CN103789389A - 鉴定、合成、优化和表征蛋白调节剂的化合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鉴定、合成、优化和识别为蛋白质抑制剂或活化剂的化合物，所述蛋白质为天然存在的内源性蛋白质及某些内源性蛋白质的变体形式，并涉及鉴定所述变体的新方法。通过命中鉴定的改进、先导优化、生物识别和毒性化合物的快速排除，使药物发现和生产方法简化，从而，所述方法加速了作为潜在治疗有效药物的化合物的鉴定和研发。由于效率的相应增加，该实施导致药物发现过程中的总成本降低。

Description

鉴定、合成、优化和表征蛋白调节剂的化合物和方法
本申请是申请日为2006年11月24日、申请号为200680051498.8、发明名称为“鉴定、合成、优化和表征蛋白调节剂的化合物和方法”的发明专利申请的分案申请。 
相关申请的交叉引用 
本申请是2006年8月29日提交的PCT国际申请PCT/US06/33890的部分继续申请,PCT/US06/33890是2005年5月23日提交的PCT国际申请PCT/US2005/18412的部分继续申请，其要求2005年11月23日提交的U.S.Ser.No.60/739,477、2005年11月23日提交的U.S.Ser.No.60/739,476、2005年12月2日提交的U.S.Ser.No.60/741,767、2005年12月16日提交的U.S.Ser.No.60/751,030、2006年3月13日提交的U.S.Ser.No.60/783,106、2006年3月23日提交的U.S.Ser.No.60/785,904、2006年3月23日提交的U.S.Ser.No.60/785,817和2006年4月4日提交的U.S.Ser.No.60/789,379的优先权。 
技术领域
本发明涉及鉴定、合成、优化和表征为蛋白质抑制剂或活化剂的化合物，所述蛋白质为天然存在的内源性蛋白质及某些内源性蛋白质的变体形式，并涉及鉴定所述变体的新方法。通过命中鉴定的改进、先导优化、生物识别和毒性化合物的快速排除使药物发现和生产方法简化，所述方法加速了作为潜在治疗有效药物的化合物的鉴定和研发。由于效率的相应增加，该实施导致药物发现过程中的总成本降低。 
发明背景 
针对存在人细胞中的选择性蛋白质靶的现代新药物的发现/生产方法的重要组成包括： 
1.鉴定抑制或活化所选靶蛋白质的"命中"化合物。(基于这些目的，定义命中为在给定的测试中得分为正的化合物并可具有一些研究者希望的效果和药学性质。然而，在现代药学研究中，实际上命中只有在实质性进一步修饰后才能成为最终的临床候选); 
2.选择先导化合物，在其基础上进一步研究和改进最初的命中化合物； 
3.通过一系列设计主要用于改善先导化合物对靶蛋白质的抑制或活化性质的化学修饰,优化先导化合物(其化学结构与原始命中化合物相关或一致)，但所述的化学修饰还可以改善生物利用度、血浆半衰期、或降低毒性; 
4.表征指定先导化合物的生物活性谱(包括优化的先导)以确定与其它非靶蛋白质相比，其对所选的靶蛋白质的相对特异性和选择性，一些非靶蛋白质与靶蛋白质本身密切相关(例如蛋白质家族的其它成员); 
5.设计临床前体外和体内动物研究以评价剂量范围、致癌性、吸收、分配、代谢、排泄、药代动力学、口服生物利用度(如果需要的话)、药效学、毒性和相关参数; 
6.在健康志愿者和患有疾病的患者中进行的临床测试，对其而言有效的治疗性处置被认为是有益的。 
本发明涉及实质改进上述步骤1-4的新方法。所述方法也可以用于产生和优化化合物，所述化合物比用目前采用的标准且简单的方法鉴定、优化或表征的典型实验药物有效得多且毒性低得多。 
作为努力研发先进新药学技术的一部分，研发了本文描述的方法，通过发明可预测、可信赖的方法学，将所述药学技术将“药物发现”过程变成一个被更精确地描述为“药物生产”过程，所述方法学 为本领域技术人员提供必需的工具以产生靶向人类疾病中重要的特异性蛋白质的新药物，同时减少与药物发现/研发方法有关的时间和高额成本。 
患者中耐药性的进行性发展为使用许多类型药物长期治疗的标志，尤其是在癌症和感染性疾病的治疗领域中。已经鉴定了介导某些类型的耐药性现象的分子机制，而在其它情况中，获得的以及重新形成的耐受性的机制目前仍然未知。 
最初认为在癌症疗法领域中相关的诱导的(获得的)耐药性的一种机制包括称作P-糖蛋白(P-gp)的蛋白质表达增加。P-gp位于细胞膜中并且起药物流出泵的作用。该蛋白质能够从细胞中泵出毒性化学活性剂，包括许多类型的抗癌药。因此，P-糖蛋白的增量调节通常产生对多种药物的耐药性。P-糖蛋白在肿瘤细胞中增量调节可以代表一种防御机制，该机制在哺乳动物细胞中发展以便防止受到毒性化学活性剂损害。目前已经鉴定了具有与P-gp类似的功能的其它相关耐药性蛋白质，包括多药物-抗性-相关蛋白家族成员，诸如MRP1和ABCG2。在任何情况下，在研发对指定靶蛋白具有特异性且毒性较低的化合物时，P-糖蛋白和相关ATP-结合弹夹(ABC)转运蛋白在临床显著性耐药性中的重要性已经下降。 
另一种可能的获得性耐药的分子机制在于可选的信号途径导致持续的细胞存活和代谢，即使原始药物仍然对其靶标有效。此外，药物胞内代谢的改变也可以导致治疗功效丧失。此外，可以发生基因表达和基因扩增结果的改变，从而导致指定靶蛋白的表达增加或减少，并且通常需要增加药物剂量以便维持相同作用(Adcock和Lane，2003)。 
突变诱导的耐药性通常为感染性疾病领域中出现的情况。例如，已经研发了几种抑制在人免疫缺陷(HIV)病毒基因组中编码的病毒逆转录酶或病毒蛋白酶的药物。在文献中充分确立了使用例如逆转录酶抑制剂反复治疗HIV-感染的AIDS患者最终产生了对药物的敏感性减低的病毒突变体形式。已经在编码逆转录酶的基因中出现的突变赋予所述酶的突变体形式受药物的影响降低。 
考虑到错误被引入HIV基因组的比例，在HIV治疗过程中耐药性的出现并不令人意外。已知HIV逆转录酶特别具有错误趋向性，其中正向突变率约为3.4x10-5种突变/碱基对/复制循环(Mansky等，J.Virol.69：5087-94(1995))。然而，在哺乳动物细胞中编码的内源性基因的类似突变率低一个数量级以上。 
新的证据表明耐药性还可能因涉及编码药物靶标的基因的突变结果产生(Gorre等，Science，2001；PCT/US02/18729)。在这种情况中，使患者接触具体的治疗物质，诸如靶向特异性所关注的蛋白质(POI或"靶"蛋白)的指定癌症药物后，隐含在编码为治疗物质靶标的蛋白质的基因中出现的突变的一组细胞的过度生长。目前还不了解该细胞群的过度生长是否因已经隐含产生药物抗性的POI的突变的患者的小百分比的预先存在的细胞所致，或这类突变是否在动物或人接触能够活化或抑制所述POI的治疗剂过程中或之后重新产生。任一情况中，这类突变结果均可以产生突变的蛋白(下文定义为theramutein)，它受所述治疗物质的影响程度较低或可能完全不受影响。 
慢性髓细胞性白血病(CML)的特征在于在该病稳定或慢性期过程中保持分化能力的骨髓先祖（progenitor）过度增殖。多线证据已经确立了作为某些形式的CML中的致病性癌基因的Abl酪氨酸激酶的失调。这种失调通常与称作费城染色体(Ph)的染色体易位相关，导致由与Abelson酪氨酸激酶融合的BCR基因产物组成的融合蛋白表达，由此形成具有酪氨酸激酶活性的p210Bcr-Abl。相关的融合蛋白称作p190Bcr-Abl，其由BCR基因中的不同断点产生并且已经证实出现在具有费城染色体阳性(Ph+)的急性成淋巴细胞性白血病(ALL)的患者中(Melo，1994；Ravandi等，1999)。转化看起来因多信号途径，包括那些涉及RAS、MYC和JUN的途径活化所致。甲磺酸伊马替尼(“STI-571”或
Figure BDA0000440201980000041
)为靶向Abl的激酶结构域的ATP结合位点的2-苯氨基嘧啶(Druker等，NEJM2001，p.1038)。随后还通过其它方法已经发现了血小板衍生的生长因子(PDGF)β受体的抑制剂和Kit酪氨酸激酶，其中后者涉及胃肠道间质瘤的发生(参见下文)。 
直到近期为止，尚未观察到在使用指定内源性细胞蛋白的特异性抑制剂治疗的过程中，其相应的内源性基因中的突变可以导致蛋白质不同的表达，所述蛋白质变体的细胞功能耐受所述抑制剂。Charles Sawyers和同事所做的工作(Gorre等，Science293：876-80(2001)；PCT/US02/18729)首次证实了使用能够抑制p210Bcr-Abl酪氨酸激酶的药物(即STI-571)治疗患者后，在编码产生p210Bcr-Abl癌的含有Abelson酪氨酸激酶结构域的靶蛋白的基因中隐含突变的所述患者中可能出现具有临床意义的细胞群。各种这类突变产生p210Bcr-Abl的突变体形式，它们对Gleevec治疗的反应性低于产生最初癌症的形式。值得注意的是，出现的突变对突变蛋白赋予了对蛋白激酶抑制剂药物作用的相对抗性，同时维持了一定程度的突变蛋白激酶的原始底物特异性。在Gorre等的工作前，本领域技术人员一般认为可以在接触抑制Abelson蛋白激酶的化合物，诸如STI-571的患者中观察到的抗性类型可能因上述药物抗性的其它机制中的一种或多种或由某些其它尚不了解的机制导致，但在任何情况下，所述的抗性均可以涉及不同于药物靶标POI的靶标(蛋白质或其它)。 
因此，治疗临床相关的还为现存疗法靶标的蛋白质突变体形式可能极为有用。这类突变蛋白(如下文定义的theramuteins)正在被公认和理解为复发性癌症中的重要靶标，并且还在其它疾病中变得具有重要性。存在对治疗剂的需求，这类治疗剂对可能在一般有效药物疗法之前、过程中或之后产生的细胞蛋白的这类药物抗性变体形式具有活性。本发明的一个关键目的在于提供一种普遍的方法，本领域技术人员可以利用所述方法从高通量筛选（HTS）系统中鉴定命中、产生和优化先导化合物以及表征所述化合物的生物活性谱，而不需要依赖于较老的方法，例如无细胞的放射性配体结合测试等。本发明的另一个关键目的在于提供可以用作用于克服在内源性出现的蛋白质中的突变-诱导的耐药性的潜在治疗剂的化合物。 
发明概述 
本文描述的方法涉及基于细胞应答的药物发现和生产系统的产生，所述系统利用所定义、预先确定的细胞特征的调节（称为表型反应）作为工具来测量指定化合物（化学试剂、调节剂）活化或抑制所选靶蛋白质的能力。通过重复应用该方法，可以利用本文描述的方法来鉴定蛋白质调节剂（如本文所定义的），在所述调节剂上进行先导优化，并生物表征所述调节剂的靶蛋白质特异性和选择性。 
可以对任何靶蛋白质和任何真核细胞类型使用本文描述的发明，然而条件是，首先鉴定并根据本文教导利用本发明称为表型反应的一个基本元素。所述方法的一个实施方案给本领域技术人员提供鉴别所选靶蛋白质的抑制剂或活性剂的能力。另一个实施方案允许本领域技术人员进行快速先导优化研究以得到潜在的临床候选化合物。另一个实施方案给本领域技术人员提供设计具有对指定靶蛋白质具有需要程度特异性以及对所述蛋白质相对于不同但密切相关靶蛋白质家族成员具有选择性的化合物的能力，所述靶蛋白质家族成员可能与某些靶一起存在。 
化合物（包括已经批准的药物）治疗功效的改进是药学研究中一个重要的重复出现的问题。一个通常采用的方法是从已知的化学结构开始，然后对所述结构进行其他化学修饰以改进其效力、特异性（针对靶蛋白质）、或与患者治疗功效相关的其它参数。在一些情况下，起始结构可以是已知药物。在其它情况下可以简单地是使用无细胞或基于原代细胞筛选试验鉴定的最初筛选命中。在其它情况下，所述化合物可以是基于筛选命中或其它模型结构的以最低限度定义的最初化学结构，且通常称为“骨架”。就本发明目的而言，骨架定义为相对于代表性化合物除去一个或多个侧链或环取代的化学结构，所述代表性化合物在其他方面其具有相同的骨架。例如，表4中第三个化合物可认为是骨架。 
本发明一个重要的贡献是表型反应的使用,以及确定第一化合物相对于第二化合物的细胞特异性以便确定第一化合物相对于第二化合 物是否展现出改进的细胞特异性。本文描述的发明中首次报导的所述方法代表对现有技术的一个根本进步。现有技术依赖于无细胞测试系统，其利用纯化或重组产生的蛋白质来测试化合物活性，并比较指定化合物对靶蛋白质与对其他蛋白质的作用，所述的其他蛋白质与靶蛋白质通常（密切或不密切）相关。可以在文献中发现许多这类现有技术方法的实例，包括Hanke等人,1996,Warmuth等人,US2003/0162222Al,Knight and Shokat,2005,和其中的参考文献。在鉴定和优化指定骨架的细胞特异性和治疗功效方面，所述较老类型的无细胞方法与本发明相比，效率要低得多或完全无效。本发明的实质改进来自至少三个关键元素。 
第一，表型反应的概念,当与测量指定化合物(例如通过确定其CSG来测定)的细胞特异性一起使用时，提供允许鉴定可能以改进的、功能上更有效的方式与靶蛋白质相互作用的化合物的系统。 
第二，本发明提供鉴定化合物的方法，所述化合物还能与其他不同于靶蛋白质的细胞组分相互作用(其包括但不限于信号传导途径的上游或下游组分，所述信号传导途径涉及靶蛋白质例如单或多亚基蛋白质、蛋白质复合物、蛋白质/核酸复合物等)，其在特异性信号传导途径中起作用或在其中靶蛋白质在细胞内起作用的细胞传导途径的外围,以促进关注的疾病状态，例如所选的人类癌症形式。由于在更高级有序的生物体（例如人）细胞中存在的信号传导级联的复杂性，目前状态的现有技术不能完全了解关于其中指定靶蛋白质在细胞内起作用的所有机理。 
第三，本发明排除了与其他非靶蛋白质交叉反应的化合物，所述非靶蛋白质不参与为其中靶蛋白质起作用的疾病状态的基础的信号传导途径。本发明排除所述化合物(其将会对患者产生不利的副作用)的能力来自使用表型反应的化合物的细胞特异性的直接比较测试，其根本上排除了对照细胞的作用。如果与参照化合物相比指定测试化合物的作用导致降低的细胞特异性，那么可以立即排除该化合物。测试化合物对靶蛋白质的效果是否更低，或测试化合物是否与其他不参与靶 蛋白质的信号传导途径的非靶蛋白质相互作用（所述信号传导途径调节与靶蛋白质相关的表型反应），或测试化合物是否只是细胞毒性的，这些都是不相关的且只是出于学术兴趣。关键的一点是测试化合物治疗有效性更低且不用作进一步考虑。这为本领域技术研究人员节约了评价各种化学结构的时间和精力。对于读者来说重要的是，识别可能针对无细胞测试系统中的靶非常有效力并高度有效的化合物可能显示相对低的CSG测定并因此可能被很快排除，从而节省了时间和先前的资源。 
本发明前述的关键优点没有在现有技术中发现，且提供了本发明相对现有技术本质上的改进。将这些优点应用于所有潜在治疗靶蛋白质，但对难处理、高度抗药性的靶蛋白质（已知为theramuteins）而言是尤其重要的(WO2005/115992)。 
作为使用本发明的结果，大大简化和提高了改进和优化指定化合物（相对于其他效率较低的化合物）的问题。本领域技术人员简单地从第一化合物开始，无论它是否为批准的药物、筛选命中、或为已知抑制或活化关注蛋白质的基本骨架，并使用第一化合物作为参考目的的起始点。然后，使用现在本领域中标准的基本药物化学合成方法合成其他化合物，所述其他化合物为第一化合物的类似物、同系物、异构体等(本文也称为“起始化合物”或“参考化合物”)。在本文的其他部分参考了部分这些化学合成方法，且读者还可以参考Burbaum等人,1995和Goodnow等人,2003作为所述方法的一般参考。一旦合成了其他化合物，本领域技术人员开始使用本发明的方法而不是通常指由无细胞测试获得的结果（通过测试新化合物对靶蛋白质和一批其他非靶蛋白质以尝试使所述化合物与其他蛋白质的交叉反应最小化）的现有技术方法。相反，通过使用本发明，本领域技术人员可以通过直接参考由使用基于本发明表型反应的细胞测试系统测定每个待测化合物的CGS获得的结果来指导起始化合物化学结构的改进。最重要地，整体排除了持续依赖于无细胞、纯化蛋白质测试的结果，包括上述在Hanke等人(1996)和Knight and Shokat(2005)中参考的“kinase  panel”，且来自实施本方法的化合物优于由较老方法获得的化合物，如本文鉴定的化合物的活性所示，其对高度抗药性的theramutein p210Bcr-Abl T315I是有效的（如表4所示）。不限制本领域技术人员在无细胞系统中独立测试所得的任何化合物用以独立确认（如果需要的话），但这对于实施本发明是决不需要的。 
在本发明之前，尚未证实基于细胞应答的药物发现系统能鉴定和对所选的靶蛋白质的抑制剂或活性剂进行排序，而不用先参考无细胞、纯化蛋白配体结合测试或酶测试(当靶蛋白质是酶时)以确立正在研究的化合物确实与靶蛋白质结合。 
这些结果首次证实，使用基于细胞应答的测试系统作为主要工具从在高通量筛选（HTS）中评分为正的化合物中鉴定指定靶蛋白质的抑制剂或活性剂。这些结果还证实一旦鉴定命中或先导化合物能活化或抑制指定靶蛋白质(通过任何方法，包括本文公开的实施例或通过经典的无细胞HTS方法)，所述化合物也可以是化学优化的(即，可以对所述化合物进行先导优化)完全采用基于表型反应的细胞测试系统而不用随后依赖于无细胞纯化蛋白质测试系统以独立验证/确认在先导优化过程中合成的各个连续化合物的抑制或活化能力。仅这个实施方案给本领域技术人员节省了大量的时间、精力和大量的实验室资源，这些通常在采用经典的无细胞纯化蛋白质测试、放射性配体结合测试等产生和独立确认抑制或活化性质是需要花费的。 
本文证实的方法使用涉及慢性骨髓性白血病(CML)的发展和进行中的引起癌症的蛋白质的特异性突变形式。所述蛋白称为Abelson蛋白激酶，以其引起癌症的形式为某些酪氨酸激酶抑制剂例如甲磺酸伊马替尼（imatinib）的一个已知的靶。然而，如下面详细讨论的，所述靶蛋白质可以在患者中以对伊马替尼的抑制作用有抗性的突变形式产生。Abelson激酶的所述形式称为theramutein。在本发明的一个实施方案中，鉴定了能抑制或活化指定theramutein的合适先导化合物。在本发明的另一个实施方案中，优化先导化合物。所述方法对鉴定命中、所述命中的先导优化(无论最初是如何鉴定了所述命中)、和涉及非 theramutein内源性靶蛋白质的化合物的生物识别是有效的。使用由隐含赋予高度抗药性的T315I突变的Abelson激酶的突变形式组成的theramutein证实了所述方法的一般用途。 
本发明进一步涉及为蛋白质的变体形式的抑制剂或活化剂的活性剂。本发明还涉及为内源性蛋白质的某些变体形式的抑制剂或活化剂的活性剂。特别关注的是由已经突变的基因编码的内源性蛋白质变体的抑制剂和活化剂，所述的变体通常在接触已知为相应未突变内源性蛋白质的抑制剂或活化剂的化学活性剂后产生或至少在已经产生后首先得到鉴定。这类蛋白质变体(突变蛋白)在本文中称作"theramuteins"，它们可以自发在生物体内出现(并且在某些情况中预先存在突变)或所述的突变体可以作为使用当能够抑制所述theramutein的未突变形式(本文称作“prototheramutein”)的指定化学活性剂治疗生物体时产生的选择压力的结果产生。可以理解在某些情况中，prototheramutein可以为POI的“野生型"形式(例如因失调产生疾病的蛋白质)。在其它情况中，prototheramutein为引起疾病的“野生型”蛋白质的变体，它已经突变且由此促使作为所述在先突变结果的患病状态发生。Prototheramutein的后一种类型的一个实例为P210BCR-ABL癌蛋白，并且在315位上隐含苏氨酸(T)到异亮氨酸(I)突变的这种蛋白质的突变体形式称作P210BCR-ABL-T315I，并且为theramutein的一个实例。本文所用的命名“P210BCR-ABL“与术语“p210Bcr-Abl”、“野生型Bcr-Abl蛋白质”等为同义词。 
Theramuteins为一类罕有的内源性蛋白质，它们隐含了赋予所述蛋白质对药物的抗性的突变，已知所述的药物以治疗有效方式抑制或活化它们的未突变对应体。目前已知编码少数几种这类蛋白质的内源性基因在某些情况下表现出这类突变。在一个实施方案中，本发明涉及抑制Abelson酪氨酸激酶蛋白质的某些耐药性突变体(theramuteins)的组合物，所述的Abelson酪氨酸激酶蛋白质在文献中最初称作P210-Bcr-Abl，它涉及慢性髓细胞性白血病的发生。 
本发明的方法特别涉及鉴定蛋白质的特异性抑制剂或特异性活 化剂的方法。术语“特异性”在上下文中术语“抑制剂”或“活化剂”中的应用(参见下文中的定义)指的是所述的抑制剂或活化剂结合蛋白质并且抑制或活化蛋白质的细胞功能，但不结合和活化或抑制细胞中的各种其它蛋白质或非-蛋白质靶标。本领域技术人员充分了解，在医学文献中讨论蛋白质抑制剂或活化剂的作用时，在特异性抑制剂或特异性活化剂的概念和靶蛋白“特异性”的相关概念方面存在一定程度的可变性。因此，就本发明的目的而言，物质为指定theramutein的特异性抑制剂或特异性活化剂，条件是所述物质能够以指定浓度抑制或活化所述蛋白质，使得相应的表型反应（phenoresponse）以适当方式得到调节，而在相同指定浓度下对相应对照细胞的表型反应（如果有的话）不具有可感觉到的作用，所述的相应对照细胞基本上不表达蛋白质。 
在某些实施方案中，物质可以为两个密切相关的蛋白质如prototheramutein和其相应的theramutein之一的调节剂。在其它实施方案中，除为prototheramutein和theramutein的调节剂外，物质还可以调节具有相似功能的蛋白质的活性。如上所述，除抑制p210Bcr Abl酪氨酸激酶外，甲磺酸伊马替尼还能够抑制在某些胃肠道间质瘤中超表达的c-kit癌基因产物(也为酪氨酸激酶)以及在某些慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)中表达的PDGFβ受体(也为酪氨酸激酶)。这类化合物有时称作“适度特异性”抑制剂。 
本发明还提供了可以用于鉴定活化或抑制theramutein的物质的一般方法，所述的物质将theramutein活化或抑制到相同程度、并且优选到甚至大于能够抑制该蛋白质的相应"野生型"形式的已知药物物质的程度(然而，本领域技术人员充分了解这类蛋白质的所述"野生型"形式已经在产生所述蛋白质参与的相应疾病的过程中突变)。 
在一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式I的P210BCR-ABL-T315I theramutein的抑制剂： 
其中： 
环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环； 
X1选自N、N-R0或C-R1； 
X2选自N、N-R0或C-R1； 
虚线表示任选的双键； 
各个R1独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR11、-(CH2)pC(O)(CH2)qR11、-(CH2)pC(O)N(R12)(R13)、-(CH2)pC(O)O(CH2)qR11、-(CH2)pN(R11)(CH2)qC(O)R11、-(CH2)pN(R12)(R13)、-(CH2)pN(R11)(CH2)qR11、-N(R11)SO2R11、-OC(O)N(R12)(R13)、-SO2N(R12)(R13)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R1基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
n为0-6； 
各个R11独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R12和R13独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R12和R13可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任选被1至3个独立选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR0、CO2R0、C(O)R0、卤素、芳基和杂环的取代基取代； 
p为0-4； 
q为0-4； 
R2选自-CR21 a-、-NR22 b-和-(C=R23)-； 
各个R21独立地选自H、卤素、-NH2、-N(H)(C1-3烷基)、-N(C1-3烷基)2、-O-(C1-3烷基)、OH和C1-3烷基； 
各个R22独立地选自H和C1-3烷基； 
R23选自O、S、N-R0和N-OR0； 
R3选自-CR31 c-、-NR32 d-、-SO2-和-(C=R33)-； 
各个R31基团选自H、卤素、-NH2、-N(H)(R0)、-N(R0)2、-O-R0、OH和C1-3烷基； 
各个R32基团选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO2R0、C(O)R0、芳基和杂环； 
R33选自O、S、N-R34和N-OR0； 
R34选自H、NO2、CN、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
R4选自-CR41 e-、-NR42 f-、-(C=R43)-、-SO2-和-O-； 
各个R41选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、CO2R0、C(O)R0、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R42基团选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO2R0、C(O)R0、芳基和杂环； 
各个R43各自选自O、S、N-R0和N-OR0； 
条件是当R2为-NR22 b-且R4为-NR42 f-时，R3不为-NR32 d-；R3和R4不同时分别选自-(C=R33)-和-(C=R43)-；且R3和R4不同时选自-SO2-; 
R5选自-Y-R6和-Z-R7； 
Y选自化学键、O、NR0； 
R6选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
Z为带有1-4个碳原子并且任选地被卤素、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO2R0、C(O)R0、C(O)N(R0)2、CN、CF3、N(R0)2、NO2和OR0中的一个或多个取代的烃链； 
R7为H或选自芳基和杂环； 
各个R0独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环； 
a为1或2； 
b为0或1； 
c为1或2； 
d为0或1； 
e为1或2；且 
f为0或1。 
本发明提供了治疗癌症和其它疾病的基础新方式，其中无论通过 何种机制，使用现存的药物化合物治疗后均跟随可鉴定的(临床显著的)theramutein-介导的药物抗性，通过提供在theramuteins产生和照此鉴定时(Wakai等，2004报导了一个实例，其中theramutein可以在持续治疗方案过程中产生)或在表达theramutein的细胞的临床显著性群体过度生长前预先给予备选药物来进行。此外，如果对特定疾病的药物治疗在表达药物靶向的蛋白质的某种theramutein的个体亚群中有效性较低，那么本发明能够通过提供有效针对所述theramutein的备选药物物质来适应那些受试者的治疗。 
本发明提供了测定化学活性剂作为细胞中theramutein的调节剂是否至少与作为已知的相应prototheramutein调节剂的物质同样有效的方法。该方法的一个实施方案包括使表达prototheramutein并且能够表现出反应性表型特征(与细胞中prototheramutein的功能相关)的对照细胞与已知的prototheramutein调节剂接触，使表达theramutein并且也能够表现出反应性表型特征(与细胞中theramutein的功能相关)的测试细胞与化学活性剂接触，并且比较测试细胞的反应与处理的对照细胞的反应；以便确定该化学活性剂作为theramutein的调节剂至少与作为已知的prototheramutein调节剂的物质同样有效。在某些其它实施方案中，一种类型的对照细胞可能完全不表达prototheramutein。在其它实施方案中，对照细胞可以表达的prototheramutein的量与测试细胞表达的theramutein的量大体相同。在其它实施方案中，在某些条件下，对照细胞能够表现出的反应性表型特征的程度与测试细胞大体相同。在其他实施方案中，测试细胞可以表达指定蛋白质，而对照细胞表达很少或基本上不表达所述蛋白质。 
本发明特别关注的蛋白质为那些涉及调节功能的Theramuteins，诸如酶；蛋白激酶；酪氨酸激酶；受体酪氨酸激酶；丝氨酸苏氨酸蛋白激酶；双向特异性蛋白激酶；蛋白酶；基质金属蛋白酶；磷酸酶；细胞周期控制蛋白；停靠蛋白质，诸如IRS家族成员；细胞表面受体；G-蛋白；离子通道；DNA-和RNA-结合蛋白；聚合酶等。不打算限止可以用于本发明的theramutein或其他蛋白质的类型。同时，已知三种 theramuteins：BCR-ABL、c-Kit和EGFR。 
可能与细胞中存在的蛋白质(包括，例如theramutein或prototheramutein)相关的任意反应性表型特征可以用于本方法，包括：例如生长或培养特性、theramutein底物的磷酸化状态(或其它修饰)和任意类型的细胞的暂时特征，正如所定义和详细讨论的。 
附图描述 
附图1显示了不同浓度的化合物2(C2)对未转化的载体对照Ba/F3细胞(为IL-3依赖性)以及表达"野生型"p210Bcr-Abl的Ba/F3细胞(命名为p210Bcr-Abl-wt)和表达p210Bcr-Abl-T315I药物抗性突变株的Ba/F3细胞的生长和存活率的作用。如本说明书中详细描述的用自动化细胞计数器测定细胞计数和存活率。细胞计数由实心颜色条表示；细胞存活率由虚线条表示。注意STI-571有效抑制P210细胞系生长(灰色条)，而甚至在10μM浓度下也不能抑制T315I细胞系生长(白色条)。500nM C2在该剂量响应系列范围内表现出最大的特异性缺口。将10μM的STI-571与500nM的C2对T315I细胞系的作用进行比较(白色条)。缩写：DMSO：二甲亚砜(用于药物溶解的溶剂)。 
附图2显示了不同浓度的化合物6(C6)对未转化的载体对照Ba/F3细胞以及表达p210Bcr-Abl-T315I药物抗性突变株的Ba/F3细胞的生长和存活率的作用。所有其它详细描述均如附图1中所。 
附图3显示了通过比较筛选中鉴定的不同化合物就其对表达prototheramutein和theramutein的细胞系中的作用而言得到的特异性缺口的不同测定结果。化合物3(C3)显示了用于鉴定化合物的能力的最佳实例，该化合物对theramutein所施加的作用甚至大于其相应对prototheramutein的作用。(E组).A组：对照组DMSO治疗；B：阴性异源特异性缺口；C：轻度阳性的异源特异性缺口；D：显著阳性的同源特异性缺口；E：阳性异源特异性缺口。参见用于解释的正文。A组：对照组DMSO治疗；B：阴性异源特异性缺口；C：轻度阳性的异 源特异性缺口；D：显著阳性的同源特异性缺口；参见解释部分。 
