WO2022244783A1 - 血中フェニルアラニン定量方法、及びそれに使用する測定キット - Google Patents

血中フェニルアラニン定量方法、及びそれに使用する測定キット Download PDF

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繁夫 呉
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Definitions

  • the present invention relates to a method for quantifying the concentration of phenylalanine contained in blood.
  • the present invention also relates to a measurement kit for use in said method.
  • the present invention relates to a method for easily confirming and managing the blood phenylalanine concentration of a patient with phenylketonuria using the method or the kit at a bedside or in a place other than a medical institution.
  • Phenylketonuria is caused by a decrease in the activity of phenylalanine hydroxylase (hereinafter also referred to as "PAH") in the body, which prevents phenylalanine (hereinafter also referred to as “Phe”) from being metabolized into tyrosine and Phe in the body. It is one of the congenital amino acid metabolism disorders that accumulate. Sustained marked elevation of Phe levels in infancy causes severe mental retardation. By controlling the blood Phe concentration within a certain range, retardation of mental development can be prevented and normal intellectual development can be achieved. Therefore, it is necessary for patients with phenylketonuria to adjust the amount of Phe ingested by diet therapy, using the blood Phe concentration as a biomarker.
  • Phe phenylalanine hydroxylase
  • the blood Phe concentration is easily affected by the amount of Phe contained in the diet, and the Phe tolerance depends on the PAH activity of the individual. , it is necessary to finely adjust the amount of Phe ingested. For this purpose, it is required that the blood Phe concentration can be measured simply and quickly at the patient's bedside or in a place other than a medical institution in daily life.
  • the method for measuring blood Phe concentration that can be used in clinical practice is the HPLC method.
  • this method requires at least one week to obtain the results, it is not suitable as a measuring method in situations where immediate evaluation is required, such as adjustment of the amount of Phe ingested in dietary therapy.
  • mass spectrometry used in neonatal mass screening.
  • this method requires pretreatment of the specimen and requires a large-sized analytical instrument, so it cannot be used for testing outside medical institutions.
  • phenylketonuria As a method for diagnosing phenylketonuria, conventionally, Phe labeled with a carbon isotope is administered orally or by injection to a subject, and phenylketonuria is detected by changes in the amount of carbon isotope contained in exhaled breath.
  • Patent Document 1 A method for diagnosis (Patent Document 1), and using a dehydrogenase, a coenzyme, an electron mediator, and a tetrazolium salt specific to L-phenylalanine in a biological sample as reaction reagents, an enzymatic reaction between the biological sample and the reaction reagent, and A method has been proposed for quantifying L-phenylalanine in a biological sample by producing formazan through an oxidation-reduction reaction and detecting it optically and/or electrochemically (Patent Document 2).
  • the former method has the problem that a mass spectrometer is required for measuring the amount of carbon isotopes.
  • the latter is a method that can easily and quickly test for phenylketonuria, but it can simultaneously test for three congenital metabolic disorders: galactosemia, maple syrup urine disease, and phenylketonuria.
  • This method differs in principle from the measuring method of the present invention, which will be described later.
  • an object of the present invention is to provide a method for measuring the blood Phe concentration simply and quickly.
  • Another object of the present invention is to provide a measurement kit for use in the above method.
  • a further object of the present invention is to provide a method for managing the blood Phe concentration in patients with phenylketonuria.
  • PAL phenylalanine ammonia lyase
  • the collected capillary blood was once allowed to coexist with an alkaline buffer, and after gasifying and volatilizing the ammonium ions contained therein, PAL By reacting with, it was confirmed that the Phe concentration in venous blood can be measured accurately while using capillary blood as test blood. Moreover, even when venous blood is used as the test blood, the blood Phe concentration of the subject can be measured with higher accuracy by gasifying and removing the ammonium ions present therein in advance.
  • the present invention has been completed through the accumulation of such studies, and has the following embodiments.
  • Method for quantifying blood Phe concentration (I-1) A method for quantifying blood Phe concentration in a subject using a test piece comprising at least two sheet-shaped members, comprising: The test piece reacts with a first sheet-like member (hereinafter sometimes referred to as "first member") provided with a sample-holding layer containing an alkaline buffer and ammonia gas to change color.
  • first member a first sheet-like member
  • sample-holding layer containing an alkaline buffer and ammonia gas
  • a second sheet-like member having an indicator layer (hereinafter sometimes abbreviated as "second member") is laminated in a peeled or peelable state,
  • the quantification method is a method having the following steps (A) to (D), a method for quantification of blood Phe concentration:
  • the first member is laminated on the second member so that the sample holding layer and the indicator layer of the second member overlap in a non-contact state, and a PAL-containing liquid is dropped onto the sample holding layer, and the process of leaving time,
  • C the step of measuring the ammonia concentration in the test blood from the degree of color of the indicator layer of the second member
  • D the step of calculating the blood Phe concentration of the subject from the ammonia concentration.
  • the alkaline buffer in the sample holding layer of the first member is an alkaline buffer containing boric acid and sodium hydroxide;
  • the content of boric acid and sodium hydroxide in the sample holding layer of the first member is 0.40 to 0.45 mg and 0.15 to 0.20 mg per member, respectively;
  • the bromcresol green content in the indicator layer of the second member is 0.3 to 0.5 mg per member,
  • the amount of test blood dropped onto the sample holding layer in step (A) is at least 10 ⁇ l,
  • the amount of PAL in the PAL-containing liquid dropped onto the sample holding layer in the step (B) is at least 2 mU;
  • the blood Phe concentration that can be calculated in the step (D) is 0 to 1400 ⁇ M, preferably 0 to 437 ⁇ M.
  • (I-4) The method for quantifying blood phenylalanine according to (I-2) or (I-3), wherein the step (C) is a step of measuring the absorbance of the color of the indicator layer at a wavelength of 635 nm.
  • (I-5) The method for quantifying blood Phe according to any one of (I-1) to (I-4), wherein the blood (test blood) collected from the subject is capillary blood.
  • (I-6) The method for quantifying blood Phe according to any one of (I-1) to (I-5), wherein the subject is a patient with phenylketonuria.
  • kits containing (a) to (c) (a) a first member provided with a sample holding layer containing an alkaline buffer; A test piece in which two members are laminated in a peeled or peelable state, (b) PAL, and (c) solvent.
  • III-1 Method for managing blood Phe concentration in patients with phenylketonuria, comprising: The blood Phe level according to any one of (I-1) to (I-6) is periodically or irregularly measured at a place other than a medical institution, using capillary blood of a phenylketonuria patient as test blood. The management method, wherein a quantification method is implemented. (III-2) The management method according to (III-1), wherein the method for quantifying the blood Phe is carried out using the kit according to (II-1) above.
  • the blood Phe concentration of a subject can be measured simply and quickly at the site of blood collection. Moreover, according to the method of the present invention, even when a small amount of blood (capillary blood) from a fingertip is used as the test blood, the Phe concentration in the venous blood or plasma of the subject can be obtained with high accuracy. Therefore, the method of the present invention can be used for screening for early detection of phenylketonuria in newborns, bedside monitoring of blood Phe concentration in patients with phenylketonuria, and in daily life at places other than medical institutions. Therefore, it can be effectively used for monitoring and managing blood Phe concentration, especially in diet therapy.
  • FIG. 1 shows a reaction schematic diagram showing the measurement principle of the present invention.
  • FIG. 1 shows the results of measuring the ammonia concentration ( ⁇ M) in capillary blood (test blood) collected from a fingertip using an Amicheck and an ammonia meter in Reference Experimental Example 1.
  • FIG. 2 In Reference Experimental Example 2, after dropping capillary blood (test blood) collected from the fingertip on the sample holding layer of the spacer portion of Amicheck, the time (0 to 10 minutes) left (X axis) and the amount of blood in the test blood The relationship with the measured value of the ammonia concentration is shown (Y-axis [A.U.] is "measured value at each standing time/measured value at 0 minute standing time").
  • test blood collected from healthy subjects (3 persons: A to C) was added with Phe at a known concentration ( ⁇ M) (X axis) (test sample (A) to ( C)) shows the results of measuring the ammonia concentration ( ⁇ M) (Y-axis) in the test sample using Amicekk and an ammonia meter.
  • ⁇ M ammonia concentration
  • Y axis ammonia concentration
  • Experiment B2 Phe concentration in the test sample measured in Experimental Example 4 (2) is plotted on the X axis
  • Experiment C2 ammonia measurement value
  • Experimental Example 4 (3) the results of Experiment A (plasma Phe concentration of PKU patients) are plotted on the X axis, and the regression equations derived from Experimental Examples 4 (1) and (2) are plotted against the fingertip capillaries of the PKU patient.
  • Plasma Phe concentrations estimated by applying the ammonia measurement values measured in Experiment C1 using blood as test blood are plotted on the Y-axis, showing the correlation between the two.
  • This quantification method comprises a test strip (hereinafter referred to as “this test strip") consisting of at least two sheet-like members. ) is used to perform the steps (A) to (D) described later.
  • this test strip consisting of at least two sheet-like members.
  • the present test piece and the steps (A) to (D) will be described below.
  • This test piece consists of a first sheet-like member (first member) provided with a sample holding layer containing an alkaline buffer, and a first sheet-like member (first member) provided with an indicator layer that changes color upon reaction with ammonia gas. It consists of two sheet-like members (second members). As for these members, the first member is arranged (stacked) on the second member. Both members may be separated from each other, or may be temporarily adhered to each other so that they can be separated from each other.
  • FIG. 1 is a perspective view of the test piece 1.
  • FIG. FIG. 2 is a cross-sectional view of the test piece 1 shown in FIG. 1 as viewed in the AA direction.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view of the test piece 1 shown in FIG. 1 as viewed in the BB direction.
  • the same parts are given the same reference numerals.
  • a sheet-like base material 11 (hereinafter also simply referred to as “first base material 11 ") of the first member 2 constituting the test piece 1 is formed with holes 12 , and the holes are formed.
  • a sample holding layer 13 is disposed thereon so as to cover it.
  • the substrate 14 hereinafter simply referred to as “second substrate 14 ”
  • An indicator layer 15 is arranged on the part, and adhesive layers 16a and 16b are arranged in front and behind it, respectively.
  • the hole 12 formed in the first substrate 11 is a vent hole for allowing ammonia gas generated in the sample holding layer 13 to reach the indicator layer 15 arranged on the second substrate 14 , as will be described later. be. For this reason, it is also called NH 3 vent.
  • FIG. 1 shows the test strip 1 with the first member 2 laminated on the second member 3 .
  • the hole 12 of the first substrate 11 is positioned above the indicator layer 15 of the second member 3 , and the opening of the hole 12 is covered with the indicator layer 15 . , placing the first member 2 on top of the second member 3 .
  • Adhesive layers 16a and 16b before and after the indicator layer 15 are portions for temporarily attaching the first member 2 and the second member 3 in a detachable state.
  • the first member 2 and the second member 3 do not necessarily have to be adhered as long as they can be temporarily attached, and the first member 2 and the second member 3 may be in a separated state.
  • the adhesion layers 16a and 16b may be formed so as to be repeatedly adhered two or more times. Also, the adhesive layer may be formed only in front of or behind the indicator layer 15 .
  • the size of the first base material 11 is not particularly limited, and in the case of a strip, for example, length 20 to 80 mm x width 3 to 10 mm x thickness 0.1 to 0.7 mm, preferably length 30 to 60 mm ⁇ 4-9 mm wide ⁇ 0.1-0.5 mm thick, more preferably 30-40 mm long ⁇ 5-8 mm wide ⁇ 0.1-0.4 mm thick.
  • the size of the second base material 14 is not limited, in the case of a rectangular shape, it preferably has the same width as the first base material 11 but a different length.
  • Materials for these members are not particularly limited, and examples include polyethylene terephthalate (PET), polyethylene (PE), polypropylene (PP), polymethyl methacrylate (PMMA), polyvinyl chloride (PVC), and polycarbonate (PC). be done. Among these, PET and PC are preferred, and PET is particularly preferred.
  • the holes 12 formed in the first base material 11 are shown as circular in FIG. 1, they are not limited to this, and may be of any shape such as rectangular.
  • the size of the hole is also not limited.
  • the diameter can be set in the range of 2 to 8 mm according to the size (especially the width) of the first base material 11 . It preferably ranges from 3 to 5.5 mm, more preferably from 3.5 to 4.5 mm.
  • the sample holding layer 13 arranged on the first substrate 11 is obtained by impregnating a porous member with an aqueous solution containing an alkaline buffer and drying it.
  • a porous member fibrous and non-fibrous materials can be used as long as they are inert to at least the test sample blood (whole blood) and alkaline buffer and do not affect the method of the present invention.
  • Any porous member can be used.
  • the fibrous porous member include filter paper, nonwoven fabric, and woven fabric.
  • Non-fibrous porous members include porous members made of 6-nylon, 6,6-nylon, cellulose acetate, cellulose nitrate, polyethylene, polypropylene and the like. Although not limited, it is preferably a non-fibrous porous member.
