WO2022154537A1 - 3-하이드록시프로피온산염의 결정 및 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정 - Google Patents

3-하이드록시프로피온산염의 결정 및 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정 Download PDF

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hydroxypropionic acid
crystal
less
recovery process
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PCT/KR2022/000673
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정우철
허인영
이경묵
강동균
김재형
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주식회사 엘지화학
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    • C07C59/01—Saturated compounds having only one carboxyl group and containing hydroxy or O-metal groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
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    • C07C51/42—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
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    • C08G18/0804—Manufacture of polymers containing ionic or ionogenic groups
    • C08G18/0819—Manufacture of polymers containing ionic or ionogenic groups containing anionic or anionogenic groups

Definitions

  • the present invention relates to a process for crystallization of 3-hydroxypropionic acid salt and a recovery process of 3-hydroxypropionic acid (3HP), and more particularly, to 3-hydroxypropionic acid using crystallization of 3-hydroxypropionic acid. It relates to a recovery process and crystals of 3-hydroxypropionate formed in the process.
  • 3-hydroxypropionic acid is a platform compound that can be converted into various chemicals such as acrylic acid, methyl acrylate, and acrylamide. Since it was selected as Top 12 value-added bio-chemical by the US Department of Energy (DOE) in 2004, it has been actively studied in academia and industry.
  • DOE US Department of Energy
  • 3-hydroxypropionic acid is largely made up of two methods: a chemical method and a biological method.
  • a chemical method it is pointed out that the initial material is expensive and is not eco-friendly due to the fact that toxic substances are generated during the production process. , eco-friendly bio-processes are in the spotlight.
  • 3-hydroxypropionic acid exhibits high hydrophilicity, and high solubility and reactivity with water. Accordingly, it is difficult to apply a conventional organic acid separation and purification process such as precipitation or extraction.
  • the reaction extraction method is a method of extracting an organic acid using an active diluent such as an amine or alcohol having good reactivity with the organic acid, and selective extraction of the organic acid is possible and the extraction efficiency is relatively high. Accordingly, it has been attempted to apply the reaction extraction method to the separation and purification of 3HP. For example, a method of using trioctylamine (TOA) as the amine has been proposed, but there are problems in that the extraction efficiency of 3HP is low and a large amount of organic solvent is required.
  • TOA trioctylamine
  • An object of the present invention is to provide a process for recovering 3-hydroxypropionic acid comprising the step of producing 3-hydroxypropionate crystals and the 3-hydroxypropionate crystals.
  • the Cation is a cation
  • the 3HP is 3-hydroxypropionic acid that binds to a cation
  • n is the number of 3HP binding to the cation, and is an integer of 1 or more
  • m is the number of water molecules in the hydrate, and is an integer of 1 or more.
  • the present inventors confirmed through an experiment that crystals of 3-hydroxypropionic acid salt can be formed when 3-hydroxypropionic acid is concentrated to a high concentration in the presence of an alkali metal salt, and 3-hydroxypropionic acid thus formed Salt crystals can be easily separated (and purified) from the liquid phase, so that high-purity 3-hydroxypropionate can be recovered with high efficiency, and the invention was also confirmed through experiments.
  • the concentrate containing 3-hydroxypropionic acid is a 3-hydroxy acid at a concentration of 300 g/L or more, 350 g/L or more, 400 g/L or more, 450 g/L or more, 500 g/L or more. It may include propionic acid, and may include 3-hydroxypropionic acid in a concentration of 900 g/L or less, 850 g/L or less, 800 g/L or less.
  • the concentration of 3-hydroxypropionic acid crystals in the concentrate is higher than the water solubility of the 3-hydroxypropionic acid crystals, the 3-hydroxypropionic acid crystals can be more easily produced. .
  • the concentration of 3-hydroxypropionic acid in the concentrate is 450 g/L When it exceeds, Ca(3HP) 2 crystal formation may be promoted.
  • the water solubility (Water Solubility) of Mg(3HP) 2 which is a crystal of 3-hydroxypropionic acid, is 250 g/L at room temperature, the concentration of 3-hydroxypropionic acid in the concentrate exceeds 250 g/L. If the Mg(3HP) 2 crystals can be produced, it can be promoted.
  • the alkali metal salt may be selected without limitation within the range of purposes for forming crystals of 3-hydroxypropionate, for example, the alkali metal salt is Na + , Mg 2+ and one or more cations selected from the group consisting of Ca 2+ , but when Mg 2+ or Ca 2+ is included, crystals of 3-hydroxypropionate may be more effectively formed.
  • the alkali metal salt may be Ca(OH) 2 , Mg(OH) 2 , or a mixture thereof.
  • the alkali metal salt is added and remains in the process of producing the 3-hydroxypropionic acid fermentation broth, or is added during the process of forming crystals of 3-hydroxypropionic acid salt in a concentrate containing 300 g/L or more of 3-hydroxypropionic acid can be
  • the concentration of the alkali metal salt may be 10% to 100%, or 30% to 90% of the concentration of 3-hydroxypropionic acid, for example, 10 to 900 g/L, 50 to 800 g/L, 100 to It may be present in the concentrate at a concentration of 700 g/L or 200 to 600 g/L.
  • the crystal of the 3-hydroxypropionate salt may be in the form of the following Structural Formula 1 or Structural Formula 2. That is, the crystal of the 3-hydroxypropionate may include 3-hydroxypropionate in the form of the following Structural Formula 1 or Structural Formula 2.
  • Cation is a cation
  • 3HP is 3-hydroxypropionic acid bonding to a cation
  • n is the number of 3HP bonding to a cation and means an integer of 1 or more
  • m is Cation in the hydrate
  • the number of water molecules bonded to (3HP)n an integer greater than or equal to 1.
  • the cation may be, for example, Na + , Mg 2+ or Ca 2+ , but in the case of Mg 2+ or Ca 2+ , crystals of 3-hydroxypropionate may be more effectively formed.
  • the step of forming the crystal of the 3-hydroxypropionate may further include agitating the concentrate.
  • the stirring step is 0 to 70 degrees Celsius, 0 to 60 degrees Celsius, 0 to 50 degrees Celsius, 0 to 40 degrees Celsius, 0 to 35 degrees Celsius, 0 to 30 degrees Celsius, 10 to 70 degrees Celsius, 10 to 60 degrees, 10 to 50 degrees Celsius, 10 to 40 degrees Celsius, 10 to 35 degrees Celsius, 10 to 30 degrees Celsius, 15 to 70 degrees Celsius, 15 to 60 degrees Celsius, 15 to 50 degrees Celsius, 15 to 40 degrees Celsius , 15 to 35 degrees Celsius, 15 to 30 degrees Celsius, 20 to 70 degrees Celsius, 20 to 60 degrees Celsius, 20 to 50 degrees Celsius, 20 to 40 degrees Celsius, 20 to 35 degrees Celsius, or 20 to 30 degrees Celsius ( For example, room temperature) and/or 100 to 2000 rpm, 100 to 1500 rpm, 100 to 1000 rpm, 100 to 500 rpm, 100 to 400 rpm, or 200 to 400 rpm (eg, about 300 rpm) conditions.
  • the crystal of 3-hydroxypropionate may have a particle size distribution D 50 of 20 ⁇ m or more and 90 ⁇ m or less, 25 ⁇ m or more and 85 ⁇ m or less, 30 ⁇ m or more and 80 ⁇ m or less, and 35 ⁇ m or more and 75 ⁇ m or less.
  • the particle size distribution D 10 of the crystal of 3-hydroxypropionate may be 5 ⁇ m or more and 40 ⁇ m or less, 8 ⁇ m or more and 35 ⁇ m or less, 10 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less, and the particles of the 3-hydroxypropionate crystal
  • the size distribution D 90 may be 50 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less, 60 ⁇ m or more and 190 ⁇ m or less, 65 ⁇ m or more and 180 ⁇ m or less, and 70 ⁇ m or more and 175 ⁇ m or less.
  • the particle size distributions D 50 , D 10 , and D 90 mean particle diameters corresponding to 50%, 10%, and 90% of the cumulative volume, respectively, in the particle size distribution curve of the particles, and the D 50 , D 10 , D 90 can be measured using, for example, a laser diffraction method.
  • the laser diffraction method is generally capable of measuring a particle diameter of several mm from a submicron region, and can obtain results of high reproducibility and high resolution.
  • (D 90 -D 10 )/D 50 of the crystal of the 3-hydroxypropionate salt may be 1.00 or more and 3.00 or less, 1.20 or more and 2.80 or less, 1.40 or more and 2.60 or less, 1.60 or more and 2.40 or less.
  • the crystal of the 3-hydroxypropionate may have a volume average particle diameter of 30 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less, 35 ⁇ m or more and 95 ⁇ m or less, 40 ⁇ m or more and 90 ⁇ m or less, and a number average particle diameter of 1 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less, 3 It may be greater than or equal to 25 ⁇ m, less than or equal to 5 ⁇ m and less than or equal to 20 ⁇ m, and may have a volume average particle diameter of greater than or equal to 10 ⁇ m and less than or equal to 70 ⁇ m, greater than or equal to 15 ⁇ m and less than or equal to 60 ⁇ m, and greater than or equal to 20 ⁇ m and less than or equal to 55 ⁇ m.
  • volume average particle diameter, number average particle diameter, and volume average particle diameter of the crystal of 3-hydroxypropionate are too large, impurities to be removed during crystallization may be included in the crystal, resulting in poor purification efficiency. This can be lowered.
  • the aspect ratio (LW Ratio; Length to width ratio) and the average aspect ratio in the particle size distribution (D 10 , D 50 , D 90 ) of the crystals of the 3-hydroxypropionate salt are 0.50 or more and 3.00 or less, 0.70 or more and 2.80 or less, respectively. , may be 1.00 or more and 2.50 or less. If the aspect ratio of the crystals of the 3-hydroxypropionate is too large, flowability and clogging problems may occur when the crystals are transported, and if the aspect ratio is too small, liquid permeability may be lowered during filtration of the crystals.
  • the crystal of 3-hydroxypropionate can measure the water content contained in the crystal by Karl Fischer method, and the water content contained in the crystal of 3-hydroxypropionate is 200 ppm or more and 5000 ppm or less , 250 ppm or more and 4800 ppm or less, 300 ppm or more and 4600 ppm or less, 350 ppm or more and 4400 ppm or less.
  • the moisture contained in the crystals of the 3-hydroxypropionate salt refers to the attached moisture contained between the crystals, not the crystal moisture (eg, Ca(3HP) 2 ⁇ 2H 2 O).
  • the water content contained in the crystal of the 3-hydroxypropionate is too large, it may be recovered in the form of a slurry rather than a solid crystal, or impurities may be contained in water, which may cause a problem in reducing the improvement of purity.
  • 3-hydroxypropionic acid is produced through a process such as fermenting a strain having 3-hydroxypropionic acid-producing ability.
  • Crystals of hydroxypropionate may contain a radiocarbon isotope ( 14 C).
  • Radiocarbon isotopes are nearly 1 per 10 12 carbon atoms in the Earth's atmosphere, have a half-life of about 5700 years, and the carbon stock includes cosmic rays and common nitrogen ( 14 N). may be abundant in the upper atmosphere due to nuclear reactions. On the other hand, in fossil fuels, radiocarbon isotopes decay long ago and the 14 C ratio can be substantially zero.
  • pMC percent modern carbon
  • the measuring method may be, for example, making carbon atoms included in the compound to be measured in the form of graphite or carbon dioxide gas and measuring it with a mass spectrometer, or measuring it according to liquid scintillation spectroscopy.
  • two isotopes may be separated by using an accelerator for separating 14 C ions from 12 C ions together with the mass spectrometer, and the content and content ratio may be measured with a mass spectrometer.
  • the content of radiocarbon isotopes measured according to ASTM D6866-21 may be 20 pMC (percent modern carbon) or more, 50 pMC or more, 90 pMC or more, 100 pMC or more, and The content may be 20 wt% or more, 50 wt% or more, 80 wt% or more, 90 wt% or more, 95 wt% or more.
  • the radiocarbon isotope ratio means the ratio of the radiocarbon isotope ( 14 C) contained in the crystal of the 3-hydroxypropionate and the radiocarbon isotope ( 14 C) of the modern reference material, The effectiveness of the nuclear test program of the 1950s continues and is not extinguished, so it could be greater than 100%.
  • the content of the bio-carbon means the content of bio-carbon with respect to the total carbon content included in the crystal of the 3-hydroxypropionate, and as this value increases, it may correspond to an eco-friendly compound.
  • the crystal state of the crystal of 3-hydroxypropionate may be confirmed through a peak in an X-ray diffraction (XRD) graph.
  • a peak between crystal lattices may appear in the range of 2 ⁇ value of 8 to 22°.
  • magnesium hydroxide Mg(OH) 2
  • the crystal of 3-hydroxypropionate formed is Mg(3HP) 2
  • X-ray diffraction for Mg(3HP) 2 In XRD analysis, a peak between 3-hydroxypropionic acid and a crystal lattice caused by a magnesium bond may appear in the range of 2 ⁇ value of 8 to 15°.
  • peaks may appear in the range of 2 ⁇ value of 8 to 15°, for example, Peaks may appear in the range of 2 ⁇ values of 8.2 to 9.3°, 9.5 to 11.0°, 11.2 to 12.7°, 12.9 to 13.3°, and 13.5 to 14.8°, respectively.
  • peaks may appear in the range of 10 to 22° of 2 ⁇ value,
  • the 2 ⁇ value is 10.0 to 11.0°, 11.1 to 11.6°, 11.6 to 12.5°, 12.7 to 13.6°, 13.8 to 16.0°, 17.0 to 18.0°, 19.0 to 19.8°, 20.2 to 21.2°, 21.5 to 22.0
  • Each peak may appear in the range of °.
