WO2022196538A1 - 改変アルカリホスファターゼ - Google Patents

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WO2022196538A1
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amino acid
modified alkaline
acid sequence
modified
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佑介 萩原
康博 三原
智晴 本山
祥吾 中野
創平 伊藤
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味の素株式会社
静岡県公立大学法人
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase

Definitions

  • the present invention relates to modified alkaline phosphatase and the like.
  • Alkaline phosphatase (EC 3.1.3.1) is a phosphomonoesterase with low substrate selectivity that has an alkaline pH optimum. Alkaline phosphatase is widely used in laboratory and clinical test reagents. For example, in experiments, alkaline phosphatase has been used to dephosphorylate the 5' ends of DNA or RNA and as a reporter in reporter assays. In clinical test reagents, alkaline phosphatase is used for the detection or quantification of target molecules in the form of alkaline phosphatase-labeled substances (eg, affinity substances such as antibodies).
  • alkaline phosphatase-labeled substances eg, affinity substances such as antibodies.
  • bovine small intestine alkaline phosphatase Bovine Intestinal Alkaline Phosphatase: bIAP
  • bIAPII Bovine Intestinal Alkaline Phosphatase
  • bIAPII which is isomer II
  • a bIAPII mutant having serine, glycine, or asparagine at position 430 and alanine at position 430 exhibits high thermostability while maintaining activity equivalent to that of native bIAPII (Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide a highly active alkaline phosphatase with excellent thermostability.
  • Modified alkaline phosphatase which is the following protein (A), (B), or (C): (A) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 5, 7, or 9; (B) a protein comprising an amino acid sequence having 95% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, or 9 and having dephosphorylation activity; or (C) SEQ ID NOs: 3, 5 , 7, or 9 amino acid sequences, including substitutions, deletions, insertions, additions, and amino acid sequences containing mutations of 1 to 23 amino acid residues selected from the group consisting of combinations thereof, and dephosphorylation A protein with oxidative activity.
  • the amino acid sequence of (B) or (C) maintains mutations of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332V, E343Q, I352T, G402S, T413E, E416D, E455Q, and I461V; The modified alkaline phosphatase of [1].
  • the amino acid sequence of (B) or (C) maintains mutation of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332V, E343Q, G402S, T413E, E416D, and E455Q of [2] Modified alkaline phosphatase.
  • the mutation of one or more amino acid residues is a mutation of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332V, E343Q, I352T, G402S, T413E, E416D, E455Q, and I461V, [ 5] modified alkaline phosphatase.
  • modified alkaline phosphatase of [5] wherein the mutation of one or more amino acid residues is mutation of one or more amino acid residues selected from the group consisting of E343, I352, G402, and E455.
  • bovine intestinal alkaline phosphatase is the following protein (A), (B), or (C): (A) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; (B) a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having dephosphorylation activity; or (C) a substitution or deletion in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 , insertions, additions, and combinations thereof, and has dephosphorylation activity.
  • A a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • B a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having dephosphorylation activity
  • C substitution or deletion in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 , insertions, additions, and combinations thereof, and has dephosphorylation activity.
  • modified alkaline phosphatase of any one of [1] to [8], wherein the modified alkaline phosphatase is a protein further comprising a portion encoding another functional peptide in addition to the portion encoding the modified alkaline phosphatase.
  • a method for producing modified alkaline phosphatase comprising: Introducing mutations of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332, E343, I352, G402, T413, E416, E455, and I461 into bovine intestinal alkaline phosphatase, In the amino acid sequence encoding bovine small intestine alkaline phosphatase, an amino acid sequence containing mutations of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332, E343, I352, G402, T413, E416, E455, and I461, and producing a modified alkaline phosphatase having dephosphorylation activity.
  • [11] A substance labeled with the modified alkaline phosphatase of any one of [1] to [9] or the modified alkaline phosphatase produced by the method of [10].
  • the method for measuring alkaline phosphatase activity is the modified alkaline phosphatase of any of [1] to [9], the modified alkaline phosphatase produced by the method of [10], or any of [11] to [13]
  • the method of [14] which is a method of detecting or quantifying a substance to be measured using the substance of and a substrate.
  • Phosphorylation using the modified alkaline phosphatase of any of [1] to [9], the modified alkaline phosphatase produced by the method of [10], or the substance of any of [11] to [13] A method of producing a dephosphorylated material comprising dephosphorylating a material to produce a dephosphorylated material.
  • [17] A polynucleotide encoding the modified alkaline phosphatase of any one of [1] to [9] or the modified alkaline phosphatase produced by the method of [10].
  • an expression vector comprising the polynucleotide of [17];
  • a transformed cell comprising an expression unit of a polynucleotide encoding the modified alkaline phosphatase of any one of [1] to [9] or the modified alkaline phosphatase produced by the method of [10].
  • the modified alkaline phosphatase mutant of the present invention is excellent in both activity and thermostability.
  • the modified alkaline phosphatase variants of the invention are useful as reagents (eg, clinical test reagents, laboratory reagents).
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of native alkaline phosphatase bIAPII (SEQ ID NO: 1).
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) of modified alkaline phosphatase Mut1.
  • FIG. 3 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of modified alkaline phosphatase Mut2.
  • Figure 4 shows the amino acid sequence of modified alkaline phosphatase Mut3 (SEQ ID NO:7).
  • Figure 5 shows the amino acid sequence of modified alkaline phosphatase Mut4 (SEQ ID NO: 9).
  • FIG. 6 is a diagram showing the thermostability evaluation (residual activity after heating for 10 minutes) of the purified enzyme.
  • Modified alkaline phosphatase or modified alkaline phosphatase-labeled substance (1) Modified alkaline phosphatase
  • the present invention provides a modified alkaline phosphatase, which is a protein (A), (B), or (C) below: (A) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 5, 7, or 9; (B) a protein comprising an amino acid sequence having 95% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, or 9 and having dephosphorylation activity; or (C) SEQ ID NOs: 3, 5 , 7, or 9 amino acid sequences, including substitutions, deletions, insertions, additions, and amino acid sequences containing mutations of 1 to 23 amino acid residues selected from the group consisting of combinations thereof, and dephosphorylation A protein with oxidative activity.
  • A a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 5, 7, or 9
  • B a protein comprising an amino acid sequence having 95% or more
  • amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, and 9 are the amino acid sequences of the bIAPII variants Mut1, Mut2, Mut3, and Mut4, respectively, disclosed in the Examples.
  • the percent identity of the above amino acid sequences is 95% or more. Preferably, the identity may be 96% or greater, 97% or greater, 98% or greater or 99% or greater.
  • the above amino acid residue mutations are selected from the group consisting of amino acid residue deletions, substitutions, insertions, additions, and combinations thereof.
  • the number of mutations is a number that does not impair the properties (eg, activity, thermostability) of the modified alkaline phosphatase, and is 1 to 23.
  • the number of mutations is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 15, still more preferably 1 to 10, particularly preferably 1 to 5 (eg, 1, 2, 3, 4 , or 5).
  • the modified alkaline phosphatase of the present invention may have one or more amino acid residue mutations as long as the desired percent identity and properties are maintained.
  • the positions of amino acid residues that may be mutated are obvious to those skilled in the art. For example, one skilled in the art can 1) compare the amino acid sequences of multiple proteins with similar properties (e.g., SEQ ID NOS: 3, 5, 7, and 9); 2) regions that are relatively conserved; 3) identify regions that are not significantly conserved, and then 3) identify regions that may play an important role in function and regions that are important for function from relatively conserved and relatively non-conserved regions, respectively. Since it can predict regions that cannot play a role, it is possible to recognize the correlation between structure and function.
  • amino acid residues that may be mutated in the amino acid sequence of the modified alkaline phosphatase of the present invention.
  • the amino acid residue after mutation at such position is the desired natural ⁇ -amino acid residue that is different from the amino acid residue before mutation.
  • Such desirable natural ⁇ -amino acid residues are L-alanine (A), L-asparagine (N), L-cysteine (C), L-glutamine (Q), L-isoleucine (I), L- Leucine (L), L-Methionine (M), L-Phenylalanine (F), L-Proline (P), L-Serine (S), L-Threonine (T), L-Tryptophan (W), L-Tyrosine (Y), L-valine (V), L-aspartic acid (D), L-glutamic acid (E), L-arginine (R), L-histidine (H), L-lysine (K), or glycine ( G).
  • amino acid residue mutations may be conservative substitutions.
  • conservative substitution refers to the replacement of a given amino acid residue with an amino acid residue having a similar side chain.
  • Families of amino acid residues with similar side chains are well known in the art. For example, such families include amino acids with basic side chains (e.g. lysine, arginine, histidine), amino acids with acidic side chains (e.g. aspartic acid, glutamic acid), amino acids with uncharged polar side chains. (e.g. asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), amino acids with non-polar side chains (e.g.
  • amino acids with aromatic side chains e.g. tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine
  • amino acids with hydroxyl group e.g. alcoholic, phenolic
  • amino acids with sulfur-containing side chains e.g. cysteine, methionine
  • Amino acids with uncharged polar side chains and amino acids with non-polar side chains are sometimes collectively referred to as neutral amino acids.
  • conservative amino acid substitutions are between aspartic acid and glutamic acid, between arginine and lysine and histidine, between tryptophan and phenylalanine, between phenylalanine and valine. , between leucine, isoleucine and alanine, and between glycine and alanine.
  • the dephosphorylation activity can be determined by measuring the conversion activity from p-nitrophenol phosphate to p-nitrophenol. For example, the modified alkaline phosphatase containing the amino acid sequences of (B) and (C) is compared with the modified alkaline phosphatase containing the amino acid sequence of the corresponding SEQ ID NO in (A) above when the activity is measured under the same conditions. As a standard, it is preferred to have an activity of 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more or 95% or more.
  • the modified alkaline phosphatase of the present invention can also have excellent thermostability.
  • the modified alkaline phosphatase containing the amino acid sequences of (B) and (C) contains the amino acid sequence of the corresponding SEQ ID NO in (A) above when subjected to heat treatment and subsequent activity measurement under the same conditions.
  • Has a residual activity of 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more based on the modified alkaline phosphatase is preferred.
  • Such conditions include heat treatment of a cell-free extract of alkaline phosphatase at 70° C.
  • the modified alkaline phosphatase of the present invention having excellent thermostability has excellent liquid stability and/or long-term storage stability. It can be said that Accordingly, the modified alkaline phosphatase of the present invention is useful as a reagent.
  • the amino acid sequence of (B) or (C) has mutations of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332V, E343Q, I352T, G402S, T413E, E416D, E455Q, and I461V. may be maintained.
  • the number of amino acid residue mutations to be maintained may be 1, or 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, or 8. good too.
  • the amino acid sequence (B) or (C) is, among the above mutations, one or more amino acid residue mutations selected from the group consisting of I332V, E343Q, G402S, T413E, E416D, and E455Q may be maintained.
  • the number of amino acid residue mutations maintained may be one, or may be two or more, three or more, four or more, five or more, or six.
  • the amino acid sequence (B) or (C) has one or more amino acid residue mutations selected from the group consisting of I332V, E343Q, G402S, T413E, and E416D among the above mutations. may be maintained.
  • the number of amino acid residue mutations maintained may be one, or two or more, three or more, four or more, or five.
  • the amino acid sequence of (B) or (C) maintains mutations of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332V, G402S, T413E, and E416D among the above mutations. You may have The number of amino acid residue mutations maintained may be one, or two or more, three or more, or four.
  • the amino acid sequence of (B) or (C) maintains one or more amino acid residue mutations selected from the group consisting of E343Q, I352T, G402S, and E455Q among the above mutations.
  • the number of amino acid residue mutations maintained may be one, or two or more, three or more, or four.
  • the present invention also includes mutations of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332, E343, I352, G402, T413, E416, E455, and I461 in the amino acid sequence encoding bovine intestinal alkaline phosphatase.
  • a modified alkaline phosphatase comprising an amino acid sequence and having dephosphorylation activity is provided.
  • the amino acid residue after mutation at these sites is the desired natural ⁇ -amino acid residue that is different from the amino acid residue before mutation.
  • Such desirable natural ⁇ -amino acid residues are glycine, L-alanine (A), L-asparagine (N), L-cysteine (C), L-glutamine (Q), L-isoleucine (I), L-leucine (L), L-methionine (M), L-phenylalanine (F), L-proline (P), L-serine (S), L-threonine (T), L-tryptophan (W), L - from tyrosine (Y), L-valine (V), L-aspartic acid (D), L-glutamic acid (E), L-arginine (R), L-histidine (H), and L-lysine (K)
  • the mutation may be a mutation of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332V, E343Q, I352T, G402S, T413E, E416D, E455
  • the mutation may be mutation of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332, E343, G402, T413, E416, and E455.
  • the mutation may be mutation of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332V, E343Q, G402S, T413E, E416D, and E455Q.
  • the number of amino acid residues to be mutated may be one, or two or more, three or more, four or more, five or more, or six.
  • the mutation may be a mutation of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332, E343, G402, T413, and E416.
  • the mutation may be mutation of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332V, E343Q, G402S, T413E, and E416D.
  • the number of amino acid residues to be mutated may be one, or two or more, three or more, four or more, or five.
  • the mutation may be a mutation of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332, G402, T413, and E416.
  • the mutation may be mutation of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332V, G402S, T413E, and E416D.
  • the number of amino acid residues to be mutated may be one, or two or more, three or more, or four.
  • the mutation may be mutation of one or more amino acid residues selected from the group consisting of E343, I352, G402, and E455.
  • the mutation may be mutation of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332V, G402S, T413E, and E416D.
  • the number of amino acid residues to be mutated may be one, or two or more, three or more, or four.
  • the calf intestinal alkaline phosphatase may be the following protein (A), (B), or (C): (A) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; (B) a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having dephosphorylation activity; or (C) a substitution or deletion in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 , insertions, additions, and combinations thereof, and has dephosphorylation activity.
  • the identity of the above amino acid sequences is 90% or more.
  • the identity may be 91% or greater, 92% or greater, 93% or greater, 94% or greater, 95% or greater, 96% or greater, 97% or greater, 98% or greater, or 99% or greater. Calculation of such percent identity can be performed in the same manner as described above.
  • the above amino acid residue mutations are selected from the group consisting of amino acid residue deletions, substitutions, insertions, additions, and combinations thereof.
  • the number of mutations is a number that does not impair the properties (eg, activity, thermostability) of the modified alkaline phosphatase, and is 1 to 47.
  • the number of mutations is preferably 1 to 45, more preferably 1 to 40, still more preferably 1 to 30, particularly preferably 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, or 1 to 5 (eg, 1, 2, 3, 4, or 5).
  • the modified alkaline phosphatase of the present invention may have one or more amino acid residue mutations as long as the desired percent identity and properties are maintained.
  • the positions of amino acid residues that may be mutated are obvious to those skilled in the art.
  • a person skilled in the art can 1) compare the amino acid sequences of a plurality of proteins having similar properties [for example, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (bovine intestinal alkaline phosphatase) and another bovine intestinal alkaline phosphatase (e.g., bovine comparison with the amino acid sequences encoding small intestine-derived alkaline phosphatase I, III, IV, V, VI, and/or VII) or comparison of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, and 9], 2) Identify relatively conserved and relatively non-conserved regions, and then 3) from the relatively conserved and relatively non-conserved regions, respectively, Since it can predict regions that can play important roles and regions that cannot play important roles in function
  • amino acid residues that may be mutated in the amino acid sequence of the modified alkaline phosphatase of the present invention.
