CN115701427A - 多取代噻唑衍生物及其在疾病治疗中的应用 - Google Patents

多取代噻唑衍生物及其在疾病治疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物领域，涉及一种多取代噻唑衍生物及其在疾病治疗中的应用。具体地，涉及式I化合物或其药学上可接受的盐、包含式I化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物、及其在治疗或预防二氢乳清酸脱氢酶介导的疾病方面的应用，其中包括肿瘤、病毒感染及免疫性疾病。

Description

多取代噻唑衍生物及其在疾病治疗中的应用
技术领域
本发明属于药物领域，涉及一种多取代噻唑衍生物及其在疾病治疗中的应用。具体地，涉及式I化合物或其药学上可接受的盐、包含式I化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物、及其在治疗或预防二氢乳清酸脱氢酶介导的疾病方面的应用，其中包括肿瘤、病毒感染及免疫性疾病。
背景技术
二氢乳清酸脱氢酶(dihydroorotate dehydrogenase,DHODH)是存在于线粒体内膜的一种含铁的黄素依赖酶,可催化嘧啶核苷酸从头合成途径的第4步反应。而嘧啶核苷酸可用于DNA、RNA、糖蛋白和磷脂生物合成,对于细胞代谢和细胞增殖至关重要。
DHODH与多种肿瘤的发生、发展密切相关，因此抑制或下调DHODH可以降低肿瘤细胞增殖,诱导其凋亡或者增加其他靶点药物的抗肿瘤效果。小分子DHODH抑制剂布喹那临床上被用于乳腺癌、头颈癌、结肠癌、胃肠癌、肺癌、卵巢癌等。还有报道称DHODH抑制剂可通过诱导白血病细胞分化，用于急性髓系白血病(AML)的治疗。并且据报道，多个药物，如ASLAN003、BAY 2402234、PTC299、RP7214、JNJ-74856665、以及WO2018192535A1等用于AML的治疗。
人体中静息淋巴细胞主要通过补救合成途径获取细胞代谢所需嘧啶核苷酸，但是，在免疫激活状态下，淋巴细胞对于嘧啶核苷酸的需求可达静息状态下的8倍以上，此时淋巴细胞增殖和各种免疫功能的完成都需要启动从头合成途径补充嘧啶核苷酸。抑制DHODH可以阻断新生嘧啶合成，致使DNA合成障碍，抑制活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞，从而在免疫抑制中起重要作用。来氟米特是第一个上市的DHODH抑制剂，用于治疗类风湿性关节炎。特立氟胺是来氟米特的活性代谢产物，于2012年获批上市，用于治疗多发性硬化症。此外，还有IMU-838和PP-001处于临床阶段，分别用于治疗溃疡性结肠炎和非感染性葡萄膜炎。
DHODH抑制剂可防止病毒复制。从头进行嘧啶合成途径的简化及其在病毒复制中的作用。DHODH抑制剂可阻止多种病毒的复制，包括负链RNA病毒(如甲乙型流感病毒)、正链RNA病毒(丙型肝炎病毒与登革热病毒)与DNA病毒(牛痘病毒与腺病毒)等。现有上市的DHODH抑制剂仅有来氟米特和特立氟胺，两者均有明显的毒副作用，如腹泻、肝酶异常、皮疹以及高血压等。因此，开发高效、低毒的DHODH抑制剂具有重要的商业价值与现实意义。
发明内容
本发明提供一种多取代噻唑衍生物及其在疾病治疗中的应用。一方面，本发明提供了式I化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0003192866330000011
其中，
R1或R2独立选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基和氰基中的任一种；
R3为-(NR7)p-O-R5；R5或R7独立选自氢或C1-6烷基；
R4任意选自C1-6烷基或C3-6环烷基；
M是氮原子或者CR6；R6任意选自氢、卤素和C1-6烷基中的任一种；
m或n任意为0-5的整数；p为0或1。
作为本发明的优选方案，本发明提供一种式I化合物或其药学上可接受的盐，
Figure BDA0003192866330000021
其中，
R1或R2任意选自氢，卤素，C1-3烷基，C1-3烷氧基，氰基；
R3为-(NR7)p-O-R5；R5、R7任意选自氢或C1-3烷基；
R4任意选自C1-4烷基或C3-6环烷基；
M是氮原子或CR6；R6任意选自氢、卤素和C1-3烷基中的任一种；
m或n为0-3的任意整数；p为0或1；
作为本发明的优选方案，本发明的式I化合物具有如下式Ia结构，
Figure BDA0003192866330000022
其中，
X为卤素；
R1或R2独立选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基和氰基中的任一种；
R3为-(NR7)p-O-R5；R5或R7独立选自氢或C1-6烷基；
R4任意选自C1-6烷基或C3-6环烷基；
M是氮原子或者CR6；R6任意选自氢、卤素和C1-6烷基中的任一种；
m或n为0-5的任意整数；p为0或1。
作为本发明的优选方案，本发明的式I化合物具有如下式Ib结构，
Figure BDA0003192866330000023
其中，
R1或R2独立选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基和氰基中的任一种；
R3为-(NR7)p-O-R5；R5或R7独立选自氢或C1-6烷基；
R4是C3-6环烷基；
R6任意选自氢或C1-6烷基；
m或n为0-5的任意整数；p为0或1。
作为本发明的优选方案，本发明的式I化合物具有如下是Ic结构，
Figure BDA0003192866330000031
其中，
R1或R2独立选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基和氰基中的任一种；
R3为-(NR7)p-O-R5；R5或R7独立选自氢或C1-6烷基；
R4任意选自氢、C1-6烷基和C3-6环烷基中的任一种；
m或n为0-5的任意整数；p为0或1。
作为本发明的优选方案，化合物式I中，合适的R1或R2是氢、卤素、甲基、甲氧基、三氟甲基、三氟甲氧基和氰基中的任一种；
合适的X为氟、氯或溴；
合适的R3为羟基或-NR7-O-R5；
合适的R5为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；优选的R5为氢、甲基或乙基；
合适的R7选自氢、甲基或乙基；
合适的R4为甲基、乙基、丙基、未取代或卤素取代的环丙基、环丁基、环戊基或环己基；优选地，R4为甲基、乙基、丙基、2-氟代环丙基或2,2-二氟代环丙基；其中当R4的环烷基具有手性中心时，本发明还进一步包括其相应的立体异构体；
合适的R6为氢、氟、氯、甲基或乙基；优选的R6为氢、氟或甲基；
合适的m或n是0、1或2；
合适的p是0或1。
本发明的式I化合物非限制性地包括以下化合物：
Figure BDA0003192866330000032
Figure BDA0003192866330000041
Figure BDA0003192866330000051
Figure BDA0003192866330000061
Figure BDA0003192866330000071
Figure BDA0003192866330000081
Figure BDA0003192866330000091
本发明优选的式I化合物包括以下化合物：
Figure BDA0003192866330000092
Figure BDA0003192866330000101