附图4显示了用于自磷酸化活性检测的重组P210Bcr-Abl野生型和T315I突变体激酶结构域的放射自显影照片。将200ng蛋白质预先与测试物质在标准自磷酸化反应条件下一起温育10分钟，然后加入放射性标记的ATP并使反应在30℃下进行30分钟，此后通过SDS-PAGE分离样品。将凝胶进行银染色，在真空中干燥并且接触X-光片。注意在10μM STI571对野生型P210Bcr-Abl有效的同时，它实际上在浓度甚至达100μM时对T315I激酶结构域无效。“P210细胞系”指的是表达p210 BCR-ABL-wt的细胞。“T315I细胞系”指的是表达p210BCR-ABL-T315I的细胞。 
附图5表示本发明有代表性的化合物的化学结构。 
附图6表示本发明有代表性的化合物的化学结构。 
附图7表示本发明有代表性的化合物的化学结构。 
附图8表示本发明有代表性的化合物的化学结构。 
附图9表示本发明有代表性的化合物的化学结构。 
附图10表示本发明有代表性的化合物的化学结构。 
附图11表示本发明有代表性的化合物的化学结构。 
附图12表示本发明有代表性的化合物的化学结构。 
附图13表示本发明有代表性的化合物的化学结构。 
附图14表示对测试细胞和对照细胞而言具有1的细胞特异性缺口的假定化合物对生长速率的抑制作用。 
附图15表示对测试细胞和对照细胞而言具有40的细胞特异性缺口的假定化合物对生长速率的抑制作用。 
附图16表示在显著低于细胞毒性的表观IC50的浓度下甲磺酸伊马替尼的生长抑制作用。 
附图17表示不同浓度的C2和各种C2类似物对表达p210Bcr-Ab1-T315I抗药性突变体的Ba/F3细胞的生长的作用。 
附图18表示在20μM浓度的C2和各种C2类似物存在下,T3151突变激酶结构域的标准无细胞蛋白激酶自磷酸化测定结果。 
发明详述 
本文所用的术语“卤素（halo）”或“卤素（halogen）”包括氟、氯、溴和碘。 
本文所用的术语“烷基”关注的是带有1-6个碳原子的取代和未被取代的直链和支链烷基。优选的烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基等。另外，烷基可以任选地被一个或多个选自卤素、CN、CO2R、C(O)R、C(O)NR2、NR2、环-氨基、NO2和OR的取代基取代。 
本文所用的术语“环烷基”关注的是取代和未被取代的环烷基。优选的环烷基为那些含有3-7个碳原子的单环，并且包括环丙基、环戊基、环己基等。其它环烷基可以选自C7-C10双环系或C9-C14三环系。另外，环烷基可以任选地被一个或多个选自卤素、CN、CO2R、C(O)R、C(O)NR2、NR2、环-氨基、NO2和OR的取代基取代。 
本文所用的术语“链烯基”关注的是取代和未被取代的直链和支链烯基团。优选的链烯基为那些含有2-6个碳原子的链烯基。另外链烯基可以任选地被一个或多个选自卤素、CN、CO2R、C(O)R、C(O)NR2、NR2、环-氨基、NO2和OR的取代基取代。 
本文所用的术语“炔基”关注的是取代和未被取代的直链和支链炔基。优选的炔基为那些含有2-6个碳原子的炔基。另外，炔基可以任选地被一个或多个选自卤素、CN、CO2R、C(O)R、C(O)NR2、NR2、环-氨基、NO2和OR的取代基取代。 
本文所用的术语“芳烷基”关注的是带有芳族基团作为取代基的烷基，所述的芳族基团可以被取代和未被取代。芳烷基可以任选地在芳基上被一个或多个取代基取代，所述的取代基选自卤素、CN、CF3、NR2、环-氨基、NO2、OR、CF3、-(CH2)xR、-(CH2)xC(O)(CH2)yR、-(CH2)xC(O)N(R')(R")、-(CH2)xC(O)O(CH2)yR、-(CH2)xN(R')(R")、-N(R)SO2R、-O(CH2)xC(O)N(R')(R")、-SO2N(R')(R")、-(CH2)xN(R)-(CH2)y-R、-(CH2)xN(R)-C(O)-(CH2)y-R、 -(CH2)xN(R)-C(O)-O-(CH2)y-R、-(CH2)x-C(O)-N(R)-(CH2)y-R、-(CH2)xC(O)N(R)-(CH2)y-R、-O-(CH2)x-C(O)-N(R)-(CH2)y-R、取代和未被取代的烷基、取代和未被取代的环烷基、取代和未被取代的芳烷基、取代和未被取代的链烯基、取代和未被取代的炔基、取代和未被取代的芳基和取代和未被取代的杂环，其中所述取代的烷基、取代的环烷基、取代的芳烷基、取代的链烯基、取代的炔基、取代的芳基和取代的杂环可以被卤素、CN、CF3、CO2R、C(O)R、C(O)NR2、NR2、环-氨基、NO2和OR中的一个或多个取代。 
本文所用的术语“杂环基”或"杂环"关注的是带有至少一个杂原子作为环成员的芳族和非-芳族环状基团。优选的杂环基为那些含有5或6个环原子的包括至少一个杂原子的杂环基，并且包括：环状胺类，诸如吗啉代、哌啶子基、吡咯烷并等；和环醚类，诸如四氢呋喃、四氢吡喃等。芳族杂环基，也称作“杂芳基”关注的是可以包括1-3个杂原子的单-环杂-芳族基团，例如吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、
Figure BDA0000440201980000181
唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪、嘧啶等。本文所用的术语杂芳基还包括带有两个或多个环的多环杂-芳族系统，其中的两个原子为两个相邻的环共用(这些环是"稠合的")，其中环中的至少一个为杂芳基，例如其它环可以为环烷基、环烯基、芳基、杂环和/或杂芳基。多环杂芳族系统的实例包括喹啉、异喹啉、四氢异喹啉、喹喔啉、quinaxoline、苯并咪唑、苯并呋喃、嘌呤、咪唑并吡啶、苯并三唑等。另外，杂环基可以任选地被如下基团取代：卤素、CN、CF3、NR2、环-氨基、NO2、OR、CF3、-(CH2)xC(O)(CH2)yR、-(CH2)xC(O)N(R')(R")、-(CH2)xC(O)O(CH2)yR、-(CH2)xN(R')(R")、-N(R)SO2R、-O(CH2)xC(O)N(R')(R")、-SO2N(R')(R")、-(CH2)xN(R)-(CH2)y-R、-(CH2)xN(R)-C(O)-(CH2) y-R、-(CH2)xN(R)-C(O)-O-(CH2)y-R、-(CH2)x-C(O)-N(R)-(CH2)y-R、-(CH2)xC(O)N(R)-(CH2)y-R、-O-(CH2)x-C(O)-N(R)-(CH2)y-R，取代和未被取代的烷基、取代和未被取代的环烷基、取代和未被取代的芳烷基、取代和未被取代的链烯基、取代和未被取代的炔基、取代和未被取代的芳基和取代和未被取代的杂环，其中所述取代的烷基、取代的环烷 基、取代的芳烷基、取代的链烯基、取代的炔基、取代的芳基和取代的杂环可以被卤素、CN、CF3、CO2R、C(O)R、C(O)NR2、NR2、环-氨基、NO2和OR中的一个或多个取代。 
本文所用的术语“环-氨基”关注的是带有至少一个氮原子作为环成员的芳族和非-芳族环状基团。优选的环氨基为那些含有5或6个环原子的包括至少一个氮原子的环氨基，并且包括：吗啉代、哌啶子基、吡咯烷并、哌嗪并、咪唑、
Figure BDA0000440201980000191
唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪、嘧啶等。此外，环-氨基可以任选被卤素、CN、CF3、NR2、NO2、OR、CF3、取代和未被取代的烷基、取代和未被取代的环烷基、取代和未被取代的芳烷基、取代和未被取代的链烯基、取代和未被取代的炔基、取代和未被取代的芳基、和取代和未被取代的杂环取代，其中取代的烷基、取代的环烷基、取代的芳烷基、取代的链烯基、取代的炔基、取代的芳基和取代的杂环可以被一个或多个卤素、CN、CF3、CO2R、C(O)R、C(O)NR2、NR2、NO2和OR取代。 
本文所用的术语“芳基”或“芳族基团”关注的是单-环芳族基团(例如苯基、吡啶基、吡唑基等)和多环环系(萘基、喹啉等)。多环可以带有两个或多个环，其中的两个原子为两个相邻的环共用(这些环是"稠合的")，其中环中的至少一个为芳族环，例如其它环可以为环烷基、环烯基、芳基、杂环和/或杂芳基。另外，芳基可以任选地被一个或多个取代基取代，所述的取代基选自卤素、CN、CF3、NR2、环-氨基、NO2、OR、CF3、-(CH2)xC(O)(CH2)yR、-(CH2)xC(O)N(R')(R")、-(CH2)xC(O)O(CH2)yR、-(CH2)xN(R')(R")、-N(R)SO2R、-O(CH2)xC(O)N(R')(R")、-SO2N(R')(R")、-(CH2)xN(R)-(CH2)y-R、-(CH2)xN(R)-C(O)-(CH2)y-R、-(CH2)xN(R)-C(O)-O-(CH2)y-R、-(CH2)x-C(O)-N(R)-(CH2)y-R、-(CH2)xC(O)N(R)-(CH2)y-R、-O-(CH2)x-C(O)-N(R)-(CH2)y-R、取代和未被取代的烷基、取代和未被取代的环烷基、取代和未被取代的芳烷基、取代和未被取代的链烯基、取代和未被取代的炔基、取代和未被取代的芳基和取代和未被取代的杂环，其中所述取代的烷基、取代的环烷基、取代的芳烷基、取代的链烯基、取代的炔基、取代的 芳基和取代的杂环可以被卤素、CN、CF3、CO2R、C(O)R、C(O)NR2、NR2、环-氨基、NO2和OR中的一个或多个取代。 
本文所用的术语"杂原子"，特别是作为环杂原子指的是N、O和S。 
各个R独立地选自H、取代和未被取代的烷基、取代和未被取代的环烷基、取代和未被取代的芳烷基、取代和未被取代的芳基和取代和未被取代的杂环，其中所述取代的烷基、取代的环烷基、取代的芳烷基、取代的芳基和取代的杂环可以被一个或多个卤素、CN、CF3、OH、CO2H、NO2、C1-6烷基、-O-(C1-6烷基)、-NH2、-NH(C1-6烷基)和-N(C1-6烷基)2取代。各个R'和R"独立地选自H、或取代和未被取代的烷基、取代和未被取代的环烷基、取代和未被取代的芳烷基、取代和未被取代的芳基和取代和未被取代的杂环，其中所述取代的烷基、取代的环烷基、取代的芳烷基、取代的芳基和取代的杂环可以被一个或多个卤素、CN、CF3、OH、CO2H、NO2、C1-6烷基、-O-(C1-6烷基)、-NH2、-NH(C1-6烷基)和-N(C1-6烷基)2取代；或R'和R"可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有至多三个额外杂原子的5-至7-元环，所述杂原子可以被C1-6烷基取代。每个x和每个y独立地选自0-4。 
在一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式I的P210BCR-ABL-T315Itheramutein的抑制剂： 
其中： 
环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环； 
X1选自N、N-R0或C-R1； 
X2选自N、N-R0或C-R1； 
虚线表示任选的双键； 
各个R1独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR11、-(CH2)pC(O)(CH2)qR11、-(CH2)pC(O)N(R12)(R13)、-(CH2)pC(O)O(CH2)qR11、-(CH2)pN(R11)(CH2)q C(O)R11、-(CH2)pN(R12)(R13)、-N(R11)SO2R11、-OC(O)N(R12)(R13)、-SO2N(R12)(R13)、卤素、芳基和杂环 组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R1基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
n为0-6； 
各个R11独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R12和R13独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R12和R13可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任选被1至3个独立选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR0、CO2R0、C(O)R0、卤素、芳基和杂环的取代基取代； 
p为0-4； 
q为0-4； 
R2选自-CR21 a-、-NR22 b-和-(C=R23)-； 
各个R21独立地选自H、卤素、-NH2、-N(H)(C1-3烷基)、-N(C1-3烷基)2、-O-(C1-3烷基)、OH和C1-3烷基； 
各个R22独立地选自H和C1-3烷基； 
R23选自-O、S、N-R0和N-OR0； 
R3选自-CR31 c-、-NR32 d-、-SO2-和-(C=R33)-； 
R31基团各自选自H、卤素、-NH2、-N(H)(R0)、-N(R0)2、-O-R0、OH和C1-3烷基； 
R32基团各自选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO2R0、C(O)R0、芳基和杂环； 
R33选自O、S、N-R34和N-OR0； 
R34选自H、NO2、CN、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
R4选自-CR41 e-、-NR42 f-、-(C=R43)-、-SO2-和-O-； 
各个R41选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、CO2R0、C(O)R0、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R42基团选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO2R0、 C(O)R0、芳基和杂环； 
各个R43选自O、S、N-R0和N-OR0； 
条件是当R2为-NR22 b-且R4为-NR42 f-时，R3不为-NR32 d-；R3和R4不同时分别选自-(C=R33)-和-(C=R43)-；且R3和R4不同时选自-SO2-; 
R5选自-Y-R6和-Z-R7； 
Y选自化学键、O、NR0； 
R6选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
Z为带有1-4个碳原子并且任选地被卤素、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO2R0、C(O)R0、C(O)N(R0)2、CN、CF3、N(R0)2、NO2和OR0中的一个或多个取代的烃链； 
R7为H或选自芳基和杂环； 
R0各自独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环； 
a为1或2； 
b为0或1； 
c为1或2； 
d为0或1； 
e为1或2；且 
f为0或1。 
本文所述的本发明中的重要组成部分和概念教导在于本发明化合物的R2和R3位置均非任意芳族或非-芳族环结构的成员。我们发现带有R2和/或R3位置作为任意芳族或非-芳族环结构的成员的化合物无法有效地抑制T315I theramutein，而除具有其它优选的活性基团外，在这些位置上缺乏这样的环成分的本发明化合物为T315I theramutein的有效抑制剂。 
在本发明的优选实施方案中，环A为芳族环。 
在本发明的优选实施方案中，X1或X2为N。在另一个优选的实施方案中，X1和X2均为N。在本发明特别优选的实施方案中，环A为吡啶环或嘧啶环。在进一步优选的实施方案中，环A选自如下提供的结构： 
Figure BDA0000440201980000231
在本发明的优选实施方案中，R5是具有下面通式的基团： 
Figure BDA0000440201980000232
其中: 
X3为N或CH; 
R61选自芳基和杂环; 
Q选自化学键或具有式-O-、-(CH2)i-、-(CH2)iC(O)(CH2)j-、-(CH2)i-N(R62)-(CH2)j-、-(CH2)iC(O)-N(R62)-(CH2)j-、-(CH2)iC(O)O(CH2)j-、-(CH2)iN(R62)C(O)-(CH2)j-、-(CH2)iOC(O)N(R62)-(CH2)j-和-O-(CH2)i-C(O)N(R62)-(CH2)j-的基团; 
R62选自H、烷基、芳基和杂环; 
各个R0独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环; 
h为0至4; 
i为0至4;且 
j为0至4。 
在本发明进一步优选的实施方案中，R5是具有下面通式的基团： 
Figure BDA0000440201980000233
其中: 
X3为N或CH; 
Q1选自化学键或具有式-O-、-CH2-、-NH-、-C(O)-NH-、-C(O)O-、-NH-C(O)-、-OC(O)NH-和-O-C(O)NH-的基团; 
各个R70选自卤素、烷基、CN、N(R71)2、环-氨基、NO2、OR71和CF3; 
各个R71选自H、烷基、芳基、芳烷基和杂环;且k为0至4。 
在本发明进一步优选的实施方案中，R5是具有下面通式的基团： 
Figure BDA0000440201980000241
其中: 
X3为N或CH; 
Q1选自化学键或具有式-O-、-CH2-、-NH-、-C(O)-NH-、-C(O)O-、-NH-C(O)-、-OC(O)NH-和-O-C(O)NH-的基团; 
R70选自卤素、烷基、CN、N(R71)2、环-氨基、NO2、OR71和CF3;且各个R71选自H、烷基、芳基、芳烷基和杂环。 
在特别优选的实施方案中，做出了一个或多个的下述选择：Q1为-NH-；X3为N；各个R71独立地选自H、甲基和乙基，且各个R71优选为甲基；和/或R70选自OH、OCH3、卤素和CF3。 
在一个优选的实施方案中，如果R2或R4被分别选为-NR22 b-或-NR42-，那么R31不选自卤素、-NH2、-N(H)(R0)、-N(R0)2、-O-R0或OH。 
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式Ia的P210BCR-ABL-T315Itheramutein的抑制剂： 
Figure BDA0000440201980000242
其中： 
环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环； 
X1选自N、N-R0或C-R1； 
X2选自N、N-R0或C-R1； 
虚线表示任选的双键； 
各个R1独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR11、-(CH2)pC(O)(CH2)qR11、-(CH2)pC(O)N(R12)(R13)、-(CH2)pC(O)O(CH2)qR11、-(CH2)pN(R11)(CH2)q C(O)R11、-(CH2)pN(R12)(R13)、-N(R11)SO2R11、-OC(O)N(R12)(R13)、-SO2N(R12)(R13)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R1基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
n为0-6； 
各个R11独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R12和R13独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R12和R13可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任选被1至3个独立选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR0、CO2R0、C(O)R0、卤素、芳基和杂环的取代基取代； 
p为0-4； 
q为0-4； 
各个R22独立地选自H和C1-3烷基； 
R3选自-CR31 c-、-NR32 d-、-SO2-和-(C=R33)-； 
各个R31基团选自H、卤素、-NH2、-N(H)(R0)、-N(R0)2、-O-R0、OH和C1-3烷基； 
各个R32基团选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO2R0、C(O)R0、芳基和杂环； 
R33选自O、S、N-R34和N-OR0； 
R34选自H、NO2、CN、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
R4选自-CR41 e-、-NR42 f-、-(C=R43)-、-SO2-和-O-； 
各个R41选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、CO2R0、C(O)R0、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R42基团选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO2R0、C(O)R0、芳基和杂环； 
各个R43选自O、S、N-R0和N-OR0； 
条件是当R4为-NR42 f-时，R3不为-NR32 d-；R3和R4不同时分别选自-(C=R33)-和-(C=R43)-；且R3和R4不同时选自-SO2-; 
R5选自-Y-R6和-Z-R7； 
Y选自化学键、O、N-R0； 
R6选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
Z为带有1-4个碳原子并且任选地被卤素、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO2R0、C(O)R0、C(O)N(R0)2、CN、CF3、N(R0)2、NO2和OR0中的一个或多个取代的烃链； 
R7为H或选自芳基和杂环； 
R0各自独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环； 
a为1或2； 
b为0或1； 
c为1或2； 
d为0或1； 
e为1或2；且 
f为0或1。 
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式Ib的P210BCR-ABL-T315Itheramutein的抑制剂： 
Figure BDA0000440201980000261
其中： 
环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环； 
X1选自N、N-R0或C-R1； 
X2选自N、N-R0或C-R1； 
虚线表示任选的双键； 
R1各自独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR11、-(CH2)pC(O)(CH2)qR11、-(CH2)pC(O)N(R12)(R13)、-(CH2)pC(O)O(CH2)qR11、-(CH2)pN(R11)(CH2)q C(O)R11、-(CH2)pN(R12)(R13)、-N(R11)SO2R11、-OC(O)N(R12)(R13)、-SO2N(R12)(R13)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R1基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
n为0-6； 
各个R11独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R12和R13独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R12和R13可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任选被1至3个独立选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR0、CO2R0、C(O)R0、卤素、芳基和杂环的取代基取代； 
p为0-4； 
q为0-4； 
各个R22各自独立地选自H和C1-3烷基； 
各个R32基团选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO2R0、C(O)R0、芳基和杂环； 
R4选自-CR41 e-、-(C=R43)-、-SO2-和-O-； 
R41各自选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、CO2R0、C(O)R0、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R43选自O、S、N-R0和N-OR0； 
R5选自-Y-R6和-Z-R7； 
Y选自化学键、O、N-R0； 
R6选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
Z为带有1-4个碳原子并且任选地被卤素、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO2R0、C(O)R0、C(O)N(R0)2、CN、CF3、N(R0)2、NO2和OR0中的一个或多个取代的烃链； 
R7为H或选自芳基和杂环； 
R0各自独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环； 
a为1或2； 
b为0或1； 
c为1或2； 
d为0或1； 
e为1或2；且 
f为0或1。 
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式Ic的P210BCR-ABL-T315Itheramutein的抑制剂： 
Figure BDA0000440201980000281
其中： 
环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环； 
X1选自N、N-R0或C-R1； 
X2选自N、N-R0或C-R1； 
虚线表示任选的双键； 
R1各自独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR11、-(CH2)pC(O)(CH2)qR11、-(CH2)pC(O)N(R12)(R13)、-(CH2)pC(O)O(CH2)qR11、-(CH2)pN(R11)(CH2)q C(O)R11、-(CH2)pN(R12)(R13)、-N(R11)SO2R11、-OC(O)N(R12)(R13)、-SO2N(R12)(R13)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R1基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
n为0-6； 
各个R11独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R12和R13独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R12和R13可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任选被1至3个独立选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR0、CO2R0、C(O)R0、卤素、芳基和杂环的取代基取代； 
p为0-4； 
q为0-4； 
X3为N、CH或C-R2； 
各个R2独立地选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR21、-(CH2)rC(O)(CH2)sR21、-(CH2)rC(O)N(R22)(R23)、-(CH2)rC(O)O(CH2)sR21、-(CH2)rN(R21)C(O)R21、-(CH2)rN(R22)(R23)、-N(R21)SO2R21、-OC(O)N(R22)(R23)、-SO2N(R22)(R23)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R2基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环; 
R21独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
R22和R21独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R22和R21可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任选被1至3个独立选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR0、CO2R0、C(O)R0、卤素、芳基和杂环的取代基取代； 
r为0至4； 
s为0至4； 
m为0至4； 
R4选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO2R0、C(O)R0、芳基和杂环； 
a为0或1； 
X4选自： 
Figure BDA0000440201980000291
和
Figure BDA0000440201980000292
各个R3独立地选自H、N(R0)2、烷基、环烷基、链烯基、炔基、CO2R0、C(O)R0、芳烷基、芳基和杂环组成的组； 
R3′选自H、N(R0)2、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环；并且各个R0独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环。 
在本发明的优选实施方案中，选择通式I的R2、R3和R4以便得到下列化学基团： 
-N(R22)-N=C(R41)- 
-N(R22)-N(R32)-C(=O)- 
-N(R22)-N(R32)-C(R41)(R41)- 
-N(R22)-C(R31)(R31)-C(R41)(R41)- 
-N(R22)-C(R31)(R31)-C(=O)- 
-N=N-C(R41)(R41)- 
-C(R21)=C=C(R41)- 
-C(R21)=C(R31)-C(=O)- 
-C(R21)=C(R31)-C(R41)(R41)- 
-C(R21)(R21)-C(R31)=C(R41)- 
-C(R21)(R21)-C(R31)(R31)-C(=O)- 
-C(R21)(R21)-C(R31)(R31)-C(R41)(R41)- 
-C(R21)(R21)-N(R32)-C(=O)- 
-C(R21)(R21)-N(R32)-C(R41)(R41)- 
-N(R22)-C(=O)-C(R41)(R41)- 
-N(R22)-C(=O)-N(R41)- 
-N(R22)-C(=O)-O- 
-C(R21)(R21)-C(=O)-C(R41)(R41)- 
-C(R21)(R21)-C(=O)-N(R42)- 
-N(R22)-C(=NR34)-N(R42)- 
-C(=O)-N(R32)-N(R42). 