  • the amino acid residue after mutation at such position is the desired natural ⁇ -amino acid residue that is different from the amino acid residue before mutation.
  • desired natural ⁇ -amino acid residues are the same as those described above.
  • Amino acid residue mutations may be conservative substitutions as described above.
  • the dephosphorylation activity and thermal stability are also the same as those described above.
  • the modified alkaline phosphatase of the present invention may be a fusion protein further comprising a portion encoding another functional peptide in addition to the portion encoding the modified alkaline phosphatase.
  • the modified alkaline phosphatase of the present invention may have a signal sequence at its N-terminus to promote extracellular secretion from transformed cells. Examples of such signal sequences include MglB signal sequence, PelB signal sequence, OmpA signal sequence, PhoA signal sequence, OmpF signal sequence, PhoE signal sequence, MalE signal sequence, OmpC signal sequence, Lpp signal sequence and LamB signal sequence. mentioned.
  • the modified alkaline phosphatase of the invention may also have other peptide moieties (eg, tag moieties) at the C-terminus or N-terminus, or both (preferably the C-terminus).
  • Other peptide components that can be added to the modified alkaline phosphatase of the present invention include, for example, peptide components that facilitate purification of the target protein (e.g., histidine tag, tag portion such as Strep-tag II; glutathione-S-transferase, proteins commonly used for purification of target proteins such as maltose binding protein), peptide components that improve the solubility of target proteins (e.g., Nus-tag), peptide components that act as chaperones (e.g., trigger factors), and other functions Proteins or domains of proteins or peptide components as linkers connecting them are included.
  • target protein e.g., histidine tag, tag portion such as Strep-tag II; glutathione-S-transferas
  • the fusion protein of the present invention may be a fusion protein that includes a portion encoding an affinity peptide or an antigenic peptide as a portion encoding another functional peptide.
  • Target molecules for such affinity peptides include oligopeptides or polypeptides (i.e. proteins), oligosaccharides or polysaccharides, nucleic acids or (e.g. DNA, RNA or artificial nucleic acids), lipids, low molecular weight compounds (e.g. amino acids, monosaccharides, nucleotides, nucleosides, other biological components present in body fluids such as blood, and pharmaceuticals).
  • affinity peptides include antibodies or fragments thereof (eg, single-chain antibodies) and antibody mimetics as described below.
  • Antigenic peptides include, for example, viral antigenic peptides, allergenic peptides, tumor-specific antigenic peptides, tumor-associated antigenic peptides, bacterial antigenic peptides, fungal antigenic peptides, parasite antigenic peptides.
  • the present invention also provides a method for producing modified alkaline phosphatase, comprising: Introducing mutations of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332, E343, I352, G402, T413, E416, E455, and I461 into bovine intestinal alkaline phosphatase, In the amino acid sequence encoding bovine small intestine alkaline phosphatase, an amino acid sequence containing mutations of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332, E343, I352, G402, T413, E416, E455, and I461, and producing a modified alkaline phosphatase having dephosphorylation activity.
  • the bovine small intestine-derived alkaline phosphatase may be a native alkaline phosphatase or a mutant alkaline phosphatase.
  • the bovine intestinal alkaline phosphatase utilized in the present invention is an alkaline phosphatase that does not have the desired mutation at one or more sites as described above.
  • the bovine intestinal alkaline phosphatase used in the present invention has two or more (e.g., 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8) sites as described above. Alkaline phosphatase that does not have the mutation of interest in
  • Mutations of amino acid residues introduced into these sites are mutations of desired natural ⁇ -amino acid residues that are different from the amino acid residues before mutation. Such desired natural ⁇ -amino acid residues are the same as those described above.
  • the introduced mutation may be a mutation of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332V, E343Q, I352T, G402S, T413E, E416D, E455Q, and I461V.
  • the number of mutations to be introduced may be 1, or may be 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, or 8. . Mutations can be introduced by any method (eg, site-directed mutagenesis) capable of introducing mutations at desired sites.
  • the introduced mutation may be a mutation of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332, E343, G402, T413, E416, and E455.
  • the introduced mutation may be a mutation of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332V, E343Q, G402S, T413E, E416D, and E455Q.
  • the number of mutations introduced may be one, or two or more, three or more, four or more, five or more, or six.
  • the introduced mutation may be a mutation of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332, E343, G402, T413, and E416.
  • the introduced mutation may be a mutation of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332V, E343Q, G402S, T413E, and E416D.
  • the number of mutations introduced may be one, or two or more, three or more, four or more, or five.
  • the introduced mutation may be a mutation of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332, G402, T413, and E416.
  • the introduced mutation may be a mutation of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332V, G402S, T413E, and E416D.
  • the number of mutations to be introduced may be one, or two or more, three or more, or four.
  • the introduced mutation may be a mutation of one or more amino acid residues selected from the group consisting of E343, I352, G402, and E455.
  • the introduced mutation may be a mutation of one or more amino acid residues selected from the group consisting of I332V, G402S, T413E, and E416D.
  • the number of mutations to be introduced may be one, or two or more, three or more, or four.
  • the calf intestinal alkaline phosphatase may be the following protein (A), (B), or (C): (A) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; (B) a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having dephosphorylation activity; or (C) a substitution or deletion in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 , insertions, additions, and combinations thereof, and has dephosphorylation activity.
  • the degree of percent identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the number of amino acid residue mutations in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are the same as described above.
  • the present invention also provides a modified alkaline phosphatase obtained by the method for producing a modified alkaline phosphatase as described above.
  • Substance labeled with modified alkaline phosphatase The present invention also provides a substance labeled with modified alkaline phosphatase.
  • a substance to be labeled with modified alkaline phosphatase is an affinity substance or an antigen for any target molecule.
  • Target molecules for such affinity substances include oligopeptides or polypeptides (i.e., proteins), oligosaccharides or polysaccharides, nucleic acids or (e.g., DNA, RNA, or artificial nucleic acids), lipids, low-molecular-weight compounds (e.g., amino acids, monosaccharides, nucleotides, nucleosides, other biological components present in body fluids such as blood, and pharmaceuticals).
  • affinity substances include antibodies, aptamers, lectins, complementary strands of nucleic acids, and antibody mimetics.
  • alkaline phosphatase-labeled affinity substances have been reported (eg, Berg et al., Labeling Antibodies, http://cshprotocols.cshlp.org/content/2020/7/pdb.top099242 .full, Suzuki et al., Open sandwich ELISA with VH-/VL-alkaline phosphorase fusion proteins, https://doi.org/10.1016/S0022-1759(99)00020-4).
  • Antigens include, for example, virus antigens, allergens, carbohydrate antigens, tumor-specific antigens, tumor-associated antigens, bacterial antigens, fungal antigens, and parasite antigens.
  • Various antigens labeled with alkaline phosphatase have been reported (see, for example, Japanese Patent No. 2525195).
  • the affinity agent may be an antibody.
  • Antibodies may be polyclonal antibodies or monoclonal antibodies.
  • Antibody isotypes include, for example, IgG (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD, IgE, and IgY.
  • Antibodies can be full-length antibodies or antibody fragments (eg, F(ab') 2 , Fab', Fab, Fv, single chain antibodies).
  • the labeling of substances with the modified alkaline phosphatase of the present invention can be carried out in the same manner as the labeling of substances with alkaline phosphatase. Since labeling of substances with alkaline phosphatase is commonly used, those skilled in the art can appropriately label substances with the modified alkaline phosphatase of the present invention. Labeling of substances with alkaline phosphatase includes, for example, chemical labeling and enzymatic labeling.
  • Examples of chemical labeling of substances with alkaline phosphatase include methods using glutaraldehyde as a cross-linking agent (e.g., Winston et al., Conjugation of Enzymes to Antibodies, https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/full /10.1002/0471142727.mb1101s50) ⁇ ( ⁇ Watabe et al.,Ultrasensitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of proteins by combination with the thio-NAD cycling method,Biophysics(Nagoya -shi), 2014, 10, 49-54; Japanese Patent No. 5265816) can be used.
  • glutaraldehyde as a cross-linking agent
  • Enzymatic labeling of substances with alkaline phosphatase includes, for example, a method using sortase A as a binding enzyme (e.g., Sakamoto et al., Enzyme-Mediated Site-Specific Antibody-Protein Modification Using a ZZ Domain as a Linker, https:/ /pubs.acs.org/doi/10.1021/bc100206z), a method using lipoic acid ligase as a binding enzyme (e.g., Cohen et al., Site-specific protein modification using lipoic acid ligase and bis-aryl hydrzone, for https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4758125/).
  • sortase A e.g., Sakamoto et al., Enzyme-Mediated Site-Specific Antibody-Protein Modification Using a ZZ Domain as a Linker, https:/ /pubs.a
  • a substance labeled with the modified alkaline phosphatase of the present invention is useful for detection or quantification of a substance to be measured.
  • immunological methods for detecting or quantifying target molecules using affinity substances as substances are widely used.
  • the affinity substance is an antibody and the target molecule (antigen) of the antibody is the substance to be measured
  • the antibody labeled with the modified alkaline phosphatase of the present invention is a detection antibody (e.g., , a labeled antibody in a sandwich assay using at least two kinds of antibodies including a solid-phase antibody against a substance to be measured and a labeled antibody against the substance to be measured, and a labeled antibody in a non-sandwich assay).
  • the affinity substance is an antibody and the target molecule of the antibody is another antibody against the substance to be measured
  • the antibody labeled with the modified alkaline phosphatase of the present invention binds to the other antibody against the substance to be measured.
  • Immunological methods for detecting or quantifying target molecules are also commonly used when the substance is an antibody.
  • the modified alkaline phosphatase of the invention is produced using a transformed cell comprising an expression unit comprising a polynucleotide encoding the modified alkaline phosphatase of the invention and a promoter operably linked thereto. or using a cell-free system or the like.
  • the present invention also provides such polynucleotides and transformed cells, as well as expression vectors that can be used to produce transformants.
  • the polynucleotide of the present invention is a polynucleotide encoding the modified alkaline phosphatase of the present invention.
  • Polynucleotides of the invention may be DNA or RNA, although DNA is preferred.
  • the transformed cells of the present invention can be produced, for example, by methods using expression vectors containing the polynucleotides of the present invention (eg, competent cell method, electroporation method), or genome modification techniques.
  • the expression vector is an integrative vector that undergoes homologous recombination with the host cell's genomic DNA
  • the expression unit can be integrated into the host cell's genomic DNA upon transformation.
  • the expression vector is a non-integrating vector that does not undergo homologous recombination with the genomic DNA of the host cell
  • the expression unit is not integrated into the genomic DNA of the host cell by transformation, and the expression vector is incorporated into the host cell. It can exist independently of genomic DNA while remaining intact.
  • the expression unit is incorporated into the host cell's genomic DNA, and the expression unit inherent in the host cell is modified. It is possible to
  • the present invention also provides an expression vector containing the polynucleotide of the present invention.
  • the expression vector of the present invention may further contain elements such as terminators, ribosome binding sites, and drug resistance genes that function in host cells.
  • Drug resistance genes include, for example, resistance genes to drugs such as tetracycline, ampicillin, kanamycin, hygromycin, and phosphinothricin.
  • the expression vector may also contain a region that allows homologous recombination with the genome of the host cell for homologous recombination with the genome DNA of the host cell.
  • an expression vector may be designed so that the expression unit it contains is located between a pair of homologous regions (e.g., homology arms, loxP, FRT, homologous to a particular sequence in the genome of the host cell).
  • the genomic region of the host cell into which the expression unit is to be introduced is not particularly limited, but may be a locus of a gene highly expressed in the host cell.
  • the expression vector may be a plasmid, viral vector, phage, or artificial chromosome.
  • Expression vectors may also be integrative or non-integrative vectors.
  • An integrating vector may be a type of vector that integrates in its entirety into the genome of the host cell.
  • an integrating vector may be a type of vector whose only part (eg, an expression unit) is integrated into the genome of the host cell.
  • Expression vectors can also be DNA vectors or RNA vectors (eg, retroviruses).
  • the expression vector may also be a commonly used expression vector.
  • Such expression vectors include, for example, pUC (e.g., pUC19, pUC18), pSTV, pBR (e.g., pBR322), pHSG (e.g., pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398), RSF (e.g., RSF1010), pACYC (e.g., pACYC177, pACYC184), pMW (eg pMW119, pMW118, pMW219, pMW218), pQE (eg pQE30), and derivatives thereof.
  • pUC e.g., pUC19, pUC18
  • pSTV e.g., pBR322
  • pHSG e.g., pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398
  • RSF e.g., RSF101010
  • pACYC e.g., p
  • Examples of hosts for expressing the modified alkaline phosphatase of the present invention include bacteria belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli, bacteria belonging to the genus Corynebacterium (e.g., Corynebacterium glutamicum), and bacilli.
  • prokaryotic cells including bacteria of the genus [e.g., Bacillus subtilis], bacteria of the genus Saccharomyces [e.g., Saccharomyces cerevisiae], bacteria of the genus Pichia [e.g., Pichia stipitis ], bacteria of the genus Aspergillus [eg, Aspergillus oryzae], and various other eukaryotic cells can be used.
  • insect cells, plant cells, animal cells (eg, mammalian cells such as Chinese hamster ovary (CHO) cells) can be used as hosts.
  • a strain lacking a given gene may be used as a host.
  • Transformed cells include, for example, transformed cells harboring an expression vector in the cytoplasm, and transformed cells into which a gene of interest has been introduced onto the genome.
  • the transformed cells of the present invention can be cultured, for example, in a medium having the composition described below, using a predetermined culture device (eg, test tube, flask, jar fermenter).
  • Culture conditions can be appropriately set. Specifically, the culture temperature may be 10° C. to 37° C., the pH may be 6.5 to 7.5, and the culture time may be 1 hour to 100 hours.
  • the culture may be performed while controlling the dissolved oxygen concentration.
  • the dissolved oxygen concentration (DO value) in the culture medium may be used as an index for control.
  • Aeration and agitation conditions should be controlled so that the relative dissolved oxygen concentration DO value when the atmospheric oxygen concentration is 21% does not fall below, for example, 1 to 10%, preferably 3% to 8%. can be done.
  • the culture may be batch culture or fed-batch culture. In the case of fed-batch culture, the culture can be continued by continuously or discontinuously adding a sugar source solution or a phosphoric acid-containing solution to the culture medium.
  • the host to be transformed is as described above, but when it comes to Escherichia coli in detail, it can be selected from Escherichia coli JM109 strain, DH5 ⁇ strain, HB101 strain, BL21 (DE3) strain, etc. of Escherichia coli K12 strain subspecies. Methods for performing transformation and methods for selecting transformed cells are also described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Press (2001/01/15), and the like. A method for producing a transformed E. coli and using it to produce a desired enzyme will be described in more detail below as an example.
  • E. Promoters used for heterologous protein production in E. coli can be used, such as PhoA, PhoC, T7 promoter, lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, PR promoter of lambda phage, PL promoter, T5 promoter, etc. Strong promoters are included, with PhoA, PhoC and lac being preferred.