本发明另一方面提供一种式I化合物的制备方法，所述方法包括：式II与式III反应制备得到式I所示化合物。
Figure BDA0003192866330000102
其中，R1、R2、R3、R4、M、m、n具有与式I相同的定义范围，R8是氨基保护基或氢，保护基非限制性地包括叔丁氧基羰基、苄氧基羰基等；当R8为保护基时，式II先脱除保护基后再与式III反应；当R3为羟基时，可进一步与任选自NH2OH、NH2OR5以及NHR7OR5或其相应的盐反应，以制备式I化合物。
当M为CR6时，式II化合物可通过式IV与式V在金属催化下发生偶联反应得到。金属催化剂优选以三(二亚苄基茚丙酮)二钯、2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯作为配体，以碱金属碳酸盐作为碱。
Figure BDA0003192866330000103
其中，R2、R4、R6、R8、n具有前述结构相同的定义范围。
当M为CR6，且R6为卤素，如氟取代时，式IV可通过将式VI与式VII反应制备得到。
Figure BDA0003192866330000104
当M为氮原子时，所述式II通过下述方法制备：
通过R2取代苯腈在双三甲基硅基胺基锂催化下反应得到式XX；再与R4取代异氰酸酯XXI在碱的条件下反应制备式XXII，所述碱是，例如有机碱，非限制性地，例如三乙胺、二异丙基乙基胺等。式XXII在单质碘和无机碱的催化下反应得到式XXIII，所述的无机碱，非限制性地，例如碳酸钾，碳酸铯等。式XXIII与亚硝酸盐，如亚硝酸钠等，反应制备得到式XXIV；再经金属还原剂还原得到式II，所述金属还原剂非限制性地包括铁粉、锌粉。所述过程表述如下：
Figure BDA0003192866330000111
本发明再一方面提供一种式II化合物，
Figure BDA0003192866330000112
其中，
M为氮或CR6，R6任意选自氢、C1-3烷基和氟原子中的任一种；
R2任意选自氢、卤素、C1-3烷基、C1-3烷氧基、氰基中的任一种；
R4任意选自C1-4烷基或C3-6环烷基；
R8为氨基的保护基或氢原子，所述保护基非限制性地包括叔丁氧基羰基、苄氧羰基等；
m任意为0、1、2或3。
本发明式I化合物还包括立体异构体和光学异构体。本发明化合物药学上可接受的盐可以是与无机碱或无机酸形成的盐、与有机碱形成的盐，并且可通过已知的常规方法将式I化合物转化成对应的盐。与无机碱形成的盐非限制性地包括：钠盐、钾盐、钙盐、盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐等；与有机碱形成的盐非限制性地包括：乙醇胺盐、铵盐、以及与各种氨基酸形成的盐等；作为优选的实施例，本发明式I药学上可接受的盐为钠盐、钾盐、钙盐、乙醇胺盐。
本发明再一方面提供一种药物组合物，所述组合物含有式I化合物或其药学上可接受的盐，所述组合物可以溶液、悬浮液、吸入剂等形式吸入给药；或以片剂、胶囊剂、颗粒剂等形式口服给药；或以栓剂的形式直肠给药或经皮给药；或以注射液形式给药。
本发明的药物组合物制备成口服制剂时，该组合物中可进一步含有药学上可接受的稀释剂，稀释剂包括但不限于赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。赋形剂包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甘露醇、微晶纤维素、羟丙基纤维素等；粘合剂包括聚乙烯醇、乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素等；崩解剂包括淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇等。将上述稀释剂与药物组合物混合后，可用常规方法压成片剂。如果需要包衣，可将前述片芯用明胶、二氧化钛等糖溶液包衣。或者将本发明化合物与稀释剂充分混合后，直接填充胶囊，制备成胶囊剂。
本发明所述式I化合物或其药学上可接受的盐，以及含有本发明式I化合物或其药学上可接受的盐的药物组合可作为治疗或预防DHODH介导的疾病，所述疾病包括但不限于：自身免疫疾病、肿瘤、病毒感染等。所述自身免疫疾病包括类风湿性关节炎、银屑病等；所述病毒感染疾病包括流感病毒、冠状病毒等感染引起的疾病。
术语解释：
本发明中，“烷基”、是指具有1至6个碳原子的饱和烷烃，如直链烷烃或支链烷烃；“烷氧基”是指具有1至6个碳原子的饱和烷基氧基，如直链烷氧基或支链烷氧基。具体的烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基等。具体的烷氧基包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁基氧基等。
本发明中，“卤素”是指氟、氯、溴、碘；优选的，本发明的卤素为氟、氯、溴。
本发明中，“环烷基”是指含有3至6个碳原子的饱和环烷基，包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基。
本发明所述的烷基、烷氧基、环烷基可以是未取代的，或任选可被一个或多个取代基取代；作为本发明优选方案，所述取代基为卤素，如氟，氯，溴；作为本发明优选方案，所述烷基、烷氧基、环烷基为三氟甲基、三氟甲氧基、2-氟代环丙基、2,2-二氟代环丙基等。
附图说明
图1示出了本发明的两个实施例分别对人单核细胞白血病THP-1细胞在小鼠异体移植瘤模型CB17SCID的疗效。
图2示出了本发明的两个实施例对人原髓细胞白血病HL-60细胞在小鼠异体移植瘤模型的疗效。
图3示出了本发明的两个实施例对人小细胞肺癌细胞NCI-H82在小鼠异体移植瘤模型的疗效。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下文将结合具体实施例和附图描述本发明具体的技术方案。但是，应理解，并不以此限定本发明。除非特别说明，本发明实施例所使用的化合物、试剂、实验动物等均可商购获得。
在此，本发明申请以整体引入的方式，组合被申请发明人先前的专利申请CN107382902A。具体地部分化合物的合成可参考CN107382902A中描述的方法，例如，制备参考例化合物(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-甲基-2-(2-羧基苄叉基)肼基]噻唑。
实施例1：
(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(1)
Figure BDA0003192866330000121
步骤(a)叔丁基(对甲苯磺酰基)氨基甲酸酯(1b)
称取20g(0.15mol)羟基氨基甲酸叔丁酯1a置于500mL三口瓶中，加入30mL二氯甲烷，在0℃搅拌状态下加入32.5g(0.165mol)对甲苯磺酰氯的二氯甲烷溶液20mL，搅拌5分钟后，加入15.2g(0.15mol)N-甲基吗啉，反应液升温至室温并反应16个小时。在0℃下反应液用水(10mL)淬灭，混合物用二氯甲烷(15mL)萃取三次，有机相合并后用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压浓缩，得到白色粉状固体的标题化合物1b(34g)，收率79.1％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.23(s,1H),7.79(d,J＝8.4Hz,2H),7.49(d,J＝8.1Hz,2H),2.43(s,3H),1.23(s,9H).