  • the angle of incidence means an angle between the crystal plane and the X-ray when X-rays are irradiated to a specific crystal plane, and the peak is 2
  • the double (2 ⁇ ) value of the incident angle of the incident X-ray which is the horizontal axis (x axis)
  • the first derivative (slope of the tangent line, dy/dx) of the double (2 ⁇ ) value of the incident angle of the X-ray, which is the horizontal axis (x-axis) with respect to the diffraction intensity, which is the vertical axis (y-axis) changes from a positive value to a negative value.
  • the spacing (d value) between atoms in the crystal derived by X-ray diffraction (XRD) analysis is 1.00 ⁇ or more and 15.00 ⁇ or less, 1.50 ⁇ or more and 13.00 ⁇ or less, 2.00 ⁇ or more and 11.00 ⁇ . ⁇ or less, 2.50 ⁇ or more and 10.00 ⁇ or less.
  • the spacing (d value) between atoms in the crystal of a peak having a 2 ⁇ value in the range of 8 to 15° is 1.00 ⁇ or more. 15.00 ⁇ or less, 2.00 ⁇ or more and 13.00 ⁇ or less, 4.00 ⁇ or more and 11.00 ⁇ or less, and 5.50 ⁇ or more and 10.00 ⁇ or less.
  • the spacing (d value) between atoms in the crystal of a peak having a 2 ⁇ value in the range of 10 to 22° is 1.00 ⁇ or more and 15.00 ⁇ Below, 2.00 ⁇ or more and 13.00 ⁇ or less, 3.00 ⁇ or more and 10.00 ⁇ or less, 3.40 ⁇ or more and 9.00 ⁇ or less, and 4.00 ⁇ or more and 8.50 ⁇ or less.
  • the crystal of the 3-hydroxypropionate may have a glass transition temperature of -55 °C or more and -30 °C or less, a melting point of 30 °C or more and 170 °C or less, and a crystallization temperature of 25 °C or more and 170 °C or less.
  • the glass transition temperature, melting point, and crystallization temperature may be measured by differential scanning calorimetry (DSC) of the crystal of 3-hydroxypropionate, and the temperature increase rate may be 1 to 20° C./min.
  • the crystal of the 3-hydroxypropionate may have a glass transition temperature of -55 °C or more and -30 °C or less, -50 °C or more -35 °C or less, -45 °C or more -40 °C or less.
  • the melting point of the crystal of the 3-hydroxypropionate salt may be 30 °C or more and 170 °C or less, 31 °C or more and 160 °C or less, 32 °C or more and 150 °C or less.
  • the crystallization temperature of the crystal of the 3-hydroxypropionate salt may be 25 °C or more and 170 °C or less, 27 °C or more and 160 °C or less, 30 °C or more and 150 °C or less.
  • the crystallization stability period of the crystal of 3-hydroxypropionate may be -40 °C to 150 °C.
  • a strain having a 3-hydroxypropionic acid-producing ability is fermented to ferment 3-hydroxypropionic acid. and concentrating the fermentation broth to form a concentrate containing 300 g/L or more of 3-hydroxypropionic acid.
  • the strain having the ability to produce 3-hydroxypropionic acid is one or more selected from the group consisting of glycerol dehydratase and aldehyde dehydrogenase, or one containing a gene encoding the two types of proteins. have.
  • the 3-hydroxypropionic acid producing strain may further include a gene (gdrAB) encoding a glycerol dehydratase reactivating enzyme (GdrAB).
  • the 3-hydroxypropionic acid producing strain may be a strain capable of additionally biosynthesizing vitamin B12.
  • the glycerol dehydratase may be encoded by a dhaB (GenBank accession no. U30903.1) gene, but is not limited thereto.
  • the dhaB gene may be an enzyme derived from Klebsiella pneumonia, but is not limited thereto.
  • the gene encoding the glycerol dehydratase may include a gene encoding dhaB1, dhaB2 and/or dhaB3.
  • the glycerol dehydratase protein and the gene encoding the same are gene and / or It may include a mutation in the amino acid sequence.
  • aldehyde dehydrogenase is, for example, aldH (GenBank Accession no. U00096.3; EaldH) derived from Escherichia coli or E. coli K12 MG1655 cell line. gene, a puuC gene derived from K. pneumoniae, and/or a KGSADH gene derived from Azospirillum brasilense, but is not limited thereto.
  • aldehyde dehydrogenase protein and the gene encoding the same may include mutations in the gene and/or amino acid sequence within the range of maintaining activity for producing 3-hydroxypropionic acid from 3-hydroxypropanal.
  • the medium for the production of the fermentation broth may be selected without limitation in the range of purposes for the production of 3-hydroxypropionic acid.
  • the medium may include glycerol as a carbon source.
  • the medium may be waste glycerol (crude glycerol) and / or pre-treated waste glycerol, but is not limited thereto.
  • the production medium may further include vitamin B12.
  • the concentration of 3-hydroxypropionic acid contained in the 3-hydroxypropionic acid fermentation broth is 1 to 200 g/L , 10 to 150 g/L, 30 to 130 g/L or 40 to 100 g/L.
  • the fermentation may be a neutral fermentation, for example, during fermentation, the pH may be maintained in the range of 6 to 8, 6.5 to 8, 6 to 7.5, or 6.5 to 7.5, but is not limited thereto.
  • the pH range may be appropriately adjusted as necessary.
  • the alkali metal salt may be added for the neutral fermentation.
  • the alkali metal salt may include Mg 2+ , Ca 2 , or a mixture thereof.
  • the alkali metal salt may be Ca(OH) 2 or Mg(OH) 2 , but is not limited thereto.
  • the recovery process of 3-hydroxypropionic acid includes the steps of: removing (separating) cells from the fermentation broth after the production of the 3-hydroxypropionic acid fermentation broth; Purifying and/or decolorizing the fermentation broth and/or the cell-removed fermentation broth; And/or it may further comprise the step of filtering the fermentation broth and/or the cell-removed fermentation broth.
  • Removal (isolation) of the cells may be performed by selecting methods known in the art without limitation within the range of the purpose of cell (strain) removal.
  • the separation of the cells may be performed by centrifugation.
  • the step of purifying and/or decolorizing the fermentation broth and/or the cell-removed fermentation broth may be performed by selecting a method known in the art without limitation within the scope of the purification purpose of the fermentation broth, for example, activated carbon It may be carried out by removing the activated carbon after mixing with the fermentation broth, but is not limited thereto.
  • the step of filtering the fermentation broth and/or the cell-removed fermentation broth is limited to methods known in the art for the purpose of removing solid impurities, removing proteins and/or materials with hydrophobic functional groups, and/or decoloration. It may be performed by selection without, for example, filter filtration, and/or activated carbon filtration method, but is not limited thereto.
  • the fermentation broth is concentrated to produce the 3-hydroxypropionic acid. It may include forming a concentrate containing 300 g/L or more of hydroxypropionic acid.
  • Concentration of the fermentation broth may be performed by evaporating the fermentation broth (eg, a liquid component of the fermentation broth).
  • the concentration may be performed by any means commonly available to evaporate the liquid component of the fermentation broth, for example, rotary evaporation, concentration by evaporation, vacuum concentration, concentration under reduced pressure, etc., but is not limited thereto. .
  • the concentration of 3-hydroxypropionic acid in the fermentation broth after concentration is 2 to 50 times, 2 to 40 times, 2 to 30 times, 2 to 20 times, 2 to 10 times, 5 to 50 times compared to before concentration. It may be increased by fold, 5 to 40 times, 5 to 30 times, 5 to 20 times, or 5 to 10 times.
  • the concentrate containing at least 300 g/L of 3-hydroxypropionic acid can form crystals of 3-hydroxypropionate in
  • the crystal of 3-hydroxypropionate may be separated from the concentrate and 3-hydroxypropionic acid may be converted.
  • the method of separating the crystals of 3-hydroxypropionate from the concentrate may be performed by selecting methods known in the art to which the present invention pertains without limitation within the objective range for isolating the crystals.
  • the recovery of the crystals of the 3-hydroxypropionate salt may be performed by drying (eg, drying by heating, etc.), and/or filtration, but is not limited thereto.
  • the method of converting (purifying) the separated crystal of 3-hydroxypropionic acid to 3-hydroxypropionic acid may be performed by selecting a method known in the art without limitation within the scope of the purpose of purifying 3-hydroxypropionic acid.
  • a method known in the art without limitation within the scope of the purpose of purifying 3-hydroxypropionic acid.
  • one or more of the methods listed below may be used, but are not limited thereto.
  • the recovery rate of 3-hydroxypropionic acid may be calculated by the method of Equation 1 below.
  • 3HP recovery rate (%) ⁇ (3HP content in crystal)/(3HP content in fermentation broth before crystallization) ⁇ *100
  • the 3-hydroxypropionic acid recovery rate of the 3-hydroxypropionic acid recovery process provided by the present invention is 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, or 90% or more, such as, 40 to 99.9%, 50 to 99.9%, 60 to 99.9%, 70 to 99.9%, 80 to 99.9%, 90 to 99.9%, 40 to 99%, 50 to 99%, 60 to 99%, 70 to 99%, 80-99%, 90-99%, 40-97%, 50-97%, 60-97%, 70-97%, 80-97%, 90-97%, 40-95%, 50-95%, 60 to 95%, 70 to 95%, 80 to 95%, or 90 to 95%, but is not limited thereto.
  • the recovery rate may be calculated based on weight.
  • the purity of 3-hydroxypropionic acid salt contained in the crystals of 3-hydroxypropionic acid salt relative to the mass of the total recovered crystals is determined by Structural Formula 1 and/or Structural Formula 2 It can be calculated as a percentage (%) of the mass of a compound having the structural formula of
  • the purity of 3-hydroxypropionate contained in the crystal of 3-hydroxypropionate produced in the 3-hydroxypropionic acid recovery process provided by the present invention is 70% or more, 80% or more, 90% or more, 70 to 99.9%, 80 to 99.9%, 90 to 99.9%, 70 to 99%, 80 to 99%, or 90 to 99%, but is not limited thereto.
  • a crystal of 3-hydroxypropionate represented by the following Structural Formula 1 or 2 is provided.
  • Cation is a cation
  • 3HP is 3-hydroxypropionic acid bonding to a cation
  • n is the number of 3HP bonding to a cation and means an integer of 1 or more
  • m is Cation in the hydrate
  • the number of water molecules that bind with (3HP)n which may be an integer greater than or equal to 1.
  • the cation may be, for example, Na + , Mg 2+ or Ca 2+ , but in the case of Mg 2+ or Ca 2+ , crystals of 3-hydroxypropionate may be more effectively formed.
  • the crystal of the 3-hydroxypropionic acid salt may be formed in the recovery process of 3-hydroxypropionic acid according to the embodiment, for example, in the presence of the alkali metal salt, 3-hydroxypropionic acid is added to 300 g/L or more It may be formed in the step of forming crystals of 3-hydroxypropionate in the containing concentrate.
  • the crystals of the 3-hydroxypropionate have a particle size distribution D 50 of 20 ⁇ m or more and 90 ⁇ m or less, 25 ⁇ m or more and 85 ⁇ m or less, 30 ⁇ m or more 80 ⁇ m or less, 35 ⁇ m or more and 75 ⁇ m or less, and the particle size distribution D 10 is 5 ⁇ m or more and 40 ⁇ m or less, 8 ⁇ m or more 35 ⁇ m or less, 10 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less, and the particle size distribution D 90 is 50 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less, 60 ⁇ m or more and 190 ⁇ m or less, 65 ⁇ m or more 180 ⁇ m or less, 70 It may be greater than or equal to ⁇ m and less than or equal to 175 ⁇ m.
  • (D 90 -D 10 )/D 50 of the crystal of the 3-hydroxypropionate salt may be 1.00 or more and 3.00 or less, 1.20 or more and 2.80 or less, 1.40 or more and 2.60 or less, and 1.60 or more and 2.40 or less.
  • the crystal of the 3-hydroxypropionate may have a volume average particle diameter of 30 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less, 35 ⁇ m or more and 95 ⁇ m or less, 40 ⁇ m or more and 90 ⁇ m or less, and a number average particle diameter of 1 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less, 3 It may be greater than or equal to 25 ⁇ m, less than or equal to 5 ⁇ m and less than or equal to 20 ⁇ m, and may have a volume average particle diameter of greater than or equal to 10 ⁇ m and less than or equal to 70 ⁇ m, greater than or equal to 15 ⁇ m and less than or equal to 60 ⁇ m, and greater than or equal to 20 ⁇ m and less than or equal to 55 ⁇ m.
  • the aspect ratio (LW Ratio; Length to width ratio) and the average aspect ratio in the particle size distribution (D 10 , D 50 , D 90 ) of the crystals of the 3-hydroxypropionate salt are 0.50 or more and 3.00 or less, 0.70 or more and 2.80 or less, respectively. , may be 1.00 or more and 2.50 or less.
  • the water content contained in the crystal of the 3-hydroxypropionate salt may be 200 ppm or more and 5000 ppm or less, 250 ppm or more and 4800 ppm or less, 300 ppm or more and 4600 ppm or less, 350 ppm or more and 4400 ppm or less.
  • the content of radiocarbon isotopes measured according to ASTM D6866-21 may be 20 pMC (percent modern carbon) or more, 50 pMC or more, 90 pMC or more, 100 pMC or more, and The content may be 20 wt% or more, 50 wt% or more, 80 wt% or more, 90 wt% or more, 95 wt% or more.
  • XRD X-ray diffraction
  • the crystal of the 3-hydroxypropionate may have a glass transition temperature of -55 °C or more and -30 °C or less, a melting point of 30 °C or more and 170 °C or less, and a crystallization temperature of 25 °C or more and 170 °C or less.
