WO2022139539A1 - SARS-CoV-2 감염증에 대한 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
SARS-CoV-2 감염증에 대한 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 SARS-CoV-2 감염증에 대한 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, CSNP1, CSNP2, CSNP3 및 CSNP4는 SARS-CoV-2의 스파이스 단백질의 RBD(receptor binding domain)에 결합하여 SARS-CoV-2의 스파이스 단백질과 ACE2의 상호작용을 억제함으로써, SARS-CoV-2가 세포에 진입하거나 면역 회피하는 메커니즘을 방해하기 때문에, CSNP1, CSNP2, CSNP3 또는 CSNP4를 유효성분으로 포함하는 조성물을 SARS-CoV-2 감염증(COVID19)의 예방 또는 치료를 위한 약제로 제공된다.
Description
본 발명은 SARS-CoV-2 감염증에 대한 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
SARS-CoV-2(코로나-19)의 팬더믹(pandemic)으로 현재까지 전 세계적으로 누적 확진자는 3천여만명, 사망자는 90 여만명에 육박하고 있을 정도로 SARS-CoV-2는 세계인의 건강에 심각한 위협이 될 뿐만 아니라 사회 안정 및 경제 발전에도 위협이 되고 있다. 이에 많은 연구자들이 이 SARS-CoV-2에 대비할 수 있는 기술, 예를 들어 SARSCoV-2의 진단, 예방, 치료를 위한 기술의 개발을 위해 많은 노력을 기울이고 있다.
SARS-CoV-2는 스파이크 단백질의 수용체-결합 도메인 부분이 숙주 세포의 ACE2 수용체와 결합하는 것을 통해 생체 내부로 감염되는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자는 이 RBD에 결합하여 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질과 숙주 세포의 ACE2 수용체와의 결합을 억제함으로써 궁극적으로 감염을 예방하고 감염증을 치료할 수 있으며 또한 진단을 가능하게 하는 항체 또는 항체 관련 분자를 개발하고자 하였다.
본 발명의 목적은 포함하는 SARS-CoV-2가 세포 진입 및 숙주의 면역 회피의 중추적인 역할을 하는 스파이크 단백질과 ACE와의 상호작용을 차단하여 SARS-CoV-2 감염증(COVID19)의 예방 또는 치료하기 위해, SARS-CoV-2의 스파이크 단백질과 ACE와의 결합을 차단하는 단백질을 제조하여 SARS-CoV-2 감염증(COVID19)의 예방 또는 치료용 조성물로 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 CSNP1, CSNP2, CSNP3 또는 CSNP4를 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 감염증에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CSNP1, CSNP2, CSNP3 또는 CSNP4를 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 감염증에 대한 예방 또는 치료를 위한 병용 투여 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CSNP1, CSNP2, CSNP3 또는 CSNP4를 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 감염증에 대한 예방 또는 개선을 위한 건강기능 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 대상체에게 CSNP1, CSNP2, CSNP3 또는 CSNP4를 유효성분으로 포함하는 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 감염증에 대한 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, CSNP1, CSNP2, CSNP3 및 CSNP4는 SARS-CoV-2의 스파이스 단백질의 RBD(receptor binding domain)에 결합하여 SARS-CoV-2의 스파이스 단백질과 ACE2의 상호작용을 억제함으로써, SARS-CoV-2가 세포에 진입하거나 면역 회피하는 메커니즘을 방해하기 때문에, CSNP1, CSNP2, CSNP3 또는 CSNP4를 유효성분으로 포함하는 조성물을 SARS-CoV-2 감염증(COVID19)의 예방 또는 치료를 위한 약제로 제공될 수 있다.
도 1은 SARS-CoV-2 Spike RBD hACE2 인터페이스를 분석하고 CSNP 펩티드를 설계한 그림이다.
도 2는 분자 역학 시뮬레이션(MDS)을 사용하여 SARS-CoV-2 스파이크 중화 펩티드, CSNP의 구조적 검증한 결과이다.
도 3은 분자 역학 시뮬레이션(MDS)을 통해 결정된 SARS-CoV-2 스파이크 RBD 및 hACE2 포함하는 CSNP 펩티드의 결합 및 구조 역학을 나타내는 그림이다.
도 4는 hACE2 과발현 HEK293 세포에서 CSNP 펩티드가 SARS-CoV-2 S1 및 hACE2의 상호 작용에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 5는 hACE2, SARS-CoV-2 S1 및 CSNP 펩티드의 결합 역학을 분석한 결과이다.
도 6은 SARS-CoV-2 S1 및 α1 나선 펩타이드(Pep 1~Pep 5)의 결합 역학을 분석한 결과이다.
도 7은 CSNP1 및 CSNP4에 ProtK 처리 후 Coomassie Brilliant Blue dye 염색을 통해 펩타이드 잔여도를 분석한 결과이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 CSNP1, CSNP2, CSNP3 또는 CSNP4를 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 감염증에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 CSNP1는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 상기 CSNP2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 상기 CSNP3은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 상기 CSNP4는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
상기 CSNP1, CSNP2, CSNP3 또는 CSNP4는 SARS-CoV-2의 스파이스 단백질과 ACE2의 상호작용을 억제하고, 상기 CSNP1, CSNP2, CSNP3 또는 CSNP4는 SARS-CoV-2의 스파이스 단백질의 RBD(receptor binding domain)에 결합한다.