步骤(b)叔丁基-2-环丙基肼基碳酸酯(1c)
称取9.93g(0.17mol)环丙胺置于500mL三口瓶中，加入20mL四氢呋喃，在-5℃搅拌状态下加入3.52g(34.8mmol)N-甲基吗啉,然后在-5℃搅拌下加入10g(34.8mmol)中间体1b的四氢呋喃溶液20mL，反应液升温至室温并反应16个小时。在0℃下反应液用水(10mL)淬灭，混合物用二氯甲烷(15mL)萃取三次，有机相合并后用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压浓缩，得到黄色油状的标题化合物1c(2.5g)，收率41.7％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.54(s,1H),6.44(d,J＝2.8Hz,1H),1.12(s,9H),0.57(td,J＝7.0,4.6Hz,2H),0.47–0.40(m,2H).
步骤(c)1-(2-氯苯基)-2-硫氰酸乙烷-1-酮(1e)
称取4g(17.1mmol)1d(2-溴-1-(2-氯苯基)乙酮)置于100mL单口瓶中，加入50mL无水乙醇，在室温搅拌状态下加入4.0g(41.2mmol)硫氰酸钾，反应液在85℃回流反应3个小时。反应液减压浓缩，柱层析分离得到黄色油状产物1e(3.8g)，收率97％。LCMS:211.9,213.9([M+H]+).
步骤(d)2-溴-4-(2-氯苯基)噻唑(1f)
称取3.8g(18.0mmol)中间体1e置于100mL单口瓶中，加入50mL冰醋酸，在室温搅拌状态下加入40mL醋酸的氢溴酸溶液，反应液在140℃回流反应3个小时。反应液倾倒入(100mL)冰水中，混合液用乙酸乙酯(50mL)分别萃取三次，有机相合并后用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液浓缩，得到粗品用柱层析分离得到黄色油状产物(2.5g)，收率51％。LCMS:273.9,275.9([M+H]+).
步骤(e)2-(4-(2-氯苯基)噻唑-2-基)-2-环丙基肼-1-羧酸叔丁酯(1g)
称取3g(11mmol)中间体2-溴-4-(2-氯苯基)噻唑1f置于500mL单口瓶中，加入1.9g(11mmol)中间体1c，0.51g(0.55mmol)的三(二亚苄基茚丙酮)二钯，0.51g(1.10mmol)的2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯和7.19g(22mmol)的碳酸铯，反应液在室温搅拌下，用氮气置换三次，反应液在100℃下搅拌反应16个小时，反应液硅藻土过滤，滤液减压浓缩，得到的粗品用柱层析分离得到黄色固体中间体1g(100mg，收率：3％)。LCMS:366.1,368.1([M+H]+).
步骤(f)4-(2-氯代苯基)-2-(1-环丙基肼)噻唑(1h)
称取100mg(0.27mmol)的中间体2-(4-(2-氯苯基)噻唑-2-基)-2-环丙基肼-1-羧酸叔丁酯1g置于100mL单口瓶中，加入10ml二氯甲烷，在室温搅拌状态下加入2mL三氟乙酸,反应液在室温搅拌反应2个小时。反应液减压浓缩，得到黄色油状中间体1h(70mg)收率97.2％。LCMS:266.0,268.0([M+H]+).
步骤(g)(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(1)
称取70mg(0.26mmol)的中间体4-(2-氯代苯基)-2-(1-环丙基肼)噻唑1h置于100mL单口瓶中，加入5mL二氯甲烷和44mg(0.26mmol)的3-氟-6-醛基苯甲酸，反应液在室温下搅拌反应2个小时。反应液减压浓缩，用高效液相制备色谱法纯化得到白色固体目标化合物1(27mg，收率：25％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.67(s,1H),9.09(s,1H),8.05(dd,J＝8.8,5.7Hz,1H),7.94(dd,J＝7.7,1.7Hz,1H),7.68(dd,J＝9.5,2.8Hz,1H),7.60–7.50(m,2H),7.50–7.39(m,2H),7.36(td,J＝7.6,1.8Hz,1H),2.91–2.83(m,1H),1.27–1.17(m,2H),1.08–0.98(m,2H).
实施例2：
(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氯苄叉基)肼基]噻唑(2)
Figure BDA0003192866330000141
与实施例1的方法类似，采用2-氯-6醛基苯甲酸替代2-氟-6-醛基苯甲酸与中间体1h反应得到42毫克标题化合物2。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.72(s,1H),9.09(s,1H),8.02(d,J＝8.6Hz,1H),7.98–7.86(m,2H),7.75(dd,J＝8.5,2.3Hz,1H),7.62–7.27(m,4H),2.98–2.78(m,1H),1.31–1.12(m,2H),1.10–0.95(m,2H).
实施例3：
(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-环丁基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(3)
Figure BDA0003192866330000142
与中间体1c方法类似，采用环丁基胺替代环丙胺与中间体1b反应得到3c；与实施例1方法类似，得到27毫克标题化合物3。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.66(s,1H),8.76(s,1H),8.02(dd,J＝8.7,5.8Hz,1H),7.96–7.88(m,1H),7.66(d,J＝7.2Hz,1H),7.57–7.46(m,3H),7.47–7.38(m,1H),7.40–7.31(m,1H),4.83(s,1H),2.89–2.74(m,2H),2.61–2.52(m,2H),1.90–1.75(m,2H).
实施例4：
(E)-4-(3-氯苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(4)
Figure BDA0003192866330000143
与实施例1方法类似，采用2-溴-1-(3-氯苯基)乙酮4d替代1d，得到29毫克标题化合物4。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.71(s,1H),9.13(s,1H),8.04(dd,J＝8.8,5.7Hz,1H),7.95(t,J＝1.7Hz,1H),7.88(d,J＝7.8Hz,1H),7.67(dd,J＝9.5,2.8Hz,1H),7.62(s,1H),7.53(td,J＝8.5,2.8Hz,1H),7.46(t,J＝7.9Hz,1H),7.40–7.33(m,1H),2.91(tt,J＝6.8,3.8Hz,1H),1.31–1.21(m,2H),1.10–0.99(m,2H).