  • the purity of 3-hydroxypropionate contained in the crystal of 3-hydroxypropionate is 70% or more, 80% or more, 90% or more, 70 to 99.9%, 80 to 99.9%, 90 to 99.9%, 70 to 99 %, 80-99%, or 90-99%.
  • particle size distribution D 10, D 50, D 90, (D 90 -D 10 )/D 50 volume average particle diameter, number average particle diameter, volume average particle diameter, particle size distribution of the crystals of the above-mentioned 3-hydroxypropionate salt (D 10 , D 50 , D 90 )
  • Aspect ratio, average aspect ratio, moisture content, radiocarbon isotope content, biocarbon content, and XRD analysis results spacing between atoms in the crystal (d value), specific 2 ⁇ (peak appearing in the value range), glass transition temperature, melting point, crystallization temperature, and measurement conditions for purity and the like, detailed description, etc. are the same as described above in the recovery process of 3-hydroxypropionic acid according to the embodiment.
  • a crystal of 3-hydroxypropionate containing an alkali metal salt of 3-hydroxypropionic acid or a hydrate thereof, and the biocarbon content measured according to ASTM D6866-21 is 20% by weight or more. to provide.
  • the alkali metal salt of 3-hydroxypropionic acid may be a calcium salt or magnesium salt of 3-hydroxypropionic acid.
  • alkali metal salt of 3-hydroxypropionic acid may be represented by Structural Formula 1
  • the hydrate of the alkali metal salt of 3-hydroxypropionic acid may be represented by Structural Formula 2 below.
  • the following Cation may be Mg 2+ or Ca 2+ .
  • the crystal of the 3-hydroxypropionate may have a content of radiocarbon isotopes measured according to ASTM D6866-21 standard of 20 pMC (percent modern carbon) or more, 50 pMC or more, 90 pMC or more, 100 pMC or more, and bio
  • the carbon content may be 20 wt% or more, 50 wt% or more, 80 wt% or more, 90 wt% or more, 95 wt% or more.
  • the crystal of 3-hydroxypropionate may have a volume average particle diameter of 30 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less, 35 ⁇ m or more and 95 ⁇ m or less, 40 ⁇ m or more and 90 ⁇ m or less, and a number average particle diameter of 1 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less, 3 ⁇ m or more. 25 ⁇ m or less, 5 ⁇ m or more and 20 ⁇ m or less, and may have a volume average particle diameter of 10 ⁇ m or more and 70 ⁇ m or less, 15 ⁇ m or more and 60 ⁇ m or less, and 20 ⁇ m or more and 55 ⁇ m or less.
  • the aspect ratio (LW Ratio; Length to width ratio) and the average aspect ratio in the particle size distribution (D10, D50, D90) of the crystals of the 3-hydroxypropionate are 0.50 or more and 3.00 or less, 0.70 or more and 2.80 or less, 1.00 or more, respectively. It may be less than or equal to 2.50.
  • the crystal of the 3-hydroxypropionate has a particle size distribution D 50 of 20 ⁇ m or more and 90 ⁇ m or less, 25 ⁇ m or more and 85 ⁇ m or less, 30 ⁇ m or more and 80 ⁇ m or less, 35 ⁇ m or more and 75 ⁇ m, and the particle size distribution D 10 is 5 ⁇ m or more and 40 ⁇ m or less, 8 ⁇ m or more and 35 ⁇ m or less, 10 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less, and the particle size distribution D 90 is 50 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less, 60 ⁇ m or more and 190 ⁇ m or less, 65 ⁇ m or more 180 ⁇ m or less, 70 ⁇ m It may be greater than or equal to 175 ⁇ m.
  • (D 90 -D 10 )/D 50 of the crystal of the 3-hydroxypropionate salt may be 1.00 or more and 3.00 or less, 1.20 or more and 2.80 or less, 1.40 or more and 2.60 or less, and 1.60 or more and 2.40 or less.
  • the water content contained in the crystal of the 3-hydroxypropionate salt may be 200 ppm or more and 5000 ppm or less, 250 ppm or more and 4800 ppm or less, 300 ppm or more and 4600 ppm or less, 350 ppm or more and 4400 ppm or less.
  • XRD X-ray diffraction
  • the crystal of the 3-hydroxypropionate may have a glass transition temperature of -55 °C or more and -30 °C or less, a melting point of 30 °C or more and 170 °C or less, and a crystallization temperature of 25 °C or more and 170 °C or less.
  • the purity of 3-hydroxypropionate contained in the crystal of 3-hydroxypropionate is 70% or more, 80% or more, 90% or more, 70 to 99.9%, 80 to 99.9%, 90 to 99.9%, 70 to 99 %, 80-99%, or 90-99%.
  • Particle size distribution D 10, D 50, D 90, (D 90 -D 10 )/D 50 volume average particle diameter, number average particle diameter, volume average particle diameter, particle size distribution (D 10 , D 50 , D 90 ) in the aspect ratio, average aspect ratio, water content, radiocarbon isotope content, bio-carbon content, and XRD analysis results (spacing between atoms in the crystal (d value), specific 2 ⁇ value range) (peak appearing in ), glass transition temperature, melting point, crystallization temperature, measurement conditions for purity, etc., detailed description, etc. are the same as described above in the recovery process of 3-hydroxypropionic acid according to the embodiment.
  • the crystal of 3-hydroxypropionate provided by the present invention contains 3-hydroxypropionate in high purity, and has a specific particle size or shape, so that it is easy to filter from impurities such as fermentation by-products and/or additives, and also In the recovery (separation, purification) process of 3-hydroxypropionic acid, it is possible to easily separate fermentation by-products and/or additives through the crystallization of 3-hydroxypropionate. It is possible to perform the process without the need for 3-hydroxypropionic acid separation and purification process can be simplified, it is possible to reduce the purification cost of 3-hydroxypropionic acid.
  • Example 1 and 2 are graphs of the results of X-ray diffraction (XRD) analysis of 3-hydroxypropionate crystals of Example 1 (Ca(3HP) 2 ).
  • 3 and 4 are graphs of the results of X-ray diffraction (XRD) analysis of 3-hydroxypropionate crystals of Example 2 (Mg(3HP) 2 ).
  • Example 5 is a graph showing the results of differential scanning calorimetry (DSC) analysis of 3-hydroxypropionate crystals of Example 1 (Ca(3HP) 2 ).
  • Example 6 is a graph showing the results of differential scanning calorimetry (DSC) analysis of 3-hydroxypropionate crystals of Example 2 (Mg(3HP) 2 ).
  • Glycerol dehydratase Glycerol dehydratase
  • aldehyde dehydrogenase Aldehyde dehydrogenase
  • 3HP 3-hydroxypropionic acid
  • plasmid pCDF comprising a gene encoding glycerol dehydratase (dhaB), a gene encoding aldehyde dehydrogenase (aldH) and a gene encoding glycerol dehydratase reactivase (gdrAB) 3-hydroxypropionic acid production by introducing the pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH_btuR vector obtained by cloning the BtuR gene encoding adenosyltransferase into W3110 strain (KCCM 40219) by electroporation using an electroporation device (Bio-Rad, Gene Pulser Xcell) strains were prepared.
  • dhaB glycerol dehydratase
  • aldH aldehyde dehydrogenase
  • gdrAB glycerol dehydratase reactivase
  • the strain for producing 3-hydroxypropionic acid prepared in Preparation Example 1 was fermented and cultured at 35 degrees Celsius in a 5 L fermenter using unrefined glycerol as a carbon source to produce 3-hydroxypropionic acid.
  • calcium hydroxide (Ca(OH) 2 ) an alkali metal salt, was added to maintain a neutral pH during fermentation.
  • the concentration of 3-hydroxypropionic acid in the fermentation broth after the primary purification is 50 to 100 g/L, and the fermentation broth is concentrated to a concentration of 600 g/L using a rotary evaporator (50 degrees Celsius, 50 mbar). was prepared and stirred at room temperature (300 rpm) to produce Ca(3HP) 2 crystals. At this time, the concentration of the alkali metal salt in the concentrate was 493.3 g/L (Ca(OH) 2 based).
  • the resulting crystals were washed 3 times with ethanol (EtOH) and dried in an oven at 50 degrees Celsius to finally recover the crystals.
  • the weight of the crystals was measured, the crystals were dissolved in water, and the amount of 3-hydroxypropionic acid (3HP) was quantified using high performance liquid chromatography (HPLC) to measure the amount of 3-hydroxypropionic acid in the crystals, and in the fermentation broth.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • 3HP recovery rate (%) ⁇ (3HP content in crystal)/(3HP content in fermentation broth before crystallization) ⁇ *100
  • the recovery rate of 3-hydroxypropionic acid recovered as crystals was measured to be about 92%.
  • the fermentation process was performed in substantially the same manner as in Example 1, but as an alkali metal salt, Mg(OH) 2 was used instead of Ca(OH) 2 , and concentrated to produce and recover Mg(3HP) 2 crystals.
  • Table 1 below shows the recovery rates of Mg(3HP) 2 crystals for each concentration concentration of each concentrate.
  • the fermented broth from which the gypsum was removed was first purified and concentrated in substantially the same manner as in Example 1, and whether or not crystals were formed was confirmed.
  • Ion chromatography (IC) analysis (Dionex Aquion; Eluent: 20 mM Methanesulfonic Acid; Column: Dionex IonPac CS12A; Flow Rate: 1.0 ml/min; Suppressor: Dionex CERS 500 4 mm; Current: 59 mA) was performed to The cation analysis of the 3-hydroxypropionate crystals obtained in Examples 1 and 2 was performed to confirm the purity of each 3-hydroxypropionate in the crystals.
  • Table 2 below shows the cation analysis results of the Ca(3HP) 2 crystals of Example 1
  • Table 3 below shows the purity measurement results of 3-hydroxypropionate for each concentration concentration of the Mg(3HP) 2 crystals of Example 2 It was.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Table 5 below shows the results of HPLC performance for the crystals of Examples 1 and 2.
  • 3-hydroxypropionate in the crystals means Ca(3HP) 2 in Example 1 and Mg(3HP) 2 in Example 2.
  • Example 1 0.2426 0.1880 0.2302 94.89
  • Example 2 0.2580 0.2118 0.2404 93.20
  • Example 1 600 27.41 71.40 170.40 88.71 18.99 53.45
  • Example 2 800 13.68 36.50 74.02 41.30 5.13 24.81
  • the particle size distribution D 10 of Examples 1 and 2 is 13.68 to 27.41 ⁇ m
  • the particle size distribution D 50 is 36.50 to 71.40 ⁇ m
  • the particles The size distribution D 90 is 74.02 to 170.40
  • (D 90 -D 10 )/D 50 is 2.00 in Example 1, 1.65 in Example 2, a volume average particle diameter of 41.30 to 88.71 ⁇ m, and a number average particle diameter of 5.13 to 18.99 ⁇ m
  • the volume average particle diameter is 24.81 to 53.45 ⁇ m
  • the D 10 aspect ratio (LW Ratio; Length to width ratio) is 13.68 to 27.41
  • the D 50 aspect ratio is 36.50 to 71.40
  • the D 90 aspect ratio is 74.02 to 170.40 , confirmed that the average aspect ratio was 41.30 to 88.71.
  • the bio-carbon content means the content of bio-carbon contained in the 3-hydroxypropionate crystals of Examples 1 and 2, respectively, and the radioactive carbon isotope ratio (pMC) is the radioactive carbon contained in the 3-hydroxypropionate crystals. It refers to the ratio of carbon isotopes ( 14 C) to radiocarbon isotopes ( 14 C) of modern reference materials.
  • the crystals prepared in Examples 1 and 2 were irradiated with Cu-K ⁇ rays having a wavelength of 1.54 ⁇ to measure X-ray diffraction (XRD) patterns in reflection mode.
  • XRD X-ray diffraction
  • the measurement equipment was a Bruker AXS D4 Endeavor XRD.
  • the voltage and current used are 40 kV and 40 mA, respectively, and the optics and detector used are as follows.
  • FIGS. 1 and 2 are graphs of the X-ray diffraction analysis result of the 3-hydroxypropionate crystal of Example 1
  • FIGS. 3 and 4 are graphs of the X-ray diffraction analysis result of the 3-hydroxypropionate crystal of Example 2.
  • the 2 ⁇ values and lattice plane spacing (d values) of the numbered peaks in the XRD graphs of FIGS. 1 and 2 are shown in Table 10 below, and the 2 ⁇ values and lattice values of the numbered peaks in the XRD graphs of FIGS. 3 and 4
  • the interplanar spacing (d value) is shown in Table 11 below.
  • Peak No. 2 ⁇ value (°) Interval between lattice planes (d-value, ⁇ ) One 10.0-11.0 8.37 8 20.6-21.2 4.24 2 11.1-11.6 7.75 9 21.5-22.0 4.10 3 11.6-12.4 7.38 10 22.0-22.4 4.01 4 12.9-13.3 6.75 11 23.2-23.7 3.78 5 14.1-14.5 6.17 12 23.9-24.3 3.69 6 17.2-17.6 5.08 13 26.9-27.2 3.29 7 19.2-19.8 4.55 14 29.2-29.6 3.03
  • the 3-hydroxypropionate crystal prepared in Example 1 is Ca(3HP) 2
  • the 3-hydroxypropionate crystal prepared in Example 2 is Mg(3HP) 2 confirmed
  • the melting point (Tm) of each crystal was confirmed using a differential scanning calorimeter (“DSC (Q2000)” manufactured by TA Instruments Co., Ltd.), and in the case of Example 1, the temperature increase rate was 10° C./ Glass transition temperature, crystallization temperature, etc. were measured in the range of -60 ° C to 150 ° C in minutes, and in the case of Example 2, the glass transition temperature, crystallization temperature, etc. was measured, and the results are shown in Table 12 below.
