WO2022136361A1 - Verfahren und mikroskop zur aufnahme von trajektorien einzelner partikel in einer probe - Google Patents

Verfahren und mikroskop zur aufnahme von trajektorien einzelner partikel in einer probe Download PDF

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Benjamin HARKE
Lars Kastrup
Christian Wurm
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Abberior Instruments Gmbh
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    • G06T2207/30241—Trajectory

Definitions

  • the invention relates to a method for tracking individual particles in a sample according to the MINFLUX principle.
  • the invention further relates to a light microscope carrying out the method.
  • Observing and tracking individual particles in a sample is an important technique for studying molecular dynamics in biological systems.
  • light-scattering particles for example metallic nanoparticles
  • fluorescent particles or individual molecules of a fluorescent dye are usually used.
  • fluorescent dyes it is also possible to mark otherwise undetectable particles and thus make them accessible for particle tracking.
  • Biological applications include the study of enzyme-catalyzed reactions, DNA transcription, ion channel activity, and vesicle trafficking.
  • the applicability of the methods used depends largely on the achievable observation period and the temporal resolution when observing individual particles.
  • microscope-based, imaging methods on the one hand and point detector-based methods on the other hand are known from the prior art.
  • the former allow the observation of individual particles over a larger image area and thus also the tracking of freely diffusing particles over comparatively long periods of time.
  • the achievable temporal resolution is limited by the frame rate of the camera, which is why an investigation of fast processes is not possible with this approach.
  • the maximum time length of the trajectories is also short at around 100 ms, which is particularly due to the limited photon budget, i. H. due to the limited number of fluorescence photons emitted by a dye molecule before it finally fades.
  • Fast beam deflection means in particular electro-optical or acousto-optical deflectors, are now available for faster tracking of individual particles and in particular individual dye molecules.
  • these fast, non-mechanical scanning means can be combined with galvanometer mirrors, which allow a (slower) pre-positioning of the focused excitation light in a large area of the sample.
  • the publication DE 10 2011 055 367 A1 describes a variant of single particle tracking known by the acronym MINFLUX, in which the particle is illuminated with a light distribution of a scanning light having a minimum intensity and the photons emitted by the particle are registered.
  • the minimum becomes the particle moving in the sample tracked by shifting the intensity distribution in relation to the sample in such a way that the rate of the photons emitted by the particle remains minimal.
  • the positions of the intensity minimum can be placed increasingly closer to the tracked particle and the power of the probing light can be increased, thereby enabling a more precise localization.
  • the particular advantage of the MINFLUX method lies in its special photon efficiency, which allows precise localization of individual particles down to the single-digit nanometer range with a comparatively small number of photons. Since the scanning takes place with an intensity minimum—ideally an intensity zero point—of the light distribution and the intensity minimum is only positioned in a close range around the particles, the particles are only exposed to a low light intensity.
  • the quantitative analysis [see K. Gwosch et al. in "MINFLUX nanoscopy delivers 3D multicolor nanometer resolution in cells", Nat.
  • the position of individual particles can be determined repeatedly at very short intervals, with the currently available state of the art approximately every 100 ps. Due to the high photon efficiency and the high localization speed, the MINFLUX method is particularly suitable for the real-time tracking of individual fluorescent dye molecules in the sample. It is also possible to track individual dye molecules in low-viscosity media. Trajectories of individual dye molecules recorded using the MINFLUX method with more than 25,000 individual position determinations are known from the prior art.
  • a variant of the MINFLUX method is described in DE 10 20 '' 6 B3, in which the scanning of the isolated fluorescent dye molecules present is not carried out by illumination with an intensity distribution of excitation light having a local intensity minimum, but with two essentially complementary intensity distributions of an excitation light and a fluorescence prevention light.
  • the intensity distribution of the excitation light has a local intensity maximum
  • the intensity distribution of the fluorescence-preventing light has a local intensity minimum at the same point.
  • the fluorescence prevention light can specifically be STED light, which prevents fluorescence dye molecules excited in the edge regions of the intensity distribution of the excitation light from emitting fluorescence photons by triggering stimulated emission.
  • the intensity of the fluorescence emitted by the dye molecule depends on the distance from the local minimum intensity of the fluorescence prevention light, but the fluorescence here does not increase with increasing distance from the minimum intensity, but rather decreases.
  • An experimental implementation of this concept was carried out by M. Weber et al. described in “MINSTED fluorescence localization and nanoscopy”, bioRxiv, doi: 10.1101/2020.10.31.363424 (2020).
  • the object of the invention is therefore to provide a method and a light microscope for tracking the movement of an individual particle in a sample, in which the tracking of the particle is interrupted or aborted if the tracking of the particle no longer provides any information relevant to a given question .
  • the object of the method according to the invention and of the light microscope is therefore to demonstrate a method that defines a suitable termination criterion for tracking the particle. solution
  • the object of the invention is achieved by a method according to independent claim 1 and by a light microscope according to independent claim 21 .
  • Dependent claims 2 to 20 relate to preferred embodiments of the method, while dependent claims 22 to 26 relate to preferred embodiments of the light microscope.
  • the invention is based on the idea that when tracking the movement of a particle in the sample, a decision about which sections of the recorded trajectory contain relevant information for answering a given question often cannot be made from the data points of the trajectory alone, but that this requires more information about the context in the sample.
  • This context can be spatial information about the (immediate) environment of the particle being tracked or functional information that characterizes the functional state of, for example, a cell organelle (e.g. the opening state of an ion channel) or the cell as a whole.
  • the invention includes a method for recording a trajectory, i.e. a time-resolved locus curve of an individual particle in a sample, a second measured variable being recorded in the sample and the recording of the trajectory being interrupted or terminated when the second measured variable or one of the second Measured variable calculated control value meets a termination criterion.
  • a trajectory i.e. a time-resolved locus curve of an individual particle in a sample
  • a second measured variable being recorded in the sample and the recording of the trajectory being interrupted or terminated when the second measured variable or one of the second Measured variable calculated control value meets a termination criterion.
  • Light-scattering particles can be used as the particles to be tracked, for example metallic nanoparticles, silica or latex nanoparticles, or—preferred in many applications—fluorescent particles.
  • fluorescent particles is to be understood here in a broad sense; Fluorescent particles are, for example, individual molecules of a reagent, a ligand, an active substance or a biomolecule (e.g. protein, DNA, lipid) labeled with a fluorescent dye, but also fluorescently labeled supramolecular structures, aggregates or molecular complexes such as micelles, vesicles or lipid rafts.
  • Fluorescent particles are also to be understood in particular as meaning molecular fluorophores, ie individual molecules of fluorescent dyes and fluorescent quantum dots (Qdots).
  • the particles appear as discrete and largely identical entities.
  • it In order to carry out the method according to the invention, it must be ensured that the particles are isolated, ie the distance between adjacent particles is above the optical diffraction limit, so that adjacent particles can be identified as separate objects in an optical image.
  • the distance requirement can be met, for example, by using the particles in such a low concentration that, on average, they have a sufficient distance from one another.
  • Spatially isolated fluorescent molecules of a fluorescent dye can also be generated by photoactivation and/or photodeactivation if the fluorescent dye can be light-inducedly converted between a fluorescent state and a non-fluorescent state in at least one direction.
  • a small number of fluorescent state dye molecules can be prepared which are at the required distance from one another.
  • the distance requirement also applies to molecules of different fluorescent dyes that can be excited to fluoresce in the same fluorescence wavelength range with excitation light of the same wavelength.
  • suitable methods for separating fluorescent dye molecules in a sample the person skilled in the art can fall back on the comprehensive state of the art for localization microscopy (PALM, STORM and related methods).
  • Initial coordinates can be obtained, for example, by scanning the sample with focused light in conventional laser scanning or from a previously recorded wide-field image; specific methods for this can also be found in the prior art for PALM, STORM and MINFLUX microscopy.
  • the particle to be tracked Starting from the initially determined coordinates of the particle, it is scanned with a scanning light at one or more scanning positions, with the intensity distribution of the scanning light in the sample having a local intensity minimum—ideally an intensity zero point. If a scanning position is mentioned below, then this means the position of this local minimum.
  • the particle to be tracked When illuminated with the scanning light, the particle to be tracked generates a detectable light signal, for example a scattered light signal in the case of light-scattering particles or a fluorescence signal in the case of fluorescent particles.
  • a light signal in the form of a number of or an intensity is detected as a first measurement variable at each scanning position.
  • the detected number of photons or light intensity represents a measure of the distance of the particle from the intensity minimum and is used to determine subsequent scanning positions and updated coordinates of the scanned particle.
  • the determination of updated coordinates of the particle can take place after a fixed or a variable number of scanning positions, ie after each individual scanning position or even after each detected photon.
  • the method according to the invention differs from the prior art in that a second measured variable is recorded in the sample while the trajectory of the particle is being recorded and the recording of the trajectory is interrupted or ended when the second measured variable or a control value calculated from the second measured variable met a termination criterion.
  • the termination criterion is that the second measured variable or the control value falls below a minimum value or exceeds a maximum value.
  • the sampling can be continued when the second measured variable or the control value exceeds the minimum value again or falls below the maximum value again, with a hysteresis being able to be provided in practice.
  • More complex criteria can also be defined as a termination criterion, in particular also taking into account the history of the second measured variable.
  • the second measured variable is detected at a location in the sample while the trajectory is being recorded, with the detection being able to take place continuously, ie asynchronously to the scanning of the particle, or it can be integrated into the scanning process of the particle.
  • the second measured variable is preferably recorded at least once per update of the particle coordinates.
  • the detection of the second measured variable can take place in a punctiform manner at the current coordinates of the particle or at the current scanning position, but it is also possible to detect the second measured variable in an extended manner to detect and average over an area in the sample, for example in a vicinity of the last determined coordinates of the particle or in a fixed, predetermined area in the sample. This area can be defined, for example, by the contour of a cell or a cell organelle, for example the cell nucleus.
  • the purpose of the termination criterion is to end the recording of the trajectory or at least to interrupt it temporarily, for example if further localizations of the observed particle do not (or no longer) provide any information relevant to a given question or if the sample changes in such a way that the data from further localizations derived information is no longer comparable with the information derived from earlier localizations, i.e. no longer meaningful for the experiment or can even lead to wrong conclusions.
  • the parallel detection of the second measured variable and the use of a termination criterion makes it possible to avoid superfluous scanning and thus an unnecessary exposure of the sample to the scanning light.
  • the measurement time can be reduced, or trajectories of more particles can be recorded in a given time. For many questions that require a statistical analysis of a large number of trajectories, this time advantage means that larger data sets can be recorded and analyzed without increasing the total measurement time.
  • the particle is scanned for each position determination at several scanning positions in a close range of typically ⁇ 250 nm around the last determined coordinates of the particle, with the polygon (in the two-dimensional case) or polyhedron (in the three-dimensional case) includes the last determined particle coordinates.
  • This ensures that a clear localization of the particle is possible.
  • the number of photons or light intensity emitted by the particle at the sample positions allows calculation of updated coordinates of the particle; For this purpose, the person skilled in the art can fall back on known methods and algorithms from the prior art (in particular for MINFLUX technology).
  • the steps described are carried out repeatedly, ie further scanning positions are defined in a vicinity around the current coordinates, the particle is scanned with the scanning light at the newly defined scanning positions, light emitted by the particle is registered at each of the scanning positions, and updated coordinates are updated definitely.
  • the respective subsequent scanning positions are determined after each localization step on the basis of the last determined coordinates of the particle.
  • the optical power of the scanning light can also be increased.
  • the determination of the scanning positions and the intensity of the scanning light is highly dependent on the diffusion or transport rate of the particle in the sample and the frequency with which the particle can be localized. While an arrangement of the scanning positions as close as possible to the current position of the particle and a high optical power of the scanning light allows precise localization and is therefore desirable, the risk that the particle leaves the capture range of the localization between successive localizations increases at the same time. While the scanning positions are successively shifted closer to the location of the dye molecule when locating static, immobile dye molecules, the optical power of the scanning light is increased and thus the localization accuracy can be increased, this is not always possible when tracking moving particles.
  • the scanning positions and the optical power of the scanning light must be adjusted in such a way that the particle remains within the capture radius between subsequent localizations. It applies here that the scanning positions can be arranged all the more densely around the particle and the optical power of the scanning light can be set all the higher, the higher the localization frequency and the lower the speed of movement of the particles. An adjustment of both parameters can also be made between consecutive localizations, i. H. take place during the recording of the trajectory.
  • the second measured variable is an optical measured variable, in particular a fluorescence signal detected in a second detection channel.
  • This fluorescence signal can originate from a (further) fluorescent dye in the sample and can be used in particular to mark a structure in the sample.
  • it can also be an autofluorescence signal, ie an intrinsic fluorescence signal of a cell.
  • a fluorescent dye for example, if the nucleus, the cell membrane, a If a cell organelle, a structural protein, an ion channel, a lipid raft or another structure of a cell in the sample is stained with a (further) fluorescent dye, its fluorescence provides context information when tracking individual particles in the sample.
  • the absence of this staining or falling below a minimum fluorescence signal of this staining at the location of a scanned particle can indicate, for example, that the scanned particle is outside a cell or an area of interest in a cell (or has left this area) and can therefore be used as a termination criterion used to track the particle.
  • the ligand and the receptor can be stained with different fluorescent dyes and individual molecules of the fluorescently labeled ligand can be monitored in the sample using the method according to the invention.
  • the tracking of individual fluorescently labeled ligand molecules can be limited to periods of time during which - as indicated by the fluorescence (control) signal of the receptor - the ligand is in the immediate vicinity of a receptor and can interact with it. Tracking can be stopped when the control value indicates that the ligand molecule has moved away from the corresponding receptor.
  • the termination criterion does not necessarily have to be defined directly on the second measured variable, but can also be related to a control value calculated from the second measured variable, in the calculation of which further measured variables can optionally be included.
  • the control value can be calculated from a fluorescence ratio in two detection channels in which the fluorescence is detected in different detection wavelength ranges.
  • An advantageous embodiment results when the fluorescence of ratiometric indicator dyes is used to calculate the control value.
  • the ratio of the fluorescence signals of such indicator dyes in two wavelength ranges can, for example, provide information about ion concentrations (in particular calcium, magnesium, zinc and sodium ions), pH values or membrane potentials.
  • a termination criterion based on such a control value allows the restriction of the individual particle tracking not only to spatially limited areas in the sample, but also to certain functional states of a cell or cell organelle, e.g. B. the opening state of an ion channel or the integrity of a cell membrane.
  • the status of cells with regard to cell cycle progression and division or cell viability or cell vitality (e.g. LIVE / DEAD assays, ThermoFisher Scientific). Fluorescent double stains can be used for the simultaneous detection of both apoptosis and necrosis, so that cells depending on Fluorescence signal in one or both fluorescence channels can be classified as dead, necrotic or apoptotic.
  • control value is derived from the fluorescence of one or more of these fluorescent cell status, vitality or viability markers
  • the tracking of individual fluorescent particles can be limited to intact cells or to observation periods in which the observed cells are classified as healthy using the method according to the invention or are in a certain phase of the cell cycle. In this way, misinterpretations of measurement data, which may result from the recording of unrepresentative data, can be avoided.
  • parameters of the fluorescence emission can also be used to define a termination criterion, in particular the fluorescence lifetime or the fluorescence anisotropy. These parameters are often sensitive to changes in the binding state or molecular environment of a dye molecule, or a molecule or particle labeled with the fluorescent dye, as a result of reduced mobility or altering possible fluorescence quenching pathways.
  • an alternative embodiment of the method according to the invention can also be selected, in which the scanning light is formed by a superimposition of excitation light known from STED microscopy and an intensity distribution of a fluorescence prevention light having the local intensity minimum, which prevents fluorescence emission from focal edge regions .
  • Fluorescence prevention light is to be understood as any type of light that prevents, reduces or completely suppresses the fluorescence emission of the fluorescent particles.
  • the fluorescence-preventing light can be stimulating light, which induces a stimulated emission of electronically excited dye molecules, as a result of which the dye molecules are converted (back) into the electronic ground state and are thus prevented from spontaneous fluorescence emission.