用于R2、R3和R4的特别优选的化学基团包括： 
-N(R22)-N=C(R41)- 
-N(R22)-N(R32)-C(=O)- 
-N(R22)-C(R31)(R31)-C(R41)(R41)- 
-N(R22)-C(R31)(R31)-C(=O)- 
-C(R21)(R21)-C(=O)-C(R41)(R41)- 
-C(R21)(R21)-C(=O)-N(R42)- 
-N(R22)-C(=NR34)-N(R42)- 
-C(=O)-N(R32)-N(R42)。 
在另一个优选的实施方案中，R6或R7为可以任选被取代的芳基。 特别优选的芳基包括取代或未被取代的苯基和吡啶基。在额外或备选的实施方案中，优选取代基R21和R22独立地选自具有小的空间体积的基团并且优选自H和CH3，且更优选H。 
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式II的P210BCR-ABL-T315Itheramutein的抑制剂： 
Figure BDA0000440201980000311
其中 
环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环； 
X1选自N、N-R0或C-R1； 
X2选自N、N-R0或C-R1； 
虚线表示任选的双键； 
R1各自独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR11、-(CH2)pC(O)(CH2)qR11、-(CH2)pC(O)N(R12)(R13)、-(CH2)pC(O)O(CH2)qR11、-(CH2)pN(R11)(CH2)q C(O)R11、-(CH2)pN(R12)(R13)、-N(R11)SO2R11、-OC(O)N(R12)(R13)、-SO2N(R12)(R13)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R1基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
n为0-6； 
各个R11独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R12和R13独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R12和R13可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任选被1至3个独立选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR0、CO2R0、C(O)R0、卤素、芳基和杂环的取代基取代； 
p为0-4； 
q为0-4； 
R8选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、CO2R0、C(O)R0、芳烷基、芳基和杂环组成的组； 
R9选自-Y-R6和-Z-R7； 
Y选自化学键、O、N-R0； 
R6选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
Z为带有1-4个碳原子并且任选地被卤素、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO2R0、C(O)R0、C(O)N(R0)2、CN、CF3、N(R0)2、NO2和OR0中的一个或多个取代的烃链； 
R7为H或选自芳基和杂环；且 
各个R0独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环。 
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式IIa的P210BCR-ABL-T315Itheramutein的抑制剂： 
Figure BDA0000440201980000321
其中 
环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环； 
X1选自N、N-R0或C-R1； 
X2选自N、N-R0或C-R1； 
虚线表示任选的双键； 
R1各自独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR11、-(CH2)pC(O)(CH2)qR11、-(CH2)pC(O)N(R12)(R13)、-(CH2)pC(O)O(CH2)qR11、-(CH2)pN(R11)C(O)R11、-(CH2)pN(R12)(R13)、-N(R11)SO2R11、-OC(O)N(R12)(R13)、-SO2N(R12)(R13)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R1基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
n为0-6； 
各个R11独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、 芳基和杂环； 
各个R12和R13独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R12和R13可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任选被1至3个独立选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR0、CO2R0、C(O)R0、卤素、芳基和杂环的取代基取代； 
p为0-4； 
q为0-4； 
R8选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、CO2R0、C(O)R0、芳烷基、芳基和杂环组成的组； 
X3为N、CH或C-R50； 
各个R50独立地选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR51、-(CH2)rC(O)(CH2)sR51、-(CH2)rC(O)N(R52)(R53)、-(CH2)rC(O)O(CH2)sR51、-(CH2)rN(R51)C(O)R51、-(CH2)rN(R52)(R53)、-N(R51)SO2R51、-OC(O)N(R52)(R53)、-SO2N(R52)(R53)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R50基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
R51选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
R52和R53独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R52和R53可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任选被1至3个独立选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR0、CO2R0、C(O)R0、卤素、芳基和杂环的取代基取代； 
r为0-4； 
s为0-4； 
m为0-4；且 
各个R0独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环。 
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式IIb的 P210BCR-ABL-T315Itheramutein的抑制剂： 
其中： 
R14选自H和F； 
R8选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、CO2R0、C(O)R0、芳烷基、芳基和杂环组成的组； 
X3为N、CH或C-R60； 
各个R60独立地选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR0、卤素、芳基和杂环组成的组； 
R61选自芳基和杂环； 
Q选自化学键或具有式-O-、-(CH2)i-、-(CH2)iC(O)(CH2)j-、-(CH2)i-N(R62)-(CH2)j-、-(CH2)iC(O)-N(R62)-(CH2)j-、-(CH2)iC(O)O(CH2)j-、-(CH2)iN(R62)C(O)-(CH2)j-、-(CH2)iOC(O)N(R62)-(CH2)j-和-O-(CH2)i-C(O)N(R62)-(CH2)j-的基团； 
R62选自H、烷基、芳基和杂环； 
各个R0独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环； 
h为0-4； 
i为0-4；且 
j为0-4。 
在通式IIb化合物的优选实施方案中，R60选自卤素、CF3和OH。在其他优选的实施方式中，R8选自H和CH3。 
在通式IIb化合物的优选实施方案中，X3为N。在进一步优选的实施方案中，Q选自-(CH2)i-N(R62)-(CH2)j-、特别在优选的实施方案中，Q为-N(R62)-。 
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式IIc的 P210BCR-ABL-T315Itheramutein的抑制剂： 
其中 
环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环； 
X1选自N、N-R0或C-R1； 
X2选自N、N-R0或C-R1； 
虚线表示任选的双键； 
各个R1独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR11、-(CH2)pC(O)(CH2)qR11、-(CH2)pC(O)N(R12)(R13)、-(CH2)pC(O)O(CH2)qR11、-(CH2)pN(R11)C(O)R11、-(CH2)pN(R12)(R13)、-N(R11)SO2R11、-OC(O)N(R12)(R13)、-SO2N(R12)(R13)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R1基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
n为0-6； 
各个R11独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R12和R13独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R12和R13可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任选被1至3个独立选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR0、CO2R0、C(O)R0、卤素、芳基和杂环的取代基取代； 
p为0-4； 
q为0-4； 
R8选自H和甲基； 
X3为N或CH； 
R61选自芳基和杂环； 
Q选自化学键或具有式-O-、-(CH2)i-、-(CH2)iC(O)(CH2)j-、 -(CH2)i-N(R62)-(CH2)j-、-(CH2)iC(O)-N(R62)-(CH2)j-、-(CH2)iC(O)O(CH2)j-、-(CH2)iN(R62)C(O)-(CH2)j-、-(CH2)iOC(O)N(R62)-(CH2)j-和-O-(CH2)i-C(O)N(R62)-(CH2)j-的基团； 
R62选自H、烷基、芳基和杂环； 
各个R0独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环； 
h为0-4； 
i为0-4；且 
j为0-4。 
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式IId的P210BCR-ABL-T315Itheramutein的抑制剂： 
Figure BDA0000440201980000361
其中： 
环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环； 
X1选自N、N-R0或C-R1； 
X2选自N、N-R0或C-R1； 
虚线表示任选的双键； 
各个R1独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR11、-(CH2)pC(O)(CH2)qR11、-(CH2)pC(O)N(R12)(R13)、-(CH2)pC(O)O(CH2)qR11、-(CH2)pN(R11)C(O)R11、-(CH2)pN(R12)(R13)、-N(R11)SO2R11、-OC(O)N(R12)(R13)、-SO2N(R12)(R13)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R1基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
n为0-6； 
各个R11独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R12和R13独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳 烷基、芳基和杂环；或R12和R13可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任选被1至3个独立选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR0、CO2R0、C(O)R0、卤素、芳基和杂环的取代基取代； 
p为0-4； 
q为0-4； 
各个R0独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环； 
R8选自H和甲基； 
X3为N或CH； 
Q1选自化学键或具有式-O-、-CH2-、-NH-、-C(O)-NH-、-C(O)O-、-NH-C(O)-、-OC(O)NH-和-O-C(O)NH-的基团; 
各个R70选自卤素、烷基、CN、N(R71)2、环-氨基、NO2、OR71和CF3； 
各个R71选自H、烷基、芳基、芳烷基和杂环；并且k为0-4。 
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式IIe的P210BCR-ABL-T315Itheramutein的抑制剂： 
Figure BDA0000440201980000371
其中： 
环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环； 
X1选自N、N-R0或C-R1； 
X2选自N、N-R0或C-R1； 
虚线表示任选的双键； 
各个R1独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR11、-(CH2)pC(O)(CH2)qR11、-(CH2)pC(O)N(R12)(R13)、-(CH2)pC(O)O(CH2)qR11、-(CH2)pN(R11)C(O)R11、-(CH2)pN(R12)(R13)、-N(R11)SO2R11、-OC(O)N(R12)(R13)、-SO2N(R12)(R13)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R1基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
n为0-6； 
各个R11独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R12和R13独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R12和R13可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任选被1至3个独立选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR0、CO2R0、C(O)R0、卤素、芳基和杂环的取代基取代； 
p为0-4； 
q为0-4； 
各个R0独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环； 
R8选自H和甲基； 
X3为N或CH； 
Q1选自化学键或具有式-O-、-CH2-、-NH-、-C(O)-NH-、-C(O)O-、-NH-C(O)-、-OC(O)NH-和-O-C(O)NH-的基团; 
各个R70选自卤素、烷基、CN、N(R71)2、环-氨基、NO2、OR71和CF3； 
各个R71选自H和烷基。 
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式IIf的P210BCR-ABL-T315I theramutein的抑制剂： 
其中： 
R14选自H和F； 
R8选自H和甲基； 
各个R70选自卤素、烷基、CN、N(R71)2、环-氨基、NO2、OR71和CF3； 
各个R71选自H、烷基、芳基、芳烷基和杂环；并且k为0-4。 
通式II、IIa、IIb、IIc、IId、IIe或IIf的典型化合物包括下列结 构： 
Figure BDA0000440201980000391
Figure BDA0000440201980000401
Figure BDA0000440201980000411
Figure BDA0000440201980000421
Figure BDA0000440201980000431
Figure BDA0000440201980000441
Figure BDA0000440201980000461
Figure BDA0000440201980000471
Figure BDA0000440201980000481
Figure BDA0000440201980000491
Figure BDA0000440201980000501
Figure BDA0000440201980000511
Figure BDA0000440201980000521
Figure BDA0000440201980000531
Figure BDA0000440201980000541
Figure BDA0000440201980000551
Figure BDA0000440201980000561
Figure BDA0000440201980000581
Figure BDA0000440201980000591
Figure BDA0000440201980000601
Figure BDA0000440201980000611
Figure BDA0000440201980000621
Figure BDA0000440201980000631
Figure BDA0000440201980000641
Figure BDA0000440201980000651
Figure BDA0000440201980000661
Figure BDA0000440201980000681
Figure BDA0000440201980000691
Figure BDA0000440201980000701
Figure BDA0000440201980000711
Figure BDA0000440201980000721
Figure BDA0000440201980000731
Figure BDA0000440201980000741
Figure BDA0000440201980000751
Figure BDA0000440201980000781
Figure BDA0000440201980000791
Figure BDA0000440201980000811
Figure BDA0000440201980000831
Figure BDA0000440201980000841
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式III的P210BCR-ABL-T315I theramutein的抑制剂： 
Figure BDA0000440201980000842
其中 
环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环； 
X1选自N、N-R0或C-R1； 
X2选自N、N-R0或C-R1； 
虚线表示任选的双键； 
各个R1独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR11、-(CH2)pC(O)(CH2)qR11、-(CH2)pC(O)N(R12)(R13)、-(CH2)pC(O)O(CH2)qR11、-(CH2)pN(R11)C(O)R11、-(CH2)pN(R12)(R13)、-N(R11)SO2R11、-OC(O)N(R12)(R13)、-SO2N(R12)(R13)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R1基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
n为0-6； 
各个R11独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R12和R13独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R12和R13可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任选被1至3个独立选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR0、CO2R0、C(O)R0、卤素、芳基和杂环的取代基取代； 
p为0-4； 
q为0-4； 
R10选自-Y'-R18； 
Y'选自化学键、O、NR0-和带有1-4个碳原子并且任选地被卤素、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO2R0、C(O)R0、C(O)N(R0)2、CN、CF3、N(R0)2、NO2和OR0中的一个或多个取代的烃链； 
R18选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CF3、芳基和杂环组成的组；且 
各个R0独立地选自H、烷基,环烷基、芳烷基、芳基和杂环。 
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式IIIa的P210BCR-ABL-T315I theramutein的抑制剂： 
Figure BDA0000440201980000851
其中： 
环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环； 
X1选自N、N-R0或C-R1； 
X2选自N、N-R0或C-R1； 
虚线表示任选的双键； 
各个R1独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR11、-(CH2)pC(O)(CH2)qR11、-(CH2)pC(O)N(R12)(R13)、-(CH2)pC(O)O(CH2)qR11、-(CH2)pN(R11)C(O)R11、-(CH2)pN(R12)(R13)、-N(R11)SO2R11、-OC(O)N(R12)(R13)、-SO2N(R12)(R13)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R1基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
n为0-6； 
各个R11独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R12和R13独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳 烷基、芳基和杂环；或R12和R13可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任选被1至3个独立选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR0、CO2R0、C(O)R0、卤素、芳基和杂环的取代基取代； 
p为0-4； 
q为0-4； 
X3为N、CH或C-R50； 
各个R50独立地选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR51、-(CH2)rC(O)(CH2)sR51、-(CH2)rC(O)N(R52)(R53)、-(CH2)rC(O)O(CH2)sR51、(CH2)rN(R51)C(O)R51、-(CH2)rN(R52)(R53)、-N(R51)SO2R51、-OC(O)N(R52)(R53)、-SO2N(R52)(R53)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R50基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
R51选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
R52和R53独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R52和R53可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任选被1至3个独立选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR0、CO2R0、C(O)R0、卤素、芳基和杂环的取代基取代； 
r为0-4； 
s为0-4； 
m为0-4；且 
各个R0各自独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环。 
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式IIIb的P210BCR-ABL-T315I theramutein的抑制剂： 
Figure BDA0000440201980000861
其中： 
环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环； 
X1选自N、N-R0或C-R1； 
X2选自N、N-R0或C-R1； 
虚线表示任选的双键； 
各个R1独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR11、-(CH2)pC(O)(CH2)qR11、-(CH2)pC(O)N(R12)(R13)、-(CH2)pC(O)O(CH2)qR11、-(CH2)pN(R11)C(O)R11、-(CH2)pN(R12)(R13)、-N(R11)SO2R11、-OC(O)N(R12)(R13)、-SO2N(R12)(R13)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R1基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
n为0-6； 
各个R11独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R12和R13独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R12和R13可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任选被1至3个独立选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR0、CO2R0、C(O)R0、卤素、芳基和杂环的取代基取代； 
p为0-4； 
q为0-4； 
X3为N或CH； 
R61选自芳基和杂环； 
Q选自化学键或具有式-O-、-(CH2)i-、-(CH2)iC(O)(CH2)j-、-(CH2)i-N(R62)-(CH2)j-、-(CH2)iC(O)-N(R62)-(CH2)j-、-(CH2)iC(O)O(CH2)j-、-(CH2)iN(R62)C(O)-(CH2)j-、-(CH2)iOC(O)N(R62)-(CH2)j-和-O-(CH2)i-C(O)N(R62)-(CH2)j-的基团； 
R62选自H、烷基、芳基和杂环； 
各个R0独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环； 
h为0-4； 
i为0-4；且 
j为0-4。 
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式IIIc的P210BCR-ABL-T315I theramutein的抑制剂： 
Figure BDA0000440201980000881
其中： 
环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环； 
X1选自N、N-R0或C-R1； 
X2选自N、N-R0或C-R1； 
虚线表示任选的双键； 
各个R1独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR11、-(CH2)pC(O)(CH2)qR11、-(CH2)pC(O)N(R12)(R13)、-(CH2)pC(O)O(CH2)qR11、-(CH2)pN(R11)C(O)R11、-(CH2)pN(R12)(R13)、-N(R11)SO2R11、-OC(O)N(R12)(R13)、-SO2N(R12)(R13)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R1基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
n为0-6； 
各个R11独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R12和R13独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R12和R13可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任选被1至3个独立选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR0、CO2R0、C(O)R0、卤素、芳基和杂环的取代基取代； 
p为0-4； 
q为0-4； 
X3为N或CH； 
各个R0独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环； 
Q1选自化学键或具有式-O-、-CH2-、-NH-、-C(O)-NH-、-C(O)O-、-NH-C(O)-、-OC(O)NH-和-O-C(O)NH-的基团; 
R70各自选自卤素、烷基、CN、N(R71)2、环-氨基、NO2、OR71和CF3; 
R71各自选自H、烷基、芳基、芳烷基和杂环;且k为0至4。 
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式IIId的P210BCR-ABL-T315I theramutein的抑制剂： 
Figure BDA0000440201980000891
其中： 
环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环； 
X1选自N、N-R0或C-R1； 
X2选自N、N-R0或C-R1； 
虚线表示任选的双键； 
各个R1独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR11、-(CH2)pC(O)(CH2)qR11、-(CH2)pC(O)N(R12)(R13)、-(CH2)pC(O)O(CH2)qR11、-(CH2)pN(R11)C(O)R11、-(CH2)pN(R12)(R13)、-N(R11)SO2R11、-OC(O)N(R12)(R13)、-SO2N(R12)(R13)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R1基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
n为0-6； 
各个R11独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R12和R13独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R12和R13可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任 选被1至3个独立选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR0、CO2R0、C(O)R0、卤素、芳基和杂环的取代基取代； 
p为0-4； 
q为0-4； 
各个R0独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环； 
R8选自H和甲基； 
X3为N或CH； 
Q1选自化学键或具有式-O-、-CH2-、-NH-、-C(O)-NH-、-C(O)O-、-NH-C(O)-、-OC(O)NH-和-O-C(O)NH-的基团; 
R70各自选自卤素、烷基、CN、N(R71)2、环-氨基、NO2、OR71和CF3; 
且R71各自选自H和烷基。 
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式IIIe的P210BCR-ABL-T315I theramutein的抑制剂： 
Figure BDA0000440201980000901
其中： 
R14选自H和F； 
R70各自选自卤素、烷基、CN、N(R71)2、环-氨基、NO2、OR71和CF3; 
R71各自选自H、烷基、芳基、芳烷基和杂环;且k为0至4。 
