CN101296912B

CN101296912B - Theramutein调节剂

Info

Publication number: CN101296912B
Application number: CN2006800403504A
Authority: CN
Inventors: 杰勒德·M·豪斯
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-08-29
Filing date: 2006-08-29
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2026-08-29
Also published as: CN101296912A; ZA200802433B

Abstract

本发明涉及为内源性蛋白质的变体形式抑制剂或活化剂的活性剂和鉴定这类变体新方法。特别关注由已经突变的基因编码的内源性蛋白质变体的抑制剂和活化剂，所述的变体通常在接触化学活性剂后产生或至少当已经产生时被首次鉴定，所述的化学活性剂为相应的未突变内源性蛋白质的抑制剂或活化剂。

Description

THERAMUTEIN调节剂

本申请是2005年5月23日提交的PCT国际申请PCT/US2005/18412的部分继续申请，并要求2005年8月29日提交的U.S.Ser.No.60/712,742、2005年11月23日提交的U.S.Ser.No.60/739,477、2005年9月9日提交的U.S.Ser.No.60/715,517、2005年11月23日提交的U.S.Ser.No.60/739,476、2005年12月2日提交的U.S.Ser.No.60/741,767、2005年12月16日提交的U.S.Ser.No.60/751,030、2006年3月13日提交的U.S.Ser.No.60/783,106、2006年3月23日提交的U.S.Ser.No.60/785,904、2006年3月23日提交的U.S.Ser.No.60/785,817、和2006年4月4日提交的U.S.Ser.No.60/789,379的优先权。

发明背景

患者中耐药性的进行性发展为使用许多类型药物长期治疗的标志，尤其是在癌症和感染性疾病的治疗领域中。已经鉴定了介导某些类型的耐药性现象的分子机制，而在其它情况中，获得的以及重新形成的耐受性的机制目前仍然未知。

最初认为在癌症疗法领域中相关的诱导的(获得的)耐药性的一种机制包括称作P-糖蛋白(P-gp)的蛋白质表达增加。P-gp位于细胞膜中并且起药物流出泵的作用。该蛋白质能够从细胞中泵出毒性化学活性剂，包括许多类型的抗癌药。因此，P-糖蛋白的增量调节通常产生对多种药物的耐药性。P-糖蛋白在肿瘤细胞中增量调节可以代表一种防御机制，该机制在哺乳动物细胞中发展以便防止受到毒性化学活性剂损害。目前已经鉴定了具有与P-gp类似的功能的其它相关耐药性蛋白质，包括多药物-抗性-相关蛋白家族成员，诸如MRP1和ABCG2。在任何情况下，在研发对指定靶蛋白具有特异性且毒性较低的化合物时，P-糖蛋白和相关ATP-结合弹夹(ABC)转运蛋白在临床显著性耐药性中的重要性已经下降。

另一种可能的获得性耐药的分子机制在于可选的信号途径导致持续的细胞存活和代谢，即使原始药物仍然对其靶标有效。此外，药物胞内代谢的改变也可以导致治疗功效丧失。此外，可以发生基因表达和基因扩增结果的改变，从而导致指定靶蛋白的表达增加或减少，并且通常需要增加药物剂量以便维持相同作用(Adcock和Lane，2003)。

突变诱导的耐药性通常为感染性疾病领域中出现的情况。例如，已经研发了几种抑制在人免疫缺陷(HIV)病毒基因组中编码的病毒逆转录酶或病毒蛋白酶的药物。在文献中充分确立了使用例如逆转录酶抑制剂反复治疗HIV-感染的AIDS患者最终产生了对药物的敏感性减低的病毒突变体形式。已经在编码逆转录酶的基因中出现的突变赋予所述酶的突变体形式受药物的影响降低。

考虑到错误被引入HIV基因组的比例，在HIV治疗过程中耐药性的出现并不令人意外。已知HIV逆转录酶特别具有错误趋向性，其中正向突变率约为3.4×10^-5种突变/碱基对/复制循环(Mansky等，J.Virol.69：5087-94(1995))。然而，在哺乳动物细胞中编码的内源性基因的类似突变率低一个数量级以上。

新的证据表明耐药性还可能因涉及编码药物靶标的基因的突变结果产生(Gorre等，Science，2001；PCT/US02/18729)。在这种情况中，使患者接触具体的治疗物质，诸如靶向特异性所关注的蛋白质(POI或″靶″蛋白)的指定癌症药物后，隐含在编码为治疗物质靶标的蛋白质的基因中出现的突变的一组细胞的过度生长。目前还不了解该细胞群的过度生长是否因已经隐含产生药物抗性的POI的突变的患者的小百分比的预先存在的细胞所致，或这类突变是否在动物或人接触能够活化或抑制所述POI的治疗剂过程中或之后重新产生。任一情况中，这类突变结果均可以产生突变的蛋白(下文定义为theramutein)，它受所述治疗物质的影响程度较低或可能完全不受影响。

慢性髓细胞性白血病(CML)的特征在于在该病稳定或慢性期过程中保持分化能力的骨髓先祖(progenitor)过度增殖。多线证据已经确立了作为某些形式的CML中的致病性癌基因的Abl酪氨酸激酶的失调。这种失调通常与称作费城染色体(Ph)的染色体易位相关，导致由与Abelson酪氨酸激酶融合的BCR基因产物组成的融合蛋白表达，由此形成具有酪氨酸激酶活性的p210^Bcr-Abl。相关的融合蛋白称作p190^Bcr-Abl，其由BCR基因中的不同断点产生并且已经证实出现在具有费城染色体阳性(Ph+)的急性成淋巴细胞性白血病(ALL)的患者中(Melo，1994；Ravandi等，1999)。转化看起来因多信号途径，包括那些涉及RAS、MYC和JUN的途径活化所致。甲磺酸伊马替尼(“STI-571”或

)为靶向Abl的激酶结构域的ATP结合位点的2-苯氨基嘧啶(Druker等，NEJM 2001，p.1038)。随后还通过其它方法已经发现了血小板衍生的生长因子(PDGF)β受体的抑制剂和Kit酪氨酸激酶，其中后者涉及胃肠道间质瘤的发生(参见下文)。

直到近期为止，尚未观察到在使用指定内源性细胞蛋白的特异性抑制剂治疗的过程中，其相应的内源性基因中的突变可以导致蛋白质不同的表达，所述蛋白质变体的细胞功能耐受所述抑制剂。CharlesSawyers和同事所做的工作(Gorre等，Science 293：876-80(2001)；PCT/US02/18729)首次证实了使用能够抑制p210^Bcr-Abl酪氨酸激酶的药物(即STI-571)治疗患者后，在编码产生p210^Bcr-Abl癌的含有Abelson酪氨酸激酶结构域的靶蛋白的基因中隐含突变的所述患者中可能出现具有临床意义的细胞群。各种这类突变产生p210^Bcr-Abl的突变体形式，它们对Gleevec治疗的反应性低于产生最初癌症的形式。值得注意的是，出现的突变对突变蛋白赋予了对蛋白激酶抑制剂药物作用的相对抗性，同时维持了一定程度的突变蛋白激酶的原始底物特异性。在Gorre等的工作前，本领域技术人员一般认为可以在接触抑制Abelson蛋白激酶的化合物，诸如STI-571的患者中观察到的抗性类型可能因上述药物抗性的其它机制中的一种或多种或由某些其它尚不了解的机制导致，但在任何情况下，所述的抗性均可以涉及不同于药物靶标POI的靶标(蛋白质或其它)。

因此，治疗临床相关的还为现存疗法靶标的蛋白质突变体形式可能极为有用。这类突变蛋白(如下文定义的theramuteins)正在被公认和理解为复发性癌症中的重要靶标，并且还在其它疾病中变得具有重要性。存在对治疗剂的需求，这类治疗剂对可能在一般有效药物疗法之前、过程中或之后产生的细胞蛋白的这类药物抗性变体形式具有活性。本发明的关键目的在于提供可以用作用于克服在内源性出现的蛋白质中的突变-诱导的耐药性的可能治疗剂的化合物。

发明概述

本发明涉及为内源性蛋白质的变体形式的抑制剂或活化剂的活性剂。特别关注的是由已经突变的基因编码的内源性蛋白质变体的抑制剂和活化剂，所述的变体通常在接触已知为相应未突变内源性蛋白质的抑制剂或活化剂的化学活性剂后产生或至少在已经产生后首先得到鉴定。这类蛋白质变体(突变蛋白)在本文中称作″theramuteins″，它们可以自发在生物体内出现(并且在某些情况中预先存在突变)或所述的突变体可以作为使用当能够抑制所述theramutein的未突变形式(本文称作“prototheramutein”)的指定化学活性剂治疗生物体时产生的选择压力的结果产生。可以理解在某些情况中，prototheramutein可以为POI的“野生型″形式(例如因失调产生疾病的蛋白质)。在其它情况中，prototheramutein为引起疾病的“野生型”蛋白质的变体，它已经突变且由此促使作为所述在先突变结果的患病状态发生。Prototheramutein的后一种类型的一个实例为P210^BCR-ABL癌蛋白，并且在315位上隐含苏氨酸(T)到异亮氨酸(I)突变的这种蛋白质的突变体形式称作P210^{BCR-ABL-T315I}，并且为theramutein的一个实例。本文所用的命名“P210^BCR-ABL“与术语“p21^Bcr-Abl”、“野生型Bcr-Abl蛋白质”等为同义词。

Theramuteins为一类罕有的内源性蛋白质，它们隐含了赋予所述蛋白质对药物的抗性的突变，已知所述的药物以治疗有效方式抑制或活化它们的未突变对应体。目前已知编码少数几种这类蛋白质的内源性基因在某些情况下表现出这类突变。本发明涉及抑制Abelson酪氨酸激酶蛋白质的某些耐药性突变体(theramuteins)的组合物，所述的Abelson酪氨酸激酶蛋白质在文献中最初称作P210-Bcr-Abl，它涉及慢性髓细胞性白血病的发生。

本发明的方法特别涉及鉴定theramuteins的特异性抑制剂或特异性活化剂的方法。术语“特异性”在上下文中术语“抑制剂”或“活化剂”中的应用(参见下文中的定义)指的是所述的抑制剂或活化剂结合theramutein并且抑制或活化theramutein的细胞功能，但不结合和活化或抑制细胞中的各种其它蛋白质或非-蛋白质靶标。本领域技术人员充分了解，在医学文献中讨论蛋白质抑制剂或活化剂的作用时，在特异性抑制剂或特异性活化剂的概念和靶蛋白“特异性”的相关概念方面存在一定程度的可变性。因此，就本发明的目的而言，物质为指定theramutein的特异性抑制剂或特异性活化剂，条件是所述物质能够以指定浓度抑制或活化所述theramutein，使得相应的表型反应(phenoresponse)以适当方式得到调节，而在相同指定浓度下对相应对照细胞的表型反应(如果有的话)不具有可感觉到的作用，所述的相应对照细胞基本上不表达theramutein或其相应的prototheramutein。

在某些实施方案中，物质可以为prototheramutein和theramutein的调节剂。在其它实施方案中，除为prototheramutein和theramutein的调节剂外，物质还可以调节具有相似功能的蛋白质的活性。如上所述，除抑制p210^Bcr-Abl酪氨酸激酶外，甲磺酸伊马替尼还能够抑制在某些胃肠道间质瘤中超表达的c-kit癌基因产物(也为酪氨酸激酶)以及在某些慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)中表达的PDGFβ受体(也为酪氨酸激酶)。这类化合物有时称作“适度特异性”抑制剂。

本发明还提供了可以用于鉴定活化或抑制theramutein的物质的一般方法，所述的物质将theramutein活化或抑制到相同程度、并且优选到甚至大于能够抑制该蛋白质的相应″野生型″形式的已知药物物质的程度(然而，本领域技术人员充分了解这类蛋白质的所述″野生型″形式已经在产生所述蛋白质参与的相应疾病的过程中突变)。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式I的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中：

环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环；

X¹选自N、N-R⁰或C-R¹；

X²选自N、N-R⁰或C-R¹；

虚线表示任选的双键；

各个R¹独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR¹¹、-(CH₂)_pC(O)(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pC(O)N(R¹²)(R¹³)、-(CH₂)_pC(O)O(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pN(R¹¹)(CH₂)_qC(O)R¹¹、-(CH₂)_pN(R¹²)(R¹³)、-(CH₂)_pN(R¹¹)(CH₂)_qR¹¹、-N(R¹¹)SO₂R¹¹、-OC(O)N(R¹²)(R¹³)、-SO₂N(R¹²)(R¹³)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R¹基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环；

n为0-6；

各个R¹¹独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；

各个R¹²和R¹³独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R¹²和R¹³可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任选被1至3个独立选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR⁰、CO₂R⁰、C(O)R⁰、卤素、芳基和杂环的取代基取代；

p为0-4；

q为0-4；

R²选自-CR²¹ _a-、-NR²² _b-和-(C＝R²³)-；

各个R²¹独立地选自H、卤素、-NH₂、-N(H)(C_1-3烷基)、-N(C_1-3烷基)₂、-O-(C_1-3烷基)、OH和C_1-3烷基；

各个R²²独立地选自H和C_1-3烷基；

R²³选自O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

R³选自-CR³¹ _c-、-NR³² _d-、-SO₂-和-(C＝R³³)-；

各个R³¹基团选自H、卤素、-NH₂、-N(H)(R⁰)、-N(R⁰)₂、-O-R⁰、OH和C_1-3烷基；

各个R³²基团选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳基和杂环；

R³³选自O、S、N-R³⁴和N-OR⁰；

R³⁴选自H、NO₂、CN、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；

R⁴选自-CR⁴¹ _e-、-NR⁴² _f-、-(C＝R⁴³)-、-SO₂-和-O-；

各个R⁴¹选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和杂环；

各个R⁴²基团选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳基和杂环；

各个R⁴³各自选自O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

条件是当R²为-NR²² _b-且R⁴为-NR⁴² _f-时，R³不为-NR³² _d-；R³和R⁴不同时分别选自-(C＝R³³)-和-(C＝R⁴³)-；且R³和R⁴不同时选自-SO₂-；

R⁵选自-Y-R⁶和-Z-R⁷；

Y选自化学键、O、NR⁰；

R⁶选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；

Z为带有1-4个碳原子并且任选地被卤素、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、C(O)N(R⁰)₂、CN、CF₃、N(R⁰)₂、NO₂和OR⁰中的一个或多个取代的烃链；

R⁷为H或选自芳基和杂环；

各个R⁰独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环；

a为1或2；

b为0或1；

c为1或2；

d为0或1；

e为1或2；且

f为0或1。

本发明提供了治疗癌症和其它疾病的基础新方式，其中无论通过何种机制，使用现存的药物化合物治疗后均跟随可鉴定的(临床显著的)theramutein-介导的药物抗性，通过提供在theramuteins产生和照此鉴定时(Wakai等，2004报导了一个实例，其中theramutein可以在持续治疗方案过程中产生)或在表达theramutein的细胞的临床显著性群体过度生长前预先给予备选药物来进行。此外，如果对特定疾病的药物治疗在表达药物靶向的蛋白质的某种theramutein的个体亚群中有效性较低，那么本发明能够通过提供有效针对所述theramutein的备选药物物质来适应那些受试者的治疗。

本发明提供了测定化学活性剂作为细胞中theramutein的调节剂是否至少与作为已知的相应prototheramutein调节剂的物质同样有效的方法。该方法的一个实施方案包括使表达prototheramutein并且能够表现出反应性表型特征(与细胞中prototheramutein的功能相关)的对照细胞与已知的prototheramutein调节剂接触，使表达theramutein并且也能够表现出反应性表型特征(与细胞中theramutein的功能相关)的测试细胞与化学活性剂接触，并且比较测试细胞的反应与处理的对照细胞的反应；以便确定该化学活性剂作为theramutein的调节剂至少与作为已知的prototheramutein调节剂的物质同样有效。在某些其它实施方案中，一种类型的对照细胞可能完全不表达prototheramutein。在其它实施方案中，对照细胞可以表达的prototheramutein的量与测试细胞表达的theramutein的量大体相同。在其它实施方案中，在某些条件下，对照细胞能够表现出的反应性表型特征的程度与测试细胞大体相同。

本发明特别关注的Theramuteins为那些涉及调节功能的Theramuteins，诸如酶；蛋白激酶；酪氨酸激酶；受体酪氨酸激酶；丝氨酸苏氨酸蛋白激酶；双向特异性蛋白激酶；蛋白酶；基质金属蛋白酶；磷酸酶；细胞周期控制蛋白；停靠蛋白质，诸如IRS家族成员；细胞表面受体；G-蛋白；离子通道；DNA-和RNA-结合蛋白；聚合酶等。不打算限止可以用于本发明的theramutein的类型。同时，已知三种theramuteins：BCR-ABL、c-Kit和EGFR。

可能与细胞中存在的theramutein(或prototheramutein)相关的任意反应性表型特征可以用于本方法，包括：例如生长或培养特性、theramutein底物的磷酸化状态(或其它修饰)和任意类型的细胞的暂时特征，正如所定义和详细讨论的。

附图描述

附图1显示了不同浓度的化合物2(C2)对未转化的载体对照Ba/F3细胞(为IL-3依赖性)以及表达″野生型″p210^Bcr-Abl的Ba/F3细胞(命名为p210^Bcr-Abl-wt)和表达p210^{Bcr-Abl-T315I}药物抗性突变株的Ba/F3细胞的生长和存活率的作用。如本说明书中详细描述的用自动化细胞计数器测定细胞计数和存活率。细胞计数由实心颜色条表示；细胞存活率由虚线条表示。注意STI-571有效抑制P210细胞系生长(灰色条)，而甚至在10μM浓度下也不能抑制T315I细胞系生长(白色条)。500nM C2在该剂量响应系列范围内表现出最大的特异性缺口。将10μM的STI-571与500nM的C2对T315I细胞系的作用进行比较(白色条)。缩写：DMSO：二甲亚砜(用于药物溶解的溶剂)。

附图2显示了不同浓度的化合物6(C6)对未转化的载体对照Ba/F3细胞以及表达p210^{Bcr-Abl-T315I}药物抗性突变株的Ba/F3细胞的生长和存活率的作用。所有其它详细描述均如附图1中所。

附图3显示了通过比较筛选中鉴定的不同化合物就其对表达prototheramutein和theramutein的细胞系中的作用而言得到的特异性缺口的不同测定结果。化合物3(C3)显示了用于鉴定化合物的能力的最佳实例，该化合物对theramutein所施加的作用甚至大于其相应对prototheramutein的作用。(E组).A组：对照组DMSO治疗；B：阴性异源特异性缺口；C：轻度阳性的异源特异性缺口；D：显著阳性的同源特异性缺口；E：阳性异源特异性缺口。参见用于解释的正文。

A组：对照组DMSO治疗；B：阴性异源特异性缺口；C：轻度阳性的异源特异性缺口；D：显著阳性的同源特异性缺口；参见解释部分。

附图4显示了用于自磷酸化活性检测的重组P210Bcr-Abl野生型和T315I突变体激酶结构域的放射自显影照片。将200ng蛋白质预先与测试物质在标准自磷酸化反应条件下一起温育10分钟，然后加入放射性标记的ATP并使反应在30℃下进行30分钟，此后通过SDS-PAGE分离样品。将凝胶进行银染色，在真空中干燥并且接触X-光片。注意在10μMSTI 571对野生型P210 Bcr-Abl有效的同时，它实际上在浓度甚至达100μM时对T315I激酶结构域无效。C2和C6为最佳的两种鉴定的化合物，随后是C5、C7和C4。所有这些化合物均测试显阳性至一定程度。“P210细胞系”指的是表达p210^BCR-ABL-wt的细胞。“T315I细胞系”指的是表达p210^{BCR-ABL-T315I}的细胞。

附图5表示本发明有代表性的化合物的化学结构。

附图6表示本发明有代表性的化合物的化学结构。

附图7表示本发明有代表性的化合物的化学结构。

附图8表示本发明有代表性的化合物的化学结构。

附图9表示本发明有代表性的化合物的化学结构。

附图10表示本发明有代表性的化合物的化学结构。

附图11表示本发明有代表性的化合物的化学结构。

附图12表示本发明有代表性的化合物的化学结构。

附图13表示本发明有代表性的化合物的化学结构。

发明详述

本文所用的术语“卤素(halo)”或“卤素(halogen)”包括氟、氯、溴和碘。

本文所用的术语“烷基”关注的是带有1-6个碳原子的取代和未被取代的直链和支链烷基。优选的烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基等。另外，烷基可以任选地被一个或多个选自卤素、CN、CO₂R、C(O)R、C(O)NR₂、NR₂、环-氨基、NO₂和OR的取代基取代。

本文所用的术语“环烷基”关注的是取代和未被取代的环烷基。优选的环烷基为那些含有3-7个碳原子的单环，并且包括环丙基、环戊基、环己基等。其它环烷基可以选自C₇-C₁₀双环系或C₉-C₁₄三环系。另外，环烷基可以任选地被一个或多个选自卤素、CN、CO₂R、C(O)R、C(O)NR₂、NR₂、环-氨基、NO₂和OR的取代基取代。

本文所用的术语“链烯基”关注的是取代和未被取代的直链和支链烯基团。优选的链烯基为那些含有2-6个碳原子的链烯基。另外链烯基可以任选地被一个或多个选自卤素、CN、CO₂R、C(O)R、C(O)NR₂、NR₂、环-氨基、NO₂和OR的取代基取代。