  • the size of the sample holding layer 13 is not limited as long as it can block the hole 12 formed in the first member 11 .
  • the planar shape of the sample holding layer 13 is rectangular, and the length of one side (horizontal) thereof is the same as the width of the first substrate 11 .
  • the alkali buffer to be retained in the sample retaining layer 13 may be any one that makes the test sample deposited on the sample retaining layer 13 alkaline and gasifies ammonium ions contained in the test sample to generate ammonia gas. It is not particularly limited as long as it is used.
  • borate buffer prepared from boric acid and sodium hydroxide
  • sodium borate buffer prepared from sodium borate and sodium hydroxide
  • carbonate-bicarbonate buffer prepared from sodium carbonate and sodium bicarbonate.
  • An alkaline buffer with a pH of 9 to 11 such as A borate buffer is preferred.
  • the sample holding layer 13 is impregnated with the alkaline buffer dissolved in ultrapure water to form an alkaline buffer, and dried (for example, natural drying, air drying, heat drying, reduced pressure drying, etc.) to form the sample holding layer. 13 can be kept dry.
  • the indicator layer 15 arranged on the second base material 14 holds an indicator, which will be described later.
  • the indicator layer 15 may be formed by coating an arbitrary member with an indicator, or may be formed by impregnating a porous member with an aqueous solution containing the indicator and drying it, as in the case of the sample holding layer 13 . There may be. These members should be inert to at least the indicator and ammonia gas and should not affect the method of the present invention.
  • the size of the indicator layer 15 is not limited as long as it is large enough to close the hole 12 formed in the first base material 11 . For example, as shown in FIG.
  • the planar shape of the indicator layer 15 is rectangular, and the length of one side (horizontal) thereof is equal to the width of the second base material 14 .
  • the width is 3 to 10 mm ⁇ length 3 to 10 mm ⁇ thickness 0.01 to 0.3 mm, preferably width 4 to 9 mm ⁇ length 4 to 9 mm ⁇ thickness 0.01 to 0.2 mm, more preferably width It is 5 to 8 mm x 4 to 9 mm long x 0.01 to 0.1 mm thick.
  • a pH indicator having a function of developing or discoloring in response to a pH change caused by ammonia gas can be used.
  • Bromocresol green can be mentioned preferably, but not limited to. Bromcresol green is a pH indicator that turns yellow around pH 3.8 and turns blue around pH 5.4.
  • the adhesive layers 16a and 16b arranged in front and behind the indicator layer 15 are portions for adhering the first member 2 and the second member 3 in a detachable state, as described above. is.
  • the members constituting the adhesive layer, the adhesive component, and the adhesive means are not particularly limited.
  • examples of the adhesive means include a method using an adhesive such as an acrylic adhesive or an elastomer adhesive, and a method using a double-sided tape, and a lamination method using heat fusion can also be used.
  • the adhesive layer 16 may be one that can be repeatedly adhered two or more times. In this case, an adhesive or a double-sided tape can be used as an adhesive means.
  • the sizes of the adhesive layers 16a and 16b are also not particularly limited.
  • the planar shape of the adhesive layers 16a and 16b is rectangular, and the length of one side (horizontal) is preferably the same as the width of the second member 14 .
  • it has a width of 3 to 10 mm, a length of 2 to 10 mm, and a thickness of 0.01 to 0.3 mm, preferably a width of 4 to 9 mm, a length of 2 to 9 mm, and a thickness of 0.01 to 0.2 mm, more preferably a width. It is 5 to 8 mm x 2 to 8 mm long x 0.01 to 0.1 mm thick.
  • the adhesive layer 16 may be adhered twice or multiple times.
  • the test piece 1 was prepared by placing the hole 12 of the first base material 11 on the indicator layer 15 of the second member 3 and covering the opening of the hole 12 with the indicator layer 15 . It can be manufactured by placing the first member 2 thereon and adhering it in a detachable state via adhesive layers 16a and 16b . However, as will be described later, when performing this quantitative method, the test piece 1 is first removed from the adhesion (temporary adhesion) between the first member 2 and the second member 3 (peeling), and the first member 2 is removed. , is used separately from the second member 3 (see FIG. 4). In addition, when using this test piece in a state where the first member 2 and the second member 3 are peeled from the beginning, the peeling operation is unnecessary.
  • FIGS. An example of a series of steps is shown in FIGS.
  • A Blood (test blood) collected from a subject is dropped as it is or after being diluted, onto the sample holding layer 13 of the first member 2 of the present test strip 1 , which is separated from the second member 3 , and the process of leaving time
  • B The first member 2 is laminated on the second member 3 so that the sample holding layer 13 and the indicator layer 15 of the second member 3 overlap in a non-contact state, and the sample holding layer 13 is coated with a step of dropping a PAL-containing liquid and leaving it for a certain period of time;
  • C a step of measuring the ammonia concentration in the test blood from the degree of color of the indicator layer 15 of the second member 3 ; and
  • D a step of calculating the blood Phe concentration of the subject from the ammonia concentration.
  • the step (A) is a step of dripping and spotting the test blood onto the sample holding layer of the test piece.
  • the test blood is blood collected from a subject to be measured. Subjects are neonates with suspected phenylketonuria (newborns requiring testing) or patients with phenylketonuria.
  • the blood is whole blood and may be capillary blood drawn from a capillary or venous blood drawn from a vein. Capillary blood is preferred. Capillary blood collected from fingertips is more preferable because blood collection is easy.
  • the blood may be spotted on the sample holding layer as a test sample as it is, but when the Phe concentration in the blood is high or the amount of blood to be collected is small, the blood may be diluted with a solvent that does not affect the present invention as necessary. It can also be spotted on the sample holding layer.
  • capillary blood 40 collected from a fingertip may be diluted by adding an arbitrary amount of 50 mM Tris-HCl buffer 43 (diluted sample 44 ) to be used as a test sample (see FIG. 5).
  • the dilution ratio in this case is not limited, it can be appropriately set so that the ammonia measurement value obtained in the step (C) described later falls within the detection range of the blood ammonia measuring device used for the measurement.
  • This test blood 40 or a diluted sample 44 containing it (also collectively referred to as a "test sample” without distinguishing between them) is applied to the sample holding layer 13 of the first member 2 , which is in a state separated from the second member 3 in advance. Add dropwise and allow to stand at room temperature (1 to 30° C., hereinafter the same) for 5 minutes or longer. By this operation, ammonia contained in the test sample can be removed. Specifically, when the test sample is dropped onto the sample holding layer 13 , the alkaline buffer in the sample holding layer dissolves, the test sample becomes alkaline, and the ammonium ions contained in the test sample are gasified. The gasified ammonia gas is volatilized and removed by leaving it for a certain period of time.
  • the standing time may be any time that can remove and reduce the ammonia gas, for example, 5 minutes or longer under room temperature conditions. Although not limited, it is preferably 8 minutes or more, more preferably 10 minutes or more. If rapid results are required, it is preferable to keep the standing time within 15 minutes. More preferably, it is about 8 to 10 minutes.
  • the sample holding layer 13 of the first member 2 can hold the test sample 45 (deammonified test sample) from which ammonia has been removed or reduced.
  • the step (B) is a step of enzymatically treating the test sample 45 held on the sample holding layer 13 of the first member 2 on the sample holding layer 13 .
  • the enzyme used in the present invention is phenylalanine ammonia lyase (PAL).
  • PAL is an enzyme that reacts with Phe to produce ammonia and cinnamic acid equimolar to Phe, as shown in FIG. In other words, when Phe is contained in the test sample (that is, test blood), it reacts with PAL to produce equimolar ammonia.
  • PAL can be prepared using Escherichia coli as shown in the examples below, but it can be conveniently obtained commercially.
  • the recombinant prepared using E. coli is stable, with no significant decrease in specific activity even after freeze-drying and subsequent storage at room temperature, as shown in the Examples section below.
  • PAL can be used or stored in a state of being dissolved in a solvent.
  • the solvent is not limited as long as it does not impair the activity of PAL, and for example, a 50 mM Tris-HCl aqueous solution can be used.
  • an osmotic pressure adjuster such as NaCl
  • a preservative such as sodium azide
  • a stabilizer such as trehalose
  • the enzymatic treatment in step (B) is performed by placing the first member 2 obtained in step (A) above the second member 2 so that the sample holding layer 13 overlaps the indicator layer 15 of the second member 3 in a non-contact state. This is done after lamination on member 3 . When laminated, the openings of the holes 12 of the first base material 11 are covered with the indicator layer 15 of the second member 3 to be closed.
  • the enzymatic treatment in the step (B) is performed by applying a PAL-containing liquid 47 obtained by diluting PAL with a solvent to the sample holding layer 13 containing the test sample 45 in a state in which the first member 2 is laminated on the second member 3 . is added dropwise and allowed to react at room temperature for a certain period of time.
  • the humidity of the environment in which the present test piece 1 is left is not limited, it is preferable to set and adjust the relative humidity within the range of 60 to 80% RH.
  • the temperature and humidity during the standing time may be controlled by using a constant temperature and humidity chamber, or by placing the test piece in a container or bag containing a moisture absorbent such as silica gel. .
  • the test blood-derived Phe contained in the test sample 45 becomes ammonia by the action of PAL, and the ammonium ions are gasified by the action of the alkaline buffer in the sample holding layer 13 to generate ammonia gas.
  • This ammonia gas contacts the indicator layer 15 of the second member 3 through the holes 12 (NH 3 ventilation holes) of the first substrate 11 .
  • the indicator of the indicator layer 15 reacts and changes color (colored portion 49 of the indicator layer). For example, when the indicator is bromcresol green, the color changes from the initial yellow to blue (see the top of FIG. 7).
  • the standing time may be the time required for the total amount of Phe contained in the test sample to be converted to ammonia by PAL, and as a result, the color of the indicator layer 15 changes as described above. Under the above temperature and humidity conditions, it may be 5 minutes or longer. Although not limited, it is preferably 8 minutes or more, more preferably 10 minutes or more. If rapid results are required, it is preferable to keep the standing time within 15 minutes. More preferably, it is about 8 to 10 minutes.
  • the step (C) is a step of calculating the ammonia concentration derived from Phe in the test sample from the color (reference numeral 49) of the indicator layer 15 of the second member 3 obtained in the step (B).
  • the method can be easily implemented by using the blood ammonia measuring device 5 .
  • a blood ammonia measuring device Pocketchem TM BA PA-4140 manufactured by ARKRAY, Inc. can be mentioned.
  • the measuring device is a compact device developed to measure ammonia concentration in blood samples using a test paper (AMMONIA TEST KIT II Amicheck (registered trademark)) sold by the company (measurement principle: single wavelength reflection measurement method, measurement wavelength: 635 nm).
  • the cross-sectional structure of the test paper (referred to as "Amicheck") is shown in FIG. 9 (cited from the attached document of Amicheck).
  • Amicheck 20 ⁇ L of venous blood is dropped on the sample holding layer of Amicheck, reacted for 180 seconds, the spacer is peeled off from the base film, and the colored part of the indicator layer of the base film is
  • the measurement is automatically started, and after 20 seconds, the ammonia concentration (N- ⁇ g/dl) (as nitrogen content) is displayed on the liquid crystal display panel.
  • the concentration range of ammonia measured by this device is 6 to 240 ⁇ M, which is 10 to 400 N- ⁇ g/dl in terms of nitrogen content.
  • the first member 2 and the second member 3 are separated from the main test piece 1 subjected to the enzyme treatment in the step (B), and the colored portion of the indicator layer 15 of the second member 3 ( 49) is set in the measuring section of the blood ammonia measuring device.
  • the ammonia concentration (N- ⁇ g/dl) (as nitrogen content) is automatically displayed on the liquid crystal display panel.
  • This ammonia concentration reflects the amount of ammonia (Phe-derived ammonia) produced from Phe in the test sample by the action of PAL in the sample-holding layer 13 of the first member 2 in the enzyme treatment step (B). and correlates with the amount of Phe contained in the test sample dropped onto the sample holding layer 13 .
  • test blood diluted with a solvent is used as the test sample, the ammonia concentration corresponding to the amount of Phe contained in the test blood can be obtained by conversion using the dilution ratio.
  • Step (D) is a step of calculating the blood Phe concentration of the subject from the Phe-derived ammonia concentration contained in the test blood obtained in the (C) step.
  • the blood Phe concentration includes both the Phe concentration in the subject's venous blood (whole blood) and the Phe concentration in the plasma. It is known that the Phe concentration in whole blood is about 20% less than the Phe concentration in plasma. Therefore, if one Phe concentration can be calculated, the other Phe concentration can be calculated.
  • the blood Phe concentration of the subject can be calculated from the Phe-derived ammonia concentration in the test sample using a calibration curve prepared in advance by experiments or a function (regression formula) obtained from the calibration curve.
