily selected from any one of hydrogen, C 1-3 alkyl and fluorine atoms;
  • R Any one selected from hydrogen, halogen, C 1-3 alkyl, C 1-3 alkoxy, cyano;
  • R 4 is arbitrarily selected from C 1-4 alkyl or C 3-6 cycloalkyl
  • R 8 is an amino protecting group or a hydrogen atom, said protecting group includes, but is not limited to, tert-butoxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, etc.;
  • n is arbitrarily 0, 1, 2 or 3.
  • the compounds of formula I in the present application also include stereoisomers and optical isomers.
  • the pharmaceutically acceptable salts of the compounds of the present application can be salts formed with inorganic bases or inorganic acids, or salts formed with organic bases, and the compounds of formula I can be converted into corresponding salts by known conventional methods.
  • the salts formed with inorganic bases include but not limited to: sodium salts, potassium salts, calcium salts, hydrochlorides, sulfates, phosphates, etc.; the salts formed with organic bases include but not limited to: ethanolamine salts, ammonium Salts, and salts formed with various amino acids; as a preferred embodiment, the pharmaceutically acceptable salts of Formula I of the present application are sodium salts, potassium salts, calcium salts, and ethanolamine salts.
  • compositions which contains a compound of formula I or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and the composition can be administered by inhalation in the form of a solution, a suspension, an inhalation, or the like; or in the form of a tablet Oral administration in the form of tablets, capsules, granules, etc.; or rectal administration or transdermal administration in the form of suppositories; or administration in the form of injection.
  • the composition may further contain a pharmaceutically acceptable diluent, which includes but not limited to excipients, binders, disintegrants, lubricants, etc. .
  • a pharmaceutically acceptable diluent which includes but not limited to excipients, binders, disintegrants, lubricants, etc.
  • the excipient includes lactose, starch, glucose, mannitol, microcrystalline cellulose, hydroxypropyl cellulose, etc.
  • the binder includes polyvinyl alcohol, ethyl cellulose, methyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, etc.
  • the disintegrant includes starch, microcrystalline cellulose, low-substituted hydroxypropyl cellulose, cross-linked carmellose sodium, etc.
  • the lubricant includes magnesium stearate, talc, polyethylene glycol Alcohol etc.
  • the compound of formula I described in the present application or its pharmaceutically acceptable salt, and the pharmaceutical combination containing the compound of formula I of the present application or its pharmaceutically acceptable salt can be used as the treatment or prevention of DHODH-mediated diseases, and the diseases include but Not limited to: autoimmune diseases, tumors, viral infections, etc.
  • the autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, psoriasis, etc.
  • the viral infection diseases include influenza virus, coronavirus and other infection-induced diseases.
  • alkyl refers to a saturated alkane with 1 to 6 carbon atoms, such as straight-chain alkane or branched alkane
  • alkoxy refers to a saturated alkyloxy group with 1 to 6 carbon atoms , such as straight-chain alkoxy or branched-chain alkoxy.
  • Specific alkyl groups include, but are not limited to, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, and the like.
  • Specific alkoxy groups include, but are not limited to, methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butyloxy, and the like.
  • halogen refers to fluorine, chlorine, bromine, iodine; preferably, the halogen in the present application is fluorine, chlorine, bromine.
  • cycloalkyl refers to a saturated cycloalkyl group containing 3 to 6 carbon atoms, including cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, and cyclohexyl.
  • the alkyl, alkoxy, and cycloalkyl groups described in the application can be unsubstituted, or optionally can be substituted by one or more substituents; as a preferred version of the application, the substituents are halogen, such as fluorine, Chlorine, bromine; As a preferred version of the present application, the alkyl, alkoxy, and cycloalkyl groups are trifluoromethyl, trifluoromethoxy, 2-fluorocyclopropyl, 2,2-difluorocyclo Propyl etc.
  • Figure 1 shows the curative effect of two embodiments of the present application on human monocytic leukemia THP-1 cells in the mouse xenograft tumor model CB17 SCID.
  • Fig. 2 shows the curative effect of two embodiments of the present application on human myeloid leukemia HL-60 cells in a mouse xenograft tumor model.
  • Fig. 3 shows the curative effect of two embodiments of the present application on human small cell lung cancer cell NCI-H82 in a mouse xenograft tumor model.
  • the present application combines the previous patent application CN107382902A of the applicant inventor by way of entirety introduction.
  • the synthesis of some compounds can refer to the method described in CN107382902A, for example, the preparation of reference example compound (E)-4-(2-chlorophenyl)-2-[1-methyl-2-(2-carboxybenzyl ylidene) hydrazino] thiazole.
  • reaction solution was quenched with water (10 mL) at 0°C, the mixture was extracted three times with dichloromethane (15 mL), the organic phases were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain the title compound as a white powdery solid 1b (34g), yield 79.1%.
  • reaction solution was quenched with water (10 mL) at 0° C., the mixture was extracted three times with dichloromethane (15 mL), the organic phases were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain the title compound 1c as a yellow oil ( 2.5g), yield 41.7%.
  • Embodiment 6 is a diagrammatic representation of Embodiment 6
  • Embodiment 7 is a diagrammatic representation of Embodiment 7:
  • Embodiment 8 is a diagrammatic representation of Embodiment 8
  • Embodiment 9 is a diagrammatic representation of Embodiment 9:
  • the compounds of the present application can be converted into pharmaceutically acceptable salts by reacting with different bases.
  • Activity Test 1 Test of the inhibitory activity of the compound of the present application on human DHODH enzyme
  • the method is to link the activity of the DHODH enzyme with the color development of the dye 2,6-dichlorophenolindophenol (DCIP).
  • DCIP 2,6-dichlorophenolindophenol
  • the purified recombinant human DHODH was diluted to 0.4 ⁇ g/mL with a test buffer (containing 50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane, 150 mM potassium chloride, 0.1% TritonX-100, pH 8.0);
  • the test buffer configuration contains 2mM L-dihydroorotic acid, 0.2mM decyl ubiquinone and 0.12mM DCIP substrate solution; add 50 ⁇ L of DHODH enzyme solution and 50 ⁇ L of The substrate solution was mixed well for 5 seconds, and the absorbance measured at 600 nM was read using a Spectramax spectrophotometer.
  • Enzyme activity can be calculated from different absorbance values by adding different test compounds.
  • Purified recombinant human DHODH enzyme was purchased from R&D SYSTEMS (catalogue number: 10062-DD), and other reagents were purchased from Sigma-Aldrich.
  • Brequinar purchased from Sigma-Aldrich
  • the inhibitory rate of the compound on cell proliferation was calculated according to the cell viability; and the half-inhibitory concentration IC50 value was fitted according to the inhibitory rate of different concentrations of the compound (see Table 1 for details).
  • Activity Test 2 Anti-cell Proliferation Activity Test of Compounds of the Application on Human Monocytic Leukemia Cells THP-1
  • the inhibitory rate of the compound on cell proliferation was calculated according to the cell viability; and the IC50 value of the half inhibitory concentration was fitted according to the inhibitory rate of different concentrations of the compound (see Table 2 for details).
  • Staurosporine was selected as a positive control compound.
  • Activity Test 4 Anti-cell Proliferation Activity Test of Compounds of the Application on Human Small Cell Lung Cancer Cell NCI-H82
  • NCI-H82 cells were seeded in 90% RPMI 1640 (Gibco, Cat. No. 22400-089) and 10% fetal bovine serum (Corning, Cat. No. 35-076-CV) in a 96-well plate, and Incubate overnight. Cells were incubated with various concentrations of test compounds for 72 hours. Cell viability was analyzed using the Promega CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit (Promega-G7573) according to the instructions provided by the supplier.
  • the inhibitory rate of the compound on cell proliferation was calculated according to the cell viability; and the half-inhibitory concentration IC50 value was fitted according to the inhibitory rate of different concentrations of the compound (see Table 4 for details).
  • Staurosporine was selected as a positive control compound.
  • the compounds of the present application have good DHOHD enzyme inhibitory activity, and the enzyme activity of some compounds is ⁇ 5nM.
  • the compounds of the present application have good anti-proliferation activity on tumor cells, and the IC 50 of the tested compounds is below about 1 ⁇ M.
  • Activity test 5 The curative effect of the compound of the present application on THP-1 cell xenograft tumor model
  • THP-1 cells (10 ⁇ 10 ⁇ 6 cells/0.2mL with Matrigel) were subcutaneously inoculated into each mouse. After the mice formed tumors and the average tumor size reached 100-150 mm 3 , the drug was started.