本文所用的术语“炔基”关注的是取代和未被取代的直链和支链炔基。优选的炔基为那些含有2-6个碳原子的炔基。另外，炔基可以任选地被一个或多个选自卤素、CN、CO₂R、C(O)R、C(O)NR₂、NR₂、环-氨基、NO₂和OR的取代基取代。

本文所用的术语“芳烷基”关注的是带有芳族基团作为取代基的烷基，所述的芳族基团可以被取代和未被取代。芳烷基可以任选地在芳基上被一个或多个取代基取代，所述的取代基选自卤素、CN、CF₃、NR₂、环-氨基、NO₂、OR、CF₃、-(CH₂)_xR、-(CH₂)_xC(O)(CH₂)_yR、-(CH₂)_xC(O)N(R′)(R″)、-(CH₂)_xC(O)O(CH₂)_yR、-(CH₂)_xN(R′)(R″)、-N(R)SO₂R、-O(CH₂)_xC(O)N(R′)(R″)、-SO₂N(R′)(R″)、-(CH₂)_xN(R)-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_xN(R)-C(O)-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_xN(R)-C(O)-O-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_x-C(O)-N(R)-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_xC(O)N(R)-(CH₂)_y-R、-O-(CH₂)_x-C(O)-N(R)-(CH₂)_y-R、取代和未被取代的烷基、取代和未被取代的环烷基、取代和未被取代的芳烷基、取代和未被取代的链烯基、取代和未被取代的炔基、取代和未被取代的芳基和取代和未被取代的杂环，其中所述取代的烷基、取代的环烷基、取代的芳烷基、取代的链烯基、取代的炔基、取代的芳基和取代的杂环可以被卤素、CN、CF₃、CO₂R、C(O)R、C(O)NR₂、NR₂、环-氨基、NO₂和OR中的一个或多个取代。

本文所用的术语“杂环基”或″杂环″关注的是带有至少一个杂原子作为环成员的芳族和非-芳族环状基团。优选的杂环基为那些含有5或6个环原子的包括至少一个杂原子的杂环基，并且包括：环状胺类，诸如吗啉代、哌啶子基、吡咯烷并等；和环醚类，诸如四氢呋喃、四氢吡喃等。芳族杂环基，也称作“杂芳基”关注的是可以包括1-3个杂原子的单-环杂-芳族基团，例如吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪、嘧啶等。本文所用的术语杂芳基还包括带有两个或多个环的多环杂-芳族系统，其中的两个原子为两个相邻的环共用(这些环是″稠合的″)，其中环中的至少一个为杂芳基，例如其它环可以为环烷基、环烯基、芳基、杂环和/或杂芳基。多环杂芳族系统的实例包括喹啉、异喹啉、四氢异喹啉、喹喔啉、quinaxoline、苯并咪唑、苯并呋喃、嘌呤、咪唑并吡啶、苯并三唑等。另外，杂环基可以任选地被如下基团取代：卤素、CN、CF₃、NR₂、环-氨基、NO₂、OR、CF₃、-(CH₂)_xC(O)(CH₂)_yR、-(CH₂)_xC(O)N(R′)(R″)、-(CH₂)_xC(O)O(CH₂)_yR、-(CH₂)_xN(R′)(R″)、-N(R)SO₂R、-O(CH₂)_xC(O)N(R′)(R″)、-SO₂N(R′)(R″)、-(CH₂)_xN(R)-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_xN(R)-C(O)-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_xN(R)-C(O)-O-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_x-C(O)-N(R)-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_xC(O)N(R)-(CH₂)_y-R、-O-(CH₂)_x-C(O)-N(R)-(CH₂)_y-R，取代和未被取代的烷基、取代和未被取代的环烷基、取代和未被取代的芳烷基、取代和未被取代的链烯基、取代和未被取代的炔基、取代和未被取代的芳基和取代和未被取代的杂环，其中所述取代的烷基、取代的环烷基、取代的芳烷基、取代的链烯基、取代的炔基、取代的芳基和取代的杂环可以被卤素、CN、CF₃、CO₂R、C(O)R、C(O)NR₂、NR₂、环-氨基、NO₂和OR中的一个或多个取代。

本文所用的术语“环-氨基”关注的是带有至少一个氮原子作为环成员的芳族和非-芳族环状基团。优选的环氨基为那些含有5或6个环原子的包括至少一个氮原子的环氨基，并且包括：吗啉代、哌啶子基、吡咯烷并、哌嗪并、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪、嘧啶等。此外，环-氨基可以任选被卤素、CN、CF₃、NR₂、NO₂、OR、CF₃、取代和未被取代的烷基、取代和未被取代的环烷基、取代和未被取代的芳烷基、取代和未被取代的链烯基、取代和未被取代的炔基、取代和未被取代的芳基、和取代和未被取代的杂环取代，其中取代的烷基、取代的环烷基、取代的芳烷基、取代的链烯基、取代的炔基、取代的芳基和取代的杂环可以被一个或多个卤素、CN、CF₃、CO₂R、C(O)R、C(O)NR₂、NR₂、NO₂和OR取代。

本文所用的术语“芳基”或“芳族基团”关注的是单-环芳族基团(例如苯基、吡啶基、吡唑基等)和多环环系(萘基、喹啉等)。多环可以带有两个或多个环，其中的两个原子为两个相邻的环共用(这些环是″稠合的″)，其中环中的至少一个为芳族环，例如其它环可以为环烷基、环烯基、芳基、杂环和/或杂芳基。另外，芳基可以任选地被一个或多个取代基取代，所述的取代基选自卤素、CN、CF₃、NR₂、环-氨基、NO₂、OR、CF₃、-(CH₂)_xC(O)(CH₂)_yR、-(CH₂)_xC(O)N(R′)(R″)、-(CH₂)_xC(O)O(CH₂)_yR、-(CH₂)_xN(R′)(R″)、-N(R)SO₂R、-O(CH₂)_xC(O)N(R′)(R″)、-SO₂N(R′)(R″)、-(CH₂)_xN(R)-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_xN(R)-C(O)-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_xN(R)-C(O)-O-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_x-C(O)-N(R)-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_xC(O)N(R)-(CH₂)_y-R、-O-(CH₂)_x-C(O)-N(R)-(CH₂)_y-R、取代和未被取代的烷基、取代和未被取代的环烷基、取代和未被取代的芳烷基、取代和未被取代的链烯基、取代和未被取代的炔基、取代和未被取代的芳基和取代和未被取代的杂环，其中所述取代的烷基、取代的环烷基、取代的芳烷基、取代的链烯基、取代的炔基、取代的芳基和取代的杂环可以被卤素、CN、CF₃、CO₂R、C(O)R、C(O)NR₂、NR₂、环-氨基、NO₂和OR中的一个或多个取代。

本文所用的术语″杂原子″，特别是作为环杂原子指的是N、O和S。

各个R独立地选自H、取代和未被取代的烷基、取代和未被取代的环烷基、取代和未被取代的芳烷基、取代和未被取代的芳基和取代和未被取代的杂环，其中所述取代的烷基、取代的环烷基、取代的芳烷基、取代的芳基和取代的杂环可以被一个或多个卤素、CN、CF₃、OH、CO₂H、NO₂、C_1-6烷基、-O-(C_1-6烷基)、-NH₂、-NH(C_1-6烷基)和-N(C_1-6烷基)₂取代。各个R′和R″独立地选自H、或取代和未被取代的烷基、取代和未被取代的环烷基、取代和未被取代的芳烷基、取代和未被取代的芳基和取代和未被取代的杂环，其中所述取代的烷基、取代的环烷基、取代的芳烷基、取代的芳基和取代的杂环可以被一个或多个卤素、CN、CF₃、OH、CO₂H、NO₂、C_1-6烷基、-O-(C_1-6烷基)、-NH₂、-NH(C_1-6烷基)和-N(C_1-6烷基)₂取代；或R′和R″可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有至多三个额外杂原子的5-至7-元环，所述杂原子可以被C_1-6烷基取代。每个x和每个y独立地选自0-4。

其中：

环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环；

X¹选自N、N-R⁰或C-R¹；

X²选自N、N-R⁰或C-R¹；

虚线表示任选的双键；

各个R¹独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR¹¹、-(CH₂)_pC(O)(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pC(O)N(R¹²)(R¹³)、-(CH₂)_pC(O)O(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pN(R¹¹)(CH₂)_qC(O)R¹¹、-(CH₂)_pN(R¹²)(R¹³)、-N(R¹¹)SO₂R¹¹、-OC(O)N(R¹²)(R¹³)、-SO₂N(R¹²)(R¹³)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R¹基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环；

n为0-6；

p为0-4；

q为0-4；

R²选自-CR²¹ _a-、-NR²² _b-和-(C＝R²³)-；

各个R²²独立地选自H和C_1-3烷基；

R²³选自-O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

R³选自-CR³¹ _c-、-NR³² _d-、-SO₂-和-(C＝R³³)-；

R³¹基团各自选自H、卤素、-NH₂、-N(H)(R⁰)、-N(R⁰)₂、-O-R⁰、OH和C_1-3烷基；

R³²基团各自选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳基和杂环；

R³³选自O、S、N-R³⁴和N-OR⁰；

R⁴选自-CR⁴¹ _e-、-NR⁴² _f-、-(C＝R⁴³)-、-SO₂-和-O-；

各个R⁴³选自O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

R⁵选自-Y-R⁶和-Z-R⁷；

Y选自化学键、O、NR⁰；

R⁷为H或选自芳基和杂环；

R⁰各自独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环；

a为1或2；

b为0或1；

c为1或2；

d为0或1；

e为1或2；且

f为0或1。

本文所述的本发明中的重要组成部分和概念教导在于本发明化合物的R²和R³位置均非任意芳族或非-芳族环结构的成员。我们发现带有R²和/或R³位置作为任意芳族或非-芳族环结构的成员的化合物无法有效地抑制T315I theramutein，而除具有其它优选的活性基团外，在这些位置上缺乏这样的环成分的本发明化合物为T315I theramutein的有效抑制剂。

在本发明的优选实施方案中，环A为芳族环。

在本发明的优选实施方案中，X¹或X²为N。在另一个优选的实施方案中，X¹和X²均为N。在本发明特别优选的实施方案中，环A为吡啶环或嘧啶环。在进一步优选的实施方案中，环A选自如下提供的结构：

在本发明的优选实施方案中，R⁵是具有下面通式的基团：

其中：

X³为N或CH；

R⁶¹选自芳基和杂环；

Q选自化学键或具有式-O-、-(CH₂)_i-、-(CH₂)_iC(O)(CH₂)_j-、-(CH₂)_i-N(R⁶²)-(CH₂)_j-、-(CH₂)_iC(O)-N(R⁶²)-(CH₂)_j-、-(CH₂)_iC(O)O(CH₂)_j-、-(CH₂)_iN(R⁶²)C(O)-(CH₂)_j-、-(CH₂)_iOC(O)N(R⁶²)-(CH₂)_j-和-O-(CH₂)_i-C(O)N(R⁶²)-(CH₂)_j-的基团；

R⁶²选自H、烷基、芳基和杂环；

h为0至4；

i为0至4；且

j为0至4。

在本发明进一步优选的实施方案中，R⁵是具有下面通式的基团：

其中：

X³为N或CH；

Q¹选自化学键或具有式-O-、-CH₂-、-NH-、-C(O)-NH-、-C(O)O-、-NH-C(O)-、-OC(O)NH-和-O-C(O)NH-的基团；

各个R⁷⁰选自卤素、烷基、CN、N(R⁷¹)₂、环-氨基、NO₂、OR⁷¹和CF₃；

各个R⁷¹选自H、烷基、芳基、芳烷基和杂环；且k为0至4。

其中：

X³为N或CH；

R⁷⁰选自卤素、烷基、CN、N(R⁷¹)₂、环-氨基、NO₂、OR⁷¹和CF₃；且各个R⁷¹选自H、烷基、芳基、芳烷基和杂环。

在特别优选的实施方案中，做出了一个或多个的下述选择：Q¹为-NH-；X³为N；各个R⁷¹独立地选自H、甲基和乙基，且各个R⁷¹优选为甲基；和/或R⁷⁰选自OH、OCH₃、卤素和CF₃。

在一个优选的实施方案中，如果R²或R⁴被分别选为-NR²² _b-或-NR⁴²-，那么R³¹不选自卤素、-NH²、-N(H)(R⁰)、-N(R⁰)₂、-O-R⁰或OH。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式I_a的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中：

环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环；

X¹选自N、N-R⁰或C-R¹；

X²选自N、N-R⁰或C-R¹；

虚线表示任选的双键；

n为0-6；

p为0-4；

q为0-4；

各个R²²独立地选自H和C_1-3烷基；

R³选自-CR³¹ _c-、-NR³² _d-、-SO₂-和-(C＝R³³)-；

R³³选自O、S、N-R³⁴和N-OR⁰；

R⁴选自-CR⁴¹ _e-、-NR⁴² _f-、-(C＝R⁴³)-、-SO₂-和-O-；

各个R⁴³选自O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

条件是当R⁴为-NR⁴² _f-时，R³不为-NR³² _d-；R³和R⁴不同时分别选自-(C＝R³³)-和-(C＝R⁴³)-；且R³和R⁴不同时选自-SO₂-；

R³选自-Y-R⁶和-Z-R⁷；

Y选自化学键、O、N-R⁰；

R⁷为H或选自芳基和杂环；

a为1或2；

b为0或1；

c为1或2；

d为0或1；

e为1或2；且

f为0或1。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式I_b的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中：

环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环；

X¹选自N、N-R⁰或C-R¹；

X²选自N、N-R⁰或C-R¹；

虚线表示任选的双键；

R¹各自独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR¹¹、-(CH₂)_pC(O)(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pC(O)N(R¹²)(R¹³)、-(CH₂)_pC(O)O(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pN(R¹¹)(CH₂)_qC(O)R¹¹、-(CH₂)_pN(R¹²)(R¹³)、-N(R¹¹)SO₂R¹¹、-OC(O)N(R¹²)(R¹³)、-SO₂N(R¹²)(R¹³)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R¹基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环；

n为0-6；

p为0-4；

q为0-4；

各个R²²各自独立地选自H和C_1-3烷基；

R⁴选自-CR⁴¹ _e-、-(C＝R⁴³)-、-SO₂-和-O-；

R⁴¹各自选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和杂环；

各个R⁴³选自O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

R⁵选自-Y-R⁶和-Z-R⁷；

Y选自化学键、O、N-R⁰；

R⁷为H或选自芳基和杂环；

a为1或2；

b为0或1；

c为1或2；

d为0或1；

e为1或2；且

f为0或1。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式I_c的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中：

环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环；

X¹选自N、N-R⁰或C-R¹；

X²选自N、N-R⁰或C-R¹；

虚线表示任选的双键；

n为0-6；

p为0-4；

q为0-4；

X³为N、CH或C-R²；

各个R²独立地选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR²¹、-(CH₂)_rC(O)(CH₂)_sR²¹、-(CH₂)_rC(O)N(R²²)(R²³)、-(CH₂)_rC(O)O(CH₂)_sR²¹、-(CH₂)_rN(R²¹)C(O)R²¹、-(CH₂)_rN(R²²)(R²³)、-N(R²¹)SO₂R²¹、-OC(O)N(R²²)(R²³)、-SO₂N(R²²)(R²³)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R²基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环；

R²¹独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；

R²²和R²¹独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R²²和R²¹可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任选被1至3个独立选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR⁰、CO₂R⁰、C(O)R⁰、卤素、芳基和杂环的取代基取代；

r为0至4；

s为0至4；

m为0至4；

R⁴选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳基和杂环；

a为0或1；

X⁴选自：

各个R³独立地选自H、N(R⁰)₂、烷基、环烷基、链烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和杂环组成的组；

R³′选自H、N(R⁰)₂、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环；并且各个R⁰独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环。

在本发明的优选实施方案中，选择通式I的R²、R³和R⁴以便得到下列化学基团：

-N(R²²)-N＝C(R⁴¹)-

-N(R²²)-N(R³²)-C(＝O)-

-N(R²²)-N(R³²)-C(R⁴¹)(R⁴¹)-

-N(R²²)-C(R³¹)(R³¹)-C(R⁴¹)(R⁴¹)-

-N(R²²)-C(R³¹)(R³¹)-C(＝O)-

-N＝N-C(R⁴¹)(R⁴¹)-

-C(R²¹)＝C＝C(R⁴¹)-

-C(R²¹)＝C(R³¹)-C(＝O)-

-C(R²¹)＝C(R³¹)-C(R⁴¹)(R⁴¹)-

-C(R²¹)(R²¹)-C(R³¹)＝C(R⁴¹)-

-C(R²¹)(R²¹)-C(R³¹)(R³¹)-C(＝O)-

-C(R²¹)(R²¹)-C(R³¹)(R³¹)-C(R⁴¹)(R⁴¹)-

-C(R²¹)(R²¹)-N(R³²)-C(＝O)-

-C(R²¹)(R²¹)-N(R³²)-C(R⁴¹)(R⁴¹)-

-N(R²²)-C(＝O)-C(R⁴¹)(R⁴¹)-

-N(R²²)-C(＝O)-N(R⁴¹)-

-N(R²²)-C(＝O)-O-

-C(R²¹)(R²¹)-C(＝O)-C(R⁴¹)(R⁴¹)-

-C(R²¹)(R²¹)-C(＝O)-N(R⁴²)-

-N(R²²)-C(＝NR³⁴)-N(R⁴²)-

-C(＝O)-N(R³²)-N(R⁴²)。

用于R²、R³和R⁴的特别优选的化学基团包括：

-N(R²²)-N＝C(R⁴¹)-

-N(R²²)-N(R³²)-C(＝O)-

-N(R²²)-C(R³¹)(R³¹)-C(R⁴¹)(R⁴¹)-

-N(R²²)-C(R³¹)(R³¹)-C(＝O)-

-C(R²¹)(R²¹)-C(＝O)-C(R⁴¹)(R⁴¹)-

-C(R²¹)(R²¹)-C(＝O)-N(R⁴²)-

-N(R²²)-C(＝NR³⁴)-N(R⁴²)-

-C(＝O)-N(R³²)-N(R⁴²)。

在另一个优选的实施方案中，R⁶或R⁷为可以任选被取代的芳基。特别优选的芳基包括取代或未被取代的苯基和吡啶基。在额外或备选的实施方案中，优选取代基R²¹和R²²独立地选自具有小的空间体积的基团并且优选自H和CH₃，且更优选H。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式II的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中

环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环；

X¹选自N、N-R⁰或C-R¹；

X²选自N、N-R⁰或C-R¹；

虚线表示任选的双键；

n为0-6；

p为0-4；

q为0-4；

R⁸选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和杂环组成的组；

R⁹选自-Y-R⁶和-Z-R⁷；

Y选自化学键、O、N-R⁰；

R⁷为H或选自芳基和杂环；且

各个R⁰独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式II_a的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中

环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环；

X¹选自N、N-R⁰或C-R¹；

X²选自N、N-R⁰或C-R¹；

虚线表示任选的双键；

R¹各自独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR¹¹、-(CH₂)_pC(O)(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pC(O)N(R¹²)(R¹³)、-(CH₂)_pC(O)O(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pN(R¹¹)C(O)R¹¹、-(CH₂)_pN(R¹²)(R¹³)、-N(R¹¹)SO₂R¹¹、-OC(O)N(R¹²)(R¹³)、-SO₂N(R¹²)(R¹³)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R¹基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环；

n为0-6；

p为0-4；

q为0-4；

X³为N、CH或C-R⁵⁰；

各个R⁵⁰独立地选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR⁵¹、-(CH₂)_rC(O)(CH₂)_sR⁵¹、-(CH₂)_rC(O)N(R⁵²)(R⁵³)、-(CH₂)_rC(O)O(CH₂)_sR⁵¹、-(CH₂)_rN(R⁵¹)C(O)R⁵¹、-(CH₂)_rN(R⁵²)(R⁵³)、-N(R⁵¹)SO₂R⁵¹、-OC(O)N(R⁵²)(R⁵³)、-SO₂N(R⁵²)(R⁵³)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R⁵⁰基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环；

R⁵¹选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；

R⁵²和R⁵³独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R⁵²和R⁵³可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任选被1至3个独立选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR⁰、CO₂R⁰、C(O)R⁰、卤素、芳基和杂环的取代基取代；

r为0-4；

s为0-4；

m为0-4；且

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式II_b的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中：

R¹⁴选自H和F；

X³为N、CH或C-R⁶⁰；

各个R⁶⁰独立地选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR⁰、卤素、芳基和杂环组成的组；

R⁶¹选自芳基和杂环；

R⁶²选自H、烷基、芳基和杂环；

h为0-4；

i为0-4；且

j为0-4。

在通式II_b化合物的优选实施方案中，R⁶⁰选自卤素、CF₃和OH。在其他优选的实施方式中，R⁸自H和CH₃。

在通式II_b化合物的优选实施方案中，X³为N。在进一步优选的实施方案中，Q选自-(CH₂)_i-N(R⁶²)-(CH₂)_j-、特别在优选的实施方案中，Q为-N(R⁶²)-。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式II_c的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中

