WO2022211523A1 - 인공 조직 제작을 위한 페놀 유도체로 수식된 조직 유래 세포외기질 유도체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인공 조직 제작을 위한 페놀 유도체로 수식된 조직 유래 세포외기질 유도체에 관한 것으로, 본 발명의 하이드로젤용 조성물 및 이로부터 제조된 하이드로젤은 지혈, 혈액 응고 촉진, 세포 이식, 약물 전달, 세포 분화 촉진 등 다양한 효과를 나타내어 단일 또는 복합 용도로서 활용할 수 있다. 나아가, 본 발명은 세포 독성이 거의 없으면서도 생분해가 가능하여 생체 적합성이 매우 우수하여 활용 가능성이 매우 높다. 또한, 본 발명의 하이드로젤의 세포 배양능 및 접착성을 통해 단일 또는 복수 종류의 세포를 포함하는 조직 구조체를 형성하여 체내 미세환경을 더욱 잘 묘사할 수 있다.
Description
본 발명은 인공 조직 제작을 위한 페놀 유도체로 수식된 조직 유래 세포외기질 유도체에 관한 것이다.
세포외기질 (Extra Cellular Matrix, ECM)은 세포 밖에 존재하지만 세포와 밀접하게 연관된 고분자들(콜라겐, 엘라스틴, 당단백질, 성장 인자 등)로 이루어진 삼차원적 망 구조체(network structure)를 말하며, 생체 적합성(biocompatibility), 생분해성 (biodegradability), 고강도 및 유연성으로 인해 우수한 천연 하이드로젤 원료 물질 중의 하나이다.
이러한 세포외기질에서 배양될 수 있는 오가노이드는 3차원 세포 구조체로서 조직을 구성하고 있는 다양한 세포로 구성되어 있어 생체 조직의 환경을 모사할 수 있다는 점에서 최근에 주목받고 있다. 때문에 기초 생물학 연구 분야에서부터 신약 개발, 질병 모델링, 재생 치료 등 다양한 응용 연구 분야에 이르기까지 폭넓게 활용되고 있다.
한편, 인공 조직은 인체 조직 및 장기와 유사한 기능을 수행하는 인위적으로 제조된 조직 및 장기 유사체를 말하며 인공 관절, 인공 뼈, 인공 피부, 인공 힘줄, 인공 신경, 인공 종양 등의 형태가 있고, 인공 장기에는 인공 간, 인공 신장, 인공 심장, 장(gut), 피부, 혈관 등이 있을 수 있다. 이러한 인공 조직은 단순한 세포 집합체의 수준이 아닌 조직으로서의 기능을 수행하기 위해 복수 종 세포의 배양능, 구획화뿐만 아니라 조직의 미세환경을 모사하기 위해 이종 세포들간의 상호작용 가능성도 확인되어야 하기 때문에 현재까지도 많은 연구가 이루어지고 있다.
이에 본 발명자들은 오가노이드 기반 인공 조직 제작을 위한 연구를 한 결과 페놀 유도체로 수식된 조직 유래 세포외기질을 이용한 오가노이드 접합을 통해 인공 조직 제작 가능성을 확인하였고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 아크릴기로 수식된 조직 유래 세포외기질을 포함하는 하이드로젤용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 조성물을 가교시켜 제조된 하이드로젤을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 조직 유래 세포외기질을 아크릴기로 수식하는 단계를 포함하는 하이드로젤용 조성물 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 조직 유래 세포외기질을 아크릴기로 수식하여 하이드로젤용 조성물을 제조하는 단계; 및 상기 하이드로젤용 조성물을 가교시키는 단계를 포함하는 하이드로젤 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양상은 페놀 유도체로 수식된 조직 유래 세포외기질을 포함하는 하이드로젤용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 페놀 유도체는 카테콜기 (
) 및 갈롤기(
) 중 어느 하나 이상에서 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 조직 유래 세포외기질은 간 조직 유래 세포외기질, 폐 조직 유래 세포외기질, 위 조직 유래 세포외기질, 장 조직 유래 세포외기질, 신장 조직 유래 세포외기질, 심장 조직 유래 세포외기질, 식도 조직 유래 세포외기질, 뇌 조직 유래 세포외기질, 척수 조직 유래 세포외기질, 췌장 조직 유래 세포외기질, 자궁 조직 유래 세포외기질 및 지방 조직 유래 세포외기질 중 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 페놀 유도체와 조직 유래 세포외기질은 중량비가 1:10 내지 10:1 일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 조성물을 가교시켜 제조된 하이드로젤을 제공한다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 조성물은 농도가 0.01% 내지 3% (w/v)일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 가교는 산화적 가교, 상기 산화적 가교는 산화제 처리에 의한 반응, 염기성 조건에서의 반응 및 자연적 산화 중 어느 하나 이상에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 하이드로젤은 접착성일 수 있고, 상기 접착성은 수식된 페놀 유도체에 의한 친핵성 공유결합, 수소결합, 소수성 상호작용 및 파이-파이 상호작용 중 어느 하나 이상에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 상기 하이드로젤은 생분해성일 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 하이드로젤을 포함하는, 조직 접착제 조성물, 세포 배양용 조성물, 세포가 도포된 상기 조성물이 접착된 조직 구조체, 상기 하이드로젤을 포함하는, 약물 전달용 조성물, 세포 이식용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양상은 a) 조직 유래 세포외기질을 페놀 유도체로 수식하는 단계; 및 b) 수식된 조직 유래 세포외기질을 가교 결합 (cross-linking)하여 하이드로젤을 형성하는 단계를 포함하는 하이드로젤 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 b) 단계의 가교 결합 (cross-linking)은 산화적 가교, 상기 산화적 가교는 산화제 처리에 의한 반응, 염기성 조건에서의 반응 및 자연적 산화 중 어느 하나에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 산화제 처리 또는 염기성 조건에서의 반응은 치환된 조직 유래 세포외기질에 NaOH, NaIO4, Na2S2O8 및 Fe3+ 중 어느 하나 이상으로 처리하는 것일 수 있다.
본 발명의 하이드로젤용 조성물 및 이로부터 제조된 하이드로젤은 지혈, 혈액 응고 촉진, 세포 이식, 약물 전달, 세포 분화 촉진 등 다양한 효과를 나타내어 단일 또는 복합 용도로서 활용할 수 있다. 나아가, 본 발명은 세포 독성이 거의 없으면서도 생분해가 가능하여 생체 적합성이 매우 우수하여 활용 가능성이 매우 높다.
또한, 본 발명의 하이드로젤의 세포 배양능 및 접착성을 통해 단일 또는 복수 종류의 세포를 포함하는 조직 구조체를 형성하여 체내 미세환경을 더욱 잘 묘사할 수 있다.
도 1은 ECM-PG 합성 및 하이드로젤 제작 모식도이다.
도 2는 ECM-PG 합성 확인 및 가교 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 ECM-PG를 이용한 ECM 모듈 간 접합을 확인한 결과이다.
도 4는 ECM-PG 패치를 이용한 iPSC 유래 간 오가노이드 접합 결과를 확인한 것이다.
도 5는 ECM-PG 패치 기반 제작된 iPSC 유래 간 오가노이드 구조체 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 ECM-PG 하이드로젤의 iPSC 유래 간 오가노이드 독성 평가결과를 나타낸 것이다.
도 7은 ECM-PG 하이드로젤을 이용한 iPSC 유래 간 오가노이드 접합 및 미니 간 조직체 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 ECM-PG 하이드로젤 기반 제작된 iPSC 유래 미니 간 조직체 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 ECM-PG 하이드로젤 기반 간 미세환경 세포가 포함된 iPSC 유래 미니 간 조직체 제작 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 ECM-PG 하이드로젤 기반 마우스 성체줄기세포 유래 간 조직체 제작 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 ECM-PG 하이드로젤을 활용한 오가노이드 (췌장 오가노이드) 접합 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 ECM-PG 하이드로젤을 활용한 오가노이드 (폐 오가노이드) 접합 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 ECM-PG 하이드로젤을 활용한 오가노이드 (신장 오가노이드) 접합 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 ECM-PG 하이드로젤을 활용한 오가노이드 (장 오가노이드) 접합결과를 나타낸 것이다.
