WO2022157457A1 - Extrait de parties aeriennes de basilic sacre et compositions cosmetiques, ou dermatologiques le comprenant - Google Patents

Extrait de parties aeriennes de basilic sacre et compositions cosmetiques, ou dermatologiques le comprenant Download PDF

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skin
holy basil
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Sophie LECLERE- BIENFAIT
Stéphanie BREDIF
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Definitions

  • the invention relates to a composition comprising an extract of aerial parts of holy basil (Ocimum sanctum), green or purple variety.
  • the composition is advantageously cosmetic, pharmaceutical or dermatological.
  • the invention also relates to a process for extracting an extract of aerial parts of holy basil, as well as the extract that can be obtained by said process.
  • the invention also relates to such a composition or such an extract for its use in the prevention or treatment of disorders or pathologies of the skin, mucous membranes or appendages, and in the prevention or treatment of vascular disorders.
  • the invention finally relates to a cosmetic care process for the skin, appendages or mucous membranes, with a view to improving their condition or their appearance, consisting in administering such a composition or such an extract.
  • Ocimum sanctum (or ocimum tenuiflorum) commonly known as "holy basil” or “tulsi” is an aromatic plant from the lamiaceae family. It has an erect habit 30 to 60 cm high with hairy stems. The leaves are green or purple depending on the variety. They are simple, petiolate and up to 5 cm long. The small purplish flowers are placed on elongated racemes. There are two varieties of holy basil: green basil and purple basil. Both varieties have a similar phytochemical composition.
  • Holy basil is cultivated in Asia for its religious and medicinal uses, particularly in Ayurvedic medicine where it is considered an “elixir of life”.
  • Holy basil leaves are also used in Thai cooking and as an insect repellent.
  • composition of Ocimum sanctum Protein: 174.5 g/kg dry plant Fibre: 90.7 g/kg dry plant Ash: 135.6 g/kg dry plant
  • Sugars are composed of xylose and polysaccharides. Stems and leaves contain saponins, flavonoids, triterpenoids and tannins.
  • Table 1 Mineral composition of Ocimum sanctum (ppm)
  • the subject of the invention is an extract rich in polyphenols of holy basil, in particular an extract rich in polyphenols of aerial parts of holy basil.
  • the terms “holy basil” and “Ocimum sanctum” have the same meaning and can be used interchangeably. There are two varieties of holy basil: the green variety and the purple variety. Unless otherwise indicated, in the context of the present invention, the term “holy basil” or “Ocimum sanctum” means the two existing varieties, that is to say the green and purple varieties.
  • the "aerial parts" of Ocimum sanctum include the leaves, stems and flowers, preferably the leaves and stems.
  • extract rich in polyphenols is meant an extract comprising mainly or essentially polyphenols.
  • the extract according to the invention thus comprises at least 6% by weight of polyphenols, relative to the total weight of the dry extract, i.e. at least 1.2 mg of polyphenols per mL of liquid extract (in gallic acid equivalent) .
  • the extract according to the invention comprises at least 9% by weight, more advantageously at least 11% by weight, more advantageously at least 15% by weight, of polyphenols, relative to the total weight of the dry extract.
  • the extract according to the invention comprises between 6% and 17%, more advantageously between 9% and 17%, more advantageously between 11% and 17%, more advantageously between 15% and 17% by weight of polyphenols.
  • the percentages are expressed relative to the total weight of said dry extract (before any addition of a drying medium) and are determined according to the Folin Ciocalteu method.
  • polyphenol within the meaning of the present invention, is meant a molecule which comprises at least two hydroxyl functions carried by one or more benzene rings.
  • the polyphenols according to the invention contain or consist of hydroxycinnamic derivatives and flavonoids.
  • the extract according to the invention comprises at least 5% by weight of hydroxycinnamic derivatives, more advantageously at least 7% by weight of hydroxycinnamic derivatives, that is to say at least 1.0 mg of hydroxycinnamic derivatives per mL of liquid extract. More advantageously, the extract according to the invention comprises at least 10% by weight, more advantageously at least 15% by weight, of hydroxycinnamic derivatives.
  • the extract according to the invention comprises between 5% and 20% by weight, more advantageously between 7% and 20% by weight, more advantageously between 10% and 20% by weight, more advantageously between 15% and 20% by weight, of hydroxycinnamic derivatives. The percentages are expressed in relation to the total weight of said dry extract (before optional addition of a drying medium), in chlorogenic acid equivalent and are determined according to the Arnow method.
  • the extract according to the invention comprises at least 2.5% by weight of flavonoids, expressed as rutin equivalent, relative to the total weight of said dry extract, more advantageously at least 3.5% by weight.
  • the extract according to the invention comprises between 2.5% and 6% by weight, more advantageously between 3.5% and 6% by weight of flavonoids, expressed as rutin equivalent, relative to the total weight of said dry extract.
  • the flavonoid content is determined according to the Loots method (AlCb).
  • the extract according to the present invention comprises at least 6% by weight of polyphenols relative to the total weight of the dry extract, i.e. at least 1.2 mg of polyphenols per mL of liquid extract (in equivalent gallic acid), in particular at least 5% by weight of hydroxycinnamic derivatives relative to the total weight of the dry extract, and at least 2.5% by weight of flavonoids, expressed as rutin equivalent, relative to the total weight of the 'dry extract.
  • hydroxycinnamic derivatives within the meaning of the present invention is meant the molecules which include in their structure the following unit: it being understood that the hydrogens of the unit can be substituted by any other group.
  • the hydroxycinnamic derivatives within the meaning of the invention include in particular hydroxycinnamic acids, esters and glycosylated derivatives.
  • hydroxycinnamic derivatives As examples of hydroxycinnamic derivatives according to the present invention, mention may be made of: chicoric acid, caffeic acid, rosmarinic acid or caffaric acid, and mixtures thereof.
  • flavonoids is meant within the meaning of the present invention, the molecules which include in their structure the following unit:
  • flavonoids As examples of flavonoids according to the present invention, mention may be made of apigenin, apigenin-7-glucuronide or luteolin-7-glucuronide, and mixtures thereof.
  • flavonoids and hydroxycinnamic derivatives are typically polyphenols.
  • the extract according to the invention is essentially devoid of eugenol and methyl eugenol which are allergenic compounds and which are phenols, and not polyphenols within the meaning of the present invention.
  • eugenol and methyl eugenol are not classified in the family of polyphenols due in particular to their physicochemical properties. Indeed, these compounds are part of the main constituents of the essential oil of holy basil and are compounds which can be steamed, unlike the polyphenols according to the present invention.
  • the extract according to the present invention does not comprise eugenol and methyl eugenol or comprises less than 50 ppm in eugenol and less than 100 ppm in methyl eugenol.
  • the extract is not an essential oil, in fact the constituents of the extract cannot be steamed.
  • the extract rich in polyphenols described above is advantageously obtained by solid/liquid extraction of the aerial parts of holy basil, in a solvent chosen from water, glycols or glycerol, and their mixtures.
  • the extraction solvent according to the invention is a non-toxic solvent and is more particularly chosen from binary water/glycol or water/glycerol mixtures, advantageously in a proportion of between 30% and 90%, typically between 50% and 80 %, more advantageously between 60% and 70% of glycol or glycerol in water, by volume relative to the total volume of solvent used (water+glycol or water+glycerol).
  • the extraction solvent is chosen from binary mixtures water/propanediol, water/propylene glycol, water/glycerin, in particular water/propanediol, more particularly water/1,3-propanediol or water/glycerin.
  • the glycols mentioned above are glycols of plant origin, in particular propanediol and/or propylene glycol, more particularly propanediol, in particular 1,3-propanediol.
  • the glycerol mentioned above is of plant origin.
  • the invention also relates to a method for preparing an extract rich in polyphenols from aerial parts of holy basil, comprising at least one solid/liquid extraction step in a mixture of suitable solvents, in particular as defined in paragraph above, and under the optimum conditions of pH, time and temperature, known to those skilled in the art.
  • the method for preparing an extract rich in polyphenols from aerial parts of holy basil comprises the following successive steps: a) grinding the aerial parts of holy basil; b) extraction of the ground aerial parts in a solvent chosen from water, glycols, glycerol, and mixtures thereof, advantageously chosen from binary water/glycol or water/glycerol mixtures, under optimal conditions of duration, pH and temperature ; c) separation of the solid phase and the liquid phase by decantation and/or centrifugation and/or successive filtration; and d) optionally, drying the extract obtained in step c).
  • the process for preparing the extract contains a stage of elimination of eugenol or methyl eugenol or of substantial reduction of the eugenol and methyl eugenol content, typically by evaporation under vacuum or deodorization.
  • Step a) of grinding the plant can be carried out by methods known to those skilled in the art, in particular using a knife mill, a hammer mill, etc.
  • the extraction is preferably carried out in the presence of an extraction solvent chosen from binary water/glycol or water/glycerol mixtures.
  • an extraction solvent chosen from binary water/glycol or water/glycerol mixtures.
  • the extraction solvent used in step b) is chosen from binary water/glycol or water/glycerol mixtures in a proportion of between 30% and 90%, typically between 50% and 80%, more advantageously between 60 % and 70% of glycol or glycerol in water, by volume relative to the total volume of solvent used (water + glycol or water + glycerol).
  • the extraction solvent is chosen from binary mixtures water/propanediol, water/propylene glycol or water/glycerin, in particular water/propanediol, more particularly water/1,3-propanediol or water/glycerin.
  • the glycols are glycols of plant origin, in particular propanediol and/or propylene glycol, more particularly propanediol, in particular 1,3-propanediol.
  • the glycerol is of vegetable origin.
  • step b) of solid/liquid extraction is preferably carried out at a temperature of between 20°C and 90°C, in particular between 30°C and 80°C, more particularly between 30°C and 75°C. °C, typically 60°C.
  • the extraction time has the advantage of being short. It is advantageously between 30 minutes and 4 h, in particular between 1 h and 3 h, advantageously it is approximately 2 hours.
  • Step c) of separating the solid phase and the liquid phase is carried out by methods known to those skilled in the art, in particular by decantation, centrifugation and/or successive filtrations, preferably by filtration.
  • the liquid phase obtained is advantageously purified and concentrated, for example by ultrafiltration and/or sterilizing filtration.
  • Step c) is carried out until perfect clarity and microbiological cleanliness of a degree less than or equal to 100 CFU/g in total germ.
  • the extract rich in polyphenols according to the invention can be stabilized by the drying step d), by methods known to those skilled in the art.
  • Step d) of drying can, for example, be carried out in the presence of a support of the maltodextrin or acacia fiber type (Fibregum® company CNI).
  • the carrier content typically varies according to a ratio ranging from 0% to 80% carrier relative to the percentage of dry matter obtained in the liquid form of the extract.
  • the extract can optionally be dried by freeze-drying in order to obtain a final powder.
  • the final powder advantageously comprises 30 to 70% by weight of dry matter of the extract, the balance at 100% being the freeze-drying support. More advantageously, the final powder comprises 50% dry matter from the extract and 50% freeze-drying support.
  • the method according to the invention does not include step d).
  • the extract as obtained is preserved in the extraction solvent, the solvent being in sufficient quantity to exhibit bacteriostatic/bactericidal activity, in particular the solvent being in an amount greater than or equal to 50% by weight relative to the total weight of extract and solvent.
  • the extraction process according to the invention advantageously makes it possible to obtain an extract concentrated in polyphenols in a single main extraction step with a process that is simple to implement. In other words, it makes it possible to obtain concentrated extracts without multiplying the successive extraction steps as during fractionation.
  • the extract rich in polyphenols according to the invention can be obtained according to the following process: i. Grinding the aerial parts of holy basil; ii. Dissolution of the ground aerial parts at 10% (w/w) in a 1,3-propanediol/water mixture (60/40) or in a glycerin/water mixture (60/40); iii. Extraction with stirring for 2 h at 60° C.; iv. Purification by stages of successive filtrations; v. Advantageously elimination of eugenol and methyl eugenol, typically by vacuum evaporation or deodorization; and v. Sterile filtration.
  • extract according to the invention designate the extract as such, as defined above, or the extract capable of being obtained by the process according to invention as described above.
  • the extract obtainable by the process according to the invention as described above has the same composition as the extract according to the invention as such, as defined above.
  • a subject of the invention is also a composition
  • a composition comprising an extract according to the invention and a water/solvent mixture in a water/solvent ratio (v/v) of between 50/50 and 0/100, advantageously between 30/70 and 10 /90, more advantageously 20/80, said solvent being chosen from glycols, vegetable glycerin and mixtures thereof, preferably from glycols of vegetable origin, and preferably from 1,3-propanediol.
  • the composition comprises from 0.001 to 30% by weight, advantageously 0.001% to 10% by weight, of an extract according to the invention (expressed by weight of dry extract relative to the total weight of the composition) and between 70 % and 99.999% by weight, advantageously between 90% and 99.999% by weight, of a water/solvent mixture, relative to the total weight of the composition, the water/solvent ratio being between 50/50 and 0/100, advantageously between 30/70 and 10/90, more advantageously 20/80, and the solvent being chosen from glycols, vegetable glycerin and mixtures thereof, preferably from glycols of vegetable origin, and preferably from 1,3- propanediol.
  • the solvent is in an amount effective for a physical and microbiological stabilizing action of the composition according to the invention and in particular of the extract according to the invention.
  • a subject of the invention is also a composition comprising an extract rich in polyphenols from the aerial parts of Ocimum sanctum according to the invention, as active principle, and where appropriate a suitable excipient.
  • the extract according to the invention is as defined in the paragraphs above relating to the extract as such and those relating to the extract capable of being obtained by the process according to the invention.
  • composition is advantageously cosmetic, pharmaceutical or dermatological.
  • Said composition is preferably formulated to be administered by external topical route.
  • composition according to the invention comprises from 0.001 to 10%, typically from 0.01 to 5%, by weight of extract according to the invention, the weight of the extract being expressed as dry extract, relative to the weight composition total.
  • composition according to the invention may also comprise one or more other active principles.
