WO2021085997A1 - 공융용매를 이용한 우르소데옥시콜산의 제조방법 - Google Patents

공융용매를 이용한 우르소데옥시콜산의 제조방법 Download PDF

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WO2021085997A1
WO2021085997A1 PCT/KR2020/014774 KR2020014774W WO2021085997A1 WO 2021085997 A1 WO2021085997 A1 WO 2021085997A1 KR 2020014774 W KR2020014774 W KR 2020014774W WO 2021085997 A1 WO2021085997 A1 WO 2021085997A1
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WO
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udca
reaction
eutectic solvent
cdca
7βhsdh
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PCT/KR2020/014774
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김희택
류미희
정예진
송봉근
강경희
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한국화학연구원
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01159—7-Alpha-hydroxysteroid dehydrogenase (1.1.1.159)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01201—7-Beta-hydroxysteroid dehydrogenase (NADP+) (1.1.1.201)

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing ursodeoxycholic acid using a eutectic solvent, and more specifically, the present invention relates to a eutectic solvent, 7 ⁇ HSDH (7 alpha-hydroxy steroid dehydrogenase), and 7 ⁇ HSDH (7 beta-hydroxy steroid dehydrogenase) containing UDCA.
  • a composition for producing (ursodeoxycholic acid), a kit for producing ursodeoxycholic acid (UDCA) containing the composition, and a method for producing UDCA from CDCA (Chenodeoxycholic acid) using 7 ⁇ HSDH and 7 ⁇ HSDH under the conditions of a reaction solvent including a eutectic solvent will be.
  • Bile acids are biomolecules necessary for digestion and absorption of fats, fatty acids and hydrophobic vitamins.
  • the bile acid found only in small amounts in humans is ursodeoxycholic acid (UDCA). It has recently gained great therapeutic importance in the dissolution of cholesterol-containing gallstones. These compounds are produced industrially in tonnage quantities in chemical or enzymatic steps.
  • An important precursor for the synthesis of UDCA is 12-ketoursodeoxycholic acid, which can be converted to UDCA by Wolf-Kishner reduction.
  • the synthetic pathway of 12-ketoursodeoxycholic acid described in the literature begins with cholic acid (3 ⁇ ,7 ⁇ ,12 ⁇ -trihydroxy-5 ⁇ -cholanic acid), which is catalyzed by 7 ⁇ -HSDH and 12 ⁇ -HSDH.
  • Korean Patent No. 10-2023208 discloses a method for synthesizing UDCA using a 7 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase mutant
  • Korean Patent Publication No. 10-2017-0036797 discloses a new 3 ⁇ -A method of synthesizing UDCA using a hydroxysteroid dehydrogenase mutant is disclosed.
  • the present inventors have made intensive research efforts to develop a method for producing UDCA more easily, and as a result, when using a eutectic solvent, it has been confirmed that UDCA can be effectively produced by a single reaction, and the present invention has been completed.
  • the main object of the present invention is to provide a composition for producing ursodeoxycholic acid (UDCA) comprising a eutectic solvent, 7 ⁇ HSDH (7 alpha-hydroxy steroid dehydrogenase) and 7 ⁇ HSDH (7 beta-hydroxy steroid dehydrogenase).
  • UDCA ursodeoxycholic acid
  • Another object of the present invention is to provide a kit for producing UDCA (ursodeoxycholic acid) comprising the composition.
  • UDCA ursodeoxycholic acid
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing UDCA from CDCA (Chenodeoxycholic acid) using 7 ⁇ HSDH and 7 ⁇ HSDH under the conditions of a reaction solvent containing a eutectic solvent.
  • Another object of the present invention is to provide the use of a eutectic solvent for producing UDCA from CDCA using 7 ⁇ HSDH and 7 ⁇ HSDH.
  • composition for producing UDCA provided by the present invention
  • UDCA can be produced in high yield from CDCA using an enzymatic reaction in which the reverse reaction is not performed, it will be widely used in the production of various products using UDCA.
  • 1 is a schematic diagram showing a process for producing UDCA from CDCA using 7 ⁇ HSDH and 7 ⁇ HSDH.
  • 2A is a graph showing the result of comparing the change in the production yield of 7-keto LCA according to the treatment concentration of 7 ⁇ HSDH when 7 ⁇ HSDH and LDH are used to generate 7-keto LCA from CDCA.
  • 2B is a graph showing the result of comparing the change in the production yield of 7-keto LCA according to the treatment concentration of LDH when 7 ⁇ HSDH and LDH are used to generate 7-keto LCA from CDCA.
  • 3A is a graph comparing the change in concentration of CDCA and 7-keto LCA over time of a reaction for generating 7-keto LCA from CDCA using 7 ⁇ HSDH and LDH in phosphate buffer conditions.
  • 3B is a graph comparing the change in concentration of 7-keto LCA and UDCA over time of the reaction for generating UDCA from 7-keto LCA using 7 ⁇ HSDH and GDH in a phosphate buffer condition.
  • Figure 3c is a graph comparing the concentration change of CDCA, 7-keto LCA and UDCA over time of the reaction to generate UDCA from CDCA by a stepwise reaction using 7 ⁇ HSDH, LDH, 7 ⁇ HSDH and GDH in a phosphate buffer condition.
  • Figure 3d is a graph comparing the concentration change of CDCA, 7-keto LCA, and UDCA over time of the reaction to generate UDCA from CDCA by a single reaction using 7 ⁇ HSDH, LDH, 7 ⁇ HSDH and GDH in a phosphate buffer condition.
  • 3E is a photograph showing the result of confirming whether or not a white precipitate is generated by adding gluconic acid to 7-keto LCA.
  • 3F is a photograph showing the result of confirming whether or not a white precipitate is generated by adding gluconic acid to UDCA.
  • 3G is a graph showing the result of measuring the pH change of the reaction solutions of Experimental Groups 1 and 2 as the reaction time elapsed.
  • 3H is a graph showing the level of change in the UDCA conversion rate measured in the reaction solutions of Experimental Groups 1, 2, and 3 over the course of the reaction time.
  • 3I is a graph showing the results of comparing the UDCA conversion rates measured in the reaction solutions of Experimental Groups 1, 2, and 3 after 9 hours have elapsed.
  • FIG. 4 is a photograph and graph showing the experimental process and results of selecting a eutectic solvent for producing UDCA from CDCA by a single reaction.
  • 5 is a graph showing the result of comparing the conversion rate of 7-keto LCA converted by the 7 ⁇ HSDH enzymatic reaction using a eutectic solvent of various concentrations (20, 40 or 60%) over the course of the reaction time.
  • 6A is a graph showing the result of comparing the conversion rate of UDCA converted by the 7 ⁇ HSDH enzymatic reaction using a eutectic solvent of various concentrations (20, 40 or 60%) over the course of the reaction time.
  • 6B is a photograph showing the result of photographing a reaction product obtained by performing a 7 ⁇ HSDH enzymatic reaction using 0 to 20% eutectic solvent.
  • Figure 7a is a graph comparing the concentration change of CDCA, 7-keto LCA and UDCA over time of the reaction to generate UDCA from CDCA by a single reaction using 7 ⁇ HSDH, LDH, 7 ⁇ HSDH and GDH under 20% eutectic solvent conditions. .
  • Figure 7b is a graph showing the result of comparing the final conversion (molar ratio) of CDCA, 7-keto LCA, and UDCA when performing a single reaction using a eutectic solvent of various concentrations.
  • Figure 7c shows the result of comparing the change in conversion (molar ratio) of CDCA, 7-keto LCA and UDCA according to the lapse of reaction time when a single reaction is performed using 0, 20, 40 or 60% eutectic solvent. It is a graph showing.
  • 7D is a graph showing the result of comparing the final conversion rate (molar ratio) of UDCA when a single reaction is performed using a eutectic solvent of various concentrations under conditions in which the concentrations of 7 ⁇ HSDH and GDH are increased.
  • 7E is a comparison of the change in the conversion rate (molar ratio) of UDCA with the passage of the reaction time when a single reaction is performed using 0, 20 or 40% eutectic solvent under the condition of increasing the concentration of 7 ⁇ HSDH and GDH. It is a graph showing the results.
  • Figure 7f shows the conversion rate of CDCA, 7-keto LCA, and UDCA according to the lapse of reaction time when a single reaction is performed using a 20% eutectic solvent under the condition that the concentration of each component involved in the single reaction is increased ( It is a graph showing the result of comparing the change in molar ratio).
  • One embodiment of the present invention for achieving the above object provides a composition for producing UDCA (ursodeoxycholic acid) comprising a eutectic solvent, 7 ⁇ HSDH (7 alpha-hydroxy steroid dehydrogenase) and 7 ⁇ HSDH (7 beta-hydroxy steroid dehydrogenase). .
  • UDCA ursodeoxycholic acid
  • deep eutectic solvent of the present invention means a substance that becomes liquid at a temperature lower than the melting point of each compound when a solid or liquid compound existing in nature is mixed in an appropriate ratio at room temperature.