도 15는 ECM-PG 하이드로젤을 활용한 오가노이드 (위 오가노이드) 접합결과를 나타낸 것이다.
도 16은 ECM-PG 하이드로젤을 활용한 오가노이드 (식도 오가노이드) 접합결과를 나타낸 것이다.
도 17은 ECM-PG 패치의 조직 접착 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 18, 19는 ECM-PG 패치를 이용한 iPSC 유래 간 오가노이드의 대량 이식 결과를 나타낸 것이다.
도 20 ECM-PG 하이드로젤 기반 제작된 iPSC 유래 미니 간 조직체의 간 천공모델 내 이식 결과를 나타낸 것이다.
도 21 내지 23은 ECM-PG 하이드로젤 기반 제작된 iPSC 유래 미니 간 조직체의 부분 간 절제모델 내 이식효과를 검증한 결과이다.
본 발명의 일 양상은 페놀 유도체로 수식된 조직 유래 세포외기질을 포함하는 하이드로젤용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다
본 발명의 일 구체예로 상기 페놀 유도체는 카테콜기 (
) 및 갈롤기(
) 중 어느 하나 이상에서 유래된 것일 수 있다.
본 발명에서 "카테콜기"는 카테콜을 포함하는 치환기를 의미하고 "갈롤기"는 갈롤을 포함하는 치환기를 의미한다. 상기 카테콜기 및 갈롤기의 산화를 통한 폴리머화 연구 결과 접착성 작용기로 활용될 수 있음이 알려졌다.
상기 조직 유래 세포외기질은 조직내 또는 세포외의 공간을 채우고 있는 생체 고분자의 집합체로서, 교원질, 탄력소 등의 섬유성 단백질, 프로테오글리칸, 클리코사미노글리칸 등의 복합단백질, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴 등의 세포 부착성 당단백질 등 함유하는 것으로 알려져 있다. 한편 본 발명에서, 조직 유래의 세포외기질은 탈세포화 용액 등과 같이 당업계에서 널리 알려진 탈세포화 기술을 통하여 수득될 수 있으며, 상기 조직은 세포외기질 성분을 함유하는 모든 생체 조직을 대상으로 할 수 있으나, 간 조직 유래 세포외기질, 폐 조직 유래 세포외기질, 위 조직 유래 세포외기질, 장 조직 유래 세포외기질, 신장 조직 유래 세포외기질, 심장 조직 유래 세포외기질, 식도 조직 유래 세포외기질, 뇌 조직 유래 세포외기질, 척수 조직 유래 세포외기질, 췌장 조직 유래 세포외기질, 자궁 조직 유래 세포외기질 및 지방 조직 유래 세포외기질 중 어느 하나 이상인 하이드로젤용 조성물.
후술되는 바와 같이 상기 조성물은 하이드로젤로 되기 위한 가교, 구체적으로 산화적 가교의 과정을 거쳐 하이드로젤이 될 수 있다
본 발명에서, "하이드로젤 (hydrogel)"은 분산매가 물이거나 물이 기본 성분으로 들어 있는 젤로서, 본 발명에서의 하이드로젤은 페놀 유도체로 수식된 조직 유래 세포외기질을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예로 상기 조성물은 하기 화학식 1로 표시되는 구조를 포함하는 것일 수 있다:
[화학식 1]
본 발명의 일 구체예로, 상기 페놀 유도체와 조직 유래 세포외기질은 중량비가 1:10 내지 10:1, 구체적으로 1:8 내지 8:1, 가장 구체적인 예시로서 5:1일 수 있다. 상기 범위 외의 경우 목적하는 본 발명의 효과를 얻을 수 없다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 조성물을 가교시켜 제조된 하이드로젤.
본 발명의 일 구체예로 상기 하이드로젤의 제조 시 상기 조성물은 농도가 0.01% 내지 3% (w/v), 구체적으로 1 내지 3% (w/v), 더욱 구체적으로는 2%(w/v)일 수 있다.
상기 하이드로젤은 a) 조직 유래 세포외기질을 페놀 유도체로 수식하는 단계; 및 b) 수식된 조직 유래 세포외기질을 가교 결합 (cross-linking)하여 하이드로젤을 형성하는 단계를 통해 제조될 수 있으며, 상기 가교는 UV 조사에 의한 화학적 가교, 물리학적 가교 또는 생물학적 가교를 포함한다. 여기서, UV 조사에 의한 화학적 가교로는 광가교 (photo-crosslinking) 또는 반응성 가교제 (reactive crosslinker)를 활용한 가교 등이 있고, 생물학적 가교로는 헤파린과 성장인자의 결합력을 활용한 가교 또는 DNA 등의 상보적 결합을 이용한 가교 등이 있으며, 물리적 가교로는 수소결합에 의한 가교, 소수성(hydrophobic) 상호작용에 의한 가교 또는 정전기적 상호작용을 활용한 가교 등이 있으나, 바람직하게는, 산화제 또는 pH 조절제를 첨가하여 가교시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 가교는 산화적 가교일 수 있고, 더욱 구체적으로 상기 산화적 가교는 산화제 처리에 의한 반응, 염기성 조건에서의 반응 및 자연적 산화 중 어느 하나 이상에 의한 것일 수 있다.
상기 하이드로젤은 가교 결과 하기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 화합물이 형성되는 것일 수 있다. 구체적으로, NaIO4 로 가교한 경우 화학식 2의 화합물 형성을 통해, NaOH 처리로 가교한 경우 화학식 3의 화합물 형성을 통해 하이드로젤이 형성될 수 있다.
[화학식 2]
[화학식 3]
본 발명의 일 구체예로 상기 하이드로젤은 혈액 응고 촉진, 지혈, 세포 분화 촉진, 세포 배양, 세포 이식 및 약물 전달로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 용도를 나타내는 것일 수 있고, 상기 하이드로젤은 접착성, 구체적으로 수식된 페놀 유도체와의 친핵성 공유결합, 수소결합, 소수성 상호작용 및 파이-파이 상호작용 중 어느 하나 이상에 의한 접착성을 나타낼 수 있으며, 더욱 구체적으로 상기 접착성은 수식된 페놀 유도체와 세포 표면 및 약물에 존재하는 다양한 작용기들과의 친핵성 공유결합, 수소결합, 소수성 상호작용 및 파이-파이 상호작용 중 어느 하나 이상에 의한 것일 수 있다.
또한, 상기 하이드로젤은 생분해성인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 하이드로젤을 포함하는, 조직 접착제 조성물을 제공한다. 상기 하이드로젤은 전술한 바와 같이 접착성을 나타내어 조직간의 접착에 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 하이드로젤을 포함하는, 세포 배양용 조성물을 제공한다. 구체적으로 상기 배양은 3차원 배양일 수 있으며, 상기 배양 대상이 되는 세포는 줄기세포, 조혈모세포, 간세포, 섬유세포, 상피세포, 중피세포, 내피세포, 근육세포, 신경세포, 면역세포, 지방세포, 연골세포, 골세포, 혈액세포 또는 피부세포일 수 있으나, 상기에 제한되는 것은 아니며 세포 종류에 관계없이 본 발명의 하이드로젤에서 성장이 가능한 모든 세포에 적용 가능하다. 더욱 구체적으로, 상기 배양은 2종 이상 세포의 동시 배양일 수 있다.
한편, 본 발명은 세포가 도포된 상기 조성물이 접착된 조직 구조체를 제공한다. 구체적으로 상기 조성물, 구체적으로 하이드로젤에 세포를 도포하고 세포를 배양하였을 때 세포가 도포된 하이드로젤이 다른 세포가 도포된 하이드로젤과 접착되면서 조직 구조체를 형성할 수 있다. 이는 전술한 본 발명의 하이드로젤이 접착성을 가지면서 세포 배양이 가능한 특성을 가지는 점에서 기인한 것으로, 단순히 하이드로젤에서 오가노이드 수준으로 배양하는 것이 아닌 단일 혹은 복수 종류의 세포를 함께 배양함으로써 조직체 혹은 기관의 환경을 더욱 구체적으로 모사할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 양상은 상기 하이드로젤을 포함하는, 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 약물은 하이드로젤 내에 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 약물은 면역세포 활성화제, 항암제, 치료용 항체, 항생제, 항박테리아제, 항바이러스제, 항염증제, 조영제, 단백질 의약품, 성장인자, 사이토카인, 펩티드 약물, 발모제, 마취제 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것일 수 있다.