  • composition according to the invention can be formulated in the form of various preparations suitable for topical administration and include in particular creams, emulsions, milks, ointments, lotions, oils, aqueous or hydroalcoholic or glycolic solutions, powders, patches, sprays, shampoos, varnishes or any other product for external application.
  • composition according to the invention may also comprise at least one cosmetically, pharmaceutically or dermatologically acceptable excipient.
  • composition according to the present invention may also comprise at least one cosmetically, pharmaceutically or dermatologically known adjuvant to those skilled in the art, chosen from surfactants, thickeners, preservatives, perfumes, dyes, chemical filters or minerals, moisturizing agents, thermal waters, etc.
  • surfactants chosen from surfactants, thickeners, preservatives, perfumes, dyes, chemical filters or minerals, moisturizing agents, thermal waters, etc.
  • compositions according to the invention can be determined according to the criteria generally taken into account in the establishment of a pharmacological, dermatological or cosmetic treatment adapted to a patient or to an animal, such as for example the age or body weight of the patient or animal, the severity of his general condition, tolerance to treatment, side effects observed, type of skin.
  • a subject of the invention is also an extract according to the invention or a composition according to the invention for its use for preventing and/or treating disorders or pathologies of the skin and/or mucous membranes (gums, periodontium, genital mucous membranes) and / or appendages (hair and nails) immature(s), normal(s) or mature/aged(s), advantageously inflammatory reactions, oxidation reactions, disorders linked to intrinsic or extrinsic stresses (such as psychological stress, stress linked to a state of anxiety, stress linked to free radical attacks linked or not to pollution (in particular chemical or atmospheric pollution) and/or linked to exposure to UV or IR ), barrier or homeostasis disorders, aging, in particular chronological and/or actinic aging, photosensitized skin, and/or mechanical or thermal attacks.
  • a subject of the invention is also an extract according to the invention or a composition according to the invention for its use for preventing and/or treating vascular disorders, in particular redness and rosacea.
  • a subject of the invention is also an extract according to the invention or a composition according to the invention for its use for preventing and/or treating imbalances and/or disorders linked to the imbalance of the microbiota of the skin and/or mucous membranes ( gums, periodontium, genital mucosa) and/or appendages and/or their appendages, immature(s), normal(s) or mature/aged.
  • the extract according to the invention has a protective activity of the skin and / or mucous membranes (gums, periodontium, genital mucous membranes) and / or appendages and / or their annexes, immature (s), normal (s) or mature(s)/aged(s), against mechanical, microbial, thermal and radical attacks.
  • the extract according to the invention acts for the defense of the microbiota and therefore makes it possible to fight against the microbiota imbalance.
  • the extract according to the invention makes it possible to stimulate the immune defenses of the skin and the cutaneous antioxidant system.
  • a subject of the invention is also the use of an extract according to the invention or of a composition according to the invention for the manufacture of a cosmetic, pharmaceutical or dermatological composition for preventing and/or treating disorders or pathologies of immature, normal or mature/aged skin and/or mucous membranes (gums, periodontium, genital mucosa) and/or appendages (hair and nails), advantageously inflammatory reactions, oxidation reactions, disorders linked to intrinsic or extrinsic stresses (such as psychological stress, stress linked to a state of anxiety, stress linked to radical attacks linked or not to pollution (in particular chemical pollution or atmospheric) and/or related to exposure to UV or IR), barrier or homeostasis disorders, aging, in particular chronological and/or actinic aging, photosensitized skin, and/or aggressions mechanical or thermal.
  • a cosmetic, pharmaceutical or dermatological composition for preventing and/or treating disorders or pathologies of immature, normal or mature/aged skin and/or mucous membranes (gums, periodontium
  • a subject of the invention is also the use of an extract according to the invention or of a composition according to the invention for the manufacture of a pharmaceutical, cosmetic or dermatological composition for preventing and/or treating vascular disorders, in especially redness and blotches.
  • a subject of the invention is also the use of an extract according to the invention or of a composition according to the invention for the manufacture of a pharmaceutical, cosmetic or dermatological composition for preventing and/or treating imbalances and/or disorders related to the imbalance of the microbiota of the skin and/or mucous membranes (gums, periodontium, genital mucous membranes) and/or appendages and/or their appendages, immature(s), normal(s) or mature(s)/aged (s).
  • the invention further relates to a method for preventing and/or treating disorders or pathologies of the skin and/or mucous membranes (gums, periodontium, genital mucous membranes) and/or appendages (hair and nails) immature(s), normal(s) or mature/aged(s), advantageously inflammatory reactions, oxidation reactions, disorders linked to intrinsic or extrinsic stresses (such as psychological stress, stress linked to a state of anxiety, stress linked to radical attacks linked or not to pollution (in particular chemical or atmospheric pollution) and/or linked to exposure to UV or IR), barrier or homeostasis disorders, aging, in particular chronological and/or actinic aging, photosensitized skin, and/or mechanical or thermal attacks, comprising the administration, in particular topical administration, of a effective amount of an extract according to the invention or of a composition according to the invention, to a subject in need thereof.
  • mucous membranes gaums, periodontium, genital mucous membranes
  • appendages hair
  • the invention also relates to a method for preventing and/or treating vascular disorders, in particular redness and rosacea, comprising the administration, in particular topical administration, of an effective quantity of an extract according to invention or a composition according to the invention, to a subject in need thereof.
  • the invention also relates to a method for preventing and/or treating for preventing and/or treating imbalances and/or disorders related to the imbalance of the microbiota of the skin and/or mucous membranes (gums, periodontium, genital mucous membranes) and /or appendages and/or their appendages, immature(s), normal(s) or mature/aged(s), comprising the administration, in particular the topical administration, of an effective amount of an extract according to the invention or of a composition according to the invention, to a subject in need thereof.
  • composition or the extract according to the invention is intended for the prevention and/or treatment of inflammatory or irritative reactions or pathologies or disorders of the barrier or of the homeostasis of the skin, skin appendages (hair and nails) and/or mucous membranes (gums, periodontium, genital mucous membranes) immature(s), normal(s) or mature/aged(s).
  • the inflammatory, irritative reactions, disorders or pathologies or disorders of the barrier or homeostasis of the skin are: acne, rosacea or erythrocouperosis, vascular disorders, in particular redness and rosacea, dermatitis diaper, atopic dermatitis, eczema, contact dermatitis, irritative dermatitis, allergic dermatitis, seborrhoeic dermatitis (cradle cap), sensitive skin, reactive skin, dry skin (xerosis), skin dehydrated skin, skin with redness, skin erythema, aged or photo-aged skin, photosensitized skin, pigmented skin (melasma, postinflammatory pigmentation...), skin with stretch marks, sunburn, irritation by agents chemical, physical (for example tension stress for pregnant women), bacteriological, fungal, skin aging, in particular photoaging and disorders linked to free radical attacks linked to chemical pollution ic or atmospheric, and/or related to exposure to UV or IR.
  • the reactions, disorders or inflammatory or irritative pathologies or disorders of the barrier or homeostasis of the mucous membranes are gingivitis (sensitive gums newborns, hygiene problems, due to smoking or other), and irritation of the external or internal male or female genital spheres.
  • the inflammatory or irritative reactions, disorders or pathologies or disorders of the barrier or of the homeostasis of the appendages are brittle nails, fragile nails, weakened hair, brittle hair, dry hair, alopecia, seborrheic dermatitis, and folliculitis dermatitis.
  • composition or the extract according to the invention is intended as an anti-ageing agent, against skin aging, in particular chronological and actinic aging, for example linked to sun exposure or to phenomena of inflammation, or to act on irritated skin.
  • the extract according to the invention is used to prevent and/or treat:
  • disorders or pathologies of the skin and/or mucous membranes and/or appendages advantageously inflammatory reactions, disorders linked to intrinsic or extrinsic stresses, such as psychological stress, stress linked to a state of anxiety, stress linked to free radical attacks linked or not to chemical or atmospheric pollution, and/or linked to exposure to UV or IR, advantageously chosen from sensitive skin, reactive skin and/or reactive mucous membranes, skin irritated, inflamed skin, barrier or homeostasis disorders, photosensitized skin, mechanical and/or thermal attacks; and or
  • vascular disorders preferably redness or rosacea and/or
  • microbiota imbalances advantageously chosen from atopic dermatitis, eczema, development of bad axillary odors, weakening of the skin barrier, acne, psoriasis, hidradenitis suppurativa, folliculitis, cradle cap, dandruff, itching in particular of the scalp, irritations, candidiasis and bacterial vaginosis and/or for its use as a healing agent.
  • a subject of the invention is also the cosmetic use of an extract according to the invention or of a composition according to the invention in the treatment and/or prevention of dehydrated skin; the skin with redness; aged skin; skin aging.
  • a subject of the invention is also the cosmetic use of an extract according to the invention or of a composition according to the invention for caring for skin appendages, in particular for preventing brittle nails; brittle nails; weakened hair; brittle hair; and dry hair.
  • the invention also relates to a cosmetic care process for the skin and/or appendages and/or mucous membranes, with a view to improving their condition and/or their appearance, consisting in administering a composition or an extract according to the present invention; especially in view to improve the firmness, the elasticity or the tonicity of the skin, with a view to reinforcing the mechanical properties of the skin and of the mucous membranes, in particular to combat withered, soft, distended and/or sagging skin, and/or with a view to reinforcing and/or restoring the elasticity or firmness of the skin, or else for treating wrinkles and fine lines.
  • the invention relates to a cosmetic care process for the skin and/or mucous membranes and/or superficial body growths, with a view to preventing alterations of the barrier and its dehydration or with a view to moisturizing the skin and/or or the mucous membranes, consisting in applying to the skin and/or the integuments and/or the mucous membranes a composition or an extract according to the present invention.
  • the invention also relates to a cosmetic care process for the skin and/or the appendages, with a view to preventing its aging, consisting in applying to the skin and/or the appendages a composition or an extract according to the present invention.
  • the invention also relates to the cosmetic use of a composition or of an extract or of a composition according to the invention for moisturizing the skin and/or the mucous membranes, for acting on the elasticity or the firmness of the skin, in particular as a tightening or anti-wrinkle agent, to act on sensitive skin.
  • the invention relates to the cosmetic use of a composition or an extract according to the invention in the treatment and/or prevention of dehydrated skin; the skin with redness; aged skin; the homogeneity of the complexion; the reduction of spots on the skin or skin ageing, in particular chronological and/or actinic ageing.
  • the cosmetic uses and methods of cosmetic care according to the present invention are typically carried out on healthy skins or healthy parts of the body and are not therapeutic.
  • Figure 1 describes the measurement of NO production by keratinocytes subjected to cortisol stress.
  • Fig. 2 Figure 2 depicts the effects of holy basil extract on cellular bioenergetics in pollutant-stressed fibroblasts, specifically the effects on oxygen consumption FIG. 2A, ATP production FIG. 2B, lactate production FIG. 2C and the NAD/NADH ratio FIG. 2D (*p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01 vs untreated control; #p ⁇ 0.05; ##p ⁇ 0.01 vs pollutant).
  • Figure 3 describes the percentage of damaged mitochondria per cell (%) (###p ⁇ 0.0001 vs. pollutant).
  • FIG. 4 demonstrates the lysosomal density (intensity/pm 2 ) (***p ⁇ 0.0001 vs control; #p ⁇ 0.05;###p ⁇ 0.0001 vs pollutant).
  • Fig. 5 Mitophagy (% of lysosomes co-localized with damaged mitochondria) (*** p ⁇ 0.0001 vs control; ###p ⁇ 0.0001 vs pollutant).
  • FIG. 6 Figure 6 demonstrates the percentage of fibroblast migration between T0 and T40h.
  • Example 1 extract according to the invention
  • a holy basil extract is obtained according to the following process: a) dissolution of 10% (w/w) of the aerial parts of Ocimum sanctum - purple variety - ground in a water/propanediol mixture 40/60 w/w b) extraction 2 h at 60° C. c) solid/liquid separation by successive filtrations.
  • the polyphenol-rich liquid extract thus obtained has the following characteristics (% by weight of molecules/dry extract of the extract obtained):
  • Example 2 extract according to the invention
  • a holy basil extract is obtained according to the following process: a) dissolution of 10% (w/w) of the aerial parts of Ocimum sanctum - green variety - ground in a water/propanediol mixture 40/60 w/w b) extraction 3 h at 60° C. c) solid/liquid separation by successive filtrations.
  • the polyphenol-rich liquid extract thus obtained has the following characteristics (% by weight of molecules/dry extract of the extract obtained):
  • Example 3 Tests of biological activities of the extract according to the invention
  • the keratinocytes were then stimulated with hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) at 100 ⁇ M for 20 minutes.
  • H 2 O 2 hydrogen peroxide
  • ROS The production of ROS was evaluated by measuring the fluorescence emitted by the probe in contact with the ROS.
  • Reconstructed human epidermis were pre-treated with a formulation containing 3% basil extract obtained according to example 1 or its placebo for 24 hours. The skins were then irradiated with 30J/cm 2 of UVA.
  • the antioxidant activity of holy basil extract was investigated by evaluating the quantity of ROS produced by keratinocytes or fibroblasts subjected to oxidative stress induced by menadione. has. Material and method
  • ROS were labeled with the CellRox® probe; intracellular fluorescence, proportional to the amount of ROS was measured.
  • ROS are the main activators of lipid peroxidation, having as their main targets polyunsaturated lipids bound to the cell membrane.
  • the anti-lipid peroxidation activity of holy basil extract was investigated in keratinocytes or fibroblasts subjected to oxidative stress induced by cumene hydroperoxide. has. Material and method
  • the lipid peroxides were revealed by labeling using the BODIPY® 581/591 C11 probe; intracellular fluorescence was measured.
  • Glutathione is the main endogenous antioxidant peptide capable of neutralizing ROS. Intracellular GSH depletion is responsible for damage induced by oxidative stress, associated with mitochondrial toxicity.
  • Skin aging is characterized by an alteration of the dermal matrix with, in particular, a reduction in the quality and quantity of matrix fibers, mainly collagen and elastin.