  • vectors examples include pUC (e.g., pUC19, pUC18), pSTV, pBR (e.g., pBR322), pHSG (e.g., pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398), RSF (e.g., RSF1010), pACYC (e.g., pACYC177, pACYC184), pMW (eg, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218), pQE (eg, pQE30), derivatives thereof, and the like may be used.
  • Phage DNA vectors may be used as other vectors.
  • expression vectors containing promoters and capable of expressing the inserted DNA sequences may be used.
  • the vector may be pUC, pSTV, pMW.
  • a terminator which is a transcription termination sequence, may also be ligated downstream of the polynucleotide of the present invention.
  • terminators include T7 terminator, fd phage terminator, T4 terminator, tetracycline resistance gene terminator, and E. coli trpA gene terminator.
  • a so-called multicopy type is preferable, and examples thereof include plasmids having a replication origin derived from ColE1, such as pUC-based plasmids, pBR322-based plasmids, and derivatives thereof. be done.
  • the term "derivative" means a plasmid modified by base substitution, deletion, insertion and/or addition.
  • the vector preferably has a marker such as an ampicillin resistance gene in order to select transformed cells.
  • Expression vectors with strong promoters are commercially available as such plasmids [eg, pUC system (manufactured by Takara Bio), pPROK system (manufactured by Clontech), pKK233-2 (manufactured by Clontech)].
  • the modified alkaline phosphatase of the present invention can be obtained by transforming E. coli with the obtained expression vector of the present invention and culturing this E. coli.
  • the medium a medium commonly used for culturing E. coli, such as M9-casamino acid medium and LB medium, may be used.
  • the medium may contain a given carbon source, nitrogen source and coenzyme (eg, pyridoxine hydrochloride).
  • coenzyme eg, pyridoxine hydrochloride
  • peptone, yeast extract, NaCl, glucose, MgSO4 , ammonium sulfate, potassium dihydrogen phosphate, ferric sulfate, manganese sulfate, and the like may be used.
  • culture conditions and production induction conditions are appropriately selected according to the types of vector markers, promoters, host bacteria, and the like used.
  • the modified alkaline phosphatase of the present invention can be obtained by disrupting (e.g., sonication, homogenization) or lysing (e.g., lysozyme treatment) the cells to produce a homogenate and a lysate.
  • disrupting e.g., sonication, homogenization
  • lysing e.g., lysozyme treatment
  • alkaline phosphatase is secreted or leaked out of the cells
  • a sterilized solution containing alkaline phosphatase can be obtained from the culture solution by centrifugation or membrane filtration.
  • the modified alkaline phosphatase of the present invention can be obtained by subjecting such crushed product, lysate and sterilized solution to techniques such as extraction, precipitation, filtration and column chromatography.
  • Method using modified alkaline phosphatase or modified alkaline phosphatase-labeled substance (1) Measurement of alkaline phosphatase activity
  • a method for measuring alkaline phosphatase activity comprising measuring alkaline phosphatase activity.
  • any substrate that can be used to measure alkaline phosphatase activity can be used as the substrate.
  • substrates include phosphorylated substances [e.g., p-nitrophenol phosphate, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, 2-chloro-5-(4-methoxyspiro[1 ,2-dioxetane-3,2′-(5-chlorotricyclo[3.3.1.1 3.7 ]decane])-4-yl]-1-phenyl phosphate, naphthol phosphate AS-TR, Phenolphthalein phosphate, indoxyl phosphate, naphthol AS-BI phosphate, naphthol AS-E phosphate, naphthol AS-MX phosphate, bis(p-nitrophenyl) phosphate, phenolphthalein bisphosphate, 5- A luminescent substrate comprising bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, 1-naphth
  • alkaline phosphatase activity e.g., pH 8-11
  • appropriate temperature e.g., 4-40 ° C.
  • index value of dephosphorylated substance e.g., absorbance
  • biological assays such as reporter assays.
  • the method for measuring alkaline phosphatase activity may be a method of detecting or quantifying a target molecule using a substance labeled with the modified alkaline phosphatase of the present invention.
  • the substance labeled with modified alkaline phosphatase and its target molecule are the same as those described above.
  • a substance labeled with the modified alkaline phosphatase of the present invention can be used as a detection antibody that can bind to the substance to be measured, or a secondary antibody that can bind to another antibody to the substance to be measured, as described above. Therefore, measurement of alkaline phosphatase activity enables detection or quantification of the substance to be measured.
  • the modified alkaline phosphatase of the present invention or a modified alkaline phosphatase-labeled substance is used to dephosphorylate a phosphorylated substance to produce a dephosphorylated substance.
  • a method for producing a dephosphorylated substance comprising:
  • the phosphorylated substances are dephosphorylated by reacting the phosphorylated substances with modified alkaline phosphatase or modified alkaline phosphatase-labeled substances under conditions for measuring alkaline phosphatase activity as described above. Phosphorylated substances can be produced.
  • dephosphorylation of a phosphorylated substance may be dephosphorylation of the 5' or 3' terminal phosphate of a nucleic acid.
  • Nucleic acids may be single-stranded or double-stranded (with overhanging or blunt ends). According to such a method, undesired ligation of nucleic acids (eg, vector self-ligation) can be prevented.
  • Example 1 Design of Alkaline Phosphatase and Production of Expression Plasmid Plasmids (expression vectors) used in this study were produced by the methods described below.
  • sequences having these motif-like sequences were selected and further analyzed with ClustalW to remove sequences with low homology and sequences containing gaps, finally obtaining 10 sequences.
  • 10 sequences were used to design artificial alkaline phosphatase sequences designated Mut1, Mut2, Mut3, and Mut4 as shown in the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9 (FIGS. 2-5).
  • (A) bIAPII expression plasmid The amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) obtained by removing the N-terminal secretory signal sequence and the C-terminal GPI anchor region from bovine intestinal alkaline phosphatase (bIAPII) was expressed in E. coli. After optimizing the codons of E. coli and converting it into a base sequence, a plasmid containing this base sequence (SEQ ID NO: 2) was synthesized by Eurofins Genomics.
  • the bIAPII-encoding region was amplified by PCR using the primers of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, and the resulting fragment was cloned with NcoI and XhoI using the In-fusion HD cloning kit (Takara Bio). Cloned into digested pET-28a(+) vector.
  • (C) The nucleotide sequence (SEQ ID NO: 4) encoding the artificially designed ALP expression plasmid Mut1 (SEQ ID NO: 3) to which the MglB signal sequence was added was inserted into the NcoI/XhoI site of the pET-28a (+) vector. Synthesized by Genomics. Using this plasmid as a template and the primers of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 16, linear DNA was amplified by PCR and circularized with an In-fusion HD cloning kit. In this plasmid, Mut1 with an MglB signal sequence added to the N-terminus and a His tag added to the C-terminus is expressed.
  • Nucleotide sequences encoding each are SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10.
  • Example 2 Preparation of cell-free extract
  • the plasmids constructed in (B) and (C) of Example 1 were transferred to E. coli.
  • E. coli BL21(DE3) was transformed to obtain various ALP-expressing strains. Each expression strain was grown overnight at 37° C. on LB agar medium containing 50 mg/L of kanamycin.
  • the obtained cells were inoculated into 100 mL of 4 ⁇ TB medium containing 50 mg/L kanamycin, 5 mM magnesium sulfate and 10 ⁇ M zinc chloride, and cultured with shaking at 37° C. using a Sakaguchi flask.
  • IPTG was added to a final concentration of 0.1 mM to induce expression, and cultured at 25° C. for 18 hours.
  • bacterial cells were collected from 1 mL of the resulting culture solution by centrifugation. Next, it was suspended in 100 ⁇ L of xTractor buffer (Takara Bio), magnesium sulfate was added to a final concentration of 1 mM and zinc chloride was added to a final concentration of 100 ⁇ M, and the cells were lysed by incubating at room temperature for 20 minutes. Cell residues were removed from the lysate by centrifugation, and the resulting supernatant was used as a cell-free extract.
  • xTractor buffer Tala Bio
  • Example 3 Activity Measurement of Cell-Free Extract The ALP activity of the cell-free extract was measured by conversion activity from p-nitrophenol phosphate to p-nitrophenol.
  • serial dilutions of the cell-free extract were prepared with a dilution buffer (100 mM Tris-HCl, 150 mM sodium chloride, 1 mM magnesium sulfate, 0.05 mM zinc chloride, 0.1% bovine serum albumin, pH 7.0).
  • the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of p-nitrophenol per minute is defined as 1 U, and the activity of the cell-free extract was measured by the following formula.
  • Activity of cell-free extract (U / L) ( ⁇ A test - ⁇ A blank ) ⁇ 1000 ⁇ 200 / (18.75 ⁇ 0.5 ⁇ 4) 18.75: Molar extinction coefficient of p-nitrophenol (mM -1 cm -1 ) 0.5: optical path length (cm)
  • Table 3 shows the ALP activity of the obtained cell-free extract.
  • the cell-free extract of the artificially designed ALP-expressing strain showed higher ALP activity than that of the bIAPII-expressing strain (Table 3).
  • Example 4 Evaluation of Thermal Stability Based on the values measured in Example 3, each cell-free extract prepared in Example 2 was diluted with the dilution buffer of Example 3 so that the activity was 300 U/L. Diluted. Next, 20 ⁇ L of the enzyme dilution solution was dispensed into microtubes, heat-treated at 70° C. for 10 minutes using TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (Takara Bio), transferred to ice and cooled. In the same manner as in Example 3, ALP activity was measured three times for each of the unheated enzyme dilution and the heat treated enzyme dilution.
  • Residual activity (%) ALP activity of diluted enzyme solution after heat treatment/ALP activity of untreated diluted enzyme solution ⁇ 100
  • a vector fragment was prepared by PCR using the primers of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16, using the pET-28a(+) vector as a template.
  • the prepared insert and vector fragment were ligated using the In-fusion HD cloning kit.
  • the resulting plasmid expresses the 385G mutant of bIAPII with an MglB signal sequence at the N-terminus and a His tag at the C-terminus.
  • a vector fragment was prepared by PCR using the primers of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 16, using the pET-28a(+) vector as a template.
  • the prepared insert and vector fragment were ligated using the In-fusion HD cloning kit.
  • the resulting plasmid expresses the 322D/385N/430A mutant of bIAPII with an N-terminal MglB signal sequence and a C-terminal His tag.
  • a cell-free extract was prepared by the method of Example 2 using the constructed plasmid, and ALP activity was measured by the method of Example 3. All activities of the cell-free extracts were lower than those of the artificially designed ALP.
  • Example 5 Comparison of expression levels
  • A Construction of wild-type and artificially designed ALP-expressing bacteria Using the plasmids prepared by gene synthesis in (A) and (C) of Example 1 as templates, the regions encoding each ALP were Amplified by PCR. Using the pET-21b(+) vector as a template, a linear vector was amplified by PCR. Table 6 shows the combinations of primer sequences used. Both obtained fragments were ligated and circularized using In-fusion HD cloning kit (Takara Bio) to obtain an expression plasmid in which each ALP was inserted into the NdeI and XhoI sites of the pET-21b(+) vector. This plasmid was transferred to E. E. coli Tuner (DE3) strain, and E. Transformed into E. coli Origami B (DE3).
  • (B) Preparation of cell-free extract and activity evaluation
  • the strain constructed in (A) was grown overnight at 37°C in LB liquid medium supplemented with 100 mg/L ampicillin.
  • the resulting cells were added to 3 mL of main culture medium (composition: 20 g / L Bacto tryptone, 15 g / L yeast extract, 1 g / L sodium chloride, 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.15) to which 100 mg / L of ampicillin was added. , 5 mM magnesium sulfate and 10 ⁇ M zinc chloride) was inoculated to 30 ⁇ L, and cultured with shaking at 37° C. using a test tube. When the OD660 reached 0.5 to 0.7, IPTG was added to a final concentration of 1 mM to induce expression, and cultured at 18°C.
  • main culture medium composition: 20 g / L Bacto tryptone, 15 g / L yeast extract, 1 g / L sodium chloride, 50 mM
  • ammonium sulfate i.e., ammonium sulfate
  • the enzyme solution was appropriately diluted, and the ALP activity was measured according to Example 3, and converted to the activity value per liter of the culture solution.
  • Example 6 Evaluation of specific activity and thermostability of purified enzyme
  • A Construction of wild-type and artificially designed ALP-expressing bacteria
  • the plasmid prepared by gene synthesis in (C) of Example 1 has a His tag at the C-terminus of ALP. was designed to be added and expressed. A stop codon was inserted between the ALP sequence and the His tag to construct a plasmid expressing ALP without a His tag.
  • the plasmid prepared by gene synthesis in Example 1 (C) was used as a template and amplified by PCR using the primers shown in Table 8.
  • the resulting linear double-stranded DNA was circularized using the In-fusion HD cloning kit (Takara Bio) to obtain an expression plasmid in which each ALP was inserted into the NcoI/XhoI site of the pET-28a(+) vector. .
  • This plasmid and the bIAPII expression plasmid constructed in (A) of Example 1 were transferred to E. coli. Transformed into E. coli Origami 2 (DE3).
  • (B) Preparation of cell-free extract The strain constructed in (A) was grown overnight at 37°C on LB agar medium supplemented with 50 mg/L of kanamycin. 100 mL of main culture medium (composition: 20 g / L Bacto tryptone, 15 g / L yeast extract, 1 g / L sodium chloride, 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.15) to which kanamycin 50 mg / L was added to the obtained cells , 5 mM magnesium sulfate and 10 ⁇ M zinc chloride), and cultured with shaking at 37° C. using a Sakaguchi flask.
  • main culture medium composition: 20 g / L Bacto tryptone, 15 g / L yeast extract, 1 g / L sodium chloride, 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.15) to which kanamycin 50 mg / L was added to the obtained cells , 5 mM magnesium sulfate and 10 ⁇ M zinc chloride
  • IPTG IPTG was added to a final concentration of 1 mM to induce expression, and cultured at 18°C. After 24 hours, the cells were collected from the culture broth by centrifugation, suspended in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 1 mM MgCl 2 and 0.1 mM ZnCl 2 , and sonicated. Cell residues were removed from the lysate by centrifugation, and the resulting supernatant was used as a cell-free extract.
  • ALP activity was measured by conversion activity from p-nitrophenol phosphate to p-nitrophenol using QuantiChrom Alkaline Phosphatase Assay Kit (BioAssay Systems). First, serial dilutions of each ALP solution were prepared with a dilution buffer (100 mM Tris-HCl, 150 mM sodium chloride, 1 mM magnesium sulfate, 0.05 mM zinc chloride, 0.1% bovine serum albumin, pH 7.0).
  • a dilution buffer 100 mM Tris-HCl, 150 mM sodium chloride, 1 mM magnesium sulfate, 0.05 mM zinc chloride, 0.1% bovine serum albumin, pH 7.0.
  • ALP activity (U / L) ( ⁇ A test - ⁇ A blank ) ⁇ 1000 ⁇ 200 / (18.75 ⁇ 0.5 ⁇ 20) 18.75: Molar extinction coefficient of p-nitrophenol (mM -1 cm -1 ) 0.5: optical path length (cm)
  • each enzyme solution was diluted appropriately and the absorbance at 280 nm was measured with an ultratrace spectrometer Nanodrop (Thermo Fisher Scientific). Taking the absorbance of ALP at 1 mg/mL as 1, the concentration of each ALP solution was calculated.
