WO2022244943A1 - 폐암 재발 예측방법 및 재발 억제용 약학적 조성물 - Google Patents

폐암 재발 예측방법 및 재발 억제용 약학적 조성물 Download PDF

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WO2022244943A1
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recurrence
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    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a method for providing information necessary for predicting lung cancer recurrence, a pharmaceutical composition for inhibiting lung cancer recurrence, and the like.
  • Cancer is one of the major diseases that causes 10 million new patients worldwide every year. In Korea, cancer-related mortality ranks first, accounting for about 27.5% of all deaths, and this trend is expected to continue.
  • the inventors of the present inventors conducted intensive research to predict lung cancer recurrence and develop a method capable of suppressing it, and as a result, it was confirmed that low-growth cancer cells, which cause lung cancer recurrence, and the expression of RGS2 and ATF4 are closely related, and RGS2 expression
  • the present invention was completed by confirming that proliferation of low-growth cancer cells could be inhibited by inhibiting or blocking the protein synthesis inhibitory action of RGS2.
  • an object of the present invention is RGS2 (regulator of G protein signaling 2) and ATF4 (Activating Transcription Factor 4) proteins; Or to provide a composition for predicting lung cancer recurrence comprising an agent for measuring the expression or activity level of these mRNAs as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for predicting lung cancer recurrence comprising the composition for predicting lung cancer recurrence according to the present invention.
  • Another object of the present invention is to detect RGS2 (regulator of G protein signaling 2) and ATF4 (Activating Transcription Factor 4) proteins in a biological sample isolated from a subject; Or to provide a method for providing information necessary for predicting lung cancer recurrence, including measuring the expression or activity level of these mRNAs.
  • RGS2 regulatory of G protein signaling 2
  • ATF4 Activating Transcription Factor 4
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for inhibiting recurrence of lung cancer, comprising an inhibitor of the expression or activity of RGS2 (regulator of G protein signaling 2) as an active ingredient.
  • RGS2 regulatory of G protein signaling 2
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for inhibiting lung cancer recurrence comprising Evodiamine (Evo) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention RGS2 (regulator of G protein signaling 2) and ATF4 (Activating Transcription Factor 4) protein; Or it provides a composition for predicting lung cancer recurrence comprising an agent for measuring the expression or activity level of these mRNAs as an active ingredient.
  • an agent for measuring the expression level of a protein may be an antibody or an aptamer specific to the protein, but is not limited thereto.
  • the agent for measuring the expression level of the mRNA may be a primer set or a probe that specifically binds to the mRNA, but is not limited thereto.
  • the lung cancer may be non-small cell lung cancer (NSCLC), but is not limited thereto.
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • the present invention provides a kit for predicting lung cancer recurrence comprising the composition for predicting lung cancer recurrence according to the present invention.
  • the present invention relates to RGS2 (regulator of G protein signaling 2) and ATF4 (Activating Transcription Factor 4) proteins in a biological sample isolated from a subject; Or it provides a method for providing information necessary for predicting lung cancer recurrence, including measuring the expression or activity level of these mRNAs.
  • the subject may be a patient who has been cured of lung cancer or a patient who has no evidence of disease after lung cancer treatment, but is not limited thereto.
  • the biological sample is selected from the group consisting of blood, whole blood, plasma, urine, saliva, tissue, cell, organ, bone marrow, core needle biopsy specimen, and vacuum aspiration biopsy specimen. It may be one or more, but is not limited thereto.
  • the method has a high risk of lung cancer recurrence when the expression or activity level of RGS2 protein or its mRNA increases and the expression or activity level of ATF4 protein or its mRNA decreases compared to lung cancer cells. It may further include the step of determining that it is, but is not limited thereto.
  • the protein expression level is measured by Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, Ouchterony immunodiffusion, Rocket immunoelectrophoresis, immunostaining, It may be measured by one or more methods selected from the group consisting of immunoprecipitation assay, complement fixation assay, mass spectrometry, FACS, and protein chip, but is not limited thereto.
  • the mRNA expression level is measured by PCR, RNase protection assay, northern blotting, southern blotting, in situ hybridization, and at least one selected from the group consisting of a DNA chip. It may be measured by a method, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting recurrence of lung cancer, comprising an inhibitor of the expression or activity of RGS2 (regulator of G protein signaling 2) as an active ingredient.
  • RGS2 regulatory of G protein signaling 2
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting lung cancer recurrence comprising Evodiamine (Evo) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the expression inhibitor is Evodiamine (Evo) or a pharmaceutically acceptable salt thereof; It may be at least one selected from the group consisting of an antisense oligonucleotide for a gene encoding the RGS2 protein, siRNA, shRNA, miRNA, and a vector containing the same, but is not limited thereto.
  • the evodiamine or a pharmaceutically acceptable salt thereof may inhibit the stability of the RGS2 protein, but is not limited thereto.
  • the activity inhibitor may be at least one selected from the group consisting of a phosphodiesterase type 5 inhibitor (PDE5 inhibitor) and an antibody specifically binding to RGS2 protein, but is not limited thereto.
  • PDE5 inhibitor phosphodiesterase type 5 inhibitor
  • an antibody specifically binding to RGS2 protein but is not limited thereto.
  • the PDE5 inhibitor may block the protein synthesis inhibitory action of RGS2, but is not limited thereto.
  • the PDE5 inhibitor is sildenafil (sild), tadalafil (tada), vardenafil, mirodenafil, udenafil, or avanafil. ), and one or more selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable salts thereof, but is not limited thereto.
  • the PDE5 inhibitor may be co-administered with an anticancer agent, but is not limited thereto.
  • the anticancer agent may be at least one selected from the group consisting of paclitaxel (Pc), cisplatin (Cs), and pemetrexed (Pm), but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for suppressing lung cancer recurrence comprising the step of administering to a subject in need of a composition containing an expression or activity inhibitor of RGS2 (regulator of G protein signaling 2) as an active ingredient.
  • RGS2 regulatory of G protein signaling 2
  • the present invention provides a use of suppressing lung cancer recurrence of a composition comprising an expression or activity inhibitor of RGS2 (regulator of G protein signaling 2) as an active ingredient.
  • RGS2 regulatory of G protein signaling 2
  • the present invention provides a use of a regulator of G protein signaling 2 (RGS2) expression or activity inhibitor for preparing a drug for suppressing lung cancer recurrence.
  • RGS2 G protein signaling 2
  • the present invention provides a method for suppressing lung cancer recurrence comprising administering a composition containing ebodiamine or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a use of a composition containing ebodiamine or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient for suppressing lung cancer recurrence.
  • the present invention provides a use of ebodiamine or a pharmaceutically acceptable salt thereof for preparing a drug for inhibiting lung cancer recurrence.
  • the present inventors have confirmed that RGS2 is significantly increased and ATF4 is decreased in low-growth cancer cells that cause lung cancer recurrence, and the possibility of lung cancer recurrence can be predicted easily and quickly by measuring the expression or activity levels of RGS2 and ATF4. It is expected that there will be In addition, the present inventors confirmed that the growth of low-growth cancer cells can be inhibited and apoptosis can be induced by suppressing the expression of RGS2 or blocking the protein synthesis inhibitory action of RGS2. It is expected that it can be used in various ways for the development of medicines for therapeutic agents.
  • PDX patient-derived xenograft (xenograft derived from a lung cancer patient)
  • Figure 2 is a diagram showing the gating strategy of flow cytometry to classify CFSE high (>90%), CFSE middle , and CFSE low ( ⁇ 10%) populations.
  • Figures 3a to 3c confirm the characteristics of the CFSE high population through comparison with the CFSE middle and CFSE low populations.
  • Figure 3a shows Ki67 positivity (a), cell proliferation (b), mitotic index (c), and colony It is a diagram showing the results of comparing (colony)-forming ability (d)
  • FIG. 3b is a diagram showing the results of comparing drug sensitivity (resistance to chemotherapy) (Pc: paclitaxel, hereinafter the same)
  • Ki67 positivity mitotic index
  • PDX2 and PDX3 This is a diagram showing the results of comparing ability and drug sensitivity with the CFSE middle and CFSE low groups (*P ⁇ 0.05, **P ⁇ 0.01, and ***P ⁇ 0.001, the same below).
  • Figure 4 is a diagram showing the results of comparing the degree of tumor formation delay after injecting CFSE high or CFSE low cells into mice.
  • FIG. 5 shows the results of RNA-Seq analysis on CFSE high and CFSE low , a Venn diagram (left) of genes differentially expressed in CFSE high compared to CFSE low and CFSE high compared to CFSE low It is a diagram showing a heatmap (right) showing hierarchical clustering of gene expression profiles in .
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of gene ontology (GO) analysis for CFSE high and CFSE low .
  • Figure 7 shows the overlap between 319 genes significantly changed in the CFSE high population and genes corresponding to cell cycle (GO: 0007049), cell proliferation regulation (GO: 0042127), and cell cycle regulation (GO: 0051726) in gene ontology analysis. It is a diagram showing a Venn diagram showing a gene that has been developed.
  • FIG. 8 is a view showing the results confirming that the expression of RGS2 mRNA is up-regulated in the CFSE high population.
  • Figure 9 shows the results of performing PKH26 staining to verify the results of experiments conducted using a group classified by CFSE, and a gating strategy for classifying PKH26 low ( ⁇ 10%) and PKH26 high ( ⁇ 10%) groups.
  • (a) cell proliferation
  • (b) Ki67 positivity
  • (right) c)
  • resistance to chemotherapy d
  • expression of RGS2 mRNA in PKH26 low and PKH26 high populations It is a diagram showing the result of comparing the amount.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of comparing the survival rate (left side) and disease-free survival rate (right side) of lung adenocarcinoma patients with high RGS2 expression (RGS2 high ) and lung adenocarcinoma patients with low RGS2 expression (RGS2 low ).
  • FIG. 11 is a view showing the results of confirming the correlation between the expression of RGS2 and cell proliferation related genes (MKI67, PCNA, and CDK2) and the expression of genes encoding cyclin-dependent kinase inhibitors (CDKN1A and CDKN1B).
  • GSEA gene set amplification analysis
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • SCCs low-growth cancer cells
  • ACC actively cycling cancer cell
  • SCC slow-cycling/dormant cancer cell
  • Figures 15a to 15c confirm the characteristics of drug-resistant subpopulations constructed using human NSCLC cell lines
  • Figure 15a is a diagram showing cell viability in the presence of chemotherapeutic drugs
  • Figure 15b is a diagram showing colony-
  • Figure 15c is a diagram showing cell death activity in the presence of chemotherapeutic drugs (PcR: paclitaxel resistance
  • CsR cisplatin resistance
  • PmR pemetrexed resistance).
  • FIG. 16 is a diagram showing the results of comparing cell proliferation (a), RGS2 mRNA expression (b), and RGS2 protein expression (c) of a group corresponding to non-low-growth cancer cells among the drug-resistant subgroups prepared with parental cells ( P: parental cells).
  • FIG. 17 is a diagram showing the results of comparing apoptosis (top) and autophagy (LC3B: autophagy marker, bottom) of a group corresponding to low-growth cancer cells among the prepared drug-resistant subgroups with parent cells.
  • FIG. 18 is a graph showing the comparison results of cell proliferation (a), colony-forming ability (b), and RGS2 expression (c) of a group corresponding to low-growth cancer cells among the prepared drug-resistant subgroups with parental cells.
  • FIG. 19 is a view showing the results of flow cytometric monitoring of CFSE-labeled changes at the cellular level of low-growth cancer cells for 10 days compared to parent cells (MFI: mean fluorescence intensity).
  • FIG. 20 is a diagram showing the results of comparison of the expression of markers related to Ki67 PI (left), cell proliferation, quiescence, and cell cycle arrest (right) of slow-growth cancer cells with those of parent cells.
  • 22 is a diagram showing the results of comparing tumor formation ability by xenotransplanting low-growth cancer cells or blast cells into mice.
  • FIG. 23 is a view showing the results of confirming the anchorage-dependent/independent colony formation ability (a), cell proliferation (b), and Ki67 PI (c) of low growth cancer cells in which RGS2 expression was suppressed.
  • FIG. 24 shows expression of cell proliferation-related markers (a), energy metabolism (OCR/ECAR) (b), CAP-dependent/independent protein translation (c), It is a diagram showing the result of confirming the initial protein synthesis (d).
  • Figure 25 is a result of Western blotting for cleaved caspase-3 and PARP in low-growth cancer cells under ER-stress (Typsigargin (TG) and hypoxia) (upper panel) and the accumulation of cells in the lower G1 phase was confirmed by flow cytometry. It is a diagram showing the results (bottom) (Cl-PARP: cleaved PARP, Cl-Cas3: cleaved caspase-3, hereinafter the same).
  • Figure 26 shows the results (top) of Western blotting on cleaved caspase-3 and PARP in parental cells in which RGS2 was forcedly overexpressed under ER-stress (TG and hypoxia) and chemotherapy (Pc) (upper panel) and accumulation of cells in the lower G1 phase. It is a diagram showing the result (bottom) confirmed by flow cytometry.
  • Figure 27 shows the results (upper panel) of western blotting on cleaved caspase-3 and PARP in slow-growth cancer cells in which RGS2 expression was suppressed under ER-stress (TG) and chemotherapy (Pc), and the accumulation of cells in the lower G1 phase. It is a diagram showing the result confirmed by flow cytometry (bottom).
  • RGS2 expression (a), cell proliferation (b), Ki67 PI (c), anchorage-dependent/independent colony-forming ability (d), protein translation ( e), and a diagram showing the results of confirming the response (f) to ER-stress (TG) and chemotherapy (Pc).
  • 29 is a view showing the results of comparing tumor formation ability by injecting low-growth cancer cells or low-growth cancer cells with suppressed RGS2 expression into mice.
  • FIG. 30 is a view showing the results of comparing the volumes of tumors formed on the 39th day after injecting low-growth cancer cells or low-growth cancer cells with suppressed RGS2 expression into mice.
  • FIG. 31 is a diagram showing the results of comparing the tumor volumes formed on day 27 after injection of low-growth cancer cells transfected with scrambled shRNA or low-growth cancer cells in which RGS2 expression was suppressed into mice.
  • 32 is a diagram showing the results of confirming the expression levels of genes related to PERK, ATF6, and IRE1 ⁇ branch of UPR in slow-growing cancer cells.
  • 33 is a view showing the results of confirming the expression of ATF4 and the phosphorylation of eIF2 ⁇ in low-growth cancer cells by Western blotting.
  • FIG. 34 is a view showing the results of confirming PERK and eIF2 ⁇ phosphorylation, ATF4, CHOP, and GADD34 expressions of slow-growth cancer cells under ER-stress (TG) by Western blotting.
  • 35 is a view showing the results of confirming the expression of ATF4 target genes (DDIT3 and PPP1R15A) (upper panel), PERK and eIF2 ⁇ phosphorylation, and ATF4, CHOP, and GADD34 expression (lower panel) in low growth cancer cells under exposure to chemotherapy drugs.
  • 36 is a view showing the results of confirming changes in mRNA translation (a) and protein synthesis level (b) according to ATF4 expression in low-growth cancer cells.
  • FIG. 37 is a diagram showing the results of confirming cell proliferation (a) and expression of cleaved caspase-3 and PARP (b) according to ATF4 expression in low-growth cancer cells.
  • FIG. 38 is a diagram showing the results of Western blot analysis of the response of ATF4-overexpressing low-growth cancer cells to mTOR inhibitor (Rap, a) and ROS scavenger (NAC, b) treatment (Rap: rapamycin, NAC: N-acetyl- L-cysteine).
  • FIG. 39 shows the results of eIF2 ⁇ phosphorylation and ATF4 protein expression (top) and expression of ATF4 target genes (DDIT3 and PPP1R15A) (bottom) in low-growth cancer cells in which RGS2 expression was suppressed (a) and RGS2-overexpressed parental cells (b). is the drawing shown.
  • FIG. 40 is a view showing the results of comparison of ATF4 mRNA expression between low-growth cancer cells and parental cells, between low-growth cancer cells and low-growth cancer cells in which RGS2 expression is suppressed, and between parental cells and parental cells in which RGS2 is overexpressed.
  • 41 is a diagram showing the results of comparing the initial synthesis rate of ATF4 protein in RGS2 overexpressed parental cells.
  • FIG. 42 is a view showing the results of confirming the half-life of ATF4 protein in RGS2 overexpressed parental cells.
  • FIG. 43 is a diagram showing the results of comparison of ATF4 ubiquitination in chemotherapy-resistant blast cells (left), RGS2-overexpressing blast cells (middle), and low-growth cancer cells in which RGS2 expression was suppressed (right).
  • 44 is a diagram showing the results of confirming the association between ATF4 and RGS2 by performing co-immunoprecipitation assay on MG132-treated low-growth cancer cells.
  • 45 is a view showing the result of confirming the interaction between ATF4 and RGS2 by conducting coimmunoprecipitation assay in MG132 treated/untreated parental cells.
  • 46 is a view showing full-length RGS2 protein and mutant recombinant RGS2 protein prepared for each RGS2 protein domain (FL: full-length).
  • 47 is a view showing the result of confirming the interaction between ATF4 and whole or mutant RGS2 protein by pulldown assay.
  • FIG. 48 is a diagram showing the results of confirming the regulation of protein translation by overexpression of whole or mutant RGS2 protein.
  • mice 49 is an experimental method for confirming the characteristics of low-growth cancer cells showing high RGS2 expression and low ATF4 expression using mice (a to d) xenografted with lung cancer cells and mice (e to h) transplanted with lung cancer cells.
  • mice (a and e) are views showing the results of confirming the residual tumor volume (b and f), RGS2 and ATF4 expression (c and g), and RGS2 and ATF4 protein expression (d and h) after chemotherapy treatment.
  • 50 is a view showing an experimental method for verifying the characteristics of low-growth cancer cells and their clinical relevance.
  • Figure 51 shows the correlation between RGS2 and Ki67 expression (a), relative tumor volume (b), expression of RGS2 and ATF4 in tumors xenografted with lung cancer patient-derived tumors (PDX) after treatment with chemotherapy drugs (Pc/Cs). It is a drawing showing the result of confirming (c).
  • FIG. 52 is a view showing the results of confirming the tumor volume after treatment with chemotherapy drugs (Pc/Cs) for a certain period of time in mice xenotransplanted with lung cancer cells, stopping and treatment with RGS2 siRNA.
  • chemotherapy drugs Pc/Cs
  • Figure 53 shows that mice xenografted with lung cancer cells were treated with chemotherapy drugs (Pc/Cs) for a certain period of time, stopped, treated with RGS2 siRNA, and immunohistochemistry (IHC) was performed on the expression of RGS2 and cleaved caspase-3.
  • IHC immunohistochemistry
  • FIG. 54 is a view showing the results of confirming the tumor volume in mice xenotransplanted with low-growth cancer cells in which RGS2 expression was suppressed by siRNA.
  • 55 is a view showing the results of IHC analysis on cleaved caspase-3 after treatment with a chemotherapeutic drug (Pc) in mice xenotransplanted with low growth cancer cells in which RGS2 expression was suppressed by siRNA.
  • Pc chemotherapeutic drug
  • Figure 56 shows the tumor volume (a) and RGS2 and cleaved caspase- 3 It is a diagram showing the result of confirming the expression (b).
  • 57 shows the result of confirming protein translation in PDE5 inhibitor-treated low-growth cancer cells (H460/PcR) (left) and the expression of markers related to cell proliferation, growth, and survival by immunoblotting (right). It is a drawing (Sild: Sildenafil, Tada: Tadalafil, hereinafter the same).
  • 58 shows cell viability (a), colony-forming ability (b), and cleaved caspase-3 and PARP between low-growth cancer cells (H460/PcR) treated with a PDE5 inhibitor alone and low-growth cancer cells treated with a PDE5 inhibitor and paclitaxel in combination. It is a drawing showing the result of confirming the expression (c).
  • 59 is a view showing the results of confirming the colony-forming ability of slow-growth cancer cells (H460/PcR) treated with paclitaxel and db-cGMP (dibutyryl-cyclic GMP), a PDE5 inhibitor analogue.
  • 60 shows the results of confirming the expression of cleaved caspase-3 and PARP after treatment with a protein synthesis inhibitor (rapamycin (a) or NAC (b)) to low growth cancer cells (H460/PcR) treated with a PDE5 inhibitor and paclitaxel in combination. is the drawing shown.
  • rapamycin (a) or NAC (b) protein synthesis inhibitor
  • H460/PcR low growth cancer cells
  • 61 is a view showing the result of confirming the volume of a tumor after a combined treatment of a PDE5 inhibitor and paclitaxel to a mouse xenografted with low-growth cancer cells (a) or a mouse xenotransplanted with a lung cancer patient-derived tumor (b).
  • FIG. 62a and 62b show the results of IHC to confirm the expression of cleaved caspase-3 after co-treatment with a PDE5 inhibitor and paclitaxel in mice xenotransplanted with low-growth cancer cells and mice xenotransplanted with lung cancer patient-derived tumors.
  • FIG. 62a is a diagram showing the IHC analysis results
  • 63 is a view showing the results of confirming the volume of the tumor after treating the tumor established in the mouse xenografted with low-growth cancer cells with a PDE5 inhibitor and paclitaxel.
  • 64 is a diagram showing the results of body weight measurement after a combination treatment of a PDE5 inhibitor and paclitaxel to a mouse xenografted with low-growth cancer cells and a mouse xenografted with a tumor derived from a lung cancer patient.
  • 65 is a view showing the result of confirming the expression of RGS2 by Western blot after treating slow-growth cancer cells with evodiamine (Evo: evodiamine, hereinafter the same).
  • 66 is a diagram showing the result of confirming the expression of RGS2 by Western blot after treatment with cycloheximide on slow-growth cancer cells treated with evodiamine (CHX: cycloheximide, hereinafter the same).
  • 67 shows strategies for survival of low-growth cancer cells (SCC) in an ER-stress environment after chemotherapy treatment compared with lung cancer cells (ACC).
  • the left side shows the mechanism of action of lung cancer cells in an ER-stress environment, and the middle shows the ER-stress environment.
  • Mechanism of action of low-growth cancer cells in a stress environment right side is a diagram showing the mechanism of action of low-growth cancer cells in an ER-stress environment when expression of RGS2 is inhibited (ER-associated protein degradation (ERAD): ER-related protein degradation).