  • the anti-aging activity of holy basil was evaluated by its ability to stimulate the expression and production of dermal matrix markers under standard conditions and under conditions of inflammatory stress modeling chronic inflammation, also called " inflamm'aging” or low-grade inflammation.
  • Collagen I The gene expression of Collagen I, Elastin, Dermatopontin and MMP1 (Matrix-Metalloproteinase-1) was evaluated by real-time quantitative PCR.
  • Human dermal fibroblasts were treated for 48 hours with the holy basil extract obtained according to Example 1 at 0.001% and 0.005% ms or with a mixture of Vitamin C at 10 ⁇ M and TGFB at 5 ng/mL, used as a positive reference. .
  • CLN3 encodes a lysosomal/endosomal transmembrane protein (neural ceroid-lipofuscinosis 3) involved in the regulation of the autophagy process.
  • Autophagy is an intracellular detoxification process allowing the degradation and recycling of damaged proteins and organelles. This process is essential for the maintenance of cell function and homeostasis. Stimulation of autophagy is of interest in slowing down aging and extending the lifespan of cells.
  • PXN encodes a focal adhesion molecule (paxillin), whose expression decreases with age and therefore represents a target for anti-aging action. Due to its crucial role in cell-matrix connections and mechanotransduction between the fibroblast and its matrix, the loss of paxillin with age could compromise cell function, resulting in the appearance or aggravation of skin aging. Inducing its expression could help restore age-related loss of collagen and dermal contractility.
  • paxillin focal adhesion molecule
  • Table 12 Genes modulated significantly by the 3% formulation of holy basil extract compared to the placebo (fixed at 1.00)
  • Reconstructed epidermis were treated topically with a formulation (cream) containing 3% holy basil extract obtained according to example 1 or its placebo, or systemically with dexamethasone at 1 ⁇ M, an anti-inflammatory reference. After 24 hours of pre-incubation, the epidermis were stimulated with 0.5 ⁇ g/mL of PMA and incubated again for 24 hours.
  • the culture subnatants were collected, an ILIa assay was carried out on the one hand and, on the other hand, these subnatants (conditioned media) were deposited on cultures of normal human dermal fibroblasts.
  • Table 14 Genes modulated by the 3% formula of holy basil in the Inflamm'aging model: gene expression in the fibroblasts incubated in the presence of conditioned media (Level of expression in relative quantity; % change compared to PMA)
  • the skin is daily exposed to different types of exogenous and/or endogenous stresses, likely to alter its functioning and quality, and which can ultimately lead to irreversible damage.
  • Nitric oxide is a reactive species involved in the regulation of skin homeostasis. This very unstable molecule is synthesized and released by many cell types to regulate physiological and homeostatic reactions, such as melanogenesis, healing, regulation of inflammation, immunomodulation, vasodilation...
  • Glucocorticoids such as cortisol.
  • HPA hypothalamic-pituitary-adrenal
  • Numerous studies have described the negative effects of psychological stress on cutaneous homeostasis, leading to an alteration of immune and inflammatory responses.
  • the inflammatory response includes the activation of free radicals, among which, NO.
  • Camptothecin is a genotoxic compound, inhibitor of toposiomerase I, used for the induction of double strand breaks in DNA.
  • Double-strand breaks were detected by immunostaining of yH2AX (phosphorylation of histone H2AX which occurs early in response to double-strand breaks) and quantified by image analysis.
  • Table 15 Expression of yH2AX in keratinocytes in the presence of camptothecin stress
  • UV, Pollution Environmental factors
  • Intracellular ROS are mainly formed by dysfunction of the mitochondrial electron transfer chain.
  • Mitochondrial DNA is particularly sensitive to ROS, resulting in the following phenomena which ultimately contribute to the aging process: decrease in energy production, increase in oxidative stress, increase in mitochondrial functions.
  • Normal human dermal fibroblasts were incubated for 120 minutes in the presence of the mixture of urban pollutants at 0.1% and the holy basil extract obtained in example 1 at 0.001% and 0.005% ms.
  • the analysis of autophagy and mitophagy was evaluated via a lysosomal marker and a specific dye of damaged mitochondria: Damaged mitochondria were visualized by a red fluorescence produced by reaction of a fluorochrome bound by covalent bond to the membrane mitochondrial which emits when damage to the mitochondrial membrane takes place. A lysosomal dye was used to label lysosomes and assess the colocalization of damaged mitochondria to lysosomes.
  • Mitophagy is represented by the percentage of lysosomes co-localized with a signal of damaged mitochondria. Pollution increased the frequency of lysosomes containing damaged mitochondria, demonstrating an increase in the process of mitophagy. Pollution increases mitochondrial and endoplasmic reticulum stress, both of which induce damage to the mitochondrial membrane. The increase in mitophagy observed under the effect of stress is linked to cells trying to eliminate damaged mitochondria and/or malformed proteins or lipids. Holy basil extract reduced and normalized pollutant stress-induced mitophagy (fig.5).
  • Aquaporin 3 plays an important role in preserving skin hydration: this transmembrane protein is involved in transporting water and glycerol into keratinocytes to maintain epidermal hydration a.
  • the anti-aging clinical efficacy of the holy basil extract according to the present invention was evaluated by an in vivo clinical study.
  • composition of the placebo is as follows:
  • the active ingredient significantly reduces the area and length of the wrinkle detected on D56 with a significant difference compared to the placebo.
  • Table 20 measurement results - crow's feet wrinkles b. Results on forehead wrinkles
  • the active ingredient significantly improves forehead wrinkles on D28 and does not induce any variation on D56.
  • the placebo does not induce any significant variation on D28 and globally induces a significant worsening on D56. Overall, this leads to significant differences in favor of the asset at D28 and D56 on all the topographic parameters evaluated.
  • the active improves tonicity (Ur and Ua) at D56 whereas the placebo causes a significant worsening.
  • the difference between the active and the placebo is significant in favor of the active for the 2 parameters.
  • the active improves the raw elasticity Ur/Uf at D56.
  • the difference is significant compared to the placebo which causes a worsening.
  • the active ingredient significantly improves the biological elasticity Ua/Uf on D28 and D56. The difference is significant compared to the placebo at D56 which causes a worsening.
  • the active improves the net elasticity Ur/Ue at D56.
  • the difference is significant compared to the placebo at D56 which causes a worsening.
  • the active improves on D28 and significantly on D56 Q1 viscoelastic recovery. The difference is significant compared to the placebo at D56 which causes a worsening.
  • the active improves elastic recovery Q2 at D56.
  • the difference is significant compared to the placebo at D56 which causes a worsening.
  • the active ingredient significantly improves Q3 viscous recovery on D28 and D56. The difference is significant compared to the placebo at D56 which does not cause any significant variation.
  • the active ingredient improves the biomechanical properties of the skin, significantly compared to the placebo, with an improvement in skin tone and elasticity.
  • the active ingredient significantly reduces redness a* on D28 and D56.
  • the difference is in favor of the active ingredient on D28 and D56 compared to the placebo, which also reduces redness on D28 and significantly on D56.
  • the active ingredient decreases hemoglobin on D28 and D56.
  • the active ingredient significantly improves the evenness of the complexion H76 to D56.
  • the active ingredient significantly improves the luminosity, redness and evenness of the complexion.
  • the active has an anti-aging effect observed instrumentally on wrinkles in the upper part of the face, namely crow's feet and forehead wrinkles. Significant differences compared to the placebo are observed according to the times in favor of the active ingredient.
  • the active ingredient significantly improves the tone and elasticity of the skin on D28 and D56 according to the parameters considered with significant differences with the placebo in favor of the active ingredient.
  • the active improves the homogeneity of the complexion at D56 with a difference compared to the placebo in favor of the active.

Abstract

L'invention se rapporte à un extrait de parties aériennes de basilic sacré, en particulier d'Ocimum sanctum, ainsi qu'à son procédé de préparation et l'extrait susceptible d'être obtenu par ledit procédé. L'invention a également pour objet une composition comprenant un tel extrait; la composition étant avantageusement cosmétique, pharmaceutique ou dermatologique. L'invention concerne également une telle composition ou un tel extrait pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des troubles ou pathologies de la peau, des muqueuses ou des phanères et pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des troubles vasculaires. L'invention concerne enfin un procédé de soin cosmétique de la peau, des phanères ou des muqueuses, en vue d'améliorer leur état ou leur aspect, consistant à administrer une telle composition ou un tel extrait.

Description

EXTRAIT DE PARTIES AERIENNES DE BASILIC SACRE ET COMPOSITIONS COSMETIQUES, OU DERMATOLOGIQUES LE COMPRENANT
L’invention se rapporte à une composition comprenant un extrait de parties aériennes de basilic sacré (Ocimum sanctum), variété verte ou pourpre. La composition est avantageusement cosmétique, pharmaceutique ou dermatologique. L’invention a également pour objet un procédé d’extraction d’un extrait de parties aériennes de basilic sacré, ainsi que l’extrait susceptible d’être obtenu par ledit procédé. L’invention concerne également une telle composition ou un tel extrait pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des troubles ou pathologies de la peau, des muqueuses ou des phanères, et dans la prévention ou le traitement des troubles vasculaires. L’invention concerne enfin un procédé de soin cosmétique de la peau, des phanères ou des muqueuses, en vue d’améliorer leur état ou leur aspect, consistant à administrer une telle composition ou un tel extrait.
BASILIC SACRE
Description botanique
Ocimum sanctum (ou ocimum tenuiflorum) communément appelé « basilic sacré » ou «« tulsi » est une plante aromatique de la famille des lamiacés. Elle possède un port érigé de 30 à 60 cm de haut avec des tiges poilues. Les feuilles sont vertes ou violettes selon la variété. Elles sont simples, pétiolées et font jusqu’à 5 cm de long. Les petites fleurs violacées sont placées sur des racèmes allongées. Il existe deux variées de basilic sacré : le basilic vert et le basilic pourpre. Les deux variétés ont une composition phytochimique similaire.
Le basilic sacré est cultivé en Asie pour ses usages religieux et médicinaux, notamment en médecine ayurvédique où il est considéré comme un « élixir de vie ». Les feuilles de basilic sacré sont aussi utilisées en cuisine thaï et en répulsif à insecte.
Phytochimie
Composition de Ocimum sanctum : Protéines : 174,5 g/kg plante sèche Fibres : 90,7 g/kg plante sèche Cendres : 135,6 g/kg plante sèche
De nombreuses molécules ont été identifiées dans des extraits aqueux et alcooliques de Ocimum sanctum. Les polyphénols sont largement présents avec l’acide rosmarinique comme composé majoritaire. Sont aussi largement reportés la présence d’acide ursolique, de dérivés d’apigénine et d’acides phénoliques.
Les sucres sont composés de xylose et de polysaccharides. Les tiges et les feuilles contiennent des saponines, flavonoïdes, triterpénoïdes et des tannins.
La composition en minéraux montre que le potassium est largement majoritaire (cf. tableau 1 ) : Tableau 1 : Composition en minéraux de Ocimum sanctum (ppm)
Figure imgf000003_0001
Descriptif de l’invention
L’invention a pour objet un extrait riche en polyphénols de basilic sacré, notamment un extrait riche en polyphénols de parties aériennes de basilic sacré.
Dans le cadre de l’invention, les termes « basilic sacré » et « Ocimum sanctum » ont la même signification et peuvent être employés de manière indifférente. Il existe deux variétés de basilic sacré : la variété verte et la variété pourpre. Sauf indication contraire, dans le cadre de la présente invention, on entend par « basilic sacré » ou « Ocimum sanctum », les deux variétés existantes, c’est-à-dire les variétés verte et pourpre.
Dans le contexte de l’invention, les « parties aériennes » d’Ocimum sanctum comprennent les feuilles, les tiges et les fleurs, de préférence les feuilles et les tiges.
Par « extrait riche en polyphénols », on entend un extrait comprenant majoritairement ou essentiellement des polyphénols.
L’extrait selon l’invention comprend ainsi au moins 6% en poids de polyphénols, par rapport au poids total de l’extrait sec, soit au moins 1 ,2 mg de polyphénols par mL d’extrait liquide (en équivalent acide gallique). Avantageusement, l’extrait selon l’invention comprend au moins 9 % en poids, plus avantageusement au moins 11 % en poids, plus avantageusement au moins 15 % en poids, de polyphénols, par rapport au poids total de l’extrait sec. Avantageusement, l’extrait selon l’invention comprend entre 6 % et 17 %, plus avantageusement entre 9 % et 17 %, plus avantageusement entre 11 % et 17 %, plus avantageusement entre 15% et 17 % en poids de polyphénols. Les pourcentages sont exprimés par rapport au poids total dudit extrait sec (avant ajout éventuel d’un support de séchage) et sont déterminés selon la méthode de Folin Ciocalteu.
Par polyphénol au sens de la présente invention, on entend une molécule qui comprend au moins deux fonctions hydroxyles portées par un ou plusieurs cycles benzéniques. De manière particulièrement avantageuse, les polyphénols selon l’invention contiennent ou sont constitués des dérivés hydroxycinnamiques et des flavonoïdes.
Avantageusement, l’extrait selon l’invention comprend au moins 5 % en poids de dérivés hydroxycinnamiques, plus avantageusement au moins 7 % en poids de dérivés hydroxycinnamiques, c’est-à-dire au moins 1 ,0 mg de dérivés hydroxycinnamiques par mL d’extrait liquide. Plus avantageusement, l’extrait selon l’invention comprend au moins 10 % en poids, plus avantageusement au moins 15 % en poids, de dérivés hydroxycinnamiques. Avantageusement, l’extrait selon l’invention comprend entre 5 % et 20 % en poids, plus avantageusement entre 7 % et 20 % en poids, plus avantageusement entre 10 % et 20 % en poids, plus avantageusement entre 15 % et 20 % en poids, de dérivés hydroxycinnamiques. Les pourcentages sont exprimés par rapport au poids total dudit extrait sec (avant ajout éventuel d’un support de séchage), en équivalent acide chlorogénique et sont déterminés selon la méthode d’Arnow.