  • a calibration curve can be prepared, for example, as follows, depending on the origin of test blood (venous blood, capillary blood). [When using venous blood as test blood] (a) Perform the steps (A) to (C) described above for a plurality of test samples prepared by adding a known amount of Phe stepwise to venous blood (whole blood) collected from one healthy subject. Then, the Phe-derived ammonia concentration in the test sample is determined from the degree of color development of the indicator layer of this test piece. (b) Plot the concentration of Phe added to venous blood on the horizontal axis (or vertical axis) and plot the Phe-derived ammonia concentration obtained in (a) on the vertical axis (or horizontal axis) to create a calibration curve.
  • the blood Phe concentration obtained in (B) is plotted on the horizontal axis (or vertical axis), and the Phe-derived ammonia concentration obtained in (A) is plotted on the vertical axis (or horizontal axis), and a calibration curve is drawn. create.
  • the subject is preferably a human having a venous Phe concentration in the range of 0 to 1400 ⁇ M, preferably 0 to 437 ⁇ M, and may be a patient with phenylketonuria, or may be a patient with Phe orally. It may be a healthy person who has taken it. Moreover, both may be mixed in the subject.
  • a regression equation can be calculated from these calibration curves.
  • the Phe-derived ammonia concentration in the test sample obtained in the above steps (A) to (C) correlates very well with the blood Phe concentration (or plasma Phe concentration) of the subject.
  • the subject's The actual blood Phe concentration can be estimated with high accuracy.
  • the Phe measurement kit of the present invention contains at least the following (a) and (b), or (a) to (c). By using the kit, the present quantification method described above can be easily carried out.
  • (a) A first member having a sample-holding layer containing an alkaline buffer and a second member having an indicator layer that changes color upon reaction with ammonia gas are laminated in a separated or releasable state. test piece, (b) PAL, and (c) solvent.
  • test piece is as described above as the main test piece 1 , and the above description can be incorporated herein.
  • a test paper AMMONIA TEST KIT II Amicheck (registered trademark)
  • ARKRAY, Inc. a test paper manufactured by ARKRAY, Inc.
  • PAL is preferably a freeze-dried product from the viewpoint of storage stability.
  • recombinant PAL prepared from Escherichia coli has an enzymatic activity sufficient for use in the present invention for at least 5 weeks even when stored in a dry state at room temperature after freeze-drying. It has been confirmed (see the column of Examples described later).
  • the solvent can be used for diluting blood used as test blood and/or dissolving PAL in a freeze-dried state.
  • a 50 mM Tris-HCl aqueous solution pH 8.5 to 9.5
  • an equivalent buffer-containing aqueous solution can be used.
  • kit of the present invention may include a blood collection capillary tube, a pipettor, an Eppendorf (tube), an instruction manual, and the like.
  • test piece AMMONIA TEST KIT II Amicheck registered trademark
  • reaction test strip in vitro diagnostic drug
  • Fig. 9 shows a cross-sectional view of Amicheck.
  • the "spacer” corresponds to the "first base material” of this test piece.
  • a hole is formed in the spacer, and a sample holding layer is laminated on the upper surface thereof so as to close the hole.
  • the sample holding layer holds an alkaline buffer (0.426 mg/sheet of boric acid, 0.187 mg/sheet of sodium hydroxide).
  • the "base film” corresponds to the "second base material” of this test piece.
  • An indicator layer is laminated on the base film through the holes of the spacer so that the sample holding layer is laminated in a non-contact state.
  • the indicator layer is coated with bromcresol green (0.04 mg/sheet) as an indicator.
  • PAL-containing solution (a) Preparation of PAL
  • the PAL cDNA contained in the plasmid (#78286, Addgene, Cambridge, USA) was cloned into pET21d(+) using the In-Fusion HD Cloning Kit (TaKaRa, Japan). It was inserted into a vector (69743, Novagen Merck Millipore, Germany) and a His6 tag was added to the C-terminus.
  • the cultured E. coli was collected, lysed using BugBuster protein extraction reagent (70584, Novagen Merck Millipore, Germany), and micrococcal nuclease (2900A, TaKaRa, Japan) was added.
  • PAL was collected with HisSpinTrap (28401353, GE Healthcare, UK) and treated with 50 mM Tris-HCl solution (pH 8.8) three times ( 1 hour, 2 hours, 1 day) were dialyzed. After concentration using Amicon Ultra (UFC500324, Merck Millipore, Germany), protein concentration was determined with the Pierce TM BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA).
  • the protein was stained with TaKaRa CBB Protein Safe Stain (TaKaRa, Japan) after electrophoresis on an SDS-PAGE gel, and a single band matching the position of the predicted molecular weight was confirmed.
  • PAL-containing liquid No.1
  • a PAL-containing liquid is prepared with ultrapure water so as to have the following concentration. Store at 4°C until use.
  • PAL 1-3 mg/mL (as protein content) Tris-HCl 50 mM NaCl 154 mM sodium azide 3.3 mM
  • PAL-containing liquid No.2
  • a PAL-containing solution (for stock) is prepared with ultrapure water so that the concentration below is obtained, 20 ⁇ L of each solution is dispensed into an Eppendorf, and stored at -20° C. until use. Before use, the temperature of the product is returned to room temperature, and the volume is increased to 100 ⁇ L with 50 mM Tris-HCl to obtain a PAL-containing solution.
  • PAL 5-15 mg/mL (as protein content) Tris-HCl 50 mM NaCl 770 mM Sodium azide 16.7 mM.
  • the PAL-containing liquid prepared by the above method was used (the PAL content in the diluted PAL-containing liquid was 1 to 3 mg/mL (in terms of protein content)).
  • PAL-containing liquid No.3
  • a PAL-containing solution (for freeze-drying) is prepared so as to have the following concentrations, 100 ⁇ L of each is dispensed into an Eppendorf, and pre-freezing is performed by freezing at ⁇ 80° C. for 24 hours. This is freeze-dried using a freeze-dryer, and the resulting freeze-dried PAL is stored under normal temperature conditions until use. Before use, 100 ⁇ L of ultrapure water is added to dissolve the freeze-dried PAL to obtain a PAL-containing solution. Tris-HCl 50 mM PAL 1-3 mg/mL (as protein content) NaCl 154 mM sodium azide 3.3 mM Trehalose 10 mg/mL.
  • PAL enzymatic activity (specific activity) 96 ⁇ L of 30 mM Phe aqueous solution was placed in a 96-well plate and allowed to stand at 30° C. for 6 minutes. Absorbance at 275 nm was measured every 5 seconds for 2 minutes. Specific activity (U/mg) was calculated using the following formula (Non-Patent Document 1: Journal of Biotechnology 258 (2017) 148-157). As a result, the specific activity of PAL (recombinant with E. coli) produced in (a) above was 0.332 ⁇ 0.014 U/mg.
  • Table 1 shows that the freeze-dried PAL prepared in (iii) above was stored at room temperature for 0 days, 1 week, 3 weeks, and 5 weeks, and then 100 ⁇ L of ultrapure water was added and dissolved to obtain a PAL-containing solution. After that, the specific activity (U/mg) of PAL was measured by the method (c) above.
  • Reference experiment example 1 Capillary blood was collected from the fingertips of 6 healthy subjects (volunteers) and used as test blood, and the ammonia concentration in the test blood was measured using an Amicheck and an ammonia meter. The blood ammonia concentration was measured according to the method described in the package insert of Amicek. The results are shown in FIG. While the normal blood ammonia level in healthy subjects is reported to be 60 ⁇ M or less, the average ammonia value obtained was as high as 68.20 ⁇ 28.70 ⁇ M. In addition, variations were observed in the measured values among the tested bloods.
  • the method of the present invention is a method for indirectly determining the blood Phe concentration of a subject by measuring the amount of Phe-derived ammonia produced by reacting Phe in a test sample with PAL. For this reason, if the ammonia concentration in the test sample fluctuates before measurement, it affects the Phe value to be obtained, reducing its reliability.
  • capillary blood collected from the fingertips of 7 healthy volunteers was used as test blood, and the following operations were performed.
  • the samples are placed on top of each other and allowed to stand for 180 seconds to allow the ammonia gas generated in the sample-retaining layer to react with the indicator layer.
  • the indicator layer portion of the colored base film is provided to the measuring part of the ammonia meter, and the measured ammonia value displayed on the ammonia meter is read.
  • the X axis represents the time left in the step (3), the ratio of the measured ammonia value at 0 minutes of standing time and the measured ammonia value at each standing time (1 minute, 2 minutes, 5 minutes, 10 minutes) (for each time A graph plotting measured value/measured value at 0 minutes: A.U.) on the Y-axis is shown in FIG.
  • FIG. 11 it was confirmed that 61.2% of the ammonia contained in the test blood was removed by dropping the test blood onto the sample holding layer of the spacer and leaving it for 5 minutes. Furthermore, it was confirmed that even 86.7% of the ammonia contained in the test blood was removed by allowing it to stand for 10 minutes.
  • test blood contains ammonia at the maximum concentration measured in Reference Experimental Example 1, after dropping the test blood onto the sample holding layer of the spacer part, the spacer is attached to the base film. By leaving it for a certain period of time such as 5 to 10 minutes in a separated state, 61.2 to 86.7% of the total amount of ammonia is removed, and the ammonia content is reduced to about 14.5 to 26.4 ⁇ M. was confirmed to be possible. Even if this amount of ammonia remains in the test blood, there is almost no effect on the measurement of the blood Phe concentration of the test subject.
  • Venous blood from three subjects was used as test blood, and the Phe concentration ( ⁇ M) added to the test blood was plotted on the X axis, and the measured value ( ⁇ M) by the ammonia meter was plotted on the Y axis. C).
  • the R2 values of the regression lines obtained from the results of (A) to (C) were 0.99, 0.97 and 0.99, respectively. From this result, it was confirmed that Phe in the test sample can be indirectly quantified by measuring the amount of ammonia generated by the reaction with PAL using venous blood containing Phe as the test sample using Amicekk.
  • FIG. 13 shows the results of plotting the plasma Phe concentration ( ⁇ M) on the X-axis and the ammonia measurement value ( ⁇ M) by the ammonia meter on the Y-axis.
  • FIG. 14 shows the results of actually measured plasma Phe concentrations ( ⁇ M) plotted on the X-axis.
  • R2 obtained from the regression equation was 0.8794, and a good correlation was obtained. From this result, it was confirmed that the blood Phe concentration of the subject can be indirectly calculated by measuring the ammonia concentration in the test blood by the method of the present invention.
  • This value (estimated plasma Phe value) was plotted on the Y-axis, and the plasma Phe concentration in the venous blood of the PKU patient obtained in experiment A was plotted on the X-axis (Fig. 17).
  • the R2 of the regression equation was 0.97.
  • the average measurement error of the estimated plasma Phe value relative to the actual plasma Phe value was 9.55% (95% confidence interval 4.7-14.4). ) was considered to have sufficient accuracy for clinical use or home use.
  • the detectable blood Phe concentration range is roughly calculated to be from 0 to 437 ⁇ M. be.
  • a plasma Phe concentration of 0 to 1400 ⁇ M, preferably 0 to 437 ⁇ M, detectable by the method of the present invention is clinically acceptable.
  • the method of the present invention is a clinically practicable method and can be measured easily and quickly. It can be effectively used for monitoring the blood Phe concentration in the body, and for monitoring and managing the blood Phe concentration in diet therapy in daily life.