그리고, 본 발명의 다른 일 양상은 상기 하이드로젤을 포함하는 세포 이식용 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 구체예로, 상기 세포는 이식을 목적으로 하는 모든 종류의 세포를 사용할 수 있고, 상기 조성물의 이식 위치 및 방법은 공지된 것과 같다.
본 발명의 일 양상은 a) 조직 유래 세포외기질을 페놀 유도체로 수식하는 단계; 및 b) 수식된 조직 유래 세포외기질을 가교 결합 (cross-linking)하여 하이드로젤을 형성하는 단계를 포함하는 하이드로젤 제조방법을 제공한다.
상기 a) 단계는 조직 유래 세포외기질을 페놀 유도체로 수식하는 단계로서, 일 구체예로 조직 유래 세포외기질의 카복시기기 (-COOH)와 페놀 유도체의 아민기를 결합시키거나 조직 유래 세포외기질의 아민기와 페놀 유도체의 카복시기를 결합시키는 것일 수 있고, 가장 구체적인 예시로 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 것일 수 있다:
[화학식 1]
상기 페놀 유도체는 카테콜기 (
) 및 갈롤기(
) 중 어느 하나 이상일 수 있다. 구체적으로, 조직 유래 세포외기질을 페놀 유도체로 치환하는 것으로, 조직 유래 세포외기질과 페놀 유도체를 혼합한 뒤 EDC/NHS를 24시간 상온 처리하여 치환시킬 수 있다. 상기 치환은 구체적으로, 조직 유래 세포외기질을 EDC/NHS와 혼합하고, pH 4 내지 8, 더욱 구체적으로 pH 5.0 내지 6.0 에서 교반한 뒤, 페놀 유도체를 첨가한 뒤 pH 3.8 내지 6.0, 페놀 유도체가 도파민인 경우 구체적으로 pH 4.5 내지 5.0, 또는 페놀 유도체가 5-히드록시도파민인 경우 구체적으로 pH 3.8 내지 5.0로 조정한 뒤 교반하여 치환시킬 수 있다 (EDC/NHS chemistry).
상기 b) 단계는 수식된 조직 유래 세포외기질을 가교 결합 (cross-linking)하여 하이드로젤을 형성하는 단계로서, 상기 단계의 가교 결합은 산화적 가교, 더욱 구체적으로 산화제 처리에 의한 반응, 염기성 조건에서의 반응 및 자연적 산화 중 어느 하나에 의한 것일 수 있다. 상기 산화제 처리 또는 염기성 조건에서의 반응은 치환된 조직 유래 세포외기질에 NaOH, NaIO4, Na2S2O8 및 Fe3+ 중 어느 하나 이상으로 처리하는 것일 수 있다.
구체적으로, 수식된 조직 유래 세포외기질의 페놀 유도체들 사이에 가교결합 (cross-linking)하는 것일 수 있고, 페놀 유도체 사이의 가교결합 결과 퀴논 (quinone), 세미 퀴논 중간체 (semi-quinone intermediate), 페녹시 라디컬 (phenoxy radical) 등이 형성될 수 있다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: ECM-PG 합성 및 하이드로젤 제작, 특성 확인
실시예 1-1. ECM-PG 합성 및 하이드로젤 제작
생체 조직의 적절한 탈세포 및 용액화 과정을 거쳐서 세포외기질 (extracellular matrix; ECM)을 수득하고 화학적 반응 (EDC/NHS chemistry)을 통해 파이로갈롤 (pyrogallol; PG)을 수식함으로써 갈롤기로 수식된 조직 유래 세포외기질 (ECM-PG)을 합성하였다 (도 1).
구체적인 합성 조건은 ECM:5-hydroxydopamine HCl = 1:5 질량비, 5-hydroxydopamine HCL:EDC:NHS = 1:1:2 몰랄 비율의 반응물을 0.05 M 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) 용액에서 6시간 상온에서 반응시킨 뒤에 산성의 PBS와 물을 이용하여 dialysis 하여 미반응물을 제거하고 ECM-PG 합성을 완료하였다. 합성한 ECM-PG 용액 (ECM-PG 재료를 최종 1X PBS 중성 조건의 버퍼에 녹여 준비하였다. 최종 재료 농도는 용도에 따라 다양하게 조절 가능함)은 산화 과정(산화제 처리 또는 자연산화 방식)을 통해 고분자 간 가교가 유도되어 하이드로젤을 형성할 수 있으며, ECM-PG 용액을 원하는 크기 및 모양으로 몰딩 (molding)하고 동결 건조 (동결된 수분이 완전히 제거될 때까지)하여 다양한 형태의 ECM-PG 패치도 제작할 수 있다.
실시예 1-2. ECM-PG 합성 확인 및 가교
앞서 기술된 과정을 거쳐 합성이 완료된 ECM 유도체에 대한 분석을 실시하였다. 여기서는 실시 예로 간 조직 유래 ECM 인 liver extracellular matrix (LEM)을 사용하였다. 1H-NMR 분석을 통해 합성된 ECM-PG의 ECM 성분에 갈롤기가 잘 수식되었음을 확인하였다. 갈롤기 ring 구조에 존재하는 phenyl proton (blue box)이 ECM-PG 샘플에서 관찰되었다. (도 2a)
합성된 ECM-PG 유도체는 PBS 버퍼에 녹여 pre-gel solution으로 준비하고 (도 2b) 가교를 유도하였을 때, 종래 보고된 갈롤기로 수식된 고분자 유도체와 마찬가지로 산화제 처리 (NaIO4) 및 염기성 pH (+NaOH)에 따라 다른 양상으로 가교 반응이 진행되어 하이드로젤 (최종 하이드로젤 농도: 2% (w/v), NaIO4 가교의 경우 최종 NaIO4 농도: 1.125 mg/ml, NaOH 가교의 경우 최종 NaOH 농도: 0.020 M)이 형성되는 것을 확인하였다. (도 2c, d)
실시예 2. 접합 가능성 확인
실시예 2-1. ECM-PG를 이용한 ECM 모듈 간 접합
ECM-PG의 갈롤기가 가지는 친핵성 작용기에 대한 강한 반응성을 통해 ECM 단백질로 구성된 ECM 하이드로젤 모듈에 ECM-PG의 강한 접착이 가능하므로 ECM 모듈 간 효율적인 접합을 유도할 수 있다. 상기 실시예 1-2.의 LEM-PG 하이드로젤은 NaOH를 처리하는 방식으로 가교를 유도하면서 모듈 간에 도포한 뒤 30분간 반응시켜 접합을 유도하였다 (최종 LEM-PG 하이드로젤 농도: 2% (w/v), 최종 NaOH 농도: 0.02 M). 오가노이드를 포함한 삼차원 세포 배양의 경우 대부분 세포가 ECM 내에서 자라게 되는데, 따라서 크기가 큰 장기 수준의 조직 구조체를 제작하기 위해 세포가 포함된 ECM 단위 모듈 (LEM) 간 접합을 유도할 때 ECM-PG (LEM-PG)가 접착제 역할로서 적용될 수 있음을 확인하였다 (도 3).
실시예 2-2. ECM-PG 패치를 이용한 iPSC 유래 간 오가노이드 접합
ECM-PG를 이용한 오가노이드 접합을 통해 인공 조직체 제작을 시도하였다. 실시예로서 LEM-PG를 이용하여 간 오가노이드의 접합을 유도하였다.
간 오가노이드의 경우, 인간 유도만능줄기세포 (Human induced Pluripotent Stem Cell; hiPSC)를 간 내배엽 세포로 분화한 뒤, 혈관내피세포 (HUVEC)와 중간엽줄기세포 (hMSC)를 함께 혼합하여 제작하였다. 인간 hiPSC 유래 간세포: 혈관내피세포: 중간엽줄기세포 =10:7:2의 비율로 혼합하여 간 오가노이드를 형성하였다.
