WO2022214023A1 - 基于细胞死活表型的药物靶点拮抗剂的新型筛选系统 - Google Patents

基于细胞死活表型的药物靶点拮抗剂的新型筛选系统 Download PDF

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suicide
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姜海
陈奭爽
褚衍凯
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    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • a live detection cell expresses an exogenous fusion protein
  • the fusion protein is a fusion protein of a target protein and a cell suicide element, wherein the fusion protein induces all the proteins in the presence of a suicide inducer.
  • the suicide inducer does not induce the detection cell to undergo apoptosis.
  • the drug candidate is selected from the group consisting of a protein degrader of a target protein, a transcription inhibitor of the target protein, or a combination thereof.
  • the target protein is a disease target protein.
  • test substance to be screened is selected from small molecule compounds, nucleic acid molecules, and proteasome targeting chimeras (PROTAC).
  • the structure of the cell suicide element is shown in the following formula II:
  • C is a suicide gene element.
  • the F is the FKBP12-F36V domain.
  • amino acid sequence of the suicide gene element is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the method further comprises: (c2) testing the degradation effect of the drug candidate on the target protein, the inhibitory effect on the transcription of the target protein, and/or the preventive or therapeutic effect on the disease related to the target protein .
  • an apoptosis screening module includes one or more culture units, and the culture unit is provided with n culture chambers (or wells) (compartments) for culturing live detection cells, wherein the culture chamber contains the screening system for screening inhibitors against the target protein according to the first aspect of the present invention; n is a positive integer ⁇ 2;
  • the number of the culture units is 1-200, preferably 4-100, more preferably 8-50, and most preferably 10-20.
  • a fusion protein is provided, and the structure of the fusion protein is shown in formula I:
  • the disease target is selected from the group consisting of: tumor-promoting protein target, tumor immune target, diabetes target, neurodegenerative disease target, novel coronavirus target, genetic disease target, or its combination.
  • the disease target protein is selected from the following group: PD-1, PD-L1, CD47, LAG3, TIGIT, KRas, Myc, TERT, SKP2, AR, PAX3, DUX4, SGLT2, SNCA, RdRp , NSP7, NSP8, RBD, IMPDH1, RANK, ⁇ -Catenin, FLI1, Caspase1, Spike, NSP8.
  • L2 is no or flexible joint
  • the F is the FKBP12-F36V domain.
  • the FKBP12-F36V domain comprises a FKBP domain, and the 36th amino acid of the FKBP domain is mutated from phenylalanine to valine.
  • nucleic acid molecule encoding the fusion protein according to the fifth aspect of the present invention.
  • a vector containing the nucleic acid molecule according to the sixth aspect of the present invention there is provided a vector containing the nucleic acid molecule according to the sixth aspect of the present invention.
  • novel screening system of the present invention screening system for protein degraders of the present invention
  • drug screening system based on conditional suicide protein (F-C fusion protein) can be used interchangeably, and all refer to the present invention.
  • the screening system for screening an inhibitor against a target protein according to the first aspect.
  • the sequence of the target protein PD1 is:
  • novel screening system of the present invention can be applied to the screening of antagonists of various disease target proteins
  • PD1 was fused to F-C protein and expressed in cells.
  • the artificially synthesized small molecule compound A6 was screened through the screening process in Figure 4. After the cells expressing PD1-F-C fusion protein were treated with DMSO or A6 for 24 h, and AP1903 was added, the cells in the DMSO control group died, but after compound A6 was added, the cells no longer died, suggesting that A6 has an antagonistic effect on PD1 gene.
  • Jurkat cells were activated by PMA and inonmycin, and treated with A6 at the same time.
  • the PD1 mRNA expression level was detected by qPCR, and the PD1 mRNA level was significantly decreased in the cells treated with A6.
  • the experimental results showed that A6 treatment was added while activating Jurkat T cells. It can be seen by FACS and qPCR that compared with the control group, the A6-treated Jurkat T cells had no expression of PD1 on the membrane surface, and the expression of PD1 mRNA in the cells. The amount is also lower.
  • Jurkat cells overexpressing exogenous HA-PD1 were treated with A6, and the level of PD1 was detected by Western Blot, and the level of PD1 protein in cells treated with A6 was decreased.
  • the inventors also tested in Jurkat T cells stably expressing exogenous HA tag-PD1. Western Blot results showed that Jurkat-HA-PD1 cells treated with A6 had lower PD1 stability.
  • the inventors constructed a simple and efficient experimental system for screening target gene transcription inhibitors and protein degraders by using the fusion of F-C protein and drug target protein.
  • Example 3 High-throughput screening of the protein degrader screening system of the present invention
  • LAG3 a target for tumor immunotherapy. As a co-inhibitory receptor, LAG3 regulates immune homeostasis, T cell activation and function, and cytokine production by transmitting immunosuppressive signals. important role.
  • Spike and NSP8 Targets for the novel coronavirus.
  • SARS-CoV-2 enters cells by binding to the human cell surface receptor ACE2 through Spike;
  • NSP8 is very important for RNA replication of the coronavirus family, and its structure is damaged, which will seriously affect viral RNA synthesis.
  • the target protein and green fluorescent protein GFP are formed into a fusion protein, and the transcription inhibitor or protein degrader of the target protein is screened according to the change of the fluorescence intensity of GFP.
  • the phenotype mediated by the conditional suicide protein FKBP12(F36V)-Caspase9 of the present invention is a highly sensitive and stable experimental phenotype, and a reduction of 75% can produce a very clear phenotype. Changes in live and dead phenotypes.
  • the screened PD1 transcription inhibitor compound A6 can clearly change the dead-live phenotype under the PD1-F-C fusion system.
  • Fig. 7c in the PD1-GFP fusion protein system, treated with the same experimental conditions, the change of the GFP fluorescence value was imperceptible by the treatment of compound A6.