  • Test piece of the present invention 2 First sheet-like member of the test piece of the present invention 3: Second sheet-like member of the test piece of the present invention 11: Base material of the first sheet-like member (first sheet base material) 12: Holes for the first sheet-like member (NH 3 ventilation holes) 13: Sample holding layer of first sheet-like member 14: Base material of second sheet-like member (second sheet base material) 15: Indicator layer 16a of second sheet-like member: Adhesive layer of second sheet-like member (front part of indicator layer) 16b: Adhesive layer of second sheet-like member (rear part of indicator layer) 40: Test blood 41: Blood collection capillary tube 42: Eppendorf 43: Solvent 44: Test sample containing test blood and solvent 45: Deammonified test sample left after dropping onto sample holding layer 46: Phenylalanine ammonia lyase (PAL) 47: PAL-containing liquid obtained by dissolving PAL in a solvent 48: Reaction spot between test sample containing test blood and PAL-containing liquid

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Abstract

本発明は血中に含まれるフェニルアラニン（Phe）を簡便且つ迅速に定量する方法、及びその方法に使用する測定キットを提供する。本発明の定量方法は、少なくとも２つのシート状部材（第１部材及び第２部材）からなる試験片を用い、下記の工程を有する： （Ａ）血液を、第２部材と分離した状態で、試験片の第１部材の試料保持層に滴下し、一定時間放置する工程、 （Ｂ）前記第１部材を、その試料保持層と第２部材の指示薬層とが非接触状態で重なるように、第２部材に積層し、当該試料保持層にフェニルアラニンアンモニアリアーゼ含有液を滴下し、一定時間放置する工程、 （Ｃ）第２部材の指示薬層の色からアンモニア濃度を測定する工程、及び （Ｄ）前記アンモニア濃度から血中Phe濃度を算出する工程。

Description

血中フェニルアラニン定量方法、及びそれに使用する測定キット
　本発明は、血中に含まれるフェニルアラニン濃度を定量する方法に関する。また本発明は、前記方法に使用する測定キットに関する。さらに本発明は、フェニルケトン尿症患者について、前記方法または前記キットを用いて、ベッドサイド若しくは医療機関以外の場所で簡便に血中フェニルアラニン濃度を確認し管理する方法に関する。
　フェニルケトン尿症は、体内のフェニルアラニン水酸化酵素（以下、「ＰＡＨ」とも称する）の活性が低下することにより、フェニルアラニン（以下、「Ｐｈｅ」とも称する）がチロシンに代謝できず、Ｐｈｅが体内に蓄積する先天性アミノ酸代謝異常症のひとつである。乳幼児期にＰｈｅ濃度の著しい上昇が続いた場合は重度の精神発達遅滞を起こす。血中Ｐｈｅ濃度を一定範囲内にコントロールすることによって精神発達遅滞を予防し、正常の知的発達を獲得することができる。よって、フェニルケトン尿症の患者は、血中Ｐｈｅ濃度をバイオマーカーとして、食事療法によって摂取Ｐｈｅ量を調整する必要がある。血中Ｐｈｅ濃度は、食事に含まれるＰｈｅ量に影響を受けやすく、またＰｈｅ耐用能は個人のＰＡＨ活性に依存することから、定期若しくは不定期に、繰り返し、血中Ｐｈｅ濃度を測定することで、細やかに摂取Ｐｈｅ量を調整することが必要である。この為には、血中Ｐｈｅ濃度が、患者のベッドサイドにて、若しくは日常生活において医療機関以外の場所で、簡便且つ迅速に測定できることが求められる。
　現在、臨床現場で使用可能な血中Ｐｈｅ濃度の測定方法は、ＨＰＬＣ法によるものである。しかし、この方法は、結果がわかるまでに最低１週間は要するため、食事療法における摂取Ｐｈｅ量の調整など、即時的な評価が求められる場面での測定方法としては不適である。一方、迅速な測定が可能な方法として、新生児マススクリーニングで用いられる質量分析法が挙げられる。しかし、この方法は、検体の前処理が必要であり、また大型の分析機器を要するため、医療機関以外での検査に用いることはできない。
　また、フェニルケトン尿症の診断方法として、従来、炭素同位体にて標識されたＰｈｅを、被験者に経口又は注射投与して、呼気中に含まれる炭素同位体量の変動によりフェニルケトン尿症を診断する方法（特許文献１）、及び生体試料中のＬ－フェニルアラニンに特異的な脱水素酵素と補酵素と電子メディエータ及びテトラゾリウム塩を反応試薬として用いて、生体試料と反応試薬との酵素反応及び酸化還元反応によってホルマザンを生成させ、これを光学的又は／及び電気化学的に検出するにより、生体試料中のＬ－フェニルアラニンを定量する方法（特許文献２）が提案されている。しかし、前者の方法は、炭素同位体量の測定に質量分析器が必要であるという問題がある。一方、後者は、簡易且つ迅速にフェニルケトン尿症が検査できる方法であるものの、先天性代謝異常症であるガラクトース血症、メープルシロップ尿症、及びフェニルケトン尿症の３疾患を同時に検査可能とする方法であり、後述する本発明の測定方法とは原理を異にするものである。
特開平９－２５７７９１号公報 国際公開第０２／０１８６２７号
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２５８（２０１７）　ｐ．１４８－１５７ 新生児マススクリーニング対象疾患等診療ガイドライン２０１９、診断と治療社、日本先天代謝異常学会編集、１６頁 Ｍｏａｔ，　Ｓ．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ　Ｉｎｈｅｒｉｔ　Ｍｅｔａｂ　Ｄｉｓ　４３，　１７９－１８８　（２０２０）．
　前述するように、従来から、簡便且つ迅速に血中のＰｈｅ濃度を測定するための方法の確立が切望されている。そこで、本発明は血中Ｐｈｅ濃度を簡便且つ迅速に測定する方法を提供することを課題とする。また本発明は、前記方法に使用される測定キットを提供することを課題とする。さらに本発明は、フェニルケトン尿症患者を対象として、当該患者における血中Ｐｈｅ濃度の管理方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、Ｐｈｅをフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（以下、「ＰＡＬ」とも称する）で分解すると、Ｐｈｅと等量のアンモニアが生成することに注目し、このアンモニア生成量を指標として、静脈血中のＰｈｅ濃度が定量的に測定できるのではないかと考えた。しかし、日夜検討を重ねていくなかで、被験試料（被験血）として指先等から採取した毛細管血を用いると、汗等に含まれるアンモニアが混入し、被験者の静脈血中のＰｈｅ濃度が正確に測定できないという問題に直面した。そこで、この問題を解決するために、さらに鋭意検討を重ねたところ、採取した毛細管血を、一旦、アルカリ緩衝剤と共存させて、その中に含まれるアンモニウムイオンをガス化し揮発させた後に、ＰＡＬと反応させることで、被験血として毛細管血を用いながらも静脈血中のＰｈｅ濃度が正確に測定できることを確認した。また、被験血として静脈血を用いる場合でも、事前に内在するアンモニウムイオンをガス化して除去しておくことで、より高い精度で、被験者の血中Ｐｈｅ濃度を測定することができる。
　本発明は、こうした検討の積み重ねによって完成したものであり、下記の実施形態を有するものである。
（Ｉ）血中Ｐｈｅ濃度の定量方法
（Ｉ－１）少なくとも２つのシート状部材からなる試験片を用いた被験者の血中Ｐｈｅ濃度の定量方法であって、
　前記試験片は、アルカリ緩衝剤を含有する試料保持層を備えた第１のシート状部材（以下、これを「第１部材」と略称する場合がある）と、アンモニアガスと反応して変色する指示薬層を備えた第２のシート状部材（以下、これを「第２部材」と略称する場合がある）が、剥離された状態又は剥離可能な状態で積層されてなるものであり、
　前記定量方法は、下記（Ａ）～（Ｄ）の工程を有する方法である、血中Ｐｈｅ濃度の定量方法：
（Ａ）被験者から採取した血液（被験血）を、そのまま又は希釈した後、第２部材と分離した状態で、前記試験片の第１部材の試料保持層に滴下し、一定時間放置する工程、
（Ｂ）前記第１部材を、その試料保持層と第２部材の指示薬層とが非接触状態で重なるように、第２部材に積層し、当該試料保持層にＰＡＬ含有液を滴下し、一定時間放置する工程、
（Ｃ）第２部材の指示薬層の色の程度から被験血中のアンモニア濃度を測定する工程、及び
（Ｄ）前記アンモニア濃度から被験者の血中Ｐｈｅ濃度を算出する工程。
（Ｉ－２）前記第１部材の試料保持層中のアルカリ緩衝剤が、ホウ酸及び水酸化ナトリウムを含有するアルカリ緩衝剤であり、
　前記第２部材の指示薬層の指示薬が、ブロムクレゾールグリーンである、（Ｉ－１）に記載する血中Ｐｈｅの定量方法。
（Ｉ－３）前記第１部材の試料保持層中のホウ酸及び水酸化ナトリウムの含有量が１部材あたり、それぞれ０．４０～０．４５ｍｇ及び０．１５～０．２０ｍｇであり、
　前記第２部材の指示薬層中のブロムクレゾールグリーンの含有量が１部材あたり、０．３～０．５ｍｇであり、
　前記（Ａ）工程で試料保持層に滴下する被験血の量が少なくとも１０μｌであり、
　前記（Ｂ）工程で前記試料保持層に滴下するＰＡＬ含有液のＰＡＬ量が少なくとも２ｍＵであり、
　前記（Ｄ）工程で算出できる血中Ｐｈｅ濃度が０～１４００μＭ、好ましくは０～４３７μＭである、
（Ｉ－２）に記載する血中Ｐｈｅの定量方法。
（Ｉ－４）前記（Ｃ）工程が、指示薬層の色を波長６３５ｎｍの吸光度を測定する工程である、（Ｉ－２）又は（Ｉ－３）に記載する血中フェニルアラニンの定量方法。
（Ｉ－５）前記被験者から採取する血液（被験血）が毛細管血である、（Ｉ－１）～（Ｉ－４）のいずれかに記載する血中Ｐｈｅの定量方法。
（Ｉ－６）前記被験者がフェニルケトン尿症の患者である、（Ｉ－１）～（Ｉ－５）のいずれかに記載する血中Ｐｈｅの定量方法。
（Ｉ－７）前記血中Ｐｈｅの定量方法を、後記（ＩＩ－１）に記載するキットを用いて実施する、（Ｉ－１）～（Ｉ－６）のいずれかに記載する血中Ｐｈｅ濃度の定量方法。
　なお、これらの定量方法は、血中Ｐｈｅの推定的定量方法または血中Ｐｈｅ濃度の推定方法と言い換えることもできる。
（ＩＩ）血中フェニルアラニンの測定キット
（ＩＩ－１）（Ｉ－１）～（Ｉ－６）のいずれかに記載する血中Ｐｈｅの定量方法に使用するための、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）、又は（ａ）～（ｃ）を含有するキット：（ａ）アルカリ緩衝剤を含有する試料保持層を備えた第１部材と、アンモニアガスと反応して変色する指示薬層を備えた第２部材が、剥離された状態又は剥離可能な状態で積層されてなる試験片、
（ｂ）ＰＡＬ、及び
（ｃ）溶媒。
（ＩＩＩ）血中Ｐｈｅ濃度の管理方法
（ＩＩＩ－１）フェニルケトン尿症患者の血中Ｐｈｅ濃度の管理方法であって、
医療機関以外の場所で定期若しくは不定期に、フェニルケトン尿症患者の毛細管血を被験血として用いて、（Ｉ－１）～（Ｉ－６）のいずれか一項に記載する血中Ｐｈｅの定量方法を実施する、前記管理方法。
（ＩＩＩ－２）前記血中Ｐｈｅの定量方法を、前記（ＩＩ－１）に記載するキットを用いて実施する方法である、（ＩＩＩ－１）記載の管理方法。
　本発明の方法によれば、採血現場において簡便且つ迅速に被験者の血中Ｐｈｅ濃度を測定することができる。また、本発明の方法によれば、例えば指先からの微量の血液（毛細管血）を被験血とした場合でも、高い精度で被験者の静脈血中又は血漿中のＰｈｅ濃度を求めることができる。このため、本発明の方法は、新生児におけるフェニルケトン尿症の早期発見のためのスクリーニング、フェニルケトン尿症患者のベッドサイドでの血中Ｐｈｅ濃度のモニタリング、また日常生活において、医療機関以外の場所で、特に食事療法における血中のＰｈｅ濃度のモニタリング及び管理に有効に利用することができる。