通式III、IIIa、IIIb、IIIc、IIId或IIIe的典型化合物包括下列结构： 
Figure BDA0000440201980000911
Figure BDA0000440201980000921
Figure BDA0000440201980000931
Figure BDA0000440201980000941
Figure BDA0000440201980000961
Figure BDA0000440201980000971
Figure BDA0000440201980000981
Figure BDA0000440201980001001
Figure BDA0000440201980001011
Figure BDA0000440201980001021
Figure BDA0000440201980001031
Figure BDA0000440201980001041
在另一个实施方案中，本发明提供了具有通式IV的P210BCR-ABL-T315I theramutein的抑制剂： 
Figure BDA0000440201980001042
其中： 
环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环； 
X1选自N、N-R0或C-R1； 
X2选自N、N-R0或C-R1； 
虚线表示任选的双键； 
R1各自独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR11、-(CH2)pC(O)(CH2)qR11、-(CH2)pC(O)N(R12)(R13)、-(CH2)pC(O)O(CH2)qR11、-(CH2)pN(R11)C(O)R11、-(CH2)pN(R12)(R13)、-N(R11)SO2R11、-OC(O)N(R12)(R13)、-SO2N(R12)(R13)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R1基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
n为0-6； 
各个R11独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、 芳基和杂环； 
各个R12和R13独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R12和R13可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环； 
p为0-4； 
q为0-4； 
R22选自H和C1-3烷基； 
R34选自H、NO2、CN、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
R44选自H、烷基、环烷基、-(C=O)R0、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
R45选自-Y"-R19； 
Y"选自化学键、O、NR0-和带有1-4个碳原子并且任选被卤素、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO2R0、C(O)R0、C(O)N(R0)2、CN、CF3、N(R0)2、NO2和OR0中的一个或多个取代的烃链； 
R19选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CF3、芳基和杂环组成的组；且 
各个R0独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环。 
通式IV的典型化合物包括下列结构： 
Figure BDA0000440201980001051
在另一个实施方案中，本发明提供了具有通式V的P210BCR-ABL-T315I theramutein的抑制剂： 
其中： 
环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环； 
X1选自N、N-R0或C-R1； 
X2选自N、N-R0或C-R1； 
虚线表示任选的双键； 
R1各自独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR11、-(CH2)pC(O)(CH2)qR11、-(CH2)pC(O)N(R12)(R13)、-(CH2)pC(O)O(CH2)qR11、-(CH2)pN(R11)C(O)R11、-(CH2)pN(R12)(R13)、-N(R11)SO2R11、-OC(O)N(R12)(R13)、-SO2N(R12)(R13)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R1基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
n为0-6； 
各个R11独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R12和R13独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R12和R13可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环； 
p为0-4； 
q为0-4； 
R22选自H和C1-3烷基； 
R34选自H、NO2、CN、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
R55选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
R56选自-Y"-R19； 
Y"选自化学键、O、NR0-和带有1-4个碳原子并且任选被卤素、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO2R0、C(O)R0、C(O)N(R0)2、CN、CF3、N(R0)2、NO2和OR0中的一个或多个取代的烃链； 
R19选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CF3、芳基和杂环组成的组；且 
各个R0各自独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环。 
在另一个实施方案中，本发明提供了具有通式Va的P210BCR-ABL-T315I theramutein的抑制剂： 
Figure BDA0000440201980001071
其中： 
环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环； 
X1选自N、N-R0或C-R1； 
X2选自N、N-R0或C-R1； 
虚线表示任选的双键； 
R1各自独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR11、-(CH2)pC(O)(CH2)qR11、-(CH2)pC(O)N(R12)(R13)、-(CH2)pC(O)O(CH2)qR11、-(CH2)pN(R11)C(O)R11、-(CH2)pN(R12)(R13)、-N(R11)SO2R11、-OC(O)N(R12)(R13)、-SO2N(R12)(R13)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R1基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
n为0-6； 
各个R11独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R12和R13独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R12和R13可以与它们所连接的氮一起形成可以 任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环； 
p为0-4； 
q为0-4； 
R55选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
X3为N或C-R50； 
各个R50独立地选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR51、-(CH2)rC(O)(CH2)sR51、-(CH2)rC(O)N(R52)(R53)、-(CH2)rC(O)O(CH2)sR51、-(CH2)rN(R51)C(O)R51、-(CH2)rN(R52)(R53)、-N(R51)SO2R51、-OC(O)N(R52)(R53)、-SO2N(R52)(R53)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R50基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
R51选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
R52和R53各自独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R52和R53可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环； 
r为0-4； 
s为0-4； 
m为0-4；且 
各个R0独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环。 
通式V或Va的典型化合物包括下列结构： 
Figure BDA0000440201980001091
在另一个实施方案中，本发明提供了具有通式VI的P210BCR-ABL-T315I theramutein的抑制剂： 
Figure BDA0000440201980001092
其中： 
环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环； 
X1选自N、N-R0或C-R1； 
X2选自N、N-R0或C-R1； 
虚线表示任选的双键； 
各个R1独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR11、-(CH2)pC(O)(CH2)qR11、-(CH2)pC(O)N(R12)(R13)、-(CH2)pC(O)O(CH2)qR11、-(CH2)pN(R11)C(O)R11、-(CH2)pN(R12)(R13)、-N(R11)SO2R11、-OC(O)N(R12)(R13)、-SO2N(R12)(R13)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R1基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
n为0-6； 
各个R11独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R12和R13独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳 烷基、芳基和杂环；或R12和R13可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环； 
p为0-4； 
q为0-4； 
R55选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
R56选自-Y"-R19； 
Y"选自化学键、O、NR0-和带有1-4个碳原子并且任选被卤素、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO2R0、C(O)R0、C(O)N(R0)2、CN、CF3、N(R0)2、NO2和OR0中的一个或多个取代的烃链； 
R19选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CF3、芳基和杂环组成的组；且 
各个R0独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环。 
在另一个实施方案中，本发明提供了具有通式VIa的P210BCR-ABL-T315I theramutein的抑制剂： 
Figure BDA0000440201980001101
其中： 
环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环； 
X1选自N、N-R0或C-R1； 
X2选自N、N-R0或C-R1； 
虚线表示任选的双键； 
各个R1独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR11、-(CH2)pC(O)(CH2)qR11、-(CH2)pC(O)N(R12)(R13)、-(CH2)pC(O)O(CH2)qR11、-(CH2)pN(R11)C(O)R11、-(CH2)pN(R12)(R13)、-N(R11)SO2R11、-OC(O)N(R12)(R13)、-SO2N(R12)(R13)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R1基团形成含有 0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
n为0-6； 
各个R11独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R12和R13独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R12和R13可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环； 
p为0-4； 
q为0-4； 
R55选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
X3为N或C-R50； 
各个R50独立地选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR51、-(CH2)rC(O)(CH2)sR51、-(CH2)rC(O)N(R52)(R53)、-(CH2)rC(O)O(CH2)sR51、-(CH2)rN(R51)C(O)R51、-(CH2)rN(R52)(R53)、-N(R51)SO2R51、-OC(O)N(R52)(R53)、-SO2N(R52)(R53)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R50基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
R51选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
R52和R53各自独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R52和R53可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环； 
r为0-4； 
s为0-4； 
m为0-4；且 
各个R0各自独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环。 
通式VI或VIa的典型化合物包括下列结构： 
Figure BDA0000440201980001121
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式VII的P210BCR-ABL-T315I theramutein的抑制剂： 
Figure BDA0000440201980001131
其中： 
环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环； 
X1选自N、N-R0或C-R1； 
X2选自N、N-R0或C-R1； 
虚线表示任选的双键； 
各个R1独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR11、-(CH2)pC(O)(CH2)qR11、-(CH2)pC(O)N(R12)(R13)、-(CH2)pC(O)O(CH2)qR11、-(CH2)pN(R11)C(O)R11、-(CH2)pN(R12)(R13)、-N(R11)SO2R11、-OC(O)N(R12)(R13)、-SO2N(R12)(R13)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R1基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
n为0-6； 
各个R11独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
各个R12和R13独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R12和R13可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环； 
p为0-4； 
q为0-4； 
环B选自带有5或6个环原子的环烷基、和包括1至3个杂原子的含有5或6个环原子的杂环； 
各个R50独立地选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF3、NO2、OR51、-(CH2)rC(O)(CH2)sR51、-(CH2)rC(O)N(R52)(R53)、 -(CH2)rC(O)O(CH2)sR51、-(CH2)rN(R51)C(O)R51、-(CH2)rN(R52)(R53)、-N(R51)SO2R51、-OC(O)N(R52)(R53)、-SO2N(R52)(R53)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R50基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环； 
R51选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环； 
R52和R53各自独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R52和R53可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环； 
r为0-4； 
s为0-4； 
m为0-4；且 
各个R0独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环。 
通式VII的典型化合物包括下列结构： 
Figure BDA0000440201980001141
Figure BDA0000440201980001151
本文所用的每种表达方式的定义，例如烷基、m、n、R、R'等在任何结构中出现一次以上时，与其在同一结构中的其它处的定义无关。 
就对结构I、Ia、Ib、II和IIa化合物的上述描述中的每一种而言，对术语卤素、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基、杂环基或杂环的每次叙述独立地选自本节开始部分中提供的这些术语的定义。 
可以理解本文提供的化学结构包括如下隐含条件，即取代按照取代原子和取代基的允许价键进行并且取代产生稳定的化合物，例如，该化合物不会通过诸如重排、环化、消除等自发进行转化。 
当本发明的化合物中存在一个或多个手性中心时，本文所述的通式包括各异构体及其混合物(例如外消旋物等)。 
当本发明的化合物中存在一个或多个双键时，本文所述的通式包括顺式-和反式-异构体。尽管本文描述了顺式或反式（cis of trans）构型的化学结构(诸如，例如结构II、IIa、V、Va、VI和VIa)，两种构型的含义是每种通式均包括。 
在某些实施方案中，本发明的化合物可以以几种互变异构体形式存在。因此，本文所述的化学结构包括所有可能的列举的化合物的互变异构形式。 
本发明的化合物一般由商购原料和公知化学技术制备。可以如下合成本发明的实施方案。药物或合成化学领域技术人员易于熟知实施如下所述的合成手段所必不可少的操作步骤和技术。 
可以通过在Gineinah等的p.562(Arch.Pharm.Pharm.Med.Chem.2002，11，556-562)所述相似的条件下使合适的肼化合物诸如A和合适的醛，诸如B反应制备通式II的化合物。 
Figure BDA0000440201980001161
例如，在质子溶剂，诸如C1-C6醇中将A与1.1当量的B一起加热1-24小时，随后冷却并且收集沉淀，可以得到C。或者，可以通过蒸发溶剂并且通过使用硅胶、氧化铝或C4-C18反相介质的色谱法纯化分离产物C。类似方法可以适用于“芳基”被如R5中定义的其它基团取代的情况。 
可以通过使合适的肼化合物，诸如D和活化的羧酸，诸如E反应制备通式III的化合物，其中LG为离去基团，诸如卤素、1-氧基苯并三唑、五氟苯氧基、对-硝基苯氧基等；或化合物E还可以为不对称羧酸酐，其中可以使用与Nair和Mehta的p.408(Indian J.Chem.19675，403-408)中所述相似的条件。 
例如，在0℃-溶剂沸点的合适的温度下，在有碱，诸如吡啶或另一种叔胺存在和任选在有催化剂，诸如4-N,N-二甲氨基吡啶存在下的惰性溶剂，诸如二氯甲烷、1,2-二氯乙烷或N,N-二甲基甲酰胺中用活性酯，诸如芳基-C(O)-OC6F5处理D可以得到F，可以通过蒸发溶剂，随后使用硅胶、氧化铝或C4-C18反相介质的色谱法对其进行分离。易于由相应的羧酸和五氟苯酚，使用碳二亚胺，诸如二环己基碳二亚胺作为缩合试剂制备E的上述活性酯实例。 
可以通过使合适的亲核体，例如，肼衍生物和在与氮原子相邻位置上带有卤素取代基的杂芳族化合物反应制备前体，诸如A和D。例如，可以使用与Wu等(J.Heterocyclic Chem.1990，27，1559-1563)、 Breshears等(J.Am.Chem.Soc.1959，81，3789-3792)或Gineinah等(Arch.Pharm.Med.Chem.2002，11，556-562)所述类似的方法，由例如，2,4-二卤代嘧啶衍生物为原料制备化合物A和D的实例，所述原料中的许多为商购可得，或者易于由本领域技术人员制备。因此，用胺或其它亲核体(Z)，任选在有添加的碱存在下处理合适的2,4-二卤代嘧啶衍生物G，选择性取代嘧啶环上的4-卤素取代基。随后用第二种亲核试剂，诸如肼或肼衍生物任选在溶剂，诸如C1-C6醇和任选在有添加的碱存在下处理产物，取代嘧啶环上的2-卤素取代基，从而得到为上述结构A和D的实例的化合物。 
Figure BDA0000440201980001171
可以通过诸如下列或其直接修饰的这类方法合成实施方案，其中R2为-NR22且R3为-C(=R33)。可以以合适的环A衍生物J为原料进行合成，所述的环A衍生物J带有与必需的环氮相邻的离去基团(LG)。如上所述，上述结构G与结构G与亲核体Z的反应产物为这类合适的环A衍生物J的实例。合适的LG’基团为卤素、烷硫基、烷基磺酰基、烷基磺酸酯或芳基磺酸酯。用胺R12NH2处理J对LG’进行取代得到中间体K。该化学转化的实例由Capps等在J.Agric.Food Chem.1993，41，2411-2415中报导，其中R12为H且LG’为CH3SO2-，并且R12为H且LG’为Cl的实例报导在Marshall等的J.Chem.Soc.1951，1004-1015中。 
Figure BDA0000440201980001172
通过同时或依次引入R3、R4和R5的元素，结构K的中间体转化成本发明的化合物。例如，用异氰酸酯R6-N=C=O各自处理结构K的中间体而在单一步骤中得到结构M的化合物，其为本发明的化合物，其中R2=-NR22-，R3=-C=O-，R4=-NH-且R5=-化学键-R6。将结构K的化合 物转化成结构M的化合物的备选方法为本领域技术人员众所周知，其中，首先引入R3与离去基团(例如对-硝基苯氧基或氯)，随后用例如胺R6-NH2取代离去基团以便引入R5和R6。 
Figure BDA0000440201980001181
或者，一般在加热条件和任选在有溶剂，诸如乙酸乙酯或二烷存在下用试剂，诸如，氨基氰(NH2-CN)处理结构K的中间体而得到中间体N。氨基氰的备选物为硝基胍或脒基磺酸(NH2-C(=NH)-SO3H)。使用氨基氰进行这类转化的实例由Latham等在J.Org.Chem.1950，15，884中报导。使用硝基胍的实例由Davis在Proc.Natl.Acad.Sci.USA1925，11，72报导。脒基磺酸的应用由Shearer等Bioorg.Med.Chem.Lett.1997，7，1763报导。 
Figure BDA0000440201980001183
按照将中间体A或D转化成由C或F表示的实施方案类似的方式，将中间体K分别转化成由P或Q表示的化合物，它们为本发明进一步的实施方案。 
Figure BDA0000440201980001184
在上述方案中，用酮S处理A或K以便取代B，其中R如上所述，而分别得到结构T或U的化合物，它们为本发明进一步的实施方案。 
Figure BDA0000440201980001191
用合适的还原剂诸如金属(硼、铝、硅等)氢化物试剂，优选一种具有碱性的还原剂选择性还原U的非-胍基碳-氮双键而得到本发明的化合物V。 
Figure BDA0000440201980001192
可以如下制备本发明的实施方案，其中R2=CO，R3=-NR32-，R4=N-且R5=ZR7，其中Z为烃链且R7如上所述。当R32=小时时，通过转化成相应的酰基氯或转化成活性酯或类似的活化衍生物来活化环A-衍生的羧酸W，上述过程中的许多为本领域众所周知。用肼处理活化的羧酸得到相应的酰肼Y。用醛或酮处理Y(如果必要，在加热条件和/或温和酸催化下)而得到所需的终产物Z。 
Figure BDA0000440201980001193
如果不是商购可得，那么可以通过用氰化物离子处理上述原料J，任选通过加热或过渡金属催化以便用氰基残基取代离去基团LG’，制备环A-衍生的羧酸W。氰基的碱性或酸性水解得到酸性的羧酸中间体W。 
当R32不为H时，单取代的肼的被保护形式可以用于上述方案以便 替代肼。因此，用R32NHNH-PG，其中PG为氮保护基团，诸如苄氧羰基或叔-丁氧羰基处理来自W的活化羧酸，随后脱保护并且如上所述用合适的醛或酮处理而得到Z’，其为本发明的另一个实施方案。 
Figure BDA0000440201980001201
有机合成领域技术人员显而易见，上述反应过程为列举的方法中合乎逻辑的扩展的一组广泛方法的代表。因此，通过上述方法的显而易见的变型可以制备本发明要求保护的引入额外的R2、R3、R4和R5变化形式的本发明进一步的实施方案。 
作为本领域技术人员公认的，有利的是在获得终产物中使用临时的保护基团。本文所用的术语"保护基团"指的是可能的反应官能基团的临时变型，所述的反应官能基团可以防止不需要的化学转化。这类保护基团的实例包括羧酸的酯类、醇的甲硅烷基醚类以及醛和酮分别的缩醛类和酮缩醇类。已经综述了保护基团化学的领域(Greene，T.W.；Wuts，P.G.M.Protective Groups in Organic Synthesis，2nd ed.；Wiley：New York，1991)。 
本发明的一个实施方案涉及本领域技术人员选择的任何内源性存在的哺乳动物靶蛋白质，其对于鉴定和/或优化作为所述蛋白质的抑制剂或活化剂的化合物是有意义的。通常已知所述选择的蛋白质涉及人类疾病的病因学或发病机致。在另一个实施方案中，本发明还涉及所述哺乳动物蛋白质的突变形式。“突变蛋白”为具有作为在其相应基因中出现的作为突变结果而改变的氨基酸序列的蛋白质(Weigel等，1989)。这类突变可以导致编码的蛋白质特性中的一种或多种改变。例如，具有因一种或多种氨基酸改变产生的修饰的催化化学的酶变体为突变蛋白。 
本发明涉及隐含至少一种氨基酸残基改变的蛋白质(术语"氨基 酸序列改变（amino acid sequence change）”或"氨基酸序列改变（amino acid sequence alteration）"包括至少一种氨基酸残基的改变、缺失或添加，或缺失、添加、改变的任意组合)，以使所得突变蛋白相对于所述蛋白质的未-突变形式对治疗剂的敏感性而言变得(作为突变的结果)对已知治疗剂产生抗性。这种特定类型的突变蛋白在下文中称作theramutein，并且缺乏突变的相应的蛋白质在本文中称作prototheramutein。 
本文所用的"prototheramutein"指的是在细胞中内源性出现的蛋白质，所述的细胞对赋予治疗化合物相对无敏感性(即抗性)的突变敏感，否则，所述的治疗化合物抑制或活化所述蛋白质。因此，"theramutein"指的是在含有相对于蛋白质的内源性形式而言至少一种氨基酸序列改变的细胞中内源性出现的蛋白质或蛋白质部分，其中在使至少一个人接触已知抑制或活化prototheramutein的物质后，所述的氨基酸序列改变得到或被鉴定或成为可鉴定，并且经显示或已经显示对指定疾病的发生或发展而言具有临床意义。就确定上句中的目的而言，唯一的是物质不需限于用于首次定义theramutein存在目的的化学活性剂。因此，作为定义，theramutein是在其相应的内源性基因中隐含了突变的蛋白质，其中所述的突变与患者对一般能够活化或抑制未-突变蛋白的药物发生临床耐受性相关。就指定的theramutein而言，本文所用的术语“相应的prototheramutein”指的是通过突变产生所述的theramutein的prototheramutein。类似地，就指定的prototheramutein而言，相应的theramutein”指的是通过由所述prototheramutein突变产生的theramutein。 
因此，本领域技术人员显而易见，当编码theramutein的基因限于内源性出现的基因时，theramutein的定义不包括由导致疾病的病原体，诸如病毒和细菌编码的蛋白质。本文所用的术语"内源性基因"指的是自摄入以后已经至少以其未突变形式存在于生物体的染色体中的基因。本文所用的术语"细胞"指的是活的真核细胞，无论是在生物体，还是维持在生物体外合适的实验室组织或器官培养条件下。 
在本发明的一个实施方案中，靶蛋白质(POI)可以是任何内源性编码的哺乳动物蛋白质。在本发明的另一方面，POI是theramutein，其为一种对通常存在的所述蛋白质的"野生型"形式而言进行首次改变的蛋白质(即，野生型蛋白是prototheramutein，theramutein由其产生)。在本发明另一方面，theramutein是本身已经是突变蛋白的蛋白质变体(即,突变蛋白是prototheramutein，theramutein由其产生)。在另一个实施方案中，theramutein与先前存在的theramutein相比可以得到进一步突变。在这类情况中，可以将第一种theramutein(诸如p210BCR-ABL的T315I突变体(参见下文)视为"初级"theramutein，而随后(已经突变的)T315I变体的突变可以称作二级theramutein、三级theramutein等。作为下文中典型的，本发明的突变蛋白为脱离“野生型”Bcr-Abl抑制剂抑制的Bcr-Abl酪氨酸激酶的变体。这类Bcr-Abl突变蛋白相对于Bcr-Abl的更常见或“野生型”形式而言得到改变(也称作突变蛋白)，以这类方式改变蛋白质的特性。 
应理解关注的蛋白质（POI）是内源性编码的哺乳动物蛋白质。也可以理解主要关注的突变蛋白为相对于其prototheramutein而言具有相同、增加或减少的比活性，并且不受或难以受到用于抑制prototheramutein的活性剂抑制的theramutein。同样，另一种主要关注的theramutein为具有相同、增加或减少的比活性(相对于其prototheramutein而言)并且不受或难以受到用于活化prototheramutein的活性剂活化的theramutein。其它变化形式对本领域技术人员而言显而易见。进一步理解theramuteins可以包括天然存在或通常观察到的蛋白质变体，例如，由特定基因的不同等位基因表达的变体。在某些情况中，这类变体就其正常细胞功能而言可能并不显著，其中功能差异仅在有差别抑制或活化变体细胞功能的活性剂存在下变得明显。例如，特定酶的天然存在的变体可以具有基本上不同的活性谱，但调节一种变体的治疗剂可能对调节另一种变体无效。 
可以理解，本发明一方面在于鉴定针对所选POI是活性的试剂，POI的细胞功能促进指定疾病状态使得预期所述POI的活化剂或抑制剂 在治疗所述疾病过程中是治疗有效的。对于可以治疗的疾病类型的任何种类或性质及根据本文教导靶向调节的蛋白类型没有限制，只要满足本文陈述的所有其他限制（包括事实：选择用于靶向的任何所述蛋白质必须是内源性蛋白质）。显然，本领域技术人员可以使用非-内源性存在的核酸例如cDNA以实施本文教导的方法，只要氨基酸序列对应于内源性存在的POI。 
还可以理解，本发明的一个方面在于鉴定针对在治疗指定疾病过程前或治疗指定疾病过程中产生或变得占优势(通过任何机制)的蛋白质或theramutein具有活性的活性剂，另一个方面在于鉴定针对在未受侵害个体群体中常见的突变蛋白具有活性的活性剂，但其中所述的突变蛋白对已经批准的药物的调节的敏感性较低，并且其中突变蛋白的活性谱变化在疾病状态中变得重要(且由此首次鉴定为theramutein)，诸如，在所述的疾病状态中，该突变蛋白得到超表达或参与信号传导过程，否则成为异常调节。例如，肿瘤性疾病可以因非theramutein或其prototheramutein的细胞成分的异常调节所致，并且仍然可使用prototheramutein抑制剂治疗，而相同的治疗对存在theramutein的情况有效性较低或无效。这可能是一种结果，其中观察到特定肿瘤类型对抗癌药的反应在个体中改变，所述的个体表达抗癌药定向于的酶的不同变体(Lynch等，2004)。在此处，变体在治疗疾病的过程中可以不产生或变得占优势，但预先存在于健康群体中并且仅根据其对建立的治疗的特定过程中改变的反应性来检测。 