  • the scanning of individual fluorescent particles provides a fluorescence signal which is dependent on the distance of the particle from the minimum intensity of the fluorescence prevention light.
  • the dependency of the signal strength on the distance is inverse, i. H. the fluorescence signal decreases with increasing distance from the minimum intensity of the fluorescence prevention light.
  • the second measured variable for deriving the termination criterion can also be another optical measured variable, in particular a second harmonic generation S' ⁇ gr ⁇ a ⁇ (SHG), a third harmonic generation S' ⁇ gr ⁇ a ⁇ (THG), a Rayleigh or Raman scattered light signal, a Coherent Anti-Stokes Raman Scatter! ng-S gna ⁇ (CARS), a reflected light signal, a differential interference contrast signal (DIC) or a polarization contrast signal.
  • SHG second harmonic generation
  • CARS Coherent Anti-Stokes Raman Scatter! ng-S gna ⁇
  • DIC differential interference contrast signal
  • polarization contrast signal a polarization contrast signal
  • contrast modalities cannot achieve a specificity comparable to a targeted fluorescent label, some of the contrast modalities nevertheless show a certain selectivity.
  • SHG signals do not arise on structures with a molecular center of symmetry, whereas certain non-centrosymmetric structures (e.g. collagen, myosin, tubulin) provide a particularly high signal in the SHG contrast.
  • the sample is usually illuminated with additional light in addition to the scanning light, the properties of which are matched to the respective contrast modality and/or to the scanning light.
  • the further light should selectively stimulate the signal of the second optical measurement variable, but not the emission of photons by the particles being tracked. Therefore, the further light normally differs in its wavelength from the scanning light.
  • the wavelength for exciting these signals is usually in the red or infrared spectral range, so that decoupling from the scanning light, which generates fluorescence or light scattering by the particles, is easily possible.
  • the light for exciting the second measured variable can be directed into the sample together with the scanning light through a single lens; however, it is also possible to illuminate the sample with the additional excitation light through separate optics.
  • These separate optics can be a second objective, which faces the objective for illuminating the sample with the scanning light or is arranged at an angle to it, so that the scanning light and the additional excitation light for generating the second measured variable intersect in the sample.
  • the beams intersect at an angle of between 15° and 165°, preferably at an angle of between 45° and 135° and particularly preferably at an angle of between 80° and 100°.
  • the exposure of the sample to the additional excitation light can be reduced, the spatial resolution of the second measured variable can be improved and a signal background caused by the additional excitation light when scanning the sample can be reduced.
  • the second measured variable can also be a non-optical variable.
  • This variable can, for example, be an electrical measured variable, in particular an electrical voltage, an electrical current, an electrical resistance, an electrical capacitance, an electrical inductance or a frequency, a phase or an amplitude of an electrical voltage, an electrical current or an alternating electromagnetic field.
  • An electric current in a sample can be measured, for example, in a patch C/amp arrangement in which a Micropipette electrically insulates a single ion channel in the cell membrane of a cell to be examined from the surrounding medium and the current through the ion channel is measured with an electrode.
  • a termination criterion for carrying out the method according to the invention can be defined on the basis of this control value.
  • the invention further relates to a light microscope that is set up to carry out the method according to the invention.
  • the light microscope includes an objective and a light source for scanning light, with which the particle in a sample can be excited to emit photons.
  • the scanning light in the sample has a local intensity minimum, which is generated with the aid of beam shaping means arranged in the beam path of the scanning light.
  • Beam-shaping means of this type are known to those skilled in the art from the prior art; phase filters or programmable phase modulators (Spatial Light Modulator, SLM), which are also used in STED microscopy, for example, may be mentioned here as examples.
  • the light microscope further comprises a scanning device with which the scanning light can be positioned in the sample and particles in the sample can be scanned at different scanning positions.
  • the light microscope has a detection channel that captures a first, optical measurement variable from the sample.
  • This optical measurement variable is the light signal emitted by the particle to be tracked as a result of illumination with the scanning light, typically a scattered light signal or a fluorescence signal.
  • An avalanche photodiode operated in the photon counting mode which can have a particularly high sensitivity, is particularly suitable as a detector for this purpose.
  • an analog photomultiplier can also be used as a detector as long as it has sufficient sensitivity for single molecule detection.
  • the light microscope also has a detection channel for detecting a second measured variable in the sample; this second measured variable is used to define the termination criterion when executing the method according to the invention.
  • the scanning light comprises at least one fluorescence excitation light with which the particles can be excited to fluoresce.
  • a particular embodiment results when the scanning light is formed by superimposing the fluorescence excitation light and a fluorescence prevention light from another light source, with (only) the fluorescence prevention light having the local intensity minimum in the sample.
  • Fluorescence prevention light is to be understood, as before, to mean any type of light suitable for the fluorescence emission of a fluorescent dye to prevent, reduce or completely suppress.
  • the fluorescence preventing light may be stimulating light that induces stimulated emission of electronically excited dye molecules.
  • the scanning of individual fluorescent particles provides a fluorescence signal dependent on the distance of the particle from the intensity minimum of the fluorescence prevention light;
  • the dependency of the signal strength on the distance is inverse, ie the fluorescence signal decreases with increasing distance from the intensity minimum of the fluorescence prevention light.
  • the scanning light is used to generate a scattered light signal on the particles, with the scattered light signal having the same wavelength as the scanning light (Rayleigh scattering) or a wavelength shifted to the scanning light (Rayleigh scattering, coherent anti-Stokes Raman scattering).
  • the light microscope can also have several contrast modes that can be used in parallel or alternatively.
  • a preferred embodiment of the light microscope according to the invention has both a galvo scanner in the beam path, with which the beam can be positioned over larger image fields, and an electro-optical deflector, with which the (rapid) scanning of the individual particles is carried out.
  • a device that integrates the functionality of the scanner and the beam deflector such a device can be formed, for example, by a deformable mirror.
  • the function of the scanner could be taken over by a moveable sample table, for example.
  • the second measured variable is also an optical measured variable, for example a (further) fluorescence of a (further) Fluorescent markers in the sample.
  • This (additional) fluorescence is preferably detected in a different wavelength range than the emission of the particle as a result of illumination with the scanning light, in order to be able to separate the two variables from one another. If a temporally or spectrally separate excitation of the emission of the particle and the (further) fluorescence marker is possible, both detection channels can, however, also be designed identically or not separately.
  • optical signals can also be detected as a second measured variable, in particular second harmonic generation signals (SHG), third harmonic generation signals (THG), Rayleigh or Raman scattered light signals, coherent anti-Stokes Raman scattered light signals (CARS), reflected light signals, differential interference contrast signals (DIC) or polarization contrast signals.
  • SHG second harmonic generation signals
  • TMG third harmonic generation signals
  • CDARS coherent anti-Stokes Raman scattered light signals
  • DIC differential interference contrast signals
  • polarization contrast signals polarization contrast signals.
  • the second measured variable is also an optical measured variable
  • the second measured variable requires one or more additional light sources with which the signal recorded as the second measured variable is generated in the sample.
  • This further light source/these further light sources can be, for example, lasers for exciting fluorescence or ultra-short-pulse lasers for generating an SHG or THG signal.
  • the light from the additional light source(s) can be directed into the sample together with the scanning light through a single lens; however, it is also possible to illuminate the sample with the light of the additional light source(s) through separate optics.
  • These separate optics can be a second objective, which faces the objective for illuminating the sample with the scanning light or can be arranged at an angle to it, so that the scanning light and the light for generating the second measured variable are at an angle between 15° and 165°, preferably at an angle between 45° and 135° and more preferably at an angle between 80° and 100° in the sample.
  • Such a configuration is implemented, for example, in a light sheet microscope.
  • the second metric is a non-optical metric.
  • Preferred non-optical measured variables are, in particular, electrical measured variables, ie electrical voltages, electrical currents, electrical capacitances, electrical inductances or frequencies, amplitudes or phases of electrical voltage, electrical currents or alternating electromagnetic fields.
  • An electric current can be measured, for example, in a patch C/amp arrangement in which a single ion channel in the cell membrane of a cell to be examined is electrically isolated from the surrounding medium with a micropipette and the current through the ion channel is measured with an electrode and after preparation is converted with a sensitive measuring amplifier into a control value for carrying out the method according to the invention.
  • FIG. 3 shows a light microscope according to the invention.
  • the initial position 3 of this particle is at least approximately known (for example from a previously recorded wide-field image, not shown here), so that the scanning of the particle 2 can be started at the initial position 3 .
  • the particle is illuminated with a scanning light 5 at a number of scanning positions 4, only a few of which are shown as examples in the figure.
  • the scanning light 5 has an intensity distribution 7 with a local intensity minimum 8 .
  • the particle 2 is here specifically a fluorescent particle that when illuminated with the scanning light 5, which is thus an excitation light 6, is excited to emit a fluorescence 9.
  • the scanning light 5 could also be a superimposition of excitation light 6 with an intensity distribution 7 of fluorescence prevention light, in particular stimulation light, having a local intensity minimum 8 .
  • the particle could also be a light-scattering particle. Instead of the fluorescence 9, a scattered light signal would then be detected when the particle 2 is illuminated with the scanning light 5.
  • the fluorescence 9 emitted by the fluorescent particle 2 is detected, and based on the last scanning position(s) and the respectively detected number(s) of fluorescence photons or the detected fluorescence intensity, updated coordinates of the fluorescent particle 2 are determined and one or more further scanning positions 4 defined.
  • the coordinates of the particle 2 can be updated in each case after scanning at a number of scanning positions 4, but it is also possible to react to each individual detected fluorescence photon by updating the coordinates of the fluorescent particle 2 and defining the subsequent scanning position(s). will.
  • the trajectory 10 of the fluorescent particle 2 is created by joining the coordinates determined one after the other.
  • a second measured variable 11 is detected as a control value 12 while the fluorescent particle 2 is being scanned, here also a fluorescence 13 of a further fluorescent dye 14 with which the cell 1 was stained 15 .
  • the additional fluorescent dye 14 is chosen such that its fluorescence 13 occurs in a different wavelength range than the fluorescence 9 of the particle 2 and does not affect the fluorescence 9 detected by the particle 2 at the scanning positions 4 . If fluorescence 13 of this further fluorescent dye 14 above a minimum value 16 is detected at the current scanning position 4, this indicates that the tracked particle 2 is moving within the cell 1, and the recording of the trajectory 10 by scanning the particle 2 is continued . However, as soon as the fluorescence 13 of the fluorescent dye 14 falls below the minimum value 16, this indicates that the particle 2 is outside the cell 1, and the scanning is terminated 17. The further trajectory 18 of the particle 2 outside the cell 1 is not pursued any further.
  • FIG. 2 schematically shows a selection of different second measured variables 11 in order to define a termination criterion for tracking individual particles 2 in the sample 19 .
  • a control value can also be derived from a number of measured variables, the measured variables shown in the figure are primarily to be regarded as alternatives.
  • the sample 19 is illuminated from below with the scanning light 5 via an objective 20 (inverse configuration).
  • a cell 1 is located in the sample, in which the cell nucleus 21 and some filaments 22 are shown as examples of the cell organelles of the cell 1 .
  • a fluorescent particle 2 is also shown, the trajectory of which is recorded by scanning with the scanning light 5 at different scanning positions in the cell 1 .
  • the focused scanning light 5 in the sample 19 is shifted to the scanning positions by tilting the light beam 23 of the scanning light 5 with a beam deflection device (not shown).
  • the fluorescence 9 emitted by the fluorescent particle 2 is collected with the lens 20 and detected with a detector (not shown).
  • a second measured variable 11 is recorded in order to define a criterion for stopping the scanning.
  • This second measured variable 11 can likewise be a fluorescence 13 of a second fluorescent dye with which individual components (eg organelles) of the cell 1 or the entire cell 1 are marked.
  • the excitation light 6 required to excite this second fluorescent dye can enter the sample in a common light beam 23 with the scanning light 5
  • the fluorescence 13 of the second dye can also be viewed with the lens
  • the fluorescence 13 then serves as a control value 12, on the basis of which a termination criterion for the scanning and tracking of the fluorescent particle 2 is established.
  • This termination criterion can be, for example, falling below a minimum value of the control value 12, which indicates that the fluorescent particle 2 has moved away from the cell 1 marked with the second fluorescent dye or the cell organelle.
  • the second measured variable 11 can also be transmitted light 26 captured in the transmission direction 24 with a second lens 25 and detected with a further detector (not shown), the intensity of which serves as a control value 12 for determining the termination criterion.
  • the scanning light 5 transmitted through the sample can be detected as the transmitted light 26 , but it is also possible to irradiate a further illumination light 27 with the scanning light 5 into the sample 19 .
  • the illumination with the further illumination light 27 can also take place in the form of dark field illumination in addition to bright field illumination; in this way, a better contrast of the control value can be achieved if necessary.
  • the transmitted-light contrast can also be implemented as a polarization contrast by arranging polarizers in the illumination and transmitted-light beam paths.
  • the illumination light 27 can also be chosen such that a non-linear optical signal, in particular an SHG signal 28 (Second Harmony Generation) or a THG signal (Third Harmony Generation) is generated in the sample.
  • the second measured variable 11 does not necessarily have to be an optical measured variable.
  • an electrical measured variable in particular an electrical current 32 or an electrical voltage, can also serve as the control value 12 .
  • the derivation of a current through an ion channel 29 in a patch-clamp arrangement is shown as an example.
  • a single ion channel 29 is isolated from the surrounding medium with a micropipette 30 and the ion current is diverted through the ion channel 29 with an electrode 31 and detected as an electric current 32 .
  • the signal processed with a measuring amplifier 33 can be used as a control value 12 in order to define a criterion for stopping the scanning and tracking of the fluorescent particle 2 in the sample 19 .
  • the tracking of the fluorescent particle 2 can thus be restricted to intervals in which the ion channel 29 is active.
  • FIG. 3 schematically shows the structure of a light microscope, which is designed here as a fluorescence microscope 34, for carrying out the method according to the invention.
  • the laser light source 35 provides scanning light 5, which is excitation light 6 for fluorescence excitation here.
  • the light beam 23 of the scanning light 5 passes through a beam deflection device, designed here in the form of two sequentially connected electro-optical deflectors (EOD) 36 for deflecting the light beam 23 in the horizontal or vertical direction.
  • EOD electro-optical deflectors
  • the wave front is shaped with a separate phase modulation element 37, here in the form of a liquid crystal modulator 38 (spatial light modulator, SLM) in such a way that during the subsequent focusing through the lens 20, an intensity distribution of the scanning light 5 in the Sample 19 results.
  • SLM spatial light modulator
  • the light beam reflected or diffracted by the liquid crystal modulator 38 is coupled into a main beam path 40 of the fluorescence microscope 34 by a beam coupler 39 .
  • the beam coupler 39 is advantageously designed as a narrow-band reflecting dielectric notch filter whose reflection range overlaps as little as possible with the wavelength range of the fluorescence 9, so that only small portions of the fluorescence 9 running in the main beam path 40 in the opposite direction to the scanning light 5 are reflected out of the main beam path 40.
  • the scanning light 5 is directed into the rear aperture of the objective 20 with a scanning lens 41 , a scanner 42 and a tube lens 43 .
  • the galvanometer-based scanner 42 is used for a relatively slow, but possible coarse positioning of the focused scanning light 5 over a large field of view on a fluorescent particle in the sample, while the EODs 36 are used for the rapid positioning of the intensity minimum in the vicinity of the fluorescent particle .
  • the EODs 36 allow positioning at high speed, but with a positioning range that is limited to a few micrometers.
  • the from the lens 20 from The fluorescence 9 received from the sample 19 propagates along the main beam path 40 in the opposite direction to the scanning light 5 .
  • the fluorescence 9 is focused with a lens 45 through a confocal pinhole 44 , collimated with a further lens 46 , separated from scattered light with a filter 47 and detected with a detector 48 .
  • a second fluorescence channel for detecting the fluorescence 13 of a second fluorescent dye is provided in the fluorescence microscope 34 , the fluorescence 13 being the second measured variable 11 for defining a termination criterion for the scanning of individual fluorescent particles in the sample 19 .
  • the fluorescence microscope 34 has a further light source 49 whose light is coupled into the main beam path 40 with a second beam coupler 50 .
  • the fluorescence 13 of the second fluorescent dye excited by the light from the light source 49 is separated from the fluorescence 9 of the fluorescent particle with a beam splitter 51 and, after filtering through a filter 47, detected with the detector 52.
  • the fluorescence microscope 34 also has a control unit 53, which generates control signals 54 for controlling the scanner 42 and the EODs 36, and also receives the detector signals 55 from the detectors 48, 52.
  • the control device 53 is set up to position the scanning light 5 with the scanner 42 on individual fluorescent particles and to track individual particles in the sample by repeatedly scanning them with the scanning light 5 in a close range and determining positions from the scanning positions and intensities detected at the scanning positions or photon numbers of fluorescence 9 can be performed.
  • the control unit 53 receives a fluorescence 13 as a second measured variable from the sample 19 and stops tracking a particle when a termination criterion is reached, which here is falling below a minimum intensity of the second measured variable, i.e. the fluorescence 13.
  • Electro-optical deflector (EOD) is Electro-optical deflector