  • organic solvents since it is cheaper than organic solvents, is easy to produce, and is composed of biodegradable materials, it is used for various materials development.
  • the eutectic solvent may be one containing HBA (Hydrogen bonding acceptors) and HBD (Hydrogen Bonding Donor), and as the HBA, betaine monohydrate may be used, and as the HBD, propylene glycol Can be used.
  • HBA Hydrophilicity Agent
  • HBD Hydrophilicity Agent
  • 7 ⁇ HSDH (7 alpha-hydroxy steroid dehydrogenase) of the present invention means an enzyme exhibiting the activity of converting the CDCA into 7-keto LCA (7-Ketolithocholic acid).
  • the 7 ⁇ HSDH is not particularly limited thereto, but as an example, it may be derived from the Escherichia coli strain, and as another example, GenBank No. It could be of SMB28026.1.
  • NAD for activating 7 ⁇ HSDH In order to perform the reaction of converting CDCA to 7-keto LCA using the 7 ⁇ HSDH, in addition to 7 ⁇ HSDH and CDCA, NAD for activating 7 ⁇ HSDH, LDH involved in the production of NAD, and sodium pyruvate for activating the LDH were used. in need.
  • 7 ⁇ HSDH (7 beta-hydroxy steroid dehydrogenase) of the present invention means an enzyme exhibiting the activity of converting 7-keto LCA into UDCA/
  • the 7 ⁇ HSDH is not particularly limited thereto, but as an example, it may be derived from the Ruminococcus gnavus strain, and as another example, GenBank No. It could be of SMB28026.1.
  • the composition of the present invention comprising the 7 ⁇ HSDH and 7 ⁇ HSDH is used to convert CDCA to UDCA. You can (Fig. 1).
  • 1 is a schematic diagram showing a process for producing UDCA from CDCA using 7 ⁇ HSDH and 7 ⁇ HSDH.
  • the 7 ⁇ HSDH and 7 ⁇ HSDH exhibit enzymatic activity even under general buffer conditions such as phosphate buffer, so that CDCA can be converted to UDCA, but when a eutectic solvent is used, the conversion rate to UDCA can be improved.
  • Another embodiment of the present invention provides a kit for producing ursodeoxycholic acid (UDCA) comprising the composition.
  • UDCA ursodeoxycholic acid
  • the kit for producing UDCA of the present invention may be used to produce UDCA from CDCA, including the composition for producing UDCA, but is not particularly limited thereto, but one or more other constituent compositions, solutions, or devices suitable for the reaction are Can be included.
  • NAD NAD
  • NADP NAD
  • LDH NAD
  • GDH GDH
  • sodium pyruvate glucose, etc. required for 7 ⁇ HSDH and 7 ⁇ HSDH reactions included in the composition may be additionally included.
  • it may further include a phosphate buffer solution required for the reaction, a reaction vessel for performing the reaction, a timer for performing the reaction, and the like.
  • Another embodiment of the present invention provides a method of producing UDCA from CDCA by a two-step reaction using the composition.
  • the method of producing UDCA from CDCA by a two-step reaction is (a) 7-keto by reacting CDCA (Chenodeoxycholic acid) and 7 ⁇ HSDH (7 alpha-hydroxy steroid dehydrogenase) under the conditions of a reaction solvent containing a eutectic solvent. Obtaining LCA (7-Ketolithocholic acid); And, (b) reacting the obtained 7-keto LCA with 7 ⁇ HSDH (7 beta-hydroxy steroid dehydrogenase) under conditions of a reaction solvent including a eutectic solvent, thereby obtaining UDCA (ursodeoxycholic acid).
  • the eutectic solvent used in step (a) includes betaine hydrate (HBA) and propylene glycol (HBD), but rather than using the eutectic solvent alone, a reaction solvent including the eutectic solvent and phosphate buffer can be used. have.
  • the content of the eutectic solvent contained in the reaction solvent is not particularly limited thereto, but as an example, it may be 1 to 40% (v/v), and as another example, it may be 10 to 30% (v/v). And, as another example, it may be 20% (v/v).
  • NAD NAD
  • LDH sodium pyruvate
  • the eutectic solvent used in step (b) includes betaine hydrate (HBA) and propylene glycol (HBD), but rather than using the eutectic solvent alone, a reaction solvent including the eutectic solvent and phosphate buffer can be used. have.
  • the content of the eutectic solvent contained in the reaction solvent is not particularly limited thereto, but as an example, it may be 1 to 50% (v/v), and as another example, it may be 10 to 40% (v/v). And, as another example, it may be 30% (v/v).
  • NADP in addition to 7-keto LCA used as a substrate, NADP, GDH, and glucose may be used under conditions containing a eutectic solvent.
  • step (b) when the step (b) is performed, gelation is performed by gluconic acid generated from glucose, so that the final yield of UDCA may be reduced.
  • it may further include a step of titration so that the pH of the reactant maintains pH 8.0 while performing the reaction.
  • Another embodiment of the present invention provides a method of producing UDCA from CDCA by a single reaction using the composition.
  • the method of producing UDCA from CDCA by a single reaction is to produce UDCA in CDCA (Chenodeoxycholic acid), 7 ⁇ HSDH (7 alpha-hydroxy steroid dehydrogenase) and 7 ⁇ HSDH (7 beta-hydroxy steroid dehydrogenase) under the conditions of a reaction solvent containing a eutectic solvent. ) And reacting by adding them together.
  • the eutectic solvent used to perform the single reaction includes betaine hydrate (HBA) and propylene glycol (HBD), and rather than using the eutectic solvent alone, a reaction solvent including the eutectic solvent and phosphate buffer is used. I can.
  • the content of the eutectic solvent contained in the reaction solvent is not particularly limited thereto, but as an example, it may be 1 to 40% (v/v), and as another example, it may be 10 to 30% (v/v). And, as another example, it may be 20% (v/v).
  • NAD NAD
  • NADP NAD
  • LDH NAD
  • GDH GDH
  • sodium pyruvate glucose
  • glucose can be used under conditions containing a eutectic solvent.
  • Another embodiment of the present invention is to provide the use of a eutectic solvent for producing UDCA from CDCA using 7 ⁇ HSDH and 7 ⁇ HSDH.
  • 2A is a graph showing the result of comparing the change in the production yield of 7-keto LCA according to the treatment concentration of 7 ⁇ HSDH when 7 ⁇ HSDH and LDH are used to generate 7-keto LCA from CDCA.
  • 2B is a graph showing the result of comparing the change in the production yield of 7-keto LCA according to the treatment concentration of LDH when 7 ⁇ HSDH and LDH are used to generate 7-keto LCA from CDCA.
  • CDCA 20 g/L, NAD 5 mM, sodium pyruvate 50 mM, LDH 0.1 unit/mL, and 7 ⁇ HSDH 2 unit/mL were added to a buffer solution (50 mM potassium phosphate, pH 8), and reacted for 14 hours, after which the reaction time elapsed. Changes in the concentration of CDCA and 7-keto LCA were measured according to (Fig. 3a).
  • 3A is a graph comparing the change in concentration of CDCA and 7-keto LCA over time of a reaction for generating 7-keto LCA from CDCA using 7 ⁇ HSDH and LDH in phosphate buffer conditions.
  • Example 2-2 7 ⁇ HSDH (7 beta-hydroxy steroid dehydrogenase) enzyme reaction
  • 3B is a graph comparing the change in concentration of 7-keto LCA and UDCA over time of the reaction for generating UDCA from 7-keto LCA using 7 ⁇ HSDH and GDH in a phosphate buffer condition.
  • Example 2-3 cascade enzyme reaction of 7 ⁇ HSDH and 7 ⁇ HSDH
  • CDCA 20 g/L, NAD 5 mM, sodium pyruvate 50 mM, LDH 0.1 unit/mL, and 7 ⁇ HSDH 2 unit/mL were added to a buffer solution (50 mM potassium phosphate, pH 8), and reacted for 14 hours, and then the reaction was heated. Enzymatic activity was removed. Then, NADP 1 mM, glucose 100mM, GDH 0.1 unit/mL, and 7 ⁇ HSDH 2 unit/mL were added to the reaction product, and after reacting for 4 hours, the concentration of CDCA, 7-keto LCA and UDCA was changed according to the reaction time. Was measured (Fig. 3c).
  • Figure 3c is a graph comparing the concentration change of CDCA, 7-keto LCA and UDCA over time of the reaction to generate UDCA from CDCA by a stepwise reaction using 7 ⁇ HSDH, LDH, 7 ⁇ HSDH and GDH in a phosphate buffer condition.
  • Example 2-4 One pot enzyme reaction of 7 ⁇ HSDH and 7 ⁇ HSDH
  • Figure 3d is a graph comparing the concentration change of CDCA, 7-keto LCA, and UDCA over time of the reaction to generate UDCA from CDCA by a single reaction using 7 ⁇ HSDH, LDH, 7 ⁇ HSDH and GDH in a phosphate buffer condition.