本試験片１の一例の斜視図を示す。 本試験片１の一例のＡ－Ａ断面図を示す。 本試験片１の一例のＢ－Ｂ断面図を示す。 本試験片１の第１シート状部材２と第２シート状部材３との剥離操作、及び両者が剥離された状態を示した図である。 本発明の定量方法の（Ａ）の工程を示す図である。 本発明の定量方法の（Ｂ）の工程を示す図である。 本発明の定量方法の（Ｃ）の工程を示す図である。 本発明の測定原理を示す反応模式図を示す。 実験例で使用したAMMONIA TEST KIT IIアミチェック（登録商標）反応試験紙（アミチェック）の断面図を示す。 参考実験例１において、アミチェック及びアンモニア測定器を用いて、指先から採取した毛細管血（被験血）中のアンモニア濃度（μＭ）を測定した結果を示す。 参考実験例２において、アミチェックのスペーサー部分の試料保持層に指先から採取した毛細管血（被験血）を滴下した後、放置した時間（０～１０分間）（Ｘ軸）と、被験血中のアンモニア濃度の測定値との関係を示す（Ｙ軸［A.U.］は、「各放置時間時の測定値／放置時間０分時の測定値」）。 実験例１において、健常者（３名：Ａ～Ｃ）から採取した静脈血（被験血）に、それぞれ既知濃度（μＭ）（Ｘ軸）のＰｈｅを添加して（被験試料（Ａ）～（Ｃ））、アミチェック及びアンモニア測定器を用いて、被験試料中のアンモニア濃度（μＭ）（Ｙ軸）を測定した結果を示す。 実験例２において、フェニルケトン尿症患者の毛細管血を被験血として、アミチェック及びアンモニア測定器を用いて測定した被験血中のアンモニア濃度（μＭ）（Ｙ軸）と、同患者の血漿Ｐｈｅ濃度が相関することを示した図である。 実験例３において、フェニルケトン尿症患者の毛細管血を被験血として、本発明の方法で測定したアンモニア値から予測される同患者の血漿Ｐｈｅ濃度が、同患者の実際の血漿Ｐｈｅ濃度と相関することを示した図である。 実験例４（１）で測定した実験Ａの結果（PKU患者の血漿Phe濃度）をＸ軸に、実験Ｂ１の結果（PKU患者の毛細管血Phe濃度）をＹ軸にプロットし、両者の相関性を示した図である。 実験例４（２）で測定した実験Ｂ２の結果（被験試料中のPhe濃度）をＸ軸に、実験Ｃ２の結果（アンモニア測定値）をＹ軸にプロットし、両者の相関性を示した図である。 実験例４（３）において、実験Ａの結果（PKU患者の血漿Phe濃度）をＸ軸に、また、実験例４（１）と（２）から導いた回帰式に、当該ＰＫＵ患者の指先毛細管血を被験血として実験Ｃ１により測定したアンモニア測定値を当てはめて推定した血漿Phe濃度をＹ軸にプロットし、両者の相関性を示した図である。
（Ｉ）血中Ｐｈｅの定量方法
　本発明の血中Ｐｈｅの定量方法（以下、「本定量法」とも称する）は、少なくとも２つのシート状部材からなる試験片（以下、「本試験片」と称する）を用いて、後述する（Ａ）～（Ｄ）の工程を実施することを特徴とする。
　以下、本試験片と（Ａ）～（Ｄ）の工程について説明する。
（1）本試験片
　本試験片は、アルカリ緩衝剤を含有する試料保持層を備えた第１のシート状部材（第１部材）と、アンモニアガスと反応して変色する指示薬層を備えた第２のシート状部材（第２部材）からなる。これらの部材は、第２部材の上に第１部材が配置（積層）されている。両部材は互いに剥離された状態であってもよいし、また両者がバラバラにならないように、剥離可能なように仮接着された状態であってもよい。
　図１～３に、本試験片１の一例を示す。図１は、本試験片１の斜視図である。図２は、図１で示す本試験片１をＡ－Ａ方向にみた断面図である。図３は図１で示す本試験片１をＢ－Ｂ方向にみた断面図である。これらの図において、同一部分には同一符号を付している。
　図示するように、本試験片１を構成する第１部材２のシート状の基材１１（以下、単に「第１基材１１」ともいう）には孔１２が形成されており、その孔を覆うようにその上には試料保持層１３が配置されている。また本試験片１を構成する第２部材３のシート上の基材１４（以下、単に「第２基材１４」ともいう）の上には、前記第１基材１１の孔１２に対応する部分に、指示薬層１５が配置されており、その前と後には各々接着層１６ａと１６ｂが配置されている。なお、第１基材１１に形成された孔１２は、後述するように、試料保持層１３で生じるアンモニアガスを、第２基材１４に配置された指示薬層１５に到達させるための通気孔である。このためＮＨ３通気孔とも称する。
　図１は、第１部材２が第２部材３の上に積層された状態にある本試験片１を示す。この場合、図２及び３に示すように、第１基材１１の孔１２が、第２部材３の指示薬層１５の上に位置し、孔１２の開口部が指示薬層１５で覆われるように、第２部材３の上に第１部材２を配置する。指示薬層１５の前後の接着層１６ａ及び１６ｂは、第１部材２と第２部材３とを剥離可能な状態で仮付け可能にするための部分である。仮付け可能であればよく、第１部材２と第２部材３とは必ずしも接着している必要はなく、剥離した状態であってもよい。当該接着層１６ａ及び１６ｂは、２回以上繰り返して、接着可能なように形成されていてもよい。また接着層は、指示薬層１５の前だけ、又は後ろだけに形成されていてもよい。
　第１基材１１の大きさは、特に制限されず、短冊状の場合、例えば、長さ２０～８０ｍｍ×幅３～１０ｍｍ×厚み０．１～０．７ｍｍであり、好ましくは長さ３０～６０ｍｍ×幅４～９ｍｍ×厚み０．１～０．５ｍｍであり、より好ましくは長さ３０～４０ｍｍ×幅５～８ｍｍ×厚み０．１～０．４ｍｍである。第２基材１４の大きさは、制限されないものの、短冊状の場合、前記第１基材１１と同じ幅で、長さが異なるものであることが好ましい。例えば、長さ２０～１００ｍｍ×幅３～１０ｍｍ×厚み０．１～０．７ｍｍであり、好ましくは長さ４０～８０ｍｍ×幅４～９ｍｍ×厚み０．１～０．５ｍｍであり、より好ましくは長さ４０～６０ｍｍ×幅５～８ｍｍ×厚み０．１～０．４ｍｍである。これらの部材の材質も特に制限されず、例えばポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリカーボネート（ＰＣ）等が挙げられる。この中でもＰＥＴ及びＰＣが好ましく、特に好ましくはＰＥＴである。
　第１基材１１に形成された孔１２は、図１では円形状として示すが、これに限定されず、例えば矩形等の任意の形状とすることができる。孔の大きさも制限されず、例えば円形状の場合、第１基材１１の大きさ（特に幅）に応じて、直径が２～８ｍｍの範囲で設定することができる。好ましくは、３～５．５ｍｍ、より好ましくは３．５～４．５ｍｍの範囲である。
　第１基材１１上に配置された試料保持層１３は、多孔質部材にアルカリ緩衝剤を含む水溶液を含浸させて乾燥させたものである。多孔質部材としては、少なくとも被験試料である血液（全血）やアルカリ緩衝剤に対して不活性であり、本発明の方法に影響を及ぼさないものであれば、繊維性及び非繊維性の別を問わず、いずれの多孔質部材をも使用することができる。繊維性多孔質部材としては、例えばろ紙、不織布、織物生地などが挙げられる。また非繊維性多孔質部材としては、６－ナイロン、６，６－ナイロン、セルロースアセテート、硝酸セルロース、ポリエチレン、ポリプロピレンなどで作製された多孔質部材が挙げられる。制限されないものの、好ましくは非繊維性の多孔質部材である。試料保持層１３の大きさは、第１部材１１に形成された孔１２を塞ぐことができる大きさであればよく、その限りにおいて制限されない。例えば、図１に示すように、第１部材２が短冊状である場合、試料保持層１３の平面形状は矩形であり、その一辺（横）の長さは第１基材１１の幅と同じであることが好ましい。例えば、横幅３～１０ｍｍ×縦３～１０ｍｍ×厚み０．１～０．５ｍｍであり、好ましくは横幅４～９ｍｍ×縦４～９ｍｍ×厚み０．１～０．４ｍｍであり、より好ましくは横幅５～８ｍｍ×縦４～９ｍｍ×厚み０．１～０．３ｍｍである。
　試料保持層１３に保持させるアルカリ緩衝剤は、試料保持層１３に点着させる被験試料をアルカリ性にし、被験試料に含まれるアンモニウムイオンをガス化させて、アンモニアガスを生じさせるものであればよく、その限りにおいて特に制限されない。例えば、ホウ酸と水酸化ナトリウムから調製されるホウ酸緩衝剤、ホウ酸ナトリウムと水酸化ナトリウムから調製されるホウ酸ナトリウム緩衝剤、炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムから調製される炭酸－重炭酸緩衝剤などのｐＨ９～１１のアルカリ緩衝剤を例示することができる。好ましくはホウ酸緩衝剤である。アルカリ緩衝剤は、例えば超純水に溶解してアルカリ緩衝液にした状態で試料保持層１３に含浸させ、乾燥（例えば自然乾燥、風乾、加熱乾燥、減圧乾燥等）させることで、試料保持層１３に乾燥状態で保持させることができる。
　第２基材１４上に配置された指示薬層１５には、後述する指示薬が保持されている。当該指示薬層１５は、任意の部材に指示薬がコーティングされてなるものであっても、また前記試料保持層１３と同様に、多孔質部材に指示薬を含む水溶液を含浸させて乾燥させてなるものであってもよい。これらの部材は、少なくとも指示薬やアンモニアガスに対して不活性であり、本発明の方法に影響を及ぼさないものであればよい。指示薬層１５の大きさは、第１基材１１に形成された孔１２を塞ぐ程度の大きさであればよく、その限りにおいて制限されない。例えば、図１に示すように、第２シート状部材３が短冊状である場合、指示薬層１５の平面形状は矩形であり、その一辺（横）の長さは第２基材１４の幅と同じであることが好ましい。例えば、横幅３～１０ｍｍ×縦３～１０ｍｍ×厚み０．０１～０．３ｍｍであり、好ましくは横幅４～９ｍｍ×縦４～９ｍｍ×厚み０．０１～０．２ｍｍであり、より好ましくは横幅５～８ｍｍ×縦４～９ｍｍ×厚み０．０１～０．１ｍｍである。
　指示薬層１５に保持させる指示薬としては、アンモニアガスに起因するｐＨ変化に反応して発色若しくは変色する作用を有するｐＨ指示薬を用いることができる。制限されないが、好ましくはブロムクレゾールグリーンを挙げることができる。ブロムクレゾールグリーンは、ｐＨが３．８付近では黄色を呈するが、ｐＨ５．４付近で青色に変色するｐＨ指示薬である。
　第２部材３において、前記指示薬層１５の前後に配置する接着層１６ａ及び１６ｂは、前述するように、第１部材２と第２部材３とを剥離可能な状態で接着しておくための部分である。本発明の方法に影響を及ぼさないものである限り、接着層を構成する部材、及び接着成分や接着手段は特に制限されない。制限されないものの、接着手段として、アクリル系接着剤やエラストマー系接着剤等の接着剤を用いる方法、両面テープを用いる方法を例示することができる、また、熱融着によるラミネート法も使用することができる。また、接着層１６は、２回以上、繰り返して接着可能なものであってもよい。この場合、接着手段として接着剤や両面テープを使用することができる。
　接着層１６ａ及び１６ｂの大きさも特に制限されない。例えば、第２部材３が短冊状である場合、接着層１６ａ及び１６ｂの平面形状は矩形であり、その一辺（横）の長さは第２部材１４の幅と同じであることが好ましい。例えば、横幅３～１０ｍｍ×縦２～１０ｍｍ×厚み０．０１～０．３ｍｍであり、好ましくは横幅４～９ｍｍ×縦２～９ｍｍ×厚み０．０１～０．２ｍｍであり、より好ましくは横幅５～８ｍｍ×縦２～８ｍｍ×厚み０．０１～０．１ｍｍである。また、接着層１６は、２回若しくは複数回、貼着可能なものであってもよい。
　本試験片１は、第１基材１１の孔１２が、第２部材３の指示薬層１５の上に位置し、孔１２の開口部が指示薬層１５で覆われるように、第２部材３の上に第１部材２を配置し、接着層１６ａ及び１６ｂを介して、剥離可能な状態で接着することにより製造することができる。
　但し、後述するように、本試験片１は、本定量法の実施に際して、まずは、第１部材２と第２部材３との接着（仮接着）を外して（剥離）、第１部材２を、第２部材３と分離した状態で使用する（図４参照）。なお、第１部材２と第２部材３とが最初から剥離された状態の本試験片を使用する場合は、前記剥離操作は不要である。
（2）本試験片を用いた血中Ｐｈｅ定量方法
　前述する本試験片を用いた本定量法は、次の（Ａ）～（Ｄ）の工程により実施することができる。一連の工程の一例を、図５～７に示す。
（Ａ）被験者から採取した血液（被験血）を、そのまま又は希釈した後、第２部材３と分離した状態にある、本試験片１の第１部材２の試料保持層１３に滴下し、一定時間放置する工程、
（Ｂ）前記第１部材２を、その試料保持層１３と第２部材３の指示薬層１５とが非接触状態で重なるように、第２部材３の上に積層し、当該試料保持層１３にＰＡＬ含有液を滴下し、一定時間放置する工程、