  • the specific activity of each ALP was calculated from the ALP activity and ALP concentration (Table 9).
  • thermostability Each purified ALP was diluted with a dilution buffer and then dispensed into microtubes. After heating at each temperature of 55° C. to 85° C. for 10 minutes with a thermal cycler TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (Takara Bio), it was ice-cooled. The ALP activity of these samples was measured three times each according to Example 3, and the activity value at the time of heating at 55° C. was defined as 100%, and the residual activity after heating at each temperature was calculated (FIG. 6). Furthermore, the temperature (T50) at which the residual activity becomes 50% was calculated (Table 9).
  • the artificially designed ALP was found to improve T50 by 13°C or more compared to bIAPII.
  • Example 7 Evaluation of Single Mutants Twenty-eight common mutation points (Table 2) in four artificially designed ALPs were introduced singly into bIAPII, and the effects of each were evaluated.
  • the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) obtained by removing the N-terminal secretory signal sequence and the C-terminal GPI anchor region from bovine intestinal alkaline phosphatase (bIAPII) was transferred to E. coli. It was optimized for the codons of E. coli and converted into a nucleotide sequence.
  • a plasmid was synthesized by GenScript Co., Ltd.
  • the ALP expression strain introduced with bIAPII and 28 single mutations and the Mut2 expression strain prepared in (B) of Example 6 were grown overnight at 37°C in LB liquid medium supplemented with 50 mg/L of kanamycin. let me The resulting cells were added to 3 mL of main culture medium supplemented with 50 mg/L of kanamycin (composition: 20 g/L Bactotryptone, 15 g/L yeast extract, 1 g/L sodium chloride, 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.15) , 5 mM magnesium sulfate and 10 ⁇ M zinc chloride) was inoculated to 30 ⁇ L, and cultured with shaking at 37° C. using a test tube. When the OD660 reached 0.5 to 0.7, IPTG was added to a final concentration of 1 mM to induce expression, and cultured at 18°C.
  • ammonium sulfate was added to these cell-free extracts to a final concentration of 1M, diluted appropriately, and the ALP activity remaining after heating at 60°C for 10 minutes was measured by the method of Example 4.
  • Example 8 Comparison of expression level and thermostability using cell-free extract According to the method, the expression level per culture medium and the remaining ALP activity after heating at 60° C. for 10 minutes were measured.

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Abstract

本発明は、熱安定性に優れた高活性アルカリホスファターゼを提供する。より具体的には、本発明は、以下（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）のタンパク質である改変アルカリホスファターゼを提供する： （Ａ）配列番号３、５、７、もしくは９のアミノ酸配列を含むタンパク質； （Ｂ）配列番号３、５、７、もしくは９のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有するタンパク質；または （Ｃ）配列番号３、５、７、もしくは９のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、および付加、ならびにそれらの組合せからなる群より選ばれる１～２３個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有するタンパク質。

Description

改変アルカリホスファターゼ
　本発明は、改変アルカリホスファターゼなどに関する。
　アルカリホスファターゼ（ＥＣ　３．１．３．１）は、アルカリ性に至適ｐＨを有する、基質選択性の低いホスホモノエステラーゼである。アルカリホスファターゼは、実験試薬および臨床検査試薬において汎用されている。例えば、実験では、アルカリホスファターゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡの５’末端の脱リン酸化処理、およびレポーターアッセイにおけるレポーターに利用されている。臨床検査試薬では、アルカリホスファターゼは、アルカリホスファターゼで標識された物質（例、抗体等の親和性物質）の形態において、標的分子の検出または定量に利用されている。
　アルカリホスファターゼとしては、ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ｂＩＡＰ）の複数のアイソマーが知られている。このうち、アイソマーＩＩであるｂＩＡＰＩＩは、活性が高いものの、熱安定性は低く、これらの特性の両立には困難を伴うこと、およびｂＩＡＰＩＩの３２２位がアスパラギン酸、３２３位がリジンもしくはアスパラギン、３８５位がセリンもしくはグリシンもしくはアスパラギン、４３０位がアラニンであるｂＩＡＰＩＩ変異体が、天然型ｂＩＡＰＩＩと同等の活性を維持しつつ高い熱安定性を示すことが知られている（特許文献１）。
特許第６７３２３６８号公報
　本発明の目的は、熱安定性に優れた高活性アルカリホスファターゼを提供することである。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、ｂＩＡＰＩＩの活性および熱安定性の双方を改善できる特定の変異を有する改変アルカリホスファターゼを作製することに成功し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）のタンパク質である、改変アルカリホスファターゼ：
（Ａ）配列番号３、５、７、もしくは９のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号３、５、７、もしくは９のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有するタンパク質；または
（Ｃ）配列番号３、５、７、もしくは９のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、および付加、ならびにそれらの組合せからなる群より選ばれる１～２３個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有するタンパク質。
〔２〕（Ｂ）または（Ｃ）のアミノ酸配列が、Ｉ３３２Ｖ、Ｅ３４３Ｑ、Ｉ３５２Ｔ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、Ｅ４１６Ｄ、Ｅ４５５Ｑ、およびＩ４６１Ｖからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を維持する、〔１〕の改変アルカリホスファターゼ。
〔３〕（Ｂ）または（Ｃ）のアミノ酸配列が、Ｉ３３２Ｖ、Ｅ３４３Ｑ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、Ｅ４１６Ｄ、およびＥ４５５Ｑからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を維持する、〔２〕の改変アルカリホスファターゼ。
〔４〕（Ｂ）または（Ｃ）のアミノ酸配列が、Ｅ３４３Ｑ、Ｉ３５２Ｔ、Ｇ４０２Ｓ、およびＥ４５５Ｑからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を維持する、〔１〕の改変アルカリホスファターゼ。
〔５〕ウシ小腸由来アルカリホスファターゼをコードするアミノ酸配列において、Ｉ３３２、Ｅ３４３、Ｉ３５２、Ｇ４０２、Ｔ４１３、Ｅ４１６、Ｅ４５５、およびＩ４６１からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有する改変アルカリホスファターゼ。
〔６〕前記１個以上のアミノ酸残基の変異が、Ｉ３３２Ｖ、Ｅ３４３Ｑ、Ｉ３５２Ｔ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、Ｅ４１６Ｄ、Ｅ４５５Ｑ、およびＩ４６１Ｖからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異である、〔５〕の改変アルカリホスファターゼ。
〔７〕前記１個以上のアミノ酸残基の変異が、Ｅ３４３、Ｉ３５２、Ｇ４０２、およびＥ４５５からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異である、〔５〕の改変アルカリホスファターゼ。
〔８〕ウシ小腸由来アルカリホスファターゼが以下（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）のタンパク質である、〔５〕～〔７〕のいずれかの改変アルカリホスファターゼ：
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有するタンパク質；または
（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、および付加、ならびにそれらの組合せからなる群より選ばれる１～４７個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有するタンパク質。
〔９〕改変アルカリホスファターゼが、改変アルカリホスファターゼをコードする部分に加えて、他の機能性ペプチドをコードする部分をさらに含むタンパク質である、〔１〕～〔８〕のいずれかの改変アルカリホスファターゼ。
〔１０〕以下を含む、改変アルカリホスファターゼの製造方法：
　ウシ小腸由来アルカリホスファターゼに対して、Ｉ３３２、Ｅ３４３、Ｉ３５２、Ｇ４０２、Ｔ４１３、Ｅ４１６、Ｅ４５５、およびＩ４６１からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を導入して、
　ウシ小腸由来アルカリホスファターゼをコードするアミノ酸配列において、Ｉ３３２、Ｅ３４３、Ｉ３５２、Ｇ４０２、Ｔ４１３、Ｅ４１６、Ｅ４５５、およびＩ４６１からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有する改変アルカリホスファターゼを生成すること。
〔１１〕〔１〕～〔９〕のいずれかの改変アルカリホスファターゼ、または〔１０〕の方法により製造された改変アルカリホスファターゼで標識された物質。
〔１２〕物質が親和性物質または抗原である、〔１１〕の物質。
〔１３〕親和性物質が抗体である、〔１２〕の物質。
〔１４〕〔１〕～〔９〕のいずれかの改変アルカリホスファターゼ、〔１０〕の方法により製造された改変アルカリホスファターゼ、または〔１１〕～〔１３〕のいずれかの物質、および基質を用いて、アルカリホスファターゼ活性を測定することを含む、アルカリホスファターゼ活性の測定方法。
〔１５〕アルカリホスファターゼ活性の測定方法が、〔１〕～〔９〕のいずれかの改変アルカリホスファターゼ、〔１０〕の方法により製造された改変アルカリホスファターゼ、または〔１１〕～〔１３〕のいずれかの物質、および基質を用いる、測定対象物質を検出または定量する方法である、〔１４〕の方法。
〔１６〕〔１〕～〔９〕のいずれかの改変アルカリホスファターゼ、〔１０〕の方法により製造された改変アルカリホスファターゼ、または〔１１〕～〔１３〕のいずれかの物質を用いて、リン酸化物質を脱リン酸化して脱リン酸化物質を生成することを含む、脱リン酸化物質の製造方法。
〔１７〕〔１〕～〔９〕のいずれかの改変アルカリホスファターゼ、または〔１０〕の方法により製造された改変アルカリホスファターゼをコードするポリヌクレオチド。
〔１８〕〔１７〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔１９〕〔１〕～〔９〕のいずれかの改変アルカリホスファターゼ、または〔１０〕の方法により製造された改変アルカリホスファターゼをコードするポリヌクレオチドの発現単位を含む形質転換細胞。
　本発明の改変アルカリホスファターゼ変異体は、活性および熱安定性の双方に優れる。例えば、本発明の改変アルカリホスファターゼ変異体は、試薬（例、臨床検査試薬、実験試薬）として有用である。
図１は、天然アルカリホスファターゼｂＩＡＰＩＩのアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。 図２は、改変アルカリホスファターゼＭｕｔ１のアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。 図３は、改変アルカリホスファターゼＭｕｔ２のアミノ酸配列（配列番号５）を示す図である。 図４は、改変アルカリホスファターゼＭｕｔ３のアミノ酸配列（配列番号７）を示す図である。 図５は、改変アルカリホスファターゼＭｕｔ４のアミノ酸配列（配列番号９）を示す図である。 図６は、精製酵素の熱安定性評価（１０分加熱後の残存活性）を示す図である。
１．改変アルカリホスファターゼ、または改変アルカリホスファターゼで標識された物質
（１）改変アルカリホスファターゼ
　本発明は、以下（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）のタンパク質である、改変アルカリホスファターゼを提供する：
（Ａ）配列番号３、５、７、もしくは９のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号３、５、７、もしくは９のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有するタンパク質；または
（Ｃ）配列番号３、５、７、もしくは９のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、および付加、ならびにそれらの組合せからなる群より選ばれる１～２３個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有するタンパク質。
　配列番号３、５、７、および９のアミノ酸配列は、それぞれ、実施例に開示されるｂＩＡＰＩＩ変異体であるＭｕｔ１、Ｍｕｔ２、Ｍｕｔ３、およびＭｕｔ４のアミノ酸配列である。
　上記アミノ酸配列についての同一性％は、９５％以上である。好ましくは、同一性は、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。このような同一性％の算出は、アルゴリズムｂｌａｓｔｐにより行うことができる。より具体的には、このような同一性の算定％は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において提供されているアルゴリズムｂｌａｓｔｐにおいて、デフォルト設定のＳｃｏｒｉｎｇ　Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｇａｐ　Ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１　Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１；Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ　Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ　ｓｃｏｒｅ　ｍａｔｒｉｘ　ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）を用いて行うことができる。
　上記アミノ酸残基の変異は、アミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および付加、ならびにそれらの組合せからなる群より選ばれる。変異の個数は、改変アルカリホスファターゼの特性（例、活性、熱安定性）を損なわない程度の個数であり、１～２３個である。変異の個数は、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１５個、さらにより好ましくは１～１０個、特に好ましくは１～５個（例、１個、２個、３個、４個、または５個）である。
　本発明の改変アルカリホスファターゼは、所望の同一性％および特性が維持される範囲内において１以上のアミノ酸残基の変異を有していてもよい。変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかである。例えば、当業者は、１）同種の特性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列（例、配列番号３、５、７、および９）を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、本発明の改変アルカリホスファターゼのアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。このような位置における変異後のアミノ酸残基は、変異前のアミノ酸残基と異なる所望の天然α－アミノ酸残基である。このような所望の天然α－アミノ酸残基は、Ｌ－アラニン（Ａ）、Ｌ－アスパラギン（Ｎ）、Ｌ－システイン（Ｃ）、Ｌ－グルタミン（Ｑ）、Ｌ－イソロイシン（Ｉ）、Ｌ－ロイシン（Ｌ）、Ｌ－メチオニン（Ｍ）、Ｌ－フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ－プロリン（Ｐ）、Ｌ－セリン（Ｓ）、Ｌ－スレオニン（Ｔ）、Ｌ－トリプトファン（Ｗ）、Ｌ－チロシン（Ｙ）、Ｌ－バリン（Ｖ）、Ｌ－アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ－グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ－アルギニン（Ｒ）、Ｌ－ヒスチジン（Ｈ）、Ｌ－リジン（Ｋ）、またはグリシン（Ｇ）の残基である。