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Abstract

Die Erfindung richtet sich auf ein Verfahren zur Aufnahme einer Bewegungstrajektorie eines einzelnen Partikels in einer Probe und auf ein dieses Verfahren ausführendes Lichtmikroskop.Ausgehend von einer zumindest näherungsweise bekannten Anfangsposition wird das Partikel mit einer ein lokales Intensitätsminimum aufweisenden Intensitätsverteilung eines Abtastlichts abgetastet. Bei der Beleuchtung mit dem Abtastlicht erzeugt das zu verfolgende Partikel ein detektierbares Lichtsignal, aus dessen Intensität aktualisierte Koordinaten des Partikels berechnet werden. Erfindungsgemäß wird das Abtasten beendet, wenn eine parallel detektierte zweite Messgröße ein Abbruchkriterium erfüllt.

Description

VERFAHREN UND MIKROSKOP ZUR AUFNAHME VON TRAJEKTORIEN EINZELNER PARTIKEL IN EINER PROBE
Technisches Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur zeitlichen Verfolgung einzelner Partikel in einer Probe nach dem MINFLUX-Prinzip. Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein das Verfahren ausführendes Lichtmikroskop.
Stand der Technik
Die Beobachtung und die Verfolgung einzelner Partikel in einer Probe (engl. Single Particle Tracking, SPT) ist eine wichtige Technik zur Untersuchung molekularer Dynamik in biologischen Systemen. Hierzu können lichtstreuende Partikel, beispielsweise metallische Nanopartikel, verwendet werden; meist werden jedoch fluoreszente Partikel oder einzelne Moleküle eines Fluoreszenzfarbstoffs eingesetzt. Mit Fluoreszenzfarbstoffen ist es auch möglich, ansonsten nicht detektierbare Partikel zu markieren und damit für die Partikelverfolgung zugänglich zu machen. Zu den biologischen Anwendungsgebieten gehören unter anderem die Untersuchung enzymkatalysierter Reaktionen, der DNA-Transkription, der Aktivität von lonenkanälen und des Vesicle Trafficking.
Die Anwendbarkeit der eingesetzten Methoden hängt dabei maßgeblich vom erreichbaren Beobachtungszeitraum und der zeitlichen Auflösung bei der Beobachtung einzelner Partikel ab. Hierzu sind aus dem Stand der Technik mikroskopbasierte, abbildende Methoden einerseits und Punktdetektor-basierte Methoden andererseits bekannt. Erstere erlauben die Beobachtung einzelner Partikel über einen größeren Bildbereich und damit die Verfolgung auch frei diffundierender Partikel über vergleichsweise lange Zeiträume. Allerdings ist die erreichbare zeitliche Auflösung durch die Bildrate der Kamera begrenzt, weswegen eine Untersuchung schneller Prozesse mit diesem Ansatz nicht möglich ist.
Umgekehrt können mit Punktdetektor-basierten Methoden, insbesondere bei der Verwendung zeitaufgelöster Einzelphotonenzählung, hohe zeitliche Auflösungen bis in den Pikosekundenbereich erzielt werden, allerdings ist der Beobachtungszeitraum in vielen Anwendungen auf die Verweildauer einzelner Partikel im Fokus des Beleuchtungslichts begrenzt. Der Beobachtungszeitraum ist insbesondere dann kurz, wenn die Partikel frei diffundieren können. Um diese Begrenzung zu überwinden, werden zu verfolgende Partikel und insbesondere Einzelmoleküle oft immobilisiert, d. h. an einen ortsfesten Träger gebunden oder mittels optischer Pinzetten an einem Ort gehalten. Zur Verwendung mit optischen Pinzetten müssen einzelne Biomoleküle allerdings an (größere) Trägerpartikel gekoppelt werden, was Anwendungen in nativen, lebenden Systemen stark einschränkt.
Die Verlängerung des Beobachtungszeitraums eines einzelnen Partikels mit einem Einzelpunktdetektor ist alternativ möglich, indem das Molekül mit Hilfe eines verstellbaren Probenhalters und einem geschlossenen Regelkreis aktiv im Fokus gehalten wird. Die Verfolgung einzelner fluoreszenter Moleküle wurde erstmals von N. P. Wells et al. in „Time Resolved 3D Molecular Tracking in Live Gells“, Nano Let. 10, 4732 (2010) realisiert, wobei Cy5-dUTP-Moleküle in 92%igem Glycerin, also einem sehr viskosen Medium, über rund 100 ms in Echtzeit verfolgt werden konnten. Eine Anwendung der Methode in weniger viskosen (und damit praxisrelevanteren) Medien ist mit den in dieser Arbeit eingesetzten piezobasierten Versteuern zum Nachführen der Probe nicht möglich, da die Diffusionsgeschwindigkeit der Farbstoffmoleküle in weniger viskosen Medien erheblich höher ist, so dass einzelne Farbstoffmoleküle nicht mehr ausreichend schnell verfolgt werden können und den Fangbereich der Regelung zur Probennachführung schnell verlassen. Auch die zeitliche Maximallänge der Trajektorien ist mit rund 100 ms kurz, was insbesondere auf das begrenzte Photonenbudget, d. h. die limitierte Zahl von Fluoreszenzphotonen, die von einem Farbstoffmolekül bis zum endgültigen Ausbleichen abgegeben wird, zurückzuführen ist.
Zur schnelleren Verfolgung einzelner Partikel und insbesondere einzelner Farbstoffmoleküle stehen inzwischen schnelle Strahlablenkmittel, insbesondere elektrooptische oder akusto- optische Deflektoren zur Verfügung, die eine Positionierzeit im (Sub-)Mikrosekundenbereich erreichen, allerdings auf einen Positionierbereich von wenigen Mikrometern beschränkt sind. Um einzelne Partikel in einem größeren Bereich der Probe abtasten zu können, können diese schnellen, nicht-mechanischen Abtastmittel mit Galvanometerspiegeln kombiniert werden, die eine (langsamere) Vorpositionierung des fokussierten Anregungslichts in einem großen Bereich der Probe ermöglichen.
Die Druckschrift DE 10 2011 055 367 AI beschreibt eine unter dem Akronym MINFLUX bekannte Variante des Single Particle Tracking, bei der das Partikel mit einer ein Intensitätsminimum aufweisenden Lichtverteilung eines Abtastlichts beleuchtet und die von dem Partikel emittierten Photonen registriert werden. Das Minimum wird dem sich in der Probe bewegenden Partikel nachgeführt, indem die Intensitätsverteilung so gegenüber der Probe verschoben wird, dass die Rate der von dem Partikel emittierten Photonen minimal bleibt. Mit zunehmender Konfidenz der Lokalisierung können die Positionen des Intensitätsminimums zunehmend näher um das verfolgte Partikel angeordnet und die Leistung des Abtastlichts erhöht werden, wodurch eine weiter präzisierte Lokalisierung möglich wird.
Der besondere Vorteil des MINFLUX-Verfahrens liegt in seiner besonderen Photoneneffizienz, die eine genaue Lokalisierung einzelner Partikel bis in den einstelligen Nanometerbereich bereits mit einer vergleichsweise geringen Zahl von Photonen erlaubt. Da die Abtastung mit einem Intensitätsminimum - idealerweise einer Intensitätsnullstelle - der Lichtverteilung erfolgt und das Intensitätsminimum nur in einem Nahbereich um die Partikel positioniert wird, werden die Partikel mit nur geringer Lichtintensität beaufschlagt. Die quantitative Analyse [siehe K. Gwosch et al. in „MINFLUX nanoscopy delivers 3D multicolor nanometer resolution in cells“, Nat. Methods 17, 217 (2020)] zeigt, dass die Standardabweichung a der Lokalisierungsgenauigkeit beim MINFLUX- Verfahren der Beziehung a oc 1//Vfe/2 folgt, wobei N die Anzahl der detektierten Photonen und k die Anzahl der Iterationsschritte ist. Bereits mit vier Iterationen ist daher a oc 1//V2, d. h. die Unsicherheit der Lokalisierung sinkt mit dem Quadrat der Anzahl von Photonen. Im Gegensatz dazu sinkt die Standardabweichung bei der Ortsbestimmung einzelner Partikel aus einem Weitfeldbild der Partikel (beispielsweise in der STORM-/PALM-Mikroskopie oder auch durch Abrastern mit einem gaußförmigen Lichtfokus) nur mit der Wurzel aus der Anzahl N der detektierten Photonen (a oc 1/V/v). Aufgrund dieser besonderen Photoneneffizienz können auch von einzelnen fluoreszenten Farbstoffmolekülen, die nur eine sehr begrenzte Zahl von Fluoreszenzphotonen emittieren, bis sie irreversibel bleichen, nach dem MINFLUX-Verfahren wesentlich mehr Positionsbestimmungen durchgeführt werden als dies mit anderen Verfahren möglich ist.
Insbesondere bei der Verwendung schneller Abtastmittel können wiederholte Positionsbestimmungen einzelner Partikel in sehr kurzem Abstand erfolgen, mit dem aktuell verfügbaren Stand der Technik ca. alle 100 ps. Aufgrund der hohen Photoneneffizienz und der hohen Lokalisierungsgeschwindigkeit eignet sich das MINFLUX-Verfahren daher für die Echtzeit- Verfolgung einzelner fluoreszenter Farbstoffmoleküle in der Probe in besonderem Maß. Dabei ist ein Verfolgen einzelner Farbstoffmoleküle auch in niederviskosen Medien möglich. Aus dem Stand der Technik sind nach dem MINFLUX-Verfahren aufgenommene Trajektorien einzelner Farbstoffmoleküle mit mehr als 25.000 Einzelpositionsbestimmungen bekannt.
In der DE 10 20 ' ' '6 B3 ist eine Variante des MINFLUX-Verfahrens beschrieben, bei der das Abtasten der vereinzelt vorliegenden Fluoreszenzfarbstoffmoleküle nicht durch Beleuchten mit einer ein lokales Intensitätsminimum aufweisenden Intensitätsverteilung von Anregungslicht, sondern mit zwei im Wesentlichen komplementären Intensitätsverteilungen eines Anregungsund eines Fluoreszenzverhinderungslichts erfolgt. Dabei weist die Intensitätsverteilung des Anregungslichts ein lokales Intensitätsmaximum auf, während die Intensitätsverteilung des Fluoreszenzverhinderungslichts an derselben Stelle ein lokales Intensitätsminimum aufweist. Bei dem Fluoreszenzverhinderungslicht kann es sich konkret um STED-Licht handeln, das in den Randbereichen der Intensitätsverteilung des Anregungslichts angeregte Fluoreszenzfarbstoffmoleküle durch Auslösen stimulierter Emission an der Aussendung von Fluoreszenzphotonen hindert. Auch in dieser Ausführungsform des MINFLUX-Verfahrens hängt die Intensität der von dem Farbstoffmolekül emittierten Fluoreszenz vom Abstand zu dem lokalen Intensitätsminimum des Fluoreszenzverhinderungslichts ab, allerdings nimmt die Fluoreszenz hier mit zunehmendem Abstand vom Intensitätsminimum nicht zu, sondern ab. Eine experimentelle Umsetzung dieses Konzepts wurde durch M. Weber et al. in „MINSTED fluorescence localization and nanoscopy“, bioRxiv, doi: 10.1101/2020.10.31.363424 (2020) beschrieben.
Während lange Trajektorien einzelner Partikel mit vielen Positionsbestimmungen grundsätzlich wünschenswert sind, stellt sich allerdings die Frage, ob die Trajektorien für eine gegebene Fragestellung in ihrer gesamten Länge aussagekräftige Informationen enthalten. Beispielsweise liefert eine Untersuchung einer möglichen Wechselwirkung zwischen einem verfolgten Partikel und einer Bindungsstelle in der Probe keine relevanten Informationen, wenn der Abstand zwischen Partikel und der Bindungsstelle zu groß wird. Auch sind aus einer Trajektorie abgeleitete Informationen möglicherweise irrelevant oder sogar irreführend, wenn während der Aufnahme der Trajektorie die Zelle in einen nichtrepräsentativen Zustand übergeht (z. B. durch Zellteilung oder Apoptose). Überflüssige Abtastungen führen zudem zu einer vermeidbaren Belastung der Probe mit dem Abtastlicht und zu einer unnötig langen Messdauer.
Aufgabe der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung besteht daher darin, ein Verfahren und ein Lichtmikroskop zum Verfolgen der Bewegung eines einzelnen Partikels in einer Probe aufzuzeigen, bei denen das Verfolgen des Partikels unterbrochen oder abgebrochen wird, wenn das Verfolgen des Partikels keine für eine gegebene Fragestellung relevante Information mehr liefert. Die Aufgabe des erfindungsgemäßen Verfahrens und des Lichtmikroskops besteht also darin, eine Methode aufzuzeigen, die ein geeignetes Abbruchkriterium für das Verfolgen des Partikels definiert. Lösung
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren nach dem unabhängigen Anspruch 1 , und durch ein Lichtmikroskop nach dem unabhängigen Anspruch 21 gelöst. Die abhängigen Ansprüche 2 bis 20 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens, während sich die abhängigen Ansprüche 22 bis 26 auf bevorzugte Ausführungsformen des Lichtmikroskops beziehen.