  • DSC differential scanning calorimeter
  • FIG. 5 is a graph showing the results of differential scanning calorimetry (DSC) analysis of 3-hydroxypropionate crystals (Ca(3HP) 2 ) of Example 1
  • FIG. 6 is 3-hydroxypropionate crystals of Example 2 (Mg ( 3HP) 2 ) is a graph of the results of differential scanning calorimetry (DSC) analysis.

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Abstract

본 발명은, 알칼리 금속염 존재 하에, 3-하이드록시프로피온산을 300 g/L 이상 포함하는 농축액에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하는 단계 및 상기 농축액에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 분리하고 3-하이드록시프로피온산을 전환하는 단계를 포함한 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정과, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정에 관한 것이다.

Description

3-하이드록시프로피온산염의 결정 및 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정
관련 출원(들)과의 상호 인용
본 출원은 2021년 1월 15일자 한국 특허 출원 제10-2021-0006246호 및 2021년 9월 8일자 한국 특허 출원 제10-2021-0119997호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 발명은 3-하이드록시프로피온산염의 결정 및 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid; 3HP)의 회수 공정에 관한 것으로, 보다 상세하게는 3-하이드록시프로피온산염의 결정화를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정 및 상기 공정에서 형성된 3-하이드록시프로피온산염의 결정에 관한 것이다.
3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid; 3HP)은 아크릴산(acrylic acid), 아크릴산메틸(methyl acrylate), 아크릴아마이드(acrylamide) 등의 다양한 화학 물질로 전환 가능한 플랫폼 화합물이다. 2004년 미국 Department of Energy(DOE)로부터 Top 12 value-added bio-chemical로 선정된 이후 학계와 산업계에서 활발히 연구되고 있다.
3-하이드록시프로피온산의 생산은 크게 화학적 방법과 생물학적 방법의 두 가지 방법으로 이루어지나, 화학적 방법의 경우 초기 물질이 고가인 점, 생산 과정 중 독성 물질이 생성되는 점 등에 의해 비친환경적이라는 지적이 있어, 친환경적인 바이오 공정이 각광받고 있다.
미생물 발효에 의한 유기산의 제조시, 미생물을 발효하는 과정에서 3-하이드록시프로피온산 등의 유기산 이외에 다른 부산물도 함께 생성되기 때문에, 발효액으로부터 유기산을 추출 및 분리하는 과정이 필요하다. 미생물 발효액으로부터 유기산을 추출 및 분리하는 방법으로는 전기 투석법, 역삼투막법, 유기산을 함유하는 용액-유기용매 반응 추출법 등이 사용되고 있으며, 특히, 수산화나트륨(NaOH)를 이용한 역추출법이 수율이 높아 널리 이용되고 있다. 그러나, 이들 방법의 경우 생성물이 유기산염 형태이므로 이를 유기산으로 전환하기 위한 공정이 추가적으로 필요하며 순도가 낮은 단점이 있다.
3-하이드록시프로피온산은 발효 공정을 통해 생산되는 다른 유기산들과는 달리, 높은 친수성을 나타내고, 물에 대한 용해도 및 반응성이 높다. 이에 따라 침전 또는 추출과 같은 종래 유기산 분리 정제 공정을 적용하기 어렵다.
반응 추출법은, 유기산과 반응성이 좋은 아민 또는 알코올과 같은 활성 희석액(active diluent)을 이용하여, 유기산을 추출하는 방법으로, 유기산의 선택적 추출이 가능하고, 추출 효율이 비교적 높다. 이에 따라, 3HP의 분리 정제 시에도 상기 반응 추출법을 적용하는 것이 시도되고 있다. 일례로, 상기 아민으로서 트리옥틸아민(trioctylamine; TOA)을 사용하는 방법이 제안되었으나, 3HP의 추출 효율이 낮고, 또 다량의 유기 용매가 필요하다는 문제점이 있다. 또, 아민으로서 트리데실아민(tridecylamine)을 사용하는 경우에는, TOA 보다 3HP의 추출 효율은 높지만, 추출 시 유기상과 수상이 분리되지 않는 에멀젼(emulsion) 현상이 발생하는 문제점이 있다.
따라서, 미생물 발효액 등 3-하이드록시프로피온산 포함 원료액으로부터 고순도 및 고수율의 3-하이드록시프로피온산을 회수하는 공정의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 3-하이드록시프로피온산염 결정을 생성하는 단계를 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정과 상기 3-하이드록시프로피온산염 결정을 제공하는 것이다.
본 명세서에서는, 알칼리 금속염 존재 하에, 3-하이드록시프로피온산을 300 g/L 이상 포함하는 농축액에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하는 단계 및 상기 농축액에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 분리하고 3-하이드록시프로피온산을 전환하는 단계를 포함한 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정이 제공된다.
또한, 본 명세서에서는, 하기 구조식 1 또는 구조식 2으로 표시되는 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 제공된다.
[구조식 1]
Cation(3HP)n
[구조식 2]
Cation(3HP)n·mH2O
상기 Cation는 양이온(Cation)이고,
상기 3HP는 양이온과 결합하는 3-하이드록시프로피온산이고,
상기 n은 양이온과 결합하는 3HP 수로, 1 이상의 정수이고,
상기 m은 수화물에서의 물 분자 수로, 1 이상의 정수이다.
이하 발명의 구체적인 구현예에 따른 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정 및 3-하이드록시프로피온산염 결정에 대해서 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
본 명세서에서 기술하는 제조 방법을 구성하는 단계들은 순차적 또는 연속적임을 명시하거나 다른 특별한 급이 있는 경우가 아니면, 하나의 제조 방법을 구성하는 하나의 단계와 다른 단계가 명세서 상에 기술된 순서로 제한되어 해석되지 않는다. 따라서 당업자가 용이하게 이해될 수 있는 범위 내에서 제조 방법의 구성 단계의 순서를 변화시킬 수 있으며, 이 경우 그에 부수하는 당업자에게 자명한 변화는 본 발명의 범위에 포함되는 것이다.
발명의 일 구현예에 따르면, 알칼리 금속염 존재 하에, 3-하이드록시프로피온산을 300 g/L 이상 포함하는 농축액에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하는 단계 및 상기 농축액에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 분리하고 3-하이드록시프로피온산을 전환하는 단계를 포함한 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정이 제공된다.
본 발명자들은, 알칼리 금속염이 존재하는 상태에서 3-하이드록시프로피온산이 높은 농도로 농축하면 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성될 수 있다는 점을 실험을 통하여 확인하였고, 이와 같이 형성된 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 액상에서 쉽게 분리(및 정제)할 수 있어 고순도의 3-하이드록시프로피온산염을 높은 효율로 회수할 수 있다는 점 또한 실험을 통해 확인하고 발명을 완성하였다.
보다 구체적으로, 상기 3-하이드록시프로피온산을 포함하는 농축액은 300 g/L 이상, 350 g/L 이상, 400 g/L 이상, 450 g/L 이상, 500 g/L 이상의 농도로 3-하이드록시프로피온산을 포함할 수 있고, 900 g/L 이하, 850 g/L 이하, 800 g/L 이하의 농도로 3-하이드록시프로피온산을 포함할 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산의 결정의 생성 여부는 알칼리 금속염의 존재와 상기 농축액에서의 상기 3-하이드록시프로피온산의 농도 등에 따라 영향을 받는 것으로 보인다.
또한, 상기 농축액 상에서 3-하이드록시프로피온산의 결정의 농도가 상기 3-하이드록시프로피온산의 결정의 수 용해도(Water Solubility) 보다 높은 경우, 상기 3-하이드록시프로피온산의 결정이 보다 용이하게 생성될 수 있다.
예를 들어, 상기 3-하이드록시프로피온산의 결정인 Ca(3HP)2의 수 용해도(Water Solubility)는 상온에서 450 g/L이므로, 상기 농축액에서의 3-하이드록시프로피온산의 농도가 450 g/L 초과하는 경우 Ca(3HP)2 결정이 생성이 촉진될 수 있다. 또한, 상기 3-하이드록시프로피온산의 결정인 Mg(3HP)2의 수 용해도(Water Solubility)는 상온에서 250 g/L이므로, 상기 농축액에서의 3-하이드록시프로피온산의 농도가 250 g/L 초과하는 경우 Mg(3HP)2 결정의 생성이 촉진 수 있다.
상기 알칼리 금속염을 포함하면서도, 상술한 농도를 만족하는 농축액으로부터 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성할 수 있으며, 상기 알칼리 금속염은 3-하이드록시프로피온산염의 결정 형성하기 위한 목적 범위에서 제한 없이 선택될 수 있으며, 예를 들어 상기 알칼리 금속염은 Na+, Mg2+ 및 Ca2+로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 양이온을 포함할 수 있으나, Mg2+ 또는 Ca2+를 포함하는 경우 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 보다 효과적으로 형성될 수 있다. 예를 들어, 상기 알칼리 금속염은 Ca(OH)2, Mg(OH)2 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
상기 알칼리 금속염은 상기 3-하이드록시프로피온산 발효액을 생산하는 공정에서 첨가되어 잔류하거나, 상기 3-하이드록시프로피온산을 300 g/L 이상 포함하는 농축액에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하는 공정 중에 첨가될 수 있다. 또한, 상기 알칼리 금속염의 농도는 3-하이드록시프로피온산 농도의 10% 내지 100%, 또는 30% 내지 90% 일 수 있으며, 예를 들어 10 내지 900 g/L, 50 내지 800 g/L, 100 내지 700 g/L 또는 200 내지 600 g/L의 농도로 상기 농축액에서 존재할 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 하기 구조식 1 또는 구조식 2의 형태일 수 있다. 즉, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 하기 구조식 1 또는 구조식 2의 형태의 3-하이드록시프로피온산염을 포함할 수 있다.
하기 구조식 1 및 구조식 2에서 Cation은 양이온을, 상기 3HP는 양이온과 결합하는 3-하이드록시프로피온산을, n은 양이온과 결합하는 3HP 수로 1 이상의 정수를 의미하고, 하기 구조식 2에서 m은 수화물에서 Cation(3HP)n과 결합하는 물 분자의 수로, 1이상의 정수이다. 상기 양이온은, 예를 들어, Na+, Mg2+ 또는 Ca2+일 수 있으나, Mg2+ 또는 Ca2+인 경우 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 보다 효과적으로 형성될 수 있다.
[구조식 1]
Cation(3HP)n
[구조식 2]
Cation(3HP)n·mH2O
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하는 단계는 상기 농축액을 교반하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 교반하는 단계는 섭씨 0 내지 70도, 섭씨 0 내지 60도, 섭씨 0 내지 50도, 섭씨 0 내지 40도, 섭씨 0 내지 35도, 섭씨 0 내지 30도, 섭씨 10 내지 70도, 섭씨 10 내지 60도, 섭씨 10 내지 50도, 섭씨 10 내지 40도, 섭씨 10 내지 35도, 섭씨 10 내지 30도, 섭씨 15 내지 70도, 섭씨 15 내지 60도, 섭씨 15 내지 50도, 섭씨 15 내지 40도, 섭씨 15 내지 35도, 섭씨 15 내지 30도, 섭씨 20 내지 70도, 섭씨 20 내지 60도, 섭씨 20 내지 50도, 섭씨 20 내지 40도, 섭씨 20 내지 35도, 또는 섭씨 20 내지 30 도 (예, 상온)의 온도 및/또는 100 내지 2000rpm, 100 내지 1500rpm, 100 내지 1000rpm, 100 내지 500rpm, 100 내지 400rpm, 또는 200 내지 400rpm (예, 약 300rpm) 조건 하에서 수행될 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 입자 크기 분포 D50이 20 ㎛ 이상 90 ㎛ 이하, 25 ㎛ 이상 85 ㎛ 이하, 30 ㎛ 이상 80 ㎛ 이하, 35 ㎛ 이상 75 ㎛ 이하일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 입자 크기 분포 D10은 5 ㎛ 이상 40 ㎛ 이하, 8 ㎛ 이상 35 ㎛ 이하, 10 ㎛ 이상 30 ㎛ 이하일 수 있고, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 입자 크기 분포 D90은 50 ㎛ 이상 200 ㎛ 이하, 60 ㎛ 이상 190 ㎛ 이하, 65 ㎛ 이상 180 ㎛ 이하, 70 ㎛ 이상 175 ㎛ 이하일 수 있다.
상기 입자 크기 분포 D50, D10, D90은 입자의 입경 분포 곡선에 있어서, 각각 체적 누적량의 50%, 10%, 90%에 해당하는 입경을 의미하는 것으로, 상기 D50, D10, D90은 예를 들어, 레이저 회절법(laser diffraction method)을 이용하여 측정할 수 있다. 상기 레이저 회절법은 일반적으로 서브미크론(submicron) 영역에서부터 수 mm 정도의 입경의 측정이 가능하며, 고 재현성 및 고 분해성의 결과를 얻을 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 입자 크기 분포 D50, D10, D90가 지나치게 크면 결정화시 제거되어야 하는 불순물이 결정 안에 포함되어 정제 효율이 떨어질 수 있고, 지나치게 작으면 결정을 여과시 통액성이 낮아질 수 있다.