（Ｃ）第２部材３の指示薬層１５の色の程度から、被験血中のアンモニア濃度を測定する工程、及び
（Ｄ）前記アンモニア濃度から被験者の血中Ｐｈｅ濃度を算出する工程。
（Ａ）工程（図５参照）
　（Ａ）工程は被験血を試験片の試料保持層に滴下し点着する工程である。
　被験血としては、測定対象とする被験者から採取した血液である。被験者はフェニルケトン尿症が疑われる新生児（検査が必要な新生児）、もしくはフェニルケトン尿症の患者である。血液は全血であり、毛細管から採取した毛細管血であっても、また静脈から採取いた静脈血であってもよい。好ましくは毛細管血である。より好ましく採血が容易であることから、指先から採取される毛細管血である。血液は、そのまま被験試料として試料保持層に点着してもよいが、血液中のＰｈｅ濃度が高い場合や採血量が少ない場合など、必要に応じて本発明に影響しない溶媒に希釈した後に、試料保持層に点着することもできる。制限されないが、一例として、指先から採取した毛細管血４０に任意量の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液４３を加えて希釈したもの（希釈試料４４）を被験試料として使用することもできる（図５参照）。この場合の希釈倍率は、制限されないものの、後述する（Ｃ）工程で得られるアンモニア測定値が、その測定に使用する血中アンモニア測定装置の検出範囲に収まるように、適宜設定することができる。
　この被験血４０またはそれを含む希釈試料４４（これらを区別することなく総じて「被験試料」とも称する）を、予め第２部材３と分離した状態にある、第１部材２の試料保持層１３に滴下し、室温条件下（１～３０℃、以下同じ）で５分以上放置する。この操作により、被験試料中に含まれるアンモニアを除去することができる。具体的には、被験試料を試料保持層１３に滴下すると、試料保持層中のアルカリ緩衝剤が溶解して、被験試料がアルカリ性になり、被験試料に含まれるアンモニウムイオンがガス化する。ガス化したアンモニアガスは一定時間放置することで揮発して除去される。放置時間として、アンモニアガスを除去し低減できる時間であればよく、例えば室温条件であれば５分以上であればよい。制限されないが、好ましくは８分以上、より好ましくは１０分以上である。結果の迅速性が要求される場合は、放置時間は１５分以内に留めることが好ましい。より好ましくは８～１０分程度である。こうして第１部材２の試料保持層１３にはアンモニアを除去又は低減させた被験試料４５（脱アンモニア被験試料）を保持させることができる。
　（Ｂ）工程（図６及び図７上段参照）
　（Ｂ）工程は、第１部材２の試料保持層１３に保持させた被験試料４５を、試料保持層１３上で酵素処理する工程である。
　本発明で使用する酵素は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）である。ＰＡＬは、図８に示すように、Ｐｈｅと反応して、Ｐｈｅと等量モルのアンモニアとケイ皮酸を生成する酵素である。つまり、被験試料中（つまり、被験血）にＰｈｅが含まれている場合、ＰＡＬと反応して等量モルのアンモニアが生成する。なお、ＰＡＬは、後述する実施例に示すように大腸菌を用いて調製することもできるが、簡便には商業的に入手することができる。特に、大腸菌を用いて調製される組み換え体は、後述する実施例の欄に示すように、凍結乾燥処理やその後の室温条件下での保存によっても比活性が大きく低下することなく、安定性が良好であるため、取り扱いやすい。
　なお、ＰＡＬは溶媒に溶解した状態で使用又は保存することができる。溶媒はＰＡＬの活性を損なわないことを限度として制限されないが、例えば５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ水溶液を例示することができる。また、ＰＡＬの活性を損なわないことを限度として、溶媒に加えてＮａＣｌ等の浸透圧調整剤、アジ化ナトリウム等の防腐剤、及び／又はトレハロース等の安定化剤を配合することもできる。
　（Ｂ）工程の酵素処理は、前記（Ａ）工程で得られた第１部材２を、試料保持層１３が、第２部材３の指示薬層１５と、非接触状態で重なるように、第２部材３の上に積層した後に行われる。積層したとき、第１基材１１の孔１２の開口部は、第２部材３の指示薬層１５に覆われて塞がれた状態になっている。つまり、（Ｂ）工程の酵素処理は、第１部材２を第２部材３の上に積層させた状態で、被験試料４５を含む試料保持層１３に、ＰＡＬを溶媒で希釈したＰＡＬ含有液４７を滴下し、室温条件下で一定時間放置して反応させる。この際、本試験片１を放置する環境の湿度は、制限されないものの、相対湿度が６０～８０％ＲＨの範囲になるように設定調整することが好ましい。なお、放置時間中の温度や湿度の管理は、恒温恒湿器を用いて行ってもよいし、またシリカゲル等の吸湿剤をいれた容器や袋に本試験片を入れることで行ってもよい。
　この放置時間、被験試料４５に含まれる被験血由来のＰｈｅがＰＡＬの作用によりアンモニアとなり、このアンモニウムイオンが試料保持層１３中のアルカリ緩衝剤の作用でガス化し、アンモニアガスが生じる。このアンモニアガスは、第１基材１１の孔１２（ＮＨ３通気孔）を通じて第２部材３の指示薬層１５に接触する。そして、その指示薬層１５の指示薬が反応して変色する（指示薬層の発色部分４９）。例えば、指示薬がブロムクレゾールグリーンである場合は、当初の黄色から青色に変色する（図７の上段参照）。
　放置時間としては、被験試料に含まれるＰｈｅの全量がＰＡＬによりアンモニアとなり、その結果、上記するように指示薬層１５が変色するのに要する時間であればよい。上記の温度及び湿度条件であれば５分以上であればよい。制限されないが、好ましくは８分以上、より好ましくは１０分以上である。結果の迅速性が要求される場合は、放置時間は１５分以内に留めることが好ましい。より好ましくは８～１０分程度である。
　（Ｃ）工程（図７参照）
　（Ｃ）工程は、前記（Ｂ）工程で得られた第２部材３の指示薬層１５の色（符号４９）から、被験試料中のＰｈｅに由来するアンモニア濃度を算出する工程である。
　当該方法は、血中アンモニア測定装置５を用いることで簡便に実施することができる。当該装置は商業的に入手することができ、例えばアークレイ株式会社の血中アンモニア測定装置　ポケットケムＴＭＢＡ　ＰＡ－４１４０を挙げることができる。
　当該測定装置は、同社が販売する試験紙（AMMONIA TEST KIT IIアミチェック（登録商標））を用いて、血液試料中のアンモニア濃度を測定するために開発された小型装置（測定原理：１波長反射測定法、測定波長：６３５ｎｍ）である。前記試験紙（「アミチェック」と称する）の断面構造を図９に示す（アミチェックの添付書類から援用）。アミチェックの添付書類によると、アミチェックの試料保持層に、静脈血を２０μＬ滴下し、１８０秒間反応させた後、ベースフィルムからスペーサーを剥ぎ取り、ベースフィルムの指示薬層の発色部分を、血中アンモニア測定装置の測定部にセットすると、自動的に測定が開始され、２０秒後に液晶表示板にアンモニア濃度（Ｎ－μg/dl）（窒素量として）が表示される。この装置のアンモニアの測定濃度範囲は６～２４０μＭ、窒素量に換算すると１０～４００Ｎ－μg/dlである。
　本発明の（Ｃ）工程では、前記（Ｂ）工程で酵素処理した本試験片１について、第１部材２と第２部材３とを分離し、第２部材３の指示薬層１５の発色部分（４９）を、前記血中アンモニア測定装置の測定部にセットする。こうすることで、自動的に液晶表示板にアンモニア濃度（Ｎ－μg/dl）（窒素量として）が表示される。なお、このアンモニア濃度は、前記（Ｂ）の酵素処理工程で、第１部材２の試料保持層１３内でＰＡＬの作用により被験試料中のＰｈｅから生じたアンモニア（Ｐｈｅ由来アンモニア）の量を反映するものであり、試料保持層１３に滴下した被験試料中に含まれるＰｈｅの量に相関する。なお、被験試料として溶媒で希釈した被験血を使用した場合は、その希釈倍率で換算することで、被験血中に含まれるＰｈｅの量に対応するアンモニア濃度を求めることができる。
　（Ｄ）工程
　（Ｄ）工程は、前記（Ｃ）工程で得られた被験血中に含まれるＰｈｅ由来アンモニア濃度から被験者の血中Ｐｈｅ濃度を算出する工程である。ここで血中Ｐｈｅ濃度には、被験者の静脈血（全血）中のＰｈｅ濃度、及びその血漿中のＰｈｅ濃度の両方の意味が含まれる。全血中のＰｈｅ濃度は血漿中のＰｈｅ濃度の約２割少ないことが知られている。このため、一方のＰｈｅ濃度が算出できれば、他方のＰｈｅ濃度は自ずと算出できる。
　被験試料中のＰｈｅ由来アンモニア濃度から被験者の血中Ｐｈｅ濃度の算出は、予め実験により作成した検量線またはその検量線から得られる関数（回帰式）を用いて行うことができる。
　検量線の作成は、被験血の由来（静脈血、毛細管血）に応じて、例えば、次のようにして行うことができる。
［静脈血を被験血として用いる場合］
（ａ）一人の健常者から採取した静脈血（全血）に、既知量のＰｈｅを段階的に添加して調製した複数の被験試料について、前述する（Ａ）～（Ｃ）の工程を実施して、本試験片の指示薬層の発色の程度から被験試料中のＰｈｅ由来アンモニア濃度を求める。
（ｂ）静脈血に添加したＰｈｅ濃度を横軸（又は縦軸）に、（ａ）で得られたＰｈｅ由来アンモニア濃度を縦軸（又は横軸）にプロットして検量線を作成する。
［毛細管血を被験血として用いる場合］
（ア）複数の被験者の指先から採取した毛細管血（全血）を被験試料として、前述する（Ａ）～（Ｃ）の工程を実施して、本試験片の指示薬層の発色の程度から被験試料中のＰｈｅ由来アンモニア濃度を求める。
（イ）別途、同被験者の静脈血（全血）のＰｈｅ濃度を、ＨＰＬＣ法にて測定し、血中Ｐｈｅ濃度を取得する。
（ウ）（イ）で取得した血中Ｐｈｅ濃度を横軸（又は縦軸）に、（ア）で得られたＰｈｅ由来アンモニア濃度を縦軸（又は横軸）にプロットして、検量線を作成する。
　なお、前記被験者は、静脈血中のＰｈｅ濃度が０～１４００μＭ、好ましくは０～４３７μＭの範囲にあるヒトであることが好ましく、フェニルケトン尿症の患者であってもよいし、またＰｈｅを経口摂取した健常者であってもよい。また、被験者中に両者が混在していてもよい。
　回帰式はこれらの検量線から算出することができる。
　実験例１～４で示すように、前述する（Ａ）～（Ｃ）工程で得られる被験試料中のＰｈｅ由来アンモニア濃度は被験者の血中Ｐｈｅ濃度（又は血漿Ｐｈｅ濃度）に非常によく相関しており、（Ａ）～（Ｃ）工程で得られる被験試料中のＰｈｅ由来アンモニア濃度から推定される被験者の血中Ｐｈｅ濃度（＝（Ｄ）工程で得られる血中Ｐｈｅ濃度）は、実際のフェニルケトン尿症患者の血中Ｐｈｅ濃度とほぼ一致する。
　従って、前記方法で得られる検量線またはそれから得られる関数（回帰式）を用いることで、（Ａ）～（Ｃ）の工程を実施して得られる被験試料中のＰｈｅ由来アンモニア濃度から、被験者の実際の血中Ｐｈｅ濃度を高い精度で推定することができる。
（ＩＩ）血中Ｐｈｅの測定キット
　本発明のＰｈｅ測定キットは、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）、又は（ａ）～（ｃ）を含有するものである。当該キットを用いることで、前述する本定量方法を簡便に実施することができる。
（ａ）アルカリ緩衝剤を含有する試料保持層を備えた第１部材と、アンモニアガスと反応して変色する指示薬層を備えた第２部材が、剥離された状態又は剥離可能な状態で積層されてなる試験片、
（ｂ）ＰＡＬ、及び
（ｃ）溶媒。
　（ａ）試験片は、本試験片１として前述した通りであり、前記の記載はここに援用することができる。簡便には、アークレイ株式会社製の試験紙（AMMONIA TEST KIT IIアミチェック（登録商標））を用いることができる。
　（ｂ）ＰＡＬは保存安定性の観点から、凍結乾燥品であることが好ましい。制限はされないものの、例えば、大腸菌から調製される組換えＰＡＬは、凍結乾燥処理後、乾燥した状態で室温保存しても、少なくとも５週間は本発明の使用に差し支えない酵素活性を有していることが確認されている（後述する実施例の欄参照）。
　（ｃ）溶媒は、被験血として使用する血液の希釈、及び／又は、凍結乾燥状態にあるＰＡＬの溶解に使用することができる。制限されないものの、例えば５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ水溶液（ｐＨ８．５～９．５）やそれと同等の緩衝剤含有水溶液を用いることができる。　
　その他、本発明のキットには、採血用毛細管、ピペッター、エッペンドルフ（チューブ）、及び使用説明書などが含まれていても良い。
（ＩＩＩ）血中Ｐｈｅ濃度の管理方法
　前述する本定量方法を用いることで、静脈血や毛細管血を被験血として、フェニルケトン尿症患者の血中Ｐｈｅ濃度を簡便に評価することができる。被験血として、好ましくは、指先から採取する毛細管血である。その結果、フェニルケトン尿症患者における血中Ｐｈｅ濃度を、医療機関以外の場所で定期的（例えば、毎日又は一定間隔おき）若しくは不定期に、管理することができる。このため、本発明によれば、前述する本定量方法を用いることによる、フェニルケトン尿症患者における血中Ｐｈｅ濃度の管理方法を提供することができる。当該方法は、前述する測定キットを用いて行うことができる。