Beschreibung der Erfindung
Der Erfindung liegt die Idee zu Grunde, dass beim Verfolgen der Bewegung eines Partikels in der Probe eine Entscheidung darüber, welche Abschnitte der aufgenommenen Trajektorie zur Beantwortung einer gegebenen Fragestellung relevante Informationen enthalten, oft nicht aus den Datenpunkten der Trajektorie allein getroffen werden kann, sondern dass hierzu weitere Informationen über den Kontext in der Probe erforderlich sind. Dieser Kontext kann eine räumliche Information über die (unmittelbare) Umgebung des gerade verfolgten Partikels sein oder auch eine funktionale Information, die den funktionalen Zustand beispielsweise einer Zellorganelle (z.B. der Öffnungszustand eines lonenkanals) oder der Zelle als Ganzes kennzeichnet.
Hierzu umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Aufnahme einer Trajektorie, also einer zeitaufgelösten Ortskurve eines einzelnen Partikels in einer Probe, wobei eine zweite Messgröße in der Probe erfasst wird und die Aufnahme der T rajektorie unterbrochen oder beendet wird, wenn die zweite Messgröße oderein aus der zweiten Messgröße berechneter Kontrollwert ein Abbruchkriterium erfüllt. Eine solche rechtzeitige Beendigung der Aufnahme einer Trajektorie ist sowohl zeit- als auch photoneneffizient.
Als zu verfolgende Partikel können dabei lichtstreuende Partikel verwendet werden, beispielsweise metallische Nanopartikel, Silica- oder Latex-Nanopartikel, oder - in vielen Anwendungen bevorzugt - fluoreszente Partikel. Der Begriff der fluoreszenten Partikel ist hier in einem breiten Sinne aufzufassen; fluoreszente Partikel sind beispielsweise auch mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte Einzelmoleküle eines Reagenzes, eines Liganden, eines Wirkstoffs oder eines Biomoleküls (z. B. Proteins, DNA, Lipids), aber auch fluoreszenzmarkierte supramolekulare Strukturen, Aggregate oder Molekülkomplexe wie Mizellen, Vesikel oder Lipid Rafts. Unter fluoreszenten Partikeln sind insbesondere auch molekulare Fluorophore, also einzelne Moleküle fluoreszenter Farbstoffe und fluoreszente Quantenpunkte (engl. quantum dots, Qdots) zu verstehen. Entscheidend ist, dass die Partikel in Form diskreter und weitgehend identischer Einheiten auftreten. Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist sicherzustellen, dass die Partikel vereinzelt vorliegen, der Abstand benachbarter Partikel also oberhalb der optischen Beugungsgrenze liegt, so dass benachbarte Partikel in einer optischen Abbildung als getrennte Objekte identifiziert werden können. Das Abstandserfordernis kann beispielsweise dadurch erfüllt werden, dass die Partikel in einer so geringen Konzentration eingesetzt werden, dass sie im statistischen Mittel einen ausreichenden Abstand voneinander aufweisen. Räumlich vereinzelte fluoreszente Moleküle eines Fluoreszenzfarbstoffs können auch durch Fotoaktivierung und / oder Fotodeaktivierung erzeugt werden, wenn der Fluoreszenzfarbstoff lichtinduziert zwischen einem fluoreszenten Zustand und einem nichtfluoreszenten Zustand in zumindest einer Richtung konvertiert werden kann. Durch eine Fotoaktivierung einer sehr kleinen Zahl von fluoreszenten Farbstoffmolekülen oder einer Fotodeaktivierung des Großteils der fluoreszenten Farbstoffmoleküle kann so eine kleine Zahl von Farbstoffmolekülen im fluoreszenten Zustand präpariert werden, die den erforderlichen Abstand voneinander aufweisen. Das Abstandserfordernis gilt dabei auch für Moleküle unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoffe, die mit Anregungslicht der gleichen Wellenlänge zur Fluoreszenz in einem gleichen Fluoreszenzwellenlängenbereich angeregt werden können. Bezüglich geeigneter Verfahren zum Vereinzeln fluoreszenter Farbstoffmoleküle in einer Probe kann der Fachmann auf umfassenden Stand der Technik zur Lokalisationsmikroskopie (PALM, STORM und verwandte Methoden) zurückgreifen.
Zur Aufnahme der Trajektorie eines einzelnen Partikels nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist eine Kenntnis seiner initialen Position bei Beginn der Messung zumindest näherungsweise erforderlich. Initiale Koordinaten können beispielsweise durch Abscannen der Probe mit fokussiertem Licht in einem konventionellen Laserscanning oder aus einem zuvor aufgenommenen Weitfeldbild erfolgen; konkrete Verfahren hierzu finden sich ebenfalls im Stand der Technik zur PALM-, STORM- und MINFLUX-Mikroskopie.
Ausgehend von den initial bestimmten Koordinaten des Partikels wird dieses mit einem Abtastlicht an einer oder mehreren Abtastpositionen abgetastet, wobei die Intensitätsverteilung des Abtastlichts in der Probe ein lokales Intensitätsminimum - idealerweise eine Intensitätsnullstelle - aufweist. Wenn im Folgenden von einer Abtastposition die Rede ist, dann ist damit die Position dieses lokalen Minimums gemeint. Bei der Beleuchtung mit dem Abtastlicht erzeugt das zu verfolgende Partikel ein detektierbares Lichtsignal, beispielsweise ein Streulichtsignal im Falle lichtstreuender Partikel oder ein Fluoreszenzsignal im Falle fluoreszenter Partikel.
Beim Abtasten des Partikels mit dem Abtastlicht wird an jeder Abtastposition ein Lichtsignal in Form einer Anzahl von oder einer Intensität als eine erste Messgröße detektiert. Abhängig davon, ob sich das Partikel im Zentrum einer Abtastposition und damit im Intensitätsminimum oder nahe des Intensitätsminimums des Abtastlichts befindet oder ob es weiter vom Intensitätsminimum entfernt liegt und damit einer höheren Intensität des Abtastlichts ausgesetzt ist, fällt das detektierte Lichtsignal niedriger oder höher aus. Die detektierte Photonenzahl oder Lichtintensität stellt insofern ein Maß für den Abstand des Partikels vom Intensitätsminimum dar und dient der Bestimmung nachfolgender Abtastpositionen und aktualisierter Koordinaten des abgetasteten Partikels. Die Bestimmung aktualisierter Koordinaten des Partikels kann dabei nach jeweils einer festen oder einer variablen, d. h. im Laufe des Abtastens angepassten Anzahl von Abtastpositionen, nach jeder einzelnen Abtastposition oder sogar nach jedem detektierten Photon erfolgen. Durch die wiederholte Lokalisierung des Partikels und die Neufestlegung der folgenden Abtastposition(en) folgt die Abtastung der Bewegung des Partikels in der Probe und bildet damit die Trajektorie des Partikels nach.
Die zuvor beschriebenen Verfahrensschritte entsprechen im Wesentlichen dem aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Einzelmolekülverfolgung nach dem MINFLUX-X/ erfahren wie es beispielsweise von F. Balzarotti et al. in „Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes“, Science 355, 606 (2017) beschrieben ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich vom Stand der Technik nun dadurch, dass während der Aufnahme der Trajektorie des Partikels eine zweite Messgröße in der Probe erfasst wird und die Aufnahme der Trajektorie unterbrochen oder beendet wird, wenn die zweite Messgröße oder ein aus der zweiten Messgröße berechneter Kontrollwert ein Abbruchkriterium erfüllt. Im einfachsten Fall besteht das Abbruchkriterium darin, dass die zweite Messgröße oder der Kontrollwert einen Minimalwert unterschreitet oder einen Maximalwert überschreitet. Optional kann das Abtasten fortgesetzt werden, wenn die zweite Messgröße oder der Kontrollwert den Minimalwert wieder überschreitet bzw. den Maximalwert wieder unterschreitet, wobei in der Praxis eine Hysterese vorgesehen sein kann. Als Abbruchkriterium können auch komplexere Kriterien festgelegt werden, insbesondere auch unter Berücksichtigung der Historie der zweiten Messgröße.
Erfindungsgemäß wird die zweite Messgröße während der Aufnahme der Trajektorie an einem Ort in der Probe detektiert, wobei die Detektion kontinuierlich, also asynchron zur Abtastung des Partikels erfolgen oder in den Abtastvorgang des Partikels integriert sein kann. Wenngleich nicht zwingend erforderlich, wird die zweite Messgröße dabei bevorzugt zumindest einmal pro Aktualisierung der Partikel-Koordinaten erfasst. Die Detektion der zweiten Messgröße kann punktförmig an den jeweils aktuellen Koordinaten des Partikels oder an der jeweils aktuellen Abtastposition erfolgen, es ist aber auch möglich, die zweite Messgröße in einem ausgedehnten Bereich in der Probe zu erfassen und über diesen Bereich zu mitteln, beispielsweise in einer Umgebung der zuletzt bestimmten Koordinaten des Partikels oder in einem festen, zuvor festgelegten Bereich in der Probe. Dieser Bereich kann zum Beispiel durch die Kontur einer Zelle oder einer Zellorganelle, beispielsweise des Zellkerns, festgelegt sein.
Der Zweck des Abbruchkriteriums besteht darin, die Aufnahme der Trajektorie zu beenden oder zumindest temporär zu unterbrechen, beispielsweise wenn weitere Lokalisierungen des beobachteten Partikels keine für eine gegebene Fragestellung relevanten Informationen (mehr) liefern oder wenn sich die Probe so verändert, dass die aus weiteren Lokalisierungen abgeleiteten Informationen nicht mehr mit denen aus früheren Lokalisierungen abgeleiteten Informationen vergleichbar sind, also für das Experiment keine Aussagekraft mehr besitzen oder sogar zu falschen Schlüssen führen können. Durch die parallele Detektion der zweiten Messgröße und die Anwendung eines Abbruchkriteriums können überflüssige Abtastungen und damit eine unnötige Belastung der Probe mit dem Abtastlicht vermieden werden. Gleichzeitig kann die Messdauer reduziert werden, oder es können in einer gegebenen Zeit Trajektorien von mehr Partikeln aufgenommen werden. Für viele Fragestellungen, die eine statistische Analyse einer großen Zahl von Trajektorien erfordern, können durch diesen Zeitvorteil größere Datensätze aufgenommen and analysiert werden, ohne dass sich die Messdauer dadurch insgesamt verlängert.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Partikel für jede Positionsbestimmung an mehreren Abtastpositionen in einem Nahbereich von typischerweise < 250 nm um die zuletzt bestimmten Koordinaten des Partikels abgetastet, wobei das durch die Abtastpositionen gebildete Polygon (im zweidimensionalen Fall) bzw. Polyeder (im dreidimensionalen Fall) die zuletzt bestimmten Partikel-Koordinaten einschließt. Dadurch ist sichergestellt, dass eine eindeutige Lokalisierung des Partikels möglich ist. Die an den Abtastpositionen durch das Partikel emittierte Photonenzahl oder Lichtintensität erlaubt eine Berechnung aktualisierter Koordinaten des Partikels; hierzu kann der Fachmann auf bekannte Verfahren und Algorithmen aus dem Stand der Technik (insbesondere zur MINFLUX- Technologie) zurückgreifen. Die beschriebenen Schritte werden wiederholt ausgeführt, d. h. es werden weitere Abtastpositionen in einem Nahbereich um die jeweils aktuellen Koordinaten festgelegt, das Partikel an den neu festgelegten Abtastpositionen mit dem Abtastlicht abgetastet, an jeder der Abtastpositionen von dem Partikel emittiertes Licht registriert, und es werden aktualisierte Koordinaten bestimmt. Die Festlegung der jeweils nachfolgenden Abtastpositionen nach jedem Lokalisierungsschritt erfolgt dabei auf Basis der zuletzt bestimmten Koordinaten des Partikels. Optional kann auch die optische Leistung des Abtastlichts erhöht werden. Durch die wiederholte Lokalisierung des Partikels und die Neufestlegung der Abtastpositionen folgt die Abtastung der Bewegung des Farbstoffmoleküls in der Probe und bildet damit die Trajektorie des Partikels ab.