  • UDCA was generated until 2 hours elapsed, but after that, UDCA was no longer generated, and only 7-keto LCA was generated, and it was confirmed that the conversion rate of UDCA was about 26%.
  • Example 2-5 Study on the gelation phenomenon that occurs during the 7 ⁇ HSDH enzyme reaction
  • Example 2-2 it was confirmed that the reaction product gelled during the 7 ⁇ HSDH enzyme reaction, and the cause of the gelation and the effect of the gelling reaction were to be investigated.
  • Figure 3e is a photograph showing the result of confirming whether a white precipitate is generated by adding gluconic acid to 7-keto LCA
  • Figure 3f is a photograph showing the result of confirming whether a white precipitate is generated by adding gluconic acid to UDCA .
  • phosphate buffers were prepared, one 50 mM phosphate buffer (Experimental group 1), the other 100 mM phosphate buffer (Experimental group 2), and the other 50 mM phosphate buffer, but the 7 ⁇ HSDH enzyme reaction process During the reaction time, a buffer solution (Experiment Group 3) maintaining pH 8.0 was prepared by performing a continuous titration.
  • Figure 3g is a graph showing the result of measuring the pH change of the reaction solutions in Experimental Groups 1 and 2 with the passage of the reaction time
  • Figure 3h is the UDCA measured in the reaction solutions of Experimental groups 1, 2 and 3 with the passage of the reaction time. It is a graph showing the level of change in the conversion rate
  • FIG. 3i is a graph showing the result of comparing the UDCA conversion rate measured in the reaction solutions of Experimental Groups 1, 2 and 3 after 9 hours have elapsed.
  • the conversion reaction was terminated when 1 hour elapsed from the start of the reaction, and it was confirmed that the pH of the reactant decreased to 7.1 during the conversion reaction, and then gradually increased.
  • the UDCA conversion rate was relatively high when the phosphate buffer was continuously appropriate for the reaction time, rather than the UDCA conversion rate when 50 mM phosphate buffer and 100 mM phosphate buffer were used.
  • choline chloride or betaine monohydrate is used as a candidate material for HBA (hydrogen bonding acceptor), and ethylene glycol (EG), glycerol ( Gly) or propylene glycol (PG) was used to select a eutectic solvent capable of dissolving CDCA.
  • HBA hydrogen bonding acceptor
  • EG ethylene glycol
  • Gly glycerol
  • PG propylene glycol
  • betaine hydrate showed a relatively high level of reaction conversion rate than choline chloride, and betaine hydrate was selected as HBA.
  • each eutectic mixture of the betaine hydrate and the HBD candidate material was 1:1, 1:2 or 1:3 (molar ratio), respectively.
  • a solvent was prepared.
  • CDCA, 7 ⁇ HSDH and 7 ⁇ HSDH were added to each of the prepared eutectic solvents to react, and then the concentration of CDCA, 7-keto-LCA or UDCA contained in the reaction product was measured and compared (FIG. 4 ).
  • FIG. 4 is a photograph and graph showing the experimental process and results of selecting a eutectic solvent for producing UDCA from CDCA by a single reaction.
  • each reaction solvent having a concentration of the eutectic solvent of 0, 10, 20, 30, 40, 50 or 60% was prepared.
  • CDCA 20 g/L, NAD 5 mM, sodium pyruvate 50 mM, LDH 0.1 unit/mL, and 7 ⁇ HSDH 2 unit/mL were added to each of the prepared reaction solvents, reacted for 14 hours, and then 7- The change in the concentration of keto LCA was measured, and the conversion rate of 7-keto LCA was calculated from this (FIG. 5 and Table 1).
  • 5 is a graph showing the result of comparing the conversion rate of 7-keto LCA converted by the 7 ⁇ HSDH enzymatic reaction using a eutectic solvent of various concentrations (20, 40 or 60%) over the course of the reaction time.
  • the concentration of the eutectic solvent for optimizing the 7 ⁇ HSDH enzymatic reaction was 20%.
  • each reaction solvent having a concentration of the eutectic solvent of 0, 10, 20, 30, 40, 50 or 60% was prepared.
  • 7-keto LCA 20 g/L, NADP 1 mM, glucose 100 mM, GDH 0.1 unit/mL, and 7 ⁇ HSDH 2 unit/mL were added, reacted for 6 hours, and then according to the course of the reaction time.
  • the change in the concentration of UDCA was measured, and the conversion rate of UDCA was calculated from this (FIG. 6A and Table 2).
  • 6A is a graph showing the result of comparing the conversion rate of UDCA converted by the 7 ⁇ HSDH enzymatic reaction using a eutectic solvent of various concentrations (20, 40 or 60%) over the course of the reaction time.
  • the concentration of the eutectic solvent for optimizing the 7 ⁇ HSDH enzymatic reaction was 40% or less.
  • 6B is a photograph showing the result of photographing a reaction product obtained by performing a 7 ⁇ HSDH enzymatic reaction using 0 to 20% eutectic solvent.
  • Example 6 One pot reaction using a eutectic solvent
  • Example 6-1 Single reaction using a eutectic solvent
  • Figure 7a is a graph comparing the concentration change of CDCA, 7-keto LCA and UDCA over time of the reaction to generate UDCA from CDCA by a single reaction using 7 ⁇ HSDH, LDH, 7 ⁇ HSDH and GDH under 20% eutectic solvent conditions. .
  • the concentration of 7-keto LCA, an intermediate product in the reaction product was maintained at 2.5% (molar ratio) or less, and it was confirmed that the final conversion rate of UDCA was about 89%.
  • Example 6-2 Optimal concentration of eutectic solvent for a single reaction
  • Figure 7b is a graph showing the result of comparing the final conversion (molar ratio) of CDCA, 7-keto LCA and UDCA when performing a single reaction using a eutectic solvent of various concentrations
  • Figure 7c is 0, 20, 40 or In the case of performing a single reaction using 60% eutectic solvent, it is a graph showing the result of comparing the change in the conversion rate (molar ratio) of CDCA, 7-keto LCA, and UDCA according to the lapse of reaction time.
  • Example 6-3 Single reaction by changing 7 ⁇ HSDH enzymatic reaction conditions
  • Figure 7d is a graph showing the result of comparing the final conversion rate (molar ratio) of UDCA in the case of performing a single reaction using a eutectic solvent of various concentrations under the condition of increasing the concentration of 7 ⁇ HSDH and GDH
  • Figure 7e is 7 ⁇ HSDH and This is a graph showing the result of comparing the change in the conversion rate (molar ratio) of UDCA over the course of the reaction time when a single reaction is performed using 0, 20 or 40% eutectic solvent under the condition of increasing the concentration of GDH. .
  • Example 6-4 Increasing the conversion rate of UDCA according to the adjustment of the reaction conditions in a single reaction
  • Example 6-3 From the results of Example 6-3, it was analyzed that when the concentration of each component was changed when performing a single reaction, the final conversion rate and reaction time of the final UDCA could be controlled. ), a single reaction was carried out.
  • CDCA Approximately, 50 g/L of CDCA, 5 mM NAD, 1 mM NADP, 125 mM sodium pyruvate, 250 mM glucose, 0.25 unit/mL LDH, 0.25 unit/mL GDH, 5 units/mL 7 ⁇ HSDH and 5 7 ⁇ HSDH in 20% eutectic solvent. After adding unit/mL and reacting for 18 hours, changes in the concentration of CDCA, 7-keto LCA, and UDCA were measured over the course of the reaction time (FIG. 7f).
  • Figure 7f shows the conversion rate of CDCA, 7-keto LCA, and UDCA according to the lapse of reaction time when a single reaction is performed using a 20% eutectic solvent under the condition that the concentration of each component involved in the single reaction is increased ( It is a graph showing the result of comparing the change in molar ratio).

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Abstract

본 발명은 공융용매, 7αHSDH(7 alpha-hydroxy steroid dehydrogenase) 및 7βHSDH(7 beta-hydroxy steroid dehydrogenase)를 포함하는 UDCA(ursodeoxycholic acid) 생산용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 UDCA(ursodeoxycholic acid) 생산용 키트 및 공융용매를 포함하는 반응용매 조건하에서 7αHSDH와 7βHSDH를 이용하여 CDCA(Chenodeoxycholic acid)로부터 UDCA를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 UDCA 생산용 조성물을 이용하면, 역반응이 수행되지 않는 효소반응을 이용하여 CDCA로부터 UDCA를 고효율로 생산할 수 있으므로, UDCA를 이용한 다양한 제품의 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

공융용매를 이용한 우르소데옥시콜산의 제조방법
본 발명은 공융용매를 이용한 우르소데옥시콜산의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 공융용매, 7αHSDH(7 alpha-hydroxy steroid dehydrogenase) 및 7βHSDH(7 beta-hydroxy steroid dehydrogenase)를 포함하는 UDCA(ursodeoxycholic acid) 생산용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 UDCA(ursodeoxycholic acid) 생산용 키트 및 공융용매를 포함하는 반응용매 조건하에서 7αHSDH와 7βHSDH를 이용하여 CDCA(Chenodeoxycholic acid)로부터 UDCA를 생산하는 방법에 관한 것이다.