상기 CSNP2 및 CSNP3에는 락탐 고리를 갖는다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물에 포함되는 첨가제의 함량은 특별히 한정되는 것은 아니며 통상의 제제화에 사용되는 함량 범위 내에서 적절하게 조절될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 정제, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 외용제 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 제형화를 위해 추가로 있는 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제는 전분, 당, 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제, 포비돈, 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 및 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제는 대상체에게 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제의 예로는 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다. 경구 투여일 경우, 정제, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여일 경우, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등으로 제형화 될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이 체질 특이성, 제제의 성질, 질병의 정도, 조성물의 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율, 및 약물 형태에 따라 그 범위가 다양할 수 있으며, 이 분야 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대, 약 0.1 내지 10,000mg/kg의 범위일 수 있으나 이제 제한되지 않으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여되거나 비경구 투여(예를 들면, 정맥 내, 피하 내, 복강 내 또는 국소에 적용)될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다.
또한, 본 발명은 CSNP1, CSNP2, CSNP3 또는 CSNP4를 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 감염증에 대한 예방 또는 치료를 위한 병용 투여 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CSNP1, CSNP2, CSNP3 또는 CSNP4를 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 감염증에 대한 예방 또는 개선을 위한 건강기능 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 통상적으로 이용되는 식품으로써 일반적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능 식품"이라 함은 건강기능 식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
예를 들어, 캡슐 형태의 건강기능 식품 중 경질 캡슐제는 통상의 경질캡슐에 본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합 및 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캡슐제는 본 발명에 따른 조성물의 부형제 등의 첨가제와 혼합하고 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에서 용어 “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 용어 “치료”는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 "개선"이란 본 발명의 조성물을 개체에 투여하거나 섭취시켜 질환의 나쁜 상태를 좋게 하는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명은 대상체에게 CSNP1, CSNP2, CSNP3 또는 CSNP4를 유효성분으로 포함하는 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 감염증에 대한 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 치료학적으로 유효한 양은 질병의 치료에 유효한 양으로, 예컨대 치료하고자 하는 대상에게 투여되는 조성물의 양으로, 재발을 예방하거나, 증상을 완화시키거나, 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저해시키거나, 전이를 예방하거나, 진행 속도를 감소시키거나, 상태를 경감 또는 일시적 완화시키거나, 예후를 개선시키는 조성물의 양을 모두 포함할 수 있다. 즉, 상기 치료학적 유효한 양은 상기 조성물에 의해 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 용량을 포괄하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료 방법은 상기 조성물을 투여함으로써, 징후의 발현 전에 질병 그 자체를 다룰 뿐만 아니라, 이의 징후를 저해하거나 피하는 것을 또한 포함한다. 질환의 관리에 있어서, 특정 활성 성분의 예방적 또는 치료학적 용량은 질병 또는 상태의 본성(nature)과 심각도, 그리고 활성 성분이 투여되는 경로에 따라 다양할 것이다. 용량 및 용량의 빈도는 개별 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 다양할 것이다. 적합한 용량 용법은 이러한 인자를 당연히 고려하는 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 쉽게 선택될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실험예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실험예 및 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실험예 및 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예> 실험 재료 및 방법
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 펩타이드 합성
ACE2(PDB ID: 6M0J)에 결합된 SARS-CoV-2 spike-RBD의 결정구조는 CSNP1-CSNP3 펩타이드를 설계하는 데에 사용되었다. CSNP4의 경우, 삼량체 spike-ACE2(PDB ID: 6ZXN) 및 ACE2-RBD 복합체가 모두 고려되었다. CSNP1-3의 경우, RBD 및 ACE2의 핫스팟 잔기는 PDBePISA를 통해 지정되었고, 인터페이스에 대한 기여도는 DrugscorePPI를 사용하여 알라닌 스캔을 통해 평가되었다. 서버는 인터페이스 지식을 활용하고 인터페이스에서 야생형(ΔGWT) 및 돌연변이체(ΔGMUT) 잔기의 결합 에너지 차이를 계산하고 수치 및 해당 3D b-인자 좌표 측면에서 핫스팟 정보를 제공한다. ACE2의 두 영역, a.a. 23-46 및 a.a. 352-357와 최적으로 결합하는 RBD는 모 펩타이드(CSNP1) 디자인을 위해 선택되었다. 두 영역 모두 GPG 루프를 통해 연결되었으며, K353의 자유는 이황화 결합(S-S)으로 제한되어 C350 및 C356 위치에서 두 개의 베타 시트를 스테플링하였다.
APBS 및 APBSrun 플러그인을 사용하여 핫스팟 및 기타 인터페이스 잔류물 주변의 정전기 표면 맵을 생성했으며, MOE(시험 버전 2019.0102)의 pharmacophore 패키지를 사용하여 α1 나선(a.a. 23-46)에서 잠재적 수정 가능하고 중요한 pharmacophores를 확인하였다. 표면 상보성을 고려하여 5개의 잠재적인 잔기, 즉 Glu23, Lys26, Thr27, His34 및 Gln42를 확인한 후, MOE 슈트의 단백질 디자인 패키지에서 잔기 스캔 도구를 사용하여 CSNP1-RBD 결합을 향상시키기 위해 대체하였다. 첫 번째 단계에서 돌연변이 창은 하나의 잔기로만 제한되었고, 글리신 및 자가 돌연변이는 돌연변이 생성 중에 제외되었다. 결합 친화도와 안정성을 기반으로, 상위 5개 돌연변이체를 선택하였고, 두 번째 단계에서 잔기 스캔을 수행하여 돌연변이 창을 5로 유지하였다. 결합에 기초하여 야생형 및 돌연변이 펩타이드의 결합 친화도의 변화를 SSIPe 및 EvoEF를 통해 이중으로 평가하였다. 선택한 펩타이드의 나선형 구조를 안정화하고 유지하기 위해, 비 인터페이스 잔기의 i 및 i + 4 위치에 락탐 브리지가 생성되었다. CSNP3의 경우, ACE2의 α1(a.a. 21-46) 영역에 있는 약동을 고려하고, a.a. 352-357 지역은 제외되었다. CSNP1과 마찬가지로 CSNP4는 SARS-CoV-2 RBD의 a.a. 445-456 및 a.a. 488-501에 연결되어 디자인되고, 잔기 스캔은 구현되지 않았다. 최종 선정된 CSNP 펩타이드 중 CSNP2-4는 Peptron Inc.(Daejeon, Korea)에서 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC; Shimadzu Prominence)에 의해 확인된 순도 99%(CSNP2), 95%(CSNP3) 및 96%(CSNP4)로 성공적으로 합성하였다.