In einer alternativen Ausführungsform werden nach jeder Abtastung des Partikels an einer Abtastposition aktualisierte Koordinaten des Partikels und die nachfolgende Abtastposition bestimmt. Eine vollständige Lokalisierung des Partikels allein aus den an einer einzelnen Abtastposition detektierten Photonen ist dabei nicht möglich; allerdings kann auf Basis der Abtasthistorie, der relativen Lage des Intensitätsminimums zu der vermuteten aktuellen Position des Partikels und der an der aktuellen Abtastposition detektierten Photonenzahl oder Lichtintensität darauf geschlossen werden, in welche Richtung die Abtastposition verschoben werden muss.
Die Festlegung der Abtastpositionen und der Intensität des Abtastlichts ist in hohem Maße von der Diffusions- oder Transportgeschwindigkeit des Partikels in der Probe und der Frequenz, mit der das Partikel lokalisiert werden kann, abhängig. Während eine möglichst dichte Anordnung der Abtastpositionen um die jeweils aktuelle Position des Partikels und eine hohe optische Leistung des Abtastlichts eine präzise Lokalisierung erlaubt und daher erstrebenswert ist, steigt dabei gleichzeitig die Gefahr, dass das Partikel zwischen aufeinanderfolgenden Lokalisierungen den Fangbereich der Lokalisierung verlässt. Während bei der Lokalisierung statischer, unbeweglicher Farbstoffmoleküle die Abtastpositionen sukzessive näher an den Ort des Farbstoffmoleküls verlagert, die optische Leistung des Abtastlichts erhöht und damit die Lokalisierungsgenauigkeit erhöht werden können, ist dies bei der Verfolgung in Bewegung befindlicher Partikel nicht beliebig möglich. Vielmehr müssen die Abtastpositionen und die optische Leistung des Abtastlichts so angepasst werden, dass das Partikel zwischen aufeinanderfolgenden Lokalisierungen innerhalb des Fangradius bleibt. Dabei gilt, dass die Abtastpositionen umso dichter um das Partikel angeordnet werden können und die optische Leistung des Abtastlichts umso höher eingestellt werden kann, je höher die Lokalisierungsfrequenz und je geringer die Bewegungsgeschwindigkeit der Partikel ist. Eine Anpassung beider Parameter kann auch zwischen aufeinanderfolgenden Lokalisierungen, d. h. während der Aufnahme der Trajektorie erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die zweite Messgröße eine optische Messgröße, insbesondere ein in einem zweiten Detektionskanal detektiertes Fluoreszenzsignal. Dieses Fluoreszenzsignal kann von einem (weiteren) Fluoreszenzfarbstoff in der Probe stammen und insbesondere zur Markierung einer Struktur in der Probe dienen. Es kann sich aber auch um ein Autofluoreszenzsignal, also ein intrinsisches Fluoreszenzsignal einer Zelle, handeln. Wenn beispielsweise der Zellkern, die Zellmembran, eine Zellorganelle, ein Strukturprotein, ein lonenkanal, ein Lipid Raft oder eine andere Struktur einer in der Probe befindlichen Zelle mit einem (weiteren) Fluoreszenzfarbstoff gefärbt ist, so liefert dessen Fluoreszenz eine Kontextinformation bei der Verfolgung einzelner Partikel in der Probe. Das Nichtvorhandensein dieser Färbung bzw. das Unterschreiten eines Mindestfluoreszenzsignals dieser Färbung am Ort eines abgetasteten Partikels kann beispielsweise anzeigen, dass sich das abgetastete Partikel außerhalb einer Zelle oder eines interessierenden Bereichs in einer Zelle befindet (bzw. diesen Bereich verlassen hat) und kann daher als Abbruchkriterium für das Verfolgen des Partikels dienen. Zur Untersuchung von Ligand-Rezeptor-Interaktionen können beispielsweise der Ligand und der Rezeptor mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt und einzelne Moleküle des fluoreszenzmarkierten Liganden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in der Probe verfolgt werden. Dabei kann die Verfolgung einzelner fluoreszenzmarkierter Ligandenmoleküle auf Zeiträume beschränkt werden, während derer sich - wie durch das Fluoreszenz(kontroll)signal des Rezeptors angezeigt - der Ligand in der unmittelbaren Nähe eines Rezeptors befindet und mit diesem interagieren kann. Die Verfolgung kann abgebrochen werden, wenn der Kontrollwert anzeigt, dass sich das Ligandenmolekül von dem entsprechenden Rezeptor entfernt hat.
Das Abbruchkriterium muss nicht notwendigerweise direkt auf der zweiten Messgröße definiert sein, sondern kann auch auf einen aus der zweiten Messgröße berechneten Kontrollwert bezogen sein, in dessen Berechnung gegebenenfalls weitere Messgrößen eingehen können. Insbesondere kann der Kontrollwert aus einem Fluoreszenzverhältnis in zwei Detektionskanälen berechnet werden, in denen die Fluoreszenz in unterschiedlichen Detektionswellenlängenbereichen detektiert wird. Eine vorteilhafte Ausführungsform ergibt sich dabei, wenn die Fluoreszenz ratiometrischer Indikatorfarbstoffe für die Berechnung des Kontrollwerts verwendet wird. Das Verhältnis der Fluoreszenzsignale derartiger Indikatorfarbstoffe in zwei Wellenlängenbereichen kann beispielsweise Auskunft geben über lonenkonzentrationen (insbesondere Calcium-, Magnesium-, Zink- und Natriumionen), pH-Werte oder Membranpotenziale. Ein auf einen derartigen Kontrollwert bezogenes Abbruchkriterium erlaubt die Beschränkung der Einzelpartikelverfolgung nicht nur auf räumlich begrenzte Bereiche in Probe, sondern auch auf bestimmte funktionale Zustände einer Zelle oder Zellorganelle, z. B. den Öffnungszustand eines lonenkanals oder die Unversehrtheit einer Zellmembran. Mit geeigneten Indikatorfarbstoffen bzw. fluoreszenzbasierten Reagenzien (z. B. Fluoreszenz-Ubiquitinations-Zellzyklus-Indikator, FUCCI) lässt sich auch der Status von Zellen bezüglich der Zellzyklus-Progression und -Teilung oder die Zellviabilität bzw. Zellvitalität (beispielsweise LIVE / DEAD Assays, ThermoFisher Scientific) beurteilen. Dabei können fluoreszierende Doppelfärbungen zum gleichzeitigen Nachweis sowohl von Apoptose als auch Nekrose zum Einsatz kommen, so dass Zellen je nach Fluoreszenzsignal in einem oder beiden Fluoreszenzkanälen als tot, nekrotisch oder apoptotisch klassifiziert werden können. Wenn der Kontrollwert aus der Fluoreszenz eines oder mehrerer dieser fluoreszenten Zellstatus-, Vitalitäts- bzw. Viabilitätsmarker abgeleitet wird, lässt sich das Verfolgen einzelner fluoreszenter Partikel nach dem erfindungsgemäßen Verfahren auf intakte Zellen bzw. auf Beobachtungszeiträume beschränken, in denen die beobachteten Zellen als gesund eingestuft werden können oder sich in einer bestimmten Phase des Zellzyklus befinden. Auf diese Weise können Fehlinterpretationen von Messdaten vermieden werden, die möglicherweise aus der Aufnahme nichtrepräsentativer Daten entstehen.
Neben der Fluoreszenzintensität können auch andere Parameter der Fluoreszenzemission zur Definition eines Abbruchkriteriums herangezogen werden, insbesondere die Fluoreszenzlebensdauer oder die Fluoreszenzanisotropie. Diese Parameter sind oft sensitiv für Änderungen des Bindungszustands oder der molekularen Umgebung eines Farbstoffmoleküls oder eines mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierten Moleküls oder Partikels infolge reduzierter Mobilität oder der Veränderung möglicher Reaktionspfade der Fluoreszenzlöschung.
Bei der Verwendung fluoreszenter Partikel kann auch eine alternative Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens gewählt werden, bei der das Abtastlicht durch eine aus der STED-Mikroskopie bekannte Überlagerung von Anregungslicht und eine das lokale Intensitätsminimum aufweisende Intensitätsverteilung eines Fluoreszenzverhinderungslichts gebildet wird, die eine Fluoreszenzemission aus fokalen Randbereichen verhindert. Unter Fluoreszenzverhinderungslicht ist dabei jede Art von Licht zu verstehen, das die Fluoreszenzemission der fluoreszenten Partikel verhindert, reduziert oder gänzlich unterdrückt. Insbesondere kann das Fluoreszenzverhinderungslicht Stimulationslicht sein, das eine stimulierte Emission elektronisch angeregter Farbstoffmoleküle induziert, wodurch die Farbstoffmoleküle (zurück) in den elektronischen Grundzustand überführt und so an einer spontanen Fluoreszenzemission gehindert werden. Auch in dieser Konfiguration liefert das Abtasten einzelner fluoreszenter Partikel ein vom Abstand des Partikels vom Intensitätsminimum des Fluoreszenzverhinderungslichts abhängiges Fluoreszenzsignal. Dabei ist die Abhängigkeit der Signalstärke vom Abstand allerdings invers, d. h. das Fluoreszenzsignal nimmt mit zunehmendem Abstand vom Intensitätsminimum des Fluoreszenzverhinderungslichts ab.
Außer der Fluoreszenz kann die zweite Messgröße zur Ableitung des Abbruchkriteriums auch eine andere optische Messgröße sein, insbesondere ein Second-Harmonic-Generation-S'\gr\a\ (SHG), ein Third-Harmonic-Generation-S'\gr\a\ (THG), ein Rayleigh- oder Raman-Streulichtsignal, ein Coherent Anti-Stokes Raman Scatter! ng-S gna\ (CARS), ein Reflexionslichtsignal, ein Differentialinterferenzkontrastsignal (DIC) oder ein Polarisationskontrastsignal. Der Vorteil bei der Nutzung einer dieser optischen Messgrößen zur Festlegung eines Abbruchkriteriums besteht darin, dass keine (weitere) Färbung der Probe mit einem Fluoreszenzmarker erforderlich ist und dass diese Signale nicht einem Fotobleichen unterliegen. Wenngleich mit diesen Kontrastmodalitäten nicht eine einer gezielten Fluoreszenzmarkierung vergleichbare Spezifität erreicht werden kann, zeigen einige der Kontrastmodalitäten trotzdem eine gewisse Selektivität. Beispielsweise entstehen SHG-Signale nicht an Strukturen mit einem molekularen Symmetriezentrum, wohingegen bestimmte nicht-zentrosymmetrische Strukturen (z. B. Collagen, Myosin, Tubulin) im SHG-Kontrast ein besonders hohes Signal liefern.
Zur Generierung einer zweiten optischen Messgröße wird die Probe in der Regel zusätzlich zum Abtastlicht mit weiterem Licht beleuchtet, das in seinen Eigenschaften auf die jeweilige Kontrastmodalität und / oder auf das Abtastlicht abgestimmt ist. Dabei sollte das weitere Licht selektiv das Signal der zweiten optischen Messgröße, nicht aber die Emission von Photonen durch die verfolgten Partikel anregen. Daher unterscheidet sich das weitere Licht im Normalfall in seiner Wellenlänge vom Abtastlicht. Bei der Nutzung eines SHG- oder THG-Signals als zweite Messgröße liegt die Wellenlänge zur Anregung dieser Signale meist im roten bzw. infraroten Spektralbereich, so dass eine Entkopplung vom Abtastlicht, das eine Fluoreszenz oder eine Lichtstreuung durch die Partikel erzeugt, einfach möglich ist. Das Licht zur Anregung der zweiten Messgröße kann zusammen mit dem Abtastlicht durch ein einziges Objektiv in die Probe gerichtet werden; es ist aber auch möglich, die Probe durch eine separate Optik mit dem zusätzlichen Anregungslicht zu beleuchten. Diese separate Optik kann ein zweites Objektiv sein, das dem Objektiv zur Beleuchtung der Probe mit dem Abtastlicht gegenübersteht oder in einem Winkel zu diesem angeordnet ist, so dass das Abtastlicht und das zusätzliche Anregungslicht zur Generierung der zweiten Messgröße sich in der Probe kreuzen. Dabei schneiden sich die Strahlen in einem Winkel zwischen 15° und 165°, bevorzugt in einem Winkel zwischen 45° und 135° und besonders bevorzugt in einem Winkel zwischen 80° und 100°. Bei einer derartigen Beleuchtung der Probe (wie sie beispielsweise in einem Lichtblattmikroskop realisiert ist) kann die Belastung der Probe mit dem zusätzlichen Anregungslicht reduziert, die räumliche Auflösung der zweiten Messgröße verbessert und ein durch das zusätzliche Anregungslicht beim Abtasten der Probe entstehender Signalhintergrund reduziert werden.
