WO2022169336A2 - 류코노스톡 시트래움 균주를 유효성분으로 포함하는 섬유화증의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

류코노스톡 시트래움 균주를 유효성분으로 포함하는 섬유화증의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention provides for preventing, improving or treating fibrosis, specifically pulmonary fibrosis, renal fibrosis, or liver fibrosis comprising a Leuconostoc citreum strain or a culture thereof as an active ingredient It relates to a composition for
  • Fibrosis refers to a high degree of deposition of fibrous connective tissues, which is due to an imbalance between proliferation and degradation of fibrous tissues.
  • a common feature of these diseases is the overgrowth of fibroblasts, and tissue and organ fibrosis is often caused by pulmonary fibrosis, liver fibrosis, chronic pancreatitis, scleroderma, renal glomerular fibrosis, and multiple organs resulting from radiochemotherapy and tissue transplantation. Fibrosis is involved, and a complete treatment is difficult because the fibrosis process is chronic.
  • Pulmonary fibrosis is a disease in which fibrosis occurs due to scarring due to inflammation of the lung tissue, which impairs the normal oxygen exchange function of the lungs. It starts with alveolitis in which the alveoli are inflamed, then the alveoli are destroyed, scars form, fibrosis, and then lose their function, resulting in respiratory distress. In addition, when pulmonary fibrosis occurs, a large load is placed on the right ventricle of the heart, which sends blood to the lungs, causing pulmonary arterial hypertension, which eventually develops into right-sided heart failure.
  • Renal fibrosis is a disease in which fibrosis occurs with scars accumulated due to inflammation in the kidney tissue. This leads to chronic renal failure, which is accompanied by anemia, blood clotting disorders, hypertension, various complications and infections of the cardiopulmonary and gastrointestinal tract.
  • anemia blood clotting disorders
  • hypertension various complications and infections of the cardiopulmonary and gastrointestinal tract.
  • uremia which is caused by not actively excreting urine, reduces the lifespan of red blood cells, causing strong anemia.
  • the incidence of systemic infection increases with the onset of uremia, which is a major factor in the development of sepsis.
  • Hepatic fibrosis can be defined as excessive deposition of extracellular matrix due to chronic intrahepatic inflammation. will progress to cirrhosis.
  • Representative cells involved in liver fibrosis include hepatic stellate cells, Kupffer cells, and endothelial cells.
  • Hepatic stellate cells are activated as the main producer of extracellular matrix and are involved in the increase in the production of various extracellular matrix including collagen.
  • Kupffer cells exist in the sinusoidal space in the liver, and the substances produced by activated Kupffer cells affect the surrounding hepatocytes, endothelial cells, and hepatic stellate cells, thereby promoting liver fibrosis.
  • endothelial cells are also involved in the production of growth factors and extracellular matrix involved in the proliferation of hepatic stellate cells due to inflammation or hepatic fibrosis.
  • the present inventors have studied to find a substance for preventing and treating fibrosis using lactic acid bacteria that has little toxicity and side effects, and as a result, Leukonostok citraum strain or a culture thereof is pulmonary fibrosis, renal fibrosis or liver fibrosis.
  • the present invention has been completed by confirming that there is a preventive or therapeutic effect on chemotherapy.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition or food additive composition for preventing or improving fibrosis comprising a Leukonostok citraum strain as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a feed composition or feed additive composition for preventing or improving fibrosis of livestock comprising a Leukonostok citraum strain as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating fibrosis comprising a Leukonostok citraum strain or a culture thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a food composition or food additive composition for preventing or improving fibrosis comprising a Leukonostok citraum strain or a culture thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a feed composition or feed additive composition for preventing or improving fibrosis of livestock comprising a Leukonostok citraum strain or a culture thereof as an active ingredient.
  • the Leukonostok citraum strain or culture thereof according to the present invention exhibits excellent preventive and therapeutic effects on various fibrosis, it is useful as a composition for use such as treatment, prevention or improvement of fibrosis in humans or animals. can be used
  • FIG. 1 is a diagram showing a graph measuring the expression level of a related gene ⁇ -SMA after treatment of the composition according to the present invention to LX-2 cells induced fibrosis.
  • FIG. 2 is a diagram showing a graph measuring the expression level of Fibronectin, a related gene, after treatment of the composition according to the present invention to fibrosis-induced LX-2 cells.
  • FIG. 3 is a view showing the result of observing the amount of ⁇ -SMA protein through Western blot after treating the leukonostok citraum WiKim0104 strain in LX-2 cells induced to fibrosis.