2. 분자 역학 시뮬레이션을 사용하여 선택한 CSNP의 구조
분자 역학 시뮬레이션은 복잡하거나 분리된 형태의 단백질 접힘 및 거대 분자의 동적 거동을 연구하는 데에 널리 사용되는 기술이다. 단백질-단백질, 단백질-리간드 및 단백질-DNA/RNA 복합체의 구조적 및 동적 통찰력을 위해 분자 역학 시뮬레이션을 사용하였다. 기본 ABMER99-ILDN force-field는 CSNP1, CSNP4 및 SBP1(이미 확인된 RBD-결합 펩타이드) 시뮬레이션에 사용되었으며, 동일한 force-field는 lactam-stapled 펩타이드, CSNP2 및 CSNP3에 대해 수정되었다. 새로운 잔류물과 매개 변수는 필요할 때마다 수정되었다. 분리된 형태의 펩타이드는 200ns에 대해 시뮬레이션하고 100ns에 대한 표적 결합 복합체를 시뮬레이션하였다. 모든 시뮬레이션은 GROMACS 2019.6에서 TIP3P 물이 채워진 큐빅 상자에서 단백질로부터 10 Å 확장된 경계로 수행되었다. 모든 시스템은 반대 이온인 Na+/Cl-로 중화되었으며, 필요한 곳이면 어디에서나 가장 가파른 하강 알고리즘 하에서 에너지를 최소화하였다. 그 후 모든 시스템을 0.2 ns 동안 NVT 앙상블로 평형화하고, 각각 일정한 온도 및 압력하에서 0.2 ns 동안 NPT 앙상블로 재평형화 하였다. 온도와 압력은 각각 V-rescale 및 Parrinello-Rahman barostat 방법과 결합되었다. 결합 길이는 LINCS 알고리즘으로 제한되었고 장거리 정전기 상호 작용은 입자 메쉬 Ewald 알고리즘으로 계산되었다.
3. 분자 역학 Poisson-Boltzmann 표면적을 사용하여 자유 에너지 계산
분자 역학 Poisson-Boltzmann surface area(MM-PBSA)은 표적에 결합된 리간드의 상대 입찰 에너지를 계산하는 데에 널리 사용되는 방법이다. 따라서 GROMACS에서 구현된 g_mmpbsa 및 APBSA 도구는 동일한 MM_PBSA 접근 방식을 활용하는 에너지 계산을 찾는 데 사용되었다. g_mmpbsa 도구는 이전 버전의 GROMACS(버전 5 이하)와 호환되므로 GROMACS 2019.6에서 생성된 "tpr"파일은 GROMACS 5.1을 통해 재생성되어 결합 에너지 계산에 사용되었다. 복합체의 상대적 결합 에너지는 다음 에너지 용어에 따라 근사화되었다.
ΔGbind = ΔEMM + ΔGsol
ΔEMM = ΔEcov + ΔEelec + ΔEvdW
ΔGsol = ΔGpolar + ΔEnon-polar
ΔEMM은 기체상 MM 에너지 변화이고 ΔGsol은 용매화 자유 에너지 변화이고, ΔEvdW는 van der Waals 에너지 변화, ΔEele는 정전기 에너지 변화, ΔEcov는 공유 에너지 변화이다. 용매화 자유 에너지(ΔGsol)는 극성 및 비극성 에너지를 결합하여 계산되었다. 이러한 모든 변화는 0.01ns 시간 간격으로 지난 25ns 시뮬레이션 궤적에 대해 샘플링된 일련의 형태에 대해 평균화된 앙상블을 통해 계산되었다.
4. 계산 도구
간단한 시각화 및 SARS-CoV-2 스파이크 및 ACE2 단백질의 구조적 통찰력을 수집하기 위해 VMD, Pymol 및 Chimera의 무료 패키지가 사용되었다. Pymol 및 VMD에서 단백질, APBS 및 APBSrun 플러그인의 정전기 표면 분리 및 시간 함수로 펩타이드의 2차 구조 변화를 모니터링하기 위해 sscache.tcl 스크립트가 VMD에서 사용되었다. 3D 애니메이션 영상 제작에는 VMD가 사용되었다. 인터페이스 분석 및 ACE2-S 바인딩에 대한 각 잔류물의 기여도를 결정하기 위해 온라인 서버 PDBePISA(v1.52) 및 무료로 제공되는 BIOVIA Discovery Studio Visualizer가 사용되었다. PPCheck 핫스팟 예측 도구를 사용한 후 동일한 서버의 알라닌 스캐닝 패키지가 아닐린 돌연변이 유발에 사용되었다. 핫스팟 결과는 DrugScorePPI 웹 서버를 통해 검증되었으며 결과는 에너지 측면에서 기록되었다. 약물 단 평가를 위해 리간드 스카우트 시험 버전 및 MOE 시험 버전을 사용하였다. 그러나 우리의 관심이 아미노산 결정 인자 분리에 있기 때문에 약물 스크리닝을 위해 약물 단 모델을 사용하지 않았다. 분자 역학 시뮬레이션을 위해 GROMACS 2019.6이 사용되었다. MM-PBSA 계산의 경우, GROMACS 2019.6에서 생성된 "tpr"파일은 GROMACS 5.1을 통해 다시 생성되었으며 앞에서 설명한 바와 같이 결합 에너지 계산에 사용되었다.