제작하고자 하는 조직 구조체의 크기를 고려하여 50~100개, 또는 그 이상의 간 오가노이드 (여기서는 100개의 간 오가노이드를 이용)를 모아서 갈롤기 수식 간 조직 유래 세포외기질 (LEM-PG) 패치에 도포한 뒤에 패치를 말아서 오가노이드들을 덮어준 상태로 30분 동안 배양을 하면 자연산화를 통해 LEM-PG 유도체간 가교가 자발적으로 촉진되어 안정적으로 하나의 구조체 형성이 가능하도록 하였다. 이후 접착성 패치에 도포된 간 오가노이드는 교반기(shaker)에서 동적 배양을 통해 24시간 이내에 하나의 큰 구조체로 합체하여 간 조직 수준으로 제작이 가능함을 확인하였다. 단일 간 오가노이드는 200~300 μm 정도의 크기인 반면, 100개 오가노이드 접합을 통해 제작된 간 조직체는 3 mm 정도의 크기로 형성된 것을 확인하였다 (도 4).
실시예 3: ECM-PG 패치 기반 제작된 iPSC 유래 간 오가노이드의 분석
실시예 3-1. ECM-PG 패치 기반 제작된 iPSC 유래 간 오가노이드 구조체 분석
LEM-PG 패치를 이용하여 100개의 iPSC 유래 간 오가노이드가 접합 (패치 위에 오가노이드를 도포한 이후 패치를 말아서 오가노이드들을 덮어준 상태로 30분 동안 배양해 주면 자연산화를 통해 LEM-PG 유도체 간 가교가 자발적으로 촉진되어 안정적으로 하나의 구조체를 형성함) 되어 형성된 간 조직체 내의 분화 마커 발현을 분석하기 위해 48시간 배양 후 면역염색을 실시하였다. 3 mm 정도 크기의 간 조직체 내에서 간 분화 마커 (HNF4A, ALB)와 간 내배엽 마커 (SOX17) 및 액틴 필라멘트 (F-actin)가 구조체 내 전체적으로 잘 발현되는 것을 확인하였다. (도 5a, b)
추가적으로 갈롤기 수식 간 조직 유래 세포외기질 (LEM-PG) 패치에 오가노이드를 도포할 때 CFDA 형광 시약으로 표지된 혈관내피세포를 함께 도포하고 간 조직체 형성을 유도한 후 면역염색을 진행하였을 때, 오가노이드 구조체 사이에 혈관세포들이 고르게 분포하고 있는 것을 확인하였다. (도 5c) 이는 LEM-PG를 이용하여 간 오가노이드를 접합할 때 혈관 구조가 포함된 간 조직체를 제작할 수 있음을 보여주는 결과이다.
실시예 3-2. ECM-PG 하이드로젤의 iPSC 유래 간 오가노이드 독성 평가
제작한 ECM-PG를 하이드로젤 형태로 단위 오가노이드에 도포하여 접합을 통한 미니 간 구조체를 제작하기에 앞서, ECM-PG 하이드로젤이 오가노이드에 독성을 나타내는지 확인하기 위해 농도별로 배양액에 첨가하여 세포 생존율 및 간 분화 마커 단백질의 발현을 분석하였다. LEM-PG 하이드로젤의 pre-gel 용액을 인간 iPSC 유래 간 오가노이드 배양액에 농도별로 첨가한 뒤 (배양액 내 재료의 최종 농도는 도 6에 표시함) 3일 후 분석을 진행하였다.
간 오가노이드의 생존율을 분석하기 위해 Live/Dead 염색 분석을 진행했을 때, 배양액에 하이드로젤을 첨가하지 않은 그룹(No treatment; NT)에서와 마찬가지로 탈세포 간 조직 유래 하이드로젤(LEM)을 첨가한 그룹, LEM-PG 하이드로젤을 농도별로 첨가한 그룹 모두에서 세포 사멸이 거의 관찰되지 않았다. 간 분화 마커인 ALB, AFP 발현의 경우에도 NT 그룹 및 LEM만을 첨가한 그룹과 마찬가지로 LEM-PG를 첨가한 그룹들에서도 간 분화 마커가 잘 발현됨을 확인하였다. 세포증식 마커인 Ki67의 발현은 NT 그룹과 LEM 그룹에서 높게 유지되었으나 LEM-PG 그룹에서는 발현이 상대적으로 낮은 것으로 보아 LEM-PG를 첨가해준 간 오가노이드는 증식보다는 분화가 많이 일어난 것을 확인하였다 (도 6).
갈롤기로 수식된 LEM-PG 하이드로젤은 간 오가노이드 배양에 있어 독성이 없는 적합한 소재로서 확인되었으며 생존율과 분화 마커의 발현이 가장 우수한 LEM-PG (0.5 mg/ml) 그룹을 오가노이드 접합에 가장 적합한 농도로 선정하고 이후 실험에 적용하였다.
실시예 4: ECM-PG 하이드로젤을 이용한 iPSC 유래 간 오가노이드 접합 및 분석
실시예 4-1.
ECM-PG 하이드로젤을 이용한 iPSC 유래 간 오가노이드 접합 및 미니 간 조직체 분석
최적화를 거친 5 mg/ml LEM-PG 하이드로젤을 인간 iPSC 유래 간 오가노이드 200개에 10% (v/v) 농도 조건으로 도포하여 (LEM-PG의 배양액 내 최종 농도: 0.5 mg/ml) 간 오가노이드의 접합을 유도하였다. LEM-PG 하이드로젤 도포 후 교반기(shaker)에서 배양을 하면 3일안에 오가노이드끼리 접합이 이루어져 5~6 mm 크기의 미니 간 구조체 형성이 가능하였다 (도 7a). 이후 추가적인 배양을 통한 성숙화 과정을 거쳐 총 7일간 배양한 뒤, 면역염색 분석을 실시하여 미니 간 구조체 분석을 진행하였다.
7일간 배양된 미니 간 구조체에 대하여 간 분화 마커인 ALB, SOX17 염색을 진행했을 때, 초기 내배엽 분화 마커인 SOX17과 성숙한 간 분화 마커인 ALB 모두 구조체 내부 오가노이드에서 잘 발현하는 것을 확인하였다 (도 7b). 추가적으로, 섬유성 필라멘트 마커인 F-actin 염색을 통해 내부에 단위 오가노이드 간 접합이 잘 이루어진 것도 확인하였다 (도 7b).
실시예 4-2. ECM-PG 하이드로젤 기반 제작된 iPSC 유래 미니 간 조직체 분석
단위 간 오가노이드의 접합을 유도하는데 있어 제작한 LEM-PG의 접합효율 및 분화증진 여부를 확인하기 위해 LEM-PG 처리를 하지 않은 그룹과 비교 분석하였다. No treatment (NT) 그룹은 인간 iPSC 유래 간 오가노이드 200개에 대하여 아무 처리를 해주지 않고 7일간 교반기에서 배양을 진행하고 LEM-PG 그룹은 LEM-PG (0.5 mg/ml) 하이드로젤을 배양액에 10% (v/v) 첨가하여 접합을 유도하였다. NT 그룹의 경우에는 일부분만 접합이 일어나며 하나의 구조체로 뭉쳐지지 못하는 반면, LEM-PG로 접합을 유도한 간 오가노이드는 하나의 큰 덩어리를 형성하며 조직화가 잘 일어나는 것을 확인하였다 (도 8a).
LEM-PG 처리를 통해 제작한 미니 간 구조체(LEM-PG 그룹)와 아무런 처리를 하지 않은 구조체(NT 그룹) 간의 유전자 발현을 비교하였을 때, 간 분화 마커인 AFP, HNF4A, ALB과 밀착 연접 마커인 CDH1, 혈관 마커인 PECAM1과 담관 마커인 KRT19 발현이 모두 LEM-PG를 통해 접합이 유도된 그룹에서 높게 나타남을 확인하였다. 추가적으로, 간 기능성 분석인 요소 합성능 분석을 위해, 배양 2일차와 배양 5일차의 요소 합성능력을 측정했을 때에도 LEM-PG로 간 오가노이드 접합을 유도한 구조체가 유의미하게 높은 기능성을 나타내는 것을 확인하였다. 이를 통해, LEM-PG 하이드로젤이 간 오가노이드의 접합을 유도해줄 뿐만 아니라 간 조직 특이적인 LEM의 효과로 인해 오가노이드의 분화 및 기능성도 증진시킬 수 있음을 확인하였다 (도 8b, c).