  • HPRT after HPRT activates 6TG, it undergoes monophosphorylation, diphosphorylation, triphosphorylation, ribose deoxygenation, incorporation into DNA, recognition by clip mismatch mechanisms, DNA damage, double-strand breaks, p53 activation, PUMA expression, mitochondrial
  • caspase 9 can be activated to kill cells. All of these processes may be interfered with by compounds, resulting in cell survival phenotypes independent of target protein expression levels, resulting in false-positive results in high-throughput screening.

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Abstract

提供了一种基于细胞死活表型的药物靶点拮抗剂的新型筛选系统。具体地，基于靶蛋白和条件自杀蛋白FKBP12(F36V)-Caspase9，设计了一种筛选体系，用于筛选靶蛋白的抑制剂或降解剂。筛选系统稳定高效，表型明显易于观察，可用于高通量筛选。

Description

基于细胞死活表型的药物靶点拮抗剂的新型筛选系统 技术领域
本发明涉及生物筛选领域，具体涉及一种基于细胞死活表型的药物靶点拮抗剂的新型筛选系统。
背景技术
细胞中某些蛋白质的异常积累会导致一些疾病的发生，这些蛋白是各种疾病中的重要靶点。例如，KRAS蛋白的异常激活与多种肿瘤的发生有关；SNCA蛋白的异常激活与一些神经退行性疾病的发生有关。除此以外，一些病原体来源的蛋白也是疾病治疗的重要靶点，例如新冠病毒的RNA聚合酶和Spike蛋白。
在针对这些疾病的治疗方法的探索中，针对靶标蛋白的抑制剂是常见的制药策略。但是，当靶标蛋白不是激酶时，很难设计和筛选抑制剂。这使得目前很多重要的疾病靶标没有药物干预手段。从理论上讲，如果可以发展针对疾病靶标蛋白的特异性转录抑制剂、特异性蛋白降解剂，可以大幅扩展针对这些疾病进行药物干预的可能性。然而，细胞中靶标基因的转录抑制或蛋白降解本身并不是一个可视化的生物过程，因此目前还没有稳定而适用的高通量筛选系统。
综上所述，急需开发一种稳定、高效、表型可视化的高通量筛选系统。
发明内容
本发明目的就是提供了一种稳定、高效、表型可视化的高通量筛选系统。
在本发明的第一方面，提供了一种用于筛选针对靶标蛋白的抑制剂的筛选体系，所述筛选体系包括一培养体系以及存在于所述培养体系中的以下组分：
(a)活的检测细胞，所述检测细胞表达外源的融合蛋白，所述的融合蛋白为靶标蛋白和细胞自杀元件的融合蛋白，其中，所述融合蛋白在自杀诱导剂存在下会诱导所述检测细胞发生凋亡；
(b)待筛选的测试物；
其中，当所述检测细胞表达所述的融合蛋白且所述的测试物不导致所述融合 蛋白降解或减少时，所述自杀诱导剂会诱导所述检测细胞发生凋亡；
并且，所述测试物导致所述检测细胞不表达所述的融合蛋白或导致所述融合蛋白降解或减少时，则所述自杀诱导剂不诱导所述检测细胞发生凋亡。
在另一优选例中，当所述测试物导致所述检测细胞不表达所述的融合蛋白或导致所述融合蛋白降解或减少时，则所述的测试物被认为是候选药物。
在另一优选例中，所述的候选药物选自下组：靶标蛋白的蛋白降解剂、靶标蛋白转录抑制剂或其组合。
在另一优选例中，所述筛选体系还包括：
(c)自杀诱导剂，所述自杀诱导剂通过所述的融合蛋白诱导所述检测细胞凋亡。
在另一优选例中，所述待筛选的测试物为所述靶标蛋白的蛋白降解剂和/或转录抑制剂。
在另一优选例中，所述的靶标蛋白为疾病靶标蛋白。
在另一优选例中，所述疾病靶标蛋白选自下组：PD1、PD-L1、CD47、LAG3、TIGIT、KRas、Myc、TERT、SKP2、AR、PAX3、DUX4、SGLT2、SNCA、RdRp、NSP7、NSP8、RBD、IMPDH1、RANK、β-Catenin、FLI1、Caspase1、刺突蛋白(Spike)、NSP8。
在另一优选例中，所述待筛选的测试物选自小分子化合物、核酸分子、蛋白酶体靶向嵌合体(PROTAC)。
在另一优选例中，当自杀诱导剂存在下，所述的融合蛋白形成二聚体，从而诱发细胞凋亡。
在另一优选例中，当自杀诱导剂不存在下，所述的融合蛋白维持单体形式，不诱发细胞凋亡。
在另一优选例中，所述靶标蛋白和细胞自杀元件的融合蛋白结构如式I所示：
B-L1-A   式I
式中，
B为疾病靶标蛋白；
A为细胞自杀元件；
L1为无或接头序列；
“-”独立地为连接肽或肽键。
在另一优选例中，所述的细胞自杀元件的结构如下式II所示：
F-L2-C   (II)
其中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
F为自杀基因诱导元件；
L2为无或柔性接头；
C为自杀基因元件。
在另一优选例中，所述的细胞自杀元件包含iCasp9。
在另一优选例中，所述的C为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9的编码基因(Caspase9基因)。
在另一优选例中，所述的F为FKBP12-F36V结构域。
在另一优选例中，所述的FKBP12-F36V结构域包含FKBP结构域，且FKBP结构域的第36位氨基酸由苯丙氨酸突变为缬氨酸。
在另一优选例中，所述L2的序列如SEQ ID NO:1的109-114位氨基酸所示(Ser-Gly-Gly-Gly-Ser)。
在另一优选例中，所述自杀基因元件的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中，所述自杀诱导剂为AP1903。
在另一优选例中，所述细胞为基因工程化的细胞。
在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。
在另一优选例中，所述细胞选自：人肾上皮细胞(293A细胞)、人外周血白血病T细胞(Jurkat T细胞)、JHH7细胞、Hela细胞。
在本发明的第二方面，提供了一种筛选针对靶标蛋白的候选药物的方法，包括步骤：