Avantageusement, l’extrait selon l’invention comprend au moins 2,5 % en poids de flavonoïdes, exprimés en équivalent rutine, par rapport au poids total dudit extrait sec, plus avantageusement au moins 3,5 % en poids. Avantageusement, l’extrait selon l’invention comprend entre 2,5 % et 6 % en poids, plus avantageusement entre 3,5 % et 6 % en poids de flavonoïdes, exprimés en équivalent rutine, par rapport au poids total dudit extrait sec. La teneur en flavonoïdes est déterminée selon la méthode de Loots (AlCb).
De manière particulièrement avantageuse, l’extrait selon la présente invention comprend au moins 6% en poids de polyphénols par rapport au poids total de l’extrait sec, soit au moins 1 ,2 mg de polyphénols par mL d’extrait liquide (en équivalent acide gallique), en particulier au moins 5 % en poids de dérivés hydroxycinnamiques par rapport au poids total de l’extrait sec, et au moins 2,5 % en poids de flavonoïdes, exprimés en équivalent rutine, par rapport au poids total de l’extrait sec.
Par dérivés hydroxycinnamiques au sens de la présente invention, on entend les molécules qui comprennent dans leur structure le motif suivant :
Figure imgf000004_0001
étant entendu que les hydrogènes du motif peuvent être substitués par n’importe quel autre groupement. Les dérivés hydroxycinnamiques au sens de l’invention comprennent notamment les acides hydroxycinnamiques, les esters et les dérivés glycosylés.
À titre d’exemples de dérivés hydroxycinnamiques selon la présente invention, on peut citer : l’acide chicorique, l’acide caféique, l’acide rosmarinique ou l’acide caffarique, et leurs mélanges.
On entend par flavonoïdes au sens de la présente invention, les molécules qui comprennent dans leur structure le motif suivant :
Figure imgf000005_0001
étant entendu que les hydrogènes du motif peuvent être substitués par n’importe quel autre groupement. Le pointillé dans la formule ci-dessus signifie une simple ou une double liaison.
À titre d’exemples de flavonoïdes selon la présente invention, on peut citer l’apigénine, l’apigénine-7-glucuronide ou la lutéoline-7-glucuronide, et leurs mélanges.
Au sens de la présente invention, les flavonoïdes et les dérivés hydroxycinnamiques sont typiquement des polyphénols.
De manière particulièrement avantageuse, l’extrait selon l’invention est essentiellement dépourvu d’eugénol et de méthyl eugénol qui sont des composés allergènes et qui sont des phénols, et non des polyphénols au sens de la présente invention. L’eugénol et le méthyl eugénol ne sont pas classés dans la famille des polyphénols en raison notamment de leurs propriétés physicochimiques. En effet, ces composés font partie des constituants principaux de l’huile essentielle de basilic sacré et sont des composés entraînables à la vapeur contrairement aux polyphénols selon la présente invention.
Ainsi, avantageusement, l’extrait selon la présente invention ne comprend pas d’eugénol et de méthyleugénol ou comprend moins de 50 ppm en eugénol et moins de 100 ppm en méthyl eugénol.
Avantageusement selon la présente invention, l’extrait n’est pas une huile essentielle, en effet les constituants de l’extrait ne sont pas entraînables à la vapeur.
Dans le cadre de la présente invention, l’extrait riche en polyphénols décrit ci-dessus est avantageusement obtenu par extraction solide/liquide des parties aériennes de basilic sacré, dans un solvant choisi parmi l’eau, les glycols ou le glycérol, et leurs mélanges. Le solvant d’extraction selon l’invention est un solvant non-toxique et est plus particulièrement choisi parmi les mélanges binaires eau/glycols ou eau/glycérol, avantageusement dans une proportion comprise entre 30 % et 90 %, typiquement entre 50 % et 80 %, plus avantageusement entre 60 % et 70 % de glycol ou de glycérol dans l’eau, en volume par rapport au volume total de solvant utilisé (eau + glycol ou eau + glycérol). En particulier, le solvant d’extraction est choisi parmi les mélanges binaires eau /propanediol, eau/propylène glycol, eau/glycérine, en particulier eau/propanediol, plus particulièrement eau/1 ,3-propanediol ou eau/glycérine. Avantageusement, les glycols cités ci-dessus sont des glycols d’origine végétale, en particulier le propanediol et/ou le propylène glycol, plus particulièrement le propanediol, notamment le 1 ,3-propanediol.
Avantageusement, le glycérol cité ci-dessus est d’origine végétale.
L’invention a également pour objet un procédé de préparation d’un extrait riche en polyphénols de parties aériennes de basilic sacré, comprenant au moins une étape d’extraction solide/ liquide dans un mélange de solvants approprié, notamment tel que défini dans le paragraphe ci-dessus, et dans les conditions optimales de pH, durée et de température, connues de l’homme de l’art.
Avantageusement selon l’invention, le procédé de préparation d’un extrait riche en polyphénols de parties aériennes de basilic sacré, comprend les étapes successives suivantes : a) broyage des parties aériennes de basilic sacré ; b) extraction des parties aériennes broyées dans un solvant choisi parmi l’eau, les glycols, le glycérol, et leurs mélanges, avantageusement choisi parmi les mélanges binaires eau/glycols ou eau/glycérol, dans des conditions optimales de durée, pH et température ; c) séparation de la phase solide et de la phase liquide par décantation et/ou centrifugation et/ou filtration successive; et d) éventuellement, séchage de l’extrait obtenu à l’étape c).
De manière particulièrement avantageuse selon la présente invention, le procédé de préparation de l’extrait contient une étape d’élimination d’eugénol ou de méthyl eugénol ou de réduction substantielle de la teneur en eugénol et en méthyl eugénol, typiquement par évaporation sous vide ou désodorisation.
L’étape a) de broyage de la plante peut être réalisée par des méthodes connues de l’homme du métier, notamment à l’aide d’un broyeur à couteaux, d’un broyeur à marteaux, etc.
À l’étape b), l’extraction est réalisée de préférence en présence d’un solvant d’extraction choisi parmi les mélanges binaires eau/glycols ou eau/glycérol. Avantageusement, le solvant d’extraction utilisé à l’étape b) est choisi parmi les mélanges binaires eau/glycols ou eau/glycérol dans une proportion comprise entre 30 % et 90 %, typiquement entre 50 % et 80 %, plus avantageusement entre 60 % et 70 % de glycol ou de glycérol dans l’eau, en volume par rapport au volume total de solvant utilisé (eau + glycol ou eau + glycérol). En particulier, le solvant d’extraction est choisi parmi les mélanges binaires eau/propanediol, eau/propylène glycol ou eau/glycérine, en particulier eau/propanediol, plus particulièrement eau/1 ,3-propanediol ou eau/glycérine. Avantageusement, les glycols sont des glycols d’origine végétale, en particulier le propanediol et/ou le propylène glycol, plus particulièrement le propanediol, notamment le 1 ,3- propanediol. Avantageusement, le glycérol est d’origine végétale.
En outre, l’étape b) d’extraction solide/ liquide est réalisée de préférence à une température comprise entre 20 °C et 90 °C, en particulier entre 30 °C et 80 °C, plus particulièrement entre 30 °C et 75 °C, typiquement 60 °C.
Contrairement à d’autres méthodes de l’art antérieur, la durée d’extraction a l’avantage d’être courte. Elle est avantageusement comprise entre 30 minutes et 4 h, en particulier entre 1 h et 3 h, avantageusement elle est d’environ 2 heures.
L’étape c) de séparation de la phase solide et de la phase liquide est réalisée par des méthodes connues de l’homme du métier, notamment par décantation, centrifugation et/ou filtrations successives, de préférence par filtration. Durant l’étape c), la phase liquide obtenue est avantageusement purifiée et concentrée par exemple par ultrafiltration et/ou filtration stérilisante. L’étape c) est effectuée jusqu’à parfaite limpidité et propreté microbiologique de degré inférieur ou égal à 100 UFC/g en germe totaux.
Avantageusement, l’extrait riche en polyphénols selon l’invention peut être stabilisé par l’étape de séchage d), par des procédés connus de l’homme de l’art.
L’étape d) de séchage peut, par exemple, être réalisée en présence d’un support de type maltodextrines ou fibres d’acacia (Fibregum® société CNI). La teneur en support varie typiquement selon un ratio allant de 0 % à 80 % de support par rapport au pourcentage de matière sèche obtenu dans la forme liquide de l’extrait.
L’extrait peut éventuellement être séché par lyophilisation afin d’obtenir une poudre finale. La poudre finale comprend avantageusement 30 à 70 % en poids de matière sèche de l’extrait, le complément à 100 % étant le support de lyophilisation. Plus avantageusement la poudre finale comprend 50 % de matière sèche issue de l’extrait et 50 % de support de lyophilisation.
Avantageusement, le procédé selon l’invention ne comprend pas d’étape d). Ainsi, l’extrait tel qu’obtenu est conservé dans le solvant d’extraction, le solvant étant en quantité suffisante pour présenter une activité bactériostatique/ bactéricide, en particulier le solvant étant en quantité supérieure ou égale à 50 % en poids par rapport au poids total de l’extrait et du solvant.
Le procédé d’extraction selon l’invention permet avantageusement d’obtenir un extrait concentré en polyphénols en une seule étape principale d’extraction avec un procédé simple à mettre en œuvre. En d’autres termes il permet d’obtenir des extraits concentrés sans multiplier les étapes successives d’extraction comme lors d’un fractionnement. Préférentiellement, à titre d’exemple, l’extrait riche en polyphénols selon l’invention peut être obtenu selon le procédé suivant : i. Broyage des parties aériennes de basilic sacré ; ii. Mise en solution des parties aériennes broyées à 10 % (p/p) dans un mélange 1 ,3- propanediol / eau (60/40) ou dans un mélange glycérine / eau (60/40) ; iii. Extraction sous agitation pendant 2 h à 60 °C ; iv. Purification par étapes de filtrations successives ; v. Avantageusement élimination d’eugénol et du méthyleugénol, typiquement par évaporation sous vide ou désodorisation ; et vi. Filtration stérile.
Dans la suite de la description, on parlera d’« extrait selon l’invention » pour désigner l’extrait en tant que tel, tel que défini ci-dessus, ou l’extrait susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’invention tel que décrit ci-dessus. L’extrait susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’invention tel que décrit ci-dessus présente la même composition que l’extrait selon l’invention en tant que tel, tel que défini ci-dessus.
L’invention a également pour objet une composition comprenant un extrait selon l’invention et un mélange eau/solvant dans un ratio eau/solvant (v/v) compris entre 50/50 et 0/100, avantageusement entre 30/70 et 10/90, plus avantageusement 20/80, ledit solvant étant choisi parmi les glycols, la glycérine végétale et leurs mélanges, de préférence parmi les glycols d’origine végétale, et préférentiellement parmi le 1 ,3-propanediol.
Avantageusement, la composition comprend de 0.001 à 30 % en poids, avantageusement 0.001 % à 10 % en poids, d’un extrait selon l’invention (exprimés en poids d’extrait sec par rapport au poids total de la composition) et entre 70 % et 99.999 % en poids, avantageusement entre 90 % et 99.999 % en poids, d’un mélange eau/solvant, par rapport au poids total de la composition, le ratio eau/solvant étant compris entre 50/50 et 0/100, avantageusement entre 30/70 et 10/90, plus avantageusement 20/80, et le solvant étant choisi parmi les glycols, la glycérine végétale et leurs mélanges, de préférence parmi les glycols d’origine végétale, et préférentiellement parmi le 1 ,3- propanediol. Selon cet aspect de l’invention, le solvant est en quantité efficace pour une action de stabilisation physique et microbiologique de la composition selon l’invention et notamment de l’extrait selon l’invention.
L’invention a également pour objet une composition comprenant un extrait riche en polyphenols des parties aériennes d’Ocimum sanctum selon l’invention, en tant que principe actif, et le cas échéant un excipient approprié. L’extrait selon l’invention est tel que défini dans les paragraphes ci-dessus concernant l’extrait en tant que tel et ceux concernant l’extrait susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’invention.
La composition est avantageusement cosmétique, pharmaceutique ou dermatologique. Ladite composition est de préférence formulée pour être administrée par voie topique externe.
Avantageusement, la composition selon l’invention comprend de 0,001 à 10 %, typiquement de 0,01 à 5 %, en poids d’extrait selon l’invention, le poids de l’extrait étant exprimé en extrait sec, par rapport au poids total de la composition.
La composition selon l’invention peut comprendre en outre un ou plusieurs autres principes actifs.
La composition selon l’invention peut être formulée sous la forme de différentes préparations adaptées à une administration topique et incluent notamment les crèmes, les émulsions, les laits, les pommades, les lotions, les huiles, les solutions aqueuses ou hydroalcooliques ou glycoliques, les poudres, les patchs, les sprays, les shampooings, les vernis ou tout autre produit pour application externe.
Selon sa nature (cosmétique, pharmaceutique ou dermatologique), la composition selon l’invention peut en outre comprendre au moins un excipient cosmétiquement, pharmaceutiquement ou dermatologiquement acceptable. Notamment, la composition selon la présente invention peut en outre comprendre au moins un adjuvant cosmétiquement, pharmaceutiquement ou dermatologiquement connu de l’homme du métier, choisi parmi les tensioactifs, les épaississants, les conservateurs, les parfums, les colorants, des filtres chimiques ou minéraux, les agents hydratants, les eaux thermales, etc. L’homme du métier sait adapter la formulation de la composition selon l’invention en utilisant ses connaissances générales.
Les posologies et les formes galéniques optimales des compositions selon l’invention peuvent être déterminées selon les critères généralement pris en compte dans l’établissement d’un traitement pharmacologique, dermatologique ou cosmétique adapté à un patient ou à un animal, comme par exemple l’âge ou le poids corporel du patient ou de l’animal, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, les effets secondaires constatés, le type de peau.