本文所用的术语蛋白质的“激动剂”和“活化剂”可以互换使用。活化剂(激动剂)限于结合和活化指定蛋白质功能的物质。除非另有说明，"活化剂"、"激动剂"和"蛋白质的活化剂"在含义上相同。通过活化剂激活可以是部分或完全的。同样，本文所用的术语蛋白质的“拮抗剂”和“抑制剂”可以互换使用。抑制剂(拮抗剂)限于结合和抑制指定蛋白质的功能的物质。描述物质“抑制”蛋白质指的含义是指该物质在细胞中结合蛋白质并且降低蛋白质的活性，但实质上不减少细胞中蛋白质的量。类似地，描述物质“活化”蛋白质，诸如 prototheramutein或theramutein是指该物质增加细胞中蛋白质的限定的功能，但基本上不改变细胞中蛋白质的水平。除非另有说明，"抑制剂"、"拮抗剂"和"蛋白质的抑制剂"也为同义词。抑制剂的抑制可以为部分或完全的。调节剂为活化剂或抑制剂。作为实例，"PKCβ1的活化剂"应解释为指结合并且活化PKCβ1的物质。类似地，“p210Bcr-Abl的抑制剂”为结合并且抑制p210Bcr-Abl功能的物质。描述物质"抑制蛋白质"要求该物质结合所述蛋白质以便发挥其抑制作用。类似地，描述物质"活化蛋白质X"是指该物质结合并且活化蛋白质X。术语“结合（bind(s)）”、“结合（binding）”和“结合（binds to）”在描述两种物质之间相互作用方面(例如酶-底物、蛋白质-DNA、受体-配体等)具有其在生物化学领域中通常的含义。本文所用的术语“结合（binds to）”在讨论物质与其相应靶蛋白之间相关性的上下文中和“与…相互作用”为同义词。本文所用的描述物质对蛋白质“起作用”、“影响”蛋白质、“发挥其对蛋白质的作用”等以及所有这类相关术语含义一致(正如本领域技术人员充分了解的)，即所述物质活化或抑制所述蛋白质。 
首次定义了将内源性蛋白质的突变形式抑制或活化至大于相应未-突变对应蛋白（counterpart protein）的程度的概念，并且在本文中称作阳性"特异性缺口"。一般来说，并且以使用抑制剂的情况作为实例，特异性缺口指的是在本发明基于细胞的试验系统中抑制theramutein的可比的条件下，指定物质与如下情况之一相比的能力之间的差异： 
a)在可比的条件下相同物质抑制prototheramutein的能力；或 
b)在可比的条件下第二种物质(通常为prototheramutein的已知抑制剂)抑制theramutein的能力；或 
c)在可比的条件下第二种物质抑制prototheramutein的能力。 
当对两种不同物质(分别测试的)单独对theramutein的作用之间进行比较时，将结果称作同源性特异性缺口测定。 
或者，当对两种不同物质(一般，但不总是)的作用之间进行比较 时，分别将其中之一用于对theramutein的测试，而另一种用于对prototheramutein的测试，将结果称作异源性特异性缺口(SG)测定。因此，作为上述给出的(a)和(c)为异源性特异性缺口(SG)测定的实例(尽管在两种情况中均使用相同的物质)，而(b)为特异性特异性缺口测定的实例。 
附图3涉及的内容为在理解和阐明这些概念中的信息。 
在情况涉及活化剂时应用类似的结果。对本领域技术人员即刻显而易见的是，本文所用的术语“可比的条件”包括测试两种不同的化合物，例如在相同浓度下(诸如比较两种紧密相关的化合物以便测定相对功效)，或通过将两种在其相应IC50值下测试的不同化合物对相应prototheramutein和theramutein的作用进行比较。本领域技术人员易于认可其它有用的变化形式和可比的条件。 
因此，在该方法应用的一个实施方案中，对theramutein更为有效的物质具有"阳性特异性缺口"。“零、无效或无"特异性缺口表示在物质对theramutein的作用与其对prototheramutein的作用之间不存在显著的可测定的差异(不过，这类化合物可能在其抑制或活化theramutein及其相应prototheramutein的能力方面相当有用)，并且"阴性特异性缺口"表示在指定浓度下的物质对指定theramutein的有效性低于对theramutein的相应prototheramutein形式或另一种相当形式(诸如可以隐含一种不同的突变)的有效性。对后者化合物类别的关注程度一般低于前者化合物的类别，但除外以下情况：其中化合物如此有效，使得其对theramutein的相对较低作用从治疗功效的前景来看并无实际的担忧。本领域技术人员易于识别以适合于他或她需求的方式量化特异性缺口评价的各种手段。这种分析可以帮助本领域技术人员将各种化合物分成独立的类，其在指导进一步先导优化或对所述化合物的生物表征研究有帮助。 
本发明还提供了用于鉴定表现出所需特异性缺口的化合物的方式。鉴定这类化合物并且使用体外基于细胞的试验系统测定其抑制或活化theramutein的能力，其中将物质对该蛋白质的突变内源性形式的 细胞功能的作用与相同药物对该蛋白质非-突变内源性形式的细胞功能的作用进行比较。 
因此，所述系统能够发现这类化合物，所述化合物能够结合theramutein并且对所述theramutein的细胞功能发挥的调节作用大于对其相应prototheramutein的细胞功能发挥的调节作用。此外，该系统能够发现这类化合物，所述化合物能够结合theramutein并且对theramutein的细胞功能发挥的调节作用至少大于或大于上述已知化合物能够对相应prototheramutein的细胞功能发挥的调节作用。在本发明的一个具体的实施方案中，为以下结果筛选和鉴定化合物：1)对theramutein的有效性至少与原始药物对prototheramutein的有效性相同；和/或2)对prototheramutein的有效性与对theramutein的有效性类似(即展示出小或基本上为零的特异性缺口)。 
在本发明的一个实施方案中，超表达所关注的theramutein的细胞用于鉴定为至少选择的theramutein的抑制剂或活化剂(即结合和抑制或结合和活化)的化学活性剂。这些化学活性剂还可以为prototheramutein乃至相同prototheramutein的其它theramuteins的抑制剂或活化剂。本文所用的术语"化学活性剂"和"化合物"可以互换使用，并且两术语仅指具有至多，但不一定包括2000原子质量单位(道尔顿)的分子量的物质。这类物质有时称作“小分子”。除非另有说明，本文所用的术语物质仅指化学活性剂/化合物，并且不指生物活性剂。本文所用的"生物活性剂"为包括蛋白质、多肽类和核酸的分子并且具有等于或大于2000原子质量单位(道尔顿)的分子。 
在本发明的一个实施方案中，选择theramutein并且用于本发明基于表型反应的细胞测定系统，设计该系统是为了鉴定为theramutein的抑制剂或活化剂的活性剂。如果已知两种或多种不同theramuteins来源于相同的prototheramutein，那么优先选择最具有抗性的可利用theramutein用于试验系统。一般来说，使用首先给予并且已知抑制或活化prototheramutein且针对theramutein"出现"的药物测定theramutein与其未-突变对应体(prototheramutein)相比较对 指定化学活性剂的抗性程度。例如，通过分析IC50或AC50值测定这类抗性程度的方法为众所周知的并且在本领域中是标准的，且在本文中未重复。然而，因果关系并非是必不可少的或应在使用自身指定的治疗剂治疗患者与随后theramutein的出现之间进行推断。而当与theramutein有关时为实施本发明所需的是按照本文的教导适当选择正确的theramutein。 
因此，例如，在实验室中产生，但尚未在临床相关性上得以证实的已知蛋白质的随机产生的定向位点突变体并非用于本发明范围内的合适的突变蛋白。当然，也不会将这类突变蛋白划分为theramuteins。 
例如，在获得p210Bcr-Abl突变体的潜在抑制剂的尝试中，Huron等(2003)使用了重组c-abl制品并且筛选了一系列已知抑制c-src酪氨酸激酶活性的化合物。作者对他们的化合物进行了c-abl激酶试验并且鉴定了在8nM时为对c-ab1最有效的化合物。然而当测试该化合物（PD166326）抗各种p210Bcr-Abl theramuteins时，它表现出对突变体中的某些，诸如p210Bcr-Abl-E255K的活性，但发现p210Bcr-Abl-T315I theramutein保留了10倍以上的抗性(Huron等2003，表3)。此外，在每种情况中，化合物对p210Bcr-Abl theramuteins的作用仍然显著低于它对野生型p210Bcr-Abl的作用。当测试化合物对p210Bcr-Abl-T315I突变体的活性时，它不能将活性抑制到任何可评估的程度(p.1270，左手栏，第二段；另外，参见附图4)。因此披露的化合物能够抑制对STI-571产生部分抗性的theramutein，但对Bcr-Abl的T315I突变体无活性，在当时已知所述的theramutein为对STI-571表现出最大抗性的theramutein。因此，精确和简单而言，Huron的方法无法鉴定p210Bcr-AblT315I theramutein的有效抑制剂。 
实际上，在披露本发明，包括本文首次描述的详述方法以及本文提供的组合物前，世界上尚无人在任何地方成功地鉴定一种化学活性剂，更不必说一种能够鉴定将p210Bcr-AblT315I theramutein有效抑制至等于或高于STI-571能够对野生型p210Bcr-Abl蛋白质所抑制的程度的化学活性剂的方法(参见Shah等，Science，2004年8月；O'Hare等，Blood， 2004；Tipping等，Leukemia，2004；Weisberg等，Leukemia，2004)。 
不能过分强调这类化合物可能非常有用，因为目前尚无用于发展成p210Bcr-Abl-T315I theramutein-介导的甲磺酸伊马替尼（imatinib）-抗性状态的患者的备选方法。一旦患者发生这类抗性，则没有可利用的其它有效备用手段，且死亡是肯定的。本文所述的方法提供了用于鉴定、从药理学方式上表征和化学合成p210Bcr-Abl-T315I theramutein的有效抑制剂的第一个报导的方法。此外，本领域技术人员立即认可了这种手段在任何高度药物抗性theramutein中的可应用性和会推广性。最后，本领域技术人员进一步意识到在适当条件下将本文定义的表型反应与细胞内特定POI存在和功能活性的增加连接起来允许人们对寻找治疗有效化合物的任何指定内源性靶蛋白质使用该方法。 
在本发明中，使用展示出谨慎选择的表型特征(如下所述)的测试细胞，所述的特征与在适当条件下细胞中特定所关注的蛋白(POI)或所关注的theramutein(TOI)的存在和功能活性相关。对theramutein而言，从定性上看，这一结果与表达prototheramutein的细胞展示出的表型特征相同。表型特征(即细胞的非-基因型特征)为观察到(测定的)、选择和/或随后用于如本文所述试验方法限定的特性。表型特征的表达是对细胞中蛋白质的总体活性的反应，并且为蛋白质的绝对量及其比活性的结果。表型特征通常可作为蛋白质活性水平升高的结果观察到并且在表达少量蛋白质或如果所述蛋白质也是theramutein时，那么表型特征通常在表达少量的theramutein或其相应的prototheramutein的细胞中并不明显。此外，通常可以证实通过用蛋白质的抑制剂或活化剂调节theramutein的比活性调节表型特征，不过，这并非是始终如一的情况，因为TOI的抑制剂或活化剂在本领域技术人员从事这类项目时可能并非始终可得。（然而，显然指定prototheramutein的已知抑制剂或活化剂总是因theramutein本身性质的内在定义而存在。）因此，为了确定随后用于为试验目的的指定测试细胞的表型特征的目的，本领域技术人员还可以使用能够增加或减少表达编码指定POI（例如在theramutein情况下的theragene）的基 因的物质，由此使得相应theramutein的水平增加或减少。这使得本领域技术人员可以模拟某些类型的theramutein活化剂或抑制剂(诸如theramutein的自杀性抑制剂，为不可逆结合和共价修饰TOI而赋予其持久无活性的化学活性剂类型)，但实际上为了精确了解随后用于建立有用的细胞试验系统的合适表型特征的目的而可以使用这类化合物。有助于这类目的的本领域技术人员已知的实例包括利用反义DNA寡核苷酸、小干涉RNAs、其它基于RNA干涉的方法和含有诱导型启动子系统的载体构建体。在这种方式中，选择的表型特征与测试细胞中theramutein的活性相关。对theramuteins值得注意的是，选择的表型特征通常也由超表达prototheramutein的细胞展示，且其中表型特征由已知的prototheramutein的抑制剂或活化剂调节。 
表型特征单纯为非细胞基因型特征的细胞特征。除如本文披露的适当确定的表型特征在按照本发明某些实施方案的教导产生有用的细胞试验系统目的中的具体需求外，对用于或适合于适当和有效实施本发明的术语任意类型或性质的表型特征没有其它限制。实际上，本领域技术人员必须能够选择将建立用于他或她需求的适当的基于细胞的试验的应用最大化的细胞的任意特征。表型特征可以为定量或定性的并且可直接观察或测定(例如可用裸眼或用显微镜)，但最常见的是使用本领域技术人员公知的标准自动化实验室设备和试验操作步骤间接测定所述特征。术语"可观察到"指的是可以测定特征，否则就是在适当条件下可通过无论何种方式，包括使用任意类型的实验室可利用的仪器操作测。术语"可测定"与"测定的"的含义不同。特征对于本领域技术人员来说是可以检测的但不在任意指定的时间测定，这取决于本领域技术人员选择如何设计试验系统。例如，在寻找POI例如 prototheramutein(或theramutein)活化剂的过程中，需要仅在添加能够活化POI的已知活化剂或测试物质后检测相关表型特征。这提供了使在试验中由测试细胞产生的信号强度最大化的能力。 
表型特征包括但不限于生长特征、转化状态、分化状态、底物磷酸化状态、催化活性、跨细胞膜的离子流(钙、钠、氯化物、钾、氢离 子等)、pH改变、第二信使分子或其它胞内化学种类，诸如cAMP、磷酸肌醇类、环核苷酸的变动、基因表达的调节等。可连续(例如细胞生长率)，或在一定时间期限后(例如细胞培养物的最终密度)或瞬时(例如蛋白的调节导致蛋白底物磷酸化瞬时改变，或离子流的瞬时流量跨膜，或胞内cAMP水平升高或降低)观察到或测定细胞特征。在某些实施方案中，可以仅在有蛋白调节剂存在下检测选择的表型特征。对可以为测定而选择的特征没有指定的限制。本文所用的术语“细胞的特征”和“表型特征”以及单纯的“特征”在用以指用物质处理测试细胞后完整细胞或细胞的亚细胞部分的具体可测定特性时的含义是相同的。例如，表型特征可以为灶性形成，当将在超表达选择的蛋白质的细胞在有该蛋白质活化剂存在下培养，或胞内代谢物或离子，诸如cAMP、钙、钠、氯化物、钾、锂、磷脂酰肌醇、cGMP、碳酸氢盐等的水平瞬时增加或降低时，这种灶性形成变得可以观察到。本领域技术人员显而易见，在细胞接触测试物质后，可以对细胞的亚细胞部分测定如此测定(检测)的特征。然而，必须对完整细胞而非亚细胞部分用物质进行最初的处理，由此使该物质接触所述细胞。 
为细胞内测定而选择的特征不一定为蛋白质（或theramutein或prototheramutein）本身内在物理或化学特性(诸如仅是细胞内部的蛋白质的量(质量))，而必须是因细胞内部蛋白质（或theramutein或prototheramutein）活性产生而由此影响不同于theramutein本身的细胞特征的特征，正如上文详细讨论的。例如，如果theramutein为能够进行自磷酸化的蛋白激酶，所述的自磷酸化即该酶能够通过从其自身上的ATP中转移末端磷酸部分而催化自磷酸化的过程，那么可能不适合于选择TOI的磷酸化状态作为用于测定的细胞的合适的表型特征。这是因为这类特征不会反映出TOI对其它细胞成分的活性。正如本领域技术人员已知的，自磷酸化不必然反映出细胞中蛋白激酶的活性，因为已知蛋白激酶的突变体保留了足以进行自磷酸化的酶活性，但失去了在细胞内进行信号转导的能力。White等的经典论文(1988)在这方面既具有教导性，又值得关注。 
术语"反应性表型特征"指的是对指定蛋白质(例如，包括prototheramutein或theramutein)的抑制剂或活化剂起反应的细胞特征。将术语"已知的治疗剂"定义为在世界范围内的国家中对人给药用于治疗疾病的任意活性剂。 
作为本文中与p210Bcr-Abl及其theramuteins相关的典型的有用的表型特征为细胞生长和增殖失调。注意相同或相似试验可以适用于许多不同所关注的蛋白质。例如，生长、增殖和/或分化失调为因各种不同细胞蛋白质超表达产生的常见表型特征。本发明的重要教导在于通过超表达选择的蛋白质而导致这类表型特征出现，所述的特征变得在合适的条件下与选择的蛋白质的存在、量和比活性相关，并且这种相关性能够使得本领域技术人员根据需要鉴定所关注的蛋白质(POI)的抑制剂或活化剂。因此，表型特征为对选择的蛋白质的水平和/或比活性改变的反应。这种应答表型特征，当也证实对所述POI的已知调节剂有应答时在本文中称作“表型反应”。在没有已知调节剂的theramuteins的具体情况下，必须使用prototheramutein调节剂来建立与theramutein一起使用的表型反应。所述概念且识别细胞的这种高度有用的性质代表本发明相比于现有技术的实质性优点之一，现有技术包括申请人本人在基于细胞测定的一般领域中的先前的工作(U.S.Pat.Nos.4,980,281；5,266,464;5,688,655;5,877,007)。就其鉴定POI抑制剂或活化剂能力而言，表型反应的鉴定和选择为有经验的研究者提供了非常灵敏的细胞测定系统，因此与现有技术中公开的任何其他相关测定方法相比可以以高得多的确定度鉴定这些化学试剂。 
尽管并非始终必要，但是通常有利的是使用表达高水平POI的细胞并且选择因POI超表达产生的表型特征。这是因为与POI功能相关的表型特征一般比POI被超表达至更大程度时更加可区分(更易于测定)。此外，在POI的功能水平增加时，对POI调节剂的反应观察到的表型反应通常得到扩大。如果以另一种方式表达，那么在超表达蛋白质(或theramutein)的细胞观察到的选择的表型反应对蛋白质(或theramutein)的调节剂特别敏感。 
优选蛋白质在测试细胞中得到稳定表达。稳定表达导致细胞中的蛋白质水平在试验过程中保持相对不会改变。例如，刺激或活化信号传导途径中的成分后为不应期，在此过程中，信号传导因所述成分的减量调节而受到抑制。就本发明的蛋白质而言，这类减量调节通常通过人工超表达蛋白质而足以克服。如果以另一种方式表达，那么充分维持表达，即在试验过程中观察到的这些表型特征改变主要是因蛋白质抑制或活化，而非其水平改变所致，即使蛋白质的减量调节随之发生也是如此。由于这些原因，所以尽管优选蛋白质的稳定表达，但是在转染后可以使用蛋白质的瞬时表达，条件是选择的表型特征可测定并且试验系统的期限比其在这类系统中随时间预计的瞬时表达的蛋白质的水平进行性下降短。由于这些原因，优选稳定表达的细胞系(美国专利US4,980,281)。 
术语"细胞特异性"指在指定浓度下化合物调节测试细胞选择的表型反应的能力，而不影响对照细胞到同一程度（如果完全不影响）。术语"细胞特异性缺口"("CSG")指测量测试细胞中所选化合物调节对应于指定靶蛋白质的表型反应的能力(不限于theramutein)相对于对照细胞中所述化合物调节同样表型反应的能力。为了将CGS技术应用于非-theramutein内源性靶蛋白质，所选的表型反应必须在之前已经用靶蛋白质的已知抑制剂或活化剂进行定义。 
CGS的测定给本领域技术人员提供了在化合物组(两个或多个)中比较不同化合物的相对潜在治疗值的方法，通过与对照细胞比较其相对交叉-反应性，与对组内任何指定化合物的靶蛋白质的效力无关。相对对照细胞在其对测试细胞的活性中展现最大"特异性"的化合物通常是最想要的化合物，因为与在前述组中具有"窄"CSG的其他化合物相比，"宽"CSG帮助选择可能合理地被认为在患者中具有最小潜在副作用的化合物。当比较基于细胞的试验整体产生的计量响应曲线时，CSG测量的效果最明显，然而下述的假设性例子也是有启发的。 
考虑假定化合物的下表和采用无细胞测试系统的相应IC50值。这个实施例使用蛋白激酶作为靶蛋白质。当处理尝试对所选的化合物或 化合物组进行先导优化以鉴定用于接下来临床前（动物）和临床研究的潜在优化先导候选化合物的问题时，这是本领域技术人员每天面临的那类情况。 
Figure BDA0000440201980001331
目前本领域的标准方法是鉴定这种化合物，其在无细胞测试系统中在抑制靶蛋白质激酶的酶活性方面展现高度效力而对不同但密切相关的蛋白激酶不显示显著的抑制活性。显示于上表1的无细胞测试系统的结果表明，化合物A是该系列化合物(A、B、C、D)中最有效力的且还显示其在针对靶蛋白质相对于其对非靶蛋白质作用的IC50之间差距最大。例如，如果对鉴定Ab1激酶抑制剂感兴趣，可以在所述测试中采用其他蛋白激酶例如EGF受体、c-kit、或c-Src作为"阴性"对照激酶。和c-Abl一样，所有后面这些酶都是酪氨酸蛋白激酶。确实，目前在本领域中通常使用称为"panel"的蛋白激酶（包括丝氨酸/苏氨酸激酶、酪氨酸激酶和双特异性激酶）来鉴定抑制尽可能少蛋白激酶的化合物（除靶蛋白质本身外）。该方法的理由是在无细胞系统中越少的激酶被指定化合物抑制，该化合物对患者产生不利副作用的可能性越小。然而，几乎没有临床证据确实支持这个观点。 
此外，在一些情况下其他人认为靶向超过一个激酶的化合物与那些只对单个靶蛋白质高度特异性的化合物相比可能具有其他治疗作用。在伊马替尼的情况下，有一些证据证实这是对的，如本文先前讨论的伊马替尼与c-kit的交叉反应在具有某些组织类型的小肠癌的患者中产生有益效果。虽然与c-kit的这种交叉反应，然而伊马替尼在本发明的测试系统中展示高度细胞特异性，这与在治疗的头三年内其高 度临床功效和相对适中的副作用特点一致。然而，随着指定化合物在本发明细胞系统中特异性的降低，与其他靶例如（在这个实施例中）其他蛋白激酶家族成员的交叉反应在患者中导致不利的副作用。下面进一步详细讨论。 
技术人员从上表1显示的无细胞测试结果得到的结论是化合物A是最有效力的化合物，显示50%的抑制浓度(IC50)值是0.2纳摩(0.2nM)。然而，如表2和图14显示的，相对于对照细胞这个化合物对测试细胞不显示特异性，因为其对对照细胞的IC50也是1纳摩。类似地，化合物B和D仍然十分有效力，两者针对测试细胞均具有10nM的IC50，而化合物D比B的特异性更高因为其对照细胞的IC50更高(200nM)。化合物B和D的CSG测量马上反映在这两个化合物中化合物D是优选化合物，所有其他考虑因素是相等的。然而，最重要的是在该实施例中就其40的CSG而言(表2,图15)显示化合物C是该组化合物中最好的化合物。这指相对于对照细胞化合物C对测试细胞显示最大的特异性，且预期在患者中诱导不希望副作用的可能性最低，因为这个发现来源于活细胞系统中化合物的直接测试，大多数药物的药学作用的极限点。本实施例的重点是CSG测量允许本领域技术人员在无细胞系统中独立于其效力对一些化合物的潜在治疗价值进行排序。因此，尽管化合物C是效力最低的化合物，其在抑制测试细胞能力中特异性最高，而在宽的浓度范围内让对照细胞相对地未受影响。这反映在其40的CSG中，并证实化合物C（而不是化合物A）是在进一步预临床和临床研发努力中给予最高优 先权的化合物。 
以这种方式使用本发明的方法提供排序和优选考虑药物发现和发展方法的能力，其是以前不可能的方式。尽管上述方法的重复应用，本领域技术人员与医药化学家合作可以合成在本文描述的测试系统中评分为正的化合物类似物，在本发明的测试方法中测试所述化合物，根据其CSG值对所述化合物进行排序，选择用于进一步研发的最佳化合物，并根据需要重复该方法尽可能多次以便完全产生并优化相对于对照细胞对指定测试细胞展现高度特异性的化合物。一旦使用本文系统对指定化合物进行了优化，所述系统通常指对照细胞和测试细胞之间的CSG(如果使用上述的细胞IC50比值的方法)至少是3到5倍，然后本领域的技术人员可以通过对以这种方式选择的化合物的其他化学修饰继续完成先导优化方法并测试性质例如血浆半衰期、生物利用度和使用合适动物模型的相关参数。当然，事实上认为所述化合物对细胞环境中的靶蛋白质具有需要效果的可能性为根据本文描述的方法优化所述化合物的方法的结果，而不是用较老的无细胞方法的结果。 
对本领域技术人员来说非常明显的是，还可以将类似的方法用于指定靶蛋白质的活化剂。对本领域技术人员来说还明显的是，存在确定CSG的其他方法。例如，使用上述给出的抑制剂的实施例，另一个确定CSG的有用方法是测定化合物导致对照细胞系50%生长抑制的最高浓度除以化合物抑制至少90%测试细胞系的最低浓度的比值。也可以利用本方法其他明显的改变，包括计算化合物显示指定百分比活性的浓度的对数，校正相对彼此的对照或测试细胞应答等。为了确定CSG，不打算对计算或观察的对照细胞应答与测试细胞应答之间的比较进行限制。 
如果人们使用如上所述的对照细胞/测试细胞的IC50比值的方法，那么通常认为CSG值低于或等于1的化合物是好的临床候选化合物，而CSG值大于约10的化合物是十分有希望并值得进一步考虑。 
本实施例还强调在无细胞系统与本发明医学上和生理学上更相关的基于细胞的系统中指定化合物的作用之间的差别。 
在本发明的一个实施方案中，化合物识别用于鉴定和/或使与给患者施用化合物相关的副作用最小化。与无细胞方法相比，基于细胞的先导优化方法允许潜在副作用的早期鉴定。例如，根据本文描述的本发明的方法，伊马替尼显示宽细胞特异性缺口。这与伊马替尼在抗癌药领域中的显著优势相一致。然而，它不是没有副作用。最近的证据证实在小部分患者中伊马替尼与心脏毒性有关(Kerkela等人,2006)。该组随着患者服用伊马替尼更长的时间而增加。 
通过使用本发明的方法，附图16显示以不同浓度在野生型Ba/F3细胞系上进行测试的伊马替尼在明显低于对照细胞系的表观细胞毒性的IC50的浓度(约10μM)时显示轻微但是显著的生长抑制作用，伊马替尼在高得多的浓度下展示该细胞毒性。当比较其他化合物对对照细胞系的作用与伊马替尼对对照细胞系的作用时，所述结果变得更加明显。 
在该方法的另一个实施中，认为在无细胞系统中显示有前景的活性但具有小的CSG值的化合物(如上所述)在患者中具有较高的潜在副作用，特别对较长的治疗时期。其他人报导了对某些靶例如p210Bcr-AblT3151突变具有低CSG值的化合物(Carter等人,2005)，且还有其他组甚至使这些化合物进入临床测试。然而，基于本发明的教导，可以预期所述化合物在患者中不利副作用的可能性增加。 
本发明优选的药物筛选方法包括下列步骤： 
1)鉴定关注蛋白(POI)，例如需要新的抑制剂或活化剂的theramutein。通常，在确立或维持疾病状态中涉及或怀疑涉及POI，可能由于不适当的表达或突变诱导的比活性变化。例如，可以使用标准技术对合适的theramutein进行鉴定(参见，Gorre等，Science，2001；另外，参见PCT/US02/18729)。简单的说，鉴定使用已知或可疑的prototheramutein的活化剂或抑制剂给予治疗有效的治疗过程且随后已经表现出与疾病复发一致的临床征兆和症状的患者，并且获得来源于这类患者的细胞或组织。使用标准实验室技术，诸如RT-PCR测定prototheramutein的序列并且与已知prototheramutein基因或cDNA序列的预先测定的核酸序列进行比较。如果存在，那么鉴定突变并且 再次使用标准方法与基于细胞或更常用的基于细胞的试验系统中prototheramutein的功能的功能抗性建立相关。一旦证实了诱导抗性的突变，那么所述的一种或多种经证实的突变体包括可以用于如本文所述的随后方法限定的theramutein。 
2)提供表达所述POI并且展示出可观察到(可测定的)与所述POI的表达相关的表型特征的测试细胞。对theramutein而言，表型特征通常是已经预先证实所述的表型特征对theramutein，或更常见的是相应的prototheramutein的抑制剂或活化剂有反应。与所述POI的表达相关，并将已经预先证实对所关注的POI(或所关注的prototheramutein(pTOI))的抑制剂或活化剂有反应的这种特异性表型特征在本文中定义为“表型反应（phenoresponse）”。本发明的一个实施方案在于所述表型反应在鉴定能够成为TOI抑制剂或活化剂的化合物的目的中的确定应用。这一过程可以通过使用应用过度产生指定的TOI并且已经鉴定和表征了适当的表型反应的细胞系的高流通量筛选来进行。或者，可以使用应用更一般性的细胞系表型特征(按照本文的教导并不定为表型反应)的高流通量初级筛选且然后按照本文的教导使用二次筛选，以便从并非所关注的theramutein的抑制剂或活化剂的假阳性化合物中区分确实为阳性的“命中”的化合物，即所关注的theramutein的抑制剂或活化剂。在一个实施方案中，选择天然表达theramutein的细胞，以便反应性表型特征在对本领域技术人员而言显而易见的适当培养条件下存在。在其它实施方案中，theramutein在某些情况中在宿主细胞中得到超表达，否则，该宿主细胞完全不表达theramutein。这一过程通常包括构建表达载体，可以将该表达载体导入合适的宿主细胞并且使用标准载体系统和方法超表达(Gorre等，2001；小时ousey等，1988)。在一个实施方案中，超表达产生的theramutein水平至少约3倍于该蛋白质通常存在于细胞中的量。或者，该量至少约为通常存在于细胞中的量的10倍。在另一个实施方案中，该量至少约为通常存在于细胞中的量的20倍或更优选至少约为50倍。 
3)只要对照细胞较低程度或完全不表达POI（例如，未修饰的 宿主细胞或隐含不表达POI的表达载体的宿主细胞)。对关注的theramutein而言,对照细胞也可以是表达相应于所关注的theramutein的prototheramutein的细胞。 
4)当本文所述的某些突变蛋白也为酶时，它们通常保留了催化活性并且由此对照细胞通常展示出基本上与测试细胞相同的表型特征。不过，这种表型特征不需要如两种细胞那样进行定量。例如，使prototheramutein再活化的突变蛋白就其在细胞中的底物中的一种或多种而言也可以增加、减少乃至影响其比活性。作为结果，它可以将选择的表型特征展示出较大或较小的程度。因此，在某些情况中，需要调整prototheramutein和theramutein之一或它们两者的表达，以便测试和对照细胞将表型特征展示至近似相同的程度。例如，均可以使用标准方法，通过由启动子表达蛋白质达到这一目的，其中可以通过调整存在的诱导物的量来调整启动子的活性（例如，参见Sambrook etal.1989和2001）。 
本领域技术人员显而易见，适当定义的表型反应在表达prototheramutein与theramutein的细胞系中可以存在定量差异作为与其相应的prototheramutein之间比活性差异(如果有的话)的结果。诱导Theramutein的突变可以增加或减少所述theramutein相对于相应的prototheramutein而言的比活性。当将表达theramutein的细胞系与表达prototheramutein的细胞系进行比较时，优选选择的表型反应在两种细胞类型中定性地相同。因此，本领域技术人员可以选择将表达theramutein的细胞系的活性与表达prototheramutein的细胞系的活性校准或反之亦然。这类归一化法在本领域中是标准的。例如，参见Bolstad等(2003)。 
或者，本领域技术人员还可以希望使用未修饰的宿主细胞或仅隐含了表达载体作为用于某些实验操作步骤的对照细胞的宿主细胞(宿主细胞为导入了编码theramutein的表达载体而产生测试细胞的细胞)。这可能就是研究人员仅对所关注的theramutein的特异性抑制剂或活化剂感兴趣，而与所述化合物是否还对所关注的 prototheramutein(pTOI)有效无关的情况[取代工作活性]。 
4)然后在合适的条件下将测试和对照细胞维持或使其增殖(不过不一定在同时)在生长培养基(乃至在完整动物体内)中，以便可以表达和检测表型反应。可以用prototheramutein的已知调节剂或用测试物质处理表达prototheramutein的对照细胞，并且用测试化合物处理测试细胞以便确定它们是否如所述物质以预计方式调节表型反应的能力所测定的对theramutein具有活性。或者，还可以根据本领域技术人员选择用于研究的特定表型反应的不同取代不表达prototheramutein的对照细胞。然后检测物质对测试细胞的作用，并且任选地同时或在另一时间测试对对照细胞的作用，并且比较结果。 
在本发明的一个实施方案中，根据以例如与prototheramutein的已知调节剂改变表达prototheramutein的对照细胞的表型反应相同的方式调节测试细胞的表型反应的能力快速鉴定对测试细胞具有活性的物质。在另一个实施方案中，可以通过调节测试细胞中theramutein的活性而对未修饰(不表达prototheramutein和/或theramutein)的对照细胞几乎或没有作用的能力来鉴定活性物质。例如，本领域技术人员易于理解该手段的许多变化形式可以用于鉴定为对theramutein更为有效或对prototheramutein和一种或多种相应的具体theramuteins等效的调节剂。 
可以观察到和/或测定其它表型反应，并且包括：例如，检测prototheramutein的底物和检测通过theramutein活性调节的基因表达的改变。在最简单的术语中，本领域技术人员预先建立的与theramutein的功能活性相关性的细胞的任意特征适用于这类方法。然而，在选择指定特征的过程中，本领域技术人员必须首先按照作为本文详述中给出的教导验证所述的特征满足作为表型反应的标准。本领域技术人员还可以希望将使用表达theramutein的细胞的表型反应与表达prototheramutein的细胞的表型反应校准。 
可以通过本领域技术人员众所周知的各种方法测定适合于检测的特征。这类方法包括但不限于：检测适当标记的蛋白质的荧光 (FACS)；用于检测蛋白质表达的免疫组织化学(IHC)；竞争放射性配体结合测定；固相基质印迹技术，诸如细胞提取物的RNA印迹、DNA印迹和蛋白质印迹；逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)；酶联免疫吸附测定(ELISA)；磷酸化测定；凝胶阻留测定；膜电位干扰等。可以在使用测试物质处理后检测完整细胞上的相关表型特征，或者在使用测试物质处理完整细胞后检测在细胞的亚细胞部分上的相关表型特征。 
一旦鉴定了对表达theramutein的测试细胞具有所需作用的化合物，就需要(但不一定)独立地验证所鉴定的化合物通过直接结合机制对theramutein发挥其作用，即按照本发明的教导，这些化合物满足作为theramutein的抑制剂或活化剂(作为理想的)的标准(读者如上所述涉及的术语"活化剂"和"抑制剂"的定义)。可以使用本领域技术人员公知的大量标准结合测定法达到这一目的，包括纯化的蛋白质样品或使用用合适的prototheramutein或theramutein转染的细胞与如通过声科学法所述的合适的对照品进行的完整细胞结合测定法。由于这类方法为本领域中充分确立的，所以不在此处重复它们。大量参考文献文本综合讨论了这类技术(例如，参见Foreman和Johansen，2002；Enna S.J.等(1991)Current Protocols in Pharmacology，Wiley&Sons，Incorporated；Bonifacino，J.S.等(1999)Current Protocols in Cell Biology，Wiley&Sons，Incorporated).还参见Housey，G.M.1988，Chapter4及其中的参考文献；另外，参见Horowitz等，1981。 