实施例5：
Figure BDA0003192866330000151
2-溴-1-(2-三氟甲基苯基)乙酮(5d)
称取10g(53.2mmol)2-三氟甲基苯乙酮(5c)置于500mL单口瓶中，加入50ml甲醇，在室温搅拌状态下加入5.68g(58.5mmol)溴化铵和35.98g(58.5mmol)过氧单磺酸钾，反应液室温搅拌下，置换氩气三次，反应液在65℃反应16个小时。反应液过滤，滤液用水(10mL)淬灭，混合物用二氯甲烷(15mL×3)萃取，有机相合并后用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压浓缩，得到油状中间体5d(15g)收率71％。
(E)-4-(2-三氟甲基苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(5)
与实施例1方法类似，采用2-溴-1-(2-三氟甲基苯基)乙酮5d替代1d，得到38毫克标题化合物5。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.66(s,1H),9.08(s,1H),8.04(dd,J＝8.8,5.7Hz,1H),7.83(d,J＝7.8Hz,1H),7.76–7.64(m,3H),7.65–7.50(m,2H),7.11(s,1H),2.91–2.75(m,1H),1.22–1.09(m,2H),1.10–0.90(m,J＝3.8Hz,2H).
实施例6：
(E)-4-(2-甲苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(6)
Figure BDA0003192866330000152
与实施例5的方法类似，采用2-甲基苯乙酮(6c)替代2-三氟甲基苯乙酮(5c)，得到标题化合物6。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.56(s,1H),9.08(s,1H),8.05(dd,J＝8.8,5.7Hz,1H),7.68(dd,J＝9.5,2.8Hz,1H),7.64–7.51(m,2H),7.31–7.19(m,3H),7.10(s,1H),2.91–2.79(m,1H),2.48(s,14H),1.26–1.16(m,2H),1.09–0.94(m,2H).
实施例7：
(E)-4-(4-氯苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(7)
Figure BDA0003192866330000153
与实施例5的方法类似，采用4-氯苯乙酮(7c)替代2-三氟甲基苯乙酮(5c)，得到标题化合物7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.68(s,1H),9.11(s,1H),8.04(dd,J＝8.8,5.7Hz,1H),7.93(d,J＝8.5Hz,2H),7.67(dd,J＝9.5,2.8Hz,1H),7.58–7.52(m,2H),7.48(d,J＝8.6Hz,2H),2.99–2.81(m,1H),1.27–1.22(m,2H),1.04(q,J＝6.5,5.5Hz,2H).
实施例8：
(E)-4-(3-甲基苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(8)
Figure BDA0003192866330000161
与实施例5的方法类似，采用3-甲基苯乙酮(8c)替代2-三氟甲基苯乙酮(5c)，得到标题化合物8。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.10(s,1H),8.04(s,1H),7.75–7.63(m,2H),7.61–7.48(m,2H),7.43(s,1H),7.35–7.25(m,1H),7.16–7.08(m,1H),2.92–2.85(m,1H),2.36(s,3H),1.28–1.21(m,2H),1.10–0.98(m,2H).
实施例9：
(E)-4-(2-甲氧基苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(9)
Figure BDA0003192866330000162
与实施例5的方法类似，用2-甲氧基苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物9。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.09(s,1H),8.15(dd,J＝7.6,1.8Hz,1H),8.01(dd,J＝8.9,5.7Hz,1H),7.76–7.60(m,2H),7.55–7.45(m,2H),7.33–7.23(m,1H),7.09(d,J＝8.3Hz,1H),7.06–6.98(m,1H),3.90(s,3H),2.91–2.82(m,1H),1.26–1.17(m,2H),0.95–0.86(m,2H).
实施例10：
(E)-4-(2-三氟甲氧基苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(10)
Figure BDA0003192866330000163
与实施例5的方法类似，用2-三氟甲氧基苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物10。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.09(s,1H),8.14–8.06(m,1H),8.06–7.97(m,1H),7.70–7.61(m,1H),7.57–7.39(m,4H),7.30(s,1H),2.91–2.80(m,1H),1.27–1.16(m,2H),1.05–0.95(m,2H).
实施例11：
(E)-4-(3-甲氧基苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(11)
Figure BDA0003192866330000164
与实施例5的方法类似，采用3-甲氧基苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物11。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.11(s,1H),8.11–8.00(m,1H),7.82–7.60(m,2H),7.60–7.44(m,3H),7.41–7.29(m,1H),6.89(d,J＝8.2Hz,1H),3.81(s,3H),2.94–2.83(m,1H),1.30–1.20(m,2H),1.08–1.01(m,2H).
实施例12：
(E)-4-(3-三氟甲氧基苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(12)
Figure BDA0003192866330000171
与实施例5的方法类似，采用3-三氟甲氧基苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物12。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.12(s,1H),8.04(dd,J＝8.7,5.6Hz,1H),7.95(d,J＝7.5Hz,1H),7.87(s,1H),7.74–7.62(m,3H),7.60–7.50(m,2H),7.30(d,J＝7.9Hz,1H),2.95–2.87(m,1H),1.27–1.20(m,4H),1.08–1.01(m,2H).
实施例13：
(E)-4-(2-氟苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(13)
Figure BDA0003192866330000172
与实施例5的方法类似，采用2-氟苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物13。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.12(s,1H),8.19–8.07(m,1H),8.05–7.95(m,1H),7.68–7.59(m,1H),7.57–7.44(m,2H),7.40–7.15(m,3H),2.92–2.83(m,1H),1.28–1.17(m,2H),1.09–0.98(m,2H).
实施例14：
(E)-4-(2-氰基苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(14)
Figure BDA0003192866330000173
与实施例5的方法类似，采用2-氰基苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物14。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.14(s,1H),8.09–7.97(m,2H),7.90(dd,J＝7.3,2.0Hz,1H),7.81–7.73(m,1H),7.71–7.64(m,1H),7.61(d,J＝5.2Hz,1H),7.59–7.50(m,2H),2.92–2.82(m,2H),1.26–1.17(m,2H),1.11–1.02(m,2H).
实施例15：
(E)-4-(2-溴苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(15)
Figure BDA0003192866330000174
与实施例5的方法类似，采用2-溴苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物15。
实施例16：
(E)-4-(3-三氟甲基苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(16)
Figure BDA0003192866330000181
与实施例5方法类似，采用3-三氟甲基苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物16。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.11(s,1H),8.07–7.99(m,1H),7.81–7.74(m,1H),7.72(d,J＝7.9Hz,1H),7.70–7.63(m,1H),7.59–7.51(m,1H),7.51–7.42(m,1H),7.37(s,1H),7.34–7.25(m,1H),2.85(s,1H),1.21(d,J＝14.2Hz,2H),1.03(s,2H).
实施例17：
(E)-4-(3-溴苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(17)
Figure BDA0003192866330000182
与实施例5的方法类似，采用3-溴苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物17。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.13(s,1H),8.11–8.07(m,1H),8.07–7.98(m,1H),7.96–7.88(m,1H),7.70–7.60(m,2H),7.56–7.46(m,2H),7.43–7.34(m,1H),2.95–2.85(m,2H),1.29–1.20(m,4H),1.08–0.98(m,2H).