L’invention a aussi pour objet un extrait selon l’invention ou une composition selon l’invention pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter les troubles ou pathologies de la peau et/ou des muqueuses (gencives, parodontes, muqueuses génitales) et/ou des phanères (cheveux et ongles) immature(s), normale(s) ou mature(s)/âgée(s), avantageusement les réactions inflammatoires, les réactions d’oxydation, les désordres liés à des stress intrinsèques ou extrinsèques (tels que le stress psychologique, le stress lié à un état d’anxiété, le stress liés à des attaques radicalaires liées ou non à la pollution (notamment la pollution chimique ou atmosphérique) et/ou liées à l’exposition aux UV ou aux IR), les troubles de la barrière ou de l’homéostasie, le vieillissement, notamment le vieillissement chronologique et/ou actinique, la peau photosensibilisée, et/ou les agressions mécaniques ou thermiques. L’invention a aussi pour objet un extrait selon l’invention ou une composition selon l’invention pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter les troubles vasculaires, en particulier les rougeurs et les couperoses.
L’invention a aussi pour objet un extrait selon l’invention ou une composition selon l’invention pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter les déséquilibres et/ou les troubles liés au déséquilibre du microbiote de la peau et/ou des muqueuses (gencives, parodontes, muqueuses génitales) et/ou des phanères et/ou leurs annexes, immature(s), normale(s) ou mature(s)/âgée(s). En effet, l’extrait selon l’invention présente une activité protectrice de la peau et/ou des muqueuses (gencives, parodontes, muqueuses génitales) et/ou des phanères et/ou leurs annexes, immature(s), normale(s) ou mature(s)/âgée(s), à l’encontre des agressions mécaniques, microbiennes, thermiques et radicalaires. L’extrait selon l’invention agit pour la défense du microbiote et permet donc de lutter contre le déséquilibre microbiote. En outre, l’extrait selon l’invention permet de stimuler les défenses immunitaires de la peau et le système antioxydant cutané.
L’invention a également pour objet l’utilisation d’un extrait selon l’invention ou d’une composition selon l’invention pour la fabrication d’une composition cosmétique, pharmaceutique ou dermatologique pour prévenir et/ou traiter les troubles ou pathologies de la peau et/ou des muqueuses (gencives, parodontes, muqueuses génitales) et/ou des phanères (cheveux et ongles) immature(s), normale(s) ou mature(s)/âgée(s), avantageusement les réactions inflammatoires, les réactions d’oxydation, les désordres liés à des stress intrinsèques ou extrinsèques (tels que le stress psychologique, le stress lié à un état d’anxiété, le stress liés à des attaques radicalaires liées ou non à la pollution (notamment la pollution chimique ou atmosphérique) et/ou liées à l’exposition aux UV ou aux IR), les troubles de la barrière ou de l’homéostasie, le vieillissement, notamment le vieillissement chronologique et/ou actinique, la peau photosensibilisée, et/ou les agressions mécaniques ou thermiques.
L’invention a aussi pour objet l’utilisation d’un extrait selon l’invention ou d’une composition selon l’invention pour la fabrication d’une composition pharmaceutique, cosmétique ou dermatologique pour prévenir et/ou traiter les troubles vasculaires, en particulier les rougeurs et les couperoses.
L’invention a aussi pour objet l’utilisation d’un extrait selon l’invention ou d’une composition selon l’invention pour la fabrication d’une composition pharmaceutique, cosmétique ou dermatologique pour prévenir et/ou traiter les déséquilibres et/ou les troubles liés au déséquilibre du microbiote de la peau et/ou des muqueuses (gencives, parodontes, muqueuses génitales) et/ou des phanères et/ou leurs annexes, immature(s), normale(s) ou mature(s)/âgée(s).
L’invention a en outre pour objet une méthode pour prévenir et/ou traiter les troubles ou pathologies de la peau et/ou des muqueuses (gencives, parodontes, muqueuses génitales) et/ou des phanères (cheveux et ongles) immature(s), normale(s) ou mature(s)/âgée(s), avantageusement les réactions inflammatoires, les réactions d’oxydation, les désordres liés à des stress intrinsèques ou extrinsèques (tels que le stress psychologique, le stress lié à un état d’anxiété, le stress liés à des attaques radicalaires liées ou non à la pollution (notamment la pollution chimique ou atmosphérique) et/ou liées à l’exposition aux UV ou aux IR), les troubles de la barrière ou de l’homéostasie, le vieillissement, notamment le vieillissement chronologique et/ou actinique, la peau photosensibilisée, et/ou les agressions mécaniques ou thermiques, comprenant l’administration, notamment l’administration topique, d’une quantité efficace d’un extrait selon l’invention ou d’une composition selon l’invention, à un sujet en ayant besoin.
L’invention a aussi pour objet une méthode pour prévenir et/ou traiter les troubles vasculaires, en particulier les rougeurs et les couperoses, comprenant l’administration, notamment l’administration topique, d’une quantité efficace d’un extrait selon l’invention ou d’une composition selon l’invention, à un sujet en ayant besoin.
L’invention a aussi pour objet une méthode pour prévenir et/ou traiter pour prévenir et/ou traiter les déséquilibres et/ou les troubles liés au déséquilibre du microbiote de la peau et/ou des muqueuses (gencives, parodontes, muqueuses génitales) et/ou des phanères et/ou leurs annexes, immature(s), normale(s) ou mature(s)/âgée(s), comprenant l’administration, notamment l’administration topique, d’une quantité efficace d’un extrait selon l’invention ou d’une composition selon l’invention, à un sujet en ayant besoin.
En particulier, la composition ou l’extrait selon l’invention est destiné(e) à la prévention et/ou au traitement des réactions ou pathologies inflammatoires, irritatives ou des troubles de la barrière ou de l’homéostasie de la peau, des phanères (cheveux et ongles) et/ou des muqueuses (gencives, parodontes, muqueuses génitales) immature(s), normale(s) ou mature(s)/âgée(s).
Avantageusement, les réactions, troubles ou pathologies inflammatoires, irritatives ou des troubles de la barrière ou de l’homéostasie de la peau sont : l’acné, la rosacée ou érythrocouperose, les troubles vasculaires, en particulier les rougeurs et les couperoses, la dermite du siège, la dermatite atopique, l’eczéma, la dermatite de contact, la dermatite irritative, la dermatite allergique, la dermite séborrhéique (croûte de lait), la peau sensible, la peau réactive, la peau sèche (xérose), la peau déshydratée, la peau avec rougeur, l’érythème cutané, la peau âgée ou photo âgée, la peau photosensibilisée, la peau pigmentée (mélasma, pigmentation postinflammatoire...), la peau avec vergetures, les coups de soleil, les irritations par agents chimiques, physiques (par exemple contrainte de tension pour les femmes enceintes), bactériologiques, fongiques, le vieillissement cutanée, notamment du photo vieillissement et les désordres liés à des attaques radicalaires liées à la pollution chimique ou atmosphérique, et/ou liées à l’exposition aux UV ou aux IR.
Avantageusement, les réactions, troubles ou pathologies inflammatoires, irritatives ou des troubles de la barrière ou de l’homéostasie des muqueuses sont les gingivites (gencives sensibles des nouveaux nés, problèmes d’hygiène, dus au tabagisme ou autres), et les irritations des sphères génitales mâles ou femelles externes ou internes.
Avantageusement, les réactions, troubles ou pathologies inflammatoires, irritatives ou des troubles de la barrière ou de l’homéostasie des phanères sont les ongles cassants, les ongles fragiles, les cheveux fragilisés, les cheveux cassants, les cheveux secs, l’alopécie, les dermites séborrhéiques, et les dermites folliculites.
De manière particulièrement avantageuse, la composition ou l’extrait selon l’invention est destiné(e) comme anti-âge, contre le vieillissement cutané, en particulier chronologique et actinique, par exemple lié à l’exposition solaire ou à des phénomènes d’inflammation, ou encore pour agir sur les peaux irritées.
Dans un mode de réalisation préféré, l’extrait selon l’invention est utilisé pour prévenir et/ou traiter :
- les troubles ou pathologies de la peau et/ou des muqueuses et/ou des phanères, avantageusement les réactions inflammatoires, les désordres liés à des stress intrinsèques ou extrinsèques, tels que le stress psychologique, le stress lié à un état d’anxiété, le stress liés à des attaques radicalaires liées ou non à la pollution chimique ou atmosphérique, et/ou liées à l’exposition aux UV ou aux IR, avantageusement choisis parmi la peau sensible, la peau réactive et/ou les muqueuses réactives, la peau irritée, la peau inflammée , les troubles de la barrière ou de l’homéostasie, la peau photosensibilisée, les agressions mécaniques et/ou thermiques; et/ou
- les troubles vasculaires, de préférence les rougeurs ou les couperoses et/ou
- les déséquilibres du microbiote avantageusement choisis parmi la dermatite atopique, l’eczéma, le développement de mauvaises odeurs axillaires, la fragilisation de la barrière cutanée, l’acné, le psoriasis, l’hidradénite suppuré, les folliculites, les croûtes de lait, les pellicules, les démangeaisons notamment du cuir chevelu, les irritations, la candidose et la vaginose bactérienne et/ou pour son utilisation comme agent cicatrisant.
L’invention a également pour objet l’utilisation cosmétique d’un extrait selon l’invention ou d’une composition selon l’invention dans le traitement et /ou la prévention de la peau déshydratée ; la peau avec rougeur ; la peau âgée ; du vieillissement cutané.
L’invention a également pour objet l’utilisation cosmétique d’un extrait selon l’invention ou d’une composition selon l’invention pour le soin des phanères, notamment pour la prévention des ongles cassants ; des ongles fragiles ; des cheveux fragilisés ; des cheveux cassants ; et des cheveux secs.
L’invention concerne également un procédé de soin cosmétique de la peau et/ou des phanères et/ou des muqueuses, en vue d’améliorer leur état et/ou leur aspect, consistant à administrer une composition ou un extrait selon la présente invention ; en particulier en vue d’améliorer la fermeté, l’élasticité ou la tonicité de la peau, en vue de renforcer les propriétés mécaniques de la peau et des muqueuses, en particulier pour lutter contre la peau flétrie, molle, distendue et/ou affaissée, et/ou en vue de renforcer et/ou restaurer l’élasticité ou la fermeté de la peau, ou encore pour traiter les rides et ridules.
En particulier, l’invention concerne un procédé de soin cosmétique de la peau et/ou des muqueuses et/ou des phanères, en vue d’en prévenir les altérations de la barrière et sa déshydratation ou en vue d’hydrater la peau et/ou les muqueuses, consistant à appliquer sur la peau et/ou les phanères et/ou les muqueuses une composition ou un extrait selon la présente invention.
L’invention concerne également un procédé de soin cosmétique de la peau et/ou des phanères, en vue d’en prévenir le vieillissement consistant à appliquer sur la peau et/ou les phanères une composition ou un extrait selon la présente invention.
L’invention concerne également l’utilisation cosmétique d’une composition ou d’un extrait ou d’une composition selon l’invention pour hydrater la peau et/ou les muqueuses, pour agir sur l’élasticité ou la fermeté de la peau, en particulier comme agent tenseur ou anti-rides, pour agir sur les peaux sensibles.
En particulier, l’invention concerne l’utilisation cosmétique d’une composition ou d’un extrait selon l’invention dans le traitement et /ou la prévention de la peau déshydratée ; la peau avec rougeur ; la peau âgée ; l’homogénéité du teint ; la réduction des tâches sur la peau ou le vieillissement cutané, notamment le vieillissement chronologique et/ou actinique.
Les utilisations cosmétiques et procédés de soin cosmétique selon la présente invention sont typiquement réalisés sur des peux saines ou des parties saines du corps et ne sont pas thérapeutiques.
Description des Figures
Fig. 1 : la figure 1 décrit la Mesure de la production de NO par des kératinocytes soumis à un stress au cortisol.
Fig. 2 : la figure 2 décrit les effets de l’extrait de basilic sacré sur la bioénergétique cellulaire dans des fibroblastes soumis à un stress polluant, en particulier les effets sur la consommation d’oxygène FIG. 2A, la production ATP FIG. 2B, la production de lactate FIG. 2C et le ratio NAD/NADH FIG. 2D (*p<0.05 ; ** p<0.01 vs contrôle non traité ; #p<0.05 ; ##p<0.01 vs polluant). Fig. 3 : la figure 3 décrite le pourcentage de mitochondries endommagées par cellules (%) (###p<0.0001 vs polluant).
Fig. 4 : la figure 4 démontre la densité lysosomale (intensité / pm2) (*** p<0.0001 vs contrôle ; #p<0.05 ; ###p<0.0001 vs polluant).
Fig. 5 : Mitophagie (% de lysosomes co-localisés à des mitochondries endommagées) (*** p<0.0001 vs contrôle ; ###p<0.0001 vs polluant).
Fig. 6 : la figure 6 démontre le pourcentage de migration des fibroblastes entre TO et T40h. Exemple 1 : extrait selon l’invention
Un extrait de basilic sacré est obtenu selon le procédé suivant : a) mise en solution de 10% (p/p) des parties aériennes d’Ocimum sanctum - variété pourpre - broyées dans un mélange eau /propanediol 40/60 p/p b) extraction 2h à 60 °C c) séparation solide/ liquide par filtrations successives.
L’extrait liquide riche en polyphénols ainsi obtenu présente les caractéristiques suivantes (% en poids de molécules /extrait sec de l’extrait obtenu) :
• Extrait sec (2 h, 105 °C, étuve ventilée) : 1 ,0 %
• Polyphénols totaux : 11 ,4 %
• Flavonoïdes : 3,6 %
• Dérivés hydroxycinnamiques : 7,6%
Exemple 2 : extrait selon l’invention
Un extrait de basilic sacré est obtenu selon le procédé suivant : a) mise en solution de 10% (p/p) des parties aériennes d’Ocimum sanctum - variété verte - broyées dans un mélange eau /propanediol 40/60 p/p b) extraction 3h à 60° C c) séparation solide/ liquide par filtrations successives.
L’extrait liquide riche en polyphénols ainsi obtenu présente les caractéristiques suivantes (% en poids de molécules /extrait sec de l’extrait obtenu) :
• Extrait sec (2 h, 105 °C, étuve ventilée) : 1 ,4 %
• Polyphénols totaux (détermination par la méthode de Folin Ciocalteu) : 16 %
• Flavonoïdes : 3,5 %
• Dérivés hydroxycinnamiques : 20 %.