在本发明的一个具体的实施方案中，该方法用于鉴定为p210Bcr-Abl-T315I theramutein的抑制剂的物质。使用标准方法在Ba/F3(鼠)细胞中各自表达prototheramutein和theramutein，并且观察到的表型反应为生长特征(谨慎确定的细胞培养物的末端细胞密度和在没有白细胞介素-3(IL-3)存在下的生长)。还可以任选使用未修饰的宿主细胞或仅含有表达载体的宿主细胞或它们两者。在另一个实施方案中，将测试细胞单独与或不与涉及的已知抑制剂或活化剂一起使用。 
另一种有用的测定法为测定p210Bcr-Abl-T315I的直接底物的磷酸化状 态。一种这类底物为Crkl(Gorre等，Science293：876-80(2001))，即一种介导Bcr-Abl与Ras之间的连接的衔接蛋白。CRKL的磷酸化状态为细胞中p210Bcr-Abl的信号传导活性的代表。另一种下游底物为p62DOK。对这些目的而言，任意这类底物均可满足，当然，条件是已经证实所述底物的磷酸化在细胞内部发生，并且不非简单地如上所述为TOI或PTOI的自磷酸化活动。还可以监测其它信号转导级联成分，包括src族激酶、STAT5、PI3激酶、raf激酶、RAS、MEK、ERK1和ERK2、JNK1、2和3、MLK1、2和3、MKK4、MKK7、AKT、mTOR、HSP90等。 
作为本文中的典型，已经鉴定了T315I theramutein的抑制剂。此外，这些抑制剂还对野生型prototheramutein p210Bcr-Abl-wt具有不同程度的活性。 
按照本发明，对需要的哺乳动物给予治疗有效量的调节p210Bcr-Abltheramutein的功能活性的一种或多种化合物。本文所用的术语“给予”指的是通过可以实现寻找的结果的任意方法将本发明的化合物递送给哺乳动物。例如，可以通过口服、非肠道(静脉内或肌内)、局部、透皮或通过吸入给予它们。本文所用的术语“哺乳动物”用以包括，但不限于人、实验室动物、驯养宠物和农场动物。“治疗有效量”指的是在对哺乳动物给药时有效产生所需治疗作用，诸如抑制激酶活性、抑制癌细胞生长和分裂等的化合物用量。 
本发明提供了治疗哺乳动物疾病的方法，通过对该哺乳动物给予有效量的theramutein的调节剂来进行。按照本发明治疗的合适的疾病包括但不限于已经对预先给予的药物产生抗性的复发性肿瘤或其它增殖性病症。该方法还用于克服个体中存在对因治疗靶标中的等位基因差异产生的药物治疗的敏感性方面的变化形式。例如，已经广泛证实了在CML中p210Bcr-Abl酪氨酸激酶信号传导的作用，因为p210Bcr-Abl的theramuteins在CML的药物抗性复发中具有作用。此外，不同的p210Bcr-Abl的突变蛋白表现出对p210Bcr-Abl的抑制剂的可变敏感性。尽管某些theramuteins在药物疗法过程中出现，但是其它可能预先存在于群体中。对后面这些实例并不公认为theramuteins，直到疾病状态随 之发生并且随后用已知类型的治疗剂治疗时为止。仅在所述治疗后，这类预先存在的theramuteins显示出其自身在导致隐含theramutein的患者中的疾病发展的相对非-反应性方面的临床显著性。 
在本发明的一个实施方案中，给予theramutein调节剂与一种或多种抗肿瘤剂。可以使用任意合适的抗肿瘤剂，诸如化疗剂、放射或其组合。抗肿瘤药可以为烷化剂或抗代谢物。烷化剂的实例包括但不限于顺铂、环磷酰胺、美法仑和达卡巴嗪。抗代谢物的实例包括但不限于多柔比星、柔红霉素和紫杉醇、吉西他滨和拓扑异构酶抑制剂伊立替康(CPT-11)、氨基喜树碱、喜树碱、DX-8951f、托泊替康(拓扑异构酶I抑制剂)和依托泊苷(VP-16；拓扑异构酶II抑制剂)和替尼泊苷(VM-26；拓扑异构酶II抑制剂)。当抗肿瘤药为放射时，放射源可以在所治疗患者的体外(外线束放疗-EBRT)或体内(近距离放射疗法-BT)。所给予的抗肿瘤剂的剂量取决于许多因素，包括：例如，活性剂的类型、所治疗的肿瘤的类型和严重程度以及活性剂的给药途径。然而，应强调本发明并不限于任何特定的剂量、给药途径或合并给予蛋白调节剂的化疗剂或其它治疗方案的组合。 
可以将目前本领域中公知或评价的抗肿瘤剂分成不同类型，包括：例如，有丝分裂抑制剂；烷化剂；抗代谢物；嵌入抗生素；生长因子抑制剂；细胞周期抑制剂；酶；拓扑异构酶抑制剂；抗存活剂；生物学反应修饰剂；抗激素和抗血管发生剂，可以将所有这类活性剂与theramuteins的抑制剂或活化剂一起给药。 
可以将theramutein的调节剂与中和涉及肿瘤生长的其它受体的抗体一起给药。此外，可以将theramutein的调节剂与另外调节信号转导途径的成分，优选与在一种或多种其它信号转导途径中具有活性并且对这些途径而言为常见的信号转导途径中的成分一起给药。在本发明的一个实施方案中，将theramutein调节剂与特异性结合表皮生长因子受体(EGFR)的受体拮抗剂联用。特别优选抗原结合蛋白，这些蛋白结合EGFR的胞外域并且阻断结合其配体中的一种或多种和/或中和配体-诱导的EGFR活化。EGFR拮抗剂可以为结合EGFR或EGFR配体并且 抑制和EGFR与其配体结合的抗体。EGFR的配体的实例包括：例如，EGF、TGF-α、双调蛋白、肝素-结合EGF(HB-EGF)和β动物纤维素。认为EGF和TGF-α为导致EGFR-介导的刺激的主要内源性配体，不过，已经证实TGF-α在促进血管发生中更为有效。应理解EGFR拮抗剂可以在外部结合EGFR的胞外部分，可以抑制，也可以不抑制配体的结合，或在化学活性剂的情况下，在内部结合酪氨酸激酶结构域。结合EGFR的EGFR拮抗剂的实例包括但不限于生物制剂，诸如对EGFR具有特异性的抗体(及其功能等效物)；和化学活性剂(小分子)，诸如对EGFR的胞质域直接起作用的合成激酶抑制剂。 
肿瘤发生中涉及的生长因子受体的其它实例为血管内皮生长因子(VEGFR-1和VEGFR-2)、血小板衍生的生长因子(PDGFR)、神经生长因子(NGFR)、成纤维细胞生长因子(FGFR)等的受体。 
在联合疗法中，在使用另一种活性剂开始治疗之前、过程中或之后给予theramutein抑制剂及其任意的组合，即在使用抗肿瘤药疗法开始之前和过程中，在之前和之后，在过程中和之后或在之前、过程中和之后。例如，可以在开始放疗前1-30天，优选3-20天，更优选5-12天给予theramutein抑制剂。在本发明的一个优选的实施方案中，在使用抗体疗法前、与之同时或更优选在其后给予化疗。 
在本发明中，可以将任意合适的方法或途径用于给予本发明的theramutein抑制剂，并且任选共同给予抗肿瘤剂和/或其它受体拮抗剂。按照本发明使用的抗肿瘤药方案包括认为最适合于治疗患者肿瘤病情的任意方案。不同的恶性肿瘤可能需要使用特异性抗肿瘤抗体和特异性抗肿瘤剂，这需要基于患者与患者的不同来决定。给药途径包括：例如，口服、静脉内、腹膜内、皮下或肌内给药。给予的拮抗剂剂量取决于许多因素，包括：例如，拮抗剂的类型、所治疗的肿瘤的类型和严重程度以及拮抗剂的给药途径。然而，应强调本发明并不限于任何特定的方法和给药途径。 
合适的载体包括：例如，水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多种及其组合。载体可以进一步包括少量辅助 物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，它们可以增加作为活性组分的theramutein调节剂的贮存期限或有效性。作为本领域众所周知的，可以将组合物配制成对哺乳动物给药后使活性组分快速、持续或延缓释放的剂型。 
本发明的组合物可以为各种形式。它们包括：例如，固体、半固体和液体剂型，诸如片剂、丸剂、粉剂、液体溶液、分散液或混悬液、脂质体、栓剂、可注射和可输注溶液。优选的剂型取决于指定的给药方式和治疗应用。 
可以按照制药领域中众所周知的方式制备本发明的这类组合物。在制备组合物的过程中，通常将活性组分与载体混合或用载体稀释组合物和/或将组合物包封在载体内，所述的载体用作稀释剂，它可以为固体、半固体或液体物质，它起活性组分的媒介物、赋形剂或介质的作用。因此，组合物可以为片剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、混悬液、气溶胶(作为固体或在液体介质中)、含有例如达10%重量的活性化合物的软膏剂、软和硬明胶胶囊、栓剂、注射溶液、混悬液、无菌包装的粉末和作为局部贴剂。 
应理解可以将本发明的方法和组合物对任意合适的哺乳动物给药，诸如家兔、大鼠或小鼠。更优选所述的哺乳动物为人。 
本发明的化合物还可以作为盐存在。在本发明的上下文中，优选给予药物上可接受的盐。药物上可接受的盐指的是本发明化合物的酸加成的盐或碱加成的盐，其中将所得抗衡离子理解为在本领域中一般对药物应用而言是可接受的。药物上可接受的盐可以为本发明化合物与无机酸或有机酸形成的盐。优选得到与无机酸形成的盐，所述的无机酸诸如：例如，盐酸、氢溴酸、磷酸或硫酸，或优选得到与有机羧酸或磺酸形成的盐，所述的有机羧酸或磺酸诸如：例如，乙酸、马来酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、苯甲酸或甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸或萘二磺酸。药物上可接受的盐还可以为本发明化合物的金属或铵盐。特别优选得到：例如，钠、钾、镁或钙的盐，并且还特别优选得到来源于氨或有机胺类的铵盐，所述的有机胺 类诸如：例如，乙胺、二-或三乙胺、二-或三乙醇胺、二环己胺、二甲氨基乙醇、精氨酸、赖氨酸、乙二胺或2-苯乙胺(参见Berge等J.Pharm.Sci.1977，66，1-19)。 
在本申请的上下文中，参照了各种公开文献、参考文献正文、教科书、技术手册、专利和专利公开文献。将这些公开文献、专利、专利申请和其它对比文件教导的和披露的内容完整地引入本申请作为参考，以便更完整地描述本发明涉及的本领域的状态。 
应理解和预计本领域技术人员可以实施本文披露的本发明的原理的变化形式并且认为这类变型包括在本发明的范围内。 
下列实施例进一步解释本发明，但不应视为以任何方式限定本发明的范围。常用方法，诸如那些用于载体和质粒构建、将编码多肽类的基因插入这类载体和质粒、将质粒导入宿主细胞以及基因和基因产物的表达及其测定的方法的详细描述可以获自大量公开文献，包括：Sambrook，J等，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring小时arbor Laboratory Press；Coligan，J.等(1994)Current Protocols in Immunology，Wiley&Sons，Incorporated；Enna，S.J.等(1991)Current Protocols in Pharmacology，Wiley&Sons，Bonifacino，J.S.等(1999)Current Protocols in Cell Biology，Wiley&Sons；和U.S.Patent4,980,281。将所有本文提及的参考文献完整地引入。 
实施例
可以理解和预期本领域的技术人员在此处公开的本发明原则下进行变化，且意图将这些改变包括在本发明的范围之内。 
列举本发明下述实施例以进一步描述本发明而不应理解为以任何方式限制本发明。 
实施例1：鉴定蛋白调节剂 
p210Bcr-Abl-T315I为对甲磺酸伊马替尼的抑制作用产生抗性的p210Bcr-Abl蛋白质(p210Bcr-Abl)的theramutein(Gleevec，STI-571)。315位上的突变将苏氨酸转化成异亮氨酸残基，并且为在抗性或复发性患者中观察到的几种突变之一。然而，这种特定的突变体为鉴定的最具抗性的这类theramutein。 
为用于超表达p210Bcr-Abl-T315I theramutein改造的Ba/F3细胞系测定表型反应。测定相对于未转化的Ba/F3细胞和表达p210Bcr-Abl-wt prototheramutein的Ba/F3细胞而言的表型反应。表型反应为T315I突变体在类似的培养条件下生长至高于对照组的未转化Ba/F3细胞系的细胞饱和密度并且在维持对照组未转化的Ba/F3细胞系所需的白细胞介素3(IL-3)不存在下生长的能力。按照上述给出的教导定义和表征表型反应。 
使用的检测系统为高速细胞成像和计数系统，其中将3μl的细胞样品体积顺序通过5μl光学微量比色池注射、数字成像并且以电方式贮存、扫描且然后计数，所有操作均在基于微型计算机的控制系统中进行。该系统具有对来自小至500μl的培养物的样品进行直接细胞计数的能力，并且提供来自含有少至12,500个细胞的培养样品的具有统计学意义的总细胞计数。所有展示出细胞计数和存活率试验的图均使用数据获取和分析用的该系统。在进行细胞计数的同时，该系统还能够通过区分计数、成像的细胞测定总体细胞存活率，所述的计数、成像的细胞从吸收锥虫蓝染料(计为"未存活"细胞)的细胞中排除锥虫蓝(计为"存活"细胞)。将锥虫蓝注入细胞样品，此后即刻依次将样品注入微量比色池以便同时进行细胞计数和成像。 
将系统整合入高流通量筛选装置的工作流程以便提供灵敏和精确的细胞计数和细胞存活率试验系统，它更可靠并且较不易于发生基于代谢存活率的细胞试验，诸如XTT或Alamar蓝的混杂效应。 
最初，以一般在10-20μM范围的浓度筛选约113,000种化合物，以便鉴定能够通过任意方式影响超表达p210Bcr-Abl-T315I theramutein的Ba/F3细胞(Ba/F3T315I细胞)生长的亚群。 
总计约11,760种化合物表现出大于50%的生长抑制作用，认为这相当于约4500种不同的化学类型。使用相同细胞系重新测试这些化合物产生了化合物反应性数据库，然后将其分类并且根据表现出最高总体生长抑制作用的那些化合物进行等级排序。然后在使用Ba/F3T315I作为测试细胞和野生型Ba/F3作为对照细胞的确定的基于细胞的试验系统中按照本发明的方法从该等级排序的数据库中重新筛选最高评分的130种化合物(基于在测试化合物的最低浓度下观察到的最大程度的生长抑制作用)。所关注的化合物为那些与未转化的野生型Ba/F3细胞相比区别抑制表达p210Bcr-Abl-T315I theramutein的Ba/F3细胞生长的化合物。鉴定满足所需标准的6种化合物并且还使用Ba/F3p210Bcr-Abl-wt细胞系(Ba/F3P210细胞)进一步详细分析这些化合物中的某些。因缺乏可利用的来自化学供应商的额外物质而导致一种化合物不能用于进一步测试。在使用上述细胞系的额外基于细胞的试验和使用分离自野生型P210Bcr-Abl和P210T315I突变体激酶结构域的人重组产生的120Kd激酶结构域片段的不含细胞的纯化蛋白激酶试验中独立地评价剩余的5种化合物。 
所有5种化合物均如自磷酸化活性抑制所测定的抑制p210Bcr-Abl-T315I120Kd活性。因此，在筛选的113,000种以上的化合物中的6种最高评分的化合物中，这6种中的至少5种直接抑制p210Bcr-Abl-T315I突变体。一种化合物看起来在SDS聚丙烯酰胺凝胶上使重组蛋白质带铺展开。这种情况在银染色的凝胶上也是明显的(数据未显示)。可能的情况是这种化合物实际上可以为能够共价交联POI以便持久抑制其活性的"自杀"抑制剂，但这一结果需要进一步研究。 
本文所述的教导和结果共同提供了结论性证据，即该系统能够鉴定选择的theramutein的抑制剂或活化剂，并且本领域技术人员立即意识到这类系统在仅进行显而易见的最小变型的情况下就易应用于任意其它theramutein或其它蛋白。 
证实Ba/F3T315I细胞系与野生型未转化Ba/F3细胞相比的生长抑制作用的基于细胞的试验结果的有代表性的实例如附图1和2中所 示。这些化合物在野生型Ba/F3未转化细胞(不表达p210Bcr-Abl-wt或p210Bcr-Abl-T315I)的生长和存活率相对不受影响的浓度下抑制表达T315Itheramutein的细胞生长并且降低其存活率，而表达prototheramutein和theramutein的细胞基本上得到抑制。在某些情况中，对表达T315I的细胞的抑制程度甚至大于对表达P210prototheramutein的细胞的抑制程度(例如，参见附图3，右手侧，化合物3对P210和T315I细胞的结果。 
概括地说，本文提供的方法提供了用于产生或鉴定任意指定theramutein的调节剂的可推广方法形式的基本发展。结果结论性地证实了该方法在鉴定关键需求的化合物方面的能力，这些化合物用于克服在某些患者群体中一致性地成为致命性的并且目前不可治疗的具体类型的获得性药物抗性。此外，对本领域技术人员显而易见的是，可以使用显而易见的变型将本文所述的技术和方法直接广泛应用于任何具有临床意义的可能的theramutein或其他疾病相关蛋白质。 
值得注意的是，在100,000种以上化合物的初步筛选中，其中约10,000种化合物表现出一定程度的生长抑制作用，当使用本文详述的方法重新筛选最有效的生长抑制物质时，鉴定了6种不同的化合物并且随后测试的所有化合物在使用T315I突变体的不含细胞的纯化蛋白激酶试验中均表现出了抑制活性(一种化合物不能用于进一步测试)。基于这类值得注意的结果，本领域技术人员立即明确基于上述部分和引入本文作为参考的对比文件中的教导的表型反应的适当选择和确定，该方法可以有效地应用于鉴定任意蛋白的抑制剂或活化剂。例如，本领域技术人员使用上述知识容易地设计分析系统来鉴定来源于其它prototheramuteins的theramuteins的抑制剂，已知所述的其它prototheramuteins显示出赋予药物抗性的突变，诸如c-kit基因产物或表皮生长因子(EGF)受体(EGFR)或血小板衍生的生长因子(PDGF)受体α和β。在使用该方法时，就方法用于在其相应的表型反应是可检测的任意哺乳动物细胞类型中表达的任意指定蛋白质(包括theramutein和prototheramutein)的能力而言，推断应没有限制。 
实施例2:基于表型反应的蛋白质调节剂优化 
在该实施例中，对根据本发明教导先前已经鉴定的化合物进行针对所选靶蛋白质的活性进行优化。然而，与本领域技术中通常采用的方法不同，本文的优化过程也完全通过使用基于表型反应的细胞测试系统进行。考虑到完全性以及为了证实该方法优化（refine）的能力，采用重组产生的靶酶的无细胞测试系统也用于独立证实在基于表型反应的细胞测试系统中评分为正的所述化合物确实在无细胞测试系统模式（其为本领域的标准并使用重组产生的酶）中也评分为正。 
对最初被鉴定为T3151theramutein抑制剂的化合物C2进行下述的新先导优化程序。使用标准医药化学合成方法在化合物C2的基本骨架结构中引入各种化学修饰。一旦合成，使用上述实施例1中基于表型反应的细胞测试系统对各种类似物（化学变体）进行测试。 
基于化合物C2的最初结构，分析了含溴、氯和羟基取代基的苯环对药理学活性的贡献。合成最初系列的类似物，其由未取代的苯环(C2-01)，或在苯环上有各种取代基（例如定位在苯环周围各种位置上的溴、氯和羟基等）组成。详细的化学结构显示于表3。 
Figure BDA0000440201980001491
Figure BDA0000440201980001501
Figure BDA0000440201980001511
然后在基于表型反应得细胞测试系统中测试这些化合物，如附图17所示。还在标准的无细胞蛋白激酶自磷酸化测试中，以20μM的浓度对各个化合物进行测试，如附图18所示。附图17和附图18的比 较显示在基于表型反应（细胞的）的测试系统中化合物活性和其在无细胞纯化蛋白激酶自磷酸化测试中的对应活性之间存在显著的、本质上完全定性相关。 
为了各种医药化学目的及在本发明范围之外的理由，在上述的同一苯环上进行其他化学修饰，但所述化学修饰与对p210Bcr-Abl-T315I靶的效力增强有关同时限制与对照野生型Ba/F3非-转化型细胞(不表达p210Bcr-Abl-wt或p210Bcr-Ab1-T315I)的交叉反应，以及改进选择性、使患者中的潜在副作用最小化等。如附图17和18以及表3所示，合成并测试的其它化合物包括C2-109、C2-112、C2-122、和C2-128。图17和18的详细比较再次显示在细胞测试系统中评分为正的所有化合物在无细胞系统中也展现蛋白激酶抑制活性，而在基于表型反应的细胞测试中本质上是无活性的那些在无细胞系统中本质上也是无活性的。最后这些结果证实在基于表型反应的测试系统中显示抑制活性的化合物与在无细胞蛋白激酶自磷酸化测试中获得的结果性质上完全一致。 
此外，当在无细胞测试结果和基于表型反应的测试结果之间在相对效力方面存在适中的差别时(参见实施例，化合物C2-122似乎在无细胞测试中比在基于表型反应的细胞系统中更有效)，这种区别表明与经典的无细胞测试系统相比，细胞测试系统预测指定化合物体内功效的能力增强。使用经典的无细胞筛选，人们可能认为C2-122是一个重要的化合物，然而基于表型反应的测试立刻将其排除因为其效力比几个所测试的其它化合物的效力低。在本领域中，之前没有报导过采用不取决和依赖于无细胞放射性配体或其它结合测试的细胞系统的这类先导优化方案。 
总之，本发明给本领域技术人员提供用于先导优化的有力和快速的方法，其代替了反复无细胞体外证实化合物命中其相应靶的能力的必要。因此，优化方法本质上可以完全依赖于基于表型反应的测试系统结果，消除了反复确认无细胞测试结果的必要。而所述的确认实验可以进行（如果本领域技术人员选择去做的话），对于这个方法通常是没有必要的，因为上述给出的结果明确证实。 
本领域技术人员充分意识到没有任何类型或性质的测试系统完全没有假阳性结果，无论是放射性配体结合测试、ELISA、配体结合测试还是细胞测试。这个测试系统，尽管惊人的强大，但不是没有假阳性结果的可能，本领域技术人员了解异常结果的独立确认仅是好的科学并在合适的时候应当考虑。 
实施例3:基于表型反应的蛋白质调节剂的表征 
对其不同程度的抑制或活化多个不同蛋白质靶的能力而言本发明基于表型反应的测试系统可用于识别指定化合物的生物活性。例如，在某些情况下，本领域技术人员可能对鉴定或优化指定靶蛋白质的调节剂感兴趣，其中已知其它蛋白质是不同但与靶POI高度相关。所述蛋白家族由两个或多个成员组成，所述成员在DNA和氨基酸序列水平上具有高程度的同源性，然而所述家族成员在细胞内可能具有不同的功能。通过本文描述的基于表型反应系统的反复应用，人们可以产生表达各个不同家族成员的单个测试细胞然后使用具有对应定义的表型反应的三个或四个或更多不同的测试细胞系来鉴定或优化对一个特定家族成员有选择性的化合物。 
在本发明另一个实施方案中，本领域的技术人员也可以在一个单测试细胞（或测试细胞系）中选择表达两个或三个或甚至四个不同蛋白质靶并产生用于鉴定在指定蛋白家族的单个同功酶中没有选择性的化合物的基于表型反应的测试系统。在某些治疗情况中，在单个家族成员中没有选择性可能是优选的。例如布洛芬是已经建立的低成本安全和有效的非甾类抗炎药物，其不显著区分环氧合酶1型(COX-I)和COX-2家族成员。所述没有区别在某些情况下是有益的且可能降低某些不希望副作用的可能性，所述不希望副作用对于过度选择的化学试剂可能发生。 
对其抑制或活化某些相关蛋白靶的能力而言，识别指定化合物的生物作用，无论所述靶是或不是同一个蛋白家族的成员，从理解指定化合物的分子和细胞作用机理方面也具有重要的价值。例如，在伊马替尼的情况下，不仅所述化合物抑制P210Bcr/Abl蛋白(p210Bcr-Abl-wt) 野生型形式，其也与c-kit致癌蛋白交叉作用且也能抑制c-kit致癌蛋白。如上讨论的，在本发明背景下，kit致癌蛋白的所述交叉反应抑制是偶然发现的，因为胃肠道间质瘤(GIST)（一类在小肠中产生的肿瘤）受kit活性的驱动并因此也对伊马替尼治疗有响应(NEJMpaper)。因此，与相关蛋白的所述交叉反应性不需要一直与药物毒性相关。在一些情况下，所述交叉反应性可以是治疗有效的。 
在本文其它地方描述（参见实施例1）的细胞测定系统中测试对应于上面指定的各种化学式的本发明有代表性的化合物，并且规定的活性类别如表I所示。规定的活性类别由下面的指定代表，其中给定细胞系的IC50是指给定化合物在细胞试验系统中抑制该细胞系生长达50%时的浓度。给定细胞系上测试展现的IC50值<300nM(小于300纳摩尔)的化合物被指定为类“A”化合物。给定细胞系上测试展现的IC50值<1μM(小于1微摩尔)的化合物被指定为类“B”化合物。给定细胞系上测试展现的IC50值<10μM(小于10微摩尔)的化合物被指定为类“C”化合物。给定细胞系上测试展现的IC50值>10μM(大于或等于10微摩尔)的化合物被指定为类“D”化合物。 
表4 
Figure BDA0000440201980001541
Figure BDA0000440201980001551
Figure BDA0000440201980001561
Figure BDA0000440201980001571
Figure BDA0000440201980001591
Figure BDA0000440201980001601
实施例4: 
Figure BDA0000440201980001602
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001603
实验细节：回流化合物1(25g)和N，N-二甲基苯胺(24.2g)在POCl3(110mL)中的混合物5小时。减压下蒸发除去POCl3，并将残余物小心倒入冰-水(500g)中并搅拌1小时。然后过滤混合物并用水洗涤固体得到黄色固体状的化合物2。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001604
实验细节：10℃下，在15分钟内向化合物2(1.04g)在15ml乙醇的溶液中逐滴加入1.08g(2eq)吗啡。搅拌混合物0.5小时并在50℃下加热15分钟。冷却并用水(50ml)稀释后，过滤得到黄色固体粉末状的化合物3。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001611
实验细节：向1.1g化合物3中加入8ml NH2NH2.H2O。回流混合物2小时。冷却后，过滤得到粗产物。通过柱色谱纯化得到淡黄色固体状的纯化合物4。 
4.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001612
实验细节：向化合物5(1.0g，1.0eq)和DMF(0.05g，计算量)在20mL二氯甲烷的溶液中逐滴加入(COCl)2(0.81g，1.1eq)。室温下搅拌反应混合物2小时然后浓缩得到1.2g化合物6的粗产物,在没有进一步纯化下将其用于下一步。 
5.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001613
实验细节：向化合物6的粗产物(1.2g，1.0eq)在20mL二氯甲烷的溶液中加入3-三氟甲基-苯胺(0.94g，1.0eq)和三乙胺(0.71g，1.2eq)。室温下搅拌反应混合物过夜，用1N NaOH溶液、1N HCl溶液和盐水洗涤。收集有机层，用Na2SO4干燥，浓缩得到化合物7的粗产物。通过柱色谱纯化后，得到1.1g化合物7。 
6.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001621
实验细节：向化合物7(0.3g，1.0eq)和3mL三氟乙酸的混合物中加入六亚甲基四胺(0.53g，4.0eq)。立刻密封反应混合物并加热到90℃20小时。冷却后，用1N NaOH溶液调节反应混合物到pH8，用二氯甲烷萃取并干燥有机相，浓缩得到棕色固体。通过制备型TLC纯化得到黄色固体状的化合物8。 
7.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001622
实验细节：室温下搅拌化合物4(30mg，1.0eq)和化合物8(19mg，1.0eq)在5mL二氯甲烷中的混合物过夜。收集沉淀并用二氯甲烷充分洗涤，真空下干燥得到需要的化合物。 
实施例5: 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001623
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001624
实验细节：向化合物1(1.0g，1.0eq)、化合物2(0.92g，1.0eq)、Na2CO3(0.77g，1.5eq)在15mL二
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001625
烷的混合物中加入Pd(PPh3)4(0.56g，0.1eq)，在N2下回流反应混合物16小时。冷却后，过滤混合物并蒸发过滤物至干，通过柱色谱纯化得到化合物3。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001631
实验细节：向化合物3(0.3g，1.0eq)和3mL三氟乙酸的混合物中加入六亚甲基四胺(0.62g，4.0eq)。立刻密封反应混合物并加热至90℃20小时。冷却后，用1N NaOH溶液调节反应混合物至pH8，用二氯甲烷萃取并干燥有机相，浓缩得到棕色固体。通过制备型TLC纯化得到黄色固体状的化合物4。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001632
实验细节：室温下搅拌化合物4(30mg，1.0eq)和化合物5(19mg，1.0eq)在5mL二氯甲烷中的混合物过夜。收集沉淀并用二氯甲烷洗涤，真空下干燥得到所需的化合物。 
实施例6. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001633
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001634
实验细节：向化合物1(0.6g，1.0eq)在10mL甲醇的溶液中加入4mL1N NaOH溶液，室温下搅拌混合物过夜。蒸发溶剂并用5%柠檬酸酸化残余物至pH6，用二氯甲烷萃取。干燥有机层，浓缩得到化合物2。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001641
实验细节：室温下搅拌化合物2(0.4g，1.0eq)、三氟甲基苯胺(0.39g，1.0eq)、EDC(0.71g，1.5eq)、HOBt(33mg，0.1eq)在10mL二氯甲烷中的混合物过夜。用1N NaOH溶液、水洗涤混合物，用二氯甲烷萃取。用Na2SO4干燥有机层，浓缩至干，并通过柱色谱纯化得到化合物3。 
3.反应流程： 
实验细节：用4mL1N HCl处理化合物3(0.2g，1.0eq)在10mL二烷中的溶液，并将混合物加热至60℃2小时。冷却后,添加NaHCO3将pH调节至8。用二氯甲烷萃取混合物，用水洗涤有机层，用Na2SO4干燥并蒸发至干。通过柱色谱纯化粗产物得到化合物4。 
4.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001644
实验细节：室温下搅拌化合物4(40mg，1.0eq)和化合物5(30mg，1.0eq)在5mL二氯甲烷中的混合物过夜。浓缩混合物至干并通过制备型HPLC纯化得到所需的化合物。 
实施例7. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001645
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001651
实验细节：室温下搅拌化合物2(0.3g，1.0eq)、2-氯-6-甲基-苯胺(0.26g，1.0eq)、EDC(0.53g，1.5eq)、HOBt(25mg，0.1eq)在10mL二氯甲烷中的混合物过夜。用1N NaOH溶液、水洗涤混合物,并用二氯甲烷萃取。用Na2SO4干燥有机层，浓缩至干，通过柱色谱纯化得到化合物3。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001652
实验细节：用4mL1N HCl处理化合物3(0.2g，1.0eq)在10mL二
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001653
烷中的溶液，并将混合物加热至60℃2小时。冷却后，通过添加NaHCO3将pH调节至8。用二氯甲烷萃取混合物并用水洗涤有机层，用Na2SO4干燥并蒸发至干。通过柱色谱纯化粗产物得到化合物4。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001654
实验细节：室温下搅拌化合物4(40mg，1.0eq)和化合物5(30mg，1.0eq)在5mL二氯甲烷中的混合物过夜。浓缩混合物至干并通过制备型HPLC纯化得到所需的化合物。 
实施例8. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001655
1.反应流程： 
实验细节：向1g(5.5mmol)5-溴-2-氰基吡啶、0.97g(6.05mmol1.1eq)3-(三氟甲基)苯胺在100ml甲苯的溶液中加入3eq t-BuONa、0.2eq BINAP和0.1eq Pd2(dba)3。然后加热回流该溶液过夜。通过LC/MS监测反应。减压下除去易挥发物。通过快速色谱纯化粗产物得到化合物2。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001662
实验细节：将250mg(0.95mmol)化合物2添加到20mL浓HCl中，然后加热回流该溶液直到初始材料消失。在没有纯化的情况下，减压浓缩混合物得到黄色固体状的化合物3。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001663
实验细节：将50mg(0.18mmol)化合物3在3mL二氯甲烷中的溶液添加到0.5mL亚硫酰氯中。加热混合物并搅拌3小时。最后减压蒸发溶液。得到化合物4并在没有纯化下用于下一步。 
4.反应流程： 
实验细节：在25℃下搅拌50mg化合物4和43mg(1.2eq)肼在5mLDCM中的溶液3小时。浓缩反应混合物并通过制备型HPLC纯化残余物得到所需的化合物. 