Die zweite Messgröße kann auch eine nicht-optische Größe sein. Diese Größe kann beispielsweise eine elektrische Messgröße, insbesondere eine elektrische Spannung, ein elektrischer Strom, ein elektrischer Widerstand, eine elektrische Kapazität, eine elektrische Induktivität oder eine Frequenz, eine Phase oder eine Amplitude einer elektrischen Spannung, eines elektrischen Stroms oder eines elektromagnetischen Wechselfeldes sein. Ein elektrischer Strom in einer Probe kann beispielsweise in einer Patch C/amp-Anordnung gemessen werden, bei der mit einer Mikropipette ein einzelner lonenkanal in der Zellmembran einer zu untersuchenden Zelle vom umgebenden Medium elektrisch isoliert und der Strom durch den lonenkanal mit einer Elektrode gemessen wird. Nach Verstärkung und Aufbereitung des detektierten Stroms mit einem empfindlichen Messverstärker zu einem Kontrollwert kann auf Basis dieses Kontrollwerts ein Abbruchkriterium zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens festgelegt werden.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Lichtmikroskop, das dazu eingerichtet ist, das erfindungsgemäße Verfahren auszuführen. Hierzu umfasst das Lichtmikroskop ein Objektiv und eine Lichtquelle für Abtastlicht, mit dem das Partikel in einer Probe zur Abgabe von Photonen angeregt werden kann. Erfindungsgemäß weist das Abtastlicht in der Probe ein lokales Intensitätsminimum auf, das mit Hilfe von im Strahlengang des Abtastlichts angeordneten Strahlformungsmitteln erzeugt wird. Derartige Strahlformungsmittel sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt; exemplarisch seien hier Phasenfilter oder programmierbare Phasenmodulatoren (engl. Spatial Light Modulator, SLM) genannt, die beispielsweise auch in der STED-Mikroskopie eingesetzt werden. Das Lichtmikroskop umfasst weiter eine Abtastvorrichtung, mit der das Abtastlicht in der Probe positioniert und Partikel in der Probe an verschiedenen Abtastpositionen abgetastet werden können.
Das Lichtmikroskop verfügt über einen Detektionskanal, der eine erste, optische Messgröße aus der Probe erfasst. Diese optische Messgröße ist das von dem zu verfolgenden Partikel infolge der Beleuchtung mit dem Abtastlicht emittierte Lichtsignal, typischerweise also ein Streulichtsignal oder ein Fluoreszenzsignal. Als Detektor eignet sich hierzu insbesondere eine im Photonenzählmodus betriebene Avalanche-Fotodiode, die eine besonders hohe Sensitivität aufweisen kann. Als Detektor kann aber auch ein analoger Fotomultiplier eingesetzt werden, solange dieser über eine ausreichende Sensitivität für die Einzelmoleküldetektion verfügt. Erfindungsgemäß weist das Lichtmikroskop außerdem einen Detektionskanal zur Erfassung einer zweiten Messgröße in der Probe auf; diese zweite Messgröße dient zur Festlegung des Abbruchkriteriums bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Sofern das Lichtmikroskop zur Aufnahme von Bewegungstrajektorien fluoreszenter Partikel eingerichtet ist, es sich mithin um ein Fluoreszenzmikroskop handelt, umfasst das Abtastlicht zumindest ein Fluoreszenzanregungslicht, mit dem die Partikel zur Fluoreszenz angeregt werden können. Eine besondere Ausführungsform ergibt sich, wenn das Abtastlicht durch Überlagerung des Fluoreszenzanregungslichts und einem Fluoreszenzverhinderungslicht aus einer weiteren Lichtquelle gebildet wird, wobei (nur) das Fluoreszenzverhinderungslicht das lokale Intensitätsminimum in der Probe aufweist. Unter Fluoreszenzverhinderungslicht ist wie zuvor jede Art von Licht zu verstehen, das geeignet ist, die Fluoreszenzemission eines Fluoreszenzfarbstoffs zu verhindern, zu reduzieren oder gänzlich zu unterdrücken. Insbesondere kann das Fluoreszenzverhinderungslicht Stimulationslicht sein, das eine stimulierte Emission elektronisch angeregter Farbstoffmoleküle induziert. Auch in der letztgenannten Ausführungsform liefert das Abtasten einzelner fluoreszenter Partikel ein vom Abstand des Partikels vom Intensitätsminimum des Fluoreszenzverhinderungslichts abhängiges Fluoreszenzsignal; dabei ist die Abhängigkeit der Signalstärke vom Abstand allerdings invers, d. h. das Fluoreszenzsignal nimmt mit zunehmendem Abstand vom Intensitätsminimum des Fluoreszenzverhinderungslichts ab.
Wenn das Lichtmikroskop zur Aufnahme von Bewegungstrajektorien lichtstreuender Partikel eingerichtet ist, so dient das Abtastlicht zur Erzeugung eines Streulichtsignals an den Partikeln, wobei das Streulichtsignal die gleiche Wellenlänge wie das Abtastlicht (Rayleigh-Streuung) oder eine zum Abtastlicht verschobene Wellenlänge (Rayleigh-Streuung, kohärente anti-Stokes Raman-Streuung) aufweisen kann. Das Lichtmikroskop kann auch mehrere Kontrastmodi aufweisen, die parallel oder alternativ genutzt werden können.
Um das Potenzial des Verfahrens hinsichtlich der erzielbaren Lokalisationsgenauigkeit ausschöpfen zu können, wird von der Abtastvorrichtung regelmäßig eine Positioniergenauigkeit von 1 nm oder darunter mit einer entsprechenden Reproduzierbarkeit gefordert. Andererseits sind Positionierzeiten im Mikrosekundenbereich bevorzugt, um ein schnelles Abtasten und eine schnelle Abfolge von Lokalisierungen des Partikels erreichen zu können. Diese Präzisions- und Geschwindigkeitsanforderungen an die Abtastvorrichtung des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops lassen sich mit mechanischen Strahlablenkeinheiten wie Galvospiegeln allein nicht oder nur unzureichend erfüllen. Für die Abtastvorrichtung eignen sich daher Strahlablenkeinheiten, die ohne bewegliche Teile auskommen, beispielsweise elektrooptische Deflektoren (EOD) oder elektroakustische Deflektoren. Mit diesen sind die gewünschten Positionierzeiten problemlos erreichbar, allerdings sind die maximalen Ablenkwinkel sehr begrenzt. Aus diesem Grund weist eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops im Strahlengang sowohl einen Galvoscanner auf, mit dem der Strahl über größere Bildfelder positioniert werden kann, als auch einen elektrooptischen Deflektor, mit dem das (schnelle) Abtasten der einzelnen Partikel vorgenommen wird. Alternativ kann eine Vorrichtung vorhanden sein, die die Funktionalität des Scanners und der Strahlablenkeinrichtung integriert; eine solche Vorrichtung kann beispielsweise durch einen deformierbaren Spiegel ausgebildet sein. In weiteren alternativen Ausführungsformen könnte die Funktion des Scanners beispielsweise von einem verfahrbaren Probentisch übernommen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Lichtmikroskops ist die zweite Messgröße ebenfalls eine optische Messgröße, beispielsweise eine (weitere) Fluoreszenz eines (weiteren) Fluoreszenzmarkers in der Probe. Die Detektion dieser (weiteren) Fluoreszenz erfolgt bevorzugt in einem anderen Wellenlängenbereich als die Emission des Partikel infolge der Beleuchtung mit dem Abtastlicht, um beide Größen voneinander trennen zu können. Sofern eine zeitlich oder spektral getrennte Anregung der Emission des Partikels und des (weiteren) Fluoreszenzmarkers möglich ist, können beide Detektionskanäle allerdings auch identisch bzw. nicht separat ausgebildet sein. Neben einer Fluoreszenz können auch andere optische Signale als zweite Messgröße erfasst werden, insbesondere Second-Harmonic-Generation-Signale (SHG), Third- Harmonic-Generation-Signale (THG), Rayleigh- oder Raman-Streulichtsignale, kohärente Anti- Stokes Raman-Streulichtsignale (CARS), Reflexionslichtsignale, Differentialinterferenzkontrastsignale (DIC) oder Polarisationskontrastsignale.
Die meisten der Ausführungsformen, bei denen die zweite Messgröße ebenfalls eine optische Messgröße ist, erfordern eine oder mehrere weitere Lichtquellen, mit denen das als zweite Messgröße erfasste Signal in der Probe generiert wird. Bei dieser weiteren Lichtquelle / diesen weiteren Lichtquellen kann es sich beispielsweise um Laser zur Anregung einer Fluoreszenz oder um Ultrakurzpulslaser zur Erzeugung eines SHG- oder THG-Signals handeln. Das Licht der weiteren Lichtquelle(n) kann zusammen mit dem Abtastlicht durch ein einziges Objektiv in die Probe gerichtet werden; es ist aber auch möglich, die Probe durch eine separate Optik mit dem Licht der weiteren Lichtquelle(n) zu beleuchten. Diese separate Optik kann ein zweites Objektiv sein, das dem Objektiv zur Beleuchtung der Probe mit dem Abtastlicht gegenübersteht oder in einem Winkel zu diesem angeordnet sein kann, so dass sich das Abtastlicht und das Licht zur Generierung der zweiten Messgröße in einem Winkel zwischen 15° und 165°, bevorzugt in einem Winkel zwischen 45° und 135° und besonders bevorzugt in einem Winkel zwischen 80° und 100° in der Probe schneiden. Eine derartige Konfiguration ist beispielsweise in einem Lichtblattmikroskop realisiert.
In einer alternativen Ausführungsform ist die zweite Messgröße eine nicht-optische Messgröße. Bevorzugte nicht-optische Messgrößen sind insbesondere elektrische Messgrößen, also elektrische Spannungen, elektrische Ströme, elektrische Kapazitäten, elektrische Induktivitäten oder Frequenzen, Amplituden oder Phasen elektrischer Spannung, elektrischer Ströme oder elektromagnetischer Wechselfelder. Ein elektrischer Strom kann beispielsweise in einer Patch C/amp-Anordnung gemessen werden, bei der mit einer Mikropipette ein einzelner lonenkanal in der Zellmembran einer zu untersuchenden Zelle vom umgebenden Medium elektrisch isoliert wird und der Strom durch den lonenkanal mit einer Elektrode gemessen und nach Aufbereitung mit einem empfindlichen Messverstärker in einen Kontrollwert zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gewandelt wird. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen und den zugehörigen Erläuterungen zu den Zeichnungen. Die beschriebenen Vorteile von Merkmalen und / oder Merkmalskombinationen der Erfindung sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen.
Hinsichtlich des Offenbarungsgehalts (aber nicht des Schutzbereichs) der ursprünglichen Anmeldungsunterlagen und des Patents gilt Folgendes: Weitere Merkmale sind den Zeichnungen - insbesondere den dargestellten relativen Anordnungen und Wirkverbindungen - zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen, was aber nicht für die unabhängigen Patentansprüche des erteilten Patents gilt.
Die in den Patentansprüchen enthaltenen Bezugszeichen stellen keine Beschränkung des Umfangs der durch die Patentansprüche geschützten Gegenstände dar. Sie dienen lediglich dem Zweck, die Patentansprüche leichter verständlich zu machen.
Kurzbeschreibung der Figuren
Fig. 1 zeigt schematisch den Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Fig. 2 zeigt verschiedene Möglichkeiten der Aufnahme einer zweiten Messgröße.
Fig. 3 zeigt ein erfindungsgemäßes Lichtmikroskop.
Beschreibung der Figuren
Fig. 1 zeigt einen Ausschnitt einer Zelle 1 , innerhalb derer sich ein Partikel 2 befindet, dessen Bewegung verfolgt werden soll. Die Anfangsposition 3 dieses Partikels ist zumindest näherungsweise bekannt (beispielsweise aus einem zuvor aufgenommenen, hier nicht gezeigten Weitfeldbild), so dass mit der Abtastung des Partikels 2 an der Anfangsposition 3 begonnen werden kann. Hierzu wird das Partikel mit einem Abtastlicht 5 an mehreren Abtastpositionen 4 beleuchtet, von denen in der Figur nur einige beispielhaft eingezeichnet sind. Erfindungsgemäß weist das Abtastlicht 5 eine Intensitätsverteilung 7 mit einem lokalen Intensitätsminimum 8 auf. Das Partikel 2 ist hier konkret ein fluoreszentes Partikel, das bei Beleuchtung mit dem Abtastlicht 5, das somit ein Anregungslicht 6 ist, zur Abgabe einer Fluoreszenz 9 angeregt wird. Das Abtastlicht 5 könnte alternativ auch eine Überlagerung von Anregungslicht 6 mit einer ein lokales Intensitätsminimum 8 aufweisenden Intensitätsverteilung 7 von Fluoreszenzverhinderungslicht, insbesondere Stimulationslicht, sein. Alternativ könnte des Partikel auch ein lichtstreuendes Partikel sein. Statt der Fluoreszenz 9 würde dann bei der Beleuchtung des Partikels 2 mit dem Abtastlicht 5 ein Streulichtsignal detektiert.