Exemple 3 : Tests d’activités biologiques de l’extrait selon l’invention
A. Activité anti-oxydante
A.1. Effet anti-oxydant
A. 1.1 Activité sur la production de ROS induits par H2O2 dans des kératinocytes humains normaux L’activité anti-oxydante de l’extrait de basilic sacré a été recherchée en évaluant la quantité de ROS (Reactive Oxygen Species, ou ERO Espèces Réactives de l’Oxygène) produits par des kératinocytes soumis à un stress oxydatif induit par H2O2. a. Matériel et méthode
Des kératinocytes humains normaux ont été traités pendant 24 heures par six concentrations de l’extrait de basilic sacré obtenu selon l’exemple 1 (0,00032% à 0,01% ms) ou les molécules de référence anti-oxydantes : Quercétine à 10 pM ou Vitamine C à 500 pM, avant incorporation de la sonde H2DCF-DA.
Les kératinocytes ont ensuite été stimulés par du peroxyde d’hydrogène (H2O2) à 100 pM pendant 20 minutes.
La production de ROS a été évaluée par mesure de la fluorescence émise par la sonde au contact des ROS.
Les résultats ont été analysés statistiquement par une ANOVA à un facteur, suivie d’un test de Tukey. b. Résultats
Les résultats sont regroupés dans le tableau 2. L’extrait de basilic sacré a significativement, et de façon dose-dépendante, inhibé la production de ROS par des kératinocytes en réponse à un stress oxydant induit par H2O2 ; il présente donc une activité anti-oxydante.
Tableau 2 : Production de ROS par des kératinocytes soumis à un stress H2O2
Figure imgf000016_0001
A. 1.2. Activité sur ta production de ROS induits par les UVA sur des épidermes humains reconstruits
L’effet protecteur vis-à-vis d’un stress oxydatif induit par une irradiation aux UVA a été étudié par dosage des ROS sur des épidermes humains reconstruits. a. Matériel et méthode
Des épidermes humains reconstruits ont été pré-traités par une formulation contenant 3% d’extrait de basilic obtenu selon l’exemple 1 ou son placebo pendant 24 heures. Les épidermes ont ensuite été irradiés par 30J/cm2 d’UVA.
La production de ROS a été évaluée par mesure de fluorescence émise par la sonde H2DCF-DA au contact des ROS. b. Résultats
Les résultats sont regroupés dans le tableau 3. L’extrait de basilic sacré en formulation à 3% a inhibé la production de ROS induite par les UVA, ce qui démontre un effet protecteur vis-à-vis d’un stress oxydatif induit par une irradiation aux UVA.
Tableau 3 : Production de ROS dans des épidermes reconstruits irradiés aux UVA
Figure imgf000017_0001
1.3. Activité sur la production de ROS induits par la ménadione dans des kératinocytes et des fibroblastes humains normaux
L’activité anti-oxydante de l’extrait de basilic sacré a été recherchée en évaluant la quantité de ROS produits par des kératinocytes ou des fibroblastes soumis à un stress oxydatif induit par la ménadione. a. Matériel et méthode
Des kératinocytes humains normaux, d’une part, et des fibroblastes humains normaux, d’autre part, ont été traités pendant 24 heures par l’extrait de basilic sacré à 0,001% et 0,005% de matière sèche (ms) obtenu selon l’exemple 1 ou par le N-Acetyl Cystéine à 10 mM (NAC), molécule scavenger de ROS utilisée comme référence anti-oxydante. Le stress oxydatif a alors été induit par incubation 1 h en présence de ménadione à 50 ou 20 pM (2-méthyl-1 ,4-naphtoquinone).
Les ROS ont été marqués par la sonde CellRox® ; la fluorescence intracellulaire, proportionnelle à la quantité de ROS a été mesurée.
Les résultats ont été analysés statistiquement par une ANOVA à un facteur, suivie d’un test de Dunnett. b. Résultats
Les résultats sont regroupés dans les tableaux 4 et 5. L’extrait de basilic sacré a significativement inhibé la production de ROS induit par un stress à la ménadione dans des kératinocytes (Tab.4) et des fibroblastes (Tab.5), confirmant son activité anti-oxydante.
Tableau 4 : Production de ROS par des kératinocytes soumis à un stress à la Ménadione
Figure imgf000018_0001
Tableau 5 : Production de ROS par des fibroblastes soumis à un stress à la Ménadione
Figure imgf000018_0002
A.2. Inhibition de la peroxydation lipidique
Les ROS sont les principaux activateurs de la péroxydation lipidique, ayant pour cibles principales les lipides polyinsaturés liés à la membrane cellulaire. L’activité anti-peroxydation lipidique de l’extrait de basilic sacré a été recherchée dans des kératinocytes ou des fibroblastes soumis à un stress oxydatif induit par l’hydroperoxyde de cumène. a. Matériel et méthode
Des kératinocytes humains normaux, d’une part, et des fibroblastes humains normaux, d’autre part, ont été traités pendant 24 heures par l’extrait de basilic sacré à 0,001% et 0,005% ms obtenu selon l’exemple 1 ou par la référence anti-oxydante, vitamine E à 200pM. Le stress oxydatif a alors été induit par incubation 1 h en présence d’hydroperoxyde de cumène à 200 ou 50pM.
Les peroxydes lipidiques ont été révélés par marquage à l’aide de la sonde BODIPY® 581 /591 C11 ; la fluorescence intracellulaire a été mesurée.
Les résultats ont été analysés statistiquement par une ANOVA à un facteur, suivie d’un test de Tukey. b. Résultats
Les résultats ont été regroupés dans les tableaux 6 et 7. L’extrait de basilic sacré a significativement inhibé la peroxydation des lipides induite par un stress oxydatif dans des kératinocytes (tab.6) et des fibroblastes (tab.7), confirmant son activité anti-oxydante.
Tableau 6 : Quantification de la peroxydation lipidique dans des kératinocytes soumis à un stress à l’ hydroperoxyde de cumène
Figure imgf000019_0001
Tableau 7 : Quantification de la peroxydation lipidique dans des fibroblastes soumis à un stress à l’ hydroperoxyde de cumène
Figure imgf000019_0002
A.3. Effet sur les défenses anti-oxydantes
Le glutathion (GSH) est le principal peptide anti-oxydant endogène capable de neutraliser les ROS. Une déplétion intra-cellulaire en GSH est responsable des dommages induits par le stress oxydatif, associés à une toxicité mitochondriale.
L’effet de l’extrait de basilic sacré sur le stock de glutathion intracellulaire a été évalué dans des fibroblastes soumis à un stress oxydatif induit par la ménadione. a. Matériel et méthode
Des fibroblastes humains normaux ont été traités pendant 24 heures par l’extrait de basilic sacré à 0,001% et 0,005% ms obtenu selon l’exemple 1 ou par la référence anti-oxydante, MAC à 10 mM. Le stress oxydatif a alors été induit par incubation 4h en présence de ménadione à 25 pM.
Le stock en GSH a été suivi à l’aide de la sonde fluorescente Monochlorobimane (Mbi) ; la fluorescence intracellulaire, proportionnelle à la quantité de GSH, a été mesurée. b. Résultats
Les résultats ont été regroupés dans le tableau 8. L’extrait de basilic sacré a restauré le stock de glutathion intracellulaire dépiété sous l’effet du stress oxydatif induit par la ménadione de manière plus significative que la référence anti-oxydante (NAC à 10 mM), ce résultat confirme l’activité anti-oxydante de l’extrait.
Tableau 8 : Evolution du contenu en glutathion (GSH) dans des fibroblastes soumis à un stress à la
Ménadione
Figure imgf000020_0001
A.4. Conclusion
L’ensemble de ces résultats montrent l’activité anti-oxydante de l’extrait de basilic sacré.
B. Activité anti -inflammatoire
L’activité anti-inflammatoire de l’extrait de basilic sacré a été recherchée par dosage de l’interleukine 8 (IL8) produite par des kératinocytes en réponse à un stress pro-inflammatoire induit par le PMA. a. Matériel et méthode
Des kératinocytes humains normaux ont été pré-incubés pendant 24 heures en présence de l’extrait de basilic sacré obtenu selon l’exemple 1 à 0,001%, 0,005% ou 0,01% ms ou de dexaméthasone à 0,1 pM, référence anti-inflammatoire. Les cellules ont ensuite été stimulées par traitement 24 heures en présence 10 pg/mL de PMA (Phorbol-Myristate-Acetate). A l’issue du traitement, l’IL8 produite a été quantifiée par dosage ELISA dans les surnageants de culture.
Les résultats ont été analysés statistiquement par un test t de Student. b. Résultats
Les résultats ont été regroupés dans le tableau 9. L’extrait de basilic sacré a significativement inhibé la production d’IL8 induite par le PMA dans les kératinocytes, parfois de manière plus significative que la référence dexaméthasone ; il présente donc une activité anti-inflammatoire.
Tableau 9 : Dosage de l’interleukine 8 produite par des kératinocytes soumis à un stress inflammatoire induit par le PMA
Figure imgf000021_0001
C. Activité anti-âge
Le vieillissement cutané se caractérise par une altération de la matrice dermique avec, notamment, une diminution de la qualité et quantité des fibres matricielles, principalement collagène et élastine.
L’activité anti-âge du basilic sacré a été évaluée par sa capacité à stimuler l’expression et la production de marqueurs de la matrice dermique en conditions standards et dans des conditions de stress inflammatoire modélisant l’inflammation chronique, également appelée l’« inflamm’aging » ou inflammation bas grade.
C.1. Effet sur la matrice dermique
L’effet de l’extrait de basilic sacré sur l’expression de marqueurs de la matrice dermique a été évalué sur des fibroblastes dermiques humains normaux en culture ou sur des peaux humaines reconstruites. C .1 .1 Stimulation de l’expression génique de marqueurs de la matrice dermique dans des fibroblastes humains normaux a. Matériel et méthode
Des fibroblastes dermiques humains normaux ont été incubés pendant 48 heures en présence de l’extrait de basilic sacré obtenu selon l’exemple 1 à 0,001% et 0,005% ms ou de TGFB1 à 5ng/mL, référence positive du test.
L’expression génique du Collagène I, de l’Elastine, de la Dermatopontine et de la MMP1 (Matrix- Metalloproteinase- 1 ) a été évaluée par PCR quantitative en temps réel.
Les résultats ont été analysés statistiquement par une analyse de variance à un facteur (ANOVA), suivie d’un post-test de Dunnett. b. Résultats
Les résultats ont été regroupés dans le tableau 10. L’extrait de basilic sacré a significativement stimulé l’expression génique du collagène I, de l’élastine et de la dermatopontine, marqueurs clés impliqués dans la densité de la matrice dermique. De plus, l’extrait a significativement inhibé l’expression génique de la MMP1 , enzyme impliquée dans la dégradation de la matrice dermique.
Ces résultats démontrent une densification de la matrice dermique et ainsi une activité antivieillissement cutané.
Tableau 10 : Expression génique de marqueurs de la matrice dermique dans des fibroblastes
Figure imgf000023_0001
C.1 .2 Stimulation de l’expression protéique de marqueurs de la matrice dermique dans des fibroblastes humains normaux a. Matériel et méthode
Des fibroblastes dermiques humains ont été traités pendant 48 heures par l’extrait de basilic sacré obtenu selon l’exemple 1 à 0,001% et 0,005% ms ou par un mélange Vitamine C à 10pM et TGFB à 5 ng/mL, utilisé comme référence positive.
La production de collagène I a été évaluée par marquage en immunofluorescence et analyse d’image. b. Résultats
Les résultats ont été regroupés dans le tableau 11 . L’extrait de basilic sacré a significativement stimulé le marquage de collagène I dans des fibroblastes. Ce résultat confirme l’activité de l’extrait sur la densification de la matrice dermique.
Tableau 11 : Production de Collagène I par des fibroblastes
Figure imgf000024_0001
C .1 .3 Stimulation de l’expression protéique de marqueurs de la matrice dermique dans des fibroblastes humains normaux a. Matériel et méthode
Une formulation (crème) contenant 3% d’extrait de basilic sacré obtenu selon l’exemple 1 , ou son placébo, ont été appliqués en surface de peaux humaines reconstruites. Après 24 heures d’incubation, l’expression génique de marqueurs d’intérêt pour leurs bénéfices dermiques a été évaluée par PCR quantitative en temps réel. b. Résultats
Les résultats ont été regroupés dans le tableau 12. L’extrait de basilic sacré a significativement augmenté l’expression des gènes CLN3 et PXN dans des peaux reconstruites.
CLN3 code pour une protéine transmembranaire lysosomale/endosomale (ceroid-lipofuscinosis neuronal 3) impliquée dans la régulation du processus d’autophagie. L’autophagie est un processus intracellulaire de détoxification permettant la dégradation et le recyclage de protéines et organites endommagés. Ce processus est indispensable pour le maintien du fonctionnement et de l’homéostasie cellulaires. La stimulation de l’autophagie présente un intérêt pour ralentir le vieillissement et allonger la durée de vie des cellules.
PXN code pour une molécule d’adhésion focale (paxillin), dont l’expression diminue avec l’âge et représente donc une cible pour une action anti-âge. En raison de son rôle crucial dans les connections cellule-matrice et la mécanotransduction entre le fibroblaste et sa matrice, la perte de paxilline avec l’âge pourrait compromettre le fonctionnement cellulaire, résultant dans l’apparition ou l’aggravation de vieillissement cutané. L’induction de son expression pourrait contribuer à restaurer la perte de collagène et de contractilité du derme liées à l’âge.