한편, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 (D90-D10)/D50은 1.00 이상 3.00 이하, 1.20 이상 2.80 이하, 1.40 이상 2.60 이하, 1.60 이상 2.40 이하일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 부피 평균 입경이 30 ㎛ 이상 100 ㎛ 이하, 35 ㎛ 이상 95 ㎛ 이하, 40 ㎛ 이상 90 ㎛ 이하일 수 있고, 개수 평균 입경이 1 ㎛ 이상 30 ㎛ 이하, 3 ㎛ 이상 25 ㎛ 이하, 5 ㎛ 이상 20 ㎛ 이하일 수 있고, 체적 평균 입경이 10 ㎛ 이상 70 ㎛ 이하, 15 ㎛ 이상 60 ㎛ 이하, 20 ㎛ 이상 55 ㎛ 이하일 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 부피 평균 입경, 개수 평균 입경 및 체적 평균 입경이 지나치게 크면 결정화시 제거되어야 하는 불순물이 결정 안에 포함되어 정제 효율이 떨어질 수 있고, 지나치게 작으면 결정을 여과시 통액성이 낮아질 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 입자 크기 분포(D10, D50, D90)서의 종횡비(LW Ratio; Length to width ratio) 및 평균 종횡비는 각각 0.50 이상 3.00 이하, 0.70 이상 2.80 이하, 1.00 이상 2.50 이하일 수 있다. 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 종횡비가 지나치게 크면 결정을 이송시 흐름성과 막힘의 문제가 발생할 수 있고, 지나치게 작으면 결정을 여과시 통액성이 낮아질 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 칼 피셔 방법(Karl Fischer method)으로 결정 내에 포함된 수분 함량을 측정할 수 있으며, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정에 포함된 수분 함량은 200 ppm 이상 5000 ppm 이하, 250 ppm 이상 4800 ppm 이하, 300 ppm 이상 4600 ppm 이하, 350 ppm 이상 4400 ppm 이하일 수 있다.
이때, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정 내에 포함된 수분은 결정 수분(예를 들어 Ca(3HP)2·2H2O)이 아닌 결정 사이에 포함된 부착 수분을 의미한다. 또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정에 포함된 수분 함량이 지나치게 많으면 결정 고체가 아닌 슬러리 형태로 회수되거나, 수분 내에 불순물이 함유되어 순도 향상 저하에 문제가 될 수 있다.
상기 일 구현예에 따른 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정에서는 후술하는 바와 같이 3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주를 발효하는 등의 공정을 통해 3-하이드록시프로피온산을 제조함에 따라, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 방사성 탄소 동위원소(14C)를 포함할 수 있다.
방사성 탄소 동위원소(14C)는 지구 대기 중에 탄소 원자 1012개 당 거의 1개이며, 반감기는 약 5700년이고, 탄소 스톡 (stock)은 우주선 (cosmic ray)과 일반 질소 (14N)가 참여하는 핵 반응으로 인해 대기 상층에 풍부할 수 있다. 한편, 화석 연료에는 방사성 탄소 동위원소 오래전에 붕괴되어 14C 비율이 실질적으로 0일 수 있다. 3-하이드록시프로피온산 원료로 바이오 유래 원료를 사용하거나, 이와 함께 화석 연료를 병용할 경우, ASTM D6866-21 규격으로 3-하이드록시프로피온산 내에 포함된 방사성 탄소 동위원소의 함량(pMC; percent modern carbon)과 바이오 탄소의 함량을 측정할 수 있다.
측정 방법은 예를 들어, 측정 대상 화합물에 포함되는 탄소 원자를 그라파이트 또는 이산화탄소 가스 형태로 만들고 질량 분석기로 측정하거나, 액체 섬광 분광법에 따라 측정할 수 있다. 이때, 상기 질량 분석기 등과 함께 14C 이온을 12C 이온으로부터 분리하기 위한 가속기를 함께 사용해 2개의 동위 원소를 분리하여 함량 및 함량비를 질량 분석기로 측정할 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 ASTM D6866-21 규격으로 측정된 방사성 탄소 동위원소의 함량이 20 pMC (percent modern carbon) 이상, 50 pMC 이상, 90 pMC 이상, 100 pMC 이상일 수 있고, 바이오 탄소의 함량은 20 중량% 이상, 50 중량% 이상, 80 중량% 이상, 90 중량% 이상, 95 중량% 이상일 수 있다.
상기 방사성 탄소 동위원소 비율(pMC)는 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정에 포함된 방사성 탄소 동위원소(14C)와 현대의 기준 참고 물질의 방사성 탄소 동위원소(14C)의 비율을 의미하고, 1950년대 핵 실험 프로그램의 효력이 지속되고 있고 소멸되지 않아, 100% 보다 클 수 있다.
또한, 상기 바이오 탄소의 함량은 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정에 포함된 전체 탄소 함량에 대한 바이오 탄소의 함량을 의미하고, 이 값이 클수록 친환경성 화합물에 해당할 수 있다.
한편, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 방사성 탄소 동위원소의 함량(pMC) 및 바이오 탄소 함량이 지나치게 적으면, 친환경성이 감소하며, 바이오 유래 물질이라 볼 수 없을 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 결정 상태는 X-선 회절 (XRD) 그래프에서 피크 등을 통해 확인할 수 있다.
예를 들어, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 X선 회절(XRD) 분석 시, 2θ값이 8 내지 22°의 범위에서 결정 격자 간의 피크가 나타날 수 있다.
예를 들어, 상기 농축액에 수산화 마그네슘(Mg(OH)2)이 포함되어 있어, 형성되는 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 Mg(3HP)2인 경우, Mg(3HP)2에 대한 X선 회절(XRD) 분석 시, 2θ값이 8 내지 15°의 범위에서 3-하이드록시프로피온산과 마그네슘 결합에 의한 결정 격자 간의 피크가 나타날 수 있다. 이러한 피크는 수산화 마그네슘(Mg(OH)2) 또는 황산 마그네슘(Mg(SO4))에 대한 X선 회절(XRD) 분석 결과와는 상이한 결과를 나타내는 것이며, X선 회절(XRD) 분석 결과 2θ값이 8 내지 15°의 범위에서 특정 피크가 나타나는 경우 Mg(3HP)2의 결정이 형성되었음을 확인할 수 있다.
구체적으로, Mg(3HP)2에 대한 X선 회절(XRD) 분석 시, 2θ값이 8 내지 15°의 범위에서 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 피크가 나타날 수 있으며, 예를 들어, 2θ값이 8.2 내지 9.3°, 9.5 내지 11.0°, 11.2 내지 12.7°, 12.9 내지 13.3°, 13.5 내지 14.8°인 범위에서 각각 피크가 나타날 수 있다.
또한, 상기 농축액에 수산화 칼슘(Ca(OH)2)이 포함되어, 형성되는 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 Ca(3HP)2인 경우, Ca(3HP)2에 대한 X선 회절(XRD) 분석 시, 2θ값이 10 내지 22°의 범위에서 3-하이드록시프로피온산과 칼슘 결합에 의한 결정 격자 간의 피크가 나타날 수 있다. 이러한 피크는 수산화 칼슘(Ca(OH)2) 또는 황산 칼슘(Ca(SO4))에 대한 X선 회절(XRD) 분석 결과와는 상이한 결과를 나타내는 것이며, X선 회절(XRD) 분석 결과 2θ값이 10 내지 22°의 범위에서 특정 피크가 나타나는 경우 Ca(3HP)2의 결정이 형성되었음을 확인할 수 있다.
구체적으로, Ca(3HP)2에 대한 X선 회절(XRD) 분석 시, 2θ값이 10 내지 22°의 범위에서 3개 이상, 5개 이상, 7개 이상, 9개 이상의 피크가 나타날 수 있으며, 예를 들어, 2θ값이 10.0 내지 11.0°, 11.1 내지 11.6°, 11.6 내지 12.5°, 12.7 내지 13.6°, 13.8 내지 16.0°, 17.0 내지 18.0°, 19.0 내지 19.8°, 20.2 내지 21.2°, 21.5 내지 22.0°인 범위에서 각각 피크가 나타날 수 있다.
한편, 상기 입사각(θ)이란 X선이 특정 결정면에 조사될 때, 결정면과 X선이 이루는 각도를 의미하며, 상기 피크란, x-y 평면에서의 가로축(x축)이 입사되는 X선의 입사각의 2배(2θ)값이고, x-y 평면에서의 세로축(y축)이 회절 강도인 그래프 상에서, 가로축(x축)인 입사되는 X선의 입사각의 2배(2θ)값이 양의 방향으로 증가함에 따라, 세로축(y축)인 회절 강도에 대한 가로축(x축)인 X선의 입사각의 2배(2θ)값의 1차 미분값(접선의 기울기, dy/dx)이 양의 값에서 음의 값으로 변하는, 1차 미분값(접선의 기울기, dy/dx)이 0인 지점을 의미한다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 X선 회절(XRD) 분석으로 도출된 결정 내 원자들 간의 간격(d값)이 1.00 Å 이상 15.00 Å 이하, 1.50 Å 이상 13.00 Å 이하, 2.00 Å 이상 11.00 Å 이하, 2.50 Å 이상 10.00 Å 이하일 수 있다.
예를 들어, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 Mg(3HP)2인 경우, 2θ값이 8 내지 15°의 범위에서 나타나는 피크의 상기 결정 내 원자들 간의 간격(d값)은, 1.00 Å 이상 15.00 Å 이하, 2.00 Å 이상 13.00 Å 이하, 4.00 Å 이상 11.00 Å 이하, 5.50 Å 이상 10.00 Å 이하일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 Ca(3HP)2인 경우, 2θ값이 10 내지 22°의 범위에서 나타나는 피크의 상기 결정 내 원자들 간의 간격(d값)은, 1.00 Å 이상 15.00 Å 이하, 2.00 Å 이상 13.00 Å 이하, 3.00 Å 이상 10.00 Å 이하, 3.40 Å 이상 9.00 Å 이하, 4.00 Å 이상 8.50 Å 이하일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 유리전이 온도가 -55 ℃ 이상 -30 ℃ 이하이고, 융점이 30 ℃ 이상 170 ℃ 이하이고, 결정화 온도가 25 ℃ 이상 170 ℃ 이하일 수 있다.
상기 유리 전이 온도, 융점, 결정화 온도는 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 시차주사열량계(DSC)에 의해 측정될 수 있으며, 측정시 승온 속도는 1 내지 20 ℃/분일 수 있다. 또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 유리전이 온도가 -55 ℃ 이상 -30 ℃ 이하, -50 ℃ 이상 -35 ℃ 이하, -45 ℃ 이상 -40 ℃ 이하일 수 있다. 또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 융점은 30 ℃ 이상 170 ℃ 이하, 31 ℃ 이상 160 ℃ 이하, 32 ℃ 이상 150 ℃ 이하일 수 있다. 또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 결정화 온도는 25 ℃ 이상 170 ℃ 이하, 27 ℃ 이상 160 ℃ 이하, 30 ℃ 이상 150 ℃ 이하일 수 있다. 또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 결정화 안정구간은 -40 ℃ 내지 150 ℃일 수 있다.
상기 일 구현예에 따른 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하는 단계 이전에, 3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주를 발효하여 3-하이드록시프로피온산 발효액을 생산하는 단계 및 상기 발효액을 농축하여 상기 3-하이드록시프로피온산을 300 g/L 이상 포함하는 농축액을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주는 글리세롤 탈수효소(glycerol dehydratase) 및 알데하이드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상 또는 상기 2종의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 3-하이드록시프로피온산 생산 균주는 추가로 글리세롤 탈수효소 재활성효소(GdrAB)를 암호화하는 유전자(gdrAB)를 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 3-하이드록시프로피온산 생산 균주는 추가로 비타민 B12를 생합성할 수 있는 균주일 수 있다.
상기 글리세롤 탈수효소(glycerol dehydratase)는 dhaB(GenBank accession no. U30903.1) 유전자에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 dhaB 유전자는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia)에서 유래한 효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 글리세롤 탈수효소를 암호화하는 유전자는 dhaB1, dhaB2 및/또는 dhaB3를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 글리세롤 탈수효소 단백질 및 이를 암호화하는 유전자는 글리세롤을 3-하이드록시프로판알(3-hydroxypropanal, 3-HPA)과 물(H2O)로 분해하는 효소 활성을 유지하는 범위 내에서 유전자 및/또는 아미노산 서열의 변이를 포함할 수 있다.
상기 알데하이드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase; ALDH)를 암호화하는 유전자(aldH)는, 예를 들어, 대장균(Escherichia coli) 또는 E. coli K12 MG1655 세포주에서 유래한 aldH(GenBank Accession no. U00096.3; EaldH) 유전자, 클렙시엘라 뉴모니아(K. pneumonia)에서 유래한 puuC 유전자, 및/또는 아조스피릴룸 브라실렌스(Azospirillum brasilense) 유래의 KGSADH 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 알데하이드 탈수소효소 단백질 및 이를 암호화하는 유전자는 3-하이드록시프로판알로부터 3-하이드록시프로피온산을 생산하기 위한 활성을 유지하는 범위 내에서 유전자 및/또는 아미노산 서열의 변이를 포함할 수 있다.
상기 발효액 생산을 위한 배지는 3-하이드록시프로피온산 생산을 위한 목적 범위에서 제한 없이 선택될 수 있다. 일 예에서 상기 배지는 탄소원으로 글리세롤(glycerol)을 포함하는 것일 수 있다. 또 다른 일 예에서 상기 배지는 폐글리세롤(crude glycerol) 및/또는 전처리된 폐글리세롤일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예에서, 상기 생산용 배지는 비타민 B12를 추가로 포함할 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주를 발효하여 3-하이드록시프로피온산 발효액을 생산하는 단계에서, 상기 3-하이드록시프로피온산 발효액에 포함된 3-하이드록시프로피온산의 농도는 1 내지 200 g/L, 10 내지 150 g/L, 30 내지 130 g/L 또는 40 내지 100 g/L일 수 있다.