环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环；

X¹选自N、N-R⁰或C-R¹；

X²选自N、N-R⁰或C-R¹；

虚线表示任选的双键；

各个R¹独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR¹¹、-(CH₂)_pC(O)(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pC(O)N(R¹²)(R¹³)、-(CH₂)_pC(O)O(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pN(R¹¹)C(O)R¹¹、-(CH₂)_pN(R¹²)(R¹³)、-N(R¹¹)SO₂R¹¹、-OC(O)N(R¹²)(R¹³)、-SO₂N(R¹²)(R¹³)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R¹基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环；

n为0-6；

p为0-4；

q为0-4；

R⁸选自H和甲基；

X³为N或CH；

R⁶¹选自芳基和杂环；

R⁶²选自H、烷基、芳基和杂环；

h为0-4；

i为0-4；且

j为0-4。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式II_d的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中：

环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环；

X¹选自N、N-R⁰或C-R¹；

X²选自N、N-R⁰或C-R¹；

虚线表示任选的双键；

n为0-6；

p为0-4；

q为0-4；

R⁸选自H和甲基；

X³为N或CH；

各个R⁷¹选自H、烷基、芳基、芳烷基和杂环；并且k为0-4。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式II_e的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中：

环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环；

X¹选自N、N-R⁰或C-R¹；

X²选自N、N-R⁰或C-R¹；

虚线表示任选的双键；

n为0-6；

p为0-4；

q为0-4；

R⁸选自H和甲基；

X³为N或CH；

各个R⁷¹选自H和烷基。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式II_f的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中：

R¹⁴选自H和F；

R⁸选自H和甲基；

各个R⁷¹选自H、烷基、芳基、芳烷基和杂环；并且k为0-4。

通式II、II_a、II_b、II_c、II_d、II_e或II_f的典型化合物包括下列结构：

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式III的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中

环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环；

X¹选自N、N-R⁰或C-R¹；

X²选自N、N-R⁰或C-R¹；

虚线表示任选的双键；

n为0-6；

p为0-4；

q为0-4；

R¹⁰选自-Y′-R¹⁸；

Y′选自化学键、O、NR⁰-和带有1-4个碳原子并且任选地被卤素、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、C(O)N(R⁰)₂、CN、CF₃、N(R⁰)₂、NO₂和OR⁰中的一个或多个取代的烃链；

R¹⁸选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CF₃、芳基和杂环组成的组；且

各个R⁰独立地选自H、烷基，环烷基、芳烷基、芳基和杂环。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式III_a的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中：

环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环；

X¹选自N、N-R⁰或C-R¹；

X²选自N、N-R⁰或C-R¹；

虚线表示任选的双键；

n为0-6；

p为0-4；

q为0-4；

X³为N、CH或C-R⁵⁰；

各个R⁵⁰独立地选自烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR⁵¹、-(CH₂)_rC(O)(CH₂)_sR⁵¹、-(CH₂)_rC(O)N(R⁵²)(R⁵³)、-(CH₂)_rC(O)O(CH₂)_sR⁵¹、(CH₂)_rN(R⁵¹)C(O)R⁵¹、-(CH₂)_rN(R⁵²)(R⁵³)、-N(R⁵¹)SO₂R₅₁、-OC(O)N(R⁵²)(R⁵³)、-SO₂N(R⁵²)(R⁵³)、卤素、芳基和杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R⁵⁰基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环；

r为0-4；

s为0-4；

m为0-4；且

各个R⁰各自独立地选自H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基和杂环。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式III_b的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中：

环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环；

X¹选自N、N-R⁰或C-R¹；

X²选自N、N-R⁰或C-R¹；

虚线表示任选的双键；

n为0-6；

p为0-4；

q为0-4；

X₃为N或CH；

R⁶¹选自芳基和杂环；

R⁶²选自H、烷基、芳基和杂环；

h为0-4；

i为0-4；且

j为0-4。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式III_c的P21^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中：

环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环；

X¹选自N、N-R⁰或C-R¹；

X²选自N、N-R⁰或C-R¹；

虚线表示任选的双键；

n为0-6；

p为0-4；

q为0-4；

X³为N或CH；

R⁷⁰各自选自卤素、烷基、CN、N(R⁷¹)₂、环-氨基、NO₂、OR⁷¹和CF₃；

R⁷¹各自选自H、烷基、芳基、芳烷基和杂环；且k为0至4。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式III_d的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中：

环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环；

X¹选自N、N-R⁰或C-R¹；

X²选自N、N-R⁰或C-R¹；

虚线表示任选的双键；

n为0-6；

p为0-4；

q为0-4；

R⁸选自H和甲基；

X³为N或CH；

Q¹选自化学键或具有式-O-、-CH²-、-NH-、-C(O)-NH-、-C(O)O-、-NH-C(O)-、-OC(O)NH-和-O-C(O)NH-的基团；

且R⁷¹各自选自H和烷基。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式III_e的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中：

R¹⁴选自H和F；

R⁷¹各自选自H、烷基、芳基、芳烷基和杂环；且k为0至4。

通式III、III_a、III_b、III_c、III_d或III_e的典型化合物包括下列结构：

在另一个实施方案中，本发明提供了具有通式IV的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中：

环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环；

X¹选自N、N-R⁰或C-R¹；

X²选自N、N-R⁰或C-R¹；

虚线表示任选的双键；

n为0-6；

各个R¹²和R¹³独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R¹²和R¹³可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；

p为0-4；

q为0-4；

R²²选自H和C_1-3烷基；

R⁴⁴选自H、烷基、环烷基、-(C＝O)R⁰、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；

R⁴⁵选自-Y″-R¹⁹；

Y″选自化学键、O、NR⁰-和带有1-4个碳原子并且任选被卤素、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、C(O)N(R⁰)₂、CN、CF₃、N(R⁰)₂、NO₂和OR⁰中的一个或多个取代的烃链；

R¹⁹选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、CF₃、芳基和杂环组成的组；且

通式IV的典型化合物包括下列结构：

在另一个实施方案中，本发明提供了具有通式V的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中：

环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环；

X¹选自N、N-R⁰或C-R¹；

X²选自N、N-R⁰或C-R¹；

虚线表示任选的双键；

n为0-6；

p为0-4；

q为0-4；

R²²选自H和C_1-3烷基；

R⁵⁵选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；

R⁵⁶选自-Y″-R¹⁹；

在另一个实施方案中，本发明提供了具有通式V_a的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中：

环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环；

X¹选自N、N-R⁰或C-R¹；

X²选自N、N-R¹或C-R¹；

虚线表示任选的双键；

n为0-6；

p为0-4；

q为0-4；

X³为N或C-R⁵⁰；

R⁵²和R⁵³各自独立地选自H、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和杂环；或R⁵²和R⁵³可以与它们所连接的氮一起形成可以任选地含有一个额外杂原子的5-至7-元环；

r为0-4；

s为0-4；

m为0-4；且

通式V或V_a的典型化合物包括下列结构：

在另一个实施方案中，本发明提供了具有通式VI的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中：

环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环；

X¹选自N、N-R⁰或C-R¹；

X²选自N、N-R⁰或C-R¹；

虚线表示任选的双键；

n为0-6；

p为0-4；

q为0-4；

R⁵⁶选自-Y″-R¹⁹；

在另一个实施方案中，本发明提供了具有通式VI_a的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中：

环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环；

X¹选自N、N-R⁰或C-R¹；

X²选自N、N-R⁰或C-R¹；

虚线表示任选的双键；

n为0-6；

p为0-4；

q为0-4；

X³为N或C-R⁵⁰；

r为0-4；

s为0-4；

m为0-4；且

通式VI或VI_a的典型化合物包括下列结构：

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有通式VII的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制剂：

其中：

环A为5-、6-或7-元环或7-至12-元稠合双环；

X¹选自N、N-R⁰或C-R¹；

X²选自N、N-R⁰或C-R¹；

虚线表示任选的双键；

n为0-6；

p为0-4；

q为0-4；

环B选自带有5或6个环原子的环烷基、和包括1至3个杂原子的含有5或6个环原子的杂环；

r为0-4；

s为0-4；

m为0-4；且

通式VII的典型化合物包括下列结构：

本文所用的每种表达方式的定义，例如烷基、m、n、R、R′等在任何结构中出现一次以上时，与其在同一结构中的其它处的定义无关。

就对结构I、I_a、I_b、II和II_a化合物的上述描述中的每一种而言，对术语卤素、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基、杂环基或杂环的每次叙述独立地选自本节开始部分中提供的这些术语的定义。

可以理解本文提供的化学结构包括如下隐含条件，即取代按照取代原子和取代基的允许价键进行并且取代产生稳定的化合物，例如，该化合物不会通过诸如重排、环化、消除等自发进行转化。

当本发明的化合物中存在一个或多个手性中心时，本文所述的通式包括各异构体及其混合物(例如外消旋物等)。

当本发明的化合物中存在一个或多个双键时，本文所述的通式包括顺式-和反式-异构体。尽管本文描述了顺式或反式(cis of trans)构型的化学结构(诸如，例如结构II、II_a、V、V_a、VI和VI_a)，两种构型的含义是每种通式均包括。

在某些实施方案中，本发明的化合物可以以几种互变异构体形式存在。因此，本文所述的化学结构包括所有可能的列举的化合物的互变异构形式。

本发明的化合物一般由商购原料和公知化学技术制备。可以如下合成本发明的实施方案。药物或合成化学领域技术人员易于熟知实施如下所述的合成手段所必不可少的操作步骤和技术。

可以通过在Gineinah等的p.562(Arch.Pharm.Pharm.Med.Chem.2002，11，556-562)所述相似的条件下使合适的肼化合物诸如A和合适的醛，诸如B反应制备通式II的化合物。

例如，在质子溶剂，诸如C₁-C₆醇中将A与1.1当量的B一起加热1-24小时，随后冷却并且收集沉淀，可以得到C。或者，可以通过蒸发溶剂并且通过使用硅胶、氧化铝或C₄-C₁₈反相介质的色谱法纯化分离产物C。类似方法可以适用于“芳基”被如R⁵中定义的其它基团取代的情况。

可以通过使合适的肼化合物，诸如D和活化的羧酸，诸如E反应制备通式III的化合物，其中LG为离去基团，诸如卤素、1-氧基苯并三唑、五氟苯氧基、对-硝基苯氧基等；或化合物E还可以为不对称羧酸酐，其中可以使用与Nair和Mehta的p.408(Indian J.Chem.1967 5，403-408)中所述相似的条件。

例如，在0℃-溶剂沸点的合适的温度下，在有碱，诸如吡啶或另一种叔胺存在和任选在有催化剂，诸如4-N，N-二甲氨基吡啶存在下的惰性溶剂，诸如二氯甲烷、1，2-二氯乙烷或N，N-二甲基甲酰胺中用活性酯，诸如芳基-C(O)-OC₆F₅处理D可以得到F，可以通过蒸发溶剂，随后使用硅胶、氧化铝或C₄-C₁₈反相介质的色谱法对其进行分离。易于由相应的羧酸和五氟苯酚，使用碳二亚胺，诸如二环己基碳二亚胺作为缩合试剂制备E的上述活性酯实例。

可以通过使合适的亲核体，例如，肼衍生物和在与氮原子相邻位置上带有卤素取代基的杂芳族化合物反应制备前体，诸如A和D。例如，可以使用与Wu等(J.Heterocyclic Chem.1990，27，1559-1563)、Breshears等(J.Am.Chem.Soc.1959，81，3789-3792)或Gineinah等(Arch.Pharm.Med.Chem.2002，11，556-562)所述类似的方法，由例如，2，4-二卤代嘧啶衍生物为原料制备化合物A和D的实例，所述原料中的许多为商购可得，或者易于由本领域技术人员制备。因此，用胺或其它亲核体(Z)，任选在有添加的碱存在下处理合适的2，4-二卤代嘧啶衍生物G，选择性取代嘧啶环上的4-卤素取代基。随后用第二种亲核试剂，诸如肼或肼衍生物任选在溶剂，诸如C₁-C₆醇和任选在有添加的碱存在下处理产物，取代嘧啶环上的2-卤素取代基，从而得到为上述结构A和D的实例的化合物。

可以通过诸如下列或其直接修饰的这类方法合成实施方案，其中R²为-NR²²且R³为-C(＝R³³)。可以以合适的环A衍生物J为原料进行合成，所述的环A衍生物J带有与必需的环氮相邻的离去基团(LG)。如上所述，上述结构G与结构G与亲核体Z的反应产物为这类合适的环A衍生物J的实例。合适的LG’基团为卤素、烷硫基、烷基磺酰基、烷基磺酸酯或芳基磺酸酯。用胺R¹²NH₂处理J对LG’进行取代得到中间体K。该化学转化的实例由Capps等在J.Agric.Food Chem.1993，41，2411-2415中报导，其中R¹²为H且LG’为CH₃SO₂-，并且R¹²为H且LG’为C1的实例报导在Marshall等的J.Chem.Soc.1951，1004-1015中。

通过同时或依次引入R³、R⁴和R⁵的元素，结构K的中间体转化成本发明的化合物。例如，用异氰酸酯R⁶-N＝C＝O各自处理结构K的中间体而在单一步骤中得到结构M的化合物，其为本发明的化合物，其中R²＝-NR²²-，R³＝-C＝O-，R⁴＝-NH-且R⁵＝-化学键-R⁶。将结构K的化合物转化成结构M的化合物的备选方法为本领域技术人员众所周知，其中，首先引入R³与离去基团(例如对-硝基苯氧基或氯)，随后用例如胺R⁶-NH₂取代离去基团以便引入R⁵和R⁶。

或者，一般在加热条件和任选在有溶剂，诸如乙酸乙酯或二噁烷存在下用试剂，诸如，氨基氰(NH₂-CN)处理结构K的中间体而得到中间体N。氨基氰的备选物为硝基胍或脒基磺酸(NH₂-C(＝NH)-SO₃H)。使用氨基氰进行这类转化的实例由Latham等在J.Org.Chem.1950，15，884中报导。使用硝基胍的实例由Davis在Proc.Natl.Acad.Sci.USA1925，11，72报导。脒基磺酸的应用由Shearer等Bioorg.Med.Chem.Lett.1997，7，1763报导。

按照将中间体A或D转化成由C或F表示的实施方案类似的方式，将中间体K分别转化成由P或Q表示的化合物，它们为本发明进一步的实施方案。

在上述方案中，用酮S处理A或K以便取代B，其中R如上所述，而分别得到结构T或U的化合物，它们为本发明进一步的实施方案。

用合适的还原剂诸如金属(硼、铝、硅等)氢化物试剂，优选一种具有碱性的还原剂选择性还原U的非-胍基碳-氮双键而得到本发明的化合物V。

可以如下制备本发明的实施方案，其中R²＝CO，R³＝-NR^32-，R⁴＝N-且R⁵＝ZR⁷，其中Z为烃链且R⁷如上所述。当R³²＝小时时，通过转化成相应的酰基氯或转化成活性酯或类似的活化衍生物来活化环A-衍生的羧酸W，上述过程中的许多为本领域众所周知．用肼处理活化的羧酸得到相应的酰肼Y。用醛或酮处理Y(如果必要，在加热条件和/或温和酸催化下)而得到所需的终产物Z。

如果不是商购可得，那么可以通过用氰化物离子处理上述原料J，任选通过加热或过渡金属催化以便用氰基残基取代离去基团LG’，制备环A-衍生的羧酸W。氰基的碱性或酸性水解得到酸性的羧酸中间体W。

当R³²不为H时，单取代的肼的被保护形式可以用于上述方案以便替代肼．因此，用R³²NHNH-PG，其中PG为氮保护基团，诸如苄氧羰基或叔-丁氧羰基处理来自W的活化羧酸，随后脱保护并且如上所述用合适的醛或酮处理而得到Z’，其为本发明的另一个实施方案。

有机合成领域技术人员显而易见，上述反应过程为列举的方法中合乎逻辑的扩展的一组广泛方法的代表。因此，通过上述方法的显而易见的变型可以制备本发明要求保护的引入额外的R²、R³、R⁴和R⁵变化形式的本发明进一步的实施方案。

作为本领域技术人员公认的，有利的是在获得终产物中使用临时的保护基团。本文所用的术语″保护基团″指的是可能的反应官能基团的临时变型，所述的反应官能基团可以防止不需要的化学转化。这类保护基团的实例包括羧酸的酯类、醇的甲硅烷基醚类以及醛和酮分别的缩醛类和酮缩醇类。已经综述了保护基团化学的领域(Greene，T.W.；Wuts，P.G.M.Protective Groups in Organic Synthesis，2^nd ed.；Wiley：New York，1991)。

“突变蛋白”为具有作为在相应基因中出现的作为突变结果而改变的氨基酸序列的蛋白质(Weigel等，1989)。这类突变可以导致编码的蛋白质特性中的一种或多种改变。例如，具有因一种或多种氨基酸改变产生的修饰的催化化学的酶变体为突变蛋白。

本发明涉及隐含至少一种氨基酸残基改变的蛋白质(术语″氨基酸序列改变(amino acid sequence change)”或″氨基酸序列改变(amino acid sequence alteration)″包括至少一种氨基酸残基的改变、缺失或添加，或缺失、添加、改变的任意组合)，以使所得突变蛋白相对于所述蛋白质的未-突变形式对治疗剂的敏感性而言变得(作为突变的结果)对已知治疗剂产生抗性。这种特定类型的突变蛋白在下文中称作theramutein，并且缺乏突变的相应的蛋白质在本文中称作prototheramutein。

本文所用的″prototheramutein″指的是在细胞中内源性出现的蛋白质，所述的细胞对赋予治疗化合物相对无敏感性(即抗性)的突变敏感，否则，所述的治疗化合物抑制或活化所述蛋白质。因此，″theramutein″指的是在含有相对于蛋白质的内源性形式而言至少一种氨基酸序列改变的细胞中内源性出现的蛋白质或蛋白质部分，其中在使至少一个人接触已知抑制或活化prototheramutein的物质后，所述的氨基酸序列改变得到或被鉴定或成为可鉴定，并且经显示或已经显示对指定疾病的发生或发展而言具有临床意义。就确定上句中的目的而言，唯一的是物质不需限于用于首次定义theramutein存在目的的化学活性剂。因此，作为定义，theramutein是在其相应的内源性基因中隐含了突变的蛋白质，其中所述的突变与患者对一般能够活化或抑制未-突变蛋白的药物发生临床耐受性相关。就指定的theramutein而言，本文所用的术语“相应的prototheramutein”指的是通过突变产生所述的theramutein的prototheramutein。类似地，就指定的prototheramutein而言，相应的theramutein”指的是通过由所述prototheramutein突变产生的theramutein。

因此，本领域技术人员显而易见，当编码theramutein的基因限于内源性出现的基因时，theramutein的定义不包括由导致疾病的病原体，诸如病毒和细菌编码的蛋白质。本文所用的术语″内源性基因″指的是自摄入以后已经至少以其未突变形式存在于生物体的染色体中的基因。本文所用的术语″细胞″指的是活的真核细胞，无论是在生物体，还是维持在生物体外合适的实验室组织或器官培养条件下。

在本发明的一个方面中，theramutein为相对于该蛋白质的通常存在的“野生型”形式(即prototheramutein)而言首次改变的蛋白质。在本发明的另一个方面中，theramutein为蛋白质变体(prototheramutein)，即其自身已经为突变蛋白。在另一个实施方案中，theramutein与先前存在的theramutein相比可以得到进一步突变。在这类情况中，可以将第一种theramutein(诸如p210BCR-ABL的T315I突变体(参见下文)视为″初级″theramutein，而随后(已经突变的)T315I变体的突变可以称作二级theramutein、三级theramutein等。作为下文中典型的，本发明的突变蛋白为脱离“野生型”Bcr-Abl抑制剂抑制的Bcr-Abl酪氨酸激酶的变体。这类Bcr-Abl突变蛋白相对于Bcr-Abl的更常见或“野生型”形式而言得到改变(也称作突变蛋白)，以这类方式改变蛋白质的特性。

可以理解主要关注的突变蛋白为相对于其prototheramutein而言具有相同、增加或减少的比活性，并且不受能够抑制prototheramutein的活性剂抑制或难以受到其抑制的theramutein。同样，另一种主要关注的theramutein为具有相同、增加或减少的比活性(相对于其prototheramutein而言)并且不受能够活化prototheramutein的活性剂活化或难以受到其活化的theramutein。其它变化形式对本领域技术人员而言显而易见。进一步理解theramuteins可以包括天然存在或通常观察到的蛋白质变体，例如，由特定基因的不同等位基因表达的变体。在某些情况中，这类变体就其正常细胞功能而言可能并不显著，其中功能差异仅在有差别抑制或活化变体细胞功能的活性剂存在下变得明显。例如，特定酶的天然存在的变体可以具有基本上不同的活性谱，但调节一种变体的治疗剂可能对调节另一种变体无效。