실시예 4-3. ECM-PG 하이드로젤 기반 간 미세환경 세포가 포함된 iPSC 유래 미니 간 조직체 제작
LEM-PG 하이드로젤 기반 미니 간 구조체 제작 시, 실제 간에 존재하는 쿠퍼세포 (kupffer cells) 및 간성상세포 (hepatic stellate cells)가 같이 포함된 구조체 제작을 위해 단위 오가노이드 제작 시 두 가지 세포를 추가적으로 주입 후 공배양 하고 LEM-PG 하이드로젤을 이용하여 오가노이드 접합을 유도하였다. 기존 간 오가노이드 제작 방식인 인간 iPSC 유래 간세포: 혈관내피세포: 중간엽줄기세포 =10:7:2의 비율에서 미세환경 세포들이 포함된 간 조직 유사체 제작을 위해서 인간 iPSC 유래 간세포: 혈관내피세포: 중간엽줄기세포: 쿠퍼세포: 간성상세포 =10:7:2:2:1의 비율로 변경하여 오가노이드를 제작하였다.
간성상세포는 다양한 자극에 의해 활성화되어 세포외기질(ECM)을 분비함으로써 간 섬유화 및 간 경변 유발에 관여하는 주요 세포이며, 쿠퍼세포는 세균과 바이러스에 대한 항체를 만들어 체내 유입되는 이물질을 처리하는 면역세포로서 두 세포 모두 간 조직의 주요 미세환경을 구성하는 세포들이다. 간성상세포는 iPSC로부터 중배엽(mesoderm), 중피세포(mesothelial cell)를 거쳐 간성상세포로 분화하고, 쿠퍼세포는 iPSC 세포로부터 EB(embryonic body)를 제작한 뒤, 대식세포 전구체(macrophage precursor) 단계를 거쳐 성숙화 과정을 통해 쿠퍼세포로 분화한다.
미세환경 세포들이 포함된 미니 간 구조체를 교반기(shaker)에서 동적 배양을 통해 7일간 배양한 뒤 면역염색을 실시하여 분석했을 때, 접합이 되지 않은 단위 오가노이드에서는 담관세포 관련 마커의 발현이 관찰되지 않는데 비해 LEM-PG 하이드로젤을 이용하여 200개 오가노이드 접합을 유도하여 형성된 간 구조체에서는 담관세포 마커인 KRT19를 발현하는 부분들이 존재하는 것을 확인하였다. 이를 통해, 미세환경 세포들이 포함된 단위 오가노이드끼리의 접합이 효율적으로 이루어지면 제작된 구조체 내에서 담관세포도 내부에 발달될 수 있음을 확인하였다 (도 9a). 간 오가노이드간 접합이 이루어지면서 크기가 확장되면 간 조직 줄기세포 유지를 위한 니치(niche)가 형성되는데 이때 담관세포가 형성될 수 있음을 확인하였다. 간 구조체 내부에 담관세포가 형성되면 담즙을 생산하여 간세포의 생존에 기여하며 인공 간 조직 이식 시 필수적인 intrahepatic bile duct(간내 담관)도 제공할 수 있으므로 간 조직 재생 효능을 증진시킬 수 있음을 확인하였다.
쿠퍼세포 마커인 CD68 면역염색을 진행했을 때, 접합된 간 구조체 내부에 쿠퍼세포들이 고르게 잘 분포하고 있음을 확인함으로써 LEM-PG 하이드로젤 기반 오가노이드 접합을 통한 미세환경 세포들이 포함된 미니 간 조직 유사체 제작 가능성을 확인하였다 (도 9b).
실시예 5: ECM-PG 하이드로젤 기반 다양한 오가노이드 및 오가노이드 접합을 통한 조직체 제작
실시예 5-1. ECM-PG 하이드로젤 기반 마우스 성체줄기세포 유래 간 조직체 제작
LEM-PG 하이드로젤을 이용하여 마우스 성체줄기세포 유래 간 오가노이드도 하나의 구조체로 접합이 가능한지 확인하기 위해 마우스 성체줄기세포 유래 간 오가노이드 200~300개를 배양하고 있는 배양액에 10% (v/v) LEM-PG 하이드로젤 (배양액 내 최종 농도: 0.5 mg/ml)을 추가하였다. 간 오가노이드는 성체줄기세포를 포함하는 마우스 담관 조직 세포들을 추출하여 7일 동안 매트리젤(Matrigel)에서 배양한 뒤 효소 처리를 통해 다량의 오가노이드를 수득하고 이들을 접합에 이용하였다. 일주일간 교반기(shaker)에서 동적 배양을 진행했을 때 LEM-PG 처리된 간 오가노이드들이 4 mm 크기의 하나의 구조체로 접합이 된 것을 확인하였고, 내부 이미지를 확인했을 때에도 간 오가노이드가 잘 분포하고 있음을 확인하였다 (도 10a).
배양 7일차에 면역염색을 통해 담관 및 간 분화 마커 발현을 확인했을 때, 담관 및 간 전구체 (hepatic progenitor) 관련 마커인 KRT19, SOX9이 제작된 간 구조체 내부에 있는 오가노이드에 잘 염색된 것을 확인하였다 (도 10b). 이를 통해, LEM-PG 하이드로젤이 성체줄기세포 유래 간 오가노이드의 접합에도 이용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 5-2. ECM-PG 하이드로젤을 활용한 오가노이드 접합: 췌장 오가노이드
오가노이드 접합에 있어 최적화를 거친 ECM-PG 하이드로젤이 췌장 오가노이드의 접합에도 활용될 수 있는지 확인하기 위해 탈세포 췌장 조직 유래 세포외기질(pancreas extracellular matrix; PEM)에 갈롤기가 수식된 PEM-PG 하이드로젤을 인간 iPSC 유래 췌장 오가노이드 200개에 10% (v/v) 농도 조건으로 도포하여 (PEM-PG의 배양액 내 최종 농도: 0.5 mg/ml) 췌장 오가노이드의 접합을 유도하였다.
iPSC 유래 췌장 오가노이드는 내배엽(definitive endoderm), 소화관 내배엽(gut tube endoderm)을 거쳐 췌장전구세포로 분화한 뒤, 췌장전구세포: 혈관내피세포: 중간엽줄기세포=10:7:2의 비율로 혼합하여 제작하였다. PEM-PG 하이드로젤 도포 후 교반기(shaker)에서 배양을 하면 3일 내에 오가노이드끼리 접합이 이루어져 1.5~2 mm 크기의 미니 췌장 구조체 형성이 가능함을 확인하였다 (도 11a). 이후 췌장 베타세포 분화를 유도하기 위한 추가적인 배양을 통한 성숙화 과정을 거쳐 총 7일간 배양한 뒤, 면역염색 분석을 실시하여 미니 췌장 구조체 분석을 진행하였다.
7일간 배양된 미니 췌장 구조체에 대하여 췌장 분화마커 염색을 진행했을 때, 성숙한 췌장 베타세포 분화 마커인 인슐린(insulin)과 섬유성 필라멘트 마커인 F-actin 염색이 접합된 췌장 구조체 내부에서 잘 발현하는 것을 확인하였다 (도 11b). 이를 통해, 대량생산된 iPSC 유래 췌장 오가노이드 간 접합에도 ECM-PG 하이드로젤이 활용될 수 있음을 검증하였다.
실시예 5-3. ECM-PG 하이드로젤을 활용한 오가노이드 접합: 폐 오가노이드
마우스 폐 조직을 추출하여 수득한 성체줄기세포 유래 폐 오가노이드를 부유 배양하면서 배양액에 탈세포 폐 조직 유래 세포외기질(lung extracellular matrix; LuEM)에 갈롤기가 수식된 LuEM-PG 하이드로젤을 다양한 농도 조건 (배양액 내 최종 농도: 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1 mg/ml)으로 추가하였다. 교반기에서 7일 동안 동적 배양한 뒤에 교반기 없이 추가적으로 2일간 더 배양한 후 9일 차에 확인해 보았을 때 비처리 그룹 (0 mg/ml)에서 오가노이드들이 접합이 되지 않은 것과 대조적으로 LuEM-PG 처리군에는 폐 오가노이드의 접합이 유도된 것을 확인하였다 (도 12a). LuEM-PG 처리 농도가 증가함에 따라 크기가 더 큰 폐 조직 구조체가 형성됨을 확인하였다 (도 12a).