또한, 상기 발효는 중성 발효일 수 있으며, 예를 들어 발효시 pH가 6 내지 8, 6.5 내지 8, 6 내지 7.5 또는 6.5 내지 7.5 범위에서 유지되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 pH 범위는 필요에 따라 적절히 조절될 수 있다. 상기 중성 발효를 위해 상기 알칼리 금속염이 투입될 수 있다. 상기 알칼리 금속염은 Mg2+, Ca2 또는 이의 혼합물을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 알칼리 금속염은 Ca(OH)2 또는 Mg(OH)2일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 일 구현예에 따른 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은 상기 3-하이드록시프로피온산 발효액을 생산하는 단계 이후, 상기 발효액으로부터 세포를 제거(분리)하는 단계; 상기 발효액 및/또는 세포가 제거된 발효액을 정제 및/또는 탈색(decoloration)하는 단계; 및/또는 상기 발효액 및/또는 세포가 제거된 발효액을 여과하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 세포의 제거(분리)는 세포(균주) 제거 목적 범위에서 당업계에 알려진 방법을 제한 없이 선택하여 수행될 수 있다. 일 예에서 상기 세포의 분리는 원심분리를 수행하여 이루어질 수 있다.
상기 발효액 및/또는 세포가 제거된 발효액을 정제 및/또는 탈색(decoloration)하는 단계는, 발효액의 정제 목적 범위에서 당업계에 알려진 방법을 제한 없이 선택하여 수행될 수 있으며, 예를 들어 활성탄을 상기 발효액과 혼합한 후 활성탄을 제거함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 발효액 및/또는 세포가 제거된 발효액을 여과하는 단계는 고형 불순물의 제거, 단백질 및/또는 소수성 functional group이 있는 물질의 제거, 및/또는 탈색(decoloration) 목적 범위에서 당업계에 알려진 방법을 제한 없이 선택하여 수행될 수 있으며, 예를 들어, 필터 여과, 및/또는 활성탄 여과 방법으로 수행될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 일 구현예에 따른 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정은 상기 3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주를 발효하여 3-하이드록시프로피온산 발효액을 생산하는 단계 이후, 상기 발효액을 농축하여 상기 3-하이드록시프로피온산을 300 g/L 이상 포함하는 농축액을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 발효액의 농축은 발효액 (예컨대, 발효액의 액상 성분)을 증발하여 수행되는 것일 수 있다.
상기 농축은 발효액의 액상 성분을 증발시키기 위하여 통상적으로 사용 가능한 모든 수단에 의하여 수행될 수 있으며, 예컨대, 회전증발농축, 증발 농축, 진공 농축, 감압 농축 등으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에서, 상기 농축 후의 발효액 내 3-하이드록시프로피온산 농도는, 농축 전과 비교하여, 2 내지 50배, 2 내지 40배, 2 내지 30배, 2 내지 20배, 2 내지 10배, 5 내지 50배, 5 내지 40배, 5 내지 30배, 5 내지 20배, 또는 5 내지 10배 증가된 것일 수 있다.
상술한 바와 같이, 상기 발효액을 농축하여 상기 3-하이드록시프로피온산을 300 g/L 이상 포함하는 농축액을 형성하는 단계 이후, 알칼리 금속염 존재 하에, 3-하이드록시프로피온산을 300 g/L 이상 포함하는 농축액에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성할 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성 단계 이후, 상기 농축액에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 분리하고 3-하이드록시프로피온산을 전환할 수 있다.
상기 농축액에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 분리하는 방법은 결정을 분리하기 위한 목적 범위에서 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려진 방법을 제한 없이 선택하여 수행될 수 있다. 일 예에서 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 회수는 건조(예를 들어 가열 건조 등), 및/또는 여과 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 분리된 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 3-하이드록시프로피온산으로 전환(정제)하는 방법은 3-하이드록시프로피온산 정제 목적 범위에서 당업계에 알려진 방법을 제한 없이 선택하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 하기 나열된 방법 중 하나 이상의 방법이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, i) 양이온 교환수지를 통해 양이온을 제거하여 3-하이드록시프로피온산을 양성자화(protonation)하는 방법;
ii) 액체 양이온 교환(Liquid Cation Exchange)을 이용해 양이온 (예를 들어, Mg, Ca 등)을 유기용매로 추출하여 3-하이드록시프로피온산을 양성자화(Protonation)하는 방법; 및
iii) 산 (예를 들어, 황산 등)으로 적정하여 염(예를 들어, CaSO4(s) 또는 MgSO4(s))을 제조함으로써 3-하이드록시프로피온산을 양성자화(Protonation)하는 방법이 있을 수 있다.
상기 일 구현예에 따른 3-하이드록시프로피온산(3HP)의 회수 공정에서, 3-하이드록시프로피온산의 회수율은 하기 수학식 1의 방법으로 계산될 수 있다.
[수학식 1]
3HP 회수율(%) = {(결정 내 3HP 함량)/(결정화 전 발효액의 3HP 함량)}*100
일 예에서 본 발명이 제공하는 3-하이드록시프로피온산 회수 공정의 3-하이드록시프로피온산 회수율은 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상, 예컨대, 40 내지 99.9%, 50 내지 99.9%, 60 내지 99.9%, 70 내지 99.9%, 80 내지 99.9%, 90 내지 99.9%, 40 내지 99%, 50 내지 99%, 60 내지 99%, 70 내지 99%, 80 내지 99%, 90 내지 99%, 40 내지 97%, 50 내지 97%, 60 내지 97%, 70 내지 97%, 80 내지 97%, 90 내지 97%, 40 내지 95%, 50 내지 95%, 60 내지 95%, 70 내지 95%, 80 내지 95%, 또는 90 내지 95%일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 회수율은 중량 기준으로 산정된 것일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산(3HP)의 회수 공정에서, 3-하이드록시프로피온산염의 결정 내에 포함된 3-하이드록시프로피온산염의 순도는, 회수된 전체 결정의 질량 대비 상기 구조식 1 및/또는 구조식 2의 구조식을 갖는 화합물의 질량의 백분율(%)로 계산될 수 있다. 일 예에서 본 발명이 제공하는 3-하이드록시프로피온산 회수 공정에서 생성된 3-하이드록시프로피온산염의 결정 내에 포함된 3-하이드록시프로피온산염의 순도는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 70 내지 99.9%, 80 내지 99.9%, 90 내지 99.9%, 70 내지 99%, 80 내지 99%, 또는 90 내지 99%, 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 하기 구조식 1 또는 구조식 2으로 표시되는 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 제공한다.
[구조식 1]
Cation(3HP)n
[구조식 2]
Cation(3HP)n·mH2O
하기 구조식 1 및 구조식 2에서 Cation은 양이온을, 상기 3HP는 양이온과 결합하는 3-하이드록시프로피온산을, n은 양이온과 결합하는 3HP 수로 1 이상의 정수를 의미하고, 하기 구조식 2에서 m은 수화물에서 Cation(3HP)n과 결합하는 물 분자의 수로, 1이상의 정수일 수 있다. 상기 양이온은, 예를 들어, Na+, Mg2+ 또는 Ca2+일 수 있으나, Mg2+ 또는 Ca2+인 경우 3-하이드록시프로피온산염의 결정이 보다 효과적으로 형성될 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 상기 일 구현예에 따른 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정에서 형성된 것일 수 있으며, 예를 들어, 상기 알칼리 금속염 존재 하에, 3-하이드록시프로피온산을 300 g/L 이상 포함하는 농축액에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하는 단계에서 형성된 것일 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 입자 크기 분포 D50이 20 ㎛ 이상 90 ㎛ 이하, 25 ㎛ 이상 85 ㎛ 이하, 30 ㎛ 이상 80 ㎛ 이하, 35 ㎛ 이상 75 ㎛ 이하이고, 입자 크기 분포 D10은 5 ㎛ 이상 40 ㎛ 이하, 8 ㎛ 이상 35 ㎛ 이하, 10 ㎛ 이상 30 ㎛ 이하이고, 입자 크기 분포 D90은 50 ㎛ 이상 200 ㎛ 이하, 60 ㎛ 이상 190 ㎛ 이하, 65 ㎛ 이상 180 ㎛ 이하, 70 ㎛ 이상 175 ㎛ 이하일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 (D90-D10)/D50은 1.00 이상 3.00 이하, 1.20 이상 2.80 이하, 1.40 이상 2.60 이하, 1.60 이상 2.40 이하일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 부피 평균 입경이 30 ㎛ 이상 100 ㎛ 이하, 35 ㎛ 이상 95 ㎛ 이하, 40 ㎛ 이상 90 ㎛ 이하일 수 있고, 개수 평균 입경이 1 ㎛ 이상 30 ㎛ 이하, 3 ㎛ 이상 25 ㎛ 이하, 5 ㎛ 이상 20 ㎛ 이하일 수 있고, 체적 평균 입경이 10 ㎛ 이상 70 ㎛ 이하, 15 ㎛ 이상 60 ㎛ 이하, 20 ㎛ 이상 55 ㎛ 이하일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 입자 크기 분포(D10, D50, D90)서의 종횡비(LW Ratio; Length to width ratio) 및 평균 종횡비는 각각 0.50 이상 3.00 이하, 0.70 이상 2.80 이하, 1.00 이상 2.50 이하일 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정에 포함된 수분 함량은 200 ppm 이상 5000 ppm 이하, 250 ppm 이상 4800 ppm 이하, 300 ppm 이상 4600 ppm 이하, 350 ppm 이상 4400 ppm 이하일 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 ASTM D6866-21 규격으로 측정된 방사성 탄소 동위원소의 함량이 20 pMC (percent modern carbon) 이상, 50 pMC 이상, 90 pMC 이상, 100 pMC 이상일 수 있고, 바이오 탄소의 함량은 20 중량% 이상, 50 중량% 이상, 80 중량% 이상, 90 중량% 이상, 95 중량% 이상일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 X선 회절(XRD) 분석 시, 2θ값이 8 내지 22°의 범위에서 결정 격자 간의 피크가 나타날 수 있고, XRD 분석으로 도출된 결정 내 원자들 간의 간격(d값)이 1.00 Å 이상 15.00 Å 이하, 1.50 Å 이상 13.00 Å 이하, 2.00 Å 이상 11.00 Å 이하, 2.50 Å 이상 10.00 Å 이하일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 유리전이 온도가 -55 ℃ 이상 -30 ℃ 이하이고, 융점이 30 ℃ 이상 170 ℃ 이하이고, 결정화 온도가 25 ℃ 이상 170 ℃ 이하일 수 있다.
또한, 3-하이드록시프로피온산염의 결정 내에 포함된 3-하이드록시프로피온산염의 순도는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 70 내지 99.9%, 80 내지 99.9%, 90 내지 99.9%, 70 내지 99%, 80 내지 99%, 또는 90 내지 99%일 수 있다.
또한, 상술한 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 입자 크기 분포 D10, D50, D90, (D90-D10)/D50, 부피 평균 입경, 개수 평균 입경, 체적 평균 입경, 입자 크기 분포(D10, D50, D90)서의 종횡비, 평균 종횡비, 수분 함량, 방사성 탄소 동위원소 함량, 바이오 탄소 함량, XRD 분석을 도출된 결과(결정 내 원자들 간의 간격(d값), 특정 2θ값 범위에서 나타나는 피크), 유리전이온도, 융점, 결정화 온도 및 순도 등에 대한 측정 조건, 구체적인 설명 등은 상기 일 구현예에 따른 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정에서 상술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염 또는 이의 수화물을 포함하고, ASTM D6866-21 규격으로 측정된 바이오 탄소의 함량은 20 중량% 이상인 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 제공한다.
상기 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염은 3-하이드록시프로피온산의 칼슘염 또는 마그네슘염일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염은 하기 구조식 1로 표시될 수 있고, 상기 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염의 수화물은 하기 구조식 2로 표시될 수 있다. 하기 Cation은 Mg2+ 또는 Ca2+일 수 있다.
[구조식 1]
Cation(3HP)n
[구조식 2]
Cation(3HP)n·mH2O
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 ASTM D6866-21 규격으로 측정된 방사성 탄소 동위원소의 함량이 20 pMC (percent modern carbon) 이상, 50 pMC 이상, 90 pMC 이상, 100 pMC 이상일 수 있고, 바이오 탄소의 함량은 20 중량% 이상, 50 중량% 이상, 80 중량% 이상, 90 중량% 이상, 95 중량% 이상일 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 부피 평균 입경이 30 ㎛ 이상 100 ㎛ 이하, 35 ㎛ 이상 95 ㎛ 이하, 40 ㎛ 이상 90 ㎛ 이하일 수 있고, 개수 평균 입경이 1 ㎛ 이상 30 ㎛ 이하, 3 ㎛ 이상 25 ㎛ 이하, 5 ㎛ 이상 20 ㎛ 이하일 수 있고, 체적 평균 입경이 10 ㎛ 이상 70 ㎛ 이하, 15 ㎛ 이상 60 ㎛ 이하, 20 ㎛ 이상 55 ㎛ 이하일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 입자 크기 분포(D10, D50, D90)서의 종횡비(LW Ratio; Length to width ratio) 및 평균 종횡비는 각각 0.50 이상 3.00 이하, 0.70 이상 2.80 이하, 1.00 이상 2.50 이하일 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 입자 크기 분포 D50이 20 ㎛ 이상 90 ㎛ 이하, 25 ㎛ 이상 85 ㎛ 이하, 30 ㎛ 이상 80 ㎛ 이하, 35 ㎛ 이상 75 ㎛이고, 입자 크기 분포 D10은 5 ㎛ 이상 40 ㎛ 이하, 8 ㎛ 이상 35 ㎛ 이하, 10 ㎛ 이상 30 ㎛ 이하이고, 입자 크기 분포 D90은 50 ㎛ 이상 200 ㎛ 이하, 60 ㎛ 이상 190 ㎛ 이하, 65 ㎛ 이상 180 ㎛ 이하, 70 ㎛ 이상 175 ㎛ 이하일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 (D90-D10)/D50은 1.00 이상 3.00 이하, 1.20 이상 2.80 이하, 1.40 이상 2.60 이하, 1.60 이상 2.40 이하일 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정에 포함된 수분 함량은 200 ppm 이상 5000 ppm 이하, 250 ppm 이상 4800 ppm 이하, 300 ppm 이상 4600 ppm 이하, 350 ppm 이상 4400 ppm 이하일 수 있다.