  • ESD ER-associated protein degradation
  • low growth cancer cells were established by repeatedly exposing human NSCLC cell lines to chemotherapeutic drugs (see Experimental Example 3).
  • RGS2 regulates the expression of ATF4 by inducing proteasome-mediated degradation by binding to ATF4 in low growth cancer cells (SCCs) (see Experimental Example 7).
  • the present invention relates to RGS2 (regulator of G protein signaling 2) and ATF4 (Activating Transcription Factor 4) proteins; Or it provides a composition for predicting lung cancer recurrence comprising an agent for measuring the expression or activity level of these mRNAs as an active ingredient.
  • regulatory of G protein signaling 2 acts as a GTPase Activating Protein (GAP) to degrade the GTP of the G protein to inhibit G protein signal transduction.
  • GAP GTPase Activating Protein
  • the RGS2 protein may be of mammalian origin, preferably of human origin. Most preferably, the RGS2 protein in the present invention is characterized by comprising the amino acid sequence of human RGS2 (NP_002914.1) represented by SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto (NCBI Genebank accession number in parentheses).
  • the RGS2 mRNA may preferably include the human RGS2 mRNA (NM_002923.4) nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto (NCBI Genebank accession number in parentheses). Characteristics such as the coding region (exon) of the above-mentioned human RGS2 mRNA transcript variants are identified in the sequence information obtained by searching the NCBI database with the Genebank accession number indicated in parentheses.
  • ATF4 Activating Transcription Factor 4
  • ATF4 belongs to the ATF/CREB (activating transcription factor/cyclic AMP response element binding 6 protein) family, and is a stress protein whose expression is increased and accumulated by ER stress It means a protein with 351 amino acids and a molecular weight of about 39 kDa.
  • the ATF4 protein may be of mammalian origin, preferably of human origin. Most preferably, the ATF4 protein in the present invention is characterized by including the amino acid sequence of human ATF4 (NP_001666.2) represented by SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto (NCBI Genebank accession number in parentheses).
  • the ATF4 mRNA may preferably include the human ATF4 mRNA (NM_001675.4) nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto (NCBI Genebank accession number in parentheses). Characteristics such as the coding region (exon) of the above-mentioned human ATF4 mRNA transcript variants are identified in the sequence information obtained by searching the NCBI database with the Genebank accession number indicated in parentheses.
  • lung cancer refers to a malignant tumor in the lung, which occurs in the lung itself or when cancer in other organs metastasizes to the lung, and is called small cell lung cancer based on the size and shape of cancer cells. cell lung cancer) and non-small cell lung cancer (NSCLC). According to one embodiment of the present invention, the lung cancer may be non-small cell lung cancer, but is not limited thereto.
  • lung cancer recurrence means that cancer reoccurs within a certain period after lung cancer is cured, and lung cancer is cured (eg, surgery, anticancer drug administration, radiation, etc.) Recurrence of the same type of tumor in the same site (primary recurrence) or another site (metastatic recurrence) after removal, disappearance, and/or reduction equivalent to the disappearance of lung cancer tissue by treatment).
  • Lung cancer recurrence includes: (1) direct recurrence in which tumor cells that are not completely eliminated proliferate (eg, local recurrence and metastatic recurrence); and 2 indirect recurrence in which the same type of tumor newly develops after tumor cells are completely removed, resulting in a poor prognosis for lung cancer patients. Therefore, it is more important than anything else to predict recurrence more conveniently and efficiently at an early stage.
  • recurrence of lung cancer may mean that cancer occurs again as a tumor is formed in an environment suitable for the growth of dormant low-growth cancer cells.
  • slow-cycling/dormant cancer cells refers to cancer cells that remain at a level that is impossible to diagnose by conventional lung cancer diagnosis methods after chemotherapy, and stop for several months to several years. It remains dormant in a slow-cycling state with a similar phenotype, and when a microenvironment suitable for tumor growth is formed, it promotes tumor growth and causes lung cancer to recur.
  • the slow-growth cancer cells release activated ATF6 through proteolytic processing and production of sXBP1 by IRE1 ⁇ -mediated ribonuclease activity, resulting in protein folding or ER-related proteolysis. It mediates the restoration of ER homeostasis by inducing transcriptional regulation of genes involved in (ER-associated protein degradation; ERAD). Accordingly, it is predicted that slow-growth cancer cells can survive in an infertile microenvironment with persistent ER stress in part by activating ATF6- and IRE1 ⁇ -mediated protein folding and ERAD.
  • the low-growth cancer cells have a higher expression of RGS2 and a lower expression of ATF4 compared to lung cancer cells (ACCs).
  • RGS2 inhibits ATF4-mediated mRNA translation by inducing proteasome-mediated degradation through binding to ATF4, allowing low-growth cancer cells to survive in an ER-stress-inducing tumor microenvironment, thus reducing RGS2 expression or activity.
  • low growth cancer cells become sensitive to ER-stress-induced apoptosis and recover sensitivity to chemotherapeutic drugs (anti-cancer drugs), thus suppressing tumor recurrence.
  • the conventional methods for diagnosing lung cancer include, for example, sputum cytology, chest CT, bronchoscopy, fine needle aspiration, chest X-ray, and the like, but are not limited thereto.
  • ACCs actively cycling cancer cells
  • lung cancer cells Parental cells may mean ACCs, and according to an embodiment of the present invention, ACCs have a low expression of RGS2 and a high expression of ATF4 compared to low-growth cancer cells.
  • IRE1 ⁇ , PERK, and ATF6 branches of the UPR are activated by exposure to various ER-stress causes including chemotherapy treatment, and PERK-induced phosphorylation of eIF2 ⁇ leads to global mRNA translation whereas selective translation of mRNA encoding ATF4, a transcription factor for GADD34, can restore protein synthesis.
  • the term "for predicting lung cancer recurrence" means to confirm, determine, or determine in advance whether or not lung cancer will recur in a patient who has been cured of lung cancer or who has no evidence of disease after lung cancer treatment.
  • RGS2 and ATF4 proteins in lung cancer patients cured or patients without evidence of disease after lung cancer treatment Alternatively, the possibility of lung cancer recurrence may be confirmed, judged, or determined in advance by measuring the expression or activity level of its mRNA.
  • no evidence of disease refers to a case in which there is no physical evidence of disease in radiation/tissue examination after treatment, that is, a case in which residual cancer is not found in a normal diagnosis process. It doesn't mean it's complete.
  • expression means the production of a protein or nucleic acid in a cell.
  • protein is used interchangeably with “polypeptide” or “peptide” and refers to a polymer of amino acid residues, e.g., as commonly found in proteins in nature. do.
  • Polynucleotide or “nucleic acid” refers to deoxyribonucleotides (DNA) or ribonucleotides (RNA) in single- or double-stranded form. Unless otherwise limited, known analogs of natural nucleotides that hybridize to nucleic acids in a manner similar to naturally occurring nucleotides are also included.
  • mRNA refers to RNA that transmits genetic information (gene-specific base sequence) to ribosomes that specify amino acid sequences from specific genes during protein synthesis.
  • the agent for measuring the expression level of mRNA may be a primer set or a probe that specifically binds to mRNA.
  • composition of the present invention including the RGS2 or ATF4 mRNA-specific primer set or probe may further include an agent required for a known RNA detection method.
  • the mRNA level of the protein markers can be measured in a subject by using a known method for detecting RNA using the composition of the present invention without limitation.
  • primer refers to a nucleic acid sequence having a short free 3-terminal hydroxyl group that can form base pairs with a complementary template and serves as a starting point for template strand copying.
  • a primer can initiate DNA synthesis in the presence of a reagent for polymerization (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) and different four nucleoside triphosphates in an appropriate buffer and temperature.
  • a reagent for polymerization i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase
  • probe refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a few bases to several hundreds of bases as short as possible to achieve specific binding with mRNA, and is labeled, so that a specific mRNA existence can be checked.
  • the probe may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, an RNA probe, or the like. Selection of suitable probes and hybridization conditions can be modified based on those known in the art.
  • primers or probes may be chemically synthesized using a phosphoramidite solid support synthesis method or other well-known methods.
  • primers or probes may be variously modified according to methods known in the art to the extent that hybridization with mRNA is not hindered. Examples of such modifications are methylation, capping, substitution of one or more homologues of the natural nucleotide, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages (e.g., methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates, carbamates). etc.) or charged linkages (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), and binding of fluorescent or enzymatic labeling materials.
  • uncharged linkages e.g., methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates, carbamates). etc.
  • charged linkages eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.
  • the agent for measuring the expression level of the protein may be an antibody or an aptamer that specifically binds to the protein.
  • an antibody refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site.
  • an antibody means an antibody that specifically binds to a marker protein, and includes both polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies.
  • a part of the entire antibody is also included in the antibody of the present invention, and all types of immunoglobulin antibodies that specifically bind to the protein of the present invention are included.
  • antibodies of the present invention include special antibodies such as humanized antibodies and chimeric antibodies and recombinant antibodies as long as they can specifically bind to the protein of the present invention.
  • the term "aptamer” refers to a substance that can specifically bind to an analyte to be detected in a sample, and is a single-stranded nucleic acid (DNA, RNA, or modified nucleic acid) having a stable tertiary structure in itself. nucleic acid), it is possible to specifically confirm the presence of a target protein in a sample.
  • the aptamer is synthesized by determining the sequence of an oligonucleotide that is selective for the target protein to be identified and has high binding ability according to the general aptamer preparation method, and then the 5' or 3' end of the oligonucleotide is applied. It can be made by modification with -SH, -COOH, -OH or NH 2 so that it can bind to the functional group of the timer chip, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention comprising an antibody specific to the RGS2 or ATF4 protein may additionally include an agent required for a method for detecting a known protein, and a method for detecting a known protein using the present composition is used without limitation.
  • the expression level of a protein in a subject in the present invention, a biological sample obtained from the subject
  • nucleic acid sequence of the gene encoding the protein marker is registered in the gene bank, a person skilled in the art can design an antisense oligonucleotide, primer set or probe that specifically amplifies a specific region of these genes based on the sequence. can do.
  • antisense oligonucleotides can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method or other well-known methods, and include all functional equivalents.
  • the above-described “primer” or “probe” may be equally applied.
  • the term "functional equivalent” refers to, for example, one or more substitutions, deletions or additions from a reference sequence, the actual effect of which does not result in various functional dissimilarities between the reference sequence and the subject sequence. (net effect) refers to both the nucleotide and nucleic acid sequences of the mutated sequence. Typically, such substantially equivalent sequences represent only about 35% (i.e., the number of each residue substitution, addition, and deletion in the substantially equivalent sequence compared to the corresponding reference sequence and the total number remaining in the substantially equivalent sequence). is about 0.35 or less when divided by ) from those listed herein. Such sequences have 65% sequence identity to the listed sequences.
  • Substantially equivalent, eg mutant, amino acid sequences according to the present invention preferably have at least 80% sequence identity, more preferably at least 90% sequence identity with the listed amino acid sequences.
  • Nucleotide sequences of the invention that are substantially equivalent may have a lower percentage of sequence identity, for example when considering redundancy or degeneracy of the genetic code.
  • the nucleotide sequences should have at least about 65% identity, more preferably at least about 75% identity, and most preferably about 95% identity.
  • sequences having substantially equivalent biological activity and substantially equivalent synthetic characteristics are considered substantially equivalent.
  • truncation of the mature sequence eg, through mutations producing a spurious stop codon
  • the present invention provides a kit for predicting lung cancer recurrence comprising the composition for predicting lung cancer recurrence according to the present invention.
  • the kit of the present invention may include an antibody recognizing a target protein as a marker, a primer set recognizing mRNA as a marker, and a probe, as well as one or more other constituent compositions, solutions, or devices suitable for the analysis method.
  • the kit for prediction may be a kit for prediction characterized in that it includes essential elements necessary for carrying out the reverse transcription polymerase reaction.
  • the reverse transcription polymerase reaction kit includes each primer set specific for a marker gene.
  • the primer is a nucleotide having a sequence specific to the nucleic acid sequence of each marker gene, and is about 7 bp to 50 bp in length, more preferably about 10 bp to 30 bp in length.
  • a primer specific for the nucleic acid sequence of the control gene may be included.
  • reverse transcription polymerase reaction kits contain a test tube or other suitable container, reaction buffer (with varying pH and magnesium concentration), deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase and RNase inhibitor DEPC. -Water (DEPC-water), sterilized water, etc. may be included.
  • the DNA chip kit may include a substrate to which cDNA or an oligonucleotide corresponding to a gene or a fragment thereof is attached, and reagents, reagents, enzymes, and the like for producing a fluorescently labeled probe.
  • the substrate may include a cDNA or oligonucleotide corresponding to a control gene or a fragment thereof.
  • the present invention is a regulator of G protein signaling 2 (RGS2) and activating transcription factor 4 (ATF4) proteins in a biological sample isolated from a subject; Or it provides a method for providing information necessary for predicting lung cancer recurrence, including measuring the expression or activity level of these mRNAs.
  • GRS2 G protein signaling 2
  • ATF4 activating transcription factor 4
  • the method increases the expression or activity level of RGS2 protein or its mRNA compared to lung cancer cells
  • a step of determining that the risk of lung cancer recurrence is high when the expression or activity level of the ATF4 protein or its mRNA is reduced may be further included, but is not limited thereto.
  • the subject may be a mammal including a human, and in the case of a human, it may be a lung cancer patient who has been cured of lung cancer or a patient who has no evidence of disease after lung cancer treatment, but is limited if it is necessary to determine the risk of lung cancer recurrence or the presence or absence of recurrence All may be included without
  • the term “measurement” refers to measuring and confirming the presence (expression) of a substance of interest (marker protein in the present invention), or measuring a change in the level of existence (expression level) of a substance of interest. And it is meant to include both confirming. That is, measuring the expression level of the protein means measuring whether or not it is expressed (ie, measuring whether or not it is expressed) or measuring the level of qualitative or quantitative change of the protein. The measurement can be performed without limitation including both qualitative methods (analysis) and quantitative methods. Types of qualitative and quantitative methods for measuring protein levels are well known in the art, and include the experimental methods described herein. Specific protein level comparison methods for each method are well known in the art. Therefore, detecting the target protein means detecting the presence or absence of RGS2 and ATF4 proteins, or confirming an increase (up-regulation) or decrease (down-regulation) of the protein expression level.
  • the biological sample may be used without limitation as long as it is collected from a subject for which lung cancer recurrence is to be predicted, and for example, blood, whole blood, plasma, urine, saliva, tissue, cell, organ, bone marrow, and core It may include, but is not limited to, a core needle biopsy specimen, a vacuum aspiration biopsy specimen, and the like.
  • the biological sample may be pretreated before being used for detection or diagnosis.
  • it may include homogenization, filtration, distillation, extraction, concentration, inactivation of interfering components, addition of reagents, and the like.
  • the sample can be prepared to increase the detection sensitivity of protein markers, for example, a sample obtained from a patient can be subjected to anion exchange chromatography, affinity chromatography, size exclusion chromatography, liquid chromatography, It may be pretreated using a method such as sequential extraction or gel electrophoresis.
  • the measurement method of the protein expression level is not particularly limited as long as it is by a protein expression measurement method known in the art, but, for example, Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, Oukter It may be one or more selected from the group consisting of Ouchterlony immunodiffusion, Rocket immunoelectrophoresis, immunostaining, immunoprecipitation, complement fixation, mass spectrometry, FACS, and protein chip.
  • the gene expression level is measured by PCR, RNase protection assay, northern blotting, southern blotting, in situ hybridization, And it may be one or more selected from the group consisting of a DNA chip.
  • analysis may preferably mean “measurement”, and the qualitative analysis may mean measuring and confirming the presence or absence of a target substance, and the quantitative analysis may mean It may mean measuring and confirming changes in the presence level (expression level) or amount of the desired substance.
  • analysis or measurement may be performed without limitation including both qualitative and quantitative methods, and preferably, quantitative measurement may be performed.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting recurrence of lung cancer, comprising an inhibitor of the expression or activity of RGS2 (regulator of G protein signaling 2) as an active ingredient.
  • RGS2 regulatory of G protein signaling 2
  • the expression inhibitor is evodiamine (Evo) or a pharmaceutically acceptable salt thereof; It may be one or more selected from the group consisting of an antisense oligonucleotide for a gene encoding the RGS2 protein, siRNA, shRNA, miRNA, and a vector containing the same, but is not limited thereto, and may include all of them as long as they can inhibit RGS2 expression.
  • the antisense oligonucleotide, siRNA, shRNA, miRNA, and vectors containing them can be prepared using methods known in the art.
  • the "evodiamine (Evo)" may be represented by the following formula 1, (1S) -21-methyl-3,13,21-triazapentacyclo[11.8.0.02,10.04,9.015,20 It may have the IUPAC name of ]henicosa-2(10),4,6,8,15,17,19-heptaen-14-one.
  • the molecular weight may be 303.4
  • the chemical formula may be C 19 H 17 N 3O .
  • the ebodiamine may be chemically synthesized by a method known in the field to which the present invention belongs, or a commercially available material may be used, and may be obtained by extraction and separation, but is not limited thereto.
  • the ebodiamine or a pharmaceutically acceptable salt thereof may suppress the RGS2 protein expression by inhibiting the stability of the RGS2 protein, but is not limited thereto.
  • antisense oligonucleotide refers to DNA or RNA or a derivative thereof containing a nucleic acid sequence complementary to a sequence of a specific mRNA, and binds to a complementary sequence in mRNA to form a protein of RGS2. It acts as a hindrance to translation.
  • the antisense sequence of the present invention refers to a DNA or RNA sequence that is complementary to RGS2 mRNA and capable of binding to RGS2 mRNA, and is involved in translation, cytoplasmic translocation, maturation, or all other overall biological functions of RGS2 mRNA. It may inhibit the essential activity of
  • RNA refers to a double-stranded RNA that induces RNA interference through cleavage of a target mRNA, and includes an RNA strand of a sense sequence having the same sequence as the target mRNA and an antisense sequence complementary thereto. It consists of a sequence of RNA strands.
  • the siRNA of the present invention consists of the antisense nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, and by including this sequence, suppresses the expression of RGS2 to suppress the growth of low-growth cancer cells and increases the sensitivity to anticancer drugs, thereby efficiently suppressing lung cancer recurrence.
  • the gene is a base having a sequence homology of at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, and most preferably at least 94% with the base sequence represented by SEQ ID NO: 5. sequence may be included.
  • sequence homology includes a polynucleotide having.
  • the "percentage of sequence homology" for polynucleotides is determined by comparing two optimally aligned sequences with a comparison region, wherein a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is a reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. may include additions or deletions (i.e., gaps) compared to (not including).
  • shRNA refers to a short double-stranded chain whose loop is cleaved by Dicer and acts with RISC like siRNA to exhibit RNAi.
  • the shRNA has a stem-loop structure, and long RNAs of 19 to 29 nucleotides complementary to both sides of the loop of 5 to 10 nucleotides are base-paired to form a double-stranded stem. form shRNA is generally transcribed and synthesized by the Pol III promoter in vivo, and then the shRNA loop is cleaved by Dicer and acts with RISC like siRNA.
  • the shRNA of the present invention consists of a sense sequence of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 and an antisense sequence thereof, and by including this sequence, inhibits the expression of RGS2 to inhibit the growth of low-growth cancer cells, and inhibits cancer cell growth / promotes apoptosis of anticancer drugs Lung cancer recurrence can be effectively inhibited by increasing the sensitivity to action.
  • the gene has a sequence homology of 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, and most preferably 94% or more, respectively, with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 or 7.
  • the branch may include a nucleotide sequence.
  • the "vector” refers to a genetic construct containing an external DNA inserted into a genome encoding a polypeptide.
  • the vector related to the present invention is a vector in which a nucleic acid sequence that inhibits the gene is inserted into the genome, and examples of these vectors include DNA vectors, plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, yeast vectors, or viral vectors.
  • the activity inhibitor refers to a material that reduces the function of the RGS2 protein, preferably, makes the protein synthesis inhibitory action of the protein impossible or exists at an insignificant level. More specifically, the activity inhibitor may be at least one selected from the group consisting of a PDE5 inhibitor (phosphodiesterase type 5 inhibitor) and an antibody that specifically binds to the RGS2 protein, but is not limited thereto, and may include all of them as long as they can inhibit RGS2 activity.
  • a PDE5 inhibitor phosphodiesterase type 5 inhibitor
  • phosphodiesterase 5 inhibitor is used for the treatment of erectile dysfunction by inhibiting the degradation of cGMP-specific phosphodiesterase type 5 in vascular smooth muscle cells that supply blood to the corpus cavernosum of the penis. By blocking the protein synthesis inhibitory action of RGS2, it can suppress the growth of low-growth cancer cells that cause lung cancer recurrence and induce apoptosis.
  • the PDE5 inhibitor is sildenafil (Sild), tadalafil (tada), vardenafil (vardenafil), mirodenafil (mirodenafil), udenafil (udenafil), avanafil (avanafil), and these It may be at least one selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable salts of, but is not limited thereto, and may include any substance capable of activating cell growth and protein synthesis promoting signaling in low growth cancer cells.
  • the PDE5 inhibitor may be administered in combination with an anticancer agent, and the anticancer agent is at least one selected from the group consisting of paclitaxel (Pc), cisplatin (Cs), and pemetrexed (Pm). It can be used, but is not limited thereto.
  • the anticancer agent is at least one selected from the group consisting of paclitaxel (Pc), cisplatin (Cs), and pemetrexed (Pm). It can be used, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting recurrence of lung cancer, comprising evodiamine (Evo) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the ebodiamine of the present invention can be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and the term "pharmaceutically acceptable salt” in the present invention includes salts derived from pharmaceutically acceptable inorganic acids, organic acids, or bases. .
  • acids examples include hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene-p-sulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, citric acid, methanesulfonic acid, formic acid , benzoic acid, malonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, benzenesulfonic acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid, benzoic acid, citric acid, lactic acid and the like.
  • Acid addition salts can be prepared by conventional methods, for example, by dissolving a compound in an aqueous solution of excess acid and precipitating the salt using a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. It can also be prepared by heating equimolar amounts of the compound and an acid or alcohol in water and then evaporating the mixture to dryness, or suction filtering the precipitated salt.
  • a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile.
  • Salts derived from suitable bases may include, but are not limited to, alkali metals such as sodium and potassium, alkaline earth metals such as magnesium, and ammonium.