Tableau 12 : Gènes modulés significativement par la formulation à 3% d’extrait de basilic sacré comparativement au placébo (fixé à 1 .00)
Figure imgf000025_0001
C.2. Effet dans un modèle d’Inflamm’aglng
Avec l’âge, une inflammation bas grade, silencieuse mais chronique peut s’installer au sein des tissus cutanés. Celle-ci est la conséquence des expositions à des stress externes cumulées au cours de la vie. Cette inflammation se traduit par le relargage de cytokines inflammatoires (IL1 , IL6, TNF, CRP...), capables de générer des dommages tissulaires et la production d’espèces réactives de l’oxygène, favorisant ainsi l’accélération du processus de vieillissement cutané. Ce phénomène de vieillissement cutané lié à un processus inflammatoire est nommé Inflamm’aglng.
L’extrait de basilic sacré a été évalué dans un modèle in vitro reproduisant le processus d’inflammaging : une inflammation, représentée par la stimulation de la production d’ILIa, est induite sur des épidermes reconstruits. Les milieux conditionnés de ces épidermes reconstruits sont ensuite appliqués sur des fibroblastes et l’expression de marqueurs dermiques, altérés par I’ IL1 a produit par les épidermes, est évaluée. a. Matériel et méthode
Des épidermes reconstruits ont été traités en topique par une formulation (crème) contenant 3% d’extrait de basilic sacré obtenu selon l’exemple 1 ou son placébo, ou en systémique par la dexaméthasone à 1 pM, référence anti-inflammatoire. Après 24 heures de pré-incubation, les épidermes ont été stimulés par 0,5pg/mL de PMA et incubés de nouveau pour 24 heures.
Les sousnageants de culture ont été collectés, un dosage d’ILIa a été réalisé d’une part et, d’autre part, ces sousnageants (milieux conditionnés) ont été déposés sur des cultures de fibroblastes dermiques humains normaux.
Après 24 heures d’incubation des fibroblastes en présence des milieux conditionnés, l’expression de marqueurs d’intérêt a été évaluée par PCR quantitative en temps réel.
Les résultats ont été analysés statistiquement à l’aide d’une ANOVA suivie d’un test de Tukey. b. Résultats
Les résultats ont été regroupés dans les tableaux 13 et 14. L’extrait de basilic sacré, formulé à 3%, a significativement inhibé le relargage d’ILIa induit par le PMA sur des épidermes reconstruits (tab.13). Cet effet est significativement plus élevé que celui du placébo. L’application sur les cultures de fibroblastes des milieux conditionnés, des épidermes reconstruits stimulés par le PMA, a induit des variations d’expression génique de marqueurs inflammatoires, du stress oxydant, de synthèse et de dégradation de la matrice dermique (tab. 14). Ces résultats valident le modèle d’lnflamm’aging.
Dans ces conditions, l’extrait de basilic sacré a modulé la surexpression des cytokines et chimiokines (CXCL1 , ILS, IL6, CCL2), de marqueurs du stress oxydatif (MT1G, SOD2), des enzymes de dégradation de la matrice (MMP1 , MMP3) et de l’ICAMI . L’extrait a également permis de restaurer l’expression des marqueurs de l’assemblage de la matrice (HAS2, DPT).
Ces résultats montrent la capacité de l’extrait de basilic sacré à moduler le processus d’lnflamm’aging.
Tableau 13 : Dosage de l’IL1 a produit par des épidermes reconstruits stimulés par le PMA
Figure imgf000026_0001
Tableau 14 : Gènes modulés par la formule à 3% de Basilic sacré dans le modèle d’lnflamm’aging : expression génique dans les fibroblastes incubés en présence des milieux conditionnés (Niveau d’expression en quantité relative ; % d’évolution par rapport au PMA)
Figure imgf000027_0001
D. Activité de défense contre différents stress
La peau est quotidiennement exposée à différents types de stress exogènes et/ou endogènes, susceptibles d’en altérer le fonctionnement et la qualité, et pouvant à terme conduire à des dommages irréversibles.
L’effet protecteur de l’extrait de basilic sacré a été évalué dans différents modèles représentatifs de différents stress externes (pollution) ou internes (stress psychologique).
D.1 . Protection contre les dommages cutanés liés au stress psychologique
L’oxyde nitrique (N0) est une espèce réactive impliquée dans la régulation de l’homéostasie cutanée. Cette molécule très instable est synthétisée et relarguée par de nombreux types cellulaires pour réguler des réactions physiologiques et homéostatiques, telles que la mélanogénèse, la cicatrisation, la régulation de l’inflammation, l’immunomodulation, la vasodilatation...
Alors que de faibles niveaux de NO sont importants pour la signalisation cellulaire, le relargage de fortes quantités de NO est généralement associé à un stress oxydatif.
Le stress psychologique se caractérise par une activation de l’axe hypothalamo-pituitaire- adrénalien (HPA), reliant les systèmes nerveux central et endocrinien, qui se caractérise par l’augmentation de glucocorticoïdes endogènes, tels que le cortisol. De nombreuses études ont décrit les effets négatifs du stress psychologique sur l’homéostasie cutanée, conduisant à une altération des réponses immune et inflammatoire. La réponse inflammatoire inclue l’activation de radicaux libres, parmi lesquels, le NO.
L’extrait de basilic sacré a été évalué dans un modèle reproduisant l’effet du stress psychologique (désordre émotionnel / anxiété) sur la peau par traitement de kératinocytes par du cortisol et quantification du NO comme biomarqueur du stress induit. a. Matériel et méthode
La production de NO par des kératinocytes épidermiques humains normaux a été mesurée par ampérométrie en continu, pendant 10 minutes, après traitement par du cortisol à 1 pM en présence de l’extrait de basilic sacré obtenu selon l’exemple 1 à 0,001% et 0,005% ms ou d’acide ascorbique (AA) à 1 mM (référence positive). b. Résultats
Les résultats apparaissent dans la Figure 1 . L’extrait de basilic sacré a significativement inhibé la production de NO induite dans des kératinocytes par un stress au cortisol. L’extrait permet donc de contrebalancer les effets néfastes d’un stress émotionnel / psychologique sur l’homéostasie cutanée.
D.2. Protection contre les dommages à l’ADN
Les polluants atmosphériques ont des effets négatifs sur de nombreux tissus, dont la peau. L’exposition répétée à des polluants peut contribuer notamment au vieillissement prématuré, à la dépigmentation ou à des dommages à l’ADN.
L’effet protecteur de l’extrait de basilic sacré a été évalué sur les dommages ADN (cassures doubles brins) induits dans des kératinocytes par un stress polluant. a. Matériel et méthode
Des kératinocytes épidermiques humains normaux ont été pré-incubés pendant 24 heures en présence de l’extrait de basilic sacré obtenu dans l’exemple 1 à 0,001% et 0,005% ms ou de la référence nicotinamide, avant exposition 1 heure à la camptothecine. La camptothécine est un composé génotoxique, inhibiteur de toposiomérase I, utilisé pour l’induction de cassures doubles brins de l’ADN.
Les cassures double brin ont été détectées par immunomarquage de yH2AX (phosphorylation de l’histone H2AX qui intervient précocement en réponse à des cassures double brin) et quantifiées par analyse d’image.
Les résultats ont été analysés statistiquement à l’aide d’une ANOVA suivie d’un test de Tukey. b. Résultats
Les résultats sont regroupés dans le tableau 15. L’extrait de basilic sacré a significativement inhibé les cassures de l’ADN double brin induites par le traitement à la camptothecine. L’extrait présente donc une activité protectrice vis-à-vis d’un stress polluant génotoxique.
Tableau 15 : Expression de yH2AX dans des kératinocytes en présence d’un stress par la camptothecine
Figure imgf000029_0001
D.3. Protection du fonctionnement mitochondrial face à un stress polluant
L’effet protecteur de l’extrait de basilic sacré vis-à-vis d’une pollution urbaine a été recherché dans des fibroblastes humains normaux. Les cellules ont été exposées au polluant urbain en présence de l’extrait, la bioénergétique cellulaire a été analysée par la technologie BBS+, ainsi que l’occurrence de l’autophagie/mitophagie.
L’altération du fonctionnement mitochondrial joue un rôle central dans le processus de vieillissement ; 90% de la production de ROS liés à l’âge est d’origine mitochondriale.
Les facteurs environnementaux (UV, Pollution) peuvent ralentir le fonctionnement cellulaire et augmenter le stress oxydatif, contribuant au vieillissement prématuré.
Les ROS intracellulaires sont principalement formés par dysfonctionnement de la chaîne mitochondriale de transfert des électrons.
L’ADN mitochondrial est particulièrement sensible aux ROS, avec pour conséquences, les phénomènes suivants qui contribuent in fine au processus de vieillissement : diminution de la production énergétique, augmentation du stress oxydatif, augmentation des fonctions mitochondriales.
D.3.1 Etude de la bioénerqétique cellulaire a. Matériel et méthode Des fibroblastes dermiques humains normaux ont été incubés pendant 120 minutes en présence du mélange de polluants urbains à 0,1% et de l’extrait de basilic sacré obtenu dans l’exemple 1 à 0,001% et 0,005% ms.
La bioénergétique cellulaire a été évaluée par la méthode BBS+ (Bioenergetic Balance Screen Plus) qui consiste en une quantification multiplexée de la consommation de dioxygène, de la production d’ATP, du niveau de lactate extracellulaire et du ratio NAD+/NADH.
Les résultats ont été analysés statistiquement par un test t de Student. b. Résultats
Les résultats apparaissent à la Figure 2. L’exposition des cellules aux polluants urbains a induit une altération de la chaîne respiratoire de transport des électrons se traduisant par une diminution de la consommation d’oxygène et du niveau d’ATP.
Dans ces conditions, l’extrait de basilic sacré a augmenté de façon dose-dépendante le taux de consommation d’oxygène, tout en stimulant la production d’ATP. Ces observations démontrent un effet direct de l’extrait sur la stimulation et la normalisation du fonctionnement du cycle de Krebs et de la production d’énergie. L’extrait a également une capacité à résoudre l’altération de la chaîne respiratoire mitochondriale induite par le polluant. Enfin, la diminution de la production de lactate par l’extrait montre que celui-ci permet de réduire la contribution de la glycolyse de novo dans la production d’ATP, tout en réengageant l’activité de la chaîne respiratoire dans la bioénergétique cellulaire.
L’extrait de basilic sacré permet ainsi de normaliser la balance énergétique altérée par le stress polluant.
D.3.2 Etude de l’autophagie ! mitophaqie a. Matériel et méthode
Des fibroblastes dermiques humains normaux ont été incubés pendant 120 minutes en présence du mélange de polluants urbains à 0,1% et de l’extrait de basilic sacré obtenu dans l’exemple 1 à 0,001% et 0,005% ms.
L’analyse de l’autophagie et de la mitophagie a été évaluée via un marqueur lysosomal et un colorant spécifique des mitochondries endommagées : Les mitochondries endommagées ont été visualisées par une fluorescence rouge produite par réaction d’un fluorochrome lié par liaison covalente à la membrane mitochondriale qui émet quand des dommages à la membrane mitochondriale ont lieu. Un colorant lysosomal a été utilisé pour marquer les lysosomes et évaluer la colocalisation des mitochondries endommagées aux lysosomes.
Trois paramètres ont été analysés : - le pourcentage de mitochondries endommagées par cellules ;
- la densité de lysosomes par cellules (indice lysosomal représentatif de l’autophagie) ;
- le pourcentage de lysosomes incluant des litochondries endommagées (indice mitophagique représentatif de la mitophagie).
Les résultats ont été analysés statistiquement par un test t de Student. b. Résultats
Les résultats sont regroupés dans les Figures 3, 4 et 5. L’exposition des cellules aux polluants urbains a augmenté le nombre de mitochondries endommagées. L’extrait de basilic sacré a très fortement et significativement inhibé la quantité de mitochondries endommagées (fig.3).
Au cours de la macro-autophagie, des autophagosomes se forment pour véhiculer les membranes mitochondriales endommagées recyclées vers le compartiment lysosomal. Le stress polluant a significativement augmenté la densité de lysosomes par cellules, montrant une augmentation du processus d’autophagie. L’extrait de basilic sacré a réduit et normalisé la densité lysosomale (fig.4).
La mitophagie est représentée par le pourcentage de lysosomes co-localisés avec un signal de mitochondries endommagées. La pollution a augmenté la fréquence de lysosomes contenant des mitochondries endommagées, démontrant une augmentation du processus de mitophagie. La pollution augmente le stress mitochondrial et au niveau du réticulum endoplasmique, tous deux inducteurs de dommages à la membrane mitochondriale. L’augmentation de la mitophagie observée sous l’effet du stress est liée aux cellules essayant d’éliminer les mitochondries endommagées et/ou les protéines ou lipides malformés. L’extrait de basilic sacré a réduit et normalisé la mitophagie induite par le stress polluant (fig.5).
Au global, l’extrait de basilic sacré a renversé l’effet de la pollution sur l’altération des mitochondries et a normalisé les processus d’autophagie et de mitophagie. Ces résultats montrent une activité protectrice du réseau mitochondrial vis-à-vis d’un stress externe.
E. Activité pro-cicatrisante
L’activité pro-cicatrisante de l’extrait de basilic sacré a été étudiée par évaluation de la migration de fibroblastes dans un modèle de « scratch-assay ». a. Matériel et méthode
Une éraflure mécanique a été réalisée sur un tapis confluent de fibroblastes dermiques humains normaux. Immédiatement après réalisation de la « cicatrice », l’extrait de basilic sacré obtenu dans l’exemple 1 à 0,001% et 0,005% ms ou le contrôle positif, insuline à 10"5M, ont été ajoutés au milieu de culture et la migration cellulaire suivie au cours du temps par marquage immunofluorescent des noyaux cellulaires. Le pourcentage de migration a été calculé. b. Résultats
Les résultats sont regroupés dans la Figure 6. L’extrait de basilic sacré à 0,005% a stimulé la migration de fibroblastes, indiquant l’activité pro-cicatrisante de l’extrait.
F. Activité hydratante
L’effet de l’extrait de basilic sacré a été évalué sur sa capacité à induire la production d’aquaporine 3 dans des kératinocytes.