  • the compounds prepared in Examples 20 and 21 were selected and administered orally for 29 days to inhibit tumor growth in a dose-dependent manner.
  • the tumor inhibition rate (TG) of Example 20 (administration dose 9 mg/kg) can reach 97%; embodiment 21 (administration dose 15 mg/kg) tumor inhibition rate can reach 85%.
  • the tumor inhibition rate of the positive control compound cytarabine (10 mg/kg) was 45%.
  • the tumor inhibition rates of the two compounds were higher than those of cytarabine.
  • Activity test 6 The curative effect of the compound of the present application on HL-60 cell xenograft model
  • mice Female, 6-8 weeks old, weighing 18-22 grams.
  • HL-60 cells (10 ⁇ 10 ⁇ 6 cells/0.2mL with Matrigel) were inoculated subcutaneously in each mouse. After the mice formed tumors and the average tumor size reached 100-150 mm 3 , the drug was started.
  • the compounds prepared in Examples 20 and 21 were selected and administered orally for 18 days, and could inhibit tumor growth in a dose-dependent manner.
  • the tumor inhibition rate (TG) of Example 20 dose 22.5 mg/kg
  • the tumor inhibition rate of Example 21 administration dose 36 mg/kg
  • the tumor inhibition rate of the positive control compound cytarabine 25mg/kg
  • the tumor inhibition rates of these two compounds were higher than those of cytarabine.
  • mice Female, 6-8 weeks old, weighing 18-22 grams.
  • NCI-H82 cells (5 ⁇ 10 ⁇ 6 cells/0.2mL with Matrigel) were inoculated subcutaneously in each mouse. After the mice formed tumors and the average tumor size reached 100-150 mm 3 , the drug was started.
  • the compounds prepared in Examples 20 and 21 were selected and administered orally for 31 days, which could inhibit tumor growth in a dose-dependent manner.
  • the tumor inhibition rate (TG) of Example 20 dose 22.5 mg/kg
  • the tumor inhibition rate of Example 21 administration dose 36 mg/kg
  • the positive control compound cisplatin and etoposide combined (2mg/kg+4mg/kg) had a tumor inhibition rate of 58.7%.
  • the tumor inhibition rates of these two compounds were higher than those of the combined use of cisplatin and etoposide.
  • the compound of the present application shows excellent anti-tumor proliferation activity in animal models.
  • the compound was dissolved in physiological saline containing 5% DMSO and 10% Solutol (the percentages are all volume ratios), and were respectively configured into 0.2mg/mL and 1mg/mL solutions, wherein the 0.2mg/mL solution was used for intravenous Administration, 1mg/mL solution is used for intragastric administration.
  • the pharmacokinetic experiment was carried out on ICR mice, 3 mice in each group, the intravenous dose was 5mL/kg, and the oral gavage dose was 10mL/kg.
  • the time points of blood collection for intravenous administration are 0, 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 and 24 hours after administration, and the time points for blood collection after oral administration are 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8 and 24 hours.
  • Blood was collected through the orbital venous plexus, and 0.03 mL was sampled at each time point. Samples were placed in tubes containing K2-EDTA and kept on ice until centrifugation. Within 1 hour after collection, the samples were centrifuged at 4000RPM for 6 minutes at 2-8°C.
  • the samples were stored in a freezer at about -80°C. The supernatant was separated for LC/MS/MS analysis.
  • the LC/MS/MS system model is LC-MS/MS-23 (TQ6500+Triple quad).
  • the sample was separated on an Acquity UPLC BEH C18, 1.7 ⁇ M, 50 ⁇ 2.1mm column, and was eluted with a linear gradient starting from 30% mobile phase B, wherein mobile phase A was an aqueous solution containing 0.1% formic acid, and mobile phase B contained 0.1% Acetonitrile solution of formic acid.
  • Electrospray ionization in positive ion mode was used to acquire LC/MS/MS data, and plasma concentrations of compounds were quantified individually using standard curves.
  • the compound of general formula Ib further includes the compound prepared in the examples shown in Table 6:
  • the compound of general formula Ia further includes the compound prepared in the examples shown in Table 7:
  • the compound of general formula Ic further includes the compound prepared in the examples shown in Table 8:
  • the compounds of the present application have extremely excellent DHODH inhibitory activity, and the IC 50 value of some compounds inhibiting DHODH even reaches the level of less than 1nM. Therefore, the compound of the present application becomes a new DHODH inhibitor with low toxicity and high safety, and can be used as an anti-inflammatory agent, an autoimmune disease therapeutic agent, an immunosuppressant, an anticancer agent, a viral infection therapeutic agent, and the like.

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Abstract

本申请属于药物领域，公开了一种多取代噻唑衍生物及其在疾病治疗中的应用。具体地，公开了式I化合物或其药学上可接受的盐、包含式I化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物、及其在治疗或预防二氢乳清酸脱氢酶介导的疾病方面的应用，其中包括肿瘤、病毒感染及免疫性疾病。

Description

多取代噻唑衍生物及其在疾病治疗中的应用 技术领域
本申请属于药物领域，涉及一种多取代噻唑衍生物及其在疾病治疗中的应用。具体地，涉及式I化合物或其药学上可接受的盐、包含式I化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物、及其在治疗或预防二氢乳清酸脱氢酶介导的疾病方面的应用，其中包括肿瘤、病毒感染及免疫性疾病。
背景技术
二氢乳清酸脱氢酶(dihydroorotate dehydrogenase，DHODH)是存在于线粒体内膜的一种含铁的黄素依赖酶，可催化嘧啶核苷酸从头合成途径的第4步反应。而嘧啶核苷酸可用于DNA、RNA、糖蛋白和磷脂生物合成，对于细胞代谢和细胞增殖至关重要。
DHODH与多种肿瘤的发生、发展密切相关，因此抑制或下调DHODH可以降低肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡或者增加其他靶点药物的抗肿瘤效果。小分子DHODH抑制剂布喹那临床上被用于乳腺癌、头颈癌、结肠癌、胃肠癌、肺癌、卵巢癌等。还有报道称DHODH抑制剂可通过诱导白血病细胞分化，用于急性髓系白血病(AML)的治疗。并且据报道，多个药物，如ASLAN003、BAY 2402234、PTC299、RP7214、JNJ-74856665、以及WO2018192535A1等用于AML的治疗。