　本発明の改変アルカリホスファターゼにおいて、アミノ酸残基の変異は、保存的置換であってもよい。用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸および非極性側鎖を有するアミノ酸を包括的に、中性アミノ酸と呼称することがある。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
　脱リン酸化活性は、ｐ－ニトロフェノールリン酸からｐ－ニトロフェノールへの変換活性を測定することにより決定することができる。例えば、（Ｂ）および（Ｃ）のアミノ酸配列を含む改変アルカリホスファターゼは、同一の条件下で活性の測定が行われた場合、上記（Ａ）における対応配列番号のアミノ酸配列を含む改変アルカリホスファターゼを基準として２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。このような条件として、アルカリホスファターゼの無細胞抽出液、ならびにジエタノールアミン、塩化マグネシウム、およびｐ－ニトロフェノールリン酸を含む反応液（例、ｐＨ８～１１）を３７℃で反応させた場合における１分あたりの吸光度（４０５ｎｍ）の変化を測定する条件を採用することができる（実施例３を参照）。
　本発明の改変アルカリホスファターゼはまた、優れた熱安定性を有することができる。例えば、（Ｂ）および（Ｃ）のアミノ酸配列を含む改変アルカリホスファターゼは、同一の条件下で熱処理およびそれに引き続き活性の測定が行われた場合、上記（Ａ）における対応配列番号のアミノ酸配列を含む改変アルカリホスファターゼを基準として１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の残存活性を有することが好ましい。このような条件として、アルカリホスファターゼの無細胞抽出液を７０℃で１０分間加熱処理する条件、およびその後に、加熱処理されたアルカリホスファターゼの無細胞抽出液、ならびにジエタノールアミン、塩化マグネシウム、およびｐ－ニトロフェノールリン酸を含む反応液（例、ｐＨ８～１１）を３７℃で反応させた場合における１分あたりの吸光度（４０５ｎｍ）の変化を測定する条件を採用することができる（実施例４を参照）。残存活性は、熱処理していないアルカリホスファターゼの無細胞抽出液について上記のとおり測定された変化を、熱処理していないアルカリホスファターゼの無細胞抽出液について同じく測定された変化に対する百分率として算出することにより決定することができる（実施例４を参照）。酵素の熱安定性と液状安定性および／または長期保存安定性は一般に相関し得るので、優れた熱安定性を有する本発明の改変アルカリホスファターゼは、液状安定性および／または長期保存安定性に優れるということができる。したがって、本発明の改変アルカリホスファターゼは、試薬として有用である。
　特定の実施形態では、（Ｂ）または（Ｃ）のアミノ酸配列は、Ｉ３３２Ｖ、Ｅ３４３Ｑ、Ｉ３５２Ｔ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、Ｅ４１６Ｄ、Ｅ４５５Ｑ、およびＩ４６１Ｖからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を維持していてもよい。維持されるアミノ酸残基の変異の個数は、１個であってもよく、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、または８個であってもよい。
　好ましい実施形態では、（Ｂ）または（Ｃ）のアミノ酸配列は、上記変異のなかでも、Ｉ３３２Ｖ、Ｅ３４３Ｑ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、Ｅ４１６Ｄ、およびＥ４５５Ｑからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を維持していてもよい。維持されるアミノ酸残基の変異の個数は、１個であってもよく、また、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、または６個であってもよい。
　より好ましい実施形態では、（Ｂ）または（Ｃ）のアミノ酸配列は、上記変異のなかでも、Ｉ３３２Ｖ、Ｅ３４３Ｑ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、およびＥ４１６Ｄからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を維持していてもよい。維持されるアミノ酸残基の変異の個数は、１個であってもよく、また、２個以上、３個以上、４個以上、または５個であってもよい。
　さらにより好ましい実施形態では、（Ｂ）または（Ｃ）のアミノ酸配列は、上記変異のなかでも、Ｉ３３２Ｖ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、およびＥ４１６Ｄからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を維持していてもよい。維持されるアミノ酸残基の変異の個数は、１個であってもよく、また、２個以上、３個以上、または４個であってもよい。
　好ましい実施形態では、（Ｂ）または（Ｃ）のアミノ酸配列は、上記変異のなかでも、Ｅ３４３Ｑ、Ｉ３５２Ｔ、Ｇ４０２Ｓ、およびＥ４５５Ｑからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を維持していてもよい。維持されるアミノ酸残基の変異の個数は、１個であってもよく、また、２個以上、３個以上、または４個であってもよい。
　本発明はまた、ウシ小腸由来アルカリホスファターゼをコードするアミノ酸配列において、Ｉ３３２、Ｅ３４３、Ｉ３５２、Ｇ４０２、Ｔ４１３、Ｅ４１６、Ｅ４５５、およびＩ４６１からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有する改変アルカリホスファターゼを提供する。これらの部位における変異後のアミノ酸残基は、変異前のアミノ酸残基と異なる所望の天然α－アミノ酸残基である。このような所望の天然α－アミノ酸残基は、グリシン、Ｌ－アラニン（Ａ）、Ｌ－アスパラギン（Ｎ）、Ｌ－システイン（Ｃ）、Ｌ－グルタミン（Ｑ）、Ｌ－イソロイシン（Ｉ）、Ｌ－ロイシン（Ｌ）、Ｌ－メチオニン（Ｍ）、Ｌ－フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ－プロリン（Ｐ）、Ｌ－セリン（Ｓ）、Ｌ－スレオニン（Ｔ）、Ｌ－トリプトファン（Ｗ）、Ｌ－チロシン（Ｙ）、Ｌ－バリン（Ｖ）、Ｌ－アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ－グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ－アルギニン（Ｒ）、Ｌ－ヒスチジン（Ｈ）、およびＬ－リジン（Ｋ）からなる群より選ばれるアミノ酸残基である。好ましくは、上記変異は、Ｉ３３２Ｖ、Ｅ３４３Ｑ、Ｉ３５２Ｔ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、Ｅ４１６Ｄ、Ｅ４５５Ｑ、およびＩ４６１Ｖからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異であってもよい。このような改変アルカリホスファターゼのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基の変異の個数は、１個であってもよく、また、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、または８個であってもよい。
　好ましい実施形態では、上記変異は、Ｉ３３２、Ｅ３４３、Ｇ４０２、Ｔ４１３、Ｅ４１６、およびＥ４５５からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異であってもよい。好ましくは、上記変異は、Ｉ３３２Ｖ、Ｅ３４３Ｑ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、Ｅ４１６Ｄ、およびＥ４５５Ｑからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異であってもよい。変異されるアミノ酸残基の個数は、１個であってもよく、また、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、または６個であってもよい。
　より好ましい実施形態では、上記変異は、Ｉ３３２、Ｅ３４３、Ｇ４０２、Ｔ４１３、およびＥ４１６からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異であってもよい。好ましくは、上記変異は、Ｉ３３２Ｖ、Ｅ３４３Ｑ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、およびＥ４１６Ｄからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異であってもよい。変異されるアミノ酸残基の個数は、１個であってもよく、また、２個以上、３個以上、４個以上、または５個であってもよい。
　さらにより好ましい実施形態では、上記変異は、Ｉ３３２、Ｇ４０２、Ｔ４１３、およびＥ４１６からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異であってもよい。好ましくは、上記変異は、Ｉ３３２Ｖ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、およびＥ４１６Ｄからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異であってもよい。変異されるアミノ酸残基の個数は、１個であってもよく、また、２個以上、３個以上、または４個であってもよい。
　好ましい実施形態では、上記変異は、Ｅ３４３、Ｉ３５２、Ｇ４０２、およびＥ４５５からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異であってもよい。好ましくは、上記変異は、Ｉ３３２Ｖ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、およびＥ４１６Ｄからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異であってもよい。変異されるアミノ酸残基の個数は、１個であってもよく、また、２個以上、３個以上、または４個であってもよい。
　特定の実施形態では、ウシ小腸由来アルカリホスファターゼは、以下（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）のタンパク質であってもよい：
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有するタンパク質；または
（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、および付加、ならびにそれらの組合せからなる群より選ばれる１～４７個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有するタンパク質。
　上記アミノ酸配列についての同一性は、９０％以上である。好ましくは、同一性は、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。このような同一性％の算出は、上述したものと同様にして行うことができる。
　上記アミノ酸残基の変異は、アミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および付加、ならびにそれらの組合せからなる群より選ばれる。変異の個数は、改変アルカリホスファターゼの特性（例、活性、熱安定性）を損なわない程度の個数であり、１～４７個である。変異の個数は、好ましくは１～４５個、より好ましくは１～４０個、さらにより好ましくは１～３０個、特に好ましくは１～２０個、１～１５個、１～１０個、または１～５個（例、１個、２個、３個、４個、または５個）である。
　本発明の改変アルカリホスファターゼは、所望の同一性％および特性が維持される範囲内において１以上のアミノ酸残基の変異を有していてもよい。変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかである。例えば、当業者は、１）同種の特性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列を比較し〔例えば、配列番号１のアミノ酸配列（ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ）と他のウシ小腸由来アルカリホスファターゼ（例、ウシ小腸由来アルカリホスファターゼＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、および／またはＶＩＩ）をコードするアミノ酸配列との比較、あるいは配列番号１、３、５、７、および９のアミノ酸配列の比較〕、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、本発明の改変アルカリホスファターゼのアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。このような位置における変異後のアミノ酸残基は、変異前のアミノ酸残基と異なる所望の天然α－アミノ酸残基である。このような所望の天然α－アミノ酸残基は、上述したものと同様である。アミノ酸残基の変異は、上述したような保存的置換であってもよい。また、脱リン酸化活性、および熱安定性についても、上述したものと同様である。
　本発明の改変アルカリホスファターゼは、改変アルカリホスファターゼをコードする部分に加えて、他の機能性ペプチドをコードする部分をさらに含む融合タンパク質であってもよい。例えば、本発明の改変アルカリホスファターゼは、形質転換細胞からの細胞外への分泌を促進するため、Ｎ末端にシグナル配列を有していてもよい。このようなシグナル配列としては、例えば、ＭｇｌＢシグナル配列、ＰｅｌＢシグナル配列、ＯｍｐＡシグナル配列、ＰｈｏＡシグナル配列、ＯｍｐＦシグナル配列、ＰｈｏＥシグナル配列、ＭａｌＥシグナル配列、ＯｍｐＣシグナル配列、Ｌｐｐシグナル配列およびＬａｍＢシグナル配列が挙げられる。本発明の改変アルカリホスファターゼはまた、Ｃ末端もしくはＮ末端、またはその双方（好ましくはＣ末端）に、他のペプチド成分（例、タグ部分）を有していてもよい。本発明の改変アルカリホスファターゼに付加され得る他のペプチド成分としては、例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ　ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等の目的タンパク質の精製に汎用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ－ｔａｇ）、シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分が挙げられる。
　特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、他の機能性ペプチドをコードする部分として、親和性ペプチドまたは抗原性ペプチドをコードする部分を含む融合タンパク質であってもよい。このような親和性ペプチドの標的分子としては、オリゴペプチドもしくはポリペプチド（すなわち、タンパク質）、オリゴ糖もしくは多糖、核酸または（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または人工核酸）、脂質、低分子化合物（例、アミノ酸、単糖、ヌクレオチド、ヌクレオシド、血液等の体液中に存在するその他の生体成分、医薬）が挙げられる。親和性ペプチドとしては、例えば、後述するような抗体またはその断片（例、単鎖抗体）、抗体ミメティックが挙げられる。抗原性ペプチドとしては、例えば、ウイルス抗原性ペプチド、アレルゲン性ペプチド、腫瘍特異抗原ペプチド、腫瘍関連抗原ペプチド、細菌抗原性ペプチド、真菌抗原性ペプチド、寄生虫抗原性ペプチドが挙げられる。
　本発明はまた、以下を含む、改変アルカリホスファターゼの製造方法を提供する：
　ウシ小腸由来アルカリホスファターゼに対して、Ｉ３３２、Ｅ３４３、Ｉ３５２、Ｇ４０２、Ｔ４１３、Ｅ４１６、Ｅ４５５、およびＩ４６１からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を導入して、
　ウシ小腸由来アルカリホスファターゼをコードするアミノ酸配列において、Ｉ３３２、Ｅ３４３、Ｉ３５２、Ｇ４０２、Ｔ４１３、Ｅ４１６、Ｅ４５５、およびＩ４６１からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有する改変アルカリホスファターゼを生成すること。
　ウシ小腸由来アルカリホスファターゼは、天然型アルカリホスファターゼであってもよく、また、変異型アルカリホスファターゼであってもよい。本発明で利用されるウシ小腸由来アルカリホスファターゼは、上記のような１個以上の部位において目的の変異を有しないアルカリホスファターゼである。好ましくは、本発明で利用されるウシ小腸由来アルカリホスファターゼは、上記のような２個以上（例、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個）の部位において目的の変異を有しないアルカリホスファターゼであってもよい。
　これらの部位に導入されるアミノ酸残基の変異は、変異前のアミノ酸残基と異なる所望の天然α－アミノ酸残基の変異である。このような所望の天然α－アミノ酸残基は、上述したものと同様である。好ましくは、導入される変異は、Ｉ３３２Ｖ、Ｅ３４３Ｑ、Ｉ３５２Ｔ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、Ｅ４１６Ｄ、Ｅ４５５Ｑ、およびＩ４６１Ｖからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異であってもよい。導入される変異の個数は、１個であってもよく、また、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、または８個であってもよい。変異の導入は、所望の部位に変異を導入できる任意の方法（例、部位特異的変異誘発法）により行うことができる。
　好ましい実施形態では、導入される変異は、Ｉ３３２、Ｅ３４３、Ｇ４０２、Ｔ４１３、Ｅ４１６、およびＥ４５５からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異であってもよい。好ましくは、導入される変異は、Ｉ３３２Ｖ、Ｅ３４３Ｑ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、Ｅ４１６Ｄ、およびＥ４５５Ｑからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異であってもよい。導入される変異の個数は、１個であってもよく、また、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、または６個であってもよい。
　より好ましい実施形態では、導入される変異は、Ｉ３３２、Ｅ３４３、Ｇ４０２、Ｔ４１３、およびＥ４１６からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異であってもよい。好ましくは、導入される変異は、Ｉ３３２Ｖ、Ｅ３４３Ｑ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、およびＥ４１６Ｄからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異であってもよい。導入される変異の個数は、１個であってもよく、また、２個以上、３個以上、４個以上、または５個であってもよい。