可以理解，本发明的一个方面在于鉴定针对在治疗指定疾病过程前或治疗指定疾病过程中产生或变得占优势(通过任何机制)的theramutein具有活性的活性剂，另一个方面在于鉴定针对在未受侵害个体群体中常见的突变蛋白具有活性的活性剂，但其中所述的突变蛋白对已经批准的药物的调节的敏感性较低，并且其中突变蛋白的活性谱变化在疾病状态中变得重要(且由此首次鉴定为theramutein)，诸如，在所述的疾病状态中，该突变蛋白得到超表达或参与信号传导过程，否则成为异常调节。例如，肿瘤性疾病可以因非theramutein或其prototheramutein的细胞成分的异常调节所致，并且仍然可使用prototheramutein抑制剂治疗，而相同的治疗对存在theramutein的情况有效性较低或无效。这可能是一种结果，其中观察到特定肿瘤类型对抗癌药的反应在个体中改变，所述的个体表达抗癌药定向于的酶的不同变体(Lynch等，2004)。在此处，变体在治疗疾病的过程中可以不产生或变得占优势，但预先存在于健康群体中并且仅根据其对建立的治疗的特定过程中改变的反应性来检测。

本文所用的术语蛋白质的“激动剂”和“活化剂”可以互换使用。活化剂(激动剂)限于结合和活化指定蛋白质功能的物质。除非另有说明，″活化剂″、″激动剂″和″蛋白质的活化剂″在含义上相同。通过活化剂激活可以是部分或完全的。同样，本文所用的术语蛋白质的“拮抗剂”和“抑制剂”可以互换使用。抑制剂(拮抗剂)限于结合和抑制指定蛋白质的功能的物质。描述物质“抑制”蛋白质指的含义是指该物质在细胞中结合蛋白质并且降低蛋白质的活性，但实质上不减少细胞中蛋白质的量。类似地，描述物质“活化”蛋白质，诸如prototheramutein或theramutein是指该物质增加细胞中蛋白质的限定的功能，但基本上不改变细胞中蛋白质的水平。除非另有说明，″抑制剂″、″拮抗剂″和″蛋白质的抑制剂″也为同义词。抑制剂的抑制可以为部分或完全的。调节剂为活化剂或抑制剂。作为实例，″PKC_β1的活化剂″应解释为指结合并且活化PKC_β1的物质。类似地，“p210^Bcr-Abl的抑制剂”为结合并且抑制p210^Bcr-Abl功能的物质。描述物质″抑制蛋白质″要求该物质结合所述蛋白质以便发挥其抑制作用。类似地，描述物质″活化蛋白质X″是指该物质结合并且活化蛋白质X。术语“结合(bind(s))”、“结合(binding)”和“结合(binds to)”在描述两种物质之间相互作用方面(例如酶-底物、蛋白质-DNA、受体-配体等)具有其在生物化学领域中通常的含义。本文所用的术语“结合(binds to)”在讨论物质与其相应靶蛋白之间相关性的上下文中和“与…相互作用”为同义词。本文所用的描述物质对蛋白质“起作用”、“影响”蛋白质、“发挥其对蛋白质的作用”等以及所有这类相关术语含义一致(正如本领域技术人员充分了解的)，即所述物质活化或抑制所述蛋白质。

首次定义了将内源性蛋白质的突变形式抑制或活化至大于相应未-突变对应蛋白(counterpart protein)的程度的概念，并且在本文中称作阳性″特异性缺口″。一般来说，并且以使用抑制剂的情况作为实例，特异性缺口指的是在本发明基于细胞的试验系统中抑制theramutein的可比的条件下，指定物质与如下情况之一相比的能力之间的差异：

a)在可比的条件下相同物质抑制prototheramutein的能力；或

b)在可比的条件下第二种物质(通常为prototheramutein的已知抑制剂)抑制theramutein的能力；或

c)在可比的条件下第二种物质抑制prototheramutein的能力。

当对两种不同物质(分别测试的)单独对theramutein的作用之间进行比较时，将结果称作同源性特异性缺口测定。

或者，当对两种不同物质(一般，但不总是)的作用之间进行比较时，分别将其中之一用于对theramutein的测试，而另一种用于对prototheramutein的测试，将结果称作异源性特异性缺口(SG)测定。因此，作为上述给出的(a)和(c)为异源性特异性缺口(SG)测定的实例(尽管在两种情况中均使用相同的物质)，而(b)为特异性特异性缺口测定的实例。

附图3涉及的内容为在理解和阐明这些概念中的信息。

在情况涉及活化剂时应用类似的结果。对本领域技术人员即刻显而易见的是，本文所用的术语“可比的条件”包括测试两种不同的化合物，例如在相同浓度下(诸如比较两种紧密相关的化合物以便测定相对功效)，或通过将两种在其相应IC₅₀值下测试的不同化合物对相应prototheramutein和theramutein的作用进行比较。本领域技术人员易于认可其它有用的变化形式和可比的条件。

因此，在该方法应用的一个实施方案中，对theramutein更为有效的物质具有″阳性特异性缺口″。“零、无效或无″特异性缺口表示在物质对theramutein的作用与其对prototheramutein的作用之间不存在显著的可测定的差异(不过，这类化合物可能在其抑制或活化theramutein及其相应prototheramutein的能力方面相当有用)，并且″阴性特异性缺口″表示在指定浓度下的物质对指定theramutein的有效性低于对theramutein的相应prototheramutein形式或另一种相当形式(诸如可以隐含一种不同的突变)的有效性。对后者化合物类别的关注程度一般低于前者化合物的类别，但除外以下情况：其中化合物如此有效，使得其对theramutein的相对较低作用从治疗功效的前景来看并无实际的担忧。本领域技术人员易于识别以适合于他或她需求的方式量化特异性缺口评价的各种手段。

本发明还提供了用于鉴定表现出所需特异性缺口的化合物的方式。鉴定这类化合物并且使用体外基于细胞的试验系统测定其抑制或活化theramutein的能力，其中将物质对该蛋白质的突变内源性形式的细胞功能的作用与相同药物对该蛋白质非-突变内源性形式的细胞功能的作用进行比较。

因此，所述系统能够发现这类化合物，所述化合物能够结合theramutein并且对所述theramutein的细胞功能发挥的调节作用大于对其相应prototheramute in的细胞功能发挥的调节作用。此外，该系统能够发现这类化合物，所述化合物能够结合theramutein并且对theramutein的细胞功能发挥的调节作用至少大于或大于上述已知化合物能够对相应prototheramutein的细胞功能发挥的调节作用。在本发明的一个具体的实施方案中，为以下结果筛选和鉴定化合物：1)对theramutein的有效性至少与原始药物对prototheramutein的有效性相同；和/或2)对prototheramutein的有效性与对theramutein的有效性类似(即展示出小或基本上为零的特异性缺口)。

在本发明的一个实施方案中，超表达所关注的theramutein的细胞用于鉴定为至少选择的theramutein的抑制剂或活化剂(即结合和抑制或结合和活化)的化学活性剂。这些化学活性剂还可以为prototheramutein乃至相同prototheramutein的其它theramuteins的抑制剂或活化剂。本文所用的术语″化学活性剂″和″化合物″可以互换使用，并且两术语仅指具有至多，但不一定包括2000原子质量单位(道尔顿)的分子量的物质。这类物质有时称作“小分子”。除非另有说明，本文所用的术语物质仅指化学活性剂/化合物，并且不指生物活性剂。本文所用的″生物活性剂″为包括蛋白质、多肽类和核酸的分子并且具有等于或大于2000原子质量单位(道尔顿)的分子。

在本发明的一个实施方案中，选择theramutein并且用于本发明基于表型反应的细胞测定系统，设计该系统是为了鉴定为theramutein的抑制剂或活化剂的活性剂。如果已知两种或多种不同theramuteins来源于相同的prototheramutein，那么优先选择最具有抗性的可利用theramutein用于试验系统。一般来说，使用首先给予并且已知抑制或活化prototheramutein且针对theramutein″出现″的药物测定theramutein与其未-突变对应体(prototheramutein)相比较对指定化学活性剂的抗性程度。例如，通过分析IC₅₀或AC₅₀值测定这类抗性程度的方法为众所周知的并且在本领域中是标准的，且在本文中未重复。然而，因果关系并非是必不可少的或应在使用自身指定的治疗剂治疗患者与随后theramutein的出现之间进行推断。而为实施本发明所需的是按照本文的教导适当选择正确的theramutein。

因此，例如，在实验室中产生，但尚未在临床相关性上得以证实的已知蛋白质的随机产生的定向位点突变体并非用于本发明范围内的合适的突变蛋白。当然，也不会将这类突变蛋白划分为theramuteins。

例如，在获得p21^Bcr-Abl突变体的潜在抑制剂的尝试中，Huron等(2003)使用了重组c-abl制品并且筛选了一系列已知抑制c-src酪氨酸激酶活性的化合物。作者对他们的化合物进行了c-abl激酶试验并且鉴定了在8nM时为对c-abl最有效的化合物。然而当测试该化合物(PD166326)抗各种p210^Bcr-Abltheramuteins时，它表现出对突变体中的某些，诸如p210^{Bcr-Abl-E255K}的活性，但发现p21^{Bcr-Abl-T315I}theramutein保留了10倍以上的抗性(Huron等2003，表3)。此外，在每种情况中，化合物对p210^Bcr-Abltheramuteins的作用仍然显著低于它对野生型p210^Bcr-Abl的作用。当测试化合物对p210^{Bcr-Abl-T315I}突变体的活性时，它不能将活性抑制到任何可评估的程度(p.1270，左手栏，第二段；另外，参见附图4)。因此披露的化合物能够抑制对STI-571产生部分抗性的theramutein，但对Bcr-Abl的T315I突变体无活性，在当时已知所述的theramutein为对STI-571表现出最大抗性的theramutein。因此，精确和简单而言，Huron的方法无法鉴定p210^Bcr-AblT315Itheramutein的有效抑制剂。

实际上，在披露本发明，包括本文首次描述的详述方法以及本文提供的组合物前，世界上尚无人在任何地方成功地鉴定一种化学活性剂，更不必说一种能够鉴定将p210^Bcr-AblT315Itheramutein有效抑制至等于或高于STI-571能够对野生型p210^Bcr-Abl蛋白质所抑制的程度的化学活性剂的方法(参见Shah等，Science，2004年8月；O′Hare等，Blood，2004；Tipping等，Leukemia，2004；Weisberg等，Leukemia，2004)。

不能过分强调这类化合物可能非常有用，因为目前尚无用于发展成p210^{Bcr-Abl-T315I}theramutein-介导的甲磺酸伊马替尼(imatinib)-抗性状态的患者的备选方法。一旦患者发生这类抗性，则没有可利用的其它有效备用手段，且死亡是肯定的。本文所述的方法提供了用于鉴定、从药理学方式上表征和化学合成p210^{Bcr-Abl-T315I}theramutein的有效抑制剂的第一个报导的方法。此外，本领域技术人员立即认可了这种手段在任何高度药物抗性theramutein中的可应用性和会推广性。

在本发明中，使用展示出谨慎选择的表型特征(如下所述)的测试细胞，所述的特征与在适当条件下细胞中特定所关注的theramutein(TOI)的存在和功能活性相关。从定性上看，这一结果与表达prototheramutein的细胞展示出的表型特征相同。表型特征(即细胞的非-基因型特征)为观察到(测定的)、选择和/或随后用于如本文所述试验方法限定的特性。表型特征的表达是对细胞中theramutein的总体活性的反应，并且为theramutein的绝对量及其比活性的结果。表型特征通常可作为theramutein活性水平升高的结果观察到并且在表达少量theramutein或少量其相应的prototheramutein的细胞中并不明显。此外，通常可以证实通过用theramutein的抑制剂或活化剂调节theramutein的比活性调节表型特征，不过，这并非是始终如一的情况，因为TOI的抑制剂或活化剂在本领域技术人员从事这类项目时可能并非始终可得。因此，为了确定随后用于为试验目的的指定测试细胞的表型特征的目的，本领域技术人员还可以使用能够增加或减少theragene表达的物质，由此使得相应theramutein的水平增加或减少。这使得本领域技术人员可以模拟某些类型的theramutein活化剂或抑制剂(诸如theramutein的自杀性抑制剂，为不可逆结合和共价修饰TOI而赋予其持久无活性的化学活性剂类型)，但实际上为了精确了解随后用于建立有用的细胞试验系统的合适表型特征的目的而可以使用这类化合物。有助于这类目的的本领域技术人员已知的实例包括利用反义DNA寡核苷酸、小干涉RNAs、其它基于RNA干涉的方法和含有诱导型启动子系统的载体构建体。在这种方式中，选择的表型特征与测试细胞中theramutein的活性相关。对theramuteins值得注意的是，选择的表型特征通常也由超表达prototheramutein的细胞展示，且其中表型特征由已知的prototheramutein的抑制剂或活化剂调节。

表型特征单纯为非细胞基因型特征的细胞特征。除如本文披露的适当确定的表型特征在按照本发明某些实施方案的教导产生有用的细胞试验系统目的中的具体需求外，对用于或适合于适当和有效实施本发明的术语任意类型或性质的表型特征没有其它限制。实际上，本领域技术人员必须能够选择将建立用于他或她需求的适当的基于细胞的试验的应用最大化的细胞的任意特征。表型特征可以为定量或定性的并且可直接观察或测定(例如可用裸眼或用显微镜)，但最常见的是使用本领域技术人员公知的标准自动化实验室设备和试验操作步骤间接测定所述特征。术语″可观察到″指的是可以测定特征，否则就是在适当条件下可通过无论何种方式，包括使用任意类型的实验室可利用的仪器操作测。术语″可测定″与″测定的″的含义不同。特征对于本领域技术人员来说是可以检测的但不在任意指定的时间测定，这取决于本领域技术人员选择如何设计试验系统。例如，在寻找prototheramutein(或theramutein)活化剂的过程中，需要仅在添加能够活化POI的已知活化剂或测试物质后检测相关表型特征。这提供了使在试验中由测试细胞产生的信号强度最大化的能力。

表型特征包括但不限于生长特征、转化状态、分化状态、底物磷酸化状态、催化活性、跨细胞膜的离子流(钙、钠、氯化物、钾、氢离子等)、pH改变、第二信使分子或其它胞内化学种类，诸如cAMP、磷酸肌醇类、环核苷酸的变动、基因表达的调节等。可连续(例如细胞生长率)，或在一定时间期限后(例如细胞培养物的最终密度)或瞬时(例如突变蛋白的调节导致突变蛋白底物磷酸化瞬时改变，或离子流的瞬时流量跨膜，或胞内cAMP水平升高或降低)观察到或测定细胞特征。在某些实施方案中，可以仅在有prototheramutein或theramutein调节剂存在下检测选择的表型特征。对可以为测定而选择的特征没有指定的限制。本文所用的术语“细胞的特征”和“表型特征”以及单纯的“特征”在用以指用物质处理测试细胞后完整细胞或细胞的亚细胞部分的具体可测定特性时的含义是相同的。例如，表型特征可以为灶性形成，当将在超表达选择的蛋白质的细胞在有该蛋白质活化剂存在下培养，或胞内代谢物或离子，诸如cAMP、钙、钠、氯化物、钾、锂、磷脂酰肌醇、cGMP、碳酸氢盐等的水平瞬时增加或降低时，这种灶性形成变得可以观察到。本领域技术人员显而易见，在细胞接触测试物质后，可以对细胞的亚细胞部分测定如此测定(检测)的特征。然而，必须对完整细胞而非亚细胞部分用物质进行最初的处理，由此使该物质接触所述细胞。

为细胞内测定而选择的特征不一定为theramutein或prototheramutein本身内在物理或化学特性(诸如仅是细胞内部的蛋白质的量(质量))，而必须是因细胞内部theramutein活性产生而由此影响不同于theramutein本身的细胞特征的特征，正如上文详细讨论的。例如，如果theramutein为能够进行自磷酸化的蛋白激酶，所述的自磷酸化即该酶能够通过从其自身上的ATP中转移末端磷酸部分而催化自身磷酸化的过程，那么可能不适合于选择TOI的磷酸化状态作为用于测定的细胞的合适的表型特征。这是因为这类特征不会反映出TOI对其它细胞成分的活性。正如本领域技术人员已知的，自磷酸化不必然反映出细胞中蛋白激酶的活性，因为已知蛋白激酶的突变体保留了足以进行自磷酸化的酶活性，但失去了在细胞内进行信号转导的能力。White等的经典论文(1988)在这方面既具有教导性，又值得关注。

术语″反应性表型特征″指的是对指定蛋白质(例如，包括prototheramutein或theramutein)的抑制剂或活化剂起反应的细胞特征。将术语″已知的治疗剂″定义为在世界范围内的国家中对人给药用于治疗疾病的任意活性剂。

作为本文中与p210^Bcr-Abl及其theramuteins相关的典型的有用的表型特征为细胞生长和增殖失调。注意相同或相似试验可以适用于许多不同所关注的蛋白质。例如，生长、增殖和/或分化失调为因各种不同细胞蛋白质超表达产生的常见表型特征。本发明的重要教导在于通过超表达选择的蛋白质而导致这类表型特征出现，所述的特征变得在合适的条件下与选择的蛋白质的存在、量和比活性相关，并且这种相关性能够使得本领域技术人员根据需要鉴定所关注的theramutein(TOI)的抑制剂或活化剂。因此，表型特征为对选择的蛋白质的水平和/或比活性改变的反应。这类反应性表型特征在本文中称作“表型反应(phenoresponse)，”并且所述概念且识别细胞的这种高度有用的性质代表本发明相比于现有技术的实质性优点之一，现有技术包括申请人本人在基于细胞测定的一般领域中的先前的工作(U.S.Pat.Nos.4,490,281；5,266,464；5,688,655；5,877,007)。就其鉴定TOI抑制剂或活化剂能力而言，表型反应的鉴定和选择为有经验的研究者提供了非常灵敏的细胞测定系统，因此与现有技术中公开的任何其他相关测定方法相比可以以高得多的确定度鉴定这些化学试剂。

尽管并非始终必要，但是通常有利的是使用表达高水平theramutein的细胞并且选择因theramutein超表达产生的表型特征。这是因为与theramutein功能相关的表型特征一般比theramutein被超表达至更大程度时更加可区分(更易于测定)。此外，在theramutein的功能水平增加时，对theramutein调节剂的反应观察到的表型反应通常得到扩大。如果以另一种方式表达，那么在超表达theramutein的细胞观察到的选择的表型反应对theramutein的调节剂特别敏感。

优选theramutein在测试细胞中得到稳定表达。稳定表达theramutein导致细胞中的水平在试验过程中保持相对不会改变。例如，刺激或活化信号传导途径中的成分后为不应期，在此过程中，信号传导因所述成分的减量调节而受到抑制。就本发明的theramuteins而言，这类减量调节通常通过人工超表达theramutein而足以克服。如果以另一种方式表达，那么充分维持表达，即在试验过程中观察到的这些表型特征改变主要是因theramutein抑制或活化，而非其水平改变所致，即使theramutein的减量调节随之发生也是如此。由于这些原因，所以尽管优选theramutein的稳定表达，但是在转染后可以使用theramutein的瞬时表达，条件是选择的表型特征可测定并且试验系统的期限比其在这类系统中随时间预计的瞬时表达的theramutein的水平进行性下降短。由于这些原因，优选稳定表达的细胞系(美国专利US4,980,281)。

本发明优选的药物筛选方法包括下列步骤：

1)鉴定需要新抑制剂或活化剂的theramutein。可以使用标准技术对合适的theramutein进行鉴定(参见，Gorre等，Science，2001；另外，参见PCT/US02/18729)。简单的说，鉴定使用已知或可疑的prototheramutein的活化剂或抑制剂给予治疗有效的治疗过程且随后已经表现出与疾病复发一致的临床征兆和症状的患者，并且获得来源于这类患者的细胞或组织。使用标准实验室技术，诸如RT-PCR测定prototheramutein的序列并且与已知prototheramutein基因或cDNA序列的预先测定的核酸序列进行比较。如果存在，那么鉴定突变并且再次使用标准方法与基于细胞或更常用的基于细胞的试验系统中prototheramutein的功能的功能抗性建立相关。一旦证实了诱导抗性的突变，那么所述的一种或多种经证实的突变体包括可以用于如本文所述的随后方法限定的theramutein。

2)提供表达所关注的所述theramutein并且展示出可观察到(可测定的)表型特征的测试细胞，已经预先证实所述的表型特征对theramutein，或更常见的是相应的prototheramutein的抑制剂或活化剂有反应。将已经预先证实对所关注的theramutein(TOI)和/或所关注的prototheramutein(pTOI)的抑制剂或活化剂有反应的这种特异性表型特征在本文中定义为“表型反应(phenoresponse)”。本发明的一个实施方案在于所述表型反应在鉴定能够成为TOI抑制剂或活化剂的化合物的目的中的确定应用。这一过程可以通过使用应用过度产生指定的TOI并且已经鉴定和表征了适当的表型反应的细胞系的高流通量筛选来进行。或者，可以使用应用更一般性的细胞系表型特征(按照本文的教导并不定为表型反应)的高流通量初级筛选且然后按照本文的教导使用二次筛选，以便从并非所关注的theramutein的抑制剂或活化剂的假阳性化合物中区分确实为阳性的“命中数”的化合物，即所关注的theramutein的抑制剂或活化剂。在一个实施方案中，选择天然表达theramutein的细胞，以便反应性表型特征在对本领域技术人员而言显而易见的适当培养条件下存在。在其它实施方案中，theramutein在某些情况中在宿主细胞中得到超表达，否则，该宿主细胞完全不表达theramutein。这一过程通常包括构建表达载体，可以将该表达载体导入合适的宿主细胞并且使用标准载体系统和方法超表达(Gorre等，2001；小时ousey等，1988)。在一个实施方案中，超表达产生的theramutein水平至少约3倍于该蛋白质通常存在于细胞中的量。或者，该量至少约为通常存在于细胞中的量的10倍。在另一个实施方案中，该量至少约为通常存在于细胞中的量的20倍或更优选至少约为50倍。