人体中静息淋巴细胞主要通过补救合成途径获取细胞代谢所需嘧啶核苷酸，但是，在免疫激活状态下，淋巴细胞对于嘧啶核苷酸的需求可达静息状态下的8倍以上，此时淋巴细胞增殖和各种免疫功能的完成都需要启动从头合成途径补充嘧啶核苷酸。抑制DHODH可以阻断新生嘧啶合成，致使DNA合成障碍，抑制活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞，从而在免疫抑制中起重要作用。来氟米特是第一个上市的DHODH抑制剂，用于治疗类风湿性关节炎。特立氟胺是来氟米特的活性代谢产物，于2012年获批上市，用于治疗多发性硬化症。此外，还有IMU-838和PP-001处于临床阶段，分别用于治疗溃疡性结肠炎和非感染性葡萄膜炎。
DHODH抑制剂可防止病毒复制。从头进行嘧啶合成途径的简化及其在病毒复制中的作用。DHODH抑制剂可阻止多种病毒的复制，包括负链RNA病毒(如甲乙型流感病毒)、正链RNA病毒(丙型肝炎病毒与登革热病毒)与DNA病毒(牛痘病毒与腺病毒)等。现有上市的DHODH抑制剂仅有来氟米特和特立氟胺，两者均有明显的毒副作用，如腹泻、肝酶异常、皮疹以及高血压等。因此，开发高效、低毒的DHODH抑制剂具有重要的商业价值与现实意义。
发明内容
本申请一方面提供作为新的DHODH抑制剂的式I化合物或其药学上可接受的盐：
Figure PCTCN2022108625-appb-000001
其中，
R 1或R 2独立选自氢、卤素、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基和氰基中的任一种；
R 3为-(NR 7) p-O-R 5；R 5或R 7独立选自氢或C 1-6烷基；
R 4任意选自C 1-6烷基或C 3-6环烷基；
M是氮原子或者CR 6；R 6任意选自氢、卤素和C 1-6烷基中的任一种；
m或n任意为0-5的整数；并且p为0或1。
作为本申请的优选方案，本申请提供一种式I化合物或其药学上可接受的盐，
Figure PCTCN2022108625-appb-000002
其中，
R 1或R 2任意选自氢、卤素、C 1-3烷基、C 1-3烷氧基或氰基；
R 3为-(NR 7)p-O-R 5；R 5、R 7任意选自氢或C 1-3烷基；
R 4任意选自C 1-4烷基或C 3-6环烷基；
M是氮原子或CR 6；R 6任意选自氢、卤素和C 1-3烷基中的任一种；
m或n为0-3的任意整数；并且p为0或1；
作为本申请的优选方案，本申请的式I化合物具有如下式Ia结构，
Figure PCTCN2022108625-appb-000003
其中，
X为卤素；
R 1或R 2独立选自氢、卤素、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基和氰基中的任一种；
R 3为-(NR 7) p-O-R 5；R 5或R 7独立选自氢或C 1-6烷基；
R 4任意选自C 1-6烷基或C 3-6环烷基；
M是氮原子或者CR 6；R 6任意选自氢、卤素和C 1-6烷基中的任一种；
m或n为0-5的任意整数；并且p为0或1。
作为本申请的优选方案，本申请的式I化合物具有如下式Ib结构，
Figure PCTCN2022108625-appb-000004
其中，
R 1或R 2独立选自氢、卤素、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基和氰基中的任一种；
R 3为-(NR 7) p-O-R 5；R 5或R 7独立选自氢或C 1-6烷基；
R 4是C 3-6环烷基；
R 6任意选自氢或C 1-6烷基；
m或n为0-5的任意整数；并且p为0或1。
作为本申请的优选方案，本申请的式I化合物具有如下是Ic结构，
Figure PCTCN2022108625-appb-000005
其中，
R 1或R 2独立选自氢、卤素、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基和氰基中的任一种；
R 3为-(NR 7) p-O-R 5；R 5或R 7独立选自氢或C 1-6烷基；
R 4任意选自氢、C 1-6烷基和C 3-6环烷基中的任一种；
m或n为0-5的任意整数；并且p为0或1。
作为本申请的优选方案，化合物式I中，R 1或R 2是氢、卤素、甲基、甲氧基、三氟甲基、三氟甲氧基和氰基中的任一种；
X为氟、氯或溴；
R 3为羟基或-NR 7-O-R 5；
R 5为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；优选地，R 5为氢、甲基或乙基；
R 7选自氢、甲基或乙基；
R 4为甲基、乙基、丙基、未取代或卤素取代的环丙基、环丁基、环戊基或环己基；优选地，R 4为甲基、乙基、丙基、2-氟代环丙基或2，2-二氟代环丙基；其中当R 4的环烷基具有手性中心时，本申请还进一步包括其相应的立体异构体；
R 6为氢、氟、氯、甲基或乙基；优选地，R 6为氢、氟或甲基；
m或n是0、1或2；并且
p是0或1。
本申请的式I化合物包括但不限于以下化合物：
Figure PCTCN2022108625-appb-000006
Figure PCTCN2022108625-appb-000007
Figure PCTCN2022108625-appb-000008
Figure PCTCN2022108625-appb-000009
Figure PCTCN2022108625-appb-000010
Figure PCTCN2022108625-appb-000011
Figure PCTCN2022108625-appb-000012
本申请优选的式I化合物包括以下化合物：
Figure PCTCN2022108625-appb-000013
本申请另一方面提供一种式I化合物的制备方法，所述方法包括：式II与式III反应制备得到式I所示化合物。
Figure PCTCN2022108625-appb-000014
其中，R 1、R 2、R 3、R 4、M、m、n具有与式I相同的定义范围，R 8是氨基保护基或氢，所述保护基包括但不限于，叔丁氧基羰基、苄氧基羰基等；当R 8为保护基时，式II先脱除保护基后再与式III反应；当R 3为羟基时，可进一步与任选自NH 2OH、NH 2OR 5以及NHR 7OR 5或其相应的盐反应，以制备式I化合物。
当M为CR 6时，式II化合物可通过式IV与式V在金属催化下发生偶联反应得到。金属催化剂优选以三(二亚苄基茚丙酮)二钯、2-二环己基磷-2′，6′-二异丙氧基-1，1′-联苯作为配体，以碱金属碳酸盐作为碱。
Figure PCTCN2022108625-appb-000015
其中，R 2、R 4、R 6、R 8、n具有前述结构相同的定义范围。
当M为CR 6，且R 6为卤素，如氟取代时，式IV可通过将式VI与式VII反应制备得到。
Figure PCTCN2022108625-appb-000016
当M为氮原子时，所述式II通过下述方法制备：
通过R 2取代苯腈在双三甲基硅基胺基锂催化下反应得到式XX；再与R 4取代异氰酸酯XXI在碱的条件下反应制备式XXII，所述碱是，例如有机碱，所述有机碱包括但不限于，三乙胺、二异丙基乙基胺等。式XXII在单质碘和无机碱的催化下反应得到式XXIII，所述的无机碱，包括但不限于，碳酸钾，碳酸铯等。式XXIII与亚硝酸盐，如亚硝酸钠等，反应制备得到式XXIV；再经金属还原剂还原得到式II，所述金属还原剂包括但不限于，铁粉、锌粉。所述过程表述如下：
Figure PCTCN2022108625-appb-000017
本申请再一方面提供一种式II化合物，
Figure PCTCN2022108625-appb-000018
其中，
M为氮或CR 6，R 6任意选自氢、C 1-3烷基和氟原子中的任一种；
R 2任意选自氢、卤素、C 1-3烷基、C 1-3烷氧基、氰基中的任一种；
R 4任意选自C 1-4烷基或C 3-6环烷基；
R 8为氨基的保护基或氢原子，所述保护基包括但不限于，叔丁氧基羰基、苄氧羰基等；并且
m任意为0、1、2或3。
本申请式I化合物还包括立体异构体和光学异构体。本申请化合物药学上可接受的盐可以是与无机碱或无机酸形成的盐、与有机碱形成的盐，并且可通过已知的常规方法将式I化合物转化成对应的盐。所述与无机碱形成的盐包括但不限于：钠盐、钾盐、钙盐、盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐等；所述与有机碱形成的盐包括但不限于：乙醇胺盐、铵盐、以及与各种氨基酸形成的盐等；作为优选的实施例，本申请式I药学上可接受的盐为钠盐、钾盐、钙盐、乙醇胺盐。
本申请再一方面提供一种药物组合物，所述组合物含有式I化合物或其药学上可接受的盐，所述组合物可以溶液、悬浮液、吸入剂等形式吸入给药；或以片剂、胶囊剂、颗粒剂等形式口服给药；或以栓剂的形式直肠给药或经皮给药；或以注射液形式给药。
本申请的药物组合物制备成口服制剂时，该组合物中可进一步含有药学上可接受的稀释剂，所述稀释剂包括但不限于赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。所述赋形剂包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甘露醇、微晶纤维素、羟丙基纤维素等；所述粘合剂包括聚乙烯醇、乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素等；所述崩解剂包括淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；所述润滑剂包括硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇等。将上述稀释剂与药物组合物混合后，可用常规方法压成片剂。如果需要包衣，可将前述片芯用明胶、二氧化钛等糖溶液包衣。或者将本申请化合物与稀释剂充分混合后，直接填充胶囊，制备成胶囊剂。
本申请所述式I化合物或其药学上可接受的盐，以及含有本申请式I化合物或其药学上可接受的盐的药物组合可作为治疗或预防DHODH介导的疾病，所述疾病包括但不限于：自 身免疫疾病、肿瘤、病毒感染等。所述自身免疫疾病包括类风湿性关节炎、银屑病等；所述病毒感染疾病包括流感病毒、冠状病毒等感染引起的疾病。
术语解释：
本申请中，“烷基”是指具有1至6个碳原子的饱和烷烃，如直链烷烃或支链烷烃；“烷氧基”是指具有1至6个碳原子的饱和烷基氧基，如直链烷氧基或支链烷氧基。具体的烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基等。具体的烷氧基包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁基氧基等。
本申请中，“卤素”是指氟、氯、溴、碘；优选地，本申请的卤素为氟、氯、溴。
本申请中，“环烷基”是指含有3至6个碳原子的饱和环烷基，包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基。
本申请所述的烷基、烷氧基、环烷基可以是未取代的，或任选可被一个或多个取代基取代；作为本申请优选方案，所述取代基为卤素，如氟，氯，溴；作为本申请优选方案，所述烷基、烷氧基、环烷基为三氟甲基、三氟甲氧基、2-氟代环丙基、2，2-二氟代环丙基等。
附图说明
图1示出了本申请的两个实施例分别对人单核细胞白血病THP-1细胞在小鼠异体移植瘤模型CB17 SCID的疗效。
图2示出了本申请的两个实施例对人原髓细胞白血病HL-60细胞在小鼠异体移植瘤模型的疗效。
图3示出了本申请的两个实施例对人小细胞肺癌细胞NCI-H82在小鼠异体移植瘤模型的疗效。
具体实施方式
为了更好地理解本申请，下文将结合具体实施例和附图描述本申请具体的技术方案。但是，应理解，并不以此限定本申请。除非特别说明，本申请实施例所使用的化合物、试剂、实验动物等均可商购获得。
在此，本申请以整体引入的方式，组合被申请发明人先前的专利申请CN107382902A。具体地，部分化合物的合成可参考CN107382902A中描述的方法，例如，制备参考例化合物(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-甲基-2-(2-羧基苄叉基)肼基]噻唑。
实施例1：
(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(1)
Figure PCTCN2022108625-appb-000019
步骤(a)叔丁基(对甲苯磺酰基)氨基甲酸酯(1b)
称取20g(0.15mol)羟基氨基甲酸叔丁酯1a置于500mL三口瓶中，加入30mL二氯甲烷，在0℃搅拌状态下加入32.5g(0.165mol)对甲苯磺酰氯的二氯甲烷溶液20mL，搅拌5分钟后，加入15.2g(0.15mol)N-甲基吗啉，反应液升温至室温并反应16个小时。在0℃ 下反应液用水(10mL)淬灭，混合物用二氯甲烷(15mL)萃取三次，有机相合并后用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压浓缩，得到白色粉状固体的标题化合物1b(34g)，收率79.1％。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.23(s，1H)，7.79(d，J＝8.4Hz，2H)，7.49(d，J＝8.1Hz，2H)，2.43(s，3H)，1.23(s，9H).