  • FIG. 4 is a diagram showing a graph measuring ⁇ -SMA after treating the leukonostok Citraum WiKim0104 strain in an animal model induced to fibrosis of the liver.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating the degree of infiltration and fibrosis of the alveolar tissue after treatment with the Leukonostok Citraum WiKim0104 strain in an animal model induced to fibrosis of the lungs.
  • composition comprising the Leukonostok citraum strain of the present invention or a culture thereof as an active ingredient has a preventive or therapeutic effect on fibrosis, and can be used as a pharmaceutical composition.
  • Leukonostok citraum strain of the present invention is a lactic acid bacteria strain.
  • the leuconostok citraum strain is a probiotic, and has a general intestinal effect and immune enhancing effect of lactic acid bacteria. It is a well-known fact that the lactic acid bacteria of the genus Leukonostok have an effect of enhancing the intestinal effect and immunity.
  • the leucono stock citraum strain may be a leukono stock citraum WiKim0104 strain, and has a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 1).
  • the Leukonostok citraum strain can be used by inoculating 0.1 to 10% in MRS liquid medium and culturing at 25 to 37° C. for 4 to 48 hours.
  • the culture method is preferably a stationary culture method, but is not limited thereto.
  • 'probiotics' is understood to mean 'living microorganisms that have a beneficial effect on the health of the host by improving the intestinal microbial environment of the host in the gastrointestinal tract of animals including humans'.
  • Probiotics are living microorganisms with probiotic activity, and when fed to humans or animals in the form of single or complex strains, in the form of dried cells or fermentation products, it can have a beneficial effect on the intestinal flora of the host.
  • the fibrosis may be pulmonary fibrosis, renal fibrosis, or liver fibrosis, but is not limited thereto.
  • the Leukonostok citraum strain included in the composition according to the present invention may exist as a live cell or a dead cell, and may also exist in a dried or lyophilized form.
  • the culture of the Leukonostok citraum strain may be an active ingredient, and the culture may include a live cell culture medium or a dead cell supernatant.
  • Forms of lactic acid bacteria suitable for inclusion in various compositions and methods of formulation are well known to those skilled in the art.
  • composition may be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration and rectal administration, etc. may be administered, preferably by intravenous injection. may be administered, but is not limited thereto.
  • a suitable dosage of the composition may be variously prescribed according to factors such as formulation method, administration method, age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and response sensitivity of the patient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared using a pharmaceutically suitable and physiologically acceptable adjuvant in addition to the active ingredient, and the adjuvant includes an excipient, bog Release, sweetener, binder, coating agent, swelling agent, lubricant, lubricant or flavoring agent and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition may be preferably formulated as a pharmaceutical composition by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the active ingredients described above for administration.
  • the active ingredient may be combined with an orally, non-toxic, pharmaceutically acceptable inert carrier such as ethanol, glycerol, water, and the like.
  • suitable binders, lubricants, disintegrants and color-developers may also be included in the mixture.
  • suitable binders include, but are not limited to, starch, gelatin, natural sugars such as glucose or beta-lactose, corn sweeteners, natural and synthetic gums such as acacia, tracacanth or sodium oleate, sodium stearate, magnesium stearate, sodium benzoate. ate, sodium acetate, sodium chloride, and the like.
  • Disintegrants include, but are not limited to, starch, methylcellulose, agar, bentonite, xanthan gum, and the like.
  • acceptable pharmaceutical carriers which are sterile and biocompatible, include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and One or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostats may be added as needed.
  • diluents such as an aqueous solution, suspension, emulsion, etc., pills, capsules, granules or tablets.
  • composition comprising the Leukonostok citraum strain of the present invention or a culture thereof as an active ingredient may be used as a food composition or a food additive composition for preventing or improving fibrosis.
  • the food composition may be in the form of a health functional food.
  • Health functional food means food manufactured and processed using raw materials or ingredients useful for the human body in accordance with the Health Functional Food Act (Article 3, No. 1), and “functionality” means It refers to obtaining useful effects for health purposes such as regulating nutrients or physiological effects on the structure and function of the human body (Article 2).
  • the food composition may additionally contain food additives, and the suitability as a "food additive" is determined according to the general rules and general test methods of the Food Additives Code approved by the Ministry of Food and Drug Safety, unless otherwise specified. and criteria.
  • Food Additives Codex for example, chemical synthetic products such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid, natural additives such as depigmentation, licorice extract, crystalline cellulose, and guar gum, L- Mixed preparations such as sodium glutamate preparation, noodle-added alkali preparation, preservative preparation, and tar color preparation can be mentioned.