  • An alkali metal or alkaline earth metal salt can be obtained, for example, by dissolving a compound in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the undissolved compound salt, and then evaporating and drying the filtrate.
  • the metal salt it is particularly suitable for pharmaceutical purposes to prepare a sodium, potassium or calcium salt, and the corresponding silver salt can be obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (eg, silver nitrate).
  • a suitable silver salt eg, silver nitrate
  • the content of ebodiamine or a pharmaceutically acceptable salt thereof in the composition of the present invention can be appropriately adjusted according to the symptoms of the disease, the progress of the symptoms, the condition of the patient, etc., for example, 0.0001 to 99.9% by weight based on the total weight of the composition, It may be 0.001 to 80% by weight or 0.01 to 50% by weight, but is not limited thereto.
  • the content ratio is a value based on the dry amount after removing the solvent.
  • the "pharmaceutical composition” according to the present invention may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • the excipient may be, for example, one or more selected from the group consisting of a diluent, a binder, a disintegrant, a lubricant, an adsorbent, a moisturizer, a film-coating material, and a controlled release additive.
  • compositions according to the present invention are powders, granules, sustained-release granules, enteric granules, solutions, eye drops, elsilic agents, emulsions, suspensions, spirits, troches, perfumes, and limonadese, respectively, according to conventional methods.
  • tablets, sustained-release tablets, enteric tablets, sublingual tablets, hard capsules, soft capsules, sustained-release capsules, enteric capsules, pills, tinctures, soft extracts, dry extracts, fluid extracts, injections, capsules, perfusate It can be formulated and used in the form of an external agent such as a warning agent, lotion, pasta agent, spray, inhalant, patch, sterile injection solution, or aerosol, and the external agent is a cream, gel, patch, spray, ointment, warning agent , lotion, liniment, pasta, or cataplasma may have formulations such as the like.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharide, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Additives for the liquid formulation according to the present invention include water, dilute hydrochloric acid, dilute sulfuric acid, sodium citrate, sucrose monostearate, polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters (tween esters), polyoxyethylene monoalkyl ethers, lanolin ethers, Lanolin esters, acetic acid, hydrochloric acid, aqueous ammonia, ammonium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, prolamine, polyvinylpyrrolidone, ethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, and the like may be used.
  • a solution of white sugar, other sugars, or a sweetener may be used, and aromatics, coloring agents, preservatives, stabilizers, suspending agents, emulsifiers, thickeners, etc. may be used as necessary.
  • Purified water may be used in the emulsion according to the present invention, and emulsifiers, preservatives, stabilizers, fragrances, etc. may be used as needed.
  • Suspension agents according to the present invention include acacia, tragacantha, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, microcrystalline cellulose, sodium alginate, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910, etc. Agents may be used, and surfactants, preservatives, stabilizers, colorants, and fragrances may be used as needed.
  • Injections according to the present invention include distilled water for injection, 0.9% sodium chloride injection, IV injection, dextrose injection, dextrose + sodium chloride injection, PEG, lactated IV injection, ethanol, propylene glycol, non-volatile oil-sesame oil , solvents such as cottonseed oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, ethyl oleate, isopropyl myristate, and benzene benzoate; solubilizing agents such as sodium benzoate, sodium salicylate, sodium acetate, urea, urethane, monoethylacetamide, butazolidine, propylene glycol, twins, nijuntinamide, hexamine, and dimethylacetamide; buffers such as weak acids and their salts (acetic acid and sodium acetate), weak bases and their salts (ammonia and ammonium acetate), organic compounds, proteins, albumin, peptone, and gums; tonicity agents such as sodium chlor
  • the suppository according to the present invention includes cacao butter, lanolin, witapsol, polyethylene glycol, glycerogelatin, methylcellulose, carboxymethylcellulose, a mixture of stearic acid and oleic acid, subanal, cottonseed oil, peanut oil, palm oil, cacao butter + Cholesterol, Lecithin, Lannet Wax, Glycerol Monostearate, Tween or Span, Imhausen, Monolen (Propylene Glycol Monostearate), Glycerin, Adeps Solidus, Buytyrum Tego-G -G), Cebes Pharma 16, Hexalide Base 95, Cotomar, Hydroxycote SP, S-70-XXA, S-70-XX75 (S-70-XX95), Hyde Hydrokote 25, Hydrokote 711, Idropostal, Massa estrarium (A, AS, B, C, D, E, I, T), Massa-MF, Masupol, Masupol-15, Neos
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations contain at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, etc. ) or by mixing lactose and gelatin.
  • excipients for example, starch, calcium carbonate, sucrose, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions for oral administration, emulsions, syrups, etc.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, aromatics, and preservatives may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations, and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
  • composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type of patient's disease, severity, activity of the drug, It may be determined according to factors including sensitivity to the drug, administration time, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by a person skilled in the art to which the present invention belongs.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration can be envisaged, eg oral administration, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, intravenous injection, intramuscular injection, paraspinal space (intrathecal) injection, sublingual administration, buccal administration, intrarectal insertion, vaginal It can be administered by intraoral insertion, ocular administration, otic administration, nasal administration, inhalation, spraying through the mouth or nose, dermal administration, transdermal administration, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of drug as an active ingredient together with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex, weight and severity of the disease of the patient.
  • the present invention provides a method for suppressing lung cancer recurrence comprising the step of administering to a subject in need of a composition containing an expression or activity inhibitor of RGS2 (regulator of G protein signaling 2) as an active ingredient.
  • RGS2 regulatory of G protein signaling 2
  • the present invention provides a use of suppressing lung cancer recurrence of a composition comprising an expression or activity inhibitor of RGS2 (regulator of G protein signaling 2) as an active ingredient.
  • RGS2 regulatory of G protein signaling 2
  • the present invention provides a use of a regulator of G protein signaling 2 (RGS2) expression or activity inhibitor for preparing a drug for suppressing lung cancer recurrence.
  • RGS2 G protein signaling 2
  • the present invention provides a method for suppressing lung cancer recurrence comprising administering a composition containing ebodiamine or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a use of a composition containing ebodiamine or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient for suppressing lung cancer recurrence.
  • the present invention provides a use of ebodiamine or a pharmaceutically acceptable salt thereof for preparing a drug for inhibiting lung cancer recurrence.
  • “individual” means a subject in need of treatment of a disease, and more specifically, a human or non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse, cow, etc. of mammals.
  • administration means providing a given composition of the present invention to a subject by any suitable method.
  • LLC mouse lung carcinoma
  • Human NSCLC lines H460, H1299, SK-MES-1, H226B, and H1792 cell lines were treated with anticancer drugs paclitaxe (Pc), cisplatin (Cs), and pemetrexed (Pm) for 3-4 months. It was prepared by continuous exposure.
  • paclitaxe Pc
  • Cs cisplatin
  • Pm pemetrexed
  • phospho-histone H3 (S10), cleaved caspase-3 (Cl-cas3), p21, LC3B, phospho-ERK (T202/Y204), ERK, phospho-eIF2 ⁇ (S51), PERK, ATF4, phospho-p70S6 kinase (T389 ), phospho-Akt (S473), Akt, phospho-4E-BP1 (S65), 4E-BP1, phospho-mTOR (S2448), and antibodies against mTOR were purchased from Cell Signaling Technology.
  • Antibodies against RGS2, Cyclin D1, CDK4, p27, Actin, eIF2 ⁇ , GADD34, CHOP/GADD153, ubiquitin, phospho-p38 (Y182), p38, OctA-probe, and His-probe were purchased from Santa Cruz Biotechnology.
  • Antibodies against Ki67, and PCNA were purchased from Abcam.
  • Rabbit polyclonal anti-phospho-PERK (S713) antibody and CFSE cell division tracker kit were purchased from BioLegend.
  • Rabbit polyclonal anti-RGS2 and anti-ATF4 antibodies were purchased from Proteintech.
  • Mouse monoclonal anti-cleaved PARP antibody was purchased from BD Biosciences.
  • HRP-linked secondary antibodies were purchased from GeneTex.
  • Paclitaxel, sildenafil citrate, and tadalafil were purchased from Selleck Chemicals. Pemetrexed was purchased from LC Laboratories. Rapamycin was purchased from Tocris Bioscience. Cycloheximide was purchased from Merck Millipore. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) was purchased from MP Biomedicals. db-cGMP was purchased from Cayman Chemical. Cisplatin, etoposide, NAC, MG132, thapsigargin, and other chemicals including crystal violet, and PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit were purchased from MilliporeSigma.
  • lung cancer cells collected from lung cancer patient-derived xenograft tumor (PDX) tumors tumors with a volume of about 500 mm 3 were separated from NOD/SCID mice and cut into small pieces using surgical scissors. cut into.
  • Single cell suspensions of lung cancer cells harvested from PDX tumors were generated using the human Tumor Dissociation Kit (Miltenyi Biotec) according to the manufacturer's instructions. The isolated cells were used immediately or cultured in RPMI 1640 medium containing 10% FBS and antibiotics for further experiments.
  • Human NSCLC lines H460, H1299, SK-MES-1, H226B, H1792 cell lines or primary cultured lung cancer cells obtained from PDX tumors (1 ⁇ 10 6 to 2 ⁇ 10 6 cells, respectively) were cultured at 37°C for 20 minutes. while labeled with 25 ⁇ M CFSE. Staining was stopped by adding a culture medium, centrifugation was performed to remove excess CSFE, and the cells were seeded in a culture plate and cultured for 7 days.
  • FFPE tumor tissue (thickness: 4 ⁇ m) or NSCLC TMA (US Biomax, Inc.) containing 40 tumor samples were deparaffinized and rehydrated, followed by antigen retrieval (citrate buffer, pH 6.0). conducted. All samples (fixed cells or antigen retrieval FFPE tissue and TMA) were permeabilized with 0.2% Triton X-100 at room temperature and then incubated in blocking buffer (5% normal serum in TBS containing 0.025% Triton X-100 [TBSTx] for one hour at room temperature). ) and incubated with.
  • blocking buffer 5% normal serum in TBS containing 0.025% Triton X-100 [TBSTx] for one hour at room temperature.
  • Samples were incubated with anti-Ki67 (1:1000), anti-RGS2 (1:200), or anti-phospho-histone H3 (1:500) antibodies as primary antibodies, then diluted in TBSTx containing 1% BSA. . After washing three times with TBSTx, they were incubated with a secondary antibody conjugated with a fluorescent (Alexa Fluor 488 or Alexa Fluor 594) diluted (1:500) in TBSTx containing 1% BSA. Nuclei were counterstained with DAPI (50 ng/mL) and mounted on coverslips with a mounting solution (Dako, Agilent). Fluorescence was observed with a confocal microscope.
  • RNA sequencing libraries were constructed using the SENSE mRNA-Seq Library Prep Kit according to the manufacturer's recommendations.
  • High-capacity sequencing was performed using a HiSeq 2000 system (Illumina) with 100 bp read.
  • RNA sequencing reads were mapped using TopHat software to obtain an alignment file. Alignment files were used to assemble transcripts using Cufflinks, estimate abundance, and detect differential expression of genes/subtypes.
  • Library preparation and RNA sequencing were performed by Ebiogen, Inc's next-generation sequencing (NGS).
  • NGS next-generation sequencing
  • Hierarchical clustering and heatmap generation of RNA sequencing data was performed using MultiExperiment Viewer software (version 4.8.1, J. Craig Venter Institute). All sequencing data supporting the findings of the study were deposited in NCBI's Gene Expression Omnibus (GEO, GSE141218).
  • GO term enrichment analysis of RNA sequencing data was performed using the GO Enrichment Analysis tool available online (http://geneontology.org/).
  • genes differentially regulated in the CFSE high population were identified as cell cycle (GO:0007049), cell population growth regulation (GO:0042127), and cell cycle regulation (GO). :0051726) and gene products associated with one of the GO terms.
  • Direct annotations of Homo sapiens to the GO terms described above were verified using AmiGO 2 (http://amigo.geneontology.org). Venn diagrams were drawn using a freely available web-based tool (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/).
  • mice All animal experiments were performed according to protocols approved by the Seoul National University Animal Experimentation Ethics Committee (IACUC). Mice were bred in a facility where normal diet and water were supplied ad libitum and temperature and humidity were controlled with a 12-hour light/12-hour light-off cycle.
  • IACUC Animal Experimentation Ethics Committee
  • tumor tissues passaged less than 5 times in mice were cut into 2 mm 3 pieces and injected subcutaneously into 6-8 week old female NOD/SCID mice.
  • mice When the volume of the tumor reaches 50-100 mm 3 , the mice are randomly grouped and divided into a control group (vehicle) and a drug-treated group, and the anticancer drug paclitaxel is dissolved in a mixture of Cremophor EL and ethanol (1:1, v/v), and then dissolved in PBS. (final 1:1:18, v/v/v), 20 mg/kg was intraperitoneally administered to mice once a week after further dilution, and anticancer drugs cisplatin and pemetrexed were 0.9% (w/v) NaCl solution was diluted and intraperitoneally administered once a week at doses of 3 mg/kg and 50 mg/kg, respectively.
  • Sildenafil citrate, a PDE5 inhibitor was dissolved in a 0.9% (w/v) NaCl solution and orally administered at a dose of 10 mg/kg 5 times a week.
  • Tumor growth was determined by measuring the short rectal/major diameter of the tumor with a caliper, and body weight was measured twice weekly to assess toxicity.
  • the tumor volume (mm 3 ) was obtained by the formula of (short diameter) 2 ⁇ (long diameter) ⁇ 0.5.
  • Cells were cultured for 1 hour in methionine-free RPMI medium (Welgene) and then pulse-labeled with 0.2 mCi L-[35S] methionine (PerkinElmer) for the indicated period.
  • An equal amount of 1 mg of protein from whole cell lysates was immunoprecipitated with an anti-ATF4 antibody (diluted 1:1000) followed by SDS-PAGE. After drying the gel using a Model 583 gel dryer (Bio-Rad Laboratories), automatic radiography was performed.
  • Cells were treated with various protease and phosphatase inhibitors (100 mM NaF, 5 mM Na 3 VO 4 , 1 mM PMSF, 1 ⁇ g/mL aprotinin, 1 ⁇ g/mL leupeptin, and It was dissolved in lysis buffer (40 mM Tris-HCl [pH 7.4], 120 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 2 mM EDTA, 1 mM MgCl 2 ) containing 1 ⁇ g/mL pepstatin.
  • lysis buffer 40 mM Tris-HCl [pH 7.4], 120 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 2 mM EDTA, 1 mM MgCl 2
  • Amount (500-1000 ⁇ g) of cell lysate was immunoprecipitated with anti-ATF4, anti-RGS2 or anti-FLAG antibody (1 ⁇ g), followed by protein A/G agarose beads for 2 hours at 4°C.
  • the beads were washed 5 times with lysis buffer or PBS, and the immunoprecipitated proteins were eluted with 2 sample buffers and boiled for 5 minutes at 95 ° C. The eluate was separated by 8% SDS-PAGE and immunoblotted. Lotting was further analyzed.
  • siRNA formulations for in vivo delivery using in vivo-jetPEI were prepared according to the manufacturer's instructions. 5 ⁇ g of siRNA diluted in sterile 5% glucose solution was complexed with in vivo-jetPEI at a rate of 0.12 ⁇ L in vivo-jetPEI per 1 ⁇ g siRNA. Formulated siRNA was administered intratumorally twice weekly.
  • Immunohistochemical analysis was performed using antibodies against cleaved caspase-3, RGS2, or ATF4. Sections of FFPE tissue specimens were deparaffinized, rehydrated, and subjected to antigen retrieval using a citrate-based antigen unmasking solution (Vector Laboratories). After treatment with 0.3% hydrogen peroxide solution, the slides were incubated with blocking buffer (5% normal serum in TBSTx) for 1 hour at room temperature. Slides were first incubated overnight at 4°C with primary antibody diluted (1:200) in TBSTx containing 1% BSA, washed three times in TBSTx, and then biotinylated (1:500) diluted in TBSTx containing 1% BSA.
  • blocking buffer 5% normal serum in TBSTx
  • each of the CFSE-labeled cells belonging to the upper (> 90%), middle, or lower ( ⁇ 10%) range was analyzed by flow cytometry, CFSE high (hi) population, CFSE middle (mid ) group, and CFSE low (lo) group.
  • the cells of the CFSE hi population had a significantly lower proliferation rate, Ki67 proliferation index (PI) as a G 0 exist marker, mitotic index, and colonies. - Formation ability, and drug sensitivity were exhibited.
  • Ki67 proliferation index PI
  • CFSE hi SCCs derived from two other PDX tumors also showed significantly lower Ki67 PI, mitotic index, colonies compared to the corresponding CFSE lo or CFSE mid populations. -Exhibited formation ability and drug sensitivity.
  • FIG. 4 tumors developed in mice in both the CFSE hi and CFSE lo groups, but tumor development was delayed in the CFSE hi group compared to the CFSE lo group.
  • RNA-Seq analysis as shown in FIG. 5, 319 genes were consistently up-regulated or down-regulated in the 5 CFSE hi populations compared to the CFSE lo population corresponding to the CFSE hi population (
  • gene ontology (GO) analysis of upregulated genes showed that various genes, including genes involved in negative regulation of response to stimuli or regulation of cell proliferation, were significantly indicated an abundance of In contrast, genes that were generally downregulated did not show such a correlation.
  • RGS2 expression As shown in FIG. 11, as a result of evaluating the correlation between RGS2 expression and genes related to cell proliferation regulation, expression of genes involved in promoting cell proliferation, including MKI67 (encoding Ki67), PCNA, and CDK2, and RGS2 It was confirmed that a significant inverse correlation between the expression of In addition, RGS2 expression correlated positively with the expression of genes encoding cyclin-dependent kinase inhibitors such as CDKN1A and CDKN1B. As shown in FIG.
  • GSEA gene set enrichment analysis
  • RGS2 hi SCCs we sought to establish RGS2 hi SCCs. Since there is no technology to reliably identify functionally defined RGS2hi SCCs, we applied the use of chemotherapeutic drugs targeting ACCs (actively cycling cancer cells, lung cancer cells). Specifically, as shown in FIG. 14, a panel of human NSCLC cell lines (H460, H1299, SK-MES-1, H226B, and H1792) were treated with paclitaxel (Pc), cisplatin (Cs), a chemotherapy drug commonly used in clinical practice. ), or in the presence of pemetrexed (Pm).
  • Pc paclitaxel
  • Cs cisplatin
  • Pm pemetrexed
  • Figs. 15a to 15c One subpopulation exhibited high drug resistance as shown by minimal changes in viability, colony-forming ability, and apoptotic activity in the presence of chemotherapeutic drugs.
  • the subpopulation that survived could be divided into two groups. As shown in FIG. 16 , the first group (H226B/PcR, H460/PmR and H1792/PmR) showed similar proliferation rates and RGS2 expression as the respective parental cells. In contrast, as shown in FIGS.
  • the second group (H460/PcR, H1299/CsR, H1299/PmR, and SK-MES-1/PcR [SK/PcR]) showed apoptotic cell death. ) or no detectable signs of autophagy, significantly reduced proliferation and colony-forming ability compared to parental cells, and transcriptional upregulation of RGS2, so further analysis was performed using the second group.
  • the chemotherapy-resistant subpopulation and the corresponding parental cells are labeled with CSFE and then the excess time of maintaining the label during culture is monitored. As shown in FIG. 19 , The therapy-resistant subpopulation showed significantly more marker retention than the corresponding parental cells for up to 10 days. As shown in FIG. 20 , this subpopulation has no detectable senescence-related changes including morphological alterations (i.e., cell flattening and vacuolization) or senescence-associated ⁇ -galactosidase (SA- ⁇ -gal) activation.
  • morphological alterations i.e., cell flattening and vacuolization
  • SA- ⁇ -gal senescence-associated ⁇ -galactosidase
  • H460/PcR, H1299/CsR, and H1299/PmR cells developed tumors with significantly delayed tumor onset compared to the parental cells. Once the tumors developed, they exhibited steeply increased growth rates and drug resistance. Thus, this subpopulation appears to remain in a slow-cycling state until a permissive in vivo microenvironment supports recurrent tumor growth. From the above results, it can be seen that the H460/PcR, H1299/CsR, H1299/PmR, and SK/PcR subpopulations represent groups of functional SCCs in NSCLC.
  • H460/PcR, H1299/CsR, and H1299/PmR subpopulations were used as preclinical models to analyze the biology of RGS2 hi SCCs below. performed.
  • H460/PcR cells and RGS2 suppressed RGS2 expression by stable transfection with shRNA (H460/PcR-shRGS2) targeting a different region of RGS2 mRNA. Forced overexpression of H460 cells (H460-RGS2) was used. As shown in Figure 23, compared to control cells (H460/PcR-shEV), two other H460/PcR-shRGS2 cells showed significant increases in proliferation, Ki67 PI, and colony-forming ability. Moreover, as shown in FIG.
  • H460/PcR-shRGS2 showed an increase in expression levels of cyclin D1, CDK4 and PCNA compared to H460/PcR-shEV cells. Conversely, H460-RGS2 cells showed a decrease in the expression level of these proteins compared to control cells (H460-EV). In addition, compared to H460/PcR-shEV cells, H460/PcR-shRGS2 cells showed an increase in OCR/ECAR, CAP-dependent and CAP-independent protein translation, and new protein synthesis, whereas all these activities were compared with H460-EV It was decreased in H460-RGS2 cells compared to cells. From the above results, it can be seen that RGS2 expression confers a quiescent-like phenotype to SCCs.
  • SCCs showed minimal changes in caspase-3 and PARP cleavage under ER-stress factor thapsigargin (TG) and hypoxia, as shown by low numbers of sub - G1 phase cells. Likewise, it showed the ability to evade ER-stress induced apoptosis.
  • TG ER-stress factor thapsigargin
  • H460-RGS2 cells compared to H460-EV cells, H460-RGS2 cells exhibited significantly increased viability to TG, hypoxia, and paclitaxel (Pc).
  • FIG. 27 compared to H460/PcR-shEV cells, H460/PcR-shRGS2 cells exhibited dramatically reduced viability to TG and paclitaxel (Pc)-induced stress.
  • proliferation, Ki67 PI, anchorage-dependent and anchorage-independent colony-forming ability, and protein translation were significantly decreased in two different H460/PcR cells in which RGS2 expression was suppressed with the CRISPR/Cas9 system. increased, but apoptosis occurred in response to TG or paclitaxel treatment.