3)提供表达相应于所关注的theramutein的对应prototheramutein的对照细胞。当本文所述的某些突变蛋白也为酶时，它们通常保留了催化活性并且由此对照细胞通常展示出基本上与测试细胞相同的表型特征。不过，这种表型特征不需要如两种细胞那样进行定量。例如，使prototheramutein再活化的突变蛋白就其在细胞中的底物中的一种或多种而言也可以增加、减少乃至影响其比活性。作为结果，它可以将选择的表型特征展示出较大或较小的程度。因此，在某些情况中，需要调整prototheramutein和theramutein之一或它们两者的表达，以便测试和对照细胞将表型特征展示至近似相同的程度。例如，均可以使用标准方法，通过由启动子表达蛋白质达到这一目的，其中可以通过调整存在的诱导物的量来调整启动子的活性(例如，参见Sambrook et al.1989和2001)。

本领域技术人员显而易见，适当定义的表型反应在表达prototheramutein与theramutein的细胞系中可以存在定量差异作为与其相应的prototheramutein之间比活性差异(如果有的话)的结果。诱导Theramutein的突变可以增加或减少所述theramutein相对于相应的prototheramutein而言的比活性。当将表达theramutein的细胞系与表达prototheramutein的细胞系进行比较时，优选选择的表型反应在两种细胞类型中定性地相同。因此，本领域技术人员可以选择将表达theramutein的细胞系的活性与表达prototheramutein的细胞系的活性校准或反之亦然。这类归一化法在本领域中是标准的。例如，参见Bolstad等(2003)。

或者，本领域技术人员还可以希望使用未修饰的宿主细胞或仅隐含了表达载体作为用于某些实验操作步骤的对照细胞的宿主细胞(宿主细胞为导入了编码theramutein的表达载体而产生测试细胞的细胞)。这可能就是研究人员仅对所关注的theramutein的特异性抑制剂或活化剂感兴趣，而与所述化合物是否还对所关注的prototheramutein(pTOI)有效无关的情况[取代工作活性]。

4)然后在合适的条件下将测试和对照细胞维持或使其增殖(不过不一定在同时)在生长培养基(乃至在完整动物体内)中，以便可以表达和检测表型反应。可以用prototheramutein的已知调节剂或用测试物质处理表达prototheramutein的对照细胞，并且用测试化合物处理测试细胞以便确定它们是否如所述物质以预计方式调节表型反应的能力所测定的对theramutein具有活性。或者，还可以根据本领域技术人员选择用于研究的特定表型反应的不同取代不表达prototheramutein的对照细胞。然后检测物质对测试细胞的作用，并且任选地同时或在另一时间测试对对照细胞的作用，并且比较结果。

在本发明的一个实施方案中，根据以例如与prototheramutein的已知调节剂改变表达prototheramutein的对照细胞的表型反应相同的方式调节测试细胞的表型反应的能力快速鉴定对测试细胞具有活性的物质。在另一个实施方案中，可以通过调节测试细胞中theramutein的活性而对未修饰(不表达prototheramutein和/或theramutein)的对照细胞几乎或没有作用的能力来鉴定活性物质。例如，本领域技术人员易于理解该手段的许多变化形式可以用于鉴定为对theramutein更为有效或对prototheramutein和一种或多种相应的具体theramuteins等效的调节剂。

可以观察到和/或测定其它表型反应，并且包括：例如，检测prototheramutein的底物和检测通过theramutein活性调节的基因表达的改变。在最简单的术语中，本领域技术人员预先建立的与theramutein的功能活性相关性的细胞的任意特征适用于这类方法。然而，在选择指定特征的过程中，本领域技术人员必须首先按照作为本文详述中给出的教导验证所述的特征满足作为表型反应的标准。本领域技术人员还可以希望将使用表达theramutein的细胞的表型反应与表达prototheramutein的细胞的表型反应校准。

可以通过本领域技术人员众所周知的各种方法测定适合于检测的特征。这类方法包括但不限于：检测适当标记的蛋白质的荧光(FACS)；用于检测蛋白质表达的免疫组织化学(IHC)；竞争放射性配体结合测定；固相基质印迹技术，诸如细胞提取物的RNA印迹、DNA印迹和蛋白质印迹；逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)；酶联免疫吸附测定(ELISA)；磷酸化测定；凝胶阻留测定；膜电位干扰等。可以在使用测试物质处理后检测完整细胞上的相关表型特征，或者在使用测试物质处理完整细胞后检测在细胞的亚细胞部分上的相关表型特征。

一旦鉴定了对表达theramutein的测试细胞具有所需作用的化合物，就需要(但不一定)独立地验证所鉴定的化合物通过直接结合机制对theramutein发挥其作用，即按照本发明的教导，这些化合物满足作为theramutein的抑制剂或活化剂(作为理想的)的标准(读者如上所述涉及的术语″活化剂″和″抑制剂″的定义)。可以使用本领域技术人员公知的大量标准结合测定法达到这一目的，包括纯化的蛋白质样品或使用用合适的prototheramutein或theramutein转染的细胞与如通过声科学法所述的合适的对照品进行的完整细胞结合测定法。由于这类方法为本领域中充分确立的，所以不在此处重复它们。大量参考文献文本综合讨论了这类技术(例如，参见Foreman和Johansen，2002；Enna S.J.等(1991)Current Protocols in Pharmacology，Wiley &Sons，Incorporated；Bonifacino，J.S.等(1999)CurrentProtocols in Cell Biology，Wiley & Sons，Incorporated).还参见Housey，G.M.1988，Chapter 4及其中的参考文献；另外，参见Horowitz等，1981。

在本发明的一个具体的实施方案中，该方法用于鉴定为p210^{Bcr-Abl-T315I}theramutein的抑制剂的物质。使用标准方法在Ba/F3(鼠)细胞中各自表达prototheramutein和theramutein，并且观察到的表型反应为生长特征(谨慎确定的细胞培养物的末端细胞密度和在没有白细胞介素-3(IL-3)存在下的生长)。还可以任选使用未修饰的宿主细胞或仅含有表达载体的宿主细胞或它们两者。在另一个实施方案中，将测试细胞单独与或不与涉及的已知抑制剂或活化剂一起使用。

另一种有用的测定法为测定p210^{Bcr-Abl-T315I}的直接底物的磷酸化状态。一种这类底物为Crk1(Gorre等，Science 293：876-80(2001))，即一种介导Bcr-Abl与Ras之间的连接的衔接蛋白。CRKL的磷酸化状态为细胞中p210^Bcr-Abl的信号传导活性的代表。另一种下游底物为p62DOK。对这些目的而言，任意这类底物均可满足，当然，条件是已经证实所述底物的磷酸化在细胞内部发生，并且不非简单地如上所述为TOI或PTOI的自磷酸化活动。还可以监测其它信号转导级联成分，包括src族激酶、STAT5、PI3激酶、raf激酶、RAS、MEK、ERK1和ERK2、JNK1、2和3、MLK1、2和3、MKK4、MKK7、AKT、mTOR、HSP90等。

作为本文中的典型，已经鉴定了T315I theramutein的抑制剂。此外，这些抑制剂还对野生型prototheramutein p210^Bcr-Abl-wt具有不同程度的活性。

按照本发明，对需要的哺乳动物给予治疗有效量的调节p210^Bcr-Abltheramutein的功能活性的一种或多种化合物。本文所用的术语“给予”指的是通过可以实现寻找的结果的任意方法将本发明的化合物递送给哺乳动物。例如，可以通过口服、非肠道(静脉内或肌内)、局部、透皮或通过吸入给予它们。本文所用的术语“哺乳动物”用以包括，但不限于人、实验室动物、驯养宠物和农场动物。“治疗有效量”指的是在对哺乳动物给药时有效产生所需治疗作用，诸如抑制激酶活性、抑制癌细胞生长和分裂等的化合物用量。

本发明提供了治疗哺乳动物疾病的方法，通过对该哺乳动物给予有效量的theramutein的调节剂来进行。按照本发明治疗的合适的疾病包括但不限于已经对预先给予的药物产生抗性的复发性肿瘤或其它增殖性病症。该方法还用于克服个体中存在对因治疗靶标中的等位基因差异产生的药物治疗的敏感性方面的变化形式。例如，已经广泛证实了在CML中p210^Bcr-Abl酪氨酸激酶信号传导的作用，因为p210^Bcr-Abl的theramuteins在CML的药物抗性复发中具有作用。此外，不同的p210^Bcr-Abl的突变蛋白表现出对p210^Bcr-Abl的抑制剂的可变敏感性。尽管某些theramuteins在药物疗法过程中出现，但是其它可能预先存在于群体中。对后面这些实例并不公认为theramuteins，直到疾病状态随之发生并且随后用已知类型的治疗剂治疗时为止。仅在所述治疗后，这类预先存在的theramuteins显示出其自身在导致隐含theramutein的患者中的疾病发展的相对非-反应性方面的临床显著性。

在本发明的一个实施方案中，给予theramutein调节剂与一种或多种抗肿瘤剂。可以使用任意合适的抗肿瘤剂，诸如化疗剂、放射或其组合。抗肿瘤药可以为烷化剂或抗代谢物。烷化剂的实例包括但不限于顺铂、环磷酰胺、美法仑和达卡巴嗪。抗代谢物的实例包括但不限于多柔比星、柔红霉素和紫杉醇、吉西他滨和拓扑异构酶抑制剂伊立替康(CPT-11)、氨基喜树碱、喜树碱、DX-8951f、托泊替康(拓扑异构酶I抑制剂)和依托泊苷(VP-16；拓扑异构酶II抑制剂)和替尼泊苷(VM-26；拓扑异构酶II抑制剂)。当抗肿瘤药为放射时，放射源可以在所治疗患者的体外(外线束放疗-EBRT)或体内(近距离放射疗法-BT)。所给予的抗肿瘤剂的剂量取决于许多因素，包括：例如，活性剂的类型、所治疗的肿瘤的类型和严重程度以及活性剂的给药途径。然而，应强调本发明并不限于任何特定的剂量、给药途径或合并给予theramutein条件的化疗剂或其它治疗方案的组合。

可以将目前本领域中公知或评价的抗肿瘤剂分成不同类型，包括：例如，有丝分裂抑制剂；烷化剂；抗代谢物；嵌入抗生素；生长因子抑制剂；细胞周期抑制剂；酶；拓扑异构酶抑制剂；抗存活剂；生物学反应修饰剂；抗激素和抗血管发生剂，可以将所有这类活性剂与theramuteins的抑制剂或活化剂一起给药。

可以将theramutein的调节剂与中和涉及肿瘤生长的其它受体的抗体一起给药。此外，可以将theramutein的调节剂与另外调节信号转导途径的成分，优选与在一种或多种其它信号转导途径中具有活性并且对这些途径而言为常见的信号转导途径中的成分一起给药。在本发明的一个实施方案中，将theramutein调节剂与特异性结合表皮生长因子受体(EGFR)的受体拮抗剂联用。特别优选抗原结合蛋白，这些蛋白结合EGFR的胞外域并且阻断结合其配体中的一种或多种和/或中和配体-诱导的EGFR活化。EGFR拮抗剂可以为结合EGFR或EGFR配体并且抑制和EGFR与其配体结合的抗体。EGFR的配体的实例包括：例如，EGF、TGF-α、双调蛋白、肝素-结合EGF(HB-EGF)和β动物纤维素。认为EGF和TGF-α为导致EGFR-介导的刺激的主要内源性配体，不过，已经证实TGF-α在促进血管发生中更为有效。应理解EGFR拮抗剂可以在外部结合EGFR的胞外部分，可以抑制，也可以不抑制配体的结合，或在化学活性剂的情况下，在内部结合酪氨酸激酶结构域。结合EGFR的EGFR拮抗剂的实例包括但不限于生物制剂，诸如对EGFR具有特异性的抗体(及其功能等效物)；和化学活性剂(小分子)，诸如对EGFR的胞质域直接起作用的合成激酶抑制剂。

肿瘤发生中涉及的生长因子受体的其它实例为血管内皮生长因子(VEGFR-1和VEGFR-2)、血小板衍生的生长因子(PDGFR)、神经生长因子(NGFR)、成纤维细胞生长因子(FGFR)等的受体。

在联合疗法中，在使用另一种活性剂开始治疗之前、过程中或之后给予theramutein抑制剂及其任意的组合，即在使用抗肿瘤药疗法开始之前和过程中，在之前和之后，在过程中和之后或在之前、过程中和之后。例如，可以在开始放疗前1-30天，优选3-20天，更优选5-12天给予theramutein抑制剂。在本发明的一个优选的实施方案中，在使用抗体疗法前、与之同时或更优选在其后给予化疗。

在本发明中，可以将任意合适的方法或途径用于给予本发明的theramutein抑制剂，并且任选共同给予抗肿瘤剂和/或其它受体拮抗剂。按照本发明使用的抗肿瘤药方案包括认为最适合于治疗患者肿瘤病情的任意方案。不同的恶性肿瘤可能需要使用特异性抗肿瘤抗体和特异性抗肿瘤剂，这需要基于患者与患者的不同来决定。给药途径包括：例如，口服、静脉内、腹膜内、皮下或肌内给药。给予的拮抗剂剂量取决于许多因素，包括：例如，拮抗剂的类型、所治疗的肿瘤的类型和严重程度以及拮抗剂的给药途径。然而，应强调本发明并不限于任何特定的方法和给药途径。

合适的载体包括：例如，水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多种及其组合。载体可以进一步包括少量辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，它们可以增加作为活性组分的theramutein调节剂的贮存期限或有效性。作为本领域众所周知的，可以将组合物配制成对哺乳动物给药后使活性组分快速、持续或延缓释放的剂型。

本发明的组合物可以为各种形式。它们包括：例如，固体、半固体和液体剂型，诸如片剂、丸剂、粉剂、液体溶液、分散液或混悬液、脂质体、栓剂、可注射和可输注溶液。优选的剂型取决于指定的给药方式和治疗应用。

可以按照制药领域中众所周知的方式制备本发明的这类组合物。在制备组合物的过程中，通常将活性组分与载体混合或用载体稀释组合物和/或将组合物包封在载体内，所述的载体用作稀释剂，它可以为固体、半固体或液体物质，它起活性组分的媒介物、赋形剂或介质的作用。因此，组合物可以为片剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、混悬液、气溶胶(作为固体或在液体介质中)、含有例如达10％重量的活性化合物的软膏剂、软和硬明胶胶囊、栓剂、注射溶液、混悬液、无菌包装的粉末和作为局部贴剂。

应理解可以将本发明的方法和组合物对任意合适的哺乳动物给药，诸如家兔、大鼠或小鼠。更优选所述的哺乳动物为人。

本发明的化合物还可以作为盐存在。在本发明的上下文中，优选给予药物上可接受的盐。药物上可接受的盐指的是本发明化合物的酸加成的盐或碱加成的盐，其中将所得抗衡离子理解为在本领域中一般对药物应用而言是可接受的。药物上可接受的盐可以为本发明化合物与无机酸或有机酸形成的盐。优选得到与无机酸形成的盐，所述的无机酸诸如：例如，盐酸、氢溴酸、磷酸或硫酸，或优选得到与有机羧酸或磺酸形成的盐，所述的有机羧酸或磺酸诸如：例如，乙酸、马来酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、苯甲酸或甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸或萘二磺酸。药物上可接受的盐还可以为本发明化合物的金属或铵盐。特别优选得到：例如，钠、钾、镁或钙的盐，并且还特别优选得到来源于氨或有机胺类的铵盐，所述的有机胺类诸如：例如，乙胺、二-或三乙胺、二-或三乙醇胺、二环己胺、二甲氨基乙醇、精氨酸、赖氨酸、乙二胺或2-苯乙胺(参见Berge等J.Pharm.Sci.1977，66，1-19)。

在本申请的上下文中，参照了各种公开文献、参考文献正文、教科书、技术手册、专利和专利公开文献。将这些公开文献、专利、专利申请和其它对比文件教导的和披露的内容完整地引入本申请作为参考，以便更完整地描述本发明涉及的本领域的状态。

应理解和预计本领域技术人员可以实施本文披露的本发明的原理的变化形式并且认为这类变型包括在本发明的范围内。

下列实施例进一步解释本发明，但不应视为以任何方式限定本发明的范围。常用方法，诸如那些用于载体和质粒构建、将编码多肽类的基因插入这类载体和质粒、将质粒导入宿主细胞以及基因和基因产物的表达及其测定的方法的详细描述可以获自大量公开文献，包括：Sambrook，J等，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2^nd ed.，Cold Spring小时arbor Laboratory Press；Coligan，J.等(1994)Current Protocols in Immunology，Wiley & Sons，Incorporated；Enna，S.J.等(1991)Current Protocols inPharmacology，Wiley & Sons，Bonifacino，J.S.等(1999)CurrentProtocols in Cell Biology，Wiley & Sons；和U.S.Patent 4,980,281。将所有本文提及的参考文献完整地引入。

实施例

可以理解和预期本领域的技术人员在此处公开的本发明原则下进行变化，且意图将这些改变包括在本发明的范围之内。

列举本发明下述实施例以进一步描述本发明而不应理解为以任何方式限制本发明。

实施例1：鉴定THERAMUTEIN调节剂

p21^{Bcr-Abl-T315I}为对甲磺酸伊马替尼的抑制作用产生抗性的p210Bcr-Abl蛋白质(p210^Bcr-Abl)的theramutein(Gleevec，STI-571)。315位上的突变将苏氨酸转化成异亮氨酸残基，并且为在抗性或复发性患者中观察到的几种突变之一。然而，这种特定的突变体为鉴定的最具抗性的这类theramutein。

为用于超表达p21^{Bcr-Abl-T315I}theramutein改造的Ba/F3细胞系测定表型反应。测定相对于未转化的Ba/F3细胞和表达p21^Bcr-Abl-wtprototheramutein的Ba/F3细胞而言的表型反应。表型反应为T315I突变体在类似的培养条件下生长至高于对照组的未转化Ba/F3细胞系的细胞饱和密度并且在维持对照组未转化的Ba/F3细胞系所需的白细胞介素3(IL-3)不存在下生长的能力。按照上述给出的教导定义和表征表型反应。

使用的检测系统为高速细胞成像和计数系统，其中将3μl的细胞样品体积顺序通过5μl光学微量比色池注射、数字成像并且以电方式贮存、扫描且然后计数，所有操作均在基于微型计算机的控制系统中进行。该系统具有对来自小至500μl的培养物的样品进行直接细胞计数的能力，并且提供来自含有少至12,500个细胞的培养样品的具有统计学意义的总细胞计数。所有展示出细胞计数和存活率试验的图均使用数据获取和分析用的该系统。在进行细胞计数的同时，该系统还能够通过区分计数、成像的细胞测定总体细胞存活率，所述的计数、成像的细胞从吸收锥虫蓝染料(计为″未存活″细胞)的细胞中排除锥虫蓝(计为″存活″细胞)。将锥虫蓝注入细胞样品，此后即刻依次将样品注入微量比色池以便同时进行细胞计数和成像。

将系统整合入高流通量筛选装置的工作流程以便提供灵敏和精确的细胞计数和细胞存活率试验系统，它更可靠并且较不易于发生基于代谢存活率的细胞试验，诸如XTT或Alamar蓝的混杂效应。

最初，以一般在10-20μM范围的浓度筛选约113,000种化合物，以便鉴定能够通过任意方式影响超表达p210^{Bcr-Abl-T315I}theramutein的Ba/F3细胞(Ba/F3 T315I细胞)生长的亚群。

总计约11,760种化合物表现出大于50％的生长抑制作用，认为这相当于约4500种不同的化学类型。使用相同细胞系重新测试这些化合物产生了化合物反应性数据库，然后将其分类并且根据表现出最高总体生长抑制作用的那些化合物进行等级排序。然后在使用Ba/F3 T315I作为测试细胞和野生型Ba/F3作为对照细胞的确定的基于细胞的试验系统中按照本发明的方法从该等级排序的数据库中重新筛选最高评分的130种化合物(基于在测试化合物的最低浓度下观察到的最大程度的生长抑制作用)。所关注的化合物为那些与未转化的野生型Ba/F3细胞相比区别抑制表达p210^{Bcr-Abl-T315I} theramutein的Ba/F3细胞生长的化合物。鉴定满足所需标准的6种化合物并且还使用Ba/F3 p210^Bcr-Abl-wt细胞系(Ba/F3 P210细胞)进一步详细分析这些化合物中的某些。因缺乏可利用的来自化学供应商的额外物质而导致一种化合物不能用于进一步测试。在使用上述细胞系的额外基于细胞的试验和使用分离自野生型P210 Bcr-Abl和P210 T315I突变体激酶结构域的人重组产生的120 Kd激酶结构域片段的不含细胞的纯化蛋白激酶试验中独立地评价剩余的5种化合物。