实施例9. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001671
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001672
实验细节：加热回流化合物1(25g，0.145mol)和SeO2(27.5g，0.247mol)在乙酸(1200mL)中的悬浮液12小时。减压浓缩反应混合物至干。在水中溶解残余物并通过添加K2CO3使得pH=9。用EA(100mL×3)萃取所得混合物。用Na2SO4干燥合并的EA。过滤掉Na2SO4后，减压下浓缩过滤物得到粗产物2，在没有纯化下将其用于下一步。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001673
实验细节：回流上述制备的2在乙醇原甲酸三乙酯(10mL)中的溶液4小时。除去溶剂后，通过柱分离残余物得到油状产物3。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001674
实验细节：在N2气氛下，向化合物3(73mg，0.28mmol)和化合物4(50mg，0.28mmol)，及tBuONa(27mg，0.56mmol)和BINAP(70.4mg，1.12mol)在甲苯(15mL)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd2(dba)3(26mg，0.028mmol)并在80℃搅拌48小时。过滤掉固体后,浓缩过滤物得到粗产物5，在没有纯化下将其用于下一步。 
4.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001675
实验细节：在-30℃和N2气氛下，用BBr3(146mg，0.6mmol)处 理化合物5(335mg，0.1mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液，然后室温下搅拌4小时。将反应物倒入冰-水中然后添加Na2CO3。用二氯甲烷萃取(25mL×3)所得混合物,用Na2SO4干燥合并的有机层。过滤掉Na2SO4后，浓缩过滤物得到粗产物6，在没有纯化下将其用于下一步。 
5.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001681
实验细节：回流下搅拌化合物6(27.74mg，0.1mmol)和化合物7(21mg，0.1mmol)在无水CH2Cl2(300mL)中的溶液6小时。减压下除去溶剂。通过制备-TLC分离残余物得到所需的化合物。 
实施例10. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001682
1.反应流程： 
实验细节：在N2气氛下，向化合物1(5g，25mmol)和化合物2(3.4g，27mmol)在DMF(50mL)和Na2CO3水溶液(20mL，2M)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd2(dbbf)3(26mg，0.028mmol)，并在100℃下搅拌18小时。冷却到室温并过滤掉固体后，用EA(200mL)萃取过滤物。浓缩有机层至干。通过柱纯化残余物得到粗产物3。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001684
实验细节：加热回流化合物3(2g，0.1mol)和Na2S2O4(5.2g，0.3mol)在甲醇(80mL)和H2O(20mL)中的混合物3小时。减压下浓缩反应物至干。在水中溶解残余物然后用EA(150mL)萃取。用盐水洗涤有机层两次并用Na2SO4干燥。滤掉Na2SO4后，浓缩过滤物得到产物4。 
3.反应流程： 
实验细节：在N2气氛下，向化合物5(228mg，88mmol)和化合物4(150mg，88mmol)，t BuONa(170mg，176mmol)和BINAP(210mg，176mmol)在甲苯(25mL)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd2(dba)3(79mg，0.88mmol)，并在80℃下搅拌48小时。过滤掉固体后,浓缩过滤物得到粗产物6。 
4.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001692
实验细节：在-30℃和N2气氛下，用BBr3(600mg，10.6mmol)处理化合物6(140mg，4mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液，然后在室温下搅拌4小时。将反应物倒入冰-水中然后通过添加Na2CO3使得pH=9。用二氯甲烷萃取(25mL×3)所得的混合物，用Na2SO4干燥合并的有机层。过滤掉Na2SO4后,浓缩过滤物至干。通过柱纯化残余物得到产物7。 
5.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001693
实验细节：回流下搅拌化合物7(98mg，0.36mmol)和化合物8(64mg，0.3mmol)在无水CH2Cl2(300mL)中的溶液6小时。减压下除去 溶剂。通过制备-TLC分离残余物得到所需的化合物。 
实施例11. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001701
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001702
实验细节：在N2气氛下，向化合物1(5.9g，25mmol)和化合物2(3.3g，27mmol)在DMF(50mL)和Na2CO3水溶液(20mL，2M)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd2(dbbf)3(26mg，0.028mmol)，并在100℃下搅拌18小时。冷却到室温和过滤掉固体后,用EA(200mL)萃取过滤物。浓缩有机层得到粗产物3，在不纯化下将其用于下一步。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001703
实验细节：在室温和氢气氛(20psi)下，搅拌3(6.5g，27.9mmol)和Pd(OH)2(10%，0.5g)在乙醇(200mL)中的混合物2小时。过滤掉催化剂，真空下除去过滤物得到无色油状产物4。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001704
实验细节：在N2气氛下，向化合物4(406mg，20mmol)和化合物5(520mg，20mmol)，及tBuONa(170mg，176mmol)和BINAP(210mg，176mmol)在甲苯(25mL)的搅拌和脱气的混合物中加入 Pd2(dba)3(79mg，0.88mmol)，并在80℃下搅拌48小时。过滤掉固体后,浓缩过滤物得到粗产物6，在不纯化下将其用于下一步。 
4.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001711
实验细节：在-30℃和N2气氛下，用BBr3(600mg，10.6mmol)处理化合物6(383mg，10mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液，然后室温下搅拌4小时。将反应物倒入冰-水中，然后通过加入Na2CO3使得pH9。用二氯甲烷萃取(25mL×3)所得混合物，并用Na2SO4干燥合并的有机层。过滤掉Na2SO4后,浓缩过滤物至干。通过柱纯化残余物得到产物7。 
5.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001712
实验细节：加热回流7(60mg，0.22mmol)和烟酰醛(33mg，0.15m mol)在二氯甲烷(10mL)中的混合物3小时。除去溶剂后，通过色谱纯化残余物得到所需的化合物。 
实施例12. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001713
1.反应流程： 
实验细节：室温下搅拌DMAP(9.3g，0.077mol)、化合物1(10g，0.051mol)和Boc2O(12g，0.051mol)在tBuOH(200mL)中的 溶液过夜。减压下除去溶剂并通过快速色谱在硅胶上纯化残余物。(乙酸乙酯/石油醚=10:1)得到无色油状的2。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001721
实验细节：在室温和氢气氛(50psi)下搅拌2(6.17g，27.9mmol)和Pd(OH)2(10%，1g)在乙醇(200mL)中的混合物4小时。过滤掉催化剂，真空下除去过滤物得到无色油状的产物3。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001722
实验细节：在N2下加热化合物3(2.65g，12mmol)、化合物4(2.6g，10mmol)、tBuONa(1.34g，14mmol,)、Pd2(dba)3(46.5mg，50mmol，)和DCHPB(70mg，0.2mmol)在干燥甲苯(50mL)中的混合物至80-90℃24小时。过滤沉淀并在真空下除去过滤物，通过色谱在硅胶上纯化残余物(乙酸乙酯/石油醚=10:1)得到黄色油状的5。 
4.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001723
实验细节：在0℃下，向5(0.9g，2.24mmol)在CHCl3(50mL)的溶液中加入CF3COOH(40mL)。加成完成后，在室温下搅拌所得的混合物过夜。减压下除去溶剂至干。从乙醚中重结晶残余物得到灰白色固体。在氨水(10mL)中溶解该固体。通过添加1M HCl使得混合物的pH=7.0并沉淀。收集沉淀物并用冷水(5mL)洗涤，减压下干燥得到黑色固体的6。 
5.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001731
实验细节：加热回流6(60mg，0.22mmol)，烟酰醛(33mg，0.15mmol)在二氯甲烷(10mL)中的混合物3小时。除去溶剂后，通过色谱纯化残余物得到黄色固体状的所需化合物。 
实施例13. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001732
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001733
实验细节：在N2气氛下，向化合物1(6.7g，25mmol)、化合物2(4.1g，27mmol)在DMF(50mL)和Na2CO3水溶液(20mL，2M)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd2(dbbf)3(26mg，0.028mmol)，并在100℃下搅拌18小时。冷却到室温后并过滤掉固体,用EA(200mL)萃取过滤物。浓缩有机层得到粗产物3。 
2.反应流程： 
实验细节：在室温和氢气氛(20psi)下，搅拌3(3.2g，10mmol)和Pd(OH)2(10%，0.5g)在乙醇(200mL)中的混合物2小时。过滤掉催化剂，真空下除去过滤物得到无色油状产物4。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001741
实验细节：在N2气氛下，向化合物4(297mg，10mmol)和化合物5(259mg，10mmol)，及tBuONa(170mg，17.6mmol)和BINAP(210mg，17.6mmol)在甲苯(25mL)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd2(dba)3(79mg，0.88mmol)，并在80℃下搅拌48小时。过滤掉固体后,浓缩过滤物得到粗产物6，在没有纯化下将其用于下一步。 
4.反应流程： 
实验细节：在-30℃和N2气氛下，用BBr3(600mg，10.6mmol)处理化合物6(446mg，10mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液，然后在室温下搅拌4小时。将反应物倒入冰-水中然后通过添加Na2CO3使得pH=9。用二氯甲烷萃取(25mL×3)所得的混合物，用Na2SO4干燥合并的有机层。过滤掉Na2SO4后，浓缩过滤物至干。通过柱纯化残余物得到产物7。 
5.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001743
实验细节：加热回流7(67mg，0.15mmol)，烟酰醛(33mg，0.15mmol)在二氯甲烷(10mL)中的混合物3小时。除去溶剂后，通过色谱纯化残余物得到黄色固体状的所需化合物。 
实施例14. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001751
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001752
实验细节：在N2气氛下，向化合物1(3g，0.02mol)和化合物2(3.4g，0.02mol)，及KOH(5.28g，0.1mol)和TBBA(6.44g，0.02mol)在无水THF(100mL)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd(PPh3)4(2.31g，2mmol)，并回流下搅拌12小时。过滤掉固体后，浓缩过滤物至干。通过柱纯化残余物得到产物3，在不纯化下将其用于下一步。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001753
实验细节：在N2气氛下，向化合物3(334mg，1.7mmol)和化合物4(434mg，1.7mmol)，及t-BuONa(322mg，3.4mmol)和BINAP(420mg，0.67mol)在甲苯(60mL)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd2(dba)3(156mg，0.017mmol)，并在80℃下搅拌48小时。过滤掉固体后，浓缩过滤物至干。通过柱纯化残余物得到产物5。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001754
实验细节：在-30℃和N2气氛下，用BBr3(393mg，0.6mmol)处理化合物5(100mg，0.3mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液，然后室温下搅拌4小时。将反应物倒入冰-水中然后加入Na2CO3。用二氯甲烷(25mL×3)萃取所得的混合物，用Na2SO4干燥合并的有机层。 过滤掉Na2SO4后，浓缩过滤物得到粗产物6。 
4.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001761
实验细节：加热回流6(39mg，0.13mmol)、烟酰醛(29mg，0.13m mol)在二氯甲烷(10mL)中的混合物3小时。除去溶剂后，通过色谱纯化残余物得到黄色固体状的所需化合物。 
实施例15. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001762
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001763
实验细节：将多聚甲醛(1.8g，59.3mmol)添加到化合物1(1.0g，5.9mmol)在乙酸(40mL)的溶液中，然后在10℃下加入NaCNBH3(1.8g，28.8mmol)。在室温下搅拌16小时，将溶液倒入冰/水(100mL)中，用浓NaOH调节PH至10。DCM(3×100mL)萃取该溶液。干燥合并的有机层(MgSO4)，过滤并在真空下浓缩得到化合物2。 
2.反应流程： 
实验细节：在1atm氢气下用Pd/C氢化0.84g(4.3mmol)化合物216小时。在没有进一步纯化下，过滤反应混合物并浓缩过滤物得到化合物3。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001771
实验细节：在150℃和微波下，使250mg(1.51mmol)化合物3、0.2eq BINAP、0.1eq Pd2(dba)3、3eq Cs2CO3和5-溴-2-二乙氧基甲基-吡啶(0.783g，3.01mmol)在10mL1,4-二
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001772
烷的溶液反应2小时。通过LC-Ms监测反应。浓缩混合物并通过制备型TLC纯化残余物得到化合物4。 
4.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001773
实验细节：向300mg(0.55mmol)化合物4在5mL DCM的溶液中加入4mL TFA。室温下搅拌反应混合物30分钟。向混合物加入冰/水并通过NaHCO3碱化到PH=10，用DCM(15mL*3)萃取。用水和盐水洗涤合并的有机层,用MgSO4干燥，过滤并浓缩得到化合物5。 
5.反应流程： 
实验细节：在25℃下搅拌80mg(0.295mmol)化合物5和(5-氟-4-吗啉基-4-基-嘧啶基-2-基)-肼(125mg，0.59mmol)在10mL DCM中的溶液15小时。浓缩反应混合物并通过制备型HPLC纯化残余物得到化合物6。 
6.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001775
实验细节：在0℃下，向化合物6(40mg，0.086mmol)在干燥DCM(5mL)的溶液中逐滴加入BBr(22mg，0.258mmol)。室温下搅拌反应混合物3小时。用甲醇淬灭反应，并浓缩混合物。通过制备型HPLC纯化残余物得到所需的化合物。 
实施例16. 
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001782
实验细节：在N2气氛下向搅拌的3-溴苯胺(0.86g)在30ml甲苯的溶液中加入0.1eq的Pd(PPh3)4、5ml饱和Na2CO3水溶液、和3-甲氧基苯基硼酸(0.75g)在10ml EtOH中的溶液。回流下剧烈搅拌混合物15小时并冷却，加入10ml H2O，并用CH2Cl2(20ml×3)萃取混合物。用Na2SO4干燥合并的有机层并浓缩。通过柱色谱(PE/EA=10:1)纯化残余物得到纯的化合物2。 
2.反应流程： 
反应细节：在150℃下，使化合物2(59.5mg)，5-溴-2-二乙氧基甲基-吡啶(116.7mg)、t-BuONa(86.4mg)、BINAP(36.7mg)和Pd2(dba)3(27.4mg)在二
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001784
烷(2ml)中的混合物进行微波处理2小时，过滤溶液并浓缩。通过制备型TLC纯化残余物得到化合物3。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001791
反应细节：向化合物3(120mg)在5ml DCM的溶液中加入1ml BBr3，室温下搅拌反应过夜。然后向混合物中加入5ml H2O，用EtOAc萃取并浓缩。通过制备型TLC纯化粗产物得到化合物4。 
4.反应流程： 
实验细节：室温下搅拌43.5mg化合物4和32mg肼在5ml DCM中的混合物过夜并浓缩。通过制备型TLC纯化粗产物得到所需化合物。 
实施例17. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001793
1.反应流程： 
实验细节：在100℃下，使2.0g(16.2mmol，1.0eq)化合物1、0.05eq BINAP、0.05eq Pd2(dba)3、1.2eq t-BuONa和1-溴-3-硝基-苯(3.28g，16.2mmol，1.0eq)在20mL无水甲苯中的溶液反应24小时。通过LC-MS监测反应。浓缩混合物并通过柱色谱纯化残余物得到化合物2。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001795
实验细节：在1atm氢气下用Pd/C(0.25g)氢化2.5g化合物2 16小时。过滤反应混合物，在没有进一步纯化下浓缩过滤物得到化合物3。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001801
实验细节：在100℃下，使500mg(2.33mmol)化合物3、5-溴-2-二乙氧基甲基吡啶(607mg，2.33mmol)、0.05eq xantphos、0.05eq Pd2(dba)3和1.5eq t-BuONa在10mL甲苯中的溶液回流24小时。通过LC-MS监测反应。浓缩混合物并通过柱色谱纯化残余物得到化合物4。 
4.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001802
实验细节：用1mL HCl(1N水溶液)和10mL二
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001803
烷处理100mg化合物4。室温下搅拌混合物4小时，用0.5N NaOH溶液调节至pH8-9。用DCM萃取后,用Na2SO4干燥有机层并浓缩得到化合物5。 
5.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001804
实验细节：在25℃下搅拌50mg(0.16mmol)化合物5和(5-氟-4-吗啉基-4-基嘧啶基-2-基)-肼(50mg，0.23mmol)在5mL DCM中的溶液15小时。浓缩反应混合物并通过制备型HPLC纯化残余物得到化合物6。 
6.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001805
实验细节：在0℃下向化合物6(50mg，0.09mmol)在干燥DCM(5mL)的溶液中逐滴加入BBr3(20mg，0.25mmol)。室温下搅拌反应混合物3小时。用甲醇淬灭反应，然后浓缩混合物。通过制备型HPLC纯化残余物得到所需的化合物。 
实施例18. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001811
1.反应流程： 
实验细节：在130℃下加热10g(70.92mmol)3-氟-硝基苯、1eq咪唑和2eq K2CO3在100ml DMSO中的溶液5小时。通过LC-MS监测反应。然后加入500mL水并过滤沉淀，在没有进一步纯化下用水洗涤该固体并干燥得到化合物2。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001813
实验细节：在1atm氢气下用Pd/C氢化5g(31.4mmol)化合物2半小时。在没有进一步纯化下，过滤反应混合物并浓缩过滤物得到化合物3。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001814
实验细节：在130℃下，回流500mg(3.14mmol)化合物3、0.1eqxantphose、0.1eq Pd2(dba)3和1.5eq t-BuONa在10mL甲苯中的溶液15小时。通过LC-Ms监测反应并用水洗涤，用EtOAc萃取。用盐水洗涤合并的有机层并用MgSO4干燥。过滤并浓缩，通过制备型TLC纯 化残余物得到化合物4。 
4.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001821
实验细节：向200mg化合物4在5mL1,4-二
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001822
烷的溶液中加入8mL4N HCl并在80℃下加热2小时。通过2N NaOH碱化反应混合物至ph=10并用DCM(15mL*3)萃取。用水和盐水洗涤合并的有机层并用MgSO4干燥，过滤并浓缩得到250mg粗产物。通过制备型TLC纯化粗产物得到化合物5。 
5.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001823
实验细节：在25℃下搅拌80mg化合物5和1eq化合物6在5mLDCM中的溶液15小时。浓缩反应混合物并通过制备型HPLC纯化残余物得到所需的化合物。 
实施例19. 