(a)将加入待筛选的测试物的培养体系作为实验组；将不加入测试化合物的培养体系作为空白对照组，其中，所述的培养体系中含有培养的活的检测细胞，所述检测细胞表达外源的融合蛋白，所述的融合蛋白为所述靶标蛋白和细胞自杀元 件的融合蛋白，其中，所述融合蛋白在自杀诱导剂存在下会诱导所述检测细胞发生凋亡；和
(b)向所述实验组和空白对照组中加入自杀诱导剂，观测实验组和空白对照组中检测细胞的存活情况；
其中，当实验组中检测细胞的存活数量显著高于对照组时，则表明该测试物为候选药物。
在另一优选例中，所述的候选药物包括蛋白降解剂和/或转录抑制剂。
在另一优选例中，所述“显著高于”指在实验组中检测细胞的存活数量E1与空白实验组中检测细胞的存活数量E0之比(E1/E0)≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥4。
在另一优选例中，所述方法还包括：(c1)将上一步确定的候选药物，进一步测试或分析所述候选药物对融合蛋白的作用方式：
其中，若所述候选药物降解检测细胞中融合蛋白，则所述候选药物为靶标蛋白的蛋白降解剂；和/或
若所述候选药物减少或抑制检测细胞中融合蛋白的表达，则所述候选药物为靶标蛋白的转录抑制剂。
在另一优选例中，所述方法还包括：(c2)测试所述候选药物对靶标蛋白的降解作用，对靶标蛋白转录的抑制作用，和/或对靶标蛋白相关的疾病的预防或治疗作用。
在本发明的第三方面，提供了一种如本发明的第一方面所述的筛选体系的用途，用于筛选靶标蛋白的蛋白降解剂和/或转录抑制剂。
在本发明的第四方面，提供了一种用于筛选针对靶标蛋白的抑制剂的筛选装置，所述装置包括：
(d1)凋亡筛选模块，所述的凋亡筛选模块包括一个或多个培养单元，所述培养单元中设有n个用于培养活的检测细胞的培养室(或孔)(compartment)，其中在所述培养室中含有本发明的第一方面所述的用于筛选针对靶标蛋白的抑制剂的筛选体系；n为≥2的正整数；
(d2)数据采集模块，所述数据采集模块被配置为对凋亡筛选模块中各个培养 室中的所述检测细胞的凋亡情况进行数据采集；
(d3)筛选分析模块，所述筛选分析模块被配置为对来自所述数据采集模块的细胞凋亡情况进行分析，获得待筛选的测试物是否是针对靶标蛋白的抑制剂的分析结果；和
(d4)输出模块，所述输出模块输出筛选分析模块的分析结果。
在另一优选例中，所述培养单元的数量为1-200个，较佳地4-100个，更佳地8-50个，最佳地10-20个。
在另一优选例中，n为≥16，较佳地≥48，更佳地≥96，如16-100000，48-10000，或96-5000。
在另一优选例中，所述的培养单元为多孔板，如1536孔板，384孔板，96孔板。
在另一优选例中，所述的检测细胞的培养室(或孔)的体积为5μl-5ml。
在另一优选例中，所述的筛选系统为高通量筛选系统。
在另一优选例中，所述的培养单元中设有空白对照组的培养室和实验组的培养室，其中，将加入待筛选的测试物的培养体系作为实验组，并将不加入测试化合物的培养体系作为空白对照组。(即除了加入或不加入待筛选的测试物之外，实验组和空白对照组的其他条件相同)。
在另一优选例中，在所述的培养单元中，设有m个不同的实验组，以测试m种不同的待筛选的测试物或测试物的组合，m为≥1的正整数(1-1600)。
在本发明的第五方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白的结构如式I所示：
B-L1-A   式I
式中，
B为疾病靶标蛋白；
A为细胞自杀元件；
L1为无或接头序列；
“-”独立地为连接肽或肽键。
在另一优选例中，所述疾病靶标选自下组：促癌蛋白靶点、肿瘤免疫靶点、糖尿病靶点、神经退行性疾病靶点、新冠病毒靶点、遗传病靶点，或其组合。
在另一优选例中，所述疾病靶标蛋白选自下组：PD-1、PD-L1、CD47、LAG3、TIGIT、KRas、Myc、TERT、SKP2、AR、PAX3、DUX4、SGLT2、SNCA、RdRp、NSP7、NSP8、RBD、IMPDH1、RANK、β-Catenin、FLI1、Caspase1、刺突蛋白(Spike)、NSP8。
在另一优选例中，所述的细胞自杀元件的结构如下式II所示：
F-L2-C   (II)
其中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
F为自杀基因诱导元件；
L2为无或柔性接头；
C为自杀基因元件。
在另一优选例中，所述的细胞自杀元件包含iCasp9。
在另一优选例中，所述的C为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9的编码基因(Caspase9基因)。
在另一优选例中，所述的F为FKBP12-F36V结构域。
在另一优选例中，所述的FKBP12-F36V结构域包含FKBP结构域，且FKBP结构域的第36位氨基酸由苯丙氨酸突变为缬氨酸。
在另一优选例中，所述L2的序列如SEQ ID NO:1的109-114位氨基酸所示(Ser-Gly-Gly-Gly-Ser)。
在另一优选例中，所述自杀基因元件的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的第六方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码如本发明的第五方面所述的融合蛋白。
在本发明的第七方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明的第六方面所述的核酸分子。
在本发明的第八方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明的第七方面所述的载体或染色体中整合有如本发明的第六方面所述的核酸分子。
在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。
在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。
在另一优选例中，所述细胞选自：人肾上皮细胞(293A细胞)、人外周血白血病T细胞(Jurkat T细胞)、JHH7细胞、Hela细胞。
在另一优选例中，提供一种工程化的293A细胞，所述工程化的293A细胞表达如本发明的第五方面所述的融合蛋白，其中融合蛋白的结构中包含细胞自杀元件，所述细胞自杀元件为iCasp9。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了AP1903诱导FKBP12(F36V)-△CASP9二聚示意图。