낮은 농도와 높은 농도 조건에 대한 대표 그룹으로 각각 0.2 mg/ml과 0.8 mg/ml 농도로 처리된 오가노이드 그룹들을 선정하여 면역염색을 통해 구조체에 대한 분석을 진행했을 때, 두 조건 모두에서 오가노이드 간 효율적인 접합을 통해 크기가 커진 폐 조직 구조체가 형성됨을 F-actin 마커 염색으로 확인하였고, 높은 농도 조건인 0.8 mg/ml 그룹에서 폐 섬모세포 (ciliated cell) 관련 마커인 Acetylated α-tubulin (Ac-α-Tub)이 더 높게 발현되는 것을 확인하였다 (도 12b). 이를 통해 LuEM-PG 하이드로젤을 이용하여 폐 오가노이드 간 접합 유도 및 폐 조직 구조체의 제작이 가능함을 확인하였다.
실시예 5-4. ECM-PG 하이드로젤을 활용한 오가노이드 접합: 신장 오가노이드
마우스 신장 조직으로부터 추출하여 수득한 성체줄기세포 유래 신장 오가노이드를 부유 배양하면서 배양액에 탈세포 신장 조직 유래 세포외기질(kidney extracellular matrix; KEM)에 갈롤기가 수식된 KEM-PG 하이드로젤을 0.5 mg/ml의 농도 조건으로 추가하였다. 교반기에서 각각 2일과 4일 동안 동적 배양을 진행한 후 확인해 보았을 때 비처리 그룹(no treatment; NT)에서 오가노이드들이 접합이 되지 않은 것과 대조적으로 KEM-PG 처리군에는 신장 오가노이드의 접합이 유도된 것을 확인하였다 (도 13). 이를 통해 KEM-PG 하이드로젤을 이용하여 신장 오가노이드 간 접합 유도 및 신장 조직 구조체의 제작이 가능함을 확인하였다.
실시예 5-5. ECM-PG 하이드로젤을 활용한 오가노이드 접합: 장 오가노이드
탈세포 장 조직 유래 세포외기질(intestine extracellular matrix; IEM)에 갈롤기가 수식된 IEM-PG 하이드로젤을 이용하여 성체줄기세포 유래 장 오가노이드를 하나의 구조체로 접합할 수 있는지 확인하기 위해, 쥐의 성체줄기세포 유래 장 오가노이드 2000개를 10% (v/v) IEM-PG 하이드로젤 (배양액 내 최종 농도: 0.4 mg/ml)이 추가된 배양액에서 배양하였다.
장 오가노이드는 장 크립트의 줄기세포를 추출하여 3일 동안 매트리젤(Matrigel)에서 배양한 뒤, 젤을 제거하는 시약을 처리하여 오가노이드만 수득하고 이를 접합에 이용하였다.
IEM-PG을 처리해서 배양한지 2일차에, 장 오가노이드들이 IEM-PG가 첨가된 모양대로 길이가 긴 거대 구조체로 접합되었음을 확인하였다 (도 14).
반면, IEM-PG를 추가하지 않은 일반 배양액 조건(no treatment; NT)에서는, 장 오가노이드가 접합되지 않고 개별적으로 존재하였다. 또한, 오가노이드를 유지/배양해줄 수 있는 배양 지지체가 부재한 관계로, 점점 형태가 손상되는 양상을 확인하였다.
이를 통해, IEM-PG 하이드로젤이 성체줄기세포 유래 장 오가노이드의 접합에 이용될 수 있으며, 이들이 별도의 배양 지지체가 없는 환경에서도 장 오가노이드의 유지 및 성장을 도와줄 수 있음을 확인하였다.
실시예 5-6. ECM-PG 하이드로젤을 활용한 오가노이드 접합: 위 오가노이드
탈세포 위 조직 유래 세포외기질(stomach extracellular matrix; SEM)에 갈롤기가 수식된 SEM-PG 하이드로젤을 이용하여, 위 오가노이드 간 접합을 유도하여 큰 크기의 위 조직을 제작하였다. 마우스 위 조직으로부터 추출된 줄기세포를 이용하여 위 오가노이드를 제작하고, 4일 간 배양하여 적당한 크기로 자란 위 오가노이드를 부유 상태에서 배양하면서, SEM-PG 하이드로젤을 0.5 mg/ml의 농도로 배양액에 처리하였다. 대조군으로 SEM-PG 하이드로젤을 처리하지 않은 그룹(no treatment; NT)을 비교하였다.
그 결과, 2일간 배양을 했을 때, NT 그룹에서는 위 오가노이드가 단일 오가노이드 형태로 남아있는 반면, SEM-PG 하이드로젤을 처리한 assembled 그룹은 위 오가노이드들이 서로 접합된 형태를 가지고 있는 것을 확인하였다. 접합된 위 오가노이드를 7일까지 배양하면 위 오가노이드가 서로 연결되어 큰 크기의 위 조직 구조체가 형성되는 것을 확인하였다. 이를 통해 SEM-PG 하이드로젤을 이용하여 위 오가노이드 간 접합 유도 및 위 조직 구조체의 제작이 가능함을 확인하였다 (도 15).
실시예 5-7. ECM-PG 하이드로젤을 활용한 오가노이드 접합: 식도 오가노이드
마우스 식도 조직으로부터 줄기세포를 추출하여 제작한 식도 오가노이드를 부유 배양하면서, 배양액에 탈세포 식도 조직 유래 세포외기질(esophagus extracellular matrix; EEM)에 갈롤기가 수식된 EEM-PG 하이드로젤을 추가하여 식도 오가노이드의 접합을 유도하였다.
접합을 위해 그룹 당 식도 오가노이드는 약 2000-2500개 사용하였으며, EEM-PG 하이드로젤의 배양액 내 최종 농도는 0.2 및 0.4 mg/ml로 추가하였다.
교반기에서 5일 간 배양 후 확인하였을 때, 오가노이드 간 접합과 매끄러운 연결이 제대로 이루어지지 않은 비처리 그룹(no treatment; NT)과 대조적으로 EEM-PG 처리 그룹에서는 오가노이드 간의 접합이 유도되어 크기가 큰 식도 구조체가 형성되는 것을 확인하였다 (도 16a).
5일 간 배양된 식도 구조체에 대하여 면역 염색을 진행한 결과, F-actin 염색을 통해 0.2 mg/ml 및 0.4 mg/ml 두 농도 조건 모두에서 오가노이드 간 접합이 잘 이루어진 것을 확인하였고, 식도의 기저상층에서 발현되는 Cytokeratin 13 (CK13)과 기저층에서 발현되는 Cytokeratin 14 (CK14)가 모두 구조체에서 잘 발현되는 것을 확인하였다 (도 16b).
이를 통해 EEM-PG 하이드로젤을 이용하여 식도 오가노이드 간 접합 유도 및 식도 구조체의 제작이 가능함을 확인하였다.
실시예 6: ECM-PG 하이드로젤의 활용 가능성 확인
실시예 6-1. ECM-PG 패치의 조직 접착 테스트
탈세포 위 조직으로부터 얻은 세포외기질 (stomach extracellular matrix; SEM), 탈세포 장 조직으로부터 얻은 세포외기질 (intestine extracellular matrix; IEM)과 탈세포 심장 조직으로부터 얻은 세포외기질 (heart extracellular matrix; HEM)에 EDC/NHS 반응을 통해 각각 갈롤기를 수식하고, 합성된 각 조직 ECM-PG 유도체(SEM-PG, IEM-PG, HEM-PG)를 용액화 (최종 농도 1% (w/v)로 PBS 버퍼에 녹여서 준비)하여 원형의 몰드에 부은 뒤 동결 건조하여 ECM-PG 패치들을 제작하였다. 도 17에서 확인되는 바와 같이 각 ECM-PG 패치들은 해당 조직에 부착하였을 때 가교제 첨가 없이도 시간이 지남에 따라 갈롤기의 자연산화 능력에 기인하여 가교가 일어나면서 조직 표면에 밀착되어 잘 부착됨을 알 수 있다.