담즙산은 지방, 지방산 및 소수성 비타민의 소화 및 흡수에 필요한 생체분자이다. 인간에서 단지 소량으로만 발견되는 담즙산은 우르소데옥시콜산(UDCA)이다. 이는 최근에, 콜레스테롤-포함 담석의 용해에 있어서 큰 치료적 중요성을 얻었다. 이러한 화합물은 화학적 단계 또는 효소적 단계에서 톤 단위의 양(tonne quantity)으로 공업적으로 생산된다. UDCA의 합성에 대한 중요한 전구체는 12-케토우르소데옥시콜산이며, 이는 볼프-키슈너 환원(Wolff-Kishner reduction)에 의해 UDCA로 전환될 수 있다. 문헌에 기술된 12-케토우르소데옥시콜산의 합성 경로는 콜산(3α,7α,12α-트리하이드록시-5β-콜란산)으로 시작하며, 이는 7α-HSDH 및 12α-HSDH에 의해 촉매화되는 2개의 산화 단계, 및 7β-HSDH에 의해 촉매화되는 1개의 환원 단계에 의해 제조될 수 있다. 추가적인 경로는 7-케토리토콜산으로 시작하며, 이는 7-케토기를 입체선택적으로 환원시킴으로써 UDCA로 전환될 수 있으며; 이러한 단계는 또한, 7β-HSDH에 의해 촉매화되는 효소적 촉매 작용을 이용하여 유리하게 수행된다. 추가적인 유리한 합성 경로는 데하이드로콜산(DHCA)으로 시작하며, 이는 2개의 환원 단계에 의해 12-케토우르소데옥시콜산으로 전환될 수 있으며; 이들 2개의 단계는 2개의 입체선택적 HSDH(3α-HSDH 및 7β-HSDH)에 의해 촉매화될 수 있다.
이같은 UDCA의 합성경로를 개량하기 위한 다양한 연구가 수행되고 있다. 예를 들어, 한국등록특허 제10-2023208호에는 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나제 돌연변이체를 사용하여 UDCA를 합성하는 방법이 개시되어 있고, 한국공개특허 제10-2017-0036797호에는 신규 3α-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제 돌연변이체를 사용하여 UDCA를 합성하는 방법이 개시되어 있다.
본 발명자들은 보다 용이하게 UDCA를 생산하는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 공융용매를 사용할 경우, 단일반응에 의해 효과적으로 UDCA를 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 공융용매, 7αHSDH(7 alpha-hydroxy steroid dehydrogenase) 및 7βHSDH(7 beta-hydroxy steroid dehydrogenase)를 포함하는 UDCA(ursodeoxycholic acid) 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 UDCA(ursodeoxycholic acid) 생산용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 공융용매를 포함하는 반응용매 조건하에서 7αHSDH와 7βHSDH를 이용하여 CDCA(Chenodeoxycholic acid)로부터 UDCA를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 7αHSDH와 7βHSDH를 이용하여 CDCA로부터 UDCA 를 생산하기 위한 공융용매의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명에서 제공하는 UDCA 생산용 조성물을 이용하면, 역반응이 수행되지 않는 효소반응을 이용하여 CDCA로부터 UDCA를 고수율로 생산할 수 있으므로, UDCA를 이용한 다양한 제품의 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 7αHSDH 및 7βHSDH를 사용하여 CDCA로부터 UDCA를 생산하는 공정을 나타내는 개략도이다.
도 2a는 7αHSDH와 LDH를 사용하여 CDCA로부터 7-keto LCA를 생성할 때, 7αHSDH의 처리농도에 따른 7-keto LCA의 생성수율의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2b는 7αHSDH와 LDH를 사용하여 CDCA로부터 7-keto LCA를 생성할 때, LDH의 처리농도에 따른 7-keto LCA의 생성수율의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 인산완충액 조건에서 7αHSDH와 LDH를 사용하여 CDCA로부터 7-keto LCA를 생성하는 반응의 시간경과에 따른 CDCA 및 7-keto LCA의 농도변화를 비교한 그래프이다.
도 3b는 인산완충액 조건에서 7βHSDH와 GDH를 사용하여 7-keto LCA로부터 UDCA를 생성하는 반응의 시간경과에 따른 7-keto LCA 및 UDCA의 농도변화를 비교한 그래프이다.
도 3c는 인산완충액 조건에서 7αHSDH, LDH, 7βHSDH 및 GDH를 사용한 단계별 반응에 의하여 CDCA로부터 UDCA를 생성하는 반응의 시간경과에 따른 CDCA, 7-keto LCA 및 UDCA의 농도변화를 비교한 그래프이다.
도 3d는 인산완충액 조건에서 7αHSDH, LDH, 7βHSDH 및 GDH를 사용한 단일반응에 의하여 CDCA로부터 UDCA를 생성하는 반응의 시간경과에 따른 CDCA, 7-keto LCA 및 UDCA의 농도변화를 비교한 그래프이다.
도 3e는 7-keto LCA에 글루콘산을 가하고 희색 침전물이 생성되는지의 여부를 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3f는 UDCA에 글루콘산을 가하고 희색 침전물이 생성되는지의 여부를 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3g는 반응시간의 경과에 따른, 실험군 1 및 2 반응액의 pH 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3h는 반응시간의 경과에 따른, 실험군 1, 2 및 3 반응액에서 측정된 UDCA 전환율 변화수준을 나타내는 그래프이다.
도 3i는 9시간이 경과된 후, 실험군 1, 2 및 3 반응액에서 측정된 UDCA 전환율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 단일반응에 의해 CDCA로부터 UDCA를 생산하기 위한 공융용매를 선발하는 실험과정 및 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 5는 다양한 농도(20, 40 또는 60%)의 공융용매를 사용하여 7αHSDH 효소반응에 의해 전환된 7-keto LCA의 전환율을 반응시간의 경과에 따라 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 다양한 농도(20, 40 또는 60%)의 공융용매를 사용하여 7βHSDH 효소반응에 의해 전환된 UDCA의 전환율을 반응시간의 경과에 따라 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6b는 0 내지 20%의 공융용매를 사용하여 7βHSDH 효소반응을 수행한 반응산물을 촬영한 결과를 나타내는 사진이다.
도 7a는 20% 공융용매 조건에서 7αHSDH, LDH, 7βHSDH 및 GDH를 사용한 단일반응에 의하여 CDCA로부터 UDCA를 생성하는 반응의 시간경과에 따른 CDCA, 7-keto LCA 및 UDCA의 농도변화를 비교한 그래프이다.
도 7b는 다양한 농도의 공융용매를 사용하여 단일반응을 수행한 경우, CDCA, 7-keto LCA 및 UDCA의 최종 전환율(몰비)을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7c는 0, 20, 40 또는 60%의 공융용매를 사용하여 단일반응을 수행한 경우, 반응시간의 경과에 따른 CDCA, 7-keto LCA 및 UDCA의 전환율(몰비)의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7d는 7βHSDH 및 GDH의 농도가 증가된 조건에서, 다양한 농도의 공융용매를 사용하여 단일반응을 수행한 경우, UDCA의 최종 전환율(몰비)을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7e는 7βHSDH 및 GDH의 농도가 증가된 조건에서, 0, 20 또는 40%의 공융용매를 사용하여 단일반응을 수행한 경우, 반응시간의 경과에 따른 UDCA의 전환율(몰비)의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7f는 단일반응에 관여하는 각 성분의 농도가 증가된 조건에서, 20%의 공융용매를 사용하여 단일반응을 수행한 경우, 반응시간의 경과에 따른 CDCA, 7-keto LCA 및 UDCA의 전환율(몰비)의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 공융용매, 7αHSDH(7 alpha-hydroxy steroid dehydrogenase) 및 7βHSDH(7 beta-hydroxy steroid dehydrogenase)를 포함하는 UDCA(ursodeoxycholic acid) 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "공융용매(Deep eutectic solvent)"란, 자연에 존재하는 고체 또는 액체상의 화합물을 실온에서 적당한 비율로 혼합했을 때, 각각의 화합물이 갖는 융점보다 낮은 온도에서 액상으로 되는 물질을 의미하는데, 유기용매 대비 저렴하고 생산이 쉬우며 생분해성의 물질들로 구성돼 있어 다양한 소재 개발을 위해 사용되고 있다.