  • chemical synthetic products such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid
  • natural additives such as depigmentation, licorice extract, crystalline cellulose, and guar gum
  • L- Mixed preparations such as sodium glutamate preparation, noodle-added alkali preparation, preservative preparation, and tar color preparation can be mentioned.
  • Foods containing the active ingredient of the present invention include bread, rice cakes, dried fruits, candies, chocolates, chewing gum, confectionery products such as jams, ice cream products, ice cream products, ice cream products such as ice cream powder milk, low-fat milk, lactose-decomposed milk, Processed milk, goat milk, fermented milk, buttermilk, concentrated milk, milk cream, butter oil, natural cheese, processed cheese, milk powder, milk products such as whey Processed meat products, processed eggs, meat products such as hamburgers Fish cakes, ham, Fish and meat products such as sausages and processed fish meat products such as bacon Ramen noodles, dried noodles, raw noodles, fried noodles, luxurious dried noodles, improved soft noodles, frozen noodles, pasta, etc.
  • the composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, It may include a carbonation agent used in carbonated beverages, and the like.
  • the composition of the present invention may include fruit for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage, and vegetable beverage. These components may be used independently or in combination.
  • the beverage composition including the active ingredient of the present invention is not particularly limited in other ingredients, and may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients like a conventional beverage.
  • natural carbohydrates include monosaccharides (eg, glucose, fructose, etc.); disaccharides, (eg maltose, sucrose, etc.); and conventional sugars such as polysaccharides (eg, dextrin, cyclodextrin, etc.), and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents taumatine, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used. .
  • composition comprising the Leukonostok citraum strain of the present invention or a culture thereof as an active ingredient may be used as a feed composition or feed additive composition for preventing or improving fibrosis of livestock.
  • the composition When the composition is prepared as a feed additive, the composition may be 20 to 90% highly concentrated or may be prepared in powder or granular form.
  • the feed additives include organic acids such as citric acid, humic acid, adipic acid, lactic acid, and malic acid, or phosphates such as sodium phosphate, potassium phosphate, acid pyrophosphate, polyphosphate (polyphosphate), polyphenol, catechin, alpha-tocopherol, rosemary Extract, vitamin C, green tea extract, licorice extract, chitosan, tannic acid, any one or more of natural antioxidants such as phytic acid may be further included.
  • the composition When prepared as a feed, the composition may be formulated in the form of a conventional feed, and may include common feed ingredients together.
  • the feed and feed additives include grains such as milled or crushed wheat, oats, barley, corn and rice; plant protein feeds, such as feeds based on rape, soybean, and sunflower; animal protein feeds such as blood meal, meat meal, bone meal and fish meal; Sugar and dairy products, for example, may further include dry ingredients made of various powdered milk and whey powder, and may further include nutritional supplements, digestion and absorption enhancers, growth promoters, and the like.
  • the feed additive may be administered to the animal alone or in combination with other feed additives in an edible carrier.
  • the feed additive can be easily administered to the animal as a top dressing, directly mixing them with animal feed, or in an oral formulation separate from the feed.
  • a pharmaceutically acceptable edible carrier as well known in the art to prepare an immediate release or sustained release formulation.
  • Such edible carriers may be solid or liquid, for example cornstarch, lactose, sucrose, soybean flakes, peanut oil, olive oil, sesame oil and propylene glycol.
  • the feed additive may be a tablet, capsule, powder, troche or sugar-containing tablet or top dressing in microdispersed form.
  • the feed additive may be in the form of a gelatin soft capsule, or a syrup or suspension, emulsion, or solution.
  • the feed and feed additives may contain adjuvants, for example, preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying agents, solution accelerators, and the like.
  • the feed additive may be used by being added to animal feed by immersion, spraying, or mixing.
  • the feed or feed additive of the present invention can be applied to a number of animal diets including mammals, poultry and fish.
  • Pigs, cattle, horses, sheep, rabbits, goats, rodents and experimental rodents as the mammals, as well as rats, hamsters, and guinea pigs can be used for pets (eg, dogs, cats), etc., and as the poultry, chicken, It can also be used for turkey, duck, geese, pheasant, and quail, and the like, and may be used for carp, crucian carp and trout as the fish, but is not limited thereto.
  • the Leukonostok Citraum WiKim0104 (Accession No. KCCM12420P) strain was tested with the permission of the Korea Food Research Institute, the depositor.