实施例18：
(E)-4-(4-甲基苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(18)
Figure BDA0003192866330000183
与实施例5的方法类似，用4-甲基苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物18。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.10(s,1H),8.03–7.96(m,1H),7.78(d,J＝7.9Hz,2H),7.63(dd,J＝12.4,3.0Hz,1H),7.54–7.44(m,1H),7.35(s,1H),7.20(d,J＝7.9Hz,2H),2.91–2.81(m,1H),2.30(s,3H),1.27–1.17(m,2H),1.07–0.97(m,2H).
实施例19：
(E)-4-(4-三氟甲基苯基)-2-[1-环丙基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(19)
Figure BDA0003192866330000184
与实施例5的方法类似，采用4-三氟甲基苯乙酮替代2-三氟甲基苯乙酮，得到标题化合物19。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.11(s,1H),8.10(d,J＝8.2Hz,2H),8.01(dd,J＝8.8,5.5Hz,1H),7.76(d,J＝8.2Hz,2H),7.69(s,1H),7.65(dd,J＝9.4,3.0Hz,2H),7.52(s,1H),2.94–2.84(m,1H),1.27–1.18(m,4H),1.06–0.99(m,2H).
实施例20：
(E)-5-氟-4-(2-氯苯基)-2-[1-甲基-2-(2-羧基苄叉基)肼基]噻唑(20)
Figure BDA0003192866330000191
2-氯-2-氟-1-(2-氯苯基)乙酮
称取10.0g(41.9mmol)的邻氯碘苯置于250mL三口瓶中，加入超干THF(100mL)，搅拌至溶清。氩气保护下，降温至-78℃，滴加入20.1mL的正丁基锂溶液(2.5M in hexane)。加毕，在-78℃条件下反应40min，再滴加入10.0g(71.2mmol)的氯氟乙酸乙酯，加完后，在-78℃下再反应40min。用饱和氯化铵(200mL)淬灭，乙酸乙酯萃取三次(120mL*3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱分离(EA/PE，0％-10％)，得无色液体5.8g，收率67.0％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.66(dd,J＝8.0,1.0Hz,1H),7.54–7.46(m,2H),7.43–7.37(m,1H),7.00(d,J＝50.5Hz,1H).
4-(2-氯苯基)-5-氟-2-(1-甲基肼基)噻唑
称取500mg(2.4mmol)的中间体2-氯-2-氟-1-(2-氯苯基)乙酮置于25mL的茄形瓶中，加入380mg(3.6mmol)的2-甲基氨基硫脲和10mL的超干四氢呋喃，在氮气保护下80℃反应25小时。将反应也冷却至室温，浓缩出去溶剂，加100mL水，用乙酸乙酯萃取三次(50mL*3)，合并有机相浓缩，柱层析分离，得到灰色固体220mg，收率35.3％。
(E)-5-氟-4-(2-氯苯基)-2-[1-甲基-2-(2-羧基苄叉基)肼基]噻唑
称取100mg(0.39mmol)的中间体4-(2-氯苯基)-5-氟-2-(1-甲基肼基)噻唑置于25mL的茄形瓶中，加入87.5mg(0.58mmol)的2-醛基苯甲酸，64mg(0.78mmol)的醋酸钠和10mL甲醇。在氮气保护下于室温下反应16小时。浓缩除去溶剂，加入50mL的水(50mL)，用乙酸乙酯萃取三次(50mL*3)，合并有机相浓缩，柱层析分离得黄色固体50mg的标题化合物，收率32.3％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.59(s,1H),7.94(d,J＝7.9Hz,1H),7.89(dd,J＝7.9,1.4Hz,1H),7.63(t,J＝7.6Hz,1H),7.59–7.52(m,2H),7.51–7.39(m,3H),3.51(s,3H).
实施例21：
(E)-5-氟-4-(2-氯苯基)-2-[1-甲基-2-(2-羧基-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(21)
Figure BDA0003192866330000192
与实施例20的方法类似，采用2-醛基-4-氟苯甲酸替代2-醛基苯甲酸，得到标题化合物21。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.64(s,2H),8.54–8.50(m,1H),7.98(dd,J＝8.8,5.6Hz,1H),7.64(dd,J＝9.4,2.9Hz,1H),7.59–7.48(m,3H),7.47–7.39(m,2H),3.51(s,3H).
实施例22：
(E)-2-((2-(4-(2-氯苯基)噻唑-2-基)-2-甲基肼叉基)甲基)-N-羟基苯甲酰胺(22)
Figure BDA0003192866330000201
参考文献报道的合成方法，得到中间体化合物(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-甲基-2-(2-羧基苄叉基)肼基]噻唑。
称取1.0g(2.6mmol)的上述中间体化合物置于100mL茄形瓶中，加入30mL的四氢呋喃，室温下搅拌至固体完全溶解。加入484mg(3.0mmol)羰基二咪唑，室温下反应16小时后，冰水浴下将反应液滴加到20mL的50％的羟胺水溶液中，并搅拌1小时。加入50mL饱和食盐水溶液，并用乙酸乙酯萃取三次(50mL*3)，合并有机相浓缩，柱层析分离得到黄色固体135mg的标题化合物，收率13％。
1H NMR(400MHz,Methanol-d4,DMSO-d6)δ8.46(s,1H),8.11(d,J＝8.0Hz,1H),7.99(dd,J＝7.8,1.8Hz,1H),7.91–7.84(m,1H),7.67(t,J＝7.6Hz,1H),7.56–7.29(m,5H),3.73(s,3H).
实施例23：
(E)-2-((2-(4-(2-氯苯基)噻唑-2-基)-2-甲基肼叉基)甲基)-N-甲氧基苯甲酰胺(23)
Figure BDA0003192866330000202
称取(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-甲基-2-(2-羧基苄叉基)肼基]噻唑500mg(1.3mmol)置于100mL茄形瓶中，加入25mL四氢呋喃，室温下搅拌至固体完全溶解，加入512mg(1.3mmol)HATU，271mg(2.6mmol)的三乙胺和167mg(2.0mmol)的O-甲基羟胺盐酸盐，室温下反应16小时。加入50mL水并用乙酸乙酯萃取三次(50mL*3)，合并有机相浓缩，柱层析分离得到白色固体167mg的标题化合物，收率30％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.81(dd,J＝7.7,2.0Hz,1H),7.77(d,J＝7.3Hz,1H),7.72–7.62(m,2H),7.60–7.52(m,1H),7.47(dd,J＝7.8,1.5Hz,1H),7.39–7.23(m,3H),6.94(d,J＝3.4Hz,1H),5.97(d,J＝3.3Hz,1H),3.91(s,3H),3.21(s,3H).