步骤(b)叔丁基-2-环丙基肼基碳酸酯(1c)
称取9.93g(0.17mol)环丙胺置于500mL三口瓶中，加入20mL四氢呋喃，在-5℃搅拌状态下加入3.52g(34.8mmol)N-甲基吗啉，然后在-5℃搅拌下加入10g(34.8mmol)中间体1b的四氢呋喃溶液20mL，反应液升温至室温并反应16个小时。在0℃下反应液用水(10mL)淬灭，混合物用二氯甲烷(15mL)萃取三次，有机相合并后用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压浓缩，得到黄色油状的标题化合物1c(2.5g)，收率41.7％。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.54(s，1H)，6.44(d，J＝2.8Hz，1H)，1.12(s，9H)，0.57(td，J＝7.0，4.6Hz，2H)，0.47-0.40(m，2H).
步骤(c)1-(2-氯苯基)-2-硫氰酸乙烷-1-酮(1e)
称取4g(17.1mmol)1d(2-溴-1-(2-氯苯基)乙酮)置于100mL单口瓶中，加入50mL无水乙醇，在室温搅拌状态下加入4.0g(41.2mmol)硫氰酸钾，反应液在85℃回流反应3个小时。反应液减压浓缩，柱层析分离得到黄色油状产物1e(3.8g)，收率97％。LCMS：211.9，213.9([M+H]+).
步骤(d)2-溴-4-(2-氯苯基)噻唑(1f)
称取3.8g(18.0mmol)中间体1e置于100mL单口瓶中，加入50mL冰醋酸，在室温搅拌状态下加入40mL醋酸的氢溴酸溶液，反应液在140℃回流反应3个小时。反应液倾倒入(100mL)冰水中，混合液用乙酸乙酯(50mL)分别萃取三次，有机相合并后用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液浓缩，得到粗品用柱层析分离得到黄色油状产物(2.5g)，收率51％。LCMS：273.9，275.9([M+H]+).
步骤(e)2-(4-(2-氯苯基)噻唑-2-基)-2-环丙基肼-1-羧酸叔丁酯(1g)
称取3g(11mmol)中间体2-溴-4-(2-氯苯基)噻唑1f置于500mL单口瓶中，加入1.9g(11mmol)中间体1c，0.51g(0.55mmol)的三(二亚苄基茚丙酮)二钯，0.51g(1.10mmol)的2-二环己基磷-2′，6′-二异丙氧基-1，1′-联苯和7.19g(22mmol)的碳酸铯，反应液在室温搅拌下，用氮气置换三次，反应液在100℃下搅拌反应16个小时，反应液硅藻土过滤，滤液减压浓缩，得到的粗品用柱层析分离得到黄色固体中间体1g(100mg，收率：3％)。LCMS：366.1，368.1([M+H]+).
步骤(f)4-(2-氯代苯基)-2-(1-环丙基肼)噻唑(1h)
称取100mg(0.27mmol)的中间体2-(4-(2-氯苯基)噻唑-2-基)-2-环丙基肼-1-羧酸叔丁酯1g置于100mL单口瓶中，加入10mL二氯甲烷，在室温搅拌状态下加入2mL三氟乙酸，反应液在室温搅拌反应2个小时。反应液减压浓缩，得到黄色油状中间体1h(70mg)收率97.2％。LCMS：266.0，268.0([M+H]+).
步骤(g)(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(1)
称取70mg(0.26mmol)的中间体4-(2-氯代苯基)-2-(1-环丙基肼)噻唑1h置于100mL单口瓶中，加入5mL二氯甲烷和44mg(0.26mmol)的3-氟-6-醛基苯甲酸，反应液在室温下搅拌反应2个小时。反应液减压浓缩，用高效液相制备色谱法纯化得到白色固体目标化合物 1(27mg，收率：25％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ13.67(s，1H)，9.09(s，1H)，8.05(dd，J＝8.8，5.7Hz，1H)，7.94(dd，J＝7.7，1.7Hz，1H)，7.68(dd，J＝9.5，2.8Hz，1H)，7.60-7.50(m，2H)，7.50-7.39(m，2H)，7.36(td，J＝7.6，1.8Hz，1H)，2.91-2.83(m，1H)，1.27-1.17(m，2H)，1.08-0.98(m，2H).
实施例2：
(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氯苄叉基)肼基]噻唑(2)
Figure PCTCN2022108625-appb-000020
与实施例1的方法类似，用2-氯-6醛基苯甲酸替代2-氟-6-醛基苯甲酸与中间体1h反应得到42mg的标题化合物2。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ13.72(s，1H)，9.09(s，1H)，8.02(d，J＝8.6Hz，1H)，7.98-7.86(m，2H)，7.75(dd，J＝8.5，2.3Hz，1H)，7.62-7.27(m，4H)，2.98-2.78(m，1H)，1.31-1.12(m，2H)，1.10-0.95(m，2H).
实施例3：
(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-环丁基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(3)
Figure PCTCN2022108625-appb-000021
与中间体1c方法类似，采用环丁基胺替代环丙胺与中间体1b反应得到3c；与实施例1方法类似，得到27mg的标题化合物3。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ13.66(s，1H)，8.76(s，1H)，8.02(dd，J＝8.7，5.8Hz，1H)，7.96-7.88(m，1H)，7.66(d，J＝7.2Hz，1H)，7.57-7.46(m，3H)，7.47-7.38(m，1H)，7.40-7.31(m，1H)，4.83(s，1H)，2.89-2.74(m，2H)，2.61-2.52(m，2H)，1.90-1.75(m，2H).
实施例4：
(E)-4-(3-氯苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(4)
Figure PCTCN2022108625-appb-000022
与实施例1方法类似，采用2-溴-1-(3-氯苯基)乙酮4d替代1d，得到29mg的标题化合物4。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ13.71(s，1H)，9.13(s，1H)，8.04(dd，J＝8.8，5.7Hz，1H)，7.95(t，J＝1.7Hz，1H)，7.88(d，J＝7.8Hz，1H)，7.67(dd，J＝9.5，2.8Hz，1H)，7.62(s，1H)，7.53(td，J＝8.5，2.8Hz，1H)，7.46(t，J＝7.9Hz，1H)，7.40-7.33(m，1H)，2.91(tt，J＝6.8，3.8Hz，1H)，1.31-1.21(m，2H)，1.10-0.99(m，2H).
实施例5：
Figure PCTCN2022108625-appb-000023
2-溴-1-(2-三氟甲基苯基)乙酮(5d)
称取10g(53.2mmol)2-三氟甲基苯乙酮(5c)置于500mL单口瓶中，加入50mL甲醇，在室温搅拌状态下加入5.68g(58.5mmol)溴化铵和35.98g(58.5mmol)过氧单磺酸钾，反应液室温搅拌下，置换氩气三次，反应液在65℃反应16个小时。反应液过滤，滤液用水(10mL)淬灭，混合物用二氯甲烷(15mL×3)萃取，有机相合并后用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压浓缩，得到油状中间体5d(15g)收率71％。
(E)-4-(2-三氟甲基苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(5)
与实施例1方法类似，采用2-溴-1-(2-三氟甲基苯基)乙酮5d替代1d，得到38mg的标题化合物5。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ13.66(s，1H)，9.08(s，1H)，8.04(dd，J＝8.8，5.7Hz，1H)，7.83(d，J＝7.8Hz，1H)，7.76-7.64(m，3H)，7.65-7.50(m，2H)，7.11(s，1H)，2.91-2.75(m，1H)，1.22-1.09(m，2H)，1.10-0.90(m，J＝3.8Hz，2H).