  • 1% of the received Leukonostok Citraum WiKim0104 strain was inoculated into 30 ml of MRS broth, and cultured at 30° C. for 18 hours. After incubation, the culture medium was stored separately by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes, and the cells were washed three times with a phosphate buffered saline (PBS) solution to remove the remaining medium components.
  • PBS phosphate buffered saline
  • TGF- ⁇ was treated at a concentration of 10ng/ml in serum free media, and then Leukonostok Citraum WiKim0104 strain Fibronectin and ⁇ -SMA, which are genes related to fibrosis, were confirmed by qRT-PCR in the case of treatment.
  • Transwell chamber (4 um pore size) leukonostok citraum WiKim0104 strain prepared in the upper chamber was treated with 1X10 7 or 1X10 8 CFU, and in the lower chamber, LX-2 cells were treated with TGF- ⁇ for 24 hours. cultured. After 24 hours, LX-2 cells were harvested and RNA was isolated, and then the expression level of fibrosis-related genes was confirmed by qRT-PCR, and the results are shown in FIGS. 1 and 2 .
  • FIGS. 1 and 2 the results are shown in FIGS. 1 and 2 .
  • FIGS. 1 and 2 the results are shown in FIGS. 1 and 2 .
  • the experimental animals used in the experiment were supplied with 8-week-old male C57BL6 mice and were bred for one week after a stabilization period in an animal breeding room in an SPF environment where the room temperature was 20 ⁇ 2°C and the humidity was maintained at 55 ⁇ 15%.
  • As the feed a normal pellet feed without antibiotics was supplied, and water was allowed to be consumed frequently, and the experiment was performed after adapting to the diet for 1 week.
  • Soft litter for experimental animals was used for the litter, and the breeding box and feeder were exchanged at a frequency of 2 times/week, and all breeding equipment used was washed with an automated washer, and then completely adapted to use. General symptoms were observed once a day for all animals, and the presence or absence of moribund and dead animals was checked twice a day.
  • CDAHFD Choline-deficient amino acid defined high fat diet
  • Bile duct ligation models are known to cause damage and fibrosis of the lungs and kidneys as well as liver fibrosis.
  • the mice prepared in 3-1 above were tied twice with a non-absorbable surgical thread to the bile duct. As a control group, the operation was performed in the same way without binding the bile duct. After surgery, mice were grouped according to the Z-arrangement method based on body weight, jaundice, and urine color change on the day of starting drug administration. After grouping, the Leukonostok Citraum WiKim0104 strain was orally administered to the experimental group once a day at 2X10 9 CFU/day, 0.2mL/head volume for 2 weeks. The control group was fed the same amount of PBS.
  • the lung tissue was extracted, washed with physiological saline, and formalin-fixed to prepare a paraffin block. Thereafter, the lung tissue was stained with Hematoxyline-eosin (H&E) and the results of observing the pathological findings of the lung tissue are shown in FIG. 5 .
  • H&E Hematoxyline-eosin
  • the composition comprising the Leukonostok Citraum WiKim0104 strain or a culture thereof according to the present invention as an active ingredient is excellent for preventing and treating fibrosis such as pulmonary fibrosis, renal fibrosis or liver fibrosis. It can be confirmed that it works.

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Abstract

본 발명은 류코노스톡 시트래움 (Leuconostoc citreum) 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 섬유화증(fibrosis), 구체적으로는 폐섬유화증, 신장섬유화증 또는 간섬유화증에 대한 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 여러 섬유화증에 대해 우수한 예방 및 치료 효과를 나타내므로, 사람 또는 동물의 섬유화증의 치료, 예방 또는 개선 등의 용도를 위한 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

류코노스톡 시트래움 균주를 유효성분으로 포함하는 섬유화증의 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명은 류코노스톡 시트래움 (Leuconostoc citreum) 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 섬유화증(fibrosis), 구체적으로는 폐섬유화증, 신장섬유화증 또는 간섬유화증에 대한 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
섬유화증(fibrosis)은 섬유성 결합조직들의 고도한 침적을 의미하며, 이는 섬유성 조직들의 증식과 분해 간의 불균형으로 인한 것이다. 이러한 질병들의 일반적인 특징은 섬유화세포의 과잉증식으로 조직 및 기관 섬유화증은 흔히 폐섬유화증, 간 섬유화증, 만성 췌장염, 피부경화증, 신 사구체 섬유화증 및 방사선화학 요법 및 조직 이식 등으로 인하여 발생한 다발성 장기 섬유화증이 포함되며, 섬유화 과정이 만성적으로 진행되기 때문에 완벽한 치료가 어려운 실정이다.