이러한 방식으로 조직 내로 조직 특이적 세포외기질을 효과적으로 전달할 수 있으며 이와 함께 약물을 담지하여 전달할 경우 약물에 의한 치료 효과와 더불어 조직 특이적 세포외기질에 의한 조직 재생 효과를 동시에 유도할 수 있기 때문에 손상된 조직의 재생치료를 위한 약물전달 시스템으로도 적용이 가능함을 알 수 있다.
실시예 6-2. ECM-PG 패치를 이용한 iPSC 유래 간 오가노이드의 대량 이식
마우스의 간 조직(normal liver; 위)에 100개의 iPSC 유래 간 오가노이드를 모아서 얹은 뒤 ECM-PG 패치 (여기서는 LEM-PG 패치)를 위에 덮는 방식으로 오가노이드 대량 이식을 진행하였을 때, 도 18에서 확인되는 바와 같이 가교를 위한 별도의 첨가제(산화제)를 추가하지 않아도 30분 정도의 시간이 지나면 갈롤기의 자연 산화에 의한 하이드로젤 형성 및 부착이 유도되어 용이하게 오가노이드를 생체 조직에 이식할 수 있음을 확인하였다.
특히, 조직이 손상되어 출혈이 있는 상처 부위(injury liver; 아래)에서도 ECM-PG 패치를 이용하면 다량의 오가노이드를 온전히 잘 이식할 수 있음을 확인하였다. 이는 손상 부위에 비침습적으로 오가노이드의 대량 이식이 가능하고 조직재생 치료를 위해서도 본 발명에서 개발된 ECM-PG 패치 기술을 적용할 수 있음을 확인하였다.
또한, 인간 iPSC 유래 간 오가노이드 200개를 모아서 조직이 손상되어 출혈이 있는 간 조직 상처 부위(injury liver)에 얹은 뒤, 제작한 ECM-PG (LEM-PG) 패치를 그 위에 덮고 이식을 진행하여 마우스 간 조직에 효과적으로 오가노이드 대량 이식이 가능함을 확인하였다. 그 결과 도 19에서 확인되는 바와 같이 이식 24시간 뒤 조직 절편을 제작하여 관찰하였을 때에도 적색 형광(DiI)으로 표지된 간 오가노이드들이 5 mm 크기의 손상 부위에 고르게 이식되어 안정적으로 위치해 있는 것을 관찰할 수 있다. 이는 본 발명으로 개발된 ECM-PG 패치 기술이 많은 양과 큰 크기의 오가노이드를 비침습적으로 대량 이식할 때에도 적용될 수 있음을 보여주는 결과이다.
실시예 6-3. ECM-PG 하이드로젤 기반 제작된 iPSC 유래 미니 간 조직체의 간 천공모델 내 이식
제작한 미니 간 구조체의 이식 가능성 및 조직재생 여부를 확인하기 위해 인간 iPSC 유래 단위 간 오가노이드 200개의 접합을 유도하여 4~5 mm 크기의 간 조직 구조체를 먼저 제작하고 간 천공(liver perforation) 모델에 LEM-PG 패치를 이용하여 이식을 진행하였다. LEM-PG 하이드로젤을 이용한 접합 유도 시 단위 오가노이드가 3일 내에 4~5 mm 크기를 가진 하나의 큰 구조체로 형성되는 것을 확인하였다 (도 20a).
마우스 간 조직에 생검 펀치 (biopsy punch)를 이용하여 6 mm 크기의 천공을 유발한 뒤 LEM-PG 하이드로젤로 접합된 간 조직 구조체(어셈블로이드; Assembloid)를 천공으로 간 손상이 일어난 부위에 얹어 놓은 후, LEM-PG 패치로 조직체가 위치한 부위를 덮는 방식으로 간 구조체 이식을 진행하였다 (도 20b). 천공 부위 인근에 어셈블로이드를 이식한 뒤 1주일 뒤에 면역염색 및 조직학 분석을 통해 이식된 간 조직체가 생착되어 제대로 기능을 하는지 확인하였다. H&E 염색을 통해 천공부위에 이식된 간 조직 구조체가 잘 생착되어 있는 것을 확인하였고, 그 위에 도포된 LEM-PG 패치도 잘 유지되어 있음을 확인하였다 (도 20c). 간 분화 마커인 ALB 염색을 통해 이식된 간 조직 구조체가 1주일 뒤에도 ALB 분화 마커를 잘 발현하고 있음을 확인하였다 (도 20d).
이를 통해, LEM-PG 하이드로젤로 단위 간 오가노이드의 접합을 통한 미니 간 조직 생산이 가능하며, LEM-PG 패치 제형을 이용하여 간 조직 손상모델에 조직체의 이식이 가능함을 입증하였다.
실시예 6-4.
ECM-PG 하이드로젤 기반 제작된 iPSC 유래 미니 간 조직체의 부분 간 절제모델 내 이식효과 검증
제작된 미니 간 조직 유사체의 간 절제모델 내로의 이식 및 조직재생 가능성을 확인하기 위해 인간 iPSC 유래 단위 간 오가노이드를 대량 생산하고 LEM-PG 하이드로젤 (배양액 내 첨가된 LEM-PG의 최종 농도: 0.5 mg/ml)을 통해 오가노이드 접합을 유도하여 6~8 mm 크기의 간 조직 구조체를 제작하였다 (도 21a).
마우스 간 조직의 좌엽 (left lateral lobe)을 50% 절제하여 부분 간 절제모델 (50 % partial hepatectomy)을 제작하고 미니 간 조직체를 손상된 간 조직 부위에 얹어 놓은 후 그 위를 LEM-PG 패치 (LEM-PG 유도체를 1% (w/v) 농도로 용액화 하여 몰드에 붓고 동결 건조하여 제작)로 덮는 방식으로 적용하여 이식하였다 (도 21b). 마우스 간 절제모델 1 마리에 적용할 수 있는 미니 간 조직체 제작을 위해 단위 간 오가노이드 400개를 이용하여 접합을 유도하였다.
마우스 간 조직의 좌엽을 50% 절제하고 지혈한 뒤, LEM-PG 패치를 이용하여 미니 간 조직체를 이식하면 손상된 간 조직 표면에 효과적으로 구조체가 잘 생착하는 것을 확인할 수 있다 (도 21b).
또한, 이식 2주 뒤 각 그룹의 마우스 몸무게와 간 무게를 측정했을 때, 부분 간 절제를 유발하고 치료하지 않은 그룹(no treatment)에서는 회복속도가 느려 정상 마우스에 비해 몸무게 및 간의 무게가 감소하였으나 간 조직체 assembloid를 이식해준 부분 간 절제 그룹에서는 몸무게 및 간의 무게가 일정수준 회복된 것을 확인하였다. 또한, 간 무게:몸무게의 비율을 조사했을 때에도 비치료 그룹 (no treatment)에서는 정상 마우스에 비해 낮은 수치를 보였으나 assembloid를 이식한 그룹에서는 간 무게:몸무게의 비율도 일정 수준 회복되었다 (도 22a).
이식 2주차에 각 그룹별로 섬유화 마커 발현을 비교하기 위해 조직 내 mRNA를 추출하여 정량적 PCR (qPCR) 분석을 진행했을 때, 정상 간 조직에 비해 비치료 그룹에서는 Col1a1의 발현량이 약 10배 정도 증가하였으나 assembloid 이식 그룹에서는 조직 재생이 유도되어 유의미한 수준으로 Col1a1 발현량이 크게 감소함을 확인하였다 (도 22b).
간 구조체 이식 후 3, 7, 10, 14일에 채혈하여 간 기능성 지표인 ALB과 주요 간 독성 지표인 ALT, LDH에 대하여 혈액 분석을 진행하였다. 정상 마우스 그룹은 ALB, ALT 및 LDH 수치에 큰 변화가 없는 반면, 부분 간 절제를 유발한 비치료 그룹 (no treatment)에서는 ALT, LDH 수치가 매우 높게 측정되며 ALB 양은 낮게 측정되는 것을 확인하였다. 2주 동안 어느 정도 회복은 보이지만 여전히 낮은 혈중 ALB 분비와 높은 간 독성 (ALT, LDH) 수치를 보였다. 이에 비해, LEM-PG 패치를 이용하여 간 조직체를 이식한 그룹 (assembloid)에서는 ALB 혈중 분비량이 빠른 속도로 회복되고, 간 독성 수치 또한 유의미하게 감소하여 빠른 속도로 간 손상이 회복되는 것을 확인하였다 (도 22c). 따라서, 이식된 미니 간 조직체에 의해 부분 간 절제로 저해된 간 기능성이 어느 정도 회복되고 간 손상이 감소된 것을 확인하였다.