实施例6：
(E)-4-(2-甲苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(6)
Figure PCTCN2022108625-appb-000024
与实施例5的方法类似，采用2-甲基苯乙酮(6c)替代2-三氟甲基苯乙酮(5c)，得到标题化合物6。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ13.56(s，1H)，9.08(s，1H)，8.05(dd，J＝8.8，5.7Hz，1H)，7.68(dd，J＝9.5，2.8Hz，1H)，7.64-7.51(m，2H)，7.31-7.19(m，3H)，7.10(s，1H)，2.91-2.79(m，1H)，2.48(s，14H)，1.26-1.16(m，2H)，1.09-0.94(m，2H).
实施例7：
(E)-4-(4-氯苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(7)
Figure PCTCN2022108625-appb-000025
与实施例5的方法类似，采用4-氯苯乙酮(7c)替代2-三氟甲基苯乙酮(5c)，得到标题化合物7。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ13.68(s，1H)，9.11(s，1H)，8.04(dd，J＝8.8，5.7Hz，1H)，7.93(d，J＝8.5Hz，2H)，7.67(dd，J＝9.5，2.8Hz，1H)，7.58-7.52(m，2H)，7.48(d，J＝8.6Hz，2H)，2.99-2.81(m，1H)，1.27-1.22(m，2H)，1.04(q，J＝6.5，5.5Hz，2H).
实施例8：
(E)-4-(3-甲基苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(8)
Figure PCTCN2022108625-appb-000026
与实施例5的方法类似，采用3-甲基苯乙酮(8c)替代2-三氟甲基苯乙酮(5c)，得到标题化合物8。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ9.10(s，1H)，8.04(s，1H)，7.75-7.63(m，2H)，7.61-7.48 (m，2H)，7.43(s，1H)，7.35-7.25(m，1H)，7.16-7.08(m，1H)，2.92-2.85(m，1H)，2.36(s，3H)，1.28-1.21(m，2H)，1.10-0.98(m，2H).
实施例9：
(E)-4-(2-甲氧基苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(9)
Figure PCTCN2022108625-appb-000027
与实施例5的方法类似，用2-甲氧基苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物9。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ9.09(s，1H)，8.15(dd，J＝7.6，1.8Hz，1H)，8.01(dd，J＝8.9，5.7Hz，1H)，7.76-7.60(m，2H)，7.55-7.45(m，2H)，7.33-7.23(m，1H)，7.09(d，J＝8.3Hz，1H)，7.06-6.98(m，1H)，3.90(s，3H)，2.91-2.82(m，1H)，1.26-1.17(m，2H)，0.95-0.86(m，2H).
实施例10：
(E)-4-(2-三氟甲氧基苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(10)
Figure PCTCN2022108625-appb-000028
与实施例5的方法类似，用2-三氟甲氧基苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物10。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ9.09(s，1H)，8.14-8.06(m，1H)，8.06-7.97(m，1H)，7.70-7.61(m，1H)，7.57-7.39(m，4H)，7.30(s，1H)，2.91-2.80(m，1H)，1.27-1.16(m，2H)，1.05-0.95(m，2H).
实施例11：
(E)-4-(3-甲氧基苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(11)
Figure PCTCN2022108625-appb-000029
与实施例5的方法类似，采用3-甲氧基苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物11。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ9.11(s，1H)，8.11-8.00(m，1H)，7.82-7.60(m，2H)，7.60-7.44(m，3H)，7.41-7.29(m，1H)，6.89(d，J＝8.2Hz，1H)，3.81(s，3H)，2.94-2.83(m，1H)，1.30-1.20(m，2H)，1.08-1.01(m，2H).
实施例12：
(E)-4-(3-三氟甲氧基苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(12)
Figure PCTCN2022108625-appb-000030
与实施例5的方法类似，采用3-三氟甲氧基苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物12。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ9.12(s，1H)，8.04(dd，J＝8.7，5.6Hz，1H)，7.95(d，J＝7.5Hz，1H)，7.87(s，1H)，7.74-7.62(m，3H)，7.60-7.50(m，2H)，7.30(d，J＝7.9Hz，1H)，2.95- 2.87(m，1H)，1.27-1.20(m，4H)，1.08-1.01(m，2H).
实施例13：
(E)-4-(2-氟苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(13)
Figure PCTCN2022108625-appb-000031
与实施例5的方法类似，采用2-氟苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物13。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ9.12(s，1H)，8.19-8.07(m，1H)，8.05-7.95(m，1H)，7.68-7.59(m，1H)，7.57-7.44(m，2H)，7.40-7.15(m，3H)，2.92-2.83(m，1H)，1.28-1.17(m，2H)，1.09-0.98(m，2H).
实施例14：
(E)-4-(2-氰基苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(14)
Figure PCTCN2022108625-appb-000032
与实施例5的方法类似，采用2-氰基苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物14。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ9.14(s，1H)，8.09-7.97(m，2H)，7.90(dd，J＝7.3，2.0Hz，1H)，7.81-7.73(m，1H)，7.71-7.64(m，1H)，7.61(d，J＝5.2Hz，1H)，7.59-7.50(m，2H)，2.92-2.82(m，2H)，1.26-1.17(m，2H)，1.11-1.02(m，2H).
实施例15：
(E)-4-(2-溴苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(15)
Figure PCTCN2022108625-appb-000033
与实施例5的方法类似，采用2-溴苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物15。
实施例16：
(E)-4-(3-三氟甲基苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(16)
Figure PCTCN2022108625-appb-000034
与实施例5方法类似，采用3-三氟甲基苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物16。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ9.11(s，1H)，8.07-7.99(m，1H)，7.81-7.74(m，1H)，7.72(d，J＝7.9Hz，1H)，7.70-7.63(m，1H)，7.59-7.51(m，1H)，7.51-7.42(m，1H)，7.37(s，1H)，7.34-7.25(m，1H)，2.85(s，1H)，1.21(d，J＝14.2Hz，2H)，1.03(s，2H).
实施例17：
(E)-4-(3-溴苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(17)
Figure PCTCN2022108625-appb-000035
与实施例5的方法类似，采用3-溴苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物17。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ9.13(s，1H)，8.11-8.07(m，1H)，8.07-7.98(m，1H)，7.96-7.88(m，1H)，7.70-7.60(m，2H)，7.56-7.46(m，2H)，7.43-7.34(m，1H)，2.95-2.85(m，2H)，1.29-1.20(m，4H)，1.08-0.98(m，2H).
实施例18：
(E)-4-(4-甲基苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(18)
Figure PCTCN2022108625-appb-000036
与实施例5的方法类似，用4-甲基苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物18。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ9.10(s，1H)，8.03-7.96(m，1H)，7.78(d，J＝7.9Hz，2H)，7.63(dd，J＝12.4，3.0Hz，1H)，7.54-7.44(m，1H)，7.35(s，1H)，7.20(d，J＝7.9Hz，2H)，2.91-2.81(m，1H)，2.30(s，3H)，1.27-1.17(m，2H)，1.07-0.97(m，2H).
实施例19：
(E)-4-(4-三氟甲基苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(19)
Figure PCTCN2022108625-appb-000037
与实施例5的方法类似，采用4-三氟甲基苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物19。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ9.11(s，1H)，8.10(d，J＝8.2Hz，2H)，8.01(dd，J＝8.8，5.5Hz，1H)，7.76(d，J＝8.2Hz，2H)，7.69(s，1H)，7.65(dd，J＝9.4，3.0Hz，2H)，7.52(s，1H)，2.94-2.84(m，1H)，1.27-1.18(m，4H)，1.06-0.99(m，2H).