L’hydratation est un critère important dans la prévention d’une altération de la fonction barrière de la peau. L’aquaporine 3 joue un rôle important pour préserver l’hydratation de la peau : cette protéine transmembranaire est impliquée dans le transport de l’eau et du glycérol dans les kératinocytes pour maintenir l’hydratation épidermique a. Matériel et méthode
Des kératinocytes épidermiques humains normaux ont été incubés pendant 24 heures en présence de l’extrait de basilic sacré obtenu dans l’exemple 1 à 0,001% et 0,005% ms ou de l’acide rétinoique, référence positive. L’expression d’aquaporine 3 a été évaluée par immunomarquage et quantifiée par analyse d’image. b. Résultats
Les résultats sont regroupés dans le tableau 16. L’extrait de basilic sacré à 0,001% ms a significativement augmenté l’expression d’aquaporine 3 dans des kératinocytes. Ce résultat révèle l’activité hydratante de l’extrait.
Tableau 16 : Production d’Aquaporine 3 dans des kératinocytes
Figure imgf000032_0001
G. Activité sur le microbiote cutané
L’effet de l’extrait de basilic sacré a été étudié sur différentes souches bactériennes représentatives du microbiote cutané, plus particulièrement sur leur capacité à former un biofilm. a. Matériel et méthodes
Souches bactériennes étudiées :
- Staphylococcus epidermidis MFP04 ;
- Staphylococcus aureus MFP03 ;
- Corynebacterium xerosis CIP 10065317 ATCC373 ;
- Micrococcus luteus 0116. a1. Etude de l’effet de l’extrait sur la croissance bactérienne
L’effet de l’extrait de basilic sacré obtenu dans l’exemple 1 dilué au 1 /50e sur la croissance des 6 modèles bactériens a été étudié par suivi de la croissance sous agitation en continue sur 24h (S. aureus, S. epidermidis) ou 48h ( M, luteus, C. xerosis), à l’aide d’un incubateur/lecteur de plaques multipuits. Les temps de génération des souches bactériennes ont été mesurés, en prenant comme référence la souche sauvage. Les différences statistiques ont été établies à l’aide du test Mann- Whitney. a2. Etude de l’effet sur la formation de biofilm
La production de biofilm des espèces bactériennes a été étudiée en plaque multipuits par la technique de coloration par le cristal violet. Les résultats ont été normalisés et exprimés en pourcentage en fonction de la valeur de formation de biofilm en milieu contrôle. Les différences statistiques sont établies à l’aide du test Mann-Whitney. b. Résultats
Les résultats sont regroupés dans les tableaux 17 et 18. L’extrait de basilic sacré augmente le temps de génération d’une souche pathogène (S. aureus), sans altération significative de la croissance de souches commensales (tab. 17).
Par ailleurs, l’extrait de basilic sacré a fortement et significativement altéré la capacité de S. aureus à former un biofilm (tab.18), sans altérer la capacité des autres souches étudiées à former un biofilm.
Ces résultats démontrent la capacité de l’extrait à préserver l’équilibre du microbiote cutané.
Tableau 17 : Effet de l’extrait de basilic sacré sur les temps de génération de différentes souches bactériennes
Figure imgf000034_0001
Tableau 18 : Effet de l’extrait de basilic sacré sur la formation de biofilm de différentes souches bactériennes
Figure imgf000034_0002
Exemple 4 : Étude clinique sur l’extrait selon l’invention
L’efficacité clinique anti-âge de l’extrait de basilic sacré selon la présente invention a été évaluée par une étude clinique in vivo. Pour cela, une formulation (crème) contenant 3% d’extrait de basilic sacré (ci-après dénommé actif) obtenu selon l’exemple 1 , ou son placébo, a été évaluée.
A. Protocole
L’étude a été réalisée en double aveugle, en comparatif (actif vs placebo). Les sujets ont appliqué la crème contenant l’extrait de basilic sacré (actif) ou le placebo (randomisation des sujets à l’inclusion) pendant 56 jours, 2 fois par jour (matin et soir).
La composition du placebo est la suivante :
Tableau 19 : Composition du placebo
Figure imgf000034_0003
Figure imgf000035_0002
Les critères d’inclusions définis pour les sujets recrutés sont :
• Sexe : féminin
Age : entre 40 et 60 ans
Phototype : I à III
Type : Caucasien
Sujet ayant des rides (patte d’oie, front)
Arrêt de toute application de produit cosmétique entre le J-6 et le J0.
L’évaluation de l’efficacité a été réalisée par les techniques suivantes (mesures à JO, J28 et J56)
Analyse d’image - Topographie
Mesure des propriétés biomécaniques de la peau Photographies en lumière polarisée croisée.
B. Évaluation de l’effet anti-âge sur les rides a. Résultats sur les rides de la patte d’oie
Les résultats obtenus à JO, J28 et J56 par analyse de topographie sont listés dans le tableau ci- dessous.
L’actif diminue significativement l’aire et la longueur de la ride détectée à J56 avec une différence significative par rapport au placebo.
Tableau 20 : résultats des mesures - rides de la patte d’oie
Figure imgf000035_0001
b. Résultats sur les rides du front
Les résultats obtenus à JO, J28 et J56 par analyse de topographie sont listés dans le tableau ci- dessous.
Sur la zone globale : l’actif améliore globalement significativement les rides du front à J28 et n’induit pas de variation à J56. Le placebo n’induit pas de variation significative à J28 et induit globalement une aggravation significative à J56. Globalement cela entraine des différences significatives en faveur de l’actif à J28 et J56 sur l’ensemble des paramètres topographiques évalués.
Tableau 21 : résultats des mesures - rides du front
Figure imgf000036_0001
d. Conclusion effet anti-rides
Les résultats montrent un effet anti-rides, significativement différent du placebo, de l’actif vis-à- vis des rides de la patte d’oie (amélioration de l’aire et de la longueur de la ride) et des rides du front (amélioration des paramètres topographiques). C. Évaluation de l'effet anti-âge sur les propriétés biomécaniques de la peau
Les résultats obtenus à JO, J28 et J56 par Cutométrie sont listés dans le tableau ci-dessous.
Tableau 22 : résultats du test de Cutométrie
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001
L’actif améliore la tonicité (Ur et Ua) à J56 alors que le placebo provoque une aggravation significative. La différence entre l’actif et le placebo est significative en faveur de l’actif pour les 2 paramètres.
L’actif améliore l’élasticité brute Ur/Uf à J56. La différence est significative par rapport au placebo qui provoque une aggravation.
L’actif améliore de manière significative l’élasticité biologique Ua/Uf à J28 et J56. La différence est significative par rapport au placebo à J56 qui provoque une aggravation.
L’actif améliore l’élasticité nette Ur/Ue à J56. La différence est significative par rapport au placebo à J56 qui provoque une aggravation.
L’actif améliore à J28 et de manière significative à J56 la récupération viscoélastique Q1. La différence est significative par rapport au placebo à J56 qui provoque une aggravation.
L’actif améliore la récupération élastique Q2 à J56. La différence est significative par rapport au placebo à J56 qui provoque une aggravation.
L’actif améliore de manière significative la récupération visqueuse Q3 à J28 et J56. La différence est significative par rapport au placebo à J56 qui ne provoque pas de variation significative.
Conclusion propriétés biomécaniques :
L’actif améliore les propriétés biomécaniques de la peau, de manière significative par rapport au placebo, avec une amélioration de la tonicité et de l’élasticité cutanées.
D. Évaluation de l’effet anti-âge sur le teint : couleur et homogénéité mesurées sur photographie
Les résultats obtenus à JO, J28 et J56 par analyse d’image sont listés dans le tableau ci-dessous.
Tableau 23 : résultats des mesures de couleur et d’homogénéité mesurés sur photographie
Figure imgf000038_0002
Figure imgf000039_0001
L’actif diminue de manière significative la rougeur a* à J28 et J56. La différence est en faveur de l’actif à J28 et à J56 par rapport au placebo qui diminue aussi à J28 et de manière significative à J56 la rougeur.
L’actif diminue l’hémoglobine à J28 et J56.
L’actif améliore de manière significative l’homogénéité du teint H76 à J56.
Conclusion évaluation du teint
L’actif améliore significativement la luminosité, la rougeur et l’homogénéité du teint.
E. Synthèse générale résultats étude clinique
Effet anti-âge sur les rides :
L’actif présente un effet anti-âge observé instrumentalement sur les rides de la partie haute du visage à savoir les rides de la patte d’oie et du front. Des différences significatives par rapport au placebo sont observées suivant les temps en faveur de l’actif.
Effet anti-âge sur les propriétés biomécaniques : L’actif améliore significativement la tonicité et l’élasticité de la peau à J28 et J56 suivant les paramètres considérés avec des différences significatives avec le placebo en faveur de l’actif.
Effet sur la couleur et l’homogénéité du teint :
L’actif améliore l’homogénéité du teint à J56 avec une différence par rapport au placebo en faveur de l’actif.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Extrait riche en polyphénols de parties aériennes de basilic sacré, Ocimum sanctum, comprenant au moins 6 % en poids de polyphénols par rapport au poids total de l’extrait sec, en particulier comprenant au moins 5 % en poids de dérivés hydroxycinnamiques par rapport au poids total de l’extrait sec, et au moins 2,5 % en poids de flavonoïdes, exprimés en équivalent rutine, par rapport au poids total de l’extrait sec.
2. Extrait selon la revendication 1 , comprenant au moins 9 % en poids, avantageusement au moins 11 %, en poids de polyphenols, par rapport au poids total de l’extrait sec.
3. Extrait selon l’une quelconque des revendications 1 à 2, dans lequel ledit extrait comprend au moins 7 %, de préférence 10 % en poids de dérivés hydroxycinnamiques par rapport au poids total de l’extrait sec.
4. Extrait selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel ledit extrait comprend au moins 3,5 % en poids de flavonoïdes, exprimés en équivalent rutine, par rapport au poids total de l’extrait sec.
5. Extrait selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu’il est obtenu par extraction solide/ liquide de parties aériennes de basilic sacré, dans un solvant choisi parmi les mélanges binaires eau/glycol ou eau/glycérol, avantageusement dans une proportion comprise entre 30 % et 90 % de glycol dans l’eau ou de glycérol dans l’eau.
6. Procédé de préparation d’un extrait riche en polyphénols de parties aériennes de basilic sacré, tel que défini selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant au moins une étape d’extraction solide/ liquide dans un solvant choisi parmi les mélanges binaires eau/glycol ou eau/glycérol, avantageusement dans une proportion comprise entre 30 % et 90 % de glycol dans l’eau ou de glycérol dans l’eau.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes successives suivantes : a) broyage des parties aériennes séchées de basilic sacré ; b) extraction solide/ liquide des parties aériennes de basilic sacré broyées dans un solvant choisi parmi les mélanges binaires eau/glycol ou eau/glycérol ; c) séparation de la phase solide et de la phase liquide par décantation et/ou centrifugation et/ou filtrations successives ; et d) éventuellement séchage de l’extrait obtenu à l’étape c).
8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu’il comprend en outre une étape d’évaporation sous vide ou de désodorisation.
9. Procédé selon l’une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le glycol est un glycol végétal, en particulier un propanediol ou le propylène glycol, notamment le 1 ,3- propanediol.
10. Composition comprenant en tant que principe actif, un extrait de parties aériennes de basilic sacré, tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 5 ou d’un extrait susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’une quelconque des revendications 6 à 9, et avantageusement un excipient approprié.
11. Extrait selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 ou extrait susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’une quelconque des revendications 6 à 9 ou composition selon la revendication 10, pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter :
- les troubles ou pathologies de la peau et/ou des muqueuses et/ou des phanères, avantageusement les réactions inflammatoires, les désordres liés à des stress intrinsèques ou extrinsèques, tels que le stress psychologique, le stress lié à un état d’anxiété, le stress liés à des attaques radicalaires liées ou non à la pollution chimique ou atmosphérique, et/ou liées à l’exposition aux UV ou aux IR, avantageusement choisis parmi la peau sensible, la peau réactive et/ou les muqueuses réactives, la peau irritée, la peau inflammée , les troubles de la barrière ou de l’homéostasie, la peau photosensibilisée, les agressions mécaniques et/ou thermiques ; et/ou
- les troubles vasculaires, de préférence les rougeurs ou les couperoses et/ou
- les déséquilibres du microbiote avantageusement choisis parmi la dermatite atopique, l’eczéma, le développement de mauvaises odeurs axillaires, la fragilisation de la barrière cutanée, l’acné, le psoriasis, l’hidradénite suppuré, les folliculites, les croûtes de lait, les pellicules, les démangeaisons notamment du cuir chevelu, les irritations, la candidose et la vaginose bactérienne et/ou pour son utilisation comme agent cicatrisant.
12. Procédé de soin cosmétique non thérapeutique de la peau et/ou des phanères et/ou des muqueuses, en vue d’améliorer leur état et/ou leur aspect, consistant à administrer un extrait tel que défini selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 ou un extrait susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’une quelconque des revendications 6 à 9 ou une composition telle que définie selon la revendication 10.
13. Procédé de soin cosmétique non thérapeutique selon la revendication 12, caractérisé en ce qu’il est destiné à hydrater la peau et/ou les muqueuses et/ou à prévenir les altérations de la barrière de la peau et sa déshydratation et/ou à prévenir le vieillissement cutané.
14. Procédé de soin cosmétique non thérapeutique selon la revendication 12 en vue d’améliorer la fermeté, l’élasticité ou la tonicité de la peau, en vue de renforcer les propriétés mécaniques de la peau et des muqueuses, en particulier pour lutter contre la peau flétrie, molle, distendue et/ou affaissée, et/ou renforcer et/ou restaurer l’élasticité ou la fermeté de la peau, ou encore pour traiter les rides et ridules.
15. Utilisation cosmétique non thérapeutique d’un extrait selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 ou d’un extrait susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’une quelconque des revendications 6 à 9 ou d’une composition selon la revendication 10 dans le traitement et /ou la prévention de la peau déshydratée ; la peau avec rougeur ; la peau âgée ; l’homogénéité du teint ; la réduction des tâches sur la peau ou le vieillissement cutané, notamment le vieillissement chronologique et/ou actinique.
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