또한, 상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 X선 회절(XRD) 분석 시, 2θ값이 8 내지 22°의 범위에서 결정 격자 간의 피크가 나타날 수 있고, XRD 분석으로 도출된 결정 내 원자들 간의 간격(d값)이 1.00 Å 이상 15.00 Å 이하, 1.50 Å 이상 13.00 Å 이하, 2.00 Å 이상 11.00 Å 이하, 2.50 Å 이상 10.00 Å 이하일 수 있다.
상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 유리전이 온도가 -55 ℃ 이상 -30 ℃ 이하이고, 융점이 30 ℃ 이상 170 ℃ 이하이고, 결정화 온도가 25 ℃ 이상 170 ℃ 이하일 수 있다.
또한, 3-하이드록시프로피온산염의 결정 내에 포함된 3-하이드록시프로피온산염의 순도는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 70 내지 99.9%, 80 내지 99.9%, 90 내지 99.9%, 70 내지 99%, 80 내지 99%, 또는 90 내지 99%일 수 있다.
상술한 3-하이드록시프로피온산염의 결정의 입자 크기 분포 D10, D50, D90, (D90-D10)/D50, 부피 평균 입경, 개수 평균 입경, 체적 평균 입경, 입자 크기 분포(D10, D50, D90)서의 종횡비, 평균 종횡비, 수분 함량, 방사성 탄소 동위원소 함량, 바이오 탄소 함량, XRD 분석을 도출된 결과(결정 내 원자들 간의 간격(d값), 특정 2θ값 범위에서 나타나는 피크), 유리전이온도, 융점, 결정화 온도 및 순도 등에 대한 측정 조건, 구체적인 설명 등은 상기 일 구현예에 따른 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정에서 상술한 바와 같다.
본 발명이 제공하는 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 3-하이드록시프로피온산염을 고순도로 포함하고, 특정 입경 내지 형상을 가짐으로 인해 발효 부산물 및/또는 첨가물 등의 불순물로부터의 여과가 용이하고, 또한 3-하이드록시프로피온산의 회수 (분리, 정제) 공정은 3-하이드록시프로피온산염의 결정화를 통해 발효 부산물 및/또는 첨가물을 손쉽게 분리할 수 있어 순도 높은 3-하이드록시프로피온산염의 회수가 가능하고, 유기 용매 없이 공정 수행이 가능하여 3-하이드록시프로피온산 분리 정제 공정을 단순화할 수 있어 3-하이드록시프로피온산의 정제 비용을 절감할 수 있다.
도 1 및 2는 실시예 1의 3-하이드록시프로피온산염 결정(Ca(3HP)2)의 X선 회절(XRD) 분석 결과 그래프이다.
도 3 및 4는 실시예 2의 3-하이드록시프로피온산염 결정(Mg(3HP)2)의 X선 회절(XRD) 분석 결과 그래프이다.
도 5는 실시예 1의 3-하이드록시프로피온산염 결정(Ca(3HP)2)의 시차주사열량계(DSC) 분석 결과 그래프이다.
도 6은 실시예 2의 3-하이드록시프로피온산염 결정(Mg(3HP)2)의 시차주사열량계(DSC) 분석 결과 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 제한되지 아니한다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한 온도는 모두 섭씨 온도로 기재되었다.
준비예 1. 3-하이드록시프로피온산 생산용 균주의 제조
글리세롤을 기질로 사용하여 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3HP)을 생산하는 것으로 알려져 있는 글리세롤 탈수효소(Glycerol dehydratase) 및 알데하이드 탈수소효소(Aldehyde dehydrogenase)를 암호화하는 유전자를 도입한 재조합 벡터를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 벡터를 대장균(E.coli) W3110 균주에 도입하여 3-하이드록시프로피온산 생산 균주를 제작하였다.
보다 구체적으로, 글리세롤 디하이드라타제를 코딩하는 유전자(dhaB), 알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자(aldH) 및 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제를 코딩하는 유전자(gdrAB)를 포함하는 플라스미드 pCDF에 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 BtuR 유전자를 클로닝하여 얻어진 pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH_btuR 벡터를 W3110 균주(KCCM 40219)에 전기 천공 장치 (Bio-Rad, Gene Pulser Xcell)를 사용한 전기천공법으로 도입하여 3-하이드록시프로피온산 생산 균주를 제작하였다. 본 준비예 1의 3-하이드록시프로피온산 생산 균주 제작 과정 및 사용된 벡터, 프라이머, 및 효소들은 대한민국 공개특허 제10-2020-0051375호 (본 명세서에 참조로서 포함됨)의 실시예 1을 참조하여 수행하였다.
실시예 1. Ca(3HP) 2 결정 제조
준비예 1에서 준비된 3-하이드록시프로피온산 생산용 균주를 비정제 글리세롤을 탄소원으로 사용하여 5 L 발효기에서 섭씨 35 도에서 발효 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하였다. 3-하이드록시프로피온산 생성으로 인한 pH 저하를 방지하기 위해 알칼리 금속염인 수산화 칼슘(Ca(OH)2)을 투입하여 발효 수행 동안의 pH를 중성으로 유지하였다.
발효배양 후 원심분리(4000 rpm, 10 분, 섭씨 4 도)하여 세포를 제거하고, 활성탄을 이용해 1차 발효액 정제 (1차 정제)를 진행하였다. 구체적으로 원심 분리하여 균체가 제거된 발효액에 활성탄을 첨가하여 잘 섞어준 후 다시 원심 분리하여 활성탄을 분리하였다. 이후 활성탄이 분리된 발효액을 0.7 um의 여과지를 통해 진공 펌프(vaccum pump)로 여과하여 3-하이드록시프로피온산 발효액을 정제하였다.
상기 1차 정제를 마친 발효액의 3-하이드록시프로피온산 농도는 50 내지 100 g/L 수준이며, 상기 발효액은 Rotary evaporator(섭씨 50 도, 50 mbar)를 이용하여 농축 농도 600 g/L로 농축하여 농축액을 제조하고, 상온에서 교반(300rpm)하여 Ca(3HP)2 결정을 생성하였다. 이때, 상기 농축액에서 상기 알칼리 금속염의 농도는 493.3 g/L (Ca(OH)2 기준) 이었다.
상기 생성된 결정을 에탄올(EtOH)을 이용해 3번 세척(washing)하고, 섭씨 50도의 오븐에서 건조하여 최종적으로 결정을 회수하였다. 상기 결정의 무게를 측정하고, 결정을 물에 녹여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용해 3-하이드록시프로피온산(3HP)의 양을 정량하여 결정 내 3-하이드록시프로피온산 양을 측정하였고, 발효액 내에서 HPLC로 측정된 3-하이드록시프로피온산 양과 비교해 회수율을 측정하였다 (수학식 1).
[수학식 1]
3HP 회수율(%) = {(결정 내 3HP 함량)/(결정화 전 발효액의 3HP 함량)}*100
결정으로 회수한 3-하이드록시프로피온산 회수율은 약 92%로 측정되었다.
실시예 2. Mg(3HP) 2 결정 제조
상기 실시예 1과 실질적으로 동일한 방법으로 발효 과정을 수행하되, 알칼리 금속염으로 Ca(OH)2 대신 Mg(OH)2를 사용하였고, 농축하여 Mg(3HP)2 결정을 생성 및 회수하였다.
하기 표 1에 각 농축액의 농축 농도별 Mg(3HP)2 결정 회수율을 나타내었다.
농축 농도(g/L) 결정을 통한 3HP 회수율 (%)
461.2 92.4
527.9 94.3
576.2 95.9
800.0 96.5
상기 표 1에서 확인되는 바와 같이, 농축 이후 결정화 결과 90% 이상의 3-하이드록시프로피온산이 회수되어 결정화를 통한 3-하이드록시프로피온산의 회수율이 우수함이 확인되었다.
비교예 1. 발효 후 황산으로 적정
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 발효 과정을 수행 후, 황산(H2SO4)을 이용해 pH 2까지 발효액을 적정하였다. 적정 과정에서 생성된 석고(Gypsum, Ca(SO)4)를 제거하여 3-하이드록시프로피온산의 양성자 추가(protonation)를 진행하였다.
상기 석고를 제거한 발효액을 상기 실시예 1과 실질적으로 동일한 방법으로 1차 정제 및 농축하고 결정 생성 가부를 확인하였다.
그러나, 농축 과정에서 600 g/L (3HP 기준) 농축한 경우에는 결정이 생성되지 않았으며, 1000 g/L (3HP 기준)까지 농축을 실시한 경우에도 결정의 생성이 확인되지 않았다.
<시험예>
1. 결정 내 3-하이드록시프로피온산염의 순도 분석
이온 크로마토그래피(Ion chromatography, IC) 분석 (Dionex Aquion; Eluent: 20mM Methanesulfonic Acid; Column: Dionex IonPac CS12A; Flow Rate: 1.0ml/min; Suppressor: Dionex CERS 500 4mm; Current: 59 mA)을 수행하여 상기 실시예 1 및 실시예 2에서 얻은 3-하이드록시프로피온산염 결정의 양이온 분석을 수행하여 결정 내 각 3-하이드록시프로피온산염의 순도를 확인하였다.
하기 표 2에는 실시예 1의 Ca(3HP)2 결정의 양이온 분석 결과를, 하기 표 3에 실시예 2의 Mg(3HP)2 결정의 각 농축 농도별 3-하이드록시프로피온산염의 순도 측정 결과를 나타내었다.
Cation 종류 Ca(3HP)2 결정
ppm Composition (%)
Na+ 3.06 0.81
Mg2+ 1.26 0.33
Ca2+ 374.42 98.53
K+ 1.26 0.33
Total Cation 380.00 100.00
실시예 2 농축 농도(g/L) Mg(3HP)2 순도
461.2 93.2
527.9 92.9
576.2 93.0
800.0 93.5
상기 표 2 및 3을 참고하면, 실시예 1 및 2에서 결정 내 3-하이드록시프로피온산염의 순도는 92.9 % 이상임을 확인했고, 실시예 1의 순도의 경우 상기 표 2의 Cation 종류 중 Ca2+의 비율로 Ca(3HP)2의 순도를 확인한 결과, 98% 이상으로 매우 우수한 순도를 나타내었다는 점을 확인했다.
2. 결정 내 3-하이드록시프로피온산 분석
실시예 1 및 실시예 2에서 얻은 3-하이드록시프로피온산염 결정 내 3-하이드록시프로피온산의 함량을 분석하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석을 수행하였다. 구체적인 HPLC 수행 조건은 하기 표 4에 나타내었다.
구분 특질(Quality)
검출기 RI / UV detector
컬럼 Bio-Rad Aminex HPX-87H Ion Exclusion Column 300 mm×7.8mm
이동상(Mobile Phase) 0.5 mM H2SO4
유량(Flow Rate) 0.4 mL/min
실행 시간(Run Time) 35 min
컬럼 온도 35℃
검출기 온도 35℃
주입 부피(Injection Volume) 10 ㎕
실시예 1 및 실시예 2의 결정에 대한 HPLC 수행 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 하기 표 5에서 결정 중 3-하이드록시프로피온산염은 실시예 1의 경우 Ca(3HP)2를, 실시예 2의 경우 Mg(3HP)2를 의미한다.
종류 결정 질량(g) 결정 내 3HP 질량 (g) 결정 중 3HP 염 질량 (g) 결정 순도 (%)
실시예 1 0.2426 0.1880 0.2302 94.89
실시예 2 0.2580 0.2118 0.2404 93.20
상기 표 5를 참고하면, 실시예 1 및 실시예 2의 결정에 대한 HPLC 수행 결과로 나타나는 결정 내 3HP염의 순도도 93.20% 이상임을 확인했다.
3. 3-하이드록시프로피온산염 결정의 입도 분석
입도 분석기(Size and Shape Particle Analyzer; Microtrac TurboSync)를 사용하여 실시예 1의 3-하이드록시프로피온산염 결정(Ca(3HP)2)과 실시예 2의 3-하이드록시프로피온산염 결정(Mg(3HP)2)의 D10, D50, D90, 부피 평균 입경, 개수 평균 입경 및 체적 평균 입경을 각각 측정하고, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
또한, 상기 입도 분석기를 사용하여 실시예 1 및 2의 3-하이드록시프로피온산염 결정의 D10, D50 및 D90 각각에서의 종횡비(LW Ratio; Length to width ratio)와 평균 종횡비를 측정하여, 하기 표 7에 나타내었다.