폐섬유화는 폐조직에 염증이 발생하여 흉터에 의한 섬유화가 발생하는 질병으로 폐의 정상적인 산소교환기능을 저해한다. 초기에 폐포에 염증이 생기는 폐포염으로 시작하여 폐포가 파괴되고 흉터가 생겨 섬유화한 후 기능을 상실하여 호흡곤란 증세가 발생한다. 또한, 폐섬유화증이 일어나면 폐로 혈액을 보내는 심장의 우심실에 큰 부하가 걸려 폐동맥고혈압을 유발하여 결국 우측심장성 심부전으로 발전하게 된다.
신장섬유화증은 신장조직에 발생한 염증으로 인해 축적된 흉터로 섬유화가 발생하는 질병으로 신장의 일부가 굳어 그 기능이 상실된다. 이는 만성 신부전증으로 이어지며, 만성 신부전은 빈혈, 혈액응고 장애, 고혈압, 심폐 및 위장관의 각종 합병증과 감염을 동반한다. 신장 기능이 정상인의 15% 이하가 되면 에라스로포이에틴(erythropoietin)의 신장 내 생산이 저하되며, 이는 적혈구 생성 감소로 이어진다. 또한 오줌의 분비가 활발히 일어나지 않아 발병되는 요독증은 적혈구의 수명을 감소시켜 강력한 빈혈을 야기시킨다. 또한, 요독증 발병으로 전신성 감염이 야기될 확률이 증가하며, 이는 폐혈증 발병의 주요 요인이 된다.
간섬유화증은 만성 간내 염증으로 인한 세포외 기질(extracellular matrix)의 과다한 침착으로 정의될 수 있으며 이러한 세포외 기질의 과다한 침착으로 만성간질환이 지속되는 경우 결국은 간내 구조의 변형과 간세포수의 감소로 간경변으로 진행되게 된다. 간섬유화에 관여하는 대표적인 세포로는 간성상세포(hepatic stellate cell), 쿠퍼세포(Kupffer cell), 내피세포(endothelial cell) 등이 있다. 간성상세포는 세포외 기질을 생산하는 주 생산원으로 활성화되며 교원질을 포함한 각종 세포외 기질의 생성 증가에 관여한다. 쿠퍼세포는 간내 동모양 혈관강(sinusoidal space)내에 존재하며 활성화된 쿠퍼세포에서 생성된 물질들은 주위 간세포, 내피세포, 그리고 간성상세포에 영향을 주게 되어 간섬유화를 촉진시킨다. 내피세포는 간내 혈류 조절에 중요한 역할을 하는 것 외에도, 염증이나 간섬유화 등에 의해 간성상세포의 증식에 관여하는 성장인자와 세포외기질의 생성에도 관여한다.
현재, 특정구조의 화합물, 이의 유도체 또는 염(한국공개특허 제10- 2019-0113639호) 내지는 적소두 추출물 또는 이의 분획물(한국공개특허 제10-2019-0003434호)을 유효성분으로 포함하는 조성물의 섬유화증의 예방 또는 치료효과를 개시하고 있으나 미생물 균주를 유효성분으로 포함하는 섬유화증 예방 또는 치료 효과에 대해서는 기재된 바 없다.
이러한 배경 하에서 본 발명자들은 독성 및 부작용이 거의 없는 유산균을 이용한 섬유화증 예방 및 치료용 물질을 찾기 위해 연구한 결과, 류코노스톡 시트래움 균주 또는 이의 배양물이 폐섬유화증, 신장섬유화증 또는 간섬유화증에 대한 예방 또는 치료 효능이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 류코노스톡 시트래움 균주를 유효성분으로 포함하는 섬유화증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 류코노스톡 시트래움 균주를 유효성분으로 포함하는 섬유화증의 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 식품 첨가제 조성물을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 류코노스톡 시트래움 균주를 유효성분으로 포함하는 가축의 섬유화증의 예방 또는 개선용 사료 조성물 또는 사료 첨가제 조성물을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 류코노스톡 시트래움 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 섬유화증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 류코노스톡 시트래움 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 섬유화증의 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 식품 첨가제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 류코노스톡 시트래움 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 가축의 섬유화증의 예방 또는 개선용 사료 조성물 또는 사료 첨가제 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 류코노스톡 시트래움 균주 또는 이의 배양물은 여러 섬유화증에 대해 우수한 예방 및 치료 효과를 나타내므로, 사람 또는 동물의 섬유화증의 치료, 예방 또는 개선 등의 용도를 위한 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 조성물을 섬유화가 유도된 LX-2 세포에 처리한 후 관련 유전자인 α-SMA의 발현량을 측정한 그래프를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 조성물을 섬유화가 유도된 LX-2 세포에 처리한 후 관련 유전자인 Fibronectin의 발현량을 측정한 그래프를 나타낸 도이다.