  • H460/PcR-shRGS2 when mice were injected with H460/PcR-shRGS2 or H460/PcR-shEV, H460/PcR-shRGS2 cells exhibited significantly delayed tumor development compared to H460/PcR-shEV cells. Specifically, on day 29 after injection, tumors developed in all mice injected with H460/PcR-shEV cells, but only one mouse injected with H460/PcR-shRGS2 cells developed a tumor. It was confirmed that tumors were formed on the 37th day after injection in all mice transplanted with H460/PcR-EV or H460/PcR-shRGS2 xenografts.
  • H460/PcR-shRGS2 tumors were significantly smaller in volume than H460/PcR tumors.
  • H460/PcR-shRGS2 xenografted tumors exhibited significantly delayed growth compared to tumors injected with H460/PcR cells transfected with scrambled shRNA.
  • RGS2 has been shown to confer viability to SCCs in an in vivo microenvironment characterized by various ER-stresses such as hypoxia and glucose deprivation. From the above results, it can be seen that RGS2 expression can allow the viability of SCCs against ER-stress induced apoptosis.
  • RGS2 expression allows SCCs to have the ability of cancer stem cells (CSCs) to exhibit self-renewal and tumor-initiating potential, and drug predicted to induce resistance.
  • CSC-related functional characteristics including expression of CSC-related markers and epithelial-mesenchymal transition-related markers, sphere-forming ability, and aldehyde dehydrogenase positivity were not observed in the parental cells. was minimally altered in established RGS2 hi SCCs compared to .
  • ATF6, ERN1, and target gene signatures of ATF6 and IRE1 ⁇ branch correspond Compared to parental cells, it was confirmed that it was almost consistently up-regulated in the three SCCs. From the above results, it was found that the ATF6 and IRE1 ⁇ branches of the UPR are activated in SCCs to ensure protein folding homeostasis (proteostasis) in an ER-stressed environment. As shown in FIG. 33 , SCCs showed higher levels of phospho-eIF2 ⁇ (peIF2 ⁇ ) with downregulation of ATF4 and ATF4 target genes including DDIT3 and PPT1R15A compared to the corresponding parental cells.
  • peIF2 ⁇ protein folding homeostasis
  • ER stress induces PERK and eIF2 ⁇ phosphorylation, which preferentially leads to translation of ATF4, and as shown in FIG. 34 , SCCs and their respective blast cells showed PERK phosphorylation upon exposure to TG. However, unlike their parental counterparts, SCCs showed minimal changes in phosphorylation of eIF2 ⁇ and protein levels of ATF4, CHOP, and GADD34 in response to ER stressors. Consistently, as shown in FIG. 35 , exposure to chemotherapeutic drugs induced minimal effects on ATF4 target gene expression, eIF2 ⁇ phosphorylation, and ATF4 levels in three SCCs. Thus, the upstream PERK branch appeared to be isolated from the downstream target gene. Based on the role of ATF4 in the restoration of protein synthesis after transient inhibition and/or induction of apoptosis under ER stress, it can be seen that regulatory mechanisms for ATF4 expression allow SCCs to maintain survival in the ER stress environment.
  • ATF4-mediated mRNA translation has been shown to induce anti-apoptotic or apoptotic activity in stressed cells depending on the expression level. Indeed, as shown in Figure 36, induced ATF4 expression caused a dose-dependent increase in mRNA translation in H460/PcR cells. Furthermore, restoring ATF4 expression to moderate levels promoted proliferation of H460/PcR cells. In contrast, as shown in FIG. 37 , translational overload through forced ATF4 overexpression resulted in an increase in cleaved caspase-3 and PARP, and decreased cell proliferation through apoptosis. In addition, as shown in FIG.
  • ATF4-induced apoptosis was significantly attenuated in response to mTOR inhibitor (rapamycin) or ROS scavenger [N-acetyl-L-cysteine (NAC)] treatment. From the above results, it can be seen that the sustained decrease in protein synthesis caused by the downregulation of ATF4 conferred cell dormancy and viability to SCCs during exposure to ER stressors.
  • mTOR inhibitor rapamycin
  • ROS scavenger N-acetyl-L-cysteine
  • H460/PcR-shRGS2 cells showed increased levels of ATF4 protein and ATF4 target gene expression with reduced levels of eIF2 ⁇ phosphorylation compared to H460/PcR cells. These differences in H460-RGS2 cells compared to H460 cells were opposite to those observed in H460/PcR-shRGS2 cells compared to H460/PcR cells. From the above results, the role of RGS2 in ATF4 expression was clearly identified.
  • MG132 pretreatment increased the level of polyubiquitinated forms of ATF4 in H460/PcR cells and RGS2-transfected H460 cells compared to control cells.
  • shRNA-mediated depletion of RGS2 inhibited ATF4 polyubiquitination in H460/PcR cells.
  • Coimmunoprecipitation assay using H460/PcR cells in which the proteasome machinery was inactivated by MG132 treatment (10 ⁇ M for 4 hours) showed an association between ATF4 and RGS2.
  • FIG. 45 the association between RGS2 and ATF4 was confirmed in H460 cells in which RGS2 expression was enhanced by transfection before MG132 treatment.
  • Comparison with input lanes representing proteins not subjected to co-immunoprecipitation analysis showed that MG132 proteasome inhibitor treatment restored ATF4 expression in RGS2-transfected H460 cells.
  • full-length (FL) RGS2 and parts of the carboxyl terminus ( ⁇ C79 and ⁇ C169) or RGS2 ( ⁇ N79) were analyzed as shown in FIG. 46 .
  • a bacterial expression vector was created carrying three deletion mutants in which residues upstream of were deleted. Pulldown assays using bacterial proteins showed that both total RGS2 and 2 RGS2 mutations ( ⁇ C79 and ⁇ C169) were associated with ATF4 in H460 cell lysates.
  • a truncation mutation ( ⁇ N79) with no residue upstream of RGS2 failed to bind to ATF4.
  • RGS2 hi /ATF4 lo drug-resistant SCCs were present in human primary NSCLC tumors and were selected during chemotherapy was evaluated. Due to technical difficulties in sampling residual human lung tumor tissue, RGS2 hi /ATF4 lo populations were monitored in three different NSCLC PDX tumors before and after chemotherapy. Consistent with the results of the NSCLC TMA analysis in FIG. 13, as shown in FIG. 51, an inverse correlation between RGS2 and Ki67 expression was shown in the PDX model. During three cycles of clinically relevant combination chemotherapy, PDX tumors shrank to less than 50% of their original volume within 22 days.
  • ATF4+ cells were detectable in drug-naive tumors at baseline by IHC analysis, their number decreased during chemotherapy (average 2.5-fold). Conversely, a time-dependent increase (average of 5-fold) of RGS2+ cells could be observed in residual tumors compared to baseline tumors during chemotherapy. The results indicate that a distinct RGS2hi / ATF4lo subpopulation within residual tumor lesions is selected during chemotherapy.
  • PDE5 inhibitors that can activate protein synthesis in skeletal muscle. Indeed, as shown in Figure 57, PDE5 inhibitors induced a dose-dependent increase in protein synthesis in SCCs and quiescent properties (e.g., upregulated p38 phosphorylation, increased p21 and p27 expression, ERK phosphorylation and cyclin D1 expression). decrease) was inhibited. In particular, as shown in FIG.
  • sildenafil together with chemotherapy was confirmed in vivo. Since the in vitro treatment results of sildenafil and tadalafil were similar, only sildenafil was used in the in vivo experiment. To confirm the effect of the combination treatment on the growth of SCCs in vivo, the mice were treated with the drug within 1 week of NSCLC cell injection. As shown in Figure 61, compared to single treatment, combined treatment with sildenafil and chemotherapy significantly inhibited the outgrowth of H460/PcR and H1299/CsR xenograft tumors and PDX tumors.
  • H460/PcR and H1299/CsR were treated with 5 ⁇ M evodiamine for 2 days, followed by cycloheximide (CHX), which inhibits protein synthesis.
  • CHX cycloheximide
  • the present inventors have confirmed that RGS2 is significantly increased and ATF4 is decreased in low-growth cancer cells that cause lung cancer recurrence, and the possibility of lung cancer recurrence can be predicted easily and quickly by measuring the expression or activity levels of RGS2 and ATF4. It is expected that there will be In addition, the present inventors confirmed that the growth of low-growth cancer cells can be inhibited and apoptosis can be induced by suppressing the expression of RGS2 or blocking the protein synthesis inhibitory action of RGS2. It is expected that it can be usefully used in the development of medicines for therapeutic agents, and thus has industrial applicability.

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Abstract

본 발명은 폐암 재발 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법, 폐암 재발을 억제하는 약학적 조성물 등에 관한 것으로, 본 발명자들은 폐암 재발의 원인이 되는 저성장 암세포에서 유의적으로 RGS2가 증가되어 있고 ATF4가 감소되어 있는 것을 확인하였는바, RGS2 및 ATF4의 발현 또는 활성 수준을 측정함으로써 쉽고 빠르게 폐암 재발의 가능성을 예측할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명자들은 RGS2의 발현을 소실시키거나 RGS2의 단백질 합성 저해 작용을 차단함으로써 저성장 암세포의 성장을 억제하고 세포자멸사를 유도할 수 있음을 확인하였는바, RGS2 발현 또는 활성을 억제하는 폐암 재발 억제용 치료제의 의약품 개발 용도로도 다양하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

폐암 재발 예측방법 및 재발 억제용 약학적 조성물
본 발명은 폐암 재발 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법, 폐암 재발을 억제하는 약학적 조성물 등에 관한 것이다.
본 발명은 2021년 5월 21일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2021-0065541호 및 2021년 12월 30일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2021-0192024호에 기초한 우선권을 주장하며, 상기 출원들의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
암은 매년 전 세계적으로 1,000만 명의 새로운 환자가 발생하고 있는 주요 질병 중에 하나로, 우리나라의 경우 암으로 인한 사망률은 1위로 전체 사망자의 약 27.5%를 차지하고 있으며, 이러한 경향성은 계속될 것으로 전망된다.
암의 치료는 1960년대 수술에 의한 치료를 시작으로 1970년대 방사선 치료 기술을 거쳐 1980년대부터 화학치료요법이 중요한 치료법으로 사용되고 있으나, 이러한 치료법들은 독성, 부작용뿐만 아니라 내성으로 인한 치료 효과 저하 및 재발이 나타나고 있어 이를 극복할 수 있는 방안에 대한 개발 요구가 커지고 있다.
암의 재발은 불량한 예후를 초래하는 주요 원인으로, 항암 치료 후 진단 불가능한 수준으로 잔존하는 암세포가 수개월 내지 수년간 잠복하고 있다가 재발암을 생성하는 것으로 추측되고 있다.
한편, 암세포와 종양 미세환경 내 다양한 세포들과의 상호작용이 암 발생 및 악성화 과정에서 가지는 다양한 역할들이 보고되어 왔으나, 잠복기에 있는 잔존암(residual tumor)의 유지 기전, 잔존암과 종양미세환경(tumor microenvrionment)의 상호작용과 그로 인한 암 재발을 설명할 수 있는 기전에 대해서는 연구가 미흡한 실정이다.
따라서, 암 재발을 극복하기 위하여 잔존 암세포의 유지 및 재발암 발생 기전 연구를 통하여 이를 예측하고 억제할 수 있는 예측 및 치료 전략의 개발이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 폐암 재발을 예측하고 이를 억제할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 연구한 결과, 폐암 재발의 원인이 되는 저성장 암세포와 RGS2 및 ATF4의 발현이 밀접한 관련이 있음을 확인하고, RGS2 발현을 억제하거나 RGS2의 단백질 합성 저해 작용을 차단함으로써 저성장 암세포의 증식을 억제할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 RGS2(regulator of G protein signaling 2) 및 ATF4(Activating Transcription Factor 4) 단백질; 또는 이들의 mRNA의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 폐암 재발 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 폐암 재발 예측용 조성물을 포함하는, 폐암 재발 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 RGS2(regulator of G protein signaling 2) 및 ATF4(Activating Transcription Factor 4) 단백질; 또는 이들의 mRNA의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 폐암 재발 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 RGS2(regulator of G protein signaling 2)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 폐암 재발 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 에보디아민(Evodiamine; Evo) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 폐암 재발 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 RGS2(regulator of G protein signaling 2) 및 ATF4(Activating Transcription Factor 4) 단백질; 또는 이들의 mRNA의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 폐암 재발 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 페암은 비소세포폐암(non-small cell lung cancer; NSCLC)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폐암 재발 예측용 조성물을 포함하는 폐암 재발 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 RGS2(regulator of G protein signaling 2) 및 ATF4(Activating Transcription Factor 4) 단백질; 또는 이들의 mRNA의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 폐암 재발 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 피검체는 폐암 완치 환자 또는 폐암 치료 후 질병증거가 없는 환자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 소변, 타액, 조직, 세포, 기관, 골수, 중심부바늘생검(core needle biopsy) 검체, 및 진공흡입생검 검체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 방법은 폐암세포와 비교하여 RGS2 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 또는 활성 수준이 증가하고, ATF4 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 또는 활성 수준이 감소한 경우 폐암 재발의 위험성이 높은 것으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단백질 발현 수준은 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(Rocket immunoelectrophoresis), 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 질량분석법(Mass spectrometry), FACS, 및 단백질칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, mRNA 발현 수준은 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블롯팅(northern blotting), 서던 블롯팅(southern blotting), In situ 교잡법, 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 RGS2(regulator of G protein signaling 2)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 폐암 재발 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 에보디아민(Evodiamine; Evo) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 폐암 재발 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 발현 억제제는 에보디아민(Evodiamine; Evo) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; RGS2 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA, 및 이를 포함하는 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 에보디아민 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 RGS2 단백질의 안정성을 억제할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 활성 억제제는 PDE5 억제제(phosphodiesterase type 5 inhibitor), 및 RGS2 단백질과 특이적으로 결합하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 PDE5 억제제는 RGS2의 단백질 합성 저해 작용을 차단할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 PDE5 억제제는 실데나필(sildenafil; sild), 타다라필(tadalafil; tada), 바데나필(Vardenafil), 미로데나필(mirodenafil), 유데나필(Udenafil), 아바나필(Avanafil), 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 PDE5 억제제는 항암제와 병용 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel; Pc), 시스플라틴(cisplatin; Cs), 및 페메트렉시드(pemetrexed; Pm)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 RGS2(regulator of G protein signaling 2)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 폐암 재발 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 RGS2(regulator of G protein signaling 2)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 폐암 재발 억제 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 RGS2 (regulator of G protein signaling 2)의 발현 또는 활성 억제제의 폐암 재발 억제용 약제 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 에보디아민 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 폐암 재발 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 에보디아민 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물의 폐암 재발 억제 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 에보디아민 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 폐암 재발 억제용 약제 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명자들은 폐암 재발의 원인이 되는 저성장 암세포에서 유의적으로 RGS2가 증가되어 있고 ATF4가 감소되어 있는 것을 확인하였는바, RGS2 및 ATF4의 발현 또는 활성 수준을 측정함으로써 쉽고 빠르게 폐암 재발의 가능성을 예측할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명자들은 RGS2의 발현을 소실시키거나 RGS2의 단백질 합성 저해 작용을 차단함으로써 저성장 암세포의 성장을 억제하고 세포자멸사를 유도할 수 있음을 확인하였는바, RGS2 발현 또는 활성을 억제하는 폐암 재발 억제용 치료제의 의약품 개발 용도로도 다양하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 CFSEhigh 및 CFSElow을 분리하기 위한 실험방법을 개시하고 있는 도면이다 (PDX: patient-derived xenograft(폐암환자 유래 이종이식)).
도 2는 CFSEhigh(>90%), CFSEmiddle, 및 CFSElow(<10%) 집단을 분류하기 위한 유세포 분석의 게이팅 전략(gating strategy)을 나타낸 도면이다.
도 3a 내지 도 3c는 CFSEhigh 집단의 특징을 CFSEmiddle 및 CFSElow 집단과의 비교를 통해 확인한 것으로, 도 3a는 Ki67 양성(a), 세포 증식(b), 유사분열 지수(c), 및 콜로니(colony)-형성 능력(d)을 비교한 결과를 나타낸 도면이고, 도 3b는 약제 감수성(화학요법에 대한 내성)을 비교한 결과를 나타낸 도면이며(Pc: 파클리탁셀, 이하 동일), 도 3c는 PDX 종양을 추가하여 면역형광(immunofluorescence)을 실시한 결과(좌측, 스케일 바=50 μm) 및 추가된 PDX 종양(PDX2 및 PDX3) 유래 CFSEhigh 집단의 Ki67 양성, 유사분열 지수, 콜로니(colony)-형성 능력, 및 약제 감수성을 CFSEmiddle 및 CFSElow 집단과 비교한 결과를 나타낸 도면이다 (*P < 0.05, **P < 0.01, and ***P < 0.001, 이하 동일).
도 4는 CFSEhigh 또는 CFSElow 세포를 마우스에 주입한 후 종양 형성 지연 정도를 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 CFSEhigh 및 CFSElow에 대한 RNA-Seq 분석을 실시한 결과를 나타낸 것으로, CFSElow와 비교하여 CFSEhigh에서 차등적으로 발현되어 있는 유전자의 벤 다이어그램(좌측) 및 CFSElow와 비교하여 CFSEhigh에서 유전자 발현 프로파일의 계층적 클러스터링(hierarchical clustering)을 보여주는 히트맵(Heatmap, 우측)을 나타낸 도면이다.
도 6은 CFSEhigh 및 CFSElow에 대해 유전자 온톨로지(gene ontology; GO) 분석을 실시한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 CFSEhigh 집단에서 유의하게 변경된 319개의 유전자와 유전자 온톨로지 분석에서 세포 주기(GO: 0007049), 세포 증식 조절(GO: 0042127), 및 세포 주기 조절(GO: 0051726)에 해당하는 유전자 간에 중첩된 유전자를 나타낸 벤 다이어그램을 나타낸 도면이다.
도 8은 CFSEhigh 집단에서 RGS2 mRNA의 발현이 상향 조절되어 있는 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 CFSE 표지로 분류한 집단을 이용하여 실시한 실험 결과를 검증하기 위하여 PKH26 염색을 실시한 결과를 나타낸 것으로, PKH26low (~10%) 및 PKH26high (~10%) 집단을 분류하기 위한 게이팅 전략(a), PKH26low 집단과 PKH26high 집단의 세포 증식(b), Ki67 양성(좌측) 및 콜로니-형성 능력(우측)(c), 및 화학요법에 대한 내성(d), 및 RGS2 mRNA의 발현량을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 RGS2 발현이 높은 폐 선암종 환자(RGS2high)와 RGS2 발현이 낮은 폐 선암종 환자(RGS2low)의 생존율(좌측) 및 무병 생존율(우측)을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 RGS2의 발현과 세포 증식 관련 유전자(MKI67, PCNA, 및 CDK2) 및 사이클린-의존성 키나제 억제제를 인코딩하는 유전자(CDKN1A 및 CDKN1B)의 발현 간의 상관관계를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 RGS2 발현이 높은 집단에서 세포 증식, 산화 스트레스, 저산소증, 비-접힘 단백질 반응(UPR) 관련 유전자 세트에 대해 유전자 세트 증폭 분석(GSEA)을 실시한 결과를 나타낸 도면이다 (NES: normalized enrichment score).
도 13은 비소세포폐암(NSCLC) TMA(tissue microarray)에 대해 면역형광 분석을 실시하여 RGS2와 Ki67 발현의 상관관계를 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (스케일 바=100 μm 및 스케일바=50 μm(실선)).
도 14는 저성장 암세포(SCCs)를 확립하기 위한 실험방법을 나타낸 도면이다 (ACC: actively cycling cancer cell, SCC: slow-cycling/dormant cancer cell, 이하 동일).
도 15a 내지 도 15c는 인간 NSCLC 세포주를 이용하여 제작한 약제 내성 하위 집단의 특징을 확인한 것으로, 도 15a는 화학요법 약물의 존재 하에 세포 생존력을 나타낸 도면이고, 도 15b는 화학요법 약물 존재 하에 콜로니-형성 능력을 나타낸 도면이고, 도 15c는 화학요법 약물 존재 하에 세포 사멸의 활성을 나타낸 도면이다 (PcR: 파클리탁셀 내성, CsR: 시스플라틴 내성, PmR: 페메트렉시드 내성).
도 16은 제작한 약제 내성 하위 집단 중 비-저성장 암세포에 해당하는 그룹의 세포 증식(a), RGS2 mRNA 발현(b), 및 RGS2 단백질 발현(c)을 모세포와 비교한 결과를 나타낸 도면이다 (P: 모세포).
도 17은 제작한 약제 내성 하위 집단 중 저성장 암세포에 해당하는 그룹의 세포자멸사(상단) 및 자가포식(LC3B: 자가포식 마커, 하단)을 모세포와 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 18은 제작한 약제 내성 하위 집단 중 저성장 암세포에 해당하는 그룹의 세포 증식(a), 콜로니-형성 능력(b), 및 RGS2 발현(c)을 모세포와 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 19는 10일 동안 저성장 암세포의 CFSE 표지의 세포 수준 변화를 유세포 분석으로 모니터링한 결과를 모세포와 비교하여 나타낸 도면이다 (MFI: 평균 형광 강도).
도 20은 저성장 암세포의 Ki67 PI(좌측), 세포 증식, 정지(quiescence), 및 세포 주기 억류(cell cycle arrest)와 관련된 마커의 발현(우측)을 모세포와 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 21은 저성장 암세포의 에너지 대사(OCR/ECAR)(a), CAP-의존성/비의존성 단백질 번역(b), 및 초기 단백질 합성(c, 스케일 바= 200 μm)을 모세포와 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 22는 저성장 암세포 또는 모세포를 마우스에 이종이식하여 종양 형성 능력을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 23은 RGS2 발현을 억제한 저성장 암세포의 anchorage-의존성/비의존성 콜로니 형성 능력(a), 세포 증식(b), 및 Ki67 PI(c)를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 24는 RGS2 발현을 억제한 저성장 암세포 및 RGS2가 과발현된 모세포의 세포 증식 관련 마커의 발현(a), 에너지 대사(OCR/ECAR)(b), CAP-의존성/비의존성 단백질 번역(c), 초기 단백질 합성(d)을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 25는 ER-스트레스(탑시가르긴(TG) 및 저산소) 하에 저성장 암세포에서의 절단된 caspase-3 및 PARP 대해 웨스턴 블롯을 실시한 결과(상단) 및 하위 G1기 세포의 축적을 유세포 분석으로 확인한 결과(하단)를 나타낸 도면이다 (Cl-PARP: 절단된 PARP, Cl-Cas3: 절단된 caspase-3, 이하 동일).