　さらにより好ましい実施形態では、導入される変異は、Ｉ３３２、Ｇ４０２、Ｔ４１３、およびＥ４１６からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異であってもよい。好ましくは、導入される変異は、Ｉ３３２Ｖ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、およびＥ４１６Ｄからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異であってもよい。導入される変異の個数は、１個であってもよく、また、２個以上、３個以上、または４個であってもよい。
　好ましい実施形態では、導入される変異は、Ｅ３４３、Ｉ３５２、Ｇ４０２、およびＥ４５５からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異であってもよい。好ましくは、導入される変異は、Ｉ３３２Ｖ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、およびＥ４１６Ｄからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異であってもよい。導入される変異の個数は、１個であってもよく、また、２個以上、３個以上、または４個であってもよい。
　特定の実施形態では、ウシ小腸由来アルカリホスファターゼは、以下（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）のタンパク質であってもよい：
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有するタンパク質；または
（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、および付加、ならびにそれらの組合せからなる群より選ばれる１～４７個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有するタンパク質。
　配列番号１のアミノ酸配列に対する同一性％の程度、および配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の変異の個数は、上述したものと同様である。
　本発明では、上述したような改変アルカリホスファターゼの製造方法により得られる改変アルカリホスファターゼもまた提供される。
（２）改変アルカリホスファターゼで標識された物質
　本発明はまた、改変アルカリホスファターゼで標識された物質を提供する。
　改変アルカリホスファターゼで標識されるべき物質は、任意の標的分子に対する親和性物質、または抗原である。このような親和性物質の標的分子としては、オリゴペプチドもしくはポリペプチド（すなわち、タンパク質）、オリゴ糖もしくは多糖、核酸または（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または人工核酸）、脂質、低分子化合物（例、アミノ酸、単糖、ヌクレオチド、ヌクレオシド、血液等の体液中に存在するその他の生体成分、医薬）が挙げられる。親和性物質としては、例えば、抗体、アプタマー、レクチン、核酸の相補鎖、抗体ミメティックが挙げられる。アルカリホスファターゼで標識された親和性物質としては、種々のものが報告されている（例、Ｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｈｔｔｐ：／／ｃｓｈｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｓｈｌｐ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２０２０／７／ｐｄｂ．ｔｏｐ０９９２４２．ｆｕｌｌ、Ｓｕｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｏｐｅｎ　ｓａｎｄｗｉｃｈ　ＥＬＩＳＡ　ｗｉｔｈ　ＶＨ－／ＶＬ－ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ，　ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ００２２－１７５９（９９）０００２０－４を参照）。抗原としては、例えば、ウイルス抗原、アレルゲン、糖鎖抗原、腫瘍特異抗原、腫瘍関連抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原が挙げられる。アルカリホスファターゼで標識された抗原としては、種々のものが報告されている（例、特許第２５２５１９５号公報を参照）。
　特定の実施形態では、親和性物質は、抗体であってもよい。抗体は、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体であってもよい。抗体のアイソタイプとしては、例えば、ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＹが挙げられる。抗体は、全長抗体、または抗体断片（例、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、単鎖抗体）であってもよい。改変アルカリホスファターゼで標識された抗体としては、種々のものが報告されている（例、Ｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｈｔｔｐ：／／ｃｓｈｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｓｈｌｐ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２０２０／７／ｐｄｂ．ｔｏｐ０９９２４２．ｆｕｌｌ、およびＳｕｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｏｐｅｎ　ｓａｎｄｗｉｃｈ　ＥＬＩＳＡ　ｗｉｔｈ　ＶＨ－／ＶＬ－ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ，　ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ００２２－１７５９（９９）０００２０－４）を参照）。
　本発明の改変アルカリホスファターゼによる物質の標識は、アルカリホスファターゼによる物質の標識と同様にして行うことができる。アルカリホスファターゼによる物質の標識は慣用されているため、当業者は、本発明の改変アルカリホスファターゼにより物質を適宜標識することができる。アルカリホスファターゼによる物質の標識としては、例えば、化学標識および酵素標識が挙げられる。アルカリホスファターゼによる物質の化学標識としては、例えば、グルタルアルデヒドを架橋剤として使用する方法（例、Ｗｉｎｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　ｔｏ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｈｔｔｐｓ：／／ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｄｏｉ／ｆｕｌｌ／１０．１００２／０４７１１４２７２７．ｍｂ１１０１ｓ５０）、マレイミドを架橋剤として使用する方法（例、Ｗａｔａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ　（ＥＬＩＳＡ）　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｂｙ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｈｉｏ－ＮＡＤ　ｃｙｃｌｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ（Ｎａｇｏｙａ－ｓｈｉ），２０１４，１０，４９－５４；特許第５２６５８１６号公報）を利用することができる。アルカリホスファターゼによる物質の酵素標識としては、例えば、ソルターゼＡを結合酵素として使用する方法（例、Ｓａｋａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｕｓｉｎｇ　ａ　ＺＺ　Ｄｏｍａｉｎ　ａｓ　ａ　Ｌｉｎｋｅｒ，ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｓ．ａｃｓ．ｏｒｇ／ｄｏｉ／１０．１０２１／ｂｃ１００２０６ｚ）、リポ酸リガーゼを結合酵素として使用する方法（例、Ｃｏｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｌｉｐｏｉｃ　ａｃｉｄ　ｌｉｇａｓｅ　ａｎｄ　ｂｉｓ－ａｒｙｌ　ｈｙｄｒａｚｏｎｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，　ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ４７５８１２５／）が挙げられる。
　本発明の改変アルカリホスファターゼで標識された物質は、測定対象物質の検出または定量に有用である。臨床検査では、物質として親和性物質を用いる標的分子を検出または定量する免疫学的方法が汎用されている。例えば、親和性物質が抗体であり、かつ当該抗体の標的分子（抗原）が測定対象物質である場合、本発明の改変アルカリホスファターゼで標識された抗体は、測定対象物質に結合できる検出抗体（例、測定対象物質に対する固相抗体および当該測定対象物質に対する標識抗体を含む少なくとも２種の抗体を用いるサンドイッチアッセイにおける標識抗体、および非サンドイッチアッセイにおける標識抗体）として使用することができる。一方、親和性物質が抗体であり、かつ当該抗体の標的分子が測定対象物質に対する別の抗体である場合、本発明の改変アルカリホスファターゼで標識された抗体は、測定対象物質に対する別の抗体に結合できる二次抗体として使用することができる。物質が抗体の場合も同様に標的分子を検出または定量する免疫学的方法が汎用されている。
２．改変アルカリホスファターゼの製造に関連し得る発明
　本発明の改変アルカリホスファターゼは、本発明の改変アルカリホスファターゼをコードするポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む形質転換細胞を用いて、または無細胞系等を用いて、調製することができる。本発明はまた、このようなポリヌクレオチドおよび形質転換細胞、ならびに形質転換体の作製に利用できる発現ベクターを提供する。
　本発明のポリヌクレオチドは、本発明の改変アルカリホスファターゼをコードするポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡが好ましい。
　本発明の形質転換細胞は、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いる方法（例、コンピテント細胞法、エレクトロポレーション法）、またはゲノム改変技術により作製することができる。発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じる組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれることができる。一方、発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じない非組込み型ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれず、宿主細胞内において、発現ベクターの状態のまま、ゲノムＤＮＡから独立して存在できる。あるいは、ゲノム編集技術（例、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ　Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ））によれば、発現単位を宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込むこと、および宿主細胞が固有に備える発現単位を改変することが可能である。
　本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、宿主細胞で機能するターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する耐性遺伝子が挙げられる。
　発現ベクターはまた、宿主細胞のゲノムＤＮＡとの相同組換えのために、宿主細胞のゲノムとの相同組換えを可能にする領域をさらに含んでいてもよい。例えば、発現ベクターは、それに含まれる発現単位が一対の相同領域（例、宿主細胞のゲノム中の特定配列に対して相同なホモロジーアーム、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ）間に位置するように設計されてもよい。発現単位が導入されるべき宿主細胞のゲノム領域（相同領域の標的）としては、特に限定されないが、宿主細胞において発現量が多い遺伝子のローカスであってもよい。
　発現ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、または人工染色体であってもよい。発現ベクターはまた、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても非組込み型ベクターであってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクター、またはＲＮＡベクター（例、レトロウイルス）であってもよい。発現ベクターはまた、汎用されている発現ベクターであってもよい。このような発現ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体が挙げられる。
　本発明の改変アルカリホスファターゼを発現させるための宿主としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌〔例、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）〕、およびバチルス属細菌〔例、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）〕をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス属細菌〔例、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、ピヒア属細菌〔例、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ　ｓｔｉｐｉｔｉｓ）〕、アスペルギルス属細菌〔例、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）〕をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。あるいは、宿主としては、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞（例、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞）を用いることができる。宿主としては、所定の遺伝子を欠損する株を用いてもよい。形質転換細胞としては、例えば、細胞質中に発現ベクターを保有する形質転換細胞、およびゲノム上に目的遺伝子が導入された形質転換細胞が挙げられる。
　本発明の形質転換細胞は、所定の培養装置（例、試験管、フラスコ、ジャーファーメンター）を用いて、例えば後述の組成を有する培地において培養することができる。培養条件は適宜設定することができる。具体的には、培養温度は１０℃～３７℃であってもよく、ｐＨは６．５～７．５であってもよく、培養時間は１ｈ～１００ｈであってもよい。また、溶存酸素濃度を管理しつつ培養を行っても良い。この場合、培養液中の溶存酸素濃度（ＤＯ値）を制御の指標として用いることがある。大気中の酸素濃度を２１％とした場合の相対的な溶存酸素濃度ＤＯ値が、例えば１～１０％を、好ましくは３％～８％を下回らない様に、通気・攪拌条件を制御することが出来る。また、培養はバッチ培養であっても、フェドバッチ培養であっても良い。フェドバッチ培養の場合は糖源となる溶液やリン酸を含む溶液を培養液に連続的あるいは不連続的に逐次添加して、培養を継続することもできる。
　形質転換される宿主は、上述したとおりであるが、大腸菌について詳述すると、大腸菌Ｋ１２株亜種のエシェリヒア　コリ　ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株などから選択することが出来る。形質転換を行う方法、および形質転換細胞を選別する方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ｐｒｅｓｓ（２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いて所定の酵素を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。
　本発明のポリヌクレオチドを発現させるプロモーターとしては、通常Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種タンパク質生産に用いられるプロモーターを使用することができ、例えば、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ５プロモーター等の強力なプロモーターが挙げられ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、ｌａｃが好ましい。また、ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体等を用いてもよい。他のベクターとしては、ファージＤＮＡのベクターを利用してもよい。さらに、プロモーターを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用してもよい。好ましくは、ベクターは、ｐＵＣ、ｐＳＴＶ、ｐＭＷであってもよい。
　また、本発明のポリヌクレオチドの下流に転写終結配列であるターミネーターを連結してもよい。このようなターミネーターとしては、例えば、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーターが挙げられる。
　本発明のポリヌクレオチドを大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入および／または付加などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。
　また、形質転換細胞を選別するために、ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている〔例、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３－２（クローンテック製）〕。
　得られた本発明の発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養することにより、本発明の改変アルカリホスファターゼを得ることができる。
　培地としては、Ｍ９－カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。培地は、所定の炭素源、窒素源、補酵素（例、塩酸ピリドキシン）を含有していてもよい。具体的には、ペプトン、酵母エキス、ＮａＣｌ、グルコース、ＭｇＳＯ４、硫酸アンモニウム、リン酸２水素カリウム、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、などを用いても良い。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモーター、宿主菌等の種類に応じて適宜選択される。
　本発明の改変アルカリホスファターゼを回収するには、以下の方法などがある。本発明の改変アルカリホスファターゼは、本発明の形質転換細胞を回収した後、菌体を破砕（例、ソニケーション、ホモジナイゼーション）あるいは溶解（例、リゾチーム処理）することにより、破砕物および溶解物として得ることができる。アルカリホスファターゼが細胞外へ分泌・漏出した場合は、培養液から遠心分離や膜ろ過により、アルカリホスファターゼを含む除菌液を取得することができる。このような破砕物、溶解物および除菌液を、抽出、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、本発明の改変アルカリホスファターゼを得ることができる。
３．改変アルカリホスファターゼ、または改変アルカリホスファターゼで標識された物質を用いる方法
（１）アルカリホスファターゼ活性の測定