본 발명에 있어서, 상기 공융용매는 HBA(Hydrogen bonding acceptors) 및 HBD(Hydrogen Bonding Donor)를 포함하는 것을 사용할 수 있는데, 상기 HBA로는 베타인 수화물(Betaine monohydrate)을 사용할 수 있고, 상기 HBD로는 프로필렌 글리콜을 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "7αHSDH(7 alpha-hydroxy steroid dehydrogenase)"란, 상기 CDCA를 7-keto LCA(7-Ketolithocholic acid)로 전환시키는 활성을 나타내는 효소를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 7αHSDH는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, Escherichia coli 균주로부터 유래된 것이 될 수 있고, 다른 예로서, GenBank No. SMB28026.1의 것이 될 수 있다.
상기 7αHSDH를 사용하여 CDCA를 7-keto LCA로 전환시키는 반응을 수행하기 위하여는, 7αHSDH 및 CDCA 이외에도 7αHSDH를 활성화시키기 위한 NAD, 상기 NAD의 생성에 관여하는 LDH 및 상기 LDH를 활성화시키기 위한 sodium pyruvate를 필요로 한다.
본 발명의 용어 "7βHSDH(7 beta-hydroxy steroid dehydrogenase)"란, 상기 7βHSDH는 7-keto LCA를 UDCA로 전환시키는 활성을 나타는 효소를 의미한다/
본 발명에 있어서, 상기 7βHSDH는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, Ruminococcus gnavus 균주로부터 유래된 것이 될 수 있고, 다른 예로서, GenBank No. SMB28026.1의 것이 될 수 있다.
상기 7βHSDH를 사용하여 7-keto LCA를 UDCA로 전환시키는 반응을 수행하기 위하여는, 7βHSDH 및 7-keto LCA 이외에도 7βHSDH를 활성화시키기 위한 NADP, 상기 NADP의 생성에 관여하는 GDH 및 상기 GDH를 활성화시키기 위한 glucose를 필요로 한다.
상술한 바와 같이, 7αHSDH는 CDCA를 7-keto LCA로 전환시키고, 7βHSDH는 상기 7-keto LCA를 UDCA로 전환시키므로, 상기 7αHSDH 및 7βHSDH를 포함하는 본 발명의 조성물은 CDCA를 UDCA로 전환시키기 위하여 사용될 수 있다(도 1).
도 1은 7αHSDH 및 7βHSDH를 사용하여 CDCA로부터 UDCA를 생산하는 공정을 나타내는 개략도이다.
상기 7αHSDH 및 7βHSDH는 인산완충액 등의 일반적인 완충액 조건하에서도 효소활성을 나타내어 CDCA를 UDCA로 전환시킬 수 있으나, 공융용매를 사용할 경우에는 UDCA로의 전환율을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태는 상기 조성물을 포함하는 UDCA(ursodeoxycholic acid) 생산용 키트를 제공한다.
본 발명의 UDCA 생산용 키트는 상기 UDCA 생산용 조성물을 포함하여 CDCA로부터 UDCA를 생산하는데 사용될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 반응에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 예로서, 상기 조성물에 포함된 7αHSDH 및 7βHSDH 반응에 필요한 NAD, NADP, LDH, GDH, sodium pyruvate, glucose 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 반응에 필요한 인산완충액, 상기 반응을 수행하기 위한 반응용기, 상기 반응을 수행하기 위한 타이머 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는, 상기 조성물을 이용한 이단계 반응에 의해 CDCA로부터 UDCA를 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 이단계 반응에 의해 CDCA로부터 UDCA를 생산하는 방법은 (a) 공융용매를 포함하는 반응용매 조건에서, CDCA(Chenodeoxycholic acid)와 7αHSDH(7 alpha-hydroxy steroid dehydrogenase)를 반응시켜서 7-keto LCA(7-Ketolithocholic acid)를 수득하는 단계; 및, (b) 공융용매를 포함하는 반응용매 조건에서, 상기 수득한 7-keto LCA와 7βHSDH(7 beta-hydroxy steroid dehydrogenase)를 반응시켜서, UDCA(ursodeoxycholic acid)를 수득하는 단계를 포함한다.
상기 (a) 단계에서 사용되는 공융용매는 베타인 수화물(HBA) 및 프로필렌 글리콜(HBD)을 포함하는데, 상기 공융용매를 단독으로 사용하기 보다는 상기 공융용매와 인산완충액을 포함하는 반응용매를 사용할 수 있다.
상기 반응용매에 포함된 공융용매의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 1 내지 40%(v/v)가 될 수 있고, 다른 예로서, 10 내지 30%(v/v)가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 20%(v/v)가 될 수 있다.
또한, 7αHSDH 효소반응을 수행하기 위하여는, 기질로서 사용되는 CDCA 이외에도, NAD, LDH 및 sodium pyruvate를 사용할 수 있다.
상기 (b) 단계에서 사용되는 공융용매는 베타인 수화물(HBA) 및 프로필렌 글리콜(HBD)을 포함하는데, 상기 공융용매를 단독으로 사용하기 보다는 상기 공융용매와 인산완충액을 포함하는 반응용매를 사용할 수 있다.
상기 반응용매에 포함된 공융용매의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 1 내지 50%(v/v)가 될 수 있고, 다른 예로서, 10 내지 40%(v/v)가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 30%(v/v)가 될 수 있다.
또한, 7βHSDH 효소반응을 수행하기 위하여는, 기질로서 사용되는 7-keto LCA 이외에도, 공융용매를 포함하는 조건에서 NADP, GDH 및 glucose를 사용할 수 있다.
한편, 상기 (b) 단계를 수행할 경우, glucose로부터 생성된 글루콘산(gluconic acid)에 의해 겔화(gelation)가 수행되어 UDCA의 최종수율이 감소될 수 있다.
이를 방지하기 위하여, 반응을 수행하면서 반응물의 pH가 pH 8.0을 유지하도록 적정(titration)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는, 상기 조성물을 이용한 단일반응에 의해 CDCA로부터 UDCA를 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 단일반응에 의해 CDCA로부터 UDCA를 생산하는 방법은 공융용매를 포함하는 반응용매 조건에서, CDCA(Chenodeoxycholic acid)에, 7αHSDH(7 alpha-hydroxy steroid dehydrogenase)와 7βHSDH(7 beta-hydroxy steroid dehydrogenase)를 함께 가하여 반응시키는 단계를 포함한다.
상기 단일반응을 수행하기 위하여 사용되는 공융용매는 베타인 수화물(HBA) 및 프로필렌 글리콜(HBD)을 포함하는데, 상기 공융용매를 단독으로 사용하기 보다는 상기 공융용매와 인산완충액을 포함하는 반응용매를 사용할 수 있다.
상기 반응용매에 포함된 공융용매의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 1 내지 40%(v/v)가 될 수 있고, 다른 예로서, 10 내지 30%(v/v)가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 20%(v/v)가 될 수 있다.
또한, 기질로서 사용되는 CDCA 이외에도, 공융용매를 포함하는 조건에서 NAD, NADP, LDH, GDH, sodium pyruvate 및 glucose를 사용할 수 있다.
한편, 상술한 바와 같이, glucose로부터 생성된 글루콘산(gluconic acid)에 의해 겔화(gelation)가 수행되어 UDCA의 최종수율이 감소될 수 있기 때문에, 이를 방지하기 위하여, 반응을 수행하면서 pH 8.0을 유지하도록 적정(titration)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는, 7αHSDH와 7βHSDH를 이용하여 CDCA로부터 UDCA 를 생산하기 위한 공융용매의 용도를 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: LDH를 이용한 7αHSDH(7 alpha-hydroxy steroid dehydrogenase)의 효소반응
완충액(50mM potassium phosphate, pH 8)에서 7αHSDH와 LDH를 사용하여 CDCA로부터 7-keto LCA를 생성할 때, 높은 생성수율을 나타낼 수 있는 7αHSDH와 LDH의 최적농도를 산출하고자 하였다.
먼저, CDCA 50 mM, NAD 5 mM, sodium pyruvate 50 mM 및 LDH 0.1 unit/mL를 포함하는 완충액(50mM potassium phosphate, pH 8)에 다양한 농도(0.5, 1, 2, 4 또는 8 unit/mL)의 7αHSDH를 가하여 반응시키고, 상기 반응에 의해 생성된 7-keto LCA의 수율을 비교하였다(도 2a).
도 2a는 7αHSDH와 LDH를 사용하여 CDCA로부터 7-keto LCA를 생성할 때, 7αHSDH의 처리농도에 따른 7-keto LCA의 생성수율의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a에서 보듯이, 0.5 내지 2 unit/mL의 7αHSDH를 가할 경우에는 7αHSDH의 처리농도에 비례하여 7-keto LCA의 생성수율이 증가하였으나, 4 unit/mL 이상의 7αHSDH를 가할 경우에는 더 이상 7-keto LCA의 생성수율이 증가되지 않음을 확인하였다.
따라서, CDCA로부터 7-keto LCA를 생성할 때, 7αHSDH의 최적 처리농도는 2 unit/mL 임을 알 수 있었다.
다음으로, CDCA 50 mM, NAD 5 mM, pyruvate 50 mM 및 7αHSDH 2 unit/mL를 포함하는 완충액(50mM potassium phosphate, pH 8)에 다양한 농도(0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 또는 1 unit/mL)의 LDH를 가하여 반응시키고, 상기 반응에 의해 생성된 7-keto LCA의 수율을 비교하였다(도 2b).