所有5种化合物均如自磷酸化活性抑制所测定的抑制p210^{Bcr-Abl-T315I} 120 Kd活性，如附图4中所示。因此，在筛选的113,000种以上的化合物中的6种最高评分的化合物中，这6种中的至少5种直接抑制p210^{Bcr-Abl-T315I}突变体。值得注意的是，化合物5看起来在SDS聚丙烯酰胺凝胶上使重组蛋白质带铺展开。这种情况在银染色的凝胶上也是明显的(数据未显示)。可能的情况是这种化合物实际上可以为能够共价交联POI以便持久抑制其活性的″自杀″抑制剂，但这一结果需要进一步研究。

本文所述的教导和结果共同提供了结论性证据，即该系统能够鉴定选择的theramutein的抑制剂或活化剂，并且本领域技术人员立即意识到这类系统在仅进行显而易见的最小变型的情况下就易应用于任意其它theramutein或其它蛋白。

证实Ba/F3 T315I细胞系与野生型未转化Ba/F3细胞相比的生长抑制作用的基于细胞的试验结果的有代表性的实例如附图1和2中所示。这些化合物在野生型Ba/F3未转化细胞(不表达p210^Bcr-Abl-wt或p210^{Bcr-Abl-T315I})的生长和存活率相对不受影响的浓度下抑制表达T315Itheramutein的细胞生长并且降低其存活率，而表达prototheramutein和theramutein的细胞基本上得到抑制。在某些情况中，对表达T315I的细胞的抑制程度甚至大于对表达P210 prototheramutein的细胞的抑制程度(例如，参见附图3，右手侧，化合物3对P210和T315I细胞的结果。

概括地说，本文提供的方法提供了用于产生或鉴定任意指定theramutein的调节剂的可推广方法形式的基本发展。结果结论性地证实了该方法在鉴定关键需求的化合物方面的能力，这些化合物用于克服在某些患者群体中一致性地成为致命性的并且目前不可治疗的具体类型的获得性药物抗性。此外，对本领域技术人员显而易见的是，可以使用显而易见的变型将本文所述的技术和方法直接广泛应用于任何具有临床意义的可能的theramutein。

值得注意的是，在100,000种以上化合物的初步筛选中，其中约10,000种化合物表现出一定程度的生长抑制作用，当使用本文详述的方法重新筛选最有效的生长抑制物质时，鉴定了6种不同的化合物并且随后测试的所有化合物在使用T315I突变体的不含细胞的纯化蛋白激酶试验中均表现出了抑制活性(一种化合物不能用于进一步测试)。基于这类值得注意的结果，本领域技术人员立即明确基于上述部分和引入本文作为参考的对比文件中的教导的表型反应的适当选择和确定，该方法可以有效地应用于鉴定任意theramutein的抑制剂或活化剂。例如，本领域技术人员使用上述知识容易地设计分析系统来鉴定来源于其它prototheramuteins的theramuteins的抑制剂，已知所述的其它prototheramuteins显示出赋予药物抗性的突变，诸如c-kit基因产物或表皮生长因子(EGF)受体(EGFR)或血小板衍生的生长因子(PDGF)受体α和β。在使用该方法时，就方法用于在其相应的表型反应是可检测的任意哺乳动物细胞类型中表达的任意指定theramutein的能力而言，推断应没有限制。

在本文其它地方描述(参见实施例1)的细胞测定系统中测试对应于上面指定的各种化学式的本发明有代表性的化合物，并且规定的活性类别如表I所示。规定的活性类别由下面的指定代表，其中给定细胞系的IC₅₀是指给定化合物在细胞试验系统中抑制该细胞系生长达50％时的浓度。给定细胞系上测试展现的IC₅₀值＜300nM(小于300纳摩尔)的化合物被指定为类“A”化合物。给定细胞系上测试展现的IC₅₀值＜1μM(小于1微摩尔)的化合物被指定为类“B”化合物。给定细胞系上测试展现的IC₅₀值＜10μM(小于10微摩尔)的化合物被指定为类“C”化合物。给定细胞系上测试展现的IC₅₀值≥10μM(大于或等于10微摩尔)的化合物被指定为类“D”化合物。

表1

实施例2：

1.化合物2的合成：

反应图示：

实验细节：

回流化合物1(25g)和N，N-二甲基苯胺(24.2g)在POCl₃(110mL)中的混合物5小时。减压下蒸发除去POCl₃，并将残余物小心倒入冰-水(500g)中并搅拌1小时。然后过滤混合物并用水洗涤固体得到黄色固体状的化合物2。

2.化合物3的合成：

反应图示：

实验细节：10℃下，在15分钟内向化合物2(1.04g)在15ml乙醇的溶液中逐滴加入1.08g(2eq)吗啡。搅拌混合物0.5小时并在50℃下加热15分钟。冷却和用水(50ml)稀释后，过滤得到黄色固体粉末状的化合物3。

3.化合物4的合成：

反应图示：

实验细节：向1.1g化合物3中加入8ml NH₂NH₂.H₂O。回流混合物2小时。冷却后，过滤得到粗产物。通过柱色谱纯化得到淡黄色固体状的纯化合物4。

4.化合物6的合成：

反应图示：

实验细节：向化合物5(1.0g，1.0eq)和DMF(0.05g，计算量)在20mL二氯甲烷的溶液中逐滴加入(COCl)₂(0.81g，1.1eq)。室温下搅拌反应混合物2小时然后浓缩得到1.2g化合物6的粗产物，在没有进一步纯化下将其用于下一步。

5.化合物7的合成：

反应图示：

实验细节：向化合物6的粗产物(1.2g，1.0eq)在20mL二氯甲烷的溶液中加入3-三氟甲基-苯胺(0.94g，1.0eq)和三乙胺(0.71g，1.2eq)。室温下搅拌反应混合物过夜，用1N NaOH溶液、1N HCl溶液和盐水洗涤。收集有机层，用Na₂SO₄干燥，浓缩得到化合物7的粗产物。通过柱色谱纯化后，得到1.1g化合物7。

6.化合物8的合成：

反应图示：

实验细节：向化合物7(0.3g，1.0eq)和3mL三氟乙酸的混合物中加入六亚甲基四胺(0.53g，4.0eq)。立刻密封反应混合物并加热到90℃ 20小时。冷却后，用1N NaOH溶液调节反应混合物到pH8，用二氯甲烷萃取并干燥有机相，浓缩得到棕色固体。通过制备型TLC纯化得到黄色固体状的化合物8。

7.最终化合物的合成：

实验细节：室温下搅拌化合物4(30mg，1.0eq)和化合物8(19mg，1.0eq)在5mL二氯甲烷中的混合物过夜。收集沉淀并用二氯甲烷充分洗涤，真空下干燥得到需要的化合物。

实施例3：

1.反应图示：

实验细节：向化合物1(1.0g，1.0eq)、化合物2(0.92g，1.0eq)、Na₂CO₃(0.77g，1.5eq)在15mL二噁烷的混合物中加入pd(PPh₃)₄(0.56g，0.1eq)，在N₂下回流反应混合物16小时。冷却后，过滤混合物并蒸发过滤物至干，通过柱色谱纯化得到化合物3。

2.反应图示：

实验细节：向化合物3(0.3g，1.0eq)和3mL三氟乙酸的混合物中加入六亚甲基四胺(0.62g，4.0eq)。立刻密封反应混合物并加热至90℃ 20小时。冷却后，用1N NaOH溶液调节反应混合物至pH 8，用二氯甲烷萃取并干燥有机相，浓缩得到棕色固体。通过制备型TLC纯化得到黄色固体状的化合物4。

3.反应图示：

实验细节：室温下搅拌化合物4(30mg，1.0eq)和化合物5(19mg，1.0eq)在5mL二氯甲烷中的混合物过夜。收集沉淀并用二氯甲烷洗涤，真空下干燥得到所需的化合物。

实施例4.

1.反应图示：

实验细节：向化合物1(0.6g，1.0eq)在10mL甲醇的溶液中加入4mL 1N NaOH溶液，室温下搅拌混合物过夜。蒸发溶剂并用5％柠檬酸酸化残余物至pH6，用二氯甲烷萃取。干燥有机层，浓缩得到化合物2.

2.反应图示：

实验细节：室温下搅拌化合物2(0.4g，1.0eq)、三氟甲基苯胺(0.39g，1.0eq)、EDC(0.71g，1.5eq)、HOBt(33mg，0.1eq)在10mL二氯甲烷中的混合物过夜。用1N NaOH溶液、水洗涤混合物，用二氯甲烷萃取。用Na₂SO₄干燥有机层，浓缩至干，并通过柱色谱纯化得到化合物3.

3.反应图示：

实验细节：用4mL 1N HCl处理化合物3(0.2g，1.0eq)在10mL二噁烷中的溶液，并将混合物加热至60℃2小时。冷却后，添加NaHCO₃将pH调节至8。用二氯甲烷萃取混合物，用水洗涤有机层，用Na₂SO₄干燥并蒸发至干。通过柱色谱纯化粗产物得到化合物4。

4.反应图示：

实验细节：室温下搅拌化合物4(40mg，1.0eq)和化合物5(30mg，1.0eq)在5mL二氯甲烷中的混合物过夜。浓缩混合物至干并通过制备型HPLC纯化得到所需的化合物.

实施例5.

1.反应图示：

实验细节：室温下搅拌化合物2(0.3g，1.0eq)、2-氯-6-甲基-苯胺(0.26g，1.0eq)、EDC(0.53g，1.5eq)、HOBt(25mg，0.1eq)在10mL二氯甲烷中的混合物过夜。用1N NaOH溶液、水洗涤混合物，并用二氯甲烷萃取。用Na₂SO₄干燥有机层，浓缩至干，通过柱色谱纯化得到化合物3。

2.反应图示：

实验细节：用4mL 1N HCl处理化合物3(0.2g，1.0eq)在10mL二噁烷中的溶液，并将混合物加热至60℃2小时。冷却后，通过添加NaHCO₃将pH调节至8。用二氯甲烷萃取混合物并用水洗涤有机层，用Na₂SO₄干燥并蒸发至干。通过柱色谱纯化粗产物得到化合物4。

3.反应图示：

实验细节：室温下搅拌化合物4(40mg，1.0eq)和化合物5(30mg，1.0eq)在5mL二氯甲烷中的混合物过夜。浓缩混合物至干并通过制备型HPLC纯化得到所需的化合物。

实施例6.

1.反应图示：

实验细节：向1g(5.5mmol)5-溴-2-氰基吡啶、0.97g(6.05mmol1.1eq)3-(三氟甲基)苯胺在100ml甲苯的溶液中加入3eq t-BuONa、0.2eq BINAP和0.1eq Pd₂(dba)₃。然后加热回流该溶液过夜。通过LC/MS监测反应。减压下除去易挥发物。通过快速色谱纯化粗产物得到化合物2。

2.反应图示：

实验细节：将250mg(0.95mmol)化合物2添加到20mL浓HC l中，然后加热回流该溶液直到初始材料消失。在没有纯化的情况下，减压浓缩混合物得到黄色固体状的化合物3。

3.反应图示：

实验细节：将50mg(0.18mmol)化合物3在3mL二氯甲烷中的溶液添加到0.5mL亚硫酰氯中。加热混合物并搅拌3小时。最后减压蒸发溶液。得到化合物4并在没有纯化下用于下一步。

4.反应图示：

实验细节：在25℃下搅拌50mg化合物4和43mg(1.2eq)肼在5mLDCM中的溶液3小时。浓缩反应混合物并通过制备型HPLC纯化残余物得到所需的化合物。

实施例7.

1.反应图示：

实验细节：加热回流化合物1(25g，0.145mol)和SeO₂(27.5g，0.247mol)在乙酸(1200mL)中的悬浮液12小时。减压浓缩反应混合物至干。在水中溶解残余物并通过添加K₂CO₃使得pH＝9。用EA(100mL×3)萃取所得混合物。用Na₂SO₄干燥合并的EA。过滤掉Na₂SO₄后，减压下浓缩过滤物得到粗产物2，在没有纯化下将其用于下一步。

2.反应图示：

实验细节：回流上述制备的2在乙醇原甲酸三乙酯(10mL)中的溶液4小时。除去溶剂后，通过柱分离残余物得到油状产物3。

3.反应图示：

实验细节：在N₂气氛下，向化合物3(73mg，0.28mmol)和化合物4(50mg，0.28mmol)，及tBuONa(27mg，0.56mmol)和BINAP(70.4mg，1.12mol)在甲苯(15mL)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd₂(dba)₃(26mg，0.028mmol)并在80℃搅拌48小时。过滤掉固体后，浓缩过滤物得到粗产物5，在没有纯化下将其用于下一步。

4.反应图示：

实验细节：在-30℃和N₂气氛下，用BBr₃(146mg，0.6mmol)处理化合物5(335mg，0.1mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液，然后室温下搅拌4小时。将反应物倒入冰-水中然后添加Na₂CO₃。用二氯甲烷萃取(25mL×3)所得混合物，用Na₂SO₄干燥合并的有机层。过滤掉Na₂SO₄后，浓缩过滤物得到粗产物6，在没有纯化下将其用于下一步。

5.反应图示：

实验细节：回流下搅拌化合物6(27.74mg，0.1mmol)和化合物7(21mg，0.1mmol)在无水CH₂Cl₂(300mL)中的溶液6小时。减压下除去溶剂。通过制备-TLC分离残余物得到所需的化合物。

实施例8.

1.反应图示：

实验细节：在N₂气氛下，向化合物1(5g，25mmol)和化合物2(3.4g，27mmol)在DMF(50mL)和Na₂CO₃水溶液(20mL，2M)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd₂(dbbf)₃(26mg，0.028mmol)，并在100℃下搅拌18小时。冷却到室温并过滤掉固体后，用EA(200mL)萃取过滤物。浓缩有机层至干。通过柱纯化残余物得到粗产物3。

2.反应图示：

实验细节：加热回流化合物3(2g，0.1mol)和Na₂S₂O₄(5.2g，0.3mol)在甲醇(80mL)和H₂O(20mL)中的混合物3小时。减压下浓缩反应物至干。在水中溶解残余物然后用EA(150mL)萃取。用盐水洗涤有机层两次并用Na₂SO₄干燥。滤掉Na₂SO₄后，浓缩过滤物得到产物4。

3.反应图示：

实验细节：在N₂气氛下，向化合物5(228mg，88mmol)和化合物4(150mg，88mmol)，t BuONa(170mg，176mmol)和BINAP(210mg，176mmol)在甲苯(25mL)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd₂(dba)₃(79mg，0.88mmol)，并在80℃下搅拌48小时。过滤掉固体后，浓缩过滤物得到粗产物6。

4.反应图示：

实验细节：在-30℃和N₂气氛下，用BBr₃(600mg，10.6mmol)处理化合物6(140mg，4mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液，然后在室温下搅拌4小时。将反应物倒入冰-水中然后通过添加Na₂CO₃使得pH＝9。用二氯甲烷萃取(25mL×3)所得的混合物，用Na₂SO₄干燥合并的有机层。过滤掉Na₂SO₄后，浓缩过滤物至干。通过柱纯化残余物得到产物7。

5.反应图示：

实验细节：回流下搅拌化合物7(98mg，0.36mmol)和化合物8(64mg，0.3mmol)在无水CH₂Cl₂(300mL)中的溶液6小时。减压下除去溶剂。通过制备-TLC分离残余物得到所需的化合物。

实施例9.

1.反应图示：

实验细节：在N₂气氛下，向化合物1(5.9g，25mmol)和化合物2(3.3g，27mmol)在DMF(50mL)和Na₂CO₃水溶液(20mL，2M)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd₂(dbbf)₃(26mg，0.028mmol)，并在100℃下搅拌18小时。冷却到室温和过滤掉固体后，用EA(200mL)萃取过滤物。浓缩有机层得到粗产物3，在不纯化下将其用于下一步。

2.反应图示：

实验细节：在室温和氢气氛(20psi)下，搅拌3(6.5g，27.9mmol)和Pd(OH)₂(10％，0.5g)在乙醇(200mL)中的混合物2小时。过滤掉催化剂，真空下除去过滤物得到无色油状产物4。

3.反应图示：

实验细节：在N₂气氛下，向化合物4(406mg，20mmol)和化合物5(520mg，20mmol)，及tBuONa(170mg，176mmol)和BINAP(210mg，176mmol)在甲苯(25mL)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd₂(dba)₃(79mg，0.88mmol)，并在80℃下搅拌48小时。过滤掉固体后，浓缩过滤物得到粗产物6，在不纯化下将其用于下一步。

4.反应图示：

实验细节：在-30℃和N₂气氛下，用BBr₃(600mg，10.6mmol)处理化合物6(383mg，10mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液，然后室温下搅拌4小时。将反应物倒入冰-水中，然后通过加入Na₂CO₃使得pH 9。用二氯甲烷萃取(25mL×3)所得混合物，并用Na₂SO₄干燥合并的有机层。过滤掉Na₂SO₄后，浓缩过滤物至干。通过柱纯化残余物得到产物7。

5.反应图示：

实验细节：加热回流7(60mg，0.22mmol)和烟酰醛(33mg，0.15m mol)在二氯甲烷(10mL)中的混合物3小时。除去溶剂后，通过色谱纯化残余物得到所需的化合物。

实施例10.

1.反应图示：

实验细节：室温下搅拌DMAP(9.3g，0.077mol)、化合物1(10g，0.051mol)和Boc₂O(12g，0.051mol)在tBuOH(200mL)中的溶液过夜。减压下除去溶剂并通过快速色谱在硅胶上纯化残余物。(乙酸乙酯/石油醚＝10∶1)得到无色油状的2。

2.反应图示：

实验细节：在室温和氢气氛(50psi)下搅拌2(6.17g，27.9mmol)和Pd(OH)₂(10％，1g)在乙醇(200mL)中的混合物4小时。过滤掉催化剂，真空下除去过滤物得到无色油状的产物3。

3.反应图示：

实验细节：在N₂下加热化合物3(2.65g，12mmol)、化合物4(2.6g，10mmol)、tBuONa(1.34g，14mmol，)、Pd₂(dba)₃(46.5mg，50mmol，)和DCHPB(70mg，0.2mmol)在干燥甲苯(50mL)中的混合物至80-90℃ 24小时。过滤沉淀并在真空下除去过滤物，通过色谱在硅胶上纯化残余物(乙酸乙酯/石油醚＝10∶1)得到黄色油状的5。

4.反应图示：

实验细节：在0℃下，向5(0.9g，2.24mmol)在CHCl₃(50mL)的溶液中加入CF₃COOH(40mL)。加成完成后，在室温下搅拌所得的混合物过夜。减压下除去溶剂至干。从乙醚中重结晶残余物得到灰白色固体。在氨水(10mL)中溶解该固体。通过添加1M HCl使得混合物的pH＝7.0并沉淀。收集沉淀物并用冷水(5mL)洗涤，减压下干燥得到黑色固体的6。

5.反应图示：

实验细节：加热回流6(60mg，0.22mmol)，烟酰醛(33mg，0.15mmol)在二氯甲烷(10mL)中的混合物3小时。除去溶剂后，通过色谱纯化残余物得到黄色固体状的所需化合物。

实施例11.

1.反应图示：

实验细节：在N₂气氛下，向化合物1(6.7g，25mmol)、化合物2(4.1g，27mmol)在DMF(50mL)和Na₂CO₃水溶液(20mL，2M)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd₂(dbbf)₃(26mg，0.028mmol)，并在100℃下搅拌18小时。冷却到室温后并过滤掉固体，用EA(200mL)萃取过滤物。浓缩有机层得到粗产物3。

2.反应图示：

实验细节：在室温和氢气氛(20psi)下，搅拌3(3.2g，10mmol)和Pd(OH)₂(10％，0.5g)在乙醇(200mL)中的混合物2小时。过滤掉催化剂，真空下除去过滤物得到无色油状产物4。

3.反应图：

实验细节：在N₂气氛下，向化合物4(297mg，10mmol)和化合物5(259mg，10mmol)，及tBuONa(170mg，17.6mmo)和BINAP(210mg，17.6mmol)在甲苯(25mL)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd₂(dba)₃(79mg，0.88mmol)，并在80℃下搅拌48小时。过滤掉固体后，浓缩过滤物得到粗产物6，在没有纯化下将其用于下一步。

4.反应图示：

实验细节：在-30℃和N₂气氛下，用BBr₃(600mg，10.6mmol)处理化合物6(446mg，10mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液，然后在室温下搅拌4小时。将反应物倒入冰-水中然后通过添加Na₂CO₃使得pH＝9。用二氯甲烷萃取(25mL×3)所得的混合物，用Na₂SO₄干燥合并的有机层。过滤掉Na₂SO₄后，浓缩过滤物至干。通过柱纯化残余物得到产物7。

5.反应图示：

实验细节：加热回流7(67mg，0.15mmol)，烟酰醛(33mg，0.15mmol)在二氯甲烷(10mL)中的混合物3小时。除去溶剂后，通过色谱纯化残余物得到黄色固体状的所需化合物。

实施例12.