实施例20：
(E)-5-氟-4-(2-氯苯基)-2-[1-甲基-2-(2-羧基苄叉基)肼基]噻唑(20)
Figure PCTCN2022108625-appb-000038
2-氯-2-氟-1-(2-氯苯基)乙酮
称取10.0g(41.9mmol)的邻氯碘苯置于250mL三口瓶中，加入超干THF(100mL)，搅拌至溶清。氩气保护下，降温至-78℃，滴加入20.1mL的正丁基锂溶液(2.5M in hexane)。加毕，在-78℃条件下反应40min，再滴加入10.0g(71.2mmol)的氯氟乙酸乙酯，加完后， 在-78℃下再反应40min。用饱和氯化铵(200mL)淬灭，乙酸乙酯萃取三次(120mL*3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱分离(EA/PE，0％-10％)，得无色液体5.8g，收率67.0％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.66(dd，J＝8.0，1.0Hz，1H)，7.54-7.46(m，2H)，7.43-7.37(m，1H)，7.00(d，J＝50.5Hz，1H).
4-(2-氯苯基)-5-氟-2-(1-甲基肼基)噻唑
称取500mg(2.4mmol)的中间体2-氯-2-氟-1-(2-氯苯基)乙酮置于25mL的茄形瓶中，加入380mg(3.6mmol)的2-甲基氨基硫脲和10mL的超干四氢呋喃，在氮气保护下80℃反应25小时。将反应也冷却至室温，浓缩出去溶剂，加100mL水，用乙酸乙酯萃取三次(50mL*3)，合并有机相浓缩，柱层析分离，得到灰色固体220mg，收率35.3％。
(E)-5-氟-4-(2-氯苯基)-2-[1-甲基-2-(2-羧基苄叉基)肼基]噻唑
称取100mg(0.39mmol)的中间体4-(2-氯苯基)-5-氟-2-(1-甲基肼基)噻唑置于25mL的茄形瓶中，加入87.5mg(0.58mmol)的2-醛基苯甲酸，64mg(0.78mmol)的醋酸钠和10mL甲醇。在氮气保护下于室温下反应16小时。浓缩除去溶剂，加入50mL的水(50mL)，用乙酸乙酯萃取三次(50mL*3)，合并有机相浓缩，柱层析分离得黄色固体50mg的标题化合物，收率32.3％。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ8.59(s，1H)，7.94(d，J＝7.9Hz，1H)，7.89(dd，J＝7.9，1.4Hz，1H)，7.63(t，J＝7.6Hz，1H)，7.59-7.52(m，2H)，7.51-7.39(m，3H)，3.51(s，3H).
实施例21：
(E)-5-氟-4-(2-氯苯基)-2-[1-甲基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(21)
Figure PCTCN2022108625-appb-000039
与实施例20的方法类似，采用2-醛基-4-氟苯甲酸替代2-醛基苯甲酸，得到标题化合物21。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ13.64(s，2H)，8.54-8.50(m，1H)，7.98(dd，J＝8.8，5.6Hz，1H)，7.64(dd，J＝9.4，2.9Hz，1H)，7.59-7.48(m，3H)，7.47-7.39(m，2H)，3.51(s，3H).
实施例22：
(E)-2-((2-(4-(2-氯苯基)噻唑-2-基)-2-甲基肼叉基)甲基)-N-羟基苯甲酰胺(22)
Figure PCTCN2022108625-appb-000040
参考文献报道的合成方法，得到中间体化合物(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-甲基-2-(2-羧基苄叉基)肼基]噻唑。
称取1.0g(2.6mmol)的上述中间体化合物置于100mL茄形瓶中，加入30mL的四氢呋喃，室温下搅拌至固体完全溶解。加入484mg(3.0mmol)羰基二咪唑，室温下反应16小时后，冰水浴下将反应液滴加到20mL的50％的羟胺水溶液中，并搅拌1小时。加入50mL饱和食盐水溶液，并用乙酸乙酯萃取三次(50mL*3)，合并有机相浓缩，柱层析分离得到黄色固体135mg的标题化合物，收率13％。
1H NMR(400MHz，Methanol-d 4，DMSO-d 6)δ8.46(s，1H)，8.11(d，J＝8.0Hz，1H)，7.99(dd，J＝7.8，1.8Hz，1H)，7.91-7.84(m，1H)，7.67(t，J＝7.6Hz，1H)，7.56-7.29(m，5H)，3.73(s，3H).
实施例23：
(E)-2-((2-(4-(2-氯苯基)噻唑-2-基)-2-甲基肼叉基)甲基)-N-甲氧基苯甲酰胺(23)
Figure PCTCN2022108625-appb-000041
称取(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-甲基-2-(2-羧基苄叉基)肼基]噻唑500mg(1.3mmol)置于100mL茄形瓶中，加入25mL四氢呋喃，室温下搅拌至固体完全溶解，加入512mg(1.3mmol)HATU，271mg(2.6mmol)的三乙胺和167mg(2.0mmol)的O-甲基羟胺盐酸盐，室温下反应16小时。加入50mL水并用乙酸乙酯萃取三次(50mL*3)，合并有机相浓缩，柱层析分离得到白色固体167mg的标题化合物，收率30％。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ7.81(dd，J＝7.7，2.0Hz，1H)，7.77(d，J＝7.3Hz，1H)，7.72-7.62(m，2H)，7.60-7.52(m，1H)，7.47(dd，J＝7.8，1.5Hz，1H)，7.39-7.23(m，3H)，6.94(d，J＝3.4Hz，1H)，5.97(d，J＝3.3Hz，1H)，3.91(s，3H)，3.21(s，3H).
实施例24：
(E)-2-((2-(3-(2-氯苯基)-1，2，4-噻二唑-5-基)-2-甲基肼叉基)甲基)苯甲酸(133)
Figure PCTCN2022108625-appb-000042
步骤(a)2-氯苯基甲脒
量取73.0mL的双三甲基硅基胺基锂的四氢呋喃溶液(2.0M，146.0mmol)置于500mL反应瓶中，加入150mL的四氢呋喃。氮气保护下，控温0-10℃，缓慢滴加入2-氯苯腈10.0g(73.0mmol)的四氢呋喃(50mL)溶液。TLC检测原始物料完全消耗，浓缩除去反应溶剂，加入200mL纯化水，并用二氯甲烷萃取三次(200mL*3).合并有机相后，并分别用2M的盐酸(200mL)和饱和食盐水(300mL)各洗涤一次。浓缩除去溶剂得到9.5克黄色固体，直接投下一步反应。LCMS：155.1([M+H] +).
步骤(b)2-氯-N-(甲基硫脲基)苯基甲脒
称取2-氯苯基甲脒(9.5g，61.3mmol)和甲基异氰酸酯(6.8g，92.5mmol)置于500mL反应瓶中，加入乙腈(170mL)。控温20℃以下，缓慢滴加入三乙胺(18.7g，185.1mmol)。滴加完毕后，反应液在室温下反应3小时。LCMS监控原料完全消耗后，浓缩出去反应溶剂，并用柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝20∶1)得到黄色固体10.0克。该两步反应，总收率60.4％。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.03(d，J＝2.3Hz，1H)，8.60-8.56(m，1H)，7.52-7.32(m，5H)，2.84(d，J＝2.3Hz，3H).LCMS：228.1([M+H]+).
步骤(c)3-(2-氯苯基)-N-甲基-1，2，4-噻二唑-5-胺
称取2-氯-N-(甲基硫脲基)苯基甲脒(10.0g，44.1mmol)和单质碘(13.4g，52.9mmol)置于250mL的反应瓶中，加入乙腈(100mL)和碳酸钾(9.1g，66.1mmol)。室温下搅拌0.5小时后，LCMS监控原料消耗完全。向反应溶液中加入水(200mL)，并用乙酸乙酯萃取 三次(200mL*3)。合并有机相并用饱和食盐水洗涤两次(200mL*2)，并用无水硫酸钠干燥，浓缩后，柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1)得到黄色固体5.0克，收率50.4％。
1H NMR(300MHz，DMSO-d 6)：δ8.49(brs，1H)，7.78-7.75(m，1H)，7.55-7.53(m，1H)，7.46-7.41(m，2H)，2.94(d，J＝4.8Hz，3H).LCMS：226.0([M+H] +).
步骤(d)N-(3-(2-氯苯基)-1，2，4-噻二唑-5-基)-N-甲基一氧化二氮酰胺
称取3-(2-氯苯基)-N-甲基-1，2，4-噻二唑-5-胺(500mg，2.2mmol)置于50mL反应瓶中，0℃下加入2M盐酸(5mL)，并逐滴加入亚硝酸钠(150mg，2.2mmol)的水溶液(2mL)。混合溶液在0-5℃下保温反应1小时。LCMS监控反应原料完全消耗后，将反应液倾到入2mL水中，并用乙酸乙酯萃取三次(5mL*3)，合并有机相并用饱和食盐水(10mL)洗涤一次，用无水硫酸钠干燥后，柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)得到200mg的白色固体，收率35.4％。
1H NMR(300MHz，DMSO-d 6)：δ8.02-7.99(m，1H)，7.73-7.70(m，1H)，7.66-7.56(m，2H)，4.62(s，3H).LCMS：255.0([M+H] +).