5. Surface Plasmon Resonance (SPR)
CSNP 및 α1 나선 펩타이드(Pep1~Pep5)와 SARS-CoV-2의 ACE2 및 S1 서브 유닛과의 물리적 상호 작용을 위해 Biacore T200(스웨덴 GE Healthcare) 기술을 사용하여 SPR 분석을 수행하였다. S1(ligand, AcroBiosystems, S1N-C52H3-100UG, USA) 단백질은 고정 완충액으로 10mM 아세트산나트륨(pH 5.5)을 사용하여 6.0μg/mL 농도로 CM5 센서 칩(GE Healthcare, Cat #. BR-1005-30)에 고정되었다. ACE2(Acrobiosystems, AC2-C52H7-50ug, USA)는 10mM 아세트산나트륨 고정 버퍼를 사용하여 6.2μg/mL 농도로 동일한 칩에 고정되었다. 실행 버퍼로 다음 솔루션이 사용되었다: 1) HBS(10mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl), 2) HBS-EP (10mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% P20), 및 3) 5% DMSO를 포함하는 HBS. 재생 완충액으로 NaOH 용액 (10 ~ 50) mM이 사용되었다. CSNP는 리간드 결합 칩에 서로 다른 농도로 주입되었고 각각의 ka, kd 및 KD 값이 계산되었다. 작동중인 버퍼는 기준으로 빈 채널에 주입되었다. 실험은 새로 준비된 시약으로 두 번 수행되었으며 데이터는 Software Control(버전 2.0.1) 및 BIAevaluation(버전 3.0) 소프트웨어에서 분석되었다.
6. 면역 세포 화학 분석 및 공초점 현미경
HEK293(human embryonic kidney 293) 세포는 한국 세포주 은행(KCLB, Chongno, Seoul, Korea)에서 구입하고, 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco, USA) 및 1% 항체(Gibco, USA)를 포함하는 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Gibco, USA) 성장 배지에서 5% CO2 가습 인큐베이터로 배양되었다. 면역 세포 화학 분석을 위해, HEK293 세포를 Lipofectamine 3000(Invitrogen, L3000015, USA)에 의해 3.0ug pcDNA3.1-hACE2(Addgene, 145033, USA) 플라스미드로 형질 감염시켰다. 상대적 hACE2 양은 프라이머 세트(Cosmo genetech, hACE2-F: 5’-TCC ATT GGT CTT CTG TCA CCC G-3’, hACE2-R: 5’-AGA CCA TCC ACC TCC ACT TCT C-3’, Republic of Korea)를 사용하여 mRNA 발현 수준을 통해 평가되었다. CSNPs 결합을 위해 먼저 CE2 과발현된 Hek293 세포를 10uM 및 25 10uM 펩타이드와 함께 1시간 동안 배양한 다음 5uM SARS-CoV-1 S1 단백질 -His Tag(AcroBiosystems, S1N-C52H3-100UG, USA)로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 1차 항체 항 -ACE2(1 : 100, Cell signalling, 4355S, USA), anti-CTNNB1(1 : 100, Cell signalling, 8480S, USA) 및 anti-His-Tag(1 : 100, Santa cruz, sc- 8036, USA)를 포함하는 무혈청 배지에서 4℃ 2시간 동안 배양하였다. 그런 다음 세포를 4% 파라포름알데히드로 5분 동안 고정하고 Alexa Fluor 594(1 : 200, Thermo, A21203, USA) 및 당나귀 항-토끼 IgG Alexa Fluor 488(1 : 200, Thermo, A21206, USA)를 실온에서 2시간 동안 유지하였다. 2차 항체가 배양되기 전에 세포 차단 용액(1% BSA 및 0.1% Tween 20을 포함하는 1% PBS)으로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 모든 2차 항체는 적절한 농도의 차단 용액으로 희석되었다. 핵은 DAPI 함유 마운팅 용액(Vector, H-1200, USA)으로 염색되었다. 그런 다음 세포를 LSM710(Carl Zeiss) 공초점 현미경으로 시각화하였다.
7. ProtK 처리 후 펩타이드 잔여도 분석
50μM 농도의 stock solution 200μL를 base buffer(10mM Tris-base, 10mM NaCl, pH 7.4)로 조제하였고, 5μM CaCl2를 보충하였다. 처리되지 않은 T0 샘플에 대해서는 각각의 샘플에서 30μL씩 확보하였다. 그 후 5ug/ml proteinaseK(Bioshop)를 남은 stock의 최종 농도에 첨가하였다. 샘플은 37℃에서 배양하였고, 30μL의 샘플들은 각각 10, 30, 60분 시점마다 확보하였으며, 20mM의 PMSF(isopropanol에 200mM Stock 용존) 첨가를 통해 protease 활성을 즉시 차단하였다. protease 비활성 샘플은 추후 사용 전까지 -20℃에서 냉동시켰다. 냉동 샘플은 8μL의 sample loading buffer(4× NuPAGE; ThermoFisher Scientific)를 보충하고 10분간 끓인 후(50℃) 젤[12% NuPAGE Bis-Tris(ThermoFisher Scientific)]을 1X Mes running buffer로 장착하기 전, 13,500 RPM에서 10분간 원심분리 하였다. 젤은 200V에서 35분 동안 처리하였고, Coomassie Brilliant Blue dye G-250(Thermo Fisher Scientific)을 통해 염색하였다. 밀도계는 배경 감산 기능이 있는 ImageJ software를 사용하였다. 모든 샘플은 처리되지 않은 샘플(T0)로 정규화 하였다.