An jeder der Abtastpositionen 4 wird die von dem fluoreszenten Partikel 2 emittierte Fluoreszenz 9 detektiert, und auf Grundlage der letzten Abtastposition(en) und der jeweils detektierten Anzahl(en) von Fluoreszenzphotonen bzw. der detektierten Fluoreszenzintensität werden aktualisierte Koordinaten des fluoreszenten Partikels 2 bestimmt und eine oder mehrere weitere Abtastpositionen 4 festgelegt. Dabei kann die Aktualisierung der Koordinaten des Partikels 2 jeweils nach dem Abtasten an mehreren Abtastpositionen 4 erfolgen, es kann aber auch auf jedes einzelne detektierte Fluoreszenzphoton reagiert werden, indem die Koordinaten des fluoreszenten Partikels 2 aktualisiert und die nachfolgende(n) Abtastposition(en) festgelegt werden. Durch Aneinanderfügen der nacheinander bestimmten Koordinaten entsteht so die Trajektorie 10 des fluoreszenten Partikels 2.
Erfindungsgemäß wird während des Abtastens des fluoreszenten Partikels 2 eine zweite Messgröße 11 als Kontrollwert 12 detektiert, hier ebenfalls eine Fluoreszenz 13 eines weiteren Fluoreszenzfarbstoffs 14, mit dem eine Färbung 15 der Zelle 1 vorgenommen wurde. Der weitere Fluoreszenzfarbstoff 14 ist dabei so gewählt, dass seine Fluoreszenz 13 in einem anderen Wellenlängenbereich als die Fluoreszenz 9 des Partikels 2 erfolgt und die an den Abtastpositionen 4 von dem Partikel 2 detektierte Fluoreszenz 9 nicht beeinflusst. Sofern an der jeweils aktuellen Abtastposition 4 eine Fluoreszenz 13 dieses weiteren Fluoreszenzfarbstoffs 14 oberhalb eines Minimalwerts 16 detektiert wird, zeigt dies an, dass sich das verfolgte Partikel 2 innerhalb der Zelle 1 bewegt, und die Aufnahme der Trajektorie 10 durch Abtasten des Partikels 2 wird fortgesetzt. Sobald die Fluoreszenz 13 des Fluoreszenzfarbstoffs 14 jedoch unter den Minimalwert 16 fällt, zeigt dies an, dass sich das Partikel 2 außerhalb der Zelle 1 befindet, und es erfolgt ein Abbruch 17 des Abtastens. Die weitere Trajektorie 18 des Partikels 2 außerhalb der Zelle 1 wird nicht weiter verfolgt.
Fig. 2 zeigt schematisch eine Auswahl verschiedener zweiter Messgrößen 11 , um ein Abbruchkriterium für das Verfolgen einzelner Partikel 2 in der Probe 19 festzulegen. Wenngleich ein Kontrollwert auch aus mehreren Messgrößen abgeleitet werden kann, so sind die in der Figur gezeigten Messgrößen primär als Alternativen zu betrachten. In der dargestellten Ausführungsform wird die Probe 19 über ein Objektiv 20 von unten mit dem Abtastlicht 5 beleuchtet (inverse Konfiguration). In der Probe befindet sich eine Zelle 1 , in der der Zellkern 21 und einige Filamente 22 exemplarisch für die Zellorganellen der Zelle 1 gezeigt sind. Gezeigt ist weiterhin ein fluoreszentes Partikel 2, dessen Trajektorie durch Abtasten mit dem Abtastlicht 5 an verschiedenen Abtastpositionen in der Zelle 1 aufgenommen wird. Hierzu wird das fokussierte Abtastlicht 5 in der Probe 19 durch der Verkippen des Lichtstrahls 23 des Abtastlichts 5 mit einer (nicht gezeigten) Strahlablenkvorrichtung an die Abtastpositionen verlagert. Die von dem fluoreszenten Partikel 2 emittierte Fluoreszenz 9 wird mit dem Objektiv 20 gesammelt und mit einem (nicht gezeigten) Detektor detektiert.
Während des Abtastens und des Verfolgens des fluoreszenten Partikels 2 in der Probe 19 erfolgt eine Aufnahme einer zweiten Messgröße 11 , um ein Abbruchkriterium für das Abtasten festzulegen. Diese zweite Messgröße 11 kann ebenfalls eine Fluoreszenz 13 eines zweiten Fluoreszenzfarbstoffs sein, mit dem einzelne Bestandteile (z. B. Organellen) der Zelle 1 oder die gesamte Zelle 1 markiert ist. Zur Anregung dieses zweiten Fluoreszenzfarbstoffs erforderliches Anregungslicht 6 kann in einem gemeinsamen Lichtstrahl 23 mit dem Abtastlicht 5 in die Probe
19 eingestrahlt werden; auch die Fluoreszenz 13 des zweiten Farbstoffs kann mit dem Objektiv
20 gesammelt werden. Die Fluoreszenz 13 dient dann als Kontrollwert 12, auf Basis dessen ein Abbruchkriterium für das Abtasten und Verfolgen des fluoreszenten Partikels 2 festgelegt wird. Dieses Abbruchkriterium kann beispielsweise das Unterschreiten eines Minimalwerts des Kontrollwerts 12 sein, wodurch angezeigt wird, dass das fluoreszente Partikel 2 sich von der mit dem zweiten Fluoreszenzfarbstoff markierten Zelle 1 bzw. der Zellorganelle entfernt hat.
Statt einer Fluoreszenz 13 kann die zweite Messgröße 11 auch in Transmissionsrichtung 24 mit einem zweiten Objektiv 25 aufgefangenes und mit einem (nicht gezeigten) weiteren Detektor detektiertes Durchlicht 26 sein, dessen Intensität als Kontrollwert 12 zur Festlegung des Abbruchkriteriums dient. Als Durchlicht 26 kann dabei das durch die Probe transmittierte Abtastlicht 5 detektiert werden, es ist aber auch möglich, ein weiteres Beleuchtungslicht 27 mit dem Abtastlicht 5 in die Probe 19 einzustrahlen. Die Beleuchtung mit dem weiteren Beleuchtungslicht 27 kann außer als Hellfeldfeldbeleuchtung auch in Form einer Dunkelfeldbeleuchtung erfolgen; auf diese Weise kann gegebenenfalls ein besserer Kontrast des Kontrollwerts erzielt werden. Auch kann der Durchlichtkontrast durch die Anordnung von Polarisatoren im Beleuchtungs- und Durchlichtstrahlengang als Polarisationskontrast ausgeführt werden. Schließlich kann das Beleuchtungslicht 27 auch so gewählt werden, dass in der Probe ein nichtlineares optisches Signal, insbesondere ein SHG-Signal 28 (Second Harmonie Generation) oder ein THG-Signal (Third Harmonie Generation) erzeugt wird. Die zweite Messgröße 11 muss nicht notwendigerweise eine optische Messgröße sein. Als Kontrollwert 12 kann beispielsweise auch eine elektrische Messgröße, insbesondere ein elektrischer Strom 32 oder eine elektrische Spannung dienen. In der Darstellung ist hierzu exemplarisch die Ableitung eines Stroms durch einen lonenkanal 29 in einer Patch-Clamp- Anordnung dargestellt. Dazu wird ein einzelner lonenkanal 29 mit einer Mikropipette 30 gegenüber dem umgebenden Medium isoliert und der lonenstrom durch den lonenkanal 29 mit einer Elektrode 31 abgeleitet und als elektrischer Strom 32 detektiert. Das mit einem Messverstärker 33 aufbereitete Signal kann als Kontrollwert 12 dienen, um ein Abbruchkriterium für das Abtasten und das Verfolgen des fluoreszenten Partikels 2 in der Probe 19 festzulegen. In dem gezeigten Beispiel kann das Verfolgen des fluoreszenten Partikels 2 so auf Intervalle beschränkt werden, in denen der lonenkanal 29 aktiv ist.
Fig. 3 zeigt schematisch den Aufbau eines Lichtmikroskops, das hier als Fluoreszenzmikroskop 34 ausgeführt ist, zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Laserlichtquelle 35 stellt Abtastlicht 5 bereit, das hier Anregungslicht 6 zur Fluoreszenzanregung ist. Der Lichtstrahl 23 des Abtastlichts 5 durchläuft eine Strahlablenkeinrichtung, hier ausgeführt in Form zweier nacheinander geschalteter elektrooptischer Deflektoren (EOD) 36 zur Ablenkung des Lichtstrahls 23 in der horizontalen bzw. vertikalen Richtung. Nach Durchlaufen der EODs 36 wird die Wellenfront mit einem separaten Phasenmodulationselement 37, hier in Form eines Flüssigkristallmodulators 38 (Spatial Light Modulator, SLM) so geformt, dass bei der nachfolgenden Fokussierung durch das Objektiv 20 eine ein lokales Intensitätsminimum aufweisende Intensitätsverteilung des Abtastlichts 5 in der Probe 19 resultiert. Der von dem Flüssigkristallmodulator 38 reflektierte bzw. gebeugte Lichtstrahl wird mit einem Strahleinkoppler 39 in einen Hauptstrahlengang 40 des Fluoreszenzmikroskops 34 eingekoppelt. Der Strahleinkoppler 39 ist vorteilhaft als schmalbandig reflektierender dielektrischer Notchfilter ausgeführt, dessen Reflexionsbereich möglichst wenig mit dem Wellenlängenbereich der Fluoreszenz 9 überlappt, so dass nur geringe Anteile der im Hauptstrahlengang 40 in Gegenrichtung zum Abtastlicht 5 verlaufenden Fluoreszenz 9 aus dem Hauptstrahlengang 40 ausgespiegelt werden. Das Abtastlicht 5 wird mit einer Scanlinse 41 , einem Scanner 42 sowie einer Tubuslinse 43 in die rückwärtige Apertur des Objektivs 20 gelenkt.
In der gezeigten Konfiguration dient der auf Galvanometern basierende Scanner 42 einer vergleichsweise langsamen, aber über ein großes Bildfeld möglichen Grobpositionierung des fokussierten Abtastlichts 5 auf ein fluoreszentes Partikel in der Probe, während die EODs 36 der schnellen Positionierung des Intensitätsminimums im Nahbereich um das fluoreszente Partikel dienen. Dabei erlauben die EODs 36 eine Positionierung mit hoher Geschwindigkeit, allerdings mit einem auf wenige Mikrometer beschränkten Positionierbereich. Die von dem Objektiv 20 aus der Probe 19 empfangene Fluoreszenz 9 propagiert entlang des Hauptstrahlengangs 40 in dem Abtastlicht 5 entgegengesetzter Richtung. Die Fluoreszenz 9 wird mit einer Linse 45 durch eine konfokale Lochblende 44 fokussiert, mit einer weiteren Linse 46 kollimiert, mit einem Filter 47 von Streulicht getrennt und mit einen Detektor 48 detektiert.
In dem Fluoreszenzmikroskop 34 ist ein zweiter Fluoreszenzkanal zur Detektion der Fluoreszenz 13 eines zweiten Fluoreszenzfarbstoffs vorgesehen, wobei die Fluoreszenz 13 die zweite Messgröße 11 zur Festlegung eines Abbruchkriteriums für die Abtastung einzelner fluoreszenter Partikel in der Probe 19 ist. Hierzu verfügt das Fluoreszenzmikroskop 34 über eine weitere Lichtquelle 49, deren Licht mit einem zweiten Strahleinkoppler 50 in den Hauptstrahlengang 40 eingekoppelt wird. Die durch das Licht der Lichtquelle 49 angeregte Fluoreszenz 13 des zweiten Fluoreszenzfarbstoffs wird von der Fluoreszenz 9 des fluoreszenten Partikels mit einem Strahlteiler 51 getrennt und nach Filterung durch einen Filter 47 mit dem Detektor 52 detektiert. Das Fluoreszenzmikroskop 34 verfügt weiter über eine Steuereinheit 53, die Steuersignale 54 zur Ansteuerung des Scanners 42 und der EODs 36 erzeugt, sowie die Detektorsignale 55 der Detektoren 48, 52 empfängt. Die Steuereinrichtung 53 ist eingerichtet, das Abtastlicht 5 mit dem Scanner 42 an einzelnen fluoreszenten Partikeln zu positionieren und einzelne Partikel in der Probe zu verfolgen, indem diese wiederholt mit dem Abtastlicht 5 in einem Nahbereich abgetastet und Positionsbestimmungen aus den Abtastpositionen und an den Abtastpositionen detektierten Intensitäten oder Photonenzahlen der Fluoreszenz 9 durchgeführt werden. Während des Verfolgens einzelner fluoreszenter Partikel empfängt die Steuereinheit 53 eine Fluoreszenz 13 als zweite Messgröße aus der Probe 19 und bricht das Verfolgen eines Partikels bei Erreichen eines Abbruchkriteriums, das hier das Unterschreiten einer Mindestintensität der zweiten Messgröße, also der Fluoreszenz 13 ist, ab.
Bezugszeichenliste
1 Zelle
2 Partikel
3 Anfangsposition
4 Abtastposition
5 Abtastlicht
6 Anregungslicht
7 Intensitätsverteilung
8 lokales Intensitätsminimum
9 Fluoreszenz
10 T rajektorie
11 zweite Messgröße
12 Kontrollwert
13 Fluoreszenz
14 Fluoreszenzfarbstoff
15 Färbung
16 Minimalwert
17 Abbruch
18 T rajektorie
19 Probe
20 Objektiv
21 Zellkern
22 Filamente
23 Lichtstrahl
24 Transmissionsrichtung
25 Objektiv
26 Durchlicht
27 Beleuchtungslicht
28 Second Harmonie Generation (SHG)-Licht
29 lonenkanal
30 Mikropipette
31 Elektrode
32 elektrischer Strom
33 Messverstärker
34 Lichtmikroskop Lichtquelle
Elektrooptischer Deflektor (EOD)
Phasenmodulationselement
Flüssigkristallmodulator
Strahleinkoppler
Hauptstrahlengang
Scanlinse
Scanner
Tubuslinse
Lochblende
Linse
Linse
Filter
Detektor
Lichtquelle
Strahleinkoppler
Strahlteiler
Detektor
Steuereinheit
Steuersignal
Detektorsignal