实施例24：
(E)-2-((2-(3-(2-氯苯基)-1,2,4-噻二唑-5-基)-2-甲基肼叉基)甲基)苯甲酸(133)
Figure BDA0003192866330000203
步骤(a)2-氯苯基甲脒
量取73.0mL的双三甲基硅基胺基锂的四氢呋喃溶液(2.0M，146.0mmol)置于500mL反应瓶中，加入150mL的四氢呋喃。氮气保护下，控温0-10℃，缓慢滴加入2-氯苯腈10.0g(73.0mmol)的四氢呋喃(50mL)溶液。TLC检测原始物料完全消耗，浓缩除去反应溶剂，加入200mL纯化水，并用二氯甲烷萃取三次(200mL*3).合并有机相后，并分别用2M的盐酸(200mL)和饱和食盐水(300mL)各洗涤一次。浓缩除去溶剂得到9.5克黄色固体，直接投下一步反应。LCMS:155.1([M+H]+).
步骤(b)2-氯-N-(甲基硫脲基)苯基甲脒
称取2-氯苯基甲脒(9.5g，61.3mmol)和甲基异氰酸酯(6.8g，92.5mmol)置于500mL反应瓶中，加入乙腈(170mL)。控温20℃一下，缓慢滴加入三乙胺(18.7g，185.1mmol)。滴加完毕后，反应液在室温下反应3小时。LCMS监控原料完全消耗后，浓缩出去反应溶剂，并用柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝20:1)得到黄色固体10.0克。该两步反应，总收率60.4％。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ9.03(d,J＝2.3Hz,1H),8.60-8.56(m,1H),7.52-7.32(m,5H),2.84(d,J＝2.3Hz,3H).LCMS:228.1([M+H]+).
步骤(c)3-(2-氯苯基)-N-甲基-1,2,4-噻二唑-5-胺
称取2-氯-N-(甲基硫脲基)苯基甲脒(10.0g，44.1mmol)和单质碘(13.4g，52.9mmol)置于250mL的反应瓶中，加入乙腈(100mL)和碳酸钾(9.1g，66.1mmol)。室温下搅拌0.5小时后，LCMS监控原料消耗完全。向反应溶液中加入水(200mL)，并用乙酸乙酯萃取三次(200mL*3)。合并有机相并用饱和食盐水洗涤两次(200mL*2)，并用无水硫酸钠干燥，浓缩后，柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)得到黄色固体5.0克，收率50.4％。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ8.49(brs,1H),7.78-7.75(m,1H),7.55-7.53(m,1H),7.46-7.41(m,2H),2.94(d,J＝4.8Hz,3H).LCMS:226.0([M+H]+).
步骤(d)N-(3-(2-氯苯基)-1,2,4-噻二唑-5-基)-N-甲基一氧化二氮酰胺
称取3-(2-氯苯基)-N-甲基-1,2,4-噻二唑-5-胺(500mg，2.2mmol)置于50mL反应瓶中，0℃下加入2M盐酸(5mL)，并逐滴加入亚硝酸钠(150mg，2.2mmol)的水溶液(2mL)。混合溶液在0–5℃下保温反应1小时。LCMS监控反应原料完全消耗后，将反应液倾到入2mL水中，并用乙酸乙酯萃取三次(5mL*3)，合并有机相并用饱和食盐水(10mL)洗涤一次，用无水硫酸钠干燥后，柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)得到200毫克白色固体，收率35.4％。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ8.02-7.99(m,1H),7.73-7.70(m,1H),7.66-7.56(m,2H),4.62(s,3H).LCMS:255.0([M+H]+).
步骤(f)3-(2-氯苯基)-5-(1-甲基肼基)-1,2,4-噻二唑
称取锌粉(100mg，1.57mmol)和冰醋酸(2mL)置于25mL反应瓶中，并加热到45℃，缓慢滴加入N-(3-(2-氯苯基)-1,2,4-噻二唑-5-基)-N-甲基一氧化二氮酰胺(200mg，0.79mmol)的冰醋酸溶液(2mL)，混合溶液在45–50℃条件下搅拌12小时。LCMS监控原料完全消耗后，过滤除去锌粉并用乙酸乙酯洗涤两次(20mL*2)，母液分别用饱和碳酸钠溶液洗涤三次(10mL*3)，饱和食盐水洗涤三次(10ml*)，并用无水硫酸钠干燥后，用柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)得到64毫克白色固体，收率67.7％。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ7.74(dd,J＝7.4,2.0Hz,1H),7.53(dd,J＝7.8,1.4Hz,1H),7.47–7.38(m,2H),5.65(s,2H).LCMS:241.1([M+H]+).
步骤(g)(E)-2-((2-(3-(2-氯苯基)-1,2,4-噻二唑-5-基)-2-甲基肼叉基)甲基)苯甲酸
称取3-(2-氯苯基)-5-(1-甲基肼基)-1,2,4-噻二唑(60mg，0.25mmol)和邻醛基苯甲酸(45mg，0.3mmol)和四氢呋喃(3mL)置于10mL反应瓶中，升温至60℃反应6小时。LCMS监控原料完全消耗后，浓缩出去反应溶剂，残留固体用甲醇(5mL)打浆后得到标题化合物41毫克的白色固体。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ13.39(brs,1H),8.78(s,1H),7.98-7.94(m,2H),7.88(dd,J＝7.6,2.0Hz,1H),7.71(t,J＝7.5Hz,1H),7.62–7.43(m,4H),3.73(s,3H).LCMS:373.0([M+H]+).
实施例25：盐的制备
称取化合物21(E)-5-氟-4-(2-氯苯基)-2-[1-甲基-2-(2-羧酸-4-氟苄叉基)肼基]噻唑(300mg，0.74mmol)溶于四氢呋喃(5mL)中，加入氢氧化钠(29.5mg，0.74mmol)。室温下搅拌2小时，浓缩除去溶剂，得到化合物21的钠盐淡黄色固体328mg(收率99％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.09(s,1H),7.84(dd,J＝8.8,5.9Hz,1H),7.64–7.38(m,5H),7.17(td,J＝8.5,2.8Hz,1H),3.47(s,3H).