　以下、本発明の構成及び効果について、その理解を助けるために、実験例を用いて本発明を説明する。但し、本発明はこれらの実験例によって何ら制限を受けるものではない。以下の実験は、特に言及しない限り、常温（２０±５℃）、及び大気圧条件下で実施した。なお、特に言及しない限り、以下に記載する「％」は「質量％」、「部」は「質量部」を意味する。また、下記の実験は、事前に東北大学大学院医学系研究科倫理委員会（日本）で承認を得たうえで実施した（承認番号2020-1-362）。
　下記の実験例で使用した試験片、アンモニア測定器、及びＰＡＬ含有溶液は下記の通りである。
（１）試験片
　AMMONIA TEST KIT IIアミチェック（登録商標）反応試験紙（体外診断用医薬品）：アークレイ株式会社製
　以下の実験例では、これを「アミチェック」と称する。
　図９にアミチェックの断面図を示す。ここで「スペーサー」は、本試験片の「第１基材」に該当する。図９に示すように、スペーサーには孔が形成されており、その孔を塞ぐようにその上面に試料保持層が積層されている。試料保持層にはアルカリ緩衝剤（ホウ酸0.426mg／シート、水酸化ナトリウム0.187mg/シート）が保持されている。また図９において「ベースフィルム」は、本試験片の「第２基材」に該当する。ベースフィルムの上には、スペーサーの孔を介して、前記試料保持層が非接触状態で積層するように、指示薬層が積層されている。指示薬層には、指示薬としてブロムクレゾールグリーン（0.04mg/シート）がコーティングされている。
［アミチェックによる全血中アンモニアの測定原理］
　アミチェックのスペーサー上の試料保持層に被験試料（血液）を点着すると、試料保持層中のアルカリ緩衝剤が溶解して、被験試料がアルカリ性になる。そうすることで被験試料中のアンモニウムイオンがガス化してアンモニアガスになり、これがスペーサーの孔を通過して指示薬層に移行する。指示薬層に移行したアンモニアガスは指示薬層中の指示薬と反応することで指示薬層の色が変色する。ベースフィルムに積層されているスペーサーを剥がし、ベースフィルム上の指示薬層の部分を、下記のアンモニア測定器の測定部に供すると、指示薬層の変色度（色の強度）を自動的に感知してアンモニア濃度（Ｎ－μg/dL）（窒素量として）が表示される。このようにして、アミチェック及びアンモニア測定器を用いることで、被験試料（血液）中のアンモニア濃度を測定することができる。
（２）アンモニア測定器
　血中アンモニア測定装置ポケットケムTM　BA　PA-4140：アークレイ株式会社製
　以下の実験例では、これを「アンモニア測定器」と称する。
（３）ＰＡＬ含有液
（ａ）ＰＡＬの作製
　プラスミド（#78286、Addgene、Cambridge、USA）に含まれるＰＡＬのｃＤＮＡを、In-Fusion HD Cloning Kit（TaKaRa, Japan）を用いて、pET21d(+)ベクター（69743, Novagen Merck Millipore, Germany）に挿入し、Ｃ末端にHis6タグを付加した。作製したpET21d(+)を大腸菌HMS174(DE3)株（69453, Merck Millipore, Germany）にトランスフェクションし、ＯＤ６００＝０．６になるまで培養した後に、１ｍＭイソプロピルチオ-α-D-ガラクトピラノシド (9030, TaKaRa, Japan)を添加し、さらに２５℃で１５時間培養を継続した。培養した大腸菌を回収し、BugBuster protein extraction reagent (70584, Novagen Merck Millipore, Germany)を用いて溶菌し、micrococcal nuclease (2900A, TaKaRa, Japan)を加えた。ＰＡＬをHisSpinTrap (28401353, GE Healthcare,UK)で回収し、Mini Dialysis Kit with a 1 kDa cut‐off (28955964, GE Healthcare, UK)を用いて５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（pH8.8）で３回（1時間、2時間、1日）透析した。アミコンウルトラ (UFC500324, Merck Millipore, Germany)を用いて濃縮した後、PierceTM BCA Protein Assay Kit（Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA）で蛋白濃度を測定した。また蛋白は、SDS-PAGEゲルで電気泳動した後にTaKaRa CBB Protein Safe Stain (TaKaRa, Japan)で染色し、予測分子量の位置に合致する単一バンドを確認した。
（ｂ）ＰＡＬ含有液の調製
　前記（ａ）で大腸菌を用いて作製した組み換えＰＡＬを用いて、下記の３種類のＰＡＬ含有液を調製した。
（ｉ）ＰＡＬ含有液（No.1）
　下記濃度になるように超純水にてＰＡＬ含有液を調製する。使用するまで４℃で保存。
　ＰＡＬ　　　　　　　１～３　ｍｇ／ｍＬ（蛋白含量として）
　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　　　５０　ｍＭ
　ＮａＣｌ　　　　　　１５４　ｍＭ
　アジ化ナトリウム　　３．３　ｍＭ
（ii）ＰＡＬ含有液（No.2）
　下記濃度になるように超純水にてＰＡＬ含有液（ストック用）を調製し、エッペンドルフに２０μＬずつ分注して、使用するまで－２０℃に保存する。使用前に品温を室温に戻し、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで１００μＬまでメスアップしてＰＡＬ含有液とする。
　ＰＡＬ　　　　　　５～１５　ｍｇ／ｍＬ（蛋白含量として）
　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　　　５０　ｍＭ
　ＮａＣｌ　　　　　　７７０　ｍＭ
　アジ化ナトリウム　１６．７　ｍＭ。
　なお、後述する参考実験例及び実験例では、上記方法で調製したＰＡＬ含有液を使用した（希釈後のＰＡＬ含有液中のＰＡＬ含有量は１～３ｍｇ／ｍＬ（蛋白含量として））。
（iii）ＰＡＬ含有液（No.3）
下記濃度になるようにＰＡＬ含有液（凍結乾燥用）を調製し、エッペンドルフに１００μＬずつ分注して、－８０℃で２４時間冷凍保存して予備凍結する。これを、凍結乾燥機を用いて凍結乾燥し、得られた凍結乾燥ＰＡＬを、使用するまで常温条件下で保存する。使用前に超純水で１００μＬを添加して凍結乾燥ＰＡＬを溶解してＰＡＬ含有液とする。　
　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　　　５０　ｍＭ
　ＰＡＬ　　　　　　　１～３　ｍｇ／ｍＬ（蛋白含量として）
　ＮａＣｌ　　　　　　１５４　ｍＭ
　アジ化ナトリウム　　３．３　ｍＭ
　トレハロース　　　　１０　ｍｇ／ｍＬ。
（ｃ）ＰＡＬの酵素活性（比活性）
　３０ｍＭのＰｈｅ水溶液９６μＬを９６ウェルプレートに入れ、３０℃で６分間静置した後、上記で作製したＰＡＬ含有液（No.3のうち、冷凍凍結前のもの）４μＬを混合し、３０℃で５秒おきに２分間、２７５ｎｍの吸光度を測定した。比活性(U/mg)は、以下の数式を用いて算出した (非特許文献１：Journal of Biotechnology 258 (2017) 148-157)。
　その結果、上記（ａ）で作製したＰＡＬ（大腸菌による組換体）の比活性は、0.332±0.014 U/mgであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
（ｄ）ＰＡＬの安定性
　下記表１に示すように、上記のＰＡＬは、凍結乾燥した後、その状態で少なくとも５週間保存（常温）した場合でも、本発明の使用に差し支えない酵素活性を保持している。
　表１は、前記（iii）で調製した凍結乾燥ＰＡＬを、常温で０日、１週間、３週間、５週間、各々保存した後に、これに超純水１００μＬを添加溶解してＰＡＬ含有液とした後に、上記（ｃ）の方法で、ＰＡＬの比活性(U/mg)を測定した結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１に示すように、ＰＡＬの比活性は、凍結乾燥後、常温下で５週間保存した場合でも、０．２ｍＵ以上保持されていた。このことから、大腸菌組み換えＰＡＬは乾燥状態で比較的安定であり、常温条件下で少なくとも５週間以内の保存であれば、本定量法に使用することができることが確認された。
参考実験例１
　健常者（ボランティア）６名の指先から毛細管血を採取し、これを被験血として、被験血中のアンモニア濃度を、アミチェックおよびアンモニア測定器を用いて測定した。血中アンモニア濃度の測定は、アミチェックの添付文書に記載する方法に従って実施した。
　結果を図１０に示す。健常者における正常な血中アンモニア値は６０μＭ以下であることが報告されているのに対して、得られたアンモニア値の平均は６８．２０±２８．７０μＭと高値であった。また被験血間で、測定値にバラツキが認められた。
　この理由として、指先の毛細血管から血液を採取する際に、指先の汗や汚れに含まれるアンモニアが混入し、毛細管血中のアンモニア量が正確に測定できなかった可能性が考えられた。このことは、アミチェックの添付文書に、「操作上の注意」として「汗や組織液が混入すると高値を示すことがあるため、指先血は使用しないでください。」と記載されていることとも合致する。
参考実験例２
　本発明の方法は、被験試料のＰｈｅにＰＡＬを反応させて生じるＰｈｅ由来アンモニアの量を測定することにより、間接的に被験者の血中Ｐｈｅ濃度を求める方法である。このため、測定前に被験試料中のアンモニア濃度が変動してしまうと、求めるＰｈｅ値に影響し、その信頼性が低下する。
　そこで、これを解決する方法として、健常者（ボランティア）７名の指先から採取した毛細管血を被験血として用いて、下記の操作を行った。
（１）仮接着されているアミチェックのスペーサー部（第１部材）とベースフィルム部（第２部材）とを分離する。
（２）スペーサー部の試料保持層に被験血（全血）を１０μＬ滴下する。
（３）そのままの状態で、０分、１分、２分、５分、及び１０分間の各時間、相対湿度４０～８０％ＲＨの条件下で放置した後に、スペーサーをベースフィルムの上に元通りに重ね合わせて、アミチェックの添付文書に記載されている通り、１８０秒間放置し、試料保持層で生じたアンモニアガスを指示薬層で反応させる。
（４）各放置時間ごとに、発色したベースフィルムの指示薬層部をアンモニア測定器の測定部に供して、アンモニア測定器に表示されたアンモニア測定値を読み取る。
　前記（３）の工程で放置した時間をＸ軸、放置時間０分のアンモニア測定値と各放置時間（１分、２分、５分、１０分間）のアンモニア測定値との比（各時間の測定値／０分の測定値：Ａ．Ｕ．)をＹ軸としてプロットしたグラフを図１１に示す。
　図１１に示すように、被験血をスペーサーの試料保持層に滴下した後、５分放置することで被験血中に含まれていたアンモニアの６１．２％が除去されることが確認された。さらに、１０分間静置することで、被験血中に含まれていたアンモニアの８６．７％までもが除去されることが確認された。このことから、仮に、被験血中にアンモニアが参考実験例１で測定された最大値の濃度で含まれている場合でも、スペーサー部の試料保持層に被験血を滴下後、当該スペーサーをベースフィルムと分離した状態で５～１０分間といった一定時間放置しておくことで、全アンモニア量の６１．２～８６．７％が除去され、アンモニア含量を１４．５～２６．４μＭ程度まで低減させることができることが確認された。被験血にこの程度アンモニアが残存していても、被験者の血中Ｐｈｅ濃度の測定にはほとんど影響がない。
実験例１
　健常者（ボランティア）３名（Ａ～Ｃ）の静脈から採血（静脈血）し、この被験血に既知濃度のＰｈｅ溶液を、被験血に５％ｖ／ｖとなる割合で添加混合した。なお、Ｐｈｅ溶液は、被験血へのＰｈｅの添加濃度が０～５００μＭになるように、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ水溶液に、段階的に溶解して作製した。
　被験血に既知量のＰｈｅを添加混合した被験試料を、２倍容量のＰＡＬ含有液と混合し、そのうち２０μＬをアミチェックの試料保持層に滴下して、１０分間常温で放置した。その後、ベースフィルムからスペーサーを剥がし、発色したベースフィルム上の指示薬層部をアンモニア測定器の測定部に供して、アンモニア測定器に表示されたアンモニア測定値を読み取った。