농축 농도 (g/L) D10 (㎛) D50 (㎛) D90 (㎛) 부피 평균 입경(MV, ㎛) 개수 평균 입경(MN, ㎛) 체적 평균 입경(MA, ㎛)
실시예1 600 27.41 71.40 170.40 88.71 18.99 53.45
실시예2 800 13.68 36.50 74.02 41.30 5.13 24.81
D10 종횡비 D50 종횡비 D90 종횡비 평균 종횡비
실시예1 27.41 71.40 170.40 88.71
실시예2 13.68 36.50 74.02 41.30
종횡비(LW Ratio; Length to width ratio)상기 표 6 및 7을 참고하면, 실시예 1 및 2의 입자 크기 분포 D10이 13.68 내지 27.41 ㎛이고, 입자 크기 분포 D50이 36.50 내지 71.40 ㎛이고, 입자 크기 분포 D90이 74.02 내지 170.40이고, (D90-D10)/D50이 실시예 1은 2.00이고, 실시예 2는 1.65이고, 부피 평균 입경이 41.30 내지 88.71 ㎛이고, 개수 평균 입경이 5.13 내지 18.99 ㎛이고, 체적 평균 입경이 24.81 내지 53.45 ㎛이고, D10 종횡비 (LW Ratio; Length to width ratio)가 13.68 내지 27.41이고, D50 종횡비가 36.50 내지 71.40이고, D90 종횡비가 74.02 내지 170.40이고, 평균 종횡비가 41.30 내지 88.71임을 확인했다.
4. 3-하이드록시프로피온산염 결정의 수분 함량 분석
Metrohm사의 칼-피셔 적정기를 이용하여 실시예 1의 3-하이드록시프로피온산염 결정 (Ca(3HP)2)과 실시예 2의 3-하이드록시프로피온산염 결정 (Mg(3HP)2)의 수분 함량을 분석하고, 하기 표 8에 나타내었다.
농축 농도 (g/L) 수분 함량 (ppm)
실시예1 600 351
실시예2 800 4370
상기 표 8을 참고하면, 실시예 1 및 2의 수분 함량이 351 내지 4370 ppm임을 확인했다.
5. 3- 하이드록시프로피온산염 결정 내 바이오 탄소 함량 분석
ASTM D 6866-21(Method B)를 이용하여 실시예 1의 3-하이드록시프로피온산염 결정 (Ca(3HP)2)과 실시예 2의 3-하이드록시프로피온산염 결정 (Mg(3HP)2)의 방사성 탄소 동위원소 비율(pMC) 및 바이오 탄소 함량을 분석하고, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
상기 바이오 탄소 함량은 실시예 1 및 2의 3-하이드록시프로피온산염 결정에 각각 포함된 바이오 탄소의 함량을 의미하고, 방사성 탄소 동위원소 비율(pMC)는 3-하이드록시프로피온산염 결정에 포함된 방사성 탄소 동위원소(14C)와 현대의 기준 참고 물질의 방사성 탄소 동위원소(14C)의 비율을 의미한다.
농축 농도 (g/L) 방사성 탄소 동위원소 비율(pMC) 바이오 탄소 함량 (%)
실시예1 600 101.52 100
실시예2 800 102.23 100
- pMC: percent Modern Carbon; 퍼센트 현대 탄소
상기 표 9를 참고하면, 상기 실시예 1 및 2의 3HP염 결정 모두 pMC가 101 이상이고, 바이오 탄소의 함량 또한 100%임을 확인하였다.
6. 3-하이드록시프로피온산염 결정에 대한 X선 회절(XRD) 분석
실시예 1과 2에서 제조된 결정에 대해 1.54 Å의 파장의 Cu-Kα선을 조사하여 반사 모드의 X-선 회절(XRD) 패턴을 측정하였다.
측정 장비는 Bruker AXS D4 Endeavor XRD 를 이용하였다. 사용 전압 및 전류는 각각 40 kV 및 40 mA이며, 사용한 옵틱스(optics) 및 검출기(detector)는 다음과 같다.
-Primary (incident beam) optics: motorized divergence slit, soller slit 2.3°
-Secondary (diffracted beam) optics: soller slit 2.3°
-LynxEye detector (1D detector)
도 1 및 2는 실시예 1의 3-하이드록시프로피온산염 결정의 X선 회절 분석 결과 그래프이고, 도 3 및 4는 실시예 2의 3-하이드록시프로피온산염 결정의 X선 회절 분석 결과 그래프이다.
도 1 및 2의 XRD 그래프에서 번호가 부여된 피크의 2θ 값 및 격자 면 간격(d값)을 하기 표 10에 나타내었고, 도 3 및 4의 XRD 그래프에서 번호가 부여된 피크의 2θ 값 및 격자 면 간격(d값)을 하기 표 11에 나타내었다.
피크 No. 2θ 값(°) 격자 면 간격(d값, Å) 피크 No. 2θ 값(°) 격자 면 간격(d값, Å)
1 10.0-11.0 8.37 8 20.6-21.2 4.24
2 11.1-11.6 7.75 9 21.5-22.0 4.10
3 11.6-12.4 7.38 10 22.0-22.4 4.01
4 12.9-13.3 6.75 11 23.2-23.7 3.78
5 14.1-14.5 6.17 12 23.9-24.3 3.69
6 17.2-17.6 5.08 13 26.9-27.2 3.29
7 19.2-19.8 4.55 14 29.2-29.6 3.03
피크 No. 2θ 값(°) 격자 면 간격(d값, Å) 피크 No. 2θ 값(°) 격자 면 간격(d값, Å)
1 8.5-9.2 9.84 6 16.8-17.3 5.29
2 9.5-10.3 8.82 7 20.7-21.0 4.24
3 12.0-12.7 7.10 8 23.3-23.7 3.85
4 12.9-13.2 6.77 9 24.0-24.4 3.66
5 13.5-14.0 5.95 - - -
상기 표 10 및 11를 통해, 실시예 1에서 제조된 3-하이드록시프로피온산염 결정은 Ca(3HP)2이고, 실시예 2에서 제조된 3-하이드록시프로피온산염 결정은 Mg(3HP)2이라는 점을 확인했다.
7. 3-하이드록시프로피온산염 결정에 대한 시차주사열량계(DSC) 분석
실시예 1 및 2의 결정에 대해 시차 주사 열량계 (TA 인스트루먼트사 제조「DSC (Q2000)」)를 사용하여, 각각의 결정의 융점(Tm)을 확인하고, 실시예 1의 경우 승온 속도 10 ℃/분으로 -60 ℃ 내지 150 ℃의 범위에서 유리전이온도, 결정화 온도 등을 측정하였고, 실시예 2의 경우 승온 속도 10 ℃/분으로 -70 ℃ 내지 30 ℃의 범위에서 유리전이온도, 결정화 온도 등을 측정하고, 그 결과는 하기 표 12에 나타내었다.
도 5는 실시예 1의 3-하이드록시프로피온산염 결정(Ca(3HP)2)의 시차주사열량계(DSC) 분석 결과 그래프이고, 도 6은 실시예 2의 3-하이드록시프로피온산염 결정(Mg(3HP)2)의 시차주사열량계(DSC) 분석 결과 그래프이다.
유리전이온도(Tg, ℃) 융점(Tm, ℃) 결정화 온도(Tc, ℃) 결정화
안정구간		 금속
실시예1 -45 32 30 -40~30 Ca
실시예2 -40 155 150 -20~150 Mg
상기 표 12를 참고하면, 실시예 1 및 2의 유리전이온도가 -45 내지 -40 ℃이고, 융점이 32 내지 155 ℃이고, 결정화 온도가 30 내지 150 ℃임을 확인했다.

Claims (33)

  1. 알칼리 금속염 존재 하에, 3-하이드록시프로피온산을 300 g/L 이상 포함하는 농축액에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 형성하는 단계; 및
    상기 농축액에서 3-하이드록시프로피온산염의 결정을 분리하고 3-하이드록시프로피온산을 전환하는 단계;를 포함한,
    3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 알칼리 금속염은 Na+, Mg2+ 및 Ca2+로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 양이온을 포함하는,
    3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 알칼리 금속염은 Ca(OH)2, Mg(OH)2 또는 이들의 혼합물인,
    3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 농축액은 상기 3-하이드록시프로피온산을 350 g/L 이상 900 g/L 이하로 포함하는,
    3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 구조식 1 또는 구조식 2의 형태인,
    3-하이드록시프로피온산의 회수 공정:
    [구조식 1]
    Cation(3HP)n
    [구조식 2]
    Cation(3HP)n·mH2O
    상기 Cation는 양이온(Cation)이고,
    상기 3HP는 양이온과 결합하는 3-하이드록시프로피온산이고,
    상기 n은 양이온과 결합하는 3HP 수로, 1 이상의 정수이고,
    상기 m은 수화물에서의 물 분자 수로, 1 이상의 정수이다.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 입자 크기 분포 D50이 20 ㎛ 이상 90 ㎛ 이하이고, (D90-D10)/D50이 1.00 이상 3.00 이하인,
    3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 부피 평균 입경이 30 ㎛ 이상 100 ㎛ 이하이고, 개수 평균 입경이 1 ㎛ 이상 30 ㎛ 이하이고, 체적 평균 입경이 10 ㎛ 이상 70 ㎛ 이하인,
    3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 평균 종횡비(LW Ratio; Length to width ratio)가 0.50 이상 3.00 이하인,
    3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 칼 피셔 방법(Karl Fischer method)으로 측정된 수분 함량이 200 ppm 이상 5000 ppm 이하인,
    3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 ASTM D6866-21 규격으로 측정된 방사성 탄소 동위원소 함량이 20 pMC (percent modern carbon) 이상이고, 바이오 탄소의 함량은 20 중량% 이상인,
    3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 X선 회절(XRD) 분석으로 도출된 결정 내 원자들 간의 간격(d값)이 1.00 Å 이상 15.00 Å 이하인,
    3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 X선 회절(XRD) 분석 시, 2θ값이 8 내지 22°의 범위에서 결정 격자 간의 피크가 나타나는,
    3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 시차주사열량계(DSC) 분석 시, 유리전이 온도가 -55 ℃ 이상 -30 ℃ 이하인,
    3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 시차주사열량계(DSC) 분석 시, 융점이 30 ℃ 이상 170 ℃ 이하인,
    3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 시차주사열량계(DSC) 분석 시, 결정화 온도가 25 ℃ 이상 170 ℃ 이하인,
    3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 순도가 70% 이상인,
    3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  17. 제1항에 있어서,
    3-하이드록시프로피온산 생산능을 갖는 균주를 발효하여 3-하이드록시프로피온산 발효액을 생산하는 단계; 및
    상기 발효액을 농축하여 상기 3-하이드록시프로피온산을 300 g/L 이상 포함하는 농축액을 형성하는 단계;를 더 포함하는,
    3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산 발효액을 생산하는 단계 이후,
    상기 발효액에서 세포를 제거하는 단계; 또는
    상기 발효액을 여과 또는 정제하는 단계;를 더 포함하는,
    3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 농축액을 형성하는 단계에서 상기 농축은 발효액을 증발(evaporation)시켜 수행되는,
    3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  20. 제1항에 있어서,
    3-하이드록시프로피온산 회수율이 40% 이상인,
    3-하이드록시프로피온산의 회수 공정.
  21. 하기 구조식 1 또는 구조식 2으로 표시되는 3-하이드록시프로피온산염의 결정:
    [구조식 1]
    Cation(3HP)n
    [구조식 2]
    Cation(3HP)n·mH2O
    상기 Cation는 양이온(Cation)이고,
    상기 3HP는 양이온과 결합하는 3-하이드록시프로피온산이고,
    상기 n은 양이온과 결합하는 3HP 수로, 1 이상의 정수이고,
    상기 m은 수화물에서의 물 분자 수로, 1 이상의 정수이다.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 입자 크기 분포 D50이 20 ㎛ 이상 90 ㎛ 이하이고, (D90-D10)/D50이 1.00 이상 3.00 이하인,
    3-하이드록시프로피온산염의 결정.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 평균 종횡비(LW Ratio; Length to width ratio)가 0.50 이상 3.00 이하인,
    3-하이드록시프로피온산염의 결정.
  24. 제21항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 ASTM D6866-21 규격으로 측정된 방사성 탄소 동위원소 함량이 20 pMC (percent modern carbon) 이상이고, 바이오 탄소의 함량은 20 중량% 이상인,
    3-하이드록시프로피온산염의 결정.
  25. 제21항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 X선 회절(XRD) 분석으로 도출된 결정 내 원자들 간의 간격(d값)이 1.00 Å 이상 15.00 Å 이하인,
    3-하이드록시프로피온산염의 결정.
  26. 제21항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 X선 회절(XRD) 분석 시, 2θ값이 8 내지 22°의 범위에서 결정 격자 간의 피크가 나타나는,
    3-하이드록시프로피온산염의 결정.
  27. 제21항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 시차주사열량계(DSC) 분석 시, 유리전이 온도가 -55 ℃ 이상 -30 ℃ 이하인,
    3-하이드록시프로피온산염의 결정.
  28. 제21항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 시차주사열량계(DSC) 분석 시, 융점이 30 ℃ 이상 170 ℃ 이하인,
    3-하이드록시프로피온산염의 결정.
  29. 제21항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정 내부에 포함된 상기 3-하이드록시프로피온산염의 순도는 70% 이상인,
    3-하이드록시프로피온산염의 결정.
  30. 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염 또는 이의 수화물을 포함하고,
    ASTM D6866-21 규격으로 측정된 바이오 탄소의 함량은 20 중량% 이상인,
    3-하이드록시프로피온산염의 결정.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산의 알카리 금속염은 3-하이드록시프로피온산의 칼슘염 또는 마그네슘염인, 3-하이드록시프로피온산염의 결정.
  32. 제30항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 부피 평균 입경이 30 ㎛ 이상 100 ㎛ 이하이고, 개수 평균 입경이 1 ㎛ 이상 30 ㎛ 이하이고, 체적 평균 입경이 10 ㎛ 이상 70 ㎛ 이하인, 3-하이드록시프로피온산염의 결정.
  33. 제30항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산염의 결정은 평균 종횡비(LW Ratio; Length to width ratio)가 0.50 이상 3.00 이하인, 3-하이드록시프로피온산염의 결정.
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