参考上述方法，可将本发明化合物与不同的碱反应，转化为药学上可接受的盐。
活性测试1：本发明化合物对人DHODH酶抑制活性测试
该方法是将DHODH酶的活性与染料2,6-二氯苯酚靛酚(DCIP)显色联系起来。具体地，将纯化的重组人DHODH用测试缓冲液(含50mM三(羟基甲基)氨基甲烷，150mM氯化钾，0.1％Triton X-100，pH 8.0)稀释至0.4μg/mL；另外用上述相同的测试缓冲液配置含有2mM的L-二氢乳清酸、0.2mM的癸基泛醌和0.12mM的DCIP的底物溶液；向96孔板的每个孔中加入50μL的DHODH酶溶液和50μL底物溶液，充分混合5秒钟，即使用Spectramax分光光度计读取600nM出的吸光度测量值。加入不同的测试化合物，通过不同吸光度值即可计算酶活性。纯化的重组人DHODH酶购自R&D SYSTEMS(目录号：10062-DD)，其他试剂均购自Sigma-Aldrich。实验中，采用Brequinar(购自Sigma-Aldrich)作为阳性对照。根据细胞活力来计算化合物对细胞增殖的抑制率；并根据不同浓度化合物的抑制率拟合半数抑制浓度IC50值(详见表1)。
Figure BDA0003192866330000221
Figure BDA0003192866330000231
表1
活性测试2：本发明化合物对人单核细胞白血病细胞THP-1抗细胞增殖活性测试
在96孔板中将5000个细胞/孔的THP-1细胞接种于90％的RPMI 1640(Gibco，货号22400-089)、10％的胎牛血清(Corning，货号35-076-CV)和0.05mM的巯基乙醇(Sigma-Aldrich，货号63689)，并培养过夜。将细胞用不同浓度的测试化合物孵育72小时。使用Promega CellTiter-Glo发光法细胞活性检测试剂盒(Promega-G7573)，按照供应商提供的说明书分析细胞活力。根据细胞活力来计算化合物对细胞增殖的抑制率；并根据不同浓度化合物的抑制率拟合半数抑制浓度IC50值(详见表2)。实验中，选取Staurosporine作为阳性对照化合物。
实施例编号 THP-1(白血病)IC<sub>50</sub>(nM)
1 615.4
2 643.1
3 26.7
4 2052.0
5 359.5
6 110.3
20 21.2
21 3.4
22 95.9
参考例 90.4
表2
活性测试3：本发明化合物对人原髓细胞白血病细胞HL-60抗细胞增殖活性测试
在96孔板中将2500个细胞/孔的HL-60细胞接种于80％的IMDM(Gibco，货号12440053)和20％的胎牛血清(Corning，货号35-076-CV)，并培养过夜。将细胞用不同浓度的测试化合物孵育72小时。使用Promega CellTiter-Glo发光法细胞活性检测试剂盒(Promega-G7573)，按照供应商提供的说明书分析细胞活力。根据细胞活力来计算化合物对细胞增殖的抑制率；并根据不同浓度化合物的抑制率拟合半数抑制浓度IC50值(详见表3)。实验中，选取Staurosporine作为阳性对照化合物。
Figure BDA0003192866330000232
Figure BDA0003192866330000241
表3
活性测试4：本发明化合物对人小细胞肺癌细胞NCI-H82抗细胞增殖活性测试
在96孔板中将5000个细胞/孔的NCI-H82细胞接种于90％的RPMI 1640(Gibco，货号22400-089)和10％的胎牛血清(Corning，货号35-076-CV)，并培养过夜。将细胞用不同浓度的测试化合物孵育72小时。使用Promega CellTiter-Glo发光法细胞活性检测试剂盒(Promega-G7573)，按照供应商提供的说明书分析细胞活力。根据细胞活力来计算化合物对细胞增殖的抑制率；并根据不同浓度化合物的抑制率拟合半数抑制浓度IC50值(详见表4)。实验中，选取Staurosporine作为阳性对照化合物。
Figure BDA0003192866330000242
表4
从酶水平的活性数据来看，本发明化合物具有良好的DHOHD酶抑制活性，部分化合物的酶活性≤5nM。本发明的化合物具有良好的肿瘤细胞抗增殖活性，测试的化合物IC50在约1μM以下。
活性测试5：本发明化合物对THP-1细胞异种型移植瘤模型的疗效
选取CB17 SCID小鼠，雌性，6-8周龄，体重18-22克。将THP-1细胞(10×10^6cells/0.2mL with Matrigel)皮下接种于每只小鼠。待小鼠成瘤后，肿瘤平均值达到100-150mm3时，开始给药。
考察肿瘤生长是否被抑制、延缓或治愈。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。实施例20、21和阳性对照化合物阿糖胞苷对该动物模型的结果如图1。
选取实施例20及21制备的化合物，口服给药29天后，可剂量依耐性的抑制肿瘤生长。实施例20(给药剂量9mg/kg)抑瘤率(TG)可达到97％；实施例21(给药剂量15mg/kg)抑瘤率可达到85％。阳性对照化合物阿糖胞苷(10mg/kg)抑瘤率为45％。两个化合物的抑瘤率均超出阿糖胞苷。
活性测试6：本发明化合物对HL-60细胞异种型移植瘤模型的疗效
选取Balb/c裸小鼠，雌性，6-8周龄，体重18-22克。HL-60细胞(10×10^6cells/0.2mL with Matrigel)皮下接种于每只小鼠。待小鼠成瘤后，肿瘤平均值达到100-150mm3时，开始给药。
考察肿瘤生长是否被抑制、延缓或治愈。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。实施例20、21和阳性对照化合物阿糖胞苷对该动物模型的结果如图2。
选取实施例20及21制备的化合物，口服给药18天后，可剂量依耐性的抑制肿瘤生长。实施例20(给药剂量22.5mg/kg)抑瘤率(TG)可达到101.6％；实施例21(给药剂量36mg/kg)抑瘤率可达到102.4％。阳性对照化合物阿糖胞苷(25mg/kg)抑瘤率为77.9％。这两个化合物的抑瘤率均超出阿糖胞苷。
活性测试7：本发明化合物对NCI-H82细胞异种型移植瘤模型的疗效
Balb/c裸小鼠，雌性，6-8周龄，体重18-22克。NCI-H82细胞(5×10^6cells/0.2mLwith Matrigel)皮下接种于每只小鼠。待小鼠成瘤后，肿瘤平均值达到100-150mm3时，开始给药。
考察肿瘤生长是否被抑制、延缓或治愈。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。实施例20、21和阳性对照化合物顺铂+依托泊苷对该动物模型的结果如图3。
选取实施例20及21制备的化合物，口服给药31天后，可剂量依赖性的抑制肿瘤生长。实施例20(给药剂量22.5mg/kg)的抑瘤率(TG)可达到96.2％；实施例21(给药剂量36mg/kg)抑瘤率分别为95.3％。阳性对照化合物顺铂和依托泊苷联用(2mg/kg+4mg/kg)抑瘤率为58.7％。这两个化合物的抑瘤率均超出顺铂和依托泊苷联用组。
通过小鼠的异体移植瘤模型数据，本发明化合物在动物模型上显示出了优秀的抗肿瘤增殖活性。
活性测试8：本发明化合物在小鼠上的药物代谢动力学实验
将化合物溶于含有5％的DMSO和10％的Solutol的生理盐水中(所属百分比均为体积比)，分别配置成0.2mg/mL和1mg/ml的溶液，其中0.2mg/mL溶液用于静脉给药，1mg/mL溶液用于灌胃给药。