图2显示了药物靶点的表达抑制和蛋白降解导致细胞由“死亡”变“存活”的示意图。图中蓝色球(左)代表靶标蛋白，红色球(右)代表F-C蛋白，在细胞中作为一个融合蛋白表达。无药物干扰时，AP1903诱导细胞凋亡；加入抑制靶标基因转录或降解靶标蛋白的药物，AP1903不诱导细胞凋亡。
图3显示了蛋白抑制剂筛选细胞系验证；a图为靶蛋白抑制剂筛选系统元件示意图；b图为表达各靶标蛋白与FKBP12(F36V)-△CASP9融合蛋白的细胞，经AP1903处理后死亡。
图4显示了高通量药物的筛选流程。
图5显示了PD1抑制剂的化合物A6的筛选和验证图。其中，a显示了表达PD1-F-C蛋白的细胞经DMSO或PD1转录抑制剂A6处理24h后的存活状态；b显示了通过流式细胞仪染色检测Jurkat细胞中PD1的表达水平；PMA和离子霉素(ionomycin)激活细胞中PD1的表达，其中，图中的x轴表示细胞PD1的荧光强度，y轴表示细胞的均一程度；c显示了Jurkat细胞经PMA和inonmycin激活，同时用A6处理，qPCR检测PD1 mRNA表达水平图；d显示了过表达外源HA-PD1的Jurkat细胞用A6处理的Western Blot检测PD1水平图，actin为肌动蛋白；e显示了PD1编码序列的568-639核酸序列与KRas的编码序列融合示意图，其中int为内含子，ext为外显子；f显示了PD1与KRas如5e中的方式(即PD1-1-KRAS)融合表达 时，通过DMSO和A6处理后，qPCR检测PD1-1-KRAS的mRNA表达水平图；g显示了KRAS序列没有与PD1这段序列融合表达时，使用A6处理，qPCR检测KRAS mRNA表达水平图。
图6显示了SKP2特异的蛋白降解剂B3的筛选和验证图，其中a显示了SKP2-F-C细胞经DMSO或SKP2蛋白降解剂B3处理24h后再加入AP1903的细胞存活状态图，其中，DMSO对照组细胞死亡，B3处理组细胞存活，no treatment为无处理组；6显示了表达SKP2-F-C蛋白的细胞以及JHH7细胞用B3处理，Western Blot检测SKP2在12h、24h、48h表达水平，经B3处理的细胞SKP2蛋白水平显著降低；6显示了表达SKP2-F-C蛋白的细胞以及JHH7细胞用B3处理，qPCR检测SKP2在12h、24h、48h的mRNA水平，经B3处理的细胞SKP2表达量差异不大；d显示了B3处理后，显著促进JHH7细胞内SKP2蛋白的降解；d'显示了B3处理后，显著促进Hela细胞内SKP2蛋白的降解。
图7显示了PD1-GFP的融合蛋白系统与本发明F-C蛋白融合系统的比较；其中a显示了经有效药物处理后，本发明F-C蛋白融合系统的表型变化；b显示了经有效药物处理后，PD1-GFP的融合蛋白系统的荧光值变化；c显示了经A6处理后，PD1-GFP的融合蛋白系统的荧光值变化。
图8显示了免疫印迹实验对高通量筛选获得的不同靶点蛋白(β-Catenin、FLI1、LAG3、Caspase1、Spike、NSP8)的降解剂(化合物1-12)的验证结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，设计了一种基于条件自杀蛋白(F-C融合蛋白)的药物筛选系统。具体地，将靶标蛋白与F-C蛋白在细胞中融合表达，构建靶蛋白-“自杀蛋白”表达细胞系，通过化合物库药物及自杀诱导药物(如AP1903)筛选存活的细胞，筛选能阻止细胞凋亡的对应化合物，进而筛选靶标蛋白的抑制剂或降解剂。本发明的筛选方法中，“死活”实验表型易于观察，筛选系统高效、简单、适用于高通量筛选。在此基础上完成本发明。
术语
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求 书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文作用，术语“本发明的新型筛选系统”、“本发明的蛋白降解剂筛选系统”、“基于条件自杀蛋白(F-C融合蛋白)的药物筛选系统”可以互换使用，均指本发明的第一方面所述的用于筛选针对靶标蛋白的抑制剂的筛选体系。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。
本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,100％。
细胞自杀元件
本发明中所用细胞自杀元件可以为单纯疱疹病毒胸苷激酶(the herpes symplex virus thymidine kinase，HSV-TK)、可诱导的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(inducible caspase 9,iCasp9)、CD20、突变型人胸苷酸激酶(mutated human thymidylate kinase，mTMPK)等。
在本发明一优选实施例中，iCasp9细胞自杀元件包含FKBP12-F36V结构域，可通过柔性Ser-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:1的109-114位)连接半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Caspase 9)，后者不含募集结构域。FKBP12-F36V包含一个FKBP结构域，在第36个氨基酸残基位点上苯丙氨酸替代了缬氨酸。它具有高选择性和亚纳摩尔亲和力，能够结合二聚合成配基，如其他惰性小分子AP1903。当加 入小分子后，能够促使其二聚化，从而诱导细胞的凋亡，而对未携带自杀基因的正常细胞无效用。
如本文所用，本发明的条件自杀蛋白、“F-C蛋白”、“F-C融合蛋白”、“FKBP12(F36V)-△CASP9”和“FKBP12(F36V)-Caspase9”可以互换使用，均指本发明中的iCasp9细胞自杀元件，表达该融合蛋白的细胞能够被自杀诱导药物AP1903诱导凋亡。
本发明中的条件自杀蛋白FKBP12(F36V)-Caspase9，表达该蛋白的细胞能够被自杀诱导药物AP1903诱导凋亡。其中，caspase9是细胞凋亡的执行者，它在二聚后产生活性引发凋亡。FKBP12-F36V可以在化合物AP1903的诱导下发生二聚。因此，将FKBP12-F36V与caspase9融合(下文中简写为F-C蛋白)并表达后，AP1903的加入可以诱导caspase9的二聚，并迅速引发细胞凋亡。其诱导过程如图1所示。