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001825
实验细节：在130℃下回流1.50g1-溴-3-甲基-5-硝基-苯和1.60g(1.2eq)哌嗪-1-甲酸叔丁酯、0.1eq xantphos、0.1eq Pd2(dba)3和1.5eq t-BuONa在20mL甲苯中的溶液4小时。通过LC-Ms监测反应， 用水洗涤并用EtOAc萃取。用盐水洗涤合并的有机层并用Na2SO4干燥。过滤并浓缩，通过柱色谱在硅胶上纯化残余物（采用10:1PA:EA作为洗脱剂）。合并适当级分并减压浓缩得到中间体1。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001831
实验细节：在1atm氢气下用Raney/Ni氢化1.6g中间体12小时。在没有进一步纯化下，过滤反应混合物并浓缩过滤物得到中间体2。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001832
实验细节：在130℃下回流1.20g中间体2、1.30g(1.20eq)5-溴-2-二乙氧基甲基-吡啶、0.1eq xantphose、0.1eq Pd2(dba)3和1.5eq t-BuONa在20mL甲苯中的溶液4小时。通过LC-Ms监测反应，用水洗涤并用EtOAc萃取。用盐水洗涤合并的有机层并用Na2SO4干燥。过滤并浓缩，用柱色谱在硅胶上纯化残余物（采用4:1PA:EA作为洗脱液）。合并适当的级分并在减压下浓缩得到中间体3。 
4.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001833
实验细节：在10ml DCM中溶解200mg中间体3。将130mg TFA逐滴加入到反应混合物溶液并室温下搅拌3小时。反应混合物用NaHCO3溶液碱化到中性，盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩得到220mg粗 产物。通过制备型TLC纯化粗产物得到中间体4。 
5.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001841
实验细节：室温下搅拌50mg中间体4和1.0eq(5-氟-4-吗啉基-4-基嘧啶基-2-基)-肼在5mL DCM中的溶液3小时。用水和盐水洗涤反应混合物，浓缩得到残余物并通过制备型HPLC纯化得到所需化合物。 
实施例20. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001842
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001843
实验细节：在0℃下将15ml1M BH3/THF逐滴加入到3g(13.95mmol)4-溴-2-甲基-苯甲酸在20ml THF的溶液中。使反应溶液到达室温持续1小时并通过逐滴加入50ml50%THF水溶液淬灭反应。用Na2CO3处理混合物并浓缩。用Et2O萃取残余物。干燥有机层得到化合物2。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001844
实验细节：向2.4g(11.9mmol)化合物2在20ml DCM的溶液中加入5.1g(23.8mmol)PCC在60ml DCM中的浆状物。室温下搅拌反应溶液1小时，用300ml Et2O稀释并过滤。浓缩过滤物得到化合物3。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001851
实验细节：将2.1g(14mmol)溶液加入到含有1.9g(9.55mmol)化合物3的乙醇溶液中。加热回流反应溶液3小时，然后浓缩。用NaHCO3洗涤固体并用乙酸乙酯萃取。干燥有机层得到化合物4。 
4.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001852
实验细节：将0.7g化合物4、0.41g3-三氟甲基-苯胺0.32gPd2(dba)3、0.21g binap和0.02g t-BuONa添加到35ml甲苯中。加热回流反应溶液过夜，并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物(乙酸乙酯/己烷=1:1)得到化合物5。 
5.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001853
实验细节：用4mL1N HCl处理化合物5(0.2g，1.0eq)在10mL二
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001854
烷中的溶液，并加热混合物至60℃2小时。冷却后，通过添加NaHCO3调节pH至8。用二氯甲烷萃取混合物，用水洗涤有机层，用Na2SO4干燥并蒸发至干。通过柱色谱纯化粗产物得到化合物6。 
6.反应流程： 
实验细节：在25℃下搅拌80mg化合物6和1eq化合物7在5mLDCM中的溶液15小时。浓缩反应混合物并通过制备型HPLC纯化残余物得到所需的化合物。 
实施例21. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001862
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001863
实验细节：向化合物1(0.5g，1.0eq)、3-三氟甲基苯基硼酸(0.63g，1.0eq)、Na2CO3(0.46g，1.5eq)在15mL二
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001864
烷的混合物中加入Pd(PPh3)4(0.33g，0.1eq),并在N2下回流反应混合物16小时。冷却后，过滤混合物并蒸发过滤物至干，通过柱色谱纯化得到化合物2。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001865
实验细节：在N2下回流化合物2(0.2g，1.0eq)、SeO2(0.19g，2.0eq)在10mL乙酸中的混合物48小时。通过蒸发除去溶剂并在水中溶解残余物，用饱和的NaHCO3溶液调节至pH6，用二氯甲烷萃取。收集有机层,干燥并蒸发至干。通过柱色谱纯化粗产物得到化合物3。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001871
实验细节：室温下搅拌化合物3(30mg，1.0eq)和化合物4(19mg，1.0eq)在5mL二氯甲烷中的混合物过夜。浓缩混合物至干并通过制备型HPLC纯化得到所需的化合物。 
实施例22. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001872
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001873
实验细节：室温下搅拌化合物1(0.5g，1.0eq)、三氟甲基苯胺(0.58g，1.0eq)、EDC(1.05g，1.5eq)、和HOBt(50mg，0.1eq)在15mL二氯甲烷中的混合物过夜。用1N NaOH溶液、水洗涤混合物，用二氯甲烷萃取。用Na2SO4干燥有机层，浓缩至干，通过柱色谱纯化得到化合物2。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001874
实验细节：在N2下回流化合物2(0.2g，1.0eq)、SeO2(0.16g，2.0eq)在10mL乙酸中的混合物48小时。通过蒸发除去溶剂并在水中溶解残余物，用饱和NaHCO3溶液调节至pH6并用二氯甲烷萃取。收集有机层，干燥并蒸发至干。通过柱色谱纯化粗产物得到化合物3。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001881
实验细节：室温下搅拌化合物3(40mg，1.0eq)和化合物4(30mg，1.0eq)在5mL二氯甲烷中的混合物过夜。收集沉淀并用二氯甲烷洗涤，真空下干燥得到所需的化合物。 
实施例23. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001882
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001883
实验细节：回流化合物1(3.0g，1.0eq)和2mL98%H2SO4在10mL EtOH中的溶液4小时，冷却至室温并蒸发至干，用水稀释，用NaHCO3调节至pH8，用二氯甲烷萃取。干燥有机层并浓缩得到化合物2。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001884
实验细节：在N2下回流化合物2(1.7g，1.0eq)、SeO2(2.29g，2.0eq)在80mL乙酸的混合物48小时。通过蒸发除去溶剂并在水中溶解残余物，用饱和的NaHCO3溶液调节至pH6，用二氯甲烷萃取。收集有机层，干燥并蒸发至干。通过柱色谱纯化粗产物得到化合物3。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001885
实验细节：回流化合物3(1.1g，1.0eq)，二乙氧基甲氧基-乙烷(2.3g，2.5eq)和TsOH.H2O(0.12g，0.1eq)在20mL乙醇中的溶液5小时。蒸发溶剂并在EtOAc中溶解固体，用水洗涤。用Na2SO4干燥有机层并蒸发得到化合物4。 
4.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001891
实验细节：向化合物4(0.6g，1.0eq)在10mL甲醇的溶液中加入4mL1N NaOH溶液，在室温下搅拌混合物过夜。蒸发溶剂并用5%柠檬酸酸化残余物至pH6，用二氯甲烷萃取。干燥有机层，浓缩得到化合物5。 
5.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001892
实验细节：室温下搅拌化合物5(0.4g，1.0eq)、三氟甲基苯胺(0.29g，1.0eq)、EDC(0.51g，1.5eq)、HOBt(25mg，0.1eq)在10mL二氯甲烷中的混合物过夜。用1N NaOH溶液、水洗涤混合物，用二氯甲烷萃取。用Na2SO4干燥有机层，浓缩至干，通过柱色谱纯化得到化合物6。 
6.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001893
实验细节：用4mL1N HCl处理化合物6(0.2g，1.0eq)在10mL二
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001894
烷中的溶液,并加热混合物至60℃2小时。冷却后，通过添加NaHCO3调节pH至8。用二氯甲烷萃取混合物，用水洗涤有机层，用Na2SO4干燥并蒸发至干。通过柱色谱纯化粗产物得到化合物7。 
7.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001901
实验细节：室温下搅拌化合物7(30mg，1.0eq)和化合物8(19mg，1.0eq)在5mL二氯甲烷中的混合物过夜。收集沉淀并用二氯甲烷洗涤，真空下干燥得到所需的化合物。 
实施例24. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001902
1.反应流程： 
实验细节：在N2下回流化合物1(2.0g，1.0eq)、SeO2(2.6g，2.0eq)在80mL乙酸中的混合物36小时。通过蒸发除去溶剂并在水中溶解残余物，用饱和的NaHCO3溶液调节至pH6，用二氯甲烷萃取。收集有机层，干燥并蒸发至干。通过柱色谱纯化粗产物得到化合物2。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001904
实验细节：回流化合物2(0.5g，1.0eq)、二乙氧基甲氧基-乙烷(1.0g，2.5eq)和TsOH.H2O(0.05g，0.1eq)在8mL乙醇中的溶液3小时。蒸发溶剂并在EtOAc中溶解该固体，用水洗涤。用Na2SO4干燥有机层并蒸发得到化合物3。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001905
实验细节：在N2下向化合物3(0.6g，1.0eq)、3-三氟甲基-苯胺(0.37g，1.0eq)、t-BuONa(0.26g，1.2eq)在15mL甲苯的混合物中加入Pd2(dba)3(42mg，0.02eq)和xantphos(28mg，0.02eq)。在N2下回流混合物16小时，冷却，过滤。浓缩过滤物并通过柱色谱纯化得到化合物4。 
4.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001911
实验细节：用4mL1N HCl处理化合物4(0.25g，1.0eq)在10mL二
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001912
烷中的溶液，并加热混合物至60℃2小时。冷却后，通过添加NaHCO3调节pH至8。用二氯甲烷萃取混合物，用水洗涤有机层，用Na2SO4干燥并蒸发至干。通过柱色谱纯化粗产物得到化合物5。 
5.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001913
实验细节：室温下搅拌化合物5(30mg，1.0eq)和化合物6(19mg，1.0eq)在5mL二氯甲烷中的混合物过夜。收集沉淀并用二氯甲烷洗涤，真空下干燥得到所需的化合物。 
实施例25. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001914
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001915
实验细节：0℃下，在30分钟内向化合物1(14g，0.1mol)在 含水HBr(30mL)的溶液中加入NaNO2(8.3g0.15mol)在H2O(10mL)中的溶液。搅拌60分钟后，在80℃下将反应混合物添加到CuBr(14g，0.1mol)在含水HBr(16mL)的溶液中。完全加入后，在相同温度下搅拌反应混合物2小时。冷却到室温后,用EA(100mL×3)萃取反应混合物。用盐水洗涤合并的有机层并用Na2SO4干燥。过滤掉Na2SO4后，浓缩过滤物至干。通过柱纯化残余物得到产物2。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001921
实验细节：在N2气氛下向化合物2(4.11g，0.02mol)和化合物3(4.74g，0.02mol),及KOH(5.28g，0.1mol)和TBBA(6.44g，0.02mol)在无水THF(100mL)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd(PPh3)4(2.31g，2mmol)，在回流下搅拌12小时。过滤掉固体后，浓缩过滤物至干。通过柱纯化残余物得到产物4。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001922
实验细节：用TFA(1mL)处理4(1g，3mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液，然后室温下搅拌6小时。减压下除去溶剂得到产物5，在没有纯化下将其用于下一步。 
4.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001923
实验细节：在N2气氛下向化合物5(619mg，2.4mmol)和化合物6(520mg，2.4mmol),及t BuONa(460mg，4.8mmol)和BINAP(599mg，6.9mol)在甲苯(60mL)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd2(dba)3(221mg，0.024mmol)，在80℃下搅拌48小时。过滤掉 固体后，浓缩过滤物至干。通过柱纯化残余物得到产物7。 
5.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001931
实验细节：在-30℃和N2气氛下，用BBr3(146mg，0.6mmol)处理化合物7(396mg，0.1mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液，然后室温下搅拌4小时。将反应物倒入冰-水中然后加入Na2CO3。用二氯甲烷萃取(25mL×3)所得的混合物，用Na2SO4干燥合并的有机层.过滤掉Na2SO4后，浓缩过滤物得到粗产物8，在没有纯化下将其用于下一步。 
6.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001932
实验细节：在回流下搅拌化合物8(32.2mg，0.1mmol)和化合物9(21mg，0.1mmol)在无水CH2Cl2(300mL)中的溶液6小时。减压下除去溶剂。通过制备-TLC分离残余物得到所需的化合物。 
实施例26. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001933
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001934
实验细节：用POCl3(500mL)处理5-氟-1H-嘧啶-2,4-二酮(113g，0.5mol)在N,N-二甲基苯胺(70mL)中的溶液，然后回流2小时。 冷却到室温后，将反应混合物倒入冰-水肿。用乙酸乙酯(100mL×3)萃取所得的混合物。用饱和的NaHCO3水溶液洗涤合并的有机层，然后用盐水洗涤。减压下除去溶剂得到化合物2。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001941
实验细节：在-10℃15分钟内向化合物2(20.8g，0.194mol)在乙醇(300mL)的溶液中逐滴加入吗啉(21.6g，0.25mol)。室温下搅拌该混合物0.5小时,然后加热至50℃15分钟。冷却到室温后并用水稀释，沉淀固体。通过过滤收集固体并用水洗涤得到化合物3。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001942
实验细节：回流加热3(4.6g，17.5mmol)和肼(8.75g，87.5mmol)在乙醇(40mL)中的溶液6小时。冷却和沉淀后，通过过滤收集沉淀并用乙醇洗涤得到化合物4。 
4.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001943
实验细节：在-15℃和N2气氛下，用BuMgCl(37.5mL，60mmol)处理化合物5(14g，50mmol)在无水THF(100mL)中的溶液。完全加成后，在该温度下搅拌混合物1小时。在0℃下30分钟内将无水DMF(0.54g，75mmol)加入到反应混合物，然后回温至室温1小时。通过添加2M HCl(80mL)淬灭反应混合物。用乙酸乙酯(50mL×3)萃取所得的混合物。用Na2SO4干燥合并的有机层。浓缩溶剂至干，通过柱分离残余物得到化合物6。 
5.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001951
实验细节：在痕量的TsOH存在下加热化合物6(4.5g，22.5mmol)在原甲酸三乙酯(15mL)中的溶液过夜。用乙酸乙酯(100mL)稀释反应混合物并用5%Na2CO3水溶液洗涤。分离有机层并用Na2SO4干燥。浓缩溶剂得到化合物7。 
6.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001952
实验细节：在N2气氛下向化合物7(1.3g，5mmol)和化合物8(0.97g，6mmol),和t BuONa(0.7g，7mmol)和P(t-Bu)3(15mg)在甲苯(60mL)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd2(dba)3(23mgl)，并在回流下搅拌12小时。过滤掉固体后，浓缩过滤物至干。通过柱纯化残余物得到产物9。 
7.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001953
实验细节：在-30℃和N2气氛下，用BBr3(146mg，0.6mmol)处理化合物9(200mg，0.58mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液，然后室温下搅拌4小时。将反应物倒入冰-水中然后加入Na2CO3。用二氯甲烷萃取(25mL×3)所得的混合物，用Na2SO4干燥合并的有机层。过滤掉Na2SO4后，浓缩过滤物得到粗产物10。 
8.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001954
实验细节：在回流下搅拌化合物10(48.7mg，0.2mmol)和化合物4(63mg，0.2mmol)在无水CH2Cl2(300mL)中的溶液6小时。减 压下除去溶剂。通过制备-TLC分离残余物得到所需的化合物。 
实施例27. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001961
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001962
实验细节：回流加热3(2.4g，11mmol)和甲基肼(2g，45mmol)在乙醇(40mL)中的溶液6小时。冷却和沉淀后，通过过滤收集沉淀并用乙醇洗涤得到化合物2。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001963
实验细节：回流搅拌化合物2(28mg，0.1mmol)和化合物3(37mg，0.1mmol)在无水CH2Cl2(300mL)中的溶液6小时。减压下除去溶剂。通过制备-TLC分离残余物得到所需的化合物。 
实施例28. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001964
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001971
实验细节：在-20℃下用MeMgCl(15mL.0.038mol)处理1(2g，0.011mol)在无水THF(100mL)中的溶液，并在该温度下搅拌2小时。通过加入饱和的NH4Cl水溶液淬灭反应混合物。用乙酸乙酯(100mL×3)萃取所得的混合物。用盐水洗涤合并的有机层。减压下除去溶剂得到化合物2。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001972
实验细节：在痕量的TsOH存在下加热化合物2(2g，0.01mol)和乙二醇(3g，0.048mol)在苯胺(100mL)中的溶液3小时。用乙酸乙酯(100mL)稀释反应混合物并用5%Na2CO3水溶液洗涤。分离有机层并用Na2SO4干燥。浓缩溶剂得到化合物3。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001973
实验细节：在N2气氛下，向化合物3(0.4g，1.6mmol)和化合物4(0.3g，1.9mmol),及t BuONa(0.22g，2mmol)和P(t-Bu)3(59mg)在甲苯(30mL)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd2(dba)3(29mgl)，并在回流下搅拌12小时。过滤掉固体后，浓缩过滤物至干。通过柱纯化残余物得到产物5。 
4.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001974
实验细节：在-30℃和N2气氛下用BBr3(146mg，0.6mmol)处理化合物5(100mg，0.3mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液，然后室温下搅拌4小时。将反应物倒入冰-水中然后加入Na2CO3。用二氯甲烷萃取(25mL×3)所得的混合物，用Na2SO4干燥合并的有机层。过 滤掉Na2SO4后，浓缩过滤物得到粗产物6。 
5.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001981
实验细节：在回流下搅拌化合物6(64mg，0.2mmol)和化合物7(45mg，0.2mmol)在无水CH2Cl2(300mL)中的溶液6小时。减压下除去溶剂。通过制备-TLC分离残余物得到所需的化合物。 
实施例29. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001982
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001983
实验细节：在回流下将1(5.2g，22mmol)和2(2.44g，20mmol)在2M Na2CO3水溶液(25mL)和甲苯(40mL)中的混合物与Pd(PPh3)4(0.57g，0.05mmol)搅拌过夜。用乙酸乙酯(100mL×3)萃取反应混合物。用盐水洗涤合并的有机层。减压下除去溶剂至干。通过柱纯化残余物得到3。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001984
实验细节：在-60℃和N2气氛下，用n-BuLi(1.5mL，3.75mmol)处理化合物3(0.78g，3.3mmol)和三异丙基硼酸酯(1mL，4mmol)在无水甲苯(50mL)中的溶液。完全加成后，在-10℃下搅拌该混 合物1小时。通过添加2M HCl水溶液淬灭反应混合物并用甲苯洗涤。通过添加Na2CO3使得水层pH=8，然后用乙酸乙酯(50mL×3)萃取。用盐水洗涤合并的有机层。减压下除去溶剂至干。通过柱分离残余物得到4。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001991
实验细节：在回流下将化合物4(2.8g，14mmol)和化合物5(7g，42mmol)在2M Na2CO3水溶液(250mL)和甲苯(40mL)中的搅拌和脱气的混合物与Pd(PPh3)4(0.57g，0.05mmol)搅拌过夜。用乙酸乙酯(100mL×3)萃取反应混合物。用盐水洗涤合并的有机层。减压下除去溶剂至干。通过柱分离残余物得到6。 
4.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001992
实验细节：在回流下搅拌6(0.53g，1.9mmol)和肼(0.52g，8.8mmol)在乙醇(50mL)中的溶液6小时。冷却和沉淀后，通过过滤收集沉淀并用乙醇洗涤得到化合物7。 
5.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880001993
实验细节：在回流下搅拌化合物7(53mg，0.13mmol)和化合物8(79mg，0.13mmol)在无水CH2Cl2(300mL)中的溶液6小时。减压下除去溶剂。通过制备-TLC纯化残余物得到所需的化合物。 
实施例30. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880002001
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880002002
实验细节：在回流下将1(3.1g，13mmol)和2(1g，12mmpl)在2M Na2CO3水溶液(15mL)和甲苯(30mL)中的混合物与Pd(PPh3)4(0.4g，0.029mmol)搅拌过夜。用乙酸乙酯(100mL×3)萃取反应混合物。用盐水洗涤合并的有机层。减压下除去溶剂至干。通过柱分离残余物得到3。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880002003
实验细节：在-60℃和N2气氛下，用n-BuLi(12mL，30mmol)处理化合物3(2.0g，10mmol)和三异丙基硼酸酯(7mL，30mmol)在无水甲苯(50mL)中的溶液。完全加成后，在-10℃下搅拌该混合物1小时。通过添加2m HCl水溶液淬灭反应混合物,并用甲苯洗涤。通过添加Na2CO3使得水层pH=8，然后用乙酸乙酯(50mL×3)萃取。用盐水洗涤合并的有机层。减压下除去溶剂至干。通过柱分离残余物得到4。 
3.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880002004
实验细节：在回流下将化合物4(0.5g，3mmol)和化合物5(1.5g，9mmol)在2M Na2CO3水溶液(3.5mL)和甲苯(40mL)的搅拌和脱气的混合物与Pd(PPh3)4(94mg，0.003mmol)搅拌过夜。用乙 酸乙酯(100mL×3)萃取反应混合物。用盐水洗涤合并的有机层。减压下除去溶剂至干。通过柱纯化残余物得到6。 
4.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880002011
实验细节：在回流下搅拌6(0.24g，1mmol)和肼(0.3g，4.7mmol)在乙醇(50mL)中的溶液6小时。冷却和沉淀后，通过过滤收集沉淀并用乙醇洗涤得到化合物7。 
5.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880002012
实验细节：在回流下搅拌化合物7(70mg，0.29mmol)和化合物8(83mg，0.3mmol)在无水CH2Cl2(300mL)中的溶液6小时。减压下除去溶剂。通过制备-TLC纯化残余物得到所需的化合物。 
实施例31. 
1.反应流程： 
实验细节：向化合物2(0.83g，5mmol)在乙醇(100mL)的溶液中逐滴加入苄胺(0.54g，5mmol)。搅拌2小时后，用水稀释反应混合物。用乙酸乙酯(50mL×3)萃取所得的混合物。用Na2SO4干燥合并的有机层。浓缩溶剂得到化合物3。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880002021
实验细节：加热回流3(1.18g，5mmol)和肼(5ml)在乙醇(40mL)中的溶液6小时。冷却和沉淀后，通过过滤收集沉淀并用乙醇洗涤得到化合物4。 
3.反应流程： 
实验细节：在回流下搅拌化合物4(48.7mg，2mmol)和化合物5(63mg，0.2mmol)在无水CH2Cl2(300mL)中的溶液6小时。减压下除去溶剂。通过制备-TLC分离残余物得到所需的化合物。 
实施例32. 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880002023
1.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880002024
实验细节：向化合物1(0.83g，5mmol)在乙醇(100mL)的溶液中逐滴加入化合物2(0.35g，5mmol)。搅拌2小时后，用水稀释反应混合物。用乙酸乙酯(50mL×3)洗涤所得的混合物。用Na2SO4干燥合并的有机层。浓缩溶剂得到化合物3。 
2.反应流程： 
Figure DEST_PATH_GDA0000477717880002031
实验细节：加热回流3(1.0g，5mmol)和肼(5mL)在乙醇(40mL)中的溶液6小时。冷却和沉淀后，通过过滤收集沉淀并用乙醇洗涤得到化合物4。 
3.反应流程： 
Figure BDA0000440201980002032
实验细节：在回流下搅拌化合物4(480mg，2mmol)和化合物5(60mg，0.2mmol)在无水CH2Cl2(300mL)中的溶液6小时。减压下除去溶剂。通过制备-TLC分离残余物得到所需的化合物。 
将所有涉及的任意公开文献、专利或其它引用的参考文献引入本文作为参考。 
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Claims (13)

1.鉴定与第一化合物相比具有改进细胞特异性的化合物的方法，所述第一化合物为蛋白质的抑制剂并调节相应的表型反应，包括：
a)测量用所述第一化合物处理过的测试细胞的表型反应的调节；
b)测量用所述第一化合物处理过的对照细胞的表型反应的调节；
c)测量用受试化合物处理过的测试细胞的表型反应的调节；
d)测量用受试化合物处理过的对照细胞的表型反应的调节；
e)确定第一化合物的细胞特异性缺口和受试化合物的细胞特异性缺口；
和f)如果所述受试化合物的细胞特异性缺口大于所述第一化合物的细胞特异性缺口，则鉴定所述受试化合物具有改进的细胞特异性。
2.权利要求1的方法，其中细胞特异性缺口由所述对照细胞的IC50除以所述测试细胞的IC50来确定。
3.鉴定与第一化合物相比具有改进的细胞特异性的化合物的方法，所述第一化合物为蛋白质的活化剂并调节相应的表型反应，包括：
a)测量用所述第一化合物处理过的测试细胞的表型反应的调节；
b)测量用所述第一化合物处理过的对照细胞的表型反应的调节；
c)测量用受试化合物处理过的测试细胞的表型反应的调节；
d)测量用受试化合物处理过的对照细胞的表型反应的调节；
e)确定第一化合物的细胞特异性缺口和受试化合物的细胞特异性缺口；
和f)如果所述受试化合物的细胞特异性缺口大于所述第一化合物的细胞特异性缺口，则鉴定所述受试化合物具有改进的细胞特异性。
4.权利要求3的方法，其中所述细胞特异性缺口由所述测试细胞的IC50除以所述对照细胞的IC50来确定。
5.改进第一化合物优化的方法，所述第一化合物为蛋白质的抑制剂并调节相应的表型反应，包括：
a)测量所述第一化合物对测试细胞的表型反应的IC5O；
b)测量所述第一化合物对对照细胞的表型反应的IC5O；
c)测量具有与所述第一化合物相同骨架的受试化合物对所述测试细胞的表型反应的IC5O；
d)测量所述受试化合物对所述对照细胞的表型反应的IC5O；
和e)如果所述测试化合物的细胞特异性缺口大于所述第一化合物的细胞特异性缺口，则鉴定所述受试化合物为所述第一化合物的改进。
6.权利要求5的方法，其中所述蛋白质是P2lOBcr-Abl-T315I或pl90Bcr-Abl，其在相应的氨基酸位点包含相应苏氨酸到异亮氨酸的突变。
7.改进第一化合物优化的方法，所述第一化合物为蛋白质的活化剂并调节相应的表型反应，包括:
a)测量所述第一化合物对测试细胞的表型反应的IC5O；
b)测量所述第一化合物对对照细胞的表型反应的IC5O；
c)测量具有与所述第一化合物相同骨架的受试化合物对所述测试细胞的表型反应的IC5O；
d)测量所述受试化合物对所述对照细胞的表型反应的IC5O；
和e)如果所述测试化合物的细胞特异性缺口大于所述第一化合物的细胞特异性缺口，则鉴定受试化合物为第一化合物的改进。
8.权利要求5-7中任一项的方法，其包括选择步骤(e)的优化化合物并重复步骤(a)-(d)。
9.权利要求5-7中任一项的方法，其中所述蛋白质为theramutein。
10.权利要求5-7中任一项的方法，其中所述受试化合物的IC50高于所述第一化合物。
11.权利要求5-7中任一项的方法，其中所述的受试化合物的IC50低于所述第一化合物。
12.确定一种物质是否是蛋白质的特异性抑制剂的方法，所述蛋白质能引起可检测的表型反应，其包括：
a)温育测试细胞，所述测试细胞表达所述蛋白质并能用所述物质引起与该细胞中所述蛋白质的存在和功能活性相关的表型反应；
b)温育对照细胞，所述对照细胞在更低水平表达或不表达所述蛋白质并能以更低程度引起或完全不引起与细胞中所述蛋白质的存在和功能活性相关的可检测的表型反应；
c)比较用所述物质处理过的所述测试细胞的表型反应与用所述物质处理过的所述对照细胞的表型反应；
和d)如果所述物质能调节所述测试细胞表型反应的程度大于所述对照细胞，则确定所述物质是所述蛋白质的特异性抑制剂。
13.确定一种物质是否是蛋白质的特异性活化剂的方法，所述蛋白质能引起可检测的表型反应，其包括:
a)温育测试细胞，所述测试细胞表达所述蛋白质并能用所述物质引起与该细胞中所述蛋白质的存在和功能活性相关的表型反应；
b)温育对照细胞，所述对照细胞在更低水平表达或不表达所述蛋白并能以更低程度引起或完全不引起与该细胞中所述蛋白质的存在和功能活性相关的可检测的表型反应；
c)比较用所述物质处理过的所述测试细胞的表型反应与用所述物质处理过的所述对照细胞的表型反应；
和d)如果所述物质能调节所述测试细胞表型反应的程度大于所述对照细胞，则确定所述物质是所述蛋白质的特异性活化剂。
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