도 3은 류코노스톡 시트래움 WiKim0104 균주를 섬유화가 유도된 LX-2 세포에 처리한 후, α-SMA의 단백질량을 Western blot을 통하여 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 류코노스톡 시트래움 WiKim0104 균주를 간 섬유화가 유도된 동물모델에 처리한 후, α-SMA를 측정한 그래프를 나타낸 도이다.
도 5는 류코노스톡 시트래움 WiKim0104 균주를 폐 섬유화가 유도된 동물모델에 처리한 후, 폐포 조직의 침윤 및 섬유화 정도를 관찰한 도이다.
본 발명의 류코노스톡 시트래움 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 섬유화증의 예방 또는 치료 효과를 가지며, 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.
본 발명의 류코노스톡 시트래움 균주는 유산균 균주이다. 상기 류코노스톡 시트래움 균주는 프로바이오틱스로서, 유산균의 일반적인 정장 효과 및 면역 증강 효과를 갖는다. 류코노스톡 속의 유산균이 정장 효과 면역 증강 효과를 갖는 것은 잘 알려진 사실이다.
상기 류코노스톡 시트래움 균주는 류코노스톡 시트래움 WiKim0104 균주일 수 있으며, 서열번호 1의(SEQ ID NO: 1)의 핵산서열을 갖는다.
상기 류코노스톡 시트래움 균주는 MRS 액체배지에 0.1 내지 10% 접종하여 25 내지 37℃에서 4시간 내지 48시간 동안 배양하여 이용할 수 있다.
상기 배양의 방법은 정치배양 방법이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, '프로바이오틱스(probiotics)'는 사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물'이라는 의미로 이해된다. 프로바이오틱스는 프로바이오틱 활성을 갖는 살아있는 미생물로 단일 또는 복합균주 형태로 사람이나 동물에 건조된 세포 형태나 발효산물 형태로 급여될 경우, 숙주의 장내 균총에 유익한 영향을 미칠 수 있다.
상기 섬유화증은 폐섬유화증, 신장섬유화증 또는 간섬유화증일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 류코노스톡 시트래움 균주는 생균체 또는 사균체로서 존재할 수 있으며, 또한 건조 또는 동결건조된 형태로 존재할 수도 있다. 또한, 류코노스톡 시트래움 균주의 배양물이 유효성분일 수 있으며, 상기 배양물에는 생균 배양액 또는 사균 상등액이 포함될 수 있다. 다양한 조성물 내에 포함시키기 적합한 유산균의 형태 및 제제화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
상기 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐 내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 정맥 내 주입방법으로 투여할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여시간, 투여경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 활용될 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연당, 옥수수감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐아세테이트, 소듐클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
나아가 해당 분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 류코노스톡 시트래움 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 섬유화증의 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 식품 첨가제 조성물로 이용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 건강기능식품의 형태일 수 있다.
상기 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률에 따라 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미(제3조 제1호)하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것(동조 제2호)을 의미한다.
상기 식품 조성물은 식품 첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 들을 들 수 있다.
본 발명의 유효성분이 포함된 식품으로는 빵, 떡류, 건과류, 캔디류, 초콜릿류, 츄잉껌, 쨈류와 같은 과자류 아이스크림류, 빙과류, 아이스크림 분말류와 같은 아이스크림 제품류 우유류, 저지방 우유류, 유당분해 우유, 가공유류, 산양유, 발효유류, 버터유류, 농축유류, 유크림류, 버터유, 자연치즈, 가공치즈, 분유류, 유청류와 같은 유가공품류 식육가공품, 알가공품, 햄버거와 같은 식육제품류 어묵, 햄, 소시지, 베이컨 등의 어육가공품과 같은 어육제품류 라면류, 건면류, 생면류, 유탕면류, 호화건먼류, 개량숙면류, 냉동면류, 파스타류와 같은 면류 과실음료, 채소류음료, 탄산음료, 두유류, 요구르트 등의 유산균음료, 혼합음료와 같은 음료 간장, 된장, 고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 식초, 소스류, 토마토케첩, 카레, 드레싱과 같은 조미식품 마가린, 쇼트닝 및 피자를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 유효성분을 포함한 음료 조성물은 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, (예를 들어, 포도당, 과당 등); 디사카라이드, (예를 들어 말토스, 슈크로스 등); 및 폴리사카라이드, (예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등)과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 류코노스톡 시트래움 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 가축의 섬유화증 예방 또는 개선용 사료 조성물 또는 사료 첨가제 조성물로 이용될 수 있다.