诱导安全开关caspase9(iCasp9)使用人的caspase9融合FK506结合蛋白(FKBP)，使其可以用化学诱导剂(AP1903/Rimiducid，Bellicum Pharmaceutical)诱导形成二聚体，导致表达融合蛋白的细胞凋亡。
融合蛋白
PD1是一个重要的肿瘤免疫靶点，目前还没有PD1的化学拮抗剂。
SKP2是一个重要的促癌基因和广受关注的癌症治疗靶点，但是目前缺少针对性的抑制手段。
如本文所用，“本发明融合蛋白”、“重组融合蛋白”均指靶标蛋白与条件自杀蛋白FKBP12(F36V)-Caspase9融合的蛋白。
如本文所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。
本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸 残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与本发明的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与本发明的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
此外，还可以对本发明融合蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括： 体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
术语“编码本发明融合蛋白的多核苷酸”可以是包括编码本发明融合蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或融合蛋白的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的融合蛋白的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。
本发明的融合蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。
本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
表达载体
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的融合蛋白。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码本发明融合蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，编码融合蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明融合蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、植物细胞(如人参细胞)。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl 2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl 2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的设计方法
本发明中，将靶标蛋白与“条件自杀蛋白”连接在一起，形成一个融合蛋白表达于细胞中，使这些细胞能够被自杀诱导药物诱导凋亡。本发明的筛选系统建立在上述的F-C融合蛋白的条件自杀特性上。例如，将KRas与上述的F-C融合并表达于细胞后，加入AP1903导致细胞死亡(图2)。如果在细胞培养液中存在KRas的特异转录抑制剂，或者KRas的特异蛋白降解剂，则会导致细胞中不再有KRas-F-C融合蛋白，加入AP1903后细胞会存活下来。利用这种方法，可以将目标蛋白KRas的转录抑制和蛋白降解转化为一个细胞从“死亡”到“存活”的可视的实验表型。
本发明的F-C融合蛋白的筛选系统可以应用于多种疾病的重要靶点。如图3a所示，将与疾病相关的重要疾病靶标蛋白和F-C做了融合表达，构建表达细胞株，经验证，在不存在靶标蛋白降解剂的情况下，AP1903处理后这些细胞会发生凋亡。说明这些融合表达的细胞对自杀诱导药物响应良好，可以通过细胞从“死亡”到“存活”的可视化表型来筛选特定靶标蛋白的降解剂。
在本发明中，所述降解剂在十余个疾病靶点的平行筛选中只能降解特定的靶蛋白。表明此物质对靶蛋白具有选择性，排除了靶向F-C蛋白的降解剂，最大程度避免了假阳性。
在另一优选例中，覆盖的靶点选自：重要促癌蛋白(KRas、Myc、TERT、SKP2、AR、IMPDH1、RANK)、癌症免疫领域的重要靶点(PD1、PD-L1、CD47、LAG3、TIGIT)、糖尿病靶点(SGLT2)、神经退行性疾病靶点(SNCA)、新冠病毒靶点(RdRp、NSP7、NSP8、Spike蛋白RBD结构域)、遗传病靶点(PAX3、DUX4)，如图3b所示。
应理解，本发明中的靶标蛋白与“条件自杀蛋白”可以以头-头、头-尾、或尾-尾方式相连。所述的“头部”指多肽或其片段的N端，尤其是野生型多肽的或其片段的N端，所述的“尾部”指多肽或其片段的C端，尤其是野生型多肽的或其片段的C端。
在另一优选例中，所述FKBP12(F36V)-Caspase9的序列为:
Figure PCTCN2022085517-appb-000001
Figure PCTCN2022085517-appb-000002
靶蛋白PD1的序列为:
Figure PCTCN2022085517-appb-000003
筛选方法
本发明的筛选系统可以对同一批化合物同时进行十多个重要疾病靶点的高通量筛选。
在另一优选例中，本发明的高通量化合物筛选方法如下：
将各个靶点的F-C融合蛋白表达细胞培养于384孔板后，将化合物文库由高通量筛选装置加入每个孔中，24小时后再加入自杀诱导药物AP1903处理。如图4所示，绝大多数孔中的细胞凋亡，个别孔的细胞存活，表明这些孔中所对应的化合物可能影响细胞中靶标蛋白的水平。每个孔中的细胞存活情况可由照相分析软件自动生成统计表格。同一批化合物可以对多个靶点同时筛选，因此可特异性地筛出针对某个靶点的转录抑制剂或蛋白降解剂。