　３名の静脈血を被験血として、各々、被験血に添加したＰｈｅ濃度（μＭ）をＸ軸、アンモニア測定器による測定値（μＭ）をＹ軸にプロットした結果を図１２（Ａ）～（Ｃ）に示す。図１２に示すように、（Ａ）～（Ｃ）の結果から得られる回帰直線のＲ２は、それぞれ０．９９、０．９７、０．９９であった。
　この結果から、Ｐｈｅを含む静脈血を被験試料としてＰＡＬとの反応で生じるアンモニア量を、アミチェックを用いて測定することで、間接的に被験試料中のＰｈｅが定量できることが確認された。
実験例２
　フェニルケトン尿症（PKU）の患者(N=3)の指先から採取した毛細管血（被験血）１０μＬを、スペーサー（第１部材）とベースフィルム（第２部材）とを分離したアミチェックの、スペーサー上の試料保持層に滴下して、１０分間、常温で放置した。放置後にスペーサーをベースフィルム上の元の位置に重ね合わせ、ＰＡＬ含有液をスペーサー上の試料保持層に１０μＬ滴下し、再び１０分間常温で放置した。放置後に、発色したベースフィルム上の指示薬層部をアンモニア測定器の測定部に供して、アンモニア測定器に表示されたアンモニア測定値を読み取った。
　また、並行して、同ＰＫＵ患者の静脈から採取した血液（静脈血）の血漿を被験試料として、血漿中のＰｈｅ濃度の測定（HPLC法）を、外部の臨床検査会社（株式会社ビー・エム・エル）に委託した。
［ＨＰＬＣ法］
　測定試薬：アミノ酸キット（ニンヒドリン試液ワコー　アミノ酸自動分析装置用キット：富士フィルム和光純薬（株）製）
　アミノ酸分析計：Ｌ－８９００（（株）日立ハイテクノロジーズ）
　血漿Ｐｈｅ濃度（μＭ）をＸ軸、アンモニア測定器によるアンモニア測定値（μＭ）をＹ軸にプロットした結果を図１３に示す。図１３に示すように、回帰式はＹ＝０．１１５１Ｘ＋７８．７８であり、Ｒ２は０．９９であった。このことから、ＰＫＵ患者の毛細管血を被験血として本発明の方法で測定される被験血中のアンモニア濃度と、同ＰＫＵ患者の血漿中のＰｈｅ濃度とは非常によく相関しており、本発明の方法で被験血中のアンモニア濃度を測定することで、ＰＫＵ患者の血液中又は血漿中のＰｈｅ濃度が間接的に算出できる可能性が確認された。
実験例３
　実験例２の結果を検証するために、実験例２とは異なるＰＫＵ患者(N=3)の指先から採取した毛細管血１０μＬを被験血として、実験例２と同様にして、アミチェックとアンモニア測定器を用いて、被験血中のアンモニア濃度を測定した。また、実験例２と同様に、並行して、同ＰＫＵ患者の静脈から採取した血液（静脈血）を被験試料として、血漿中のＰｈｅ濃度の測定を外部業者に委託した。
　毛細管血を被験血として得られたアンモニア測定値（μＭ）を、実験例２で得られた回帰式を用いて、血漿Ｐｈｅ濃度に換算した値（血漿Ｐｈｅ予測値）（μＭ）をＹ軸、実際に測定した血漿Ｐｈｅ濃度（μＭ）をＸ軸にプロットした結果を図１４に示す。図１４に示すように、回帰式から得られるＲ２は０．８７９４であり、良好な相関が得られた。この結果から、本発明の方法で被験血中のアンモニア濃度を測定することで、被験者の血中Ｐｈｅ濃度が間接的に算出できることが確認された。
　なお、実験例２の図１３で得られた回帰式に、アンモニア測定器の測定可能範囲６～２４０μＭ（１０～４００μｇ／ｄＬ）を適用すると、検出可能な血中Ｐｈｅ濃度の範囲は０～１４００μＭであると概算される。
実験例４
　表２に記載する実験Ａ～Ｃを行い、実験Ａと実験Ｂ１、実験Ｂ２と実験Ｃを、それぞれ対比することで本定量法（実験Ｃ）の精度（毛細血中アンモニア濃度と血漿Ｐｈｅ濃度との相関性）を評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（１）実験Ａ及び実験Ｂ１
　ＰＫＵ患者(N=14)から静脈血及び毛細管血（指先から採血）を採取し、これらを被験血として、各々表２の実験例Ａ及びＢ１の方法で、血漿中及び毛細管血中のＰｈｅ濃度を測定した。
　得られた結果を、血漿Ｐｈｅ濃度をＸ軸に、毛細管血Ｐｈｅ濃度をＹ軸にプロットした（図１５）。この図から得られる回帰式はＹ＝０．８７３１Ｘ―１２．７５であり、Ｒ２は０．９９であった。この結果から、ＰＫＵ患者の血漿Ｐｈｅ濃度と毛細管血Ｐｈｅ濃度とは非常によく相関しており、前記回帰式を用いることによって、毛細管血Ｐｈｅ濃度から血漿Ｐｈｅ濃度が推定できることがわかる。なお、ＰＫＵ患者の血漿Ｐｈｅ濃度と毛細管血Ｐｈｅ濃度とが相関していることは、以前より報告されており（非特許文献３）、前記の結果は既報と整合していた。
（２）実験Ｂ２及び実験Ｃ２
　超純水を溶媒として、Ｐｈｅ濃度がそれぞれ０ｍＭ、１．２１ｍＭ、２．４２ｍＭ、及び３．６３ｍＭとなるように、各Ｐｈｅ水溶液を調製した。健常者の指先から採取した毛細管血に、前記各濃度のＰｈｅ水溶液を５％ｖ／ｖの割合で添加し混合し、これを被験試料(N=105)とした。
　前記被験試料について、表２の実験例Ｂ２の方法でＰｈｅ濃度を測定するとともに、実験例Ｃ２の方法でＮＨ３濃度を測定した。
　得られた結果を、Ｐｈｅ濃度をＸ軸に、ＮＨ３濃度（アンモニア測定値）をＹ軸にプロットした（図１６）。この図から得られる回帰式はＹ＝０．５００７Ｘ＋５０．４８５であり、Ｒ２は０．８１あった。
　この結果から、Ｐｈｅを含む毛細管血を被験試料として、ＰＡＬとの反応で生じるアンモニア量（Phe由来NH3）をアミチェック及びアンモニア測定器を用いて測定し、得られたアンモニア測定値に、前記回帰式を当てはめることで、間接的に被験試料中のＰｈｅ濃度が定量（推定）できることが確認された。
（３）実験Ａ～Ｃの結果の考察
　前記(１)と(２)で求めた２つの回帰式Ｙ＝０．８７３１Ｘー１２．７５とＹ＝０．５００７Ｘ＋５０．４８を組み合わせると、下記の関係式が成り立つ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　この関係式のＸに、ＰＫＵ患者由来の毛細管血(N = 11)を用いて実験Ｃ１を行って得られたアンモニア測定値を入れて、当該患者の静脈血の血漿Ｐｈｅ濃度（Ｙ）を算出した。この値（推定血漿Phe値）をＹ軸に、実験Ａで得られたＰＫＵ患者の静脈血の血漿Phe濃度をＸ軸にプロットした（図１７）。図１７に示すように、その回帰式のＲ２は０．９７であった。実際の血漿Ｐｈｅ値に対して推定血漿Ｐｈｅ値の測定誤差は平均９．５５％（95％信頼区間4.7～14.4)であり、このことから、本定量法による血漿Ｐｈｅ値の定量（推定的定量）は、臨床現場ないしは家庭での使用に差し支えない精度を有するものと考えられた。
　なお、前記で得られた回帰式に、アンモニア測定器の測定可能範囲６～２３５μＭ（１０～４００μｇ／ｄＬ）を適用すると、検出可能な血中Ｐｈｅ濃度の範囲は０～４３７μＭであると概算される。
　ＰＫＵ患者においては合併症の予防のために血漿Ｐｈｅ濃度を１２０～３６０μＭの範囲内でコントロールすることが推奨されている（新生児マススクリーニング対象疾患等診療ガイドライン２０１９、診断と治療社、１６ページ：非特許文献２）。このため、本発明の方法で検出できる血漿Ｐｈｅ濃度０～１４００μＭ、好ましくは０～４３７μＭは、臨床的に十分使用可能である。つまり、本発明の方法は、臨床的に実用可能な方法であり、しかも簡易に迅速に測定できるため、新生児におけるフェニルケトン尿症の早期発見のためのスクリーニング、フェニルケトン尿症患者のベッドサイドでの血中Ｐｈｅ濃度のモニタリング、また日常生活での食事療法における血中Ｐｈｅ濃度のモニタリング及び管理に有効に利用することができる。
１：本発明の試験片
２：本発明の試験片の第１のシート状部材
３：本発明の試験片の第２のシート状部材
１１：第１のシート状部材の基材（第１のシート基材）
１２：第１のシート状部材分の孔（ＮＨ３通気孔）
１３：第１のシート状部材の試料保持層
１４：第２のシート状部材の基材（第２のシート基材）
１５：第２のシート状部材の指示薬層
１６ａ：第２のシート状部材の接着層（指示薬層の前方部）
１６ｂ：第２のシート状部材の接着層（指示薬層の後方部）
４０：被験血
４１：採血用毛細管
４２：エッペンドルフ
４３：溶媒
４４：被験血と溶媒を含む被験試料
４５：試料保持層に滴下後放置した脱アンモニア被験試料
４６：フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）
４７：ＰＡＬを溶媒で溶解したＰＡＬ含有液
４８：被験血を含む被験試料とＰＡＬ含有液との反応スポット
４９：アンモニアガスに反応して発色した指示薬層
５：アンモニア測定器
５１：アンモニア測定器の測定結果を示す表示板

Claims (9)

  1. 　少なくとも２つのシート状部材からなる試験片を用いた被験者の血中フェニルアラニン濃度の定量方法であって、
    　前記試験片は、アルカリ緩衝剤を含有する試料保持層を備えた第１のシート状部材と、アンモニアガスと反応して変色する指示薬層を備えた第２のシート状部材が、剥離した状態又は剥離可能な状態で積層されてなるものであり、
    　前記定量方法は、下記（Ａ）～（Ｄ）の工程を有する方法である、血中フェニルアラニンの定量方法：
    （Ａ）被験者から採取した血液（被験血）を、そのまま又は希釈した後、第２のシート状部材と分離した状態で、前記試験片の第１のシート状部材の試料保持層に滴下し、一定時間放置する工程、
    （Ｂ）前記第１のシート状部材を、その試料保持層と第２のシート状部材の指示薬層とが非接触状態で重なるように、第２のシート状部材に積層し、当該試料保持層にフェニルアラニンアンモニアリアーゼ含有液を滴下し、一定時間放置する工程、
    （Ｃ）第２のシート状部材の指示薬層の色の程度から被験血中のアンモニア濃度を算出する工程、及び
    （Ｄ）前記のアンモニア濃度から被験者の血中フェニルアラニン濃度を算出する工程。
  2. 　前記第１のシート状部材の試料保持層中のアルカリ緩衝剤が、ホウ酸及び水酸化ナトリウムを含有するアルカリ緩衝剤であり、
    　前記第２のシート状部材の指示薬層で使用の指示薬が、ブロムクレゾールグリーンである、請求項１に記載する血中フェニルアラニンの定量方法。
  3. 　前記第１のシート状部材の試料保持層中のホウ酸及び水酸化ナトリウムの含有量が１部材あたり、それぞれ０．４０～０．４５ｍｇ及び０．１５～０．２０ｍｇであり、
    　前記第２のシート状部材の指示薬層中のブロムクレゾールグリーンの含有量が１部材あたり、０．３～０．５ｍｇであり、
    　前記（Ａ）工程で第１のシート状部材の試料保持層に適用する被験血の量が少なくとも１０μｌであり、
    　前記（Ｂ）工程で前記試料保持層に滴下するフェニルアラニンアンモニアリアーゼ含有液のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ量が少なくとも２ｍＵであり、
    　前記（Ｄ）工程で算出できる血中フェニルアラニン濃度が０～１４００μＭである、請求項２に記載する血中フェニルアラニンの定量方法。
  4. 　前記（Ｃ）工程が、指示薬層の色を波長６３５ｎｍの吸光度を測定する工程である、請求項３に記載する血中フェニルアラニンの定量方法。
  5. 　前記被験者から採取する血液（被験血）が毛細管血である、請求項１に記載する血中フェニルアラニンの定量方法。
  6. 　前記被験者がフェニルケトン尿症の患者である、請求項１に記載する血中フェニルアラニンの定量方法。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載する血中フェニルアラニンの定量方法に使用するための、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）、又は（ａ）～（ｃ）を含有するキット：
    （ａ）アルカリ緩衝剤を含有する試料保持層を備えた第１のシート状部材と、アンモニアガスと反応して変色する指示薬層を備えた第２のシート状部材が、剥離された状態又は剥離可能な状態で積層されてなる試験片、
    （ｂ）フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、
    （ｃ）溶媒。
  8. 　フェニルケトン尿症患者の血中フェニルアラニン濃度の管理方法であって、
    定期若しくは不定期に、毛細管血を被験試料として、請求項１～６のいずれか一項に記載する血中フェニルアラニン濃度の定量方法を実施する、前記管理方法。
  9. 　前記血中フェニルアラニン濃度の定量方法を、請求項７に記載するキットを用いて実施する、請求項８に記載する管理方法。
PCT/JP2022/020562 2021-05-17 2022-05-17 血中フェニルアラニン定量方法、及びそれに使用する測定キット WO2022244783A1 (ja)

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