步骤(f)3-(2-氯苯基)-5-(1-甲基肼基)-1，2，4-噻二唑
称取锌粉(100mg，1.57mmol)和冰醋酸(2mL)置于25mL反应瓶中，并加热到45℃，缓慢滴加入N-(3-(2-氯苯基)-1，2，4-噻二唑-5-基)-N-甲基一氧化二氮酰胺(200mg，0.79mmol)的冰醋酸溶液(2mL)，混合溶液在45-50℃条件下搅拌12小时。LCMS监控原料完全消耗后，过滤除去锌粉并用乙酸乙酯洗涤两次(20mL*2)，母液分别用饱和碳酸钠溶液洗涤三次(10mL*3)，饱和食盐水洗涤三次(10ml*)，并用无水硫酸钠干燥后，用柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)得到64mg的白色固体，收率67.7％。
1H NMR(300MHz，DMSO-d 6)：δ7.74(dd，J＝7.4，2.0Hz，1H)，7.53(dd，J＝7.8，1.4Hz，1H)，7.47-7.38(m，2H)，5.65(s，2H).LCMS：241.1([M+H] +).
步骤(g)(E)-2-((2-(3-(2-氯苯基)-1，2，4-噻二唑-5-基)-2-甲基肼叉基)甲基)苯甲酸
称取3-(2-氯苯基)-5-(1-甲基肼基)-1，2，4-噻二唑(60mg，0.25mmol)和邻醛基苯甲酸(45mg，0.3mmol)和四氢呋喃(3mL)置于10mL反应瓶中，升温至60℃反应6小时。LCMS监控原料完全消耗后，浓缩出去反应溶剂，残留固体用甲醇(5mL)打浆后得到标题化合物41mg的的白色固体。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ13.39(brs，1H)，8.78(s，1H)，7.98-7.94(m，2H)，7.88(dd，J＝7.6，2.0Hz，1H)，7.71(t，J＝7.5Hz，1H)，7.62-7.43(m，4H)，3.73(s，3H).LCMS：373.0([M+H] +).
实施例25：盐的制备
称取化合物21(E)-5-氟-4-(2-氯苯基)-2-[1-甲基-2-(2-羧酸-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(300mg，0.74mmol)溶于四氢呋喃(5mL)中，加入氢氧化钠(29.5mg，0.74mmol)。室温下搅拌2小时，浓缩除去溶剂，得到化合物21的钠盐淡黄色固体328mg(收率99％)。 1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ9.09(s，1H)，7.84(dd，J＝8.8，5.9Hz，1H)，7.64-7.38(m，5H)，7.17(td，J＝8.5，2.8Hz，1H)，3.47(s，3H).
参考上述方法，可将本申请化合物与不同的碱反应，转化为药学上可接受的盐。
活性测试1：本申请化合物对人DHODH酶抑制活性测试
该方法是将DHODH酶的活性与染料2，6-二氯苯酚靛酚(DCIP)显色联系起来。具体地，将纯化的重组人DHODH用测试缓冲液(含50mM三(羟基甲基)氨基甲烷，150mM氯化钾， 0.1％TritonX-100，pH 8.0)稀释至0.4μg/mL；另外用上述相同的测试缓冲液配置含有2mM的L-二氢乳清酸、0.2mM的癸基泛醌和0.12mM的DCIP的底物溶液；向96孔板的每个孔中加入50μL的DHODH酶溶液和50μL底物溶液，充分混合5秒钟，即使用Spectramax分光光度计读取600nM出的吸光度测量值。加入不同的测试化合物，通过不同吸光度值即可计算酶活性。纯化的重组人DHODH酶购自R&D SYSTEMS(目录号：10062-DD)，其他试剂均购自Sigma-Aldrich。实验中，采用Brequinar(购自Sigma-Aldrich)作为阳性对照。根据细胞活力来计算化合物对细胞增殖的抑制率；并根据不同浓度化合物的抑制率拟合半数抑制浓度IC 50值(详见表1)。
表1
Figure PCTCN2022108625-appb-000043
活性测试2：本申请化合物对人单核细胞白血病细胞THP-1抗细胞增殖活性测试
在96孔板中将5000个细胞/孔的THP-1细胞接种于90％的RPMI 1640(Gibco，货号22400-089)、10％的胎牛血清(Coming，货号35-076-CV)和0.05mM的巯基乙醇(Sigma-Aldrich，货号63689)，并培养过夜。将细胞用不同浓度的测试化合物孵育72小时。使用Promega  CellTiter-Glo发光法细胞活性检测试剂盒(Promega-G7573)，按照供应商提供的说明书分析细胞活力。根据细胞活力来计算化合物对细胞增殖的抑制率；并根据不同浓度化合物的抑制率拟合半数抑制浓度IC 50值(详见表2)。实验中，选取Staurosporine作为阳性对照化合物。
表2
Figure PCTCN2022108625-appb-000044
活性测试3：本申请化合物对人原髓细胞白血病细胞HL-60抗细胞增殖活性测试
在96孔板中将2500个细胞/孔的HL-60细胞接种于80％的IMDM(Gibco，货号12440053)和20％的胎牛血清(Corning，货号35-076-CV)，并培养过夜。将细胞用不同浓度的测试化合物孵育72小时。使用Promega CellTiter-Glo发光法细胞活性检测试剂盒(Promega-G7573)，按照供应商提供的说明书分析细胞活力。根据细胞活力来计算化合物对细胞增殖的抑制率；并根据不同浓度化合物的抑制率拟合半数抑制浓度IC 50值(详见表3)。实验中，选取Staurosporine作为阳性对照化合物。
表3
Figure PCTCN2022108625-appb-000045
活性测试4：本申请化合物对人小细胞肺癌细胞NCI-H82抗细胞增殖活性测试
在96孔板中将5000个细胞/孔的NCI-H82细胞接种于90％的RPMI 1640(Gibco，货号 22400-089)和10％的胎牛血清(Corning，货号35-076-CV)，并培养过夜。将细胞用不同浓度的测试化合物孵育72小时。使用Promega CellTiter-Glo发光法细胞活性检测试剂盒(Promega-G7573)，按照供应商提供的说明书分析细胞活力。根据细胞活力来计算化合物对细胞增殖的抑制率；并根据不同浓度化合物的抑制率拟合半数抑制浓度IC 50值(详见表4)。实验中，选取Staurosporine作为阳性对照化合物。
表4
Figure PCTCN2022108625-appb-000046
从酶水平的活性数据来看，本申请化合物具有良好的DHOHD酶抑制活性，部分化合物的酶活性≤5nM。本申请的化合物具有良好的肿瘤细胞抗增殖活性，测试的化合物IC 50在约1μM以下。
活性测试5：本申请化合物对THP-1细胞异种型移植瘤模型的疗效
选取CB17 SCID小鼠，雌性，6-8周龄，体重18-22克。将THP-1细胞(10×10^6cells/0.2mL with Matrigel)皮下接种于每只小鼠。待小鼠成瘤后，肿瘤平均值达到100-150mm 3时，开始给药。
考察肿瘤生长是否被抑制、延缓或治愈。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b 2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。实施例20、21和阳性对照化合物阿糖胞苷对该动物模型的结果如图1。
选取实施例20及21制备的化合物，口服给药29天后，可剂量依耐性的抑制肿瘤生长。实施例20(给药剂量9mg/kg)抑瘤率(TG)可达到97％；实施例21(给药剂量15mg/kg)抑瘤率可达到85％。阳性对照化合物阿糖胞苷(10mg/kg)抑瘤率为45％。两个化合物的抑瘤率均超出阿糖胞苷。
活性测试6：本申请化合物对HL-60细胞异种型移植瘤模型的疗效
选取Balb/c裸小鼠，雌性，6-8周龄，体重18-22克。HL-60细胞(10×10^6cells/0.2mL with Matrigel)皮下接种于每只小鼠。待小鼠成瘤后，肿瘤平均值达到100-150mm 3时，开始给药。
考察肿瘤生长是否被抑制、延缓或治愈。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b 2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。实施例20、21和阳性对照 化合物阿糖胞苷对该动物模型的结果如图2。
选取实施例20及21制备的化合物，口服给药18天后，可剂量依耐性的抑制肿瘤生长。实施例20(给药剂量22.5mg/kg)抑瘤率(TG)可达到101.6％；实施例21(给药剂量36mg/kg)抑瘤率可达到102.4％。阳性对照化合物阿糖胞苷(25mg/kg)抑瘤率为77.9％。这两个化合物的抑瘤率均超出阿糖胞苷。
活性测试7：本申请化合物对NCI-H82细胞异种型移植瘤模型的疗效
Balb/c裸小鼠，雌性，6-8周龄，体重18-22克。NCI-H82细胞(5×10^6cells/0.2mL with Matrigel)皮下接种于每只小鼠。待小鼠成瘤后，肿瘤平均值达到100-150mm 3时，开始给药。