在一优选例中，本发明人将PD1与F-C蛋白融合并表达于细胞中，通过图4的筛选流程筛选到化合物A6。后续的验证试验说明，本发明的系统筛选到的药物A6对PD1的mRNA转录具有很强的抑制作用。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的新型筛选系统中的死活表型高度稳定而简单可视；
(b)本发明的新型筛选系统可用于高通量筛选，操作简单且一致性高；
(c)本发明的新型筛选系统可适用于多种疾病靶标蛋白的拮抗剂的筛选；
(d)本发明的新型筛选系统反应灵敏、结果呈线性、抗干扰性强；
(e)本发明的新型筛选系统反应仅需要很少量的化合物即可实现高效、快速的高通量筛选。
下面的具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如(Sambrook和Russell等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版)(2001)CSHL出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：PD-1与F-C蛋白融合体系
将PD1与F-C蛋白融合并表达于细胞中。通过图4的筛选流程筛选到人工合成小分子化合物A6。表达PD1-F-C融合蛋白的细胞经DMSO或A6处理24h后，添加AP1903处理，DMSO对照组细胞死亡，而添加了化合物A6后，细胞不再死亡，提示A6对于PD1基因存在拮抗作用。
实验结果如图5a所示，该化合物处理后的细胞经AP1903处理后存活，表明该化合物可能对PD1基因的转录有影响。
在同批筛选的近10个疾病蛋白靶点中，该化合物仅对表达PD1-F-C融合蛋白的细胞显效，表明其具有靶点特异性，而不是一个普遍的干扰基因转录、蛋白降解，或是抑制细胞凋亡的化合物。
本发明人在Jurkat T细胞中做了进一步的验证。通过流式细胞仪染色检测细胞PD1的表达水平。Jurkat T细胞可被PMA和离子霉素激活，促进细胞中PD1的转录表达。
如图5b所示，Jurkat细胞经10ng/ml PMA和1μM离子霉素(ionomycin)激活后，DMSO对照组PD1的表达水平显著上调。用A6处理的实验组PD1的表达水平基本没有上调。
如图5c所示，Jurkat细胞经PMA和inonmycin激活，同时用A6处理，qPCR检测PD1 mRNA表达水平，经A6处理的细胞PD1 mRNA水平显著降低。
实验结果表明，在激活Jurkat T细胞的同时，添加A6处理，通过FACS和qPCR检测可以看到，相比于对照组，经A6处理的Jurkat T细胞膜表面PD1基本没有表达，细胞中PD1 mRNA的表达量也较低。
如图5d所示，过表达外源HA-PD1的Jurkat细胞用A6处理，Western Blot检测PD1水平，经A6处理的细胞PD1蛋白水平降低。本发明人也在稳定表达外源HA tag-PD1的Jurkat T细胞中进行了检测，Western Blot结果表明，经A6处理的Jurkat-HA-PD1细胞，具有较低的PD1稳定性。
在PD1的编码序列上定位一段几十个碱基的序列，将该序列融合到其余靶点后，会导致那些靶点的mRNA转录水平也受到A6的抑制，这进一步证明了A6通过特异性抑制PD1转录，影响其功能。如图5e和5f所示，PD1编码序列的568-639核酸序列与KRas的编码序列融合后，A6可以抑制KRas融合蛋白的mRNA表达。如图5g所示，KRas序列没有融合PD1的这段序列时，A6对KRas mRNA没有抑制作用。
因此，本发明的系统筛选到的药物A6对PD1的mRNA转录具有很强的抑制作用。
实施例2：SKP2与F-C蛋白融合体系
本发明人将SKP2与F-C蛋白融合并表达于细胞中。构建表达SKP2-F-C融合蛋白的筛选体系，通过图4的高通量筛选流程发现了SKP2特异的蛋白降解剂：人工合成小分子化合物B3(图6a)。表达SKP2-F-C蛋白的细胞经DMSO或B3处理24h后再加入AP1903，DMSO对照组细胞死亡，B3处理组细胞存活。
如图6b所示，表达SKP2-F-C蛋白的细胞和JHH7细胞用B3处理，Western Blot检测SKP2水平。实验结果表明，经B3处理的细胞SKP2蛋白水平显著降低。表达SKP2-F-C蛋白的细胞以及JHH7细胞用B3处理，通过qPCR检测SKP2 mRNA水平，结果如图6c所示，经B3处理的细胞SKP2蛋白表达量差异不大。
如图6d-d'所示，通过B3处理JHH7细胞和Hela细胞，显著促进细胞内SKP2蛋白的降解。
细胞实验证明该抑制剂作用于蛋白降解(图6b、d)，而对mRNA水平没有影响(图6c)。在十余个疾病靶点的平行筛选中，这一化合物仅对表达SKP2-F-C蛋白的细胞显现出保护作用，表明该化合物对于SKP2蛋白具有特异性。
综上所述，本发明人利用F-C蛋白与药物靶标蛋白的融合，构建了一个简单而高效的，可用于筛选靶标基因转录抑制剂和蛋白降解剂的实验系统。
实施例3：本发明的蛋白降解剂筛选系统的高通量筛选
运用本发明的筛选体系，采用与实施例1、2类似的方法，本发明人使用两个化合物文库(约1.2万个化合物)，对30多个重要疾病靶点进行了高通量筛选。
其中，对于十余个靶点蛋白发现了降解剂，其中一些已用Western Blotting做了初步验证，如图8所示。这些靶点的疾病相关性如下：
β-Catenin:癌症靶点。是近20％的肝癌和子宫内膜癌、近40％的软组织肉瘤和脑膜瘤、近6％的胃癌和肠癌病例中的驱动突变。β-Catenin突变后，导致其无法被细胞内在机制降解，从而不受控地异常激活，促进细胞增殖和癌症发生发展。本次筛选使用的是肿瘤中的激活突变体，筛到两个化合物可以促进这些激活突变体的降解。
FLI1：癌症靶点。是绝大多数尤文氏肉瘤中的重排基因。FLI1与EWSR融合后，表达的融合蛋白作为转录因子，驱动尤文肉瘤的发生、发展及转移。
LAG3：肿瘤免疫治疗的靶点。LAG3作为共抑制受体，通过传递免疫抑制信号调节机体免疫稳态、T细胞的活化和功能以及细胞因子的产生等多个环节，在自身免疫耐受及肿瘤的发生、发展和免疫逃逸方面具有重要作用。
Caspase1：急性炎症的靶点。炎症小体激活caspase-1，从而促进IL-1β的成熟和释放，并启动启动的下游细胞焦亡反应等一系列炎症事件。
Spike及NSP8：新型冠状病毒的靶点。SARS-CoV-2通过Spike结合人细胞表面受体ACE2从而进入细胞；NSP8对于冠状病毒家族的RNA复制十分重要，其结构受到破坏会导致病毒RNA合成受严重影响。
以上的结果进一步地证明了本发明的蛋白降解剂筛选系统的高效性。