도 2b는 7αHSDH와 LDH를 사용하여 CDCA로부터 7-keto LCA를 생성할 때, LDH의 처리농도에 따른 7-keto LCA의 생성수율의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2b에서 보듯이, 0 내지 0.1 unit/mL의 LDH를 가할 경우에는 LDH의 처리농도에 비례하여 7-keto LCA의 생성수율이 증가하였으나, 0.5 unit/mL 이상의 LDH를 가할 경우에는 더 이상 7-keto LCA의 생성수율이 증가되지 않음을 확인하였다.
따라서, CDCA로부터 7-keto LCA를 생성할 때, LDH의 최적 처리농도는 0.1 unit/mL 임을 알 수 있었다.
실시예 2: 7αHSDH 및 7βHSDH 효소반응을 이용한 UDCA의 생성
실시예 2-1: 7αHSDH 효소반응
완충액(50mM potassium phosphate, pH 8)에 CDCA 20 g/L, NAD 5 mM, sodium pyruvate 50 mM, LDH 0.1 unit/mL 및 7αHSDH 2 unit/mL를 가하고, 14시간 동안 반응시킨 후, 반응시간의 경과에 따른 CDCA 및 7-keto LCA의 농도변화를 측정하였다(도 3a).
도 3a는 인산완충액 조건에서 7αHSDH와 LDH를 사용하여 CDCA로부터 7-keto LCA를 생성하는 반응의 시간경과에 따른 CDCA 및 7-keto LCA의 농도변화를 비교한 그래프이다.
도 3a에서 보듯이, 7-keto LCA의 전환율은 약 87%임을 확인하였다.
실시예 2-2: 7βHSDH(7 beta-hydroxy steroid dehydrogenase) 효소반응
완충액(50mM potassium phosphate, pH 8)에 7-keto LCA, NADP 1 mM, glucose 100mM, GDH 0.1 unit/mL 및 7βHSDH 2 unit/mL를 가하고, 4시간 동안 반응시킨 후, 반응시간의 경과에 따른 7-keto LCA 및 UDCA의 농도변화를 측정하였다(도 3b).
도 3b는 인산완충액 조건에서 7βHSDH와 GDH를 사용하여 7-keto LCA로부터 UDCA를 생성하는 반응의 시간경과에 따른 7-keto LCA 및 UDCA의 농도변화를 비교한 그래프이다.
도 3b에서 보듯이, 30분이 경과된 시점에서 반응이 종결되었으며, UDCA의 전환율은 약 48%임을 확인하였다.
다만, 반응산물이 겔화(gelation)되는 현상이 나타남을 확인하였다.
실시예 2-3: 7αHSDH 및 7βHSDH의 cascade 효소반응
완충액(50mM potassium phosphate, pH 8)에 CDCA 20 g/L, NAD 5 mM, sodium pyruvate 50 mM, LDH 0.1 unit/mL 및 7αHSDH 2 unit/mL를 가하고, 14시간 동안 반응시킨 후, 반응물을 가열하여 효소활성을 제거하였다. 이어, 상기 반응물에 NADP 1 mM, glucose 100mM, GDH 0.1 unit/mL 및 7βHSDH 2 unit/mL를 가하고, 4시간 동안 반응시킨 후, 반응시간의 경과에 따른 CDCA, 7-keto LCA 및 UDCA의 농도변화를 측정하였다(도 3c).
도 3c는 인산완충액 조건에서 7αHSDH, LDH, 7βHSDH 및 GDH를 사용한 단계별 반응에 의하여 CDCA로부터 UDCA를 생성하는 반응의 시간경과에 따른 CDCA, 7-keto LCA 및 UDCA의 농도변화를 비교한 그래프이다.
도 3c에서 보듯이, UDCA의 전환율은 약 48%임을 확인하였다.
실시예 2-4: 7αHSDH 및 7βHSDH의 one pot 효소반응
완충액(50mM potassium phosphate, pH 8)에 CDCA 20 g/L, NAD 5 mM, NADP 1 mM, sodium pyruvate 50 mM, glucose 100mM, LDH 0.1 unit/mL, GDH 0.1 unit/mL, 7αHSDH 2 unit/mL 및 7βHSDH 2 unit/mL를 가하고, 14시간 동안 반응시킨 후, 반응시간의 경과에 따른 CDCA, 7-keto LCA 및 UDCA의 농도변화를 측정하였다(도 3d).
도 3d는 인산완충액 조건에서 7αHSDH, LDH, 7βHSDH 및 GDH를 사용한 단일반응에 의하여 CDCA로부터 UDCA를 생성하는 반응의 시간경과에 따른 CDCA, 7-keto LCA 및 UDCA의 농도변화를 비교한 그래프이다.
도 3d에서 보듯이, 2시간이 경과된 시점까지 UDCA가 생성되었으나, 이 후에는 더 이상 UDCA가 생성되지 않고, 7-keto LCA 만이 생성되었으며, UDCA의 전환율은 약 26%임을 확인하였다.
실시예 2-5: 7βHSDH 효소반응시 나타나는 겔화 현상에 대한 고찰
상기 실시예 2-2에서 보듯이, 7βHSDH 효소반응시 반응산물이 겔화(gelation)되는 현상이 나타남을 확인하였는데, 이러한 겔화 현상이 나타나는 원인 및 겔화반응에 의한 영향을 규명하고자 하였다.
먼저, 상기 겔화의 원인이 글루코스로부터 전환된 글루콘산(gluconic acid)일 것으로 가정하고, 이를 확인하고자 하였다.
대략적으로, 인산완충액(50mM potassium phosphate, pH 8)에 20 g/L의 7-keto LCA 또는 UDCA를 가한 다음, 이에 다양한 농도(0, 10, 25, 50, 75 또는 100 mM)의 글루콘산을 가하여 흰색 침전물의 형성여부를 확인하였다(도 3e 및 3f).
도 3e는 7-keto LCA에 글루콘산을 가하고 희색 침전물이 생성되는지의 여부를 확인한 결과를 나타내는 사진이고, 도 3f는 UDCA에 글루콘산을 가하고 희색 침전물이 생성되는지의 여부를 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3e 및 3f에서 보듯이, 10 mM의 글루콘산을 가할 경우, 7-keto LCA 및 UDCA에서 흰색 침전물이 형성됨을 확인하였다.
상기 글루콘산의 처리농도에 비례하여 pH가 감소됨을 확인할 수 있었으므로, 글루콘산의 부가에 따른 pH 저하에 의해 7-keto LCA 및 UDCA에서 흰색 침전물이 형성되는 것으로 분석되었다.
또한, 상기 겔화에 의해 7βHSDH 효소반응이 영향을 받는지의 여부를 확인하고자 하였다.
대략적으로, 3종의 인산완충액을 준비하였는데, 하나는 50 mM 인산완충액(실험군 1), 다른 하나는 100 mM 인산완충액(실험군 2), 또 다른 하나는 50 mM 인산완충액을 사용하되 7βHSDH 효소반응 과정 중에 지속적인 적정(titration)을 수행하여 반응시간 동안 pH 8.0을 유지하는 완충액(실험군 3)을 각각 준비하였다.
상기 준비된 3종의 인산완충액 각각에 7-keto LCA 20 g/L, NADP 1 mM, 글루코스 100 mM, GDH 0.1 unit/mL 및 7βHSDH 2 unit/mL를 가하고, 9시간 동안 반응시킨 후, 반응시간의 경과에 따른 UDCA의 농도변화를 측정하고, 이로부터 UDCA의 전환율을 산출하였다(도 3g, 3h 및 3i).
도 3g는 반응시간의 경과에 따른, 실험군 1 및 2 반응액의 pH 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 3h는 반응시간의 경과에 따른, 실험군 1, 2 및 3 반응액에서 측정된 UDCA 전환율 변화수준을 나타내는 그래프이며, 도 3i는 9시간이 경과된 후, 실험군 1, 2 및 3 반응액에서 측정된 UDCA 전환율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3g, 3h 및 3i에서 보듯이, 반응시작 1시간이 경과된 시점에서 전환반응이 종료되었는데, 상기 전환반응이 수행되는 동안 반응물의 pH는 7.1까지 저하되었고, 이후 점차 증가됨을 확인하였다.
또한, 50 mM 인산완충액과 100 mM 인산완충액을 사용한 경우의 UDCA 전환율 보다는 반응시간 동안 지속적으로 적정한 인산완충액을 사용한 경우의 UDCA 전환율이 상대적으로 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 7βHSDH 효소반응시 나타나는 겔화현상을 억제하면 UDCA의 전환율을 증가시킬 수 있을 것으로 분석되었다.