실시예 1. CSNP의 설계
SARS-CoV-2 스파이크를 중화하고 가용성 ACE2에 의한 RBD 및 S1 마스킹의 가역적 위치 전환을 해결하기 위해 CSNP를 설계하는 두 가지 전략을 설정하였다. 먼저, 주로 RBD- 상호 작용에 관여하는 ACE2의 α1 나선의 주 스캐폴드를 나선형 CSNP(CSNP1-3)를 설계하고 조립하기 위한 시작 구조로 추출하였다. 둘째, RBD의 ACE2 상호 작용 모티프를 추출하여 CSNP4로 조립하여 RBD 이동을 제한하고 ACE2에 대한 결합을 차단하였다.
ACE2는 주로 α1 나선의 극성 및 하전된 잔류물을 사용하여 염 다리와 수소 결합을 통해 상향 형태로 RBD를 잡았다(표 1). α1의 처음 3개 아미노산인 Ile21, Glu22 및 Glu23은 RBD 결합에 관여하지 않고 용매에 노출되었다. 잔류물은 α1 나선을 확립하는 데 기인하였다. 5개의 잔기, Gln24, Asp30, Lys31, Asp38 및 Tyr41은 ACE2-RBD 복합체에 가장 높은 결합 에너지를 갖는 데 기여하는 α1의 주요 핫스팟으로 발견되었다. α1 나선 외에도 ACE2는 Lys353을 활용하여 SARS-CoV 및 SARS-CoV-2의 RBD에 고정하고 ACE2-RBD 인터페이스 잔기 중에서 두 번째로 높은 결합 에너지를 공유하였다. Lys353이 Cys344와 Cys361 사이의 이황화 결합에 의해 스테이플링 된 β3-β4의 힌지에 놓이기 때문에 아미노산의 유연성과 자유가 제한될 수 있다. 이것은 ACE2의 Lys353과 RBD의 Gly496, Gln498 및 Gly502 사이의 수소 결합 네트워크를 온전하게 유지하였다(도 1, 표 1). ACE2-RBD를 온전하게 유지하는 α1의 Asp30, Lys31, Asp38 및 Tyr41과 β3-β4의 Lys353과 같은 5가지 약물을 식별하였다. Asp30의 COOH- 그룹은 RBD의 Lys417의 NH3+ 그룹 근처에 있는 수소 결합 수용체로 분리되었다. α1의 Lys31의 NH3+ 그룹은 RBD의 α1의 Glu35와 RBD의 Glu484 사이에 위치하며, 교대로 확립된 염 다리이다. α1에서 Asp38의 COOH- 그룹은 ACE2에서 Lys353의 안정성에 필수 불가결하며 RBD의 Tyr449 및 Gln498 과도 중요한 접촉을 하였다. Tyr41의 부피가 큰 측쇄는 a.a. 350-359 세그먼트와 펩티드에서 a.a. 21-46 세그먼트의 N- 말단 사이의 소수성 공간을 차지한다. ACE2와 RBD 사이의 Tyr41-Thr500 수소 결합은 Tyr41의 회전을 제한한다. Lys353의 NH3+ 그룹은 ACE2-RBD 상호 작용과 관련하여 매우 중요한 약물단이다(표 1).
| ACE2 | RBD | Ekcal/mol | Dist Å |
| Asp30 | Lys417 | -33.5 | 2.71 |
| Lys353 | G1y496 | -11.1 | 2.71 |
| Lys353 | G1n498 | -7.3 | 2.68 |
| Lys31 | G1n493 | -6.3 | 2.93 |
| Lys31 | G1u484 | -5.64 | 3.24 |
| G1u35 | G1n493 | -4.9 | 2.71 |
| Lys353 | G1y502 | -4.9 | 2.75 |
| G1u37 | Tyr505 | -2.8 | 2.65 |
| G1n24 | Asn487 | -1.9 | 2.81 |
| Tyr83 | Asn487 | -1.7 | 2.64 |
| G1n42 | G1y446 | -1.6 | 2.92 |
| Asp38 | G1n498 | -1.2 | 3.57 |
| Lys31 | Tyr489 | -0.5 | 4.35 |
나선형 펩타이드의 경우 ACE2의 α1 나선(a.a. 21-46)의 스캐폴드를 절단하고 Gly-Pro-Gly (GPG) 링커를 통해 β3-β4(a.a. 350-359)와 연결하였다. Lys353의 자유는 위치 D350C와 F356C 사이에 S-S 결합을 생성함으로써 제한되었다. 이 펩타이드를 부모 펩타이드(CSNP1, 도 1)로 지정하여 다음으로 정전기 표면의 상보성을 조사하였다. 이는 CSNP와 RBD 사이의 결합 친화성을 향상시킬 수 있는 잠재적인 포인트를 밝혀냈다. 잠재적인 잔기 Glu23, Lys26, Thr27, His34 및 Gln42의 돌연변이는 사용 가능한 부피, 표면 상보성, 총 결합 에너지 및 복합체의 안정성을 고려하여 가능한 모든 순열로 구성되었다. 단일 치환 및 각각의 결합 친화성 및 결합 안정성을 갖는 생성된 펩티드 데이터베이스(81개 돌연변이체)를 기록하고 다음 라운드의 잔기 스캔에 사용하였다. 각각의 Glu23, Lys26, Thr27, His34, Gln42, 잔기의 상위 5개 치환을 선택하여 다중 치환 펩티드 구성 단계에서 구현하였다. 결합 에너지를 모니터링하면 CSNP2 및 CSNP2-1을 RBD 인터페이스에 가장 적합한 펩티드로 식별할 수 있다. 헬리시티를 유지하기 위해 비인터페이스 잔기 Phe32Asp 및 Ala36Lys(도 1)의 측쇄 사이에 구조적 제약 (락탐 브리지)이 생성되었다. GPG 링커는 루프의 유연성을 향상시키기 위해 CNSP2에서 PGG로 변경되었다. RBD 결합에 대한 Lys353의 중요성과 α1 나선의 자 급성 모두를 검증하기 위해 α1 나선의 약리단을 고려하여 더 짧은 구속된 펩티드인 CSNP3을 구성하였다.