对比例 靶标蛋白-GFP的融合蛋白筛选体系
将靶标蛋白和绿色荧光蛋白GFP形成融合蛋白，依据GFP的荧光强度变化筛选靶标蛋白的转录抑制剂或蛋白降解剂。
如图7b所示，GFP的荧光强度的读数在显示上是对数形式，一个化合物仅仅降低75％的靶标蛋白水平，在GFP的指数轴读数上变化是相当小的，其低灵敏度难以进行准确的高通量的化合物筛选。
与本发明筛选体系相比，如图7a所示，本发明的条件自杀蛋白FKBP12(F36V)-Caspase9介导的表型是一个高度敏感而稳定的实验表型，降低75％可以产生非常明确的死活表型的变化。
如实施例2中的图5a所示，筛选到的PD1转录抑制剂化合物A6可以明确地改变PD1-F-C融合系统下的死活表型。如图7c所示，在PD1-GFP的融合蛋白系统中，通过相同的实验条件处理，化合物A6的处理对GFP荧光值的改变难以察觉。
综上所述，若选用PD1-GFP的融合蛋白系统，无法筛出化合物A6。这体现了本发明筛选体系的高灵敏性。
讨论
除了caspase9以外，还有其余的自杀基因，例如HPRT可将化疗药物6-TG活化，为毒性物质杀伤细胞。然而，其余的自杀基因系统，从该基因发挥作用到细胞凋亡中间还有多个步骤，这些步骤都有可能被高通量化合物库中的某些化合物干扰，从而造成筛选的假阳性。例如，HPRT将6TG活化后，要经历单磷酸化、二磷酸化、三磷酸化、核糖脱氧、掺入DNA、被剪辑错配机制识别、DNA损伤、双链断裂、p53激活、PUMA表达、线粒体损伤、细胞色素C释放这一系列过程之后，才能激活caspase 9，杀死细胞。这些过程都有可能受到化合物的干扰，导致与靶标蛋白表达水平无关的细胞存活表型，从而造成高通量筛选的假阳性结果。
与此相比，运用细胞死亡过程中最下游的Caspase9作为死亡机制，除了caspase抑制剂之外，基本不会受到其余化合物的干扰，可以在最大程度上排除假阳性结果。
本发明的筛选方法仅需要很少量的化合物(0.1-10μl)，即可实现高效快速的高通量筛选，方法简便，利于工业生产和应用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (16)

  1. 一种用于筛选针对靶标蛋白的抑制剂的筛选体系，其特征在于，所述筛选体系包括一培养体系以及存在于所述培养体系中的以下组分：
    (a)活的检测细胞，所述检测细胞表达外源的融合蛋白，所述的融合蛋白为靶标蛋白和细胞自杀元件的融合蛋白，其中，所述融合蛋白在自杀诱导剂存在下会诱导所述检测细胞发生凋亡；
    (b)待筛选的测试物；
    其中，当所述检测细胞表达所述的融合蛋白且所述的测试物不导致所述融合蛋白降解或减少时，所述自杀诱导剂会诱导所述检测细胞发生凋亡；
    并且，所述测试物导致所述检测细胞不表达所述的融合蛋白或导致所述融合蛋白降解或减少时，则所述自杀诱导剂不诱导所述检测细胞发生凋亡。
  2. 如权利要求1所述的筛选体系，其特征在于，所述筛选体系还包括：
    (c)自杀诱导剂，所述自杀诱导剂通过所述的融合蛋白诱导所述检测细胞凋亡。
  3. 如权利要求1所述的筛选体系，其特征在于，所述待筛选的测试物为所述靶标蛋白的蛋白降解剂和/或转录抑制剂。
  4. 如权利要求3所述的筛选体系，其特征在于，所述待筛选的测试物选自小分子化合物、核酸分子、蛋白酶体靶向嵌合体(PROTAC)。
  5. 如权利要求1所述的筛选体系，其特征在于，所述靶标蛋白和细胞自杀元件的融合蛋白结构如式I所示：
    B-L1-A  式I
    式中，
    B为靶标蛋白，优选为疾病靶标蛋白；
    A为细胞自杀元件；
    L1为无或接头序列；
    “-”独立地为连接肽或肽键。
  6. 如权利要求1所述的筛选体系，其特征在于，所述疾病靶标蛋白选自下组：PD1、PD-L1、CD47、LAG3、TIGIT、KRas、Myc、TERT、SKP2、AR、PAX3、DUX4、SGLT2、 SNCA、RdRp、NSP7、NSP8、RBD、IMPDH1、RANK、β-Catenin、FLI1、Caspase1、刺突蛋白(Spike)、NSP8。
  7. 如权利要求5所述的筛选体系，其特征在于，所述的细胞自杀元件的结构如下式II所示：
    F-L2-C  (II)
    其中，
    各“-”独立地为连接肽或肽键；
    F为自杀基因诱导元件；
    L2为无或柔性接头；
    C为自杀基因元件。
  8. 一种筛选针对靶标蛋白的候选药物的方法，其特征在于，包括步骤：
    (a)将加入待筛选的测试物的培养体系作为实验组；将不加入测试化合物的培养体系作为空白对照组，其中，所述的培养体系中含有培养的活的检测细胞，所述检测细胞表达外源的融合蛋白，所述的融合蛋白为所述靶标蛋白和细胞自杀元件的融合蛋白，其中，所述融合蛋白在自杀诱导剂存在下会诱导所述检测细胞发生凋亡；和
    (b)向所述实验组和空白对照组中加入自杀诱导剂，观测实验组和空白对照组中检测细胞的存活情况；
    其中，当实验组中检测细胞的存活数量显著高于对照组时，则表明该测试物为候选药物。
  9. 一种如权利要求1所述的筛选体系的用途，其特征在于，用于筛选靶标蛋白的蛋白降解剂和/或转录抑制剂。
  10. 一种用于筛选针对靶标蛋白的抑制剂的筛选装置，其特征在于，所述装置包括：
    (d1)凋亡筛选模块，所述的凋亡筛选模块包括一个或多个培养单元，所述培养单元中设有n个用于培养活的检测细胞的培养室(或孔)(compartment)，其中在所述培养室中含有权利要求1所述的用于筛选针对靶标蛋白的抑制剂的筛选体系；n为≥2的正整数；
    (d2)数据采集模块，所述数据采集模块被配置为对凋亡筛选模块中各个培养室中的所述检测细胞的凋亡情况进行数据采集；
    (d3)筛选分析模块，所述筛选分析模块被配置为对来自所述数据采集模块的细胞凋亡情况进行分析，获得待筛选的测试物是否是针对靶标蛋白的抑制剂的分析结果；和
    (d4)输出模块，所述输出模块输出筛选分析模块的分析结果。
  11. 如权利要求10所述的筛选装置，其特征在于，所述培养单元的数量为1-200个，较佳地4-100个，更佳地8-50个，最佳地10-20个。
  12. 一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的结构如式I所示：
    B-L1-A  式I
    式中，
    B为疾病靶标蛋白；
    A为细胞自杀元件；
    L1为无或接头序列；
    “-”独立地为连接肽或肽键。