도 26은 ER-스트레스(TG 및 저산소) 및 화학요법(Pc) 하에 RGS2가 강제 과발현된 모세포의 절단된 caspase-3 및 PARP에 대해 웨스턴 블롯을 실시한 결과(상단) 및 하위 G1기 세포의 축적을 유세포 분석으로 확인한 결과(하단)를 나타낸 도면이다.
도 27은 ER-스트레스(TG) 및 화학요법(Pc) 하에 RGS2 발현이 억제된 저성장 암세포의 절단된 caspase-3 및 PARP에 대해 웨스턴 블롯을 실시한 결과(상단) 및 하위 G1기 세포의 축적을 유세포 분석으로 확인한 결과(하단)를 나타낸 도면이다.
도 28은 CRISPR/Cas9 시스템으로 RGS2 발현을 억제한 저성장 암세포의 RGS2 발현(a), 세포 증식(b), Ki67 PI(c), anchorage-의존/비의존 콜로니-형성 능력(d), 단백질 번역(e), 및 ER-스트레스(TG) 및 화학요법(Pc)에 대한 반응(f)을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 29는 저성장 암세포 또는 RGS2 발현을 억제한 저성장 암세포를 마우스에 주입하여 종양 형성 능력을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 30은 저성장 암세포 또는 RGS2 발현을 억제한 저성장 암세포를 마우스에 주입한 후 39일차에 형성된 종양의 부피를 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 31은 스크램블(scramble)된 shRNA로 형질감염된 저성장 암세포 또는 RGS2 발현을 억제한 저성장 암세포를 마우스에 주입한 후 27일차에 형성된 종양의 부피를 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 32는 저성장 암세포에서 UPR의 PERK, ATF6, 및 IRE1α branch와 관련된 유전자의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 33은 저성장 암세포에서 ATF4의 발현 및 eIF2α의 인산화를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 34는 ER-스트레스(TG) 하에서 저성장 암세포의 PERK 및 eIF2α 인산화, ATF4, CHOP, 및 GADD34 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 35는 화학요법 약물 노출 하에서 저성장 암세포의 ATF4 표적 유전자 (DDIT3 및 PPP1R15A)발현(상단), 및 PERK 및 eIF2α 인산화, ATF4, CHOP, 및 GADD34 발현(하단)을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 36은 저성장 암세포에서 ATF4 발현에 따른 mRNA 번역(a) 및 단백질 합성 수준(b) 변화를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 37은 저성장 암세포에서 ATF4 발현에 따른 세포 증식(a) 및 절단된 caspase-3 및 PARP의 발현(b)을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 38은 ATF4가 과발현된 저성장 암세포의 mTOR 억제제(Rap, a) 및 ROS 제거제(NAC, b)처리에 대한 반응을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (Rap: rapamycin, NAC: N-acetyl-L-cysteine).
도 39는 RGS2 발현을 억제한 저성장 암세포(a) 및 RGS2가 과발현된 모세포(b)에서 eIF2α 인산화 및 ATF4 단백질 발현(상단) 및 ATF4 표적 유전자(DDIT3 및 PPP1R15A)의 발현(하단)을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 40은 저성장 암세포와 모세포 사이, RGS2 발현을 억제한 저성장 암세포와 저성장 암세포 사이, 및 RGS2가 과발현된 모세포 및 모세포 사이에서 ATF4 mRNA의 발현을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 41은 RGS2가 과발현된 모세포에서 ATF4 단백질 초기 합성 속도를 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 42는 RGS2가 과발현된 모세포에서 ATF4 단백질의 반감기를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 43은 화학요법 내성 모세포(좌측), RGS2가 과발현된 모세포(중간), 및 RGS2 발현을 억제한 저성장 암세포(우측)에서 ATF4의 유비퀴틴화(ubiquitination)를 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 44는 MG132 처리한 저성장 암세포에서 공동면역침전 분석(Coimmunoprecipitation assay)을 실시하여 ATF4와 RGS2 사이의 연관성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 45는 ATF4와 RGS2 사이의 상호작용을 MG132 처리/비처리된 모세포에서 공동면역침전 분석(Coimmunoprecipitation assay)을 실시하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 46은 전체(full-length) RGS2 단백질 및 RGS2 단백질 도메인 별로 제작한 돌연변이 재조합 RGS2 단백질을 나타낸 도면이다 (FL: full-length).
도 47은 ATF4와 전체 또는 돌연변이 RGS2 단백질 간의 상호 작용을 풀다운 분석(pulldown assay)으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 48은 전체 또는 돌연변이 RGS2 단백질의 과발현에 의한 단백질 번역의 조절을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 49는 폐암세포를 이종이식한 마우스(a 내지 d) 및 폐암세포를 동종이식한 마우스(e 내지 h)를 이용하여 높은 RGS2 발현 및 낮은 ATF4 발현을 나타내는 저성장 암세포의 특징을 확인하기 위한 실험방법(a 및 e), 화학요법 처리 후 잔여 종양의 부피(b 및 f), RGS2 및 ATF4 발현(c 및 g), 및 RGS2 및 ATF4 단백질 발현(d 및 h)을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 50은 저성장 암세포의 특징과 임상적 관련성을 검증하기 위한 실험방법을 나타낸 도면이다.
도 51은 화학요법 약물(Pc/Cs) 처리 후 폐암환자 유래 종양을 이종이식한(PDX) 종양에서 RGS2와 Ki67 발현 사이의 상관관계(a), 상대적인 종양 부피(b), RGS2 및 ATF4의 발현(c)을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 52는 폐암세포를 이종이식한 마우스에 일정 기간 화학요법 약물(Pc/Cs) 처리를 한 뒤 중단하고 RGS2 siRNA를 처리한 후, 종양 부피를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 53은 폐암세포를 이종이식한 마우스에 일정 기간 화학요법 약물(Pc/Cs) 처리를 한 뒤 중단하고 RGS2 siRNA 처리한 후, RGS2 및 절단된 caspase-3 발현에 대해 면역조직화학(IHC)을 실시한 대표적인 IHC 결과(a, 스케일 바=50 μm) 및 IHC 분석 결과(b)를 나타낸 도면이다 (Scr: scrambled, 이하 동일).
도 54는 siRNA로 RGS2 발현을 억제한 저성장 암세포를 이종이식한 마우스에서 종양의 부피를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 55는 siRNA로 RGS2 발현을 억제한 저성장 암세포를 이종이식한 마우스에 화학요법 약물(Pc)을 처리한 후 절단된 caspase-3에 대해 IHC 분석을 실시한 결과를 나타낸 도면이다.
도 56은 폐암환자 유래 종양을 이종이식한 마우스에 일정 기간 화학요법 약물(Pc/Cs) 처리를 한 뒤 중단하고, RGS2 siRNA를 처리한 후, 종양의 부피(a) 및 RGS2 및 절단된 caspase-3 발현(b)을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 57은 PDE5 억제제 처리된 저성장 암세포(H460/PcR)에서 단백질 번역을 확인한 결과(좌측) 및 세포 증식, 성장, 및 생존과 관련된 마커의 발현을 면역 블롯(Immunoblotting)으로 확인한 결과(우측)를 나타낸 도면이다 (Sild: 실데나필, Tada: 타다라필, 이하 동일).
도 58은 PDE5 억제제 단독 처리한 저성장 암세포(H460/PcR)와 PDE5 억제제 및 파클리탁셀을 병용 처리한 저성장 암세포 사이의 세포 생존력(a), 콜로니-형성 능력(b), 및 절단된 caspase-3 및 PARP 발현(c)을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 59는 PDE5 억제제 유사체인 db-cGMP(dibutyryl-cyclic GMP)와 파클리탁셀을 병용 처리한 저성장 암세포(H460/PcR)의 콜로니-형성 능력을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 60은 PDE5 억제제 및 파클리탁셀을 병용 처리한 저성장 암세포(H460/PcR)에 단백질 합성 억제제(라파마이신(a) 또는 NAC(b))를 처리한 후 절단된 caspase-3 및 PARP 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 61은 저성장 암세포를 이종이식한 마우스(a) 또는 폐암환자 유래 종양을 이종이식한 마우스(b)에 PDE5 억제제 및 파클리탁셀을 병용 처리한 후 종양의 부피를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 62a 및 도 62b는 저성장 암세포를 이종이식한 마우스 및 폐암환자 유래 종양을 이종이식한 마우스에 PDE5 억제제 및 파클리탁셀을 병용 처리한 후 절단된 caspase-3 발현을 확인하기 위해 IHC를 실시한 결과를 나타낸 것으로, 도 62a는 IHC 분석 결과를 나타낸 도면이고, 도 62b는 IHC 결과를 나타낸 도면이다 (스케일 바=100 μm).
도 63은 저성장 암세포를 이종이식한 마우스에서 확립된 종양에 PDE5 억제제 및 파클리탁셀을 처리한 후 종양의 부피를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 64는 저성장 암세포를 이종이식한 마우스 및 폐암환자 유래 종양을 이종이식한 마우스에 PDE5 억제제 및 파클리탁셀을 병용 처리한 후 체중을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 65는 저성장 암세포에 에보디아민을 처리한 후 RGS2의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (Evo: 에보디아민, 이하 동일).
도 66은 에보디아민을 처리한 저성장 암세포에 사이클로헥시미드를 처리한 후 RGS2 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (CHX: 사이클로헥시미드, 이하 동일).
도 67은 화학요법 치료 후 저성장 암세포(SCC)가 ER-스트레스 환경에서 생존하는 전략을 폐암세포(ACC)와 비교하여 나타낸 것으로, 좌측은 ER-스트레스 환경에서 폐암세포의 작용 기전, 중간은 ER-스트레스 환경에서 저성장 암세포의 작용 기전, 우측은 RGS2의 발현을 억제한 경우 ER-스트레스 환경에서 저성장 암세포의 작용 기전을 나타낸 도면이다 (ERAD(ER-associated protein degradation): ER-관련 단백질 분해).
본 발명의 일 실험예에서는 증식-의존성 형광 세포-추적 염료인 CFSE에 의한 표지방법을 이용하여 획득한 저성장 암세포(CFSEhigh)에서 RGS2 발현이 상향 조절되어 있는 것을 확인하였다 (실험예 1 참조).
본 발명의 다른 실험예에서는 RGS2 발현과 세포 증식 조절과 관련된 유전자의 발현 간에 역 상관관계가 있는 것을 확인하였으며, RGS2 발현이 증가되어 있는 폐암 환자의 경우, 생존율이 감소한 것을 확인하였다 (실험예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서는 인간 NSCLC 세포주를 화학요법 약물에 반복적으로 노출시켜 저성장 암세포(SCCs)를 확립하였다 (실험예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서는 RGS2 발현을 억제한 저성장 암세포(SCCs) 및 RGS2가 과발현된 모세포를 이용하여 RGS2의 발현과 저성장 암세포(SCCs)의 정지-유사 표현형이 상관관계를 가지고 있음을 확인하였으며, RGS2가 다양한 ER-스트레스 환경에서 저성장 암세포(SCCs)가 생존할 수 있는 능력을 부여할 수 있음을 확인하였다 (실험예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서는 저성장 암세포(SCCs)는 ATF4 발현에 대한 조절을 통해 ER 스트레스 환경에서 생존함을 확인하였다 (실험예 5 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서는 저성장 암세포(SCCs)가 ATF4-매개 단백질 합성을 억제함으로써 ER 스트레스 환경에서 세포자멸사를 회피함을 확인하였다 (실험예 6 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서는 저성장 암세포(SCCs)에서 RGS2는 ATF4와 결합하여 프로테아좀-매개 분해를 유도함으로써 ATF4의 발현을 조절하는 것을 확인하였다 (실험예 7 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서는 인간 또는 마우스의 폐암세포를 이식한 마우스에 반복적으로 화학요법 약물을 노출시킨 후 RGS2 및 ATF4의 발현을 확인한 결과, RGS2의 발현은 증가하고 ATF4의 발현은 감소한 것을 확인하였다 (실험예 8 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서는 RGS2 siRNA를 이용하여 저성장 암세포(SCCs)에서 RGS2 발현을 억제한 결과, 세포자멸사가 유도되고 화학요법 약물에 대한 감수성이 회복되는 것을 확인하였다 (실험예 9 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서는 단백질 합성을 활성화시키는 약물인 PDE5 억제제를 화학요법 약물과 함께 병용 투여할 경우 저성장 암세포의 세포자멸사를 유도하며, 종양 성장을 억제하는 것을 확인하였다 (실험예 10 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서는 에보디아민이 저성장 암세포(SCCs)에서 RGS2 단백질의 안정성 억제를 통해 RGS2 발현을 억제할 수 있음을 확인하였다 (실험예 11 참조).
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
이에, 본 발명은 RGS2(regulator of G protein signaling 2) 및 ATF4(Activating Transcription Factor 4) 단백질; 또는 이들의 mRNA의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 폐암 재발 예측용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "RGS2(regulator of G protein signaling 2)"는 GTP 분해효소 활성화 단백질(GTPase Activating Protein; GAP)로 작용하여 G 단백질의 GTP를 분해하여 G 단백질 신호 전달을 억제하는 역할을 하며, 최근 연구를 통해 여러 스트레스 상황에서 발현이 유도되면서 단백질의 번역을 억제하는 작용이 있음이 확인되었다.
본 명세서에서, RGS2 단백질은 포유류에서 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간에서 유래한 것이다. 가장 바람직하게, 본 발명에서의 RGS2 단백질은 서열번호 1로 표시되는 인간의 RGS2 (NP_002914.1) 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다 (괄호 안은 NCBI Genebank accession number).
상기 RGS2 mRNA는 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 인간 RGS2 mRNA (NM_002923.4) 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다 (괄호 안은 NCBI Genebank accession number). 상기한 인간의 RGS2 mRNA transcript variant들의 coding region(exon) 등의 특징 사항은 괄호 안에 기재된 Genebank accession number로 NCBI 데이터베이스를 검색하여 나오는 서열정보에서 확인된다.
본 명세서에서 사용된 용어, "ATF4(Activating Transcription Factor 4)"는 ATF/CREB (activating transcription factor/cyclic AMP response element binding 6 protein) 패밀리에 속하고, ER 스트레스에 의해 발현이 증가되어 축적되는 스트레스 단백질로서 351개의 아미노산과, 약 39kDa의 분자량을 가지는 단백질을 의미한다.
본 명세서에서, ATF4 단백질은 포유류에서 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간에서 유래한 것이다. 가장 바람직하게, 본 발명에서의 ATF4 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 인간의 ATF4 (NP_001666.2) 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다 (괄호 안은 NCBI Genebank accession number).
상기 ATF4 mRNA는 바람직하게는 서열번호 4로 표시되는 인간 ATF4 mRNA (NM_001675.4) 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다 (괄호 안은 NCBI Genebank accession number). 상기한 인간의 ATF4 mRNA transcript variant들의 coding region(exon) 등의 특징 사항은 괄호 안에 기재된 Genebank accession number로 NCBI 데이터베이스를 검색하여 나오는 서열정보에서 확인된다.
본 명세서에서 사용된 용어, "폐암"은 폐에 생긴 악성 종양을 의미하는 것으로, 폐 자체에서 발생하거나 다른 장기에서 생긴 암이 폐로 전이되어 발생하며, 암세포의 크기와 형태를 기준으로 소세포폐암(small cell lung cancer)과 비소세포폐암(non-small cell lung cancer; NSCLC)으로 구분할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 폐암은 비소세포폐암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "폐암 재발"은 폐암이 치유된 후에 일정한 기간 내에 다시 암이 발생하는 것을 의미하는 것으로, 폐암이 치유(예를 들어, 외과적 수술, 항암제 투여, 방사선 조사 등의 항암 치료에 의한 폐암 조직의 제거, 소멸, 및/또는 소멸과 동등한 정도의 감소)된 후 동일형의 종양이 동일 부위 (원발성 재발) 또는 다른 부위 (전이성 재발)에 다시 발생하는 경우를 의미한다. 폐암 재발은 ① 완전히 제거되지 않은 종양세포가 증식하는 직접 재발 (예를 들어, 국소성 재발 및 전이성 재발); 및 ② 종양세포가 완전히 제거된 후에 새롭게 같은 종류의 종양이 발생하는 간접 재발 등이 있으며, 폐암 환자의 불량한 예후를 초래한다. 따라서, 보다 간편하고 효율적으로 조기에 재발을 예측하는 것이 무엇보다 중요하다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 폐암 재발은 잠복하고 있던 저성장 암세포가 성장하기에 적절한 환경이 형성되어 종양이 형성됨으로써 다시 암이 발생하는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "저성장 암세포(Slow-cycling/dormant cancer cells; SCCs)"는 항암 치료 후 통상적인 폐암 진단 방법으로는 진단이 불가능한 수준으로 잔존하는 암세포를 의미하며, 수개월에서 수년간 정지-유사 표현형의 느린 순환(Slow-cycling) 상태로 잠복하고 있다가 종양이 성장하기에 적절한 미세환경이 형성되는 경우 종양의 성장을 촉진하여 폐암을 재 발생시킨다.
상기 저성장 암세포는 도 67에 나타낸 바와 같이, IRE1α 매개-리보뉴클레아제(ribonuclease) 활성에 의한 sXBP1의 단백질 분해 처리 및 생산을 통한 활성화된 ATF6의 방출이 단백질 폴딩(folding) 또는 ER-관련 단백질 분해(ER-associated protein degradation; ERAD)에 관여하는 유전자의 전사 조절을 유도함으로써 ER 항상성의 회복을 매개한다. 이에 따라, 저성장 암세포는 ATF6 매개- 및 IRE1α 매개- 단백질 접힘 및 ERAD를 활성화함으로써 부분적으로 지속적인 ER 스트레스가 있는 척박한 미세 환경에서 생존할 수 있을 것으로 예측되고 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 저성장 암세포는 폐암세포(ACCs)에 비해 RGS2가 높게 발현되어 있고, ATF4가 낮게 발현되어 있다. 구체적으로, RGS2는 ATF4와의 결합을 통해 프로테아좀-매개 분해를 유도하여 ATF4-매개 mRNA 번역을 억제함으로써 저성장 암세포가 ER-스트레스를 유발하는 종양 미세환경에서 생존할 수 있도록 하므로, RGS2 발현 또는 활성을 억제할 경우, 저성장 암세포는 ER-스트레스 유도 세포자멸사에 민감하게 되고 화학요법 약물(항암제)에 대한 민감성을 회복하므로 종양 재발을 억제할 수 있다.
상기 통상적인 폐암 진단 방법으로는 예를 들어, 객담세포진검사, 흉부 CT검사, 기관지내시경 검사, 세침 흡인 검사, 흉부 엑스선검사 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "ACCs(actively cycling cancer cells)"는 저성장 암세포와 반대로 통상적인 폐암 진단 방법으로 진단이 가능한 암세포로 활발하게 종양을 형성하고 있는 폐암세포를 의미하며, 본 발명에서 폐암세포, 모세포는 ACCs를 의미할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, ACCs는 저성장 암세포에 비해 RGS2는 낮게 발현되어 있고, ATF4는 높게 발현되어 있다.
상기 ACCs는 도 67에 나타낸 바와 같이, 화학요법 치료를 포함한 다양한 ER-스트레스 원인 노출에 의해 UPR의 IRE1α, PERK, 및 ATF6 branch가 활성화되고, PERK-유도된 eIF2α의 인산화는 전반적인(global) mRNA 번역을 약화시킨 반면, GADD34에 대한 전사 인자인 ATF4를 인코딩하는 mRNA의 선택적 번역은 단백질 합성을 회복시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "폐암 재발 예측용"은 폐암 완치 환자 또는 폐암 치료 후 질병증거가 없는 환자에서의 폐암 재발 여부 또는 재발 가능성을 미리 확인, 판단 또는 결정하는 것을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 폐암 완치 환자 또는 폐암 치료 후 질병증거가 없는 환자에서 RGS2 및 ATF4 단백질; 또는 이의 mRNA의 발현 또는 활성 수준을 측정함으로써 폐암 재발 가능성을 미리 확인, 판단 또는 결정할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "질병증거가 없는"은 치료 후 방사선/조직 검사 등에서 질병의 물리적인 증거가 없는 경우 즉, 통상적인 진단 과정에서 잔여암이 발견되지 않는 경우를 의미하는 것으로, 암이 완치되었음을 의미하는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어, "발현(expression)"은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "단백질"은 "폴리펩타이드(polypeptide)"또는 "펩타이드(peptide)"와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"또는 "핵산"은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. "mRNA"는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자로부터 아미노산 서열을 특정하게 되는 리보솜으로 유전 정보(유전자 특이적 염기 서열)를 전달하는 RNA를 의미한다.
본 발명의 조성물이 mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 것인 경우에 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브일 수 있다.
상기 RGS2 또는 ATF4의 mRNA에 특이적인 프라이머 세트 또는 프로브를 포함하는 본 발명의 조성물은 공지된 RNA를 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물을 이용하여 공지된 RNA를 감지하는 방법을 제한없이 사용함으로써 피검체에서 상기 단백질 마커들의 mRNA의 수준을 측정할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지(labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
상기 "프라이머" 또는 "프로브"는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 mRNA와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예를 들어 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.
한편, 본 발명에서 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한 항원-항체 결합성을 갖는 것이면 전체 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되며, 본 발명 단백질에 특이적으로 결합하는 모든 종류의 면역글로불린 항체가 포함된다. 예를 들어 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편, 즉 항원 결합 기능을 갖는 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 나아가 본 발명의 항체에는 본 발명 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 인간화 항체, 키메릭 항체 등의 특수 항체와 재조합 항체도 포함된다.