Claims

23
Patentansprüche
1. Verfahren zur Aufnahme einer Trajektorie (10) eines einzelnen Partikels (2) in einer Probe (19) ausgehend von einer zumindest näherungsweise bekannten Anfangsposition (3) des Partikels (2), umfassend die wiederholt ausgeführten Verfahrensschritte:
- Abtasten des Partikels (2) mit einer ein lokales Minimum (8) aufweisenden Intensitätsverteilung (7) eines Abtastlichts (5) an einer oder mehreren Abtastpositionen (4);
- Detektieren einer von dem Partikel (2) infolge der Beleuchtung mit dem Abtastlicht (5) an jeder der Abtastpositionen (4) emittierten Anzahl von Photonen oder einer Lichtintensität als eine erste Messgröße;
- Bestimmen aktualisierter Koordinaten des Partikels aus der an den Abtastpositionen (4) detektierten Photonenzahl oder der detektierten Lichtintensität und Hinzufügen der aktualisierten Koordinaten zu der Trajektorie (10), dadurch gekennzeichnet, dass während der Aufnahme der Trajektorie (10) eine zweite Messgröße (11) in der Probe (19) erfasst wird und die Aufnahme der Trajektorie (10) unterbrochen oder beendet wird, wenn die zweite Messgröße (11) oder ein aus der zweiten Messgröße (11) berechneter Kontrollwert (12) ein Abbruchkriterium erfüllt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die optische Leistung des Abtastlichts (5) im Laufe mehrerer Bestimmungen aktualisierter Koordinaten des Partikels (2) angepasst, insbesondere erhöht wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Partikel (2) ein fluoreszentes Partikel oder ein fluoreszentes Farbstoffmolekül ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Abtastlicht (5) ein Fluoreszenzanregungslicht ist, das das Partikel zur Fluoreszenz anregt.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Abtastlicht (5) eine Überlagerung eines Fluoreszenzanregungslichts und eines Fluoreszenzverhinderungslichts ist, wobei das Fluoreszenzverhinderungslicht die Intensitätsverteilung (7) mit dem lokalen Intensitätsminimum (8) aufweist.
6. Verfahren einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Partikel (2) für jede Aktualisierung seiner Koordinaten an mehreren Abtastpositionen (4) in einem Nahbereich um die zuletzt bestimmten Koordinaten abgetastet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Koordinaten des Partikels (2) nach jedem Abtasten des Partikels (2) an einer Abtastposition (4) aktualisiert werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Abbruchkriterium erfüllt ist, wenn die zweite Messgröße (11) oder der Kontrollwert (12) einen Minimalwert (16) unterschreitet oder einen Maximalwert überschreitet.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Abtasten fortgesetzt wird, wenn die zweite Messgröße (11) oder der Kontrollwert (12) den Minimalwert (16) wieder überschreitet bzw. den Maximalwert wieder unterschreitet.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Messgröße (11) an der Position des Abtastlichts (5) in der Probe (19) detektiert wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Messgröße (11) in einer Umgebung um die aktuellen Koordinaten des Partikels (2) in der Probe (19) detektiert wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Messgröße (11) an einer ortsfesten Position oder in einem ortsfesten Bereich der Probe (19) detektiert wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Messgröße (11) eine optische Messgröße ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Messgröße (11) ein Fluoreszenzsignal ist.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Kontrollwert (12) aus dem Fluoreszenzsignal und einem weiteren Fluoreszenzsignal, insbesondere aus dem Verhältnis dieser Signale berechnet wird.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Kontrollwert (12) eine aus der Fluoreszenzintensität oder aus der Fluoreszenzlebensdauer des Fluoreszenzsignals oder der Fluoreszenzsignale berechnete Größe, insbesondere ein pH-Wert, eine lonenkonzentration, ein Membranpotenzial oder eine Fluoreszenzanisotropie ist.
17. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Messgröße (11) ein Second-Harmonic-Generation-S'\gr\a\ (SHG), ein Third-Harmonic-Generation-S'\gr\a\ (THG), ein Rayleigh- oder Raman-Streulichtsignal, eine kohärente anti-Stokes Raman-Streuung (CARS), ein Reflexionslichtsignal, ein Differentialinterferenzkontrastsignal (DIC) oder ein Polarisationskontrastsignal ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das als zweite Messgröße (11) detektierte Signal durch Beleuchten der Probe (19) mit Licht generiert wird, das in einem Winkel zwischen 15° und 165°, bevorzugt in einem Winkel zwischen 45° und 135°, besonders bevorzugt in einem Winkel zwischen 80° und 100° zur Einstrahlrichtung des Abtastlichts (5) in die Probe (19) eingestrahlt wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Messgröße (11) eine elektrische Messgröße, insbesondere eine elektrische Spannung, ein elektrischer Strom (32), ein elektrischer Widerstand, eine elektrische Kapazität, eine elektrische Induktivität oder eine Frequenz, eine Phase odereine Amplitude einer elektrischen Wechselspannung, eines elektrischen Wechselstroms oder eines elektromagnetischen Wechselfeldes ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Messgröße (11) oder der aus der zweiten Messgröße (11) berechnete Kontrollwert (12) ein Viabilitäts-, Vitalitäts- oder Zellzyklusindikator einer in der Probe (19) befindlichen Zelle (1) ist. Lichtmikroskop (34) mit
- einem Objektiv (20),
- einer Lichtquelle (35) für Abtastlicht (5),
- Strahlformungsmitteln zur Ausbildung einer ein lokales Intensitätsminimum (8) aufweisenden Intensitätsverteilung (7) des Abtastlichts (5) in einer Probe (19),
- einer Abtastvorrichtung zur Positionierung des Abtastlichts (5) in der Probe (19),
- einem Detektionskanal zur Erfassung einer ersten, optischen Messgröße in der Probe (19),
- einem Detektionskanal zur Erfassung einer zweiten Messgröße (11) in der Probe, dadurch gekennzeichnet, dass das Lichtmikroskop (34) eingerichtet ist, ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20 auszuführen. Lichtmikroskop (34) nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass das Abtastlicht (5) als ein Fluoreszenzanregungslicht ausgebildet ist. 26
23. Lichtmikroskop (34) nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Abtastlicht (5) als eine Überlagerung eines Fluoreszenzanregungslichts und eines Fluoreszenzverhinderungslichts ausgebildet ist, wobei das Fluoreszenzverhinderungslicht die Intensitätsverteilung mit dem lokalen Intensitätsminimum (8) aufweist. 24. Lichtmikroskop (34) nach einem der Ansprüche 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Lichtmikroskop (34) eine weitere Lichtquelle aufweist, die dazu ausgebildet ist, das als zweite Messgröße (11) erfasste Signal in der Probe zu generieren.
25. Lichtmikroskop (34) nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht der weiteren Lichtquelle in einem Winkel zwischen 15° und 165°, bevorzugt in einem Winkel zwischen 45° und 135°, besonders bevorzugt in einem Winkel zwischen 80° und 100° zur Einstrahlrichtung des Abtastlichts (5) in die Probe (19) gerichtet ist.
26. Lichtmikroskop (34) nach einem der Ansprüche 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Messgröße (11) eine nicht-optische Messgröße, insbesondere eine elektrische Messgröße, insbesondere eine elektrische Spannung, ein elektrischer Strom (32), ein elektrischer Widerstand, eine elektrische Kapazität, eine elektrische Induktivität oder eine Frequenz, eine Phase oder eine Amplitude einer elektrischen Wechselspannung, eines elektrischen Wechselstroms oder eines elektromagnetischen Wechselfeldes ist.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024038190A1 (de) 2022-08-18 2024-02-22 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und vorrichtung zum simultanen verfolgen zweier emitter

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102022109027B4 (de) 2022-04-13 2023-12-21 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zum Kartieren der Oberfläche eines Makromoleküls
DE102022119332B3 (de) 2022-08-02 2023-12-28 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, lichtmikroskop und computerprogramm zum lokalisieren oder verfolgen von emittern in einer probe

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009098272A2 (en) * 2008-02-05 2009-08-13 Dublin City University Microfluidic device for assessing object / test material interactions
DE102011055367A1 (de) 2011-11-15 2013-05-16 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und Vorrichtung zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels, insbesondere eines einzelnen Moleküls, in einer Probe
DE102017104736B3 (de) 2017-03-07 2018-08-16 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und Vorrichtung zum räumlichen Messen nanoskaliger Strukturen
CN109308457A (zh) * 2018-08-31 2019-02-05 华南理工大学 一种高浓度下多粒子三维追踪方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9291562B2 (en) 2011-11-15 2016-03-22 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Method and apparatus for tracking a particle, particularly a single molecule, in a sample
DE102015004104B4 (de) 2015-03-27 2020-09-03 Laser-Laboratorium Göttingen e.V. Verfahren zum Lokalisieren wenigstens eines Emitters míttels eines Lokalisationsmikroskops
DE102015015497A1 (de) 2015-11-30 2017-06-14 Horst Wochnowski Verschiedene Anwendungen von auf hochauflösenden fluoreszenz-basierten Mikroskopiemethoden (RESOLFT/STED u.a.) basierende Verfahren, wie beispielsweise fluoreszenz-basierte Nanostrukturierung
WO2018069283A1 (de) 2016-10-10 2018-04-19 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zum räumlich hochauflösenden bestimmen des orts eines vereinzelten, mit anregungslicht zur emission von lumineszenzlicht anregbaren moleküls in einer probe
DE102017129837A1 (de) 2017-12-13 2019-06-13 Leibniz-Institut für Photonische Technologien e. V. Kombinierte Untersuchung mit Bildgebung und Lasermessung
US20220163440A1 (en) 2019-03-28 2022-05-26 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Target-locking single-molecule nanoscopy
WO2021111187A2 (en) 2019-12-02 2021-06-10 Bioaxial Sas Dark tracking, hybrid method, conical diffraction microscopy and dark addressing
DE102019008989B3 (de) 2019-12-21 2021-06-24 Abberior Instruments Gmbh Verfahren zur Störungskorrektur und Laserscanningmikroskop mit Störungskorrektur
DE102020113998A1 (de) 2020-05-26 2021-12-02 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, Computerprogramm und Vorrichtung zum Bestimmen von Positionen von Molekülen in einer Probe

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009098272A2 (en) * 2008-02-05 2009-08-13 Dublin City University Microfluidic device for assessing object / test material interactions
DE102011055367A1 (de) 2011-11-15 2013-05-16 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und Vorrichtung zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels, insbesondere eines einzelnen Moleküls, in einer Probe
DE102017104736B3 (de) 2017-03-07 2018-08-16 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und Vorrichtung zum räumlichen Messen nanoskaliger Strukturen
CN109308457A (zh) * 2018-08-31 2019-02-05 华南理工大学 一种高浓度下多粒子三维追踪方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
F. BALZAROTTI ET AL.: "Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes", SCIENCE, vol. 355, 2017, pages 606, XP055767212, DOI: 10.1126/science.aak9913
FRANCISCO BALZAROTTI ET AL: "Supplementary Materials for Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes", SCIENCE, vol. 355, no. 6325, 22 December 2016 (2016-12-22), US, pages 606 - 612, XP055767212, ISSN: 0036-8075, DOI: 10.1126/science.aak9913 *
K. GWOSCH ET AL.: "MINFLUX nanoscopy delivers 3D multicolor nanometer resolution in cells", NAT. METHODS, vol. 17, 2020, pages 217, XP055868805, DOI: 10.1038/s41592-019-0688-0
M. WEBER ET AL.: "MINSTED fluorescence localization and nanoscopy", BIORXIV, DOI: 10.1101/2020.10.31.363424, 2020
MARTÍNEZ-MUÑOZ LAURA ET AL: "Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function", MOLECULAR CELL, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 70, no. 1, 5 April 2018 (2018-04-05), pages 106, XP085371376, ISSN: 1097-2765, DOI: 10.1016/J.MOLCEL.2018.02.034 *
N. P. WELLS ET AL.: "Time Resolved 3D Molecular Tracking in Live Cells", NANO LETT, vol. 10, 2010, pages 4732

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024038190A1 (de) 2022-08-18 2024-02-22 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und vorrichtung zum simultanen verfolgen zweier emitter
DE102022120952A1 (de) 2022-08-18 2024-02-29 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und vorrichtung zum simultanen verfolgen zweier emitter
DE102022120952B4 (de) 2022-08-18 2024-03-14 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und vorrichtung zum simultanen verfolgen zweier emitter

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DE102020134495A1 (de) 2022-07-07
US20240035950A1 (en) 2024-02-01

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