  13. 如权利要求12所述的融合蛋白，其特征在于，所述的细胞自杀元件的结构如下式II所示：
    F-L2-C  (II)
    其中，
    各“-”独立地为连接肽或肽键；
    F为自杀基因诱导元件；
    L2为无或柔性接头；
    C为自杀基因元件。
  14. 一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求12所述的融合蛋白。
  15. 一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求14所述的核酸分子。
  16. 一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有如权利要求15所述的载体或染色体中整合有如权利要求14所述的核酸分子。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103789389A (zh) * 2005-11-23 2014-05-14 杰勒德·M·豪斯 鉴定、合成、优化和表征蛋白调节剂的化合物和方法
US20160166613A1 (en) * 2014-12-15 2016-06-16 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for controlled elimination of therapeutic cells
CN108330140A (zh) * 2017-01-19 2018-07-27 西南大学 一种免筛选原/真核双表达载体及其构建与应用
CN109593721A (zh) * 2017-09-30 2019-04-09 亘喜生物科技（上海）有限公司 具有自杀基因开关的靶向人间皮素的工程化免疫细胞

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103789389A (zh) * 2005-11-23 2014-05-14 杰勒德·M·豪斯 鉴定、合成、优化和表征蛋白调节剂的化合物和方法
US20160166613A1 (en) * 2014-12-15 2016-06-16 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for controlled elimination of therapeutic cells
CN108330140A (zh) * 2017-01-19 2018-07-27 西南大学 一种免筛选原/真核双表达载体及其构建与应用
CN109593721A (zh) * 2017-09-30 2019-04-09 亘喜生物科技（上海）有限公司 具有自杀基因开关的靶向人间皮素的工程化免疫细胞

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANTONIO DI STASI, SIOK-KEEN TEY, GIANPIETRO DOTTI, YURIKO FUJITA, ALANA KENNEDY-NASSER, CARIDAD MARTINEZ, KARIN STRAATHOF, ENLI L: "Inducible Apoptosis as a Safety Switch for Adoptive Cell Therapy", NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE, MASSACHUSETTS MEDICAL SOCIETY, US, vol. 365, 3 November 2011 (2011-11-03), US , pages 1673 - 1683, XP002756622, DOI: 10.1056/NEJMoa1106152 *
BENJAMIN S. JONES, LAWRENCE S. LAMB, FREDERICK GOLDMAN, ANTONIO DI STASI: "Improving the safety of cell therapy products by suicide gene transfer", FRONTIERS IN PHARMACOLOGY, vol. 5, XP055340558, DOI: 10.3389/fphar.2014.00254 *
J.BIOL.CHEM, vol. 243, 1968, pages 3558
SAMBROOKRUSSELL ET AL.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2001, CSHL PRESS
SHI ZHONG-DONG, JASON TCHAO, LING WU, AARON J. CARMAN: "Precision installation of a highly efficient suicide gene safety switch in human induced pluripotent stem cells", STEM CELLS TRANSLATIONAL MEDICINE, vol. 9, 13 July 2020 (2020-07-13), pages 1378 - 1388, XP055975373, DOI: 10.1002/sctm.20-0007 *
TEY, S.K. DOTTI, G. ROONEY, C.M. HESLOP, H.E. BRENNER, M.K.: "Inducible Caspase 9 Suicide Gene to Improve the Safety of Allodepleted T Cells after Haploidentical Stem Cell Transplantation", BIOLOGY OF BLOOD AND MARROW TRANSPLANTATION, KLUGE CARDEN JENNINGS PUBLISHING, CHARLOTTESVILLE, VA, US, vol. 13, no. 8, 18 July 2007 (2007-07-18), US , pages 913 - 924, XP022157037, ISSN: 1083-8791, DOI: 10.1016/j.bbmt.2007.04.005 *

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