본 명세서에서 사용된 용어, "앱타머(aptamer)"는 시료 내의 검출하고자 하는 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는 것으로, 특이적으로 시료 내의 표적 단백질의 존재를 확인할 수 있다. 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에 따라, 확인하고자 하는 표적 단백질에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 앱타머 칩의 관능기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 NH2로 변형을 시킴으로써 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 RGS2 또는 ATF4 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 본 발명의 조성물은 공지된 단백질을 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 본 조성물을 이용하여 공지된 단백질을 감지하는 방법을 제한없이 사용하여 피검체(본 발명에서는 피검체로부터 수득한 생물학적 시료)에서 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단백질 마커를 코딩하는 유전자는 그 핵산 서열이 유전자 은행에 등록되어 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 세트 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 포스포르아미다이트 고체지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있으며, 모든 기능적 등가물을 포함한다. 또한, 전술한 "프라이머" 또는 "프로브"에 관한 내용이 동일하게 적용될 수 있다.
상기 "기능적 등가물"이라는 용어는 예를 들어, 기준(reference) 서열로부터 하나 또는 그 이상의 치환, 결실 또는 부가, 기준(reference) 서열과 실험(subject) 서열 사이의 다양한 기능적 비유사성을 낳지 않는 실제 효과(net effect) 등 변화된 돌연변이 서열의 뉴클레오티드와 핵산서열 모두를 의미한다. 통상적으로, 그런 실질적 등가물인 서열은 단지 약 35%(즉, 실질적으로 등가적인 서열에서의 각 잔기 치환, 부가 및 결실의 숫자는 상응하는 기준 서열과 비교하고 실질적으로 등가적인 서열에서의 나머지 전체 숫자로 나누었을 때 약 0.35 또는 그 이하이다) 정도로 본 명세서에 나열된 것에서부터 다양하다. 그런 서열은 나열된 서열과 65%의 서열 동일성을 갖는다. 본 발명에 따른 실질적 등가물인, 예를 들어 돌연변이, 아미노산 서열은 나열된 아미노산 서열과 바람직하게는 최소한 80%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 최소한 90%의 서열 동일성을 갖는다. 실질적 등가물인 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 유전자 암호의 중복(redundancy) 또는 축퇴(degeneracy)를 고려할 때, 더 낮은 백분율의 서열 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 최소한 약 65%의 동일성, 보다 바람직하게는 최소한 약 75%의 동일성, 가장 바람직하게는 약 95%의 동일성을 가져야 한다. 본 발명의 목적을 위해서는, 실질적으로 등가적인 생물학적 활성과 실질적으로 등가적인 합성 특징을 가지는 서열들은 실질적 등가물로 취급된다. 등가물을 결정하기 위해, 성숙 서열(예를 들어, 위(spurious) 종결코돈(stop codon)을 제조하는 돌연변이를 통한)의 절단(truncation)은 무시되어야 한다.
또한, 본 발명의 다른 양태로, 본 발명은 본 발명에 따른 폐암 재발 예측용 조성물을 포함하는 폐암 재발 예측용 키트를 제공한다.
상기 본 발명의 키트에는 표적 단백질을 마커로 인식하는 항체 또는 mRNA를 마커로 인식하는 프라이머 세트, 프로브뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 양태로서 상기 예측용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 예측용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 세트를 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7bp 내지 50bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10bp 내지 30bp의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
다른 구체적인 양태로는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 예측용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로, 본 발명은 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 RGS2(regulator of G protein signaling 2) 및 ATF4(activating Transcription Factor 4) 단백질; 또는 이들의 mRNA의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 폐암 재발 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 폐암세포와 비교하여 RGS2 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 또는 활성 수준이 증가하고,
ATF4 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 또는 활성 수준이 감소한 경우 폐암 재발의 위험성이 높은 것으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 피검체는 인간을 포함한 포유류일 수 있으며, 인간의 경우 폐암 완치 환자 또는 폐암 치료 후 질병증거가 없는 환자일 수 있으나, 폐암 재발의 위험성 또는 재발 유무를 판단할 필요가 있다면 제한없이 모두 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "측정"은 목적하는 물질(본 발명에서의 마커 단백질)의 존재(발현) 여부를 측정 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준)의 변화를 측정 및 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 즉, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 것은 발현 여부를 측정하는 것(즉, 발현 유무를 측정하는 것), 또는 상기 단백질의 질적, 양적 변화 수준을 측정하는 것을 의미한다. 상기 측정은 정성적인 방법(분석)과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있다. 단백질 수준의 측정에 있어서 정성적 방법과 정량적 방법의 종류는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 기술한 실험법들이 이에 포함된다. 각 방법 별로 구체적 단백질 수준 비교 방식은 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서 상기 목적 단백질 검출은 RGS2 및 ATF4 단백질의 존재 여부의 검출, 또는 상기 단백질 발현량의 증가(상향 조절) 또는 감소(하향 조절)를 확인하는 것을 포함하는 의미이다.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 폐암 재발을 예측하고자 하는 피검체에서 채취된 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 혈액, 전혈, 혈장, 소변, 타액, 조직, 세포, 기관, 골수, 중심부바늘생검(core needle biopsy) 검체, 및 진공흡입생검 검체 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 생물학적 시료는 검출 또는 진단에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 상기 시료는 단백질 마커의 탐지 감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데, 예를 들어 환자로부터 수득한 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정은 당업계에 공지된 단백질 발현 측정 방법에 의한 것이라면 측정 방법이 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(Rocket immunoelectrophoresis), 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 질량분석법(Mass spectrometry), FACS, 및 단백질칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자 발현 수준 측정은 당업계에 공지된 유전자 발현 측정 방법에 의한 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블롯팅(northern blotting), 사우던 블롯팅(southern blotting), In situ 교잡법, 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "분석"은 바람직하게는 "측정"을 의미하는 것일 수 있고, 상기 정성분석은 목적하는 물질의 존재 여부를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있으며, 상기 정량분석은 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준) 또는 양의 변화를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 본 발명에서 분석 또는 측정은 정성적인 방법과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한없이 수행될 수 있으며, 바람직하게는 정량적인 측정이 수행되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로, 본 발명은 RGS2(regulator of G protein signaling 2)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 폐암 재발 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 발현 억제제는 에보디아민(evodiamine; Evo) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; RGS2 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA, 및 이를 포함하는 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 RGS2 발현을 억제할 수 있다면 모두 포함될 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA, 및 이들을 포함하는 벡터는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제작할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "에보디아민(evodiamine; Evo)"은 하기 화학식 1로 표시될 수 있으며, (1S)-21-methyl-3,13,21-triazapentacyclo[11.8.0.02,10.04,9.015,20]henicosa-2(10),4,6,8,15,17,19-heptaen-14-one의 IUPAC 네임을 가질 수 있다. 또한, 분자량은 303.4, 화학식은 C19H17N3O일 수 있다. 또한, 상기 에보디아민은 본 발명이 속한 분야에서 공지된 방법으로 화학적으로 합성하거나 시판되는 물질을 사용할 수 있으며, 추출, 분리하여 획득할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
[화학식 1]
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본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 에보디아민 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 RGS2 단백질의 안전성을 억제함으로써 RGS2 단백질 발현을 억제할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 RGS2의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 RGS2 mRNA에 상보적이고 RGS2 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, RGS2 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "siRNA"는 표적 mRNA의 절단을 통해 RNA 간섭현상을 유도하는 이중사슬 RNA를 의미하며, 표적 mRNA와 같은 서열을 가지는 센스서열의 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 서열의 RNA 가닥으로 구성된다.
본 발명의 siRNA는 서열번호 5의 안티센스 염기서열로 이루어지며, 이 서열을 포함함으로써, RGS2의 발현을 억제하여 저성장 암세포의 성장을 억제하고 항암제에 대한 민감성을 증가시켜 폐암 재발을 효율적으로 억제할 수 있다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 5로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 94% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "shRNA"는 다이서(Dicer)에 의하여 루프가 절단되고 siRNA처럼 RISC와 작용하게 되어 RNAi 현상을 나타내는 짧은 이중가닥 사슬을 의미한다. 상기 shRNA는 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루고 있으며, 5 내지 10 뉴클레오티드의 루프(loop) 부위 양쪽으로 상보적으로 19 내지 29 뉴클레오티드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템(stem)을 형성한다. shRNA는 일반적으로 in vivo상에서 Pol III 프로모터에 의해 전사되어 합성되며 이후 shRNA는 다이서에 의해 루프가 절단되고 siRNA처럼 RISC와 작용하게 된다.
본 발명의 shRNA는 서열번호 6 또는 서열번호 7의 센스서열 및 그의 안티센스 서열로 이루어지며, 이 서열을 포함함으로써, RGS2의 발현을 억제하여 저성장 암세포의 성장을 억제하고 항암제의 암세포 성장 억제/사멸 촉진 작용에 대한 민감성을 증가시켜 폐암 재발을 효율적으로 억제할 수 있다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 6 또는 7로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 94% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 "벡터"는 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 내로 삽입된 외부 DNA를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명과 관련된 벡터는 상기 유전자를 저해하는 핵산 서열이 게놈 내로 삽입된 벡터로서, 이들 벡터는 DNA 벡터, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 효모 벡터, 또는 바이러스 벡터를 예로 들 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 활성 억제제는 RGS2 단백질의 기능 저하, 바람직하게, 상기 단백질의 단백질 합성 저해 작용이 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하도록 하는 물질을 의미한다. 보다 구체적으로, 상기 활성 억제제는 PDE5 억제제(phosphodiesterase type 5 inhibitor), 및 RGS2 단백질과 특이적으로 결합하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 RGS2 활성을 억제할 수 있다면 모두 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "PDE5 억제제(phosphodiesterase 5 inhibitor)"는 음경의 음핵해면체에 혈액을 공급하는 혈관평활근 세포에서 cGMP 특이 포스포다이에스터레이스 5형의 분해 작용을 저해함으로써 발기부전 치료에 사용되는 약물로 개발된 것으로, RGS2의 단백질 합성 저해 작용을 차단함으로써 폐암 재발의 원인이 되는 저성장 암세포의 성장을 억제하고 세포자멸사를 유도할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 PDE5 억제제는 실데나필(sildenafil; Sild), 타다라필(tadalafil; Tada), 바데나필(vardenafil), 미로데나필(mirodenafil), 유데나필(udenafil), 아바나필(avanafil), 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 저성장 암세포에서 세포 성장 및 단백질 합성 촉진 신호전달을 활성화시킬 수 있는 물질이라면 모두 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 PDE5 억제제는 항암제와 병용 투여될 수 있으며, 상기 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel; Pc), 시스플라틴(cisplatin; Cs), 및 페메트렉시드(pemetrexed; Pm)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 다른 양태로, 본 발명은 에보디아민(evodiamine; Evo) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 폐암 재발 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 에보디아민은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 염"이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다.
적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아질산, 안식향산, 구연산, 젖산 등을 들 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
본 발명의 조성물 내의 에보디아민 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 0.001 내지 80중량% 또는 0.01 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에 따른 "약학적 조성물"은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는 에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아검(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9% 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막 내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
또한, 본 발명은 RGS2(regulator of G protein signaling 2)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 폐암 재발 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 RGS2(regulator of G protein signaling 2)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 폐암 재발 억제 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 RGS2(regulator of G protein signaling 2)의 발현 또는 활성 억제제의 폐암 재발 억제용 약제 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 에보디아민 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 폐암 재발 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 에보디아민 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물의 폐암 재발 억제 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 에보디아민 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 폐암 재발 억제용 약제 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 "투여"란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 세포 배양
인간 NSCLC lines H460, H1299, SK-MES-1, H226B, H1792 세포주들 및 생쥐 폐암 세포주(Lewis lung carcinoma; LLC)는 American Type Culture Collection에서 구입하거나 John V. Heymach(MD Anderson Cancer Center)에서 제공받았다. LLC 세포주는 10% FBS 및 항생제 함유 DMEM 배지에서, 다른 세포주들은 10% FBS 및 항생제 함유 RPMI 1640 배지에서 37℃, 5% CO2의 가습화된 공기조건 하에서 배양하였다.
저성장 암세포주는 인간 NSCLC lines H460, H1299, SK-MES-1, H226B, H1792 세포주들을 항암제 파클리탁셀(paclitaxe; Pc), 시스플라틴(cisplatin; Cs), 페메트렉시드(pemetrexed; Pm)에 3-4개월 동안 지속적으로 노출시켜 제조하였다.
실시예 2. 시약
phospho-histone H3(S10), cleaved caspase-3(Cl-cas3), p21, LC3B, phospho-ERK(T202/Y204), ERK, phospho-eIF2α(S51), PERK, ATF4, phospho-p70S6 kinase(T389), phospho-Akt(S473), Akt, phospho-4E-BP1(S65), 4E-BP1, phospho-mTOR(S2448), 및 mTOR에 대한 항체는 Cell Signaling Technology에서 구입하였다. RGS2, Cyclin D1, CDK4, p27, Actin, eIF2α, GADD34, CHOP/GADD153, ubiquitin, phospho-p38(Y182), p38, OctA-probe, 및 His-probe에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다. Ki67, 및 PCNA에 대한 항체는 Abcam에서 구입하였다. 토끼 다클론 항-phospho-PERK(S713) 항체 및 CFSE 세포 분열 추적기 키트(CFSE cell division tracker kit)는 BioLegend에서 구입하였다. 토끼 다클론 항-RGS2 및 항-ATF4 항체는 Proteintech에서 구입하였다. 마우스 단클론 항- cleaved PARP 항체는 BD Biosciences에서 구입하였다. HRP-결합 2차 항체는 GeneTex에서 구입하였다. 파클리탁셀, 시트르산염(sildenafil citrate), 및 타다라필(tadalafil)은 Selleck Chemicals에서 구입하였다. 페메트렉시드는 LC Laboratories에서 구입하였다. 라파마이신(Rapamycin)은 Tocris Bioscience에서 구입하였다. 사이클로헥시미드(Cycloheximide)는 Merck Millipore에서 구입하였다. MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)는 MP Biomedicals에서 구입하였다. db-cGMP는 Cayman Chemical에서 구입하였다. 시스플라틴, 에토포시드(etoposide), NAC, MG132, 탑시가르긴, 및 크리스털 바이올렛(crystal violet)을 포함하는 다른 화학 물질들, 및 PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit는 MilliporeSigma에서 구입하였다.
실시예 3. 일차 배양
폐암환자 유래 종양 이종이식(patient-derived xenograft tumor; PDX) 종양에서 채취한 폐암세포의 일차 배양을 위해, 약 500 mm3 부피의 종양을 NOD/SCID 마우스로부터 분리하여 외과용 가위를 이용하여 작은 조각으로 절단하였다. PDX 종양으로부터 채취한 폐암세포의 단일 세포 현탁액은 제조업체의 지침에 따라 human Tumor Dissociation Kit(Miltenyi Biotec)을 사용하여 생성하였다. 분리된 세포는 즉시 사용하거나 추가 실험을 위해 10% FBS 및 항생제 함유 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.
실시예 4. CFSE assay
인간 NSCLC lines H460, H1299, SK-MES-1, H226B, H1792 세포주들 또는 PDX 종양으로부터 수득한 폐암세포를 일차 배양한 세포(각각 1×106 내지 2×106 세포)는 37℃에서 20분 동안 25 μM CFSE로 표지 하였다. 배양 배지를 넣어 염색을 중단하고 원심분리하여 여분의 CSFE를 제거한 뒤, 배양 플레이트에 시딩(seeding)한 후 7일 동안 배양하였다. 배양한 세포는 트립신-EDTA로 해리한 뒤 3×107개 이상의 단일 세포 현탁액을 준비하여 FACS Aria III cell sorter (BD Biosciences)를 사용하여 유세포 분석(flow cytometry)에 따라 CFSElow(하부, ~ 10%), CFSEmiddle(중간, ~ 35%-40%), 및 CFSEhigh(상부, ~10%) 군집으로 분류하였다. 분류된 세포는 in vitro 또는 in vivo 실험을 위해 즉시 플레이팅(plating)하거나 주입(injecting)하였다. 관련 실험을 반복하기 위해 3개의 세포 분류 실험을 실시하였다.
실시예 5. 면역형광(Immunofluorescence)
세포를 커버슬립에 씨딩(seeding)한 후 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 15분 동안 실온에서 고정하였다. FFPE 종양 조직의 절편(두께: 4 μm) 또는 40개의 종양 샘플을 포함하는 NSCLC TMA(US Biomax, Inc.)를 탈파라핀화하고 재수화한 뒤 항원 복원(antigen retrieval; citrate buffer, pH 6.0)을 실시하였다. 모든 샘플(고정한 세포 또는 항원 복원된 FFPE 조직 및 TMA)은 상온에서 0.2% Triton X-100으로 투과시킨 다음 상온에서 한시간 동안 blocking buffer(5% normal serum in TBS containing 0.025% Triton X-100 [TBSTx])와 함께 배양하였다. 샘플들은 1차 항체로 항-Ki67(1:1000), 항-RGS2(1:200), 또는 항-phospho-histone H3(1:500) 항체와 함께 배양한 뒤 1% BSA 함유 TBSTx로 희석하였다. TBSTx로 3회 세척한 뒤 1% BSA 함유 TBSTx로 희석(1:500)한 형광(Alexa Fluor 488 또는 Alexa Fluor 594)이 결합된 2차 항체와 함께 배양하였다. 핵을 DAPI(50 ng/mL)로 대조 염색한 후 커버슬립에 마운팅 솔루션(Dako, Agilent)으로 마운팅(mounting)하였다. 형광은 공초점 현미경으로 관찰하였다.
실시예 6. RNA 시퀀싱 분석(RNA-Seq)
제조업체의 권장사항에 따라 SENSE mRNA-Seq Library Prep Kit를 사용하여 라이브러리를 구성했다. 고용량 염기서열 분석법은 HiSeq 2000 system(Illumina)을 사용하여 100bp로 리드하여 실시하였다. RNA 시퀀싱 리드는 정렬 파일을 얻기 위해 TopHat software를 사용하여 매핑(mapping)하였다. 정렬 파일은 Cufflinks를 사용하여 전사체를 조립하고, 풍부도를 추정하고, 유전자/아형의 차등 발현을 감지하기 위해 사용하였다. 라이브러리 제조 및 RNA 시퀀싱은 Ebiogen, Inc의 next-generation sequencing(NGS)으로 실시하였다. RNA 시퀀싱 데이터의 계층적 클러스터링 및 히트맵(heatmap) 생성은 MultiExperiment Viewer software(version 4.8.1, J. Craig Venter Institute)를 사용하여 실시하였다. 연구의 결과를 뒷받침하는 모든 시퀀싱 데이터는 NCBI's Gene Expression Omnibus(GEO, GSE141218)에 기탁하였다.
RNA 시퀀싱 데이터의 GO term enrichment analysis는 온라인에서 이용 가능한 GO Enrichment Analysis 도구(http://geneontology.org/)를 사용하여 실시하였다. CFSEhigh 집단에서 세포 증식과 관련된 GO terms의 관련성을 검증하기 위해 CFSEhigh 집단에서 차별적으로 조절된 유전자를 세포주기(GO:0007049), 세포 집단 증식 조절(GO:0042127), 및 세포주기 조절(GO:0051726) GO terms 중 하나와 관련된 유전자 산물과 비교했다. 위에서 설명한 GO terms에 대한 Homo sapiens의 직접적인 주석은 AmiGO 2(http://amigo.geneontology.org)를 사용하여 확인하였다. 벤 다이어그램은 무료로 사용 가능한 웹 기반 도구 (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)를 사용하여 그렸다.
실시예 7. 종양 동물모델
모든 동물실험은 서울대 동물실험윤리위원회(IACUC)가 승인한 프로토콜에 맞추어 수행되었다. 마우스는 일반 식이와 물이 자유롭게 공급되고 12 시간 점등/12 시간 소등 주기로 온도와 습도가 제어되는 시설에서 사육하였다. 이종이식(xenograft) 실험의 경우, 스팟(spot) 당 마트리겔 매트릭스(Matrigel matrix)와 1:1로 혼합한 PBS 100 μL로 현탁한 0.5×106 내지 1×106 세포를 6-8주령의 암컷 NOD/SCID 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. PDX 실험의 경우, 마우스에서 5회 미만으로 계대된 종양 조직을 2 mm3 조각으로 잘게 썰어, 6-8주령의 암컷 NOD/SCID 마우스에 피하 주입하였다. 종양의 볼륨이 50-100 mm3에 이르면 마우스를 무작위로 그룹화하여 대조군(vehicle)과 약물 처리군으로 나누고, 항암제 파클리탁셀은 Cremophor EL과 에탄올(1:1, v/v)의 혼합물에 용해시켜 PBS(최종 1:1:18, v/v/v)에 추가로 희석한 뒤 주 1회 마우스에 20 mg/kg을 복강 내 투여하였으며, 항암제 시스플라틴 및 페메트렉시드는 0.9% (w/v) NaCl 용액으로 희석하여 주 1회 각각 3 mg/kg, 50 mg/kg 용량으로 복강 내 투여하였다. 또한, PDE5 억제제인 실데나필 시트르산염(Sildenafil citrate)은 0.9% (w/v) NaCl 용액에 용해시켜 10 mg/kg의 용량으로 주 5회 경구 투여하였다.
종양 성장은 캘리퍼(caliper)로 종양의 단직격/장직경을 측정하여 결정하였고, 체중은 독성을 평가하기 위해 매주 2회 측정하였다. 종양의 볼륨(mm3)은 (단직경)2 ×(장직경)×0.5의 공식으로 구하였다.
실시예 8. ATF4 단백질 합성 확인을 위한 대사적 표지법
세포를 메티오닌이 없는 RPMI 배지(Welgene)에서 1시간 동안 배양한 뒤 지시된 기간 동안 0.2 mCi L-[35S] methionine(PerkinElmer)로 pulse-labeling하였다. 전체 세포 용해물에서 동량의 단백질 1 mg을 항-ATF4 항체(1:1000로 희석된)로 면역 침전시킨 뒤 SDS-PAGE를 실시하였다. Model 583 gel dryer(Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 겔을 건조시킨 후 자동 방사선 촬영을 실시하였다.