실시예 3: 공융용매(Deep eutectic solvent DES)의 선별
상기 실시예 2의 결과에서 보듯이, 7αHSDH 및 7βHSDH를 이용하여 단일반응(one pot reaction)으로 CDCA(Chenodeoxycholic acid)로부터 UDCA(ursodeoxycholic acid)를 생산하는 방법을 수행함에 있어서, 인산염 완충액이 부적절함을 확인하였는 바, 보다 적절하게 사용될 수 있는 공융용매(DES)를 선발하고자 하였다.
이에 따라, HBA(hydrogen bonding acceptor)의 후보물질로서, 콜린클로라이드(choline chloride) 또는 베타인 수화물(Betaine monohydrate)을 사용하고, HBD(hydrogen bonding donor)의 후보물질로서 에틸렌글리콜(EG), 글리세롤(Gly) 또는 프로필렌 글리콜(PG)을 사용하여 CDCA를 용해시킬 수 있는 공융용매를 선별하고자 하였다
우선, HBA에 적합한 성분을 선별하기 위하여, 콜린클로라이드 또는 베타인 수화물의 반응전환율을 비교하였다.
그 결과, 콜린클로라이드 보다는 베타인 수화물이 상대적으로 높은 수준의 반응전환율을 나타냄을 확인하였는 바, HBA로서 베타인 수화물을 선별하였다.
다음으로, 상기 선별된 베타인 수화물과 함께 사용하기 적합한 HBD를 선발하기 위하여, 베타인 수화물과 상기 HBD 후보물질을 각각 1:1, 1:2 또는 1:3(몰비)로 혼합한 각각의 공융용매를 제조하였다. 이어, 상기 제조된 각 공융용매에 CDCA, 7αHSDH 및 7βHSDH를 가하여 반응시킨 후, 반응산물에 포함된 CDCA, 7-keto-LCA 또는 UDCA의 농도를 측정한 후, 비교하였다(도 4).
도 4는 단일반응에 의해 CDCA로부터 UDCA를 생산하기 위한 공융용매를 선발하는 실험과정 및 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 4에서 보듯이, 베타인 수화물과 HBD 후보물질의 몰비별 혼합에 의해 침전물이 생성되는 경우는 정상적인 진행되지 않아 제외하였다. 정상적인 반응이 진행된 반응산물 중에서 베타인 수화물과 프로필렌 글리콜(PG)이 1:3(몰비)으로 혼합된 공융용매를 사용한 경우에만 UDCA가 생성됨을 확인하였다.
따라서, 단일반응에 의해 CDCA로부터 UDCA를 생산하기 위한 공융용매로는 베타인 수화물과 프로필렌 글리콜(PG)이 1:3(몰비)으로 혼합된 용매를 사용함이 바람직함을 알 수 있었다.
실시예 4: 공융용매에서 7αHSDH 효소반응
상기 실시예 3에서 선발한 공융용매를 이용하여 7αHSDH 효소반응을 수행하고 이에 적합한 공융용매의 농도를 결정하고자 하였다.
대략적으로, 상기 공융용매와 인산완충액(50mM potassium phosphate, pH 8)을 혼합하여, 공융용매의 농도가 0, 10, 20, 30, 40, 50 또는 60%인 각각의 반응용매를 준비하였다. 상기 준비된 각 반응용매에 CDCA 20 g/L, NAD 5 mM, sodium pyruvate 50 mM, LDH 0.1 unit/mL 및 7αHSDH 2 unit/mL를 가하고, 14시간 동안 반응시킨 후, 반응시간의 경과에 따른 7-keto LCA의 농도변화를 측정하고, 이로부터 7-keto LCA의 전환율을 산출하였다(도 5 및 표 1).
도 5는 다양한 농도(20, 40 또는 60%)의 공융용매를 사용하여 7αHSDH 효소반응에 의해 전환된 7-keto LCA의 전환율을 반응시간의 경과에 따라 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
공융용매 농도별 7-keto LCA 전환율
공융용매농도(%) 전환율(%)
0 87
10 90
20 93
30 90
40 71
50 24
60 8
상기 도 5 및 표 1에서 보듯이, 공융용매의 농도에 따라 7αHSDH 효소반응에 의한 7-keto LCA의 전환율이 변화됨을 확인하였다.
특히, 공융용매의 농도가 20%까지 증가할 경우 이에 비례하여 7-keto LCA의 전환율이 증가하여, 20%에서 최대 전환율을 나타내었으나, 공융용매의 농도가 더 증가하면 오히려 7-keto LCA의 전환율이 감소됨을 알 수 있었다.
따라서, 7αHSDH 효소반응을 최적화하기 위한 공융용매의 농도는 20%임을 알 수 있었다.
실시예 5: 공융용매에서 7βHSDH 효소반응
상기 실시예 3에서 선발한 공융용매를 이용하여 7βHSDH 효소반응을 수행하고 이에 적합한 공융용매의 농도를 결정하고자 하였다.
대략적으로, 상기 공융용매와 인산완충액(50mM potassium phosphate, pH 8)을 혼합하여, 공융용매의 농도가 0, 10, 20, 30, 40, 50 또는 60%인 각각의 반응용매를 준비하였다. 상기 준비된 각 반응용매에 7-keto LCA 20 g/L, NADP 1 mM, 글루코스 100 mM, GDH 0.1 unit/mL 및 7βHSDH 2 unit/mL를 가하고, 6시간 동안 반응시킨 후, 반응시간의 경과에 따른 UDCA의 농도변화를 측정하고, 이로부터 UDCA의 전환율을 산출하였다(도 6a 및 표 2).
도 6a는 다양한 농도(20, 40 또는 60%)의 공융용매를 사용하여 7βHSDH 효소반응에 의해 전환된 UDCA의 전환율을 반응시간의 경과에 따라 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
공융용매 농도별 UDCA 전환율
공융용매농도(%) 전환율(%)
0 48
10 82
20 88
30 98
40 99
50 64
60 13
상기 도 6a 및 표 2에서 보듯이, 공융용매의 농도에 따라 7βHSDH 효소반응에 의한 UDCA의 전환율이 변화됨을 확인하였다.
특히, 공융용매의 농도가 40%까지 증가할 경우 이에 비례하여 UDCA의 전환율이 증가하여, 40%에서 최대 전환율을 나타내었으나, 공융용매의 농도가 더 증가하면 오히려 UDCA의 전환율이 감소됨을 알 수 있었다.
다만, 20% 공융용매를 사용한 반응 그래프와 40% 공융용매를 사용한 반응그래프에서 보듯이, 40% 공융용매를 사용할 경우에는 반응종결시간이 늦어짐을 확인하였다.
따라서, 7βHSDH 효소반응을 최적화하기 위한 공융용매의 농도는 40% 이하임을 알 수 있었다.
한편, 7βHSDH 효소반응을 1.5시간 동안 수행한 경우, 반응산물이 겔화(gelation)되는 현상이 나타남을 확인하였다(도 6b).
도 6b는 0 내지 20%의 공융용매를 사용하여 7βHSDH 효소반응을 수행한 반응산물을 촬영한 결과를 나타내는 사진이다.
실시예 6: 공융용매를 사용한 단일반응(one pot reaction)
실시예 6-1: 공융용매를 사용한 단일반응
상기 실시예 4 및 5의 결과에 따라, 7αHSDH 및 7βHSDH 효소반응을 모두 만족시킬 수 있는 공융용매의 농도가 20%임을 확인하였는 바, 상기 20%의 공융용매를 사용한 단일반응에 의하여 CDCA를 UDCA로 전환시키고자 하였다.
대략적으로, 20% 공융용매에 CDCA 20 g/L, NAD 5 mM, NADP 1 mM, sodium pyruvate 50 mM, glucose 100mM, LDH 0.1 unit/mL, GDH 0.1 unit/mL, 7αHSDH 2 unit/mL 및 7βHSDH 2 unit/mL를 가하고, 14시간 동안 반응시킨 후, 반응시간의 경과에 따른 CDCA, 7-keto LCA 및 UDCA의 농도변화를 측정하였다(도 7a).
도 7a는 20% 공융용매 조건에서 7αHSDH, LDH, 7βHSDH 및 GDH를 사용한 단일반응에 의하여 CDCA로부터 UDCA를 생성하는 반응의 시간경과에 따른 CDCA, 7-keto LCA 및 UDCA의 농도변화를 비교한 그래프이다.
도 7a에서 보듯이, 반응물내 중간산물인 7-keto LCA의 농도는 2.5%(몰비) 이하로 유지되었고, UDCA의 최종 전환율은 약 89%인 것으로 확인되었다.
실시예 6-2: 단일반응을 위한 공융용매의 최적 농도
다른 농도의 공융용매를 사용한 단일반응 수행시 UDCA의 전환율을 비교하기 위하여, 다양한 농도의 공융용매를 사용하여 단일반응을 수행하였다.