　本発明は、本発明の改変アルカリホスファターゼまたは改変アルカリホスファターゼで標識された物質、および基質を用いて、アルカリホスファターゼ活性を測定することを含む、アルカリホスファターゼ活性の測定方法を提供する。
　基質としては、アルカリホスファターゼ活性の測定に利用できる任意の基質を用いることができる。このような基質としては、例えば、リン酸化物質〔例、ｐ－ニトロフェノールリン酸、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルリン酸、２－クロロ－５－（４－メトキシスピロ［１，２－ジオキセタン－３，２′－（５－クロロトリシクロ［３．３．１．１３．７］デカン］）－４－イル］－１－フェニルリン酸、リン酸ナフトールＡＳ－ＴＲ、フェノールフタレインリン酸、インドキシルリン酸、ナフトールＡＳ－ＢＩリン酸、ナフトールＡＳ－Ｅリン酸、ナフトールＡＳ－ＭＸ　リン酸、ビス（ｐ－ニトロフェニル）リン酸、フェノールフタレインビスリン酸、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルリン酸、１－ナフチルリン酸、２－ナフチルリン酸、４－メチルウンベリフェリルリン酸、１，２－ジオキセタンもくしはアクリダンを基本骨格に含んでなる発光基質（例、ＣＤＰ－ｓｔａｒ、ＡＰＳ－５、Ｌｕｍｉ－Ｐｈｏｓ５３０、ＡＭＰＰＤ、Ｌｕｍｉｇｅｎ　ＰＰＤ）、核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、人工核酸）〕が挙げられる。基質は、例えば０．１～１００ｍＭ、好ましくは１～３０ｍＭの濃度で使用することができる。例えば、アルカリホスファターゼ活性の測定条件として、アルカリ条件下（例、ｐＨ８～１１）、適温（例、４～４０℃）で脱リン酸化物質の指標値（例、吸光度）を測定する条件を採用することができる。アルカリホスファターゼ活性の測定は、例えば、親和性物質の標的分子を測定するアッセイ（例、親和性物質として抗体を用いる免疫学的アッセイ）、レポーターアッセイなどの生物学的アッセイに有用である。
　特定の実施形態では、アルカリホスファターゼ活性の測定方法は、本発明の改変アルカリホスファターゼで標識された物質を用いて標的分子を検出または定量する方法であってもよい。改変アルカリホスファターゼにより標識された物質およびその標的分子は、上述したものと同様である。例えば、本発明の改変アルカリホスファターゼにより標識された物質は、上述したように、測定対象物質に結合できる検出抗体、または測定対象物質に対する別の抗体に結合できる二次抗体として使用することができる。したがって、アルカリホスファターゼ活性の測定により、測定対象物質を検出または定量することができる。
（２）リン酸化物質の脱リン酸化
　本発明は、本発明の改変アルカリホスファターゼまたは改変アルカリホスファターゼに標識された物質を用いて、リン酸化物質を脱リン酸化して脱リン酸化物質を生成することを含む、脱リン酸化物質の製造方法を提供する。
　リン酸化物質の脱リン酸化では、上述したようなアルカリホスファターゼ活性の測定条件下で上述のリン酸化物質を改変アルカリホスファターゼまたは改変アルカリホスファターゼに標識された物質と反応させることにより、リン酸化物質から脱リン酸化物質を生成することができる。
　特定の実施形態では、リン酸化物質の脱リン酸化は、核酸の５’または３’末端リン酸の脱リン酸化であってもよい。核酸は、一本鎖核酸であっても二本鎖核酸（突出末端もしくは平滑末端）であってもよい。このような方法によれば、所望されない核酸の連結（例、ベクターのセルフライゲーション）を防止することができる。
　以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１：アルカリホスファターゼの設計及び発現プラスミドの作製
　本検討に用いたプラスミド（発現ベクター）を、それぞれ以下に示す方法で作製した。
　ｂＩＡＰＩＩ（ＡＡＮ１９３９１）を鋳型とし、Ｂｌａｓｔｐから類似配列を５０００個取得した。なおＢｌａｓｔｐの解析条件として、Ｍａｘ　ｔａｒｇｅｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓを５０００，Ｅｘｐｅｃｔｅｄ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄの値を１．０Ｅ－６に設定した。取得した類似配列を解析し、鋳型配列と類似した配列等を除去し、１１６１配列まで選抜した。これを配列ライブラリーとした。その後文献１（Ｎａｋａｎｏ，　Ｓ．，　Ｍｏｔｏｙａｍａ，　Ｔ．，　Ｍｉｙａｓｈｉｔａ，　Ｙ．，　Ｉｓｈｉｚｕｋａ，　Ｙ．，　Ｍａｔｓｕｏ，　Ｎ．，　Ｔｏｋｉｗａ，　Ｈ．，　Ｓｈｉｎｏｄａ，　Ｓ．，　Ａｓａｎｏ，　Ｙ．，　ａｎｄ　Ｉｔｏ，　Ｓ．　（２０１８）　Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｖｅ　ａｎｄ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ＮＡＤ＋－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｂｙ　ａ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ　Ｄｅｓｉｇｎ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｗｉｔｈ　ｏｒ　ｗｉｔｈｏｕｔ　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｄａｔａ，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　５７，　３７２２－３７３２．）　及び２　（Ｎａｋａｎｏ，　Ｓ．，　Ｎｉｗａ，　Ｍ．，　Ａｓａｎｏ，　Ｙ．，　ａｎｄ　Ｉｔｏ，　Ｓ．　（２０１９）　Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　Ｔｒａｃｋ　ｏｆ　ａ　Ｈｉｇｈｌｙ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｌ－Ａｒｇｉｎｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ　ｂｙ　Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ａｎｃｅｓｔｒａｌ　ａｎｄ　Ｎａｔｉｖｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ，　Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　８５，　ｅ００４５９－００４１９．）で用いた手法を適用することで、ｂＩＡＰＩＩ（ＡＡＮ１９３９１）のモチーフ様配列（Ｉ５４、Ｄ８６、Ａ９３、Ｓ１１３、Ｔ１６３、Ｐ３０３、Ａ３２４、Ｌ３５１）を同定した。配列ライブラリーにおいて、これらモチーフ様配列を有する配列のみを選抜、さらにＣｌｕｓｔａｌＷで解析し、相同性の低い配列やギャップを含む配列を除去し、最終的に１０配列を得た。１０配列を用いて人工設計を行い、Ｍｕｔ１、Ｍｕｔ２、Ｍｕｔ３、およびＭｕｔ４と名づけた配列番号３、５、７、９のアミノ酸配列で示される人工アルカリホスファターゼ配列を設計した（図２～５）。
（Ａ）ｂＩＡＰＩＩ発現プラスミド
　ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ（ｂＩＡＰＩＩ）からＮ末端の分泌シグナル配列およびＣ末端のＧＰＩアンカー領域を除いたアミノ酸配列（配列番号１）をＥ．ｃｏｌｉのコドンに最適化して塩基配列に変換し、本塩基配列（配列番号２）を含むプラスミドをユーロフィンジェノミクス社で合成した。本プラスミドを鋳型として、ｂＩＡＰＩＩをコードする領域を配列番号１１および配列番号１２のプライマーを用いたＰＣＲにより増幅し、得られた断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（タカラバイオ）により、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＥＴ－２８ａ（＋）ベクターにクローニングした。
（Ｂ）ＭｇｌＢシグナル配列を付加したｂＩＡＰＩＩ発現プラスミド
　配列番号１３および配列番号１４のプライマーを用いて、（Ａ）で作製したプラスミドを鋳型として、ＰＣＲによりｂＩＡＰＩＩをコードする領域を増幅し、インサート断片を調製した。また、配列番号１５および配列番号１６のプライマーを用いてｐＥＴ－２８ａ（＋）ベクターを鋳型として、ＰＣＲによりベクター断片を調製した。配列番号１６にはＭｇｌＢシグナル配列（配列番号１７）に相当する塩基配列を含んでいる。調製したインサートおよびベクター断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔにより連結した。得られたプラスミドにより、Ｎ末端側にＭｇｌＢシグナル配列、Ｃ末端側にＨｉｓタグが付加されたｂＩＡＰＩＩが発現する。
（Ｃ）ＭｇｌＢシグナル配列を付加した人工設計ＡＬＰ発現プラスミド
　Ｍｕｔ１（配列番号３）をコードする塩基配列（配列番号４）をｐＥＴ－２８ａ（＋）ベクターのＮｃｏＩ／ＸｈｏＩサイトに挿入したプラスミドをユーロフィンジェノミクス社で合成した。本プラスミドを鋳型として配列番号１８および配列番号１６のプライマーを用いて、ＰＣＲにより直鎖ＤＮＡを増幅し、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔにより環状化した。本プラスミドでは、Ｎ末端側にＭｇｌＢシグナル配列、Ｃ末端側にＨｉｓタグが付加されたＭｕｔ１が発現する。
　同様に、配列番号１８のプライマーの代わりに配列番号１９～２１のプライマーを用いて、Ｍｕｔ２（配列番号５）、Ｍｕｔ３（配列番号７）およびＭｕｔ４（配列番号９）を発現するプラスミドを構築した。それぞれをコードする塩基配列は、配列番号６、配列番号８および配列番号１０である。
　天然アルカリホスファターゼであるｂＩＡＰＩＩ（配列番号１）、ならびに人工設計アルカリホスファターゼであるＭｕｔ１（配列番号３）、Ｍｕｔ２（配列番号５）、Ｍｕｔ３（配列番号７）、およびＭｕｔ４（配列番号９）のアミノ酸配列同一性の関係は、以下のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　次に、天然アルカリホスファターゼであるｂＩＡＰＩＩ（配列番号１）では認められず、人工設計アルカリホスファターゼであるＭｕｔ１（配列番号３）、Ｍｕｔ２（配列番号５）、Ｍｕｔ３（配列番号７）、Ｍｕｔ４（配列番号９）間で保存されているアミノ酸残基の共通変異をアミノ酸配列のアライメントにより解析した。その結果、このような共通変異は、Ｇ１０５Ａ、Ｒ１０８Ｋ、Ｉ１３３Ｍ、Ａ１４２Ｓ、Ａ１５９Ｔ、Ｌ１７４Ｍ、Ｎ１８１Ｅ、Ａ１８８Ｔ、Ｖ１９１Ｉ、Ｍ２０５Ｋ、Ｖ２２３Ｑ、Ｑ２３１Ｒ、Ａ２５７Ｓ、Ｓ２６０Ｐ、Ｎ２７７Ｅ、Ｑ２８０Ｒ、Ｔ２８７Ｓ、Ｑ２９７Ｒ、Ｉ３３２Ｖ、Ｎ３４２Ｓ、Ｅ３４３Ｑ、Ｉ３５２Ｔ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、Ｅ４１６Ｄ、Ｅ４５５Ｑ、Ｉ４６１Ｖ、およびＧ４６６Ａであった（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
実施例２：無細胞抽出液の調製
　実施例１の（Ｂ）および（Ｃ）で構築したプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、各種ＡＬＰ発現株を得た。各発現株をカナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地で３７℃、一晩生育させた。得られた菌体をカナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム５ｍＭおよび塩化亜鉛１０μＭを含む４×ＴＢ培地１００ｍＬに植菌し、坂口フラスコを用いて３７℃で振とう培養を行った。ＯＤ６６０が０．６～０．７となった時に終濃度で０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加して発現を誘導し、２５℃で１８時間培養した。
　培養終了後、得られた培養液１ｍＬから菌体を遠心分離により集めた。次に１００μＬのｘＴｒａｃｔｏｒ　ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）に懸濁し、終濃度１ｍＭとなるように硫酸マグネシウムを、１００μＭとなるように塩化亜鉛を添加し、室温で２０分間インキュベートすることで溶菌した。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を無細胞抽出液とした。
実施例３：無細胞抽出液の活性測定
　無細胞抽出液のＡＬＰ活性をｐ－ニトロフェノールリン酸からｐ－ニトロフェノールへの変換活性で測定した。まず、希釈用緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１ｍＭ硫酸マグネシウム、０．０５ｍＭ塩化亜鉛、０．１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．０）で無細胞抽出液の希釈系列を調製した。反応液として、Ａ液（ジエタノールアミン１０００ｍＭ、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ９．８）およびＢ液（ｐ－ニトロフェノールリン酸６７０ｍＭ）を調製しておき、測定前にＡ：Ｂ＝４８：１の比率で混合した。反応液を３７℃で１０分以上保温したのち、９６穴プレートに１９６μＬずつ分注した。無細胞抽出液の希釈系列を４μＬずつ反応液に添加し、混合後、３７℃でマイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ　１９０（モレキュラーデバイス）で４０５ｎｍの吸光度を測定し、１分あたりの変化を算出した（ΔＡｔｅｓｔ）。酵素ブランクとして、無細胞抽出液の代わりにＡ液を添加して同様に算出した（ΔＡｂｌａｎｋ）。
　１分間に１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを生成する酵素量を１Ｕと定義し、以下の式で無細胞抽出液の活性を測定した。
　無細胞抽出液の活性（Ｕ／Ｌ）＝（ΔＡｔｅｓｔ－ΔＡｂｌａｎｋ）×１０００×２００／（１８．７５×０．５×４）
　１８．７５：ｐ－ニトロフェノールのモル吸光係数（ｍＭ－１・ｃｍ－１）
　０．５：光路長（ｃｍ）
　各測定は３回ずつ実施した。得られた無細胞抽出液のＡＬＰ活性を表３に示す。人工設計ＡＬＰ発現株の無細胞抽出液は、ｂＩＡＰＩＩ発現株の場合に比べて、高いＡＬＰ活性を示した（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
実施例４：熱安定性の評価
　実施例３で測定した測定値に基づき、実施例２で調製した各無細胞抽出液の活性が３００Ｕ／Ｌとなるように実施例３の希釈用緩衝液で希釈した。次に酵素希釈液を２０μＬずつマイクロチューブに分注し、ＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（タカラバイオ）を用いて７０℃で１０分間加熱処理し、氷上に移して冷却した。熱処理していない酵素希釈液、および熱処理後の酵素希釈液のそれぞれを実施例３と同様に３回ずつＡＬＰ活性を測定した。
　以下の式で残存活性を算出した。
残存活性（％）＝熱処理後の酵素希釈液のＡＬＰ活性／未処理の酵素希釈液のＡＬＰ活性×１００
　その結果、人工設計ＡＬＰはｂＩＡＰＩＩと比較して、高い熱安定性を示した（表４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
〔比較例１〕無細胞抽出液の調製および熱安定性の評価
　比較のためにＭｕｔ１、Ｍｕｔ２、Ｍｕｔ３およびＭｕｔ４に含まれる公知の変異（３８５Ｇ）を導入したｂＩＡＰＩＩ（特許第６７３２３６８号の図５～７に記載される、３８５Ｇの有無が相違する「３２２Ｄ／３２３Ｎ／４３０Ａ」と「３２２Ｄ／３２３Ｎ／３８５Ｇ／４３０Ａ」の比較を参照）、および公知の３重変異（３２２Ｄ／３８５Ｎ／４３０Ａ）を導入したｂＩＡＰＩＩ（特許第６７３２３６８号の図５～７における「３２２Ｄ／３８５Ｎ／４３０Ａ」を参照）の熱安定性を評価した。
（Ａ）ＭｇｌＢシグナル配列を付加した３８５Ｇ変異体発現プラスミドの構築
　３８５Ｇ変異体は、実施例１の（Ａ）で作成したｂＩＡＰＩＩ発現プラスミドにＰＣＲにより塩基配列を置換して導入した。まず、ｂＩＡＰＩＩ発現プラスミドを鋳型として、置換する塩基配列を含むプライマーセット（配列番号２２および配列番号２３）を用いて、ＰＣＲにより直鎖ＤＮＡを増幅し、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔにより環状化した。このプラスミドを鋳型として、配列番号１３および配列番号１４のプライマーを用いて、ＰＣＲによりｂＩＡＰＩＩをコードする領域を増幅し、インサート断片を調製した。また、配列番号１５および配列番号１６のプライマーを用いてｐＥＴ－２８ａ（＋）ベクターを鋳型として、ＰＣＲによりベクター断片を調製した。調製したインサートおよびベクター断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔにより連結した。得られたプラスミドにより、Ｎ末端側にＭｇｌＢシグナル配列、Ｃ末端側にＨｉｓタグが付加されたｂＩＡＰＩＩの３８５Ｇ変異体が発現する。
（Ｂ）ＭｇｌＢシグナル配列を付加した３２２Ｄ／３８５Ｎ／４３０Ａ　変異体発現プラスミドの構築
　ｂＩＡＰＩＩの３２２Ｄ／３８５Ｎ／４３０Ａ変異体をコードする塩基配列を（配列番号２４）をｐＥＴ－２８ａ（＋）ベクターのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩサイトに挿入したプラスミドをユーロフィンジェノミクス社で合成した。本プラスミドを鋳型として、配列番号２５および配列番号２６のプライマーを用いてＰＣＲによりｂＩＡＰＩＩをコードする領域を増幅し、インサート断片を調製した。また、配列番号２７および配列番号１６のプライマーを用いてｐＥＴ－２８ａ（＋）ベクターを鋳型として、ＰＣＲによりベクター断片を調製した。調製したインサートおよびベクター断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔにより連結した。得られたプラスミドにより、Ｎ末端側にＭｇｌＢシグナル配列、Ｃ末端側にＨｉｓタグが付加されたｂＩＡＰＩＩの３２２Ｄ／３８５Ｎ／４３０Ａ変異体が発現する。
　構築したプラスミドを用いて実施例２の方法で、無細胞抽出液を調製し、実施例３の方法でＡＬＰ活性を測定した。無細胞抽出液の活性はいずれも人工設計ＡＬＰと比較して低かった。
　次に実施例４の方法で、７０℃で１０分加熱後に残存するＡＬＰ活性を測定した。その結果、いずれの酵素も活性が失われていた（表５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
実施例５：発現量の比較
（Ａ）野生型および人工設計ＡＬＰ発現菌の構築
　実施例１の（Ａ）および（Ｃ）で遺伝子合成により作成したプラスミドを鋳型として、各ＡＬＰをコードする領域をＰＣＲにより増幅した。また、ｐＥＴ－２１ｂ（＋）ベクターを鋳型として、直鎖状のベクターをＰＣＲにより増幅した。用いたプライマーの配列の組み合わせを表６に示す。得られた両断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結して環状化し、ｐＥＴ－２１ｂ（＋）ベクターのＮｄｅＩおよびＸｈｏＩサイトに各ＡＬＰが挿入された発現プラスミドを得た。本プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ　Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）株、およびＥ．ｃｏｌｉ　Ｏｒｉｇａｍｉ　Ｂ（ＤＥ３）に形質転換した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
（Ｂ）無細胞抽出液の調製および活性評価
　（Ａ）で構築した株をアンピシリン１００ｍｇ／Ｌを添加したＬＢ液体培地で３７℃にて一晩生育させた。得られた菌体をアンピシリン１００ｍｇ／Ｌを添加した３ｍＬの本培養培地（組成：２０ｇ／Ｌ　Ｂａｃｔｏ　ｔｒｙｐｔｏｎｅ、１５ｇ／Ｌ　酵母エキス、１ｇ／Ｌ　塩化ナトリウム、５０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．１５）、５ｍＭ　硫酸マグネシウムおよび１０μＭ　塩化亜鉛)に３０μＬ植菌し、試験管を用いて３７℃で振とう培養を行った。ＯＤ６６０が０．５～０．７となった時に終濃度で１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加して発現を誘導し、１８℃で培養した。