상기 조성물이 사료 첨가제로서 제조될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립 형태로 제조될 수 있다. 상기 사료 첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산등의 유기산이나 인산 나트륨, 인산 칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 제조될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화될 수 있으며, 통상의 사료 성분을 함께 포함할 수 있다.
상기 사료 및 사료 첨가제는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
상기 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 탑드레싱으로서 또는 이들을 동물사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료 첨가제를 동물사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수전분, 락토오스, 수크로오스, 콩플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
또한, 상기 사료 및 사료 첨가제는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료 첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 발명의 사료 또는 사료 첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다.
상기 포유류로서 돼지, 소, 말, 양, 토끼, 염소, 설치동물 및 실험용 설치동물인 쥐, 햄스터, 기니피그 뿐만 아니라, 애완동물(예: 개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 잉어, 붕어 및 송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 균주의 배양
류코노스톡 시트래움 WiKim0104(기탁번호 KCCM12420P) 균주는 기탁자인 한국식품연구원의 허락을 받아 분양받아 실험을 실시하였다.
상기 분양받은 류코노스톡 시트래움 WiKim0104 균주를 MRS 액체배지 30ml에 1% 접종하여 30℃에서 18시간 동안 정치배양 하였다. 배양 후, 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 배양액은 따로 보관하였고, 균체는 PBS(phosphate buffered saline) 용액으로 3회 세척하여 남아 있는 배지 성분을 제거하였다.
실시예 2. 간 성상세포 (Hepatic stellate cell)에서의 관련 유전자 발현량 측정
간 성상세포(Hepatic stellate cell)인 LX-2 세포를 6 well plate에 plating 한 후 무혈청 배지(serum free media)에 TGF-β를 10ng/ml의 농도로 처리한 후 류코노스톡 시트래움 WiKim0104 균주를 처리한 경우에 섬유화 관련 유전자인 Fibronectin, α-SMA의 발현량을 qRT-PCR로 확인하였다.
트랜스웰 챔버(Transwell chamber; 4 um pore size) upper chamber에 준비한 류코노스톡 시트래움 WiKim0104 균주를 1X107 또는 1X108 CFU로 처리하고 lower chamber에는 LX-2 세포에 TGF-β를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 LX-2 세포를 수확(harvest)하여 RNA를 분리한 후 qRT-PCR로 섬유화 관련 유전자의 발현량 변화를 확인하였으며, 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다. 또한, LX-2 세포에서 α-SMA의 단백질 발현량을 확인하기 위하여 Western blot으로 확인한 결과, TGF-β에 의해 증가된 α-SMA의 단백량이 류코노스톡 시트래움 처리군에서 현저히 감소함을 확인하였다 (도 3).
도 1 내지 도 3에 나타난 바와 같이, 류코노스톡 시트래움 WiKim0104 균주를 처리한 경우에 α-SMA, fibronectin의 발현량이 유의미하게 감소함을 확인하였다.
실시예 3. 동물모델에서의 섬유화 억제효과 확인
3-1. 실험동물 마우스 조건
실험에 사용된 실험동물은 수컷 8주령의 C57BL6 마우스를 공급받아 실내 온도 20±2℃, 습도 55±15%가 유지되는 SPF 환경의 동물 사육실에서 1주일의 안정화 기간을 거쳐 실험기간 동안 사육하였다. 사료는 항생제가 첨가되지 않은 일반적인 팰렛 사료를 공급하였고, 물은 수시로 섭취할 수 있게 하였으며, 1주 동안 식이에 적응시킨 후 실험을 수행하였다. 깔짚은 실험동물 전용 연질 깔짚을 사용하였으며, 사육상자 및 급이기는 2회/1주 빈도로 교환하고 사용되는 모든 사육기재는 자동화 세정기로 세척한 후, 완전히 적응하여 사용하였다. 모든 동물에 대하여 1일 1회 일반증상을 관찰하고 1일 2회 빈사 및 사망 동물의 유무를 확인하였다.