1.反应图示：

实验细节：在N₂气氛下，向化合物1(3g，0.02mol)和化合物2(3.4g，0.02mol)，及KOH(5.28g，0.1mol)和TBBA(6.44g，0.02mol)在无水THF(100mL)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd(PPh₃)₄(2.31g，2mmo1)，并回流下搅拌12小时。过滤掉固体后，浓缩过滤物至干。通过柱纯化残余物得到产物3，在不纯化下将其用于下一步。

2.反应图示：

实验细节：在N₂气氛下，向化合物3(334mg，1.7mmol)和化合物4(434mg，1.7mmo1)，及t-BuONa(322mg，3.4mmol)和BINAP(420mg，0.67mol)在甲苯(60mL)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd₂(dba)₃(156mg，0.017mmol)，并在80℃下搅拌48小时。过滤掉固体后，浓缩过滤物至干。通过柱纯化残余物得到产物5。

3.反应图示：

实验细节：在-30℃和N₂气氛下，用BBr₃(393mg，0.6mmol)处理化合物5(100mg，0.3mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液，然后室温下搅拌4小时。将反应物倒入冰-水中然后加入Na₂CO₃。用二氯甲烷(25mL×3)萃取所得的混合物，用Na₂SO₄干燥合并的有机层。

过滤掉Na₂SO₄后，浓缩过滤物得到粗产物6。

4.反应图示：

实验细节：加热回流6(39mg，0.13mmol)、烟酰醛(29mg，0.13mmol)在二氯甲烷(10mL)中的混合物3小时。除去溶剂后，通过色谱纯化残余物得到黄色固体状的所需化合物。

实施例13.

1.反应图示：

实验细节：将多聚甲醛(1.8g，59.3mmol)添加到化合物1(1.0g，5.9mmol)在乙酸(40mL)的溶液中，然后在10℃下加入NaCNBH₃(1.8g，28.8mmol)。在室温下搅拌16小时，将溶液倒入冰/水(100mL)中，用浓NaOH调节PH至10。DCM(3×100mL)萃取该溶液。干燥合并的有机层(MgSO₄)，过滤并在真空下浓缩得到化合物2。

2.反应图示：

实验细节：在1atm氢气下用Pd/C氢化0.84g(4.3mmol)化合物216小时。在没有进一步纯化下，过滤反应混合物并浓缩过滤物得到化合物3。

3.反应图示：

实验细节：在150℃和微波下，使250mg(1.51mmol)化合物3、0.2eq BINAP、0.1eq Pd₂(dba)₃、3eq Cs₂CO₃和5-溴-2-二乙氧基甲基-吡啶(0.783g，3.01mmol)在10mL 1，4-二噁烷的溶液反应2小时。通过LC-Ms监测反应。浓缩混合物并通过制备型TLC纯化残余物得到化合物4。

4.反应图示：

实验细节：向300mg(0.55mmol)化合物4在5mL DCM的溶液中加入4mL TFA。室温下搅拌反应混合物30分钟。向混合物加入冰/水并通过NaHCO₃碱化到PH＝10，用DCM(15mL*3)萃取。用水和盐水洗涤合并的有机层，用MgSO₄干燥，过滤并浓缩得到化合物5。

5.反应图示：

实验细节：在25℃下搅拌80mg(0.295mmol)化合物5和(5-氟-4-吗啉基-4-基-嘧啶基-2-基)-肼(125mg，0.59mmol)在10mL DCM中的溶液15小时。浓缩反应混合物并通过制备型HPLC纯化残余物得到化合物6。

6.反应图示：

实验细节：在0℃下，向化合物6(40mg，0.086mmol)在干燥DCM(5mL)的溶液中逐滴加入BBr(22mg，0.258mmol)。室温下搅拌反应混合物3小时。用甲醇淬灭反应，并浓缩混合物。通过制备型HPLC纯化残余物得到所需的化合物。

实施例14.

1.反应图示：

实验细节：在N₂气氛下向搅拌的3-溴苯胺(0.86g)在30ml甲苯的溶液中加入0.1eq的Pd(PPh₃)₄、5ml饱和Na₂CO₃水溶液、和3-甲氧基苯基硼酸(0.75g)在10ml EtOH中的溶液。回流下剧烈搅拌混合物15小时并冷却，加入10ml H₂O，并用CH₂Cl₂(20ml×3)萃取混合物。用Na₂SO₄干燥合并的有机层并浓缩。通过柱色谱(PE/EA＝10∶1)纯化残余物得到纯的化合物2。

2.反应图示：

反应细节：在150℃下，使化合物2(59.5mg)，5-溴-2-二乙氧基甲基-吡啶(116.7mg)、t-BuONa(86.4mg)、BINAP(36.7mg)和Pd₂(dba)₃(27.4mg)在二噁烷(2ml)中的混合物进行微波处理2小时，过滤溶液并浓缩。通过制备型TLC纯化残余物得到化合物3。

3.反应图示：

反应细节：向化合物3(120mg)在5ml DCM的溶液中加入1ml BBr₃，室温下搅拌反应过夜。然后向混合物中加入5ml H₂O，用EtOAc萃取并浓缩。通过制备型TLC纯化粗产物得到化合物4。

4.反应图示：

实验细节：室温下搅拌43.5mg化合物4和32mg肼在5ml DCM中的混合物过夜并浓缩。通过制备型TLC纯化粗产物得到所需化合物。

实施例15.

1.反应图示：

实验细节：在100℃下，使2.0g(16.2mmol，1.0eq)化合物1、0.05eq BINAP、0.05eq Pd₂(dba)₃、1.2eq t-BuONa和1-溴-3-硝基-苯(3.28g，16.2mmol，1.0eq)在20mL无水甲苯中的溶液反应24小时。通过LC-MS监测反应。浓缩混合物并通过柱色谱纯化残余物得到化合物2。

2.反应图示：

实验细节：在1atm氢气下用Pd/C(0.25g)氢化2.5g化合物216小时。过滤反应混合物，在没有进一步纯化下浓缩过滤物得到化合物3。

3.反应图示：

实验细节：在100℃下，使500mg(2.33mmol)化合物3、5-溴-2-二氧基甲基吡啶(607mg，2.33mmol)、0.05eq xantphos、0.05eq Pd₂(dba)₃和1.5eq t-BuONa在10mL甲苯中的溶液回流24小时。通过LC-MS监测反应。浓缩混合物并通过柱色谱纯化残余物得到化合物4。

4.反应图示：

实验细节：用1mL HCl(1N水溶液)和10mL二噁烷处理100mg化合物4。室温下搅拌混合物4小时，用0.5N NaOH溶液调节至pH 8-9。用DCM萃取后，用Na₂SO₄干燥有机层并浓缩得到化合物5。

5.反应图示：

实验细节：在25℃下搅拌50mg(0.16mmol)化合物5和(5-氟-4-吗啉基-4-基嘧啶基-2-基)-肼(50mg，0.23mmol)在5mL DCM中的溶液15小时。浓缩反应混合物并通过制备型HPLC纯化残余物得到化合物6。

6.反应图示：

实验细节：在0℃下向化合物6(50mg，0.09mmol)在干燥DCM(5mL)的溶液中逐滴加BBr₃(20mg，0.25mmol)。室温下搅拌反应混合物3小时。用甲醇淬灭反应，然后浓缩混合物。通过制备型HPLC纯化残余物得到所需的化合物.

实施例16.

1.反应图示：

实验细节：在130℃下加热10g(70.92mmol)3-氟-硝基苯、1eq咪唑和2eq K₂CO₃在100ml DMSO中的溶液5小时。通过LC-MS监测反应。然后加入500mL水并过滤沉淀，在没有进一步纯化下用水洗涤该固体并干燥得到化合物2.

2.反应图示：

实验细节：在1atm氢气下用Pd/C氢化5g(31.4mmol)化合物2半小时。在没有进一步纯化下，过滤反应混合物并浓缩过滤物得到化合物3。

3.反应图示：

实验细节：在130℃下，回流500mg(3.14mmol)化合物3、0.1eqxantphose、0.1eq Pd₂(dba)₃和1.5eq t-BuONa在10mL甲苯中的溶液15小时。通过LC-Ms监测反应并用水洗涤，用EtOAc萃取。用盐水洗涤合并的有机层并用MgSO₄干燥。过滤并浓缩，通过制备型TLC纯化残余物得到化合物4。

4.反应图示：

实验细节：向200mg化合物4在5mL 1，4-二噁烷的溶液中加入8mL 4N HCl并在80℃下加热2小时。通过2N NaOH碱化反应混合物至ph＝10并用DCM(15mL*3)萃取。用水和盐水洗涤合并的有机层并用MgSO₄干燥，过滤并浓缩得到250mg粗产物。通过制备型TLC纯化粗产物得到化合物5。

5.反应图示：

实验细节：在25℃下搅拌80mg化合物5和1eq化合物6在5mLDCM中的溶液15小时。浓缩反应混合物并通过制备型HPLC纯化残余物得到所需的化合物。

实施例17.

1.反应图示：

实验细节：在130℃下回流1.50g 1-溴-3-甲基-5-硝基-苯和1.60g(1.2eq)哌嗪-1-甲酸叔丁酯、0.1eq xantphos、0.1eq Pd₂(dba)₃和1.5eq t-BuONa在20mL甲苯中的溶液4小时。通过LC-Ms监测反应，用水洗涤并用EtOAc萃取。用盐水洗涤合并的有机层并用Na₂SO₄干燥。过滤并浓缩，通过柱色谱在硅胶上纯化残余物(采用10∶1 PA∶EA作为洗脱剂)。合并适当级分并减压浓缩得到中间体1。

2.反应图示：

实验细节：在1atm氢气下用Raney/Ni氢化1.6g中间体12小时。在没有进一步纯化下，过滤反应混合物并浓缩过滤物得到中间体2。

3.反应图示：

实验细节：在130℃下回流1.20g中间体2、1.30g(1.20eq)5-溴-2-二乙氧基甲基-吡啶、0.1eq xantphose、0.1eq Pd₂(dba)₃和1.5eq t-BuONa在20mL甲苯中的溶液4小时。通过LC-Ms监测反应，用水洗涤并用EtOAc萃取。用盐水洗涤合并的有机层并用Na₂SO₄干燥。过滤并浓缩，用柱色谱在硅胶上纯化残余物(采用4∶1 PA∶EA作为洗脱液)。合并适当的级分并在减压下浓缩得到中间体3。

4.反应图示：

实验细节：在10ml DCM中溶解200mg中间体3。将130mg TFA逐滴加入到反应混合物溶液并室温下搅拌3小时。反应混合物用NaHCO₃溶液碱化到中性，盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩得到220mg粗产物。通过制备型TLC纯化粗产物得到中间体4。

5.反应图示：

实验细节：室温下搅拌50mg中间体4和1.0eq(5-氟-4-吗啉基-4-基嘧啶基-2-基)-肼在5mL DCM中的溶液3小时。用水和盐水洗涤反应混合物，浓缩得到残余物并通过制备型HPLC纯化得到所需化合物。

实施例18.

1.反应图示：

实验细节：在0℃下将15ml 1M BH₃/THF逐滴加入到3g(13.95mmol)4-溴-2-甲基-苯甲酸在20ml THF的溶液中。使反应溶液到达室温持续1小时并通过逐滴加入50ml 50％THF水溶液淬灭反应。用Na₂CO₃处理混合物并浓缩。用Et₂O萃取残余物。干燥有机层得到化合物2。

2.反应图示：

实验细节：向2.4g(11.9mmol)化合物2在20ml DCM的溶液中加入5.1g(23.8mmol)PCC在60ml DCM中的浆状物。室温下搅拌反应溶液1小时，用300ml Et₂O稀释并过滤。浓缩过滤物得到化合物3.

3.反应图示：

实验细节：将2.1g(14mmol)溶液加入到含有1.9g(9.55mmol)化合物3的乙醇溶液中。加热回流反应溶液3小时，然后浓缩。用NaHCO₃洗涤固体并用乙酸乙酯萃取。干燥有机层得到化合物4。

4.反应图示：

实验细节：将0.7g化合物4、0.41g 3-三氟甲基-苯胺0.32gPd₂(dba)₃、0.21g binap和0.02g t-BuONa添加到35ml甲苯中。加热回流反应溶液过夜，并浓缩。通过柱色谱纯化粗产物(乙酸乙酯/己烷＝1∶1)得到化合物5。

5.反应图示：

实验细节：用4mL 1N HCl处理化合物5(0.2g，1.0eq)在10mL二噁烷中的溶液，并加热混合物至60℃ 2小时。冷却后，通过添加NaHCO₃调节pH至8。用二氯甲烷萃取混合物，用水洗涤有机层，用Na₂SO₄干燥并蒸发至干。通过柱色谱纯化粗产物得到化合物6。

6.反应图示：

实验细节：在25℃下搅拌80mg化合物6和1eq化合物7在5mLDCM中的溶液15小时。浓缩反应混合物并通过制备型HPLC纯化残余物得到所需的化合物。

实施例19.

1.反应图示：

实验细节：向化合物1(0.5g，1.0eq)、3-三氟甲基苯基硼酸(0.63g，1.0eq)、Na₂CO₃(0.46g，1.5eq)在15mL二噁烷的混合物中加入Pd(PPh₃)₄(0.33g，0.1eq)，并在N₂下回流反应混合物16小时。冷却后，过滤混合物并蒸发过滤物至干，通过柱色谱纯化得到化合物2。

2.反应图示：

实验细节：在N₂下回流化合物2(0.2g，1.0eq)、SeO₂(0.19g，2.0eq)在10mL乙酸中的混合物48小时。通过蒸发除去溶剂并在水中溶解残余物，用饱和的NaHCO₃溶液调节至pH 6，用二氯甲烷萃取。收集有机层，干燥并蒸发至干。通过柱色谱纯化粗产物得到化合物3。

3.反应图示：

实验细节：室温下搅拌化合物3(30mg，1.0eq)和化合物4(19mg，1.0eq)在5mL二氯甲烷中的混合物过夜。浓缩混合物至干并通过制备型HPLC纯化得到所需的化合物。

实施例20.

1.反应图示：

实验细节：室温下搅拌化合物1(0.5g，1.0eq)、三氟甲基苯胺(0.58g，1.0eq)、EDC(1.05g，1.5eq)、和HOBt(50mg，0.1eq)在15mL二氯甲烷中的混合物过夜。用1N NaOH溶液、水洗涤混合物，用二氯甲烷萃取。用Na₂SO₄干燥有机层，浓缩至干，通过柱色谱纯化得到化合物2。

2.反应图示：

实验细节：在N₂下回流化合物2(0.2g，1.0eq)、SeO₂(0.16g，2.0eq)在10mL乙酸中的混合物48小时。通过蒸发除去溶剂并在水中溶解残余物，用饱和NaHCO₃溶液调节至pH6并用二氯甲烷萃取。收集有机层，干燥并蒸发至干。通过柱色谱纯化粗产物得到化合物3。

3.反应图示：

实验细节：室温下搅拌化合物3(40mg，1.0eq)和化合物4(30mg，1.0eq)在5mL二氯甲烷中的混合物过夜。收集沉淀并用二氯甲烷洗涤，真空下干燥得到所需的化合物.

实施例21.

1.反应图示：

实验细节：回流化合物1(3.0g，1.0eq)和2mL 98％H₂SO₄在10mL EtOH中的溶液4小时，冷却至室温并蒸发至干，用水稀释，用NaHCO₃调节至pH8，用二氯甲烷萃取。干燥有机层并浓缩得到化合物2。

2.反应图示：

实验细节：在N₂下回流化合物2(1.7g，1.0eq)、SeO₂(2.29g，2.0eq)在80mL乙酸的混合物48小时。通过蒸发除去溶剂并在水中溶解残余物，用饱和的NaHCO₃溶液调节至pH6，用二氯甲烷萃取。收集有机层，干燥并蒸发至干。通过柱色谱纯化粗产物得到化合物3。

3.反应图示：

实验细节：回流化合物3(1.1g，1.0eq)，二乙氧基甲氧基-乙烷(2.3g，2.5eq)和TsOH.H₂O(0.12g，0.1eq)在20mL乙醇中的溶液5小时。蒸发溶剂并在EtOAc中溶解固体，用水洗涤。用Na₂SO₄干燥有机层并蒸发得到化合物4。

4.反应图示：

实验细节：向化合物4(0.6g，1.0eq)在10mL甲醇的溶液中加入4mL 1N NaOH溶液，在室温下搅拌混合物过夜。蒸发溶剂并用5％柠檬酸酸化残余物至pH6，用二氯甲烷萃取。干燥有机层，浓缩得到化合物5。

5.反应图示：

实验细节：室温下搅拌化合物5(0.4g，1.0eq)、三氟甲基苯胺(0.29g，1.0eq)、EDC(0.51g，1.5eq)、HOBt(25mg，0.1eq)在10mL二氯甲烷中的混合物过夜。用1N NaOH溶液、水洗涤混合物，用二氯甲烷萃取。用Na₂SO₄干燥有机层，浓缩至干，通过柱色谱纯化得到化合物6.

6.反应图示：

实验细节：用4mL 1N HCl处理化合物6(0.2g，1.0eq)在10mL二噁烷中的溶液，并加热混合物至60℃ 2小时。冷却后，通过添加NaHCO₃调节pH至8。用二氯甲烷萃取混合物，用水洗涤有机层，用Na₂SO₄干燥并蒸发至干。通过柱色谱纯化粗产物得到化合物7。

7.反应图示：

实验细节：室温下搅拌化合物7(30mg，1.0eq)和化合物8(19mg，1.0eq)在5mL二氯甲烷中的混合物过夜。收集沉淀并用二氯甲烷洗涤，真空下干燥得到所需的化合物。

实施例22.

1.反应图示：

实验细节：在N₂下回流化合物1(2.0g，1.0eq)、SeO₂(2.6g，2.0eq)在80mL乙酸中的混合物36小时。通过蒸发除去溶剂并在水中溶解残余物，用饱和的NaHCO₃溶液调节至pH6，用二氯甲烷萃取。收集有机层，干燥并蒸发至干。通过柱色谱纯化粗产物得到化合物2。

2.反应图示：

实验细节：回流化合物2(0.5g，1.0eq)、二乙氧基甲氧基-乙烷(1.0g，2.5eq)和TsOH.H₂O(0.05g，0.1eq)在8mL乙醇中的溶液3小时。蒸发溶剂并在EtOAc中溶解该固体，用水洗涤。用Na₂SO₄干燥有机层并蒸发得到化合物3。

3.反应图示：

实验细节：在N₂下向化合物3(0.6g，1.0eq)、3-三氟甲基-苯胺(0.37g，1.0eq)、t-BuONa(0.26g，1.2eq)在15mL甲苯的混合物中加入Pd₂(dba)₃(42mg，0.02 eq)和xantphos(28mg，0.02eq)。在N₂下回流混合物16小时，冷却，过滤。浓缩过滤物并通过柱色谱纯化得到化合物4。

4.反应图示：

实验细节：用4mL 1N HCl处理化合物4(0.25g，1.0eq)在10mL二噁烷中的溶液，并加热混合物至60℃ 2小时。冷却后，通过添加NaHCO₃调节pH至8。用二氯甲烷萃取混合物，用水洗涤有机层，用Na₂SO₄干燥并蒸发至干。通过柱色谱纯化粗产物得到化合物5.

5.反应图示：

实验细节：室温下搅拌化合物5(30mg，1.0eq)和化合物6(19mg，1.0eq)在5mL二氯甲烷中的混合物过夜。收集沉淀并用二氯甲烷洗涤，真空下干燥得到所需的化合物。

实施例23.

1.反应图示：

实验细节：0℃下，在30分钟内向化合物1(14g，0.1mol)在含水HBr(30mL)的溶液中加入NaNO₂(8.3g 0.15mol)在H₂O(10mL)中的溶液。搅拌60分钟后，在80℃下将反应混合物添加到CuBr(14g，0.1mol)在含水HBr(16mL)的溶液中。完全加入后，在相同温度下搅拌反应混合物2小时。冷却到室温后，用EA(100mL×3)萃取反应混合物。用盐水洗涤合并的有机层并用Na₂SO₄干燥。过滤掉Na₂SO₄后，浓缩过滤物至干。通过柱纯化残余物得到产物2。

2.反应图示：

实验细节：在N₂气氛下向化合物2(4.11g，0.02mol)和化合物3(4.74g，0.02mol)，及KOH(5.28g，0.1mol)和TBBA(6.44g，0.02mol)在无水THF(100mL)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd(PPh₃)₄(2.31g，2mmol)，在回流下搅拌12小时。过滤掉固体后，浓缩过滤物至干。通过柱纯化残余物得到产物4。

3.反应图示：

实验细节：用TFA(1mL)处理4(1g，3mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液，然后室温下搅拌6小时。减压下除去溶剂得到产物5，在没有纯化下将其用于下一步。

4.反应图示：

实验细节：在N₂气氛下向化合物5(619mg，2.4mmol)和化合物6(520mg，2.4mmol)，及t BuONa(460mg，4.8mmol)和BINAP(599mg，6.9mol)在甲苯(60mL)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd₂(dba)₃(221mg，0.024mmol)，在80℃下搅拌48小时。过滤掉固体后，浓缩过滤物至干。通过柱纯化残余物得到产物7。

5.反应图示：

实验细节：在-30℃和N₂气氛下，用BBr₃(146mg，0.6mmol)处理化合物7(396mg，0.1mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液，然后室温下搅拌4小时。将反应物倒入冰-水中然后加入Na₂CO₃。用二氯甲烷萃取(25mL×3)所得的混合物，用Na₂SO₄干燥合并的有机层.过滤掉Na₂SO₄后，浓缩过滤物得到粗产物8，在没有纯化下将其用于下一步。

6.反应图示：

实验细节：在回流下搅拌化合物8(32.2mg，0.1mmol)和化合物9(21mg，0.1mmol)在无水CH₂Cl₂(300mL)中的溶液6小时。减压下除去溶剂。通过制备-TLC分离残余物得到所需的化合物。

实施例24.