대략적으로, 다양한 농도(0, 10, 20, 30, 40, 50 또는 60%)의 공융용매에 CDCA 20 g/L, NAD 5 mM, NADP 1 mM, sodium pyruvate 50 mM, glucose 100mM, LDH 0.1 unit/mL, GDH 0.1 unit/mL, 7αHSDH 2 unit/mL 및 7βHSDH 2 unit/mL를 가하고, 14시간 동안 반응시킨 후, 반응시간의 경과에 따른 CDCA, 7-keto LCA 및 UDCA의 농도변화를 측정하였다(도 7b, 7c 및 표 3).
도 7b는 다양한 농도의 공융용매를 사용하여 단일반응을 수행한 경우, CDCA, 7-keto LCA 및 UDCA의 최종 전환율(몰비)을 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 7c는 0, 20, 40 또는 60%의 공융용매를 사용하여 단일반응을 수행한 경우, 반응시간의 경과에 따른 CDCA, 7-keto LCA 및 UDCA의 전환율(몰비)의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
단일반응시 공융용매 농도별 UDCA 전환율
공융용매농도(%) 전환율(%)
0 26
10 77
20 89
30 85
40 65
50 18
60 6
도 7b, 7c 및 표 3에서 보듯이, 공융용매의 농도에 따라 단일반응에 의한 UDCA의 전환율이 변화됨을 확인하였다.
특히, 공융용매의 농도가 20%까지 증가할 경우 이에 비례하여 UDCA의 전환율이 증가하여, 20%에서 최대 전환율을 나타내었으나, 공융용매의 농도가 더 증가하면 오히려 UDCA의 전환율이 감소됨을 알 수 있었다.
따라서, 단일반응을 최적화하기 위한 공융용매의 농도는 20% 임을 알 수 있었다.
실시예 6-3: 7βHSDH 효소반응 조건을 변화시킨 단일반응
단일반응 결과에 7βHSDH 효소반응이 기여하는 바를 분석하기 위하여, 7βHSDH 효소반응에 관여하는 7βHSDH 및 GDH의 농도를 증가시킨 조건에서 단일반응을 수행하였다.
대략적으로, 다양한 농도(0, 10, 20, 30, 40, 50 또는 60%)의 공융용매에 CDCA 20 g/L, NAD 5 mM, NADP 1 mM, sodium pyruvate 50 mM, glucose 100mM, LDH 0.1 unit/mL, GDH 1 unit/mL, 7αHSDH 2 unit/mL 및 7βHSDH 10 unit/mL를 가하고, 14시간 동안 반응시킨 후, 반응시간의 경과에 따른 UDCA의 농도변화를 측정하였다(도 7d 및 7e).
도 7d는 7βHSDH 및 GDH의 농도가 증가된 조건에서, 다양한 농도의 공융용매를 사용하여 단일반응을 수행한 경우, UDCA의 최종 전환율(몰비)을 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 7e는 7βHSDH 및 GDH의 농도가 증가된 조건에서, 0, 20 또는 40%의 공융용매를 사용하여 단일반응을 수행한 경우, 반응시간의 경과에 따른 UDCA의 전환율(몰비)의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
상기 도 7b의 결과와 도 7d의 결과를 비교하면, 7βHSDH 및 GDH의 농도가 증가된 조건에서는 단일반응에 의한 UDCA의 최대 전환율이 89%에서 93%로 증가됨을 확인하였다.
또한, 상기 도 7c의 결과와 도 7e의 결과를 비교하면, UDCA의 전환이 종료되는 반응시간이 7시간에서 2시간으로 단축됨을 확인하였다.
따라서, 단일반응시 각 성분의 농도를 변화시키면, UDCA의 최종 전환율과 반응시간을 조절할 수 있을 것으로 분석되었다.
실시예 6-4: 단일반응시 반응조건의 조정에 따른 UDCA의 전환율 증가
상기 실시예 6-3의 결과로부터, 단일반응 수행시 각 성분의 농도를 변화시킬 경우, 최종 UDCA의 최종 전환율과 반응시간을 조절할 수 있을 것으로 분석되었으므로, 각 성분의 농도를 증가시킨 조건(2.5배)에서 단일반응을 수행하였다.
대략적으로, 20% 공융용매에 CDCA 50 g/L, NAD 5 mM, NADP 1 mM, sodium pyruvate 125 mM, glucose 250mM, LDH 0.25 unit/mL, GDH 0.25 unit/mL, 7αHSDH 5 unit/mL 및 7βHSDH 5 unit/mL를 가하고, 18시간 동안 반응시킨 후, 반응시간의 경과에 따른 CDCA, 7-keto LCA 및 UDCA의 농도변화를 측정하였다(도 7f).
도 7f는 단일반응에 관여하는 각 성분의 농도가 증가된 조건에서, 20%의 공융용매를 사용하여 단일반응을 수행한 경우, 반응시간의 경과에 따른 CDCA, 7-keto LCA 및 UDCA의 전환율(몰비)의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7f에서 보듯이, 반응시작 후 약 12시간이 경과된 시점에서 UDCA의 전환이 종료되었으며, 종료된 UDCA의 전환율을 약 70%를 나타냄을 확인하였다.
상기 UDCA의 전환이 종료된 시점에서, 반응물에 7αHSDH 및 7βHSDH를 추가하고 반응물의 pH를 8.0으로 적정한 결과, 단일반응이 추가로 진행되어 UDCA의 전환율이 증가하였으며, 약 6시간이 추가로 경과된 시점에서 UDCA의 전환이 종료되었으며, 종료된 UDCA의 전환율을 약 93%를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 20% 공융용매 조건에서 실용화 가능한 고농도의 CDCA(50g/L)를 기질로 사용할 경우 93%의 높은 전환율을 나타내었으므로, 산업적인 생산 가능성이 높을 것으로 예상되었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (19)

  1. 공융용매, 7αHSDH(7 alpha-hydroxy steroid dehydrogenase) 및 7βHSDH(7 beta-hydroxy steroid dehydrogenase)를 포함하는, UDCA(ursodeoxycholic acid) 생산용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 공융용매는 HBA(Hydrogen bonding acceptors) 및 HBD(Hydrogen Bonding Donor)를 포함하는 것인, UDCA 생산용 조성물.
  3. 제4항에 있어서,
    상기 HBA는 베타인 수화물(Betaine monohydrate)인 것인, UDCA 생산용 조성물.
  4. 제4항에 있어서,
    상기 HBD는 프로필렌 글리콜인 것인, UDCA 생산용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 CDCA(Chenodeoxycholic acid)를 기질로 사용하여 UDCA를 생산하는데 사용되는 것인, UDCA 생산용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 7αHSDH는 CDCA를 7-keto LCA(7-Ketolithocholic acid)로 전환시키는 효소활성을 나타내고, 상기 7βHSDH는 7-keto LCA를 UDCA로 전환시키는 효소활성을 나타내는 것인, UDCA 생산용 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 UDCA(ursodeoxycholic acid) 생산용 키트.
  8. (a) 공융용매를 포함하는 반응용매 조건에서, CDCA(Chenodeoxycholic acid)와 7αHSDH(7 alpha-hydroxy steroid dehydrogenase)를 반응시켜서 7-keto LCA(7-Ketolithocholic acid)를 수득하는 단계; 및,
    (b) 공융용매를 포함하는 반응용매 조건에서, 상기 수득한 7-keto LCA와 7βHSDH(7 beta-hydroxy steroid dehydrogenase)를 반응시켜서, UDCA(ursodeoxycholic acid)를 수득하는 단계를 포함하는, 이단계 반응에 의한 UDCA 생산방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 (a) 단계는 NAD, LDH 및 피루베이트(sodium pyruvate)를 추가로 사용하여 수행하는 것인, 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 NADP, GDH 및 글루코스를 추가로 사용하여 수행하는 것인, 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 공융용매는 베타인 수화물(HBA) 및 프로필렌 글리콜(HBD)을 포함하는 것인, 방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 반응용매는 1 내지 40%(v/v)의 공융용매를 포함하는 것인, 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 반응용매는 1 내지 50%(v/v)의 공융용매를 포함하는 것인, 방법.
  14. 제8항에 있어서,
    상기 (b) 단계를 수행할 경우, 반응물이 pH 8.0을 유지하도록 적정(titration)하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  15. 공융용매를 포함하는 반응용매 조건에서, CDCA(Chenodeoxycholic acid)에, 7αHSDH(7 alpha-hydroxy steroid dehydrogenase)와 7βHSDH(7 beta-hydroxy steroid dehydrogenase)를 함께 가하여 반응시키는 단계를 포함하는, 단일반응에 의한 UDCA(ursodeoxycholic acid) 생산방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 공융용매는 베타인 수화물(HBA) 및 프로필렌 글리콜(HBD)을 포함하는 것인, 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 반응용매는 1 내지 40%(v/v)의 공융용매를 포함하는 것인, 방법.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 반응은 NAD, NADP, LDH, GDH, 피루베이트(sodium pyruvate) 및 글루코스를 추가로 사용하여 수행하는 것인, 방법.
  19. 제15항에 있어서,
    반응물이 pH 8.0을 유지하도록 적정(titration)하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
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