3-2. 동물모델에서의 간 섬유화증에 대한 효과 확인
상기 실시예 3-1에서 준비된 동물에 CDAHFD (choline-deficient amino acid defined high fat diet)를 12주간 투여하여 비알콜성 지방간염을 동반한 간 섬유화를 유도한 후 8주간 2X109 cfu/200 ul의 류코노스톡 시트래움 WiKim0104 균주 조성물을 경구투여하였다. 이후 간 조직의 섬유화 정도를 측정하기 위하여 간 조직을 포르말린 고정 후에 파라핀 블록을 제조하여 anti-α-SMA로 면역염색을 실시하였다. 면역 염색된 α-SMA의 염색 정도를 정량화하여 측정한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, anti-α-SMA positive area가 류코노스톡 시트래움 균주 투여군에서 현저히 감소됨을 확인되었다.
3-3. 동물모델에서의 폐 섬유화에 대한 효과 확인
Bile duct ligation 모델은 간 섬유화 뿐만 아니라 폐 및 신장의 손상 및 섬유화를 일으키는 것으로 알려져 있다. 상기 3-1에서 준비된 마우스를 비흡수성 수술용 실로 담관을 두번 묶어주었다. 대조군으로는 담관을 묶지 않고 같은 방법으로 수술을 진행하였다. 수술 후 마우스를 약물 투여 개시 당일 체중 및 황달 및 뇨 색상 변화 등을 기준으로 Z 배열법에 따라 군분리를 실시하였다. 그룹화한 후 실험군에는 류코노스톡 시트래움 WiKim0104 균주를 2X109 CFU/일로 일일 1회, 2주간 0.2mL/head volume으로 경구투여하였다. 대조군은 같은 양의 PBS를 식이하였다. 이후, 폐 조직을 적출하여 생리식염수로 세척하고 포르말린 고정하여 파라핀 블록을 제조하였다. 이후 폐 조직을 Hematoxyline-eosin(H&E)로 염색하여 폐 조직의 병리소견을 관찰한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 유도군에서는 염증세포의 침윤 및 섬유화에 따라 폐포의 비정상적인 조직부위가 관찰되었으나 류코노스톡 시트래움 균주 투여그룹에서는 그 정도가 현저히 감소됨이 확인하였다.
상기 결과에 비추어 볼 때, 본 발명에 따른 류코노스톡 시트래움 WiKim0104 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 조성물은 폐섬유화증, 신장섬유화증 또는 간섬유화증 등 섬유화증에 대한 예방 및 치료에 우수한 효과가 있음을 확인할 수 있다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM12420P
수탁일자 : 20181214
Figure PCTKR2022001869-appb-img-000001

Claims (12)

  1. 류코노스톡 시트래움 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 섬유화증(fibrosis)의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 류코노스톡 시트래움 균주는 서열번호 1의 핵산서열을 갖는, 류코노스톡 시트래움 WiKim0104 (Leuconostoc citreum WiKim0104; 수탁번호 KCCM12420P) 균주인, 섬유화증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 섬유화증은 폐섬유화증, 신장섬유화증 또는 간섬유화증인, 섬유화증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여의 방법으로 투여 가능한 것을 특징으로 하는 섬유화증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 비경구 투여의 방법은 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐 내 투여 또는 직장 내 투여인 것인, 섬유화증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 류코노스톡 시트래움 (Leuconostoc citreum) 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 섬유화증(fibrosis)의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 식품은 건강기능식품인, 섬유화증의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 식품은 빵, 떡, 캔디, 초콜릿, 껌, 아이스크림, 우유, 치즈, 식육가공품, 어육가공품, 김치, 간장, 된장, 고추장, 춘장, 청국장, 식초, 케첩, 카레, 드레싱, 음료 및 발효유로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 식품인 것을 특징으로 하는 섬유화증의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  9. 류코노스톡 시트래움 (Leuconostoc citreum) 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 섬유화증의 예방 또는 개선용 식품 첨가제 조성물.
  10. 류코노스톡 시트래움 (Leuconostoc citreum) 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 가축의 섬유화증 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 가축은 돼지, 소, 말, 양, 토끼, 염소, 쥐, 햄스터, 기니피그, 개, 고양이, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 메추라기, 잉어, 붕어 및 송어로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 가축의 섬유화증 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  12. 류코노스톡 시트래움 (Leuconostoc citreum) 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 가축의 섬유화증 예방 또는 개선용 사료 첨가제 조성물.
PCT/KR2022/001869 2021-02-08 2022-02-07 류코노스톡 시트래움 균주를 유효성분으로 포함하는 섬유화증의 예방 또는 치료용 약학 조성물 WO2022169336A2 (ko)

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