　培養２４時間後、培養液１ｍＬを回収し菌体を遠心分離により集めた。終濃度１ｍＭとなるように硫酸マグネシウムを、１００μＭとなるように塩化亜鉛を添加した１００μＬのｘＴｒａｃｔｏｒ　ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）に懸濁し、室温で２０分間インキュベートすることで溶菌した。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を無細胞抽出液とした。
　人工設計ＡＬＰにおける宿主の差異および硫酸塩の添加の効果を総合的に評価するため、無細胞抽出液に終濃度が１Ｍとなるように硫安（すなわち、硫酸アンモニウム）溶液を添加し、４℃で１時間保管した。硫安添加後の酵素液を適宜希釈して、実施例３に従ってＡＬＰ活性を測定し、培養液１Ｌあたりの活性値に換算した。
　その結果、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）およびＯｒｉｇａｍｉ　Ｂ（ＤＥ３）のいずれを宿主とした場合にも人工設計ＡＬＰはｂＩＡＰＩＩより高い活性を示した（表７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
実施例６：精製酵素の比活性と熱安定性評価
（Ａ）野生型および人工設計ＡＬＰ発現菌の構築
　実施例１の（Ｃ）で遺伝子合成により作成したプラスミドは、ＡＬＰのＣ末端にＨｉｓタグが付加して発現する設計となっていた。Ｈｉｓタグが付加しないＡＬＰを発現するプラスミドを構築するため、ＡＬＰ配列とＨｉｓタグの間に終止コドンを挿入した。まず、実施例１の（Ｃ）で遺伝子合成により作成したプラスミドを鋳型として、表８に示されるプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。得られた直鎖状の２本鎖ＤＮＡをＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（タカラバイオ）により環状化し、ｐＥＴ－２８ａ（＋）ベクターのＮｃｏＩ／ＸｈｏＩサイトに各ＡＬＰが挿入された発現プラスミドを得た。本プラスミドおよび実施例１の（Ａ）で構築したｂＩＡＰＩＩ発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ　Ｏｒｉｇａｍｉ　２（ＤＥ３）に形質転換した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
（Ｂ）無細胞抽出液の調製
　（Ａ）で構築した株をカナマイシン５０ｍｇ／Ｌを添加したＬＢ寒天培地で３７℃にて一晩生育させた。得られた菌体をカナマイシン５０ｍｇ／Ｌを添加した１００ｍＬの本培養培地（組成：２０ｇ／Ｌ　Ｂａｃｔｏ　ｔｒｙｐｔｏｎｅ、１５ｇ／Ｌ　酵母エキス、１ｇ／Ｌ　塩化ナトリウム、５０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．１５）、５ｍＭ　硫酸マグネシウムおよび１０μＭ　塩化亜鉛）に植菌し、坂口フラスコを用いて３７℃で振とう培養を行った。ＯＤ６６０が０．５～０．７となった時に終濃度で１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加して発現を誘導し、１８℃で培養した。２４時間後、培養液より菌体を遠心分離により集め、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２および　０．１ｍＭ　ＺｎＣｌ２を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波破砕を行った。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を無細胞抽出液とした。
（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィーによる分画
　１ｍＭ　ＭｇＣｌ２および０．１ｍＭ　ＺｎＣｌ２を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて平衡化したＨｉＴｒａｐ　Ｑ　ＨＰ，５ｍＬカラム（Ｃｙｔｉｖａ）に、無細胞抽出液をアプライした。カラムを同緩衝液で洗浄した後、０～０．７ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配により、吸着タンパク質を分画した。得られた画分のＡＬＰ活性を実施例２に従い測定し、活性画分を回収した。
（Ｄ）硫安添加による処理
　回収した画分に終濃度１Ｍとなるように硫安溶液を添加し、４℃で保管した。１８時間後、遠心分離を行った。ｂＩＡＰＩＩ、Ｍｕｔ１、およびＭｕｔ２では上清を回収し、（Ｄ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーにより分画した。Ｍｕｔ３およびＭｕｔ４では上清を除去し、沈殿を１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＭｇＳＯ４、０．０５ｍＭ　ＺｎＣｌ２を含む１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍＬに溶解し、（Ｆ）のゲルろ過クロマトグラフィーにより分画した。
（Ｅ）疎水性相互作用クロマトグラフィーによる分画（ｂＩＡＰＩＩ、Ｍｕｔ１、およびＭｕｔ２のみ）
　回収した試料を、１．０Ｍ　硫安、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２および０．１ｍＭ　ＺｎＣｌ２を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて平衡化したＨｉＴｒａｐ　ｂｕｔｙｌ，５ｍｌカラム（Ｃｙｔｉｖａ）にアプライした。カラムを同緩衝液で洗浄した後、１．０～０　Ｍの硫酸アンモニウム直線濃度勾配により、吸着タンパク質を溶出した。得られた画分のＡＬＰ活性を実施例２に従い測定し、活性画分を回収した。
（Ｆ）硫安沈殿による濃縮（ｂＩＡＰＩＩ、Ｍｕｔ１、およびＭｕｔ２のみ）
　回収した試料に等量の４Ｍ硫安溶液を添加し、４℃で一晩保管した。遠心分離したのち、沈殿を１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＭｇＳＯ４、０．０５ｍＭ　ＺｎＣｌ２を含む１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍＬに溶解した。
（Ｇ）ゲルろ過クロマトグラフィーによる分画
　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＭｇＳＯ４、０．０５ｍＭ　ＺｎＣｌ２を含む１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００　Ｉｎｃｒｅａｓｅ　１０／３００　ＧＬカラム（Ｃｙｔｉｖａ）にアプライし、同緩衝液により溶出した。
（Ｈ）限外濾過による濃縮
　Ａｍｉｃｏｎ　１０ｋＤａ，０．５ｍＬによりＡＬＰを含む画分を限外濾過により濃縮した。
（Ｉ）比活性の測定
　ＡＬＰの活性をＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈ　ａｔａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＢｉｏＡｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ｐ－ニトロフェノールリン酸からｐ－ニトロフェノールへの変換活性で測定した。まず、希釈用緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ硫酸マグネシウム、０．０５ｍＭ塩化亜鉛、０．１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．０）で各ＡＬＰ溶液の希釈系列を調製した。ＡＬＰ活性をキットの説明書に従ってアッセイ溶液を９６穴プレートに分注し、酵素の希釈液を添加して混合し、３７℃でマイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ　１９０（モレキュラーデバイス）で４０５ｎｍの吸光度を測定し、１分あたりの変化を算出した（ΔＡｔｅｓｔ）。酵素ブランクとして、酵素溶液の代わりに希釈用緩衝液を添加して同様に算出した（ΔＡｂｌａｎｋ）。各測定は２回ずつ実施した。１分間に１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを生成する酵素量を１Ｕと定義し、以下の式でＡＬＰ活性を算出した。
　ＡＬＰ活性（Ｕ／Ｌ）＝（ΔＡｔｅｓｔ－ΔＡｂｌａｎｋ）×１０００×２００／（１８．７５×０．５×２０）
　１８．７５：ｐ－ニトロフェノールのモル吸光係数（ｍＭ－１・ｃｍ－１）
　０．５：光路長（ｃｍ）
　また、それぞれの酵素液を適宜希釈し、２８０ｎｍの吸光度を超微量分光計ナノドロップ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で測定した。１ｍｇ／ｍＬのときのＡＬＰの吸光度を１として、各ＡＬＰ溶液の濃度を算出した。
　ＡＬＰ活性およびＡＬＰ濃度からそれぞれのＡＬＰの比活性を算出した（表９）。
（Ｊ）熱安定性の評価
　精製した各ＡＬＰを希釈用緩衝液で希釈後、マイクロチューブに分注した。サーマルサイクラーＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（タカラバイオ）で５５℃から８５℃の各温度で１０分加熱したのちに氷冷した。これらの試料のＡＬＰ活性を実施例３に従って３回ずつ測定し、５５℃で加熱時の活性値を１００％として、それぞれの温度で加熱後の残活性を算出した（図６）。さらに残活性が５０％となる温度（Ｔ５０）を算出した（表９）。
　その結果、人工設計ＡＬＰはｂＩＡＰＩＩと比べて、Ｔ５０として１３℃以上の向上が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
実施例７：単変異体の評価
　４つの人工設計ＡＬＰで共通の変異点２８か所（表２）について、単独でｂＩＡＰＩＩに導入し、それぞれの影響を評価した。まず、ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ（ｂＩＡＰＩＩ）からＮ末端の分泌シグナル配列およびＣ末端のＧＰＩアンカー領域を除いたアミノ酸配列（配列番号１）をＥ．ｃｏｌｉのコドンに最適化して塩基配列に変換した。本塩基配列（配列番号２）に開始コドンＡＴＧおよび終止コドンＴＡＡを付加した配列をｐＥＴ２８ｂ（＋）のＮｃｏＩ／ＸｈｏＩサイトに挿入したプラスミドを、ジェンスクリプト社で合成した。本プラスミドをもとにジェンスクリプト社で各アミノ酸置換を導入したプラスミド２８種を調製した。本プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ　Ｏｒｉｇａｍｉ　２（ＤＥ３）に形質転換した。
　ｂＩＡＰＩＩおよび２８種の単変異を導入したＡＬＰの発現株、および実施例６の（Ｂ）で作成したＭｕｔ２の発現株を、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを添加したＬＢ液体培地で３７℃にて一晩生育させた。得られた菌体をカナマイシン５０ｍｇ／Ｌを添加した３ｍＬの本培養培地（組成：２０ｇ／Ｌ　Ｂａｃｔｏ　ｔｒｙｐｔｏｎｅ、１５ｇ／Ｌ　酵母エキス、１ｇ／Ｌ　塩化ナトリウム、５０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．１５）、５ｍＭ　硫酸マグネシウムおよび１０μＭ　塩化亜鉛）に３０μＬ植菌し、試験管を用いて３７℃で振とう培養を行った。ＯＤ６６０が０．５～０．７となった時に終濃度で１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加して発現を誘導し、１８℃で培養した。
　培養２４時間後、培養液１ｍＬを回収し菌体を遠心分離により集めた。終濃度１ｍＭとなるように硫酸マグネシウムを、１００μＭとなるように塩化亜鉛を添加した１００μＬのｘＴｒａｃｔｏｒ　ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）に懸濁し、室温で２０分間インキュベートすることで溶菌した。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を無細胞抽出液とした。これらの試料のＡＬＰ活性を実施例３に従って３回ずつ測定し、培養液あたりの発現量を算出した（表１０）。
　次に、これらの無細胞抽出液に終濃度１Ｍとなるように硫安を添加後、適宜希釈して、実施例４の方法で、６０℃で１０分加熱後に残存するＡＬＰ活性を測定した。
　その結果、Ｉ３３２Ｖ、Ｅ３４３Ｑ、Ｉ３５２Ｔ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、Ｅ４１６Ｄ、Ｅ４５５Ｑ、およびＩ４６１Ｖ変異は単独での導入で残存活性が特に向上していた（表１０）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
実施例８：無細胞抽出液を用いた発現量および熱安定性の比較
　実施例６の（Ｂ）で作成したｂＩＡＰＩＩ、Ｍｕｔ１、Ｍｕｔ２、Ｍｕｔ３、およびＭｕｔ４の発現株を用いて、実施例７の方法に従い、培養液あたりの発現量及び６０℃で１０分加熱後に残存するＡＬＰ活性を測定した。
　その結果、人工設計ＡＬＰはいずれもｂＩＡＰＩＩに比べて高い発現量と熱安定性を示した（表１１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020

Claims (19)

  1. 　以下（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）のタンパク質である、改変アルカリホスファターゼ：
    （Ａ）配列番号３、５、７、もしくは９のアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （Ｂ）配列番号３、５、７、もしくは９のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有するタンパク質；または
    （Ｃ）配列番号３、５、７、もしくは９のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、および付加、ならびにそれらの組合せからなる群より選ばれる１～２３個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有するタンパク質。
  2. 　（Ｂ）または（Ｃ）のアミノ酸配列が、Ｉ３３２Ｖ、Ｅ３４３Ｑ、Ｉ３５２Ｔ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、Ｅ４１６Ｄ、Ｅ４５５Ｑ、およびＩ４６１Ｖからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を維持する、請求項１記載の改変アルカリホスファターゼ。
  3. 　（Ｂ）または（Ｃ）のアミノ酸配列が、Ｉ３３２Ｖ、Ｅ３４３Ｑ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、Ｅ４１６Ｄ、およびＥ４５５Ｑからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を維持する、請求項２記載の改変アルカリホスファターゼ。
  4. 　（Ｂ）または（Ｃ）のアミノ酸配列が、Ｅ３４３Ｑ、Ｉ３５２Ｔ、Ｇ４０２Ｓ、およびＥ４５５Ｑからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を維持する、請求項１記載の改変アルカリホスファターゼ。
  5. 　ウシ小腸由来アルカリホスファターゼをコードするアミノ酸配列において、Ｉ３３２、Ｅ３４３、Ｉ３５２、Ｇ４０２、Ｔ４１３、Ｅ４１６、Ｅ４５５、およびＩ４６１からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有する改変アルカリホスファターゼ。
  6. 　前記１個以上のアミノ酸残基の変異が、Ｉ３３２Ｖ、Ｅ３４３Ｑ、Ｉ３５２Ｔ、Ｇ４０２Ｓ、Ｔ４１３Ｅ、Ｅ４１６Ｄ、Ｅ４５５Ｑ、およびＩ４６１Ｖからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異である、請求項５記載の改変アルカリホスファターゼ。
  7. 　前記１個以上のアミノ酸残基の変異が、Ｅ３４３、Ｉ３５２、Ｇ４０２、およびＥ４５５からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異である、請求項５記載の改変アルカリホスファターゼ。
  8. 　ウシ小腸由来アルカリホスファターゼが以下（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）のタンパク質である、請求項５～７のいずれか一項記載の改変アルカリホスファターゼ：
    （Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有するタンパク質；または
    （Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、および付加、ならびにそれらの組合せからなる群より選ばれる１～４７個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有するタンパク質。
  9. 　改変アルカリホスファターゼが、改変アルカリホスファターゼをコードする部分に加えて、他の機能性ペプチドをコードする部分をさらに含むタンパク質である、請求項１～８のいずれか一項記載の改変アルカリホスファターゼ。
  10. 　以下を含む、改変アルカリホスファターゼの製造方法：
    　ウシ小腸由来アルカリホスファターゼに対して、Ｉ３３２、Ｅ３４３、Ｉ３５２、Ｇ４０２、Ｔ４１３、Ｅ４１６、Ｅ４５５、およびＩ４６１からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を導入して、
    　ウシ小腸由来アルカリホスファターゼをコードするアミノ酸配列において、Ｉ３３２、Ｅ３４３、Ｉ３５２、Ｇ４０２、Ｔ４１３、Ｅ４１６、Ｅ４５５、およびＩ４６１からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸化活性を有する改変アルカリホスファターゼを生成すること。
  11. 　請求項１～９のいずれか一項記載の改変アルカリホスファターゼ、または請求項１０記載の方法により製造された改変アルカリホスファターゼで標識された物質。
  12. 　物質が親和性物質または抗原である、請求項１１記載の物質。
  13. 　親和性物質が抗体である、請求項１２記載の物質。
  14. 　請求項１～９のいずれか一項記載の改変アルカリホスファターゼ、請求項１０記載の方法により製造された改変アルカリホスファターゼ、または請求項１１～１３のいずれか一項記載の物質、および基質を用いて、アルカリホスファターゼ活性を測定することを含む、アルカリホスファターゼ活性の測定方法。
  15. 　アルカリホスファターゼ活性の測定方法が、請求項１～９のいずれか一項記載の改変アルカリホスファターゼ、請求項１０記載の方法により製造された改変アルカリホスファターゼ、または請求項１１～１３のいずれか一項記載の物質、および基質を用いる、測定対象物質を検出または定量する方法である、請求項１４記載の方法。
  16. 　請求項１～９のいずれか一項記載の改変アルカリホスファターゼ、請求項１０記載の方法により製造された改変アルカリホスファターゼ、または請求項１１～１３のいずれか一項記載の物質を用いて、リン酸化物質を脱リン酸化して脱リン酸化物質を生成することを含む、脱リン酸化物質の製造方法。
  17. 　請求項１～９のいずれか一項記載の改変アルカリホスファターゼ、または請求項１０記載の方法により製造された改変アルカリホスファターゼをコードするポリヌクレオチド。
  18. 　請求項１７記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  19. 　請求項１～９のいずれか一項記載の改変アルカリホスファターゼ、または請求項１０記載の方法により製造された改変アルカリホスファターゼをコードするポリヌクレオチドの発現単位を含む形質転換細胞。
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