CSNP4는 RBD의 ACE2-RBD 인터페이스 잔류물뿐만 아니라 자발적 위치 전환을 고려하여 설계되었다. ACE2 결합에 참여하는 긴 고정 루프를 통해 연결된 두 개의 아미노산 스트레치, 445-456 및 488-501을 RBD에서 절단하고 유연한 링커인 LIGRGP를 통해 결합하여 결합 펩티드를 최적으로 배향하고 표적 결합 능력을 유지하였다. 휴지(RBDdown) 위치에서 동일한 시트 루프 시트 모티프가 NTD와 조정 S protomer의 RBD 도메인 사이에 놓여 있다. 따라서 ACE2-RBD 장애 외에도 CSNP4가 자발적인 위치 전환을 제한하여 면역 감시를 위한 RBD를 제시할 수 있음을 시사한다.
실시예 2. CSNP 구조 안정화
구조적 안정성과 효소 분해에 대한 내성은 작은 치료 펩티드를 설계하는 데 중요한 특징이다. 더욱이 fold-on-binding은 시간이 필요하며 구조가 손상되지 않은 경우 펩티드는 표적 특이성을 잃는 경우가 많다. 따라서 CSNP1-3의 구조는 구조적 구속을 적용하여 안정화되었으며 CSNP4의 두 아미노산 스트레치는 더 짧은 루프 "LIGRGP"를 통해 연결되었다. 구조적 안정성을 확인하기 위해 이러한 펩타이드를 시간 함수로 수성 환경에서 시뮬레이션하였다. 검증 및 안정성 비교를 위해 이전에 보고된 구조적으로 제한되지 않은 ACE2 유래 RBD 결합 펩티드인 SBP1도 시뮬레이션 되었다. 전반적으로 시뮬레이션의 2분기 및 3분기에 펩티드의 모든 원자에서 상당한 제곱 평균 제곱근 편차(RMSD)가 있었다(도 2A). 원자 수준에서 RMSD 변동을 추적하기 위해 5개 펩티드 모두의 모든 원자에 대한 RMSF(root mean square fluctuation)를 계산하였다. 모든 펩티드, 특히 CSNP4의 말단 원자는 펩티드 본체의 원자에 비해 상당한 변동을 나타냈다. 그러나 CSNP1 및 SBP1은 CSNP2 및 CSNP3에 비해 100-170 범위의 원자에서 높은 변동을 나타냈다(도 2B). 펩타이드의 압축(즉 접힘)을 예측하는 회전 반경(Rg)은 SBP1 및 CSNP3이 극적인 변화를 겪고 구조의 수축을 나타냄을 보여주었다(도 2C). 이는 펩티드의 측쇄 사이의 수소 결합이 아마도 새로운 패턴을 얻었고 아마도 펩티드 구조를 무질서하게 만들었음을 시사한다. 이러한 데이터를 검증하기 위해 각 펩타이드의 200ns MD 궤적에서 1000개의 구조 프레임을 추출하고 2차 구조의 변화를 조사하였다. 3D 모션과 2차 구조의 변화는 시간의 함수로서 3D 영상에 보존되었다(도 2D). 놀랍게도 CSNP1 및 SBP1은 나선형 구조에서 불규칙한 루프 구조로 이동하여 구조적 나선형을 영구적으로 잃었으나, CSNP3는 부분적으로 나선형 구조를 유지하였다. 나선형 펩타이드 중 CSNP2는 구조를 그대로 유지하였으나, C- 터미널 S-S 구속 영역은 PGG 접합에서 유연하게 유지되었다. 상기 데이터는 펩티드 구조를 안정화시키고 가능하게 그들의 표적 결합 친 화성을 유지할 수 있음을 시사한다.