1.反应图示：

实验细节：用POCl₃(500mL)处理5-氟-1H-嘧啶-2，4-二酮(113g，0.5mol)在N，N-二甲基苯胺(70mL)中的溶液，然后回流2小时。

冷却到室温后，将反应混合物倒入冰-水肿。用乙酸乙酯(100mL×3)萃取所得的混合物。用饱和的NaHCO₃水溶液洗涤合并的有机层，然后用盐水洗涤。减压下除去溶剂得到化合物2。

2.反应图示：

实验细节：在-10℃ 15分钟内向化合物2(20.8g，0.194mol)在乙醇(300mL)的溶液中逐滴加入吗啉(21.6g，0.25mol)。室温下搅拌该混合物0.5小时，然后加热至50℃ 15分钟。冷却到室温后并用水稀释，沉淀固体。通过过滤收集固体并用水洗涤得到化合物3。

3.反应图示：

实验细节：回流加热3(4.6g，17.5mmol)和肼(8.75g，87.5mmol)在乙醇(40mL)中的溶液6小时。冷却和沉淀后，通过过滤收集沉淀并用乙醇洗涤得到化合物4。

4.反应图示：

实验细节：在-15℃和N₂气氛下，用BuMgCl(37.5mL，60mmol)处理化合物5(14g，50mmol)在无水THF(100mL)中的溶液。完全加成后，在该温度下搅拌混合物1小时。在0℃下30分钟内将无水DMF(0.54g，75mmol)加入到反应混合物，然后回温至室温1小时。通过添加2M HCl(80mL)淬灭反应混合物。用乙酸乙酯(50mL×3)萃取所得的混合物。用Na₂SO₄干燥合并的有机层。浓缩溶剂至干，通过柱分离残余物得到化合物6。

5.反应图示：

实验细节：在痕量的TsOH存在下加热化合物6(4.5g，22.5mmol)在原甲酸三乙酯(15mL)中的溶液过夜。用乙酸乙酯(100mL)稀释反应混合物并用5％ Na₂CO₃水溶液洗涤。分离有机层并用Na₂SO₄干燥。浓缩溶剂得到化合物7。

6.反应图示：

实验细节：在N₂气氛下向化合物7(1.3g，5mmol)和化合物8(0.97g，6mmol)，和t BuONa(0.7g，7mmol)和P(t-Bu)₃(15mg)在甲苯(60mL)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd₂(dba)₃(23mgl)，并在回流下搅拌12小时。过滤掉固体后，浓缩过滤物至干。通过柱纯化残余物得到产物9。

7.反应图示：

实验细节：在-30℃和N₂气氛下，用BBr₃(146mg，0.6mmol)处理化合物9(200mg，0.58mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液，然后室温下搅拌4小时。将反应物倒入冰-水中然后加入Na₂CO₃。用二氯甲烷萃取(25mL×3)所得的混合物，用Na₂SO₄干燥合并的有机层。过滤掉Na₂SO₄后，浓缩过滤物得到粗产物10。

8.反应图示：

实验细节：在回流下搅拌化合物10(48.7mg，0.2mmol)和化合物4(63mg，0.2mmol)在无水CH₂Cl₂(300mL)中的溶液6小时。减压下除去溶剂。通过制备-TLC分离残余物得到所需的化合物。

实施例25.

1.反应图示：

实验细节：回流加热3(2.4g，11mmol)和甲基肼(2g，45mmol)在乙醇(40mL)中的溶液6小时。冷却和沉淀后，通过过滤收集沉淀并用乙醇洗涤得到化合物2。

2.反应图示：

实验细节：回流搅拌化合物2(28mg，0.1mmol)和化合物3(37mg，0.1mmol)在无水CH₂Cl₂(300mL)中的溶液6小时。减压下除去溶剂。通过制备-TLC分离残余物得到所需的化合物。

实施例26.

1.反应图示：

实验细节：在-20℃下用MeMgCl(15mL.0.038mol)处理1(2g，0.011mol)在无水THF(100mL)中的溶液，并在该温度下搅拌2小时。通过加入饱和的NH₄Cl水溶液淬灭反应混合物。用乙酸乙酯(100mL×3)萃取所得的混合物。用盐水洗涤合并的有机层。减压下除去溶剂得到化合物2。

2.反应图示：

实验细节：在痕量的TsOH存在下加热化合物2(2g，0.01mol)和乙二醇(3g，0.048mol)在苯胺(100mL)中的溶液3小时。用乙酸乙酯(100mL)稀释反应混合物并用5％ Na₂CO₃水溶液洗涤。分离有机层并用Na₂SO₄干燥。浓缩溶剂得到化合物3。

3.反应图示：

实验细节：在N₂气氛下，向化合物3(0.4g，1.6mmol)和化合物4(0.3g，1.9mmol)，及t BuONa(0.22g，2mmol)和P(t-Bu)₃(59mg)在甲苯(30mL)的搅拌和脱气的混合物中加入Pd₂(dba)₃(29mgl)，并在回流下搅拌12小时。过滤掉固体后，浓缩过滤物至干。通过柱纯化残余物得到产物5。

4.反应图示：

实验细节：在-30℃和N₂气氛下用BBr₃(146mg，0.6mmol)处理化合物5(100mg，0.3mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液，然后室温下搅拌4小时。将反应物倒入冰-水中然后加入Na₂CO₃。用二氯甲烷萃取(25mL×3)所得的混合物，用Na₂SO₄干燥合并的有机层。过滤掉Na₂SO₄后，浓缩过滤物得到粗产物6。

5.反应图示：

实验细节：在回流下搅拌化合物6(64mg，0.2mmol)和化合物7(45mg，0.2mmol)在无水CH₂Cl₂(300mL)中的溶液6小时。减压下除去溶剂。通过制备-TLC分离残余物得到所需的化合物。

实施例27.

1.反应图示：

实验细节：在回流下将1(5.2g，22mmol)和2(2.44g，20mmol)在2M Na₂CO₃水溶液(25mL)和甲苯(40mL)中的混合物与Pd(PPh₃)₄(0.57g，0.05mmol)搅拌过夜。用乙酸乙酯(100mL×3)萃取反应混合物。用盐水洗涤合并的有机层。减压下除去溶剂至干。通过柱纯化残余物得到3。

2.反应图示：

实验细节：在-60℃和N₂气氛下，用n-BuLi(1.5mL，3.75mmol)处理化合物3(0.78g，3.3mmol)和三异丙基硼酸酯(1mL，4mmol)在无水甲苯(50mL)中的溶液。完全加成后，在-10℃下搅拌该混合物1小时。通过添加2M HCl水溶液淬灭反应混合物并用甲苯洗涤。通过添加Na₂CO₃使得水层pH＝8，然后用乙酸乙酯(50mL×3)萃取。用盐水洗涤合并的有机层。减压下除去溶剂至干。通过柱分离残余物得到4。

3.反应图示：

实验细节：在回流下将化合物4(2.8g，14mmol)和化合物5(7g，42mmol)在2M Na₂CO₃水溶液(250mL)和甲苯(40mL)中的搅拌和脱气的混合物与Pd(PPh₃)₄(0.57g，0.05mmo)搅拌过夜。用乙酸乙酯(100mL×3)萃取反应混合物。用盐水洗涤合并的有机层。减压下除去溶剂至干。通过柱分离残余物得到6。

4.反应图示：

实验细节：在回流下搅拌6(0.53g，1.9mmol)和肼(0.52g，8.8mmol)在乙醇(50mL)中的溶液6小时。冷却和沉淀后，通过过滤收集沉淀并用乙醇洗涤得到化合物7。

5.反应图示：

实验细节：在回流下搅拌化合物7(53mg，0.13mmol)和化合物8(79mg，0.13mmol)在无水CH₂Cl₂(300mL)中的溶液6小时。减压下除去溶剂。通过制备-TLC纯化残余物得到所需的化合物。

实施例28.

1.反应图示：

实验细节：在回流下将1(3.1g，13mmol)和2(1g，12mmpl)在2M Na₂CO₃水溶液(15mL)和甲苯(30mL)中的混合物与Pd(PPh₃)₄(0.4g，0.029mmol)搅拌过夜。用乙酸乙酯(100mL×3)萃取反应混合物。用盐水洗涤合并的有机层。减压下除去溶剂至干。通过柱分离残余物得到3。

2.反应图示：

实验细节：在-60℃和N₂气氛下，用n-BuLi(12mL，30mmol)处理化合物3(2.0g，10mmol)和三异丙基硼酸酯(7mL，30mmol)在无水甲苯(50mL)中的溶液。完全加成后，在-10℃下搅拌该混合物1小时。通过添加2m HCl水溶液淬灭反应混合物，并用甲苯洗涤。通过添加Na₂CO₃使得水层pH＝8，然后用乙酸乙酯(50mL×3)萃取。用盐水洗涤合并的有机层。减压下除去溶剂至干。通过柱分离残余物得到4。

3.反应图示：

实验细节：在回流下将化合物4(0.5g，3mmol)和化合物5(1.5g，9mmol)在2M Na₂CO₃水溶液(3.5mL)和甲苯(40mL)的搅拌和脱气的混合物与Pd(PPh₃)₄(94mg，0.003mmol)搅拌过夜。用乙酸乙酯(100mL×3)萃取反应混合物。用盐水洗涤合并的有机层。减压下除去溶剂至干。通过柱纯化残余物得到6。

4.反应图示：

实验细节：在回流下搅拌6(0.24g，1mmol)和肼(0.3g，4.7mmol)在乙醇(50mL)中的溶液6小时。冷却和沉淀后，通过过滤收集沉淀并用乙醇洗涤得到化合物7。

5.反应图示：

实验细节：在回流下搅拌化合物7(70mg，0.29mmol)和化合物8(83mg，0.3mmol)在无水CH₂Cl₂(300mL)中的溶液6小时。减压下除去溶剂。通过制备-TLC纯化残余物得到所需的化合物。

实施例29.

1.反应图示：

实验细节：向化合物2(0.83g，5mmol)在乙醇(100mL)的溶液中逐滴加入苄胺(0.54g，5mmol)。搅拌2小时后，用水稀释反应混合物。用乙酸乙酯(50mL×3)萃取所得的混合物。用Na₂SO₄干燥合并的有机层。浓缩溶剂得到化合物3。

2.反应图示：

实验细节：加热回流3(1.18g，5mmol)和肼(5ml)在乙醇(40mL)中的溶液6小时。冷却和沉淀后，通过过滤收集沉淀并用乙醇洗涤得到化合物4。

3.反应图示：

实验细节：在回流下搅拌化合物4(48.7mg，2mmol)和化合物5(63mg，0.2mmol)在无水CH₂Cl₂(300mL)中的溶液6小时。减压下除去溶剂。通过制备-TLC分离残余物得到所需的化合物。

实施例30.

1.反应图示：

实验细节：向化合物1(0.83g，5mmol)在乙醇(100mL)的溶液中逐滴加入化合物2(0.35g，5mmol)。搅拌2小时后，用水稀释反应混合物。用乙酸乙酯(50mL×3)洗涤所得的混合物。用Na₂SO₄干燥合并的有机层。浓缩溶剂得到化合物3。

2.反应图示：

实验细节：加热回流3(1.0g，5mmol)和肼(5mL)在乙醇(40mL)中的溶液6小时。冷却和沉淀后，通过过滤收集沉淀并用乙醇洗涤得到化合物4。

3.反应图示：

实验细节：在回流下搅拌化合物4(480mg，2mmol)和化合物5(60mg，0.2mmol)在无水CH₂Cl₂(300mL)中的溶液6小时。减压下除去溶剂。通过制备-TLC分离残余物得到所需的化合物。

将所有涉及的任意公开文献、专利或其它引用的参考文献引入本文作为参考。

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Claims

1.具有通式I的化合物：

或其药学可接受的盐或水合物，其中：

环A为嘧啶环；虚线表示任选的双键；

各个R¹独立地选自H、带有1-6个碳原子的烷基、含有3-7个碳原子的环烷基、含有2-6个碳原子的链烯基、含有2-6个碳原子的炔基、CN、CF₃、NO₂、OR¹¹、-(CH₂)_pC(O)(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pC(O)N(R¹²)(R¹³)、-(CH₂)_pC(O)O(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pN(R¹¹)(CH₂)_qC(O)R¹¹、-(CH₂)_pN(R¹²)(R¹³)、-N(R¹¹)SO₂R¹¹、-OC(O)N(R¹²)(R¹³)、-SO₂N(R¹²)(R¹³)、卤素、选自苯基、吡啶基、吡唑基、萘基和喹啉的芳基和含有5或6个环原子的杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R¹基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环；

n为0-6；

各个R¹¹独P立地选自H、带有1-6个碳原子的烷基、含有3-7个碳原子的环烷基、含有2-6个碳原子的链烯基、含有2-6个碳原子的炔基、选自苯基、吡啶基、吡唑基、萘基和喹啉的芳基和含有5或6个环原子的杂环；

各个R¹²和R¹³独立地选自H、带有1-6个碳原子的烷基、含有3-7个碳原子的环烷基、含有2-6个碳原子的链烯基、含有2-6个碳原子的炔基、选自苯基、吡啶基、吡唑基、萘基和喹啉的芳基和含有5或6个环原子的杂环；或R¹²和R¹³可以与它们所连接的氮一起形成可以任选含有一个额外杂原子的5-至7-元环；其中5-至7-元环可以任选被1至3个独立选自带有1-6个碳原子的烷基、含有3-7个碳原子的环烷基、含有2-6个碳原子的链烯基、含有2-6个碳原子的炔基、CN、CF₃、NO₂、OR⁰、CO₂R⁰、C(O)R⁰、卤素、选自苯基、吡啶基、吡唑基、萘基和喹啉的芳基和含有5或6个环原子的杂环的取代基取代；

p为0-4；

q为0-4；

R²选自-CR²¹ _a-、-NR²² _b-和-(C＝R²³)-；

各个R²²独立地选自H和C_1-3烷基；

R²³选自O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

R³选自-CR³¹ _c-、-NR³² _d-、-SO₂-和-(C＝R³³)-；

各个R³¹基团选自H、卤素、-NH₂、-N(H)(R⁰)，-N(R⁰)₂、-O-R⁰，OH和C_1-3烷基；

各个R³²基团选自H、带有1-6个碳原子的烷基、含有3-7个碳原子的环烷基、含有2-6个碳原子的链烯基、含有2-6个碳原子的炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、选自苯基、吡啶基、吡唑基、萘基和喹啉的芳基和含有5或6个环原子的杂环；

R³³选自O、S、N-R³⁴和N-OR⁰；

R³⁴选自H、NO₂、CN、带有1-6个碳原子的烷基、含有3-7个碳原子的环烷基、含有2-6个碳原子的链烯基、含有2-6个碳原子的炔基、选自苯基、吡啶基、吡唑基、萘基和喹啉的芳基和含有5或6个环原子的杂环；

R⁴选自-CR⁴¹ _e-、-NR⁴² _f-、-(C＝R⁴³)-、-SO₂-和-O-；

各个R⁴¹选自H、带有1-6个碳原子的烷基、含有3-7个碳原子的环烷基、含有2-6个碳原子的链烯基、含有2-6个碳原子的炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、选自苯基、吡啶基、吡唑基、萘基和喹啉的芳基和含有5或6个环原子的杂环；

各个R⁴²基团选自H、带有1-6个碳原子的烷基、含有3-7个碳原子的环烷基、含有2-6个碳原子的链烯基、含有2-6个碳原子的炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、选自苯基、吡啶基、吡唑基、萘基和喹啉的芳基和含有5或6个环原子的杂环；

各个R⁴³选自O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

R⁵为具有下面通式的基团：

X³为N或CH；

R⁷⁰选自卤素、带有1-6个碳原子的烷基、CN、N(R⁷¹)₂、含有5或6个环原子的环-氨基、NO₂、OR⁷¹和CF₃；

各个R⁷¹选自H、带有1-6个碳原子的烷基、选自苯基、吡啶基、吡唑基、萘基和喹啉的芳基和含有5或6个环原子的杂环；

各个R⁰独立地选自H、带有1-6个碳原子的烷基、含有3-7个碳原子的环烷基、选自苯基、吡啶基、吡唑基、萘基和喹啉的芳基和含有5或6个环原子的杂环；

a为1或2；

b为0或1；

c为1或2；

d为0或1；

e为1或2；并且

f为0或1。

2.权利要求1所述的化合物，其中环A选自

和

组成的组，其中：

R¹独立地选自H、带有1-6个碳原子的烷基、含有3-7个碳原子的环烷基、含有2-6个碳原子的链烯基、含有2-6个碳原子的炔基、CN、CF₃、NO₂、OR¹¹、-(CH₂)_pC(O)(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pC(O)N(R¹²)(R¹³)、-(CH₂)_pC(O)O(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pN(R¹¹)C(O)R¹¹、-(CH₂)_pN(R¹²)(R¹³)、-N(R¹¹)SO₂R¹¹、-OC(O)N(R¹²)(R¹³)、-SO₂N(R¹²)(R¹³)、卤素、选自苯基、吡啶基、吡唑基、萘基和喹啉的芳基和含有5或6个环原子的杂环组成的组；

各个R¹¹独立地选自H、带有1-6个碳原子的烷基、含有3-7个碳原子的环烷基、含有2-6个碳原子的链烯基、含有2-6个碳原子的炔基、选自苯基、吡啶基、吡唑基、萘基和喹啉的芳基和含有5或6个环原子的杂环；

p为0-4；

q为0-4；并且

各个R⁰独立地选自H、带有1-6个碳原子的烷基、含有3-7个碳原子的环烷基、选自苯基、吡啶基、吡唑基、萘基和喹啉的芳基和含有5或6个环原子的杂环。

3.权利要求1所述的化合物，具有通式II_e

或其药学可接受的盐或水合物，

其中：

环A为嘧啶环；

各个R¹独立地选自H、带有1-6个碳原子的烷基、含有3-7个碳原子的环烷基、含有2-6个碳原子的链烯基、含有2-6个碳原子的炔基、CN、CF₃、NO₂、OR¹¹、-(CH₂)_pC(O)(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pC(O)N(R¹²)(R¹³)、-(CH₂)_pC(O)O(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pN(R¹¹)C(O)R¹¹、-(CH₂)_pN(R¹²)(R¹³)、-N(R¹¹)SO₂R¹¹、-OC(O)N(R¹²)(R¹³)、-SO₂N(R¹²)(R¹³)、卤素、选自苯基、吡啶基、吡唑基、萘基和喹啉的芳基和含有5或6个环原子的杂环组成的组，并且另外或可选地，相邻环原子上的两个R¹基团形成含有0-3个杂原子的5-或6-元稠合环；

n为0-6；

p为0-4；

q为0-4；

R⁸选自H和甲基；

X³为N或CH；

各个R⁷⁰选自卤素、带有1-6个碳原子的烷基、CN、N(R⁷¹)₂、含有5或6个环原子的环-氨基、NO₂、OR⁷¹和CF₃；并且各个R⁷¹选自H和带有1-6个碳原子的烷基。

4.具有通式III_b的化合物：

或其药学可接受的盐或水合物，

其中：

环A为嘧啶环；

n为0-6；

p为0至4；

q为0至4；

X³为N或CH；

R⁶¹选自苯基、吡啶基、吡唑基、萘基和喹啉的芳基和含有5或6个环原子的杂环；

R⁶²选自H、带有1-6个碳原子的烷基、选自苯基、吡啶基、吡唑基、萘基和喹啉的芳基和含有5或6个环原子的杂环；

i为0-4；且

j为0-4。

5.权利要求4所述的化合物，具有通式III_c

或其药学可接受的盐或水合物，

其中：

环A为嘧啶环；

n为0-6；

p为0至4；

q为0至4；

X³为N或CH；

各个R⁷⁰选自卤素、带有1-6个碳原子的烷基、CN、N(R⁷¹)₂、含有5或6个环原子的环-氨基、NO₂、OR⁷¹和CF₃；

各个R⁷¹选自H、带有1-6个碳原子的烷基、选自苯基、吡啶基、吡唑基、萘基和喹啉的芳基和含有5或6个环原子的杂环；且k为0至4。

6.权利要求5所述的化合物，具有通式III_d

或其药学可接受的盐或水合物，

其中：

环A为嘧啶环；

n为0-6；

p为0至4；

q为0至4；

X³为N或CH；

各个R⁷⁰选自卤素、带有1-6个碳原子的烷基、CN、N(R⁷¹)₂、含有5或6个环原子的环-氨基、NO₂、OR⁷¹和CF₃；并且

各个R⁷¹选自H和带有1-6个碳原子的烷基。

7.权利要求4所述的化合物，具有通式III_e

或其药学可接受的盐或水合物，

其中：

R¹⁴选自H和F；

R⁷⁰各自选自卤素、带有1-6个碳原子的烷基、CN、N(R⁷¹)₂、含有5或6个环原子的环-氨基、NO₂、OR⁷¹和CF₃；

R⁷¹各自选自H、带有1-6个碳原子的烷基、选自苯基、吡啶基、吡唑基、萘基和喹啉的芳基和含有5或6个环原子的杂环；且k为0至4。

8.权利要求1-7所述的化合物在制备用于治疗人肿瘤性疾病或增殖性障碍的药物中的用途。