考察肿瘤生长是否被抑制、延缓或治愈。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b 2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。实施例20、21和阳性对照化合物顺铂+依托泊苷对该动物模型的结果如图3。
选取实施例20及21制备的化合物，口服给药31天后，可剂量依赖性的抑制肿瘤生长。实施例20(给药剂量22.5mg/kg)的抑瘤率(TG)可达到96.2％；实施例21(给药剂量36mg/kg)抑瘤率分别为95.3％。阳性对照化合物顺铂和依托泊苷联用(2mg/kg+4mg/kg)抑瘤率为58.7％。这两个化合物的抑瘤率均超出顺铂和依托泊苷联用组。
通过小鼠的异体移植瘤模型数据，本申请化合物在动物模型上显示出了优秀的抗肿瘤增殖活性。
活性测试8：本申请化合物在小鼠上的药物代谢动力学实验
将化合物溶于含有5％的DMSO和10％的Solutol的生理盐水中(所属百分比均为体积比)，分别配置成0.2mg/mL和1mg/mL的溶液，其中0.2mg/mL溶液用于静脉给药，1mg/mL溶液用于灌胃给药。
药代动力学实验在ICR小鼠上进行，每组3只，静脉注射剂量为5mL/kg，口服灌胃给药剂量为10mL/kg。静脉给药的采血时间点是给药后0、0.083、0.25、0.5、1、2、4、8和24小时，口服给药后的采血时间点是给药后0、0.25、0.5、1、2、4、6、8和24小时。经眶静脉丛采血，每个时间点取样0.03mL。样品被放置在含有K2-EDTA的试管中，并在冰中保存直到离心。样品在采集后1小时内，于2-8℃条件下，4000RPM离心6分钟，离心完毕后样品置于约-80℃冷冻保存。分离上清液用于LC/MS/MS分析。LC/MS/MS系统型号为LC-MS/MS-23(TQ6500+Triple quad)。样品在Acquity UPLC BEH C18、1.7μM、50×2.1mm柱上分离，从30％流动相B开始以线性梯度洗脱，其中流动相A是含有0.1％甲酸的水溶液、流动相B是含有0.1％甲酸的乙腈溶液。采用正离子模式的电喷雾电离来获取LC/MS/MS数据，使用标准曲线分别定量化合物的血浆浓度。得到各时间点的血药浓度后，采用FDA认证的药代动力学程序Phoenix WinNonlin 7.0(Pharsight，美国)拟合得到T 1/2、C max、T max及生物利用度(F％)等药代动力学参数。
其中，部分实施例化合物的药物代谢动力学结果详见表5。
表5
  参考例 实施例1 实施例20 实施例21
F(％) 30.99±4.62 19.43±2.64 56.75±5.05 73.06±11.73
从代谢数据可知，相较于参考例化合物，选取实施例20和21制备的化合物，口服给药后，生物利用度(F(％))显著提高。
作为本申请的具体实施例，参照上述合成方法，优选地，通式Ib化合物进一步包括表6所示实施例制备的化合物：
Figure PCTCN2022108625-appb-000047
表6
Figure PCTCN2022108625-appb-000048
Figure PCTCN2022108625-appb-000049
Figure PCTCN2022108625-appb-000050
Figure PCTCN2022108625-appb-000051
作为本申请的具体实施例，参照上述合成方法，优选地，通式Ia化合物进一步包括表7所示实施例制备的化合物：
Figure PCTCN2022108625-appb-000052
表7
Figure PCTCN2022108625-appb-000053
Figure PCTCN2022108625-appb-000054
Figure PCTCN2022108625-appb-000055
Figure PCTCN2022108625-appb-000056
Figure PCTCN2022108625-appb-000057
Figure PCTCN2022108625-appb-000058
Figure PCTCN2022108625-appb-000059
Figure PCTCN2022108625-appb-000060
作为本申请的具体实施例，参照上述合成方法，优选地，通式Ic化合物进一步包括表8所示实施例制备的化合物：
Figure PCTCN2022108625-appb-000061
表8
Figure PCTCN2022108625-appb-000062
Figure PCTCN2022108625-appb-000063
从上述活性测试结果可知，本申请的化合物具备及其优异的DHODH抑制活性，其中一些化合物抑制DHODH的IC 50值甚至达到小于1nM的级别。因此，本申请的化合物成为低毒性、高安全性的新的DHODH抑制剂，可以作为抗炎剂、自身免疫疾病治疗剂、免疫抑制剂、抗癌剂、病毒感染治疗剂等应用。
应理解，在阅读了本申请的上述公开内容之后，在不脱离本申请的方面构思和精神的情况下，本领域普通技术人员可以对本申请的技术方案作各种改动、调整等，或做组合灯，这些等价形式同样落于本申请要求保护的范围内。

Claims (11)

  1. 一种如下式I所示的化合物或其药学上可接受的盐，
    Figure PCTCN2022108625-appb-100001
    其中，
    R 1或R 2独立选自氢、卤素、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、和氰基中的任一种；
    R 3为-(NR 7) p-O-R 5；
    R 5或R 7独立选自氢或C 1-6烷基；
    R 4任意选自C 1-6烷基或C 3-6环烷基；
    M是氮原子或者CR 6；
    R 6任意选自氢、卤素和C 1-6烷基中任一种；
    m或n任意为0-5的整数；并且p为0或1。
  2. 如权利要求1所述的式I所示的化合物，其中，所述化合物任选自式Ia、式Ib、式Ic化合物或其药学上可接受的盐，
    Figure PCTCN2022108625-appb-100002
    其中，
    R 1或R 2独立选自氢、卤素、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基和氰基中的任一种；
    R 3为-(NR 7) p-O-R 5；
    R 4任意选自C 1-6烷基或C 3-6环烷基；
    R 5或R 7独立选自氢或C 1-6烷基；
    R 6任意选自氢或C 1-6烷基；
    X为卤素；
    m或n任意为0-5的整数；并且p为0或1。
  3. 如权利要求1或2任一项所述的化合物，其中，
    R 1或R 2是氢、卤素、甲基、甲氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、和氰基中的任一种；
    并且m或n是0或1或2。
  4. 如权利要求1或2任一项所述的化合物，其中，
    R 4为C 1-3烷基、未取代的环丙基、环丁基、氟取代的环丙基、和环丁基中的任一种。
  5. 如权利要求1或2任一项所述的化合物，其中，
    R 3为羟基或NR 7-O-R 5；
    R 5或R 7独立选自氢、甲基和乙基中的任一种；
  6. 如权利要求2所述的化合物，其中，在式Ia化合物中，X是氟，R 4是C 1-4烷基、环丙基、环丁基；在式Ib化合物中，R 4是环丙基、环丁基。
  7. 如权利要求1或2任一项所述的化合物，其中，所述化合物是以下化合物或其药学上可接受的盐：
    Figure PCTCN2022108625-appb-100003
    Figure PCTCN2022108625-appb-100004
    Figure PCTCN2022108625-appb-100005
    Figure PCTCN2022108625-appb-100006
    Figure PCTCN2022108625-appb-100007
    Figure PCTCN2022108625-appb-100008
    Figure PCTCN2022108625-appb-100009
    Figure PCTCN2022108625-appb-100010
    Figure PCTCN2022108625-appb-100011
  8. 一种式II化合物，
    Figure PCTCN2022108625-appb-100012
    其中，
    M为氮或CR 6，R 6任意选自氢、C 1-3烷基和氟中任一种；
    R 2任意选自氢、卤素、C 1-3烷基、C 1-3烷氧基和氰基中的任一种；
    R 4任意选自C 1-4烷基或C 3-6环烷基；
    R 8为氨基保护基或氢原子；并且m任意为0、1、2或3。
  9. 一种药物组合物，其包含如权利要求1或2任一所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或药学上可接受的载体。
  10. 如权利要求9所述的药物组合物在制备治疗或预防DHODH介导的疾病的药物中的用途。
  11. 如权利要求10所述的用途，其中，所述DHODH介导的疾病包括自身免疫疾病、肿瘤和病毒感染。
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