药代动力学实验在ICR小鼠上进行，每组3只，静脉注射剂量为5mL/kg，口服灌胃给药剂量为10mL/kg。静脉给药的采血时间点是给药后0、0.083、0.25、0.5、1、2、4、8和24小时，口服给药后的采血时间点是给药后0、0.25、0.5、1、2、4、6、8和24小时。经眶静脉丛采血，每个时间点取样0.03mL。样品被放置在含有K2-EDTA的试管中，并在冰中保存直到离心。样品在采集后1小时内,于2-8℃条件下，4000RPM离心6分钟，离心完毕后样品置于约-80℃冷冻保存。分离上清液用于LC/MS/MS分析。LC/MS/MS系统型号为LC-MS/MS-23(TQ6500+Triplequad)。样品在Acquity UPLC BEH C18、1.7μM、50×2.1mm柱上分离，从30％流动相B开始以线性梯度洗脱，其中流动相A是含有0.1％甲酸的水溶液、流动相B是含有0.1％甲酸的乙腈溶液。采用正离子模式的电喷雾电离来获取LC/MS/MS数据，使用标准曲线分别定量化合物的血浆浓度。得到各时间点的血药浓度后，采用FDA认证的药代动力学程序PhoenixWinNonlin 7.0(Pharsight，美国)拟合得到T1/2，Cmax，Tmax、生物利用度(F％)等药代动力学参数。
其中，部分实施例化合物的药物代谢动力学结果详见表5。
参考例 实施例1 实施例20 实施例21
F(％) 30.99±4.62 19.43±2.64 56.75±5.05 73.06±11.73
表5
从代谢数据可知，相较于参考例化合物，选取实施例20和21制备的化合物，口服给药后，生物利用度(F(％))显著提高。
作为本发明的具体实施例，参照上述合成方法，优选地，通式Ib化合物进一步包括表6所示实施例制备的化合物：
Figure BDA0003192866330000261
Figure BDA0003192866330000262
Figure BDA0003192866330000271
Figure BDA0003192866330000281
Figure BDA0003192866330000291
表6
作为本发明的具体实施例，参照上述合成方法，优选地，通式Ia化合物进一步包括表7所示实施例制备的化合物：
Figure BDA0003192866330000301
Figure BDA0003192866330000302
Figure BDA0003192866330000311
Figure BDA0003192866330000321
Figure BDA0003192866330000331
Figure BDA0003192866330000341
Figure BDA0003192866330000351
Figure BDA0003192866330000361
Figure BDA0003192866330000371
表7
作为本发明的具体实施例，参照上述合成方法，优选地，通式Ic化合物进一步包括表8所示实施例制备的化合物：
Figure BDA0003192866330000372
Figure BDA0003192866330000373
Figure BDA0003192866330000381
表8
从上述活性测试结果可知，本发明的化合物具备及其优异的DHODH抑制活性，其中一些化合物抑制DHODH的IC50值甚至达到小于1nM的级别。因此，本发明的化合物成为低毒性、高安全性的新的DHODH抑制剂，可以作为抗炎剂、自身免疫疾病治疗剂、免疫抑制剂、抗癌剂、病毒感染治疗剂等应用。
应理解，在阅读了本发明的上述公开内容之后，在不脱离本发明申请的方面构思和精神的情况下，本领域普通技术人员可以对本发明的技术方案作各种改动、调整等，或做组合灯，这些等价形式同样落于本申请要求保护的范围内。

Claims (11)

1.式I化合物或其药学上可接受的盐，
Figure FDA0003192866320000011
其中，
R1或R2独立选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、和氰基中的任一种；
R3为-(NR7)p-O-R5；
R5或R7独立选自氢或C1-6烷基；
R4任意选自C1-6烷基或C3-6环烷基；
M是氮原子或者CR6；
R6任意选自氢、卤素和C1-6烷基中任一种；
m或n任意为0-5的整数；p为0或1。
2.如权利要求1所述的式I化合物，其特征在于，所述化合物任选自式Ia、式Ib、式Ic化合物或其药学上可接受的盐，
Figure FDA0003192866320000012
其中，
R1或R2独立选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基和氰基中的任一种；
R3为-(NR7)p-O-R5；
R4任意选自C1-6烷基或C3-6环烷基；
R5或R7独立选自氢或C1-6烷基；
R6任意选自氢或C1-6烷基；
X为卤素；
m或n任意为0-5的整数；p为0或1。
3.如权利要求1或2任一所述的化合物，其特征在于，
R1或R2是氢、卤素、甲基、甲氧基、三氟甲基或三氟甲氧基、和氰基中的任一种；
m或n是0或1或2。
4.如权利要求1或2任一所述的化合物，其特征在于，
R4为C1-3烷基、未取代的环丙基、环丁基、氟取代的环丙基、和环丁基中的任一种。
5.如权利要求1或2任一所述的化合物，其特征在于，
R3为羟基或NR7-O-R5；
R5或R7独立选自氢、甲基和乙基中的任一种。
6.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，在式Ia化合物中，X是氟，R4是C1-4烷基、环丙基、环丁基；在式Ib化合物中，R4是环丙基、环丁基。
7.如权利要求1或2任一所述的化合物，其特征在于，所述化合物是以下化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003192866320000021
Figure FDA0003192866320000031
Figure FDA0003192866320000041
Figure FDA0003192866320000051
Figure FDA0003192866320000061
Figure FDA0003192866320000071
Figure FDA0003192866320000081
Figure FDA0003192866320000091
Figure FDA0003192866320000101
Figure FDA0003192866320000111
8.一种式II化合物，
Figure FDA0003192866320000112
其中，
M为氮或CR6，R6任意选自氢、C1-3烷基和氟中任一种；
R2任意选自氢、卤素、C1-3烷基、C1-3烷氧基和氰基中的任一种；
R4任意选自C1-4烷基或C3-6环烷基；
R8为氨基保护基或氢原子，m任意为0、1、2或3。
9.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1或2任一所述的式I化合物或其药学上可接受的盐和/或药学上可接受的载体。
10.如权利要求9所述的药物组合物在制备治疗或预防DHODH介导的疾病的药物中的用途。
11.如权利要求10所述药物组合物，其特征在于，所述DHODH介导的疾病包括自身免疫疾病、肿瘤和病毒感染。
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