실시예 3. CSNP와 표적 (RBD 및 ACE2)의 결합 안정성
RBD에 도킹된 ACE2 유래 CSNP는 중화된 용액 상태에서 시뮬레이션 된 반면 CSNP4는 ACE2로 시뮬레이션 되었다. 도킹된 CSNP의 인터페이스 잔류물을 식별하고 ACE2-RBD의 인터페이스 잔류물과 겹치는 것으로 확인되었다(도 3A). 펩티드의 모든 표적 결합 형태가 결합되지 않은 분리된 상태에 비해 상대적으로 더 안정적임을 확인하였다(도 3B). CSNP3는 N- 말단 친수성 Glutamic acid로 인해 RMSD가 증가하여 시뮬레이션 중에 RBD가 분리되었다. SBP1은 RBD의 전체 RMSD에도 영향을 미치는 것으로 확인되었다. SBP1 및 CSNP3 결합 RBD는 모두 RMSD 플롯에서 유사한 경향을 나타냈다(도 3C). 대상에서 CSNP의 해리를 측정하기 위해 질량 중심과 분자간 수소 결합 수 사이의 평균 거리를 시간 함수로 계산하였다(도 3D, E). CSNP1-, CSNP2- 및 SBP1-RBD 복합체 사이의 평균 거리는 시뮬레이션 과정을 통해 일정하게 유지되었다. 그러나 CSNP3-RBD와 CSNP4-ACE2 사이의 거리는 불안정하게 유지되었다(도 3D). ACE2와 CSNP4 사이의 거리는 시뮬레이션 시작시 ~ 35nm였으며 MD 실행의 중간 지점(50ns)에서 ~ 40nm로 증가하였다. 이러한 거리 증가는 CSNP4의 자유 N- 및 C- 말단 때문일 수 있으며, 이는 또한 펩타이드의 전체 안정성 (RMSD) 및 CSNP4-ACE2 복합체(도 3B, 도 3C)에 상당한 영향을 미쳤다. CSNP3와 RBD 사이의 거리는 펩타이드의 느슨하게 결합된 친수성 N- 말단 글루타민산으로 인해 변동되었으며, 이는 인접한 아스파라긴에도 영향을 미치고 RBD에서 분리되었다. 이러한 분리는 펩타이드의 N- 말단을 채찍과 같은 움직임으로 강제합니다. 그럼에도 불구하고, C- 말단 잔기는 RBD와 함께 손상되지 않았다.
펩티드와 표적 사이의 결합 강도는 Poisson-Boltzmann 표면적(MM-PBSA) 방법을 사용하여 추정되었다. 5가지 펩타이드 결합 복합체 모두에 대해 van der Waals(vdW), Electrostatic(Ele), Polar Solvation(PS) 및 Solvent access surface area(SASA)에 대한 에너지를 계산하였다(표 2). 펩타이드의 유형과 길이에 따라 세 그룹으로 분리할 수 있다. 1) CSNP1 및 CSNP2는 α1 나선 및 β3-β4 영역을 모두 포함하고 RBD에 결합한다. 2) CSNP3 및 SBP1은 α1 나선으로 만 구성되며 RBD에 결합한다. 3) CSNP4는 나선형 펩타이드와 완전히 다르며 ACE2 및 RBD에 결합한다. RBD를 사용한 CSNP1(총 E = -298.44 +/- 82.0 kcal/mol) 및 CSNP2(총 E = -283.77 +/- 81.3)의 전체 결합 친화도는 비교적 유사하였다. 그러나 CSNP2에 대한 vdW 및 Ele의 에너지는 CSNP1에 대한 에너지보다 강하게 나타났다(표 2). 유사하게, RBD를 사용한 CSNP3 나선형 펩타이드(총 E = -382.73 +/- 63.4 kcal/mol)의 총 결합 에너지는 SBP1(총 E = 356.73 +/- 75.1)보다 상대적으로 강하게 나타났다. SBP1-RBD (853.42 +/- 116.0 kcal/mol)의 극성 용 매화 에너지는 CSNP3-RBD(532.67 +/- 190.2)보다 상당히 높게 나타났다. 상기의 결과는 용매에 노출되면 SBP1-RBD 복합체가 CSNP3-RBD에 비해 더 빨리 해리 될 수 있음을 시사한다.
| Complex | VDW E | Ele E | PS E | SASA E | Total E |
| CSNP1/RBD | -294.49 +/- 26.0 | -685.26 +/- 74.0 | 719.22 +/- 125.0 | -37.91 +/- 3.3 | -298.44 +/- 82.0 |
| CSNP2/RBD | -302.45 +/- 20.3 | -705.56 +/- 96.1 | 763.25 +/- 119.8 | -39.01 +/- 2.4 | -283.77 +/- 81.3 |
| CSNP3/RBD | -225.15 +/- 26.6 | -660.4 +/- 159.4 | 532.67 +/- 190.2 | -29.85 +/- 4.3 | -382.73 +/- 63.4 |
| SBP1/RBD | -282.12 +/- 23.7 | -889.03 +/- 74.0 | 853.42 +/- 116.0 | -39.00 +/- 2.4 | -356.73 +/- 75.1 |
| CSNP4/ACE2 | -217.30 +/- 29.6 | -1124.5 +/- 72.6 | 422.46 +/- 135.8 | -27.72 +/- 3.4 | -947.06 +/- 104.2 |
| VDW: van der Waal; Ele: Electrostatic; PS: Polar Solvation; SASA: Solvent accessible surface area; E: Energy. All energies are measured in kcal/mol. | |||||
실시예 4. CSNP가 hACE2 발현 세포에 대한 S1 결합에 미치는 영향
인간 ACE2 (hACE2) 과발현 세포는 HEK293 세포를 hACE2- 발현 플라스미드, pcDNA3.1-hACE2로 형질 감염시켜 제조하고 펩티드로 처리하였다(도 4A). S1이 CSNP 처리되지 않은 세포에서 세포막에 국한된 반면, CSNP3는 S1-ACE2 상호 작용을 완전히 폐지하는 것으로 나타났다(도 4B). 세포막에 대한 S1 위치를 확인하고 펩티드의 억제 효과를 추가로 확인하기 위해, β-catenin 표지된 hACE2-HEK 세포에서 반복수행하였다. CSNP2 및 CSNP4는 S1의 막 국소화를 완전히 차단하는 것으로 나타났다(도 4C).