실시예 9. 면역침강법(Immunoprecipitation) 및 풀다운 분석(pulldown assay)
세포는 다양한 프로테아제(protease) 및 포스파타제(phosphatase) 억제제(100 mM NaF, 5 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 1 μg/mL 아프로티닌(aprotinin), 1 μg/mL 류펩틴(leupeptin), 및 1 μg/mL 펩스타틴(pepstatin)을 포함하는 lysis buffer(40 mM Tris-HCl [pH 7.4], 120 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 2 mM EDTA, 1 mM MgCl2)로 용해하였다. 동일한 양(500-1000 μg)의 세포 용해물은 항-ATF4, 항-RGS2 또는 항-FLAG 항체(1 μg)로 면역 침전시킨 뒤 4℃에서 2시간 동안 단백질 A/G 아가로스 비드(agarose bead)와 함께 배양하였다. 비드는 lysis buffer 또는 PBS로 5회 세척한 뒤 면역 침전된 단백질을 2 sample buffer를 처리하고 95℃에서 5분 동안 끓여 용출시켰다. 용출액은 8% SDS-PAGE로 분리하여 면역 블롯팅으로 추가 분석하였다.
풀다운 분석을 실시하기 위해, 전체 세포 용해물은 4℃에서 밤새 Ni-NTA-아가로스 비드에 결합된 재조합 전체(full-length; FL) 또는 잘린(truncated) RGS2 단백질과 함께 배양하였다. 비드는 여러 번 세척하였고, 결합된 단백질은 위에서 설명한대로 용출하였다.
실시예 10. siRNA의 종양 내 주입
in vivo-jetPEI(Polyplus-Transfection SA)를 사용한 in vivo 전달을 위한 siRNA 제형은 제조업체의 지침에 따라 제조하였다. 멸균한 5% 포도당 용액에 희석된 5 μg의 siRNA는 1 μg siRNA 당 0.12 μL in vivo-jetPEI의 비율로 in vivo-jetPEI와 복합체를 형성하였다. 제형화된 siRNA는 매주 2회 종양 내로 투여하였다.
실시예 11. 면역조직화학(immunohistochemistry; IHC)
면역조직화학 분석은 cleaved caspase-3, RGS2, 또는 ATF4에 대한 항체를 사용하여 실시하였다. FFPE 조직 표본의 절편은 파라핀을 제거하고 재수화한 뒤 citrate-based antigen unmasking solution(Vector Laboratories)을 사용하여 항원 복원(antigen retrieval)을 실시하였다. 0.3% 과산화수소 용액으로 처리한 뒤, 슬라이드를 상온에서 1시간 동안 blocking buffer(5% normal serum in TBSTx)와 함께 배양하였다. 슬라이드는 먼저 1% BSA 함유 TBSTx에 희석(1:200)한 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하고, TBSTx로 3회 세척한 뒤 1% BSA 함유 TBSTx에 희석(1:500)한 비오틴화된(biotinylated) 2차 항체(Vector Laboratories)와 함께 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 용액 A와 B(ABC-Elite, Vector Laboratories)를 30분 동안 동시에 첨가하고, 3,3'-diaminobenzidine(DAB) substrate kit (Vector Laboratories)를 사용하여 신호를 검출하였다. 슬라이드는 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대조염색(counterstain)하였다.
실시예 12. 통계 분석
데이터는 평균±SD로 표시하였고, 모든 in vitro 및 in vivo 실험은 독립적으로 최소 2회 실시하여 대표적인 결과로 나타내었으며, 그래프는 대표적인 실험을 여러 번 반복하여 값을 표시하였다. in vitro 및 in vivo 실험 샘플 크기를 결정하는데 통계적 방법을 적용하지 않았다. 통계적 유의성은 GraphPad Prism(version 7 및 8)을 사용하는 2-tailed Student's t 테스트 또는 one-way ANOVA로 결정하였다. 테스트 그룹의 동일한 분산(variance)의 여부를 확인하기 위해 F-test를 실시하였다. in vitro 또는 in vivo 데이터가 정규 분포를 따랐는지 확인하기 위해 Shapiro-Wilk 테스트를 실시하였다. p<0.05은 유의적인 차이를 의미한다.
[실험예]
실험예 1. 비소세포폐암(NSCLC) 세포주, 환자 유래 이종이식 종양, 및 환자 종양 조직 내의 저성장 암세포(SCCs)에서 상향 조절되어 있는 RGS2
SCCs의 휴면 특성에도 불구하고, 약제내성 및 증식 마커 Ki67 발현의 결실을 특징으로 하는 SCCs의 하위 집단은 빠르게 성장하는 종양 및 암 세포주에서도 발견되는 것으로 알려지고 있다. 따라서 천천히 성장하는 세포 및 빠르게 성장하는 세포의 하위 집단을 구별하는 증식-의존성 형광 세포-추적 염료 CFSE를 사용하여 SCCs를 획득하려고 하였다. 구체적으로, 도 1에 나타낸 바와 같이, 3개의 NSCLC 세포주(H460, H1299, 및 SK-MES-1) 및 폐암환자 유래 종양 이종이식(patient-derived xenograft; PDX) 종양(PDX1-1, PDX1-2; 종양 이질성(heterogeneity)을 설명하기 위해 각각 다른 부위에서 획득함)을 CFSE로 표지하였다. 1주일 이상 분열한 세포는 표지가 희석되고 형광 강도가 감소하므로, 7일차에, 표지를 유지하는 세포의 하위 집단은 표지가 없거나/표지 정도가 낮은 활발히 분열하는 세포와 구별할 수 있다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 상위(> 90%), 중간, 또는 하위(< 10%) 범위에 속하는 CFSE 표지된 세포 각각을 유세포 분석(flow cytometry)으로 CFSEhigh(hi) 집단, CFSEmiddle(mid) 집단, 및 CFSElow(lo) 집단으로 분류하였다. 도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이, CFSElo 및 CFSEmid 집단과 비교하여 CFSEhi 집단의 세포는 현저하게 낮은 증식률, G0 exist 마커인 Ki67 증식 지수(PI), 유사분열 지수, 콜로니(colony)-형성 능력, 및 약제 감수성을 나타냈다. CFSE 세포의 대부분이 속해있는 CSFEmid 집단은 CSFElo 집단과 비교하여 유사하거나 약간 더 낮은 증식률, 유사분열 지수, anchorage-의존성 콜로니 형성 능력, 또는 화학요법 약물(파클리탁셀) 감수성을 나타냈다. 또한, 도 3c에 나타낸 바와 같이, 2개의 다른 PDX 종양(PDX 2 및 PDX 3)으로부터 유래한 CFSEhi SCCs에서도 대응하는 CFSElo 또는 CFSEmid 집단과 비교하여 현저하게 낮은 Ki67 PI, 유사분열 지수, 콜로니-형성 능력 및 약제 감수성을 나타냈다. 도 4에 나타낸 바와 같이, CFSEhi 및 CFSElo 집단 모두 마우스에서 종양이 발생되었지만, CFSEhi 집단은 CFSElo 집단에 비해 종양 발생이 지연된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 소수의 CSFEhi 집단이 명백하게 저성장(slow-cycling) 하위 집단임을 나타낸다.
한편, CFSEhi 집단과 CFSEhi 집단에 대응하는 CFSElo 집단의 유전자 발현 프로파일(profile)을 분석하여 SCCs와 관련된 것으로 추정되는 바이오마커를 평가하였다. RNA-Seq 분석 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 5개의 CFSEhi 집단에서 CFSEhi 집단에 대응하는 CFSElo 집단과 비교하여 319개의 유전자가 일관되게 상향 조절되거나 하향 조절되어 있는 것으로 나타났다 (|배수 변화(fold change)| ≥ 1.25). 도 6에 나타낸 바와 같이, 상향 조절된 유전자에 대한 유전자 온톨로지(gene ontology; GO) 분석은 자극에 대한 반응의 음성 조절 또는 세포 증식의 조절에 관여하는 유전자를 포함하여 다양한 유전자가 CFSEhi 집단에서 상당히 풍부하다는 것을 나타냈다. 대조적으로, 일반적으로 하향 조절된 유전자는 그러한 상관관계를 나타내지 않았다. 도 7에 나타낸 바와 같이, CFSEhi 집단에서 일반적으로 상향 조절된 유전자 및 증식과 세포 주기 조절과 관련된 유전자 산물에 대한 추가 분석은 11개의 유전자(RGS2, PRDM11, CCPG1, CLU, IER5, SIX3, MAP3K8, PDCD2L, ZNF703, BCL6, 및 LAMA5)가 일관되게 상향 조절되어 있음을 나타냈다. 실시간 PCR(real-time PCR) 분석을 수행하여 CFSEhi 집단에 대응하는 CFSElo 집단에 비해 CFSEhi 집단에서 이러한 유전자의 발현이 상향 조절되어 있음을 검증하였다. 또한, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 공개적으로 이용 가능한 데이터 세트 4개(NCBI의 GSE8894, GSE41271, GSE42127 및 GSE63074)를 이용하여 11개의 상향 조절된 유전자(RGS2, PRDM11, CCPG1, CLU, IER5, SIX3, MAP3K8, PDCD2L, ZNF703, BCL6, 및 LAMA5)와 5개의 세포 분열 관련 유전자(CDKN1A, CDKN1B, PCNA, MKI67, CDK2)의 관련성을 비교한 결과, RGS2 발현만이 증식 관련 유전자의 발현과 일관되고 유의하게 상관관계가 있다는 것을 확인하였다.
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도 8에 나타낸 바와 같이, RGS2 전사의 상향 조절은 3개의 NSCLC 세포주 및 4개의 PDX 종양에서 유래한 CFSEhi SCCs 모두에서 관찰되었다 (배수 변화=2.5, 7개의 CFSEhi SCCs의 평균). 나아가, 도 9에 나타낸 바와 같이, 원형질막에 통합되는 PKH26 염료를 사용하여 상기 결과들을 확인한 결과, CSFE로 표지된 세포의 PI는 PKH26으로 표지된 세포의 PI와 비슷하였고, PKH26lo 집단과 비교하여, PKH26hi 집단은 하향 조절된 증식, 감소된 Ki67 PI, 콜로니-형성 능력 및 화학요법 약물(파클리탁셀)-유도 세포 사멸에 대한 내성, 및 증가된 RGS2 mRNA의 발현을 나타냈다.
실험예 2. 세포 증식을 인코딩(encoding) 하는 유전자의 발현과 RGS2 발현의 음의 상관관계 및 NSCLC 환자의 열악한 임상 결과와 RGS2 발현의 양의 상관관계
2-1. NSCLC 환자의 임상
RGS2 발현이 NSCLC 환자의 임상 결과에서 영향을 미치는지 확인하기 위해 공개적으로 이용 가능한 데이터 세트(NCBI의 GSE30219)를 분석하였다. 그 결과, RGS2 mRNA의 발현과 NSCLC 조직학적 하위 유형 간에 유의미한 상관관계는 나타나지 않은 반면, 도 10에 나타낸 바와 같이, RGS2 mRNA 발현이 증가되어 있는 폐 선암종(lung adenocarcinoma) 환자의 전반적인 생존율 및 무병 생존율은 크게 감소한 것으로 나타났다.
2-2. 세포 증식 조절과 관련된 유전자
도 11에 나타낸 바와 같이, RGS2 발현과 세포 증식 조절과 관련된 유전자 사이의 상관 관계를 평가한 결과, MKI67(Ki67을 인코딩함), PCNA, 및 CDK2를 포함한 세포 증식 촉진에 관여하는 유전자의 발현과 RGS2의 발현 간에 유의미한 역(inverse) 상관관계를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 또한, RGS2 발현은 CDKN1A 및 CDKN1B와 같은 사이클린-의존성 키나제 억제제를 인코딩하는 유전자의 발현과 양의 상관관계가 있었다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 유전자 세트 증폭 분석(Gene set enrichment analysis; GSEA)은 증식과 관련된 유전자 세트가 RGS2hi 집단에서 억제되어 있는 반면, 산화 스트레스, 저산소증(hypoxia), 및 비-접힘 단백질 반응(Unfold Protein Response; UPR)과 같은 위험한 미세 환경에 대한 반응과 관련된 유전자 세트가 RGS2hi 집단에서 상당히 향상되어(오류 발견률(false discovery rate; FDR) < 25%) 있음을 나타냈다. 도 13에 나타낸 바와 같이, NSCLC TMA(tissue microarray)(n = 40)의 면역형광(immunofluorescence; IF) 분석을 수행하여 환자에서 RGS2 발현과 NSCLC 세포 증식 간의 상관관계를 추가로 검증한 결과, 조직에서 RGS2 발현과 Ki67 수준 사이에 상당한 역 상관관계를 나타냈다. 상기 결과로부터, RGS2가 세포 휴면의 중요한 조절자이며 NSCLC 환자의 불량한(poor) 예후에 대한 임상적으로 유용한 바이오마커임을 알 수 있다.
실험예 3. 반복적인 화학요법 노출로 RGS2 hi SCCs가 증가된 NSCLC 세포 및 PDX 종양 구축
NSCLC SCCs의 기능적 특징에서 RGS2의 역할을 확인하기 위해 RGS2hi SCCs를 확립하고자 하였다. 기능적으로 정의된 RGS2hi SCCs를 안정적으로 식별하는 기술이 없으므로, ACCs(actively cycling cancer cells, 폐암세포)를 표적으로 하는 화학요법 약물의 사용을 응용하였다. 구체적으로, 도 14에 나타낸 바와 같이, 인간 NSCLC 세포주(H460, H1299, SK-MES-1, H226B, 및 H1792) 패널을 임상에서 흔하게 사용되는 화학요법 약물인 파클리탁셀(Pc), 시스플라틴(cisplatin; Cs), 또는 페메트렉시드(pemetrexed; Pm)의 존재 하에 배양하였다. 3-4개월 동안 약물에 노출과 제거(휴약기)를 반복한 후, 대부분의 세포가 죽었지만 소수의 살아남은 하위 집단이 결국 콜로니를 형성한 것을 확인하였으며, 도 15a 내지 15c에 나타낸 바와 같이, 생존한 하위 집단은 화학요법 약물의 존재 하에서 생존력(viability), 콜로니-형성 능력, 및 세포 사멸 활성의 최소 변화에서 보여지는 바와 같이 높은 약제 내성을 나타냈다. 생존한 하위 집단은 2개의 그룹으로 분류할 수 있었다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 제1 그룹(H226B/PcR, H460/PmR 및 H1792/PmR)은 각각의 모세포와 유사한 증식 속도 및 RGS2 발현을 나타냈다. 대조적으로, 도 17 및 도 18에 나타낸 바와 같이, 제2 그룹(H460/PcR, H1299/CsR, H1299/PmR, 및 SK-MES-1/PcR[SK/PcR])은 세포자멸사(apoptotic cell death) 또는 자가포식의 감지가능한 징후 없이, 모세포와 비교하여 현저하게 감소된 증식과 콜로니-형성 능력, 및 RGS2의 전사 상향 조절을 나타내므로, 제2 그룹을 이용하여 추가 분석을 수행하였다.
하위 집단에서 표지를 유지하는 세포가 있는지 확인하기 위해, 화학 요법 내성 하위 집단 및 대응되는 모세포를 CSFE로 표지한 다음 배양 중 표지를 유지하는 초과 시간을 모니터링한 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, 화학요법 내성 하위 집단은 최대 10일 동안 해당 모세포보다 뚜렷하게 더 많은 표지 유지를 나타냈다. 도 20에 나타낸 바와 같이, 이러한 하위 집단은 형태학적 변경(즉, 세포 평탄화 및 액포화(vacuolization)) 또는 SA-β-gal(senescence-associated β-galactosidase) 활성화를 포함하는 감지가능한 노화 관련 변화 없이, Ki67 PI, cyclin D1 및 CDK4 발현에서 현저한 감소와 p27과 p21 발현, p38 인산화 및 ERK1/2 탈인산화에서 증가에 의해 입증된 바와 같이 노화(senescence) 보다는 정지(quiescence) 상태에 있는 것으로 확인되었다. 또한, 도 21에 나타낸 바와 같이, 해당 모세포와 비교하여, 이들 하위 집단은 에너지 대사와 관련된 산소 소비율(oxygen consumption rate; OCR)/세포외 산성화율(extracellular acidification rate; ECAR) 및 각각, CAP-의존성 및 CAP-비의존성 단백질 번역을 반영하는 Renilla and firefly luciferase reporter activities의 감소, 및 초기(de novo) 단백질 합성을 반영하는 메티오닌 유사체(methionine analog)의 포함 감소에 의해 입증되는 바와 같이, 대사 활성 및 mRNA 번역의 감소를 나타냈다. 나아가, 종양 형성 능력을 마우스에서 분석한 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이, H460/PcR, H1299/CsR, 및 H1299/PmR 세포는 해당 모세포와 비교하여 현저하게 지연된 종양 발병으로 종양을 발달시켰고, 일단 종양이 발병하면, 가파르게 증가된 성장률과 약제 내성을 나타냈다. 따라서, 이러한 하위 집단은 허용되는 생체 내 미세 환경이 재발성 종양 성장을 지원할 때까지 느린 순환(slow-cycling) 상태로 유지되는 것으로 나타났다. 상기 결과로부터, H460/PcR, H1299/CsR, H1299/PmR, 및 SK/PcR 하위 집단이 NSCLC에서 기능적 SCCs의 그룹을 나타냄을 알 수 있다. SK/PcR 세포는 종양 주사 후 100일 이내에 이종이식 종양을 생성하지 못했으므로, H460/PcR, H1299/CsR, 및 H1299/PmR 하위 집단을 전임상 모델로 사용하여 하기의 RGS2hi SCCs의 생물학과 관련된 분석을 수행하였다.
실험예 4. RGS2의 SSC 정지-유사(quiescence-like) 표현형 및 ER(endoplasmic reticulum)-스트레스 유도 세포자멸사(apoptosis)에 대한 생존 촉진
4-1. SCCs의 정지-유사 표현형
SCCs의 정지-유사 표현형에서 RGS2의 역할을 확인하기 위해, RGS2 mRNA의 다른 영역을 표적으로 하는 shRNA(H460/PcR-shRGS2)로 안정적인 형질감염에 의해 RGS2 발현을 억제한 H460/PcR 세포 및 RGS2가 강제 과발현된 H460 세포(H460-RGS2)를 사용하였다. 도 23에 나타낸 바와 같이, 대조군 세포(H460/PcR-shEV)와 비교하여, 2개의 다른 H460/PcR-shRGS2 세포는 증식, Ki67 PI, 및 콜로니-형성 능력에서 상당한 증가를 나타냈다. 더욱이, 도 24에 나타낸 바와 같이, H460/PcR-shRGS2는 H460/PcR-shEV 세포와 비교하여 cyclin D1, CDK4 및 PCNA의 발현 수준에서 증가를 나타냈다. 반대로, H460-RGS2 세포는 대조군 세포(H460-EV)와 비교하여 상기 단백질의 발현 수준에서 감소를 나타냈다. 또한, H460/PcR-shEV 세포와 비교하여, H460/PcR-shRGS2 세포는 OCR/ECAR, CAP-의존성 및 CAP-비의존성 단백질 번역, 새로운 단백질 합성의 증가를 나타낸 반면, 이러한 모든 활성은 H460-EV 세포와 비교하여 H460-RGS2 세포에서 감소하였다. 상기 결과로부터, RGS2 발현이 SCCs에 정지-유사 표현형을 부여함을 알 수 있다.
4-2. ER-스트레스 유도 세포자멸사
화학 요법에 의한 DNA 손상, ER 칼슘 고갈, 및 저산소증과 같은 지속적인 ER-스트레스가 세포자멸사를 유도할 수 있다는 점을 고려하여, SCCs가 ER-스트레스로 인한 세포자멸사를 유발하는 조건에서 생존을 보장하는 독특한 기전(mechanism)을 발전시킬 수 있는 것으로 예측하였다. 실제로, 도 25에 나타낸 바와 같이, SCCs는 ER-스트레스 요인인 탑시가르긴(thapsigargin; TG)과 저산소증 하에 caspase-3 및 PARP 절단의 최소 변화와 하위 G1기 세포의 낮은 수에 의해 보여지는 바와 같이, ER-스트레스 유도 세포자멸사를 피할 수 있는 능력을 나타냈다. 흥미롭게도, 도 26에 나타낸 바와 같이, H460-EV 세포와 비교하여 H460-RGS2 세포는 TG, 저산소증, 및 파클리탁셀(Pc)에 대해 상당히 증가된 생존 능력을 나타냈다. 반대로, 도 27에 나타낸 바와 같이, H460/PcR-shEV 세포와 비교하여 H460/PcR-shRGS2 세포는 TG 및 파클리탁셀(Pc)-유도 스트레스에 대해 극적으로 감소된 생존 능력을 나타냈다. 일관되게, 도 28에 나타낸 바와 같이, CRISPR/Cas9 시스템으로 RGS2 발현을 억제한 2개의 다른 H460/PcR 세포에서도 증식, Ki67 PI, anchorage-의존 및 anchorage-비의존 콜로니-형성 능력, 및 단백질 번역이 크게 증가했으나, TG 또는 파클리탁셀 처리에 대한 반응으로 세포자멸사가 나타났다.
한편, 도 29에 나타낸 바와 같이, 마우스에 H460/PcR-shRGS2 또는 H460/PcR-shEV를 주입하였을 때, H460/PcR-shRGS2 세포는 H460/PcR-shEV 세포와 비교하여 현저히 지연된 종양 발달을 나타냈다. 구체적으로, 주입 후 29일차에 H460/PcR-shEV 세포가 주입된 마우스 모두에서 종양이 발생했으나, H460/PcR-shRGS2 세포가 주입된 마우스의 경우 종양이 발생한 마우스는 한 마리였다. H460/PcR-EV 또는 H460/PcR-shRGS2 이종이식된 모든 마우스에서 주입 후 37일차에 종양이 형성된 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 도 30에 나타낸 바와 같이, H460/PcR-shRGS2 종양은 H460/PcR 종양보다 부피가 상당히 작았다. 또한, 도 31에 나타낸 바와 같이, H460/PcR-shRGS2 이종이식된 종양은 스크램블(scramble)된 shRNA로 형질감염된 H460/PcR 세포가 주입된 종양과 비교하여 현저하게 지연된 성장을 나타냈다. 따라서, RGS2는 저산소증 및 포도당 결핍과 같은 다양한 ER-스트레스를 특징으로 하는 생체 내 미세 환경에서 SCCs에 생존 능력을 부여하는 것으로 나타났다. 상기 결과로부터, RGS2 발현이 ER-스트레스 유도 세포자멸사에 대한 SCCs의 생존 능력을 허용할 수 있다는 것을 알 수 있다.