이를 통해, 개발한 LEM-PG가 오가노이드 접합용 하이드로젤로 사용되어 간 조직체를 제작하는데 이용될 수 있으며, 나아가 패치 제형으로 적용되어 효율적으로 조직을 이식하는 용도로도 활용될 수 있음을 확인하였다.
그리고, LEM-PG 하이드로젤을 이용하여 제작된 미니 간 조직체(assembloid)를 LEM-PG 패치를 이용하여 간 부분절제 (partial hepatectomy) 마우스 모델에 이식한 뒤 2주차에 H&E 조직학 분석과 면역염색을 통해 생착된 미니 간 조직체를 확인하였다.
마우스 간 조직의 좌엽을 50% 절제하고 어떤 치료도 하지 않은 비치료 그룹(no treatment)은 정상 간(normal) 조직에 비해 조직 손상부위가 재생이 잘 되지 않음을 확인하였고, LEM-PG 패치로 간 구조체 assembloid를 이식한 그룹에서는 이식된 assembloid에 의해 효과적으로 손상된 부위가 채워지고 손상된 간 조직 표면에 구조체가 2주 동안 잘 생착되어 있는 것을 확인하였다 (도 23a).
각 그룹에 대하여 섬유화 마커인 SMA 면역염색을 진행했을 때, 비치료 그룹의 조직 손상 부위(defect)에서는 섬유화가 활발히 일어나기 때문에 SMA 마커가 높게 발현되는데 비해 assembloid 이식 그룹에서는 이식한 간 조직체에 의한 조직 재생 효과로 인해 SMA 발현이 거의 관찰되지 않음을 확인하였다 (도 23b).
이를 통해, 개발한 LEM-PG가 오가노이드 접합용 하이드로젤로 사용되어 간 조직체를 제작하는데 이용될 수 있으며, 나아가 패치 제형으로 적용되어 효율적으로 조직을 이식하는 용도로도 활용될 수 있음을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (20)
- 페놀 유도체로 수식된 조직 유래 세포외기질을 포함하는 하이드로젤용 조성물.
- 제 1항에 있어서,상기 페놀 유도체는 카테콜기 () 및 갈롤기(
) 중 어느 하나 이상에서 유래된 것인 하이드로젤용 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 조직 유래 세포외기질은 간 조직 유래 세포외기질, 폐 조직 유래 세포외기질, 위 조직 유래 세포외기질, 장 조직 유래 세포외기질, 신장 조직 유래 세포외기질, 심장 조직 유래 세포외기질, 식도 조직 유래 세포외기질, 뇌 조직 유래 세포외기질, 척수 조직 유래 세포외기질, 췌장 조직 유래 세포외기질, 자궁 조직 유래 세포외기질 및 지방 조직 유래 세포외기질 중 어느 하나 이상인 하이드로젤용 조성물.
- 제 1항에 있어서,상기 페놀 유도체와 조직 유래 세포외기질은 중량비가 1:10 내지 10:1 인 하이드로젤용 조성물.
- 제1항의 조성물을 가교시켜 제조된 하이드로젤.
- 제5항에 있어서,상기 조성물은 농도가 0.01% 내지 3% (w/v)인 하이드로젤.
- 제5항에 있어서,상기 가교는 산화적 가교인 하이드로젤.
- 제7항에 있어서,상기 산화적 가교는 산화제 처리에 의한 반응, 염기성 조건에서의 반응 및 자연적 산화 중 어느 하나 이상에 의한 것인 하이드로젤.
- 제5항에 있어서, 상기 하이드로젤은 접착성인, 하이드로젤.
- 제 9항에 있어서,상기 접착성은 수식된 페놀 유도체에 의한 친핵성 공유결합, 수소결합, 소수성 상호작용 및 파이-파이 상호작용 중 어느 하나 이상에 의한 것인 하이드로젤.
- 제5항에 있어서, 상기 하이드로젤은 생분해성인, 하이드로젤.
- 제5항의 하이드로젤을 포함하는, 조직 접착제 조성물.
- 제5항의 하이드로젤을 포함하는, 세포 배양용 조성물.
- 세포가 도포된 제13항의 조성물이 접착된 조직 구조체.
- 제5항의 하이드로젤을 포함하는, 약물 전달용 조성물.
- 제5항의 하이드로젤을 포함하는, 세포 이식용 조성물.
- a) 조직 유래 세포외기질을 페놀 유도체로 수식하는 단계; 및b) 수식된 조직 유래 세포외기질을 가교 결합 (cross-linking)하여 하이드로젤을 형성하는 단계를 포함하는 하이드로젤 제조방법.
- 제 17항에 있어서,상기 b) 단계의 가교 결합 (cross-linking)은 산화적 가교인 제조방법.
- 제18항에 있어서,상기 산화적 가교는 산화제 처리에 의한 반응, 염기성 조건에서의 반응 및 자연적 산화 중 어느 하나에 의한 것인 제조방법.
- 제19항에 있어서,상기 산화제 처리 또는 염기성 조건에서의 반응은 치환된 조직 유래 세포외기질에 NaOH, NaIO4, Na2S2O8 및 Fe3+ 중 어느 하나 이상으로 처리하는 것인 제조방법.
Priority Applications (2)
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| EP22781642.8A EP4299083A1 (en) | 2021-03-31 | 2022-03-31 | Phenol derivative-modified, tissue-derived extracellular matrix derivative for construction of artificial tissue |
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Non-Patent Citations (4)
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| CHO JUNG HO, JUNG SEUNG LEE, JISOO SHIN, EUN JE JEON, SOOHWAN AN, YI SUN CHOI, SEUNG-WOO CHO: "Ascidian-Inspired Fast-Forming Hydrogel System for Versatile Biomedical Applications: Pyrogallol Chemistry for Dual Modes of Crosslinking Mechanism", ADVANCED FUNCTIONAL MATERIALS, vol. 28, 15 December 2017 (2017-12-15), XP055906558, DOI: 10.1002/adfm.201705244 * |
| SHIN JISOO, LEE JUNG SEUNG, LEE CHANGHYUN, PARK HYUN-JI, YANG KISUK, JIN YOONHEE, RYU JI HYUN, HONG KI SUNG, MOON SUNG-HWAN, CHUNG: "Tissue Reconstruction: Tissue Adhesive Catechol-Modified Hyaluronic Acid Hydrogel for Effective, Minimally Invasive Cell Therapy (Adv. Funct. Mater. 25/2015)", ADVANCED FUNCTIONAL MATERIALS, WILEY - V C H VERLAG GMBH & CO. KGAA, DE, vol. 25, no. 25, 1 July 2015 (2015-07-01), DE , pages 3798 - 3798, XP055975016, ISSN: 1616-301X, DOI: 10.1002/adfm.201570167 * |
| SHIN MIKYUNG; GALARRAGA JONATHAN H.; KWON MI Y.; LEE HAESHIN; BURDICK JASON A.: "Gallol-derived ECM-mimetic adhesive bioinks exhibiting temporal shear-thinning and stabilization behavior", ACTA BIOMATERIALIA, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 95, 24 October 2018 (2018-10-24), AMSTERDAM, NL, pages 165 - 175, XP085782333, ISSN: 1742-7061, DOI: 10.1016/j.actbio.2018.10.028 * |
| WANG DANDAN; XU PINGPING; WANG SHUOSHUO; LI WENLI; LIU WEIZHI: "Rapidly curable hyaluronic acid-catechol hydrogels inspired by scallops as tissue adhesives for hemostasis and wound healing", EUROPEAN POLYMER JOURNAL, PERGAMON PRESS LTD OXFORD, GB, vol. 134, 25 May 2020 (2020-05-25), GB , XP086221049, ISSN: 0014-3057, DOI: 10.1016/j.eurpolymj.2020.109763 * |
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