실시예 5. CSNP와 표적 단백질(SPR)의 생물 물리학적 상호 작용
SPR은 CSNP와 표적의 결합 동역학 및 생물 물리학적 상호 작용을 확인할 수 있는 Biolayer 간섭계에 비해 재현 가능하고 민감한 기술로 간주된다. 검증 단계로 ACE2 및 S1 서브 유닛을 CM5 센서 칩에 리간드로 고정하고 CSNP 종류별로(분석물)테스트를 실시했다. S1을 리간드로 사용하고 CSNP1을 분석물로 사용했을 때, KD =0.3μM로 의존적 결합을 나타냈다(도 5A).
CSNP2와 CSNP3는 각각 6가지 농도와 7가지 농도로 고정화된 S1에 분석물로 주입되었다. CSNP2는 KD = 31.8μM으로 S1 단백질에 대한 용량 의존적 결합을 나타냈고(도 5B), CSNP3은 의존적 결합이 나타나지 않았다(도 5C). 상기 결과는 CSNP2 및 아마도 CSNP1이 RBD에 대한 결합을 유지함을 시사한다. 또한, CSNP4는 KD = 0.3μM로 역시 의존적 결합을 나타냈다(도 5D).
CSNP4와 고정된 ACE2의 결합 동역학을 측정한 결과, 상대적으로 약하고 용량 의존적인 결합 친화성을 나타내었다(KD = 158μM)(도 5F). 면역 세포 화학 결과(도 4)와 CSNP4가 삼량체 스파이크 단백질에서 인접한 S protomer의 NTD와 RBDup 사이의 접합점을 차지한다는 사실(도 5F)을 고려하여 CSNP4와 S1의 결합 친화성을 추정하였다. CSNP4가 CSNP2만큼 강한 S1에 결합하는 것으로 나타났다(도 5D). CSNP4-ACE2의 더 약한 결합 친화력은 다음 두 가지 이유로 설명된다. 첫째, ACE2의 α1 나선은 CSNP4 결합을 위한 좁고 얕은 표면을 제공한다. 둘째, ACE2-RBD 결합에 크게 기여하는 Lys417(표 1)은 CSNP4에 포함되지 않는다. 상기 결과는 ACE2에 대한 RBD 유래 미끼 펩티드를 설계하는 것이 RBD에서 ACE2- 결합 모티프의 넓은 입체 형태 공간과 불규칙한 루프 구조로 인해 ACE2-RBD 상호 작용을 차단하기에 충분하지 않을 수 있음을 시사한다. CSNP4 기반 S1 중화는 더 강한 CSNP4-S1 결합에 기인할 수 있으며, 이는 RBD의 자유를 제한하고 궁극적으로 ACE2에 결합할 수 있다.
또한, S1을 리간드로 사용하고 α1 나선 펩타이드(Pep1~Pep5)를 분석물로 사용했을 때, Pep 1은 KD = 0.67μM로 의존적 결합을 나타낸 반면, 나머지 펩타이드는 의존적 결합을 나타내지 않음을 확인하였다(도 6).
실시예 6. 구조적으로 부자연스러운 선형 펩타이드의 효소 안정성
펩타이드에 proteinaseK 처리 및 염색 후, 펩타이드 잔여도(peptide remaining)를 분석한 결과, CSNP4는 일정량 잔여 했음을 확인한 반면, CSNP1은 거의 잔여하지 않음을 확인하였다(도 7).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
Claims (8)
- CSNP1, CSNP2, CSNP3 또는 CSNP4를 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 감염증에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 CSNP1는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 상기 CSNP2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 상기 CSNP3은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 상기 CSNP4는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 CSNP1, CSNP2, CSNP3 또는 CSNP4는 SARS-CoV-2의 스파이스 단백질과 ACE2의 상호작용을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 CSNP1, CSNP2, CSNP3 또는 CSNP4는 SARS-CoV-2의 스파이스 단백질의 RBD(receptor binding domain)에 결합하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 CSNP2 및 CSNP3에는 락탐 고리를 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- CSNP1, CSNP2, CSNP3 또는 CSNP4를 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 감염증에 대한 예방 또는 치료를 위한 병용 투여 조성물.
- CSNP1, CSNP2, CSNP3 또는 CSNP4를 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 감염증에 대한 예방 또는 개선을 위한 건강기능 식품 조성물.
- 대상체에게 CSNP1, CSNP2, CSNP3 또는 CSNP4를 유효성분으로 포함하는 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 감염증에 대한 예방 또는 치료 방법.
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8241864B2 (en) * | 2006-10-19 | 2012-08-14 | Apeiron Biologics Forschungs-und Entwicklungsgesellschaft m.b.H. | Method for determining ACE2 activity |
| CN111217918A (zh) * | 2020-03-04 | 2020-06-02 | 中山大学 | 一种基于2,4-二氧四氢喋啶合酶的新型冠状病毒s蛋白双区域亚单位纳米疫苗 |
| CN111732637A (zh) * | 2020-05-25 | 2020-10-02 | 上海交通大学 | 抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2感染宿主细胞的多肽及其应用 |
-
2021
- 2021-12-24 WO PCT/KR2021/019796 patent/WO2022139539A1/ko active Application Filing
- 2021-12-24 US US18/269,708 patent/US20240059741A1/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8241864B2 (en) * | 2006-10-19 | 2012-08-14 | Apeiron Biologics Forschungs-und Entwicklungsgesellschaft m.b.H. | Method for determining ACE2 activity |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20240059741A1 (en) | 2024-02-22 |
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