실험예 5. SCCs에서 억제되며 ER-스트레스 동안 변하지 않고 유지되는 ATF4발현
SCCs에서 RGS2의 기능적 역할을 매개하는 기전(mechanism)을 확인하고자 하였으며, RGS2 발현이 SCCs가 자가 재생, 및 종양 개시 잠재성을 나타내는 암 줄기 세포(cancer stem cells; CSCs)의 능력을 가지도록 하고 약제 내성을 유도하는 것으로 예측하였다. 그러나, CSC-관련 마커 및 상피-중간엽 전이(epithelial-mesenchymal transition)-관련 마커의 발현, 구체(sphere)-형성 능력, 및 알데하이드탈수소효소(aldehyde dehydrogenase) 양성을 포함한 CSC-관련 기능적 특징은 모세포와 비교하여 확립된 RGS2hi SCCs에서 최소한으로 변화하였다. 또한, SCCs에서 UPR의 PERK, ATF6, 및 IRE1α branch와 관련된 유전자의 발현 수준을 모니터링한 결과, 도 32에 나타낸 바와 같이, ATF6, ERN1, 및 ATF6 및 IRE1α branch의 표적 유전자 시그니처(signature)가 대응하는 모세포와 비교하여 3개의 SCCs에서 거의 일관되게 상향 조절된 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, UPR의 ATF6 및 IRE1α branch가 ER-스트레스가 있는 환경에서 단백질 접힘 항상성(proteostasis)을 보장하기 위해 SCCs에서 활성화되는 것을 알 수 있었다. 도 33에 나타낸 바와 같이, SCCs는 대응하는 모세포와 비교하여 DDIT3 및 PPT1R15A를 포함한 ATF4 및 ATF4 표적 유전자의 하향 조절과 함께 더 높은 수준의 phospho-eIF2α(peIF2α)를 나타냈다. ER 스트레스는 PERK 및 eIF2α 인산화를 유도하고, 이는 우선적으로 ATF4의 번역으로 이어지며, 도 34에 나타낸 바와 같이, SCCs 및 각각의 대응하는 모세포는 TG에 노출 시 PERK 인산화를 나타냈다. 그러나, 대응되는 모세포와 다르게 SCCs는 ER 스트레스 요인에 대한 반응으로 eIF2α의 인산화 및 ATF4, CHOP, 및 GADD34의 단백질 수준에서 최소한의 변화를 나타냈다. 일관되게, 도 35에 나타낸 바와 같이, 화학요법 약물에 대한 노출은 3개의 SCCs에서 ATF4 표적 유전자 발현, eIF2α 인산화, 및 ATF4 수준에 대한 최소한의 효과를 유도하였다. 따라서, 상류에 있는(upstream) PERK branch는 하류에 있는(downstream) 표적 유전자에서 분리된 것으로 나타났다. ER 스트레스 하에서 일시적인 억제 및/또는 세포자멸사 유도 후, 단백질 합성의 회복에서 ATF4의 역할에 기초하여, ATF4 발현에 대한 조절 기전이 SCCs가 ER 스트레스 환경에서 생존을 유지할 수 있도록 함을 알 수 있다.
실험예 6. ATF4-매개 단백질 합성을 억제하여 ER 스트레스 유도 세포자멸사를 피하는 SCCs
ATF4-매개 mRNA 번역은 발현 수준에 따라 스트레스를 받은 세포에서 항-세포자멸사 또는 세포자멸사 활성을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 실제로, 도 36에 나타낸 바와 같이, 유도된 ATF4 발현은 H460/PcR 세포에서 mRNA 번역의 용량-의존적 증가를 야기하였다. 나아가, ATF4 발현을 중간 수준으로 회복시키면 H460/PcR 세포의 증식이 촉진되었다. 대조적으로, 도 37에 나타낸 바와 같이, 강제 ATF4 과발현을 통한 번역의 과부하는 절단된 caspase-3 및 PARP의 증가로 나타났으며, 세포자멸사를 통한 세포 증식의 감소를 야기하였다. 또한, 도 38에 나타낸 바와 같이, ATF4-유도 세포자멸사는 mTOR 억제제(rapamycin) 또는 ROS 제거제[N-acetyl-L-cysteine(NAC)] 처리에 대한 반응으로 현저하게 약화되었다. 상기 결과로부터, ATF4의 하향 조절에 의해 나타나는 단백질 합성의 지속적인 감소가 ER 스트레스 원인에 노출되는 동안 SCCs에 세포 휴면 및 생존 능력을 부여함을 알 수 있다.
실험예 7. ATF4에 결합하여 프로테아좀(proteasome) - 매개 분해를 유도하는 RGS2
RGS2hi SCCs에서 ATF4의 하향 조절을 보여주는 상기 결과 및 RGS2와 ATF4 사이의 조절 연결(modulatory link)을 제안하는 이전 연구 결과를 기초로, ATF4 발현의 조절에 RGS2가 잠재적으로 관여함을 가정하였다. 실제로, 도 39에 나타낸 바와 같이, H460/PcR-shRGS2 세포는 H460/PcR 세포와 비교하여 감소된 수준의 eIF2α 인산화와 함께 ATF4 단백질 및 ATF4 표적 유전자 발현의 증가된 수준을 나타냈다. H460 세포와 비교한 H460-RGS2 세포의 이러한 차이는 H460/PcR 세포와 비교하여 H460/PcR-shRGS2 세포에서 관찰된 것과 반대의 결과를 나타냈다. 상기 결과로부터, ATF4 발현에서 RGS2의 역할을 명확히 알 수 있었다.
한편, RGS2가 ATF4 발현을 조절하는 기전을 확인하고자 하였다. 도 40에 나타낸 바와 같이, ATF4 전사는 SCCs와 대응하는 모세포, H460/PcR-shRGS2와 H460/PcR 세포, 또는 H460-RGS2와 H460 세포 간에 차이가 없었다. RGS2는 단백질 합성에서 조절 역할을 하였다. 그러나, 도 41에 나타낸 바와 같이, H460-RGS2 및 H460 세포는 ATF4 단백질의 초기(de novo) 합성 속도에서 유사한 비율을 나타냈다. 흥미롭게도, 도 42에 나타낸 바와 같이, ATF4 단백질의 반감기는 그들의 대응하는 대조군 세포에서보다 RGS2-형질감염된 H460 및 H1299 세포에서 상당히 짧았다. 더욱이, 도 43에 나타낸 바와 같이, MG132 전처리는 대조군 세포와 비교하여 H460/PcR 세포 및 RGS2-형질감염된 H460 세포에서 ATF4의 폴리유비퀴틴화된(polyubiquitinated) 형태의 수준을 증가시켰다. 대조적으로, shRNA-매개 RGS2의 적제는 H460/PcR 세포에서 ATF4 폴리유비퀴틴화를 억제하였다. 도 44에 나타낸 바와 같이, MG132 처리에(4시간 동안 10μM) 의해 프로테아좀 기계(proteasome machinery)가 비활성화된 H460/PcR 세포를 사용한 공동면역침전 분석(Coimmunoprecipitation assay)은 ATF4와 RGS2 사이의 연관성을 보여주었다. 도 45에 나타낸 바와 같이, MG132 처리 전에 형질감염에 의해 RGS2 발현이 강화된 H460 세포는 RGS2 및 ATF4 연관성을 확인하였다. 공동면역침전 분석을 실시하지 않은 단백질을 나타내는 입력 레인(input lane)과의 비교를 통해 MG132 프로테아좀 억제제 처리가 RGS2-형질감염된 H460 세포에서 ATF4 발현을 회복시킴을 보여주었다.
ATF4 결합 능력을 부여하는 RGS2 내의 활성 도메인을 확인하기 위해, 도 46에 나타낸 바와 같이, 전체(full-length; FL) RGS2 및 카르복실 말단의 일부(△C79 및 △C169) 또는 RGS2(△N79)의 상류 잔기가 결실된 3개의 결실 돌연변이를 운반하는 박테리아 발현 벡터를 생성하였다. 박테리아 단백질을 사용한 풀다운 분석(pulldown assay)은 전체 RGS2 및 2 RGS2 돌연변이(△C79 및 △C169) 모두가 H460 세포 용해물에서 ATF4와 연관되어 있음을 나타냈다. 대조적으로, 도 47에 나타낸 바와 같이, RGS2의 상류에 잔기가 없는 절단(truncation) 돌연변이(△N79)는 ATF4와 결합하지 못하였다. 또한, 도 48에 나타낸 바와 같이, 단백질 번역은 공 벡터-형질감염(EV(empty vector)-형질감염) 또는 △N79-형질감염 세포와 비교하여 전체 RGS2-형질감염 또는 △C79-형질감염 H460 세포에서 현저하게 억제되었다. 상기 결과는 RGS2 N-말단 잔기(1-79)를 통한 RGS2와 ATF4 사이의 상호작용이 ATF4 프로테아좀 분해를 매개하여 NSCLC SCCs에서 전반적인(global) mRNA 번역의 장기간 억제를 유도함을 나타낸다.
실험예 8. NSCLC PDX에 존재하며 화학 요법 동안 증가하는 RGS2 hi /ATF4 lo SCCs
상기 결과들은 SCCs가 높은 RGS2 발현 및 낮은 ATF4 발현(RGS2hi/ATF4lo)을 특징으로 하며 ER 스트레스를 피할 수 있음을 나타냈다. 따라서, 생체 내 화학 요법 동안 잔여 폐 종양 내에서 RGS2hi/ATF4lo SCCs가 나타나는지 확인하고자 하였다. 웨스턴 블롯 및 IHC 분석 결과, 도 49에 나타난 바와 같이, 임상적으로 관련된 조합 화학요법으로 3회 처리된(즉, 1일 동안 파클리탁셀(Pc)/시스플라틴(Cs) 처리 후 6일 동안 휴약기를 갖는 7일 요법) NOD/SCID 마우스의 잔여 H460 이종이식 종양 및 C57BL/6 마우스의 마우스 폐암 세포주(LLC) 동종이식 종양은 대응되는 비히클(vehicle)-처리 대조군 종양과 비교하여 현저하게 증가된 RGS2 및 감소된 ATF4 단백질 수준을 나타냈다.
상기 결과의 임상적 관련성을 검증하기 위해, 도 50에 나타낸 바와 같이, RGS2hi/ATF4lo 약물-내성 SCCs가 인간 원발성(primary) NSCLC 종양에 존재하고 화학요법 동안 선택되었는지 여부를 평가하였다. 잔여 인간 폐 종양 조직을 샘플링하는데 기술적인 어려움이 있으므로, 화학요법 전후에 3개의 다른 NSCLC PDX 종양에서 RGS2hi/ATF4lo 집단을 모니터링 하였다. 도 13의 NSCLC TMA 분석 결과와 일치하게, 도 51에 나타낸 바와 같이, RGS2와 Ki67 발현 사이에 역(inverse) 상관관계가 PDX 모델에서 나타났다. 임상적으로 관련된 조합 화학요법을 3회 순환하는 동안, PDX 종양은 22일 이내에 원래 부피의 50% 미만으로 축소되었다. ATF4+ 세포가 IHC 분석에 의해 기준선에서 약물-비노출(drug-naive) 종양으로 검출 가능할지라도, 화학요법 동안 그 수는 감소하였다 (평균 2.5배). 반대로, 화학요법 동안 기준선 종양과 비교하여 잔여 종양에서 RGS2+ 세포는 시간-의존적으로 증가하는(평균 5배) 것을 관찰할 수 있었다. 상기 결과는 잔류 종양 병변(lesion) 내에 별개의 RGS2hi/ATF4lo 하위 집단이 화학요법 동안 선택됨을 나타낸다.
실험예 9. RGS2 hi /ATF4 lo SCCs에서 세포자멸사를 유도하고 종양 재발을 억제하는 RGS2의 억제
상기 결과들을 임상과 연결하기 위해, 화학요법 후 종양 재발에 대한 RGS2 상실의 효과를 확인하였다. 도 52에 나타낸 바와 같이, 화학요법 동안 명백하게 퇴행했던 H460 이종이식 종양은 화학요법 중단 후 성장을 재개하였다. 도 53에 나타낸 바와 같이, 리포솜-캡슐화 siRNA 주입에 의한 RGS2 억제는 종양에서 절단된 caspase-3 수준의 IHC 분석에 의해 입증된 바와 같이, 세포자멸사를 유도함으로써 잔여 이종이식 종양의 성장을 유의하게 억제하였다. 또한, 도 54에 나타낸 바와 같이, siRNA-매개 RGS2 상실은 H460/PcR-매개 이종이식 종양의 성장을 억제하였다. 또한, 도 55에 나타낸 바와 같이, RGS2 siRNA와 파클리탁셀(Pc)을 함께 처리한 후 향상된 항-종양 활성을 관찰할 수 있었다. 도 56에 나타낸 바와 같이, 2개의 다른 PDX 모델에서도 유사한 결과를 나타냈다. 상기 결과는 SCCs-유래 종양 재발을 억제하고 약물 감수성을 회복하기 위해 RGS2를 표적화할 수 있음을 나타낸다.
실험예 10. 번역 조절의 방해는 SCCs를 ER 스트레스-유도 세포자멸사에 민감하게 하고 화학요법과 함께 시험관 내( in vitro ) 및 생체 내( in vivo )에서 SCCs의 박멸을 촉진함
RGS2를 표적으로 하는 항암제는 현재 구할 수 없으므로, 번역 프로그램을 복원할 수 있는 임상적으로 사용 가능한 치료제를 찾기 위해 FDA-승인 약물 목록(1,622개 화합물)을 검색하였다. 골격근에서 단백질 합성을 활성화할 수 있는 PDE5 억제제(실데나필(sildenafil) 및 타다라필(tadalafil))에 초점을 맞추었다. 실제로, 도 57에 나타낸 바와 같이, PDE5 억제제는 SCCs에서 단백질 합성의 용량-의존적 증가를 유도하고, 정지 특성(예를 들어, 상향 조절된 p38 인산화, p21 및 p27 발현 증가, ERK 인산화 및 cyclin D1 발현 감소)을 억제하였다. 특히, 도 58에 나타낸 바와 같이, PDE5 억제제 단독 치료와 비교하여 PDE5 억제제와 파클리탁셀(Pc)의 병용 치료는 세포자멸사를 유도함으로써 H460/PcR 세포의 생존력 및 콜로니-형성 능력을 현저하게 억제하였다. 일관되게, 도 59에 나타낸 바와 같이, PDE5 억제제와 유사하게 작용하는 cGMP 유사체인 db-cGMP(dibutyryl-cyclic GMP)와 파클리탁셀(Pc)의 병용 치료는 db-cGMP 단독 치료에 비해 H460/PcR 세포의 콜로니-형성 능력을 더 크게 억제하는 것으로 나타났다. 인슐린 신호전달 경로에 대한 cGMP 신호전달의 효과와 일관되게, 이러한 억제제는 Akt, mTOR, 및 4E-BP1 인산화를 증가시켰으며, 이는 단백질 합성에 대한 이들 약물의 효과가 PI3K/ Akt/mTOR 신호 전달 및 후속 4E-BP1 인산화에 의해 매개되는 것을 나타낸다. 도 60에 나타낸 바와 같이, 세포자멸사는 라파마이신(rapamycin) 또는 NAC 처리로 현저하게 약화되었으며, 이는 증가된 단백질 합성 및 ROS 생성이 실데나필 및 파클리탁셀(Pc) 처리된 H460/PcR 세포에서 세포자멸사의 주요한 동인임을 나타낸다.
한편, 생체 내에서 화학요법과 함께 실데나필의 치료 효과를 확인하였다. 실데나필과 타다라필의 시험관 내(in vitro) 치료 결과는 유사하였으므로, 생체 내(in vivo) 실험에서 실데나필만 사용하였다. 생체 내 SCCs의 성장에 대한 병용 치료의 효과를 확인하기 위해 NSCLC 세포 주입 1주 이내에 마우스에 약물 치료를 시작하였다. 도 61에 나타낸 바와 같이, 단일 치료와 비교하여, 실데나필과 화학요법의 병용 치료는 H460/PcR 및 H1299/CsR 이종이식 종양 및 PDX 종양의 생육(outgrowth)을 유의하게 억제하였다. 도 62a 및 도 62b에 나타낸 바와 같이, 종양의 IHC 분석은 다른 치료와 비교하여 병용 치료가 caspase-3 절단에서 통계적으로 유의한 증가를(비히클-처리 대조군과 비교하여 평균 20배 증가) 유도함을 나타냈다. 나아가, 부피가 약 200 mm3인 H460/PcR 이종이식 종양을 보유하는 마우스에서 병용 치료의 효능을 평가한 결과, 도 63에 나타낸 바와 같이, 단독 치료와 비교하여 병용 치료는 확립된 종양에서 유의미한 성장 억제를 유도하였다. 도 64에 나타낸 바와 같이, 병용 요법은 PDE5 억제제 단독 요법 또는 비히클 치료에서 볼 수 있는 것보다 많은 체중 감소를 나타내지 않았다. 상기 결과는 PDE5 억제제에 의한 단백질 합성 복원이 SCCs에 추가적인 ER 스트레스를 가하여 화학요법에 의한 박멸을 촉진하고 궁극적으로 생체 내 종양 재발을 예방함을 나타낸다.
실험예 11. 에보디아민(Evodiamine; Evo)의 RGS2 억제
에보디아민에 의한 RGS2 단백질의 발현 조절 작용을 확인하기 위해, 항암제에 내성을 나타내는 SCCs인 H460/PcR, H1299/CsR, 및 H1299/PmR에 에보디아민 5 μM을 2일 동안 처리한 후 웨스턴 블롯을 실시하였다. 그 결과, 도 65에 나타낸 바와 같이, 에보디아민에 의해 SCCs에서 RGS2 발현이 감소된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 에보디아민이 RGS2 단백질 발현을 조절하는 기전을 확인하기 위해, H460/PcR 및 H1299/CsR에 에보디아민 5 μM을 2일 동안 처리한 후, 단백질 합성을 저해하는 사이클로헥시미드(cycloheximide; CHX) 100 μg/mL을 일정한 시간 간격을 두고 최대 12시간까지 처리한 뒤, 웨스턴 블롯을 실시하였다. 도 66에 나타낸 바와 같이, 사이클로헥시미드를 처리하여 RGS2 단백질이 더 이상 합성되지 못하도록 한 상태에서 비히클(DMSO) 또는 에보디아민(Evo)을 처리할 경우, 비히클-처리 대조군 (Con)에서는 RGS2 단백질 발현이 사이클로헥시미드를 처리한 상태에서도 일정 수준으로 유지된 반면, 에보디아민을 처리할 경우 RGS2의 발현이 사이클로헥시미드 처리 시간이 증가됨에 따라 뚜렷하게 감소된 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 에보디아민은 RGS2 단백질의 안정성 억제를 통해 RGS2의 발현을 억제함을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
본 발명자들은 폐암 재발의 원인이 되는 저성장 암세포에서 유의적으로 RGS2가 증가되어 있고 ATF4가 감소되어 있는 것을 확인하였는바, RGS2 및 ATF4의 발현 또는 활성 수준을 측정함으로써 쉽고 빠르게 폐암 재발의 가능성을 예측할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명자들은 RGS2의 발현을 소실시키거나 RGS2의 단백질 합성 저해 작용을 차단함으로써 저성장 암세포의 성장을 억제하고 세포자멸사를 유도할 수 있음을 확인하였는바, RGS2 발현 또는 활성을 억제하는 폐암 재발 억제용 치료제의 의약품 개발에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대되는바, 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (27)

  1. RGS2(regulator of G protein signaling 2) 및 ATF4(activating transcription factor 4) 단백질; 또는 이들의 mRNA의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 폐암 재발 예측용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는, 폐암 재발 예측용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 폐암 재발 예측용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 페암은 비소세포폐암(non-small cell lung cancer; NSCLC)인 것을 특징으로 하는, 폐암 재발 예측용 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폐암 재발 예측용 조성물을 포함하는, 폐암 재발 예측용 키트.
  6. 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 RGS2(regulator of G protein signaling 2) 및 ATF4(activating transcription factor 4) 단백질; 또는 이들의 mRNA의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 폐암 재발 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 피검체는 폐암 완치 환자 또는 폐암 치료 후 질병증거가 없는 환자인 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 소변, 타액, 조직, 세포, 기관, 골수, 중심부바늘생검(core needle biopsy) 검체, 및 진공흡입생검 검체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 방법은 폐암세포와 비교하여 RGS2 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 또는 활성 수준이 증가하고,
    ATF4 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 또는 활성 수준이 감소한 경우 폐암 재발의 위험성이 높은 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 단백질 발현 수준은 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(Rocket immunoelectrophoresis), 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 질량분석법(Mass spectrometry), FACS, 및 단백질칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. 제6항에 있어서,
    상기 mRNA 발현 수준은 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블롯팅(northern blotting), 서던 블롯팅(southern blotting), In situ 교잡법, 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. RGS2(regulator of G protein signaling 2)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 폐암 재발 억제용 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 발현 억제제는 에보디아민(evodiamine; Evo) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; RGS2 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA, 및 이를 포함하는 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 에보디아민 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 RGS2 단백질의 안정성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 활성 억제제는 PDE5 억제제(phosphodiesterase type 5 inhibitor), 및 RGS2 단백질과 특이적으로 결합하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 PDE5 억제제는 RGS2의 단백질 합성 저해 작용을 차단하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 PDE5 억제제는 실데나필(sildenafil; sild), 타다라필(tadalafil; tada), 바데나필(vardenafil), 미로데나필(mirodenafil), 유데나필(udenafil), 아바나필(avanafil), 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 PDE5 억제제는 항암제와 병용 투여되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel; Pc), 시스플라틴(cisplatin; Cs), 및 페메트렉시드(pemetrexed; Pm)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  20. 에보디아민(evodiamine; Evo) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 폐암 재발 억제용 약학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 에보디아민 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 RGS2 단백질 안전성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 폐암 재발 억제용 약학적 조성물.
  22. RGS2(regulator of G protein signaling 2)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 폐암 재발 억제 방법.
  23. RGS2(regulator of G protein signaling 2)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 폐암 재발 억제 용도.
  24. RGS2 (regulator of G protein signaling 2)의 발현 또는 활성 억제제의 폐암 재발 억제용 약제 제조를 위한 용도.
  25. 에보디아민 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 폐암 재발 억제 방법.
  26. 에보디아민 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물의 폐암 재발 억제 용도.
  27. 에보디아민 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 폐암 재발 억제용 약제 제조를 위한 용도.
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